７位レチノイン酸誘導体
【課題】従来のレチノイン酸及びその類似体と比較して光安定性が高く、且つ活性に優れた、新規なレチノイン酸誘導体、及びそれらを効率的な製造方法を提供する。
【解決手段】下記式：
の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩、及びそれらの製造方法。
【解決手段】下記式：
の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩、及びそれらの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光安定性の高い、新規な７位レチノイン酸誘導体、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイン酸は、ビタミンＡ（レチノール）の誘導体であるレチノイドの１つで、オールトランスレチノイン酸（トレチノイン、ＡＴＲＡ（all trans retinoic acid））や９−シス−レチノイン酸（特許文献１）、１３−シス−レチノイン酸（特許文献２）等の立体異性体の存在が知られている。
【０００３】
この中でもＡＴＲＡは、転写因子として機能する核受容体の１つであるＲＡＲの天然リガンドであり、ＡＴＲＡが当該受容体に結合することにより、細胞の増殖、分化、アポトーシス、及び悪性形質転換、機能性ペプチド及びタンパク質の遺伝子発現及び合成が制御される。このため、レチノイン酸及びその類似体は、悪性腫瘍や乾癬の治療に用いられるほか、皮膚科学領域ではニキビや光老化治療薬として利用されている。
【０００４】
また、レチノイン酸及びその類似体は、ＵＶに弱く不安定である。このため製造時（合成時）には光を遮断する措置が必要となり、操作が煩雑である。また薬剤に配合した場合は、冷暗所に保存しても１ヶ月程度での使い切りが推奨されるように、有効期限が非常に短く、保存時に特別の注意を要する点が問題となっている。
【０００５】
これに対し、薬剤の有効期限を延長する対処法として、薬剤におけるレチノイン酸の初期濃度を高濃度に設定することも考えられる。しかしながら、レチノイン酸は外用により、紅斑、落屑、乾燥等の皮膚炎（レチノイド皮膚炎）や、多用による催奇形性などの副作用の発生が知られており（非特許文献２）、レチノイン酸を過度に高濃度で含有する処方には問題がある。
【０００６】
レチノイン酸の光安定性を向上させるため、従来はレチノイン酸又はレチノイン酸誘導体を含有する組成物に、シクロデキストリン（特許文献３）又はフラーレン（特許文献４）等を配合し、光による分解を抑制する対処法がとられていた。しかしながら、上記のような他の成分を混合すると、製剤化における工程が増え、操作が煩雑になる。他の成分で補助することなく、レチノイン酸又はレチノイン酸誘導体自体の光安定性を向上させる試みはこれまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許３６３１２５９号公報
【特許文献２】特許４４１８０４８号公報
【特許文献３】特開２００８−１０６０４１号公報
【特許文献４】特開２００９−２６９９１５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】菊池克子：レチノイド外用、MB Derma、67, p. 21-28 (2002)
【非特許文献２】漆畑修：皮膚の抗老化最前線、株式会社エヌ・ティー・エス、p. 463-472、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来のレチノイン酸及びその類似体と比較して光安定性が高く、且つ活性に優れた、新規なレチノイン酸誘導体、及びそれらを効率的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、藻類から７位レチノイン酸誘導体を得ることに成功した。検討の結果、当該誘導体は、レチノイン酸と比較して光安定性に優れ、活性も良好な、新規な誘導体であることを見出し、本発明を為すに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は下記に関する。
（１）下記式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ1は、−ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ2、−ＣＯＮＨＲ2、−ＣＯＮＲ2Ｒ3、−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ、及び−ＣＨ2ＯＲ4からなる群から選択され、
Ｒ2及びＲ3は、各々独立に、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、好ましくはＣ1−Ｃ7アルキル基、より好ましくはＣ1−Ｃ4アルキル基であるか、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルケニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルケニル基であるか、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルキニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルキニル基であり、
Ｒ4は、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、好ましくはＣ1−Ｃ7アルキル基、より好ましくはＣ1−Ｃ4アルキル基であるか、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルケニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルケニル基であるか、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルキニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルキニル基であるか、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アシル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アシル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アシル基であり、
Ｘは、以下の
【化２】
からなる群から選択され、
Ｒ5は、同一でも異なってもよく、各々独立に、水素、−ＯＨ、−ＯＲ6、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニルであり、
ｎは、１〜３の整数であり、
Ｒ6は、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、好ましくはＣ1−Ｃ7アルキル基、より好ましくはＣ1−Ｃ4アルキル基であるか、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルケニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルケニル基であるか、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルキニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルキニル基であるか、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アシル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アシル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アシル基であり、
Ｘのシクロヘキセン環は、当該環の３位と４位、又は４位と５位の間に二重結合を形成してもよい）
の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩。
【００１２】
（２）また本発明は、下記（Ｉ１〜Ｉ４）
【化３】
から選択される７位レチノイン酸誘導体を獲得するための方法であって、当該誘導体を藻類から抽出する工程を含んでなる方法に関する。
【００１３】
