ＣＨＫ１阻害に有用なヘテロアリール尿素誘導体
ＤＮＡ複製におけるＤＮＡ損傷又は傷害に関連する疾病及び症状の治療に有用な置換ウレア化合物が開示される。この化合物の作製方法、並びに癌及びＤＮＡ複製、染色体分離、又は細胞分裂における欠陥によって特徴付けられる他の疾病の治療等における治療薬としての使用も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝物質の完全性を維持及び修復する酵素を阻害するために有用な化合物に関する。更に詳細には、本発明は、一連のアリール置換及びヘテロアリール置換尿素化合物、当該化合物の製造方法、並びに例えば、癌、及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）複製、染色体分離、又は細胞分裂の欠陥により特徴付けられる他の疾患の治療における治療剤としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な疾患、症状、及び障害（以下「適応症」）は、異常に増殖している細胞の関与により特徴付けられる。本明細書で用いる場合、「異常に増殖している細胞」（又は「異常な細胞増殖」）とは、正常の、適切な、又は予測される経過から逸脱した細胞増殖を意味する。例えば、異常な細胞増殖には、ＤＮＡもしくは他の細細胞成分が損傷を受けているか又は欠損している、細胞の不適切な増殖が含まれる。異常な細胞増殖はまた、不適切に高レベルの細胞分裂、不適切に低レベルの細胞死（例えば、アポトーシス）の一方もしくは双方によって引き起こされるか、仲介されるか、又は結果的にこれらの一方もしくは双方をもたらす臨床的適応症も特徴付ける。このような適応症は、例えば、細胞、細胞群又は組織（単一もしくは複数種）の、単一又は複数箇所での局所的異常増殖によって特徴付けることができ、癌性（良性又は悪性）及び非癌性の適応症を含んでいる。
【０００３】
当然ながら、すべての癌（良性及び悪性）に、異常な細胞増殖の何らかの型が関わっている。いくつかの非癌性適応症も、異常な細胞増殖に関わっている。異常な細胞増殖が関わっている非癌性適応症の例として、リウマチ様関節炎、乾癬、白斑、ヴェグナー肉芽腫症、及び全身性狼瘡が挙げられる。
【０００４】
異常に増殖している細胞に関わる適応症を治療する一手法として、ＤＮＡ損傷因子の使用が挙げられる。これらの作用因子は、ＤＮＡ代謝、ＤＮＡ合成、ＤＮＡ転写、及び微小管紡錘体形成等の重要な細胞プロセスを破壊することによって、異常に増殖している細胞を死滅させるように設計されているそれらは、例えば染色体の構造的完全性を乱すＤＮＡへの傷害を導入することによっても操作できる。ＤＮＡ損傷因子は、正常な健常細胞への損傷を最小限にし、異常に増殖している細胞での最大限の損傷及び結果的な細胞死の誘発を試みるように設計及び投与される。
【０００５】
化学療法薬及び放射線を含め、多種多様なＤＮＡ損傷因子が今日までに開発されており、その他のものが開発途中である。残念ながら、異常な細胞増殖に関わる症状を治療する場合のＤＮＡ損傷因子の有効性は、特に癌の治療では望まれるものに至っていない。健常細胞よりも、異常に増殖している細胞に対するこのような作用因子の選択性（場合により、治療係数と称される）は、ごく僅かであることが多い。
【０００６】
更に、あらゆる細胞はＤＮＡ損傷因子に対して相反する目的で働く可能性がある、検出及び修復機構を有している。細胞周期チェックポイントと称されるこのような検出機構は、様々な細胞複製段階の順序を保って、各工程が高い忠実度で実行されることを保証する助けになる（Ｈａｒｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：６２９−６３４ （１９８９）； Ｗｅｉｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ８：６５２ （１９９４））。ＤＮＡ損傷因子によって意図的に誘発された損傷を含むＤＮＡ損傷を細胞が検出すると、所定のシグナル伝達経路が細胞周期チェックポイントを活性化して、細胞複製周期が一時的に停止する（「休止する」）。この休止で、細胞にそれらのＤＮＡを修復する時間が、多くの場合その細胞が生存及び増殖を継続するのに充分な程度にまで与えられる。異常に増殖している細胞の場合、この修復は、このような細胞を死滅させるに足るＤＮＡ損傷を誘発する努力を損なうかもしれないので望ましくない。
【０００７】
例えば、ＧＥＭＺＡＲ（商標名）と称される化学療法薬（ゲムシタビン、即ち２’，２’−ジフロロ−２’−デオキシシチジン）は、合成期にそれ自体をＤＮＡへ組み込むことによってＤＮＡを損傷する。未修復のまま、損傷を受けたＤＮＡは、通常、生命を維持できなくなってしまう。しかし、多くの標的細胞では、不適当に作られた（又はそうでなくとも損傷を受けた）ＤＮＡを細胞周期チェックポイントが検出する。活性化された細胞周期チェックポイントは、損傷を受けたＤＮＡを修復させるのに充分な時間、細胞周期の休止を惹起する。これは、化学療法薬、放射線、及び他の療法剤等のＤＮＡ損傷因子の細胞死滅効果に対する、異常に増殖している細胞の抵抗についての一論法である。
【０００８】
他のＤＮＡ損傷因子は、Ｓ期での休止を腫瘍細胞に引き起こす。腫瘍細胞は、化学療法薬が投与されている間に単にＳ期で休止することにより、特定の化学療法に抵抗することが観察されている。その後、薬物が除去されると直ちにＤＮＡ損傷が修復され、細胞周期休止は停止して、その細胞は細胞周期の残余部分を経過する（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１：１０６５−１０７２， ２００１）。他の療法剤は、Ｇ１及びＧ２を含む他のチェックポイントでの細胞周期休止を引き起こす。従って、様々なＤＮＡ損傷チェックポイントの阻害は、治療により誘発されたＤＮＡ損傷を細胞が修復するのを阻止する助けをし、またＤＮＡ損傷因子に対して標的細胞を増感することが期待される。このような増感は次に、これらの療法の治療係数を高めることが期待される。
【０００９】
細胞周期は、その基本プロセス及びあらゆる真核生物種にわたる調節の態様が、構造的及び機能的に同じである。有糸分裂（体性）細胞周期は、Ｇ１（ギャップ）期、Ｓ（合成）期、Ｇ２（ギャップ）期、及びＭ（有糸分裂）期の４期からなる。Ｇ１、Ｓ、及びＧ２期はまとめて、細胞周期の間期と称される。Ｇ１期の間、細胞の生合成活性は高い率で進行する。Ｓ期は、ＤＮＡ合成開始時に始まり、細胞の核のＤＮＡ内容物が複製されて２つの同一の染色体のセットが形成される時に終結する。
【００１０】
細胞は次いでＧ２期に入り、有糸分裂が開始するまでこれが続く。有糸分裂において、染色体は対合し、分離して２つの新しい核を形成し、そして細胞質分裂が起こり、ここで染色体の２つのセットのうちの一方を含む１つの核を各々受け取る２つの娘細胞へと細胞が分裂する。細胞質分裂でＭ期が終結し、次の細胞周期の間期の開始へと踏み出す。細胞周期事象が進行するシークエンスは、細胞周期事象の開始が前の細胞周期事象の完結に依存するよう、厳密に調節されている。これにより、体性細胞の一世代から次世代への遺伝物質の複製及び分離における忠実度が実現される。
【００１１】
細胞周期チェックポイントは、少なくとも３種の別異のポリペプチドのクラスで構成され、それらが細胞周期シグナル、又は染色体機構の欠損に応答して順次作用することが報告されている（Ｃａｒｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７１：３１４−３１５， １９９６）。第一のクラスは、ＤＮＡ損傷又は細胞周期の異常を検出又は感知するタンパク質のファミリーである。これらの検出子には、Ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ変異型タンパク質（Ａｔｍ）、及びＡｔａｘｉａ−ＴｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａＲａｄ−関連タンパク質（Ａｔｒ）が含まれる。ポリペプチドの第二のクラスは、検出子により検出された信号を増幅して伝達するもので、Ｒａｄ５３（Ａｌｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：２４１６−２４８８、１９９４）及びＣｈｋ１が例示される。ポリペプチドの第三のクラスとしては、細胞性応答、例えば、有糸分裂の休止及びアポトーシスを媒介するｐ５３等の細胞周期エフェクタが挙げられる。
【００１２】
細胞周期チェックポイントの機能の現状での理解は、多くが腫瘍由来細胞系の研究から引き出されている。多くの場合、腫瘍細胞は重要な細胞周期チェックポイントを喪失している（Ｈａｒｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１８２１−２８、１９９４）。細胞の新生物状態への進展において重要な工程は、ｐ５３に関わるもの等細胞周期チェックポイント経路を不活性化する変異の獲得であることが報告されている（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ｃｅｌｌ ８１：３２３−３３０， １９９５； Ｌｅｖｉｎｅ， Ｃｅｌｌ ８８：３２３４−３３１， １９９７）。これら細胞周期チェックポイントの喪失の結果、ＤＮＡの損傷に関わらず腫瘍細胞の複製が引き起こされる。
【００１３】
非癌性組織で完全な細胞周期チェックポイントを有するものは通常、単一のチェックポイント経路の一時的な破壊から逃れられる。しかし、腫瘍細胞は、さらなるチェックポイントの摂動で、ＤＮＡ損傷因子に対して特にそれらを感受性にするように細胞周期の進行を制御する経路に欠陥がある。例えば、変異型ｐ５３を含む腫瘍細胞は、Ｇ１のＤＮＡ損傷チェックポイントと、Ｇ２のＤＮＡ損傷チェックポイントを維持する能力との両方に欠陥がある（Ｂｕｎｚ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１４９７−５０１、１９９８）．Ｇ２チェックポイント又はＳ期チェックポイントの開始を標的とするチェックポイントインヒビタは、これら腫瘍細胞がＤＮＡ損傷を修復する能力を更に無力化することが期待され、従って、放射線及び全身の化学療法の双方の治療係数を高める候補物質である（Ｇｅｓｎｅｒ， Ａｂｓｔｒａｃｔ ａｔ ＳＲＩ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ： Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ Ｓｕｍｍｉｔ， Ｍａｒｃｈ ２００３）。
【００１４】
ＤＮＡ損傷、又はＤＮＡ複製に対する何らかの障害の存在下に、チェックポイントタンパク質Ａｔｍ及びＡｔｒはシグナル伝達系路を始動させて、細胞周期休止へと導く。Ａｔｍは、イオン化放射線（ＩＲ）に応答してＤＮＡ損傷チェックポイントで役割を果たすことが示されている。Ａｔｒは、一本鎖ＤＮＡ破断、二本鎖ＤＮＡ破断を引き起こす作用因子、及びＤＮＡ放射線を遮断する作用因子によって刺激される。
【００１５】
Ｃｈｋ１は、ＤＮＡ損傷チェックポイントシグナル伝達系路においてＡｔｍ及び／又はＡｔｒより下流に位置するプロテインキナーゼである（Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：１４９７−１５０１， １９９７； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，２１８，１０９）。哺乳動物細胞で、Ｃｈｋ１は、イオン化放射線（ＩＲ）、紫外（ＵＶ）光、及びヒドロキシ尿素を含む、ＤＮＡ損傷を引き起こす作用因子に応答してリン酸化される（Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １４：１４４８−１４５９， ２０００）。哺乳動物細胞でＣｈｋ１を活性化するこのリン酸化は、Ａｔｍ （Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １８：２４９−２５６， １９９９） 及びＡｔｒ （Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）に依存性である。更に、Ｃｈｋ１は、細胞周期制御に重要であることが知られている遺伝子産物であるｗｅｅ１（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １６：５４５−５５４， １９９７）及びＰｄｓ１ （Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８６：１１６６−１１７１， １９９９）の双方をリン酸化することが示されている。
【００１６】
これらの研究では、哺乳類Ｃｈｋ１がＡｔｍ依存的ＤＮＡ損傷チェックポイントにおいてＳ期で停止させる役割を果たすことが示されている。Ｓ期哺乳動物細胞におけるＣｈｋ１に対する役割が最近解明され（Ｆｅｉｊｏｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５４：９１３−９２３、２００１；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ、９９：１４７９５−８００、２００２；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７８（２４）：２１７６７−２１７７３、２００３；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、３（３）：２４７−５８、２００３）、ＤＮＡ合成の完全性をモニターする際のＣｈｋ１の役割が強調されている。Ｃｈｋ１は、サイクリンＡ／ｃｄｋ２活性を調節するＣｄｃ２５Ａをリン酸化することによって、Ｓ期の休止を発動する（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．、前出及びＳｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、前出）．Ｃｈｋ１はまた、Ｇ２から有糸分裂へと細胞が進行するにつれて通常はサイクリン−Ｂ／ｃｄｃ２（Ｃｄｋ１としても知られている）を脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼであるＣｄｃ２５Ｃをリン酸化及び不活性化することによって、Ｇ２の休止も発動する（Ｆｅｒｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：１４９５−７， １９９７； Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８２：１８９３−１８９７， １９９８； ａｎｄ Ｂｌａｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ９：１−１０， １９９９）。両方の場合で、Ｃｄｋ活性の調節は細胞周期の休止を誘発し、ＤＮＡ損傷又は未複製ＤＮＡの存在下に細胞が有糸分裂に入るのを阻止する。
【００１７】
細胞周期チェックポイントインヒビタのさらなるクラスは、Ｇ１又はＧ２／Ｍ期のいずれかで作動する。ＵＣＮ−０１、すなわち７−ヒドロキシスタウロスポリンは、元はプロテインキナーゼＣに対してその主要な効果を有する非特異性キナーゼインヒビタとして単離されたが、最近になってＣｈｋ１の活性を阻害すること、及びＧ２細胞周期チェックポイントを抑止することが見出されている（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）。このように、ＵＣＮ−０１は非特異的なＣｈｋ１インヒビタであるため、高用量では細胞に対して毒性である。低用量では、それは非特異的に多くの細胞性キナーゼを阻害し、またＧ１チェックポイントも阻害する（Ｔｅｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ， ３：３５−４６， ２００３）。
【００１８】
ＵＣＮ−０１は、放射線、抗癌剤カンプトセシン（Ｔｅｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、前出）、及びゲムシタビン（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、前出）等の癌治療と組み合わせて用いられているが、その成功には限度がある。更に、ＵＣＮ−０１は、グリア芽腫細胞においてテモゾロマイド（ＴＭＺ）で誘発されるＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）の効果を増強するのに使用されている（Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６１：５８４３−５８４９、２００１）。臨床現場では、ＵＣＮ−０１は期待されるような有効な化学療法薬ではなく、これはおそらく、治療計画の失敗と、特に重要な分子標的の同定がなされていないことに起因している（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｕｐｄａｔｅｓ、６：１５−２６、２００３）．そこで、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．は、ＵＣＮ−０１による、非小細胞肺癌腫培養細胞系における細胞周期依存的なシスプラチンの増強を報告しているが、ＵＣＮ−０１が標的とする重要な細胞周期チェックポイント（単数又は複数種）を、特異性をもって同定していない（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．。
【００１９】
化学療法に影響を及ぼす細胞周期での治療に対して腫瘍細胞を増感させるための戦略が、他にいくつかある。例えば、２−アミノプリンの投与は、ミモシンで誘発されるＧ１休止、又はヒドロキシ尿素で誘発されるＳ期休止等の複数の細胞周期チェックポイント機構を抑止して、その細胞を有糸分裂に移行させてこれを進めることを可能にする（Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８６：２２７２−２２７６， １９９２）。カフェイン、すなわちメチルキサンチンは、Ｇ２チェックポイントの経過進行を媒介することによって、シスプラチン及びイオン化放射線等のＤＮＡ損傷因子の細胞毒性を増強し、これにより細胞死を誘導するために使用されている（Ｂｒａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ３：１３７１−１３８１， １９９７）。しかし、細胞周期抑止を成し遂げるために用いられるカフェインの用量は、臨床的に容認できるレベルを超えており、これは実行可能な療法の選択肢にならない。更に、Ｃｈｋ１キナーゼに対するアンチセンスヌクレオチドが、トポイソメラーゼインヒビタＢＮＰ１３５０に対する感度を増大するために使用されている（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２９５：４３５−４４、２００２）が、アンチセンス治療及び遺伝子療法に通常伴う問題が示されている。
【００２０】
Ｃｈｋ１インヒビタとしては、米国特許出願第１０／０８７７１５号及び米国仮特許出願第６０／５８３０８０号、６０／５８５２９２号、及び６０／６０２９６８号に記載のアリール置換及びヘテロアリール置換尿素化合物；米国特許公開第２００４／００１４７６５号、米国特許公開第ＵＳ２００３／１９９５１１号、米国特許公開第２００４／００１４７６５号、及びＷＯ ０３／１０１４４４号に記載のジアリール尿素化合物；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１６４９−５４．１９９５に記載のメチルキサンチン類及び関連化合物；ＷＯ ０３／０２９２４１号及びＷＯ ０３／０２８７３１号に記載のウレイドチオフェン類；ＷＯ ０３／０２８７２４号に記載のＮ−ピロロピリジニルカルボキサミド類；ＷＯ ０１／５７２０６号及び米国特許第６２１１１６４号に記載のアンチセンスＣｈｋ１オリゴヌクレオチド；ＷＯ ００／１６７８１号に記載のＣｈｋ１レセプターアンタゴニスト；ＷＯ ０３／０３７８８６号に記載のヘテロ芳香族カルボキサミド誘導体；ＷＯ ０３／０２９２４２号に記載のアミノチオフェン類；ＷＯ ０３／００４４８８号に記載の（インダゾリル）ベンズイミダゾール類；米国特許公開第２００４００９２５３５号及びＷＯ ０４／０１８４１９号に記載のベンズイミダゾールキノリノン類；ＷＯ ０２／１６３２６号に記載のヘテロ環状ヒドロキシイミノ−フルオレン類；米国特許第６４９５５８６号に記載のサイトネミン（ｓｃｙｔｏｎｅｍｉｎ）等のサイトネマン（ｓｃｙｔｏｎｅｍａｎ）誘導体；ＷＯ ０１／５３２７４号に記載のヘテロアリールベンズアミド類；ＷＯ ０１／５３２６８号に記載のインダゾール類；Ｔｅｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、前出に記載のインドラカルバゾール類；ＷＯ ０２／０７０５１５号に記載のクロマン誘導体；Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ：２９０９−２９１９、１９９９に記載のポウロン類（ｐａｕｌｌｏｎｅｓ）；ＷＯ ９９／１７７６９号に記載のインデノピラゾール類；Ｓｅｄｌａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．、９：１１４３−１１６８、１９９６に記載のフラボン類；ＷＯ ９８／５３０５０号に記載のセリンスレオニンキナーゼのペプチドループのペプチド誘導体；ＷＯ ０３／０５１８３８号に記載のオキシインドール類；ＷＯ ２００４／０６３１９８号に記載のジアゼピノインドロン類；ＷＯ ２００４／０４８３４３号に記載のピリミジン類；ＷＯ ２００４／０１４８７６号に記載の尿素化合物；並びにＷＯ ２００３／０９１２５５号に記載のピロロカルバゾール類、ベンゾフロイソインドール類、及びアザシクロペンタフルオレン類が挙げられる。
【００２１】
しかし、Ｃｈｋ１の効果的且つ選択的インヒビタが、当該技術分野で依然として要求されている。本発明は、このような要求や、その他の要求にも対処するものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、生化学及び／又は細胞系アッセイにおいて予期せぬ特性を呈するチェックポイントキナーゼＣｈｋ１の強力且つ選択的なインヒビタに関する。このＣｈｋ１インヒビタは、ＤＮＡ損傷又はＤＮＡ複製における障害に関連する適応症の治療における化学療法薬及び放射線治療薬のように、異常な細胞増殖を伴う適応症の治療に有用である。
【００２３】
従って、本発明の一態様は構造式（Ｉ）の化合物を提供することである。中でも、この化合物は、有効量の構造式（Ｉ）の化合物を必要とする個体に投与する工程を含むＣｈｋ１の阻害方法において有用である。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物は、次の構造式を有し、又はその薬理学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物である。
【化１】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり、Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり、Ｒ３ は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２の環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６〜７員の飽和複素環であって、Ｒａは独立に水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＨ２ＣＮ、又はＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は任意にオキソ（＝Ｏ）で置換され、Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、ＳＣ１−３アルキル、Ｎ（Ｒｂ）２、ＮＲｂＣ（＝Ｏ）Ｃ１−３アルキル、又は１個のＮ−Ｒａ基及び１〜３個のＣ１−３アルキル基で任意に置換される環を含む５又は６員の飽和複素環であり、又はＲ２及びＲ４は付着する炭素で結合して、５〜７員の飽和炭素環を形成し、Ｒ５は水素又はハロであり、ただし、Ｒ２及びＲ４の少なくとも一方は水素と異なり、Ｒ５はハロであり、Ｒ２又はＲ４は水素である）
【００２５】
本発明の別の態様は、構造式（ＩＩ）の化合物を提供することであり、この化合物は他の用途の中でも、Ｃｈｋ１の阻害方法において使用できる。
【化２】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり、Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり、Ｒ３は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６又は７員の飽和複素環であって、Ｒａは独立して水素、Ｃ１−３アルキル、又はＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は任意にオキソ（＝Ｏ）で置換され、Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、又はハロであり、又はＲ２及びＲ４は付着する炭素で結合して、５〜７員の飽和炭素環を形成し、ただし、Ｒ２及びＲ４の少なくとも一方は水素と異なる）
【００２６】
本発明の別の態様は、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の１以上の化合物を含有する医薬組成物、及びこの組成物のインビボ又はエクスビボでのＣｈｋ１の阻害が治療的利点を与え、又は研究もしくは診断的目的である適応症の治療における使用を提供する。
【００２７】
本発明の別の態様は、適応症の化学療法的又は放射療法的治療を受ける被検者における細胞を感作する方法であって、個体に、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を化学療法薬、放射線治療薬、又はその双方と組み合わせて投与することを含む方法を提供することである。この方法によって治療される適応症は、特に限定されないが、癌である。
【００２８】
本発明の別の態様は、異常な細胞増殖を阻害又は抑制する方法を提供することである。一実施形態では、この方法は、異常増殖細胞を含む細胞集団を、異常増殖細胞間で細胞周期停止を実質的に同期させるのに十分な量及び時間で異常増殖細胞と接触させることを含む。細胞集団内での細胞周期停止の実質的な同期を行うために、細胞集団を、細胞周期停止を実質的に無効化するのに十分な量及び時間で少なくとも１種のＣｈｋ１インヒビタと接触させることを含む。
【００２９】
本発明の別の態様は、ヒト治療用製品であって、（ａ）構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を含有する医薬組成物と、（ｂ）この組成物が異常な細胞増殖を伴う適応症の治療に有用であることを記載する添付文書と、（ｃ）容器と、を備えるヒト治療用製品を提供することである。
【００３０】
本発明の別の態様は、（ａ）構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を含有する医薬組成物と、（ｂ）この組成物がＤＮＡ障害又はＤＮＡ複製に関連する適応症の治療における化学療法薬又は放射線治療薬として有用であることを記載する添付文書と、（ｃ）容器と、を提供することである。
【００３１】
本発明のこれら及びその他の態様は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明の化合物は、構造式（Ｉ）を有し、又はその薬理学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物である。
【化３】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり、Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり、Ｒ３は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２の環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６又は７員の飽和複素環であって、Ｒａは独立して水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＨ２ＣＮ、又はＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は任意にオキソ（＝Ｏ）で置換され、Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、ＳＣ１−３アルキル、Ｎ（Ｒｂ）２、ＮＲｂＣ（＝Ｏ）Ｃ１−３アルキル、又は１個のＮ−Ｒａ基と、任意に１〜３個のＣ１−３アルキル基で置換された環とを含む５又は６員飽和複素環であり、又は、Ｒ２及びＲ４は付着する炭素で結合して、５〜７員の飽和炭素環を形成し、Ｒ５は水素又はハロであり、ただし、Ｒ２及びＲ４の少なくとも一方は水素と異なり、Ｒ５がハロであるとき、Ｒ２又はＲ４は水素である）
【００３３】
好ましい実施形態では、化合物は構造式（ＩＩ）を有し、又はその薬理学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物である。
【化４】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり、Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり、Ｒ３は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２の環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６又は７員の飽和ヘテロ環基であって、Ｒａは独立して水素、Ｃ１−３アルキル、又はＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は任意にオキソ（＝Ｏ）で置換され、Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、又はハロであり、又はＲ２及びＲ４は付着する炭素で結合して、５〜７員の飽和炭素環を形成し、ただし、Ｒ２及びＲ４の少なくとも一方は水素と異なる）
【００３４】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物の好ましい実施形態では、Ｒ１はクロロ、メチル、ＣＮ、又はＣＦ３である。別の好ましい実施形態では、Ｒ２は、水素、メチル、エチル、クロロ、ブロモ、ジメチルアミノ、シアノ、又はメトキシである。より好ましい実施形態では、Ｒ２は水素と異なる。
【００３５】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の他の好ましい実施形態では、Ｒ４は、メチル、クロロ、フルオロ、メトキシ、イソプロポキシ、ジメチルアミノ、−ＳＣＨ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、ピロリジニル、又は３，３−ジメチル−ピロリジニルである。より好ましい実施形態では、Ｒ４は、メチル、クロロ、又はメトキシである。更に別の好ましい実施形態では、Ｒ２及びＲ４は付着する炭素で結合して、５員又は６員の飽和炭素環を形成する。
【００３６】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の更に別の好ましい実施形態では、Ｒ５はハロであり、Ｒ４は水素である。好ましい実施形態では、Ｒ５はフルオロである。より好ましい実施形態では、Ｒ５は水素である。
【００３７】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の一実施形態では、Ｒ１がシアノであるとき、Ｒ２は水素であり、Ｒ４は好ましくはクロロ又はメチルである。別の実施形態では、Ｒ５はフルオロであり、Ｒ４は水素であり、Ｒ２はメチル、クロロ又はブロモである。
【００３８】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）中の好ましいＲ３基の例としては、特に限定されないが、
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
及び
【化１０】
が挙げられる。
【００３９】
本明細書で用いられる場合、「Ｃ１−３アルキル」という用語は、１〜３個の炭素原子を含む直鎖又は分岐のアルキル基、つまりメチル、エチル、ｎ−プロピル、及びイソプロピルを包含する。
【００４０】
「ハロ」は本明細書ではフルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードとして定義される。「シアノ」は−ＣＮとして定義される。「トリフルオロメチル」は−ＣＦ３を意味するものと定義される。「Ｍｅ」という略語はメチル、つまり−ＣＨ３である。
【００４１】
細胞周期チェックポイントを活性化するＤＮＡ損傷因子を、概して本明細書で「チェックポイント活性化因子」と称する。「Ｃｈｋ１」（「チェック−ワン」と発音）と示す、チェックポイントを活性化するＤＮＡ損傷因子を、本明細書で「Ｃｈｋ１活性化因子」と称する。同様に、かかるチェックポイントのインヒビタを、本明細書でそれぞれ、「チェックポイントインヒビタ」及び「Ｃｈｋ１インヒビタ」とそれぞれ称する。
【００４２】
本明細書で用いる場合、Ｃｈｋ１インヒビタは、Ｃｈｋ１タンパク質の細胞周期チェックポイント活性の少なくとも１つを、少なくとも部分的に抑止できる化合物である。細胞周期チェックポイントの抑止は、細胞性チェックポイント機構が充分に克服され、中断した細胞周期の期から細胞周期の次の期に細胞を経過させるか、又は細胞を直接細胞死へと進ませる場合に成し遂げられる。細胞周期チェックポイントの抑止によって、細胞が、損傷されたか又は不完全な遺伝物質を細胞周期の引き続く期に保有できるようになり、これにより細胞死が誘導又は促進される。細胞死は、アポトーシス及び有糸分裂のカタストロフを含む、いかなる機構によっても引き起こされ得る。本発明の化合物は、Ｃｈｋ１インヒビタである。
【００４３】
Ｃｈｋ１活性化因子としては、Ｃｈｋ１キナーゼ活性を活性化する能力を有し、よって少なくとも部分的な細胞周期休止を誘発する、既知又は発見後の作用因子の何れもが挙げられる。Ｃｈｋ１活性化因子には、細胞周期のいかなる期でも細胞周期を休止させることができる作用因子が含まれ、この期は本明細書で、活性化因子に対する「標的期」と称してもよい。標的期には、有糸分裂を除く細胞周期の期の何れも、すなわち、Ｇ１、Ｓ、及びＧ２期の何れもが含まれる。本発明で有用なＣｈｋ１活性化因子には、化学療法薬及び／又は放射線等のＤＮＡ損傷因子が含まれる。放射線Ｃｈｋ１活性化因子としては、限定されないが、イオン化放射線が挙げられる。イオン化放射線には、物質と相互作用することによりイオン対を生じることができる電磁又は微粒子放射線が含まれる。イオン化放射線には、Ｘ及びガンマ線、アルファ及びベータ粒子、中性子及び荷電核が含まれる。放射線には、紫外光、可視光、赤外放射線、マイクロ波放射線、及びそれらの組合せが含まれる。実施例８に記載のようなアッセイを用いて、作用因子がＣｈｋ１活性化因子であるかどうかを判定できる。
【００４４】
「異常な細胞増殖を阻害する」とは、異常に増殖している細胞が増殖する速度を遅延させること、又はこのような増殖を全体的に排除することを意味する。この阻害は結果的に、複製の速度の低下か、細胞死の速度の増大の一方、又は両方に起因する可能性がある。細胞死は、アポトーシス及び有糸分裂のカタストロフを含む何れの機構によっても引き起こされ得る。
【００４５】
「異常な細胞増殖を阻止する」とは、発生前に異常な細胞増殖を阻害すること、又はその再発を阻害することを意味する。
【００４６】
「インビボ」とは、動物又はヒトの体内のような、生存している被験者体内を意味する。これに関連して、異常に複製している細胞の増殖を遅延又は排除するのに、作用因子をインビボで治療的に使用できる。作用因子は、異常な細胞増殖又はそれに関連する病徴の出現を阻止するために、インビボで予防薬としても使用できる。
【００４７】
「エキソビボ」とは、生存している被験者の体外を意味する。エキソビボ細胞集団の例として、ヒト又は動物由来の流体又は組織試料等の生物学的試料及び細胞培養物が挙げられる。このような試料は、当該技術分野で良く知られた方法によって得ることができる。典型的な生物学的流体試料として、血液、脳脊髄液、尿、唾液が挙げられる。典型的な組織試料として、腫瘍及びバイオプシーが挙げられる。これに関連して、本発明の化合物は治療でも実験でも、幾多の適用が可能である。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「放射線治療薬」とは、電磁放射線に対する細胞の感度を高めるため、及び／又は電磁放射線で治療可能な疾患の治療を促進するために、治療上有効な量でヒト又は他の動物に投与される化合物を意味する。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「放射線」としては、限定されないが、１０−２０〜１００メートルの範囲の波長を有する放射線が挙げられる。「容器」の用語は、医薬品の保存、運送、調剤、及び／又は取扱に好適な、任意の入れ物及びそれ用の閉塞体を意味する。
【００５０】
「添付文書」の用語は、製品の投与方法の説明を、製品の使用に関して充分な情報を得た上での意思決定を医師、薬剤師、及び患者に行わせるのに必要とされる安全性及び効能のデータと共に提供する、製品に伴う情報を意味する。この添付文書は通常、医薬品用の「ラベル」と考えられる。
【００５１】
本発明には、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の、可能性を有するあらゆる立体異性体及び幾何異性体が含まれる。本発明には、ラセミ化合物のみならず、光学活性異性体も含まれる。構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物が単一エナンチオマーとして望まれる場合、それは、最終品の分割によって、又は異性体として純粋な出発物質から、もしくはキラル補助試薬を用いて立体特異的に合成することの何れかによって得ることができる。例えば、Ｚ． Ｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、８（６）、８８３−８８８（１９９７）参照。最終品、中間体、又は出発物質の分割は、当該技術分野において知られた何れの好適な方法によってでも成し遂げることができる。更に、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の互変異性体が存在できる状況で、本発明には、その化合物のあらゆる互変異性体を含めることを意図する。以下に実証する通り、特異的立体異性体は、化学療法薬又は放射線での治療と組み合わせて、Ｃｈｋ１を阻害する並外れた能力を示すことができる。
【００５２】
構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物のプロドラッグもまた、本発明の方法での化合物として使用できる。ある化合物を製剤及び／又は投与に好適な形態に誘導体化し、次いでインビボで薬物として遊離させるプロドラッグアプローチを、その化合物の物理化学的性質を一過性に（例えば、生物可逆的に）変化させるために成功裡に使用することは充分に確立されている（Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｅｄ．， ”Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，” Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， （１９８５）； Ｒ．Ｂ． Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， ”Ｔｈｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｃｔｉｏｎ，” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｃｈａｐｔｅｒ ８， （１９９２）； Ｋ．Ｍ． Ｈｉｌｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ．， １５， ８３ （１９９５）参照）。
【００５３】
本発明の化合物は、１以上の官能基を含んでいる。所望又は必要な場合、官能基を修飾してプロドラッグを提供できる。好適なプロドラッグとして、例えば、アミド類及びエステル類等の酸誘導体が挙げられる。プロドラッグとしてＮ−酸化物を使用できることも、当業者によって理解される。
【００５４】
本発明の化合物は、塩として存在できる。本発明の化合物の薬学的に許容できる塩が、通常、本発明の方法では好ましい。本明細書で用いる場合、「薬学的に許容できる塩」の用語は、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の塩又は双性イオン性フォームをいう。式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の塩は、化合物の最終的な単離及び精製の際に調製でき、又は好適なカチオンを有する酸と化合物とを反応させることによって別途に調製できる。薬学的に許容できる好適なカチオンには、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）及びアルカリ土類金属（例えば、カルシウム又はマグネシウム）カチオンが含まれる。更に、塩基性中心を含む構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の薬学的に許容できる塩は、薬学的に許容できる酸で形成される酸付加塩である。薬理学的に許容できる塩の形成に使用できる酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及びリン酸といった無機酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、マロン酸、及びクエン酸といった有機酸が挙げられる。本発明の化合物の塩の非限定例としては、特に限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、二硫酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホネート、リン酸塩、水素リン酸塩、アセテート、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゾエート、酪酸塩、樟脳酸塩、カンホスルホネート、クエン酸塩、二グルコン酸塩、リン酸グリセロール、ヘミサルフェート、ヘプタン酸、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、コハク酸、マロン酸、フマル酸塩、マレイン酸、メタンスルホン酸塩、メシチレンスルホネート、ナフチル−エンスルホネート、ニコチネート、２−ナフタレンスルホネート、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロプリオネート、ピクラート、ピバレート、プロピオン酸塩、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、グルタミン酸塩、重炭酸塩、パラトルエンスルホネート、ウンデカノエート、ラクテート、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、ベンゼンスルホネート、及びｐ−トルエンスルホネート塩が挙げられる。更に、本発明の化合物中に存在する有効なアミノ基は、メチル、エチル、プロピル、及びブチルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物；ジメチル、ジエチル、ジブチル、及びジアミルの硫酸塩；デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステリルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物、並びにベンジル及びフェネチルの臭化物を用いて四級化できる。以上に鑑み、本明細書に記載の本発明の化合物の言及は何れも、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を初めとして、その薬学的に許容できる塩、溶媒和物、又はプロドラッグを含むことを意図する。
【００５５】
本発明の化合物の非限定例は、
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
【化４２】
【化４３】
【化４４】
【化４５】
【化４６】
【化４７】
【化４８】
【化４９】
【化５０】
【化５１】
【化５２】
【化５３】
【化５４】
【化５５】
【化５６】
【化５７】
【化５８】
【化５９】
【化６０】
１−［５−メチル−２−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチルピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３７２．４）
【化６１】
１−［５−クロロ−２−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９２．４）
【化６２】
１−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［２−（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−５−メチル−フェニル］−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９６．４）
【化６３】
１−［５−クロロ−２−Ｒ−（１−メチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９１．３）
【化６４】
１−［５−ブロモ−２−Ｒ−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４３８．０）
【化６５】
１−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−Ｒ−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３８３．０）
【化６６】
１−［５−クロロ−２−（４−メチル−［１，４］オキサゼパン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４０６．０）
【化６７】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（５−オキソ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９２．２）
【化６８】
Ｎ−［２−クロロ−４−［３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−５−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−アセトアミド（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４３５．０）
【化６９】
１−［５−クロロ−３−フルオロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９６．３）
【化７０】
１−［５−メトキシ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素 （ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３７４．３）
【化７１】
１−［５−メトキシ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３５８．３）
【化７２】
１−［４−クロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３７８．３）
【化７３】
１−［５−クロロ−４−フルオロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９６．１）
【化７４】
１−［５−シアノ−４−メチル−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３８３．３）
【化７５】
１−［５−クロロ−４−ジメチルアミノ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４２１．２）
【化７６】
Ｎ−［２−クロロ−４−［３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−５−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−イソブチラミド（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４６３．２）
【化７７】
１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−［６−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−インダン−５−イル］−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３８４．３）
【化７８】
１−［５−クロロ−２−（４−シアノメチル−チオモルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４３３．０）
【化７９】
１−｛５−クロロ−２−［４−（２−シアノ−エチル）−Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ］−フェニル｝−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４３１．０）
【化８０】
１−［５−クロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−４−ピロリジン−１−イル−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４４７．２）
【化８１】
【化８２】
【化８３】
【化８４】
【化８５】
【化８６】
【化８７】
【化８８】
及び
【化８９】
、又はその塩、溶媒和物（例えば水和物）、もしくはプロドラッグである。
【００５６】
本発明の化合物は、化学薬品そのままで治療的に投与できるが、医薬組成物又は製剤としてその化合物を投与するのが好ましい。よって、本発明は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を、それに対する薬学的に許容できる希釈剤又は担体と共に含む医薬組成物を提供する。更に提供されるのは、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を、それに対する薬学的に許容できる希釈剤又は担体と混合することを含む、医薬組成物の調製法である。
【００５７】
従って、本発明は更に、構造式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を、１以上の薬学的に許容できる担体と、任意に他の治療及び／又は予防用成分と共に含む医薬製剤を提供する。担体は、製剤の他の成分と適合し、且つそのレシピエントにとって有害でないという意味で「許容できる」。
【００５８】
本発明の化合物は予想外に高い作用強度を示す。作用強度は、典型的には特定の結果を得るのに必要な化合物の濃度として表す。作用強度が大きいほど、意図したその機能を遂行するのに必要とされる化合物は少なくなる。インビトロの作用強度は、典型的にはＩＣ５０値として表し、用量応答アッセイを用いて測定する。ＩＣ５０値は、効果が観察されないか又は最小の効果しか観察されない濃度、部分的な効果が観察される更に高濃度を経て、最大の効果が観察される飽和濃度までを含む様々な濃度にわたる目的化合物と、感受性アッセイ系とを接触させることによって測定できる。論理的には、インヒビタ化合物のこのような用量応答効果のアッセイは、対数スケール上にプロットした場合に濃度の関数として阻害の程度を表すＳ字形曲線として描写できる。その曲線はまた、理論的に、チェックポイント酵素の活性を、そのアッセイで観察される最低と最高の酵素活性の差の活性の５０％になるレベルにまで低下させるのにその濃度が充分である点を通る。この濃度を、５０％阻害の阻害濃度、又はＩＣ５０値と定義する。
【００５９】
ＩＣ５０値は、当業者に周知の従来の生化学的（無細胞）アッセイ技術又は細胞を基礎にしたアッセイ技術を用いて定量できる。このようなアッセイの例を、下記実施例１に示す。
【００６０】
好ましくは、関連アッセイを少なくとも２回実施してＩＣ５０値を得、得られた個々の数値の平均（相加平均、すなわち「平均値」）として、そのＩＣ５０値を表す。より好ましくは、アッセイを３〜１０（又はそれ以上）回繰り返し、得られた数値の平均値としてＩＣ５０値を表す。最も好ましくは、当業者に知られた統計的手法を用いて統計的に信頼できる平均ＩＣ５０値を引き出すのに充分な回数のアッセイを実施する。
【００６１】
本発明の化合物は、予想外に高いインビトロ作用強度に対応して、予想外に低いＩＣ５０値を示す。本発明の化合物は、下記実施例１に記載の通りにアッセイすると約２００ｎＭ未満、いくつかの実施形態では約１５０ｎＭ未満、他の実施形態では約１００ｎＭ未満、その他の場合で約５０ｎＭ未満、その他の場合で約１０ｎＭ未満、そしてその他の場合で約５ｎＭ未満のＩＣ５０値を示す。他の実施形態で、本発明の化合物は約０．１ｎＭ〜約５ｎＭのＩＣ５０値を示す。
【００６２】
本発明の化合物は、他のプロテインキナーゼよりもＣｈｋ１の阻害に選択性を示す。選択性は、有害な副作用の低減及び／又は治療係数の増大に有利であるかもしれない。
【００６３】
「選択性」は本明細書では「選択性倍数」として表す。概して、本明細書で用いる場合に選択性倍数とは、比較酵素に対する被験化合物のＩＣ５０をコンパレータ酵素のＩＣ５０で割ったものである。特に、本明細書で用いる場合にＣｈｋ１インヒビタに対する選択性倍数とは、Ｃｈｋ１（比較酵素）に対するＣｈｋ１インヒビタ（被験化合物）のＩＣ５０を、コンパレータ酵素に対するＩＣ５０で割ったものである。本発明の化合物を測定し得る比較酵素としては、Ｃｄｃ２、Ｃｈｋ２、ＣＴＡＫ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｋ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ４、ＩＲ、ＪＮＫ１、ｃ−Ｋｉｔ、ｐ３８アルファ、ｐ３８ベータ、ｐ３８デルタ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ２、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ｐｐ６０ｖ−ｓｒｃ、タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔ−１、ｐ３８ＭａｐＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、カルシウムカルモジュリン依存的キナーゼＩＩ、及びａｂ１チロシンキナーゼ等のタンパク質キナーゼが少なくとも挙げられる。
【００６４】
コンパレータ酵素に対する被験化合物のＩＣ５０値を求めるためのアッセイは、実施例２に記載しており、当業者に周知である。本発明の化合物は、試験した前記プロテインキナーゼに比して少なくとも約２０倍の選択性を示す。いくつかの実施形態で、本発明のＣｈｋ１インヒビタは、試験した前記プロテインキナーゼよりもＣｈｋ１の阻害に少なくとも約５０倍の選択性、他の実施形態では少なくとも約７５倍の選択性、他の実施形態では少なくとも約１００倍の選択性を示す。
【００６５】
本発明の化合物は、細胞を基礎にしたアッセイにおいて予想外に高い作用強度を示す。Ｃｈｋ１インヒビタの細胞に基づく作用強度を測定するために、異常に増殖している細胞を含む、細胞を基礎にしたモデルにおけるＤＮＡ損傷因子の成長阻止効果を高めるのに必要なＣｈｋ１インヒビタの濃度の測定を可能とするアッセイを開発した。細胞に基づく作用強度のこの測定値は、本明細書で「ＥＣＴＦＳ」値と表し、この「ＥＣＴＦＳ」は、ＤＮＡ損傷因子の成長阻止効果に対し、異常に増殖している細胞の集団に２倍の増感を生じさせるＣｈｋ１インヒビタの有効濃度である。ＥＣＴＦＳは、細胞成長の９０％阻害に必要なＤＮＡ損傷因子の量を半分に低減するＣｈｋ１インヒビタの濃度として算出される。本出願人は、本発明の化合物が、細胞に基づく予想外に高い作用強度に対応して予想外に低いＥＣＴＦＳ値を示すことを見出している。
【００６６】
測定してもよい別のパラメータは、Ｃｈｋ１インヒビタ化合物に対するＬＤ５０（細胞の５０％の成長を阻害する化合物単独の用量）で達成される増感倍数である。これらの２つの数値ＥＣＴＦＳ及びＬＤ５０での増感倍数で、Ｃｈｋ１インヒビタの作用強度及び毒性の双方を直接的に相互に順位付けできるようになる。
【００６７】
ＥＣＴＦＳ値を測定するのに有用なアッセイの例は、下記実施例３に記載する。簡単に説明すると、このアッセイでは、異常に増殖している細胞の集団としてＨＴ２９ヒト結腸癌腫細胞、ＤＮＡ損傷因子／Ｃｈｋ１活性化因子としてゲムシタビン、及びＣｈｋ１インヒビタとして本発明の化合物を使用する。異常に増殖している細胞の集団を培養して、好適な生育培地で成長させる。次に、様々な濃度にわたるＤＮＡ損傷因子に細胞を曝す。所定時間の後にＤＮＡ損傷因子を除き、その細胞を様々な濃度にわたるＣｈｋ１インヒビタに所定時間曝す。次いで培養細胞のプレートを回収して、生存している細胞の相対数を計数する。データは対照としてのＣｈｋ１インヒビタ単独に対して正規化し、その後［ＤＮＡ損傷因子濃度］対［相対細胞生存率（１００％が１．０と同等）］の対数／対数グラフにプロットする。用いたＣｈｋ１インヒビタの各濃度につき、Ｃｈｋ１インヒビタ無しと有りの場合で９０％の成長阻害を達成するのに必要なＤＮＡ損傷因子の量の差から、増感倍数を求める。これらのデータは、次いで増感倍数に対するＣｈｋ１インヒビタ濃度のグラフにプロットし、これよりＥＣＴＦＳを算出する。
【００６８】
好ましくは、少なくとも２回アッセイを実施してＥＣＴＦＳ値を得、得られた個々の数値の平均値として、そのＥＣＴＦＳ値を表す。より好ましくは、アッセイを３〜１０（又はそれ以上）回繰り返し、得られた数値の平均値としてＥＣＴＦＳ値を表す。最も好ましくは、当業者に知られた統計的手法を用いて統計的に信頼できる平均ＥＣＴＦＳ値を引き出すのに必要な回数のアッセイを実施する。
