ＩＬ−１８ＢＰのプロモーター、その製造および使用
本発明は、インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）のプロモーター、その製造および使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）のプロモーター、その製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質に結合するサイトカイン（可溶性サイトカイン受容体）は、通常、それらそれぞれの細胞表面サイトカイン受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。それらは、選択的スプライシングまたは細胞表面受容体のタンパク質分解性切断のいずれかによって産生される。これらの可溶性受容体は、たとえば、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γの可溶性受容体（Novick et al. 1989）、ＴＮＦの可溶性受容体（Engelmann et al. 1989 and Engelmann et al. 1990）、ＩＬ−１およびＩＬ−４の可溶性受容体（Maliszewski et al. 1990）、ならびにＩＦＮ−α／βの可溶性受容体（Novick et al. 1994, Novick et al. 1992） など、これまでに報告されている。オステオプロテゲリン（osteoprotegerin）（ＯＰＧ、破骨細胞阻害因子ＯＣＩＦとしても既知である。）と名づけられたＴＮＦＲ／Ｆａｓファミリーの一員である１つのサイトカイン結合タンパク質は、分泌タンパク質としてのみ存在する可溶性受容体の初めての例のようである（Anderson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasuda et al. 1998）。
【０００３】
インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、ＩＬ−１８カラムで尿からアフィニティー精製された（Novick et al. 1999）。ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＦＮ−γのＩＬ−１８誘導およびインビトロでのＮＦ−ｋＢのＩＬ−１８活性化を廃する（abolishes）。さらに、ＩＬ−１８ＢＰはＬＰＳを注射したマウスでのＩＦＮ−γの誘導を阻害する。ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子はヒトの１１番目の染色体に位置し、ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子を含む８．３ｋｂのゲノム配列中には膜貫通ドメインをコードするエクソンは見出されなかった。選択的ｍＲＮＡスプライシングにより産生されるＩＬ−１８ＢＰの４つのアイソフォームがこれまでにヒトで見つかっている。それらはＩＬ−１８ＢＰａ、ｂ、ｃおよびｄと名付けられ、すべて共通のＮ末端を有し、Ｃ末端は異なっている（Novick et al 1999）。
【０００４】
これらのアイソフォームは、ＩＬ−１８を結合する能力の点で異なる（Kim et al. 2000）。４つのうち、ヒトＩＬ−１８ＢＰ（ｈＩＬ−１８ＢＰ）アイソフォームａおよびｃは、ＩＬ−１８の中和能力を有することが知られている。もっとも豊富なＩＬ−１８ＢＰのアイソフォームであるスプライス変異体アイソフォームａは、急速な吸着速度、遅い離脱速度、および約０．４ｎＭの解離定数（Ｋｄ）により、ＩＬ−１８に対して高い親和性を示す（Kim et al. 2000）。ＩＬ−１８ＢＰは、本質的には脾臓に発現し（Novick 1999）、そして血漿濃度２．５ｎｇ／ｍｌで循環する（Novick et al. 2001）。ＩＬ−１８ＢＰとＩＬ−１８の相互作用に関与する残基は、コンピューターモデリングの使用を通して（Kim et al. 2000）、また同様のタンパク質ＩＬ−１βとＩＬ−１ＲＩ型との相互作用に基づいて（Vigers et al. 1997）説明されている。ＩＬ−１８ＢＰに結合するＩＬ−１８のモデルにより、ＩＬ−１８の４２位のＧｌｕ残基と８９位のＬｙｓ残基が、ＩＬ−１８ＢＰのＬｙｓ−１３０およびＧｌｕ−１１４にそれぞれ結合すると提案されている（Kim et al. 2000）。
【０００５】
前述したように、ＩＬ−１８はＩＦＮγを誘導し、ＩＦＮγは順にＩＬ−１８ＢＰａのｍＲＮＡ産生をインビトロで誘導することが近年報告されている（Muhl et al 2000）。したがって、ＩＬ−１８ＢＰａは、「遮断（shut off）」シグナルとしてはたらき炎症性応答を終わらせる。
【０００６】
ＩＬ−１８ＢＰは、いくつかのポックスウイルスによってコードされるタンパク質のファミリーに顕著な相同性を有する（Novick et al., 1999, Xiang and Moss 1999）。この推定されるウイルス性ＩＬ−１８ＢＰによるＩＬ−１８の阻害は、炎症性抗ウイルスＴｈ１応答を軽減し得る。
【０００７】
血清ＩＬ−１８ＢＰは、敗血症において有意に上昇されることから、インビボでの免疫応答の制御におけるその役割が示唆される（Novick et al. 2001）。実際、ＩＬ−１８ＢＰは、様々な細胞においてＩＦＮγによって誘導され、ＩＬ−１８媒介免疫応答の負のフィードバック阻害剤としてはたらくことが示唆される（Mughl et al. 2000）。
【０００８】
予備段階の結果は、ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡが白血球、結腸、小腸、前立腺および特に脾臓細胞で検出されることを示す（Novick et al. 1999）。脾臓の構成細胞は、マクロファージ、リンパ球、および血漿細胞と循環血液由来の付加的な細胞で構成される。
【０００９】
転写を制御するエレメント、プロモーターおよびエンハンサーの活性は、細胞の種類でかなり変化する。プロモーターやエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短い配列からなる（Dynan and Tjian 1985, McKnight and Tjian 1986, Sassone-Corsi and Borreli 1986 and Maniatis et al 1987に概観される）。種々の認識配列の組み合わせと同族転写因子の量とは、所定の遺伝子が特定の細胞型において転写される効率を決定する。多くの真核細胞プロモーターは、２種類の認識配列：ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含む。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位の２５〜３０ｂｐ上流に位置し、正確な部位でＲＮＡ合成が開始されるようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを導くことに関与すると考えられている。対照的に、上流プロモーターエレメントは、転写が開始される比率を決定している。エンハンサーエレメントは、連結した同種または異種プロモーターの１０００倍まで転写を刺激することができる。しかしながら、上流プロモーターエレメントとは異なり、エンハンサーは、転写開始部位から下流、またはプロモーターからかなり離れて位置する場合に活性である。細胞遺伝子のエンハンサーの多くは、もっぱら特定の種類の組織または細胞においてのみ作動する（Voss et al. 1986, Maniatis et al. 1987によって概説される）。さらに、いくつかのエンハンサーは、ホルモンまたは金属イオンなどの誘導因子の存在下によって発生される特定の条件下でのみ活性となる（Sassone-Corsi and Borrelli 1986 and Maniatis 1987によって概説される）。細胞エンハンサーの細胞特異性の違いのため、真核細胞発現ベクターに組み込むプロモーターとエンハンサーエレメントとの選択は、組み換え遺伝子を発現させたい細胞種によって決定されるであろう。逆に、特定のプロモーターと細胞エンハンサーを含有する既成のベクターの使用は、発現が得られる細胞の種類を厳しく制限し得る。
【００１０】
異なる種類の細胞では有意な定量的相違が観察されるが、ウイルス由来の多くのエンハンサーエレメントは、広い宿主範囲をもち、多様な組織で活性である。たとえば、ＳＶ４０初期エンハンサーは、多様な哺乳動物種由来の多くの細胞種において無差別に活性であり、その結果、このエンハンサーを組み込んだベクターが使用されている（Dijkema et al. 1985）。広範囲の細胞で活性である他の２つのエンハンサー／プロモーターの組み合わせは、ラウス肉腫ウイルスゲノムの長い反復配列（ＬＴＲ）（Gorman et al. 1982b）およびヒトサイトメガロウイルスに由来する（Boshart et al. 1985）。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、または配列番号２または３のようなそのフラグメントまたは機能的誘導体であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列に関する。
【００１２】
より詳細には、本発明による誘導体は、配列中のサイレンサーエレメントに存在する１つ以上のＡＰ１部位が変異されている本発明のＤＮＡであり得、さらにＤＮＡ配列はＩＬ−１８ＢＰプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含み得る。
【００１３】
本発明の１つの側面では、遺伝子は、たとえば、ＩＬ−１８ＢＰまたは、ルシフェラーゼ、インターフェロン−ベータ、ＴＮＦ、エリスロポエチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター、顆粒細胞コロニー刺激因子、超酸化マンガンジスムターゼ、イムノグロブリン、またはそのフラグメント、成長ホルモン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＩＬ−１８、ｈｓＬＤＬＲおよびＴＮＦ受容体結合タンパク質などの異種遺伝子をコードし得る。
【００１４】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含有するベクター、該ベクターを含有する宿主細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＷＩＳＨ、ＨｅｐＧ２、Ｃｏｓ、ＣＶ−１、ＨｅＬａ、およびＨａｋａｔ Ｕ９３７細胞）、および該宿主細胞を培養し、産生された組換えタンパク質を単離することを含む組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、ウイルスゲノムの一部分、目的の遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントおよびヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含有する組換えウイルスベクターを提供する。より詳細には、ウイルス部分は、たとえば、アデノ随伴ウイルス、ならびにＨＩＶ、ＨＦＶ、ＭＬＶ、ＦＩＶおよびＶＳＶなどのレトロウイルスであり得る。
【００１６】
また、本発明は目的の遺伝子の細胞特異的発現を制御する方法であって、標的哺乳類細胞を、造血幹細胞および単球などの標的細胞において本発明のウイルスベクターで形質転換することを含む方法を提供する。目的の遺伝子は、たとえばＨＩＶ感染症に耐性を与えるタンパク質であり得る。目的の遺伝子の細胞特異的発現を制御することは、たとえば、ＨＩＶ感染症の治療、ＳＣＩＤ、慢性肉芽腫症およびサラセミアなどの造血系疾患の治療において使用することができる。
【００１７】
本発明はさらに、体組織のＩＦＮγの上昇を示す個体における疾患の治療のための遺伝子治療法であって、本発明の有効量のウイルスベクターの投与および任意には、ＩＬ−６および／またはＴＮＦ−αおよび／またはＩＲＦおよび／またはＣ／ＥＢＰβ因子の投与を含む遺伝子治療方法を提供する。
【００１８】
もう１つの側面では、本発明は、本発明のＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を宿すトランスジェニックマウスに関する。
【００１９】
さらに、本発明は、疾患の治療のための医薬の製造におけるヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体の使用であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含む、使用を教示する。
【００２０】
また、本発明は、治療的有効量のヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体を含有する医薬組成物であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含む、医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ＢＰのプロモーターに関する。このプロモーターは、特定の細胞、たとえば単球においてＩＬ−１８ＢＰの構造的な発現を促進し、多くの細胞においてＩＬ−１８ＢＰ発現のＩＦＮγ媒介誘導を促進する。ヒトＩＬ−１８ＢＰのプロモーターは、異種タンパク質の構造的およびＩＦＮγ誘導発現を導くことができる。
【００２２】
本発明は、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列に関する。
【００２３】
ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡは、白血球、結腸、小腸、前立腺および主には脾臓細胞において検出される（Novick et al. 1999）。以下の実施例の１つでは、ＩＬ−１８タンパク質が本質的に単球において発現することを示した。
【００２４】
ＩＬ−１８ＢＰ発現は、単球のみならず多くの種々の細胞においてＩＦＮγによって誘導されることおよびこの誘導はＩＬ−６およびＴＮＦαの添加によりさらに増強されることが見出された。
【００２５】
新規のタンパク質合成が、ＩＦＮγによるＩＬ−１８ＢＰ遺伝子活性化に不可欠であることが見出された。
【００２６】
ヒトＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡの転写開始部位は、５′ＲＡＣＥにより決定した。
【００２７】
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の上流に位置するＺｎフィンガータンパク質の３′端ｍＲＮＡが見出され、それによりＩＬ−１８ＢＰａの潜在的上流調節を塩基１の上流１６０１塩基に制限していた。
【００２８】
６つの調節エレメント（図１）をこの領域内で同定した（転写近位から転写遠位まで）：１−塩基−２４から−３２のガンマ−活性化配列（ＧＡＳ）、２−塩基−５７から−６９にかかるＩＲＦ−１、２応答エレメント（ＩＲＦ−Ｅ）、３−および４−塩基−３０９から−３２２および−６２１から−６３４の２つのＣ／ＥＢＰβ応答エレメント、５−残基−６２５から−１１０６のサイレンサー、ならびに６−塩基−１１０６から−１２７２にかかるエンハンサーエレメント。１６０１ｂｐフラグメントの５′端での順送り切断（progressive truncation）による一連のルシフェラーゼレポーターベクターを、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞癌株）において調べた。配列番号１に示す１２７２ｋｂ領域は、ＩＦＮγによる誘導と同様に、いくつかの組織および細胞種において見られる基礎発現も導く。この領域内の連続した切断ＤＮＡフラグメントのプロモーター活性を調べることにより、配列番号３に示される転写開始部位の近位の１２２ｂｐＤＮＡフラグメントが、最小のプロモーターを含むことが証明された。この最小プロモーターも誘導可能である。しかしながら、この最小プロモーターの上流の他の調節配列は、誘導の程度に寄与している。ＩＲＦ−１とＧＡＳに加えて２つのＣ／ＥＢＰβエレメント（配列番号２に示す）を含有する６３５ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ＩＦＮγによるルシフェラーゼ発現の最大誘導を与えることが見出された。
【００２９】
ＩＲＦ−１欠損マウスで行なったインビボ実験により、ＩＬ−１８ＢＰのＩＦＮγ誘導発現のみならず、基礎発現の媒介物としてのＩＲＦ−１の重要性が確認された。
【００３０】
ＩＦＮγ誘導の際、ＩＲＦ−１因子の発現が誘導され、その因子は、細胞に本質的に存在するＣ／ＥＢＰβと複合化されるということが見出された。その複合体は、近位のＧＡＳプロモーターエレメントとその隣接したＩＲＦ−Ｅプロモーターエレメントに結合する。
【００３１】
転写部位の遠位端に存在するエンハンサーは、ＩＲＦ−１を通して基礎プロモーターと相互作用することが見出された。
【００３２】
本発明は、配列番号１のＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはそのフラグメントおよび遺伝子発現の調節方法に関する。より詳細には、本発明は、ＩＬ−１８ＢＰ １２７２ｂｐ（配列番号１）の単離ＤＮＡ配列または遺伝子発現を導くことができる６３５ｂｐ（配列番号２）および１２２ｂｐ（配列番号３）などのそのフラグメントに関する。
【００３３】
このＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域はクローン化され、配列決定され、ＩＬ−１８ＢＰの転写開始部位の上流１２７２ｂｐ（配列番号１）におけるヌクレオチドに対応する。
【００３４】
本発明は、全ＩＬ−１８ＢＰプロモーター（配列番号１）、また遺伝子の転写、したがって最終的には遺伝子発現を導くことができるそのフラグメント（配列番号２、３）を含むＤＮＡ配列をも包含し、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域の他の部分と共に、あるいは遺伝子の転写を制御するための同種プロモーターまたは異種プロモーターエレメントと共に使用できる。このプロモーターまたはそのフラグメントは、ＩＦＮγにより誘導できる。そのような誘導は、ＩＲＦ−１および／またはＣ／ＥＢＰβの過剰発現によりおよび／またはＩＬ−６および／またはＴＮＦαによる処理によりさらに増強することができる。
【００３５】
配列番号１に示すプロモーターまたは配列番号２もしくは３に示すそのフラグメントの機能的誘導体は、１から１０、好ましくは１から５、より好ましくは１つのヌクレオチドが別のもので置換されているか、または欠失しており、かつ遺伝子発現とＩＦＮγ誘導を導くことができる変異体である。
【００３６】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーター（配列番号１）を含有する本発明のＤＮＡ配列、または配列番号２または３のＤＮＡ配列などのそのフラグメントは、当技術分野において既知の種々の方法を用いて単離することができる。少なくとも、３つの選択的で主要な方法が用いられ得る。
【００３７】
（１）配列を含むゲノムＤＮＡからのＤＮＡ配列の単離；（２）ＤＮＡ配列の化学的合成；および（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ配列の合成。
【００３８】
１番目のアプローチでは、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはＩＬ−１８ＢＰプロモーターエレメントを含むＤＮＡ配列を同定するためにヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングできる。
【００３９】
２番目のアプローチでは、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはＩＬ−１８ＢＰプロモーターエレメントを含むＤＮＡ配列を化学的に合成できる。たとえば、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域またはＩＬ−１８ＢＰプロモーターを含むＤＮＡ配列を、ヌクレオチドの正しい直線配列を形成するようにのちに連続的に連結することができる（適当な末端制限部位を介して）一連の１００塩基オリゴヌクレオチドとして合成することができる。
【００４０】
３番目のアプローチでは、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域またはＩＬ−１８ＢＰプロモーターを含むＤＮＡ配列はＰＣＲを用いて合成することができる。簡単に言えば、標的ＤＮＡ配列の反対のストランドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の１対の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＰＣＲプライマー）が、標的配列上のＤＮＡの介在（intervening）領域を酵素的に増幅するために使用することができる。鋳型の熱変性、プライマーのアニーリング、およびアニーリングしたプライマーの３′末端のＤＮＡポリメラーゼによる伸張の繰り返しサイクルの結果、ＰＣＲプライマーの５′末端により規定されたセグメントの増幅がもたらされる。米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号参照。
【００４１】
本発明のＩＬ−１８ＢＰプロモーターは、異種遺伝子の基礎発現とＩＦＮγによる誘導発現も与えることができるということが示された。したがって、ＩＬ−１８ＢＰのプロモーターは、基礎活性および誘導活性の両方を有する。
【００４２】
そのプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１に示され、プロモーター活性を有するそのフラグメントは、本明細書におけるそのような配列に言及されるが、ヌクレオチド誘導体は、プロモーターまたはプロモーターエレメント機能に影響を及ぼさないように作製することができるということが認識される。これらの改変したヌクレオチド配列は、たとえば変異が結果として、当技術分野において既知の種々の方法を用いて１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、反転または付加という結果になるようにヌクレオチド配列を突然変異させることにより製造され得る。たとえば、Taylor, J. W. et al., Nucl. Acids Res. 13, 8749-8764 (1985)およびKunkel, J. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 482-492 (1985)に記載された部位指定突然変異の方法が用いられ得る。さらに、部位指定突然変異用キットが商業的供給元から購入可能である。たとえば、部位指定突然変異を行なうためのキットが、アマシャム社（Amersham Corp.）（アーリントンハイツ、Ill）から購入可能である。本発明は、プロモーター活性が保持されるおよび／または増強される場合、配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ少なくとも５０％同一、好ましくは７５％同一およびより好ましくは９０％同一の配列を含むＤＮＡを包含する。そのような誘導体、たとえば配列番号１における誘導体の１つは、サイレンサー領域に存在する３つのＡＰ１部位の１つまたはすべてにおいて変異されているものである。
【００４３】
ＩＬ−１８ＢＰのプロモーターを含むヌクレオチド配列、そのフラグメントおよび／またはその誘導体は、適切な宿主細胞においてその遺伝子を発現するために目的の任意の遺伝子のコーディング領域に作動可能に連結できる。作動可能な連結とは、プロモーターおよびエレメントに対する作動可能な連結を意図する。目的の遺伝子の発現については、配列番号１の全ＩＬ−１８ＢＰプロモーター、または配列番号２もしくは配列番号３のようなそのフラグメント、またはその誘導体は、目的の遺伝子に作動可能に連結されることが好ましい。以下の実施例に示すように、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター、または配列番号２もしくは配列番号３のようなそのフラグメントは、異種遺伝子の発現を導くことが可能である。本発明のプロモーターによる同種遺伝子の発現も検討される。
【００４４】
プロモーターは、さらにイントロン、たとえばＩＬ−１８ＢＰの第１イントロンを含有する。
【００４５】
「動作可能に連結された」ＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはプロモーターエレメントは、適切な読み取り枠に結合した核酸分子の転写を導くであろう。異種プロモーターに関しては、本発明のプロモーターおよびエレメントは、それらがそのような異種プロモーターの機能を制御する場合動作可能に連結される。
【００４６】
前述したように、本発明のＩＬ−１８プロモーター、そのフラグメントおよびその誘導配列は、目的の任意の遺伝子を発現するために利用することができる。典型的には、発現ベクターはこの目的で使用される。したがって、本発明はさらに、遺伝子発現を誘導することができ、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはそのフラグメントもしくはその誘導体を含む単離ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターに関する。発現ベクターは、好ましくはそれぞれ配列番号１、２または３に対応するヌクレオチド配列を有するＩＬ−１８ＢＰプロモーター、そのフラグメントまたはその誘導体、またはそのフラグメントおよび／または誘導体を含有する。発現ベクターは、さらに、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター、またはそのフラグメントおよび／またはそのヌクレオチド配列を修飾したその誘導体に作動可能に連結された同種または異種遺伝子を含有することが好ましい。