（３）また本発明は、前記７位レチノイン酸誘導体又はその塩を含んでなる医薬組成物、化粧組成物、食用組成物又は殺有害生物組成物に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、従来のレチノイン酸及びその類似体と比較して光安定性が高く、且つ活性に優れた、新規なレチノイン酸誘導体を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の７位レチノイン酸誘導体とオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）とを比較したＭＳ分析の結果を示す。
【図２】図２は、ＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ及びＧＣ／ＭＣの結果に対する、本発明の７位レチノイン酸誘導体の帰属を示す。これによりレチノイン酸の７位にヒドロキシル基が付加していることが示される。
【図３】図３は、本発明の７位レチノイン酸誘導体と、レチノイン酸（コントロール）の光安定性を比較した試験の結果を示す。初期の活性を100％とし、ＵＶを照射した場合の残存活性の経時変化を示す。全てのｐＨ条件（酸性、中性及びアルカリ性）で本発明の化合物がレチノイン酸より高い光安定性を有することが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明で使用される、アルキル、アルケニル、アルキニル及びアシル基に関する「未置換又は置換された」なる用語は、これらの基が未置換であるか、または１個以上のハロゲン原子もしくは直鎖型もしくは分岐型の（Ｃ1−Ｃ16）アルコキシ基、ヒドロキシ、メルカプト、アルキルチオ、シアノ、(任意に、１もしくは２個の（Ｃ1−Ｃ6）アルキル基によって置換された）アミノ、ニトロ、カルボキシ、ホルミル、アルコキシカルボニル、(任意に、１または２個の直鎖型もしくは分岐型の（Ｃ1−Ｃ6）アルキル基によって置換された）アミノカルボニル、およびカルバモイル基によって置換されることを意味する。
【００１７】
本発明で使用される「アルキル基」なる用語は、好ましくは直鎖型もしくは分岐型のアルキル基のことを言う。
【００１８】
本発明で使用される「アルケニル基」なる用語は、好ましくは直鎖型もしくは分岐型のアルケニル基のことを言う。
【００１９】
本発明で使用される「アルキニル基」なる用語は、好ましくは直鎖型もしくは分岐型のアルケニル基のことを言う。
【００２０】
式（Ｉ）の化合物において、好ましくはＲ1は、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ及び−ＣＨ2ＯＨから選択される基である。より好ましくは、Ｒ1は−ＣＯＯＨである。
【００２１】
好ましいＸは、Ｒ5が、水素、−ＯＨ、−ＯＲ6（Ｒ6は前記の通りである）、メチル及びエチルから選択される。
【００２２】
最も好ましいＸは、
【化４】
から選択される。
【００２３】
式（Ｉ）の７位レチノイン酸誘導体の中でも、下記の誘導体はより一層好ましい。
【化５】
【００２４】
前記式（Ｉ１〜Ｉ４）の７位レチノイン酸誘導体は、当該４つの誘導体から選択される少なくとも２つからなる混合物として存在してもよい。好ましくは、４つの誘導体から選択される少なくとも３つからなる混合物であり、より好ましくは、４つの混合物として存在する。
【００２５】
塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、ホスホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、樟脳酸、シュウ酸等の酸との塩がある。また、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、第三ブチルアミン等の塩基との塩がある。
【００２６】
式（Ｉ）に示される不飽和基の二重結合は概して全てがＥ配置を有するが、本発明は二重結合の全てまたは一部分のみがＺ配置である式（Ｉ）の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩にも関する。
【００２７】
本発明で使用される「異性体」なる用語は、幾何異性体、光学的異性体又は互変異性体を意味する。本発明は、当該異性体及び互変異性体、及びそれらのあらゆる比率での混合物の全てを包含する。
【００２８】
特定の理論に限定されるものではないが、本発明の新規な７位レチノイン酸誘導体は、７位がヒドロキシ化又はオキソ化されるため、従来のレチノイン酸及びレチノイン酸誘導体が有する共役系が遮断され、光安定性が向上していると考えられる。
【００２９】
さらに、特定の理論に限定されるものではないが、本発明の新規な７位レチノイン酸誘導体は、互変異性を起こし、常に混合物として存在することで光安定性の向上に貢献する可能性もある。
【００３０】
本発明の新規な７位レチノイン酸誘導体の製造方法において使用される藻類には、藍藻類、原核緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クリプト藻類、渦鞭毛藻類、黄金色藻類、珪藻類、褐藻類、黄緑藻類、ハプト藻類、ラフィド藻類（緑色鞭藻類）、クロララクニオン藻類、ミドリムシ藻類、プラシノ藻類、緑藻類、車軸藻類などがあり、好ましくは、藍藻類が使用される。藍藻類の中で最も好ましいものは、スピルリナ（Spirulina sp）及びミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）である。
【００３１】
本発明で使用する藻類は、例えば国立環境研究所から入手可能であり、特にスピルリナ原末についてはＤＩＣライフテック株式会社等から市販されている。
【００３２】
特に、スピルリナは増殖速度が非常に速い藍藻類であり、培養は、幅広い条件（ｐＨ 7〜10、温度 20〜30℃）で行うことができ、野外での培養も世界各国行われていることから、工業的利用に適する。前記新規な７位レチノイン酸誘導体は、このスピルリナ及びミクロキスティスから生産できるために、従来の合成法と比較して生産効率が高く、且つコストを抑えることができる。
【００３３】
本発明の７位レチノイン酸誘導体を藻類から製造する場合、藻類を培養した後、遠心分離又はフィルター等を用いる濾過により培養物を回収し、脱水濃縮し、乾燥サンプルとする。当該乾燥サンプルから目的物を溶媒により抽出する。当該溶媒の例としては、水、アルコール、エーテル、石油エーテル、ベンゼン、酢酸エチル、クロロホルム等が挙げられる。好ましくは溶媒はアルコールであり、好ましくは、メタノール又はエタノールである。抽出物から溶媒を除去した後、残存物を適切な溶液に溶解させ、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）等により単離することにより、本発明の７位レチノイン酸誘導体を得ることができる。
【００３４】
本発明の７位レチノイン酸誘導体は、有機化学合成によって得ることもできる。例えば、レチノイン酸メチルエステル（市販品であっても、当業者に既知の方法により作製してもよい）を、ジクロロホルム（ＤＣＭ）中で酸化させることにより、７−オキソレチノイン酸メチルエステルを得ることができる。逆相ＨＰＬＣ等で分離精製後、必要に応じて還元することにより７−オキソレチノイン酸を得てもよい。
【００３５】
本発明の７位レチノイン酸誘導体は、それ自身単独で、又は他の成分と組み合わせて使用することができる。好ましくは、当該７位レチノイン酸誘導体は、医薬組成物、化粧組成物、食用組成物又は殺有害生物組成物に配合して使用することができる。
【００３６】
医薬組成物、化粧組成物又は食用組成物は、創傷、荒れ肌やきめの粗さ、肌のはりの低減、しわ、色素沈着などの乾燥、紫外線、活性酸素及び老化による皮膚障害、乾癬、苔癬、魚鱗癬、角化症、ダリエ症等の皮膚角化異常症、膿疱症、座瘡、湿疹、アトピー性皮膚炎等の皮膚疾患、脱毛症、口腔粘膜の損傷、歯周病等の口腔疾患、ドライアイ、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症等の眼疾患、口腔乳頭腫、乳頭腫ウイルス関連疾患、消化器潰瘍等の腫瘍、カポジ肉腫等の悪性腫瘍、口腔白斑病、皮膚癌、乳癌、胃癌、白血病等の前癌症状、並びに癌、関節炎、大腸炎、腎炎等の炎症性疾患、紅斑性狼瘡、全身性エリスマトーデス、遅延型過敏症、臓器移植拒絶等の免疫性疾患、脂血症、アテローム性動脈硬化症等の循環器系疾患、子宮内膜過形成、良性前立腺肥大などの非悪性過増殖性疾患、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患、成長ホルモン分泌低下などの下垂体機能異常、アポトーシス調整異常などに関連する症状又は疾患を予防及び／又は治療するために使用することができる。前記疾患及び障害の予防及び／又は治療は、他の治療法、例えば、外科的療法、レーザー療法、化学療法、薬物療法等と組み合わせて行ってもよい。本発明の新規な７位レチノイン酸誘導体の具体的な適用例としては、例えば、化粧水、乳液、美容クリーム、美容液、化粧下地、ハンドクリーム、ファンデーション、仕上げ用パウダー、パック剤、マスク、貼付剤、洗顔料、クレンジング剤、日焼け止め、日焼け処置剤、ボディーソープ、リンス、シャンプー、育毛剤、養毛剤、整髪料、入浴剤、制汗剤、点眼剤、コンタクトレンズ装着液、洗口剤、健康食品、サプリメント、ビタミン剤、ドリンク剤等が挙げられる。剤型としては、錠剤、顆粒剤、粉末、トローチ、貼付剤、クリーム、溶液、エマルション、ゲル剤、軟膏、ゼリー剤、注射液等が挙げられる。