【００６９】
ＥＣＴＦＳアッセイに付したすべての化合物が、約１０００ｎＭ未満のＥＣＴＦＳ値を示した。これに対し、構造的に類似の既知化合物は、約１１，０００ｎＭのＥＣＴＦＳ値を示す。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、約５００ｎＭ未満、又は約３００ｎＭ未満、又は約２００ｎＭ未満、又は約１５０ｎＭ未満、又は約１００ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満、又は約３０ｎＭ未満、又は２０ｎＭ未満、又は約１０ｎＭ未満、又は他の実施形態では約５ｎＭ未満のＥＣＴＦＳ値を呈する。
【００７０】
本発明での使用に好適な化合物及び医薬組成物には、その使用目的を達成するのに有効な量の有効成分を投与するものが含まれる。更に詳細には、「治療上有効な量」とは、適応症を患っている個体を治療するのに、又は適応症の現存している病徴を緩和するのに充分な量を意味する。治療上有効な量の決定は、特に本明細書に挙げる詳細な開示に鑑みて、当業者が充分にできることである。
【００７１】
Ｃｈｋ１インヒビタに加えて、本発明の医薬組成物は、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、他の造血因子、又はそれらの混合物等の生物学的に活性な作用因子配合し、当該医薬組成物の単独投与で起こる、又はこれに伴う可能性のある有害な副作用を低減するように製剤化できる。あるいは、かかる生物学的に活性な作用因子を、所望の治療効果を促進するために本発明の医薬組成物に配合してもよい。本発明の医薬組成物において有用なアジュバント生理活性物質としては、特に限定されないが、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポイエチン、幹細胞因子、ＥＰＯ、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、及び／又はヒトアンジオポイエチン様ポリペプチド等のアンジオポイエチン、血管内皮の成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオジェニン、骨形態形成タンパク質−１（ＢＭＰ−１）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰレセプタＩＡ、ＢＭＰレセプタＩＢ、脳由来神経栄養因子、繊毛神経栄養因子、繊毛神経栄養因子レセプタ、サイトカイン誘導好中球走化因子１、サイトカイン誘導好中球走化因子２、サイトカイン誘導好中球走化因子２、内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮細胞成長因子、上皮誘導好中球誘引剤、フィブロブラスト成長因子（ＦＧＦ）４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ｃ、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ酸性、ＦＧＦ塩基性、グリア細胞系誘導神経栄養因子レセプタ１、グリア細胞系誘導神経栄養因子レセプタ２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質、ヘアピン結合上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子レセプタ、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子レセプタ、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子レセプタ、神経成長因子神経成長因子レセプタ、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板誘導内皮細胞成長因子、血小板誘導成長因子、血小板誘導成長因子Ａ鎖、血小板誘導成長因子ＡＡ、血小板誘導成長因子ＡＢ、血小板誘導成長因子Ｂ鎖、血小板誘導成長因子ＢＢ、血小板誘導成長因子レセプタ、血小板誘導成長因子レセプタ、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子レセプタ、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ、ＴＧＦ１、ＴＧＦ１．２、ＴＧＦ２、ＴＧＦ３、ＴＧＦ５、潜在的ＴＧＦ１、ＴＧＦ、結合タンパク質Ｉ、ＴＧＦ結合タンパク質ＩＩ、ＴＧＦ結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子レセプタＩ型、腫瘍壊死因子レセプタＩＩ型、ウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータレセプタ型、血管内皮成長因子、及びキメラタンパク質、並びにその生物学的又は免疫学的に活性のフラグメントが挙げられる。
【００７２】
構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は、治療的使用法での当該化合物の有益な性質を促進する（又は望ましくない性質を軽減する）補助部分に接合又は結合させることもできる。かかる接合体は、目的とする特定の解剖学的部位又は領域（例えば、腫瘍）への化合物の送達を増強し、標的細胞で化合物の治療濃度を持続できるようにし、化合物の薬物動態学的及び薬力学的性質を変え、且つ／又は化合物の治療係数又は安全性プロファイルを改善する。好適な補助部分として例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、又はポリペプチド、例えばモノクローナル抗体及び他の改変抗体等の抗体；並びに標的細胞又は組織中の受容体に対する天然もしくは合成リガンドが挙げられる。他の好適な補助成分には、体内分布及び／又は標的細胞による化合物の取込を促進する脂肪酸又は脂質部分が含まれる（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７：３２２９、２００１参照）。
【００７３】
本発明の製剤は、経口、非経口、経粘膜（例えば、舌下又は口腔内投与）、局所、経皮、直腸内、吸入（例えば、鼻又は肺深部吸入）等、示唆される疾患の治療のために標準法にて投与できる。非経口投与としては、限定されないが、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鞘内、及び関節内が挙げられる。非経口投与はまた、ＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ（商標名）、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｌｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）のような高圧技術を用いて成し遂げることもできる。
【００７４】
経口投与及び口腔内投与のため、組成物は従来法で製剤化した錠剤又は薬用ドロップの形態とすることができる。例えば、錠剤及びカプセルは、結合剤（例えば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、スターチ粘液、又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば、乳糖、ショ糖、微結晶性セルロース、トウモロコシスターチ、リン酸カルシウム、又はソルビトール）、潤滑剤（例えば、、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、又はシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモスターチ、又はスターチグリコール酸ナトリウム）、又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような従来の賦形剤を含有できる。錠剤は、当該技術分野でよく知られた方法によってコーティングできる。
【００７５】
あるいは、本発明の化合物は、例えば水性又は油性懸濁液剤、溶液剤、乳剤、シロップ剤、又はエリキシル剤等の経口液剤に取り込ませることができる。更に、これらの化合物を含有する製剤は、使用前に水又は他の好適な媒体で構成するための乾燥品として提供できる。かかる液性調製物は、例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／ショ糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、及び水素化食用脂のような懸濁剤、レシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアラビアゴムのような乳化剤、アーモンド油、椰子油、脂肪エステル、プロピレングリコール、及びエチルアルコールのような非水性ビヒクル（食用油を含んでよい）；並びにメチル又はプロピルのｐ−ヒドロキシ安息香酸及びソルビン酸塩のような保存剤といった従来の添加剤を含有できる。
【００７６】
調剤は、例えば、ココアバター又は他のグリセリド類等の従来の坐剤用基材を含有する坐剤としても製剤化できる。吸入用組成物は、典型的には乾燥粉体として投与できる溶液、懸濁液、もしくはエマルションの形態で、又はジクロロジフルオロメタンもしくはトリクロロフルオロメタン等の従来の噴霧剤を用いたエアロゾルの形態で提供される。
【００７７】
局所及び経皮製剤には、点眼剤、クリーム、軟膏、ローション、及びペースト剤等の、従来の水性又は非水性媒体が含まれ、又は薬用硬膏剤、パッチ、もしくは膜の形態をとる。
【００７８】
更に、本発明の組成物は、注射又は連続注入による投与用に製剤化できる。注射用製剤は、懸濁液、溶液、又は油性もしくは水性媒体中のエマルションの形態をとることができ、また、懸濁化、安定化、及び／又は分散剤等の製剤用薬剤を含有できる。あるいは、有効成分は使用前に好適な媒体（例えば、滅菌、発熱物質不含の水）で構成するための粉末形態とすることができる。
【００７９】
本発明の組成物は、デポ剤としても製剤化できる。このような長時間作用性製剤は、（例えば皮下又は筋肉内への）埋め込みにより、又は筋肉内注射により投与できる。従って、本発明の化合物は、好適なポリマー材料（例えば、水溶性ポリマー）、疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルション）、イオン交換樹脂、又は難溶性誘導体（例えば、難溶性塩）を用いて製剤化できる。
【００８０】
獣医による使用には、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を、通常の獣医実務に従って、好適に許容できる製剤として投与する。獣医師は、特定の動物にとって最も適切な投与計画及び投与経路を容易に決定できる。本発明の化合物及び方法によって治療可能な動物としては、限定されないが、ペット、家畜、ショーアニマル、及び動物園の被験動物が挙げられる。
合成方法
【００８１】
本発明の化合物は、以下の合成スキームによって調製できる。先ず、本明細書に記載のＣｈｋ１インヒビタを調製するのに使用するアルコキシアリールアミン類は、異なる一般合成スキームによって調製できる。例えば、一般スキーム１に、アルコールの活性型とニトロフェノールとの、原位置で形成、又は別途に調製及び単離する、ニトロフェニルエーテル産物を提供する反応の概要を示す。標準的条件下でのエーテルの還元により、本発明の化合物を生産するために使用するアリールアミンを提供する。
一般スキーム１
【化９０】
あるいは、水素化ナトリウム又はカリウムビス（トリメチルシリル）アミド等の強塩基の存在下にハロニトロベンゼンをアルコールと反応させることでも、一般スキーム２に示すようにニトロアリールエーテルが得られる。次いでこれらのエーテルを、一般スキーム１に示すように還元する。
一般スキーム２
【化９１】
アリールアミンの尿素への変換は、いくつかの合成スキームの１つによって成し遂げることができる。例えば、一般スキーム３に示すように、アリールアミンをピラジンカーバメートと反応させて尿素を生じさせることができる。
一般スキーム３
【化９２】
あるいは、一般スキーム４に概説するように、アシルアジドの加熱誘発分解によって反応性アリールイソシアネートを生成させ、これを次いでアリールアミンと反応させて所望の尿素を得る。
一般スキーム４
【化９３】
一般スキーム５に示す別のアプローチでは、ホスゲン又はホスゲン等価物を用いて２つのアリールアミンをカップリングさせ、尿素を提供する。
一般スキーム５
【化９４】
本明細書で説明する合成に用いられる略語は、時間（ｈ）、分（ｍｉｎ）、１平方インチ当たりポンド（ｐｓｉ）、飽和（ｓａｔ’ｄ）、水（Ｈ２Ｏ）、脱イオン（ＤＩ）、イソプロピルアルコール（ｉＰｒＯＨ）、炭素上白金（Ｐｔ／Ｃ）、窒素（Ｎ２）、水素（Ｈ２）、炭素上パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）、白金オキシド（Ｐｔ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ）、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、メタノール（ＭｅＯＨ）、アンモニウム水酸化物（ＮＨ４ＯＨ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、酢酸（ＡｃＯＨ）、ＮａＯＨ（ＮａＯＨ）、ＥｔＯＡｃ（ＥｔＯＡｃ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、重水素化ジメチルスルフォキシド（ｄ６−ＤＭＳＯ）、カルボン酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、水素化ナトリウム（ＮａＨ）、ＴＥＡ（ＴＥＡ）、カルボン酸セシウム（ＣＳｓＣＯ３）、二酸化炭素（ＣＯ２）、水酸化パラジウム（Ｐｄ（ＯＨ）２）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、硝酸（ＨＮＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である。化合物の調製以下の本発明の化合物は、前記の一般スキームを用いて調製した。さらなる本発明の化合物は、前記一般スキーム、及び以下の特異的合成を用い、出発物質の慎重な選択により調製できる。
化合物１
【化９５】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【００８２】
ステップ１： ２−アミノ−５−メチルピラジン
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホン酸塩（２０．０ｇ、７９ｍｍｏｌ）及びピルブアルデヒド１−オキシム（６．８８ｇ、７９ｍｍｏｌ）をフラスコ内で合わせた。ｉＰｒＯＨ（１４０ｍＬ）を添加し、得られた黄色スラリーを室温で１８時間撹拌し、この間に黄色沈殿が蓄積した。混合液を濾過して、沈殿をｉＰｒＯＨ（２×５０ｍＬ）及び脱イオン水（２０ｍＬ）で洗浄し、その後凍結乾燥して２−アミノ−３−シアノ−５−メチルピラジンＮ−オキシド（１０．７ｇ）を得た。
【００８３】
ピラジンＮ−オキシドをＭｅＯＨ（２２ｍＬ）及びＡｃＯＨ（５ｍＬ）に懸濁させた。これに５％Ｐｔ／Ｃ（１．６ｇ）及びＤａｒｃｏ ＫＢ−Ｂ（８ｇ）を注意深く添加した。混合液に、６０ｐｓｉで１８時間、Ｈ２を吸収させた。反応を２５％ＮａＯＨ（３４ｍＬ）でクエンチし、Ｎ２を３０分間パージした。混合液は、湿潤セライト床を通して濾過して、ＭｅＯＨ（４×１００ｍＬ）で洗浄した。濾液を真空で４分の１の体積まで濃縮した。濾液をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈して５％ＮａＯＨ（３０ｍＬ）で洗浄し、ＥｔＯＡｃ（２×７０ｍＬ）で逆抽出した。有機層を集めて飽和ＮａＣｌ（２０ｍＬ）で洗浄して濾過し、真空で濃縮して橙色粘性固体（５．１６ｇ）を得た。
【００８４】
ステップ２：（５−メチルピラジン−２−イル）カルバミン酸フェニルエステル
２−アミノ−５−メチルピラジン（５．１６ｇ、４７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５２ｍＬ）に溶解させ、Ｎ２下に撹拌して、０℃になるまで冷却した。これに、ピリジン（４．８ｍＬ、５９ｍｍｏｌ）を添加し、次いでフェニルクロロホルメート（６．２ｍＬ、５９ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下して沈殿を形成させた。混合液を０℃で１時間撹拌した。その後、反応を０．２５ＭのＨＣｌ（４０ｍＬ）及び無水エーテル（５０ｍＬ）でクエンチし、０℃で３０分間撹拌した。沈殿を濾過によって単離して、脱イオン水（２０ｍＬ）及びエーテル（２×２５ｍＬ）で洗浄し、減圧下に乾燥させて白色綿毛状粉末として産物（７．４ｇ）を得た。
【００８５】
ステップ３： （Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−［１，４］オキサゼパン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
２５０ｍＬの丸底フラスコに、（Ｓ）−（＋）−ベンジルグリシジルエーテル、（１．３１ｇ、７．９ｍｍｏｌ）、３−ベンジルアミノ−プロパン−１−オール（１．３ｇ、７．９ｍｍｏｌ）及び１０ｍＬのＥｔＯＨを加えた。混合液を４０℃に１５時間加熱した。反応液を冷却して真空で濃縮し、得られた油状産物を、更に精製することなく使用した。ジオールを２５０ｍＬの丸底フラスコに入れて、７５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解させた。溶液を０℃に冷却し、トルエンスルホニルクロライド（５．２７ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）を一分配にて添加した。混合液は、反応温度を注意深く０℃に保ちながら６時間撹拌した。冷反応を、５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。更に２０ｍＬの水を加え、混合液はＥｔＯＡｃを１００ｍＬずつ用いて３回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。アルコールはその後、溶離液としてＥｔＯＡｃ及びヘキサンの２５〜５０％濃度勾配を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、黄色オイルとして１．３９ｇのトシルアルコールが得られた。
【００８６】
アルコールを５０ｍＬのＤＭＦに溶解させて、０℃に冷却した。冷撹拌混合液に、９５重量％のＮａＨ（０．２９ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を注意深く添加した。反応液を０℃で１５分間撹拌し、次いでゆっくりと室温にまで昇温して６時間撹拌した。反応を５０ｍＬの水で注意深くクエンチし、ＥｔＯＡｃを５０ｍＬずつ用いて３回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。粗製産物をＥｔＯＨに溶かし、Ｐａｒｒ水素化装置に入れた。また、この溶液に１０重量％のＰｄ／Ｃ（０．４２６ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）及び２ＭのＨＣｌ（２．１ｍＬ）を添加した。水素化を５０ｐｓｉで２日間行い、この時点で反応が完了したと、ＬＣＭＳ解析により判断した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で中和し、ＣＨＣｌ３：ｉＰｒＯＨの３：１混合液を用いて抽出した。有機層を合わせて真空で濃縮して、粗製産物を次の工程に進めた。
【００８７】
粗製アミノアルコールを、１００ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。この溶液に、ＴＥＡ（１．５９ｍＬ、１１．５ｍｍｏｌ）及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（５．７４ｇ、５．７４ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１８時間撹拌し、その後飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２を５０ｍＬずつ用いて３回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。産物は、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの２５〜５０％濃度勾配を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、黄色オイルとして０．２４０ｇのオキサザパンアルコールが得られた。
【００８８】
ステップ４： （Ｓ）−２−（４−クロロ−２−ニトロ−フェノキシメチル）−［１，４］オキサゼパン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
５０ｍＬの丸底に、オキサザパンアルコール（０．２４０ｇ、１．０３ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．２１ｍＬ、１．５４５ｍｍｏｌ）、及び１０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を添加した。溶液を０℃に冷却し、メタンスルホニルクロライド（０．１０ｍＬ）を滴下した。混合液を０℃で１．５時間撹拌し、次いで水で完全にクエンチした。層を分離させ、水層を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で１回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。次いで、粗製メシレートを５ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解させた。この溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３（０．６７１ｇ、２．０６ｍｍｏｌ）及び４−クロロ−２−ニトロ−フェノール（０．２１５ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）を添加した。この淡黄色溶液はその後、終夜１００℃に加熱した。反応液を室温まで冷却して、５０ｍＬの水でクエンチし、ＥｔＯＡｃを５０ｍＬずつ用いて３回抽出した。産物は、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの１０〜３５％濃度勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。この工程手順で、黄色オイルとして０．１２０ｇのニトロフェニルオキサザパンが得られた。
【００８９】
ステップ５： １−［５−クロロ−２−（［１，４］オキサゼピン−２−（Ｓ）−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
２５ｍＬの丸底で、５ｍＬのＭｅＯＨにニトロフェニルオキサザパン（０．１２０ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）及びＰｔ２Ｏ（０．００７ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を入れた。ヘリウムバルーンを取り付け、アスピレーターを用いてフラスコを排気して、Ｈ２を３回充填し、次いでＨ２下に２時間撹拌させた。反応液をセライトを通して濾過し、そのセライトパッドを、ＭｅＯＨを２０ｍＬずつ用いて２回洗浄した。溶液は、真空で濃縮した。粗製アニリンを、５ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解させた。この溶液に、ＴＥＡ（０．００５ｍＬ、０．３４ｍｍｏｌ）及び（５−メチルピラジン−２−イル）カルバミン酸フェニルエステル（０．０７ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を、室温で１８時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を１０ｍＬのＥｔＯＡｃに再溶解させて飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧で濃縮した。灰色／褐色残渣を３ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で覆い、これに１ｍＬの濃トリフルオロ酢酸を添加した。酸の添加で、固体はすべて溶解した。反応液を室温で４時間撹拌し、この時点で、溶液のｐＨが８に達するまで飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加する。混合液は、ＣＨＣｌ３：ｉＰｒＯＨの３：１混合液を１０ｍＬずつ用いて３回抽出した。その後有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下に濃縮した。オフホワイト色の固体は、次いでＥｔＯＡｃ中で摩砕して、濾材フリットフィルターを通して濾過し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。白色固体は、減圧下に完全に乾燥させた。この手順で、白色微粉末として０．０２０ｇの所望の尿素が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．８３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．３９ （ｄｄ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ） ８．０４ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．９９ （ｄｄ， １Ｈ）， ６．８２ （ｄ， １Ｈ）， ４．２５−３．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９０−３．７６ （ｍ， １Ｈ）， ３．３８ （ｄ， １Ｈ）， ３．１３−３．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．００ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．５４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６−１．８９ （ｍ， ３Ｈ）．ＬＣＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．３ （Ｍ＋１）．
化合物２
【化９６】
１−［５−クロロ−２−（Ｒ−モルホリン−３−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【００９０】
ステップ１： ３−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
モルホリン−３−Ｒ−４−ジカルボン酸４−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．００ｇ、４．３２ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃浴）乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）溶液に、ボラン（１ＭのＴＨＦ溶液、４．７６ｍＬ、４．７６ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下に１５分間かけて滴下した。１時間撹拌した後、浴を除き、更に３時間、外界温度で撹拌を継続した。酢酸（１４．３ｍＬの１Ｍ水溶液、１４．３ｍｍｏｌ）を、その後添加した。１時間撹拌した後、溶液を過剰の水性飽和炭酸水素ナトリウムを添加して中和した。ジクロロメタン（２０ｍＬ）を添加して、その溶液を１５分間撹拌し、次いで層を分離させた。水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過した。濾過した溶液を濃縮して白色固体（０．４６ｇ）とした。
【００９１】
ステップ２： ３−（４−クロロ−２−ニトロ−フェノキシメチル）−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
３−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．１３ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）及び５−クロロ−２−フルオロニトロベンゼン（０．１１ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の冷却した（−７８℃浴）乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）撹拌溶液に、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド（２．４ｍＬのＴＨＦ０．５Ｍ溶液、１．２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に１５分間かけて滴下した。更に１５分間撹拌した後、水性飽和アンモニウムクロライド（１０ｍＬ）を添加し、浴を除いて溶液を外界温度まで昇温させた。１時間撹拌した後、水（１５ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を添加し、５分間撹拌して層を分離させた。水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過した。濾過した溶液を濃縮して黄色オイル（０．２６ｇ）とし、これをヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１：１）で溶出させるカラムクロマトグラフィーにより精製し、淡黄色オイル（０．１９５ｇ）を得た。
【００９２】
ステップ３： ３−（２−アミノ−４−クロロ−フェノキシメチル）−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
３−（４−クロロ−２−ニトロ−フェノキシメチル）−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．１７ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４ｍＬ）撹拌溶液に、Ｐｔ２Ｏ（０．０２０ｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコを排気し、次いでＨ２を３回繰り返して充填した。４時間撹拌した後、溶液をセライトのパッドで濾過して濾液を濃縮し、黄色オイルとして産物を得た。
【００９３】
ステップ４： ３−｛４−クロロ−２−［３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−フェノキシメチル｝−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
黄色オイル及び（５−メチル−ピラジン−２−イル）−カルバミン酸フェニルエステル（０．１３ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を調製して、ＴＥＡ（０．０７４ｍＬ、０．５３ｍｍｏｌ）を添加した。２４時間撹拌した後、反応液を減圧下に濃縮し、次いで水（１０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に再溶解させた。１５分間撹拌した後、層を分離させて、水層をＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて鹹水（１０ｍＬ）で洗浄して、その後乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させて濾過した。濾過した溶液を濃縮し、その後ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）で溶出させるカラムクロマトグラフィーにより精製して黄色オイル（０．８ｇ）を得た。
【００９４】
ステップ５： １−［５−クロロ−２−（Ｒ−モルホリン−３−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
３−｛４−クロロ−２−［３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−フェノキシメチル｝−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．８ｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）撹拌溶液にトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を添加した。５時間撹拌した後、溶液を炭酸カリウム水溶液（１Ｍ）で塩基性になるまで処理し、次いで３０分間撹拌した。層を分離させて、水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）して、濾過した。濾過した溶液を濃縮し、次いでＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１：９）で溶出させるカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄白色固体（０．０５２３ｇ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２２ （ｓ， １Ｈ）， ９．９６ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．７４ （ｓ， １Ｈ）， ８．２８ （ｄ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ）， ７．０４ （ｄｄ， ２Ｈ）， ３．．９４ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７１ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ３．４３ （ｍ， １Ｈ）， ３．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３４ （ｂｒ ｍ， ２Ｈ）， ２．６６ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７８．３ （Ｍ＋１）．
化合物３
【化９７】
１−［２−（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−５−メチル−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【００９５】
ステップ１： １，４−ジメチル−２−（４−メチル−２−ニトロ−フェノキシメチル）−ピペラジン
４−メチル−２−ニトロ−フェノール（０．９５ｇ、６．２０ｍｍｏｌ）、（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イル）−ＭｅＯＨ（０．９８ｇ、６．８２ｍｍｏｌ）、及びトリフェニルホスフィン（１．７９ｇ、６．８２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ中で合わせて５分間撹拌し、次いでＤＩＡＤ（１．３８ｇ、６．８２ｍｍｏｌ）で処理した。反応液を終夜撹拌させた。減圧下濃縮により橙色オイルを得て、これをＥｔＯＡｃに溶解させて２ＭのＨＣｌ水溶液で抽出した。水性洗浄液を合わせて、ＥｔＯＡｃで洗浄し、塩基性になるまで固体ＮａＯＨで処理した。得られた水性混合液をＥｔＯＡｃで抽出し、有機抽出液を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過して真空で濃縮し、褐色オイルを得た。フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中１％ＭｅＯＨ）により、１．０ｇの所望のアリールエーテルを得た。
【００９６】
ステップ２： ２−（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−５−メチル−フェニルアミン
１，４−ジメチル−２−（４−メチル−２−ニトロ−フェノキシメチル）−ピペラジン（１．０２ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（７５ｍＬ）に溶解させて、混合液が濁るまで飽和塩化アンモニウム水溶液で処理した。亜鉛（０．２４ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた暖かい反応混合液を更に３０分間撹拌し、この時点で出発物質が消費されたことがＬＣＭＳにより示された。反応液をＥｔＯＡｃで希釈して、水性Ｎａ２ＣＯ３と層を分離させた。有機層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、固体無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。混合液を濾過して真空で濃縮し、所望のアニリンを得た。
【００９７】
ステップ３： １−［２−（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−５−メチル−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
５−メチル−ピラジン−２−カルボン酸（６９１ｍｇ、５ｍｍｏｌ）をトルエン（１５ｍＬ）中で撹拌し、ＴＥＡ（７６５ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）、次いでジフェニルホスホリルアジド（１．０ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）で処理した。得られた溶液を３０分間撹拌し、次いでそのまま使用した。
【００９８】
５−メチル−ピラジン−２−カルボニルアジド（１．０ｍｍｏｌ）のトルエン溶液を９０℃で１０分間加熱した。反応フラスコを加熱浴から取り出して、褐色溶液を２−（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−５−メチル−フェニルアミン（０．２５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）で処理した。フラスコを加熱浴に戻して、４０℃で４時間加熱した。混合液を冷まし、その後濾過して黄褐色の粉末として産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １０．９０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．４ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２ （ｍ， ３， Ｈ）， ６．８ （ｍ， ２， Ｈ）， ４．２ （ｄｄ， １， Ｈ）， ３．９ （ｔ， １， Ｈ）， ３．１ （ｄ， １， Ｈ）， ２．８ （ｂｒ ｄ， １， Ｈ）， ２．６ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．５ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．４ （ｍ， １， Ｈ）， ２．４ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．３ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．２５ （ｍ， １， Ｈ）， ２．２ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．１ （ｍ， １， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３８５．３０ （Ｍ＋１）．
化合物４
【化９８】
１−［４，５−ジクロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【００９９】
ステップ１： （Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
５００ｍＬのフラスコで、（Ｓ）−ベンジルグリシジルエーテル（１５ｇ、９１．４ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）、及び５０重量％のＮａＯＨ（３０ｍＬ、３６５ｍｍｏｌ）を合わせた。この混合液に、２−アミノエチルスルフェート（２５．８ｇ、１８３ｍｍｏｌ）を複数分配で添加した。この不均一な混合液を４０℃に加熱し、この時点で溶液は均一になる。温度を４０℃に４時間維持した。反応液をわずかに冷却し、更に固体ＮａＯＨ（１４．６ｇ、３６５ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬのトルエンと共に添加した。二相性溶液は、次いで６５℃に１２時間加熱した。反応液を室温に冷却して層を分離し、水層を７５ｍＬのトルエンで１回抽出した。有機層を合わせて、１ＭのＨＣｌを７５ｍＬずつ用いて３回洗浄した。合わせた水層のｐＨをｐＨ１２にＮａＯＨ水溶液で調整し、ＥｔＯＡｃを７０ｍＬずつ用いて４回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮して、不透明なオイルとして１０．０８４ｇの所望のモルホリンを得た。
【０１００】
粗製モルホリン産物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）及びＴＥＡ（１２．１ｍＬ、８７．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（１５．９ｇ、７３ｍｍｏｌ）を添加したが、これに伴いＣＯ２ガスが発生した。反応液を室温で１８時間撹拌し、次いで３５ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。更に５０ｍＬの水を添加して、層を分離させた。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮して、フラッシュクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して淡黄色オイル（５．５３６ｇ）として所望のＮ−Ｂｏｃ−Ｏ−ベンジルモルホリンを得た。
【０１０１】
精製した二保護モルホリンを５０Ｌの絶対ＥｔＯＨに溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２（１．２６ｇ、２０重量％、１．８ｍｍｏｌ）を添加した。水素バルーンを取り付けて、アスピレーターを用いてフラスコを排気し、Ｈ２を３回充填した。反応液を、Ｈ２下に３０時間撹拌した。混合液をセライトで濾過し、セライトのパッドをＥｔＯＨで充分に濯いだ。濾過した溶液を減圧下に濃縮して、青白色固体（３．９１８ｇ）として所望のＮ−ｂｏｃ−モルホリンアルコールを得た。
【０１０２】
ステップ２： ４，５−ジクロロ−２−ニトロ−フェノール
３，４−ジクロロフェノール（３．０５３ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）の５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２溶液を入れた２５０ｍＬの丸底フラスコを、氷浴中で０℃に冷却した。撹拌した溶液に、濃Ｈ２ＳＯ４（１．５６ｍＬ、２８．１ｍｍｏｌ）を添加した。溶液は濁った。この混合液に濃ＨＮＯ３（１．２ｍＬ、１８．７ｍｍｏｌ）を滴下し、温度は５℃より下に注意深く保った。反応液を０℃で３０分間撹拌し、その後氷浴で冷却して、１５０ｍＬのＨ２Ｏでクエンチした。層を分離させて、水層を３５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で１回抽出した。有機層を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下に濃縮して、フラッシュクロマトグラフィー（溶離液として１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を用いて精製し、明黄色固体（１．７９３ｇ）として所望のニトロフェノールを得た。
【０１０３】
ステップ３： １−［４，５−ジクロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
化合物１、工程４及び５に対する手順に従い、４，５−ジクロロ−２−ニトロ−フェノール及び（Ｓ）−２−ベンジルオキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４２ （ｓ， １Ｈ）， １０．２９ （ｓ， １Ｈ）， ８．９３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４２ （ｓ， １Ｈ）， ８．２１ （ｓ， １Ｈ）， ７．３２ （ｓ， １Ｈ）， ４．１８−３．４１ （ｍ， ５Ｈ）， ３．０３−２．６６ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ） ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４１２．２ （Ｍ＋１）．
化合物 ５
【化９９】
１−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素
【０１０４】
ステップ１： ５−ブロモ−ピラジン−２−イルアミン
ピラジン−２−イルアミン（６．６６ｇ、７０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）溶液を０℃に冷却して、Ｎ−ブロモスクシンアミド（１２．５ｇ、７０ｍｍｏｌ）で処理し、室温まで昇温させた。得られた反応混合液を終夜撹拌し、その後追加のＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で希釈して、１０％のＮａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。層を分離させ、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで無水ＭｇＳＯ４で乾燥して濾過し、減圧下に濃縮させた。残渣をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に溶かして、ヘキサン（３００ｍＬ）の添加により産物を沈殿させた。沈殿を減圧下に乾燥させて、５．５７ｇの黄褐色固体を得た。
【０１０５】
ステップ２： ５−アミノ−ピラジン−２−カルボニトリル
５−ブロモ−ピラジン−２−イルアミンを、ＤＭＦ（１５ｍＬ）中、ヨウ化銅（Ｉ）（１．３ｇ、６．９ｍｍｏｌ）、シアン化カリウム（０．４４ｇ、６．８ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．９５ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、及び１８−クラウン−６（０．０５８ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）と合わせた。得られた混合液を４０分間撹拌し、その後還流温度（１５５℃）で２時間加熱した。反応液を室温まで冷却し、次いで終夜静置した。沈殿を濾過によって分離し、濾液は真空にて乾燥するまで濃縮した。橙色の残渣をＥｔＯＡｃ及びヘキサンに溶解し、初期沈殿が形成され、その後、濾過によって分離した。静置すると、母液中にさらなる沈殿が形成され、これを濾過により収集した。固体を集めて、０．１０ｇの明橙色固体を得た。
【０１０６】
ステップ３： ２−｛２−［３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−４−メチル−フェノキシメチル｝−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
２−（２−アミノ−４−メチル−フェノキシメチル）−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．０８７ｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）は、２−アミノ−４−メチル−フェノールから、化合物３、工程１及び２の方法に従い、２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物２、工程１に対する手順に従い、対応する酸を用いて調製）及び４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用いて調製した。これをトリホスゲン（０．０２９ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、トルエン（２ｍＬ）及びヒューニッヒ塩基（０．１５ｍＬ、０．８６ｍｍｏｌ）と合わせて、室温で２５分間撹拌した。次いで懸濁液を、ＴＨＦ（１ｍＬ）中に５−アミノ−ピラジン−２−カルボニトリル（０．０３２ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、及びリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（０．２７ｍｍｏｌ）を含有し、−７８℃で３０分間撹拌しておいた冷溶液（−７８℃）に、カニューレを通して移した。反応液は昇温させ、次いで室温で１６時間撹拌した。沈殿が形成され、これを濾過により収集して所望の産物（０．０４３ｇ）を得た。
【０１０７】
ステップ４： １−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素
ＴＨＦ（２ｍＬ）中、２−｛２−［３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−４−メチル−フェノキシメチル｝−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．０４３ｇ、０．０９１８ｍｍｏｌ）のスラリーを、ジオキサン中ＨＣｌ（４Ｍ、０．１１ｍＬ）で処理して、２０時間撹拌した。さらなるジオキサン中ＨＣｌ（４Ｍ、０．２５ｍＬ）を追加して、この反応液を５０℃に１８時間加熱した。反応液は冷却して濃縮した。得られた固体をエーテル中に懸濁させ、その懸濁液を濾過して風乾し、ＨＣｌ塩（０．０４２ｇ）として所望の産物を得た。
【０１０８】
ステップ５： １−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素
１−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素塩酸塩（０．０１０４ｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１ｍＬ）溶液を０℃に冷却し、ホルムアルデヒド（０．１２ｍｍｏｌ）の水溶液、次にナトリウムトリアセトキシホウ化水素（０．０６ｇ、０．２９２ｍｍｏｌ）で処理した。反応液を１２時間撹拌し、次いで真空にて濃縮した。残渣をシリカのクロマトグラフィーにかけ（ＣＨ２Ｃｌ２中２％ＭｅＯＨ）、白色固体（０．０１４ｇ）として産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．９０ （ｓ， １， Ｈ）， １０ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．９ （ｓ， １， Ｈ）， ８．８ （ｓ， １， Ｈ）， ８ （ｓ， １， Ｈ）， ６．９ （ｍ， １， Ｈ）， ６．８ （ｍ， １， Ｈ）， ３．９ （ｍ， ４， Ｈ）， ３．６ （ｔ， １， Ｈ）， ２．９ （ｄ， １， Ｈ）， ２．７ （ｄ， １， Ｈ）， ２．２ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．１ （ｓ， ３， Ｈ）， ２ （ｔ， １， Ｈ）， １．８ （ｔ， １， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３８３．４０ （Ｍ＋１）．
化合物６
【化１００】
１−［５−クロロ−２−（［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１０９】
ステップ１： ３−ベンジル−２−クロロメチル−［１，３］オキサゼパン
３−ベンジルアミノ−プロパン−１−オール（１４ｇ、８８．０ｍｍｏｌ）及びエピクロロヒドリン（８１．４ｇ、８８０ｍｍｏｌ）の溶液を４０℃に加熱した。３時間撹拌した後、反応液を冷却して、過剰のエピクロロヒドリンを真空にて蒸発させることにより除去した。硫酸（１０ｍＬ）をゆっくりと添加し、その後反応フラスコを１５０℃の予加熱油浴に入れた。撹拌を１時間行い、次いで反応液を室温まで冷まして、氷を加えてクエンチした。混合液は、１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で塩基性のｐＨに調整し、ＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて無水ＭｇＳＯ４で乾燥して濾過し、減圧下に乾燥させた。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（７０：２８：２ ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／２Ｍ水性ＮＨ４ＯＨ）により精製して、５ｇの淡黄色オイルを得た。
【０１１０】
ステップ２： ２−（４−クロロ−２−ニトロ−フェノキシメチル）−［１，３］オキサゼパン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
４−ブロモ−２−ニトロ−フェノール（１．３９ｇ、８．０ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３０ｍＬ）撹拌溶液に炭酸カリウム（２．７６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）、次いで３−ベンジル−２−クロロメチル−［１，３］−オキサゼパンを添加した。反応液を６０℃で１２時間撹拌し、次いで室温まで冷まして、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）及び１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液（２００ｍＬ）で希釈した。層を分離し、有機層を鹹水で洗浄して無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空にて濃縮した。粗製産物をフラッシュクロマトグラフィー（７０：３０のヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により精製して、４８０ｍｇの淡橙色オイルを得た。
【０１１１】
オイルをＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶かして、氷浴で冷却した。アルファクロロエチルクロロホルメート（０．１８ｍＬ、１．６５ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を２時間撹拌し、その後２ＮのＨＣｌ水溶液を添加した。撹拌を１０分間継続し、次いで混合液を乾燥するまで濃縮した。得られた残渣をＭｅＯＨに溶かし、２時間還流した。反応液を減圧下に濃縮して、残渣を２ＮのＨＣｌ水溶液（７５ｍＬ）に溶かし、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で洗浄した。水層のｐＨは、固体ＮａＯＨを添加することによりｐＨ１１に調整した。得られた塩基性溶液はＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて鹹水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。濾過及び真空濃縮にて、淡黄色オイルとして２４０ｍｇの産物が得られた。
【０１１２】
オイルをＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解させ、次いでＴＥＡ（０．１１６ｍＬ、０．８３１ｍｍｏｌ）及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（０．１８１ｇ、０．８３１ｍｍｏｌ）で処理した。反応液を室温で１時間撹拌し、次いで更にＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過して減圧下に濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（７：３ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を用いて精製を行い、白色発泡物として２５２ｍｇの産物を得た。
【０１１３】
ステップ３： ２−（２−アミノ−４−クロロ−フェノキシメチル）−［１，３］オキサゼパン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
２−（４−クロロ−２−ニトロ−フェノキシメチル）−［１，３］−オキサゼパン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．２５２ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）から、化合物３、ステップ２の手順に従って、透明油として１５０ｍｇの産物を得た。
【０１１４】
ステップ４： １−［５−クロロ−２−（［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
