ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答を予測またはモニタリングする方法
本発明は、患者由来の生体液サンプルを準備する段階；前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；およびＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階を含むＥｒｂＢ受容体突然変異の検出方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥｒｂＢ受容体薬、例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするゲフィチニブに対する患者の応答を予測またはモニタリングする方法に関するものである。この方法は、血清などの生体液において低濃度で生じるゲノムＤＮＡ中の突然変異についての、感受性が高く、特異的なスクリーニングを提供するものである。この方法は、ＥｒｂＢチロシンキナーゼ受容体活性を増加することが知られており、ＥｒｂＢ受容体薬治療に対する応答と相関するように思われる突然変異を検出する上で好適である。
【背景技術】
【０００２】
ＥｒｂＢ受容体は、ＴＫスーパーファミリー（そのメンバーは細胞の増殖および生存を制御するシグナル伝達経路を調節する）に属するタンパク質チロシンキナーゼ（ＴＫ）である。ＥｒｂＢファミリーの受容体は、４種類の関連の深いサブタイプ、すなわちＥｒｂＢ１（上皮成長因子受容体［ＥＧＦＲ］）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）からなる（非特許文献１）。
【０００３】
ＥＧＦＲからのシグナル伝達は例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）などの成長因子の結合によって誘発され、ＥＧＦＲ分子の二量体化またはＨＥＲ２／ｎｅｕなどの他の関連性の強い受容体とのヘテロ二量体化を生じる。これらの受容体のチロシンキナーゼドメインを介した自身の自己リン酸化およびトランスリン酸化によって、下流エフェクターの補充および増殖シグナルおよび細胞生存シグナルの活性化が生じる（非特許文献２）。突然変異によって過剰発現または活性化されると、ＥｒｂＢ受容体ＴＫは、乳癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌、頭部および頸部の癌、ならびに他の多くの固形腫瘍の発達に導く可能性がある（非特許文献３）。ＥＧＦＲは、非小細胞肺癌および多くの他の上皮癌の４０〜８０％で過剰発現される（非特許文献４）。抗癌療法は、そのような遺伝子の産生物を標的化して、その活性を阻害するよう設計されてきた。例えば、ゲフィチニブという薬剤は、ＥｒｂＢ１などのＥＧＦＲファミリーのチロシンキナーゼ酵素の強力な阻害薬であり、手術不可能なまたは再発性のＮＳＣＬＣの治療について、２００２年７月５日に日本で承認された。
【非特許文献１】Cell, 2000; 103: 211-225
【非特許文献２】Exp. Cell. Res. 2003; 284: 31-53
【非特許文献３】Exp. Cell. Res. 2003; 284: 122-130
【非特許文献４】N. Engl. J. Med. 2004; 350(21): 2129-2139
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
患者の処方薬に対する応答は、それがどの程度良好に作用するか（その効能）およびそれに対する有害反応（副作用）の両方に関して変動するものである。ゲフィチニブの場合、患者は、急速かつ多くの場合で劇的な臨床応答を有する患者の約１０％の群を含めて、チロシンキナーゼ阻害薬治療に対して異なる応答を示す（N. Engl. J. Med. 2004; 350(21): 2129-2139）。従って、薬剤に応答する患者を治療前に確認し、さらにはその薬剤に応答している患者を治療後に確認して、医薬をより効率的に標的化に用いることができるようにする必要がある。
【０００５】
最近、非小細胞肺癌患者のサブグループがＥＧＦＲ遺伝子において特異的突然変異を有し、それがチロシンキナーゼ阻害薬であるゲフィチニブに対する臨床的応答性と相関しているようであることが発見された（Science 2004; 304: 1497-1500）。これらの突然変異によって、増殖因子のシグナル伝達の増加が生じ、その阻害薬に対する感受性が得られる。肺癌でそのような突然変異についてのスクリーニングを行うことで、ゲフィチニブに対する応答を有する患者を確認できるものと思われる（J. Clin. Oncol. 23; 2493-2501）。しかしながら、現在までのところ、確実に突然変異を測定できる唯一の方法は、患者由来の腫瘍生検を行うことによる固形腫瘍サンプルの分析によるものである。これは困難な手法であり、患者にとっては非常に不快であり、腫瘍を手術できない時には実施不可能である場合がある。
【０００６】
突然変異について患者をスクリーニングする上での別の問題は、非常に多くの野生型遺伝子の中で突然変異遺伝子を検出することが困難であるという点である。これは当業界で公知の問題であり、低濃度での突然変異ＤＮＡの確認が腫瘍の早期検出のために、または早期の段階で患者にとって適切な治療方針を確認する上で重要であり得ることを考慮すると特に重要である（Clin Cancer Res. 2004;10(7):2379-85）。従って、例えば非常に有効であるがわずかな比率の患者にしか効果がない可能性がある治療法を患者に始める前に、侵襲性が比較的小さく、より信頼性が高い、ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答をモニターおよび予測する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、患者から採取した生体液サンプルでＥｒｂＢ受容体突然変異を確実に検出する方法を見出した。この方法は、ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答または延命効果を予測するために用いることができる。特に、ＥｒｂＢ受容体のチロシンキナーゼ活性を変える突然変異の存在は、患者が薬剤に対して正の応答をする可能性のあることを示しており、それに対して野生型対立遺伝子のみの存在は、患者がＥｒｂＢ受容体薬に対して応答しない可能性があることを示している。
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；および
（ｃ）前記受容体における１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含むＥｒｂＢ突然変異の検出方法が提供される。
【０００９】
好ましくは、上記のＥｒｂＢ突然変異の検出方法は、ＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える該受容体中の１以上の突然変異の検出を含む。
【００１０】
最も好ましくは、前記方法におけるＥｒｂＢ受容体はＥＧＦＲである。
【００１１】
本発明者らは、患者の生体液サンプルにおける突然変異の測定を用いて、イン・ビボでＥｒｂＢ受容体薬の効果について予測およびモニタリングを行うことが可能であることを見出した。
【００１２】
好ましい態様では、本発明は、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；
（ｃ）ＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含む、ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答を予測する方法を提供する。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；
（ｃ）ＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含む、ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答をモニタリングする方法が提供される。
【００１４】
当業者には明らかなように、ＥｒｂＢ受容体薬に対する応答をモニタリングすることで、該薬剤の投与をすでに行っている患者の応答を評価することができる（すなわち治療後の患者に利用される）。しかしながら、応答の予測は、ＥｒｂＢ受容体薬に曝露されていない患者で、及び治療前に行う。
【００１５】
別の実施形態では、前記方法は、上記の各段階を含み、ＥｒｂＢ受容体薬に対する癌患者の応答の予測が、その患者に対する延命効果を予測するものである。
【００１６】
好ましくは、上記のＥｒｂＢ薬剤に対する応答の予測方法は、
（ｄ）突然変異型および野生型の両方の対立遺伝子が検出される患者は、ＥｒｂＢ受容体薬に対して陽性の応答をし、野生型の対立遺伝子のみが検出される患者は該薬剤に対して陽性の応答をしないと結論づける段階
をさらに含む。
【００１７】
別の実施形態では、上記のスクリーニング方法は、単一塩基突然変異、小さなインフレーム欠失または塩基置換を検出する対立遺伝子特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応の使用を含むものである。
【００１８】
好ましくは、前記スクリーニング方法は、単一塩基突然変異、小さなインフレーム欠失または塩基置換を検出する対立遺伝子特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイム−ＰＣＲ）の使用を含む。
【００１９】
さらに別の実施形態において、ＥｒｂＢ薬剤に対する応答の予測方法は、上記の通りであるが、第１のプライマー対を用いて野生型対立遺伝子を検出し、第２のプライマー対を用いて突然変異体対立遺伝子を検出し；各プライマー対のうちの一方のプライマーが、
（ａ）特定の突然変異に特異的な対立遺伝子である末端３′ヌクレオチドを有するプライマー；および
（ｂ）そのプライマーの３′末端での可能な追加のミスマッチ
を含む。
【００２０】
好ましくは、上記の各プライマー対における一方のプライマーは、
（ａ）プライマー配列および標的配列に特異的なさらなる配列の両方を含む単一分子または核酸二本鎖プローブ；
（ｂ）前記単一分子または核酸二本鎖内のクエンチャー分子の非常に近位にある前記プローブの５′末端に結合した蛍光レポーター色素；
（ｃ）前記プローブの一端にある１以上の非コードヌクレオチド残基；
をさらに含み；
（ｄ）前記レポーター色素およびクエンチャー分子は、前記標的配列の増幅時に分離されるようになる。
【００２１】
有利には、前記プローブはＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブである。
【００２２】
好ましくは、本発明による方法は、野生型配列のレベルの１０％で存在する突然変異体配列を検出することができる技術を用いるものである。より好ましくは、前記技術は、野生型配列のレベルの９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％または０．０１％の突然変異体配列を検出することができる。
【００２３】
上記の蛍光プローブシステムは、増幅した標的に結合するのに別個のプローブを必要とせず、他の系より迅速かつ効率的に検出が行われるという利点を有する。本発明は、ＡＲＭＳ増幅システムにおけるスコルピオン（登録商標）プライマーの使用によって、ＥＧＦＲ突然変異の検出に用いられる方法の感度が高められることを示している（実施例４参照）。
【００２４】
好ましくは上記の方法に記載の生体液は、血液、血清、血漿、汗または唾液のうちのいずれかである。有利には、前記生体液は血清である。
【００２５】
ＥＧＦＲ突然変異とＮＳＣＬＣ進行との間の相関を見る既報の試験のほとんどが、回顧的試験のために治療開始後に採取した手術切除腫瘍サンプルでそのような突然変異を示している。しかしながら、初期段階で患者から手術できないＮＳＣＬＣ腫瘍をサンプリングすることが困難であることが、治療開始前に患者を選択する可能性のある前向き試験の実施の試みにおいて障害となっていた。
【００２６】
しかしながら本発明は、腫瘍標本以外の癌患者のサンプルから突然変異体ＥＧＦＲを検出する方法を提供する。生体液のサンプリングは、癌患者におけるＥＧＦＲ突然変異の過去の分析方法より侵襲性が低い。腫瘍検体の採取とは対照的に、血清サンプルは例えば、容易に採取することができ、試験を繰り返すことができる。さらに腫瘍細胞は、血行中にＤＮＡを放出し、それが血清および血漿中で豊富となることで、癌患者の血清ＤＮＡでの突然変異およびマイクロサテライト変化を検出可能にすることが知られている（Cancer Res. 1999;59(1):67-70）。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態では、ＥｒｂＢ受容体薬はＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ阻害薬である。好ましくは、ＥｒｂＢ受容体薬はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である。好ましい方法では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬は、ゲフィチニブ、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ、ＯＳＩ−７７４、ＣＰ−３５８７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２（ＷＡＹ−１７７８２０）、ラパチニブ（ＧＷ２０１６、ＧＷ−５７２０１６、ＧＳＫ５７２０１６）、カネルチニブ（ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ）（ＣＩ−１０３３、ＰＤ１８３８０５）、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ５５９９６２６、ＺＤ６４７４（ＺａｃｔｉｍａＴＭ）またはＷＯ２００４／００６８４６もしくはＷＯ２００３／０８２２９０に開示のいずれかの化合物からなる群から選択される。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、ＥｒｂＢ受容体薬はＥＧＦＲ阻害薬である。好ましくは、ＥＧＦＲ阻害薬は、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｃ２２５）、マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ／ｒＨｕＭＡｂ−ＥＧＦＲ）、ＭＲ１−１、ＩＭＣ−１１Ｆ８またはＥＧＦＲＬ１１からなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である。
【００２９】
好ましくは、前記いずれの方法も、単独療法として、または他薬剤との併用で使用されるＥｒｂＢ受容体薬を含む。
【００３０】
最も好ましい実施形態では、ＥＦＧＲチロシンキナーゼ阻害薬は、ゲフィチニブ、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ、ＯＳＩ−７７４、ＣＰ−３５８７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２（ＷＡＹ−１７７８２０）、ラパチニブ（ＧＷ２０１６、ＧＷ−５７２０１６、ＧＳＫ５７２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３、ＰＤ１８３８０５）、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ５５９９６２６、ＺＤ６４７４（ＺａｃｔｉｍａＴＭ）またはＷＯ２００４／００６８４６もしくはＷＯ２００３／０８２２９０に開示のいずれかの化合物からなる群から選択される。
【００３１】
本発明における突然変異は、核酸の挿入、欠失または置換として生じることが認められる。突然変異は、好ましくは、ＥｒｂＢ受容体のチロシンキナーゼドメインで起こる。好ましくは、突然変異は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインで起こる。好ましくは、突然変異は、表５に挙げたＥＧＦＲ突然変異の群から選択される。有利には、突然変異は、ＥＧＦＲのエキソン１８、１９、２０または２１におけるＡＴＰ結合部位周囲に集まっている。好ましくは、突然変異は、表５に挙げたＥＧＦＲ突然変異の群から選択される。最も好ましい実施形態では、突然変異はＥＧＦＲのエキソン１９におけるＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌおよびエキソン２１におけるＬ８５８Ｒである。
【００３２】
ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１における約３０種の突然変異が、肺腫瘍標本において検出されている。腫瘍標本で検出されたＮＳＣＬＣ関連のＥＧＦＲ突然変異の中で、エキソン１９における１５ｂｐヌクレオチドインフレーム欠失（Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ）およびエキソン２１におけるコドン８５８でのアルギニンによるロイシンの置換である点突然変異（Ｌ８５８Ｒ）が、これら突然変異の約９０％を占める（Cancer Res. 2004;64:8919-8923, Proc. Natl. Acad. Sci USA 2004;101:13306-13311）。
【００３３】
有利には、患者は、白血病、多発性骨髄腫またはリンパ腫などの非固形腫瘍、および例えば胆管、骨、膀胱、脳／ＣＮＳ、神経膠芽腫、乳房、結腸直腸、子宮頚部、子宮内膜、胃、頭部および頚部、肝臓、肺、筋肉、神経、食道、卵巣、膵臓、胸膜／腹膜、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮および外陰部の腫瘍などの固形腫瘍からなる群から選択される癌をわずらっている。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、上記の方法は、
（ｅ）ＥｒｂＢ受容体の下流シグナル伝達経路の成分における１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
をさらに含む。
【００３５】
本発明の第２の態様は、野生型対立遺伝子を検出するのに用いられる第１のプライマー対、およびＥｒｂＢ受容体の突然変異体対立遺伝子を検出するのに用いられる第２のプライマー対を含む組成物であって、各プライマー対における一方のプライマーは、
（ａ）特定の突然変異に特異的な対立遺伝子である末端３′ヌクレオチドを有するプライマー；および
（ｂ）前記プライマーの３′末端における可能な追加のミスマッチ；
（ｃ）プライマー配列および標的配列に特異的なさらに別の配列の両方を含む単一分子または核酸二本鎖プローブ；
（ｄ）前記単一分子または核酸二本鎖内でクエンチャー分子の非常に近位にある５′末端に結合した蛍光レポーター色素；
（ｅ）前記プローブの一端にある１以上の非コードヌクレオチド残基
をさらに含み、
（ｆ）前記レポーター色素およびクエンチャー分子が前記標的配列の増幅時に分離されるようになる、
前記組成物を包含するものである。
【００３６】
本発明の第３の態様は、ＥｒｂＢ薬剤に対する患者の応答を予測するために生体液で実施されるアッセイにおける、ＥｒｂＢ受容体に特異的なプライマーの使用を含むものである。
【００３７】
好ましくは、上記の使用は、ＥｒｂＢ薬剤に対する患者の応答を予測するために生体液を調べるための組成物の製造を含むものである。
【００３８】