【００３７】
殺有害生物組成物は、虫、ダニ、線虫及び軟体動物等の有害生物（以下、単に「有害生物」と言う）を防除及び駆除するために、有害生物及び有害生物の生育場所に施用して使用することができる。剤型としては、粉剤、粒剤、水和剤、水溶剤、乳剤、液剤、油剤、エアロゾル、マイクロカプセル剤、ペースト剤、くん煙剤、塗布剤、スプレー剤等が挙げられる。
【００３８】
本発明の新規な７位レチノイン酸誘導体の他に、前記組成物に配合するものとしては、他の活性成分、賦形剤等がある。他の活性成分としては、ハイドロキノン、コエンザイムＱ１０、アスコルビン酸等が挙げられる。賦形剤としては、水、アルコール等の溶媒、界面活性剤、植物油、鉱物油等の油、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、保湿剤、分散剤、ｐＨ調整剤、紫外線防止剤、着色剤、香料等が挙げられる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００４０】
実施例１．化合物の製造（藻類からの抽出）
（１）原料
藍藻類である、スピルリナ（Spirulina sp.）（ＴＵ−３）（国立環境研究所から入手）及びミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）（ＮＩＥＳ−８８）（国立環境研究所から入手）を用意した。
レチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、Aldrich Chemicalsから入手した。
ＭＡ培地は、Ｃａ（ＮＯ3）2・4Ｈ2Ｏ（5mg）、ＫＮＯ3（10 mg）、ＮａＮＯ3（5mg）、ＭｇＣｌ2・6Ｈ2Ｏ（5 mg）、Ｎａ2ＳＯ4（4 mg）、β-グリセロリン酸ナトリウム五水和物（10 mg）、Ｎａ2ＥＤＴＡ（0.5 mg）、ＦｅＣｌ3・6Ｈ2Ｏ（0.05 mg）、ＭｎＣｌ2・4Ｈ2Ｏ（0.5 mg）、ＺｎＣｌ2（0.05 mg）、ＣｏＣｌ3・6Ｈ2Ｏ（0.5 mg）、Ｎａ2ＭｏＯ4・2Ｈ2Ｏ（0.08 mg）、Ｈ3ＢＯ3（2 mg）、Bicine（50 mg）を、100 mlの蒸留水に溶解させて作製した（ｐＨ8.6）。
【００４１】
（２）方法
１．培養
スピルリナ（ＴＵ−３）又はミクロキスティス・エルギノーサ（ＮＩＥＳ−８８）を、25℃、24mE/m2・sの条件下で４週間、ＭＡ培地において培養した。培養後、細胞を遠心分離及び凍結乾燥により回収した。当該凍結乾燥サンプルは、使用するまで−30℃で保存した。
２．抽出及び精製
前記乾燥サンプルにメタノールを加え、抽出物を得た。当該抽出物を、38℃、減圧下で乾燥させ、残存した固体をジクロロメタン（ＤＣＭ）に懸濁した。当該懸濁物中の不溶性物質を、2,500 rpmで遠心分離することにより除去した。次に、フロリジルカートリッジ（60 gのフロリジル）にこの上清をアプライした。当該カートリッジを、200 mLのＤＣＭで洗浄後、10％アセトン含有ＤＣＭ及びメタノールを前記カートリッジにアプライし、メタノール溶出により溶出物を得た。この溶出液を蒸発させ、クロロホルムに再懸濁した。当該クロロホルム溶液を、シリカゲルカラムにアプライし、２％メタノール含有クロロホルムで溶出した。当該溶出液の溶媒を除去した後、残存物を、調製用ＨＰＬＣに供した（カラム：Mightysil ODSカラム（i.d.20 x 250mm, 5mm）、移動相：メタノール含有の25％リン酸バッファ（50 mM, pH3.0）、流速：14 mL/分）。溶出プロファイルを、フォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）（Agilent DAD）でモニターした。この結果、保持時間15〜25分の間に４つのピークが観察され、それぞれを分取した（溶液１〜４）。
【００４２】
３．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる抽出化合物の分析
前記分取した各溶液（溶液１〜４）中のリン酸バッファを、スチレンポリマーカートリッジ（ＰＳ−１）を用いて除去した後、各溶液をＬＣ／ＭＳ−ＭＳで分析した。比較のために、ＡＴＲＡを同様に処理し、分析した。
【００４３】
ＬＣ／ＭＳ−ＭＳは、ＨＰＬＣ（Agilent 1200）（カラム：Zorbax Eclipse Pluse C18 （i.d. 2.1 x 50 mm,1.8 mm）、グラジエント条件：0.2％酢酸及びメタノール、流速0.3 mL/分）及びAgilent 6520 Ｑ−ＴＯＦからなるシステムを用いて分析した。ＭＳ条件は、イオン化：ESI；ネブライザー（Nebulizer） 50 psi(Ｎ2)、乾燥気体：10L/分、350℃（Ｎ2）；Ｖcap：5000V、フラグメンター（Fragmentor）：100V；スキャン（Scan）：100〜1000 m/z； 計測回数／スキャン/：10,000；参照基準（References）：121.0509及び922.0098 m/z；衝突エネルギー：15〜30 eVとした。
【００４４】
ＨＰＬＣでは保持時間3.7〜7.7分の間に４つのピークが現れた（化合物１〜４とする）。表１に化合物１〜４のＭＳ分析の結果を示す。本分析において、溶液１〜４は全て同じ結果を示した。これは、本分析のための処理により、各溶液に含まれる化合物が互変異性化を起こし、４つの異性体の混合物となるためと考えられる。
【００４５】
【表１】
【００４６】
図１には、ＨＰＬＣで得られた４番目のピークとＡＴＲＡとを比較したＭＳ分析の結果を示す。これにより、当該化合物の主要なフラグメントパターンは、ＡＴＲＡのパターンと一致することがわかる。
【００４７】
４．化合物の構造決定
４−１．化合物の水素化と分析
上記３で得られた化合物１〜４の混合物、及びパラジウム炭素（触媒）を、乾燥Ｎ2流下、乾燥メタノールに懸濁させた。分割したＮａＢＨ4粉末を、10分間隔で３時間、当該混合物に添加した。水素化の後、当該反応溶液を、38℃、減圧下で蒸発させた。残存物を水に再懸濁し、ＰＳ−１カートリッジアプライした。当該水素化化合物の一部をＬＣ／ＭＳ−ＭＳにより分析した。分析は上記３と同条件で行った。
【００４８】
４−２．化合物のＯ−アセチルメチルエステル化と分析
前記水素化化合物の残部を当業者に周知の方法により、Ｏ−アセチルメチルエステルに変換した。これを、ＧＣ／ＭＳ分析に供した。
【００４９】
ＧＣ／ＭＳ分析はJEOL JMS-700KII Mstationを用いて行った。ＧＣ条件は、カラム： DB-5MS (30mx 0.25mm I.D. Rf, 025mm)；キャリア：Ｈｅ；流速：1.0 ml/分；注入温度：280℃；カラム温度：60℃ (２分保持)から280℃まで、速度8℃／分で温度上昇、とした。ＭＳ条件は、イオン化：ＥＩ；イオン化電流：200 mA；イオン化エネルギー： 38 eV; 加速電圧: 8.0 KV；Ion mult.: 1.0 KV; イオン源真空: 4 x 10-4 Pa；計測管真空: 1.0 x 10-5 Pa；チャンバー温度：200℃とした。
【００５０】
４−３．結果
図２に帰属した結果を示す。この分析により、化合物１〜４は、７位にヒドロキシル基又はオキソ基が付加したレチノイン酸であることがわかった。これにより、化合物１〜４は、下記のケト−エノール互変異性体、及びシス−トランス異性体の４つのいずれかの構造を有することがわかった。
【００５１】
【化６】
【００５２】
５．各７位レチノイン酸誘導体のモル吸光係数の決定
５−１．ＬＣ／ＭＳによる分析
前記化合物１〜４のフォトダイオードアレイ検出（ＤＡＤ）による最大吸収波長（λmax）での面積比率と、ＭＳ分析による面積比率から、各化合物のモル吸光係数（ε）を決定した。