２−（２−アミノ−４−ブロモ−フェノキシメチル）−［１，３］オキサゼパン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルから、化合物２、ステップ４及び化合物５、ステップ４の手順に従って、０．１７５ｇの産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）， δ ８．６５ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．３ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２５ （ｓ， １， Ｈ）， ６．９８ （ｄｄ， １， Ｈ）， ６．８ （ｄ， １， Ｈ）， ４．０８ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．８ （ｍ， １， Ｈ）， ３．３５ （ｓ， １， Ｈ）， ３．２５ （ｄ， １， Ｈ）， ３ （ｍ， ３， Ｈ）， ２．５ （ｓ， ３， Ｈ）， １．９８ （ｍ， ２， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９１．９０ （Ｍ＋１）．
化合物 ７
【化１０１】
１−［５−メチル−２−（１−メチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１１５】
ステップ１： ３−ヒドロキシメチル−４−メチル−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル１：１のＨ２Ｏ／ジオキサン２００ｍＬ中のピペラジン−２−カルボン酸（２０ｇ、１５４ｍｍｏｌ）のスラリーを氷浴中で冷却し、固体ＮａＯＨ（１１ｇ）、次いでジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（２１．６ｇ、９９ｍｍｏｌｅ）のジオキサン溶液を添加漏斗から滴下して処理した。反応液のｐＨは、反応継続中に必要に応じてｐＨ＞１０に調整した。得られた混合液を３時間撹拌し、次いで均一になるまで水で希釈して、ｐＨが２から３の間になるまで水性濃ＨＣｌで酸性化した。溶液をエーテルで洗浄し、次いでｐＨが６．５〜７になるまでＮａＯＨでｐＨ調整した。溶液を数日間静置し、得られた沈殿を濾過により集めて、白色固体（９．７ｇ）としてピペラジン−１，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得た。
【０１１６】
ＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）中のピペラジン−１，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４．６２ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）のスラリーを、水性ホルムアルデヒド（４０ｍｍｏｌ）及びギ酸（７０ｍｍｏｌ）にて処理し、次いで６５℃で数時間加熱した。ＨＰＬＣにより完了を確認して、反応液を冷まし、真空にて濃縮した。
【０１１７】
残渣をＴＨＦに溶かして氷浴中で冷却し、次いで水素化リチウムアルミニウムのＴＨＦ（１９．０ｍｍｏｌ）溶液で処理した。１時間後に、反応液を室温まで昇温させて、更に３０分間撹拌した。その後反応液を氷浴中で冷却して、Ｈ２Ｏ（０．７５ｍＬ）及び１５％ＮａＯＨ水溶液（０．７５ｍＬ）、そして再度Ｈ２Ｏ（３×０．７５ｍＬ）でクエンチした。塩を濾過により除去し、濾液を減圧下に濃縮して粗製産物を得た。シリカゲル（ＣＨ２Ｃｌ２中２．５％ＭｅＯＨ）のクロマトグラフィーで、黄色オイル（０．７０ｇ）として産物を得た。
【０１１８】
ステップ２： １−［５−メチル−２−（１−メチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
３−ヒドロキシメチル−４−メチル−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いる化合物３の手順、及び化合物５、ステップ４に従って、調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２４ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， １０．１ （ｓ， １， Ｈ）， ９．７ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．４２ （ｓ， １， Ｈ）， ９．１２ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２ （ｓ， １， Ｈ）， ８．０８ （ｓ， １， Ｈ）， ６．９１ （ｄ， １， Ｈ）， ６．８２ （ｄ， １， Ｈ）， ４．６ （ｄ， １， Ｈ）， ４．４ （ｍ， １， Ｈ）， ４．１ （ｍ， １， Ｈ）， ３．６ （ｍ， ６， Ｈ）， ３ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．４ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．２ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７１．４０ （Ｍ＋１）．
化合物８
【化１０２】
１−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素化合物５、ステップ１〜４の手順に従い、４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用いて調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）， δ ８．８０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．７ （ｓ， １， Ｈ）， ７．９ （ｓ， １， Ｈ）， ６．８ （ｍ， ２， Ｈ）， ４．２ （ｍ， ４， Ｈ）， ３．８ （ｍ， １， Ｈ）， ３．６ （ｍ， １， Ｈ）， ３．５ （ｍ， １， Ｈ）， ３．２ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．３ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３６９．３０ （Ｍ＋１）．
化合物 ９
【化１０３】
１−［５−クロロ−４−メチル−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１１９】
化合物４、ステップ１の手順を用いて調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルと、化合物４、ステップ２の手順に従って調製した４−クロロ−５−メチル−２−ニトロ−フェノールとを用いて、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３２ （ｓ， １Ｈ）， １０．２１ （ｓ， １Ｈ）， ８．７５ （ｓ， １Ｈ）， ８．２９−８．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０６ （ｄ， １Ｈ）， ７．１８ （ｄ， １Ｈ）， ４．１２−３．４２ （ｍ， ５Ｈ）， ３．２９−２．６３ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．２ （Ｍ＋１）．
化合物１０
【化１０４】
１−［５−クロロ−４−メチル−２−（Ｒ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２０】
（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルから化合物４、ステップ１を用いて調製した２−ヒドロキシメチル−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸と、化合物４、ステップ２の手順に従って調製した４−クロロ−５−メチル−２−ニトロ−フェノールとを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３２ （ｓ， １Ｈ）， １０．２１ （ｓ， １Ｈ）， ８．７５ （ｓ， １Ｈ）， ８．２９−８．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０６ （ｄ， １Ｈ）， ７．１８ （ｄ， １Ｈ）， ４．１２−３．４２ （ｍ， ５Ｈ）， ３．２９−２．６３ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．３ （Ｍ＋１）．
化合物１１
【化１０５】
１−［４，５−ジクロロ−２−（Ｒ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２１】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４，５−ジクロロ−２−ニトロ−フェノールを用いて、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４２ （ｓ， １Ｈ）， １０．２９ （ｓ， １Ｈ）， ８．９３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４２ （ｓ， １Ｈ）， ８．２１ （ｓ， １Ｈ）， ７．３２ （ｓ， １Ｈ）， ４．１８−３．４１ （ｍ， ５Ｈ）， ３．０３−２．６６ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４１２．２ （Ｍ＋１）．
化合物１２
【化１０６】
１−［４，５−ジメチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２２】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４，５−ジメチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．０２ （ｓ， １Ｈ）， ９．８９ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．８５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．２７ （ｓ， １Ｈ）， ８．９１ （ｓ， １Ｈ）， ６．８４ （ｓ， １Ｈ）， ４．１８−３．９７ （ｍ， ３Ｈ）， ３．６９ （ｔ， １Ｈ）， ３．４３−３．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９７ （ｔ， ２Ｈ）， ２．３３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ２Ｈ）， ２．１２ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７２．３ （Ｍ＋１）．
化合物１３
【化１０７】
１−［４−クロロ−５−メチル−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２３】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び５−クロロ−４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２６ （ｓ， １Ｈ）， ８．８２ （ｓ， １Ｈ）， ８．１９ （ｓ， １Ｈ）， ８．１７ （ｓ， １Ｈ）， ７．１０ （ｓ， １Ｈ）， ４．２１３．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９０−３．８６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５４ （ｄｔ， １Ｈ）， ２．９８ （ｄ， １Ｈ）， ２．８４ （ｔ， ２Ｈ）， ２．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２１ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．１ （Ｍ＋１）．
化合物 １４
【化１０８】
１−［５−シアノ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２４】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−ヒドロキシ−３−ニトロ−ベンゾニトリルを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １０．３０ （ｓ， １Ｈ）， ８．６２ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．５３ （ｓ， １Ｈ）， ８．２１ （ｓ， １Ｈ）， ７．４８ （ｄ， １Ｈ）， ７．３３ （ｄ， １Ｈ）， ４．２０−４．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９４−３．７３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５１ （ｄｔ， １Ｈ）， ３．００ （ｄ， １Ｈ）， ２．７７−２．６１ （ｍ， ２Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３６９．２ （Ｍ＋１）．
化合物 １５
【化１０９】
１−［５−クロロ−４−エチル−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２５】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−クロロ−５−エチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３３ （ｓ， １Ｈ）， １０．１９ （ｓ， １Ｈ）， ８．６６ （ｓ， １Ｈ）， ８．３３−８．０１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．０５ （ｄ， １Ｈ）， ４．２９−３．３９ （ｍ， ５Ｈ）， ３．２９−２．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８９−２．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５８ （ｑ， ２Ｈ）， ２．４９ （ｓ， ３Ｈ）， １．１７ （ｔ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４０６．１ （Ｍ＋１）．
化合物１６
【化１１０】
１−［５−クロロ−４−メトキシ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２６】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−クロロ−５−メトキシ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．１１ （ｓ， １Ｈ）， １０．０５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．６４ （ｓ， １Ｈ）， ８．１９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９１ （ｓ， １Ｈ）， ４．２９ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１６ （ｍ， １Ｈ）， ４．０９ （ｄ， １Ｈ）， ３．８７ （ｓ， ３Ｈ）， ３．７５ （ｔ， １Ｈ）， ３．４４−３．１７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０１ （ｔ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４０８．０ （Ｍ＋１）．
化合物１７
【化１１１】
１−［５−ジメチルアミノ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２７】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−ジメチルアミノ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．１１ （ｓ， １Ｈ）， １０．０５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．６９ （ｓ， １Ｈ）， ８．１９ （ｓ， １Ｈ）， ７．７５ （ｓ， １Ｈ）， ６．９０ （ｄ， １Ｈ）， ６．３４ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．０５−３．８１ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５６ （ｔ， １Ｈ）， ３．１４ （ｄ， １Ｈ）， ２．９３ （ｄ， １Ｈ）， ２．８０ （ｓ， ６Ｈ）， ２．７６−２．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３８７．４ （Ｍ＋１）．
化合物１８
【化１１２】
１−［５−ブロモ−４−メチル−２−Ｓ−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２８】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した４−ブロモ−５−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３１ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １０．１９ （ｓ， １Ｈ）， ８．６３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４１ （ｓ， １Ｈ）， ８．２０ （ｓ， １Ｈ）， ７．０７ （ｓ， １Ｈ）， ４．１３−３．９４ （ｍ， ３Ｈ）， ３．８７−３．７４ （ｍ， ２Ｈ）， δ ３．５２ （ｔｄ， １Ｈ）， ３．００ （ｄ， １Ｈ）， ２．６９ （ｔ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｓ， １Ｈ）， ２．２５ （ｓ， １Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４３８．２．０ （Ｍ＋１）．化合物１９
【化１１３】
１−［５−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２９】
化合物２、ステップ１の手順に従って対応する酸から調製した２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて、化合物３の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）， δ ８．９０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．６ （ｓ， １， Ｈ）， ７．９ （ｓ， １， Ｈ）， ６．９ （ｍ， ２， Ｈ）， ４．２ （ｍ， ４， Ｈ）， ３．８ （ｔ， １， Ｈ）， ３．７ （ｓ， ２， Ｈ）， ３．５ （ｄ， １， Ｈ）， ３．２ （ｍ， １， Ｈ）， ２．６ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．３ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３５８．２０ （Ｍ＋１）．
化合物２０
【化１１４】
１−［５−クロロ−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３０】
化合物２、ステップ１の手順に従って対応する酸から調製した４−クロロ−２−ニトロ−フェノール及び２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用い、化合物３の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）， δ ８．７０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．５ （ｓ， １， Ｈ）， ８．４ （ｓ， １， Ｈ）， ７．０５ （ｍ， １， Ｈ）， ４．２ （ｍ， ４， Ｈ）， ３．８ （ｔ， １， Ｈ）， ３．５ （ｄ， １， Ｈ）， ３．２ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．６ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７８．５０ （Ｍ＋１）．
化合物２１
【化１１５】
１−［５−クロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３１】
４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３５ （ｓ， １， Ｈ）， ９．４ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．５５ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．２５ （ｍ， ２， Ｈ）， ７．２２ （ｍ， ２， Ｈ）， ４．２ （ｍ， ３， Ｈ）， ４ （ｄ， １， Ｈ）， ３．８ （ｔ， １， Ｈ）， ３．４ （ｄ， １， Ｈ）， ３．２ （ｄ， １， Ｈ）， ２．８ （ｍ， １， Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７８．３０ （Ｍ＋１）．
化合物２２
【化１１６】
１−［５−メチル−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３２】
（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル及び４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２０ （ｓ， １， Ｈ）， １０．１ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．８９ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．５ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．７ （ｓ， １， Ｈ）， ８．３ （ｓ， １， Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １， Ｈ）， ６．９ （ｍ， １， Ｈ）， ６．８ （ｍ， １， Ｈ）， ４ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．４２ （ｍ， ２， Ｈ）， ３．１９ （ｍ， ２， Ｈ）， ３ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３５８．３０ （Ｍ＋１）．
化合物２３
【化１１７】
１−［５−クロロ−２−（Ｒ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３３】
（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル及び４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４５ （ｓ， １， Ｈ）， ９．６ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．３ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．７ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．３ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１９ （ｍ， ２， ）， ４．２ （ｍ， ２， Ｈ）， ４ （ｄ， １， Ｈ）， ３．８４ （ｔ， １， Ｈ）， ３．４１ （ｄ， １， Ｈ）， ３．２１ （ｄ， １， Ｈ）， ３．０２ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．５ （ｓ， ３， Ｈ）ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７８．３０ （Ｍ＋１）．化合物２４
【化１１８】
１−［５−クロロ−２−Ｒ−（［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３４】
（Ｒ）−２−ヒドロキシメチル−［１，４］オキサゼパン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用い、化合物１の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．８３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．３９ （ｄｄ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ）， ８．０４ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．９９ （ｄｄ， １Ｈ）， ６．８２ （ｄ， １Ｈ）， ４．２５−３．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９０−３．７６ （ｍ， １Ｈ）， ３．３８ （ｄ， １Ｈ）， ３．１３−３．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．００ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．５４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６−１．８９ （ｍ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．３ （Ｍ＋１）．
化合物２５
【化１１９】
１−［５−クロロ−２−（１−メチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３５】
４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物７の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３５ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， １０．２ （ｓ， １， Ｈ）， ９．８４ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．６ （ｓ， １， Ｈ）， ８．３１ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２１ （ｓ， １， Ｈ）， ７．０８ （ｍ， ２， Ｈ）， ４．５８ （ｄ， １， Ｈ）， ４．４２ （ｄ， １， Ｈ）， ３．７ （ｍ， ６， Ｈ）， ３ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．４４ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９１．４０ （Ｍ＋１）．
化合物２６
【化１２０】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（１−メチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３６】
Ｓ−ピペラジン−２−カルボン酸及び４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物７の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ８．８０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２８ （ｄ， ２， Ｈ）， ６．９９ （ｓ， ２， Ｈ）， ４．１７ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．１ （ｄ， １， Ｈ）， ２．９２ （ｄ， ２， Ｈ）， ２．８４ （ｔ， １， Ｈ）， ２．５ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．４５ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．４２ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９１．３０ （Ｍ＋１）．
化合物２７
【化１２１】
１−［５−クロロ−４−メチル−２−Ｓ−（［１，４］−オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３７】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した４−クロロ−５−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２ （ｓ， １Ｈ）， ８．６２ （ｓ， １Ｈ）， ８．２７ （ｓ， １Ｈ）， ８．２４ （ｓ， １Ｈ）， ７．３２ （ｍ， １Ｈ）， ７．１８ （ｓ， １Ｈ）， ４．０９−３．９１ （ｍ， ３Ｈ）， ３．９０−３．７９ （ｍ， １Ｈ）， ３．７７−３．６２ （ｍ， １Ｈ）， ３．１４ （ｄ， １Ｈ）， ２．８５ （ｍ， １Ｈ）， ２．７３ （ｓ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２７ （ｓ， １Ｈ）， １．８２−１．６７ （ｍ， ２Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４０６．２ （Ｍ＋１）．
化合物２８
【化１２２】
１−［５−ブロモ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３８】
４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ）， δ １０．３０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．６３ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．４３ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２２ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１５ （ｍ， １， Ｈ）， ７．０５ （ｄ， １， Ｈ）， ４．０８ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．８２ （ｍ， ２， Ｈ）， ３．４７ （ｔ， １， Ｈ）， ３．１７ （ｓ， ２， Ｈ）， ３ （ｄ， １， Ｈ）， ３．０７ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．６８ （ｍ， ２， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４２３．９０ （Ｍ＋１）．
化合物２９
【化１２３】
１−［５−ブロモ−２−Ｒ−（Ｒ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３９】
（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル及び４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ）， δ １０．３０ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．６５ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．４３ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２５ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１８ （ｄｄ， １， Ｈ）， ７．０３ （ｄ， １， Ｈ）， ４．０３ （ｍ， ２， Ｈ）， ３．８２ （ｍ， ２， Ｈ）， ３．５２ （ｔ， ２， Ｈ）， ３．１９ （ｄ， １， Ｈ）， ３ （ｄ， １， Ｈ）， ２．７６ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４４３．９０ （Ｍ＋１）．
化合物３０
【化１２４】
１−［５−ブロモ−２−Ｓ−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４０】
４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用いる化合物４の手順、及び化合物２，ステップ４並びに化合物５，ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）， δ １１．４３ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．０２ （ｓ， １， Ｈ）， ８．６ （ｓ， １， Ｈ）， ８．３３ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１２ （ｄ， １， Ｈ）， ６．７６ （ｄ， １， Ｈ）， ４ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．８ （ｔ， １， Ｈ）， ３．０２ （ｄ， １， Ｈ）， ２．７３ （ｄ， １， Ｈ）， ２．５１ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．３ （ｔ， １， Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．０８ （ｔ， １， Ｈ）．化合物３１
【化１２５】
１−［５−ブロモ−２−（［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４１】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物６の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）， δ ８．７２ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．４８ （ｓ， １， Ｈ）， ８．４５ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１１ （ｄ， １， Ｈ）， ６．７５ （ｄ， １， Ｈ）， ４．０２ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．８ （ｍ， １， Ｈ）， ３．２１ （ｄ， １， Ｈ）， ２．９７ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．５１ （ｓ， ３， Ｈ）， １．９２ （ｂｒ ｍ， ２， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４３６．００ （Ｍ＋１）．
化合物３２
【化１２６】
１−［５−ブロモ−２−（４−メチル−［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４２】
４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用いる化合物６の手順に従い、化合物５、ステップ５の手順によって調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）， δ ８．２５ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２３ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１ （ｄ， １， Ｈ）， ６．７２ （ｄ， １， Ｈ）， ４．１９ （ｍ， １， Ｈ）， ４ （ｍ， １， Ｈ）， ３．９５ （ｍ， ２， Ｈ）， ３．４２ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ３．０２ （ｄ， １， Ｈ）， ２．８４ （ｍ， １， Ｈ）， ２．６２ （ｔ， １， Ｈ）， ２．５ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．４ （ｓ， ３， Ｈ）， ２ （ｍ， ２， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４５１．９０ （Ｍ＋１）．
化合物３３
【化１２７】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（４−シアノメチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素１−［５−クロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（０．１８９ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）中に懸濁した。カルボン酸カリウム（０．１０４ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）及びブロモアセトニトリル（０．０３５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８０℃で８時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却させ、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）の添加によって奪活させた。得られた個体をろ過して回収し、メタノールから再結晶させることで、白色粉末（０．０７２ｇ）として産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４６ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １０．２６ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．６３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．３１ （ｄ， １Ｈ）， ８．１７ （ｓ， １Ｈ）， ７．１０ （ｄ， １Ｈ）， ７．０３ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．１４ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．０９ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．９６−４．０１ （ｍ， １Ｈ）， ３．９１３．９５ （ｍ， １Ｈ）． ３．８１ （ｄ， １Ｈ）， ３．７２ （ｄ， １Ｈ）， ３．６４ （ｔｄ， １Ｈ）， ２．９５ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ２．７２ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３２ （ｔｄ， １Ｈ）， ２．１８ （ｔ， １Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４１７ （Ｍ＋１）．
化合物３４
【化１２８】
１−［５−クロロ−２−（チオモルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４３】
化合物２、ステップ２（化合物２、ステップ１の手順に従い、チオモルホリン−２，４−ジカルボン酸４−ｔｅｒｔ−ブチルエステルから得た２−ヒドロキシメチル−チオモルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いる）、並びに化合物３、ステップ２及び化合物２、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４８ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １０．２７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．６２ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．３１ （ｄ， １Ｈ）， ８．２１ （ｓ， １Ｈ）， ７．１２ （ｄ， １Ｈ）， ７．０３ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．３６ （ｔ， １Ｈ）， ４．１２ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．２４ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．１０−３．１７ （ｍ， １Ｈ）， ２．９９ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．９４−２．９８ （ｍ， １Ｈ）， ２．８９ （ｄｄｄ， １Ｈ）， ２．７１ （ｄｄｄ， １Ｈ）， ２．４６−２．４８ （ｍ， １Ｈ）， ２．４４ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９４ （Ｍ＋１）．
化合物３５
【化１２９】
１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−［３−Ｓ−（モルホリン−２−イルメトキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル］−尿素
【０１４４】
化合物３、ステップ１（化合物２、ステップ１の手順に従ってＳ−モルホリン−２，４−ジカルボン酸４−ｔｅｒｔ−ブチルエステルから得た（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、及び化合物４、ステップ２及び化合物１、ステップ５の手順に従って調製した３−ニトロ−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オールを用いる）の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．０９ （ｂｒ，１，Ｈ）， １０．０５ （ｓ，１，Ｈ）， ８．６０ （ｂｒ ｓ，１，Ｈ）， ８．１７ （ｓ，１，Ｈ）， ７．８６ （ｓ，１，Ｈ）， ６．６８ （ｓ，１，Ｈ）， ３．９７ （ｍ，１，Ｈ）， ３．８９ （ｍ，１，Ｈ）， ３．７８ （ｍ，２，Ｈ）， ３．３１ （ｔ，１，Ｈ）， ２．９８ （ｄ，１，Ｈ）， ２．６３ （ｍ，６，Ｈ）， ２．４４ （ｍ，１，Ｈ）， ２．４１ （ｓ，３，Ｈ）， １．６８ （ｍ，４，Ｈ）．
化合物３６
【化１３０】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（モルホリン−３−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４５】
モルホリン−３−Ｓ−４−ジカルボン酸４−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用い、化合物２の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２２ （ｓ，１，Ｈ）， ９．９６ （ｂｒ，１，Ｈ）， ８．７４ （ｓ，１，Ｈ）， ８．２９ （ｄ，１，Ｈ）， ８．１８ （ｓ，１，Ｈ）， ７．０４ （ｍ，２，Ｈ）， ３．９４ （ｍ，３，Ｈ） ３．７０ （ｂｒ ｄ， １，Ｈ）， ３．４２ （ｍ，１，Ｈ）， ３．２３ （ｍ，２，Ｈ）， ２．８３ （ｂｒ ｓ，２，Ｈ）， ２．４３ （ｓ，３，Ｈ）．
化合物３７
【化１３１】
１−［５−メチル−２−Ｒ−（モルホリン−３−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４６】
４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物２の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．０８ （ｂｒ ｓ，１，Ｈ）， ９．７６ （ｂｒ，１，Ｈ）， ８．１７ （ｓ，１，Ｈ）， ８．０３ （ｄ，１，Ｈ）， ６．９０ （ｄ，１，Ｈ）， ６．８０ （ｄ，１，Ｈ）， ３．８８ （ｍ，３，Ｈ）， ３．７０ （ｂｒ ｄ，２，Ｈ）， ３．４１ （ｍ，１，Ｈ）， ３．２０ （ｍ，２，Ｈ）， ２．８２ （ｍ，２，Ｈ）， ２．４３ （ｓ，３，Ｈ）， ２．２４ （ｓ，３，Ｈ）．
化合物３８
【化１３２】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−トリフルオロメチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４７】
Ｍｉｅｓｅｌの米国特許第４，２９３，５５２号の方法に従って調製した５−トリフルオロメチル−ピラジン−２−イルアミン、並びに（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用い、化合物１、ステップ２〜５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．８５ （ｂｓ， １Ｈ）， ９．９７ （ｂｓ， １Ｈ）， ９．１１ （ｂｓ， １Ｈ）， ８．９８ （ｂｓ， １Ｈ）， ８．７３ （ｂｓ， １Ｈ）， ８．２２ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．０８ （ｂｓ， １Ｈ）， ４．１９−３．７３ （ｍ， ６Ｈ）， ３．３２−２．９８ （ｍ， ４Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４３２ （Ｍ＋１）．化合物３９
【化１３３】
１−［４−クロロ−５−メチル−２−Ｓ−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４８】
化合物４、ステップ２の手順に従い３−クロロ−４−メチル−フェノールから調製した５−クロロ−４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物５、ステップ１〜４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １０．３９ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ９．０５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．７４ （ｓ， １Ｈ）， ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ）， ６．９１ （ｓ， １Ｈ）， ４．０４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７８ （ｍ， １Ｈ）， ３．１９ （ｄ， １Ｈ）， ２．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７８ （ｍ， １Ｈ）， ２．３６ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＣＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ４０３．１６ （Ｍ＋１）．化合物４０
【化１３４】
１−［５−クロロ−４−メトキシ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４９】
化合物１、ステップ２（化合物５、ステップ１及び２の手順に従って調製した５−アミノ−ピラジン−２−カルボニトリルを用いる）の手順、及び化合物１、ステップ４及び５（化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−クロロ−５−メトキシ−２−ニトロ−フェノールを用いる）の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．８２ （ｓ， １Ｈ）， ９．９３ （ｓ， １Ｈ）， ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．８１ （ｓ， １Ｈ）， ８．１４ （ｓ， １Ｈ）， ６．９３ （ｓ， １Ｈ）， ４．２５ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１３−３．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．６１ （ｔ， １Ｈ）， ３．４１−３．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１７−２．９１ （ｍ， ２Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４１９．１ （Ｍ＋１）．
化合物４１
【化１３５】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１５０】
化合物１、ステップ２（化合物５、ステップ１及び２の手順に従って調製した５−アミノ−ピラジン−２−カルボニトリルを用いる）、及び化合物１、ステップ４及び５（２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用いる）の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．９７ （ｂｓ， １Ｈ）， １０．０２ （ｂｓ， １Ｈ）， ９．０５ （ｂｓ， １Ｈ）， ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．８５ （ｓ， １Ｈ）， ８．２ （ｓ， １Ｈ）， ７．１０ （ｍ， １Ｈ）， ３．９６−４．２４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６８−３．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０ （ｍ， ２Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３８８ （Ｍ＋１）．
化合物４２
【化１３６】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１５１】
ステップ１： １−［５−クロロ−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素化合物１、ステップ２（化合物５、ステップ１及び２の手順に従って調製した５−アミノ−ピラジン−２−カルボニトリルを用いる）の手順、及び化合物１、ステップ４及び５（２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用いる）の手順に従って調製し、０．２７ｇの産物を得た。
【０１５２】
ステップ２： １−［５−クロロ−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素（０．２７６ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に懸濁し、カルボン酸カリウム（０．１５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）及びヨウ化メチル（０．０４６ｍＬ、０．７３ｍｍｏｌ）で処理した。混合物は均質化され、室温にて４時間撹拌した。水（２０ｍＬ）を添加して反応物を奪活し、ＣＨＣｌ３：ｉＰｒＯＨの３：１混合物（３ｘ２５ｍＬ）で抽出した。混合有機層を減圧下で濃縮し、残渣をエタノールで練和した。ろ過によって、白色個体として０．２１４ｇの産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １１．０１ （ｓ， １Ｈ）， １０．１６ （ｓ， １Ｈ）， ８．８６ （ｄ， ２Ｈ）， ８．２７ （ｄ， １Ｈ）， ８．１７ （ｓ， １Ｈ）， ７．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２５−４．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９５ （ｍ， １Ｈ）， ３．８３ （ｄ， １Ｈ）， ３．６１ （ｔ， １Ｈ）， ２．８９ （ｄ， １Ｈ）， ２．６５ （ｄ， １Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０２ （ｔｄ， １Ｈ）， １．８３ （ｔ， １Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４０３．０ （Ｍ＋１）．
化合物４３
【化１３７】
１−［５−クロロ−２−（Ｓ−４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１５３】
１−［５−クロロ−２−（Ｓ−４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素を用い、化合物４２，ステップ２の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．５４ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １０．２４ （ｓ， １Ｈ）， ８．７３ （ｓ， １Ｈ）， ８．３０ （ｓ， １Ｈ）， ８．２７ （ｓ， １Ｈ）， ７．１２−６．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１７−３．８１ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５９ （ｔ， １Ｈ）， ３．９１ （ｄ， １Ｈ）， ２．６４ （ｄ， １Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０３ （ｔｄ， １Ｈ）， １．８２ （ｔ， １Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．１ （Ｍ＋１）．
治療方法
【０１５４】
本発明の化合物を使用して、異常な細胞増殖が関わる症状を治療できる。例えば、化合物を使用して、癌、及びヒト及び他の動物のものを含む、真核細胞に関わる他の細胞増殖適応症の治療に用いる放射線及び／又は化学療法薬の治療効果を増強できる。一般的に、本発明の化合物は、癌性及び非癌性の双方の、異常に増殖している細胞を阻害する。例えば、本発明の化合物を使用して、例えば、メトトレキセート、ゲムシタビン、又は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗剤で通例のように処置される腫瘍の治療を増強できる。
【０１５５】
本発明の化合物の使用の結果、異常に増殖している細胞の部分的又は完全な退行、すなわち、細胞集団からのこのような細胞の減少又は排除を引き起こすことができる。例えば、異常に増殖している細胞の集団が腫瘍細胞である場合、腫瘍成長速度を遅延させ、腫瘍の数を減少させ、及び／又は部分的もしくは完全な腫瘍退行を誘導するのに、本発明の化合物を使用できる。
【０１５６】
異常な細胞増殖が全く同定されない場合、又は異常な細胞増殖は進行していないが、異常な細胞増殖が疑われるか予期される場合に、本発明の化合物をインビボ又はエキソビボで使用できる。異常な細胞増殖が、その再発を予防又は阻止するために予め治療されている場合にも、本発明の化合物を使用できる。
【０１５７】
本発明の一方法は、化学療法薬と組み合わせて、それを必要としている個体に治療上有効な量の本発明のＣｈｋ１インヒビタを投与することを含む。あるいは、本発明の方法は、癌細胞の増殖を阻害する活性を有する、ハーセプチン等の抗体と組み合わせて、それを必要としている個体に治療上有効な量の少なくとも１種の本発明のＣｈｋ１インヒビタを投与することを含む。
【０１５８】
従って、化学療法薬又は抗体と組み合わせて本発明のＣｈｋ１インヒビタを投与することにより強化した治療に対して、癌は感受性である。本発明によって治療可能な癌として、固形腫瘍、並びに白血病、リンパ腫、及び典型的に腫瘍塊がないが、血管又はリンパ細網系に分布するその他の癌を含む、骨髄系又はリンパ系の癌により特徴付けられる癌腫及び肉腫が挙げられる。これら癌としては、例えば、大腸癌、頭部及び頚部癌、膵癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、外陰部癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、腎細胞癌、卵巣癌、脳癌、骨肉腫及び肺癌が挙げられる。
【０１５９】
従って、本発明の化合物は、Ｃｈｋ１活性によって調節される癌において有用である。より詳細には、Ｃｈｋ１活性は癌の形態に関係し、特に限定されないが、成体及び小児オンコロジー、固形癌／悪性成長、粘液様且つ円形細胞の癌腫、局所的な腫瘍の進行、移転性癌、ユーイング肉腫等のヒト軟組織肉腫、特に頭部及び頚部のリンパ転移、有棘細胞癌等の癌転移、食道有棘細胞癌、経口癌、骨髄腫等の血球悪性、急性リンパ性白血病、急性反リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病及び毛様細胞白血病等の白血病、滲出リンパ腫（体腔系リンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌（小細胞癌腫及び管癌腫等の小細胞癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンスリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ−産生性腫瘍、非小細胞癌、乳癌）、胃腸性の癌（胃癌、結腸癌、大腸癌、及び結腸直腸新形成に関連するポリープ等）、膵癌、肝癌、泌尿器科学の癌（原発性表在膀胱腫瘍、膀胱及び筋侵襲的膀胱癌の侵襲的移行上皮癌等の膀胱癌等）、前立腺癌、女性生殖器の悪性腫瘍（子房癌腫、原発性腹膜上皮腫瘍、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、卵胞の外陰部、子宮癌及び固形癌等）、男性生殖器の悪性腫瘍（精巣癌及びペニス癌等）、腎癌（腎細胞癌腫等）、脳癌（内因的脳腫瘍、神経芽、アストロサイトの脳腫瘍、神経膠腫、及び中枢神経系内の転移性腫瘍細胞滲出等）、骨癌（骨腫及び骨肉腫等）、皮膚癌（黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行及び鱗状細胞癌等）、甲状腺ガン、網膜芽腫、神経芽、腹水、悪性胸水、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆のう癌、栄養膜の腫瘍、血管外皮細胞腫、及びカポジ肉腫が挙げられる。