【００４７】
本発明において有効な発現ベクターは、しばしば環状二本鎖ＤＮＡを意味する「プラスミド」の形態であり、そのベクターの形態おいて染色体に結合しない。しかしながら、本発明は、等価な機能を提供するその他の形態の発現ベクターおよびそののちここに当技術分野において知られるようになる発現ベクターの形態を含むことを意図する。
【００４８】
本発明において有用な発現ベクターは、通常、複製の起源、目的の遺伝子の前（すなわち上流）に位置するＩＬ−１８ＢＰプロモーター、転写終結配列および残余ベクターを含有する。発現ベクターは、当技術分野で既知の他のＤＮＡ配列、たとえば発現産物の安定性に備える安定リーダー配列、発現産物の分泌に備える第２リーダー配列、調節されるために構造遺伝子の発現を可能にする配列（たとえば、成長培地における栄養素またはほかの誘導因子の存在、不存在によって）、形質転換された宿主細胞において形質選択を提供することができるマーキング配列、および制限エンドヌクレアーゼによる切断に部位を提供する配列も含むことができる。使用される実際の発現ベクターの特徴は、用いられる宿主細胞に適合しなければならない。本発明によって検討される発現ベクターは、少なくともＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域またはＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはその改変されたヌクレオチド配列により指示された目的の遺伝子の転写（好ましくは発現）を導くことができる。好適な複製起源は、たとえばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のものがあげられる。好適な終結配列は、たとえばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のものがあげられる。本発明のプロモーターは、たとえば、インターフェロン−ベータ、ＴＮＦ、エリスロポイエチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベータ、顆粒球コロニー刺激因子、超酸化マンガンジスムターゼ、イムノグロブリン、またはそのフラグメント、成長ホルモン、ｈｓＬＤＬＲ、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＩＬ−１８、ＴＮＦ受容体結合タンパク質、およびＩＬ−１８結合タンパク質などの治療物質をコードする遺伝子などの任意の目的の遺伝子のほとんどの発現に用いることができる。これらの物質のすべては当技術分野において既知であり、多くは市販されている。
【００４９】
所望のコーディングおよび制御配列を含む好適な発現ベクターは、当技術分野で既知の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて構築され得る。そのような技術の多くは、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, N.Y. (1989)に記載されている。
【００５０】
本発明は、さらにＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域またはＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはその改変されたヌクレオチド配列を含む遺伝子発現を導くことができる単離ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域は、配列番号１に示すＩＬ−１８ＢＰの転写開始部位の上流１２７２ｂｐに対応するヌクレオチド配列、配列番号２に示す転写開始部位の上流６３５ｂｐに対応するヌクレオチド配列などのそのフラグメント、または配列番号３に示す転写開始部位の上流１２２ｂｐのヌクレオチド配列などのそのフラグメントを有する。また、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域、または配列番号１に示すＩＬ−１８ＢＰまたはそのフラグメントに作動可能に連結された同種または異種遺伝子をさらに含有する発現ベクターを含む宿主細胞が好ましい。好適な宿主細胞には、たとえば、ヒトＨｅＬａ細胞またはアフリカ緑ザル細胞ＣＶ−１およびＣＯＳ−１、ＣＨＯ細胞、ＨｅｐＧ２、ＷＩＳＨ細胞、Ｈａｋａｔ Ｕ９３７などがあげられる。
【００５１】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーターの誘導を可能にし、したがって目的の遺伝子の発現を高めるＩＦＮγの受容体を含有する宿主細胞が好ましい。
【００５２】
発現ベクターは、当技術分野において既知の種々の方法により宿主細胞に導入され得る。たとえば、宿主細胞の発現ベクターによるトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法により行なうことができる。しかしながら、発現ベクターを宿主細胞に導入するための他の方法、たとえば、エレクトロポーレーション、パーティクルガン（biolistic）融合、リポソーム融合、核注入およびウイルスまたはファージ感染も用いることができる。
【００５３】
発現ベクターを適切な宿主細胞に導入するとすぐに、宿主細胞を培養し、目的の遺伝子にコードされるポリペプチドを単離することができる。あるいは、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入するとすぐに、細胞を培養し、所望の細胞密度に到達したのち、細胞をＩＦＮγで刺激し、目的の遺伝子にコードされるポリペプチドを単離することができる。
【００５４】
目的の遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞は、当技術分野で既知の様々な方法を用いて同定することが可能である。たとえば、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、マーカー遺伝子機能の存在または不存在の評価、宿主細胞における目的の遺伝子のｍＲＮＡ転写物の産生によって測定されるような転写のレベルの評価、および遺伝子産物の免疫学的検出を用いることができる。
【００５５】
本発明の発現ベクター、プラスミドまたはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、当技術分野において既知の種々の方法によって決定され得る。たとえば、Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)に記載されたジデオキシ鎖停止反応法（dideoxy chain termination method）、またはProc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)に記載されたマクサム・ギルバート法などが使用され得る。
【００５６】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーター内の特定のヌクレオチドまたは領域は、調節に必要なものとして認定され得るということが理解されるべきである。これらの領域またはヌクレオチドは、エレメントの微細な構造分析により位置付けられ、プロモーターの変異体の機能的能力を分析する実験によって調べることができる。たとえば、プロモーターエレメントの一塩基対変異体または順送り欠失（以下の実施例において使用されたそのもの）は、ＰＣＲを使用して作成することができる。このように、多数の変異したプロモーター領域または欠失構築物は増幅され、そののちレポーター構築物中にクローニングで戻され、そしてトランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ技術で評価される（以下の実施例に示されているように）。これらの増幅されたフラグメントは、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターのコンテクストや、異種プロモーター構築物へもクローニングで戻すことができる。このようにして、遺伝子転写の誘導に重要な正確なヌクレオチド配列が同定される。
【００５７】
この分析は、プロモーター機能に影響しないヌクレオチドの変化、またはプロモーター機能を増加させ得るヌクレオチドの変化も同定するであろう。したがって、機能的誘導プロモーターおよびプロモーターエレメントも構築することができる。
【００５８】
プロモーター領域またはプロモーターの機能的分析は、フットプリントおよびゲル−シフト研究により容易にすることができる。タンパク質の結合を媒介するのに重要な正確な塩基対の知識は、転写応答を媒介するのに重要な塩基の証拠を提供する。
【００５９】
したがって、本発明はさらにＤＮＡ−タンパク質相互作用に重要な塩基対を包含する。そのような塩基対を明らかにすることができる。目的の領域を含むゲノムフラグメントは、インビトロフットプリント実験に用いることができる［Galas et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981)］。単離した制限フラグメントは放射線標識され、そののちそのフラグメントに結合するであろうＤＮＡ結合タンパク質を含むことが期待される細胞から確立した技術で作成された核抽出物とインキュベートされ得る［たとえば、Dignam et al., Nucleic Acid Res. 11, 1475-1489 (1983)］。標識されたＤＮＡフラグメントは核抽出物とインキュベートされ、ＤＮＡｓｅＩで消化され、そして変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動される。細胞抽出物中のＤＮＡ結合タンパク質は、標識された制限フラグメントに含まれるそれらの認識配列に結合し、ＤＮＡｓｅによる消化からＤＮＡを保護する。保護領域は結合部位の輪郭を描く。フラグメントのマクサムおよびギルバート配列決定反応は、ＤＮＡｓｅ消化から保護されるヌクレオチドを定義するマーカーとして使用することができる。
【００６０】
本発明はさらに、プロモーターまたはプロモーターエレメントと相互作用するトランス作用（transacting）因子の同定と特徴づけとに引き付けられる。シス作用調節配列は、トランス作用因子（ＴＡＦ）と呼ばれるタンパク質に対する結合部位としての機能を果たす［Dynan W.S., Tjian T. Nature 316, 774-778 (1985); Maniatis, T. et al., Science 236, 1237-1245 (1987)］。各遺伝子はその各調節配列で１つ以上のタンパク質を結合することが推測され、これらのタンパク質は、互いに相互作用し、転写を制御するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用する。
【００６１】
ＴＡＦｓは、シス作用配列ＤＮＡフラグメントに結合し、その電気泳動度を遅らせるそれらの能力により、核抽出物において同定されている［Dignam, J.D. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983); Dynan, W., Cell 58, 1-4 (1989);Fletcher, C. et al., Cell 773-781 (1987); Scheidereit, C. et al., Cell 51, 783-793 (1987)］。
【００６２】
シス作用配列は、核抽出物での結合活性を測定するためのゲル遅延アッセイにおいて有用である。ゲルシフトアッセイに関する技術は文献に記載されており、フットプリント実験で使用されるものと同じ試薬が多く含まれる［Fried, M. et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981); Revzin, A., Biotechniques 7, 346-355 (1989); Strauss, F. A. et al., Cell 37, 889-901 (1984)］。３２Ｐ標識化制限フラグメントまたは相補オリゴのアニール対のいずれかを結合緩衝液中で核抽出物およびポリｄ（Ｉ−Ｃ）とインキュベートし、この反応の産物を非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。オートラジオグラフィーで決定されるように、ＤＮＡフラグメントのゲル上の位置は、タンパク質がＤＮＡに結合している場合に遅延する。遅延の程度は、タンパク質の大きさの相対的関数である。
【００６３】
そのように同定された結合タンパク質は、ついで精製し、最終的に既知の技術を用いてクローン化することができる。
【００６４】
ＩＬ−１８ＢＰのプロモーターもトランスジェニック研究における用途を見出す。トランスジェニックマウスは、癌などの多くのヒトの疾患の研究のための強力な遺伝的モデルを提供する。それらは、トランスフェクションレポーター遺伝子（たとえばルシフェラーゼ）実験でなされた観測結果を確認、拡張する遺伝子調節の重要なインビボ研究法も提供する［Palmiter, F.L. et al., Ann. Rev. Genet. 20, 465-499 (1986)］。遺伝子発現のシグナル許容発展的関係を分析するための研究は、細胞培養モデルにおいてほとんど行なうことができず、おそらくトランスジェニックモデルで一番研究される。この種の実験は、ヒト調節シグナルがマウスの転写機構により正しく解明されているように、調節配列の種のあいだの顕著な保存のために可能である。
【００６５】
したがって、トランスジェニックマウスにおいて発現される構築物は、ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の調節に関して多くの情報を提供できる。
【００６６】
トランスジェニックマウスは、当技術分野において既知の方法により作成できる。トランスジェニック動物を作成する最も広く使用されている方法は、受精卵の雄の前核へのＤＮＡ分子の注入を伴う［Brinster et al., Cell 27, 223 (1981); Costantini et al., Nature 294, 982 (1981); Harpers et al., Nature 293, 540 (1981); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5016 (1981); Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1260 (1976)］。
【００６７】
ＤＮＡ分子を受精卵細胞に注入するとすぐに、細胞をレシピエントの雌の子宮内に移植し、動物に発育させる。したがって、えられる動物のすべての細胞は、導入された遺伝子配列を含有する。
【００６８】
得られるトランスジェニックマウスまたは創始細胞（founders）は繁殖することができ、子孫は導入遺伝子を発現する創始細胞由来の株を確立するために解析される。トランスジェニック動物において、多様な（multiple）組織を遺伝子発現を観察するためにスクリーニングすることができる。種々のマウス株におけるＲＮＡ研究により、導入遺伝子の発現レベルへの統合部位（integration site）の独立性の評価が可能となるであろう。Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1986)参照。
【００６９】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーターおよびプロモーターエレメントは、遺伝子治療を行なうための有効な手段も提供する。「遺伝子治療」は、治療用途のため生細胞の生物学的性質を変えるための遺伝子産物の発現を改変または操作するための遺伝物質の投与である。細胞は同種異系または自系であり得る。細胞は、被検体への次の投与のためにエクソビボで改変されてもよく、または被検体への直接的に投与される遺伝子治療産物によりインビボで変更されてもよい。
【００７０】
大部分は、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはそのフラグメントおよび／またはその誘導体を含有する構築物は、ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子が正常に発現されるそれらの細胞（たとえば単核細胞）における標的遺伝子の発現のために利用され得る。構築物のヒトなどの動物への導入のために当技術分野において利用できる手段はいずれも使用することができる。これには、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクター（たとえば、Zweibel et al., Science 243, 220 (1989)およびそこで引用されている参考文献など参照）、ならびに他の方法があげられる。
【００７１】
組換えＡＡＶベクターは、肝臓や骨格筋における治療的遺伝子送達に関してかなり前途有望であると示されている（Snyder et al., 1997, Murphy et al., 1997, Song et al., 1998, Snyder et al., 1999, Herzog et al., 1997）。凝固因子ＩＸ遺伝子を壊すことにより作出されたマウスは、重篤な出血性障害を示し、Ｂ型肝炎患者に見られる表現型に非常に似ている。肝臓特異的エンハンサー／プロモーターの制御下に犬の因子ＩＸのｃＤＮＡをコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの単回門脈内注射は、出血性障害の長期の完全な是正をもたらすということが報告されている（Wang et al., 1999）。
【００７２】
マウス白血病ウイルス（ＭＶＬ）などのオンコレトロウイルス由来のレトロウイルスベクターは、ベクターゲノムが標的細胞の染色体に一体化し、結果として導入遺伝子の安定な発現をもたらす（I.M. Verma and N. Somia. Nature 389, 239 (1997)）ため、遺伝子移動のために最も広く使用されているベクターであるが、これらのベクターは、分割細胞（dividing cells）に対して特に良好であると証明された。ＨＩＶベクターなどのレンチウイルスベクターが、非分割細胞に対して現在使用されている（Mioshi et al., Science 1999 283: 682-686）。レンチウイルスのマクロファージなどの非分割細胞への感染能力により、それらは遺伝子移送ツールとしての使用に対するよい候補である。ＨＩＶベクターは、静止ヒト造血幹細胞（ＨＳＣｓ）の形質導入を促進する。
【００７３】
ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）は、完全な造血系を再生する能力を有するので、遺伝性造血障害ならびに他の後天的な障害の遺伝子治療のための魅力的なターゲットである。たとえば、造血幹細胞は、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）の病原に関与することが知られている単球細胞を再生することができる。
【００７４】
造血幹細胞を用いた遺伝子治療の分野における１５年より長い研究にもかかわらず、依然として、これらの細胞に効率的にそして安定して遺伝子を挿入できないことが主な障害である。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づくレトロウイルスベクターは、最も広範囲にわたって使用されているが、多能性ヒトＨＳＣへの比較的低い遺伝子移送とたいてい不充分な遺伝子発現をもたらす。
【００７５】
近年、ＨＩＶ−１の複製を阻害する遺伝子による造血幹細胞の遺伝的改変の試みが、ＨＩＶ−１感染に耐性な単球の開発を目指している（Kohn et al. 1999）。
【００７６】
理論的には、ＨＩＶ−１への耐性を与えることができる遺伝子の造血幹細胞への挿入は、その遺伝子が子孫の成熟単球および他のＨＩＶ−１感受性細胞に存在するようになるという結果をもたらすであろう。したがって、ＨＩＶ−１遺伝子治療に対しては、ＩＬ−１８ＢＰのプロモーターまたはそのフラグメントのような単球において活性なプロモーターの使用が有利である。
【００７７】
ほとんどの血液遺伝病（たとえば、ＳＣＩＤ、慢性肉芽腫症、サラセミアなど）の遺伝子治療は、移植でき、自己再生する（self renewing）ＨＳＣへのエクソビボ遺伝子転移、および１つ以上の細胞系統における導入遺伝子発現の調節を必要とする。ＨＳＣｓの特定の子孫に影響を及ぼす障害（たとえば、異常ヘモグロビン症またはサラセミア、ＨＩＶ−１感染）の修正は、細胞系統特異的方法での治療遺伝子の限定的発現を必要とする（lotti et al. 2002）。これらのケースでは、転移された遺伝子の転写ターゲッティングが不可欠である。異なる種類の細胞における遺伝子発現は、使用されるプロモーターの相対的強度に依存する。しかしながら、これまで行なわれたほとんどの前臨床的研究は、導入遺伝子発現を導くウイルス性、構造性プロモーターの使用に頼っている。たとえば、ＨＩＶ−１ベクターでは、内性ＣＭＶプロモーターが使用され、マウスＣＭＶプロモーターがマウスレトロウイルスベクターＬＴＲで使用される。レトロウイルスベクターの枠組みでの適切な導入遺伝子調節は、ウイルス性の長い末端反復（ＬＴＲ）と内性エンハンサー−プロモーターとのあいだの転写干渉ならびに複合体調節配列の遺伝的不安定性のため、難しい課題である。本発明において、単核細胞において転写を導くことが知られているＩＬ−１８ＢＰプロモーターは、そのような単核細胞の前駆体であるＨＳＣｓにおける導入遺伝子発現を導くために使用される。
【００７８】
「抗ＨＩＶ遺伝子」による造血幹細胞の遺伝的改変は、移植後にＨＩＶ感染に耐性なリンパ球および単球の発達をもたらす。ＨＩＶ−１感染患者のＨＳＣは回収され、ＣＤ３４＋細胞が単離され、インビトロでＩＬ−１８ＢＰプロモーター（レトロウイルスベクターの代わり）の制御下でＨＩＶ−１阻害タンパク質を運ぶレトロウイルスベクターで形質導入され、そしてこれらの細胞をこれらの患者に再注入することができる（Kohn et al. 1999）。
【００７９】
最も一般的に使用されるＨＳＣ源は末梢血造血幹細胞（ＰＢＳＣ）であり、自己移植の環境では大部分は骨髄に代わる（Gale et al. 1992 and Kessinger et al. 1991）。ＰＢＳＣは、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどの因子の３〜５日間の投与により骨髄から末梢循環へ移動し、ついで白血球搬出法により回収することができる。いくつかの研究により、骨髄の代わりに末梢血幹細胞を移植するとより速く植え付け（engraftment）が生じることが示されている（Henon et al. 1992 and Chao et al. 1993）。Ｇ−ＣＳＦ集結ＰＢＳＣに含まれるクローン原性前駆細胞は、レトロウイルス媒介遺伝子移転にかなり敏感であるが、ＰＢＳＣにおける長期的な再構築幹細胞の形質導入ラットは、骨髄と変わりない（Breni et al. 1992, Cassel et al. 1993, Dunbar et al. 1995）。被検体に感染したＨＩＶ−１は、少なくとも疾患の初期のあいだ内因性ＨＩＶ−１レベルのいかなる増加も伴わずＧ−ＣＳＦ集結ＰＢＳＣの動員や収集に成功することができる（Junker et al. 1997 and Slobod et al. 1996）。
【００８０】
造血幹細胞の他の供給源は、レトロウイルス形質導入に敏感であることが示されている臍帯血（ＵＣＢ）であり、骨髄細胞よりなおさらに可能性を秘めている（Moritz et al. 1993 and Hao et al. 1995）。ＨＳＣへのＵＣＢ細胞の使用は、特にＨＩＶ−１感染新生児に有益であり得る。感染は主に周産期であるので、臍帯血は、ＨＩＶ−１に感染した子供や大人の骨髄では減少している造血幹細胞の正常な数と機能を含むはずである（Kearns et al. 1997）。
【００８１】
アンチセンス、リボザイム、ドミナントネガティブ突然変異体（たとえば、ＲｅｖＭ１０）、ＲＮＡデコイ、ウイルスタンパク質または細胞性共受容体の発現を妨げる細胞内抗体などのＨＩＶ−１複製を抑制できる多数の合成遺伝子（「抗−ＨＩＶ−１遺伝子」）が開発されている（Veres et al. 1996, Zhou et al. 1994, Couture et al 1996, Malim et al. 1989, bahner et al. 1993 and Sullenger et al. 1990, Lee et al. 1994, Marasco et al. 1997 and Chen et al. 1997）。多くの場合、これらの抗−ＨＩＶ−１遺伝子はモデル系において有意にＨＩＶ−１の複製を抑制できることが示されており、いくつかのケースでは、細胞へのウイルスの進入を制限しさえする（36, 39-44）。本質的に１００％の患者のＨＳＣおよび得られる単球細胞がＨＩＶ−１複製を指示することができなくされ得る場合、ウイルスの負担は減少する結果となるようである。理論的には、感受性細胞の９９％におけるＨＩＶ−１複製の活性な阻害は、ウイルス容量（load）で３−対数減少（3-log reduction）を実現することが必要とされ、効果は、しばしば高効率の抗レトロウイルス治療によって引き起こされる。しかしながら、高い割合のヒト造血幹細胞を効率的に形質導入する制限された能力により、現在、感受性細胞の大多数を保護することは不可能である。効率的な代替機序は、活性ＨＩＶ−１複製を支持できないように設計された細胞は、ウイルス誘導細胞変性から保護され、したがって、非保護細胞と比較して選択的な延命効果を有する可能性に基づいている。その場合、適度な数の保護細胞がすべての単球の増加した割合を構成し得、いくぶんかの免疫機能保存につながる。