サンプルは化合物１〜４の混合物を用いた。ＬＣ／ＭＳ分析は、ＨＰＬＣ(Shimadzu LC10 Avp)（カラム：Zorbax Eclipse Pluse C18 (i.d. 2.1 x 50 mm,1.8 mm)、グラジエント条件：0.2％酢酸及びメタノール、流速0.3 mL/分）及び四重極型質量分析器（ＱＭＳ）（Shimadzu LCMS 2010A）からなるシステムを用いて行った。ＭＳ条件は、イオン化：ＥＳＩ；極性：ネガティブ；ネブライザー：1.5Lmin-1(Ｎ2)；乾燥気体：0.1Mpa (Ｎ2)；質量範囲（mass range）0.5スキャン/秒で180〜500 m/z；選択イオンモニタリング（ＳＩＭ)：315 m/z (Ｍ−Ｈ)-（７−ヒドロキシレチノイン酸）、299 m/z (Ｍ−Ｈ)- (レチノイン酸）とした。
【００５３】
５−２．結果
結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
ＡＴＲＡのλmax及びモルεは、それぞれ356nm及び45,000であることより、上記の結果から、表１の化合物１〜４の構造を以下の通り決定した。
【００５６】
【表３】
【００５７】
上記化合物１〜４の混合物は、スピルリナ及びミクロキスティス・エルギノーサの乾燥細胞50 gから、それぞれ3.5 g及び2.5 g作製することができた。
【００５８】
実施例２．化合物の製造方法（合成）
レチノイン酸（東京化成工業）を三フッ化ホウ素１４％を含むメタノールに溶解し、70℃、30分加熱する。反応液に水を加えてｎ−ヘキサンで抽出すると、メチルエステルが得られる。当該レチノイン酸メチルエステルを、ジクロロメタン中で二酸化マンガンを用いて酸化し、１−メチルエステル−７−オキソレチノイン酸を得る。これをＨＰＬＣ（shimadzu LC6AD）（カラム：Mightysil ODS, 20mmφ x300 mmＬ、条件：移動相50 mM リン酸緩衝液（ｐＨ3.0）７５％ＭｅＯＨ、流速 14ｍＬ/min）で分離する。得られる化合物は、１−メチルエステル−７−ヒドロキシレチノイン酸又は１−メチルエステル−７−オキソレチノイン酸の混合物となる。必要に応じて、メチルエステル部分をＮａＢＨ4で還元してもよい。
【００５９】
実施例３．活性測定
方法
イースト・ツーハイブリッド・アッセイ（Yeast Two-Hybrid Assay）
イースト・ツーハイブリッド・レチノイン酸活性アッセイには、ヒトＲＡ（レチノイン酸）受容体ＲＡＲ又はＲＸＲ、及び活性化補助因子ＴＩＦ２を誘導する、組み換え酵母細胞（サッカロマイセス・セルビサエ（Saccharomyces cervisae）Ｔ１９０）を用いた。化学発光性レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を用いた。β−ガラクトシダーゼの基質であるＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトシド）を、β−ガラクトシダーゼが分解して黄色のｏ−ニトロフェノールを生成する。このサンプル中のｏ−ニトロフェノールを420nmの吸光度を測定することにより定量した。
【００６０】
結果
当該化合物１〜４の混合物は、ＡＴＲＡの活性の１／２であった。
【００６１】
実施例４．光安定性試験
方法
本発明の化合物１〜４の混合物及びＡＴＲＡ（コントロール）を、濃度70 ng/mlの溶液とした。溶液はｐＨ条件の異なる３種類を用意し、それぞれ10％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する、0.1％酢酸水溶液（ｐＨ3.3）、10 mM リン酸バッファ（ｐＨ7.4）及び0.1％トリエチルアミン水溶液（ｐＨ11.1）に溶解させることにより調製した。各溶液（0.2 ml）を、Pyrex試験管に移し窒素ガス流を流し込んだ。テフロン（登録商標）ライニングねじ付キャップで密閉後、当該試験管を蛍光灯下60分暴露させた。紫外線強度計（ＵＶＲ−３００, Topcon）で測定したＵＶ−Ａエネルギーは、暴露容器表面で1.0μＷ／cm2であった。暴露後すぐに、暴露したサンプルのＲＡＲアゴニスト活性を、イースト・ツーハイブリッド・アッセイを用いて評価した。
【００６２】
結果
光安定性試験の結果を図３に示す。本発明の化合物１〜４の混合物は、ｐＨ 11.1の溶液中、60分蛍光灯暴露後の残存活性が75％であったのに対して、同条件でのＡＴＲＡ（コントロール）の残存活性は29％であった。残存活性はｐＨに依存するが、全てのｐＨ条件において、本発明の化合物１〜４の混合物はＡＴＲＡより高い残存活性を示した。
【００６３】
実施例５．処方例
以下の組成の美白用ゲルを作製した。
【００６４】
【表４】
【００６５】
以下の組成の美白用液体を作製した。
【００６６】
【表５】
【００６７】
以下の組成の錠剤を作製した。
【００６８】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光安定性の高い、新規な７位レチノイン酸誘導体、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイン酸は、ビタミンＡ（レチノール）の誘導体であるレチノイドの１つで、オールトランスレチノイン酸（トレチノイン、ＡＴＲＡ（all trans retinoic acid））や９−シス−レチノイン酸（特許文献１）、１３−シス−レチノイン酸（特許文献２）等の立体異性体の存在が知られている。
【０００３】
この中でもＡＴＲＡは、転写因子として機能する核受容体の１つであるＲＡＲの天然リガンドであり、ＡＴＲＡが当該受容体に結合することにより、細胞の増殖、分化、アポトーシス、及び悪性形質転換、機能性ペプチド及びタンパク質の遺伝子発現及び合成が制御される。このため、レチノイン酸及びその類似体は、悪性腫瘍や乾癬の治療に用いられるほか、皮膚科学領域ではニキビや光老化治療薬として利用されている。
【０００４】
また、レチノイン酸及びその類似体は、ＵＶに弱く不安定である。このため製造時（合成時）には光を遮断する措置が必要となり、操作が煩雑である。また薬剤に配合した場合は、冷暗所に保存しても１ヶ月程度での使い切りが推奨されるように、有効期限が非常に短く、保存時に特別の注意を要する点が問題となっている。
【０００５】
これに対し、薬剤の有効期限を延長する対処法として、薬剤におけるレチノイン酸の初期濃度を高濃度に設定することも考えられる。しかしながら、レチノイン酸は外用により、紅斑、落屑、乾燥等の皮膚炎（レチノイド皮膚炎）や、多用による催奇形性などの副作用の発生が知られており（非特許文献２）、レチノイン酸を過度に高濃度で含有する処方には問題がある。
【０００６】
レチノイン酸の光安定性を向上させるため、従来はレチノイン酸又はレチノイン酸誘導体を含有する組成物に、シクロデキストリン（特許文献３）又はフラーレン（特許文献４）等を配合し、光による分解を抑制する対処法がとられていた。しかしながら、上記のような他の成分を混合すると、製剤化における工程が増え、操作が煩雑になる。他の成分で補助することなく、レチノイン酸又はレチノイン酸誘導体自体の光安定性を向上させる試みはこれまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許３６３１２５９号公報
【特許文献２】特許４４１８０４８号公報
【特許文献３】特開２００８−１０６０４１号公報
【特許文献４】特開２００９−２６９９１５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】菊池克子：レチノイド外用、MB Derma、67, p. 21-28 (2002)
【非特許文献２】漆畑修：皮膚の抗老化最前線、株式会社エヌ・ティー・エス、p. 463-472、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来のレチノイン酸及びその類似体と比較して光安定性が高く、且つ活性に優れた、新規なレチノイン酸誘導体、及びそれらを効率的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、藻類から７位レチノイン酸誘導体を得ることに成功した。検討の結果、当該誘導体は、レチノイン酸と比較して光安定性に優れ、活性も良好な、新規な誘導体であることを見出し、本発明を為すに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は下記に関する。