【０１６０】
本発明の化合物は、細胞の放射増感にも使用できる。放射線で治療できる疾病としては、特に限定されないが、腫瘍性疾患、良性及び悪性腫瘍、並びに癌細胞が挙げられる。放射線治療は、γ線（１０−２０〜１０−１３ｍ），Ｘ線（１０−１２〜１０−９ｍ）、紫外光（１０ｎｍ〜４００ｎｍ）、可視光（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）、赤外線（７００ｎｍ〜１．０ｍｍ）、及びマイクロ波（１ｍｍ〜３０ｃｍ）等の電磁波照射を使用する。
【０１６１】
現在、癌治療プロトコルでは場合により、電磁放射線、例えば、Ｘ線によって活性化された放射線治療薬が用いられる。Ｘ線活性化放射線治療薬の例としては、特に限定されないが、メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、ＥＯ９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジンーリン酸（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシ尿素、シスプラチン、及びその治療的に有効なアナログ及び誘導体が挙げられる。
【０１６２】
癌の光線力学的療法（ＰＤＴ）では、増感作用因子の放射線活性化因子として可視光が用いられる。光力学的放射線治療薬の例としては、特に限定されないが、ヘマトポルフィリン誘導体、ＰＨＯＴＯＦＲＩＮ（登録商標）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、エチオポルフィリンスズ（ＳｎＥＴ２）、フェオボルビド−ａ、バクテリオクロロフィル−ａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、及びその治療的に有効なアナログ及び誘導体が挙げられる。
【０１６３】
放射線治療薬は、Ｃｈｋ１インヒビタに加えて治療上有効な量の１以上の化合物と共に投与でき、かかる化合物としては、限定されないが、標的細胞への放射線治療薬の取込みを促進する化合物や、治療剤、栄養分、及び／もしくは酸素の標的細胞への流動を制御する化合物、さらなる放射線の存在もしくは非存在下に腫瘍に作用する化学療法薬、又は癌もしくは他の疾病の処置用の他の治療上有効な化合物が挙げられる。放射線治療薬と併せて使用できる、さらなる治療剤又は方法の例として、限定されないが、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、酸素、カルボゲン、赤血球細胞注入、パーフルオロカーボン（例えば、ＦＬＵＯＳＯＬＷ（登録商標）−ＤＡ）、２，３−ＤＰＧ、ＢＷ１２Ｃ、カルシウムチャンネルブロッカー、ペントキシフィリン、抗血管新生化合物、ヒドララジン、及びＬ−ＢＳＯが挙げられる。
【０１６４】
癌を治療するために本発明の化合物と組み合わせて使用できる化学療法薬として、限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン及びそのアンタゴニスト、放射性同位体、抗体や、更には天然産物、並びにその組み合わせが挙げられる。例えば、本発明のインヒビタ化合物は、ドキソルビシン等の抗生物質、並びに他のアントラサイクリン類似体、シクロホスファミド等のナイトロジェンマスタード類、５−フルオロウラシル等のピリミジン類似体、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、タキソール、並びにその天然及び合成誘導体等と共に投与できる。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性及びゴナドトロピン非依存性細胞を含む乳房の腺癌等の混合腫瘍の場合、化合物をロイプロリド又はゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類似体）と併せて投与できる。他の抗悪性腫瘍プロトコルには、本明細書で「抗悪性腫瘍補助様式」とも称される、例えば手術又は放射線等の別の治療様式と共にインヒビタ化合物を使用することが含まれる。本発明で有用なさらなる化学療法薬として、ホルモン及びそのアンタゴニスト、放射性同位体、抗体、天然産物、並びにその組み合わせが挙げられる。本発明の化合物を用いる方法で有用な化学療法薬の例を、以下の表に挙げる。
【表１−１】
【表１−２】
【０１６５】
放射線治療薬との併用に特に有用な化学療法薬の例としては、例えば、カンプトセシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ＩＦＮ（α、β、γ）、イリノテカン（ヒドロキシ尿素）、クロランブシル、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ＭＴＸ、２−クロロアデノシン、フルダラビン、アザシチジン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、及びその治療的に有効なアナログ及び誘導体が挙げられる。
【０１６６】
本発明によれば、ゲムシタビン単独、又は更にパクリタキセルと共に、本発明の化合物を組み合わせるのが有用である。また、ペメトレキセド単独、又は更にシスプラチン、カルボプラチン、もしくは他のプラチン類と共に、本発明の化合物と組み合わせるのも有用である。本発明のＣｈｋ１インヒビタは、ゲムシタビン及びペメトレキセドと組み合わせて投与することもできる。
【０１６７】
ゲムシタビンと組み合わせて投与されるＣｈｋ１インヒビタは、例えば、膵癌、子宮平滑筋肉腫、骨肉腫、転移性非小細胞肺癌、四肢及び体躯軟組織肉腫、腎細胞癌、腺癌、及びホジキン病の治療に有用であり得る。ペメトレキセドと共に投与される本発明のＣｈｋ１インヒビタは、中皮腫の治療に有用でありうる。
【０１６８】
本発明の化合物はまた、異常な細胞増殖により特徴付けられる炎症性疾患、症状、又は障害の治療に使用される薬物の効力を強化することもできる。本発明の化合物で治療できる炎症性疾患の例としては、特に限定されないが、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、白斑、ヴェゲナー肉芽腫症、全身性発生若年型慢性関節炎（ＪＣＡ）、及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）が挙げられる。関節炎、ヴェグナー肉芽腫症、及びＳＬＥの治療には、イオン化放射線、メトトレキセート、及びシクロホスファミド等の免疫抑制治療剤の使用が含まれることが多い。このような治療は、典型的に、直接的又は間接的にＤＮＡ損傷を誘発する。攻撃中の免疫細胞内のＣｈｋ１活性の阻害によって、これらの標準的治療による制御に対して細胞がより感受性になる。乾癬及び白斑は通常、ソラレンと組み合わせて紫外放射線（ＵＶ）で治療される本発明の化合物は、ＵＶ及びソラレンによる死滅効果を増強し、この治療計画の治療係数を増加させる。一般的に、本発明の化合物は、免疫抑制薬と組み合わせて用いた場合に炎症性疾患細胞の制御を増強する。
【０１６９】
本発明の化合物はまた、異常に増殖している細胞により特徴付けられる他の非癌性症状を治療する方法にも使用できる。かかる症状としては、特に限定されないが、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、血管炎、腎炎、網膜症、腎臓病、増殖性皮膚障害、乾癬、ケロイド瘢痕、光線性角化症、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、骨粗鬆症、上皮下方成長等の目の過剰増殖性疾患、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、糖尿病性網膜症、血管増殖性疾患、魚鱗癬、及び乳頭腫が挙げられる。
【０１７０】
本発明のＣｈｋ１インヒビタを投与する、好ましい一方法は、２００４年９月１７日出願のＫｅｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／３０８０６号明細書に記載されており、これは２００３年９月１７日出願の米国仮出願第６０／５０３，９２５号明細書に基づくものであって、これを引用してその開示の全体を本願に援用する。異常な細胞増殖を阻害するためのこのような方法には、Ｃｈｋ１活性化因子（例えば、化学療法薬）、及び本発明に係るＣｈｋ１インヒビタの投与を計画することが含まれる。この方法では、少なくとも１つのＣｈｋ１活性化因子を、増殖している細胞での細胞周期休止の実質的な同期化を誘発するのに足る用量及び時間で投与する。期の実質的な同期化を成し遂げれば、少なくとも１つのＣｈｋ１インヒビタを投与して、細胞周期休止を抑止し、治療的細胞死を誘発する。本方法は何れのＣｈｋ１活性化因子でも有用であり、異常な細胞増殖が関わる癌性及び非癌性症状の治療又は予防における用途が認められる。
【０１７１】
異常に増殖している細胞の集団を、１、又は１以上の本発明のＣｈｋ１インヒビタと接触させることができる。１以上のＣｈｋ１インヒビタを用いる場合、Ｃｈｋ１インヒビタを、例えば、担当医師（ヒト患者の場合）又は研究室の実験者（インビトロもしくはエキソビボ法の場合）等の当業者が決定する、同じか又は異なる方法を用いて（例えば、同時もしくは順次に、同じかもしくは異なる期間、又は同じかもしくは異なる様式により）細胞と接触させることができる。
【０１７２】
異常に増殖している細胞の集団は、１以上のＣｈｋ１活性化因子と接触させることもできる。１以上のＣｈｋ１活性化因子を用いる場合、概ね、前記Ｃｈｋ１インヒビタに関し記したと同様、Ｃｈｋ１活性化因子を、同じか又は異なる方法を用いて細胞と接触させることができる。
【０１７３】
本発明の化合物は、エキソビボで細胞集団に適用できる。例えば、本発明の化合物をエキソビボに使用して、特定の適応症、細胞型、患者、及び／又は他の治療パラメータに対して、Ｃｈｋ１インヒビタを投与するための至適なスケジュール及び／又は服用に関する情報を得ることができる。この情報は、実験目的、又はインビボ治療用のプロトコルを決定する診療の場で使用できる。本発明の化合物に対する他のエキソビボの使用は、当業者にとって明らかであろう。
【０１７４】
当業者により理解されるように、さらなる活性又は補助的な作用因子を本明細書に記載の方法で用いてもよい。やはり当業者により理解されるように、本明細書でいう処置は、予防や、既存の疾患又は病徴の治療にも及ぶ。
【０１７５】
処置での使用に必要な本発明の化合物の量は、処置すべき病状の性質、並びに患者の年齢及び状態に伴って変化し、最終的には担当医師又は獣医師によって決定される。しかし、一般的に、成人ヒトの処置のために投与される用量は、典型的には１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲にある。その用量は、単回量にて、又は例えば１日に２、３、４、もしくはそれ以上の回数の小用量にて適切な間隔で投与される複数回量として投与できる。実際には、医師が個々の患者にとって好適な投与計画を決定し、その投与量は年齢、体重、及び特殊な患者の応答によって変化する。前記投与量は、平均的な場合の模範例であるが、より多いか又はより少ない投与量の方が良い個々の実例が存在し、これらも本発明の範囲に含まれる。
【０１７６】
如何なる用量でも、本発明のＣｈｋ１インヒビタとの細胞集団の接触は、細胞周期チェックポイントの実質的な抑止を成し遂げるのに充分な時間行う。必須ではないが、このような時間として典型的には、上限約７２時間〜約９６時間が挙げられ、これは様々な因子に依存する。いくつかの実施形態では、担当医師又は技術者が決定する通り、約数週間もしくはそれ以上までの期間にわたってＣｈｋ１インヒビタを投与することが望ましいか、又は必要とされる。そこで、Ｃｈｋ１インヒビタは、典型的には、約１時間以下、約２時間以下、約３時間以下、約４時間以下、約６時間、約１２時間以下、約１８時間以下、約２４時間以下、約４８時間以下、又は約７２時間以下で投与できる。本明細書で示す時間の範囲は単なる例示に過ぎず、示したものに入っても入らなくても、その範囲及び部分範囲とも、本発明の範囲に含まれることを、当業者は理解するはずである。
【０１７７】
本発明のＣｈｋ１インヒビタは、複数種の用量を投与できる。例えば、Ｃｈｋ１インヒビタは、４回量を４日の間隔で１日１用量として送達（ｑ４ｄ×４）；４回量を３日の間隔で１日１用量として送達（ｑ３ｄ×４）；５日の間隔で１日１用量を送達（ｑｄ×５）；１週１用量を３週間（ｑｗｋ３）；２日残して５日は毎日用量、及び更に５日間、毎日用量（５／２／５）；又は、状況に適するように決定した何れかの投与計画による頻度で投与できる。
【実施例】
【０１７８】
＜実施例１＞
Ｃｈｋ１インヒビタのＩＣ５０値の定量
１９９８年９月４日出願の国際出願公開第ＷＯ ９９／１１７９５号に以前報告したように、ヒトＣｈｋ１ｃＤＮＡを同定してクローニングした。ＦＬＡＧ（登録商標）タグを全長のＣｈｋ１のアミノ末端と枠内に挿入した。５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列を含み、Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いた親和性による精製のためのＦＬＡＧ（登録商標）タグもコードする。３’プライマーは、ＳａｌＩ部位を含む。ＰＣＲで増幅した断片を、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）としてｐＣＩ−Ｎｅｏにクローニングし、次いでＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片としてｐＦａｓｔＢａｃＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）にサブクローニングした。組換えバキュロウイルスを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬのＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃマニュアルに記載の通りに調製し、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ付Ｃｈｋ１タンパク質の発現のため、ＣＣＭ３培地（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）で生育するＳｆ−９細胞を感染させるのに用いた。
【０１７９】
ＦＬＡＧ（登録商標）タグ付Ｃｈｋ１は、バキュロウイルスを感染させたＳＦ９細胞の凍結ペレットから精製した。凍結細胞ペレットを１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ β−グリセロリン酸、２５ｍＭ ＮａＦ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、２ｍＭバナジウム酸ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ、及びプロテアーゼインヒビタのカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ２０００、カタログ＃１８３６１７０）を含有する等容量の２×溶解バッファーと混合した。次いで細胞をダウンスホモジナイザーの緩い内筒を２０回上下して細胞破砕し、４８，４００×ｇで１時間遠心分離した。Ｍ２親和性樹脂をカラム１０倍容量の５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．５、次いで２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで交互に３回予備洗浄し、最後にトリスＮａＣｌで洗浄した。次いで、２５カラム容量の２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１×コンプリートミニプロテアーゼ錠剤でカラムを洗浄した。その後、清澄化した溶解液をバッチ状態のＭ２親和性樹脂に４℃で４時間結合させた。その後、樹脂と溶解液の混合液はカラムに注ぎ、通過液を集めた。カラム１０倍容量の２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び３ｍＭ Ｎ−オクチルグルコシドで樹脂を洗浄した。ＦＬＡＧ（登録商標）タグ付Ｃｈｋ１を、次いで、カラム６倍容量の、０．５ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ｓｉｇｍａ、２０００、カタログ＃ Ｆ−３２９０）を含有する冷２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎ−オクチルグルコシドでカラムから溶出させた。３つの画分を採取して、ＦＬＡＧタグ付Ｃｈｋ１の存在について分析した。
【０１８０】
１００ｎｇの精製ＦＬＡＧ（登録商標）−Ｃｈｋ１（１５０ｐｍｏｌのＡＴＰ／分）、２０μＭ Ｃｄｃ２５Ｃペプチド（Ｈ−ｌｅｕ−ｔｙｒ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｍｅｔ−ｐｒｏ−ｇｌｕ−ａｓｎ−ｌｅｕ−ａｓｎ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ＯＨ）（配列番号１）、４μＭ ＡＴＰ、２μＣｉ［３２Ｐ］γ−ＡＴＰ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＮＰ４０、及び１ｍＭＤＴＴを含有するＣｈｋ１キナーゼ活性のアッセイ。反応は、ＡＴＰを含有する反応ミックスの添加によって開始し、室温で１０分間行った。リン酸（１５０ｍＭ最終濃度）の添加によって反応を停止し、ホスホセルロースディスクに移した。このホスホセルロースディスクを、１５０ｍＭリン酸で５回洗浄して、風乾した。シンチレーション液を添加して、ディスクをＷａｌｌａｃシンチレーションカウンターで計数した。アッセイ液を、広い範囲の濃度のＣｈｋ１インヒビタ化合物存在下にインキュベートし、その化合物に対するＩＣ５０値を求めた。アッセイに付した本発明の化合物はすべて、このアッセイで約２００ｎＭ未満のＩＣ５０値を示した。
【０１８１】
＜実施例２＞
選択性
比較酵素としてＣｈｋ１、並びにコンパレータ酵素として以下のプロテインキナーゼ：Ｃｄｃ２、Ｃｈｋ２、ＣＴＡＫ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｋ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ４、ＩＲ、ＪＮＫ１、ｃ−キット、ｐ３８ａｌｐｈａ、ｐ３８ｂｅｔａ、ｐ３８ｄｅｌｔａ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ２、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ｐｐ６０ｖ−ｓｒｃ、プロテインキナーゼＢ／Ａｋｔ−１、ｐ３８ＭａｐＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ、及びａｂ１チロシンキナーゼを用い、本発明のＣｈｋ１インヒビタを選択性について試験した。
【０１８２】
Ｃｈｋ１に対する化合物のＩＣ５０値を前記の通りに測定した。ＳｅｌｅｃｔＳｍａｒｔ（商標名）（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｅｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）独占的技術プラットフォームを用い、ＥＬＩＳＡ変法又は蛍光偏光のいずれかで、コンパレータ酵素に対する化合物のＩＣ５０値を測定した。試験したインヒビタはすべて、試験したコンパレータ酵素よりも、Ｃｈｋ１に少なくとも２０倍の選択性を示した。
【０１８３】
あるいは、これらのキナーゼの各々に対するＩＣ５０を定量するためのアッセイは、米国特許公開第２００２−０１６５２１ Ａ１号明細書、及び１９９５年１月２３日出願のＰＣＴ／ＵＳ９５／００９１２号（双方とも、引用して本願に援用する）を含む文献に、以前に報告されている。
【０１８４】
＜実施例３＞
Ｃｈｋ１インヒビタのＥＣＴＦＳ値の定量のための、細胞を基礎にしたアッセイ
本発明に係るＣｈｋ１インヒビタの、細胞に基づく作用強度を、その化合物がゲムシタビンに対してＨＴ２９ヒト癌腫細胞系を増感させる能力を測定することによって評価した。平均ＥＣＴＦＳ値は、複数の実験によって求めた。このように、本発明に係るＣｈｋ１インヒビタは、本明細書に記載の方法により合成した。化合物を１０ｍＭの原液濃度で１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させて、−７０℃で保存した。ＨＴ２９細胞はＡＴＣＣから入手し、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、グルタミン及び他の補充物質を含有するＲＰＭＩからなる生育培地で維持した。ゲムシタビン塩酸塩はＱｖｅｎｔａｓから入手し、５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させて、−２０℃で保存した。３Ｈ−チミジンは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから入手した。
【０１８５】
ＨＴ２９細胞は、９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、ウェル当たり１．３ｘ１０３の密度で播種し、終夜接着させた。翌日、ゲムシタビンを先ず１２５倍希釈し、次いで生育培地中１．２ｍｌのＴｉｔｅｒ Ｔｕｂｅｓ（商標名、バイオラッド）にて５倍希釈を繰り返した。最終的な希釈系列の濃度は、１１、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、６．４ｘ１０−３、１．２８ｘ１０−４、及び５．１２ｘ１０−５ｎＭであった。希釈したゲムシタビンを、次いで細胞に２時間添加した。その後ゲムシタビンを洗浄除去して、希釈した本発明のＣｈｋ１インヒビタを細胞に２４時間添加した。生育培地での最初の１０００倍希釈の後、本発明に係る１０μＭ（ＤＭＳＯ原液）Ｃｈｋ１インヒビタを１．２ｍｌのＴｉｔｅｒ Ｔｕｂｅｓ（商標名）にて連続的に３倍希釈し、２．５、０．８３、０．２８、０．０９、及び０．０３μＭの最終希釈系列を得た。７２時間後に、各ウェル内の細胞を、１μＭＣｉの３Ｈ−チミジンで１２時間標識化し、その後−７０℃で凍結した。その後、プレートを解凍して、Ｃｅｌｌ Ｍａｔｅ（商標名）プレートハーベスター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に収集した。次いでＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（商標名）２０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を３０μＬ添加して、プレートをＴｏｐ Ｃｏｕｎｔプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で計数した。データを、本発明に係るＣｈｋ１インヒビタ単独で処理した細胞に対して正規化し、その後［ゲムシタビン濃度（μＭ）］対［相対細胞成長（１００％が１．０と同等）］の対数／対数グラフにプロットした。９０％成長阻害で増加した増感倍数を、用いたＣｈｋ１インヒビタの各濃度に対して求め、次いでこれを、増感倍数に対するＣｈｋ１インヒビタ濃度のグラフにプロットした。その後、ＥＣＴＦＳ値を計算した。
【０１８６】
アッセイに付した本発明のＣｈｋ１インヒビタのＥＣＴＦＳ値の測定値は、約１０００ｎＭ未満であった。
【０１８７】
＜実施例４＞
本発明のＣｈｋ１インヒビタは、癌治療による細胞の死滅を強化する
本発明の化合物によるＣｈｋ１の阻害がＤＮＡ損傷因子による死滅効果に対して標的細胞を増感することを立証するために、細胞を本発明のＣｈｋ１インヒビタの存在下にインキュベートし、放射線又は化学的ＤＮＡ損傷因子の何れかに曝すことができる。９６ウェルのミクロタイタープレートにウェル当たり１０００〜２０００の密度で播種した細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＭＰＩ１６４０で、５％ＣＯ２を含む加湿したインキュベーターの中で３７℃にて１８時間生育する。被検細胞としては、ＨｅＬａ、ＡＣＨＮ、７８６−０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＳＷ６２０、ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、Ａ５４９、Ｈ３２２、ＯＶＣＡＲ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＰＣ−３、ＨＬ−６０、Ｋ５６２、Ｂｘ−ＰＣ３、Ｍｉａ−ＰａＣａ２、Ｈ８１０、Ｈ２２６、Ｈ２１２６、及びＭＯＬＴ４といった目的のあらゆる細胞又は細胞系が挙げられる。すべての細胞系の表記は、以下のヒト細胞系を示す。
【表２】
【０１８８】
化学療法薬を単独で、又は化学療法薬とＣｈｋ１インヒビタとを含有する培地で細胞を処理する。３Ｈ−チミジン取込のレベルの定量によって成長を測定する前におよそ５日間、細胞をインキュベートする。化学療法薬に含まれるのは、エトプシド、ドキソルビシン、シスプラチン、クロラムブシル、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）である。未処理の対照細胞の９０％に細胞成長を阻害するのに必要な薬物濃度を、ＧＩ９０と規定する。
【０１８９】
本発明の化合物は、メトトレキセート、ヒドロキシ尿素、２−クロロアデノシン、フルダラビン、アザシチジン、及びゲムシチビンを含むさらなる代謝拮抗剤と共に試験して、この中で作用因子による死滅を強化する能力を評価できる。本発明の化合物は、ゲムシチビンと組み合わせてＨＴ２９結腸直腸癌腫の死滅の強化を評価することによって互いに比較できる。
【０１９０】
更に、放射線による死滅を強化する本発明のＣｈｋ１インヒビタの能力を試験できる。
【０１９１】
＜実施例５＞
動物モデルでのＣｈｋ１インヒビタ活性を測定するための高感度アッセイ
齧歯類腫瘍モデルにおけるＣｈｋ１インヒビタ活性を測定する、以下の高感度アッセイを開発した。詳細には、このアッセイはとりわけ、Ｃｈｋ１インヒビタがＣｈｋ１機能を阻止する能力を腫瘍モデルで測定し、分子標的へのＣｈｋ１インヒビタの接近を円滑にする条件の評価を可能にするのに使用できる。
【０１９２】
化学療法で誘発されるチェックポイントを、選択的Ｃｈｋ１インヒビタが抑止する能力は、有糸分裂に特異的な事象であるセリン１０（Ｈ３−Ｐ）でのヒストンＨ３リン酸化をモニターすることにより有糸分裂の指標を測定する、定量的免疫蛍光アッセイを用いて測定する（Ａｊｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２７１：１３１９７−２０１， １９９６； Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２７４：２５５４３−９， １９９９）。アッセイプロトコルは以下の通りである。Ｃｈｋ１活性化因子（本研究では、化学療法薬）及び／又はＣｈｋ１インヒビタで処理した、又は処理しない齧歯類由来の腫瘍を切除して、パラフィン包埋する。腫瘍を６ミクロンの厚みの切片に切り、ガラススライドに載置する。キシレン、１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノール及び脱イオン水での３分間の連続処理によって、スライドからパラフィンを除去する。次にスライドを１０ｍＭクエン酸ナトリウム中で９５℃に１０分間加熱し、その後２０分の冷却工程を行う。スライドを、ブロッキングバッファー（０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳＴ）を含有する２０％正常ヒト血清及び２％ウシ血清アルブミンのリン酸緩衝食塩水）で３０分間ブロッキングする。抗ホスホヒストンＨ３抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．＃０６−５７０）をブロッキングバッファーで１：２００に希釈し、１時間スライドとインキュベートする。スライドをＰＢＳＴ中で５分間３回洗浄する。二次抗体の、ロバ抗ウサギローダミン（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｃａｔ＃７１１−２９５−１５２）を３０分間添加する。次いでスライドをＰＢＳＴで２回洗浄し、７５μＭの０．１μＭ／ｍｌ ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加して３０分間染色させる。その後スライドをＰＢＳＴで更に２回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ベクター、ｃａｔ＃Ｈ−１４００）に載置する。蛍光顕微鏡を用いてスライドを観察する。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．６）を用いて、Ｈ３−Ｐ抗体で染色された細胞の総（ＤＡＰＩ染色）細胞に対する、百分率を数量化する。
【０１９３】
＜実施例６＞
選択的Ｃｈｋ１インヒビタは、ＤＮＡ損傷で誘発されたＧ２及びＳ期チェックポイントを抑止する。
以前の研究により、選択的Ｃｈｋ１インヒビタは、ＤＮＡ損傷で誘発されたＧ２／Ｍ及びＳ期チェックポイントを実質的に抑止することが立証されている。前者では、ＤＮＡ損傷はイオン化放射線（ＩＲ）によって誘発され、その標的期はＧ２期である。後者では、ＤＮＡ損傷は標的期がＳ期である化学療法薬によって誘発される。公開された米国特許出願公開第２００３／００６９２８４号明細書参照、この文献を本明細書で引用する。
【０１９４】
概説すると、ＩＲで誘発されたＧ２ＤＮＡ損傷チェックポイントのＣｈｋ１インヒビタによる抑止は、有糸分裂の指標実験によってアッセイする。およそ１ｘ１０６のＨｅＬａ細胞を、８００ラドで照射し、３７℃で７時間インキュベートする。これらの細胞は機能的にｐ５３陰性なので、専らＧ２のみで休止する。次いで、ノコダゾールを０．５μｇ／ｍＬの濃度に添加して、３７℃で１５時間インキュベートする。（ノコダゾールの添加は、有糸分裂においてＧ２休止を経た細胞をトラップし、よってそれらが更にＧ１に進むのを阻止して、Ｍ期細胞の数量化を可能とするように計画する。）選択的Ｃｈｋ１インヒビタを８時間添加し、この細胞を遠心によって収集し、ＰＢＳで１回洗浄して、その後２．５ｍＬの７５ｍＭ ＫＣｌに再懸濁させて再び遠心する。細胞はその後、調製したばかりの冷酢酸：ＭｅＯＨ（１：３）３ｍＬで固定して、氷上で２０分間インキュベートする。細胞をペレット化して固定液を吸引し、０．５ｍＬのＰＢＳに細胞を再懸濁する。１００μＬの固定した細胞をガラス顕微鏡スライド上にピペッティングし、１ｍｌの固定液で試料を横溢することによって、有糸分裂スプレッドを調製する。その後、スライドを風乾して、Ｗｒｉｇｈｔｓ染色液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で１分間染色し、次いで水で１回洗浄し、５０％ＭｅＯＨで１回洗浄する。濃縮された染色体の存在と、核エンベロープの欠損で有糸分裂細胞を同定する。Ｃｈｋ１インヒビタによって、放射線照射のもとに有糸分裂細胞数の増加がもたらされ、これにより、ＩＲで誘発されたＧ２休止の抑止が立証される。このチェックポイント抑止の結果、サイクリンＢ／ｃｄｃ２の活性の増強が引き起こされ、これは有糸分裂への細胞の進行に必要なものである。ＩＲと、その後Ｃｈｋ１インヒビタで処理した細胞はかくして、損傷を受けたＤＮＡを備えて有糸分裂に進む。これらの実験によって、ＩＲで誘発されたＧ２にＣｈｋ１が関わっているという仮説を確証する。
【０１９５】
＜実施例７＞
異種移植片腫瘍モデルで、Ｃｈｋ１活性化因子の存在下、Ｃｈｋ１インヒビタは腫瘍によって取り込まれる。
異種移植片腫瘍モデルで、ヌードマウスの横腹にＨＴ２９結腸癌腫腫瘍を移植し、２００ｍｍ３まで成長させる。その後マウスは、媒体、３００ｍｇ／ｋｇＣｈｋ１インヒビタ、２０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンのいずれかで処理するか、又は３００ｍｇ／ｋｇＣｈｋ１インヒビタと２０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンとを２回、３日間あけて１日目と４日目に一緒に投与する。腫瘍担持マウスのＣｈｋ１インヒビタとゲムシタビンとの共投与による処理の結果、ゲムシタビン単独に比較して腫瘍の成長に４日の遅延が引き起こされる。
【０１９６】
腫瘍組織へのＣｈｋ１インヒビタの拡散を評価するために、Ｃｈｋ１インヒビタの血漿及び組織レベルを測定する。Ａｌｚｅｔポンプを用いて、連続送達システムにて２４時間にわたり５００ｍｇ／ｋｇのＣｈｋ１インヒビタをＨＴ２９腫瘍担持マウスに投与する。血漿試料を採取し、その後腫瘍、腎臓、肝臓、脾臓、及び肺を回収する。１、２、４、８、及び２４時間の時点で採取を行う。組織を抽出し、Ｃｈｋ１インヒビタのレベルを数量化する。この実験により、Ｃｈｋ１インヒビタが正常及び腫瘍組織内に浸透し、腫瘍組織で約１５μＭのレベルに達し、脾臓組織では８時間で約２０μＭの最高値になることが示される。このように、Ｃｈｋ１インヒビタは増殖している細胞によって容易に取り込まれた。そしてこれは、Ｃｈｋ１を活性化する化学療法薬と併せて、増殖性疾患の処置のための療法として有用である。
【０１９７】
＜実施例８＞
Ｃｈｋ１インヒビタ及びゲムシタビンで処理した腫瘍の用量応答
ゲムシタビン処理後のＣｈｋ１インヒビタの有効用量と、用量依存性のチェックポイント抑止が抗腫瘍活性と呼応しているかどうかを調べるために、用量応答実験を実施する。
【０１９８】
ヌードマウスにＨＴ２９腫瘍細胞を移植して、腫瘍を１０日間増大させる。開始時の腫瘍は、およそ１００ｍｍ３であった。動物をＭＴＤ（１６０ｍｇ／ｋｇ）のゲムシタビンで、その後５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、又は４００ｍｇ／ｋｇのＣｈｋ１インヒビタで処理した。ゲムシタビン前処理の時間はこの実験では３２時間であり、これは当該時点がこの型の腫瘍に対して至適であることを示した、細胞を基礎にしたアッセイによって求めたものである。各治療計画における腫瘍体積の解析によって、ＨＴ２９腫瘍担持マウスを前記療法で処理すると、ゲムシタビンに加えて２００ｍｇ／ｋｇ又は４００ｍｇ／ｋｇのＣｈｋ１インヒビタのいずれかにより、ゲムシタビン単独よりも腫瘍の成長を遅らせることが示唆され、また、Ｃｈｋ１インヒビタの用量依存性効果を示していた。
【０１９９】
＜実施例９＞
作用因子がＣｈｋ１活性化因子であるかどうかを調べるアッセイ
作用因子がＣｈｋ１活性化因子であるかどうかを調べるために、Ｃｈｋ１の特異的リン酸化部位に対するホスホ特異抗体を用いてＣｈｋ１のリン酸化状態を測定できる。セリン３１７及び３４５は、イオン化放射線、紫外放射線、ヒドロキシ尿素、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、テモゾラマイド及びゲムシタビンで細胞を処理した後にリン酸化されることが示されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４：１４４８−１４５９， ２０００； Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２１：４１２９−４１３９， ２００１； Ｌｏｐｅｚ−Ｇｉｒｏｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９８：１１２８９−１１２９４， ２００１； Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４：２７４５−２７５６， ２０００； Ｇａｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：１４８０６−１４８１１， ２００３； Ｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）。これらセリン部位は、上流のチェックポイントキナーゼ、Ａｔｍ及びＡｔｒによってリン酸化される（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４：１４４８−１４５９， ２０００； Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２１：４１２９−４１３９， ２００１）。
【０２００】
Ｃｈｋ１活性化因子の候補物質に応答するこれらの部位のリン酸化は、腫瘍細胞のウエスタンブロット又は免疫組織化学的方法によってモニターできる。例えば、以下の手順を用いて、ゲムシタビンがセリン３４５及び３１７でＣｈｋ１活性化を引き起こすことを立証できる。ＨＴ２９細胞を、２０μＭゲムシタビンで２時間処理する。ゲムシタビンを細胞生育培地から洗い去り、この細胞を更に２２時間インキュベートする。タンパク質溶解液を調製して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写して、リン酸化セリン３１７又は３４５（細胞シグナリング）の何れかに特異的な抗血清（細胞シグナリング）でプローブ検知する。ウエスタンブロットによって、ＨＴ２９結腸癌腫細胞のゲムシタビン処理は、セリン３１７及び３４５の双方のリン酸化をもたらすことが示される。
【０２０１】
＜実施例１０＞
Ｃｈｋ１インヒビタに応答するＣｈｋ１活性をモニターするためのアッセイ
セリン２９６でのＣｈｋ１のリン酸化が、ゲムシタビンでの腫瘍細胞の処理によって刺激され、この部位でのリン酸化はＣｈｋ１インヒビタによって阻害されることが見出されている。この部位でのリン酸化は、Ａｔｍ及びＡｔｒを阻害するワートマニンによって阻害されない。従って、セリン２９６のリン酸化は、セリン３１７及び３４５でのリン酸化と異なっている。更に、この部位は、精製されたＣｈｋ１調製物でリン酸化されることが見出されており、精製酵素が、それ自体又は他のＣｈｋ１分子をセリン２９６でリン酸化できることを示唆している。まとめると、これらのデータは、セリン２９６でのリン酸化はＣｈｋ１自体によって行われることを示唆している。従って、このアプローチを使用して、Ｃｈｋ１活性化因子に応答する、腫瘍でのＣｈｋ１活性をモニターできる。更に、このアプローチを使用して、Ｃｈｋ１インヒビタによるＣｈｋ１活性化の阻害を測定できる。
【０２０２】
同様に、２０μＭゲムシタビンでＨＴ２９細胞を２時間処理する。ゲムシタビンを細胞生育培地から洗い去り、この細胞を更に２２時間インキュベートする。タンパク質溶解液を調製して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。タンパク質をポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写して、リン酸化セリン２９６（細胞シグナリング）に特異的な抗血清（細胞シグナリング）でプローブ検知する。ウエスタンブロットによって、ＨＴ２９結腸癌腫細胞のゲムシタビン処理は、セリン２９６のリン酸化をもたらすことが示される。更に、選択的Ｃｈｋ１インヒビタで１５分間処理したＨＴ２９細胞は、セリン２９６のリン酸化を示さない。これらのデータは、セリン２９６のリン酸化がＣｈｋ１キナーゼによって行われることを示唆している。
【０２０３】
＜実施例１１＞
動物腫瘍モデル
マウスにおけるＤＮＡ損傷因子による腫瘍の死滅を本発明のＣｈｋ１インヒビタが強化する能力を試験するために、結腸腫瘍細胞系を用いる異種移植片腫瘍モデルを確立する。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）又はゲムシタビンを、ＤＮＡ損傷因子として使用できる。ＨＴ２９及びＣｏｌｏ２０５（ヒト結腸癌腫）並びにＨ４６０及びＣａｌｕ−６（非小細胞癌腫）細胞を使用して、６〜８週齢の雌性胸腺Ｂａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスで異種移植片腫瘍を増殖できる。マウスは、層状空気流キャビネットで無病原体条件下に保持し、適宜無菌食餌及び水を与えた。５％ＣＯ２加湿環境において、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１．５ｍＭＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で細胞系を亜集密にまで生育する。単一種細胞懸濁液をＣＭＦ−ＰＢＳで調製し、細胞濃度は１×１０８細胞／ｍＬに調整する。合計１ｘ１０７細胞（１００μＬ）を、マウスの右横腹又は右足の皮下（ｓ．ｃ．）に接種する。マウスを４処置群に無作為化し（５〜１５匹のマウス／群）、腫瘍が７５〜１００ｃｍ３の体積に達したら（通常、接種後７〜１１日）使用する。腫瘍を副尺付きカリパスで計測して、経験的に導き出した式：腫瘍体積（ｃｍ３）＝腫瘍長さ（ｃｍ）×腫瘍幅（ｃｍ）×腫瘍深さ（ｃｍ）／３．３を用いて腫瘍体積を概算する。処置は、以下の工程からなる：ｉ）ゲムシタビンを１６０ｍｇ／ｋｇで１００μＬ腹腔内（ｉ．ｐ）注射。腫瘍成長の遅延は、ゲムシタビンで処理したマウスで観察される。Ｃｈｋ１インヒビタの経口投与と組み合わせた１６０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンとの両者でのマウスの処理は、腫瘍体積を低減して寿命を延ばすことが予想される。腫瘍サイズは、実験期間中、隔日にモニターする。明らかに、上記した通り、本発明の多くの修正及び変形を本発明の技術的思想及び技術的範囲内でなすことができるため、その制限は特許請求の範囲によって規定されるものだけによるべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝物質の完全性を維持及び修復する酵素を阻害するために有用な化合物に関する。更に詳細には、本発明は、一連のアリール置換及びヘテロアリール置換尿素化合物、当該化合物の製造方法、並びに例えば、癌、及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）複製、染色体分離、又は細胞分裂の欠陥により特徴付けられる他の疾患の治療における治療剤としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な疾患、症状、及び障害（以下「適応症」）は、異常に増殖している細胞の関与により特徴付けられる。本明細書で用いる場合、「異常に増殖している細胞」（又は「異常な細胞増殖」）とは、正常の、適切な、又は予測される経過から逸脱した細胞増殖を意味する。例えば、異常な細胞増殖には、ＤＮＡもしくは他の細細胞成分が損傷を受けているか又は欠損している、細胞の不適切な増殖が含まれる。異常な細胞増殖はまた、不適切に高レベルの細胞分裂、不適切に低レベルの細胞死（例えば、アポトーシス）の一方もしくは双方によって引き起こされるか、仲介されるか、又は結果的にこれらの一方もしくは双方をもたらす臨床的適応症も特徴付ける。このような適応症は、例えば、細胞、細胞群又は組織（単一もしくは複数種）の、単一又は複数箇所での局所的異常増殖によって特徴付けることができ、癌性（良性又は悪性）及び非癌性の適応症を含んでいる。
【０００３】
当然ながら、すべての癌（良性及び悪性）に、異常な細胞増殖の何らかの型が関わっている。いくつかの非癌性適応症も、異常な細胞増殖に関わっている。異常な細胞増殖が関わっている非癌性適応症の例として、リウマチ様関節炎、乾癬、白斑、ヴェグナー肉芽腫症、及び全身性狼瘡が挙げられる。
【０００４】
異常に増殖している細胞に関わる適応症を治療する一手法として、ＤＮＡ損傷因子の使用が挙げられる。これらの作用因子は、ＤＮＡ代謝、ＤＮＡ合成、ＤＮＡ転写、及び微小管紡錘体形成等の重要な細胞プロセスを破壊することによって、異常に増殖している細胞を死滅させるように設計されているそれらは、例えば染色体の構造的完全性を乱すＤＮＡへの傷害を導入することによっても操作できる。ＤＮＡ損傷因子は、正常な健常細胞への損傷を最小限にし、異常に増殖している細胞での最大限の損傷及び結果的な細胞死の誘発を試みるように設計及び投与される。
【０００５】
化学療法薬及び放射線を含め、多種多様なＤＮＡ損傷因子が今日までに開発されており、その他のものが開発途中である。残念ながら、異常な細胞増殖に関わる症状を治療する場合のＤＮＡ損傷因子の有効性は、特に癌の治療では望まれるものに至っていない。健常細胞よりも、異常に増殖している細胞に対するこのような作用因子の選択性（場合により、治療係数と称される）は、ごく僅かであることが多い。
【０００６】
更に、あらゆる細胞はＤＮＡ損傷因子に対して相反する目的で働く可能性がある、検出及び修復機構を有している。細胞周期チェックポイントと称されるこのような検出機構は、様々な細胞複製段階の順序を保って、各工程が高い忠実度で実行されることを保証する助けになる（Ｈａｒｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：６２９−６３４ （１９８９）； Ｗｅｉｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ８：６５２ （１９９４））。ＤＮＡ損傷因子によって意図的に誘発された損傷を含むＤＮＡ損傷を細胞が検出すると、所定のシグナル伝達経路が細胞周期チェックポイントを活性化して、細胞複製周期が一時的に停止する（「休止する」）。この休止で、細胞にそれらのＤＮＡを修復する時間が、多くの場合その細胞が生存及び増殖を継続するのに充分な程度にまで与えられる。異常に増殖している細胞の場合、この修復は、このような細胞を死滅させるに足るＤＮＡ損傷を誘発する努力を損なうかもしれないので望ましくない。
【０００７】
例えば、ＧＥＭＺＡＲ（商標名）と称される化学療法薬（ゲムシタビン、即ち２’，２’−ジフロロ−２’−デオキシシチジン）は、合成期にそれ自体をＤＮＡへ組み込むことによってＤＮＡを損傷する。未修復のまま、損傷を受けたＤＮＡは、通常、生命を維持できなくなってしまう。しかし、多くの標的細胞では、不適当に作られた（又はそうでなくとも損傷を受けた）ＤＮＡを細胞周期チェックポイントが検出する。活性化された細胞周期チェックポイントは、損傷を受けたＤＮＡを修復させるのに充分な時間、細胞周期の休止を惹起する。これは、化学療法薬、放射線、及び他の療法剤等のＤＮＡ損傷因子の細胞死滅効果に対する、異常に増殖している細胞の抵抗についての一論法である。
【０００８】
他のＤＮＡ損傷因子は、Ｓ期での休止を腫瘍細胞に引き起こす。腫瘍細胞は、化学療法薬が投与されている間に単にＳ期で休止することにより、特定の化学療法に抵抗することが観察されている。その後、薬物が除去されると直ちにＤＮＡ損傷が修復され、細胞周期休止は停止して、その細胞は細胞周期の残余部分を経過する（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１：１０６５−１０７２， ２００１）。他の療法剤は、Ｇ１及びＧ２を含む他のチェックポイントでの細胞周期休止を引き起こす。従って、様々なＤＮＡ損傷チェックポイントの阻害は、治療により誘発されたＤＮＡ損傷を細胞が修復するのを阻止する助けをし、またＤＮＡ損傷因子に対して標的細胞を増感することが期待される。このような増感は次に、これらの療法の治療係数を高めることが期待される。
【０００９】
細胞周期は、その基本プロセス及びあらゆる真核生物種にわたる調節の態様が、構造的及び機能的に同じである。有糸分裂（体性）細胞周期は、Ｇ１（ギャップ）期、Ｓ（合成）期、Ｇ２（ギャップ）期、及びＭ（有糸分裂）期の４期からなる。Ｇ１、Ｓ、及びＧ２期はまとめて、細胞周期の間期と称される。Ｇ１期の間、細胞の生合成活性は高い率で進行する。Ｓ期は、ＤＮＡ合成開始時に始まり、細胞の核のＤＮＡ内容物が複製されて２つの同一の染色体のセットが形成される時に終結する。
【００１０】
細胞は次いでＧ２期に入り、有糸分裂が開始するまでこれが続く。有糸分裂において、染色体は対合し、分離して２つの新しい核を形成し、そして細胞質分裂が起こり、ここで染色体の２つのセットのうちの一方を含む１つの核を各々受け取る２つの娘細胞へと細胞が分裂する。細胞質分裂でＭ期が終結し、次の細胞周期の間期の開始へと踏み出す。細胞周期事象が進行するシークエンスは、細胞周期事象の開始が前の細胞周期事象の完結に依存するよう、厳密に調節されている。これにより、体性細胞の一世代から次世代への遺伝物質の複製及び分離における忠実度が実現される。
【００１１】
細胞周期チェックポイントは、少なくとも３種の別異のポリペプチドのクラスで構成され、それらが細胞周期シグナル、又は染色体機構の欠損に応答して順次作用することが報告されている（Ｃａｒｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７１：３１４−３１５， １９９６）。第一のクラスは、ＤＮＡ損傷又は細胞周期の異常を検出又は感知するタンパク質のファミリーである。これらの検出子には、Ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ変異型タンパク質（Ａｔｍ）、及びＡｔａｘｉａ−ＴｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａＲａｄ−関連タンパク質（Ａｔｒ）が含まれる。ポリペプチドの第二のクラスは、検出子により検出された信号を増幅して伝達するもので、Ｒａｄ５３（Ａｌｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：２４１６−２４８８、１９９４）及びＣｈｋ１が例示される。ポリペプチドの第三のクラスとしては、細胞性応答、例えば、有糸分裂の休止及びアポトーシスを媒介するｐ５３等の細胞周期エフェクタが挙げられる。
【００１２】
細胞周期チェックポイントの機能の現状での理解は、多くが腫瘍由来細胞系の研究から引き出されている。多くの場合、腫瘍細胞は重要な細胞周期チェックポイントを喪失している（Ｈａｒｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１８２１−２８、１９９４）。細胞の新生物状態への進展において重要な工程は、ｐ５３に関わるもの等細胞周期チェックポイント経路を不活性化する変異の獲得であることが報告されている（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ｃｅｌｌ ８１：３２３−３３０， １９９５； Ｌｅｖｉｎｅ， Ｃｅｌｌ ８８：３２３４−３３１， １９９７）。これら細胞周期チェックポイントの喪失の結果、ＤＮＡの損傷に関わらず腫瘍細胞の複製が引き起こされる。
【００１３】
非癌性組織で完全な細胞周期チェックポイントを有するものは通常、単一のチェックポイント経路の一時的な破壊から逃れられる。しかし、腫瘍細胞は、さらなるチェックポイントの摂動で、ＤＮＡ損傷因子に対して特にそれらを感受性にするように細胞周期の進行を制御する経路に欠陥がある。例えば、変異型ｐ５３を含む腫瘍細胞は、Ｇ１のＤＮＡ損傷チェックポイントと、Ｇ２のＤＮＡ損傷チェックポイントを維持する能力との両方に欠陥がある（Ｂｕｎｚ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１４９７−５０１、１９９８）．Ｇ２チェックポイント又はＳ期チェックポイントの開始を標的とするチェックポイントインヒビタは、これら腫瘍細胞がＤＮＡ損傷を修復する能力を更に無力化することが期待され、従って、放射線及び全身の化学療法の双方の治療係数を高める候補物質である（Ｇｅｓｎｅｒ， Ａｂｓｔｒａｃｔ ａｔ ＳＲＩ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ： Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ Ｓｕｍｍｉｔ， Ｍａｒｃｈ ２００３）。
【００１４】
ＤＮＡ損傷、又はＤＮＡ複製に対する何らかの障害の存在下に、チェックポイントタンパク質Ａｔｍ及びＡｔｒはシグナル伝達系路を始動させて、細胞周期休止へと導く。Ａｔｍは、イオン化放射線（ＩＲ）に応答してＤＮＡ損傷チェックポイントで役割を果たすことが示されている。Ａｔｒは、一本鎖ＤＮＡ破断、二本鎖ＤＮＡ破断を引き起こす作用因子、及びＤＮＡ放射線を遮断する作用因子によって刺激される。
【００１５】
Ｃｈｋ１は、ＤＮＡ損傷チェックポイントシグナル伝達系路においてＡｔｍ及び／又はＡｔｒより下流に位置するプロテインキナーゼである（Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：１４９７−１５０１， １９９７； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，２１８，１０９）。哺乳動物細胞で、Ｃｈｋ１は、イオン化放射線（ＩＲ）、紫外（ＵＶ）光、及びヒドロキシ尿素を含む、ＤＮＡ損傷を引き起こす作用因子に応答してリン酸化される（Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １４：１４４８−１４５９， ２０００）。哺乳動物細胞でＣｈｋ１を活性化するこのリン酸化は、Ａｔｍ （Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １８：２４９−２５６， １９９９） 及びＡｔｒ （Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）に依存性である。更に、Ｃｈｋ１は、細胞周期制御に重要であることが知られている遺伝子産物であるｗｅｅ１（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １６：５４５−５５４， １９９７）及びＰｄｓ１ （Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８６：１１６６−１１７１， １９９９）の双方をリン酸化することが示されている。
【００１６】
これらの研究では、哺乳類Ｃｈｋ１がＡｔｍ依存的ＤＮＡ損傷チェックポイントにおいてＳ期で停止させる役割を果たすことが示されている。Ｓ期哺乳動物細胞におけるＣｈｋ１に対する役割が最近解明され（Ｆｅｉｊｏｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５４：９１３−９２３、２００１；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ、９９：１４７９５−８００、２００２；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７８（２４）：２１７６７−２１７７３、２００３；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、３（３）：２４７−５８、２００３）、ＤＮＡ合成の完全性をモニターする際のＣｈｋ１の役割が強調されている。Ｃｈｋ１は、サイクリンＡ／ｃｄｋ２活性を調節するＣｄｃ２５Ａをリン酸化することによって、Ｓ期の休止を発動する（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．、前出及びＳｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、前出）．Ｃｈｋ１はまた、Ｇ２から有糸分裂へと細胞が進行するにつれて通常はサイクリン−Ｂ／ｃｄｃ２（Ｃｄｋ１としても知られている）を脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼであるＣｄｃ２５Ｃをリン酸化及び不活性化することによって、Ｇ２の休止も発動する（Ｆｅｒｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：１４９５−７， １９９７； Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８２：１８９３−１８９７， １９９８； ａｎｄ Ｂｌａｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ９：１−１０， １９９９）。両方の場合で、Ｃｄｋ活性の調節は細胞周期の休止を誘発し、ＤＮＡ損傷又は未複製ＤＮＡの存在下に細胞が有糸分裂に入るのを阻止する。
【００１７】
細胞周期チェックポイントインヒビタのさらなるクラスは、Ｇ１又はＧ２／Ｍ期のいずれかで作動する。ＵＣＮ−０１、すなわち７−ヒドロキシスタウロスポリンは、元はプロテインキナーゼＣに対してその主要な効果を有する非特異性キナーゼインヒビタとして単離されたが、最近になってＣｈｋ１の活性を阻害すること、及びＧ２細胞周期チェックポイントを抑止することが見出されている（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）。このように、ＵＣＮ−０１は非特異的なＣｈｋ１インヒビタであるため、高用量では細胞に対して毒性である。低用量では、それは非特異的に多くの細胞性キナーゼを阻害し、またＧ１チェックポイントも阻害する（Ｔｅｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ， ３：３５−４６， ２００３）。
【００１８】
ＵＣＮ−０１は、放射線、抗癌剤カンプトセシン（Ｔｅｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、前出）、及びゲムシタビン（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、前出）等の癌治療と組み合わせて用いられているが、その成功には限度がある。更に、ＵＣＮ−０１は、グリア芽腫細胞においてテモゾロマイド（ＴＭＺ）で誘発されるＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）の効果を増強するのに使用されている（Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６１：５８４３−５８４９、２００１）。臨床現場では、ＵＣＮ−０１は期待されるような有効な化学療法薬ではなく、これはおそらく、治療計画の失敗と、特に重要な分子標的の同定がなされていないことに起因している（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｕｐｄａｔｅｓ、６：１５−２６、２００３）．そこで、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．は、ＵＣＮ−０１による、非小細胞肺癌腫培養細胞系における細胞周期依存的なシスプラチンの増強を報告しているが、ＵＣＮ−０１が標的とする重要な細胞周期チェックポイント（単数又は複数種）を、特異性をもって同定していない（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．。