【００８２】
本発明はまた、薬学的に許容し得る担体、および好適な薬物をコードする目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域またはプロモーターに対応する本発明の配列を含むウイルスを含有する医薬組成物に関する。これらの組成物は、好ましくは薬物をＩＦＮγのレベルが上昇されている組織にターゲッティングするために使用され得る。
【００８３】
本発明はここで説明したように、以下の実施例を参考にしてより容易に理解できるであろう。この実施例は、例示的に提供され、また本発明の限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００８４】
単球におけるＩＬ−１８ＢＰの基礎発現
ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡは、白血球、結腸、小腸、前立腺および特には脾臓細胞において検出される（Novick et al. 1999）。脾臓細胞は、マクロファージ、リンパ球および血漿細胞、さらに循環（circulation）由来の細胞から構成される。
【００８５】
細胞におけるＩＬ−１８ＢＰタンパク質の発現を測定するために、特異的ＥＬＩＳＡ試験を用いた（実施例１２）。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本質的にＩＬ−１８ＢＰ（０．７〜１．５ｎｇ／ｍｌ）産生することが見出された。Ｕ−９３７細胞、すなわち組織球性リンパ腫の患者の胸水から得られた悪性腫瘍細胞由来の細胞株は、ＩＬ−１８ＢＰを少しも発現しなかった。Ｕ−９３７細胞は、ホルボールエステルでの処理により最終単球分化へ誘導され得る。０．０７±０．０１ｎｇ／ｍｌの基礎ＩＬ−１８ＢＰ発現は、ＴＰＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）による刺激によってマクロファージ様細胞への細胞の分化後のみ検出された。これらの結果は、ＩＬ−１８ＢＰが本質的に単球およびマクロファージにおいて産生されていることを示す。
【実施例２】
【００８６】
種々の異なる細胞におけるＩＬ−１８ＢＰの誘導
ＩＦＮγがＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡおよびタンパク質を、ケラチノサイト細胞株、結腸癌細胞株、および主には腎臓メサンギウム細胞などの種々の細胞株において誘導されることが以前に報告されている（Muhl et al. 2000）。種々のヒト細胞株および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、ＩＦＮγや他のサイトカインによるＩＬ−１８ＢＰの誘導を検討した。ＩＦＮγは、用量依存的にＩＬ−１８ＢＰ発現を誘導し（ｍＲＮＡのモニタリングについては実施例１１、ＥＬＩＳＡについては実施例１２参照）、ＷＩＳＨおよびＨｅｐＧ２細胞において５０Ｕ／ｍｌのＥＣ50を示した（図２ＡおよびＢ）。ＩＬ−１８ＢＰは、その濃度が２４時間と比較して４８時間で高かったように（図２Ａ）、明らかにＷＩＳＨ細胞の培養上清に蓄積された。
【００８７】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本質的にＩＬ−１８ＢＰ（０．７〜１．５ｎｇ／ｍｌ）を産生し、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）による処理は、ＩＬ−１８ＢＰのレベルを２４時間および４８時間でそれぞれ、１．７±０．１および２．１±０．３倍増加した（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。ＩＬ−１８ＢＰ産生に対する効果は、ＴＰＡによるＰＢＭＣの前処理の際には見られなかった。
【００８８】
ＩＦＮγによるＩＬ−１８ＢＰ誘導をＵ９３７細胞株において検討した。ＩＦＮγは、未分化細胞Ｕ９３７細胞ではＩＬ−１８ＢＰを誘導しなかったが、ホルボールエステル（ＴＰＡ、１０ｎｇ／ｍｌ）によるマクロファージ様細胞への分化ののち、基礎レベルのＩＬ−１８ＢＰ（０．０７±０．０１ｎｇ／ｍｌ）が得られ、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ、２４時間）での誘導の際は、４．６±０．０５倍増加し、９６時間でさらに増加した（示さない）。
【００８９】
ＩＦＮα２、ＩＦＮβ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＴＮＦαなどの他のサイトカインのＩＬ−１８ＢＰ発現に対する効果をＨｅｐＧ２細胞において検討した（図２Ｂ）。ＩＦＮγの存在下または不存在下において種々のサイトカインと共に細胞をインキュベートしたのちに得られた結果（図１ＰＮＡＳウェブ）は、ＩＦＮα２、ＩＦＮβ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＴＮＦαが単独ではＩＬ−１８ＢＰを誘導しないことを示す。しかしながら、ＨｅｐＧ２細胞においては、ＩＬ−６およびＴＮＦαは、ＩＦＮγと相乗的に作用し、統計的に有意なＩＬ−１８ＢＰの増加をもたらした。
【００９０】
これらの結果は、ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＦＮγにより単球および多くの種々の細胞において誘導されることを示唆する。ＩＬ−１８ＢＰのＩＦＮγによる誘導は、ＩＬ−６およびＴＮＦαの添加によりさらに増強される。
【実施例３】
【００９１】
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子は、ＩＦＮγにより転写が調節され、新規のタンパク質合成を必要とする。
【００９２】
ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡのＩＦＮγによる誘導が、転写レベルであるかどうかを確認するために、ＨｅｐＧ２およびＷＩＳＨ細胞に対するインターフェロンの作用を、翻訳阻害剤、すなわちアクチノマイシンＤの存在下において測定した（図３Ａ）。ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡレベルの増加は、ＨｅｐＧ２細胞においてはＩＦＮγ処理の３時間後、そしてＨａｋａｔおよびＷＩＳＨ細胞では５時間後に半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出できた。ＩＦＮγ刺激より前のＨｅｐＧ２およびＷＩＳＨ細胞のアクチノマイシンＤによる前処理は、種々の時点でのＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの発現を廃し、ＩＦＮγ刺激が新規のｍＲＮＡ合成を刺激することを示唆した。
【００９３】
ＩＬ−１８ＢＰの蓄積は、明らかにＩＦＮγ処理後２４時間、およびそれ以後であったようであり、ＩＦＮγによるたとえば転写因子などのタンパク質の前誘導へのＩＬ−１８ＢＰ発現の依存を支持した。したがって、そのような仮説を確認するために、さらにタンパク質阻害剤、シクロヘキシミドを用いてＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡのＩＦＮγによる誘導がタンパク質の新規の合成を必要とするかどうか調べた。図３Ｂにまとめたその結果は、シクロヘキシミドによる細胞の前処理は、ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの誘導を廃したことを示す。この結果は、新規のタンパク質合成が、ＩＦＮγによるＩＬ−１８ＢＰ遺伝子活性化に不可欠であることを示唆している。
【実施例４】
【００９４】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーターをマッピングするためのＩＬ−１８ＢＰａの転写開始部位およびそのプロモーター領域の決定
Ｉｌ−１８ＢＰプロモーター領域を検討するために、まず、転写開始部位を明確に位置付けることが要求される。
【００９５】
ヒトＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡの転写開始部位は、５′ＲＡＣＥにより決定した（ＲＡＣＥ、実施例１４）。最も豊富なスプライス変異体であるＩＬ−１８ＢＰａに相当するただ１つのＰＣＲ産物が５′ＲＡＣＥにより得られた。この産物のＤＮＡ配列分析により、転写開始部位、およびゲノムＩＬ−１８ＢＰＤＮＡの７８５〜８３５位に相当するヒトＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡの５′端で転写開始部位の後ろ５０ｂｐの付加的なエクソンを明らかにした（Ｅｎｔｒｅｚ ｐｕｂｍｅｄ ヌクレオチドデータベース、受託番号 ＡＦ１１０７９８に見られる）。したがって、新しいエクソン−イントロン地図が、ゲノムＤＮＡを新しい５′エクソンが追加されたｍＲＮＡと比較することにより作成された（図４参照）。
【００９６】
ＩＬ−１８ＢＰａの転写開始部位（塩基１）を有する、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域に相当する塩基１の上流のヒトゲノムＤＮＡ（染色体１１ｑ クローン：ＲＰ１１−７５７Ｃ１５、受託番号ＡＰ０００７１９．４ 塩基１５２，１７８の上流のヌクレオチドがさらに分析され得た。このＤＮＡのＢＬＡＳＴプログラムによるＮＣＢＩの発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースとの比較は、Ｚｎフィンガータンパク質（受託番号ＡＫ００１９６１）をコードする＋ストランドでの上流遺伝子を明らかにした。このＺｎフィンガータンパク質の寄託されたｍＲＮＡ配列は、ヒトＥＳＴｓの広範囲のコレクションを細かく調べた「インスタントＲＡＣＥ」プログラム（www.LabOnWeb.com）によりさらに伸張された。そのプログラムは、Ｚｎフィンガータンパク質の３′端ｍＲＮＡを、ゲノムクローンＲＰ１１−７５７Ｃ１５のヌクレオチド１５０，５１７に位置づけ、それにより、ＩＬ−１８ＢＰａの潜在的な上流調節配列を塩基１の上流１６６１塩基に制限した。
【実施例５】
【００９７】
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の上流、異種遺伝子の本質的発現を促進することができる最小プロモーターの探求
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の上流で、ルシフェラーゼレポーター遺伝子などの異種遺伝子の発現を導くことができる最小ＤＮＡフラグメントを見つけるために、ルシフェラーゼ遺伝子に融合された、塩基１の上流のＤＮＡ配列に相当する１６０１ｂｐまでを含み、転写開始部位の下流５０ｂｐ（配列番号５）を含むベクター、ならびにこのＤＮＡの切断型を有するベクター（図５Ａ）を作出した（実施例１５）。１６０１ｂｐ上流ＤＮＡを含むベクター（ｐＧＬ３（１６０１））でトランスフェクトしたヒトＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞癌株）におけるルシフェラーゼ活性は、空のｐＧＬ３ベクターで得られるものより１０．３±０．９倍高かった。そのような活性は、同じＤＮＡを反対の方向で挿入した（ｐＧＬ３（−１６０１））場合には観測されなかった。この結果は、塩基１の上流１６０１ｂｐＤＮＡが基礎プロモーター活性を有するということを証明した。この１６０１ｂｐＤＮＡフラグメントの配列決定試験により、それはＴＡＴＡボックスエレメントを含まず、いくつかのＧＣリッチドメインを転写開始部位近くの塩基−３から−９、−３９から−４８および−１２２から−１３２に有することが明らかになった。プログラムＴＦＳＥＡＲＣＨによる１６０１ｂｐＤＮＡ配列の分析は、塩基−２４から−３２にガンマ活性化配列（ＧＡＳ）を同定した（図１）。さらなる分析により、塩基−５７から−６９にかかるＩＲＦ１、２応答エレメント（ＩＲＦ−Ｅ）および塩基−３０９から−３２２および−６２１から−６３４の２つのＣ／ＥＢＰβ応答エレメント（Ｃ／ＥＢＰ−Ｅ）が明らかになった。
【００９８】
１６０１ｂｐフラグメントの５′端での順送り切断による一連のルシフェラーゼレポーターベクターを検討した。図５Ａにまとめられた結果は、ＩＲＦおよびＧＡＳエレメントのみを含有するｐＧＬ３（１２２）を含むすべての構築物が、少なくとも基礎プロモーター活性の支持においてｐＧＬ３（１６０１）と同等に効果的であった。
【００９９】
これらの結果より、ＩＲＦおよびＧＡＳエレメントを含有する１２２ｂｐフラグメント（配列番号３）は、異種遺伝子の基礎活性を促進するのに充分であるということが明らかになった（図５Ａ）。
【実施例６】
【０１００】
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の上流で異種遺伝子の誘導発現を促進することができる最小プロモーターの探求
ＩＬ−１８ＢＰプロモーターの上流領域でＩＦＮγ誘導ルシフェラーゼ発現を促進することができる最小ＤＮＡフラグメントを同定するために、前述の実施例の切断ＤＮＡベクターを、ＩＦＮγの存在下でトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞において検討した（トランスフェクションについては図５Ｂ、実施例１６参照）。
【０１０１】
図５Ｂにまとめられた結果は、２４時間後、ＩＦＮγは、ＩＲＦ−ＥおよびＧＡＳエレメントのみを含むベクター（ｐＧＬ３（１２２）ベクター）においては、ルシフェラーゼ活性を基礎発現レベルに対して３３倍増加したことを示す。この結果は、ＩＲＦ−Ｅ−ＧＡＳペア単独でＩＦＮγによる異種遺伝子の誘導を媒介できるということを証明している。Ｃ／ＥＢＰ−Ｅ１および２エレメント（ｐＧＬ３（６５６））の封入体は、ＩＦＮγによるルシフェラーゼ活性の誘導を基礎活性の８８倍に有意に増加し、これらのエレメントがＩＦＮγによる誘導性に重要であることを証明した。対照的に、付加的な上流ＤＮＡのそのような挿入物への封入（ｐＧＬ３（１１０６））は、その基礎レベル以上のルシフェラーゼ活性の誘導を廃した。この結果は、サイレンサーエレメントが塩基−６５６から−１１０６の範囲（第２Ｃ／ＥＢＰ−Ｅ１エレメントの上流）に存在するということを示唆した。３つのＡＰ１応答エレメントはサイレンサー領域に存在すること、およびそこにｃ−Ｊｕｎが結合し、そのような３つのＡＰ−１応答エレメントのすべてを通してＩＬ−１８ＢＰ遺伝子のサイレンシングに関与するということを証明した。
【０１０２】
サイレンサーの上流８８塩基によるプロモーターのさらなる伸張（ｐＧＬ３（１２７２））は、ＩＦＮγへの応答を報告し、エンハンサーエレメントは塩基−１１０６から−１２７２に存在し、ＩＦＮγによるその活性化は、隣接するサイレンサーの効果を抑制するということを示唆した。配列のさらなる伸張は、基礎活性またはＩＦＮγ誘導活性に影響を及ぼさず、したがって、全上流調節配列は、塩基−１から−１２７２（配列番号１）の範囲に位置することを示した。
【０１０３】
試験されたすべての構築物のなかで、ｐＧＬ３（６５６）の誘導性が最も高く、このＤＮＡフラグメントがＩＬ−１８ＢＰの最適誘導可能プロモーターを含有することを示している。
【０１０４】
その結果は、最小誘導可能プロモーターは、ＩＲＦ−ＥおよびＧＡＳエレメントを含有する転写開始部位の上流１２２ｂｐ（配列番号３）に位置し、最大および最適な誘導可能プロモーターは、ＩＲＦ−ＥおよびＧＡＳエレメントに加えて２つのＣ／ＥＢＰβエレメントを含有する転写開始部位の上流６５６ｂｐ（配列番号２）に位置することを示す。
【実施例７】
【０１０５】
インビボのＩＬ−１８ＢＰ発現におけるＩＲＦ−１の関与
ＩＬ−１８ＢＰ発現におけるＩＲＦ−１の関与、すなわちＩＬ−１８ＢＰのプロモーターにおいて見出されたその結合部位を探るために、ＩＲＦ−１欠損マウスにおけるＩＬ−１８ＢＰの発現を検討した。
【０１０６】
ＩＬ−１８ＢＰのレベルを、マウスＩＦＮγの投与の前後にＩＲＦ−１欠損マウス（ジャクソン ラボラトリーズ、バー・ハーバー、ＭＥ）において測定し、コントロールＣ５７Ｂ１／６マウスにおけるレベルと比較した（図６）。コントロールＣ５７Ｂ１／６マウスにおける基礎血清ＩＬ−１８ＢＰは、９．１±１．９ｎｇ／ｍｌであり、ＩＦＮγにより２２．４±２．２ｎｇ／ｍｌまで増加した。対照的に、ＩＲＦ−１欠損マウスにおける血清ＩＬ−１８ＢＰは、検出限界以下であり、ＩＦＮγにより、たった０．７±１．１５ｎｇ／ｍｌまで増加した。この結果は、ＩＬ−１８ＢＰのＩＦＮγ誘導発現のみならず、基礎発現の媒介物としてもＩＲＦ−１が重要であることを確認した。
【実施例８】
【０１０７】
誘導条件下でＩＬ−１８ＢＰプロモーターに結合する転写因子の検出
ＩＬ−１８ＢＰプロモーター内の様々な応答エレメントのあいだのタンパク質−ＤＮＡ相互作用を同定するために、電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ 実施例１８）が用いられた。塩基−３３から−７５（ＩＲＦ−Ｅを含有する）および−８から−５５（ＧＡＳを含有する）に対応するラベルされたｄｓＤＮＡプローブを、コントロール細胞とＩＦＮγ処理細胞の核抽出物と結合させた。ＩＲＦ−Ｅ含有プローブと核タンパク質の複合体は、ＩＦＮγとの１時間の細胞のインキュベーションの後に明らかとなり、最大の応答は、３時間で見られた（図７Ａ、レーン１〜５）。予想されたように、ＩＲＦ−Ｅの抗体の添加は、「スーパーシフト」を招き、一方、コントロールの転写１の抗シグナル誘導因子および活性化因子（ＳＴＡＴ１）抗体は、効果を持たなかった（データは示さない）。ＩＲＦ−Ｅとは対照的に、ＧＡＳ−含有プローブは、本質的にタンパク質と関係付けられ（図７Ａ、レーン６）、この複合体は３から６時間ＩＦＮγによる細胞の誘導の際増強された（レーン７、８）。ＧＡＳは、ＩＦＮγ−誘導ＳＴＡＴ１二量体に結合することが予想される。にもかかわらず、その複合体は、ＳＴＡＴ１の抗体に影響されず（レーン１０）、ＩＦＮγ−誘導ＳＴＡＴ１二量体はこのＧＡＳと無関係であることが示唆された。同様の負の結果は、ＩＦＮγでたった１５分または３０分間処理した核抽出物で得られた（データは示さない）。驚くべきことに、この複合体はＣ／ＥＢＰβの抗体により廃止され（レーン９）、ＩＲＦ−１の抗体でスーパーシフトした（レーン１０）。したがって、ＧＡＳ−含有ＤＮＡプローブは合意Ｃ／ＥＢＰβＥの欠如にもかかわらず、Ｃ／ＥＢＰβと結合すると思われる。
【０１０８】
ＥＭＳＡにより得られた結果は、ＩＦＮγによる誘導の際、ＩＲＦ−１はＩＬ−１８ＢＰプロモーターにおけるＩＲＦ−Ｅエレメントに結合することを示唆する。さらに、ＩＲＦ−１およびＣ／ＥＢＰβを含む複合体が形成され、ＧＡＳエレメントに結合する。
【実施例９】
【０１０９】
ＩＬ−１８ＢＰ誘導におけるＩＲＦ−１−Ｃ／ＥＢＰβ複合体の役割の探求
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子誘導におけるＩＲＦ−１およびＣ／ＥＢＰβの役割をさらに研究するために、発現ベクターのトランスフェクションを用いることによるＩＲＦ−１およびＣ／ＥＢＰβの過剰発現ののち、ＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡを半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した（実施例１４、図７Ｂ）。ＨｅｐＧ２細胞における各転写因子または両因子の組合せのいずれの過剰発現もＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡを誘導しなかった。この結果は、付加的なＩＦＮγ−誘導因子がＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の活性化のために要求されるということを示唆した。ＩＦＮγによる誘導ののち、いずれかの１つの発現ベクターによる細胞のトランスフェクションは、ＩＦＮγ単独と比較して、実際はＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡを減じた。対照的に、２つの転写因子の共発現は、ＩＦＮγによるＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの誘導を増加した。この結果は、ＩＲＦ−１およびＣ／ＥＢＰβが、特定の比率で存在しなければならず、あるいは転写開始複合体の内部に複合体を形成するということを示唆している。ＩＲＦ−１とＣ／ＥＢＰβとのあいだの可能な相互作用をさらに研究するために、ｐＧＬ３（１２７２）、定量のＩＲＦ−１発現ベクターおよび可変量のＣ／ＥＢＰβ発現ベクターでの共トランスフェクト細胞によるルシフェラーゼ活性の滴定を行なった。同様に、Ｃ／ＥＢＰβベクターが一定に保たれ、ＩＲＦ−１ベクターが可変量でのルシフェラーゼ活性が測定された。両ケースにおいて、ベル型の用量応答曲線が得られ、最適のＩＬ−１８ＢＰ誘導が、これらの２つの転写因子のあいだの固定モル比を必要とすることが示唆された（図７Ｃ）。
【０１１０】
免疫沈降試験は、ＩＲＦ−１とＣ／ＥＢＰβとのあいだの物理的関係を確認するために実施された（実施例１９、図７Ｄ）。ＩＦＮγ処理細胞由来の核および細胞質タンパク質（実施例１５）のＣ／ＥＢＰβの抗体による免疫沈降（ｉｐ）とそれに続く免疫ブロッティング（ｉｂ）は、Ｃ／ＥＢＰβが本質的にＨｅｐＧ２細胞において発現し、ＩＦＮγに応答して核に移行されるということを明らかにした（上段）。ＩＦＮγによって誘導されないＣ／ＥＢＰβとは対照的に、ＩＲＦ−１の抗体による細胞抽出物のｉｐおよびｉｂは、ＩＦＮγがＩＲＦ−１の発現を誘導することを明らかにした。しかし、Ｃ／ＥＢＰβと同様に、ＩＦＮγ誘導の場合、ＩＲＦ−１は核に移行する（中段）。Ｃ／ＥＢＰβの抗体によるｉｐとそれに続くＩＲＦ−１の抗体によるｉｂは、核画分における安定なＩＲＦ−１−Ｃ／ＥＢＰβ複合体の存在を明らかにした（下段）。これらの結果は、ＩＦＮγ誘導の際のＩＲＦ−１−Ｃ／ＥＢＰβ複合体の形成を確認し、これら２つの転写因子のあいだのそのような複合体の存在の最初の実証である。したがって、ＩＦＮγ誘導では、近位のＧＡＳ含有配列とそれに隣接したＩＲＦ−ＥがＣ／ＥＢＰβおよびＩＲＦ−１の複合体を結び付ける。
【実施例１０】
【０１１１】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーター活性におけるＣ／ＥＢＰ−Ｅｓの役割の探求
−３０９から−３２２位および−６２１から−６３４位の２つのＣ／ＥＢＰβ部位は、隣接したＩＲＦ−Ｅをもたない。実際、−３０９から−３２２位のＣ／ＥＢＰβ部位に対応するプローブのＥＭＳＡ（実施例１８）は、Ｃ／ＥＢＰβの抗体によりスーパーシフトされる（空矢印）が、ＩＲＦ−１の抗体によってはスーパーシフトされない遅延バンド（rentarded band）（塗矢印）を示した（図８Ａ）。したがって、この部位は、Ｃ／ＥＢＰβに結合し、ＩＲＦ−１とのその複合体には結合しないと推論された。さらに、このバンドは、本質的にＣ／ＥＢＰβを発現し、ＩＲＦ−１を欠いた非誘導ＨｅｐＧ２細胞の核抽出物で生成された。実際、ＩＦＮγは、これらの細胞においてＣ／ＥＢＰβの発現を増加させず（図８Ｄ）、その結果、遅延バンドの強度を増加させなかった（図８Ａ）。同様の結果は、より遠位のＣ／ＥＢＰβ部位で得られた（データは示さない）。
【０１１２】
その結果は、ＩＲＦ−１とは異なりＣ／ＥＢＰ転写因子は本質的に発現され、ＩＦＮγによって誘導されないこと、およびＩＲＦ−１およびＧＡＳへの結合に加えて、それはＩＬ−１８ＢＰプロモーターに存在するＣ／ＥＢＰエレメントの両方に結合するということを示す。
【実施例１１】
【０１１３】
ＩＬ−１８ＢＰの発現におけるエンハンサーの役割の研究
遠位のエンハンサーの調節的役割を、ヌクレオチド−１０８１から−１２７２に対応する１９２ｂｐのＤＮＡプローブでＥＭＳＡにより検討した（実施例１８）。コントロールＨｅｐＧ２細胞の核抽出物は、このプローブと複合体を形成した（図８Ｂ、塗矢印）。ＩＦＮγによる細胞の処理では、複合体はより強く、いくぶんより遅延された。ＩＲＦ−１、Ｃ／ＥＢＰβおよびｃＦｏｓに対する抗体によるこの複合体のスーパーシフトが行なわれた。このうち、抗ＩＲＦ−１のみがスーパーシフトを導き出した（図８Ｂ、空矢印）。ヌクレオチド−１０８３から−１１７４に対応する非ラベルｄｓＤＮＡは、放射線ラベルプローブと競合せず、核タンパク質は、残基−１１７５から−１２７２に結合することを示した。ＩＲＦ−Ｅは近位の領域でのみ同定されたので、この結果は、遠位のエンハンサーは、おそらく近位のＩＲＦ−Ｅと関係付けられるということを示唆する。
【０１１４】
これらの結果は、遠位のエンハンサーは、ＩＲＦ−１を通して基礎プロモーターと相互作用するということを示す。
【実施例１２】
【０１１５】
ＩＬ−１８ＢＰに関するＥＬＩＺＡ
ヒトＩＬ−１８ＢＰは、記載されたように二重抗体ＥＬＩＳＡにより測定した（Novicket al. 2001）。マウスＩＬ−１８ＢＰは、マウスＩＬ−１８ＢＰに対するウサギ抗原アフィニティー−精製ポリクローナル抗体およびビオチン化抗体（サイトラブ、イスラエルより入手）を用いて二重抗体ＥＬＩＳＡにより測定した。
【実施例１３】
【０１１６】
ＲＮＡ単離と逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ
血清不含培地での処理後、ＨｅｐＧ２およびＷＩＳＨ細胞（１０6）を示した時間で回収し、総ＲＮＡはＴＲＩ試薬を用いて抽出した。ｃＤＮＡは、ランダム六量体およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（インビトロゲン（商標）、リーク（Leek）、オランダ）を用いて、製造業者の使用説明書にしたがって製造した。ＰＣＲは、以下のプライマー：ヒトＩＬ−１８ＢＰ ５′ＣＡＣＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＴＣＣＴＧＧおよび５′ＣＧＡＣＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣ；ヒトＩＲＦ−１ ５′ＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＡＧおよび５′ＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧ；ヒトβアクチン ５′ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡおよび５′ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣを用いて行なった。増幅は、初期変性（９２℃、２分）、２８サイクルの変性（９２℃、４５秒）、アニーリング（６２℃、１分）および伸張（７２℃、１．５分）、ならびに最終伸張（７２℃、１０分）でなされた。得られたＰＣＲ産物をアガロース（１％）ゲル電気泳動で分析した。
【実施例１４】
【０１１７】
５′ｃＤＮＡ末端の急速増幅（５′ＲＡＣＥ）
５′ＲＡＣＥは、５′ＲＡＣＥシステム（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて製造業者の使用説明書にしたがって行なった。要約すると、ＩＦＮγ処理ＷＩＳＨ細胞からの総ＲＮＡを、ＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡ（ジーンバンク、受託番号ＡＦ１１０７９９）のヌクレオチド８９〜７０に相補的なプライマーを用いて逆転写し（実施例１３）、アンカーＤＮＡで新規に合成された末端をテーリングした。つぎに、アンカーＤＮＡに相補的なフォワードプライマーと、ＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡのヌクレオチド３１〜１１に相補的なネストされたリバースプライマーによりＰＣＲを行なった。ついで、ＰＣＲ産物をサブクローニングし、ＤＮＡ配列分析にかけた。
【実施例１５】
【０１１８】
プラスミドおよびクローニング
１６０１ｂｐの全推定ＩＬ−１８ＢＰａプロモーター領域を、ＫｐｎＩ部位を含むセンスプライマー（Ｓ4753.ｐｇｌ）（５′ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＣ）とＮｈｅＩ部位を含むリバースプライマー（ＲｌｅｘＡ）（５′ＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴ）とを用いてゲノムＤＮＡのＰＣＲにより得た。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ、マジソン、ＷＩ）にクローニングし、ＤＮＡ配列分析により確認した。ＫｐｎＩ−ＮｈｅＩフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙクローンから単離し、急速ＤＮＡライゲーションキット（ロッシュ）を用いてｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ）にライゲートしてｐＧＬ３（１６０１）を得た。一連の５′−切断レポーター（ｐＧＬ３（１４５４）、ｐＧＬ３（１２７４）、ｐＧＬ３（１１０６）、ｐＧＬ３（６５６）、ｐＧＬ３（２８０）およびｐＧＬ３（１２２））を同様にして、同一のリバースプライマーとそれぞれ以下のセンスプライマーで製造した。
【０１１９】
Ｓ334.ｐｇｌ５′：ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＴＧＡＡＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＡＧＡＧ；
Ｓ415.ｐｇｌ５′：ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＴＧＡＧＡＴＣＡ；
Ｓ501.ｐｇｌ５′：ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＴＴＧＣＡＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＡＣ；
１ｅｘＤｐｇｌ５′：ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＧ；
Ｓ504.ｐｇｌ５′：ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＡＣＡＣＴＴＧ；および
Ｓ139.ｐｇｌ５′：ＴＴＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＣＴＡＡＡＧＣ
すべてのＰＣＲ産物は、コントロールとして役立てるために逆方向でもｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターにクローニングした。
【実施例１６】
【０１２０】
一過性トランスフェクションアッセイ
６ウェルプレート（０．５×１０6／ウェル）においてＨｅｐＧ２またはＷＩＳＨ細胞を、ＦｕＧＥＮＥ６および示したルシフェラーゼレポーターベクター（０．５μｇ／ウェル）およびｐＳＶ４０βＧＡＬ（０．２μｇ／ウェル、プロメガ）を用いて製造元の使用説明書にしたがってトランスフェクトした。いくつかのケースでは、共トランスフェクションが、以下の発現ベクター：ｐｃＤＮＡ３−ＩＲＦ−１（０．０７〜１．５μｇ／ウェル、Ｂ．Ｌｅｖｙ博士から提供、テクニオン（Technion）、イスラエル）；ｐｃＤＮＡ３−Ｃ／ＥＢＰβ（０．５〜２．５μｇ／ウェル、Ｄ．Ｚｉｐｏｒｉ博士から提供、ワイズマン インスチチュート オブ サイエンス）１６時間後、細胞をＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１５０Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）またはそれらの示した組合せのいずれかで、血清不含培地において２４時間処理した。ついで細胞を回収し、溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。すべての結果は、βガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。
【実施例１７】
【０１２１】
核および細胞質抽出物の調製
細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、液体窒素で速やかに凍結した。細胞ペレットを、４包装細胞容量（four packed cell volume）の細胞質緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．９、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５容量％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｎａ2ＭｏＯ4、ロイペプチン、ペプスタチンおよびアプロチニン 各２μｇ／ｍｌ）に再懸濁した。溶解物を遠心分離（３０００×ｇ、１０分）し、細胞質タンパク質を含む上清を回収した。ペレットを２．５包装細胞容量の核緩衝液（ＮａＣｌが０．４２Ｍに増加されている以外は細胞質緩衝液と同一）に再懸濁した。核デブリを遠心分離（１，５０００×ｇ、２０分、４℃）により除去し、上清の部分標本を液体窒素で凍結し、−８０℃で保管した。タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（ピアス、ロックフィールド、ＵＳＡ）によりウシ血清アルブミンを標準として用いて決定した。
【実施例１８】
【０１２２】
電気泳動度シフトアッセイ
選択された応答エレメント（１０ｐｍｏｌ）に対応するｄｓオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドキナーゼ（ニュー イングランド バイオラブ（New England Biolabs））により［32Ｐ］３ ＡＴＰで標識した。核抽出物（５μｇタンパク質）を、２０μｌのＥＭＳＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴおよび５容量％グリセロール）中でポリ（ｄＩ−ｄＣ）（アマシャム ファルマシア バイオテクノロジー）と共に前インキュベート（１５分、０℃）した。ついで標識したプローブ（３×１０4ｃｐｍ）を添加し、インキュベーションを室温でさらに３０分継続した。スーパーシフトアッセイのために、試料をプローブの添加前に示した抗体とインキュベートした（４μｇ、１ｈ、０℃）。２００倍過剰の野生型と変異型の競合物を、関連プローブと共に添加した。ついで、反応混合物を５％非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。ゲルを真空で乾燥し、−８０℃で一晩オートラジオグラフにかけた。
【実施例１９】
【０１２３】
免疫沈降（ｉｐ）および免疫ブロット（ｉｂ）分析
核または細胞質タンパク質抽出物（８０μｇ）を、６μｇの示したポリクローナル抗体と共に一晩４℃でインキュベートし、タンパク質Ｇセファロースビーズ（ファルマシア）で１時間室温で免疫沈降した。次にビーズを、１０％ＤＴＴを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で煮沸し、上清を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）により分離した。ついでゲルをニトロセルロース膜にブロットし、示した抗体でタンパク質を検出した。免疫複合体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（商標）（ピアス）検出キットにより同定した。
【実施例２０】
【０１２４】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーターを用いるＣＨＯｒ−ｈｓＬＤＬＲの製造
ヒト可溶性ＬＤＬＲを発現する安定な組換えＣＨＯ細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を欠いたＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞を２つの発現ベクター：ＬＤＬＲのＮ−末端リガンド結合ドメインを含み、アミノ酸残基Ａｓｐ（＋４）で始まりＧｌｕ２９１（＋２９１）までのもの、およびＤＨＦＲ（ＤＨＦＲは初期ＳＶ４０プロモーターによって制御されている）のマウス遺伝子およびＩＬ−１８ＢＰプロモーター（配列番号２）によるｓＬＤＬＲ遺伝子およびＳＶ４０初期領域の転写末端エレメントを含むｐＤＨＦＲでの共トランスフェクションにより作出する。トランスフェクションは、リポフェクトアミン（LipofectAmine）（ギブコ ＢＲＬ）を用いて製造元のプロトコールに従い陽イオンのリポソームにより行なわれた。トランスフェクションの７２時間後に、細胞をデオキシおよびリボヌクレオシドを欠き、１０％透析ＦＣＳを補完した選択培地に移す。ＤＨＦＲ活性を発現する細胞は、トリプシン浸漬ペーパーディスクで細胞をリフティングすることにより単離されるクローンを形成することができる。細胞は増殖し、ｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性に対してスクリーニングした。ついで、トランスフェクトされた細胞をＭＴＸによる遺伝子増幅に付し、そののちサブクローニングし安定な産生クローンを選択する。
【０１２５】
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Zweibel et al. 1989 Science 243:220.
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】５つの調節エレメントを含むＩＬ−１８ＢＰ遺伝子のプロモーター領域の略図を示す。
【図２】ＩＬ−１８ＢＰ誘導の速度論およびＴＮＦαおよびＩＬ−６との相乗効果を示す。（Ａ）ＩＦＮγは、ヒトＷＩＳＨ細胞において用量および時間に依存してＩＬ−１８ＢＰを誘導する。細胞は、示した濃度のＩＦＮγで２４時間および４８時間インキュベートした。（Ｂ）ＴＮＦα、ＩＬ−６とそれらの組み合わせの、ＩＦＮγ誘導ＩＬ−１８ＢＰに対する相乗効果。ＨｅｐＧ２細胞は、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−６（３００Ｕ／ｍｌ）の示した組み合わせでインキュベートした。各組み合わせによるＩＬ−１８ＢＰの誘導は、ＩＦＮγ単独による誘導より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。データは、平均±ＳＤである（ｎ＝３対Ａ、ｎ＝４対Ｂ）。
【図３】ヒトおよびマウスＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の保存されたエクソン−イントロン構成の略図を示す。ヒトＩＬ−１８ＢＰａ遺伝子をマウスＩＬ−１８ＢＰｄ遺伝子と比較した。エクソンを示す。転写開始部位、翻訳開始部位（ＡＴＧ）、終始コドン（Ｓｔｏｐ）、およびポリアデニル化シグナル（ＰＡＳ）をヒトＩＬ−１８ＢＰａ遺伝子について示す。
【図４】ＩＬ−１８ＢＰのＩＦＮγによる誘導は転写レベルであり、新規の（de novo）タンパク質合成に依存するということを示す。（Ａ）アクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ、３０分）で前培養し、洗浄、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）で示した時間インキュベートしたＨｅｐＧ２細胞由来のＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。βアクチンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲをコントロールとして示す。（Ｂ）シクロヘキシミド（２０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）で示した時間前インキュベートしたＨｅｐＧ２細胞由来のＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。
【図５】ヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターを運ぶルシフェラーゼレポーターベクターの基礎活性およびＩＦＮγ誘導活性を示す。転写開始部位（＋１）から伸びる挿入サイズは、括弧に記載する。丸数字は、種々の応答エレメント：１．ＧＡＳ、２．ＩＲＦ−Ｅ、３．Ｃ／ＥＢＰ−Ｅ（２部位）、サイレンサー５．遠位エンハンサーを示す。塗四角は特異的応答エレメントにおける変異を表わす。ＨｅｐＧ２細胞は、示したレポーターベクターとｐＳＶ４０βＧＡＬとで共トランスフェクトされた。すべてのルシフェラーゼ値は、βガラクトシダーゼ活性で標準化した。（Ａ）ｐＧＬ３−ベーシックベクターでトランスフェクトされた細胞の活性と相対的な誘導されていない細胞の抽出物におけるルシフェラーゼ活性。（Ｂ）選択されたベクターでトランスフェクトされ、ＩＦＮγで誘導された細胞におけるルシフェラーゼ活性。誘導倍率は、（Ａ）で与えられている基礎活性に対する。
【図６】ＩＲＦ−１はマウスにおけるＩＬ−１８ＢＰ発現に不可欠であるということを示す。マウスＩＦＮγ（５３，０００ｕ／マウス）を腹腔内に注射したＣ５７Ｂ１／６ ＩＲＦ−１-/-およびコントロールＣ５７ Ｂ１／６マウスの血清ＩＬ−１８ＢＰ。マウスを注射前と注射後２４時間とに採血した。血清ＩＬ−１８ＢＰをＥＬＩＳＡで測定した。データは、平均±ＳＥである（各群ｎ＝６）。コントロールとＩＲＦ−欠損マウスとにおける血清ＩＬ−１８ＢＰの違いは、コントロールマウスにおけるＩＬ−１８ＢＰの誘導と同様に統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【図７】ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子におけるＩＲＦ−１およびＣ／ＥＢＰβの役割とその関連性を示す。（Ａ）塩基−３３〜−７５（ＩＲＦ−Ｅ、左パネル）および−８〜−５５（ＧＡＳ、右パネル）に対応するｄｓＤＮＡプローブの電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ実施例１８）。ＨｅｐＧ２細胞をＩＦＮγで示した時間処理し、核抽出物をＩＲＦ−ＥまたはＧＡＳプローブと反応させた。シフトしたバンドを塗矢印で示す。ＧＡＳ複合体も示した抗体でスーパーシフトに付した。スーパーシフトしたバンドは、空矢印で示す。（Ｂ）ＩＲＦ−１またはＣ／ＥＢＰβ発現ベクターの示した組み合わせでトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞由来のＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。示した場合には、ＩＦＮγを添加し、細胞を５時間後に回収した。値はβアクチンｍＲＮＡで標準化した。（Ｃ）完全なＩＬ−１８ＢＰプロモーターを含有するルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３（１２７２）で、示した濃度のｐＣＤＮＡ３−ＩＲＦ−１（丸）および１μｇ／１０6細胞のｐＣＤＮＡ３−Ｃ／ＥＢＰβと共にトランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼ活性。あるいは、細胞を示した濃度のｐＣＤＮＡ３−Ｃ／ＥＢＰβ（四角）と０．１μｇ／１０6細胞のｐＣＤＮＡ３−ＩＲＦ−１でトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、βＧａｌ活性で標準化した。（Ｄ）ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ、２時間）で処理した細胞の核および細胞質抽出物（抽出物の調製については実施例１７参照）のイムノブロット。抽出物は示した抗体と免疫沈降（ＩＰ）し、イムノブロット（ＩＢ）した。
【図８】ＩＦＮγ誘導の際、ＩＬ−１８ＢＰのプロモーターに結合する因子を示す。（Ａ）近位のＣ／ＥＢＰβ ＥおよびＴＮＦγによる処理後の前細胞抽出物。示した場合には、抽出物を示した抗体でスーパーシフトした。（Ｂ）遠位のエンハンサーに対応するプローブおよびＩＦＮγによる処理後の全細胞抽出物でのＥＭＳＡ。示した場合には、抽出物を示した抗体で、プローブの近位の半分に対応するｄｓＤＮＡとの競合ありまたはなしでスーパーシフトした。シフトしたバンドを塗矢印で示し、スーパーシフトしたバンドを空矢印で示す。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）のプロモーター、その製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質に結合するサイトカイン（可溶性サイトカイン受容体）は、通常、それらそれぞれの細胞表面サイトカイン受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。それらは、選択的スプライシングまたは細胞表面受容体のタンパク質分解性切断のいずれかによって産生される。これらの可溶性受容体は、たとえば、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γの可溶性受容体（Novick et al. 1989）、ＴＮＦの可溶性受容体（Engelmann et al. 1989 and Engelmann et al. 1990）、ＩＬ−１およびＩＬ−４の可溶性受容体（Maliszewski et al. 1990）、ならびにＩＦＮ−α／βの可溶性受容体（Novick et al. 1994, Novick et al. 1992） など、これまでに報告されている。オステオプロテゲリン（osteoprotegerin）（ＯＰＧ、破骨細胞阻害因子ＯＣＩＦとしても既知である。）と名づけられたＴＮＦＲ／Ｆａｓファミリーの一員である１つのサイトカイン結合タンパク質は、分泌タンパク質としてのみ存在する可溶性受容体の初めての例のようである（Anderson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasuda et al. 1998）。
【０００３】
インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、ＩＬ−１８カラムで尿からアフィニティー精製された（Novick et al. 1999）。ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＦＮ−γのＩＬ−１８誘導およびインビトロでのＮＦ−ｋＢのＩＬ−１８活性化を廃する（abolishes）。さらに、ＩＬ−１８ＢＰはＬＰＳを注射したマウスでのＩＦＮ−γの誘導を阻害する。ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子はヒトの１１番目の染色体に位置し、ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子を含む８．３ｋｂのゲノム配列中には膜貫通ドメインをコードするエクソンは見出されなかった。選択的ｍＲＮＡスプライシングにより産生されるＩＬ−１８ＢＰの４つのアイソフォームがこれまでにヒトで見つかっている。それらはＩＬ−１８ＢＰａ、ｂ、ｃおよびｄと名付けられ、すべて共通のＮ末端を有し、Ｃ末端は異なっている（Novick et al 1999）。
【０００４】
これらのアイソフォームは、ＩＬ−１８を結合する能力の点で異なる（Kim et al. 2000）。４つのうち、ヒトＩＬ−１８ＢＰ（ｈＩＬ−１８ＢＰ）アイソフォームａおよびｃは、ＩＬ−１８の中和能力を有することが知られている。もっとも豊富なＩＬ−１８ＢＰのアイソフォームであるスプライス変異体アイソフォームａは、急速な吸着速度、遅い離脱速度、および約０．４ｎＭの解離定数（Ｋｄ）により、ＩＬ−１８に対して高い親和性を示す（Kim et al. 2000）。ＩＬ−１８ＢＰは、本質的には脾臓に発現し（Novick 1999）、そして血漿濃度２．５ｎｇ／ｍｌで循環する（Novick et al. 2001）。ＩＬ−１８ＢＰとＩＬ−１８の相互作用に関与する残基は、コンピューターモデリングの使用を通して（Kim et al. 2000）、また同様のタンパク質ＩＬ−１βとＩＬ−１ＲＩ型との相互作用に基づいて（Vigers et al. 1997）説明されている。ＩＬ−１８ＢＰに結合するＩＬ−１８のモデルにより、ＩＬ−１８の４２位のＧｌｕ残基と８９位のＬｙｓ残基が、ＩＬ−１８ＢＰのＬｙｓ−１３０およびＧｌｕ−１１４にそれぞれ結合すると提案されている（Kim et al. 2000）。
【０００５】
前述したように、ＩＬ−１８はＩＦＮγを誘導し、ＩＦＮγは順にＩＬ−１８ＢＰａのｍＲＮＡ産生をインビトロで誘導することが近年報告されている（Muhl et al 2000）。したがって、ＩＬ−１８ＢＰａは、「遮断（shut off）」シグナルとしてはたらき炎症性応答を終わらせる。
【０００６】
ＩＬ−１８ＢＰは、いくつかのポックスウイルスによってコードされるタンパク質のファミリーに顕著な相同性を有する（Novick et al., 1999, Xiang and Moss 1999）。この推定されるウイルス性ＩＬ−１８ＢＰによるＩＬ−１８の阻害は、炎症性抗ウイルスＴｈ１応答を軽減し得る。
【０００７】
血清ＩＬ−１８ＢＰは、敗血症において有意に上昇されることから、インビボでの免疫応答の制御におけるその役割が示唆される（Novick et al. 2001）。実際、ＩＬ−１８ＢＰは、様々な細胞においてＩＦＮγによって誘導され、ＩＬ−１８媒介免疫応答の負のフィードバック阻害剤としてはたらくことが示唆される（Mughl et al. 2000）。
【０００８】
予備段階の結果は、ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡが白血球、結腸、小腸、前立腺および特に脾臓細胞で検出されることを示す（Novick et al. 1999）。脾臓の構成細胞は、マクロファージ、リンパ球、および血漿細胞と循環血液由来の付加的な細胞で構成される。
【０００９】
転写を制御するエレメント、プロモーターおよびエンハンサーの活性は、細胞の種類でかなり変化する。プロモーターやエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短い配列からなる（Dynan and Tjian 1985, McKnight and Tjian 1986, Sassone-Corsi and Borreli 1986 and Maniatis et al 1987に概観される）。種々の認識配列の組み合わせと同族転写因子の量とは、所定の遺伝子が特定の細胞型において転写される効率を決定する。多くの真核細胞プロモーターは、２種類の認識配列：ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含む。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位の２５〜３０ｂｐ上流に位置し、正確な部位でＲＮＡ合成が開始されるようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを導くことに関与すると考えられている。対照的に、上流プロモーターエレメントは、転写が開始される比率を決定している。エンハンサーエレメントは、連結した同種または異種プロモーターの１０００倍まで転写を刺激することができる。しかしながら、上流プロモーターエレメントとは異なり、エンハンサーは、転写開始部位から下流、またはプロモーターからかなり離れて位置する場合に活性である。細胞遺伝子のエンハンサーの多くは、もっぱら特定の種類の組織または細胞においてのみ作動する（Voss et al. 1986, Maniatis et al. 1987によって概説される）。さらに、いくつかのエンハンサーは、ホルモンまたは金属イオンなどの誘導因子の存在下によって発生される特定の条件下でのみ活性となる（Sassone-Corsi and Borrelli 1986 and Maniatis 1987によって概説される）。細胞エンハンサーの細胞特異性の違いのため、真核細胞発現ベクターに組み込むプロモーターとエンハンサーエレメントとの選択は、組み換え遺伝子を発現させたい細胞種によって決定されるであろう。逆に、特定のプロモーターと細胞エンハンサーを含有する既成のベクターの使用は、発現が得られる細胞の種類を厳しく制限し得る。