（１）下記式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ1は、−ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ2、−ＣＯＮＨＲ2、−ＣＯＮＲ2Ｒ3、−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ、及び−ＣＨ2ＯＲ4からなる群から選択され、
Ｒ2及びＲ3は、各々独立に、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、好ましくはＣ1−Ｃ7アルキル基、より好ましくはＣ1−Ｃ4アルキル基であるか、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルケニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルケニル基であるか、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルキニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルキニル基であり、
Ｒ4は、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、好ましくはＣ1−Ｃ7アルキル基、より好ましくはＣ1−Ｃ4アルキル基であるか、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルケニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルケニル基であるか、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルキニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルキニル基であるか、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アシル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アシル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アシル基であり、
Ｘは、以下の
【化２】
からなる群から選択され、
Ｒ5は、同一でも異なってもよく、各々独立に、水素、−ＯＨ、−ＯＲ6、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニルであり、
ｎは、１〜３の整数であり、
Ｒ6は、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、好ましくはＣ1−Ｃ7アルキル基、より好ましくはＣ1−Ｃ4アルキル基であるか、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルケニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルケニル基であるか、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アルキニル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アルキニル基であるか、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アシル基、好ましくはＣ2−Ｃ7アシル基、より好ましくはＣ2−Ｃ4アシル基であり、
Ｘのシクロヘキセン環は、当該環の３位と４位、又は４位と５位の間に二重結合を形成してもよい）
の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩。
【００１２】
（２）また本発明は、下記（Ｉ１〜Ｉ４）
【化３】
から選択される７位レチノイン酸誘導体を獲得するための方法であって、当該誘導体を藻類から抽出する工程を含んでなる方法に関する。
【００１３】
（３）また本発明は、前記７位レチノイン酸誘導体又はその塩を含んでなる医薬組成物、化粧組成物、食用組成物又は殺有害生物組成物に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、従来のレチノイン酸及びその類似体と比較して光安定性が高く、且つ活性に優れた、新規なレチノイン酸誘導体を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の７位レチノイン酸誘導体とオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）とを比較したＭＳ分析の結果を示す。
【図２】図２は、ＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ及びＧＣ／ＭＣの結果に対する、本発明の７位レチノイン酸誘導体の帰属を示す。これによりレチノイン酸の７位にヒドロキシル基が付加していることが示される。
【図３】図３は、本発明の７位レチノイン酸誘導体と、レチノイン酸（コントロール）の光安定性を比較した試験の結果を示す。初期の活性を100％とし、ＵＶを照射した場合の残存活性の経時変化を示す。全てのｐＨ条件（酸性、中性及びアルカリ性）で本発明の化合物がレチノイン酸より高い光安定性を有することが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明で使用される、アルキル、アルケニル、アルキニル及びアシル基に関する「未置換又は置換された」なる用語は、これらの基が未置換であるか、または１個以上のハロゲン原子もしくは直鎖型もしくは分岐型の（Ｃ1−Ｃ16）アルコキシ基、ヒドロキシ、メルカプト、アルキルチオ、シアノ、(任意に、１もしくは２個の（Ｃ1−Ｃ6）アルキル基によって置換された）アミノ、ニトロ、カルボキシ、ホルミル、アルコキシカルボニル、(任意に、１または２個の直鎖型もしくは分岐型の（Ｃ1−Ｃ6）アルキル基によって置換された）アミノカルボニル、およびカルバモイル基によって置換されることを意味する。
【００１７】
本発明で使用される「アルキル基」なる用語は、好ましくは直鎖型もしくは分岐型のアルキル基のことを言う。
【００１８】
本発明で使用される「アルケニル基」なる用語は、好ましくは直鎖型もしくは分岐型のアルケニル基のことを言う。
【００１９】
本発明で使用される「アルキニル基」なる用語は、好ましくは直鎖型もしくは分岐型のアルケニル基のことを言う。
【００２０】
式（Ｉ）の化合物において、好ましくはＲ1は、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ及び−ＣＨ2ＯＨから選択される基である。より好ましくは、Ｒ1は−ＣＯＯＨである。
【００２１】
好ましいＸは、Ｒ5が、水素、−ＯＨ、−ＯＲ6（Ｒ6は前記の通りである）、メチル及びエチルから選択される。
【００２２】
最も好ましいＸは、
【化４】
から選択される。
【００２３】
式（Ｉ）の７位レチノイン酸誘導体の中でも、下記の誘導体はより一層好ましい。
【化５】
【００２４】
前記式（Ｉ１〜Ｉ４）の７位レチノイン酸誘導体は、当該４つの誘導体から選択される少なくとも２つからなる混合物として存在してもよい。好ましくは、４つの誘導体から選択される少なくとも３つからなる混合物であり、より好ましくは、４つの混合物として存在する。
【００２５】
塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、ホスホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、樟脳酸、シュウ酸等の酸との塩がある。また、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、第三ブチルアミン等の塩基との塩がある。
【００２６】
式（Ｉ）に示される不飽和基の二重結合は概して全てがＥ配置を有するが、本発明は二重結合の全てまたは一部分のみがＺ配置である式（Ｉ）の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩にも関する。
【００２７】
本発明で使用される「異性体」なる用語は、幾何異性体、光学的異性体又は互変異性体を意味する。本発明は、当該異性体及び互変異性体、及びそれらのあらゆる比率での混合物の全てを包含する。
【００２８】