【００１９】
化学療法に影響を及ぼす細胞周期での治療に対して腫瘍細胞を増感させるための戦略が、他にいくつかある。例えば、２−アミノプリンの投与は、ミモシンで誘発されるＧ１休止、又はヒドロキシ尿素で誘発されるＳ期休止等の複数の細胞周期チェックポイント機構を抑止して、その細胞を有糸分裂に移行させてこれを進めることを可能にする（Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８６：２２７２−２２７６， １９９２）。カフェイン、すなわちメチルキサンチンは、Ｇ２チェックポイントの経過進行を媒介することによって、シスプラチン及びイオン化放射線等のＤＮＡ損傷因子の細胞毒性を増強し、これにより細胞死を誘導するために使用されている（Ｂｒａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ３：１３７１−１３８１， １９９７）。しかし、細胞周期抑止を成し遂げるために用いられるカフェインの用量は、臨床的に容認できるレベルを超えており、これは実行可能な療法の選択肢にならない。更に、Ｃｈｋ１キナーゼに対するアンチセンスヌクレオチドが、トポイソメラーゼインヒビタＢＮＰ１３５０に対する感度を増大するために使用されている（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２９５：４３５−４４、２００２）が、アンチセンス治療及び遺伝子療法に通常伴う問題が示されている。
【００２０】
Ｃｈｋ１インヒビタとしては、米国特許出願第１０／０８７７１５号及び米国仮特許出願第６０／５８３０８０号、６０／５８５２９２号、及び６０／６０２９６８号に記載のアリール置換及びヘテロアリール置換尿素化合物；米国特許公開第２００４／００１４７６５号、米国特許公開第ＵＳ２００３／１９９５１１号、米国特許公開第２００４／００１４７６５号、及びＷＯ ０３／１０１４４４号に記載のジアリール尿素化合物；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１６４９−５４．１９９５に記載のメチルキサンチン類及び関連化合物；ＷＯ ０３／０２９２４１号及びＷＯ ０３／０２８７３１号に記載のウレイドチオフェン類；ＷＯ ０３／０２８７２４号に記載のＮ−ピロロピリジニルカルボキサミド類；ＷＯ ０１／５７２０６号及び米国特許第６２１１１６４号に記載のアンチセンスＣｈｋ１オリゴヌクレオチド；ＷＯ ００／１６７８１号に記載のＣｈｋ１レセプターアンタゴニスト；ＷＯ ０３／０３７８８６号に記載のヘテロ芳香族カルボキサミド誘導体；ＷＯ ０３／０２９２４２号に記載のアミノチオフェン類；ＷＯ ０３／００４４８８号に記載の（インダゾリル）ベンズイミダゾール類；米国特許公開第２００４００９２５３５号及びＷＯ ０４／０１８４１９号に記載のベンズイミダゾールキノリノン類；ＷＯ ０２／１６３２６号に記載のヘテロ環状ヒドロキシイミノ−フルオレン類；米国特許第６４９５５８６号に記載のサイトネミン（ｓｃｙｔｏｎｅｍｉｎ）等のサイトネマン（ｓｃｙｔｏｎｅｍａｎ）誘導体；ＷＯ ０１／５３２７４号に記載のヘテロアリールベンズアミド類；ＷＯ ０１／５３２６８号に記載のインダゾール類；Ｔｅｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、前出に記載のインドラカルバゾール類；ＷＯ ０２／０７０５１５号に記載のクロマン誘導体；Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ：２９０９−２９１９、１９９９に記載のポウロン類（ｐａｕｌｌｏｎｅｓ）；ＷＯ ９９／１７７６９号に記載のインデノピラゾール類；Ｓｅｄｌａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．、９：１１４３−１１６８、１９９６に記載のフラボン類；ＷＯ ９８／５３０５０号に記載のセリンスレオニンキナーゼのペプチドループのペプチド誘導体；ＷＯ ０３／０５１８３８号に記載のオキシインドール類；ＷＯ ２００４／０６３１９８号に記載のジアゼピノインドロン類；ＷＯ ２００４／０４８３４３号に記載のピリミジン類；ＷＯ ２００４／０１４８７６号に記載の尿素化合物；並びにＷＯ ２００３／０９１２５５号に記載のピロロカルバゾール類、ベンゾフロイソインドール類、及びアザシクロペンタフルオレン類が挙げられる。
【００２１】
しかし、Ｃｈｋ１の効果的且つ選択的インヒビタが、当該技術分野で依然として要求されている。本発明は、このような要求や、その他の要求にも対処するものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、生化学及び／又は細胞系アッセイにおいて予期せぬ特性を呈するチェックポイントキナーゼＣｈｋ１の強力且つ選択的なインヒビタに関する。このＣｈｋ１インヒビタは、ＤＮＡ損傷又はＤＮＡ複製における障害に関連する適応症の治療における化学療法薬及び放射線治療薬のように、異常な細胞増殖を伴う適応症の治療に有用である。
【００２３】
従って、本発明の一態様は構造式（Ｉ）の化合物を提供することである。中でも、この化合物は、有効量の構造式（Ｉ）の化合物を必要とする個体に投与する工程を含むＣｈｋ１の阻害方法において有用である。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物は、次の構造式を有し、又はその薬理学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物である。
【化１】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり、Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり、Ｒ３ は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２の環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６〜７員の飽和複素環であって、Ｒａは独立に水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＨ２ＣＮ、又はＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は任意にオキソ（＝Ｏ）で置換され、Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、ＳＣ１−３アルキル、Ｎ（Ｒｂ）２、ＮＲｂＣ（＝Ｏ）Ｃ１−３アルキル、又は１個のＮ−Ｒａ基及び１〜３個のＣ１−３アルキル基で任意に置換される環を含む５又は６員の飽和複素環であり、又はＲ２及びＲ４は付着する炭素で結合して、５〜７員の飽和炭素環を形成し、Ｒ５は水素又はハロであり、ただし、Ｒ２及びＲ４の少なくとも一方は水素と異なり、Ｒ５はハロであり、Ｒ２又はＲ４は水素である）
【００２５】
本発明の別の態様は、構造式（ＩＩ）の化合物を提供することであり、この化合物は他の用途の中でも、Ｃｈｋ１の阻害方法において使用できる。
【化２】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり、Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり、Ｒ３は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６又は７員の飽和複素環であって、Ｒａは独立して水素、Ｃ１−３アルキル、又はＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は任意にオキソ（＝Ｏ）で置換され、Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、又はハロであり、又はＲ２及びＲ４は付着する炭素で結合して、５〜７員の飽和炭素環を形成し、ただし、Ｒ２及びＲ４の少なくとも一方は水素と異なる）
【００２６】
本発明の別の態様は、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の１以上の化合物を含有する医薬組成物、及びこの組成物のインビボ又はエクスビボでのＣｈｋ１の阻害が治療的利点を与え、又は研究もしくは診断的目的である適応症の治療における使用を提供する。
【００２７】
本発明の別の態様は、適応症の化学療法的又は放射療法的治療を受ける被検者における細胞を感作する方法であって、個体に、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を化学療法薬、放射線治療薬、又はその双方と組み合わせて投与することを含む方法を提供することである。この方法によって治療される適応症は、特に限定されないが、癌である。
【００２８】
本発明の別の態様は、異常な細胞増殖を阻害又は抑制する方法を提供することである。一実施形態では、この方法は、異常増殖細胞を含む細胞集団を、異常増殖細胞間で細胞周期停止を実質的に同期させるのに十分な量及び時間で異常増殖細胞と接触させることを含む。細胞集団内での細胞周期停止の実質的な同期を行うために、細胞集団を、細胞周期停止を実質的に無効化するのに十分な量及び時間で少なくとも１種のＣｈｋ１インヒビタと接触させることを含む。
【００２９】
本発明の別の態様は、ヒト治療用製品であって、（ａ）構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を含有する医薬組成物と、（ｂ）この組成物が異常な細胞増殖を伴う適応症の治療に有用であることを記載する添付文書と、（ｃ）容器と、を備えるヒト治療用製品を提供することである。
【００３０】
本発明の別の態様は、（ａ）構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を含有する医薬組成物と、（ｂ）この組成物がＤＮＡ障害又はＤＮＡ複製に関連する適応症の治療における化学療法薬又は放射線治療薬として有用であることを記載する添付文書と、（ｃ）容器と、を提供することである。
【００３１】
本発明のこれら及びその他の態様は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明の化合物は、構造式（Ｉ）を有し、又はその薬理学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物である。
【化３】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり、Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり、Ｒ３は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２の環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６又は７員の飽和複素環であって、Ｒａは独立して水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＨ２ＣＮ、又はＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は任意にオキソ（＝Ｏ）で置換され、Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、ＳＣ１−３アルキル、Ｎ（Ｒｂ）２、ＮＲｂＣ（＝Ｏ）Ｃ１−３アルキル、又は１個のＮ−Ｒａ基と、任意に１〜３個のＣ１−３アルキル基で置換された環とを含む５又は６員飽和複素環であり、又は、Ｒ２及びＲ４は付着する炭素で結合して、５〜７員の飽和炭素環を形成し、Ｒ５は水素又はハロであり、ただし、Ｒ２及びＲ４の少なくとも一方は水素と異なり、Ｒ５がハロであるとき、Ｒ２又はＲ４は水素である）
【００３３】
好ましい実施形態では、化合物は構造式（ＩＩ）を有し、又はその薬理学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物である。
【化４】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり、Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり、Ｒ３は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２の環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６又は７員の飽和ヘテロ環基であって、Ｒａは独立して水素、Ｃ１−３アルキル、又はＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は任意にオキソ（＝Ｏ）で置換され、Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、又はハロであり、又はＲ２及びＲ４は付着する炭素で結合して、５〜７員の飽和炭素環を形成し、ただし、Ｒ２及びＲ４の少なくとも一方は水素と異なる）
【００３４】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物の好ましい実施形態では、Ｒ１はクロロ、メチル、ＣＮ、又はＣＦ３である。別の好ましい実施形態では、Ｒ２は、水素、メチル、エチル、クロロ、ブロモ、ジメチルアミノ、シアノ、又はメトキシである。より好ましい実施形態では、Ｒ２は水素と異なる。
【００３５】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の他の好ましい実施形態では、Ｒ４は、メチル、クロロ、フルオロ、メトキシ、イソプロポキシ、ジメチルアミノ、−ＳＣＨ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、ピロリジニル、又は３，３−ジメチル−ピロリジニルである。より好ましい実施形態では、Ｒ４は、メチル、クロロ、又はメトキシである。更に別の好ましい実施形態では、Ｒ２及びＲ４は付着する炭素で結合して、５員又は６員の飽和炭素環を形成する。
【００３６】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の更に別の好ましい実施形態では、Ｒ５はハロであり、Ｒ４は水素である。好ましい実施形態では、Ｒ５はフルオロである。より好ましい実施形態では、Ｒ５は水素である。
【００３７】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の一実施形態では、Ｒ１がシアノであるとき、Ｒ２は水素であり、Ｒ４は好ましくはクロロ又はメチルである。別の実施形態では、Ｒ５はフルオロであり、Ｒ４は水素であり、Ｒ２はメチル、クロロ又はブロモである。
【００３８】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）中の好ましいＲ３基の例としては、特に限定されないが、
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
及び
【化１０】
が挙げられる。
【００３９】
本明細書で用いられる場合、「Ｃ１−３アルキル」という用語は、１〜３個の炭素原子を含む直鎖又は分岐のアルキル基、つまりメチル、エチル、ｎ−プロピル、及びイソプロピルを包含する。
【００４０】
「ハロ」は本明細書ではフルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードとして定義される。「シアノ」は−ＣＮとして定義される。「トリフルオロメチル」は−ＣＦ３を意味するものと定義される。「Ｍｅ」という略語はメチル、つまり−ＣＨ３である。
【００４１】
細胞周期チェックポイントを活性化するＤＮＡ損傷因子を、概して本明細書で「チェックポイント活性化因子」と称する。「Ｃｈｋ１」（「チェック−ワン」と発音）と示す、チェックポイントを活性化するＤＮＡ損傷因子を、本明細書で「Ｃｈｋ１活性化因子」と称する。同様に、かかるチェックポイントのインヒビタを、本明細書でそれぞれ、「チェックポイントインヒビタ」及び「Ｃｈｋ１インヒビタ」とそれぞれ称する。
【００４２】
本明細書で用いる場合、Ｃｈｋ１インヒビタは、Ｃｈｋ１タンパク質の細胞周期チェックポイント活性の少なくとも１つを、少なくとも部分的に抑止できる化合物である。細胞周期チェックポイントの抑止は、細胞性チェックポイント機構が充分に克服され、中断した細胞周期の期から細胞周期の次の期に細胞を経過させるか、又は細胞を直接細胞死へと進ませる場合に成し遂げられる。細胞周期チェックポイントの抑止によって、細胞が、損傷されたか又は不完全な遺伝物質を細胞周期の引き続く期に保有できるようになり、これにより細胞死が誘導又は促進される。細胞死は、アポトーシス及び有糸分裂のカタストロフを含む、いかなる機構によっても引き起こされ得る。本発明の化合物は、Ｃｈｋ１インヒビタである。
【００４３】
Ｃｈｋ１活性化因子としては、Ｃｈｋ１キナーゼ活性を活性化する能力を有し、よって少なくとも部分的な細胞周期休止を誘発する、既知又は発見後の作用因子の何れもが挙げられる。Ｃｈｋ１活性化因子には、細胞周期のいかなる期でも細胞周期を休止させることができる作用因子が含まれ、この期は本明細書で、活性化因子に対する「標的期」と称してもよい。標的期には、有糸分裂を除く細胞周期の期の何れも、すなわち、Ｇ１、Ｓ、及びＧ２期の何れもが含まれる。本発明で有用なＣｈｋ１活性化因子には、化学療法薬及び／又は放射線等のＤＮＡ損傷因子が含まれる。放射線Ｃｈｋ１活性化因子としては、限定されないが、イオン化放射線が挙げられる。イオン化放射線には、物質と相互作用することによりイオン対を生じることができる電磁又は微粒子放射線が含まれる。イオン化放射線には、Ｘ及びガンマ線、アルファ及びベータ粒子、中性子及び荷電核が含まれる。放射線には、紫外光、可視光、赤外放射線、マイクロ波放射線、及びそれらの組合せが含まれる。実施例８に記載のようなアッセイを用いて、作用因子がＣｈｋ１活性化因子であるかどうかを判定できる。
【００４４】
「異常な細胞増殖を阻害する」とは、異常に増殖している細胞が増殖する速度を遅延させること、又はこのような増殖を全体的に排除することを意味する。この阻害は結果的に、複製の速度の低下か、細胞死の速度の増大の一方、又は両方に起因する可能性がある。細胞死は、アポトーシス及び有糸分裂のカタストロフを含む何れの機構によっても引き起こされ得る。
【００４５】
「異常な細胞増殖を阻止する」とは、発生前に異常な細胞増殖を阻害すること、又はその再発を阻害することを意味する。
【００４６】
「インビボ」とは、動物又はヒトの体内のような、生存している被験者体内を意味する。これに関連して、異常に複製している細胞の増殖を遅延又は排除するのに、作用因子をインビボで治療的に使用できる。作用因子は、異常な細胞増殖又はそれに関連する病徴の出現を阻止するために、インビボで予防薬としても使用できる。
【００４７】
「エキソビボ」とは、生存している被験者の体外を意味する。エキソビボ細胞集団の例として、ヒト又は動物由来の流体又は組織試料等の生物学的試料及び細胞培養物が挙げられる。このような試料は、当該技術分野で良く知られた方法によって得ることができる。典型的な生物学的流体試料として、血液、脳脊髄液、尿、唾液が挙げられる。典型的な組織試料として、腫瘍及びバイオプシーが挙げられる。これに関連して、本発明の化合物は治療でも実験でも、幾多の適用が可能である。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「放射線治療薬」とは、電磁放射線に対する細胞の感度を高めるため、及び／又は電磁放射線で治療可能な疾患の治療を促進するために、治療上有効な量でヒト又は他の動物に投与される化合物を意味する。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「放射線」としては、限定されないが、１０−２０〜１００メートルの範囲の波長を有する放射線が挙げられる。「容器」の用語は、医薬品の保存、運送、調剤、及び／又は取扱に好適な、任意の入れ物及びそれ用の閉塞体を意味する。
【００５０】
「添付文書」の用語は、製品の投与方法の説明を、製品の使用に関して充分な情報を得た上での意思決定を医師、薬剤師、及び患者に行わせるのに必要とされる安全性及び効能のデータと共に提供する、製品に伴う情報を意味する。この添付文書は通常、医薬品用の「ラベル」と考えられる。
【００５１】
本発明には、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の、可能性を有するあらゆる立体異性体及び幾何異性体が含まれる。本発明には、ラセミ化合物のみならず、光学活性異性体も含まれる。構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物が単一エナンチオマーとして望まれる場合、それは、最終品の分割によって、又は異性体として純粋な出発物質から、もしくはキラル補助試薬を用いて立体特異的に合成することの何れかによって得ることができる。例えば、Ｚ． Ｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、８（６）、８８３−８８８（１９９７）参照。最終品、中間体、又は出発物質の分割は、当該技術分野において知られた何れの好適な方法によってでも成し遂げることができる。更に、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の互変異性体が存在できる状況で、本発明には、その化合物のあらゆる互変異性体を含めることを意図する。以下に実証する通り、特異的立体異性体は、化学療法薬又は放射線での治療と組み合わせて、Ｃｈｋ１を阻害する並外れた能力を示すことができる。
【００５２】
構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物のプロドラッグもまた、本発明の方法での化合物として使用できる。ある化合物を製剤及び／又は投与に好適な形態に誘導体化し、次いでインビボで薬物として遊離させるプロドラッグアプローチを、その化合物の物理化学的性質を一過性に（例えば、生物可逆的に）変化させるために成功裡に使用することは充分に確立されている（Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｅｄ．， ”Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，” Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， （１９８５）； Ｒ．Ｂ． Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， ”Ｔｈｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｃｔｉｏｎ，” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｃｈａｐｔｅｒ ８， （１９９２）； Ｋ．Ｍ． Ｈｉｌｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ．， １５， ８３ （１９９５）参照）。
【００５３】
本発明の化合物は、１以上の官能基を含んでいる。所望又は必要な場合、官能基を修飾してプロドラッグを提供できる。好適なプロドラッグとして、例えば、アミド類及びエステル類等の酸誘導体が挙げられる。プロドラッグとしてＮ−酸化物を使用できることも、当業者によって理解される。
【００５４】
本発明の化合物は、塩として存在できる。本発明の化合物の薬学的に許容できる塩が、通常、本発明の方法では好ましい。本明細書で用いる場合、「薬学的に許容できる塩」の用語は、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の塩又は双性イオン性フォームをいう。式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の塩は、化合物の最終的な単離及び精製の際に調製でき、又は好適なカチオンを有する酸と化合物とを反応させることによって別途に調製できる。薬学的に許容できる好適なカチオンには、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）及びアルカリ土類金属（例えば、カルシウム又はマグネシウム）カチオンが含まれる。更に、塩基性中心を含む構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の薬学的に許容できる塩は、薬学的に許容できる酸で形成される酸付加塩である。薬理学的に許容できる塩の形成に使用できる酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及びリン酸といった無機酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、マロン酸、及びクエン酸といった有機酸が挙げられる。本発明の化合物の塩の非限定例としては、特に限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、二硫酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホネート、リン酸塩、水素リン酸塩、アセテート、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゾエート、酪酸塩、樟脳酸塩、カンホスルホネート、クエン酸塩、二グルコン酸塩、リン酸グリセロール、ヘミサルフェート、ヘプタン酸、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、コハク酸、マロン酸、フマル酸塩、マレイン酸、メタンスルホン酸塩、メシチレンスルホネート、ナフチル−エンスルホネート、ニコチネート、２−ナフタレンスルホネート、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロプリオネート、ピクラート、ピバレート、プロピオン酸塩、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、グルタミン酸塩、重炭酸塩、パラトルエンスルホネート、ウンデカノエート、ラクテート、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、ベンゼンスルホネート、及びｐ−トルエンスルホネート塩が挙げられる。更に、本発明の化合物中に存在する有効なアミノ基は、メチル、エチル、プロピル、及びブチルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物；ジメチル、ジエチル、ジブチル、及びジアミルの硫酸塩；デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステリルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物、並びにベンジル及びフェネチルの臭化物を用いて四級化できる。以上に鑑み、本明細書に記載の本発明の化合物の言及は何れも、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を初めとして、その薬学的に許容できる塩、溶媒和物、又はプロドラッグを含むことを意図する。
【００５５】
本発明の化合物の非限定例は、
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
【化４２】
【化４３】
【化４４】
【化４５】
【化４６】
【化４７】
【化４８】
【化４９】
【化５０】
【化５１】
【化５２】
【化５３】
【化５４】
【化５５】
【化５６】
【化５７】
【化５８】
【化５９】
【化６０】
１−［５−メチル−２−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチルピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３７２．４）
【化６１】
１−［５−クロロ−２−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９２．４）
【化６２】
１−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［２−（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−５−メチル−フェニル］−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９６．４）
【化６３】
１−［５−クロロ−２−Ｒ−（１−メチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９１．３）
【化６４】
１−［５−ブロモ−２−Ｒ−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４３８．０）
【化６５】
１−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−Ｒ−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３８３．０）
【化６６】
１−［５−クロロ−２−（４−メチル−［１，４］オキサゼパン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４０６．０）
【化６７】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（５−オキソ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９２．２）
【化６８】
Ｎ−［２−クロロ−４−［３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−５−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−アセトアミド（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４３５．０）
【化６９】
１−［５−クロロ−３−フルオロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９６．３）
【化７０】
１−［５−メトキシ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素 （ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３７４．３）
【化７１】
１−［５−メトキシ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３５８．３）
【化７２】
１−［４−クロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３７８．３）
【化７３】
１−［５−クロロ−４−フルオロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３９６．１）
【化７４】
１−［５−シアノ−４−メチル−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３８３．３）
【化７５】
１−［５−クロロ−４−ジメチルアミノ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４２１．２）
【化７６】
Ｎ−［２−クロロ−４−［３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−５−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−イソブチラミド（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４６３．２）
【化７７】
１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−［６−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−インダン−５−イル］−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ３８４．３）
【化７８】
１−［５−クロロ−２−（４−シアノメチル−チオモルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４３３．０）
【化７９】
１−｛５−クロロ−２−［４−（２−シアノ−エチル）−Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ］−フェニル｝−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４３１．０）
【化８０】
１−［５−クロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−４−ピロリジン−１−イル−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ − ４４７．２）
【化８１】
【化８２】
【化８３】
【化８４】
【化８５】
【化８６】
【化８７】
【化８８】
及び
【化８９】
、又はその塩、溶媒和物（例えば水和物）、もしくはプロドラッグである。
【００５６】
本発明の化合物は、化学薬品そのままで治療的に投与できるが、医薬組成物又は製剤としてその化合物を投与するのが好ましい。よって、本発明は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を、それに対する薬学的に許容できる希釈剤又は担体と共に含む医薬組成物を提供する。更に提供されるのは、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を、それに対する薬学的に許容できる希釈剤又は担体と混合することを含む、医薬組成物の調製法である。
【００５７】
従って、本発明は更に、構造式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を、１以上の薬学的に許容できる担体と、任意に他の治療及び／又は予防用成分と共に含む医薬製剤を提供する。担体は、製剤の他の成分と適合し、且つそのレシピエントにとって有害でないという意味で「許容できる」。
【００５８】
本発明の化合物は予想外に高い作用強度を示す。作用強度は、典型的には特定の結果を得るのに必要な化合物の濃度として表す。作用強度が大きいほど、意図したその機能を遂行するのに必要とされる化合物は少なくなる。インビトロの作用強度は、典型的にはＩＣ５０値として表し、用量応答アッセイを用いて測定する。ＩＣ５０値は、効果が観察されないか又は最小の効果しか観察されない濃度、部分的な効果が観察される更に高濃度を経て、最大の効果が観察される飽和濃度までを含む様々な濃度にわたる目的化合物と、感受性アッセイ系とを接触させることによって測定できる。論理的には、インヒビタ化合物のこのような用量応答効果のアッセイは、対数スケール上にプロットした場合に濃度の関数として阻害の程度を表すＳ字形曲線として描写できる。その曲線はまた、理論的に、チェックポイント酵素の活性を、そのアッセイで観察される最低と最高の酵素活性の差の活性の５０％になるレベルにまで低下させるのにその濃度が充分である点を通る。この濃度を、５０％阻害の阻害濃度、又はＩＣ５０値と定義する。
【００５９】
ＩＣ５０値は、当業者に周知の従来の生化学的（無細胞）アッセイ技術又は細胞を基礎にしたアッセイ技術を用いて定量できる。このようなアッセイの例を、下記実施例１に示す。
【００６０】
好ましくは、関連アッセイを少なくとも２回実施してＩＣ５０値を得、得られた個々の数値の平均（相加平均、すなわち「平均値」）として、そのＩＣ５０値を表す。より好ましくは、アッセイを３〜１０（又はそれ以上）回繰り返し、得られた数値の平均値としてＩＣ５０値を表す。最も好ましくは、当業者に知られた統計的手法を用いて統計的に信頼できる平均ＩＣ５０値を引き出すのに充分な回数のアッセイを実施する。
【００６１】
本発明の化合物は、予想外に高いインビトロ作用強度に対応して、予想外に低いＩＣ５０値を示す。本発明の化合物は、下記実施例１に記載の通りにアッセイすると約２００ｎＭ未満、いくつかの実施形態では約１５０ｎＭ未満、他の実施形態では約１００ｎＭ未満、その他の場合で約５０ｎＭ未満、その他の場合で約１０ｎＭ未満、そしてその他の場合で約５ｎＭ未満のＩＣ５０値を示す。他の実施形態で、本発明の化合物は約０．１ｎＭ〜約５ｎＭのＩＣ５０値を示す。
【００６２】
本発明の化合物は、他のプロテインキナーゼよりもＣｈｋ１の阻害に選択性を示す。選択性は、有害な副作用の低減及び／又は治療係数の増大に有利であるかもしれない。
【００６３】
「選択性」は本明細書では「選択性倍数」として表す。概して、本明細書で用いる場合に選択性倍数とは、比較酵素に対する被験化合物のＩＣ５０をコンパレータ酵素のＩＣ５０で割ったものである。特に、本明細書で用いる場合にＣｈｋ１インヒビタに対する選択性倍数とは、Ｃｈｋ１（比較酵素）に対するＣｈｋ１インヒビタ（被験化合物）のＩＣ５０を、コンパレータ酵素に対するＩＣ５０で割ったものである。本発明の化合物を測定し得る比較酵素としては、Ｃｄｃ２、Ｃｈｋ２、ＣＴＡＫ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｋ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ４、ＩＲ、ＪＮＫ１、ｃ−Ｋｉｔ、ｐ３８アルファ、ｐ３８ベータ、ｐ３８デルタ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ２、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ｐｐ６０ｖ−ｓｒｃ、タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔ−１、ｐ３８ＭａｐＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、カルシウムカルモジュリン依存的キナーゼＩＩ、及びａｂ１チロシンキナーゼ等のタンパク質キナーゼが少なくとも挙げられる。
【００６４】
コンパレータ酵素に対する被験化合物のＩＣ５０値を求めるためのアッセイは、実施例２に記載しており、当業者に周知である。本発明の化合物は、試験した前記プロテインキナーゼに比して少なくとも約２０倍の選択性を示す。いくつかの実施形態で、本発明のＣｈｋ１インヒビタは、試験した前記プロテインキナーゼよりもＣｈｋ１の阻害に少なくとも約５０倍の選択性、他の実施形態では少なくとも約７５倍の選択性、他の実施形態では少なくとも約１００倍の選択性を示す。
【００６５】
本発明の化合物は、細胞を基礎にしたアッセイにおいて予想外に高い作用強度を示す。Ｃｈｋ１インヒビタの細胞に基づく作用強度を測定するために、異常に増殖している細胞を含む、細胞を基礎にしたモデルにおけるＤＮＡ損傷因子の成長阻止効果を高めるのに必要なＣｈｋ１インヒビタの濃度の測定を可能とするアッセイを開発した。細胞に基づく作用強度のこの測定値は、本明細書で「ＥＣＴＦＳ」値と表し、この「ＥＣＴＦＳ」は、ＤＮＡ損傷因子の成長阻止効果に対し、異常に増殖している細胞の集団に２倍の増感を生じさせるＣｈｋ１インヒビタの有効濃度である。ＥＣＴＦＳは、細胞成長の９０％阻害に必要なＤＮＡ損傷因子の量を半分に低減するＣｈｋ１インヒビタの濃度として算出される。本出願人は、本発明の化合物が、細胞に基づく予想外に高い作用強度に対応して予想外に低いＥＣＴＦＳ値を示すことを見出している。
【００６６】
測定してもよい別のパラメータは、Ｃｈｋ１インヒビタ化合物に対するＬＤ５０（細胞の５０％の成長を阻害する化合物単独の用量）で達成される増感倍数である。これらの２つの数値ＥＣＴＦＳ及びＬＤ５０での増感倍数で、Ｃｈｋ１インヒビタの作用強度及び毒性の双方を直接的に相互に順位付けできるようになる。
【００６７】
ＥＣＴＦＳ値を測定するのに有用なアッセイの例は、下記実施例３に記載する。簡単に説明すると、このアッセイでは、異常に増殖している細胞の集団としてＨＴ２９ヒト結腸癌腫細胞、ＤＮＡ損傷因子／Ｃｈｋ１活性化因子としてゲムシタビン、及びＣｈｋ１インヒビタとして本発明の化合物を使用する。異常に増殖している細胞の集団を培養して、好適な生育培地で成長させる。次に、様々な濃度にわたるＤＮＡ損傷因子に細胞を曝す。所定時間の後にＤＮＡ損傷因子を除き、その細胞を様々な濃度にわたるＣｈｋ１インヒビタに所定時間曝す。次いで培養細胞のプレートを回収して、生存している細胞の相対数を計数する。データは対照としてのＣｈｋ１インヒビタ単独に対して正規化し、その後［ＤＮＡ損傷因子濃度］対［相対細胞生存率（１００％が１．０と同等）］の対数／対数グラフにプロットする。用いたＣｈｋ１インヒビタの各濃度につき、Ｃｈｋ１インヒビタ無しと有りの場合で９０％の成長阻害を達成するのに必要なＤＮＡ損傷因子の量の差から、増感倍数を求める。これらのデータは、次いで増感倍数に対するＣｈｋ１インヒビタ濃度のグラフにプロットし、これよりＥＣＴＦＳを算出する。
【００６８】
好ましくは、少なくとも２回アッセイを実施してＥＣＴＦＳ値を得、得られた個々の数値の平均値として、そのＥＣＴＦＳ値を表す。より好ましくは、アッセイを３〜１０（又はそれ以上）回繰り返し、得られた数値の平均値としてＥＣＴＦＳ値を表す。最も好ましくは、当業者に知られた統計的手法を用いて統計的に信頼できる平均ＥＣＴＦＳ値を引き出すのに必要な回数のアッセイを実施する。
【００６９】
ＥＣＴＦＳアッセイに付したすべての化合物が、約１０００ｎＭ未満のＥＣＴＦＳ値を示した。これに対し、構造的に類似の既知化合物は、約１１，０００ｎＭのＥＣＴＦＳ値を示す。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、約５００ｎＭ未満、又は約３００ｎＭ未満、又は約２００ｎＭ未満、又は約１５０ｎＭ未満、又は約１００ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満、又は約３０ｎＭ未満、又は２０ｎＭ未満、又は約１０ｎＭ未満、又は他の実施形態では約５ｎＭ未満のＥＣＴＦＳ値を呈する。
【００７０】
本発明での使用に好適な化合物及び医薬組成物には、その使用目的を達成するのに有効な量の有効成分を投与するものが含まれる。更に詳細には、「治療上有効な量」とは、適応症を患っている個体を治療するのに、又は適応症の現存している病徴を緩和するのに充分な量を意味する。治療上有効な量の決定は、特に本明細書に挙げる詳細な開示に鑑みて、当業者が充分にできることである。
【００７１】
Ｃｈｋ１インヒビタに加えて、本発明の医薬組成物は、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、他の造血因子、又はそれらの混合物等の生物学的に活性な作用因子配合し、当該医薬組成物の単独投与で起こる、又はこれに伴う可能性のある有害な副作用を低減するように製剤化できる。あるいは、かかる生物学的に活性な作用因子を、所望の治療効果を促進するために本発明の医薬組成物に配合してもよい。本発明の医薬組成物において有用なアジュバント生理活性物質としては、特に限定されないが、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポイエチン、幹細胞因子、ＥＰＯ、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、及び／又はヒトアンジオポイエチン様ポリペプチド等のアンジオポイエチン、血管内皮の成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオジェニン、骨形態形成タンパク質−１（ＢＭＰ−１）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰレセプタＩＡ、ＢＭＰレセプタＩＢ、脳由来神経栄養因子、繊毛神経栄養因子、繊毛神経栄養因子レセプタ、サイトカイン誘導好中球走化因子１、サイトカイン誘導好中球走化因子２、サイトカイン誘導好中球走化因子２、内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮細胞成長因子、上皮誘導好中球誘引剤、フィブロブラスト成長因子（ＦＧＦ）４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ｃ、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ酸性、ＦＧＦ塩基性、グリア細胞系誘導神経栄養因子レセプタ１、グリア細胞系誘導神経栄養因子レセプタ２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質、ヘアピン結合上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子レセプタ、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子レセプタ、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子レセプタ、神経成長因子神経成長因子レセプタ、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板誘導内皮細胞成長因子、血小板誘導成長因子、血小板誘導成長因子Ａ鎖、血小板誘導成長因子ＡＡ、血小板誘導成長因子ＡＢ、血小板誘導成長因子Ｂ鎖、血小板誘導成長因子ＢＢ、血小板誘導成長因子レセプタ、血小板誘導成長因子レセプタ、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子レセプタ、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ、ＴＧＦ１、ＴＧＦ１．２、ＴＧＦ２、ＴＧＦ３、ＴＧＦ５、潜在的ＴＧＦ１、ＴＧＦ、結合タンパク質Ｉ、ＴＧＦ結合タンパク質ＩＩ、ＴＧＦ結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子レセプタＩ型、腫瘍壊死因子レセプタＩＩ型、ウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータレセプタ型、血管内皮成長因子、及びキメラタンパク質、並びにその生物学的又は免疫学的に活性のフラグメントが挙げられる。
【００７２】
構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は、治療的使用法での当該化合物の有益な性質を促進する（又は望ましくない性質を軽減する）補助部分に接合又は結合させることもできる。かかる接合体は、目的とする特定の解剖学的部位又は領域（例えば、腫瘍）への化合物の送達を増強し、標的細胞で化合物の治療濃度を持続できるようにし、化合物の薬物動態学的及び薬力学的性質を変え、且つ／又は化合物の治療係数又は安全性プロファイルを改善する。好適な補助部分として例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、又はポリペプチド、例えばモノクローナル抗体及び他の改変抗体等の抗体；並びに標的細胞又は組織中の受容体に対する天然もしくは合成リガンドが挙げられる。他の好適な補助成分には、体内分布及び／又は標的細胞による化合物の取込を促進する脂肪酸又は脂質部分が含まれる（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７：３２２９、２００１参照）。
【００７３】
本発明の製剤は、経口、非経口、経粘膜（例えば、舌下又は口腔内投与）、局所、経皮、直腸内、吸入（例えば、鼻又は肺深部吸入）等、示唆される疾患の治療のために標準法にて投与できる。非経口投与としては、限定されないが、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鞘内、及び関節内が挙げられる。非経口投与はまた、ＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ（商標名）、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｌｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）のような高圧技術を用いて成し遂げることもできる。
【００７４】
経口投与及び口腔内投与のため、組成物は従来法で製剤化した錠剤又は薬用ドロップの形態とすることができる。例えば、錠剤及びカプセルは、結合剤（例えば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、スターチ粘液、又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば、乳糖、ショ糖、微結晶性セルロース、トウモロコシスターチ、リン酸カルシウム、又はソルビトール）、潤滑剤（例えば、、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、又はシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモスターチ、又はスターチグリコール酸ナトリウム）、又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような従来の賦形剤を含有できる。錠剤は、当該技術分野でよく知られた方法によってコーティングできる。
【００７５】
あるいは、本発明の化合物は、例えば水性又は油性懸濁液剤、溶液剤、乳剤、シロップ剤、又はエリキシル剤等の経口液剤に取り込ませることができる。更に、これらの化合物を含有する製剤は、使用前に水又は他の好適な媒体で構成するための乾燥品として提供できる。かかる液性調製物は、例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／ショ糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、及び水素化食用脂のような懸濁剤、レシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアラビアゴムのような乳化剤、アーモンド油、椰子油、脂肪エステル、プロピレングリコール、及びエチルアルコールのような非水性ビヒクル（食用油を含んでよい）；並びにメチル又はプロピルのｐ−ヒドロキシ安息香酸及びソルビン酸塩のような保存剤といった従来の添加剤を含有できる。
【００７６】
調剤は、例えば、ココアバター又は他のグリセリド類等の従来の坐剤用基材を含有する坐剤としても製剤化できる。吸入用組成物は、典型的には乾燥粉体として投与できる溶液、懸濁液、もしくはエマルションの形態で、又はジクロロジフルオロメタンもしくはトリクロロフルオロメタン等の従来の噴霧剤を用いたエアロゾルの形態で提供される。
【００７７】
局所及び経皮製剤には、点眼剤、クリーム、軟膏、ローション、及びペースト剤等の、従来の水性又は非水性媒体が含まれ、又は薬用硬膏剤、パッチ、もしくは膜の形態をとる。
【００７８】
更に、本発明の組成物は、注射又は連続注入による投与用に製剤化できる。注射用製剤は、懸濁液、溶液、又は油性もしくは水性媒体中のエマルションの形態をとることができ、また、懸濁化、安定化、及び／又は分散剤等の製剤用薬剤を含有できる。あるいは、有効成分は使用前に好適な媒体（例えば、滅菌、発熱物質不含の水）で構成するための粉末形態とすることができる。
【００７９】
本発明の組成物は、デポ剤としても製剤化できる。このような長時間作用性製剤は、（例えば皮下又は筋肉内への）埋め込みにより、又は筋肉内注射により投与できる。従って、本発明の化合物は、好適なポリマー材料（例えば、水溶性ポリマー）、疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルション）、イオン交換樹脂、又は難溶性誘導体（例えば、難溶性塩）を用いて製剤化できる。
【００８０】
獣医による使用には、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を、通常の獣医実務に従って、好適に許容できる製剤として投与する。獣医師は、特定の動物にとって最も適切な投与計画及び投与経路を容易に決定できる。本発明の化合物及び方法によって治療可能な動物としては、限定されないが、ペット、家畜、ショーアニマル、及び動物園の被験動物が挙げられる。
合成方法
【００８１】
本発明の化合物は、以下の合成スキームによって調製できる。先ず、本明細書に記載のＣｈｋ１インヒビタを調製するのに使用するアルコキシアリールアミン類は、異なる一般合成スキームによって調製できる。例えば、一般スキーム１に、アルコールの活性型とニトロフェノールとの、原位置で形成、又は別途に調製及び単離する、ニトロフェニルエーテル産物を提供する反応の概要を示す。標準的条件下でのエーテルの還元により、本発明の化合物を生産するために使用するアリールアミンを提供する。
一般スキーム１
【化９０】
あるいは、水素化ナトリウム又はカリウムビス（トリメチルシリル）アミド等の強塩基の存在下にハロニトロベンゼンをアルコールと反応させることでも、一般スキーム２に示すようにニトロアリールエーテルが得られる。次いでこれらのエーテルを、一般スキーム１に示すように還元する。
一般スキーム２
【化９１】
アリールアミンの尿素への変換は、いくつかの合成スキームの１つによって成し遂げることができる。例えば、一般スキーム３に示すように、アリールアミンをピラジンカーバメートと反応させて尿素を生じさせることができる。
一般スキーム３
【化９２】
あるいは、一般スキーム４に概説するように、アシルアジドの加熱誘発分解によって反応性アリールイソシアネートを生成させ、これを次いでアリールアミンと反応させて所望の尿素を得る。
一般スキーム４
【化９３】
一般スキーム５に示す別のアプローチでは、ホスゲン又はホスゲン等価物を用いて２つのアリールアミンをカップリングさせ、尿素を提供する。
一般スキーム５
【化９４】
本明細書で説明する合成に用いられる略語は、時間（ｈ）、分（ｍｉｎ）、１平方インチ当たりポンド（ｐｓｉ）、飽和（ｓａｔ’ｄ）、水（Ｈ２Ｏ）、脱イオン（ＤＩ）、イソプロピルアルコール（ｉＰｒＯＨ）、炭素上白金（Ｐｔ／Ｃ）、窒素（Ｎ２）、水素（Ｈ２）、炭素上パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）、白金オキシド（Ｐｔ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ）、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、メタノール（ＭｅＯＨ）、アンモニウム水酸化物（ＮＨ４ＯＨ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、酢酸（ＡｃＯＨ）、ＮａＯＨ（ＮａＯＨ）、ＥｔＯＡｃ（ＥｔＯＡｃ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、重水素化ジメチルスルフォキシド（ｄ６−ＤＭＳＯ）、カルボン酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、水素化ナトリウム（ＮａＨ）、ＴＥＡ（ＴＥＡ）、カルボン酸セシウム（ＣＳｓＣＯ３）、二酸化炭素（ＣＯ２）、水酸化パラジウム（Ｐｄ（ＯＨ）２）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、硝酸（ＨＮＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である。化合物の調製以下の本発明の化合物は、前記の一般スキームを用いて調製した。さらなる本発明の化合物は、前記一般スキーム、及び以下の特異的合成を用い、出発物質の慎重な選択により調製できる。
化合物１
【化９５】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【００８２】
ステップ１： ２−アミノ−５−メチルピラジン
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホン酸塩（２０．０ｇ、７９ｍｍｏｌ）及びピルブアルデヒド１−オキシム（６．８８ｇ、７９ｍｍｏｌ）をフラスコ内で合わせた。ｉＰｒＯＨ（１４０ｍＬ）を添加し、得られた黄色スラリーを室温で１８時間撹拌し、この間に黄色沈殿が蓄積した。混合液を濾過して、沈殿をｉＰｒＯＨ（２×５０ｍＬ）及び脱イオン水（２０ｍＬ）で洗浄し、その後凍結乾燥して２−アミノ−３−シアノ−５−メチルピラジンＮ−オキシド（１０．７ｇ）を得た。
【００８３】
ピラジンＮ−オキシドをＭｅＯＨ（２２ｍＬ）及びＡｃＯＨ（５ｍＬ）に懸濁させた。これに５％Ｐｔ／Ｃ（１．６ｇ）及びＤａｒｃｏ ＫＢ−Ｂ（８ｇ）を注意深く添加した。混合液に、６０ｐｓｉで１８時間、Ｈ２を吸収させた。反応を２５％ＮａＯＨ（３４ｍＬ）でクエンチし、Ｎ２を３０分間パージした。混合液は、湿潤セライト床を通して濾過して、ＭｅＯＨ（４×１００ｍＬ）で洗浄した。濾液を真空で４分の１の体積まで濃縮した。濾液をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈して５％ＮａＯＨ（３０ｍＬ）で洗浄し、ＥｔＯＡｃ（２×７０ｍＬ）で逆抽出した。有機層を集めて飽和ＮａＣｌ（２０ｍＬ）で洗浄して濾過し、真空で濃縮して橙色粘性固体（５．１６ｇ）を得た。
【００８４】
ステップ２：（５−メチルピラジン−２−イル）カルバミン酸フェニルエステル
２−アミノ−５−メチルピラジン（５．１６ｇ、４７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５２ｍＬ）に溶解させ、Ｎ２下に撹拌して、０℃になるまで冷却した。これに、ピリジン（４．８ｍＬ、５９ｍｍｏｌ）を添加し、次いでフェニルクロロホルメート（６．２ｍＬ、５９ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下して沈殿を形成させた。混合液を０℃で１時間撹拌した。その後、反応を０．２５ＭのＨＣｌ（４０ｍＬ）及び無水エーテル（５０ｍＬ）でクエンチし、０℃で３０分間撹拌した。沈殿を濾過によって単離して、脱イオン水（２０ｍＬ）及びエーテル（２×２５ｍＬ）で洗浄し、減圧下に乾燥させて白色綿毛状粉末として産物（７．４ｇ）を得た。
【００８５】