【００１０】
異なる種類の細胞では有意な定量的相違が観察されるが、ウイルス由来の多くのエンハンサーエレメントは、広い宿主範囲をもち、多様な組織で活性である。たとえば、ＳＶ４０初期エンハンサーは、多様な哺乳動物種由来の多くの細胞種において無差別に活性であり、その結果、このエンハンサーを組み込んだベクターが使用されている（Dijkema et al. 1985）。広範囲の細胞で活性である他の２つのエンハンサー／プロモーターの組み合わせは、ラウス肉腫ウイルスゲノムの長い反復配列（ＬＴＲ）（Gorman et al. 1982b）およびヒトサイトメガロウイルスに由来する（Boshart et al. 1985）。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、または配列番号２または３のようなそのフラグメントまたは機能的誘導体であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列に関する。
【００１２】
より詳細には、本発明による誘導体は、配列中のサイレンサーエレメントに存在する１つ以上のＡＰ１部位が変異されている本発明のＤＮＡであり得、さらにＤＮＡ配列はＩＬ−１８ＢＰプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含み得る。
【００１３】
本発明の１つの側面では、遺伝子は、たとえば、ＩＬ−１８ＢＰまたは、ルシフェラーゼ、インターフェロン−ベータ、ＴＮＦ、エリスロポエチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター、顆粒細胞コロニー刺激因子、超酸化マンガンジスムターゼ、イムノグロブリン、またはそのフラグメント、成長ホルモン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＩＬ−１８、ｈｓＬＤＬＲおよびＴＮＦ受容体結合タンパク質などの異種遺伝子をコードし得る。
【００１４】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含有するベクター、該ベクターを含有する宿主細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＷＩＳＨ、ＨｅｐＧ２、Ｃｏｓ、ＣＶ−１、ＨｅＬａ、およびＨａｋａｔ Ｕ９３７細胞）、および該宿主細胞を培養し、産生された組換えタンパク質を単離することを含む組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、ウイルスゲノムの一部分、目的の遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントおよびヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含有する組換えウイルスベクターを提供する。より詳細には、ウイルス部分は、たとえば、アデノ随伴ウイルス、ならびにＨＩＶ、ＨＦＶ、ＭＬＶ、ＦＩＶおよびＶＳＶなどのレトロウイルスであり得る。
【００１６】
また、本発明は目的の遺伝子の細胞特異的発現を制御する方法であって、標的哺乳類細胞を、造血幹細胞および単球などの標的細胞において本発明のウイルスベクターで形質転換することを含む方法を提供する。目的の遺伝子は、たとえばＨＩＶ感染症に耐性を与えるタンパク質であり得る。目的の遺伝子の細胞特異的発現を制御することは、たとえば、ＨＩＶ感染症の治療、ＳＣＩＤ、慢性肉芽腫症およびサラセミアなどの造血系疾患の治療において使用することができる。
【００１７】
本発明はさらに、体組織のＩＦＮγの上昇を示す個体における疾患の治療のための遺伝子治療法であって、本発明の有効量のウイルスベクターの投与および任意には、ＩＬ−６および／またはＴＮＦ−αおよび／またはＩＲＦおよび／またはＣ／ＥＢＰβ因子の投与を含む遺伝子治療方法を提供する。
【００１８】
もう１つの側面では、本発明は、本発明のＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を宿すトランスジェニックマウスに関する。
【００１９】
さらに、本発明は、疾患の治療のための医薬の製造におけるヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体の使用であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含む、使用を教示する。
【００２０】
また、本発明は、治療的有効量のヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体を含有する医薬組成物であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含む、医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ＢＰのプロモーターに関する。このプロモーターは、特定の細胞、たとえば単球においてＩＬ−１８ＢＰの構造的な発現を促進し、多くの細胞においてＩＬ−１８ＢＰ発現のＩＦＮγ媒介誘導を促進する。ヒトＩＬ−１８ＢＰのプロモーターは、異種タンパク質の構造的およびＩＦＮγ誘導発現を導くことができる。
【００２２】
本発明は、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列に関する。
【００２３】
ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡは、白血球、結腸、小腸、前立腺および主には脾臓細胞において検出される（Novick et al. 1999）。以下の実施例の１つでは、ＩＬ−１８タンパク質が本質的に単球において発現することを示した。
【００２４】
ＩＬ−１８ＢＰ発現は、単球のみならず多くの種々の細胞においてＩＦＮγによって誘導されることおよびこの誘導はＩＬ−６およびＴＮＦαの添加によりさらに増強されることが見出された。
【００２５】
新規のタンパク質合成が、ＩＦＮγによるＩＬ−１８ＢＰ遺伝子活性化に不可欠であることが見出された。
【００２６】
ヒトＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡの転写開始部位は、５′ＲＡＣＥにより決定した。
【００２７】
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の上流に位置するＺｎフィンガータンパク質の３′端ｍＲＮＡが見出され、それによりＩＬ−１８ＢＰａの潜在的上流調節を塩基１の上流１６０１塩基に制限していた。
【００２８】
６つの調節エレメント（図１）をこの領域内で同定した（転写近位から転写遠位まで）：１−塩基−２４から−３２のガンマ−活性化配列（ＧＡＳ）、２−塩基−５７から−６９にかかるＩＲＦ−１、２応答エレメント（ＩＲＦ−Ｅ）、３−および４−塩基−３０９から−３２２および−６２１から−６３４の２つのＣ／ＥＢＰβ応答エレメント、５−残基−６２５から−１１０６のサイレンサー、ならびに６−塩基−１１０６から−１２７２にかかるエンハンサーエレメント。１６０１ｂｐフラグメントの５′端での順送り切断（progressive truncation）による一連のルシフェラーゼレポーターベクターを、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞癌株）において調べた。配列番号１に示す１２７２ｋｂ領域は、ＩＦＮγによる誘導と同様に、いくつかの組織および細胞種において見られる基礎発現も導く。この領域内の連続した切断ＤＮＡフラグメントのプロモーター活性を調べることにより、配列番号３に示される転写開始部位の近位の１２２ｂｐＤＮＡフラグメントが、最小のプロモーターを含むことが証明された。この最小プロモーターも誘導可能である。しかしながら、この最小プロモーターの上流の他の調節配列は、誘導の程度に寄与している。ＩＲＦ−１とＧＡＳに加えて２つのＣ／ＥＢＰβエレメント（配列番号２に示す）を含有する６３５ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ＩＦＮγによるルシフェラーゼ発現の最大誘導を与えることが見出された。
【００２９】
ＩＲＦ−１欠損マウスで行なったインビボ実験により、ＩＬ−１８ＢＰのＩＦＮγ誘導発現のみならず、基礎発現の媒介物としてのＩＲＦ−１の重要性が確認された。
【００３０】
ＩＦＮγ誘導の際、ＩＲＦ−１因子の発現が誘導され、その因子は、細胞に本質的に存在するＣ／ＥＢＰβと複合化されるということが見出された。その複合体は、近位のＧＡＳプロモーターエレメントとその隣接したＩＲＦ−Ｅプロモーターエレメントに結合する。
【００３１】
転写部位の遠位端に存在するエンハンサーは、ＩＲＦ−１を通して基礎プロモーターと相互作用することが見出された。
【００３２】
本発明は、配列番号１のＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはそのフラグメントおよび遺伝子発現の調節方法に関する。より詳細には、本発明は、ＩＬ−１８ＢＰ １２７２ｂｐ（配列番号１）の単離ＤＮＡ配列または遺伝子発現を導くことができる６３５ｂｐ（配列番号２）および１２２ｂｐ（配列番号３）などのそのフラグメントに関する。
【００３３】
このＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域はクローン化され、配列決定され、ＩＬ−１８ＢＰの転写開始部位の上流１２７２ｂｐ（配列番号１）におけるヌクレオチドに対応する。
【００３４】
本発明は、全ＩＬ−１８ＢＰプロモーター（配列番号１）、また遺伝子の転写、したがって最終的には遺伝子発現を導くことができるそのフラグメント（配列番号２、３）を含むＤＮＡ配列をも包含し、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域の他の部分と共に、あるいは遺伝子の転写を制御するための同種プロモーターまたは異種プロモーターエレメントと共に使用できる。このプロモーターまたはそのフラグメントは、ＩＦＮγにより誘導できる。そのような誘導は、ＩＲＦ−１および／またはＣ／ＥＢＰβの過剰発現によりおよび／またはＩＬ−６および／またはＴＮＦαによる処理によりさらに増強することができる。
【００３５】
配列番号１に示すプロモーターまたは配列番号２もしくは３に示すそのフラグメントの機能的誘導体は、１から１０、好ましくは１から５、より好ましくは１つのヌクレオチドが別のもので置換されているか、または欠失しており、かつ遺伝子発現とＩＦＮγ誘導を導くことができる変異体である。
【００３６】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーター（配列番号１）を含有する本発明のＤＮＡ配列、または配列番号２または３のＤＮＡ配列などのそのフラグメントは、当技術分野において既知の種々の方法を用いて単離することができる。少なくとも、３つの選択的で主要な方法が用いられ得る。
【００３７】
（１）配列を含むゲノムＤＮＡからのＤＮＡ配列の単離；（２）ＤＮＡ配列の化学的合成；および（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ配列の合成。
【００３８】
１番目のアプローチでは、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはＩＬ−１８ＢＰプロモーターエレメントを含むＤＮＡ配列を同定するためにヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングできる。
【００３９】
２番目のアプローチでは、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはＩＬ−１８ＢＰプロモーターエレメントを含むＤＮＡ配列を化学的に合成できる。たとえば、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域またはＩＬ−１８ＢＰプロモーターを含むＤＮＡ配列を、ヌクレオチドの正しい直線配列を形成するようにのちに連続的に連結することができる（適当な末端制限部位を介して）一連の１００塩基オリゴヌクレオチドとして合成することができる。
【００４０】
３番目のアプローチでは、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域またはＩＬ−１８ＢＰプロモーターを含むＤＮＡ配列はＰＣＲを用いて合成することができる。簡単に言えば、標的ＤＮＡ配列の反対のストランドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の１対の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＰＣＲプライマー）が、標的配列上のＤＮＡの介在（intervening）領域を酵素的に増幅するために使用することができる。鋳型の熱変性、プライマーのアニーリング、およびアニーリングしたプライマーの３′末端のＤＮＡポリメラーゼによる伸張の繰り返しサイクルの結果、ＰＣＲプライマーの５′末端により規定されたセグメントの増幅がもたらされる。米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号参照。
【００４１】
本発明のＩＬ−１８ＢＰプロモーターは、異種遺伝子の基礎発現とＩＦＮγによる誘導発現も与えることができるということが示された。したがって、ＩＬ−１８ＢＰのプロモーターは、基礎活性および誘導活性の両方を有する。
【００４２】
そのプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１に示され、プロモーター活性を有するそのフラグメントは、本明細書におけるそのような配列に言及されるが、ヌクレオチド誘導体は、プロモーターまたはプロモーターエレメント機能に影響を及ぼさないように作製することができるということが認識される。これらの改変したヌクレオチド配列は、たとえば変異が結果として、当技術分野において既知の種々の方法を用いて１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、反転または付加という結果になるようにヌクレオチド配列を突然変異させることにより製造され得る。たとえば、Taylor, J. W. et al., Nucl. Acids Res. 13, 8749-8764 (1985)およびKunkel, J. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 482-492 (1985)に記載された部位指定突然変異の方法が用いられ得る。さらに、部位指定突然変異用キットが商業的供給元から購入可能である。たとえば、部位指定突然変異を行なうためのキットが、アマシャム社（Amersham Corp.）（アーリントンハイツ、Ill）から購入可能である。本発明は、プロモーター活性が保持されるおよび／または増強される場合、配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ少なくとも５０％同一、好ましくは７５％同一およびより好ましくは９０％同一の配列を含むＤＮＡを包含する。そのような誘導体、たとえば配列番号１における誘導体の１つは、サイレンサー領域に存在する３つのＡＰ１部位の１つまたはすべてにおいて変異されているものである。
【００４３】
ＩＬ−１８ＢＰのプロモーターを含むヌクレオチド配列、そのフラグメントおよび／またはその誘導体は、適切な宿主細胞においてその遺伝子を発現するために目的の任意の遺伝子のコーディング領域に作動可能に連結できる。作動可能な連結とは、プロモーターおよびエレメントに対する作動可能な連結を意図する。目的の遺伝子の発現については、配列番号１の全ＩＬ−１８ＢＰプロモーター、または配列番号２もしくは配列番号３のようなそのフラグメント、またはその誘導体は、目的の遺伝子に作動可能に連結されることが好ましい。以下の実施例に示すように、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター、または配列番号２もしくは配列番号３のようなそのフラグメントは、異種遺伝子の発現を導くことが可能である。本発明のプロモーターによる同種遺伝子の発現も検討される。
【００４４】
プロモーターは、さらにイントロン、たとえばＩＬ−１８ＢＰの第１イントロンを含有する。
【００４５】
「動作可能に連結された」ＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはプロモーターエレメントは、適切な読み取り枠に結合した核酸分子の転写を導くであろう。異種プロモーターに関しては、本発明のプロモーターおよびエレメントは、それらがそのような異種プロモーターの機能を制御する場合動作可能に連結される。
【００４６】
前述したように、本発明のＩＬ−１８プロモーター、そのフラグメントおよびその誘導配列は、目的の任意の遺伝子を発現するために利用することができる。典型的には、発現ベクターはこの目的で使用される。したがって、本発明はさらに、遺伝子発現を誘導することができ、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはそのフラグメントもしくはその誘導体を含む単離ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターに関する。発現ベクターは、好ましくはそれぞれ配列番号１、２または３に対応するヌクレオチド配列を有するＩＬ−１８ＢＰプロモーター、そのフラグメントまたはその誘導体、またはそのフラグメントおよび／または誘導体を含有する。発現ベクターは、さらに、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター、またはそのフラグメントおよび／またはそのヌクレオチド配列を修飾したその誘導体に作動可能に連結された同種または異種遺伝子を含有することが好ましい。
【００４７】
本発明において有効な発現ベクターは、しばしば環状二本鎖ＤＮＡを意味する「プラスミド」の形態であり、そのベクターの形態おいて染色体に結合しない。しかしながら、本発明は、等価な機能を提供するその他の形態の発現ベクターおよびそののちここに当技術分野において知られるようになる発現ベクターの形態を含むことを意図する。
【００４８】
本発明において有用な発現ベクターは、通常、複製の起源、目的の遺伝子の前（すなわち上流）に位置するＩＬ−１８ＢＰプロモーター、転写終結配列および残余ベクターを含有する。発現ベクターは、当技術分野で既知の他のＤＮＡ配列、たとえば発現産物の安定性に備える安定リーダー配列、発現産物の分泌に備える第２リーダー配列、調節されるために構造遺伝子の発現を可能にする配列（たとえば、成長培地における栄養素またはほかの誘導因子の存在、不存在によって）、形質転換された宿主細胞において形質選択を提供することができるマーキング配列、および制限エンドヌクレアーゼによる切断に部位を提供する配列も含むことができる。使用される実際の発現ベクターの特徴は、用いられる宿主細胞に適合しなければならない。本発明によって検討される発現ベクターは、少なくともＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域またはＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはその改変されたヌクレオチド配列により指示された目的の遺伝子の転写（好ましくは発現）を導くことができる。好適な複製起源は、たとえばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のものがあげられる。好適な終結配列は、たとえばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のものがあげられる。本発明のプロモーターは、たとえば、インターフェロン−ベータ、ＴＮＦ、エリスロポイエチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベータ、顆粒球コロニー刺激因子、超酸化マンガンジスムターゼ、イムノグロブリン、またはそのフラグメント、成長ホルモン、ｈｓＬＤＬＲ、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＩＬ−１８、ＴＮＦ受容体結合タンパク質、およびＩＬ−１８結合タンパク質などの治療物質をコードする遺伝子などの任意の目的の遺伝子のほとんどの発現に用いることができる。これらの物質のすべては当技術分野において既知であり、多くは市販されている。
【００４９】
所望のコーディングおよび制御配列を含む好適な発現ベクターは、当技術分野で既知の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて構築され得る。そのような技術の多くは、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, N.Y. (1989)に記載されている。
【００５０】
本発明は、さらにＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域またはＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはその改変されたヌクレオチド配列を含む遺伝子発現を導くことができる単離ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域は、配列番号１に示すＩＬ−１８ＢＰの転写開始部位の上流１２７２ｂｐに対応するヌクレオチド配列、配列番号２に示す転写開始部位の上流６３５ｂｐに対応するヌクレオチド配列などのそのフラグメント、または配列番号３に示す転写開始部位の上流１２２ｂｐのヌクレオチド配列などのそのフラグメントを有する。また、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域、または配列番号１に示すＩＬ−１８ＢＰまたはそのフラグメントに作動可能に連結された同種または異種遺伝子をさらに含有する発現ベクターを含む宿主細胞が好ましい。好適な宿主細胞には、たとえば、ヒトＨｅＬａ細胞またはアフリカ緑ザル細胞ＣＶ−１およびＣＯＳ−１、ＣＨＯ細胞、ＨｅｐＧ２、ＷＩＳＨ細胞、Ｈａｋａｔ Ｕ９３７などがあげられる。
【００５１】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーターの誘導を可能にし、したがって目的の遺伝子の発現を高めるＩＦＮγの受容体を含有する宿主細胞が好ましい。
【００５２】
発現ベクターは、当技術分野において既知の種々の方法により宿主細胞に導入され得る。たとえば、宿主細胞の発現ベクターによるトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法により行なうことができる。しかしながら、発現ベクターを宿主細胞に導入するための他の方法、たとえば、エレクトロポーレーション、パーティクルガン（biolistic）融合、リポソーム融合、核注入およびウイルスまたはファージ感染も用いることができる。
【００５３】
発現ベクターを適切な宿主細胞に導入するとすぐに、宿主細胞を培養し、目的の遺伝子にコードされるポリペプチドを単離することができる。あるいは、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入するとすぐに、細胞を培養し、所望の細胞密度に到達したのち、細胞をＩＦＮγで刺激し、目的の遺伝子にコードされるポリペプチドを単離することができる。
【００５４】
目的の遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞は、当技術分野で既知の様々な方法を用いて同定することが可能である。たとえば、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、マーカー遺伝子機能の存在または不存在の評価、宿主細胞における目的の遺伝子のｍＲＮＡ転写物の産生によって測定されるような転写のレベルの評価、および遺伝子産物の免疫学的検出を用いることができる。
【００５５】
本発明の発現ベクター、プラスミドまたはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、当技術分野において既知の種々の方法によって決定され得る。たとえば、Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)に記載されたジデオキシ鎖停止反応法（dideoxy chain termination method）、またはProc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)に記載されたマクサム・ギルバート法などが使用され得る。