特定の理論に限定されるものではないが、本発明の新規な７位レチノイン酸誘導体は、７位がヒドロキシ化又はオキソ化されるため、従来のレチノイン酸及びレチノイン酸誘導体が有する共役系が遮断され、光安定性が向上していると考えられる。
【００２９】
さらに、特定の理論に限定されるものではないが、本発明の新規な７位レチノイン酸誘導体は、互変異性を起こし、常に混合物として存在することで光安定性の向上に貢献する可能性もある。
【００３０】
本発明の新規な７位レチノイン酸誘導体の製造方法において使用される藻類には、藍藻類、原核緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クリプト藻類、渦鞭毛藻類、黄金色藻類、珪藻類、褐藻類、黄緑藻類、ハプト藻類、ラフィド藻類（緑色鞭藻類）、クロララクニオン藻類、ミドリムシ藻類、プラシノ藻類、緑藻類、車軸藻類などがあり、好ましくは、藍藻類が使用される。藍藻類の中で最も好ましいものは、スピルリナ（Spirulina sp）及びミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）である。
【００３１】
本発明で使用する藻類は、例えば国立環境研究所から入手可能であり、特にスピルリナ原末についてはＤＩＣライフテック株式会社等から市販されている。
【００３２】
特に、スピルリナは増殖速度が非常に速い藍藻類であり、培養は、幅広い条件（ｐＨ 7〜10、温度 20〜30℃）で行うことができ、野外での培養も世界各国行われていることから、工業的利用に適する。前記新規な７位レチノイン酸誘導体は、このスピルリナ及びミクロキスティスから生産できるために、従来の合成法と比較して生産効率が高く、且つコストを抑えることができる。
【００３３】
本発明の７位レチノイン酸誘導体を藻類から製造する場合、藻類を培養した後、遠心分離又はフィルター等を用いる濾過により培養物を回収し、脱水濃縮し、乾燥サンプルとする。当該乾燥サンプルから目的物を溶媒により抽出する。当該溶媒の例としては、水、アルコール、エーテル、石油エーテル、ベンゼン、酢酸エチル、クロロホルム等が挙げられる。好ましくは溶媒はアルコールであり、好ましくは、メタノール又はエタノールである。抽出物から溶媒を除去した後、残存物を適切な溶液に溶解させ、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）等により単離することにより、本発明の７位レチノイン酸誘導体を得ることができる。
【００３４】
本発明の７位レチノイン酸誘導体は、有機化学合成によって得ることもできる。例えば、レチノイン酸メチルエステル（市販品であっても、当業者に既知の方法により作製してもよい）を、ジクロロホルム（ＤＣＭ）中で酸化させることにより、７−オキソレチノイン酸メチルエステルを得ることができる。逆相ＨＰＬＣ等で分離精製後、必要に応じて還元することにより７−オキソレチノイン酸を得てもよい。
【００３５】
本発明の７位レチノイン酸誘導体は、それ自身単独で、又は他の成分と組み合わせて使用することができる。好ましくは、当該７位レチノイン酸誘導体は、医薬組成物、化粧組成物、食用組成物又は殺有害生物組成物に配合して使用することができる。
【００３６】
医薬組成物、化粧組成物又は食用組成物は、創傷、荒れ肌やきめの粗さ、肌のはりの低減、しわ、色素沈着などの乾燥、紫外線、活性酸素及び老化による皮膚障害、乾癬、苔癬、魚鱗癬、角化症、ダリエ症等の皮膚角化異常症、膿疱症、座瘡、湿疹、アトピー性皮膚炎等の皮膚疾患、脱毛症、口腔粘膜の損傷、歯周病等の口腔疾患、ドライアイ、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症等の眼疾患、口腔乳頭腫、乳頭腫ウイルス関連疾患、消化器潰瘍等の腫瘍、カポジ肉腫等の悪性腫瘍、口腔白斑病、皮膚癌、乳癌、胃癌、白血病等の前癌症状、並びに癌、関節炎、大腸炎、腎炎等の炎症性疾患、紅斑性狼瘡、全身性エリスマトーデス、遅延型過敏症、臓器移植拒絶等の免疫性疾患、脂血症、アテローム性動脈硬化症等の循環器系疾患、子宮内膜過形成、良性前立腺肥大などの非悪性過増殖性疾患、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患、成長ホルモン分泌低下などの下垂体機能異常、アポトーシス調整異常などに関連する症状又は疾患を予防及び／又は治療するために使用することができる。前記疾患及び障害の予防及び／又は治療は、他の治療法、例えば、外科的療法、レーザー療法、化学療法、薬物療法等と組み合わせて行ってもよい。本発明の新規な７位レチノイン酸誘導体の具体的な適用例としては、例えば、化粧水、乳液、美容クリーム、美容液、化粧下地、ハンドクリーム、ファンデーション、仕上げ用パウダー、パック剤、マスク、貼付剤、洗顔料、クレンジング剤、日焼け止め、日焼け処置剤、ボディーソープ、リンス、シャンプー、育毛剤、養毛剤、整髪料、入浴剤、制汗剤、点眼剤、コンタクトレンズ装着液、洗口剤、健康食品、サプリメント、ビタミン剤、ドリンク剤等が挙げられる。剤型としては、錠剤、顆粒剤、粉末、トローチ、貼付剤、クリーム、溶液、エマルション、ゲル剤、軟膏、ゼリー剤、注射液等が挙げられる。
【００３７】
殺有害生物組成物は、虫、ダニ、線虫及び軟体動物等の有害生物（以下、単に「有害生物」と言う）を防除及び駆除するために、有害生物及び有害生物の生育場所に施用して使用することができる。剤型としては、粉剤、粒剤、水和剤、水溶剤、乳剤、液剤、油剤、エアロゾル、マイクロカプセル剤、ペースト剤、くん煙剤、塗布剤、スプレー剤等が挙げられる。
【００３８】
本発明の新規な７位レチノイン酸誘導体の他に、前記組成物に配合するものとしては、他の活性成分、賦形剤等がある。他の活性成分としては、ハイドロキノン、コエンザイムＱ１０、アスコルビン酸等が挙げられる。賦形剤としては、水、アルコール等の溶媒、界面活性剤、植物油、鉱物油等の油、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、保湿剤、分散剤、ｐＨ調整剤、紫外線防止剤、着色剤、香料等が挙げられる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００４０】
実施例１．化合物の製造（藻類からの抽出）
（１）原料
藍藻類である、スピルリナ（Spirulina sp.）（ＴＵ−３）（国立環境研究所から入手）及びミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）（ＮＩＥＳ−８８）（国立環境研究所から入手）を用意した。
レチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、Aldrich Chemicalsから入手した。
ＭＡ培地は、Ｃａ（ＮＯ3）2・4Ｈ2Ｏ（5mg）、ＫＮＯ3（10 mg）、ＮａＮＯ3（5mg）、ＭｇＣｌ2・6Ｈ2Ｏ（5 mg）、Ｎａ2ＳＯ4（4 mg）、β-グリセロリン酸ナトリウム五水和物（10 mg）、Ｎａ2ＥＤＴＡ（0.5 mg）、ＦｅＣｌ3・6Ｈ2Ｏ（0.05 mg）、ＭｎＣｌ2・4Ｈ2Ｏ（0.5 mg）、ＺｎＣｌ2（0.05 mg）、ＣｏＣｌ3・6Ｈ2Ｏ（0.5 mg）、Ｎａ2ＭｏＯ4・2Ｈ2Ｏ（0.08 mg）、Ｈ3ＢＯ3（2 mg）、Bicine（50 mg）を、100 mlの蒸留水に溶解させて作製した（ｐＨ8.6）。
【００４１】
（２）方法
１．培養
スピルリナ（ＴＵ−３）又はミクロキスティス・エルギノーサ（ＮＩＥＳ−８８）を、25℃、24mE/m2・sの条件下で４週間、ＭＡ培地において培養した。培養後、細胞を遠心分離及び凍結乾燥により回収した。当該凍結乾燥サンプルは、使用するまで−30℃で保存した。
２．抽出及び精製
前記乾燥サンプルにメタノールを加え、抽出物を得た。当該抽出物を、38℃、減圧下で乾燥させ、残存した固体をジクロロメタン（ＤＣＭ）に懸濁した。当該懸濁物中の不溶性物質を、2,500 rpmで遠心分離することにより除去した。次に、フロリジルカートリッジ（60 gのフロリジル）にこの上清をアプライした。当該カートリッジを、200 mLのＤＣＭで洗浄後、10％アセトン含有ＤＣＭ及びメタノールを前記カートリッジにアプライし、メタノール溶出により溶出物を得た。この溶出液を蒸発させ、クロロホルムに再懸濁した。当該クロロホルム溶液を、シリカゲルカラムにアプライし、２％メタノール含有クロロホルムで溶出した。当該溶出液の溶媒を除去した後、残存物を、調製用ＨＰＬＣに供した（カラム：Mightysil ODSカラム（i.d.20 x 250mm, 5mm）、移動相：メタノール含有の25％リン酸バッファ（50 mM, pH3.0）、流速：14 mL/分）。溶出プロファイルを、フォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）（Agilent DAD）でモニターした。この結果、保持時間15〜25分の間に４つのピークが観察され、それぞれを分取した（溶液１〜４）。