ステップ３： （Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−［１，４］オキサゼパン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
２５０ｍＬの丸底フラスコに、（Ｓ）−（＋）−ベンジルグリシジルエーテル、（１．３１ｇ、７．９ｍｍｏｌ）、３−ベンジルアミノ−プロパン−１−オール（１．３ｇ、７．９ｍｍｏｌ）及び１０ｍＬのＥｔＯＨを加えた。混合液を４０℃に１５時間加熱した。反応液を冷却して真空で濃縮し、得られた油状産物を、更に精製することなく使用した。ジオールを２５０ｍＬの丸底フラスコに入れて、７５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解させた。溶液を０℃に冷却し、トルエンスルホニルクロライド（５．２７ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）を一分配にて添加した。混合液は、反応温度を注意深く０℃に保ちながら６時間撹拌した。冷反応を、５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。更に２０ｍＬの水を加え、混合液はＥｔＯＡｃを１００ｍＬずつ用いて３回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。アルコールはその後、溶離液としてＥｔＯＡｃ及びヘキサンの２５〜５０％濃度勾配を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、黄色オイルとして１．３９ｇのトシルアルコールが得られた。
【００８６】
アルコールを５０ｍＬのＤＭＦに溶解させて、０℃に冷却した。冷撹拌混合液に、９５重量％のＮａＨ（０．２９ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を注意深く添加した。反応液を０℃で１５分間撹拌し、次いでゆっくりと室温にまで昇温して６時間撹拌した。反応を５０ｍＬの水で注意深くクエンチし、ＥｔＯＡｃを５０ｍＬずつ用いて３回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。粗製産物をＥｔＯＨに溶かし、Ｐａｒｒ水素化装置に入れた。また、この溶液に１０重量％のＰｄ／Ｃ（０．４２６ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）及び２ＭのＨＣｌ（２．１ｍＬ）を添加した。水素化を５０ｐｓｉで２日間行い、この時点で反応が完了したと、ＬＣＭＳ解析により判断した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で中和し、ＣＨＣｌ３：ｉＰｒＯＨの３：１混合液を用いて抽出した。有機層を合わせて真空で濃縮して、粗製産物を次の工程に進めた。
【００８７】
粗製アミノアルコールを、１００ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。この溶液に、ＴＥＡ（１．５９ｍＬ、１１．５ｍｍｏｌ）及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（５．７４ｇ、５．７４ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１８時間撹拌し、その後飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２を５０ｍＬずつ用いて３回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。産物は、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの２５〜５０％濃度勾配を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、黄色オイルとして０．２４０ｇのオキサザパンアルコールが得られた。
【００８８】
ステップ４： （Ｓ）−２−（４−クロロ−２−ニトロ−フェノキシメチル）−［１，４］オキサゼパン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
５０ｍＬの丸底に、オキサザパンアルコール（０．２４０ｇ、１．０３ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．２１ｍＬ、１．５４５ｍｍｏｌ）、及び１０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を添加した。溶液を０℃に冷却し、メタンスルホニルクロライド（０．１０ｍＬ）を滴下した。混合液を０℃で１．５時間撹拌し、次いで水で完全にクエンチした。層を分離させ、水層を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で１回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。次いで、粗製メシレートを５ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解させた。この溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３（０．６７１ｇ、２．０６ｍｍｏｌ）及び４−クロロ−２−ニトロ−フェノール（０．２１５ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）を添加した。この淡黄色溶液はその後、終夜１００℃に加熱した。反応液を室温まで冷却して、５０ｍＬの水でクエンチし、ＥｔＯＡｃを５０ｍＬずつ用いて３回抽出した。産物は、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの１０〜３５％濃度勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。この工程手順で、黄色オイルとして０．１２０ｇのニトロフェニルオキサザパンが得られた。
【００８９】
ステップ５： １−［５−クロロ−２−（［１，４］オキサゼピン−２−（Ｓ）−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
２５ｍＬの丸底で、５ｍＬのＭｅＯＨにニトロフェニルオキサザパン（０．１２０ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）及びＰｔ２Ｏ（０．００７ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を入れた。ヘリウムバルーンを取り付け、アスピレーターを用いてフラスコを排気して、Ｈ２を３回充填し、次いでＨ２下に２時間撹拌させた。反応液をセライトを通して濾過し、そのセライトパッドを、ＭｅＯＨを２０ｍＬずつ用いて２回洗浄した。溶液は、真空で濃縮した。粗製アニリンを、５ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解させた。この溶液に、ＴＥＡ（０．００５ｍＬ、０．３４ｍｍｏｌ）及び（５−メチルピラジン−２−イル）カルバミン酸フェニルエステル（０．０７ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を、室温で１８時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を１０ｍＬのＥｔＯＡｃに再溶解させて飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧で濃縮した。灰色／褐色残渣を３ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で覆い、これに１ｍＬの濃トリフルオロ酢酸を添加した。酸の添加で、固体はすべて溶解した。反応液を室温で４時間撹拌し、この時点で、溶液のｐＨが８に達するまで飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加する。混合液は、ＣＨＣｌ３：ｉＰｒＯＨの３：１混合液を１０ｍＬずつ用いて３回抽出した。その後有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下に濃縮した。オフホワイト色の固体は、次いでＥｔＯＡｃ中で摩砕して、濾材フリットフィルターを通して濾過し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。白色固体は、減圧下に完全に乾燥させた。この手順で、白色微粉末として０．０２０ｇの所望の尿素が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．８３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．３９ （ｄｄ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ） ８．０４ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．９９ （ｄｄ， １Ｈ）， ６．８２ （ｄ， １Ｈ）， ４．２５−３．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９０−３．７６ （ｍ， １Ｈ）， ３．３８ （ｄ， １Ｈ）， ３．１３−３．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．００ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．５４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６−１．８９ （ｍ， ３Ｈ）．ＬＣＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．３ （Ｍ＋１）．
化合物２
【化９６】
１−［５−クロロ−２−（Ｒ−モルホリン−３−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【００９０】
ステップ１： ３−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
モルホリン−３−Ｒ−４−ジカルボン酸４−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．００ｇ、４．３２ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃浴）乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）溶液に、ボラン（１ＭのＴＨＦ溶液、４．７６ｍＬ、４．７６ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下に１５分間かけて滴下した。１時間撹拌した後、浴を除き、更に３時間、外界温度で撹拌を継続した。酢酸（１４．３ｍＬの１Ｍ水溶液、１４．３ｍｍｏｌ）を、その後添加した。１時間撹拌した後、溶液を過剰の水性飽和炭酸水素ナトリウムを添加して中和した。ジクロロメタン（２０ｍＬ）を添加して、その溶液を１５分間撹拌し、次いで層を分離させた。水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過した。濾過した溶液を濃縮して白色固体（０．４６ｇ）とした。
【００９１】
ステップ２： ３−（４−クロロ−２−ニトロ−フェノキシメチル）−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
３−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．１３ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）及び５−クロロ−２−フルオロニトロベンゼン（０．１１ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の冷却した（−７８℃浴）乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）撹拌溶液に、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド（２．４ｍＬのＴＨＦ０．５Ｍ溶液、１．２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に１５分間かけて滴下した。更に１５分間撹拌した後、水性飽和アンモニウムクロライド（１０ｍＬ）を添加し、浴を除いて溶液を外界温度まで昇温させた。１時間撹拌した後、水（１５ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を添加し、５分間撹拌して層を分離させた。水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過した。濾過した溶液を濃縮して黄色オイル（０．２６ｇ）とし、これをヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１：１）で溶出させるカラムクロマトグラフィーにより精製し、淡黄色オイル（０．１９５ｇ）を得た。
【００９２】
ステップ３： ３−（２−アミノ−４−クロロ−フェノキシメチル）−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
３−（４−クロロ−２−ニトロ−フェノキシメチル）−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．１７ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４ｍＬ）撹拌溶液に、Ｐｔ２Ｏ（０．０２０ｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコを排気し、次いでＨ２を３回繰り返して充填した。４時間撹拌した後、溶液をセライトのパッドで濾過して濾液を濃縮し、黄色オイルとして産物を得た。
【００９３】
ステップ４： ３−｛４−クロロ−２−［３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−フェノキシメチル｝−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
黄色オイル及び（５−メチル−ピラジン−２−イル）−カルバミン酸フェニルエステル（０．１３ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を調製して、ＴＥＡ（０．０７４ｍＬ、０．５３ｍｍｏｌ）を添加した。２４時間撹拌した後、反応液を減圧下に濃縮し、次いで水（１０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に再溶解させた。１５分間撹拌した後、層を分離させて、水層をＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて鹹水（１０ｍＬ）で洗浄して、その後乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させて濾過した。濾過した溶液を濃縮し、その後ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）で溶出させるカラムクロマトグラフィーにより精製して黄色オイル（０．８ｇ）を得た。
【００９４】
ステップ５： １−［５−クロロ−２−（Ｒ−モルホリン−３−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
３−｛４−クロロ−２−［３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−フェノキシメチル｝−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．８ｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）撹拌溶液にトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を添加した。５時間撹拌した後、溶液を炭酸カリウム水溶液（１Ｍ）で塩基性になるまで処理し、次いで３０分間撹拌した。層を分離させて、水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）して、濾過した。濾過した溶液を濃縮し、次いでＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１：９）で溶出させるカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄白色固体（０．０５２３ｇ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２２ （ｓ， １Ｈ）， ９．９６ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．７４ （ｓ， １Ｈ）， ８．２８ （ｄ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ）， ７．０４ （ｄｄ， ２Ｈ）， ３．．９４ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７１ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ３．４３ （ｍ， １Ｈ）， ３．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３４ （ｂｒ ｍ， ２Ｈ）， ２．６６ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７８．３ （Ｍ＋１）．
化合物３
【化９７】
１−［２−（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−５−メチル−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【００９５】
ステップ１： １，４−ジメチル−２−（４−メチル−２−ニトロ−フェノキシメチル）−ピペラジン
４−メチル−２−ニトロ−フェノール（０．９５ｇ、６．２０ｍｍｏｌ）、（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イル）−ＭｅＯＨ（０．９８ｇ、６．８２ｍｍｏｌ）、及びトリフェニルホスフィン（１．７９ｇ、６．８２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ中で合わせて５分間撹拌し、次いでＤＩＡＤ（１．３８ｇ、６．８２ｍｍｏｌ）で処理した。反応液を終夜撹拌させた。減圧下濃縮により橙色オイルを得て、これをＥｔＯＡｃに溶解させて２ＭのＨＣｌ水溶液で抽出した。水性洗浄液を合わせて、ＥｔＯＡｃで洗浄し、塩基性になるまで固体ＮａＯＨで処理した。得られた水性混合液をＥｔＯＡｃで抽出し、有機抽出液を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過して真空で濃縮し、褐色オイルを得た。フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中１％ＭｅＯＨ）により、１．０ｇの所望のアリールエーテルを得た。
【００９６】
ステップ２： ２−（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−５−メチル−フェニルアミン
１，４−ジメチル−２−（４−メチル−２−ニトロ−フェノキシメチル）−ピペラジン（１．０２ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（７５ｍＬ）に溶解させて、混合液が濁るまで飽和塩化アンモニウム水溶液で処理した。亜鉛（０．２４ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた暖かい反応混合液を更に３０分間撹拌し、この時点で出発物質が消費されたことがＬＣＭＳにより示された。反応液をＥｔＯＡｃで希釈して、水性Ｎａ２ＣＯ３と層を分離させた。有機層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、固体無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。混合液を濾過して真空で濃縮し、所望のアニリンを得た。
【００９７】
ステップ３： １−［２−（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−５−メチル−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
５−メチル−ピラジン−２−カルボン酸（６９１ｍｇ、５ｍｍｏｌ）をトルエン（１５ｍＬ）中で撹拌し、ＴＥＡ（７６５ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）、次いでジフェニルホスホリルアジド（１．０ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）で処理した。得られた溶液を３０分間撹拌し、次いでそのまま使用した。
【００９８】
５−メチル−ピラジン−２−カルボニルアジド（１．０ｍｍｏｌ）のトルエン溶液を９０℃で１０分間加熱した。反応フラスコを加熱浴から取り出して、褐色溶液を２−（１，４−ジメチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−５−メチル−フェニルアミン（０．２５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）で処理した。フラスコを加熱浴に戻して、４０℃で４時間加熱した。混合液を冷まし、その後濾過して黄褐色の粉末として産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １０．９０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．４ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２ （ｍ， ３， Ｈ）， ６．８ （ｍ， ２， Ｈ）， ４．２ （ｄｄ， １， Ｈ）， ３．９ （ｔ， １， Ｈ）， ３．１ （ｄ， １， Ｈ）， ２．８ （ｂｒ ｄ， １， Ｈ）， ２．６ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．５ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．４ （ｍ， １， Ｈ）， ２．４ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．３ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．２５ （ｍ， １， Ｈ）， ２．２ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．１ （ｍ， １， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３８５．３０ （Ｍ＋１）．
化合物４
【化９８】
１−［４，５−ジクロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【００９９】
ステップ１： （Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
５００ｍＬのフラスコで、（Ｓ）−ベンジルグリシジルエーテル（１５ｇ、９１．４ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）、及び５０重量％のＮａＯＨ（３０ｍＬ、３６５ｍｍｏｌ）を合わせた。この混合液に、２−アミノエチルスルフェート（２５．８ｇ、１８３ｍｍｏｌ）を複数分配で添加した。この不均一な混合液を４０℃に加熱し、この時点で溶液は均一になる。温度を４０℃に４時間維持した。反応液をわずかに冷却し、更に固体ＮａＯＨ（１４．６ｇ、３６５ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬのトルエンと共に添加した。二相性溶液は、次いで６５℃に１２時間加熱した。反応液を室温に冷却して層を分離し、水層を７５ｍＬのトルエンで１回抽出した。有機層を合わせて、１ＭのＨＣｌを７５ｍＬずつ用いて３回洗浄した。合わせた水層のｐＨをｐＨ１２にＮａＯＨ水溶液で調整し、ＥｔＯＡｃを７０ｍＬずつ用いて４回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮して、不透明なオイルとして１０．０８４ｇの所望のモルホリンを得た。
【０１００】
粗製モルホリン産物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）及びＴＥＡ（１２．１ｍＬ、８７．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（１５．９ｇ、７３ｍｍｏｌ）を添加したが、これに伴いＣＯ２ガスが発生した。反応液を室温で１８時間撹拌し、次いで３５ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。更に５０ｍＬの水を添加して、層を分離させた。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮して、フラッシュクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して淡黄色オイル（５．５３６ｇ）として所望のＮ−Ｂｏｃ−Ｏ−ベンジルモルホリンを得た。
【０１０１】
精製した二保護モルホリンを５０Ｌの絶対ＥｔＯＨに溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２（１．２６ｇ、２０重量％、１．８ｍｍｏｌ）を添加した。水素バルーンを取り付けて、アスピレーターを用いてフラスコを排気し、Ｈ２を３回充填した。反応液を、Ｈ２下に３０時間撹拌した。混合液をセライトで濾過し、セライトのパッドをＥｔＯＨで充分に濯いだ。濾過した溶液を減圧下に濃縮して、青白色固体（３．９１８ｇ）として所望のＮ−ｂｏｃ−モルホリンアルコールを得た。
【０１０２】
ステップ２： ４，５−ジクロロ−２−ニトロ−フェノール
３，４−ジクロロフェノール（３．０５３ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）の５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２溶液を入れた２５０ｍＬの丸底フラスコを、氷浴中で０℃に冷却した。撹拌した溶液に、濃Ｈ２ＳＯ４（１．５６ｍＬ、２８．１ｍｍｏｌ）を添加した。溶液は濁った。この混合液に濃ＨＮＯ３（１．２ｍＬ、１８．７ｍｍｏｌ）を滴下し、温度は５℃より下に注意深く保った。反応液を０℃で３０分間撹拌し、その後氷浴で冷却して、１５０ｍＬのＨ２Ｏでクエンチした。層を分離させて、水層を３５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で１回抽出した。有機層を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下に濃縮して、フラッシュクロマトグラフィー（溶離液として１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を用いて精製し、明黄色固体（１．７９３ｇ）として所望のニトロフェノールを得た。
【０１０３】
ステップ３： １−［４，５−ジクロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
化合物１、工程４及び５に対する手順に従い、４，５−ジクロロ−２−ニトロ−フェノール及び（Ｓ）−２−ベンジルオキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４２ （ｓ， １Ｈ）， １０．２９ （ｓ， １Ｈ）， ８．９３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４２ （ｓ， １Ｈ）， ８．２１ （ｓ， １Ｈ）， ７．３２ （ｓ， １Ｈ）， ４．１８−３．４１ （ｍ， ５Ｈ）， ３．０３−２．６６ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ） ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４１２．２ （Ｍ＋１）．
化合物 ５
【化９９】
１−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素
【０１０４】
ステップ１： ５−ブロモ−ピラジン−２−イルアミン
ピラジン−２−イルアミン（６．６６ｇ、７０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）溶液を０℃に冷却して、Ｎ−ブロモスクシンアミド（１２．５ｇ、７０ｍｍｏｌ）で処理し、室温まで昇温させた。得られた反応混合液を終夜撹拌し、その後追加のＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で希釈して、１０％のＮａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。層を分離させ、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで無水ＭｇＳＯ４で乾燥して濾過し、減圧下に濃縮させた。残渣をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に溶かして、ヘキサン（３００ｍＬ）の添加により産物を沈殿させた。沈殿を減圧下に乾燥させて、５．５７ｇの黄褐色固体を得た。
【０１０５】
ステップ２： ５−アミノ−ピラジン−２−カルボニトリル
５−ブロモ−ピラジン−２−イルアミンを、ＤＭＦ（１５ｍＬ）中、ヨウ化銅（Ｉ）（１．３ｇ、６．９ｍｍｏｌ）、シアン化カリウム（０．４４ｇ、６．８ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．９５ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、及び１８−クラウン−６（０．０５８ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）と合わせた。得られた混合液を４０分間撹拌し、その後還流温度（１５５℃）で２時間加熱した。反応液を室温まで冷却し、次いで終夜静置した。沈殿を濾過によって分離し、濾液は真空にて乾燥するまで濃縮した。橙色の残渣をＥｔＯＡｃ及びヘキサンに溶解し、初期沈殿が形成され、その後、濾過によって分離した。静置すると、母液中にさらなる沈殿が形成され、これを濾過により収集した。固体を集めて、０．１０ｇの明橙色固体を得た。
【０１０６】
ステップ３： ２−｛２−［３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−４−メチル−フェノキシメチル｝−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
２−（２−アミノ−４−メチル−フェノキシメチル）−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．０８７ｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）は、２−アミノ−４−メチル−フェノールから、化合物３、工程１及び２の方法に従い、２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物２、工程１に対する手順に従い、対応する酸を用いて調製）及び４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用いて調製した。これをトリホスゲン（０．０２９ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、トルエン（２ｍＬ）及びヒューニッヒ塩基（０．１５ｍＬ、０．８６ｍｍｏｌ）と合わせて、室温で２５分間撹拌した。次いで懸濁液を、ＴＨＦ（１ｍＬ）中に５−アミノ−ピラジン−２−カルボニトリル（０．０３２ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、及びリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（０．２７ｍｍｏｌ）を含有し、−７８℃で３０分間撹拌しておいた冷溶液（−７８℃）に、カニューレを通して移した。反応液は昇温させ、次いで室温で１６時間撹拌した。沈殿が形成され、これを濾過により収集して所望の産物（０．０４３ｇ）を得た。
【０１０７】
ステップ４： １−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素
ＴＨＦ（２ｍＬ）中、２−｛２−［３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−ウレイド］−４−メチル−フェノキシメチル｝−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．０４３ｇ、０．０９１８ｍｍｏｌ）のスラリーを、ジオキサン中ＨＣｌ（４Ｍ、０．１１ｍＬ）で処理して、２０時間撹拌した。さらなるジオキサン中ＨＣｌ（４Ｍ、０．２５ｍＬ）を追加して、この反応液を５０℃に１８時間加熱した。反応液は冷却して濃縮した。得られた固体をエーテル中に懸濁させ、その懸濁液を濾過して風乾し、ＨＣｌ塩（０．０４２ｇ）として所望の産物を得た。
【０１０８】
ステップ５： １−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素
１−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素塩酸塩（０．０１０４ｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１ｍＬ）溶液を０℃に冷却し、ホルムアルデヒド（０．１２ｍｍｏｌ）の水溶液、次にナトリウムトリアセトキシホウ化水素（０．０６ｇ、０．２９２ｍｍｏｌ）で処理した。反応液を１２時間撹拌し、次いで真空にて濃縮した。残渣をシリカのクロマトグラフィーにかけ（ＣＨ２Ｃｌ２中２％ＭｅＯＨ）、白色固体（０．０１４ｇ）として産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．９０ （ｓ， １， Ｈ）， １０ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．９ （ｓ， １， Ｈ）， ８．８ （ｓ， １， Ｈ）， ８ （ｓ， １， Ｈ）， ６．９ （ｍ， １， Ｈ）， ６．８ （ｍ， １， Ｈ）， ３．９ （ｍ， ４， Ｈ）， ３．６ （ｔ， １， Ｈ）， ２．９ （ｄ， １， Ｈ）， ２．７ （ｄ， １， Ｈ）， ２．２ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．１ （ｓ， ３， Ｈ）， ２ （ｔ， １， Ｈ）， １．８ （ｔ， １， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３８３．４０ （Ｍ＋１）．
化合物６
【化１００】
１−［５−クロロ−２−（［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１０９】
ステップ１： ３−ベンジル−２−クロロメチル−［１，３］オキサゼパン
３−ベンジルアミノ−プロパン−１−オール（１４ｇ、８８．０ｍｍｏｌ）及びエピクロロヒドリン（８１．４ｇ、８８０ｍｍｏｌ）の溶液を４０℃に加熱した。３時間撹拌した後、反応液を冷却して、過剰のエピクロロヒドリンを真空にて蒸発させることにより除去した。硫酸（１０ｍＬ）をゆっくりと添加し、その後反応フラスコを１５０℃の予加熱油浴に入れた。撹拌を１時間行い、次いで反応液を室温まで冷まして、氷を加えてクエンチした。混合液は、１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で塩基性のｐＨに調整し、ＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて無水ＭｇＳＯ４で乾燥して濾過し、減圧下に乾燥させた。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（７０：２８：２ ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／２Ｍ水性ＮＨ４ＯＨ）により精製して、５ｇの淡黄色オイルを得た。
【０１１０】
ステップ２： ２−（４−クロロ−２−ニトロ−フェノキシメチル）−［１，３］オキサゼパン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
４−ブロモ−２−ニトロ−フェノール（１．３９ｇ、８．０ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３０ｍＬ）撹拌溶液に炭酸カリウム（２．７６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）、次いで３−ベンジル−２−クロロメチル−［１，３］−オキサゼパンを添加した。反応液を６０℃で１２時間撹拌し、次いで室温まで冷まして、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）及び１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液（２００ｍＬ）で希釈した。層を分離し、有機層を鹹水で洗浄して無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空にて濃縮した。粗製産物をフラッシュクロマトグラフィー（７０：３０のヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により精製して、４８０ｍｇの淡橙色オイルを得た。
【０１１１】
オイルをＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶かして、氷浴で冷却した。アルファクロロエチルクロロホルメート（０．１８ｍＬ、１．６５ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を２時間撹拌し、その後２ＮのＨＣｌ水溶液を添加した。撹拌を１０分間継続し、次いで混合液を乾燥するまで濃縮した。得られた残渣をＭｅＯＨに溶かし、２時間還流した。反応液を減圧下に濃縮して、残渣を２ＮのＨＣｌ水溶液（７５ｍＬ）に溶かし、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で洗浄した。水層のｐＨは、固体ＮａＯＨを添加することによりｐＨ１１に調整した。得られた塩基性溶液はＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて鹹水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。濾過及び真空濃縮にて、淡黄色オイルとして２４０ｍｇの産物が得られた。
【０１１２】
オイルをＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解させ、次いでＴＥＡ（０．１１６ｍＬ、０．８３１ｍｍｏｌ）及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（０．１８１ｇ、０．８３１ｍｍｏｌ）で処理した。反応液を室温で１時間撹拌し、次いで更にＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過して減圧下に濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（７：３ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を用いて精製を行い、白色発泡物として２５２ｍｇの産物を得た。
【０１１３】
ステップ３： ２−（２−アミノ−４−クロロ−フェノキシメチル）−［１，３］オキサゼパン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
２−（４−クロロ−２−ニトロ−フェノキシメチル）−［１，３］−オキサゼパン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．２５２ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）から、化合物３、ステップ２の手順に従って、透明油として１５０ｍｇの産物を得た。
【０１１４】
ステップ４： １−［５−クロロ−２−（［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
２−（２−アミノ−４−ブロモ−フェノキシメチル）−［１，３］オキサゼパン−３−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルから、化合物２、ステップ４及び化合物５、ステップ４の手順に従って、０．１７５ｇの産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）， δ ８．６５ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．３ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２５ （ｓ， １， Ｈ）， ６．９８ （ｄｄ， １， Ｈ）， ６．８ （ｄ， １， Ｈ）， ４．０８ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．８ （ｍ， １， Ｈ）， ３．３５ （ｓ， １， Ｈ）， ３．２５ （ｄ， １， Ｈ）， ３ （ｍ， ３， Ｈ）， ２．５ （ｓ， ３， Ｈ）， １．９８ （ｍ， ２， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９１．９０ （Ｍ＋１）．
化合物 ７
【化１０１】
１−［５−メチル−２−（１−メチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１１５】
ステップ１： ３−ヒドロキシメチル−４−メチル−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル１：１のＨ２Ｏ／ジオキサン２００ｍＬ中のピペラジン−２−カルボン酸（２０ｇ、１５４ｍｍｏｌ）のスラリーを氷浴中で冷却し、固体ＮａＯＨ（１１ｇ）、次いでジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（２１．６ｇ、９９ｍｍｏｌｅ）のジオキサン溶液を添加漏斗から滴下して処理した。反応液のｐＨは、反応継続中に必要に応じてｐＨ＞１０に調整した。得られた混合液を３時間撹拌し、次いで均一になるまで水で希釈して、ｐＨが２から３の間になるまで水性濃ＨＣｌで酸性化した。溶液をエーテルで洗浄し、次いでｐＨが６．５〜７になるまでＮａＯＨでｐＨ調整した。溶液を数日間静置し、得られた沈殿を濾過により集めて、白色固体（９．７ｇ）としてピペラジン−１，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得た。
【０１１６】
ＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）中のピペラジン−１，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４．６２ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）のスラリーを、水性ホルムアルデヒド（４０ｍｍｏｌ）及びギ酸（７０ｍｍｏｌ）にて処理し、次いで６５℃で数時間加熱した。ＨＰＬＣにより完了を確認して、反応液を冷まし、真空にて濃縮した。
【０１１７】
残渣をＴＨＦに溶かして氷浴中で冷却し、次いで水素化リチウムアルミニウムのＴＨＦ（１９．０ｍｍｏｌ）溶液で処理した。１時間後に、反応液を室温まで昇温させて、更に３０分間撹拌した。その後反応液を氷浴中で冷却して、Ｈ２Ｏ（０．７５ｍＬ）及び１５％ＮａＯＨ水溶液（０．７５ｍＬ）、そして再度Ｈ２Ｏ（３×０．７５ｍＬ）でクエンチした。塩を濾過により除去し、濾液を減圧下に濃縮して粗製産物を得た。シリカゲル（ＣＨ２Ｃｌ２中２．５％ＭｅＯＨ）のクロマトグラフィーで、黄色オイル（０．７０ｇ）として産物を得た。
【０１１８】
ステップ２： １−［５−メチル−２−（１−メチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
３−ヒドロキシメチル−４−メチル−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いる化合物３の手順、及び化合物５、ステップ４に従って、調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２４ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， １０．１ （ｓ， １， Ｈ）， ９．７ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．４２ （ｓ， １， Ｈ）， ９．１２ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２ （ｓ， １， Ｈ）， ８．０８ （ｓ， １， Ｈ）， ６．９１ （ｄ， １， Ｈ）， ６．８２ （ｄ， １， Ｈ）， ４．６ （ｄ， １， Ｈ）， ４．４ （ｍ， １， Ｈ）， ４．１ （ｍ， １， Ｈ）， ３．６ （ｍ， ６， Ｈ）， ３ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．４ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．２ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７１．４０ （Ｍ＋１）．
化合物８
【化１０２】
１−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−３−［５−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−尿素化合物５、ステップ１〜４の手順に従い、４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用いて調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）， δ ８．８０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．７ （ｓ， １， Ｈ）， ７．９ （ｓ， １， Ｈ）， ６．８ （ｍ， ２， Ｈ）， ４．２ （ｍ， ４， Ｈ）， ３．８ （ｍ， １， Ｈ）， ３．６ （ｍ， １， Ｈ）， ３．５ （ｍ， １， Ｈ）， ３．２ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．３ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３６９．３０ （Ｍ＋１）．
化合物 ９
【化１０３】
１−［５−クロロ−４−メチル−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１１９】
化合物４、ステップ１の手順を用いて調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルと、化合物４、ステップ２の手順に従って調製した４−クロロ−５−メチル−２−ニトロ−フェノールとを用いて、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３２ （ｓ， １Ｈ）， １０．２１ （ｓ， １Ｈ）， ８．７５ （ｓ， １Ｈ）， ８．２９−８．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０６ （ｄ， １Ｈ）， ７．１８ （ｄ， １Ｈ）， ４．１２−３．４２ （ｍ， ５Ｈ）， ３．２９−２．６３ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．２ （Ｍ＋１）．
化合物１０
【化１０４】
１−［５−クロロ−４−メチル−２−（Ｒ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２０】
（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルから化合物４、ステップ１を用いて調製した２−ヒドロキシメチル−Ｒ−モルホリン−４−カルボン酸と、化合物４、ステップ２の手順に従って調製した４−クロロ−５−メチル−２−ニトロ−フェノールとを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３２ （ｓ， １Ｈ）， １０．２１ （ｓ， １Ｈ）， ８．７５ （ｓ， １Ｈ）， ８．２９−８．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０６ （ｄ， １Ｈ）， ７．１８ （ｄ， １Ｈ）， ４．１２−３．４２ （ｍ， ５Ｈ）， ３．２９−２．６３ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．３ （Ｍ＋１）．
化合物１１
【化１０５】
１−［４，５−ジクロロ−２−（Ｒ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２１】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４，５−ジクロロ−２−ニトロ−フェノールを用いて、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４２ （ｓ， １Ｈ）， １０．２９ （ｓ， １Ｈ）， ８．９３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４２ （ｓ， １Ｈ）， ８．２１ （ｓ， １Ｈ）， ７．３２ （ｓ， １Ｈ）， ４．１８−３．４１ （ｍ， ５Ｈ）， ３．０３−２．６６ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４１２．２ （Ｍ＋１）．
化合物１２
【化１０６】
１−［４，５−ジメチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２２】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４，５−ジメチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．０２ （ｓ， １Ｈ）， ９．８９ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．８５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．２７ （ｓ， １Ｈ）， ８．９１ （ｓ， １Ｈ）， ６．８４ （ｓ， １Ｈ）， ４．１８−３．９７ （ｍ， ３Ｈ）， ３．６９ （ｔ， １Ｈ）， ３．４３−３．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９７ （ｔ， ２Ｈ）， ２．３３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ２Ｈ）， ２．１２ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７２．３ （Ｍ＋１）．
化合物１３
【化１０７】
１−［４−クロロ−５−メチル−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２３】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び５−クロロ−４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２６ （ｓ， １Ｈ）， ８．８２ （ｓ， １Ｈ）， ８．１９ （ｓ， １Ｈ）， ８．１７ （ｓ， １Ｈ）， ７．１０ （ｓ， １Ｈ）， ４．２１３．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９０−３．８６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５４ （ｄｔ， １Ｈ）， ２．９８ （ｄ， １Ｈ）， ２．８４ （ｔ， ２Ｈ）， ２．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２１ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．１ （Ｍ＋１）．
化合物 １４
【化１０８】
１−［５−シアノ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２４】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−ヒドロキシ−３−ニトロ−ベンゾニトリルを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １０．３０ （ｓ， １Ｈ）， ８．６２ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．５３ （ｓ， １Ｈ）， ８．２１ （ｓ， １Ｈ）， ７．４８ （ｄ， １Ｈ）， ７．３３ （ｄ， １Ｈ）， ４．２０−４．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９４−３．７３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５１ （ｄｔ， １Ｈ）， ３．００ （ｄ， １Ｈ）， ２．７７−２．６１ （ｍ， ２Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３６９．２ （Ｍ＋１）．
化合物 １５
【化１０９】
１−［５−クロロ−４−エチル−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２５】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−クロロ−５−エチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３３ （ｓ， １Ｈ）， １０．１９ （ｓ， １Ｈ）， ８．６６ （ｓ， １Ｈ）， ８．３３−８．０１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．０５ （ｄ， １Ｈ）， ４．２９−３．３９ （ｍ， ５Ｈ）， ３．２９−２．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８９−２．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５８ （ｑ， ２Ｈ）， ２．４９ （ｓ， ３Ｈ）， １．１７ （ｔ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４０６．１ （Ｍ＋１）．
化合物１６
【化１１０】
１−［５−クロロ−４−メトキシ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２６】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−クロロ−５−メトキシ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．１１ （ｓ， １Ｈ）， １０．０５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．６４ （ｓ， １Ｈ）， ８．１９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９１ （ｓ， １Ｈ）， ４．２９ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１６ （ｍ， １Ｈ）， ４．０９ （ｄ， １Ｈ）， ３．８７ （ｓ， ３Ｈ）， ３．７５ （ｔ， １Ｈ）， ３．４４−３．１７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０１ （ｔ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４０８．０ （Ｍ＋１）．
化合物１７
【化１１１】
１−［５−ジメチルアミノ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２７】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−ジメチルアミノ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．１１ （ｓ， １Ｈ）， １０．０５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．６９ （ｓ， １Ｈ）， ８．１９ （ｓ， １Ｈ）， ７．７５ （ｓ， １Ｈ）， ６．９０ （ｄ， １Ｈ）， ６．３４ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．０５−３．８１ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５６ （ｔ， １Ｈ）， ３．１４ （ｄ， １Ｈ）， ２．９３ （ｄ， １Ｈ）， ２．８０ （ｓ， ６Ｈ）， ２．７６−２．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３８７．４ （Ｍ＋１）．
化合物１８
【化１１２】