有利には、上記の使用は、
（ａ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階
（ｂ）前記受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
をさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
別段の断りがない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者が共通に理解するものと同じ意味を有する（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学におけるもの）。分子的方法、遺伝子的方法および生化学的方法については、標準的な技術を用いる。概して、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.；ならびにGuthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.), McPherson et al., PCR Volume 1 N.Y.), およびGene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.)(これらの文書は、参照によって本明細書に組み込まれる), Oxford University Press, (1991), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.), およびGene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E
. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.を参照されたい。これらの文書は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４０】
生物マーカー
医学的状態および毒物学的状態への生化学および分子生物学の応用を通じて、生物カーカーと称される各種の生物学的マーカーが確認および研究されてきた。生物マーカーは、組織および生体液の両方で発見することができ、血液が生物マーカーの研究で用いられる最も一般的な生体液である（Proteomics 2000;1:1-13, Physiol. 2005;563:23-60）。
【００４１】
生物マーカーは、「正常な生物学的プロセス、発病プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答、の指標として客観的に測定および評価される特徴」と説明することができる。生物マーカーは、生物マーカーの存在もしくはレベルと症状もしくは疾患の何らかの側面（症状もしくは疾患の存在、そのレベルもしくはそのレベルの変化、その種類、その段階、それに対する感受性、あるいは症状もしくは疾患の治療に用いられる薬剤に対する応答性など）との間に相関がある場合に、特定の症状または疾患に関連する同定可能かつ測定可能な指標である。その相関は、定性的、定量的または定性的と定量的の両方であることができる。代表的には、生物マーカーは、化合物、化合物断片または化合物群である。そのような化合物は、タンパク質（およびペプチド）、核酸および他の化合物などの、生物で認められるかまたは生物が産生する化合物であることができる。
【００４２】
生物マーカーは、予測力を有する場合があり、それ自体、特定の症状もしくは疾患の存在、レベル、種類もしくは段階（特定の微生物もしくは毒物の存在またはレベルを含む）、特定の症状もしくは疾患に対する感受性（遺伝的感受性を含む）、または特定の治療（薬物治療を含む）に対する応答、を予測または検出するのに用いることができる。生物マーカーは、研究および開発プログラムの効率を改善することで、将来の創薬および薬剤開発においてますます重要な役割を果たすものと考えられる。生物マーカーは、診断剤、疾患進行のモニター、治療のモニターおよび臨床的結果の予測因子として用いることができる。例えば、各種の生物マーカー研究プロジェクトによって、特定の癌ならびに特定の心血管疾患および免疫疾患のマーカーの確認が試みられている。
【００４３】
本明細書で使用される「ＥｒｂＢ受容体薬」という用語は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ）、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４などのｅｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼに対して作用する薬剤を含むものである。１実施形態において、ＥｒｂＢ受容体薬はＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ阻害薬である。別の実施形態では、ＥｒｂＢ受容体薬はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である。ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害薬の例には、ゲフィチニブ、エルロチニブ（ＯＳＩ−７７４、ＣＰ−３５８７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２（ＷＡＹ−１７７８２０）、ラパチニブ（ＧＷ２０１６、ＧＷ−５７２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３、ＰＤ１８３８０５）、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ５５９９６２６、またはＷＯ２００４／００６８４６、ＷＯ２００３／０８２８３１もしくはＷＯ２００３／０８２２９０に開示のいずれかの化合物などがあるが、これらに限定されるものではない。特に、ゲフィチニブ（ＩｒｅｓｓａＴＭとも称され、コード番号ＺＤ１８３９およびＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｎｕｍｂｅｒ １８４４７５−３５−２で知られる）が、国際特許出願ＷＯ９６／３３９８０に開示されており、ＥｒｂＢ１などの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのチロシンキナーゼ酵素の強力な阻害薬である。
【００４４】
別の実施形態では、ＥｒｂＢ受容体薬は、例えばセツキシマブ（Ｃ２２５）、マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ／ｒＨｕＭＡｂ−ＥＧＦｒ）、ＭＲ１−１、ＩＭＣ−１１Ｆ８またはＥＧＦＲＬ１１のうちの１つなど、抗ＥＧＦＲ抗体である。本明細書で言及されるＥｒｂＢ受容体薬は、単独療法として、あるいは同じ種類または異なる種類の他の薬剤との併用で用いることができる。特定の実施形態では、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害薬はゲフィチニブである。
【００４５】
「生存期間」とは、患者の「全生存期間」および「無増悪生存期間」を包含するものである。「全生存期間」（ＯＳ）とは、ゲフィチニブ投与の開始から何らかの原因による死亡までの時間と定義される。「無増悪生存期間」（ＰＦＳ）は、ゲフィチニブ投与の開始から進行性疾患の最初の発現または何らかの原因による死亡までの時間と定義される。
【００４６】
「応答」とは、部分的応答もしくは安定した疾患を示す患者および進行性疾患の徴候を示す患者という２つの主要な群への患者の分類を含む「固形腫瘍における応答評価基準」（ＲＥＣＩＳＴ）に従って得られる測定値によって定義される。
【００４７】
「増幅」反応は、非標的核酸より多くの標的核酸の特異的増幅を生じる核酸反応である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は周知の増幅反応である。
【００４８】
「癌」は本明細書においては、腫瘍性表現型への細胞転換から生じる腫瘍増殖を指すのに用いられる。そのような細胞転換には多くの場合、遺伝子突然変異が関与し、本発明の関連では、転換には、本明細書に記載の１以上のＥｒｂ遺伝子の変化による遺伝子突然変異が関与する。
【００４９】
「プローブ」という用語は、検出対象の対立遺伝子の標的配列に対して正確に相補的である配列を有する一本鎖配列特異的オリゴヌクレオチドを指す。
【００５０】
「プライマー」という用語は、複製される核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物の合成のための開始点として作用することができる一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列または特異的プライマーを指す。プライマーの長さおよび配列は、これらが伸長産物の合成を開始（prime）できるようなものでなければならない。
【００５１】
本願は、ＥｒｂＢ核酸突然変異体を記載する。本明細書で使用される「ＥｒｂＢ受容体突然変異体」という用語は、ＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ受容体のメンバーのいずれかをコードする核酸を指すのに用いられる。そこで、「ＥｒｂＢ受容体」という用語は、全ての公知のヒトＥｒｂＢ受容体の相同体および変異体、ならびにＥｒｂＢ受容体の相同体と同定されるのに十分なＥｒｂＢ受容体ファミリーメンバーに対する相同性を示す他の核酸分子を包含するものである。好ましくは、ＥＧＦＲは、配列番号１として示されるＥＧＦＲの配列を有する核酸と同定される。
【００５２】
「核酸」という用語は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、上記で同定された天然核酸とハイブリダイズできるポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｐｇ／ｍｌの変性・剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩のインキュベーション、その後の０．１ｘＳＳＣ中、約６５℃でのフィルター洗浄を指す。
【００５３】
核酸の検出方法
本発明の関連で、ＥｒｂＢ受容体をコードする突然変異核酸の検出を用いて、薬剤治療に対する応答を予測することができる。通常はＥｒｂＢ受容体遺伝子における突然変異はＤＮＡレベルで起こることから、本発明のその方法は、ゲノムＤＮＡ、ならびに転写物およびタンパク質自体における突然変異の検出に基づくものであることができる。転写物および／またはポリペプチドの分析によってゲノムＤＮＡ中の突然変異を確認することで、検出された突然変異が被験者において実際に発現されることを確認することが望ましいものとなり得る。
【００５４】
ゲノム核酸中での突然変異は、有利には、増幅核酸断片における移動度シフトに基づく技術によって検出される。例えばチェンらの報告（Chen et al., Anal Biochem 1996 Jul 15;239(1):61-9）には、競合移動度シフトアッセイによる単一塩基突然変異の検出が記載されている。さらに、マルセリノら（Marcelino et al., BioTechniques 26(6): 1134-1148 (June 1999)）の技術に基づくアッセイが市販されている。
【００５５】
好ましい例では、キャピラリーヘテロ二本鎖分析を用いて、ミスマッチの存在の結果によるキャピラリーシステムにおける二本鎖核酸の移動度シフトに基づいて突然変異の存在を検出することができる。
【００５６】
サンプルからの分析用の核酸の生成には、核酸増幅が必要である。多くの増幅方法は、酵素連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応または自立配列複製など）に基づくものであるか、それがクローニングされているベクターの全て又は一部の複製からのものである。好ましくは、本発明による増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応によって示される指数関数的増幅である。
【００５７】
多くの標的およびシグナル増幅方法が、文献に記載されており、例えばランデグレンらの報告（Landegren, U., et al., Science 242:229-237 (1988)）およびルイスの報告（Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990)）に、これらの方法の概説がある。これらの増幅方法は本発明の方法で用いることができ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、イン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）のＰＣＲ、リガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）、リガーゼハイブリダイゼーション、Ｑベータ・バクテリオファージ・レプリカーゼ、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、転写産物配列決定を伴うゲノム増幅（ＧＡＷＴＳ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）およびイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションなどがある。各種増幅技術での使用に好適なプライマーは、当業界で公知の方法に従って製造することができる。
【００５８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲは、特に、米国特許第４６８３１９５号および４６８３２０２号に記載された核酸増幅方法である。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼが引き起こすプライマー伸長反応の繰り返しサイクルからなる。標的ＤＮＡを熱変性し、増幅されるＤＮＡの反対の鎖上で標的配列を挟む２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによる使用のためのプライマーとなる。ＤＮＡはプライマー伸長によって複製され、両方の鎖の第２コピーを生じる。熱変性、プライマーハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルを繰り返すことで、標的ＤＮＡを約２〜４時間で百万倍以上に増幅させることができる。ＰＣＲは、増幅の結果を測定する検出技術と組み合わせて使用しなければならない分子生物学的手段である。ＰＣＲの利点は、約４時間で標的ＤＮＡの量を百万〜１０億倍に増幅することで、それが感度を増加する点である。ＰＣＲを用いて、診断の関連であらゆる公知の核酸を増幅することができる（Mok et al., (1994), Gynaecologic Oncology, 52: 247-252）。
【００５９】
自立配列複製（３ＳＲ）
自立配列複製（３ＳＲ）は、酵素カクテルおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーが介在する逆転写酵素（ＲＴ）活性、ポリメラーゼ活性およびヌクレアーゼ活性の順次サイクルを介した核酸鋳型の等温増幅が含むＴＡＳの変形である（Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）。ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖のＲＮＡの酵素分解を熱変性に代えて用いる。ＲＮａｓｅＨおよび他の全ての酵素を反応液に加え、全ての段階を同じ温度で行い、それ以上の試薬添加は行わない。このプロセス後に、４２℃１時間で、１０６〜１０９の増幅が達成されている。
【００６０】
ライゲーション増幅（ＬＡＲ／ＬＡＳ）
ライゲーション増幅反応またはライゲーション増幅システムは、ＤＮＡリガーゼおよび４種のオリゴヌクレオチド（標的鎖当たり２種）を用いる。この技術は、ウーら（Wu, D. Y. and Wallace, R. B. (1989) Genomics 4:560）が記載している。オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ上の隣接する配列にハイブリダイズし、リガーゼによって連結される。反応液を熱変性し、サイクルを繰り返す。
【００６１】
Ｑβレプリカーゼ
この技術では、リザルディらの報告（Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197）に記載されるように、一本鎖ＲＮＡを複製するバクテリオファージＱβ用のＲＮＡレプリカーゼを用いて、標的ＤＮＡを増幅する。最初に、標的ＤＮＡを、Ｔ７プロモーターおよびＱβ５′配列領域を含むプライマーにハイブリダイズさせる。このプライマーを用いると、このプロセスで逆転写酵素がプライマーをその５′末端に結合するｃＤＮＡを生成する。これらの２段階はＴＡＳプロトコールに類似している。得られるヘテロ二本鎖を熱変性する。次に、Ｑβ３′配列領域を含む第２のプライマーを用いて、ｃＤＮＡ合成の第２回目を開始する。これによって、Ｑβバクテリオファージの５′末端および３′末端の両方ならびに活性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含む二本鎖ＤＮＡが得られる。次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、二本鎖ＤＮＡを、Ｑβを模倣する新たなＲＮＡに転写する。十分に洗浄して、ハイブリダイズされていないプローブを除去した後、前記の新たなＲＮＡを標的から溶出し、Ｑβレプリカーゼによって複製する。後者の反応によって、約２０分で１０７倍の増幅が生じる。
【００６２】
代替の増幅技術を本発明で利用することができる。例えば、ローリング・サークル増幅（Lizardi et al., (1998) Nat Genet 19:225）は、ＤＮＡポリメラーゼによって駆動され、等温条件下で直線的反応速度または幾何学的反応速度のいずれかで環状オリゴヌクレオチドプローブを複製することができる市販の（ＲＣＡＴＴＭ）増幅技術である。
【００６３】
２つの好適に設計されたプライマーの存在下で、ＤＮＡの置換および超分岐を介して幾何学的増幅が起こることで、１時間で各サークルの１０１２以上のコピーが生じる。
【００６４】
単一プライマーを用いる場合、ＲＣＡＴによって数分で、標的が共有結合により直列的に結合した数千の標的のＤＮＡコピーの直鎖が生じる。
【００６５】
さらに別の技術である鎖置換増幅（ＳＤＡ；Walker et al., (1992) PNAS (USA) 80:392）は、特定の標的に特有の具体的に定義された配列で開始する。しかし、熱サイクルに基づく他の技術とは異なり、ＳＤＡは一連のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび制限酵素を利用して、特有の核酸配列を指数関数的に増幅させる等温プロセスである。
【００６６】
ＳＤＡは、標的生成段階および指数関数的増幅段階の両方を含む。
【００６７】
標的生成では、二本鎖ＤＮＡを熱変性して、２つの一本鎖コピーを作る。一連の特別に製造されたプライマー（塩基配列をコピーするための増幅プライマーと新たに作られた鎖を置換するためのバンパープライマーと）をＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて、指数関数的増幅が可能な改変標的を形成する。
【００６８】
指数関数的増幅プロセスは、標的生成段階からの改変標的（制限酵素認識部位を有する一本鎖部分ＤＮＡ鎖）で開始する。
【００６９】