【００４２】
３．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる抽出化合物の分析
前記分取した各溶液（溶液１〜４）中のリン酸バッファを、スチレンポリマーカートリッジ（ＰＳ−１）を用いて除去した後、各溶液をＬＣ／ＭＳ−ＭＳで分析した。比較のために、ＡＴＲＡを同様に処理し、分析した。
【００４３】
ＬＣ／ＭＳ−ＭＳは、ＨＰＬＣ（Agilent 1200）（カラム：Zorbax Eclipse Pluse C18 （i.d. 2.1 x 50 mm,1.8 mm）、グラジエント条件：0.2％酢酸及びメタノール、流速0.3 mL/分）及びAgilent 6520 Ｑ−ＴＯＦからなるシステムを用いて分析した。ＭＳ条件は、イオン化：ESI；ネブライザー（Nebulizer） 50 psi(Ｎ2)、乾燥気体：10L/分、350℃（Ｎ2）；Ｖcap：5000V、フラグメンター（Fragmentor）：100V；スキャン（Scan）：100〜1000 m/z； 計測回数／スキャン/：10,000；参照基準（References）：121.0509及び922.0098 m/z；衝突エネルギー：15〜30 eVとした。
【００４４】
ＨＰＬＣでは保持時間3.7〜7.7分の間に４つのピークが現れた（化合物１〜４とする）。表１に化合物１〜４のＭＳ分析の結果を示す。本分析において、溶液１〜４は全て同じ結果を示した。これは、本分析のための処理により、各溶液に含まれる化合物が互変異性化を起こし、４つの異性体の混合物となるためと考えられる。
【００４５】
【表１】
【００４６】
図１には、ＨＰＬＣで得られた４番目のピークとＡＴＲＡとを比較したＭＳ分析の結果を示す。これにより、当該化合物の主要なフラグメントパターンは、ＡＴＲＡのパターンと一致することがわかる。
【００４７】
４．化合物の構造決定
４−１．化合物の水素化と分析
上記３で得られた化合物１〜４の混合物、及びパラジウム炭素（触媒）を、乾燥Ｎ2流下、乾燥メタノールに懸濁させた。分割したＮａＢＨ4粉末を、10分間隔で３時間、当該混合物に添加した。水素化の後、当該反応溶液を、38℃、減圧下で蒸発させた。残存物を水に再懸濁し、ＰＳ−１カートリッジアプライした。当該水素化化合物の一部をＬＣ／ＭＳ−ＭＳにより分析した。分析は上記３と同条件で行った。
【００４８】
４−２．化合物のＯ−アセチルメチルエステル化と分析
前記水素化化合物の残部を当業者に周知の方法により、Ｏ−アセチルメチルエステルに変換した。これを、ＧＣ／ＭＳ分析に供した。
【００４９】
ＧＣ／ＭＳ分析はJEOL JMS-700KII Mstationを用いて行った。ＧＣ条件は、カラム： DB-5MS (30mx 0.25mm I.D. Rf, 025mm)；キャリア：Ｈｅ；流速：1.0 ml/分；注入温度：280℃；カラム温度：60℃ (２分保持)から280℃まで、速度8℃／分で温度上昇、とした。ＭＳ条件は、イオン化：ＥＩ；イオン化電流：200 mA；イオン化エネルギー： 38 eV; 加速電圧: 8.0 KV；Ion mult.: 1.0 KV; イオン源真空: 4 x 10-4 Pa；計測管真空: 1.0 x 10-5 Pa；チャンバー温度：200℃とした。
【００５０】
４−３．結果
図２に帰属した結果を示す。この分析により、化合物１〜４は、７位にヒドロキシル基又はオキソ基が付加したレチノイン酸であることがわかった。これにより、化合物１〜４は、下記のケト−エノール互変異性体、及びシス−トランス異性体の４つのいずれかの構造を有することがわかった。
【００５１】
【化６】
【００５２】
５．各７位レチノイン酸誘導体のモル吸光係数の決定
５−１．ＬＣ／ＭＳによる分析
前記化合物１〜４のフォトダイオードアレイ検出（ＤＡＤ）による最大吸収波長（λmax）での面積比率と、ＭＳ分析による面積比率から、各化合物のモル吸光係数（ε）を決定した。
サンプルは化合物１〜４の混合物を用いた。ＬＣ／ＭＳ分析は、ＨＰＬＣ(Shimadzu LC10 Avp)（カラム：Zorbax Eclipse Pluse C18 (i.d. 2.1 x 50 mm,1.8 mm)、グラジエント条件：0.2％酢酸及びメタノール、流速0.3 mL/分）及び四重極型質量分析器（ＱＭＳ）（Shimadzu LCMS 2010A）からなるシステムを用いて行った。ＭＳ条件は、イオン化：ＥＳＩ；極性：ネガティブ；ネブライザー：1.5Lmin-1(Ｎ2)；乾燥気体：0.1Mpa (Ｎ2)；質量範囲（mass range）0.5スキャン/秒で180〜500 m/z；選択イオンモニタリング（ＳＩＭ)：315 m/z (Ｍ−Ｈ)-（７−ヒドロキシレチノイン酸）、299 m/z (Ｍ−Ｈ)- (レチノイン酸）とした。
【００５３】
５−２．結果
結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
ＡＴＲＡのλmax及びモルεは、それぞれ356nm及び45,000であることより、上記の結果から、表１の化合物１〜４の構造を以下の通り決定した。
【００５６】
【表３】
【００５７】
上記化合物１〜４の混合物は、スピルリナ及びミクロキスティス・エルギノーサの乾燥細胞50 gから、それぞれ3.5 g及び2.5 g作製することができた。
【００５８】
実施例２．化合物の製造方法（合成）
レチノイン酸（東京化成工業）を三フッ化ホウ素１４％を含むメタノールに溶解し、70℃、30分加熱する。反応液に水を加えてｎ−ヘキサンで抽出すると、メチルエステルが得られる。当該レチノイン酸メチルエステルを、ジクロロメタン中で二酸化マンガンを用いて酸化し、１−メチルエステル−７−オキソレチノイン酸を得る。これをＨＰＬＣ（shimadzu LC6AD）（カラム：Mightysil ODS, 20mmφ x300 mmＬ、条件：移動相50 mM リン酸緩衝液（ｐＨ3.0）７５％ＭｅＯＨ、流速 14ｍＬ/min）で分離する。得られる化合物は、１−メチルエステル−７−ヒドロキシレチノイン酸又は１−メチルエステル−７−オキソレチノイン酸の混合物となる。必要に応じて、メチルエステル部分をＮａＢＨ4で還元してもよい。
【００５９】
実施例３．活性測定
方法
イースト・ツーハイブリッド・アッセイ（Yeast Two-Hybrid Assay）
イースト・ツーハイブリッド・レチノイン酸活性アッセイには、ヒトＲＡ（レチノイン酸）受容体ＲＡＲ又はＲＸＲ、及び活性化補助因子ＴＩＦ２を誘導する、組み換え酵母細胞（サッカロマイセス・セルビサエ（Saccharomyces cervisae）Ｔ１９０）を用いた。化学発光性レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を用いた。β−ガラクトシダーゼの基質であるＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトシド）を、β−ガラクトシダーゼが分解して黄色のｏ−ニトロフェノールを生成する。このサンプル中のｏ−ニトロフェノールを420nmの吸光度を測定することにより定量した。
【００６０】
結果
当該化合物１〜４の混合物は、ＡＴＲＡの活性の１／２であった。
【００６１】
実施例４．光安定性試験
方法
本発明の化合物１〜４の混合物及びＡＴＲＡ（コントロール）を、濃度70 ng/mlの溶液とした。溶液はｐＨ条件の異なる３種類を用意し、それぞれ10％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する、0.1％酢酸水溶液（ｐＨ3.3）、10 mM リン酸バッファ（ｐＨ7.4）及び0.1％トリエチルアミン水溶液（ｐＨ11.1）に溶解させることにより調製した。各溶液（0.2 ml）を、Pyrex試験管に移し窒素ガス流を流し込んだ。テフロン（登録商標）ライニングねじ付キャップで密閉後、当該試験管を蛍光灯下60分暴露させた。紫外線強度計（ＵＶＲ−３００, Topcon）で測定したＵＶ−Ａエネルギーは、暴露容器表面で1.0μＷ／cm2であった。暴露後すぐに、暴露したサンプルのＲＡＲアゴニスト活性を、イースト・ツーハイブリッド・アッセイを用いて評価した。
【００６２】
結果