【００５６】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーター内の特定のヌクレオチドまたは領域は、調節に必要なものとして認定され得るということが理解されるべきである。これらの領域またはヌクレオチドは、エレメントの微細な構造分析により位置付けられ、プロモーターの変異体の機能的能力を分析する実験によって調べることができる。たとえば、プロモーターエレメントの一塩基対変異体または順送り欠失（以下の実施例において使用されたそのもの）は、ＰＣＲを使用して作成することができる。このように、多数の変異したプロモーター領域または欠失構築物は増幅され、そののちレポーター構築物中にクローニングで戻され、そしてトランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ技術で評価される（以下の実施例に示されているように）。これらの増幅されたフラグメントは、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターのコンテクストや、異種プロモーター構築物へもクローニングで戻すことができる。このようにして、遺伝子転写の誘導に重要な正確なヌクレオチド配列が同定される。
【００５７】
この分析は、プロモーター機能に影響しないヌクレオチドの変化、またはプロモーター機能を増加させ得るヌクレオチドの変化も同定するであろう。したがって、機能的誘導プロモーターおよびプロモーターエレメントも構築することができる。
【００５８】
プロモーター領域またはプロモーターの機能的分析は、フットプリントおよびゲル−シフト研究により容易にすることができる。タンパク質の結合を媒介するのに重要な正確な塩基対の知識は、転写応答を媒介するのに重要な塩基の証拠を提供する。
【００５９】
したがって、本発明はさらにＤＮＡ−タンパク質相互作用に重要な塩基対を包含する。そのような塩基対を明らかにすることができる。目的の領域を含むゲノムフラグメントは、インビトロフットプリント実験に用いることができる［Galas et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981)］。単離した制限フラグメントは放射線標識され、そののちそのフラグメントに結合するであろうＤＮＡ結合タンパク質を含むことが期待される細胞から確立した技術で作成された核抽出物とインキュベートされ得る［たとえば、Dignam et al., Nucleic Acid Res. 11, 1475-1489 (1983)］。標識されたＤＮＡフラグメントは核抽出物とインキュベートされ、ＤＮＡｓｅＩで消化され、そして変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動される。細胞抽出物中のＤＮＡ結合タンパク質は、標識された制限フラグメントに含まれるそれらの認識配列に結合し、ＤＮＡｓｅによる消化からＤＮＡを保護する。保護領域は結合部位の輪郭を描く。フラグメントのマクサムおよびギルバート配列決定反応は、ＤＮＡｓｅ消化から保護されるヌクレオチドを定義するマーカーとして使用することができる。
【００６０】
本発明はさらに、プロモーターまたはプロモーターエレメントと相互作用するトランス作用（transacting）因子の同定と特徴づけとに引き付けられる。シス作用調節配列は、トランス作用因子（ＴＡＦ）と呼ばれるタンパク質に対する結合部位としての機能を果たす［Dynan W.S., Tjian T. Nature 316, 774-778 (1985); Maniatis, T. et al., Science 236, 1237-1245 (1987)］。各遺伝子はその各調節配列で１つ以上のタンパク質を結合することが推測され、これらのタンパク質は、互いに相互作用し、転写を制御するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用する。
【００６１】
ＴＡＦｓは、シス作用配列ＤＮＡフラグメントに結合し、その電気泳動度を遅らせるそれらの能力により、核抽出物において同定されている［Dignam, J.D. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983); Dynan, W., Cell 58, 1-4 (1989);Fletcher, C. et al., Cell 773-781 (1987); Scheidereit, C. et al., Cell 51, 783-793 (1987)］。
【００６２】
シス作用配列は、核抽出物での結合活性を測定するためのゲル遅延アッセイにおいて有用である。ゲルシフトアッセイに関する技術は文献に記載されており、フットプリント実験で使用されるものと同じ試薬が多く含まれる［Fried, M. et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981); Revzin, A., Biotechniques 7, 346-355 (1989); Strauss, F. A. et al., Cell 37, 889-901 (1984)］。３２Ｐ標識化制限フラグメントまたは相補オリゴのアニール対のいずれかを結合緩衝液中で核抽出物およびポリｄ（Ｉ−Ｃ）とインキュベートし、この反応の産物を非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。オートラジオグラフィーで決定されるように、ＤＮＡフラグメントのゲル上の位置は、タンパク質がＤＮＡに結合している場合に遅延する。遅延の程度は、タンパク質の大きさの相対的関数である。
【００６３】
そのように同定された結合タンパク質は、ついで精製し、最終的に既知の技術を用いてクローン化することができる。
【００６４】
ＩＬ−１８ＢＰのプロモーターもトランスジェニック研究における用途を見出す。トランスジェニックマウスは、癌などの多くのヒトの疾患の研究のための強力な遺伝的モデルを提供する。それらは、トランスフェクションレポーター遺伝子（たとえばルシフェラーゼ）実験でなされた観測結果を確認、拡張する遺伝子調節の重要なインビボ研究法も提供する［Palmiter, F.L. et al., Ann. Rev. Genet. 20, 465-499 (1986)］。遺伝子発現のシグナル許容発展的関係を分析するための研究は、細胞培養モデルにおいてほとんど行なうことができず、おそらくトランスジェニックモデルで一番研究される。この種の実験は、ヒト調節シグナルがマウスの転写機構により正しく解明されているように、調節配列の種のあいだの顕著な保存のために可能である。
【００６５】
したがって、トランスジェニックマウスにおいて発現される構築物は、ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の調節に関して多くの情報を提供できる。
【００６６】
トランスジェニックマウスは、当技術分野において既知の方法により作成できる。トランスジェニック動物を作成する最も広く使用されている方法は、受精卵の雄の前核へのＤＮＡ分子の注入を伴う［Brinster et al., Cell 27, 223 (1981); Costantini et al., Nature 294, 982 (1981); Harpers et al., Nature 293, 540 (1981); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5016 (1981); Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1260 (1976)］。
【００６７】
ＤＮＡ分子を受精卵細胞に注入するとすぐに、細胞をレシピエントの雌の子宮内に移植し、動物に発育させる。したがって、えられる動物のすべての細胞は、導入された遺伝子配列を含有する。
【００６８】
得られるトランスジェニックマウスまたは創始細胞（founders）は繁殖することができ、子孫は導入遺伝子を発現する創始細胞由来の株を確立するために解析される。トランスジェニック動物において、多様な（multiple）組織を遺伝子発現を観察するためにスクリーニングすることができる。種々のマウス株におけるＲＮＡ研究により、導入遺伝子の発現レベルへの統合部位（integration site）の独立性の評価が可能となるであろう。Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1986)参照。
【００６９】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーターおよびプロモーターエレメントは、遺伝子治療を行なうための有効な手段も提供する。「遺伝子治療」は、治療用途のため生細胞の生物学的性質を変えるための遺伝子産物の発現を改変または操作するための遺伝物質の投与である。細胞は同種異系または自系であり得る。細胞は、被検体への次の投与のためにエクソビボで改変されてもよく、または被検体への直接的に投与される遺伝子治療産物によりインビボで変更されてもよい。
【００７０】
大部分は、ＩＬ−１８ＢＰプロモーターまたはそのフラグメントおよび／またはその誘導体を含有する構築物は、ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子が正常に発現されるそれらの細胞（たとえば単核細胞）における標的遺伝子の発現のために利用され得る。構築物のヒトなどの動物への導入のために当技術分野において利用できる手段はいずれも使用することができる。これには、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクター（たとえば、Zweibel et al., Science 243, 220 (1989)およびそこで引用されている参考文献など参照）、ならびに他の方法があげられる。
【００７１】
組換えＡＡＶベクターは、肝臓や骨格筋における治療的遺伝子送達に関してかなり前途有望であると示されている（Snyder et al., 1997, Murphy et al., 1997, Song et al., 1998, Snyder et al., 1999, Herzog et al., 1997）。凝固因子ＩＸ遺伝子を壊すことにより作出されたマウスは、重篤な出血性障害を示し、Ｂ型肝炎患者に見られる表現型に非常に似ている。肝臓特異的エンハンサー／プロモーターの制御下に犬の因子ＩＸのｃＤＮＡをコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの単回門脈内注射は、出血性障害の長期の完全な是正をもたらすということが報告されている（Wang et al., 1999）。
【００７２】
マウス白血病ウイルス（ＭＶＬ）などのオンコレトロウイルス由来のレトロウイルスベクターは、ベクターゲノムが標的細胞の染色体に一体化し、結果として導入遺伝子の安定な発現をもたらす（I.M. Verma and N. Somia. Nature 389, 239 (1997)）ため、遺伝子移動のために最も広く使用されているベクターであるが、これらのベクターは、分割細胞（dividing cells）に対して特に良好であると証明された。ＨＩＶベクターなどのレンチウイルスベクターが、非分割細胞に対して現在使用されている（Mioshi et al., Science 1999 283: 682-686）。レンチウイルスのマクロファージなどの非分割細胞への感染能力により、それらは遺伝子移送ツールとしての使用に対するよい候補である。ＨＩＶベクターは、静止ヒト造血幹細胞（ＨＳＣｓ）の形質導入を促進する。
【００７３】
ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）は、完全な造血系を再生する能力を有するので、遺伝性造血障害ならびに他の後天的な障害の遺伝子治療のための魅力的なターゲットである。たとえば、造血幹細胞は、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）の病原に関与することが知られている単球細胞を再生することができる。
【００７４】
造血幹細胞を用いた遺伝子治療の分野における１５年より長い研究にもかかわらず、依然として、これらの細胞に効率的にそして安定して遺伝子を挿入できないことが主な障害である。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づくレトロウイルスベクターは、最も広範囲にわたって使用されているが、多能性ヒトＨＳＣへの比較的低い遺伝子移送とたいてい不充分な遺伝子発現をもたらす。
【００７５】
近年、ＨＩＶ−１の複製を阻害する遺伝子による造血幹細胞の遺伝的改変の試みが、ＨＩＶ−１感染に耐性な単球の開発を目指している（Kohn et al. 1999）。
【００７６】
理論的には、ＨＩＶ−１への耐性を与えることができる遺伝子の造血幹細胞への挿入は、その遺伝子が子孫の成熟単球および他のＨＩＶ−１感受性細胞に存在するようになるという結果をもたらすであろう。したがって、ＨＩＶ−１遺伝子治療に対しては、ＩＬ−１８ＢＰのプロモーターまたはそのフラグメントのような単球において活性なプロモーターの使用が有利である。
【００７７】
ほとんどの血液遺伝病（たとえば、ＳＣＩＤ、慢性肉芽腫症、サラセミアなど）の遺伝子治療は、移植でき、自己再生する（self renewing）ＨＳＣへのエクソビボ遺伝子転移、および１つ以上の細胞系統における導入遺伝子発現の調節を必要とする。ＨＳＣｓの特定の子孫に影響を及ぼす障害（たとえば、異常ヘモグロビン症またはサラセミア、ＨＩＶ−１感染）の修正は、細胞系統特異的方法での治療遺伝子の限定的発現を必要とする（lotti et al. 2002）。これらのケースでは、転移された遺伝子の転写ターゲッティングが不可欠である。異なる種類の細胞における遺伝子発現は、使用されるプロモーターの相対的強度に依存する。しかしながら、これまで行なわれたほとんどの前臨床的研究は、導入遺伝子発現を導くウイルス性、構造性プロモーターの使用に頼っている。たとえば、ＨＩＶ−１ベクターでは、内性ＣＭＶプロモーターが使用され、マウスＣＭＶプロモーターがマウスレトロウイルスベクターＬＴＲで使用される。レトロウイルスベクターの枠組みでの適切な導入遺伝子調節は、ウイルス性の長い末端反復（ＬＴＲ）と内性エンハンサー−プロモーターとのあいだの転写干渉ならびに複合体調節配列の遺伝的不安定性のため、難しい課題である。本発明において、単核細胞において転写を導くことが知られているＩＬ−１８ＢＰプロモーターは、そのような単核細胞の前駆体であるＨＳＣｓにおける導入遺伝子発現を導くために使用される。
【００７８】
「抗ＨＩＶ遺伝子」による造血幹細胞の遺伝的改変は、移植後にＨＩＶ感染に耐性なリンパ球および単球の発達をもたらす。ＨＩＶ−１感染患者のＨＳＣは回収され、ＣＤ３４＋細胞が単離され、インビトロでＩＬ−１８ＢＰプロモーター（レトロウイルスベクターの代わり）の制御下でＨＩＶ−１阻害タンパク質を運ぶレトロウイルスベクターで形質導入され、そしてこれらの細胞をこれらの患者に再注入することができる（Kohn et al. 1999）。
【００７９】
最も一般的に使用されるＨＳＣ源は末梢血造血幹細胞（ＰＢＳＣ）であり、自己移植の環境では大部分は骨髄に代わる（Gale et al. 1992 and Kessinger et al. 1991）。ＰＢＳＣは、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどの因子の３〜５日間の投与により骨髄から末梢循環へ移動し、ついで白血球搬出法により回収することができる。いくつかの研究により、骨髄の代わりに末梢血幹細胞を移植するとより速く植え付け（engraftment）が生じることが示されている（Henon et al. 1992 and Chao et al. 1993）。Ｇ−ＣＳＦ集結ＰＢＳＣに含まれるクローン原性前駆細胞は、レトロウイルス媒介遺伝子移転にかなり敏感であるが、ＰＢＳＣにおける長期的な再構築幹細胞の形質導入ラットは、骨髄と変わりない（Breni et al. 1992, Cassel et al. 1993, Dunbar et al. 1995）。被検体に感染したＨＩＶ−１は、少なくとも疾患の初期のあいだ内因性ＨＩＶ−１レベルのいかなる増加も伴わずＧ−ＣＳＦ集結ＰＢＳＣの動員や収集に成功することができる（Junker et al. 1997 and Slobod et al. 1996）。
【００８０】
造血幹細胞の他の供給源は、レトロウイルス形質導入に敏感であることが示されている臍帯血（ＵＣＢ）であり、骨髄細胞よりなおさらに可能性を秘めている（Moritz et al. 1993 and Hao et al. 1995）。ＨＳＣへのＵＣＢ細胞の使用は、特にＨＩＶ−１感染新生児に有益であり得る。感染は主に周産期であるので、臍帯血は、ＨＩＶ−１に感染した子供や大人の骨髄では減少している造血幹細胞の正常な数と機能を含むはずである（Kearns et al. 1997）。
【００８１】
アンチセンス、リボザイム、ドミナントネガティブ突然変異体（たとえば、ＲｅｖＭ１０）、ＲＮＡデコイ、ウイルスタンパク質または細胞性共受容体の発現を妨げる細胞内抗体などのＨＩＶ−１複製を抑制できる多数の合成遺伝子（「抗−ＨＩＶ−１遺伝子」）が開発されている（Veres et al. 1996, Zhou et al. 1994, Couture et al 1996, Malim et al. 1989, bahner et al. 1993 and Sullenger et al. 1990, Lee et al. 1994, Marasco et al. 1997 and Chen et al. 1997）。多くの場合、これらの抗−ＨＩＶ−１遺伝子はモデル系において有意にＨＩＶ−１の複製を抑制できることが示されており、いくつかのケースでは、細胞へのウイルスの進入を制限しさえする（36, 39-44）。本質的に１００％の患者のＨＳＣおよび得られる単球細胞がＨＩＶ−１複製を指示することができなくされ得る場合、ウイルスの負担は減少する結果となるようである。理論的には、感受性細胞の９９％におけるＨＩＶ−１複製の活性な阻害は、ウイルス容量（load）で３−対数減少（3-log reduction）を実現することが必要とされ、効果は、しばしば高効率の抗レトロウイルス治療によって引き起こされる。しかしながら、高い割合のヒト造血幹細胞を効率的に形質導入する制限された能力により、現在、感受性細胞の大多数を保護することは不可能である。効率的な代替機序は、活性ＨＩＶ−１複製を支持できないように設計された細胞は、ウイルス誘導細胞変性から保護され、したがって、非保護細胞と比較して選択的な延命効果を有する可能性に基づいている。その場合、適度な数の保護細胞がすべての単球の増加した割合を構成し得、いくぶんかの免疫機能保存につながる。
【００８２】
本発明はまた、薬学的に許容し得る担体、および好適な薬物をコードする目的の遺伝子に作動可能に連結されたＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域またはプロモーターに対応する本発明の配列を含むウイルスを含有する医薬組成物に関する。これらの組成物は、好ましくは薬物をＩＦＮγのレベルが上昇されている組織にターゲッティングするために使用され得る。
【００８３】
本発明はここで説明したように、以下の実施例を参考にしてより容易に理解できるであろう。この実施例は、例示的に提供され、また本発明の限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００８４】
単球におけるＩＬ−１８ＢＰの基礎発現
ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡは、白血球、結腸、小腸、前立腺および特には脾臓細胞において検出される（Novick et al. 1999）。脾臓細胞は、マクロファージ、リンパ球および血漿細胞、さらに循環（circulation）由来の細胞から構成される。
【００８５】
細胞におけるＩＬ−１８ＢＰタンパク質の発現を測定するために、特異的ＥＬＩＳＡ試験を用いた（実施例１２）。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本質的にＩＬ−１８ＢＰ（０．７〜１．５ｎｇ／ｍｌ）産生することが見出された。Ｕ−９３７細胞、すなわち組織球性リンパ腫の患者の胸水から得られた悪性腫瘍細胞由来の細胞株は、ＩＬ−１８ＢＰを少しも発現しなかった。Ｕ−９３７細胞は、ホルボールエステルでの処理により最終単球分化へ誘導され得る。０．０７±０．０１ｎｇ／ｍｌの基礎ＩＬ−１８ＢＰ発現は、ＴＰＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）による刺激によってマクロファージ様細胞への細胞の分化後のみ検出された。これらの結果は、ＩＬ−１８ＢＰが本質的に単球およびマクロファージにおいて産生されていることを示す。
【実施例２】
【００８６】
種々の異なる細胞におけるＩＬ−１８ＢＰの誘導
ＩＦＮγがＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡおよびタンパク質を、ケラチノサイト細胞株、結腸癌細胞株、および主には腎臓メサンギウム細胞などの種々の細胞株において誘導されることが以前に報告されている（Muhl et al. 2000）。種々のヒト細胞株および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、ＩＦＮγや他のサイトカインによるＩＬ−１８ＢＰの誘導を検討した。ＩＦＮγは、用量依存的にＩＬ−１８ＢＰ発現を誘導し（ｍＲＮＡのモニタリングについては実施例１１、ＥＬＩＳＡについては実施例１２参照）、ＷＩＳＨおよびＨｅｐＧ２細胞において５０Ｕ／ｍｌのＥＣ50を示した（図２ＡおよびＢ）。ＩＬ−１８ＢＰは、その濃度が２４時間と比較して４８時間で高かったように（図２Ａ）、明らかにＷＩＳＨ細胞の培養上清に蓄積された。
【００８７】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本質的にＩＬ−１８ＢＰ（０．７〜１．５ｎｇ／ｍｌ）を産生し、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）による処理は、ＩＬ−１８ＢＰのレベルを２４時間および４８時間でそれぞれ、１．７±０．１および２．１±０．３倍増加した（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。ＩＬ−１８ＢＰ産生に対する効果は、ＴＰＡによるＰＢＭＣの前処理の際には見られなかった。
【００８８】
ＩＦＮγによるＩＬ−１８ＢＰ誘導をＵ９３７細胞株において検討した。ＩＦＮγは、未分化細胞Ｕ９３７細胞ではＩＬ−１８ＢＰを誘導しなかったが、ホルボールエステル（ＴＰＡ、１０ｎｇ／ｍｌ）によるマクロファージ様細胞への分化ののち、基礎レベルのＩＬ−１８ＢＰ（０．０７±０．０１ｎｇ／ｍｌ）が得られ、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ、２４時間）での誘導の際は、４．６±０．０５倍増加し、９６時間でさらに増加した（示さない）。
【００８９】
ＩＦＮα２、ＩＦＮβ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＴＮＦαなどの他のサイトカインのＩＬ−１８ＢＰ発現に対する効果をＨｅｐＧ２細胞において検討した（図２Ｂ）。ＩＦＮγの存在下または不存在下において種々のサイトカインと共に細胞をインキュベートしたのちに得られた結果（図１ＰＮＡＳウェブ）は、ＩＦＮα２、ＩＦＮβ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＴＮＦαが単独ではＩＬ−１８ＢＰを誘導しないことを示す。しかしながら、ＨｅｐＧ２細胞においては、ＩＬ−６およびＴＮＦαは、ＩＦＮγと相乗的に作用し、統計的に有意なＩＬ−１８ＢＰの増加をもたらした。
【００９０】
これらの結果は、ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＦＮγにより単球および多くの種々の細胞において誘導されることを示唆する。ＩＬ−１８ＢＰのＩＦＮγによる誘導は、ＩＬ−６およびＴＮＦαの添加によりさらに増強される。
【実施例３】
【００９１】
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子は、ＩＦＮγにより転写が調節され、新規のタンパク質合成を必要とする。
【００９２】
ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡのＩＦＮγによる誘導が、転写レベルであるかどうかを確認するために、ＨｅｐＧ２およびＷＩＳＨ細胞に対するインターフェロンの作用を、翻訳阻害剤、すなわちアクチノマイシンＤの存在下において測定した（図３Ａ）。ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡレベルの増加は、ＨｅｐＧ２細胞においてはＩＦＮγ処理の３時間後、そしてＨａｋａｔおよびＷＩＳＨ細胞では５時間後に半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出できた。ＩＦＮγ刺激より前のＨｅｐＧ２およびＷＩＳＨ細胞のアクチノマイシンＤによる前処理は、種々の時点でのＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの発現を廃し、ＩＦＮγ刺激が新規のｍＲＮＡ合成を刺激することを示唆した。
【００９３】
ＩＬ−１８ＢＰの蓄積は、明らかにＩＦＮγ処理後２４時間、およびそれ以後であったようであり、ＩＦＮγによるたとえば転写因子などのタンパク質の前誘導へのＩＬ−１８ＢＰ発現の依存を支持した。したがって、そのような仮説を確認するために、さらにタンパク質阻害剤、シクロヘキシミドを用いてＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡのＩＦＮγによる誘導がタンパク質の新規の合成を必要とするかどうか調べた。図３Ｂにまとめたその結果は、シクロヘキシミドによる細胞の前処理は、ＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの誘導を廃したことを示す。この結果は、新規のタンパク質合成が、ＩＦＮγによるＩＬ−１８ＢＰ遺伝子活性化に不可欠であることを示唆している。