増幅プライマーを、その相補ＤＮＡ配列で各鎖に結合させる。次に、個々のヌクレオチドを添加するための鋳型として改変標的を用い、ＤＮＡポリメラーゼがその3’末端からプライマーを伸長する位置を同定するためにプライマーを利用する。こうして、伸長したプライマーが、各末端で完全な制限酵素認識部位を含む二本鎖ＤＮＡセグメントを形成する。
【００７０】
次に、制限酵素を、二本鎖ＤＮＡセグメントにその認識部位に結合させる。制限酵素は、両側セグメントの一方の鎖のみを開裂させ、ニックを形成させた後に認識部位から解離する。ＤＮＡポリメラーゼがそのニックを認識し、その部位から鎖を伸長させて、予め形成された鎖に取って代わる。そうして認識部位は、制限酵素およびＤＮＡポリメラーゼによって、標的セグメントを含むＤＮＡ鎖の連続的な置換と共に、繰り返しニック形成および復元がなされる。
【００７１】
その後、各置換された鎖は、上記の増幅プライマーとアニーリングするのに利用可能である。そのプロセスは、新たなＤＮＡ鎖の反復的なニック形成、伸長および置換とともに継続して、元のＤＮＡ標的の指数関数的増幅を生じる。
【００７２】
核酸が増幅されれば、単一塩基対突然変異の検出に多くの技術が利用可能である。そのような技術の一つは、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）である。ＳＣＣＰ検出は、電気泳動中に、参照ＤＮＡと比較した一本鎖突然変異ＤＮＡの異常移動に基づくものである。突然変異は、一本鎖ＤＮＡにおける高次構造変化を生じさせて、移動度シフトを生じる。蛍光ＳＣＣＰは、蛍光標識プライマーを用いて検出を補助するものである。したがって、参照および突然変異体ＤＮＡを、蛍光標識プライマーを用いて増幅する。その増幅ＤＮＡを変性および急冷（snap-cooled）して一本鎖ＤＮＡ分子を生成し、それを未変性ゲル電気泳動によって調べる。
【００７３】
化学的ミスマッチ開裂（ＣＭＣ）は、ヒドロキシルアミン、四酸化オスミウムおよびピペリジンの組み合わせによるＤＮＡミスマッチ塩基対の認識および開裂に基づくものである。従って、参照ＤＮＡと突然変異体ＤＮＡの両方を、蛍光標識プライマーを用いて増幅する。アンプリコンをハイブリダイズさせて、次にミスマッチＴ塩基に結合する四酸化オスミウム、またはミスマッチＣ塩基に結合するヒドロキシルアミンを用いて開裂させ、その後、ピペリジンによって修飾塩基の部位で開裂を行う。次いで、開裂断片を電気泳動によって検出する。
【００７４】
制限断片多型（ＲＦＬＰ）に基づく技術も用いることができる。多くの一塩基多型（ＳＮＰ）で従来のＲＦＬＰ分析ができないが、プライマー誘導型制限分析ＰＣＲ（ＰＩＲＡ−ＰＣＲ）を用いることで、ＰＣＲプライマーを用いてＳＮＰ依存的に制限部位を導入することができる。好適な制限部位を導入するＰＩＲＡ−ＰＣＲ用のプライマーは、キシアイイらの報告（Xiaiyi et al., (2001) Bioinformatics 17:838-839）に記載のコンピュータ分析によって設計することができる。
【００７５】
さらに、ＷＡＶＥ分析に基づく技術を用いることができる（Methods Mol. Med. 2004;108:173-88）。このＤＮＡ断片分析システムを用いて、一塩基多型を検出することができ、このシステムは温度変調型液体クロマトグラフィーおよび高分解能マトリクスに基づくものである（Genet Test. 1997-98;1(3):201-6）。
【００７６】
リアルタイムＰＣＲ（定量ＰＣＲ、リアルタイム定量ＰＣＲまたはＲＴＱ−ＰＣＲとも称される）は、同時ＤＮＡ定量および増幅の方法である（Expert Rev. Mol. Diagn. 2005(2):209-19）。ポリメラーゼ連鎖反応によってＤＮＡを特異的に増幅する。各増幅ラウンド後に、ＤＮＡを定量する。一般的な定量方法には、相補ＤＮＡとハイブリダイズした時に蛍光を生じる修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド（プローブと称される）および二本鎖ＤＮＡに挿入する蛍光色素の使用などがある。
【００７７】
高感度で迅速なＤＮＡ増幅系のために「Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマー」と称される特異的プライマーを用いることができる。そのようなプライマーは、プローブを単一分子で特異的標的配列と組み合わせて、単分子反応速度（unimolecular kinetics）の蛍光検出系を生じる（Nucl. Acids Res. 2000;28:3752-3761）。これは、増幅標的に結合するのに別個のプローブを必要とせず、検出をより迅速かつより効率的にするという点で、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｅａｃｏｎｓおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）などの他の蛍光プローブ系に勝る長所を有する。これら３種類の検出方法の直接比較（Nucl. Acids Res 2000;28:3752-3761）から、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（登録商標）が、特に迅速なサイクル条件下で、細胞間プロービング系より性能が良好であることがわかる。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーのあるバージョンの構造は、対象標的に特異的なプローブ配列に隣接する約６個の塩基の相補ステム配列によってヘアピンループ配座に保持されるものである（Nat. Biotechnol. 1999;17:804-807）。ステムは、蛍光レポーター色素（５′末端に結合）を一緒にクエンチャー分子に非常に近接した位置に配置する働きも有する。この配座では、シグナルは生じない。ＰＣＲブロッカーが、プライマー配列からヘアピンループを分離して、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）の３′末端を形成する。このブロッカーは、特異的標的の非存在下でヘアピンループのアンフォールディングを生じると考えられるリードスルーを防止する。ＰＣＲ中、プライマーから通常の通り伸長が起こる。その後の変性段階およびアニーリング段階後に、ヘアピンループがほどけ、正しい産物が増幅されていた場合は、プローブ配列が、新たに合成された鎖上でプライマーの下流にある特異的標的配列に結合する。この新しい構造は、元のヘアピンループより熱力学的に安定である。蛍光色素がクエンチャーの非常に近位にはすでに存在しないことから、この時点で蛍光シグナルが生じる。この蛍光シグナルは、標的ＤＮＡの量に正比例する。
【００７８】
代替のＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーは、２つの相補的な標識オリゴヌクレオチドの二本鎖を含む。この二本鎖の一方のオリゴヌクレオチドは、５′末端レポーター色素で標識されており、ブロッカー非コードヌクレオチドおよびＰＣＲプライマー要素の両方を有しており、他方のオリゴヌクレオチドは３′末端クエンチャー色素で標識されている。そして、作用機序は上記のＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）ヘアピンプライマーと本質的に同じであり、リアルタイム定量ＰＣＲ中に、５′末端レポーターおよび３′末端クエンチャー色素が互いに分離されて、蛍光発光に有意な増加を生じる。
【００７９】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（登録商標）は、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲＭＳ）（Nucl. Acids Res. 1989;17:2503-2516, Nat. Biotechnol. 1999;17:804-807）と併用して、一塩基突然変異の検出を可能にすることができる。適切なＰＣＲ条件下で、プライマーの３′末端に位置する一塩基ミスマッチは、完全に適合する対立遺伝子の優先的増殖には十分であることから（Newton et al., 1989）、非常に関連の深い種を区別することができる。上記のプライマーを用いる増幅システムの基礎は、ミスマッチ３′残基を有するオリゴヌクレオチドが適切な条件下でＰＣＲにおけるプライマーとして機能しないということである。この増幅システムにより、アガロースゲル電気泳動後に反応混合物を調べるだけで遺伝子型決定を行うことができる。それは簡易かつ信頼性があり、いずれの対立遺伝子についても、遺伝子座でヘテロ接合体をホモ接合体と明瞭に区別する。ＡＲＭＳでは、制限酵素消化、従来用いられていた対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物の配列解析が必要ない。
【実施例】
【００８０】
実施例１−臨床試験および血清サンプルの採取
本研究は、ゲフィチニブ単独療法についての多施設臨床フェーズＩＩ試験での相関研究として行った。本研究は、ヒト被験者が関与する生物医学研究に関するヘルシンキ宣言の勧告に基づく適切な倫理審査委員会の承認のもとで実施した。ＩＩＩＢ期またはＩＶ期であると組織学的または細胞学的に立証された化学療法を受けたことがないＮＳＣＬＣの日本人患者を、本試験に登録した。ゲフィチニブを、２５０ｍｇ／日の固定用量で患者全員に経口投与した。「Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｕｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）」ガイドライン（J. Natl. Cancer Inst. 2000;92:205-216）を用いて、効能を評価した。
【００８１】
患者２８名を、２００２年１０月２３日〜２００３年８月３日に登録した（表１）。患者全員について、応答を評価し、無増悪生存期間および全生存期間の追跡を行った。患者２７名から採血を行ってから（２ｍＬ）、ゲフィチニブ投与を開始した。２７サンプル全てで、１７２０ｎｇ／ｍＬまでの各種濃度で血清ＤＮＡを抽出した。
【００８２】
検体採取およびＤＮＡ抽出。ＮＳＣＬＣ患者２６名から採血を行ってから、ゲフィチニブ投与を開始した。分離した血清を、使用時まで−８０℃で保存した。下記のプロトコール変更を加えてＱｉａｍｐ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（Qiagen, Hilden, Germany）を用い、血清ＤＮＡを抽出し、精製した。サンプル全体が処理されるまで、１本のカラムを繰り返し用いた。得られたＤＮＡを、無菌の２回蒸留緩衝液５０μＬに溶出させた。抽出ＤＮＡの濃度および純度を、分光測光によって求めた。抽出したＤＮＡは、使用時まで−２０℃で保存した。
【００８３】
実施例２−Ｅ７４６Ａ７５０ｄｅｌおよびＬ８５８ＲＥＧＦＲ突然変異を検出するためのＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーおよび増幅不応突然変異系（ＡＲＭＳ）の使用
ＥＧＦＲ ＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭ Ｋｉｔの感度
予備実験を行って、ＥＧＦＲ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｋｉｔの感度を評価する（図１）。１ｐｇ〜１００００ｐｇの容量でＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡを用いた全ての曲線が、４５サイクルに達するまでに増加した（図１ａ）。野生型標準ＤＮＡおよび水を陰性対照として用いた場合、曲線は増加せず、５０サイクルに到達した時点で平坦なままであった（図１ａ）。１００〜１０−５の比で野生標準ＤＮＡを含む希釈Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡを用いると、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌの存在を示した全ての曲線が、４５サイクルに到達するまでに増加した（図１ｂ）。この研究で測定した容量範囲での標準曲線は直線であり、ｒ２値は０．９９７および０．９８７であった。いずれの曲線の傾きもほぼ平行であった（図１ｃ）。野生型ＤＮＡを含む希釈Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡのＣｔは、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡの全ての容量で、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡのみの値に近かった。野生型ＤＮＡを含む希釈Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡのピーク蛍光レベルは、１０−３未満の比率で野生型ＤＮＡ標準を含まない場合より低かったが、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌの存在が明瞭に検出された。１ｐｇまでの量でＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを含むＤＮＡの曲線は、野生型ＥＧＦＲのＤＮＡの混入による影響を受けなかった。ヒト癌細胞株のゲノムＤＮＡを用いた細胞ベースの実験では、ＰＣ−９細胞由来のＤＮＡを用いたシグナルが検出され、Ａ４３１細胞からのものは予想通り検出されなかった（図２）。
【００８４】
本発明者らは、２つの技術、すなわちＡＲＭＳＴＭおよびＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭを併用したＥＧＦＲ ＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭ Ｋｉｔ（DxS Ltd, Manchester, UK）を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応で突然変異を検出した。エキソン１９およびエキソン２１の両方におけるＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ、Ｌ８５８Ｒおよび野生型の検出のための４種類のｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーを設計し、それをＤｘＳ社（DxS Ltd, Manchester, UK）が合成した。Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌおよびＬ８５８Ｒ用のｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーの配列は、ＥＧＦＲについてＧｅｎＢａｎｋに記録されたヒト配列（登録番号：ＡＹ５８８２４６）を基礎とした。反応はいずれも、鋳型ＤＮＡ１μＬ、反応緩衝液混合物７．５μＬ、プライマー混合物０．６ｍＬおよびＴａｑポリメラーゼ０．１ｍＬを用い、容量２５μＬで行った。全ての試薬がこのキットに含まれている。リアルタイムＰＣＲを、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）を以下の条件で用いて実施した：９５℃で１０分間の初回変性、９５℃３０秒、６２℃６０秒の５０サイクル、各サイクル終了後の蛍光読み取り（４８０ｎｍでの光学的励起および５２０ｎｍでの測定が可能なＦＡＭに設定）。データ解析は、Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒソフトウェア（Ｖｅｒ．１．２ｂ）を用いて行った。閾値サイクル（Ｃｔ）は、増殖曲線の最大曲率点を表す二次誘導曲線の最高ピークでのサイクルと定義した。Ｃｔおよび最大蛍光（ＦＩ）の両方を、結果の解釈に用いた。陽性結果は、Ｃｔ≦４５およびＦＩ≧５０と定義した。これらの解析は、各サンプルについて二回行った。Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌの検出についての感度を確認するため、本発明者らはＥＧＦＲ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｋｉｔに含まれる標準ＤＮＡを用いた。１、１０、１００、１０００または１００００ｐｇの容量でＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを含む標準ＤＮＡ、および１００００ｐｇで野生型を含む標準ＤＮＡと１、１０、１００、１０００もしくは１００００ｐｇの容量でＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを含む標準ＤＮＡとの混合物を用いた。定量のために、既知標準のＤＮＡ容量の対数に対してＣｔのサイクル数をプロットすることで、標準曲線を得た。直線相関係数（Ｒ２）値および勾配の式を計算した。陽性対照用のＤＮＡは、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを含むことが知られている日本人の腺癌ＰＣ−９細胞株およびエキソン１９に野生型を含むことが知られているヒト類表皮癌Ａ４３１細胞株から抽出し、それらのＤＮＡ１００００ｐｇを用いた。
【００８５】
ＡＲＭＳによって検出された血清ＤＮＡのＥＧＦＲ突然変異状態
ＮＳＣＬＣ患者２７名由来の血清ＤＮＡのＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌまたはＬ８５８Ｒを調べた。エキソン１９およびエキソン２１の両方における野生型を、全ての血清サンプルから検出した。Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを、１２名の患者のサンプルで検出した。Ｌ８５８Ｒは１名の患者で検出された（表２）。合計で、ＥＧＦＲ突然変異は、患者２７名のうち１３名で検出された（４８．１％）。本来の腫瘍の組織学的サブタイプを、血清中にＥＧＦＲ突然変異を有する患者２３名において表３ａにまとめた。２３名の腺癌患者の２３症例のうちの１１症例（４７．８％）、扁平上皮細胞癌の２症例のうちの１症例および大細胞癌の２症例のうちの１症例が、ＥＧＦＲ突然変異に関して陽性であった。ＥＧＦＲ突然変異状態は、組織学的タイプと統計的に相関していなかった。ＥＧＦＲ突然変異は、男性患者の場合より女性患者由来のサンプルにおいてより高頻度で検出された（１０名中７名；７０％対１７名中６名；２９．４％、表３ｂ）。
【００８６】
血清におけるＥＧＦＲ突然変異状態およびゲフィチニブに対する応答
ＥＧＦＲ突然変異は、進行性疾患患者由来のサンプル（ＰＤ、１０症例中２症例、１８％）より、部分的応答（ＰＲ）または安定疾患（ＳＤ）を示した患者由来のサンプル（１７症例中１１症例、７５％）において有意に高頻度で認められた（ｐ＝０．０４６、フィッシャーの直接確率検定、表３ｃ）。
【００８７】
実施例３：血清におけるＥＧＦＲ突然変異状態および生存期間に対する影響
統計解析。フィッシャーの直接確率検定を用いて、性別、腫瘍型およびゲフィチニブに対する応答などの異なる特徴を有するＮＳＣＬＣ患者においてＥＧＦＲ突然変異の存在を比較した。ゲフィチニブに対する応答の解析に関しては、患者をＲＥＣＩＳＴ基準に応じて部分的応答または安定疾患（ＰＲ／ＳＤ）と進行性疾患（ＰＤ）の２つの群に分類した。本発明者らは、標準的なログランク検定を用いて、全生存期間および無増悪生存期間に関してＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を比較した。全生存期間（ＯＳ）は、ゲフィチニブ投与開始から何らかの原因による死亡までの時間と定義し、解析の時点でなお生存していることがわかっている患者は、その患者の最後の追跡調査時点で打ち切った。無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、ゲフィチニブ投与開始から進行性疾患の最初の発現または何らかの原因による死亡までの時間と定義し、解析時点で生存していることがわかっており、かつ進行性疾患のない患者は、その患者の最後の追跡調査時点で打ち切った。０．０５のＰ値を、統計的に有意であるとみなした。統計解析は、Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗソフトウェアパッケージ、バージョン５．０を用いて行った。