光安定性試験の結果を図３に示す。本発明の化合物１〜４の混合物は、ｐＨ 11.1の溶液中、60分蛍光灯暴露後の残存活性が75％であったのに対して、同条件でのＡＴＲＡ（コントロール）の残存活性は29％であった。残存活性はｐＨに依存するが、全てのｐＨ条件において、本発明の化合物１〜４の混合物はＡＴＲＡより高い残存活性を示した。
【００６３】
実施例５．処方例
以下の組成の美白用ゲルを作製した。
【００６４】
【表４】
【００６５】
以下の組成の美白用液体を作製した。
【００６６】
【表５】
【００６７】
以下の組成の錠剤を作製した。
【００６８】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ1は、−ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ2、−ＣＯＮＨＲ2、−ＣＯＮＲ2Ｒ3、−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ、及び−ＣＨ2ＯＲ4からなる群から選択され、
Ｒ2及びＲ3は、各々独立に、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基であり、
Ｒ4は、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アシル基であり、
Ｘは、以下の
【化２】
からなる群から選択され、
Ｒ5は、同一でも異なってもよく、各々独立に、水素、−ＯＨ、−ＯＲ6、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニルであり、
ｎは、１〜３の整数であり、
Ｒ6は、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アシル基であり、
Ｘのシクロヘキセン環は、当該環の３位と４位、又は４位と５位の間に二重結合を形成してもよい）
の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩。
【請求項２】
Ｒ1が、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ及び−ＣＨ2ＯＨから選択される基である、請求項１に記載の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩。
【請求項３】
Ｒ5が、水素、−ＯＨ、−ＯＲ6（Ｒ6は請求項１に定義の通りである）、メチル及びエチルから選択される、請求項１又は２に記載の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩。
【請求項４】
Ｘが、
【化３】
から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩。
【請求項５】
式（Ｉ）の７位レチノイン酸誘導体が、
【化４】
から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の７位レチノイン酸誘導体。
【請求項６】
下記（Ｉ１〜Ｉ４）
【化５】
から選択される７位レチノイン酸誘導体を獲得するための方法であって、当該誘導体を藻類から抽出する工程を含んでなる方法。
【請求項７】
前記７位レチノイン酸誘導体が、式Ｉ１〜Ｉ４から選択される少なくとも２つの混合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記藻類が、スピルリナ（Spirulina sp.）又はミクロキスティス（Microcystis sp.）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の７位レチノイン酸誘導体又はその塩を含んでなる医薬組成物、化粧組成物、食用組成物又は殺有害生物組成物。
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ1は、−ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ2、−ＣＯＮＨＲ2、−ＣＯＮＲ2Ｒ3、−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ、及び−ＣＨ2ＯＲ4からなる群から選択され、
Ｒ2及びＲ3は、各々独立に、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基であり、
Ｒ4は、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アシル基であり、
Ｘは、以下の
【化２】
からなる群から選択され、
Ｒ5は、同一でも異なってもよく、各々独立に、水素、−ＯＨ、−ＯＲ6、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニルであり、
ｎは、１〜３の整数であり、
Ｒ6は、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ1−Ｃ16アルキル基、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルケニル基、直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アルキニル基、又は直鎖型又は分岐型の未置換又は置換されたＣ2−Ｃ16アシル基であり、
Ｘのシクロヘキセン環は、当該環の３位と４位、又は４位と５位の間に二重結合を形成してもよい）
の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩。
【請求項２】
Ｒ1が、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ及び−ＣＨ2ＯＨから選択される基である、請求項１に記載の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩。
【請求項３】
Ｒ5が、水素、−ＯＨ、−ＯＲ6（Ｒ6は請求項１に定義の通りである）、メチル及びエチルから選択される、請求項１又は２に記載の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩。
【請求項４】
Ｘが、
【化３】
から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の７位レチノイン酸誘導体、又はその塩。
【請求項５】
式（Ｉ）の７位レチノイン酸誘導体が、
【化４】
から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の７位レチノイン酸誘導体。
【請求項６】
下記（Ｉ１〜Ｉ４）
【化５】
から選択される７位レチノイン酸誘導体を獲得するための方法であって、当該誘導体を藻類から抽出する工程を含んでなる方法。
【請求項７】
前記７位レチノイン酸誘導体が、式Ｉ１〜Ｉ４から選択される少なくとも２つの混合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記藻類が、スピルリナ（Spirulina sp.）又はミクロキスティス（Microcystis sp.）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の７位レチノイン酸誘導体又はその塩を含んでなる医薬組成物、化粧組成物、食用組成物又は殺有害生物組成物。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２０１１−２５１９４２（Ｐ２０１１−２５１９４２Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２７１５５（Ｐ２０１０−１２７１５５）
【出願日】平成２２年６月２日（２０１０．６．２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＲＥＸ
【出願人】（５１０１５４０３９）株式会社新産業創造研究所 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２日（２０１０．６．２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＲＥＸ
【出願人】（５１０１５４０３９）株式会社新産業創造研究所 (3)
【Ｆターム（参考）】
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