【実施例４】
【００９４】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーターをマッピングするためのＩＬ−１８ＢＰａの転写開始部位およびそのプロモーター領域の決定
Ｉｌ−１８ＢＰプロモーター領域を検討するために、まず、転写開始部位を明確に位置付けることが要求される。
【００９５】
ヒトＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡの転写開始部位は、５′ＲＡＣＥにより決定した（ＲＡＣＥ、実施例１４）。最も豊富なスプライス変異体であるＩＬ−１８ＢＰａに相当するただ１つのＰＣＲ産物が５′ＲＡＣＥにより得られた。この産物のＤＮＡ配列分析により、転写開始部位、およびゲノムＩＬ−１８ＢＰＤＮＡの７８５〜８３５位に相当するヒトＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡの５′端で転写開始部位の後ろ５０ｂｐの付加的なエクソンを明らかにした（Ｅｎｔｒｅｚ ｐｕｂｍｅｄ ヌクレオチドデータベース、受託番号 ＡＦ１１０７９８に見られる）。したがって、新しいエクソン−イントロン地図が、ゲノムＤＮＡを新しい５′エクソンが追加されたｍＲＮＡと比較することにより作成された（図４参照）。
【００９６】
ＩＬ−１８ＢＰａの転写開始部位（塩基１）を有する、ＩＬ−１８ＢＰプロモーター領域に相当する塩基１の上流のヒトゲノムＤＮＡ（染色体１１ｑ クローン：ＲＰ１１−７５７Ｃ１５、受託番号ＡＰ０００７１９．４ 塩基１５２，１７８の上流のヌクレオチドがさらに分析され得た。このＤＮＡのＢＬＡＳＴプログラムによるＮＣＢＩの発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースとの比較は、Ｚｎフィンガータンパク質（受託番号ＡＫ００１９６１）をコードする＋ストランドでの上流遺伝子を明らかにした。このＺｎフィンガータンパク質の寄託されたｍＲＮＡ配列は、ヒトＥＳＴｓの広範囲のコレクションを細かく調べた「インスタントＲＡＣＥ」プログラム（www.LabOnWeb.com）によりさらに伸張された。そのプログラムは、Ｚｎフィンガータンパク質の３′端ｍＲＮＡを、ゲノムクローンＲＰ１１−７５７Ｃ１５のヌクレオチド１５０，５１７に位置づけ、それにより、ＩＬ−１８ＢＰａの潜在的な上流調節配列を塩基１の上流１６６１塩基に制限した。
【実施例５】
【００９７】
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の上流、異種遺伝子の本質的発現を促進することができる最小プロモーターの探求
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の上流で、ルシフェラーゼレポーター遺伝子などの異種遺伝子の発現を導くことができる最小ＤＮＡフラグメントを見つけるために、ルシフェラーゼ遺伝子に融合された、塩基１の上流のＤＮＡ配列に相当する１６０１ｂｐまでを含み、転写開始部位の下流５０ｂｐ（配列番号５）を含むベクター、ならびにこのＤＮＡの切断型を有するベクター（図５Ａ）を作出した（実施例１５）。１６０１ｂｐ上流ＤＮＡを含むベクター（ｐＧＬ３（１６０１））でトランスフェクトしたヒトＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞癌株）におけるルシフェラーゼ活性は、空のｐＧＬ３ベクターで得られるものより１０．３±０．９倍高かった。そのような活性は、同じＤＮＡを反対の方向で挿入した（ｐＧＬ３（−１６０１））場合には観測されなかった。この結果は、塩基１の上流１６０１ｂｐＤＮＡが基礎プロモーター活性を有するということを証明した。この１６０１ｂｐＤＮＡフラグメントの配列決定試験により、それはＴＡＴＡボックスエレメントを含まず、いくつかのＧＣリッチドメインを転写開始部位近くの塩基−３から−９、−３９から−４８および−１２２から−１３２に有することが明らかになった。プログラムＴＦＳＥＡＲＣＨによる１６０１ｂｐＤＮＡ配列の分析は、塩基−２４から−３２にガンマ活性化配列（ＧＡＳ）を同定した（図１）。さらなる分析により、塩基−５７から−６９にかかるＩＲＦ１、２応答エレメント（ＩＲＦ−Ｅ）および塩基−３０９から−３２２および−６２１から−６３４の２つのＣ／ＥＢＰβ応答エレメント（Ｃ／ＥＢＰ−Ｅ）が明らかになった。
【００９８】
１６０１ｂｐフラグメントの５′端での順送り切断による一連のルシフェラーゼレポーターベクターを検討した。図５Ａにまとめられた結果は、ＩＲＦおよびＧＡＳエレメントのみを含有するｐＧＬ３（１２２）を含むすべての構築物が、少なくとも基礎プロモーター活性の支持においてｐＧＬ３（１６０１）と同等に効果的であった。
【００９９】
これらの結果より、ＩＲＦおよびＧＡＳエレメントを含有する１２２ｂｐフラグメント（配列番号３）は、異種遺伝子の基礎活性を促進するのに充分であるということが明らかになった（図５Ａ）。
【実施例６】
【０１００】
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の上流で異種遺伝子の誘導発現を促進することができる最小プロモーターの探求
ＩＬ−１８ＢＰプロモーターの上流領域でＩＦＮγ誘導ルシフェラーゼ発現を促進することができる最小ＤＮＡフラグメントを同定するために、前述の実施例の切断ＤＮＡベクターを、ＩＦＮγの存在下でトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞において検討した（トランスフェクションについては図５Ｂ、実施例１６参照）。
【０１０１】
図５Ｂにまとめられた結果は、２４時間後、ＩＦＮγは、ＩＲＦ−ＥおよびＧＡＳエレメントのみを含むベクター（ｐＧＬ３（１２２）ベクター）においては、ルシフェラーゼ活性を基礎発現レベルに対して３３倍増加したことを示す。この結果は、ＩＲＦ−Ｅ−ＧＡＳペア単独でＩＦＮγによる異種遺伝子の誘導を媒介できるということを証明している。Ｃ／ＥＢＰ−Ｅ１および２エレメント（ｐＧＬ３（６５６））の封入体は、ＩＦＮγによるルシフェラーゼ活性の誘導を基礎活性の８８倍に有意に増加し、これらのエレメントがＩＦＮγによる誘導性に重要であることを証明した。対照的に、付加的な上流ＤＮＡのそのような挿入物への封入（ｐＧＬ３（１１０６））は、その基礎レベル以上のルシフェラーゼ活性の誘導を廃した。この結果は、サイレンサーエレメントが塩基−６５６から−１１０６の範囲（第２Ｃ／ＥＢＰ−Ｅ１エレメントの上流）に存在するということを示唆した。３つのＡＰ１応答エレメントはサイレンサー領域に存在すること、およびそこにｃ−Ｊｕｎが結合し、そのような３つのＡＰ−１応答エレメントのすべてを通してＩＬ−１８ＢＰ遺伝子のサイレンシングに関与するということを証明した。
【０１０２】
サイレンサーの上流８８塩基によるプロモーターのさらなる伸張（ｐＧＬ３（１２７２））は、ＩＦＮγへの応答を報告し、エンハンサーエレメントは塩基−１１０６から−１２７２に存在し、ＩＦＮγによるその活性化は、隣接するサイレンサーの効果を抑制するということを示唆した。配列のさらなる伸張は、基礎活性またはＩＦＮγ誘導活性に影響を及ぼさず、したがって、全上流調節配列は、塩基−１から−１２７２（配列番号１）の範囲に位置することを示した。
【０１０３】
試験されたすべての構築物のなかで、ｐＧＬ３（６５６）の誘導性が最も高く、このＤＮＡフラグメントがＩＬ−１８ＢＰの最適誘導可能プロモーターを含有することを示している。
【０１０４】
その結果は、最小誘導可能プロモーターは、ＩＲＦ−ＥおよびＧＡＳエレメントを含有する転写開始部位の上流１２２ｂｐ（配列番号３）に位置し、最大および最適な誘導可能プロモーターは、ＩＲＦ−ＥおよびＧＡＳエレメントに加えて２つのＣ／ＥＢＰβエレメントを含有する転写開始部位の上流６５６ｂｐ（配列番号２）に位置することを示す。
【実施例７】
【０１０５】
インビボのＩＬ−１８ＢＰ発現におけるＩＲＦ−１の関与
ＩＬ−１８ＢＰ発現におけるＩＲＦ−１の関与、すなわちＩＬ−１８ＢＰのプロモーターにおいて見出されたその結合部位を探るために、ＩＲＦ−１欠損マウスにおけるＩＬ−１８ＢＰの発現を検討した。
【０１０６】
ＩＬ−１８ＢＰのレベルを、マウスＩＦＮγの投与の前後にＩＲＦ−１欠損マウス（ジャクソン ラボラトリーズ、バー・ハーバー、ＭＥ）において測定し、コントロールＣ５７Ｂ１／６マウスにおけるレベルと比較した（図６）。コントロールＣ５７Ｂ１／６マウスにおける基礎血清ＩＬ−１８ＢＰは、９．１±１．９ｎｇ／ｍｌであり、ＩＦＮγにより２２．４±２．２ｎｇ／ｍｌまで増加した。対照的に、ＩＲＦ−１欠損マウスにおける血清ＩＬ−１８ＢＰは、検出限界以下であり、ＩＦＮγにより、たった０．７±１．１５ｎｇ／ｍｌまで増加した。この結果は、ＩＬ−１８ＢＰのＩＦＮγ誘導発現のみならず、基礎発現の媒介物としてもＩＲＦ−１が重要であることを確認した。
【実施例８】
【０１０７】
誘導条件下でＩＬ−１８ＢＰプロモーターに結合する転写因子の検出
ＩＬ−１８ＢＰプロモーター内の様々な応答エレメントのあいだのタンパク質−ＤＮＡ相互作用を同定するために、電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ 実施例１８）が用いられた。塩基−３３から−７５（ＩＲＦ−Ｅを含有する）および−８から−５５（ＧＡＳを含有する）に対応するラベルされたｄｓＤＮＡプローブを、コントロール細胞とＩＦＮγ処理細胞の核抽出物と結合させた。ＩＲＦ−Ｅ含有プローブと核タンパク質の複合体は、ＩＦＮγとの１時間の細胞のインキュベーションの後に明らかとなり、最大の応答は、３時間で見られた（図７Ａ、レーン１〜５）。予想されたように、ＩＲＦ−Ｅの抗体の添加は、「スーパーシフト」を招き、一方、コントロールの転写１の抗シグナル誘導因子および活性化因子（ＳＴＡＴ１）抗体は、効果を持たなかった（データは示さない）。ＩＲＦ−Ｅとは対照的に、ＧＡＳ−含有プローブは、本質的にタンパク質と関係付けられ（図７Ａ、レーン６）、この複合体は３から６時間ＩＦＮγによる細胞の誘導の際増強された（レーン７、８）。ＧＡＳは、ＩＦＮγ−誘導ＳＴＡＴ１二量体に結合することが予想される。にもかかわらず、その複合体は、ＳＴＡＴ１の抗体に影響されず（レーン１０）、ＩＦＮγ−誘導ＳＴＡＴ１二量体はこのＧＡＳと無関係であることが示唆された。同様の負の結果は、ＩＦＮγでたった１５分または３０分間処理した核抽出物で得られた（データは示さない）。驚くべきことに、この複合体はＣ／ＥＢＰβの抗体により廃止され（レーン９）、ＩＲＦ−１の抗体でスーパーシフトした（レーン１０）。したがって、ＧＡＳ−含有ＤＮＡプローブは合意Ｃ／ＥＢＰβＥの欠如にもかかわらず、Ｃ／ＥＢＰβと結合すると思われる。
【０１０８】
ＥＭＳＡにより得られた結果は、ＩＦＮγによる誘導の際、ＩＲＦ−１はＩＬ−１８ＢＰプロモーターにおけるＩＲＦ−Ｅエレメントに結合することを示唆する。さらに、ＩＲＦ−１およびＣ／ＥＢＰβを含む複合体が形成され、ＧＡＳエレメントに結合する。
【実施例９】
【０１０９】
ＩＬ−１８ＢＰ誘導におけるＩＲＦ−１−Ｃ／ＥＢＰβ複合体の役割の探求
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子誘導におけるＩＲＦ−１およびＣ／ＥＢＰβの役割をさらに研究するために、発現ベクターのトランスフェクションを用いることによるＩＲＦ−１およびＣ／ＥＢＰβの過剰発現ののち、ＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡを半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した（実施例１４、図７Ｂ）。ＨｅｐＧ２細胞における各転写因子または両因子の組合せのいずれの過剰発現もＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡを誘導しなかった。この結果は、付加的なＩＦＮγ−誘導因子がＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の活性化のために要求されるということを示唆した。ＩＦＮγによる誘導ののち、いずれかの１つの発現ベクターによる細胞のトランスフェクションは、ＩＦＮγ単独と比較して、実際はＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡを減じた。対照的に、２つの転写因子の共発現は、ＩＦＮγによるＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの誘導を増加した。この結果は、ＩＲＦ−１およびＣ／ＥＢＰβが、特定の比率で存在しなければならず、あるいは転写開始複合体の内部に複合体を形成するということを示唆している。ＩＲＦ−１とＣ／ＥＢＰβとのあいだの可能な相互作用をさらに研究するために、ｐＧＬ３（１２７２）、定量のＩＲＦ−１発現ベクターおよび可変量のＣ／ＥＢＰβ発現ベクターでの共トランスフェクト細胞によるルシフェラーゼ活性の滴定を行なった。同様に、Ｃ／ＥＢＰβベクターが一定に保たれ、ＩＲＦ−１ベクターが可変量でのルシフェラーゼ活性が測定された。両ケースにおいて、ベル型の用量応答曲線が得られ、最適のＩＬ−１８ＢＰ誘導が、これらの２つの転写因子のあいだの固定モル比を必要とすることが示唆された（図７Ｃ）。
【０１１０】
免疫沈降試験は、ＩＲＦ−１とＣ／ＥＢＰβとのあいだの物理的関係を確認するために実施された（実施例１９、図７Ｄ）。ＩＦＮγ処理細胞由来の核および細胞質タンパク質（実施例１５）のＣ／ＥＢＰβの抗体による免疫沈降（ｉｐ）とそれに続く免疫ブロッティング（ｉｂ）は、Ｃ／ＥＢＰβが本質的にＨｅｐＧ２細胞において発現し、ＩＦＮγに応答して核に移行されるということを明らかにした（上段）。ＩＦＮγによって誘導されないＣ／ＥＢＰβとは対照的に、ＩＲＦ−１の抗体による細胞抽出物のｉｐおよびｉｂは、ＩＦＮγがＩＲＦ−１の発現を誘導することを明らかにした。しかし、Ｃ／ＥＢＰβと同様に、ＩＦＮγ誘導の場合、ＩＲＦ−１は核に移行する（中段）。Ｃ／ＥＢＰβの抗体によるｉｐとそれに続くＩＲＦ−１の抗体によるｉｂは、核画分における安定なＩＲＦ−１−Ｃ／ＥＢＰβ複合体の存在を明らかにした（下段）。これらの結果は、ＩＦＮγ誘導の際のＩＲＦ−１−Ｃ／ＥＢＰβ複合体の形成を確認し、これら２つの転写因子のあいだのそのような複合体の存在の最初の実証である。したがって、ＩＦＮγ誘導では、近位のＧＡＳ含有配列とそれに隣接したＩＲＦ−ＥがＣ／ＥＢＰβおよびＩＲＦ−１の複合体を結び付ける。
【実施例１０】
【０１１１】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーター活性におけるＣ／ＥＢＰ−Ｅｓの役割の探求
−３０９から−３２２位および−６２１から−６３４位の２つのＣ／ＥＢＰβ部位は、隣接したＩＲＦ−Ｅをもたない。実際、−３０９から−３２２位のＣ／ＥＢＰβ部位に対応するプローブのＥＭＳＡ（実施例１８）は、Ｃ／ＥＢＰβの抗体によりスーパーシフトされる（空矢印）が、ＩＲＦ−１の抗体によってはスーパーシフトされない遅延バンド（rentarded band）（塗矢印）を示した（図８Ａ）。したがって、この部位は、Ｃ／ＥＢＰβに結合し、ＩＲＦ−１とのその複合体には結合しないと推論された。さらに、このバンドは、本質的にＣ／ＥＢＰβを発現し、ＩＲＦ−１を欠いた非誘導ＨｅｐＧ２細胞の核抽出物で生成された。実際、ＩＦＮγは、これらの細胞においてＣ／ＥＢＰβの発現を増加させず（図８Ｄ）、その結果、遅延バンドの強度を増加させなかった（図８Ａ）。同様の結果は、より遠位のＣ／ＥＢＰβ部位で得られた（データは示さない）。
【０１１２】
その結果は、ＩＲＦ−１とは異なりＣ／ＥＢＰ転写因子は本質的に発現され、ＩＦＮγによって誘導されないこと、およびＩＲＦ−１およびＧＡＳへの結合に加えて、それはＩＬ−１８ＢＰプロモーターに存在するＣ／ＥＢＰエレメントの両方に結合するということを示す。
【実施例１１】
【０１１３】
ＩＬ−１８ＢＰの発現におけるエンハンサーの役割の研究
遠位のエンハンサーの調節的役割を、ヌクレオチド−１０８１から−１２７２に対応する１９２ｂｐのＤＮＡプローブでＥＭＳＡにより検討した（実施例１８）。コントロールＨｅｐＧ２細胞の核抽出物は、このプローブと複合体を形成した（図８Ｂ、塗矢印）。ＩＦＮγによる細胞の処理では、複合体はより強く、いくぶんより遅延された。ＩＲＦ−１、Ｃ／ＥＢＰβおよびｃＦｏｓに対する抗体によるこの複合体のスーパーシフトが行なわれた。このうち、抗ＩＲＦ−１のみがスーパーシフトを導き出した（図８Ｂ、空矢印）。ヌクレオチド−１０８３から−１１７４に対応する非ラベルｄｓＤＮＡは、放射線ラベルプローブと競合せず、核タンパク質は、残基−１１７５から−１２７２に結合することを示した。ＩＲＦ−Ｅは近位の領域でのみ同定されたので、この結果は、遠位のエンハンサーは、おそらく近位のＩＲＦ−Ｅと関係付けられるということを示唆する。
【０１１４】
これらの結果は、遠位のエンハンサーは、ＩＲＦ−１を通して基礎プロモーターと相互作用するということを示す。
【実施例１２】
【０１１５】
ＩＬ−１８ＢＰに関するＥＬＩＺＡ
ヒトＩＬ−１８ＢＰは、記載されたように二重抗体ＥＬＩＳＡにより測定した（Novicket al. 2001）。マウスＩＬ−１８ＢＰは、マウスＩＬ−１８ＢＰに対するウサギ抗原アフィニティー−精製ポリクローナル抗体およびビオチン化抗体（サイトラブ、イスラエルより入手）を用いて二重抗体ＥＬＩＳＡにより測定した。
【実施例１３】
【０１１６】
ＲＮＡ単離と逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ
血清不含培地での処理後、ＨｅｐＧ２およびＷＩＳＨ細胞（１０6）を示した時間で回収し、総ＲＮＡはＴＲＩ試薬を用いて抽出した。ｃＤＮＡは、ランダム六量体およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（インビトロゲン（商標）、リーク（Leek）、オランダ）を用いて、製造業者の使用説明書にしたがって製造した。ＰＣＲは、以下のプライマー：ヒトＩＬ−１８ＢＰ ５′ＣＡＣＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＴＣＣＴＧＧおよび５′ＣＧＡＣＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣ；ヒトＩＲＦ−１ ５′ＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＡＧおよび５′ＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧ；ヒトβアクチン ５′ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡおよび５′ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣを用いて行なった。増幅は、初期変性（９２℃、２分）、２８サイクルの変性（９２℃、４５秒）、アニーリング（６２℃、１分）および伸張（７２℃、１．５分）、ならびに最終伸張（７２℃、１０分）でなされた。得られたＰＣＲ産物をアガロース（１％）ゲル電気泳動で分析した。
【実施例１４】
【０１１７】
５′ｃＤＮＡ末端の急速増幅（５′ＲＡＣＥ）
５′ＲＡＣＥは、５′ＲＡＣＥシステム（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて製造業者の使用説明書にしたがって行なった。要約すると、ＩＦＮγ処理ＷＩＳＨ細胞からの総ＲＮＡを、ＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡ（ジーンバンク、受託番号ＡＦ１１０７９９）のヌクレオチド８９〜７０に相補的なプライマーを用いて逆転写し（実施例１３）、アンカーＤＮＡで新規に合成された末端をテーリングした。つぎに、アンカーＤＮＡに相補的なフォワードプライマーと、ＩＬ−１８ＢＰａｍＲＮＡのヌクレオチド３１〜１１に相補的なネストされたリバースプライマーによりＰＣＲを行なった。ついで、ＰＣＲ産物をサブクローニングし、ＤＮＡ配列分析にかけた。
【実施例１５】
【０１１８】
プラスミドおよびクローニング
１６０１ｂｐの全推定ＩＬ−１８ＢＰａプロモーター領域を、ＫｐｎＩ部位を含むセンスプライマー（Ｓ4753.ｐｇｌ）（５′ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＣ）とＮｈｅＩ部位を含むリバースプライマー（ＲｌｅｘＡ）（５′ＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴ）とを用いてゲノムＤＮＡのＰＣＲにより得た。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ、マジソン、ＷＩ）にクローニングし、ＤＮＡ配列分析により確認した。ＫｐｎＩ−ＮｈｅＩフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙクローンから単離し、急速ＤＮＡライゲーションキット（ロッシュ）を用いてｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ）にライゲートしてｐＧＬ３（１６０１）を得た。一連の５′−切断レポーター（ｐＧＬ３（１４５４）、ｐＧＬ３（１２７４）、ｐＧＬ３（１１０６）、ｐＧＬ３（６５６）、ｐＧＬ３（２８０）およびｐＧＬ３（１２２））を同様にして、同一のリバースプライマーとそれぞれ以下のセンスプライマーで製造した。
【０１１９】
Ｓ334.ｐｇｌ５′：ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＴＧＡＡＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＡＧＡＧ；
Ｓ415.ｐｇｌ５′：ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＴＧＡＧＡＴＣＡ；
Ｓ501.ｐｇｌ５′：ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＴＴＧＣＡＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＡＣ；
１ｅｘＤｐｇｌ５′：ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＧ；
Ｓ504.ｐｇｌ５′：ＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＡＣＡＣＴＴＧ；および
Ｓ139.ｐｇｌ５′：ＴＴＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＣＴＡＡＡＧＣ
すべてのＰＣＲ産物は、コントロールとして役立てるために逆方向でもｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターにクローニングした。
【実施例１６】
【０１２０】
一過性トランスフェクションアッセイ
６ウェルプレート（０．５×１０6／ウェル）においてＨｅｐＧ２またはＷＩＳＨ細胞を、ＦｕＧＥＮＥ６および示したルシフェラーゼレポーターベクター（０．５μｇ／ウェル）およびｐＳＶ４０βＧＡＬ（０．２μｇ／ウェル、プロメガ）を用いて製造元の使用説明書にしたがってトランスフェクトした。いくつかのケースでは、共トランスフェクションが、以下の発現ベクター：ｐｃＤＮＡ３−ＩＲＦ−１（０．０７〜１．５μｇ／ウェル、Ｂ．Ｌｅｖｙ博士から提供、テクニオン（Technion）、イスラエル）；ｐｃＤＮＡ３−Ｃ／ＥＢＰβ（０．５〜２．５μｇ／ウェル、Ｄ．Ｚｉｐｏｒｉ博士から提供、ワイズマン インスチチュート オブ サイエンス）１６時間後、細胞をＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１５０Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）またはそれらの示した組合せのいずれかで、血清不含培地において２４時間処理した。ついで細胞を回収し、溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。すべての結果は、βガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。
【実施例１７】
【０１２１】
核および細胞質抽出物の調製
細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、液体窒素で速やかに凍結した。細胞ペレットを、４包装細胞容量（four packed cell volume）の細胞質緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．９、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５容量％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｎａ2ＭｏＯ4、ロイペプチン、ペプスタチンおよびアプロチニン 各２μｇ／ｍｌ）に再懸濁した。溶解物を遠心分離（３０００×ｇ、１０分）し、細胞質タンパク質を含む上清を回収した。ペレットを２．５包装細胞容量の核緩衝液（ＮａＣｌが０．４２Ｍに増加されている以外は細胞質緩衝液と同一）に再懸濁した。核デブリを遠心分離（１，５０００×ｇ、２０分、４℃）により除去し、上清の部分標本を液体窒素で凍結し、−８０℃で保管した。タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（ピアス、ロックフィールド、ＵＳＡ）によりウシ血清アルブミンを標準として用いて決定した。