【００８８】
ゲフィチニブ治療を行った患者全員のＰＦＳ中央値は９８日であり、ＯＳ中央値は３０６日であった。血清にＥＧＦＲ突然変異のある患者は、ＥＧＦＲ突然変異のない患者と比較して有意に長いＰＦＳ中央値を示した（２００日対４６日、Ｐ＝０．００５、図３ａ）。ＥＧＦＲ突然変異を有する患者はＥＧＦＲ突然変異のない患者と比較して長いＯＳ中央値を示したが、統計的有意差はなかった（６１１日対２３２日、Ｐ＝０．０７８、図３ｂ）。これらの結果は、血清ＥＧＦＲ突然変異が、無増悪生存期間および全生存期間についての予後因子ならびにゲフィチニブで治療を行った患者における応答の予測因子として挙動することを示唆している。
【００８９】
実施例４：直接配列決定により解析した、およびＡＲＭＳと比較して解析した血清におけるＥＧＦＲ突然変異
患者２７名のうちの１０名（３７．０％）から抽出した血清ＤＮＡでの直接配列決定によって、欠失突然変異（Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ）を検出した。
【００９０】
ＰＣＲ増幅および直接配列決定。増幅および直接配列決定を、血清および組織標本から得た各サンプルについて二回実施した。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ１５μＬ、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ）０．７５ユニット、ＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、０．８ｍＭ ｄＮＴＰ、各プライマー０．５μＭおよび多形マーカーに応じた各種濃度のＭｇＣｌ２を用いて、容量２５ｍＬで実施した。プライマーセットの配列および増幅計画は、既報の方法に従った（Nuc. Acids Res. 1989;17:2503-2516）。増幅は、熱サイクラー（Perkin-Elmer, Foster City, CA）を用いて実施した。配列決定は、ＡＢＩプリズム３１０（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて行った。配列をＥＧＦＲについてＧｅｎＢａｎｋに記録されたヒト配列（登録番号：ＡＹ５８８２４６）と比較した。
【００９１】
血清サンプルからのＰＣＲ産物において、エキソン１８、１９、２０および２１に点突然変異は検出されなかった。直接配列決定によって検出された血清ＥＧＦＲ状態は、組織型、性別、ゲフィチニブの応答性（表３）および延命効果（ＰＦＳ：Ｐ＝０．２７７、ＯＳ：Ｐ＝０．８５９、補充データ２）のいずれとも統計的に相関していなかった。直接配列決定によるＥＧＦＲ突然変異状態は、対応のあるサンプルの１５／２７（５５．６％）においてＡＲＭＳによるものと一致していた。４症例におけるＥＧＦＲ突然変異（Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ）が、直接配列決定によって陽性であり、ＡＲＭＳによって陰性であった。８症例が直接配列決定によって陰性であり、ＡＲＭＳによって陽性であった。
【００９２】
実施例５：血清のものと比較した腫瘍におけるＥＧＦＲ突然変異
２０種の腫瘍サンプルを、回顧的に患者１５名から得た。
【００９３】
組織サンプル採取およびＤＮＡ抽出。施設内倫理委員会によって承認されたプロトコールに基づいて、腫瘍標本を得た。治療前の診断用に患者１５名から得た腫瘍材料のパラフィンブロック２０個を、回顧的に採取した。腫瘍サンプル１１種を、経気管支肺生検を介して原発癌から採取し、１種を手術によって切除し、９種を転移部位から得た（骨から４種、リンパ節３種、脳１種および結腸１種）。全ての標本について組織学的検査を行って、ＮＳＣＬＣの診断を確認した。ＤＥＸＰＡＴＴＭキット（TaKaRa Biomedicals, Shiga, Japan）を用いて、腫瘍サンプルからのＤＮＡ抽出を行った。
【００９４】
ＥＧＦＲにおけるエキソン１９および２１の配列決定を、同じＰＣＲ条件下で行った。患者１２名からの腫瘍サンプルを配列決定した（表４）。ＥＧＦＲ突然変異が４症例で検出され（２５．０％）、そのうちの３症例がエキソン１９における１５ｂｐ欠失（Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ）であり、１症例がエキソン２１でのＬ８５８Ｒであった。ＥＧＦＲ突然変異を有する患者の組織型は、３症例で腺癌であり、１症例で大細胞癌であった。これら４名の患者におけるゲフィチニブに対する応答は、２名でＰＲであり、１名でＳＤであり、１名の患者でＰＤであった。他の３つのサンプルは、ＰＣＲ産物の増幅が低かったことから評価しなかった。
【００９５】
腫瘍サンプルおよび血清サンプルのペアを、回顧的に患者１１名から入手した（表４）。腫瘍におけるＥＧＦＲ突然変異状態は、対応のある検体で、８／１１（７２．７％）の血清におけるものと一致していた。Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌは、２名の患者において腫瘍で陽性かつ血清で陰性であり、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌは、１名の患者において腫瘍で陰性かつ血清で陽性であった。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【表２】
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
配列表
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１はＥＧＦＲ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｋｉｔを用いたＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌおよびＬ８５８Ｒの突然変異についての検出感度を示す。（ａ）１０,０００ｐｇ（１０４）、１,０００ｐｇ（１０３）、１００ｐｇ（１０２）、１０ｐｇ（１０１）および１ｐｇ（１００）という各種容量で、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを有する標準ＤＮＡを用いた。野生型を有する標準ＤＮＡ（Ｗｉｌｄ）および蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を同じ実験で陰性対照として用いた。（ｂ）１ｐｇ〜１０,０００ｐｇの濃度のＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを有する標準ＤＮＡを、１：１（１００）、１：１０（１０−１）、１：１００（１０−２）、１：１,０００（１０−３）および１：１０,０００（１０−４）の比率で野生型の標準ＤＮＡ１０,０００ｐｇと混合した。（ｃ）容量１０,０００ｐｇでのＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを有する標準ＤＮＡから得た一次曲線および二次導関数曲線。二次導関数は、増殖曲線の勾配における変化率を表すものである。閾値サイクルは、二次導関数曲線の最高ピークでのサイクル数と定義される（図１ｃにおける垂直線）。（ｄ）標準曲線は、標準ＤＮＡ容量の対数に対する各曲線のＣｔ（図１Ａおよび１Ｂに示した）をプロットすることで誘導した。
【図２】図２は、肺癌細胞株由来のゲノムＤＮＡにおけるＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌの検出を示す。（ａ）Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを有するＰＣ−９および野生型を有するＡ４３１。（ｂ）Ｌ８５８ＲおよびＡ４３１を有する１１＿１８。
【図３】図３は、非小細胞肺癌のＥＧＦＲ突然変異状態に関する無増悪生存期間（Ａ）および全生存期間（Ｂ）を示す。（＊）ログランク検定。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥｒｂＢ受容体薬、例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするゲフィチニブに対する患者の応答を予測またはモニタリングする方法に関するものである。この方法は、血清などの生体液において低濃度で生じるゲノムＤＮＡ中の突然変異についての、感受性が高く、特異的なスクリーニングを提供するものである。この方法は、ＥｒｂＢチロシンキナーゼ受容体活性を増加することが知られており、ＥｒｂＢ受容体薬治療に対する応答と相関するように思われる突然変異を検出する上で好適である。
【背景技術】
【０００２】
ＥｒｂＢ受容体は、ＴＫスーパーファミリー（そのメンバーは細胞の増殖および生存を制御するシグナル伝達経路を調節する）に属するタンパク質チロシンキナーゼ（ＴＫ）である。ＥｒｂＢファミリーの受容体は、４種類の関連の深いサブタイプ、すなわちＥｒｂＢ１（上皮成長因子受容体［ＥＧＦＲ］）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）からなる（非特許文献１）。
【０００３】
ＥＧＦＲからのシグナル伝達は例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）などの成長因子の結合によって誘発され、ＥＧＦＲ分子の二量体化またはＨＥＲ２／ｎｅｕなどの他の関連性の強い受容体とのヘテロ二量体化を生じる。これらの受容体のチロシンキナーゼドメインを介した自身の自己リン酸化およびトランスリン酸化によって、下流エフェクターの補充および増殖シグナルおよび細胞生存シグナルの活性化が生じる（非特許文献２）。突然変異によって過剰発現または活性化されると、ＥｒｂＢ受容体ＴＫは、乳癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌、頭部および頸部の癌、ならびに他の多くの固形腫瘍の発達に導く可能性がある（非特許文献３）。ＥＧＦＲは、非小細胞肺癌および多くの他の上皮癌の４０〜８０％で過剰発現される（非特許文献４）。抗癌療法は、そのような遺伝子の産生物を標的化して、その活性を阻害するよう設計されてきた。例えば、ゲフィチニブという薬剤は、ＥｒｂＢ１などのＥＧＦＲファミリーのチロシンキナーゼ酵素の強力な阻害薬であり、手術不可能なまたは再発性のＮＳＣＬＣの治療について、２００２年７月５日に日本で承認された。
【非特許文献１】Cell, 2000; 103: 211-225
【非特許文献２】Exp. Cell. Res. 2003; 284: 31-53
【非特許文献３】Exp. Cell. Res. 2003; 284: 122-130
【非特許文献４】N. Engl. J. Med. 2004; 350(21): 2129-2139
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
患者の処方薬に対する応答は、それがどの程度良好に作用するか（その効能）およびそれに対する有害反応（副作用）の両方に関して変動するものである。ゲフィチニブの場合、患者は、急速かつ多くの場合で劇的な臨床応答を有する患者の約１０％の群を含めて、チロシンキナーゼ阻害薬治療に対して異なる応答を示す（N. Engl. J. Med. 2004; 350(21): 2129-2139）。従って、薬剤に応答する患者を治療前に確認し、さらにはその薬剤に応答している患者を治療後に確認して、医薬をより効率的に標的化に用いることができるようにする必要がある。
【０００５】
最近、非小細胞肺癌患者のサブグループがＥＧＦＲ遺伝子において特異的突然変異を有し、それがチロシンキナーゼ阻害薬であるゲフィチニブに対する臨床的応答性と相関しているようであることが発見された（Science 2004; 304: 1497-1500）。これらの突然変異によって、増殖因子のシグナル伝達の増加が生じ、その阻害薬に対する感受性が得られる。肺癌でそのような突然変異についてのスクリーニングを行うことで、ゲフィチニブに対する応答を有する患者を確認できるものと思われる（J. Clin. Oncol. 23; 2493-2501）。しかしながら、現在までのところ、確実に突然変異を測定できる唯一の方法は、患者由来の腫瘍生検を行うことによる固形腫瘍サンプルの分析によるものである。これは困難な手法であり、患者にとっては非常に不快であり、腫瘍を手術できない時には実施不可能である場合がある。
【０００６】
突然変異について患者をスクリーニングする上での別の問題は、非常に多くの野生型遺伝子の中で突然変異遺伝子を検出することが困難であるという点である。これは当業界で公知の問題であり、低濃度での突然変異ＤＮＡの確認が腫瘍の早期検出のために、または早期の段階で患者にとって適切な治療方針を確認する上で重要であり得ることを考慮すると特に重要である（Clin Cancer Res. 2004;10(7):2379-85）。従って、例えば非常に有効であるがわずかな比率の患者にしか効果がない可能性がある治療法を患者に始める前に、侵襲性が比較的小さく、より信頼性が高い、ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答をモニターおよび予測する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、患者から採取した生体液サンプルでＥｒｂＢ受容体突然変異を確実に検出する方法を見出した。この方法は、ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答または延命効果を予測するために用いることができる。特に、ＥｒｂＢ受容体のチロシンキナーゼ活性を変える突然変異の存在は、患者が薬剤に対して正の応答をする可能性のあることを示しており、それに対して野生型対立遺伝子のみの存在は、患者がＥｒｂＢ受容体薬に対して応答しない可能性があることを示している。
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；および
（ｃ）前記受容体における１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含むＥｒｂＢ突然変異の検出方法が提供される。
【０００９】
好ましくは、上記のＥｒｂＢ突然変異の検出方法は、ＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える該受容体中の１以上の突然変異の検出を含む。
【００１０】
最も好ましくは、前記方法におけるＥｒｂＢ受容体はＥＧＦＲである。
【００１１】
本発明者らは、患者の生体液サンプルにおける突然変異の測定を用いて、イン・ビボでＥｒｂＢ受容体薬の効果について予測およびモニタリングを行うことが可能であることを見出した。
【００１２】
好ましい態様では、本発明は、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；
（ｃ）ＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含む、ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答を予測する方法を提供する。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；
（ｃ）ＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含む、ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答をモニタリングする方法が提供される。
【００１４】
当業者には明らかなように、ＥｒｂＢ受容体薬に対する応答をモニタリングすることで、該薬剤の投与をすでに行っている患者の応答を評価することができる（すなわち治療後の患者に利用される）。しかしながら、応答の予測は、ＥｒｂＢ受容体薬に曝露されていない患者で、及び治療前に行う。
【００１５】
別の実施形態では、前記方法は、上記の各段階を含み、ＥｒｂＢ受容体薬に対する癌患者の応答の予測が、その患者に対する延命効果を予測するものである。
【００１６】
好ましくは、上記のＥｒｂＢ薬剤に対する応答の予測方法は、
（ｄ）突然変異型および野生型の両方の対立遺伝子が検出される患者は、ＥｒｂＢ受容体薬に対して陽性の応答をし、野生型の対立遺伝子のみが検出される患者は該薬剤に対して陽性の応答をしないと結論づける段階
をさらに含む。
【００１７】
別の実施形態では、上記のスクリーニング方法は、単一塩基突然変異、小さなインフレーム欠失または塩基置換を検出する対立遺伝子特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応の使用を含むものである。
【００１８】
好ましくは、前記スクリーニング方法は、単一塩基突然変異、小さなインフレーム欠失または塩基置換を検出する対立遺伝子特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイム−ＰＣＲ）の使用を含む。
【００１９】
さらに別の実施形態において、ＥｒｂＢ薬剤に対する応答の予測方法は、上記の通りであるが、第１のプライマー対を用いて野生型対立遺伝子を検出し、第２のプライマー対を用いて突然変異体対立遺伝子を検出し；各プライマー対のうちの一方のプライマーが、
（ａ）特定の突然変異に特異的な対立遺伝子である末端３′ヌクレオチドを有するプライマー；および
（ｂ）そのプライマーの３′末端での可能な追加のミスマッチ
を含む。
【００２０】
好ましくは、上記の各プライマー対における一方のプライマーは、
（ａ）プライマー配列および標的配列に特異的なさらなる配列の両方を含む単一分子または核酸二本鎖プローブ；
（ｂ）前記単一分子または核酸二本鎖内のクエンチャー分子の非常に近位にある前記プローブの５′末端に結合した蛍光レポーター色素；
（ｃ）前記プローブの一端にある１以上の非コードヌクレオチド残基；
をさらに含み；
（ｄ）前記レポーター色素およびクエンチャー分子は、前記標的配列の増幅時に分離されるようになる。
【００２１】
有利には、前記プローブはＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブである。
【００２２】
好ましくは、本発明による方法は、野生型配列のレベルの１０％で存在する突然変異体配列を検出することができる技術を用いるものである。より好ましくは、前記技術は、野生型配列のレベルの９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％または０．０１％の突然変異体配列を検出することができる。
【００２３】
上記の蛍光プローブシステムは、増幅した標的に結合するのに別個のプローブを必要とせず、他の系より迅速かつ効率的に検出が行われるという利点を有する。本発明は、ＡＲＭＳ増幅システムにおけるスコルピオン（登録商標）プライマーの使用によって、ＥＧＦＲ突然変異の検出に用いられる方法の感度が高められることを示している（実施例４参照）。
【００２４】