１−［５−ブロモ−４−メチル−２−Ｓ−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２８】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した４−ブロモ−５−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３１ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １０．１９ （ｓ， １Ｈ）， ８．６３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４１ （ｓ， １Ｈ）， ８．２０ （ｓ， １Ｈ）， ７．０７ （ｓ， １Ｈ）， ４．１３−３．９４ （ｍ， ３Ｈ）， ３．８７−３．７４ （ｍ， ２Ｈ）， δ ３．５２ （ｔｄ， １Ｈ）， ３．００ （ｄ， １Ｈ）， ２．６９ （ｔ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｓ， １Ｈ）， ２．２５ （ｓ， １Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４３８．２．０ （Ｍ＋１）．化合物１９
【化１１３】
１−［５−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１２９】
化合物２、ステップ１の手順に従って対応する酸から調製した２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて、化合物３の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）， δ ８．９０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．６ （ｓ， １， Ｈ）， ７．９ （ｓ， １， Ｈ）， ６．９ （ｍ， ２， Ｈ）， ４．２ （ｍ， ４， Ｈ）， ３．８ （ｔ， １， Ｈ）， ３．７ （ｓ， ２， Ｈ）， ３．５ （ｄ， １， Ｈ）， ３．２ （ｍ， １， Ｈ）， ２．６ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．３ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３５８．２０ （Ｍ＋１）．
化合物２０
【化１１４】
１−［５−クロロ−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３０】
化合物２、ステップ１の手順に従って対応する酸から調製した４−クロロ−２−ニトロ−フェノール及び２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用い、化合物３の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）， δ ８．７０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．５ （ｓ， １， Ｈ）， ８．４ （ｓ， １， Ｈ）， ７．０５ （ｍ， １， Ｈ）， ４．２ （ｍ， ４， Ｈ）， ３．８ （ｔ， １， Ｈ）， ３．５ （ｄ， １， Ｈ）， ３．２ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．６ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７８．５０ （Ｍ＋１）．
化合物２１
【化１１５】
１−［５−クロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３１】
４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３５ （ｓ， １， Ｈ）， ９．４ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．５５ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．２５ （ｍ， ２， Ｈ）， ７．２２ （ｍ， ２， Ｈ）， ４．２ （ｍ， ３， Ｈ）， ４ （ｄ， １， Ｈ）， ３．８ （ｔ， １， Ｈ）， ３．４ （ｄ， １， Ｈ）， ３．２ （ｄ， １， Ｈ）， ２．８ （ｍ， １， Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７８．３０ （Ｍ＋１）．
化合物２２
【化１１６】
１−［５−メチル−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３２】
（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル及び４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２０ （ｓ， １， Ｈ）， １０．１ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．８９ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．５ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．７ （ｓ， １， Ｈ）， ８．３ （ｓ， １， Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １， Ｈ）， ６．９ （ｍ， １， Ｈ）， ６．８ （ｍ， １， Ｈ）， ４ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．４２ （ｍ， ２， Ｈ）， ３．１９ （ｍ， ２， Ｈ）， ３ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３５８．３０ （Ｍ＋１）．
化合物２３
【化１１７】
１−［５−クロロ−２−（Ｒ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３３】
（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル及び４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４５ （ｓ， １， Ｈ）， ９．６ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．３ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．７ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．３ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１９ （ｍ， ２， ）， ４．２ （ｍ， ２， Ｈ）， ４ （ｄ， １， Ｈ）， ３．８４ （ｔ， １， Ｈ）， ３．４１ （ｄ， １， Ｈ）， ３．２１ （ｄ， １， Ｈ）， ３．０２ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．５ （ｓ， ３， Ｈ）ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３７８．３０ （Ｍ＋１）．化合物２４
【化１１８】
１−［５−クロロ−２−Ｒ−（［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３４】
（Ｒ）−２−ヒドロキシメチル−［１，４］オキサゼパン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用い、化合物１の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．８３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．３９ （ｄｄ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ）， ８．０４ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．９９ （ｄｄ， １Ｈ）， ６．８２ （ｄ， １Ｈ）， ４．２５−３．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９０−３．７６ （ｍ， １Ｈ）， ３．３８ （ｄ， １Ｈ）， ３．１３−３．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．００ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．５４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６−１．８９ （ｍ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．３ （Ｍ＋１）．
化合物２５
【化１１９】
１−［５−クロロ−２−（１−メチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３５】
４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物７の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．３５ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， １０．２ （ｓ， １， Ｈ）， ９．８４ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．６ （ｓ， １， Ｈ）， ８．３１ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２１ （ｓ， １， Ｈ）， ７．０８ （ｍ， ２， Ｈ）， ４．５８ （ｄ， １， Ｈ）， ４．４２ （ｄ， １， Ｈ）， ３．７ （ｍ， ６， Ｈ）， ３ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．４４ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９１．４０ （Ｍ＋１）．
化合物２６
【化１２０】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（１−メチル−ピペラジン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３６】
Ｓ−ピペラジン−２−カルボン酸及び４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物７の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ８．８０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２８ （ｄ， ２， Ｈ）， ６．９９ （ｓ， ２， Ｈ）， ４．１７ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．１ （ｄ， １， Ｈ）， ２．９２ （ｄ， ２， Ｈ）， ２．８４ （ｔ， １， Ｈ）， ２．５ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．４５ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．４２ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９１．３０ （Ｍ＋１）．
化合物２７
【化１２１】
１−［５−クロロ−４−メチル−２−Ｓ−（［１，４］−オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３７】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した４−クロロ−５−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物１の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２ （ｓ， １Ｈ）， ８．６２ （ｓ， １Ｈ）， ８．２７ （ｓ， １Ｈ）， ８．２４ （ｓ， １Ｈ）， ７．３２ （ｍ， １Ｈ）， ７．１８ （ｓ， １Ｈ）， ４．０９−３．９１ （ｍ， ３Ｈ）， ３．９０−３．７９ （ｍ， １Ｈ）， ３．７７−３．６２ （ｍ， １Ｈ）， ３．１４ （ｄ， １Ｈ）， ２．８５ （ｍ， １Ｈ）， ２．７３ （ｓ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２７ （ｓ， １Ｈ）， １．８２−１．６７ （ｍ， ２Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４０６．２ （Ｍ＋１）．
化合物２８
【化１２２】
１−［５−ブロモ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３８】
４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ）， δ １０．３０ （ｓ， １， Ｈ）， ８．６３ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．４３ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２２ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１５ （ｍ， １， Ｈ）， ７．０５ （ｄ， １， Ｈ）， ４．０８ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．８２ （ｍ， ２， Ｈ）， ３．４７ （ｔ， １， Ｈ）， ３．１７ （ｓ， ２， Ｈ）， ３ （ｄ， １， Ｈ）， ３．０７ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．６８ （ｍ， ２， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４２３．９０ （Ｍ＋１）．
化合物２９
【化１２３】
１−［５−ブロモ−２−Ｒ−（Ｒ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１３９】
（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル及び４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ）， δ １０．３０ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．６５ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．４３ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２５ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１８ （ｄｄ， １， Ｈ）， ７．０３ （ｄ， １， Ｈ）， ４．０３ （ｍ， ２， Ｈ）， ３．８２ （ｍ， ２， Ｈ）， ３．５２ （ｔ， ２， Ｈ）， ３．１９ （ｄ， １， Ｈ）， ３ （ｄ， １， Ｈ）， ２．７６ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４４３．９０ （Ｍ＋１）．
化合物３０
【化１２４】
１−［５−ブロモ−２−Ｓ−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４０】
４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用いる化合物４の手順、及び化合物２，ステップ４並びに化合物５，ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）， δ １１．４３ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ９．０２ （ｓ， １， Ｈ）， ８．６ （ｓ， １， Ｈ）， ８．３３ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１２ （ｄ， １， Ｈ）， ６．７６ （ｄ， １， Ｈ）， ４ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．８ （ｔ， １， Ｈ）， ３．０２ （ｄ， １， Ｈ）， ２．７３ （ｄ， １， Ｈ）， ２．５１ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．３ （ｔ， １， Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．０８ （ｔ， １， Ｈ）．化合物３１
【化１２５】
１−［５−ブロモ−２−（［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４１】
化合物４、ステップ２の手順に従って調製した４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物６の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）， δ ８．７２ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ８．４８ （ｓ， １， Ｈ）， ８．４５ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１１ （ｄ， １， Ｈ）， ６．７５ （ｄ， １， Ｈ）， ４．０２ （ｍ， ３， Ｈ）， ３．８ （ｍ， １， Ｈ）， ３．２１ （ｄ， １， Ｈ）， ２．９７ （ｍ， ２， Ｈ）， ２．５１ （ｓ， ３， Ｈ）， １．９２ （ｂｒ ｍ， ２， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４３６．００ （Ｍ＋１）．
化合物３２
【化１２６】
１−［５−ブロモ−２−（４−メチル−［１，４］オキサゼピン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４２】
４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用いる化合物６の手順に従い、化合物５、ステップ５の手順によって調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）， δ ８．２５ （ｓ， １， Ｈ）， ８．２３ （ｓ， １， Ｈ）， ７．１ （ｄ， １， Ｈ）， ６．７２ （ｄ， １， Ｈ）， ４．１９ （ｍ， １， Ｈ）， ４ （ｍ， １， Ｈ）， ３．９５ （ｍ， ２， Ｈ）， ３．４２ （ｂｒ ｓ， １， Ｈ）， ３．０２ （ｄ， １， Ｈ）， ２．８４ （ｍ， １， Ｈ）， ２．６２ （ｔ， １， Ｈ）， ２．５ （ｓ， ３， Ｈ）， ２．４ （ｓ， ３， Ｈ）， ２ （ｍ， ２， Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４５１．９０ （Ｍ＋１）．
化合物３３
【化１２７】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（４−シアノメチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素１−［５−クロロ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素（０．１８９ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）中に懸濁した。カルボン酸カリウム（０．１０４ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）及びブロモアセトニトリル（０．０３５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８０℃で８時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却させ、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）の添加によって奪活させた。得られた個体をろ過して回収し、メタノールから再結晶させることで、白色粉末（０．０７２ｇ）として産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４６ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １０．２６ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．６３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．３１ （ｄ， １Ｈ）， ８．１７ （ｓ， １Ｈ）， ７．１０ （ｄ， １Ｈ）， ７．０３ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．１４ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．０９ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．９６−４．０１ （ｍ， １Ｈ）， ３．９１３．９５ （ｍ， １Ｈ）． ３．８１ （ｄ， １Ｈ）， ３．７２ （ｄ， １Ｈ）， ３．６４ （ｔｄ， １Ｈ）， ２．９５ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ２．７２ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３２ （ｔｄ， １Ｈ）， ２．１８ （ｔ， １Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４１７ （Ｍ＋１）．
化合物３４
【化１２８】
１−［５−クロロ−２−（チオモルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４３】
化合物２、ステップ２（化合物２、ステップ１の手順に従い、チオモルホリン−２，４−ジカルボン酸４−ｔｅｒｔ−ブチルエステルから得た２−ヒドロキシメチル−チオモルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いる）、並びに化合物３、ステップ２及び化合物２、ステップ４及び５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．４８ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １０．２７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．６２ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．３１ （ｄ， １Ｈ）， ８．２１ （ｓ， １Ｈ）， ７．１２ （ｄ， １Ｈ）， ７．０３ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．３６ （ｔ， １Ｈ）， ４．１２ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．２４ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．１０−３．１７ （ｍ， １Ｈ）， ２．９９ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．９４−２．９８ （ｍ， １Ｈ）， ２．８９ （ｄｄｄ， １Ｈ）， ２．７１ （ｄｄｄ， １Ｈ）， ２．４６−２．４８ （ｍ， １Ｈ）， ２．４４ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９４ （Ｍ＋１）．
化合物３５
【化１２９】
１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−［３−Ｓ−（モルホリン−２−イルメトキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル］−尿素
【０１４４】
化合物３、ステップ１（化合物２、ステップ１の手順に従ってＳ−モルホリン−２，４−ジカルボン酸４−ｔｅｒｔ−ブチルエステルから得た（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、及び化合物４、ステップ２及び化合物１、ステップ５の手順に従って調製した３−ニトロ−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オールを用いる）の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．０９ （ｂｒ，１，Ｈ）， １０．０５ （ｓ，１，Ｈ）， ８．６０ （ｂｒ ｓ，１，Ｈ）， ８．１７ （ｓ，１，Ｈ）， ７．８６ （ｓ，１，Ｈ）， ６．６８ （ｓ，１，Ｈ）， ３．９７ （ｍ，１，Ｈ）， ３．８９ （ｍ，１，Ｈ）， ３．７８ （ｍ，２，Ｈ）， ３．３１ （ｔ，１，Ｈ）， ２．９８ （ｄ，１，Ｈ）， ２．６３ （ｍ，６，Ｈ）， ２．４４ （ｍ，１，Ｈ）， ２．４１ （ｓ，３，Ｈ）， １．６８ （ｍ，４，Ｈ）．
化合物３６
【化１３０】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（モルホリン−３−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４５】
モルホリン−３−Ｓ−４−ジカルボン酸４−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用い、化合物２の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．２２ （ｓ，１，Ｈ）， ９．９６ （ｂｒ，１，Ｈ）， ８．７４ （ｓ，１，Ｈ）， ８．２９ （ｄ，１，Ｈ）， ８．１８ （ｓ，１，Ｈ）， ７．０４ （ｍ，２，Ｈ）， ３．９４ （ｍ，３，Ｈ） ３．７０ （ｂｒ ｄ， １，Ｈ）， ３．４２ （ｍ，１，Ｈ）， ３．２３ （ｍ，２，Ｈ）， ２．８３ （ｂｒ ｓ，２，Ｈ）， ２．４３ （ｓ，３，Ｈ）．
化合物３７
【化１３１】
１−［５−メチル−２−Ｒ−（モルホリン−３−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４６】
４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物２の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．０８ （ｂｒ ｓ，１，Ｈ）， ９．７６ （ｂｒ，１，Ｈ）， ８．１７ （ｓ，１，Ｈ）， ８．０３ （ｄ，１，Ｈ）， ６．９０ （ｄ，１，Ｈ）， ６．８０ （ｄ，１，Ｈ）， ３．８８ （ｍ，３，Ｈ）， ３．７０ （ｂｒ ｄ，２，Ｈ）， ３．４１ （ｍ，１，Ｈ）， ３．２０ （ｍ，２，Ｈ）， ２．８２ （ｍ，２，Ｈ）， ２．４３ （ｓ，３，Ｈ）， ２．２４ （ｓ，３，Ｈ）．
化合物３８
【化１３２】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−トリフルオロメチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４７】
Ｍｉｅｓｅｌの米国特許第４，２９３，５５２号の方法に従って調製した５−トリフルオロメチル−ピラジン−２−イルアミン、並びに（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用い、化合物１、ステップ２〜５の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．８５ （ｂｓ， １Ｈ）， ９．９７ （ｂｓ， １Ｈ）， ９．１１ （ｂｓ， １Ｈ）， ８．９８ （ｂｓ， １Ｈ）， ８．７３ （ｂｓ， １Ｈ）， ８．２２ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．０８ （ｂｓ， １Ｈ）， ４．１９−３．７３ （ｍ， ６Ｈ）， ３．３２−２．９８ （ｍ， ４Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４３２ （Ｍ＋１）．化合物３９
【化１３３】
１−［４−クロロ−５−メチル−２−Ｓ−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４８】
化合物４、ステップ２の手順に従い３−クロロ−４−メチル−フェノールから調製した５−クロロ−４−メチル−２−ニトロ−フェノールを用い、化合物５、ステップ１〜４の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １０．３９ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ９．０５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．７４ （ｓ， １Ｈ）， ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ）， ６．９１ （ｓ， １Ｈ）， ４．０４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７８ （ｍ， １Ｈ）， ３．１９ （ｄ， １Ｈ）， ２．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７８ （ｍ， １Ｈ）， ２．３６ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＣＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ４０３．１６ （Ｍ＋１）．化合物４０
【化１３４】
１−［５−クロロ−４−メトキシ−２−（Ｓ−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１４９】
化合物１、ステップ２（化合物５、ステップ１及び２の手順に従って調製した５−アミノ−ピラジン−２−カルボニトリルを用いる）の手順、及び化合物１、ステップ４及び５（化合物４、ステップ２の手順に従って調製した２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−クロロ−５−メトキシ−２−ニトロ−フェノールを用いる）の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．８２ （ｓ， １Ｈ）， ９．９３ （ｓ， １Ｈ）， ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．８１ （ｓ， １Ｈ）， ８．１４ （ｓ， １Ｈ）， ６．９３ （ｓ， １Ｈ）， ４．２５ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１３−３．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．６１ （ｔ， １Ｈ）， ３．４１−３．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１７−２．９１ （ｍ， ２Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４１９．１ （Ｍ＋１）．
化合物４１
【化１３５】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１５０】
化合物１、ステップ２（化合物５、ステップ１及び２の手順に従って調製した５−アミノ−ピラジン−２−カルボニトリルを用いる）、及び化合物１、ステップ４及び５（２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用いる）の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．９７ （ｂｓ， １Ｈ）， １０．０２ （ｂｓ， １Ｈ）， ９．０５ （ｂｓ， １Ｈ）， ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．８５ （ｓ， １Ｈ）， ８．２ （ｓ， １Ｈ）， ７．１０ （ｍ， １Ｈ）， ３．９６−４．２４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６８−３．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０ （ｍ， ２Ｈ）．ＬＲＭＳ （ｅｓｉ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３８８ （Ｍ＋１）．
化合物４２
【化１３６】
１−［５−クロロ−２−Ｓ−（４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１５１】
ステップ１： １−［５−クロロ−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素化合物１、ステップ２（化合物５、ステップ１及び２の手順に従って調製した５−アミノ−ピラジン−２−カルボニトリルを用いる）の手順、及び化合物１、ステップ４及び５（２−ヒドロキシメチル−Ｓ−モルホリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び４−クロロ−２−ニトロ−フェノールを用いる）の手順に従って調製し、０．２７ｇの産物を得た。
【０１５２】
ステップ２： １−［５−クロロ−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−シアノ−ピラジン−２−イル）−尿素（０．２７６ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に懸濁し、カルボン酸カリウム（０．１５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）及びヨウ化メチル（０．０４６ｍＬ、０．７３ｍｍｏｌ）で処理した。混合物は均質化され、室温にて４時間撹拌した。水（２０ｍＬ）を添加して反応物を奪活し、ＣＨＣｌ３：ｉＰｒＯＨの３：１混合物（３ｘ２５ｍＬ）で抽出した。混合有機層を減圧下で濃縮し、残渣をエタノールで練和した。ろ過によって、白色個体として０．２１４ｇの産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １１．０１ （ｓ， １Ｈ）， １０．１６ （ｓ， １Ｈ）， ８．８６ （ｄ， ２Ｈ）， ８．２７ （ｄ， １Ｈ）， ８．１７ （ｓ， １Ｈ）， ７．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２５−４．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９５ （ｍ， １Ｈ）， ３．８３ （ｄ， １Ｈ）， ３．６１ （ｔ， １Ｈ）， ２．８９ （ｄ， １Ｈ）， ２．６５ （ｄ， １Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０２ （ｔｄ， １Ｈ）， １．８３ （ｔ， １Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ４０３．０ （Ｍ＋１）．
化合物４３
【化１３７】
１−［５−クロロ−２−（Ｓ−４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
【０１５３】
１−［５−クロロ−２−（Ｓ−４−メチル−モルホリン−２−イルメトキシ）−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素を用い、化合物４２，ステップ２の手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １０．５４ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １０．２４ （ｓ， １Ｈ）， ８．７３ （ｓ， １Ｈ）， ８．３０ （ｓ， １Ｈ）， ８．２７ （ｓ， １Ｈ）， ７．１２−６．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１７−３．８１ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５９ （ｔ， １Ｈ）， ３．９１ （ｄ， １Ｈ）， ２．６４ （ｄ， １Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０３ （ｔｄ， １Ｈ）， １．８２ （ｔ， １Ｈ）．ＬＲＭＳ （ＥＳ， ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｅ ３９２．１ （Ｍ＋１）．
治療方法
【０１５４】
本発明の化合物を使用して、異常な細胞増殖が関わる症状を治療できる。例えば、化合物を使用して、癌、及びヒト及び他の動物のものを含む、真核細胞に関わる他の細胞増殖適応症の治療に用いる放射線及び／又は化学療法薬の治療効果を増強できる。一般的に、本発明の化合物は、癌性及び非癌性の双方の、異常に増殖している細胞を阻害する。例えば、本発明の化合物を使用して、例えば、メトトレキセート、ゲムシタビン、又は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗剤で通例のように処置される腫瘍の治療を増強できる。
【０１５５】
本発明の化合物の使用の結果、異常に増殖している細胞の部分的又は完全な退行、すなわち、細胞集団からのこのような細胞の減少又は排除を引き起こすことができる。例えば、異常に増殖している細胞の集団が腫瘍細胞である場合、腫瘍成長速度を遅延させ、腫瘍の数を減少させ、及び／又は部分的もしくは完全な腫瘍退行を誘導するのに、本発明の化合物を使用できる。
【０１５６】
異常な細胞増殖が全く同定されない場合、又は異常な細胞増殖は進行していないが、異常な細胞増殖が疑われるか予期される場合に、本発明の化合物をインビボ又はエキソビボで使用できる。異常な細胞増殖が、その再発を予防又は阻止するために予め治療されている場合にも、本発明の化合物を使用できる。
【０１５７】
本発明の一方法は、化学療法薬と組み合わせて、それを必要としている個体に治療上有効な量の本発明のＣｈｋ１インヒビタを投与することを含む。あるいは、本発明の方法は、癌細胞の増殖を阻害する活性を有する、ハーセプチン等の抗体と組み合わせて、それを必要としている個体に治療上有効な量の少なくとも１種の本発明のＣｈｋ１インヒビタを投与することを含む。
【０１５８】
従って、化学療法薬又は抗体と組み合わせて本発明のＣｈｋ１インヒビタを投与することにより強化した治療に対して、癌は感受性である。本発明によって治療可能な癌として、固形腫瘍、並びに白血病、リンパ腫、及び典型的に腫瘍塊がないが、血管又はリンパ細網系に分布するその他の癌を含む、骨髄系又はリンパ系の癌により特徴付けられる癌腫及び肉腫が挙げられる。これら癌としては、例えば、大腸癌、頭部及び頚部癌、膵癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、外陰部癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、腎細胞癌、卵巣癌、脳癌、骨肉腫及び肺癌が挙げられる。
【０１５９】
従って、本発明の化合物は、Ｃｈｋ１活性によって調節される癌において有用である。より詳細には、Ｃｈｋ１活性は癌の形態に関係し、特に限定されないが、成体及び小児オンコロジー、固形癌／悪性成長、粘液様且つ円形細胞の癌腫、局所的な腫瘍の進行、移転性癌、ユーイング肉腫等のヒト軟組織肉腫、特に頭部及び頚部のリンパ転移、有棘細胞癌等の癌転移、食道有棘細胞癌、経口癌、骨髄腫等の血球悪性、急性リンパ性白血病、急性反リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病及び毛様細胞白血病等の白血病、滲出リンパ腫（体腔系リンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌（小細胞癌腫及び管癌腫等の小細胞癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンスリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ−産生性腫瘍、非小細胞癌、乳癌）、胃腸性の癌（胃癌、結腸癌、大腸癌、及び結腸直腸新形成に関連するポリープ等）、膵癌、肝癌、泌尿器科学の癌（原発性表在膀胱腫瘍、膀胱及び筋侵襲的膀胱癌の侵襲的移行上皮癌等の膀胱癌等）、前立腺癌、女性生殖器の悪性腫瘍（子房癌腫、原発性腹膜上皮腫瘍、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、卵胞の外陰部、子宮癌及び固形癌等）、男性生殖器の悪性腫瘍（精巣癌及びペニス癌等）、腎癌（腎細胞癌腫等）、脳癌（内因的脳腫瘍、神経芽、アストロサイトの脳腫瘍、神経膠腫、及び中枢神経系内の転移性腫瘍細胞滲出等）、骨癌（骨腫及び骨肉腫等）、皮膚癌（黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行及び鱗状細胞癌等）、甲状腺ガン、網膜芽腫、神経芽、腹水、悪性胸水、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆のう癌、栄養膜の腫瘍、血管外皮細胞腫、及びカポジ肉腫が挙げられる。
【０１６０】
本発明の化合物は、細胞の放射増感にも使用できる。放射線で治療できる疾病としては、特に限定されないが、腫瘍性疾患、良性及び悪性腫瘍、並びに癌細胞が挙げられる。放射線治療は、γ線（１０−２０〜１０−１３ｍ），Ｘ線（１０−１２〜１０−９ｍ）、紫外光（１０ｎｍ〜４００ｎｍ）、可視光（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）、赤外線（７００ｎｍ〜１．０ｍｍ）、及びマイクロ波（１ｍｍ〜３０ｃｍ）等の電磁波照射を使用する。
【０１６１】
現在、癌治療プロトコルでは場合により、電磁放射線、例えば、Ｘ線によって活性化された放射線治療薬が用いられる。Ｘ線活性化放射線治療薬の例としては、特に限定されないが、メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、ＥＯ９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジンーリン酸（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシ尿素、シスプラチン、及びその治療的に有効なアナログ及び誘導体が挙げられる。
【０１６２】
癌の光線力学的療法（ＰＤＴ）では、増感作用因子の放射線活性化因子として可視光が用いられる。光力学的放射線治療薬の例としては、特に限定されないが、ヘマトポルフィリン誘導体、ＰＨＯＴＯＦＲＩＮ（登録商標）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、エチオポルフィリンスズ（ＳｎＥＴ２）、フェオボルビド−ａ、バクテリオクロロフィル−ａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、及びその治療的に有効なアナログ及び誘導体が挙げられる。
【０１６３】
放射線治療薬は、Ｃｈｋ１インヒビタに加えて治療上有効な量の１以上の化合物と共に投与でき、かかる化合物としては、限定されないが、標的細胞への放射線治療薬の取込みを促進する化合物や、治療剤、栄養分、及び／もしくは酸素の標的細胞への流動を制御する化合物、さらなる放射線の存在もしくは非存在下に腫瘍に作用する化学療法薬、又は癌もしくは他の疾病の処置用の他の治療上有効な化合物が挙げられる。放射線治療薬と併せて使用できる、さらなる治療剤又は方法の例として、限定されないが、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、酸素、カルボゲン、赤血球細胞注入、パーフルオロカーボン（例えば、ＦＬＵＯＳＯＬＷ（登録商標）−ＤＡ）、２，３−ＤＰＧ、ＢＷ１２Ｃ、カルシウムチャンネルブロッカー、ペントキシフィリン、抗血管新生化合物、ヒドララジン、及びＬ−ＢＳＯが挙げられる。
【０１６４】
癌を治療するために本発明の化合物と組み合わせて使用できる化学療法薬として、限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン及びそのアンタゴニスト、放射性同位体、抗体や、更には天然産物、並びにその組み合わせが挙げられる。例えば、本発明のインヒビタ化合物は、ドキソルビシン等の抗生物質、並びに他のアントラサイクリン類似体、シクロホスファミド等のナイトロジェンマスタード類、５−フルオロウラシル等のピリミジン類似体、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、タキソール、並びにその天然及び合成誘導体等と共に投与できる。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性及びゴナドトロピン非依存性細胞を含む乳房の腺癌等の混合腫瘍の場合、化合物をロイプロリド又はゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類似体）と併せて投与できる。他の抗悪性腫瘍プロトコルには、本明細書で「抗悪性腫瘍補助様式」とも称される、例えば手術又は放射線等の別の治療様式と共にインヒビタ化合物を使用することが含まれる。本発明で有用なさらなる化学療法薬として、ホルモン及びそのアンタゴニスト、放射性同位体、抗体、天然産物、並びにその組み合わせが挙げられる。本発明の化合物を用いる方法で有用な化学療法薬の例を、以下の表に挙げる。
【表１−１】
【表１−２】
【０１６５】
放射線治療薬との併用に特に有用な化学療法薬の例としては、例えば、カンプトセシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ＩＦＮ（α、β、γ）、イリノテカン（ヒドロキシ尿素）、クロランブシル、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ＭＴＸ、２−クロロアデノシン、フルダラビン、アザシチジン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、及びその治療的に有効なアナログ及び誘導体が挙げられる。
【０１６６】
本発明によれば、ゲムシタビン単独、又は更にパクリタキセルと共に、本発明の化合物を組み合わせるのが有用である。また、ペメトレキセド単独、又は更にシスプラチン、カルボプラチン、もしくは他のプラチン類と共に、本発明の化合物と組み合わせるのも有用である。本発明のＣｈｋ１インヒビタは、ゲムシタビン及びペメトレキセドと組み合わせて投与することもできる。
【０１６７】
ゲムシタビンと組み合わせて投与されるＣｈｋ１インヒビタは、例えば、膵癌、子宮平滑筋肉腫、骨肉腫、転移性非小細胞肺癌、四肢及び体躯軟組織肉腫、腎細胞癌、腺癌、及びホジキン病の治療に有用であり得る。ペメトレキセドと共に投与される本発明のＣｈｋ１インヒビタは、中皮腫の治療に有用でありうる。
【０１６８】
本発明の化合物はまた、異常な細胞増殖により特徴付けられる炎症性疾患、症状、又は障害の治療に使用される薬物の効力を強化することもできる。本発明の化合物で治療できる炎症性疾患の例としては、特に限定されないが、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、白斑、ヴェゲナー肉芽腫症、全身性発生若年型慢性関節炎（ＪＣＡ）、及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）が挙げられる。関節炎、ヴェグナー肉芽腫症、及びＳＬＥの治療には、イオン化放射線、メトトレキセート、及びシクロホスファミド等の免疫抑制治療剤の使用が含まれることが多い。このような治療は、典型的に、直接的又は間接的にＤＮＡ損傷を誘発する。攻撃中の免疫細胞内のＣｈｋ１活性の阻害によって、これらの標準的治療による制御に対して細胞がより感受性になる。乾癬及び白斑は通常、ソラレンと組み合わせて紫外放射線（ＵＶ）で治療される本発明の化合物は、ＵＶ及びソラレンによる死滅効果を増強し、この治療計画の治療係数を増加させる。一般的に、本発明の化合物は、免疫抑制薬と組み合わせて用いた場合に炎症性疾患細胞の制御を増強する。
【０１６９】
本発明の化合物はまた、異常に増殖している細胞により特徴付けられる他の非癌性症状を治療する方法にも使用できる。かかる症状としては、特に限定されないが、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、血管炎、腎炎、網膜症、腎臓病、増殖性皮膚障害、乾癬、ケロイド瘢痕、光線性角化症、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、骨粗鬆症、上皮下方成長等の目の過剰増殖性疾患、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、糖尿病性網膜症、血管増殖性疾患、魚鱗癬、及び乳頭腫が挙げられる。
【０１７０】
本発明のＣｈｋ１インヒビタを投与する、好ましい一方法は、２００４年９月１７日出願のＫｅｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／３０８０６号明細書に記載されており、これは２００３年９月１７日出願の米国仮出願第６０／５０３，９２５号明細書に基づくものであって、これを引用してその開示の全体を本願に援用する。異常な細胞増殖を阻害するためのこのような方法には、Ｃｈｋ１活性化因子（例えば、化学療法薬）、及び本発明に係るＣｈｋ１インヒビタの投与を計画することが含まれる。この方法では、少なくとも１つのＣｈｋ１活性化因子を、増殖している細胞での細胞周期休止の実質的な同期化を誘発するのに足る用量及び時間で投与する。期の実質的な同期化を成し遂げれば、少なくとも１つのＣｈｋ１インヒビタを投与して、細胞周期休止を抑止し、治療的細胞死を誘発する。本方法は何れのＣｈｋ１活性化因子でも有用であり、異常な細胞増殖が関わる癌性及び非癌性症状の治療又は予防における用途が認められる。
【０１７１】
異常に増殖している細胞の集団を、１、又は１以上の本発明のＣｈｋ１インヒビタと接触させることができる。１以上のＣｈｋ１インヒビタを用いる場合、Ｃｈｋ１インヒビタを、例えば、担当医師（ヒト患者の場合）又は研究室の実験者（インビトロもしくはエキソビボ法の場合）等の当業者が決定する、同じか又は異なる方法を用いて（例えば、同時もしくは順次に、同じかもしくは異なる期間、又は同じかもしくは異なる様式により）細胞と接触させることができる。
【０１７２】
異常に増殖している細胞の集団は、１以上のＣｈｋ１活性化因子と接触させることもできる。１以上のＣｈｋ１活性化因子を用いる場合、概ね、前記Ｃｈｋ１インヒビタに関し記したと同様、Ｃｈｋ１活性化因子を、同じか又は異なる方法を用いて細胞と接触させることができる。
【０１７３】
本発明の化合物は、エキソビボで細胞集団に適用できる。例えば、本発明の化合物をエキソビボに使用して、特定の適応症、細胞型、患者、及び／又は他の治療パラメータに対して、Ｃｈｋ１インヒビタを投与するための至適なスケジュール及び／又は服用に関する情報を得ることができる。この情報は、実験目的、又はインビボ治療用のプロトコルを決定する診療の場で使用できる。本発明の化合物に対する他のエキソビボの使用は、当業者にとって明らかであろう。
【０１７４】
当業者により理解されるように、さらなる活性又は補助的な作用因子を本明細書に記載の方法で用いてもよい。やはり当業者により理解されるように、本明細書でいう処置は、予防や、既存の疾患又は病徴の治療にも及ぶ。
【０１７５】
処置での使用に必要な本発明の化合物の量は、処置すべき病状の性質、並びに患者の年齢及び状態に伴って変化し、最終的には担当医師又は獣医師によって決定される。しかし、一般的に、成人ヒトの処置のために投与される用量は、典型的には１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲にある。その用量は、単回量にて、又は例えば１日に２、３、４、もしくはそれ以上の回数の小用量にて適切な間隔で投与される複数回量として投与できる。実際には、医師が個々の患者にとって好適な投与計画を決定し、その投与量は年齢、体重、及び特殊な患者の応答によって変化する。前記投与量は、平均的な場合の模範例であるが、より多いか又はより少ない投与量の方が良い個々の実例が存在し、これらも本発明の範囲に含まれる。
【０１７６】
如何なる用量でも、本発明のＣｈｋ１インヒビタとの細胞集団の接触は、細胞周期チェックポイントの実質的な抑止を成し遂げるのに充分な時間行う。必須ではないが、このような時間として典型的には、上限約７２時間〜約９６時間が挙げられ、これは様々な因子に依存する。いくつかの実施形態では、担当医師又は技術者が決定する通り、約数週間もしくはそれ以上までの期間にわたってＣｈｋ１インヒビタを投与することが望ましいか、又は必要とされる。そこで、Ｃｈｋ１インヒビタは、典型的には、約１時間以下、約２時間以下、約３時間以下、約４時間以下、約６時間、約１２時間以下、約１８時間以下、約２４時間以下、約４８時間以下、又は約７２時間以下で投与できる。本明細書で示す時間の範囲は単なる例示に過ぎず、示したものに入っても入らなくても、その範囲及び部分範囲とも、本発明の範囲に含まれることを、当業者は理解するはずである。
【０１７７】
本発明のＣｈｋ１インヒビタは、複数種の用量を投与できる。例えば、Ｃｈｋ１インヒビタは、４回量を４日の間隔で１日１用量として送達（ｑ４ｄ×４）；４回量を３日の間隔で１日１用量として送達（ｑ３ｄ×４）；５日の間隔で１日１用量を送達（ｑｄ×５）；１週１用量を３週間（ｑｗｋ３）；２日残して５日は毎日用量、及び更に５日間、毎日用量（５／２／５）；又は、状況に適するように決定した何れかの投与計画による頻度で投与できる。
【実施例】
【０１７８】
＜実施例１＞
Ｃｈｋ１インヒビタのＩＣ５０値の定量
１９９８年９月４日出願の国際出願公開第ＷＯ ９９／１１７９５号に以前報告したように、ヒトＣｈｋ１ｃＤＮＡを同定してクローニングした。ＦＬＡＧ（登録商標）タグを全長のＣｈｋ１のアミノ末端と枠内に挿入した。５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列を含み、Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いた親和性による精製のためのＦＬＡＧ（登録商標）タグもコードする。３’プライマーは、ＳａｌＩ部位を含む。ＰＣＲで増幅した断片を、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）としてｐＣＩ−Ｎｅｏにクローニングし、次いでＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片としてｐＦａｓｔＢａｃＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）にサブクローニングした。組換えバキュロウイルスを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬのＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃマニュアルに記載の通りに調製し、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ付Ｃｈｋ１タンパク質の発現のため、ＣＣＭ３培地（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）で生育するＳｆ−９細胞を感染させるのに用いた。
【０１７９】
ＦＬＡＧ（登録商標）タグ付Ｃｈｋ１は、バキュロウイルスを感染させたＳＦ９細胞の凍結ペレットから精製した。凍結細胞ペレットを１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ β−グリセロリン酸、２５ｍＭ ＮａＦ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、２ｍＭバナジウム酸ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ、及びプロテアーゼインヒビタのカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ２０００、カタログ＃１８３６１７０）を含有する等容量の２×溶解バッファーと混合した。次いで細胞をダウンスホモジナイザーの緩い内筒を２０回上下して細胞破砕し、４８，４００×ｇで１時間遠心分離した。Ｍ２親和性樹脂をカラム１０倍容量の５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．５、次いで２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで交互に３回予備洗浄し、最後にトリスＮａＣｌで洗浄した。次いで、２５カラム容量の２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１×コンプリートミニプロテアーゼ錠剤でカラムを洗浄した。その後、清澄化した溶解液をバッチ状態のＭ２親和性樹脂に４℃で４時間結合させた。その後、樹脂と溶解液の混合液はカラムに注ぎ、通過液を集めた。カラム１０倍容量の２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び３ｍＭ Ｎ−オクチルグルコシドで樹脂を洗浄した。ＦＬＡＧ（登録商標）タグ付Ｃｈｋ１を、次いで、カラム６倍容量の、０．５ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ｓｉｇｍａ、２０００、カタログ＃ Ｆ−３２９０）を含有する冷２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎ−オクチルグルコシドでカラムから溶出させた。３つの画分を採取して、ＦＬＡＧタグ付Ｃｈｋ１の存在について分析した。