好ましくは上記の方法に記載の生体液は、血液、血清、血漿、汗または唾液のうちのいずれかである。有利には、前記生体液は血清である。
【００２５】
ＥＧＦＲ突然変異とＮＳＣＬＣ進行との間の相関を見る既報の試験のほとんどが、回顧的試験のために治療開始後に採取した手術切除腫瘍サンプルでそのような突然変異を示している。しかしながら、初期段階で患者から手術できないＮＳＣＬＣ腫瘍をサンプリングすることが困難であることが、治療開始前に患者を選択する可能性のある前向き試験の実施の試みにおいて障害となっていた。
【００２６】
しかしながら本発明は、腫瘍標本以外の癌患者のサンプルから突然変異体ＥＧＦＲを検出する方法を提供する。生体液のサンプリングは、癌患者におけるＥＧＦＲ突然変異の過去の分析方法より侵襲性が低い。腫瘍検体の採取とは対照的に、血清サンプルは例えば、容易に採取することができ、試験を繰り返すことができる。さらに腫瘍細胞は、血行中にＤＮＡを放出し、それが血清および血漿中で豊富となることで、癌患者の血清ＤＮＡでの突然変異およびマイクロサテライト変化を検出可能にすることが知られている（Cancer Res. 1999;59(1):67-70）。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態では、ＥｒｂＢ受容体薬はＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ阻害薬である。好ましくは、ＥｒｂＢ受容体薬はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である。好ましい方法では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬は、ゲフィチニブ、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ、ＯＳＩ−７７４、ＣＰ−３５８７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２（ＷＡＹ−１７７８２０）、ラパチニブ（ＧＷ２０１６、ＧＷ−５７２０１６、ＧＳＫ５７２０１６）、カネルチニブ（ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ）（ＣＩ−１０３３、ＰＤ１８３８０５）、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ５５９９６２６、ＺＤ６４７４（ＺａｃｔｉｍａＴＭ）またはＷＯ２００４／００６８４６もしくはＷＯ２００３／０８２２９０に開示のいずれかの化合物からなる群から選択される。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、ＥｒｂＢ受容体薬はＥＧＦＲ阻害薬である。好ましくは、ＥＧＦＲ阻害薬は、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｃ２２５）、マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ／ｒＨｕＭＡｂ−ＥＧＦＲ）、ＭＲ１−１、ＩＭＣ−１１Ｆ８またはＥＧＦＲＬ１１からなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である。
【００２９】
好ましくは、前記いずれの方法も、単独療法として、または他薬剤との併用で使用されるＥｒｂＢ受容体薬を含む。
【００３０】
最も好ましい実施形態では、ＥＦＧＲチロシンキナーゼ阻害薬は、ゲフィチニブ、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ、ＯＳＩ−７７４、ＣＰ−３５８７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２（ＷＡＹ−１７７８２０）、ラパチニブ（ＧＷ２０１６、ＧＷ−５７２０１６、ＧＳＫ５７２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３、ＰＤ１８３８０５）、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ５５９９６２６、ＺＤ６４７４（ＺａｃｔｉｍａＴＭ）またはＷＯ２００４／００６８４６もしくはＷＯ２００３／０８２２９０に開示のいずれかの化合物からなる群から選択される。
【００３１】
本発明における突然変異は、核酸の挿入、欠失または置換として生じることが認められる。突然変異は、好ましくは、ＥｒｂＢ受容体のチロシンキナーゼドメインで起こる。好ましくは、突然変異は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインで起こる。好ましくは、突然変異は、表５に挙げたＥＧＦＲ突然変異の群から選択される。有利には、突然変異は、ＥＧＦＲのエキソン１８、１９、２０または２１におけるＡＴＰ結合部位周囲に集まっている。好ましくは、突然変異は、表５に挙げたＥＧＦＲ突然変異の群から選択される。最も好ましい実施形態では、突然変異はＥＧＦＲのエキソン１９におけるＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌおよびエキソン２１におけるＬ８５８Ｒである。
【００３２】
ＥＧＦＲのエキソン１８〜２１における約３０種の突然変異が、肺腫瘍標本において検出されている。腫瘍標本で検出されたＮＳＣＬＣ関連のＥＧＦＲ突然変異の中で、エキソン１９における１５ｂｐヌクレオチドインフレーム欠失（Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ）およびエキソン２１におけるコドン８５８でのアルギニンによるロイシンの置換である点突然変異（Ｌ８５８Ｒ）が、これら突然変異の約９０％を占める（Cancer Res. 2004;64:8919-8923, Proc. Natl. Acad. Sci USA 2004;101:13306-13311）。
【００３３】
有利には、患者は、白血病、多発性骨髄腫またはリンパ腫などの非固形腫瘍、および例えば胆管、骨、膀胱、脳／ＣＮＳ、神経膠芽腫、乳房、結腸直腸、子宮頚部、子宮内膜、胃、頭部および頚部、肝臓、肺、筋肉、神経、食道、卵巣、膵臓、胸膜／腹膜、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮および外陰部の腫瘍などの固形腫瘍からなる群から選択される癌をわずらっている。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、上記の方法は、
（ｅ）ＥｒｂＢ受容体の下流シグナル伝達経路の成分における１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
をさらに含む。
【００３５】
本発明の第２の態様は、野生型対立遺伝子を検出するのに用いられる第１のプライマー対、およびＥｒｂＢ受容体の突然変異体対立遺伝子を検出するのに用いられる第２のプライマー対を含む組成物であって、各プライマー対における一方のプライマーは、
（ａ）特定の突然変異に特異的な対立遺伝子である末端３′ヌクレオチドを有するプライマー；および
（ｂ）前記プライマーの３′末端における可能な追加のミスマッチ；
（ｃ）プライマー配列および標的配列に特異的なさらに別の配列の両方を含む単一分子または核酸二本鎖プローブ；
（ｄ）前記単一分子または核酸二本鎖内でクエンチャー分子の非常に近位にある５′末端に結合した蛍光レポーター色素；
（ｅ）前記プローブの一端にある１以上の非コードヌクレオチド残基
をさらに含み、
（ｆ）前記レポーター色素およびクエンチャー分子が前記標的配列の増幅時に分離されるようになる、
前記組成物を包含するものである。
【００３６】
本発明の第３の態様は、ＥｒｂＢ薬剤に対する患者の応答を予測するために生体液で実施されるアッセイにおける、ＥｒｂＢ受容体に特異的なプライマーの使用を含むものである。
【００３７】
好ましくは、上記の使用は、ＥｒｂＢ薬剤に対する患者の応答を予測するために生体液を調べるための組成物の製造を含むものである。
【００３８】
有利には、上記の使用は、
（ａ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階
（ｂ）前記受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
をさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
別段の断りがない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者が共通に理解するものと同じ意味を有する（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学におけるもの）。分子的方法、遺伝子的方法および生化学的方法については、標準的な技術を用いる。概して、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.；ならびにGuthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.), McPherson et al., PCR Volume 1 N.Y.), およびGene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.)(これらの文書は、参照によって本明細書に組み込まれる), Oxford University Press, (1991), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.), およびGene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E
. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.を参照されたい。これらの文書は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４０】
生物マーカー
医学的状態および毒物学的状態への生化学および分子生物学の応用を通じて、生物カーカーと称される各種の生物学的マーカーが確認および研究されてきた。生物マーカーは、組織および生体液の両方で発見することができ、血液が生物マーカーの研究で用いられる最も一般的な生体液である（Proteomics 2000;1:1-13, Physiol. 2005;563:23-60）。
【００４１】
生物マーカーは、「正常な生物学的プロセス、発病プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答、の指標として客観的に測定および評価される特徴」と説明することができる。生物マーカーは、生物マーカーの存在もしくはレベルと症状もしくは疾患の何らかの側面（症状もしくは疾患の存在、そのレベルもしくはそのレベルの変化、その種類、その段階、それに対する感受性、あるいは症状もしくは疾患の治療に用いられる薬剤に対する応答性など）との間に相関がある場合に、特定の症状または疾患に関連する同定可能かつ測定可能な指標である。その相関は、定性的、定量的または定性的と定量的の両方であることができる。代表的には、生物マーカーは、化合物、化合物断片または化合物群である。そのような化合物は、タンパク質（およびペプチド）、核酸および他の化合物などの、生物で認められるかまたは生物が産生する化合物であることができる。
【００４２】
生物マーカーは、予測力を有する場合があり、それ自体、特定の症状もしくは疾患の存在、レベル、種類もしくは段階（特定の微生物もしくは毒物の存在またはレベルを含む）、特定の症状もしくは疾患に対する感受性（遺伝的感受性を含む）、または特定の治療（薬物治療を含む）に対する応答、を予測または検出するのに用いることができる。生物マーカーは、研究および開発プログラムの効率を改善することで、将来の創薬および薬剤開発においてますます重要な役割を果たすものと考えられる。生物マーカーは、診断剤、疾患進行のモニター、治療のモニターおよび臨床的結果の予測因子として用いることができる。例えば、各種の生物マーカー研究プロジェクトによって、特定の癌ならびに特定の心血管疾患および免疫疾患のマーカーの確認が試みられている。
【００４３】
本明細書で使用される「ＥｒｂＢ受容体薬」という用語は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ）、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４などのｅｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼに対して作用する薬剤を含むものである。１実施形態において、ＥｒｂＢ受容体薬はＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ阻害薬である。別の実施形態では、ＥｒｂＢ受容体薬はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である。ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害薬の例には、ゲフィチニブ、エルロチニブ（ＯＳＩ−７７４、ＣＰ−３５８７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２（ＷＡＹ−１７７８２０）、ラパチニブ（ＧＷ２０１６、ＧＷ−５７２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３、ＰＤ１８３８０５）、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ５５９９６２６、またはＷＯ２００４／００６８４６、ＷＯ２００３／０８２８３１もしくはＷＯ２００３／０８２２９０に開示のいずれかの化合物などがあるが、これらに限定されるものではない。特に、ゲフィチニブ（ＩｒｅｓｓａＴＭとも称され、コード番号ＺＤ１８３９およびＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｎｕｍｂｅｒ １８４４７５−３５−２で知られる）が、国際特許出願ＷＯ９６／３３９８０に開示されており、ＥｒｂＢ１などの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのチロシンキナーゼ酵素の強力な阻害薬である。
【００４４】
別の実施形態では、ＥｒｂＢ受容体薬は、例えばセツキシマブ（Ｃ２２５）、マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ／ｒＨｕＭＡｂ−ＥＧＦｒ）、ＭＲ１−１、ＩＭＣ−１１Ｆ８またはＥＧＦＲＬ１１のうちの１つなど、抗ＥＧＦＲ抗体である。本明細書で言及されるＥｒｂＢ受容体薬は、単独療法として、あるいは同じ種類または異なる種類の他の薬剤との併用で用いることができる。特定の実施形態では、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害薬はゲフィチニブである。
【００４５】
「生存期間」とは、患者の「全生存期間」および「無増悪生存期間」を包含するものである。「全生存期間」（ＯＳ）とは、ゲフィチニブ投与の開始から何らかの原因による死亡までの時間と定義される。「無増悪生存期間」（ＰＦＳ）は、ゲフィチニブ投与の開始から進行性疾患の最初の発現または何らかの原因による死亡までの時間と定義される。
【００４６】
「応答」とは、部分的応答もしくは安定した疾患を示す患者および進行性疾患の徴候を示す患者という２つの主要な群への患者の分類を含む「固形腫瘍における応答評価基準」（ＲＥＣＩＳＴ）に従って得られる測定値によって定義される。
【００４７】
「増幅」反応は、非標的核酸より多くの標的核酸の特異的増幅を生じる核酸反応である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は周知の増幅反応である。
【００４８】
「癌」は本明細書においては、腫瘍性表現型への細胞転換から生じる腫瘍増殖を指すのに用いられる。そのような細胞転換には多くの場合、遺伝子突然変異が関与し、本発明の関連では、転換には、本明細書に記載の１以上のＥｒｂ遺伝子の変化による遺伝子突然変異が関与する。
【００４９】
「プローブ」という用語は、検出対象の対立遺伝子の標的配列に対して正確に相補的である配列を有する一本鎖配列特異的オリゴヌクレオチドを指す。
【００５０】
「プライマー」という用語は、複製される核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物の合成のための開始点として作用することができる一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列または特異的プライマーを指す。プライマーの長さおよび配列は、これらが伸長産物の合成を開始（prime）できるようなものでなければならない。
【００５１】
本願は、ＥｒｂＢ核酸突然変異体を記載する。本明細書で使用される「ＥｒｂＢ受容体突然変異体」という用語は、ＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ受容体のメンバーのいずれかをコードする核酸を指すのに用いられる。そこで、「ＥｒｂＢ受容体」という用語は、全ての公知のヒトＥｒｂＢ受容体の相同体および変異体、ならびにＥｒｂＢ受容体の相同体と同定されるのに十分なＥｒｂＢ受容体ファミリーメンバーに対する相同性を示す他の核酸分子を包含するものである。好ましくは、ＥＧＦＲは、配列番号１として示されるＥＧＦＲの配列を有する核酸と同定される。
【００５２】
「核酸」という用語は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、上記で同定された天然核酸とハイブリダイズできるポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｐｇ／ｍｌの変性・剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩のインキュベーション、その後の０．１ｘＳＳＣ中、約６５℃でのフィルター洗浄を指す。
【００５３】
核酸の検出方法
本発明の関連で、ＥｒｂＢ受容体をコードする突然変異核酸の検出を用いて、薬剤治療に対する応答を予測することができる。通常はＥｒｂＢ受容体遺伝子における突然変異はＤＮＡレベルで起こることから、本発明のその方法は、ゲノムＤＮＡ、ならびに転写物およびタンパク質自体における突然変異の検出に基づくものであることができる。転写物および／またはポリペプチドの分析によってゲノムＤＮＡ中の突然変異を確認することで、検出された突然変異が被験者において実際に発現されることを確認することが望ましいものとなり得る。
【００５４】
ゲノム核酸中での突然変異は、有利には、増幅核酸断片における移動度シフトに基づく技術によって検出される。例えばチェンらの報告（Chen et al., Anal Biochem 1996 Jul 15;239(1):61-9）には、競合移動度シフトアッセイによる単一塩基突然変異の検出が記載されている。さらに、マルセリノら（Marcelino et al., BioTechniques 26(6): 1134-1148 (June 1999)）の技術に基づくアッセイが市販されている。
【００５５】
好ましい例では、キャピラリーヘテロ二本鎖分析を用いて、ミスマッチの存在の結果によるキャピラリーシステムにおける二本鎖核酸の移動度シフトに基づいて突然変異の存在を検出することができる。
【００５６】