【０１８０】
１００ｎｇの精製ＦＬＡＧ（登録商標）−Ｃｈｋ１（１５０ｐｍｏｌのＡＴＰ／分）、２０μＭ Ｃｄｃ２５Ｃペプチド（Ｈ−ｌｅｕ−ｔｙｒ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｍｅｔ−ｐｒｏ−ｇｌｕ−ａｓｎ−ｌｅｕ−ａｓｎ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ＯＨ）（配列番号１）、４μＭ ＡＴＰ、２μＣｉ［３２Ｐ］γ−ＡＴＰ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＮＰ４０、及び１ｍＭＤＴＴを含有するＣｈｋ１キナーゼ活性のアッセイ。反応は、ＡＴＰを含有する反応ミックスの添加によって開始し、室温で１０分間行った。リン酸（１５０ｍＭ最終濃度）の添加によって反応を停止し、ホスホセルロースディスクに移した。このホスホセルロースディスクを、１５０ｍＭリン酸で５回洗浄して、風乾した。シンチレーション液を添加して、ディスクをＷａｌｌａｃシンチレーションカウンターで計数した。アッセイ液を、広い範囲の濃度のＣｈｋ１インヒビタ化合物存在下にインキュベートし、その化合物に対するＩＣ５０値を求めた。アッセイに付した本発明の化合物はすべて、このアッセイで約２００ｎＭ未満のＩＣ５０値を示した。
【０１８１】
＜実施例２＞
選択性
比較酵素としてＣｈｋ１、並びにコンパレータ酵素として以下のプロテインキナーゼ：Ｃｄｃ２、Ｃｈｋ２、ＣＴＡＫ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｋ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ４、ＩＲ、ＪＮＫ１、ｃ−キット、ｐ３８ａｌｐｈａ、ｐ３８ｂｅｔａ、ｐ３８ｄｅｌｔａ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ２、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ｐｐ６０ｖ−ｓｒｃ、プロテインキナーゼＢ／Ａｋｔ−１、ｐ３８ＭａｐＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ、及びａｂ１チロシンキナーゼを用い、本発明のＣｈｋ１インヒビタを選択性について試験した。
【０１８２】
Ｃｈｋ１に対する化合物のＩＣ５０値を前記の通りに測定した。ＳｅｌｅｃｔＳｍａｒｔ（商標名）（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｅｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）独占的技術プラットフォームを用い、ＥＬＩＳＡ変法又は蛍光偏光のいずれかで、コンパレータ酵素に対する化合物のＩＣ５０値を測定した。試験したインヒビタはすべて、試験したコンパレータ酵素よりも、Ｃｈｋ１に少なくとも２０倍の選択性を示した。
【０１８３】
あるいは、これらのキナーゼの各々に対するＩＣ５０を定量するためのアッセイは、米国特許公開第２００２−０１６５２１ Ａ１号明細書、及び１９９５年１月２３日出願のＰＣＴ／ＵＳ９５／００９１２号（双方とも、引用して本願に援用する）を含む文献に、以前に報告されている。
【０１８４】
＜実施例３＞
Ｃｈｋ１インヒビタのＥＣＴＦＳ値の定量のための、細胞を基礎にしたアッセイ
本発明に係るＣｈｋ１インヒビタの、細胞に基づく作用強度を、その化合物がゲムシタビンに対してＨＴ２９ヒト癌腫細胞系を増感させる能力を測定することによって評価した。平均ＥＣＴＦＳ値は、複数の実験によって求めた。このように、本発明に係るＣｈｋ１インヒビタは、本明細書に記載の方法により合成した。化合物を１０ｍＭの原液濃度で１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させて、−７０℃で保存した。ＨＴ２９細胞はＡＴＣＣから入手し、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、グルタミン及び他の補充物質を含有するＲＰＭＩからなる生育培地で維持した。ゲムシタビン塩酸塩はＱｖｅｎｔａｓから入手し、５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させて、−２０℃で保存した。３Ｈ−チミジンは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから入手した。
【０１８５】
ＨＴ２９細胞は、９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、ウェル当たり１．３ｘ１０３の密度で播種し、終夜接着させた。翌日、ゲムシタビンを先ず１２５倍希釈し、次いで生育培地中１．２ｍｌのＴｉｔｅｒ Ｔｕｂｅｓ（商標名、バイオラッド）にて５倍希釈を繰り返した。最終的な希釈系列の濃度は、１１、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、６．４ｘ１０−３、１．２８ｘ１０−４、及び５．１２ｘ１０−５ｎＭであった。希釈したゲムシタビンを、次いで細胞に２時間添加した。その後ゲムシタビンを洗浄除去して、希釈した本発明のＣｈｋ１インヒビタを細胞に２４時間添加した。生育培地での最初の１０００倍希釈の後、本発明に係る１０μＭ（ＤＭＳＯ原液）Ｃｈｋ１インヒビタを１．２ｍｌのＴｉｔｅｒ Ｔｕｂｅｓ（商標名）にて連続的に３倍希釈し、２．５、０．８３、０．２８、０．０９、及び０．０３μＭの最終希釈系列を得た。７２時間後に、各ウェル内の細胞を、１μＭＣｉの３Ｈ−チミジンで１２時間標識化し、その後−７０℃で凍結した。その後、プレートを解凍して、Ｃｅｌｌ Ｍａｔｅ（商標名）プレートハーベスター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に収集した。次いでＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（商標名）２０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を３０μＬ添加して、プレートをＴｏｐ Ｃｏｕｎｔプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で計数した。データを、本発明に係るＣｈｋ１インヒビタ単独で処理した細胞に対して正規化し、その後［ゲムシタビン濃度（μＭ）］対［相対細胞成長（１００％が１．０と同等）］の対数／対数グラフにプロットした。９０％成長阻害で増加した増感倍数を、用いたＣｈｋ１インヒビタの各濃度に対して求め、次いでこれを、増感倍数に対するＣｈｋ１インヒビタ濃度のグラフにプロットした。その後、ＥＣＴＦＳ値を計算した。
【０１８６】
アッセイに付した本発明のＣｈｋ１インヒビタのＥＣＴＦＳ値の測定値は、約１０００ｎＭ未満であった。
【０１８７】
＜実施例４＞
本発明のＣｈｋ１インヒビタは、癌治療による細胞の死滅を強化する
本発明の化合物によるＣｈｋ１の阻害がＤＮＡ損傷因子による死滅効果に対して標的細胞を増感することを立証するために、細胞を本発明のＣｈｋ１インヒビタの存在下にインキュベートし、放射線又は化学的ＤＮＡ損傷因子の何れかに曝すことができる。９６ウェルのミクロタイタープレートにウェル当たり１０００〜２０００の密度で播種した細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＭＰＩ１６４０で、５％ＣＯ２を含む加湿したインキュベーターの中で３７℃にて１８時間生育する。被検細胞としては、ＨｅＬａ、ＡＣＨＮ、７８６−０、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１５、ＳＷ６２０、ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、Ａ５４９、Ｈ３２２、ＯＶＣＡＲ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＰＣ−３、ＨＬ−６０、Ｋ５６２、Ｂｘ−ＰＣ３、Ｍｉａ−ＰａＣａ２、Ｈ８１０、Ｈ２２６、Ｈ２１２６、及びＭＯＬＴ４といった目的のあらゆる細胞又は細胞系が挙げられる。すべての細胞系の表記は、以下のヒト細胞系を示す。
【表２】
【０１８８】
化学療法薬を単独で、又は化学療法薬とＣｈｋ１インヒビタとを含有する培地で細胞を処理する。３Ｈ−チミジン取込のレベルの定量によって成長を測定する前におよそ５日間、細胞をインキュベートする。化学療法薬に含まれるのは、エトプシド、ドキソルビシン、シスプラチン、クロラムブシル、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）である。未処理の対照細胞の９０％に細胞成長を阻害するのに必要な薬物濃度を、ＧＩ９０と規定する。
【０１８９】
本発明の化合物は、メトトレキセート、ヒドロキシ尿素、２−クロロアデノシン、フルダラビン、アザシチジン、及びゲムシチビンを含むさらなる代謝拮抗剤と共に試験して、この中で作用因子による死滅を強化する能力を評価できる。本発明の化合物は、ゲムシチビンと組み合わせてＨＴ２９結腸直腸癌腫の死滅の強化を評価することによって互いに比較できる。
【０１９０】
更に、放射線による死滅を強化する本発明のＣｈｋ１インヒビタの能力を試験できる。
【０１９１】
＜実施例５＞
動物モデルでのＣｈｋ１インヒビタ活性を測定するための高感度アッセイ
齧歯類腫瘍モデルにおけるＣｈｋ１インヒビタ活性を測定する、以下の高感度アッセイを開発した。詳細には、このアッセイはとりわけ、Ｃｈｋ１インヒビタがＣｈｋ１機能を阻止する能力を腫瘍モデルで測定し、分子標的へのＣｈｋ１インヒビタの接近を円滑にする条件の評価を可能にするのに使用できる。
【０１９２】
化学療法で誘発されるチェックポイントを、選択的Ｃｈｋ１インヒビタが抑止する能力は、有糸分裂に特異的な事象であるセリン１０（Ｈ３−Ｐ）でのヒストンＨ３リン酸化をモニターすることにより有糸分裂の指標を測定する、定量的免疫蛍光アッセイを用いて測定する（Ａｊｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２７１：１３１９７−２０１， １９９６； Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２７４：２５５４３−９， １９９９）。アッセイプロトコルは以下の通りである。Ｃｈｋ１活性化因子（本研究では、化学療法薬）及び／又はＣｈｋ１インヒビタで処理した、又は処理しない齧歯類由来の腫瘍を切除して、パラフィン包埋する。腫瘍を６ミクロンの厚みの切片に切り、ガラススライドに載置する。キシレン、１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノール及び脱イオン水での３分間の連続処理によって、スライドからパラフィンを除去する。次にスライドを１０ｍＭクエン酸ナトリウム中で９５℃に１０分間加熱し、その後２０分の冷却工程を行う。スライドを、ブロッキングバッファー（０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳＴ）を含有する２０％正常ヒト血清及び２％ウシ血清アルブミンのリン酸緩衝食塩水）で３０分間ブロッキングする。抗ホスホヒストンＨ３抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．＃０６−５７０）をブロッキングバッファーで１：２００に希釈し、１時間スライドとインキュベートする。スライドをＰＢＳＴ中で５分間３回洗浄する。二次抗体の、ロバ抗ウサギローダミン（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｃａｔ＃７１１−２９５−１５２）を３０分間添加する。次いでスライドをＰＢＳＴで２回洗浄し、７５μＭの０．１μＭ／ｍｌ ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加して３０分間染色させる。その後スライドをＰＢＳＴで更に２回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ベクター、ｃａｔ＃Ｈ−１４００）に載置する。蛍光顕微鏡を用いてスライドを観察する。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．６）を用いて、Ｈ３−Ｐ抗体で染色された細胞の総（ＤＡＰＩ染色）細胞に対する、百分率を数量化する。
【０１９３】
＜実施例６＞
選択的Ｃｈｋ１インヒビタは、ＤＮＡ損傷で誘発されたＧ２及びＳ期チェックポイントを抑止する。
以前の研究により、選択的Ｃｈｋ１インヒビタは、ＤＮＡ損傷で誘発されたＧ２／Ｍ及びＳ期チェックポイントを実質的に抑止することが立証されている。前者では、ＤＮＡ損傷はイオン化放射線（ＩＲ）によって誘発され、その標的期はＧ２期である。後者では、ＤＮＡ損傷は標的期がＳ期である化学療法薬によって誘発される。公開された米国特許出願公開第２００３／００６９２８４号明細書参照、この文献を本明細書で引用する。
【０１９４】
概説すると、ＩＲで誘発されたＧ２ＤＮＡ損傷チェックポイントのＣｈｋ１インヒビタによる抑止は、有糸分裂の指標実験によってアッセイする。およそ１ｘ１０６のＨｅＬａ細胞を、８００ラドで照射し、３７℃で７時間インキュベートする。これらの細胞は機能的にｐ５３陰性なので、専らＧ２のみで休止する。次いで、ノコダゾールを０．５μｇ／ｍＬの濃度に添加して、３７℃で１５時間インキュベートする。（ノコダゾールの添加は、有糸分裂においてＧ２休止を経た細胞をトラップし、よってそれらが更にＧ１に進むのを阻止して、Ｍ期細胞の数量化を可能とするように計画する。）選択的Ｃｈｋ１インヒビタを８時間添加し、この細胞を遠心によって収集し、ＰＢＳで１回洗浄して、その後２．５ｍＬの７５ｍＭ ＫＣｌに再懸濁させて再び遠心する。細胞はその後、調製したばかりの冷酢酸：ＭｅＯＨ（１：３）３ｍＬで固定して、氷上で２０分間インキュベートする。細胞をペレット化して固定液を吸引し、０．５ｍＬのＰＢＳに細胞を再懸濁する。１００μＬの固定した細胞をガラス顕微鏡スライド上にピペッティングし、１ｍｌの固定液で試料を横溢することによって、有糸分裂スプレッドを調製する。その後、スライドを風乾して、Ｗｒｉｇｈｔｓ染色液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で１分間染色し、次いで水で１回洗浄し、５０％ＭｅＯＨで１回洗浄する。濃縮された染色体の存在と、核エンベロープの欠損で有糸分裂細胞を同定する。Ｃｈｋ１インヒビタによって、放射線照射のもとに有糸分裂細胞数の増加がもたらされ、これにより、ＩＲで誘発されたＧ２休止の抑止が立証される。このチェックポイント抑止の結果、サイクリンＢ／ｃｄｃ２の活性の増強が引き起こされ、これは有糸分裂への細胞の進行に必要なものである。ＩＲと、その後Ｃｈｋ１インヒビタで処理した細胞はかくして、損傷を受けたＤＮＡを備えて有糸分裂に進む。これらの実験によって、ＩＲで誘発されたＧ２にＣｈｋ１が関わっているという仮説を確証する。
【０１９５】
＜実施例７＞
異種移植片腫瘍モデルで、Ｃｈｋ１活性化因子の存在下、Ｃｈｋ１インヒビタは腫瘍によって取り込まれる。
異種移植片腫瘍モデルで、ヌードマウスの横腹にＨＴ２９結腸癌腫腫瘍を移植し、２００ｍｍ３まで成長させる。その後マウスは、媒体、３００ｍｇ／ｋｇＣｈｋ１インヒビタ、２０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンのいずれかで処理するか、又は３００ｍｇ／ｋｇＣｈｋ１インヒビタと２０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンとを２回、３日間あけて１日目と４日目に一緒に投与する。腫瘍担持マウスのＣｈｋ１インヒビタとゲムシタビンとの共投与による処理の結果、ゲムシタビン単独に比較して腫瘍の成長に４日の遅延が引き起こされる。
【０１９６】
腫瘍組織へのＣｈｋ１インヒビタの拡散を評価するために、Ｃｈｋ１インヒビタの血漿及び組織レベルを測定する。Ａｌｚｅｔポンプを用いて、連続送達システムにて２４時間にわたり５００ｍｇ／ｋｇのＣｈｋ１インヒビタをＨＴ２９腫瘍担持マウスに投与する。血漿試料を採取し、その後腫瘍、腎臓、肝臓、脾臓、及び肺を回収する。１、２、４、８、及び２４時間の時点で採取を行う。組織を抽出し、Ｃｈｋ１インヒビタのレベルを数量化する。この実験により、Ｃｈｋ１インヒビタが正常及び腫瘍組織内に浸透し、腫瘍組織で約１５μＭのレベルに達し、脾臓組織では８時間で約２０μＭの最高値になることが示される。このように、Ｃｈｋ１インヒビタは増殖している細胞によって容易に取り込まれた。そしてこれは、Ｃｈｋ１を活性化する化学療法薬と併せて、増殖性疾患の処置のための療法として有用である。
【０１９７】
＜実施例８＞
Ｃｈｋ１インヒビタ及びゲムシタビンで処理した腫瘍の用量応答
ゲムシタビン処理後のＣｈｋ１インヒビタの有効用量と、用量依存性のチェックポイント抑止が抗腫瘍活性と呼応しているかどうかを調べるために、用量応答実験を実施する。
【０１９８】
ヌードマウスにＨＴ２９腫瘍細胞を移植して、腫瘍を１０日間増大させる。開始時の腫瘍は、およそ１００ｍｍ３であった。動物をＭＴＤ（１６０ｍｇ／ｋｇ）のゲムシタビンで、その後５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、又は４００ｍｇ／ｋｇのＣｈｋ１インヒビタで処理した。ゲムシタビン前処理の時間はこの実験では３２時間であり、これは当該時点がこの型の腫瘍に対して至適であることを示した、細胞を基礎にしたアッセイによって求めたものである。各治療計画における腫瘍体積の解析によって、ＨＴ２９腫瘍担持マウスを前記療法で処理すると、ゲムシタビンに加えて２００ｍｇ／ｋｇ又は４００ｍｇ／ｋｇのＣｈｋ１インヒビタのいずれかにより、ゲムシタビン単独よりも腫瘍の成長を遅らせることが示唆され、また、Ｃｈｋ１インヒビタの用量依存性効果を示していた。
【０１９９】
＜実施例９＞
作用因子がＣｈｋ１活性化因子であるかどうかを調べるアッセイ
作用因子がＣｈｋ１活性化因子であるかどうかを調べるために、Ｃｈｋ１の特異的リン酸化部位に対するホスホ特異抗体を用いてＣｈｋ１のリン酸化状態を測定できる。セリン３１７及び３４５は、イオン化放射線、紫外放射線、ヒドロキシ尿素、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、テモゾラマイド及びゲムシタビンで細胞を処理した後にリン酸化されることが示されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４：１４４８−１４５９， ２０００； Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２１：４１２９−４１３９， ２００１； Ｌｏｐｅｚ−Ｇｉｒｏｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９８：１１２８９−１１２９４， ２００１； Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４：２７４５−２７５６， ２０００； Ｇａｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：１４８０６−１４８１１， ２００３； Ｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）。これらセリン部位は、上流のチェックポイントキナーゼ、Ａｔｍ及びＡｔｒによってリン酸化される（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４：１４４８−１４５９， ２０００； Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２１：４１２９−４１３９， ２００１）。
【０２００】
Ｃｈｋ１活性化因子の候補物質に応答するこれらの部位のリン酸化は、腫瘍細胞のウエスタンブロット又は免疫組織化学的方法によってモニターできる。例えば、以下の手順を用いて、ゲムシタビンがセリン３４５及び３１７でＣｈｋ１活性化を引き起こすことを立証できる。ＨＴ２９細胞を、２０μＭゲムシタビンで２時間処理する。ゲムシタビンを細胞生育培地から洗い去り、この細胞を更に２２時間インキュベートする。タンパク質溶解液を調製して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写して、リン酸化セリン３１７又は３４５（細胞シグナリング）の何れかに特異的な抗血清（細胞シグナリング）でプローブ検知する。ウエスタンブロットによって、ＨＴ２９結腸癌腫細胞のゲムシタビン処理は、セリン３１７及び３４５の双方のリン酸化をもたらすことが示される。
【０２０１】
＜実施例１０＞
Ｃｈｋ１インヒビタに応答するＣｈｋ１活性をモニターするためのアッセイ
セリン２９６でのＣｈｋ１のリン酸化が、ゲムシタビンでの腫瘍細胞の処理によって刺激され、この部位でのリン酸化はＣｈｋ１インヒビタによって阻害されることが見出されている。この部位でのリン酸化は、Ａｔｍ及びＡｔｒを阻害するワートマニンによって阻害されない。従って、セリン２９６のリン酸化は、セリン３１７及び３４５でのリン酸化と異なっている。更に、この部位は、精製されたＣｈｋ１調製物でリン酸化されることが見出されており、精製酵素が、それ自体又は他のＣｈｋ１分子をセリン２９６でリン酸化できることを示唆している。まとめると、これらのデータは、セリン２９６でのリン酸化はＣｈｋ１自体によって行われることを示唆している。従って、このアプローチを使用して、Ｃｈｋ１活性化因子に応答する、腫瘍でのＣｈｋ１活性をモニターできる。更に、このアプローチを使用して、Ｃｈｋ１インヒビタによるＣｈｋ１活性化の阻害を測定できる。
【０２０２】
同様に、２０μＭゲムシタビンでＨＴ２９細胞を２時間処理する。ゲムシタビンを細胞生育培地から洗い去り、この細胞を更に２２時間インキュベートする。タンパク質溶解液を調製して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。タンパク質をポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写して、リン酸化セリン２９６（細胞シグナリング）に特異的な抗血清（細胞シグナリング）でプローブ検知する。ウエスタンブロットによって、ＨＴ２９結腸癌腫細胞のゲムシタビン処理は、セリン２９６のリン酸化をもたらすことが示される。更に、選択的Ｃｈｋ１インヒビタで１５分間処理したＨＴ２９細胞は、セリン２９６のリン酸化を示さない。これらのデータは、セリン２９６のリン酸化がＣｈｋ１キナーゼによって行われることを示唆している。
【０２０３】
＜実施例１１＞
動物腫瘍モデル
マウスにおけるＤＮＡ損傷因子による腫瘍の死滅を本発明のＣｈｋ１インヒビタが強化する能力を試験するために、結腸腫瘍細胞系を用いる異種移植片腫瘍モデルを確立する。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）又はゲムシタビンを、ＤＮＡ損傷因子として使用できる。ＨＴ２９及びＣｏｌｏ２０５（ヒト結腸癌腫）並びにＨ４６０及びＣａｌｕ−６（非小細胞癌腫）細胞を使用して、６〜８週齢の雌性胸腺Ｂａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスで異種移植片腫瘍を増殖できる。マウスは、層状空気流キャビネットで無病原体条件下に保持し、適宜無菌食餌及び水を与えた。５％ＣＯ２加湿環境において、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１．５ｍＭＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で細胞系を亜集密にまで生育する。単一種細胞懸濁液をＣＭＦ−ＰＢＳで調製し、細胞濃度は１×１０８細胞／ｍＬに調整する。合計１ｘ１０７細胞（１００μＬ）を、マウスの右横腹又は右足の皮下（ｓ．ｃ．）に接種する。マウスを４処置群に無作為化し（５〜１５匹のマウス／群）、腫瘍が７５〜１００ｃｍ３の体積に達したら（通常、接種後７〜１１日）使用する。腫瘍を副尺付きカリパスで計測して、経験的に導き出した式：腫瘍体積（ｃｍ３）＝腫瘍長さ（ｃｍ）×腫瘍幅（ｃｍ）×腫瘍深さ（ｃｍ）／３．３を用いて腫瘍体積を概算する。処置は、以下の工程からなる：ｉ）ゲムシタビンを１６０ｍｇ／ｋｇで１００μＬ腹腔内（ｉ．ｐ）注射。腫瘍成長の遅延は、ゲムシタビンで処理したマウスで観察される。Ｃｈｋ１インヒビタの経口投与と組み合わせた１６０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンとの両者でのマウスの処理は、腫瘍体積を低減して寿命を延ばすことが予想される。腫瘍サイズは、実験期間中、隔日にモニターする。明らかに、上記した通り、本発明の多くの修正及び変形を本発明の技術的思想及び技術的範囲内でなすことができるため、その制限は特許請求の範囲によって規定されるものだけによるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造式を有する化合物、又はその薬理学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物。
【化１】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり；
Ｒ３は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６または７員の飽和複素環であって、Ｒａは独立に水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＨ２ＣＮ、又はＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は任意にオキソ（＝Ｏ）で置換され；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、ＳＣ１−３アルキル、Ｎ（Ｒｂ）２、ＮＲｂＣ（＝Ｏ）Ｃ１−３アルキル、又は１個のＮ−Ｒａ基及び任意に１〜３個のＣ１−３アルキル基で置換される環を含む５又は６員の飽和複素環であり；
又はＲ２及びＲ４はそれらが結合する炭素とともに５〜７員の飽和炭素環を形成し；
及び、Ｒ５は水素又はハロであり、
ただしＲ２及びＲ４の少なくとも一方は水素ではなく、またＲ５がハロであるとき、Ｒ２又はＲ４は水素である）
【請求項２】
Ｒ１がクロロ、メチル、ＣＮ、又はＣＦ３である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が、水素、メチル、エチル、クロロ、ブロモ、ジメチルアミノ、シアノ、又はメトキシである請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が水素以外の基である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ４が、水素、メチル、クロロ、メトキシ、フルオロ、ジメチルアミノ、−ＳＣＨ３、イソプロポキシ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、
【化２】
又は
【化３】
である請求項１記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ４が、メチル、クロロ、又はメトキシである請求項１記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ５がハロである請求項１記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ５がフルオロである請求項７記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ２又はＲ４が水素である請求項７記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ４は水素である請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ２及びＲ４がそれらが結合する炭素とともに５員又は６員の飽和炭素環を形成する請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ３が、
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
及び
【化９】
からなる群より選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
次の構造式を有する化合物、又はその薬理学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物。
【化１０】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり；
Ｒ３は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２の環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６又は７員の飽和ヘテロ環基であって、Ｒａは独立して水素、Ｃ１−３アルキル、又はＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は適宜オキソ（＝Ｏ）で置換されていてもよく；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、又はハロであり；
又はＲ２及びＲ４はそれらが結合する炭素とともに５〜７員の飽和炭素環を形成し、
ただし、Ｒ２及びＲ４の少なくとも一方は水素ではない）
【請求項１４】
Ｒ１がクロロ、メチル、ＣＮ、又はＣＦ３である請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ２が、メチル、エチル、クロロ、ブロモ、シアノ、ジメチルアミノ、又はメトキシである請求項１３記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ４が、メチル、クロロ、又はメトキシである請求項１３記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ２及びＲ４がそれらが結合する炭素とともに６員の飽和炭素環を形成する請求項１３記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ３が、
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
及び
【化１６】
からなる群より選択される請求項１３記載の化合物。
【請求項１９】
構造
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
【化４２】
【化４３】
【化４４】
【化４５】
【化４６】
【化４７】
【化４８】
【化４９】
【化５０】
【化５１】
【化５２】
【化５３】
【化５４】
【化５５】
【化５６】
【化５７】
【化５８】
【化５９】
【化６０】
【化６１】
【化６２】
【化６３】
【化６４】
【化６５】
【化６６】
【化６７】
【化６８】
【化６９】
【化７０】
【化７１】
【化７２】
【化７３】
【化７４】
【化７５】
【化７６】
【化７７】
【化７８】
【化７９】
【化８０】
【化８１】
【化８２】
【化８３】
【化８４】
【化８５】
【化８６】
【化８７】
【化８８】
【化８９】
【化９０】
【化９１】
【化９２】
【化９３】
【化９４】
【化９５】
を有する請求項１記載の化合物及びその混合物、又はその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ。
【請求項２０】
構造
【化９６】
【化９７】
【化９８】
【化９９】
【化１００】
【化１０１】
【化１０２】
【化１０３】
【化１０４】
【化１０５】
【化１０６】
【化１０７】
【化１０８】
【化１０９】
【化１１０】
【化１１１】
【化１１２】
【化１１３】
【化１１４】
【化１１５】
【化１１６】
【化１１７】
【化１１８】
【化１１９】
【化１２０】
【化１２１】
【化１２２】
【化１２３】
【化１２４】
【化１２５】
【化１２６】
【化１２７】
【化１２８】
【化１２９】
【化１３０】
【化１３１】
【化１３２】
【化１３３】
【化１３４】
【化１３５】
【化１３６】
【化１３７】
【化１３８】
【化１３９】
【化１４０】
【化１４１】
【化１４２】
【化１４３】
【化１４４】
を有する請求項１３記載の化合物及びその混合物、又はその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ。
【請求項２１】
Ｒ１がメチル又はシアノであり、Ｒ２はメチル、シアノ、クロロ、又はブロモであり、Ｒ３が
【化１４５】
である請求項１３記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ４が水素である請求項２１記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ４がメチル又はエチルである請求項２１記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ４がクロロである請求項２１記載の化合物。
【請求項２５】
構造；
【化１４６】
【化１４７】
【化１４８】
【化１４９】
【化１５０】
【化１５１】
【化１５２】
【化１５３】
【化１５４】
【化１５５】
【化１５６】
【化１５７】
【化１５８】
【化１５９】
【化１６０】
【化１６１】
【化１６２】
【化１６３】
【化１６４】
【化１６５】
【化１６６】
を有する化合物及びその混合物、又はその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ。
【請求項２６】
細胞内のチェックポイントキナーゼ１を阻害する方法であって、該細胞を、有効量の請求項１又は１３記載の化合物と接触させる工程を含む方法。
【請求項２７】
医学的適応症の化学療法又は放射線療法を受ける個体における細胞を増感する方法であって、治療的有効量の請求項１又は１３記載の化合物を化学療法薬、放射線治療薬、又はその混合物と組み合わせて前記個体に投与することを含む方法。
【請求項２８】
サイトカイン、リンホカイン、成長因子、他の造血因子、又はこれらの混合物を該個体に投与することを更に含む請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記化学療法薬が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、そのホルモン又はアンタゴニスト、放射性同位体、抗体、及びこれらの混合物からなる群より選択される請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記放射線治療薬が、γ線、Ｘ線、紫外光、可視光、赤外線、及びマイクロ波からなる群より選択される請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
該症状が、大腸癌、頭部及び頚部癌、膵癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、外陰部癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、腎細胞癌腫、卵巣癌、脳癌、骨肉腫及び肺癌からなる群より選択される癌である請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
該症状が、粘液且つ円形の細胞癌腫、局所進行性腫瘍、転移性癌、ユーイング肉腫、癌転移、リンパ転移、扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、口腔癌、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、急性抗リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、滲出リンパ腫（体腔系リンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌、小細胞癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンスリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ生成腫瘍、非小細胞癌、乳癌、小細胞癌腫、腺管癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、結腸直腸新生物に伴うポリープ、膵癌、肝癌、膀胱癌、原発性表在性膀胱腫瘍、浸潤性膀胱移行上皮癌、筋肉浸潤性膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、原発性腹膜上皮性腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、子宮体癌、膣癌、外陰部の癌、卵胞の子宮癌及び固形癌、精巣癌、陰茎癌、腎細胞癌腫、内因的脳腫瘍、神経芽種、アストロサイトの脳腫瘍、神経膠腫、中枢神経系の転移性腫瘍細胞滲出、骨腫及び骨肉腫、悪性黒色腫、ヒト皮膚角化細胞の腫瘍進行、扁平上皮癌、甲状腺ガン、網膜芽腫、神経芽種、腹水、悪性胸水、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆のう癌、栄養膜腫瘍、血管外皮細胞腫、及びカポジ肉腫からなる群より選択される癌である請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記治療が、慢性関節リウマチ、乾癬、白斑、ヴェゲナー肉芽腫症、及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択される炎症性疾患のために行われる請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
請求項１記載の化合物が、Ｃｈｋ１阻害において、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ｃｄｃ２、及びｐｐ６０ｖ−ｓｒｃの２０倍以上の選択性を有する請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
請求項１記載の化合物が、Ｃｈｋ１阻害において、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ｃｄｃ２、及びｐｐ６０ｖ−ｓｒｃの７５倍以上の選択性を有する請求項２７記載の方法。
【請求項３６】
請求項１記載の化合物が、Ｃｈｋ１阻害において、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ｃｄｃ２、及びｐｐ６０ｖ−ｓｒｃの１００倍以上の選択性を有する請求項２７記載の方法。
【請求項３７】
異常な細胞増殖を阻害又は抑制する方法であって、異常増殖細胞を含む細胞集団をＣｈｋ１アクチベータと接触させることで、前記異常増殖細胞間で細胞周期停止を実質的に同期させ、前記細胞集団を請求項１又は１３記載の化合物と接触させることで、前記細胞周期停止を実質的に無効化することを含む方法。
【請求項３８】
前記Ｃｈｋ１アクチベータが、１種以上の化学療法薬を含む請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｃｈｋ１アクチベータが、電離放射線又は紫外線を含む請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記電離放射線が、放射線治療薬、光増感剤、又はこれらの混合物と共に投与される請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記異常増殖細胞が、非癌性である請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
請求項１又は１３記載の化合物の、チェックポイントキナーゼ１の阻害用医薬の製造のための使用。
【請求項４３】
請求項１又は１３記載の化合物の、医学的適応症の化学療法的又は放射線療法的治療を受ける個体における細胞の増感用医薬の製造のための使用。
【請求項４４】
請求項１又は１３記載の化合物の、異常増殖細胞を含む細胞集団における異常な細胞増殖の阻害用医薬の製造のための使用。
【請求項４５】
請求項１又は１３記載の化合物の、チェックポイントキナーゼ１の阻害が治療的に利点がある症状の治癒的又は予防的治療のための細胞内医薬の製造のための使用。
【請求項４６】
（ａ）請求項１又は１３の化合物を含有する医薬組成物と、（ｂ）この組成物が異常な細胞増殖を伴う適応症の治療に有用であることを記載する添付文書と、（ｃ）容器と、を備えるヒト治療用製品。
【請求項４７】
（ａ）請求項１又は１３の化合物を含有する医薬組成物と、（ｂ）この組成物がＤＮＡ損傷又はＤＮＡ複製に関連する適応症の治療における化学療法薬又は放射線治療薬として有用であることを記載する添付文書と、（ｃ）容器と、を備えるヒト治療用製品。
【請求項１】
次の構造式を有する化合物、又はその薬理学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物。
【化１】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり；
Ｒ３は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６または７員の飽和複素環であって、Ｒａは独立に水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＨ２ＣＮ、又はＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は任意にオキソ（＝Ｏ）で置換され；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、ＳＣ１−３アルキル、Ｎ（Ｒｂ）２、ＮＲｂＣ（＝Ｏ）Ｃ１−３アルキル、又は１個のＮ−Ｒａ基及び任意に１〜３個のＣ１−３アルキル基で置換される環を含む５又は６員の飽和複素環であり；
又はＲ２及びＲ４はそれらが結合する炭素とともに５〜７員の飽和炭素環を形成し；
及び、Ｒ５は水素又はハロであり、
ただしＲ２及びＲ４の少なくとも一方は水素ではなく、またＲ５がハロであるとき、Ｒ２又はＲ４は水素である）
【請求項２】
Ｒ１がクロロ、メチル、ＣＮ、又はＣＦ３である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が、水素、メチル、エチル、クロロ、ブロモ、ジメチルアミノ、シアノ、又はメトキシである請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が水素以外の基である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ４が、水素、メチル、クロロ、メトキシ、フルオロ、ジメチルアミノ、−ＳＣＨ３、イソプロポキシ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、
【化２】
又は
【化３】
である請求項１記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ４が、メチル、クロロ、又はメトキシである請求項１記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ５がハロである請求項１記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ５がフルオロである請求項７記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ２又はＲ４が水素である請求項７記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ４は水素である請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ２及びＲ４がそれらが結合する炭素とともに５員又は６員の飽和炭素環を形成する請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ３が、
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
及び
【化９】
からなる群より選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
次の構造式を有する化合物、又はその薬理学的に許容できる塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物。
【化１０】
（式中、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、又はＣＦ３であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＣＮ、ＯＣ１−３アルキル、ハロ、又はＮ（Ｒｂ）２であって、Ｒｂは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり；
Ｒ３は、１個の環Ｎ−Ｒａ基と、第２の環Ｎ−Ｒａ基、環酸素、又は環硫黄のいずれかとを含む６又は７員の飽和ヘテロ環基であって、Ｒａは独立して水素、Ｃ１−３アルキル、又はＣＨ２ＣＮであり、Ｒ３は適宜オキソ（＝Ｏ）で置換されていてもよく；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−３アルキル、ＯＣ１−３アルキル、又はハロであり；
又はＲ２及びＲ４はそれらが結合する炭素とともに５〜７員の飽和炭素環を形成し、
ただし、Ｒ２及びＲ４の少なくとも一方は水素ではない）
【請求項１４】
Ｒ１がクロロ、メチル、ＣＮ、又はＣＦ３である請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ２が、メチル、エチル、クロロ、ブロモ、シアノ、ジメチルアミノ、又はメトキシである請求項１３記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ４が、メチル、クロロ、又はメトキシである請求項１３記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ２及びＲ４がそれらが結合する炭素とともに６員の飽和炭素環を形成する請求項１３記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ３が、
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
及び
【化１６】
からなる群より選択される請求項１３記載の化合物。
【請求項１９】
構造
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
【化４２】
【化４３】
【化４４】
【化４５】
【化４６】
【化４７】
【化４８】
【化４９】
【化５０】
【化５１】
【化５２】
【化５３】
【化５４】
【化５５】
【化５６】
【化５７】
【化５８】
【化５９】
【化６０】
【化６１】
【化６２】
【化６３】
【化６４】
【化６５】
【化６６】
【化６７】
【化６８】
【化６９】
【化７０】
【化７１】
【化７２】
【化７３】
【化７４】
【化７５】
【化７６】
【化７７】
【化７８】
【化７９】
【化８０】
【化８１】
【化８２】
【化８３】
【化８４】
【化８５】
【化８６】
【化８７】
【化８８】
【化８９】
【化９０】
【化９１】
【化９２】
【化９３】
【化９４】
【化９５】
を有する請求項１記載の化合物及びその混合物、又はその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ。
【請求項２０】
構造
【化９６】
【化９７】
【化９８】
【化９９】
【化１００】
【化１０１】
【化１０２】
【化１０３】
【化１０４】
【化１０５】
【化１０６】
【化１０７】
【化１０８】
【化１０９】
【化１１０】
【化１１１】
【化１１２】
【化１１３】
【化１１４】
【化１１５】
【化１１６】
【化１１７】
【化１１８】
【化１１９】
【化１２０】
【化１２１】
【化１２２】
【化１２３】
【化１２４】
【化１２５】
【化１２６】
【化１２７】
【化１２８】
【化１２９】
【化１３０】
【化１３１】
【化１３２】
【化１３３】
【化１３４】
【化１３５】
【化１３６】
【化１３７】
【化１３８】
【化１３９】
【化１４０】
【化１４１】
【化１４２】
【化１４３】
【化１４４】
を有する請求項１３記載の化合物及びその混合物、又はその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ。
【請求項２１】
Ｒ１がメチル又はシアノであり、Ｒ２はメチル、シアノ、クロロ、又はブロモであり、Ｒ３が
【化１４５】
である請求項１３記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ４が水素である請求項２１記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ４がメチル又はエチルである請求項２１記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ４がクロロである請求項２１記載の化合物。
【請求項２５】
構造；
【化１４６】
【化１４７】
【化１４８】
【化１４９】
【化１５０】
【化１５１】
【化１５２】
【化１５３】
【化１５４】
【化１５５】
【化１５６】
【化１５７】
【化１５８】
【化１５９】
【化１６０】
【化１６１】
【化１６２】
【化１６３】
【化１６４】
【化１６５】
【化１６６】
を有する化合物及びその混合物、又はその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ。
【請求項２６】
細胞内のチェックポイントキナーゼ１を阻害する方法であって、該細胞を、有効量の請求項１又は１３記載の化合物と接触させる工程を含む方法。
【請求項２７】
医学的適応症の化学療法又は放射線療法を受ける個体における細胞を増感する方法であって、治療的有効量の請求項１又は１３記載の化合物を化学療法薬、放射線治療薬、又はその混合物と組み合わせて前記個体に投与することを含む方法。
【請求項２８】
サイトカイン、リンホカイン、成長因子、他の造血因子、又はこれらの混合物を該個体に投与することを更に含む請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記化学療法薬が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、そのホルモン又はアンタゴニスト、放射性同位体、抗体、及びこれらの混合物からなる群より選択される請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記放射線治療薬が、γ線、Ｘ線、紫外光、可視光、赤外線、及びマイクロ波からなる群より選択される請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
該症状が、大腸癌、頭部及び頚部癌、膵癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、外陰部癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、腎細胞癌腫、卵巣癌、脳癌、骨肉腫及び肺癌からなる群より選択される癌である請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
該症状が、粘液且つ円形の細胞癌腫、局所進行性腫瘍、転移性癌、ユーイング肉腫、癌転移、リンパ転移、扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、口腔癌、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、急性抗リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、滲出リンパ腫（体腔系リンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌、小細胞癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンスリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ生成腫瘍、非小細胞癌、乳癌、小細胞癌腫、腺管癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、結腸直腸新生物に伴うポリープ、膵癌、肝癌、膀胱癌、原発性表在性膀胱腫瘍、浸潤性膀胱移行上皮癌、筋肉浸潤性膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、原発性腹膜上皮性腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、子宮体癌、膣癌、外陰部の癌、卵胞の子宮癌及び固形癌、精巣癌、陰茎癌、腎細胞癌腫、内因的脳腫瘍、神経芽種、アストロサイトの脳腫瘍、神経膠腫、中枢神経系の転移性腫瘍細胞滲出、骨腫及び骨肉腫、悪性黒色腫、ヒト皮膚角化細胞の腫瘍進行、扁平上皮癌、甲状腺ガン、網膜芽腫、神経芽種、腹水、悪性胸水、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆のう癌、栄養膜腫瘍、血管外皮細胞腫、及びカポジ肉腫からなる群より選択される癌である請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記治療が、慢性関節リウマチ、乾癬、白斑、ヴェゲナー肉芽腫症、及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択される炎症性疾患のために行われる請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
請求項１記載の化合物が、Ｃｈｋ１阻害において、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ｃｄｃ２、及びｐｐ６０ｖ−ｓｒｃの２０倍以上の選択性を有する請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
請求項１記載の化合物が、Ｃｈｋ１阻害において、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ｃｄｃ２、及びｐｐ６０ｖ−ｓｒｃの７５倍以上の選択性を有する請求項２７記載の方法。
【請求項３６】
請求項１記載の化合物が、Ｃｈｋ１阻害において、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ｃｄｃ２、及びｐｐ６０ｖ−ｓｒｃの１００倍以上の選択性を有する請求項２７記載の方法。
【請求項３７】
異常な細胞増殖を阻害又は抑制する方法であって、異常増殖細胞を含む細胞集団をＣｈｋ１アクチベータと接触させることで、前記異常増殖細胞間で細胞周期停止を実質的に同期させ、前記細胞集団を請求項１又は１３記載の化合物と接触させることで、前記細胞周期停止を実質的に無効化することを含む方法。
【請求項３８】
前記Ｃｈｋ１アクチベータが、１種以上の化学療法薬を含む請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｃｈｋ１アクチベータが、電離放射線又は紫外線を含む請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記電離放射線が、放射線治療薬、光増感剤、又はこれらの混合物と共に投与される請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記異常増殖細胞が、非癌性である請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
請求項１又は１３記載の化合物の、チェックポイントキナーゼ１の阻害用医薬の製造のための使用。
【請求項４３】
請求項１又は１３記載の化合物の、医学的適応症の化学療法的又は放射線療法的治療を受ける個体における細胞の増感用医薬の製造のための使用。
【請求項４４】
請求項１又は１３記載の化合物の、異常増殖細胞を含む細胞集団における異常な細胞増殖の阻害用医薬の製造のための使用。
【請求項４５】
請求項１又は１３記載の化合物の、チェックポイントキナーゼ１の阻害が治療的に利点がある症状の治癒的又は予防的治療のための細胞内医薬の製造のための使用。
【請求項４６】
（ａ）請求項１又は１３の化合物を含有する医薬組成物と、（ｂ）この組成物が異常な細胞増殖を伴う適応症の治療に有用であることを記載する添付文書と、（ｃ）容器と、を備えるヒト治療用製品。
【請求項４７】
（ａ）請求項１又は１３の化合物を含有する医薬組成物と、（ｂ）この組成物がＤＮＡ損傷又はＤＮＡ複製に関連する適応症の治療における化学療法薬又は放射線治療薬として有用であることを記載する添付文書と、（ｃ）容器と、を備えるヒト治療用製品。
【公表番号】特表２００８−５３５８３０（Ｐ２００８−５３５８３０Ａ）
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０４３３７（Ｐ２００８−５０４３３７）
【出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１１５８４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０５２６２
【国際公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【出願人】（３９８０７２１６０）イコス・コーポレイション (10)
【氏名又は名称原語表記】ＩＣＯＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１１５８４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０５２６２
【国際公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【出願人】（３９８０７２１６０）イコス・コーポレイション (10)
【氏名又は名称原語表記】ＩＣＯＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]