サンプルからの分析用の核酸の生成には、核酸増幅が必要である。多くの増幅方法は、酵素連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応または自立配列複製など）に基づくものであるか、それがクローニングされているベクターの全て又は一部の複製からのものである。好ましくは、本発明による増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応によって示される指数関数的増幅である。
【００５７】
多くの標的およびシグナル増幅方法が、文献に記載されており、例えばランデグレンらの報告（Landegren, U., et al., Science 242:229-237 (1988)）およびルイスの報告（Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990)）に、これらの方法の概説がある。これらの増幅方法は本発明の方法で用いることができ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、イン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）のＰＣＲ、リガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）、リガーゼハイブリダイゼーション、Ｑベータ・バクテリオファージ・レプリカーゼ、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、転写産物配列決定を伴うゲノム増幅（ＧＡＷＴＳ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）およびイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションなどがある。各種増幅技術での使用に好適なプライマーは、当業界で公知の方法に従って製造することができる。
【００５８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲは、特に、米国特許第４６８３１９５号および４６８３２０２号に記載された核酸増幅方法である。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼが引き起こすプライマー伸長反応の繰り返しサイクルからなる。標的ＤＮＡを熱変性し、増幅されるＤＮＡの反対の鎖上で標的配列を挟む２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによる使用のためのプライマーとなる。ＤＮＡはプライマー伸長によって複製され、両方の鎖の第２コピーを生じる。熱変性、プライマーハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルを繰り返すことで、標的ＤＮＡを約２〜４時間で百万倍以上に増幅させることができる。ＰＣＲは、増幅の結果を測定する検出技術と組み合わせて使用しなければならない分子生物学的手段である。ＰＣＲの利点は、約４時間で標的ＤＮＡの量を百万〜１０億倍に増幅することで、それが感度を増加する点である。ＰＣＲを用いて、診断の関連であらゆる公知の核酸を増幅することができる（Mok et al., (1994), Gynaecologic Oncology, 52: 247-252）。
【００５９】
自立配列複製（３ＳＲ）
自立配列複製（３ＳＲ）は、酵素カクテルおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーが介在する逆転写酵素（ＲＴ）活性、ポリメラーゼ活性およびヌクレアーゼ活性の順次サイクルを介した核酸鋳型の等温増幅が含むＴＡＳの変形である（Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）。ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖のＲＮＡの酵素分解を熱変性に代えて用いる。ＲＮａｓｅＨおよび他の全ての酵素を反応液に加え、全ての段階を同じ温度で行い、それ以上の試薬添加は行わない。このプロセス後に、４２℃１時間で、１０６〜１０９の増幅が達成されている。
【００６０】
ライゲーション増幅（ＬＡＲ／ＬＡＳ）
ライゲーション増幅反応またはライゲーション増幅システムは、ＤＮＡリガーゼおよび４種のオリゴヌクレオチド（標的鎖当たり２種）を用いる。この技術は、ウーら（Wu, D. Y. and Wallace, R. B. (1989) Genomics 4:560）が記載している。オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ上の隣接する配列にハイブリダイズし、リガーゼによって連結される。反応液を熱変性し、サイクルを繰り返す。
【００６１】
Ｑβレプリカーゼ
この技術では、リザルディらの報告（Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197）に記載されるように、一本鎖ＲＮＡを複製するバクテリオファージＱβ用のＲＮＡレプリカーゼを用いて、標的ＤＮＡを増幅する。最初に、標的ＤＮＡを、Ｔ７プロモーターおよびＱβ５′配列領域を含むプライマーにハイブリダイズさせる。このプライマーを用いると、このプロセスで逆転写酵素がプライマーをその５′末端に結合するｃＤＮＡを生成する。これらの２段階はＴＡＳプロトコールに類似している。得られるヘテロ二本鎖を熱変性する。次に、Ｑβ３′配列領域を含む第２のプライマーを用いて、ｃＤＮＡ合成の第２回目を開始する。これによって、Ｑβバクテリオファージの５′末端および３′末端の両方ならびに活性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含む二本鎖ＤＮＡが得られる。次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、二本鎖ＤＮＡを、Ｑβを模倣する新たなＲＮＡに転写する。十分に洗浄して、ハイブリダイズされていないプローブを除去した後、前記の新たなＲＮＡを標的から溶出し、Ｑβレプリカーゼによって複製する。後者の反応によって、約２０分で１０７倍の増幅が生じる。
【００６２】
代替の増幅技術を本発明で利用することができる。例えば、ローリング・サークル増幅（Lizardi et al., (1998) Nat Genet 19:225）は、ＤＮＡポリメラーゼによって駆動され、等温条件下で直線的反応速度または幾何学的反応速度のいずれかで環状オリゴヌクレオチドプローブを複製することができる市販の（ＲＣＡＴＴＭ）増幅技術である。
【００６３】
２つの好適に設計されたプライマーの存在下で、ＤＮＡの置換および超分岐を介して幾何学的増幅が起こることで、１時間で各サークルの１０１２以上のコピーが生じる。
【００６４】
単一プライマーを用いる場合、ＲＣＡＴによって数分で、標的が共有結合により直列的に結合した数千の標的のＤＮＡコピーの直鎖が生じる。
【００６５】
さらに別の技術である鎖置換増幅（ＳＤＡ；Walker et al., (1992) PNAS (USA) 80:392）は、特定の標的に特有の具体的に定義された配列で開始する。しかし、熱サイクルに基づく他の技術とは異なり、ＳＤＡは一連のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび制限酵素を利用して、特有の核酸配列を指数関数的に増幅させる等温プロセスである。
【００６６】
ＳＤＡは、標的生成段階および指数関数的増幅段階の両方を含む。
【００６７】
標的生成では、二本鎖ＤＮＡを熱変性して、２つの一本鎖コピーを作る。一連の特別に製造されたプライマー（塩基配列をコピーするための増幅プライマーと新たに作られた鎖を置換するためのバンパープライマーと）をＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて、指数関数的増幅が可能な改変標的を形成する。
【００６８】
指数関数的増幅プロセスは、標的生成段階からの改変標的（制限酵素認識部位を有する一本鎖部分ＤＮＡ鎖）で開始する。
【００６９】
増幅プライマーを、その相補ＤＮＡ配列で各鎖に結合させる。次に、個々のヌクレオチドを添加するための鋳型として改変標的を用い、ＤＮＡポリメラーゼがその3’末端からプライマーを伸長する位置を同定するためにプライマーを利用する。こうして、伸長したプライマーが、各末端で完全な制限酵素認識部位を含む二本鎖ＤＮＡセグメントを形成する。
【００７０】
次に、制限酵素を、二本鎖ＤＮＡセグメントにその認識部位に結合させる。制限酵素は、両側セグメントの一方の鎖のみを開裂させ、ニックを形成させた後に認識部位から解離する。ＤＮＡポリメラーゼがそのニックを認識し、その部位から鎖を伸長させて、予め形成された鎖に取って代わる。そうして認識部位は、制限酵素およびＤＮＡポリメラーゼによって、標的セグメントを含むＤＮＡ鎖の連続的な置換と共に、繰り返しニック形成および復元がなされる。
【００７１】
その後、各置換された鎖は、上記の増幅プライマーとアニーリングするのに利用可能である。そのプロセスは、新たなＤＮＡ鎖の反復的なニック形成、伸長および置換とともに継続して、元のＤＮＡ標的の指数関数的増幅を生じる。
【００７２】
核酸が増幅されれば、単一塩基対突然変異の検出に多くの技術が利用可能である。そのような技術の一つは、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）である。ＳＣＣＰ検出は、電気泳動中に、参照ＤＮＡと比較した一本鎖突然変異ＤＮＡの異常移動に基づくものである。突然変異は、一本鎖ＤＮＡにおける高次構造変化を生じさせて、移動度シフトを生じる。蛍光ＳＣＣＰは、蛍光標識プライマーを用いて検出を補助するものである。したがって、参照および突然変異体ＤＮＡを、蛍光標識プライマーを用いて増幅する。その増幅ＤＮＡを変性および急冷（snap-cooled）して一本鎖ＤＮＡ分子を生成し、それを未変性ゲル電気泳動によって調べる。
【００７３】
化学的ミスマッチ開裂（ＣＭＣ）は、ヒドロキシルアミン、四酸化オスミウムおよびピペリジンの組み合わせによるＤＮＡミスマッチ塩基対の認識および開裂に基づくものである。従って、参照ＤＮＡと突然変異体ＤＮＡの両方を、蛍光標識プライマーを用いて増幅する。アンプリコンをハイブリダイズさせて、次にミスマッチＴ塩基に結合する四酸化オスミウム、またはミスマッチＣ塩基に結合するヒドロキシルアミンを用いて開裂させ、その後、ピペリジンによって修飾塩基の部位で開裂を行う。次いで、開裂断片を電気泳動によって検出する。
【００７４】
制限断片多型（ＲＦＬＰ）に基づく技術も用いることができる。多くの一塩基多型（ＳＮＰ）で従来のＲＦＬＰ分析ができないが、プライマー誘導型制限分析ＰＣＲ（ＰＩＲＡ−ＰＣＲ）を用いることで、ＰＣＲプライマーを用いてＳＮＰ依存的に制限部位を導入することができる。好適な制限部位を導入するＰＩＲＡ−ＰＣＲ用のプライマーは、キシアイイらの報告（Xiaiyi et al., (2001) Bioinformatics 17:838-839）に記載のコンピュータ分析によって設計することができる。
【００７５】
さらに、ＷＡＶＥ分析に基づく技術を用いることができる（Methods Mol. Med. 2004;108:173-88）。このＤＮＡ断片分析システムを用いて、一塩基多型を検出することができ、このシステムは温度変調型液体クロマトグラフィーおよび高分解能マトリクスに基づくものである（Genet Test. 1997-98;1(3):201-6）。
【００７６】
リアルタイムＰＣＲ（定量ＰＣＲ、リアルタイム定量ＰＣＲまたはＲＴＱ−ＰＣＲとも称される）は、同時ＤＮＡ定量および増幅の方法である（Expert Rev. Mol. Diagn. 2005(2):209-19）。ポリメラーゼ連鎖反応によってＤＮＡを特異的に増幅する。各増幅ラウンド後に、ＤＮＡを定量する。一般的な定量方法には、相補ＤＮＡとハイブリダイズした時に蛍光を生じる修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド（プローブと称される）および二本鎖ＤＮＡに挿入する蛍光色素の使用などがある。
【００７７】
高感度で迅速なＤＮＡ増幅系のために「Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマー」と称される特異的プライマーを用いることができる。そのようなプライマーは、プローブを単一分子で特異的標的配列と組み合わせて、単分子反応速度（unimolecular kinetics）の蛍光検出系を生じる（Nucl. Acids Res. 2000;28:3752-3761）。これは、増幅標的に結合するのに別個のプローブを必要とせず、検出をより迅速かつより効率的にするという点で、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｅａｃｏｎｓおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）などの他の蛍光プローブ系に勝る長所を有する。これら３種類の検出方法の直接比較（Nucl. Acids Res 2000;28:3752-3761）から、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（登録商標）が、特に迅速なサイクル条件下で、細胞間プロービング系より性能が良好であることがわかる。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーのあるバージョンの構造は、対象標的に特異的なプローブ配列に隣接する約６個の塩基の相補ステム配列によってヘアピンループ配座に保持されるものである（Nat. Biotechnol. 1999;17:804-807）。ステムは、蛍光レポーター色素（５′末端に結合）を一緒にクエンチャー分子に非常に近接した位置に配置する働きも有する。この配座では、シグナルは生じない。ＰＣＲブロッカーが、プライマー配列からヘアピンループを分離して、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）の３′末端を形成する。このブロッカーは、特異的標的の非存在下でヘアピンループのアンフォールディングを生じると考えられるリードスルーを防止する。ＰＣＲ中、プライマーから通常の通り伸長が起こる。その後の変性段階およびアニーリング段階後に、ヘアピンループがほどけ、正しい産物が増幅されていた場合は、プローブ配列が、新たに合成された鎖上でプライマーの下流にある特異的標的配列に結合する。この新しい構造は、元のヘアピンループより熱力学的に安定である。蛍光色素がクエンチャーの非常に近位にはすでに存在しないことから、この時点で蛍光シグナルが生じる。この蛍光シグナルは、標的ＤＮＡの量に正比例する。
【００７８】
代替のＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーは、２つの相補的な標識オリゴヌクレオチドの二本鎖を含む。この二本鎖の一方のオリゴヌクレオチドは、５′末端レポーター色素で標識されており、ブロッカー非コードヌクレオチドおよびＰＣＲプライマー要素の両方を有しており、他方のオリゴヌクレオチドは３′末端クエンチャー色素で標識されている。そして、作用機序は上記のＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）ヘアピンプライマーと本質的に同じであり、リアルタイム定量ＰＣＲ中に、５′末端レポーターおよび３′末端クエンチャー色素が互いに分離されて、蛍光発光に有意な増加を生じる。
【００７９】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（登録商標）は、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲＭＳ）（Nucl. Acids Res. 1989;17:2503-2516, Nat. Biotechnol. 1999;17:804-807）と併用して、一塩基突然変異の検出を可能にすることができる。適切なＰＣＲ条件下で、プライマーの３′末端に位置する一塩基ミスマッチは、完全に適合する対立遺伝子の優先的増殖には十分であることから（Newton et al., 1989）、非常に関連の深い種を区別することができる。上記のプライマーを用いる増幅システムの基礎は、ミスマッチ３′残基を有するオリゴヌクレオチドが適切な条件下でＰＣＲにおけるプライマーとして機能しないということである。この増幅システムにより、アガロースゲル電気泳動後に反応混合物を調べるだけで遺伝子型決定を行うことができる。それは簡易かつ信頼性があり、いずれの対立遺伝子についても、遺伝子座でヘテロ接合体をホモ接合体と明瞭に区別する。ＡＲＭＳでは、制限酵素消化、従来用いられていた対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物の配列解析が必要ない。
【実施例】
【００８０】
実施例１−臨床試験および血清サンプルの採取
本研究は、ゲフィチニブ単独療法についての多施設臨床フェーズＩＩ試験での相関研究として行った。本研究は、ヒト被験者が関与する生物医学研究に関するヘルシンキ宣言の勧告に基づく適切な倫理審査委員会の承認のもとで実施した。ＩＩＩＢ期またはＩＶ期であると組織学的または細胞学的に立証された化学療法を受けたことがないＮＳＣＬＣの日本人患者を、本試験に登録した。ゲフィチニブを、２５０ｍｇ／日の固定用量で患者全員に経口投与した。「Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｕｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）」ガイドライン（J. Natl. Cancer Inst. 2000;92:205-216）を用いて、効能を評価した。
【００８１】
患者２８名を、２００２年１０月２３日〜２００３年８月３日に登録した（表１）。患者全員について、応答を評価し、無増悪生存期間および全生存期間の追跡を行った。患者２７名から採血を行ってから（２ｍＬ）、ゲフィチニブ投与を開始した。２７サンプル全てで、１７２０ｎｇ／ｍＬまでの各種濃度で血清ＤＮＡを抽出した。
【００８２】
検体採取およびＤＮＡ抽出。ＮＳＣＬＣ患者２６名から採血を行ってから、ゲフィチニブ投与を開始した。分離した血清を、使用時まで−８０℃で保存した。下記のプロトコール変更を加えてＱｉａｍｐ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（Qiagen, Hilden, Germany）を用い、血清ＤＮＡを抽出し、精製した。サンプル全体が処理されるまで、１本のカラムを繰り返し用いた。得られたＤＮＡを、無菌の２回蒸留緩衝液５０μＬに溶出させた。抽出ＤＮＡの濃度および純度を、分光測光によって求めた。抽出したＤＮＡは、使用時まで−２０℃で保存した。
【００８３】
実施例２−Ｅ７４６Ａ７５０ｄｅｌおよびＬ８５８ＲＥＧＦＲ突然変異を検出するためのＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーおよび増幅不応突然変異系（ＡＲＭＳ）の使用
ＥＧＦＲ ＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭ Ｋｉｔの感度
予備実験を行って、ＥＧＦＲ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｋｉｔの感度を評価する（図１）。１ｐｇ〜１００００ｐｇの容量でＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡを用いた全ての曲線が、４５サイクルに達するまでに増加した（図１ａ）。野生型標準ＤＮＡおよび水を陰性対照として用いた場合、曲線は増加せず、５０サイクルに到達した時点で平坦なままであった（図１ａ）。１００〜１０−５の比で野生標準ＤＮＡを含む希釈Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡを用いると、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌの存在を示した全ての曲線が、４５サイクルに到達するまでに増加した（図１ｂ）。この研究で測定した容量範囲での標準曲線は直線であり、ｒ２値は０．９９７および０．９８７であった。いずれの曲線の傾きもほぼ平行であった（図１ｃ）。野生型ＤＮＡを含む希釈Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡのＣｔは、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡの全ての容量で、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡのみの値に近かった。野生型ＤＮＡを含む希釈Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ標準ＤＮＡのピーク蛍光レベルは、１０−３未満の比率で野生型ＤＮＡ標準を含まない場合より低かったが、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌの存在が明瞭に検出された。１ｐｇまでの量でＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを含むＤＮＡの曲線は、野生型ＥＧＦＲのＤＮＡの混入による影響を受けなかった。ヒト癌細胞株のゲノムＤＮＡを用いた細胞ベースの実験では、ＰＣ−９細胞由来のＤＮＡを用いたシグナルが検出され、Ａ４３１細胞からのものは予想通り検出されなかった（図２）。
【００８４】
本発明者らは、２つの技術、すなわちＡＲＭＳＴＭおよびＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭを併用したＥＧＦＲ ＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭ Ｋｉｔ（DxS Ltd, Manchester, UK）を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応で突然変異を検出した。エキソン１９およびエキソン２１の両方におけるＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ、Ｌ８５８Ｒおよび野生型の検出のための４種類のｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーを設計し、それをＤｘＳ社（DxS Ltd, Manchester, UK）が合成した。Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌおよびＬ８５８Ｒ用のｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーの配列は、ＥＧＦＲについてＧｅｎＢａｎｋに記録されたヒト配列（登録番号：ＡＹ５８８２４６）を基礎とした。反応はいずれも、鋳型ＤＮＡ１μＬ、反応緩衝液混合物７．５μＬ、プライマー混合物０．６ｍＬおよびＴａｑポリメラーゼ０．１ｍＬを用い、容量２５μＬで行った。全ての試薬がこのキットに含まれている。リアルタイムＰＣＲを、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）を以下の条件で用いて実施した：９５℃で１０分間の初回変性、９５℃３０秒、６２℃６０秒の５０サイクル、各サイクル終了後の蛍光読み取り（４８０ｎｍでの光学的励起および５２０ｎｍでの測定が可能なＦＡＭに設定）。データ解析は、Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒソフトウェア（Ｖｅｒ．１．２ｂ）を用いて行った。閾値サイクル（Ｃｔ）は、増殖曲線の最大曲率点を表す二次誘導曲線の最高ピークでのサイクルと定義した。Ｃｔおよび最大蛍光（ＦＩ）の両方を、結果の解釈に用いた。陽性結果は、Ｃｔ≦４５およびＦＩ≧５０と定義した。これらの解析は、各サンプルについて二回行った。Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌの検出についての感度を確認するため、本発明者らはＥＧＦＲ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｋｉｔに含まれる標準ＤＮＡを用いた。１、１０、１００、１０００または１００００ｐｇの容量でＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを含む標準ＤＮＡ、および１００００ｐｇで野生型を含む標準ＤＮＡと１、１０、１００、１０００もしくは１００００ｐｇの容量でＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを含む標準ＤＮＡとの混合物を用いた。定量のために、既知標準のＤＮＡ容量の対数に対してＣｔのサイクル数をプロットすることで、標準曲線を得た。直線相関係数（Ｒ２）値および勾配の式を計算した。陽性対照用のＤＮＡは、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを含むことが知られている日本人の腺癌ＰＣ−９細胞株およびエキソン１９に野生型を含むことが知られているヒト類表皮癌Ａ４３１細胞株から抽出し、それらのＤＮＡ１００００ｐｇを用いた。
【００８５】
ＡＲＭＳによって検出された血清ＤＮＡのＥＧＦＲ突然変異状態
ＮＳＣＬＣ患者２７名由来の血清ＤＮＡのＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌまたはＬ８５８Ｒを調べた。エキソン１９およびエキソン２１の両方における野生型を、全ての血清サンプルから検出した。Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを、１２名の患者のサンプルで検出した。Ｌ８５８Ｒは１名の患者で検出された（表２）。合計で、ＥＧＦＲ突然変異は、患者２７名のうち１３名で検出された（４８．１％）。本来の腫瘍の組織学的サブタイプを、血清中にＥＧＦＲ突然変異を有する患者２３名において表３ａにまとめた。２３名の腺癌患者の２３症例のうちの１１症例（４７．８％）、扁平上皮細胞癌の２症例のうちの１症例および大細胞癌の２症例のうちの１症例が、ＥＧＦＲ突然変異に関して陽性であった。ＥＧＦＲ突然変異状態は、組織学的タイプと統計的に相関していなかった。ＥＧＦＲ突然変異は、男性患者の場合より女性患者由来のサンプルにおいてより高頻度で検出された（１０名中７名；７０％対１７名中６名；２９．４％、表３ｂ）。
【００８６】
血清におけるＥＧＦＲ突然変異状態およびゲフィチニブに対する応答
ＥＧＦＲ突然変異は、進行性疾患患者由来のサンプル（ＰＤ、１０症例中２症例、１８％）より、部分的応答（ＰＲ）または安定疾患（ＳＤ）を示した患者由来のサンプル（１７症例中１１症例、７５％）において有意に高頻度で認められた（ｐ＝０．０４６、フィッシャーの直接確率検定、表３ｃ）。
【００８７】
実施例３：血清におけるＥＧＦＲ突然変異状態および生存期間に対する影響
統計解析。フィッシャーの直接確率検定を用いて、性別、腫瘍型およびゲフィチニブに対する応答などの異なる特徴を有するＮＳＣＬＣ患者においてＥＧＦＲ突然変異の存在を比較した。ゲフィチニブに対する応答の解析に関しては、患者をＲＥＣＩＳＴ基準に応じて部分的応答または安定疾患（ＰＲ／ＳＤ）と進行性疾患（ＰＤ）の２つの群に分類した。本発明者らは、標準的なログランク検定を用いて、全生存期間および無増悪生存期間に関してＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を比較した。全生存期間（ＯＳ）は、ゲフィチニブ投与開始から何らかの原因による死亡までの時間と定義し、解析の時点でなお生存していることがわかっている患者は、その患者の最後の追跡調査時点で打ち切った。無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、ゲフィチニブ投与開始から進行性疾患の最初の発現または何らかの原因による死亡までの時間と定義し、解析時点で生存していることがわかっており、かつ進行性疾患のない患者は、その患者の最後の追跡調査時点で打ち切った。０．０５のＰ値を、統計的に有意であるとみなした。統計解析は、Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗソフトウェアパッケージ、バージョン５．０を用いて行った。
【００８８】
ゲフィチニブ治療を行った患者全員のＰＦＳ中央値は９８日であり、ＯＳ中央値は３０６日であった。血清にＥＧＦＲ突然変異のある患者は、ＥＧＦＲ突然変異のない患者と比較して有意に長いＰＦＳ中央値を示した（２００日対４６日、Ｐ＝０．００５、図３ａ）。ＥＧＦＲ突然変異を有する患者はＥＧＦＲ突然変異のない患者と比較して長いＯＳ中央値を示したが、統計的有意差はなかった（６１１日対２３２日、Ｐ＝０．０７８、図３ｂ）。これらの結果は、血清ＥＧＦＲ突然変異が、無増悪生存期間および全生存期間についての予後因子ならびにゲフィチニブで治療を行った患者における応答の予測因子として挙動することを示唆している。
【００８９】
実施例４：直接配列決定により解析した、およびＡＲＭＳと比較して解析した血清におけるＥＧＦＲ突然変異
患者２７名のうちの１０名（３７．０％）から抽出した血清ＤＮＡでの直接配列決定によって、欠失突然変異（Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ）を検出した。
【００９０】
ＰＣＲ増幅および直接配列決定。増幅および直接配列決定を、血清および組織標本から得た各サンプルについて二回実施した。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ１５μＬ、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ）０．７５ユニット、ＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、０．８ｍＭ ｄＮＴＰ、各プライマー０．５μＭおよび多形マーカーに応じた各種濃度のＭｇＣｌ２を用いて、容量２５ｍＬで実施した。プライマーセットの配列および増幅計画は、既報の方法に従った（Nuc. Acids Res. 1989;17:2503-2516）。増幅は、熱サイクラー（Perkin-Elmer, Foster City, CA）を用いて実施した。配列決定は、ＡＢＩプリズム３１０（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて行った。配列をＥＧＦＲについてＧｅｎＢａｎｋに記録されたヒト配列（登録番号：ＡＹ５８８２４６）と比較した。
【００９１】
血清サンプルからのＰＣＲ産物において、エキソン１８、１９、２０および２１に点突然変異は検出されなかった。直接配列決定によって検出された血清ＥＧＦＲ状態は、組織型、性別、ゲフィチニブの応答性（表３）および延命効果（ＰＦＳ：Ｐ＝０．２７７、ＯＳ：Ｐ＝０．８５９、補充データ２）のいずれとも統計的に相関していなかった。直接配列決定によるＥＧＦＲ突然変異状態は、対応のあるサンプルの１５／２７（５５．６％）においてＡＲＭＳによるものと一致していた。４症例におけるＥＧＦＲ突然変異（Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ）が、直接配列決定によって陽性であり、ＡＲＭＳによって陰性であった。８症例が直接配列決定によって陰性であり、ＡＲＭＳによって陽性であった。
【００９２】
実施例５：血清のものと比較した腫瘍におけるＥＧＦＲ突然変異
２０種の腫瘍サンプルを、回顧的に患者１５名から得た。
【００９３】
組織サンプル採取およびＤＮＡ抽出。施設内倫理委員会によって承認されたプロトコールに基づいて、腫瘍標本を得た。治療前の診断用に患者１５名から得た腫瘍材料のパラフィンブロック２０個を、回顧的に採取した。腫瘍サンプル１１種を、経気管支肺生検を介して原発癌から採取し、１種を手術によって切除し、９種を転移部位から得た（骨から４種、リンパ節３種、脳１種および結腸１種）。全ての標本について組織学的検査を行って、ＮＳＣＬＣの診断を確認した。ＤＥＸＰＡＴＴＭキット（TaKaRa Biomedicals, Shiga, Japan）を用いて、腫瘍サンプルからのＤＮＡ抽出を行った。
【００９４】
ＥＧＦＲにおけるエキソン１９および２１の配列決定を、同じＰＣＲ条件下で行った。患者１２名からの腫瘍サンプルを配列決定した（表４）。ＥＧＦＲ突然変異が４症例で検出され（２５．０％）、そのうちの３症例がエキソン１９における１５ｂｐ欠失（Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ）であり、１症例がエキソン２１でのＬ８５８Ｒであった。ＥＧＦＲ突然変異を有する患者の組織型は、３症例で腺癌であり、１症例で大細胞癌であった。これら４名の患者におけるゲフィチニブに対する応答は、２名でＰＲであり、１名でＳＤであり、１名の患者でＰＤであった。他の３つのサンプルは、ＰＣＲ産物の増幅が低かったことから評価しなかった。
【００９５】
腫瘍サンプルおよび血清サンプルのペアを、回顧的に患者１１名から入手した（表４）。腫瘍におけるＥＧＦＲ突然変異状態は、対応のある検体で、８／１１（７２．７％）の血清におけるものと一致していた。Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌは、２名の患者において腫瘍で陽性かつ血清で陰性であり、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌは、１名の患者において腫瘍で陰性かつ血清で陽性であった。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【表２】
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
配列表
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１はＥＧＦＲ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｋｉｔを用いたＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌおよびＬ８５８Ｒの突然変異についての検出感度を示す。（ａ）１０,０００ｐｇ（１０４）、１,０００ｐｇ（１０３）、１００ｐｇ（１０２）、１０ｐｇ（１０１）および１ｐｇ（１００）という各種容量で、Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを有する標準ＤＮＡを用いた。野生型を有する標準ＤＮＡ（Ｗｉｌｄ）および蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を同じ実験で陰性対照として用いた。（ｂ）１ｐｇ〜１０,０００ｐｇの濃度のＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを有する標準ＤＮＡを、１：１（１００）、１：１０（１０−１）、１：１００（１０−２）、１：１,０００（１０−３）および１：１０,０００（１０−４）の比率で野生型の標準ＤＮＡ１０,０００ｐｇと混合した。（ｃ）容量１０,０００ｐｇでのＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを有する標準ＤＮＡから得た一次曲線および二次導関数曲線。二次導関数は、増殖曲線の勾配における変化率を表すものである。閾値サイクルは、二次導関数曲線の最高ピークでのサイクル数と定義される（図１ｃにおける垂直線）。（ｄ）標準曲線は、標準ＤＮＡ容量の対数に対する各曲線のＣｔ（図１Ａおよび１Ｂに示した）をプロットすることで誘導した。
【図２】図２は、肺癌細胞株由来のゲノムＤＮＡにおけるＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌの検出を示す。（ａ）Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌを有するＰＣ−９および野生型を有するＡ４３１。（ｂ）Ｌ８５８ＲおよびＡ４３１を有する１１＿１８。
【図３】図３は、非小細胞肺癌のＥＧＦＲ突然変異状態に関する無増悪生存期間（Ａ）および全生存期間（Ｂ）を示す。（＊）ログランク検定。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥｒｂＢ受容体における１以上の突然変異の検出方法であって、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；および
（ｃ）前記受容体における１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含む、前記方法。
【請求項２】
ＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える前記受容体中の１以上の突然変異の検出を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥｒｂＢ受容体がＥＧＦＲである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答を予測する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；および
（ｃ）前記受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含む、前記方法。
【請求項５】
ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答をモニタリングする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；
（ｃ）前記受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含む、前記方法。
【請求項６】
ＥｒｂＢ受容体薬に対する癌患者の応答の予測が、その患者に対する延命効果を予測するものである請求項４に記載の方法。
【請求項７】
（ｄ）突然変異型および野生型の両方の対立遺伝子が検出される患者は、ＥｒｂＢ受容体薬に対して陽性の応答をするが、野生型の対立遺伝子のみが検出される患者はその薬剤に対して陽性の応答をしないと結論づける段階をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項８】
上記スクリーニング方法が、単一塩基突然変異、小さなインフレーム欠失または塩基置換を検出する対立遺伝子特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応の使用を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記スクリーニング方法が、単一塩基突然変異、小さなインフレーム欠失または塩基置換を検出する対立遺伝子特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイム−ＰＣＲ）の使用を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第１のプライマー対を用いて野生型対立遺伝子を検出し、第２のプライマー対を用いて突然変異対立遺伝子を検出し；各プライマー対のうちの一方のプライマーが、
（ａ）特定の突然変異に特異的な対立遺伝子である末端３′ヌクレオチドを有するプライマー；および
（ｂ）そのプライマーの３′末端での可能な追加のミスマッチ
を含む請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
各プライマー対における一方のプライマーが、
（ａ）プライマー配列および標的配列に特異的なさらなる配列の両方を含む単一分子または核酸二本鎖プローブ；
（ｂ）前記単一分子または核酸二本鎖内のクエンチャー分子の非常に近位にある前記プローブの５′末端に結合した蛍光レポーター色素；
（ｃ）前記プローブの一端にある１以上の非コードヌクレオチド残基；
を含み；
（ｄ）前記レポーター色素およびクエンチャー分子は、前記標的配列の増幅時に分離されるようになる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブがＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記突然変異を、野生型配列のレベルの１０％で存在する突然変異配列を検出することができる技術を用いて検出する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体液が、血液、血清、血漿、汗または唾液のうちのいずれかである請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体液が血清である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥｒｂＢ受容体薬がＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ阻害薬である請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＥｒｂＢ受容体薬がＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である請求項1〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ、ＯＳＩ−７７４、ＣＰ−３５８７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２（ＷＡＹ−１７７８２０）、ラパチニブ（ＧＷ２０１６、ＧＷ−５７２０１６、ＧＳＫ５７２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３、ＰＤ１８３８０５）、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ５５９９６２６、ＺＤ６４７４（ＺａｃｔｉｍａＴＭ）またはＷＯ２００４／００６８４６もしくはＷＯ２００３／０８２２９０に開示のいずれかの化合物からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
最も好ましいＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬がゲフィチニブまたはエルロチニブである請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＥｒｂＢ受容体薬が、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｃ２２５）、マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ／ｒＨｕＭＡｂ−ＥＧＦＲ）、ＭＲ１−１、ＩＭＣ−１１Ｆ８またはＥＧＦＲＬ１１からなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＥｒｂＢ受容体薬を、単独療法としてまたは他の薬剤との併用で使用する請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記突然変異が、核酸の挿入、欠失または置換である請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記突然変異がＥｒｂＢ受容体のチロシンキナーゼドメインで起こる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記突然変異がＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインで起こる請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記突然変異が、ＥＧＦＲのエキソン１８、１９、２０または２１におけるＡＴＰ結合部位周囲に集まっている請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記突然変異が、表５に挙げたＥＧＦＲ突然変異の群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記突然変異が、ＥＧＦＲのエキソン１９におけるＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌおよびエキソン２１におけるＬ８５８Ｒである請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が、白血病、多発性骨髄腫またはリンパ腫などの非固形腫瘍、ならびに胆管、骨、膀胱、脳／ＣＮＳ、神経膠芽腫、乳房、結腸直腸、子宮頚部、子宮内膜、胃、頭部および頚部、肝臓、肺、筋肉、神経、食道、卵巣、膵臓、胸膜／腹膜、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮および外陰部の腫瘍などの固形腫瘍からなる群から選択される癌をわずらっている請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
（ｄ）ＥｒｂＢ受容体の下流シグナリング経路の成分における１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項３０】
ＥｒｂＢ受容体の野生型対立遺伝子を検出するのに用いられる第１のプライマー対およびＥｒｂＢ受容体の突然変異体対立遺伝子を検出するのに用いられる第２のプライマー対を含む組成物であって、各プライマー対における一方のプライマーはさらに、
（ａ）特定の突然変異に特異的な対立遺伝子である末端３′ヌクレオチドを有するプライマー；および
（ｂ）前記プライマーの３′末端における可能な追加のミスマッチ；
（ｃ）プライマー配列および標的配列に特異的なさらなる配列の両方を含む単一分子または核酸二本鎖プローブ；
（ｄ）前記単一分子または核酸二本鎖内でクエンチャー分子の非常に近位にある５′末端に結合した蛍光レポーター色素；
（ｅ）前記プローブの一端にある１以上の非コードヌクレオチド残基
を含み、
（ｆ）前記レポーター色素およびクエンチャー分子が前記標的配列の増幅時に分離されるようになる、前記組成物。
【請求項３１】
ＥｒｂＢ薬に対する患者の応答を予測するための、生体液で実施されるアッセイにおけるＥｒｂＢ受容体に特異的なプライマーの使用。
【請求項３２】
ＥｒｂＢ薬に対する患者の応答を予測するために生体液を調べるための組成物の製造におけるＥｒｂＢ受容体に特異的なプライマーの使用。
【請求項３３】
（ａ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；および
（ｂ）ＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
をさらに含む請求項３１に記載の使用。
【請求項１】
ＥｒｂＢ受容体における１以上の突然変異の検出方法であって、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；および
（ｃ）前記受容体における１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含む、前記方法。
【請求項２】
ＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える前記受容体中の１以上の突然変異の検出を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥｒｂＢ受容体がＥＧＦＲである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答を予測する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；および
（ｃ）前記受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含む、前記方法。
【請求項５】
ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答をモニタリングする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
（ａ）患者由来の生体液サンプルを準備する段階；
（ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；
（ｃ）前記受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
を含む、前記方法。
【請求項６】
ＥｒｂＢ受容体薬に対する癌患者の応答の予測が、その患者に対する延命効果を予測するものである請求項４に記載の方法。
【請求項７】
（ｄ）突然変異型および野生型の両方の対立遺伝子が検出される患者は、ＥｒｂＢ受容体薬に対して陽性の応答をするが、野生型の対立遺伝子のみが検出される患者はその薬剤に対して陽性の応答をしないと結論づける段階をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項８】
上記スクリーニング方法が、単一塩基突然変異、小さなインフレーム欠失または塩基置換を検出する対立遺伝子特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応の使用を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記スクリーニング方法が、単一塩基突然変異、小さなインフレーム欠失または塩基置換を検出する対立遺伝子特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイム−ＰＣＲ）の使用を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第１のプライマー対を用いて野生型対立遺伝子を検出し、第２のプライマー対を用いて突然変異対立遺伝子を検出し；各プライマー対のうちの一方のプライマーが、
（ａ）特定の突然変異に特異的な対立遺伝子である末端３′ヌクレオチドを有するプライマー；および
（ｂ）そのプライマーの３′末端での可能な追加のミスマッチ
を含む請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
各プライマー対における一方のプライマーが、
（ａ）プライマー配列および標的配列に特異的なさらなる配列の両方を含む単一分子または核酸二本鎖プローブ；
（ｂ）前記単一分子または核酸二本鎖内のクエンチャー分子の非常に近位にある前記プローブの５′末端に結合した蛍光レポーター色素；
（ｃ）前記プローブの一端にある１以上の非コードヌクレオチド残基；
を含み；
（ｄ）前記レポーター色素およびクエンチャー分子は、前記標的配列の増幅時に分離されるようになる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブがＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記突然変異を、野生型配列のレベルの１０％で存在する突然変異配列を検出することができる技術を用いて検出する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体液が、血液、血清、血漿、汗または唾液のうちのいずれかである請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体液が血清である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥｒｂＢ受容体薬がＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ阻害薬である請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＥｒｂＢ受容体薬がＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である請求項1〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ、ＯＳＩ−７７４、ＣＰ−３５８７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２（ＷＡＹ−１７７８２０）、ラパチニブ（ＧＷ２０１６、ＧＷ−５７２０１６、ＧＳＫ５７２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３、ＰＤ１８３８０５）、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ５５９９６２６、ＺＤ６４７４（ＺａｃｔｉｍａＴＭ）またはＷＯ２００４／００６８４６もしくはＷＯ２００３／０８２２９０に開示のいずれかの化合物からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
最も好ましいＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬がゲフィチニブまたはエルロチニブである請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＥｒｂＢ受容体薬が、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｃ２２５）、マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ／ｒＨｕＭＡｂ−ＥＧＦＲ）、ＭＲ１−１、ＩＭＣ−１１Ｆ８またはＥＧＦＲＬ１１からなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＥｒｂＢ受容体薬を、単独療法としてまたは他の薬剤との併用で使用する請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記突然変異が、核酸の挿入、欠失または置換である請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記突然変異がＥｒｂＢ受容体のチロシンキナーゼドメインで起こる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記突然変異がＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインで起こる請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記突然変異が、ＥＧＦＲのエキソン１８、１９、２０または２１におけるＡＴＰ結合部位周囲に集まっている請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記突然変異が、表５に挙げたＥＧＦＲ突然変異の群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記突然変異が、ＥＧＦＲのエキソン１９におけるＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌおよびエキソン２１におけるＬ８５８Ｒである請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が、白血病、多発性骨髄腫またはリンパ腫などの非固形腫瘍、ならびに胆管、骨、膀胱、脳／ＣＮＳ、神経膠芽腫、乳房、結腸直腸、子宮頚部、子宮内膜、胃、頭部および頚部、肝臓、肺、筋肉、神経、食道、卵巣、膵臓、胸膜／腹膜、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮および外陰部の腫瘍などの固形腫瘍からなる群から選択される癌をわずらっている請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
（ｄ）ＥｒｂＢ受容体の下流シグナリング経路の成分における１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項３０】
ＥｒｂＢ受容体の野生型対立遺伝子を検出するのに用いられる第１のプライマー対およびＥｒｂＢ受容体の突然変異体対立遺伝子を検出するのに用いられる第２のプライマー対を含む組成物であって、各プライマー対における一方のプライマーはさらに、
（ａ）特定の突然変異に特異的な対立遺伝子である末端３′ヌクレオチドを有するプライマー；および
（ｂ）前記プライマーの３′末端における可能な追加のミスマッチ；
（ｃ）プライマー配列および標的配列に特異的なさらなる配列の両方を含む単一分子または核酸二本鎖プローブ；
（ｄ）前記単一分子または核酸二本鎖内でクエンチャー分子の非常に近位にある５′末端に結合した蛍光レポーター色素；
（ｅ）前記プローブの一端にある１以上の非コードヌクレオチド残基
を含み、
（ｆ）前記レポーター色素およびクエンチャー分子が前記標的配列の増幅時に分離されるようになる、前記組成物。
【請求項３１】
ＥｒｂＢ薬に対する患者の応答を予測するための、生体液で実施されるアッセイにおけるＥｒｂＢ受容体に特異的なプライマーの使用。
【請求項３２】
ＥｒｂＢ薬に対する患者の応答を予測するために生体液を調べるための組成物の製造におけるＥｒｂＢ受容体に特異的なプライマーの使用。
【請求項３３】
（ａ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する段階；および
（ｂ）ＥｒｂＢ受容体におけるチロシンキナーゼ活性を変える１以上の突然変異の存在について前記ＤＮＡをスクリーニングする段階
をさらに含む請求項３１に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５１１００８（Ｐ２００９−５１１００８Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３４０６１（Ｐ２００８−５３４０６１）
【出願日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００４０３６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３９７０５
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５０２０９７０９０）アストラゼネカ ユーケー リミテッド (4)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００４０３６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３９７０５
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５０２０９７０９０）アストラゼネカ ユーケー リミテッド (4)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
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