【実施例１８】
【０１２２】
電気泳動度シフトアッセイ
選択された応答エレメント（１０ｐｍｏｌ）に対応するｄｓオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドキナーゼ（ニュー イングランド バイオラブ（New England Biolabs））により［32Ｐ］３ ＡＴＰで標識した。核抽出物（５μｇタンパク質）を、２０μｌのＥＭＳＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴおよび５容量％グリセロール）中でポリ（ｄＩ−ｄＣ）（アマシャム ファルマシア バイオテクノロジー）と共に前インキュベート（１５分、０℃）した。ついで標識したプローブ（３×１０4ｃｐｍ）を添加し、インキュベーションを室温でさらに３０分継続した。スーパーシフトアッセイのために、試料をプローブの添加前に示した抗体とインキュベートした（４μｇ、１ｈ、０℃）。２００倍過剰の野生型と変異型の競合物を、関連プローブと共に添加した。ついで、反応混合物を５％非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。ゲルを真空で乾燥し、−８０℃で一晩オートラジオグラフにかけた。
【実施例１９】
【０１２３】
免疫沈降（ｉｐ）および免疫ブロット（ｉｂ）分析
核または細胞質タンパク質抽出物（８０μｇ）を、６μｇの示したポリクローナル抗体と共に一晩４℃でインキュベートし、タンパク質Ｇセファロースビーズ（ファルマシア）で１時間室温で免疫沈降した。次にビーズを、１０％ＤＴＴを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で煮沸し、上清を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）により分離した。ついでゲルをニトロセルロース膜にブロットし、示した抗体でタンパク質を検出した。免疫複合体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（商標）（ピアス）検出キットにより同定した。
【実施例２０】
【０１２４】
ＩＬ−１８ＢＰプロモーターを用いるＣＨＯｒ−ｈｓＬＤＬＲの製造
ヒト可溶性ＬＤＬＲを発現する安定な組換えＣＨＯ細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を欠いたＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞を２つの発現ベクター：ＬＤＬＲのＮ−末端リガンド結合ドメインを含み、アミノ酸残基Ａｓｐ（＋４）で始まりＧｌｕ２９１（＋２９１）までのもの、およびＤＨＦＲ（ＤＨＦＲは初期ＳＶ４０プロモーターによって制御されている）のマウス遺伝子およびＩＬ−１８ＢＰプロモーター（配列番号２）によるｓＬＤＬＲ遺伝子およびＳＶ４０初期領域の転写末端エレメントを含むｐＤＨＦＲでの共トランスフェクションにより作出する。トランスフェクションは、リポフェクトアミン（LipofectAmine）（ギブコ ＢＲＬ）を用いて製造元のプロトコールに従い陽イオンのリポソームにより行なわれた。トランスフェクションの７２時間後に、細胞をデオキシおよびリボヌクレオシドを欠き、１０％透析ＦＣＳを補完した選択培地に移す。ＤＨＦＲ活性を発現する細胞は、トリプシン浸漬ペーパーディスクで細胞をリフティングすることにより単離されるクローンを形成することができる。細胞は増殖し、ｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性に対してスクリーニングした。ついで、トランスフェクトされた細胞をＭＴＸによる遺伝子増幅に付し、そののちサブクローニングし安定な産生クローンを選択する。
【０１２５】
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【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】５つの調節エレメントを含むＩＬ−１８ＢＰ遺伝子のプロモーター領域の略図を示す。
【図２】ＩＬ−１８ＢＰ誘導の速度論およびＴＮＦαおよびＩＬ−６との相乗効果を示す。（Ａ）ＩＦＮγは、ヒトＷＩＳＨ細胞において用量および時間に依存してＩＬ−１８ＢＰを誘導する。細胞は、示した濃度のＩＦＮγで２４時間および４８時間インキュベートした。（Ｂ）ＴＮＦα、ＩＬ−６とそれらの組み合わせの、ＩＦＮγ誘導ＩＬ−１８ＢＰに対する相乗効果。ＨｅｐＧ２細胞は、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−６（３００Ｕ／ｍｌ）の示した組み合わせでインキュベートした。各組み合わせによるＩＬ−１８ＢＰの誘導は、ＩＦＮγ単独による誘導より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。データは、平均±ＳＤである（ｎ＝３対Ａ、ｎ＝４対Ｂ）。
【図３】ヒトおよびマウスＩＬ−１８ＢＰ遺伝子の保存されたエクソン−イントロン構成の略図を示す。ヒトＩＬ−１８ＢＰａ遺伝子をマウスＩＬ−１８ＢＰｄ遺伝子と比較した。エクソンを示す。転写開始部位、翻訳開始部位（ＡＴＧ）、終始コドン（Ｓｔｏｐ）、およびポリアデニル化シグナル（ＰＡＳ）をヒトＩＬ−１８ＢＰａ遺伝子について示す。
【図４】ＩＬ−１８ＢＰのＩＦＮγによる誘導は転写レベルであり、新規の（de novo）タンパク質合成に依存するということを示す。（Ａ）アクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ、３０分）で前培養し、洗浄、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）で示した時間インキュベートしたＨｅｐＧ２細胞由来のＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。βアクチンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲをコントロールとして示す。（Ｂ）シクロヘキシミド（２０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）で示した時間前インキュベートしたＨｅｐＧ２細胞由来のＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。
【図５】ヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターを運ぶルシフェラーゼレポーターベクターの基礎活性およびＩＦＮγ誘導活性を示す。転写開始部位（＋１）から伸びる挿入サイズは、括弧に記載する。丸数字は、種々の応答エレメント：１．ＧＡＳ、２．ＩＲＦ−Ｅ、３．Ｃ／ＥＢＰ−Ｅ（２部位）、サイレンサー５．遠位エンハンサーを示す。塗四角は特異的応答エレメントにおける変異を表わす。ＨｅｐＧ２細胞は、示したレポーターベクターとｐＳＶ４０βＧＡＬとで共トランスフェクトされた。すべてのルシフェラーゼ値は、βガラクトシダーゼ活性で標準化した。（Ａ）ｐＧＬ３−ベーシックベクターでトランスフェクトされた細胞の活性と相対的な誘導されていない細胞の抽出物におけるルシフェラーゼ活性。（Ｂ）選択されたベクターでトランスフェクトされ、ＩＦＮγで誘導された細胞におけるルシフェラーゼ活性。誘導倍率は、（Ａ）で与えられている基礎活性に対する。
【図６】ＩＲＦ−１はマウスにおけるＩＬ−１８ＢＰ発現に不可欠であるということを示す。マウスＩＦＮγ（５３，０００ｕ／マウス）を腹腔内に注射したＣ５７Ｂ１／６ ＩＲＦ−１-/-およびコントロールＣ５７ Ｂ１／６マウスの血清ＩＬ−１８ＢＰ。マウスを注射前と注射後２４時間とに採血した。血清ＩＬ−１８ＢＰをＥＬＩＳＡで測定した。データは、平均±ＳＥである（各群ｎ＝６）。コントロールとＩＲＦ−欠損マウスとにおける血清ＩＬ−１８ＢＰの違いは、コントロールマウスにおけるＩＬ−１８ＢＰの誘導と同様に統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【図７】ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子におけるＩＲＦ−１およびＣ／ＥＢＰβの役割とその関連性を示す。（Ａ）塩基−３３〜−７５（ＩＲＦ−Ｅ、左パネル）および−８〜−５５（ＧＡＳ、右パネル）に対応するｄｓＤＮＡプローブの電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ実施例１８）。ＨｅｐＧ２細胞をＩＦＮγで示した時間処理し、核抽出物をＩＲＦ−ＥまたはＧＡＳプローブと反応させた。シフトしたバンドを塗矢印で示す。ＧＡＳ複合体も示した抗体でスーパーシフトに付した。スーパーシフトしたバンドは、空矢印で示す。（Ｂ）ＩＲＦ−１またはＣ／ＥＢＰβ発現ベクターの示した組み合わせでトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞由来のＩＬ−１８ＢＰｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。示した場合には、ＩＦＮγを添加し、細胞を５時間後に回収した。値はβアクチンｍＲＮＡで標準化した。（Ｃ）完全なＩＬ−１８ＢＰプロモーターを含有するルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３（１２７２）で、示した濃度のｐＣＤＮＡ３−ＩＲＦ−１（丸）および１μｇ／１０6細胞のｐＣＤＮＡ３−Ｃ／ＥＢＰβと共にトランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼ活性。あるいは、細胞を示した濃度のｐＣＤＮＡ３−Ｃ／ＥＢＰβ（四角）と０．１μｇ／１０6細胞のｐＣＤＮＡ３−ＩＲＦ−１でトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、βＧａｌ活性で標準化した。（Ｄ）ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ、２時間）で処理した細胞の核および細胞質抽出物（抽出物の調製については実施例１７参照）のイムノブロット。抽出物は示した抗体と免疫沈降（ＩＰ）し、イムノブロット（ＩＢ）した。
【図８】ＩＦＮγ誘導の際、ＩＬ−１８ＢＰのプロモーターに結合する因子を示す。（Ａ）近位のＣ／ＥＢＰβ ＥおよびＴＮＦγによる処理後の前細胞抽出物。示した場合には、抽出物を示した抗体でスーパーシフトした。（Ｂ）遠位のエンハンサーに対応するプローブおよびＩＦＮγによる処理後の全細胞抽出物でのＥＭＳＡ。示した場合には、抽出物を示した抗体で、プローブの近位の半分に対応するｄｓＤＮＡとの競合ありまたはなしでスーパーシフトした。シフトしたバンドを塗矢印で示し、スーパーシフトしたバンドを空矢印で示す。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列。
【請求項２】
誘導体が配列中のサイレンサーエレメントに存在する１つ以上のＡＰ１部位で変異されている請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
フラグメントが配列番号２を含有する請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
フラグメントが配列番号３を含有する請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
さらにイントロンを含有する請求項１、２、３または４記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
イントロンがＩＬ−１８ＢＰの第１イントロンからなる請求項５記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
さらにＩＬ−１８ＢＰプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む請求項１、２、３、４、５または６記載のＤＮＡ配列。
【請求項８】
遺伝子がＩＬ−１８ＢＰをコードする請求項７記載のＤＮＡ配列。
【請求項９】
遺伝子が異種タンパク質をコードする請求項７記載のＤＮＡ配列。
【請求項１０】
異種遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子をコードする請求項９記載のＤＮＡ配列。
【請求項１１】
異種遺伝子が、インターフェロン−ベータ、ＴＮＦ、エリスロポエチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター、顆粒細胞コロニー刺激因子、超酸化マンガンジスムターゼ、イムノグロブリン、またはそれらのフラグメント、成長ホルモン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＩＬ−１８、ｈｓＬＤＬＲおよびＴＮＦ受容体結合タンパク質から選択されるタンパク質をコードする請求項９記載のＤＮＡ配列。
【請求項１２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１４】
哺乳類の細胞である請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ＣＨＯ、ＷＩＳＨ、ＨｅｐＧ２、Ｃｏｓ、ＣＶ−１、ＨｅＬａ、およびＨａｋａｔ Ｕ９３７細胞から選択される請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３、１４または１５記載の宿主細胞を培養し、産生された組み換えタンパク質を単離することを含む組み換えタンパク質の製造方法。
【請求項１７】
ウイルスゲノムの一部分、目的の遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントおよび目的の遺伝子に作動可能に連結された請求項１、２、３、４、５または６記載のヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含有する組み換えウイルスベクター。
【請求項１８】
目的の遺伝子が、インターフェロン−ベータ、ＴＮＦ、エリスロポエチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター、顆粒細胞コロニー刺激因子、超酸化マンガンジスムターゼ、イムノグロブリン、またはそれらのフラグメント、成長ホルモン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＩＬ−１８、ｈｓＬＤＬＲおよびＴＮＦ受容体結合タンパク質から選択される請求項１７記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１９】
ウイルスゲノムの一部分がアデノ随伴ウイルスに属する請求項１７記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２０】
ウイルスゲノムの一部分がレトロウイルスに属する請求項１７記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２１】
レトロウイルスがＨＩＶ、ＨＦＶ、ＭＬＶ、ＦＩＶおよびＶＳＶから選択される請求項２０記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２２】
目的の遺伝子の細胞特異的発現を制御する方法であって、標的哺乳類細胞を請求項１７、１８、１９、２０または２１記載のベクターで形質転換すること、および必要とする個体にその細胞を移植すること含む方法。
【請求項２３】
標的細胞が造血幹細胞である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
標的細胞が単球である請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
標的細胞がマクロファージである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
目的の遺伝子がＨＩＶ感染症に耐性を与えるタンパク質をコードする請求項２２、２３、２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
ＨＩＶ感染症の治療のための請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
造血系疾患の治療のための請求項２２、２３、２４または２５記載の方法。
【請求項２９】
造血系疾患がＳＣＩＤ、慢性肉芽腫症およびサラセミアから選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
体組織のＩＦＮγの上昇を示す個体における疾患の治療のための遺伝子治療法であって、有効量の請求項１７、１８、１９、２０または２１記載のベクターを投与することを含む方法。
【請求項３１】
さらにＩＬ−６および／またはＴＮＦ−αおよび／またはＩＲＦおよび／またはＣ／ＥＢＰβ因子の投与を含む請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１記載のＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を宿すトランスジェニックマウス。
【請求項３３】
疾患の治療のための医薬の製造における、ヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体の使用であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含有する使用。
【請求項３４】
治療に有効量のヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体を含有する医薬組成物であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含有する医薬組成物。
【請求項１】
ヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列。
【請求項２】
誘導体が配列中のサイレンサーエレメントに存在する１つ以上のＡＰ１部位で変異されている請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
フラグメントが配列番号２を含有する請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
フラグメントが配列番号３を含有する請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
さらにイントロンを含有する請求項１、２、３または４記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
イントロンがＩＬ−１８ＢＰの第１イントロンからなる請求項５記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
さらにＩＬ−１８ＢＰプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む請求項１、２、３、４、５または６記載のＤＮＡ配列。
【請求項８】
遺伝子がＩＬ−１８ＢＰをコードする請求項７記載のＤＮＡ配列。
【請求項９】
遺伝子が異種タンパク質をコードする請求項７記載のＤＮＡ配列。
【請求項１０】
異種遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子をコードする請求項９記載のＤＮＡ配列。
【請求項１１】
異種遺伝子が、インターフェロン−ベータ、ＴＮＦ、エリスロポエチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター、顆粒細胞コロニー刺激因子、超酸化マンガンジスムターゼ、イムノグロブリン、またはそれらのフラグメント、成長ホルモン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＩＬ−１８、ｈｓＬＤＬＲおよびＴＮＦ受容体結合タンパク質から選択されるタンパク質をコードする請求項９記載のＤＮＡ配列。
【請求項１２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１４】
哺乳類の細胞である請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ＣＨＯ、ＷＩＳＨ、ＨｅｐＧ２、Ｃｏｓ、ＣＶ−１、ＨｅＬａ、およびＨａｋａｔ Ｕ９３７細胞から選択される請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３、１４または１５記載の宿主細胞を培養し、産生された組み換えタンパク質を単離することを含む組み換えタンパク質の製造方法。
【請求項１７】
ウイルスゲノムの一部分、目的の遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントおよび目的の遺伝子に作動可能に連結された請求項１、２、３、４、５または６記載のヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含有する組み換えウイルスベクター。
【請求項１８】
目的の遺伝子が、インターフェロン−ベータ、ＴＮＦ、エリスロポエチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター、顆粒細胞コロニー刺激因子、超酸化マンガンジスムターゼ、イムノグロブリン、またはそれらのフラグメント、成長ホルモン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＩＬ−１８、ｈｓＬＤＬＲおよびＴＮＦ受容体結合タンパク質から選択される請求項１７記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１９】
ウイルスゲノムの一部分がアデノ随伴ウイルスに属する請求項１７記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２０】
ウイルスゲノムの一部分がレトロウイルスに属する請求項１７記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２１】
レトロウイルスがＨＩＶ、ＨＦＶ、ＭＬＶ、ＦＩＶおよびＶＳＶから選択される請求項２０記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２２】
目的の遺伝子の細胞特異的発現を制御する方法であって、標的哺乳類細胞を請求項１７、１８、１９、２０または２１記載のベクターで形質転換すること、および必要とする個体にその細胞を移植すること含む方法。
【請求項２３】
標的細胞が造血幹細胞である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
標的細胞が単球である請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
標的細胞がマクロファージである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
目的の遺伝子がＨＩＶ感染症に耐性を与えるタンパク質をコードする請求項２２、２３、２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
ＨＩＶ感染症の治療のための請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
造血系疾患の治療のための請求項２２、２３、２４または２５記載の方法。
【請求項２９】
造血系疾患がＳＣＩＤ、慢性肉芽腫症およびサラセミアから選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
体組織のＩＦＮγの上昇を示す個体における疾患の治療のための遺伝子治療法であって、有効量の請求項１７、１８、１９、２０または２１記載のベクターを投与することを含む方法。
【請求項３１】
さらにＩＬ−６および／またはＴＮＦ−αおよび／またはＩＲＦおよび／またはＣ／ＥＢＰβ因子の投与を含む請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１記載のＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を宿すトランスジェニックマウス。
【請求項３３】
疾患の治療のための医薬の製造における、ヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体の使用であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含有する使用。
【請求項３４】
治療に有効量のヒトＩＬ−１８ＢＰプロモーターをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体を含有する医薬組成物であって、該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの３′末端が配列番号５の５′末端由来の１つ以上のヌクレオチドを含有する医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００６−５０１８３９（Ｐ２００６−５０１８３９Ａ）
【公表日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４２７６５（Ｐ２００４−５４２７６５）
【出願日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００３／０００８１５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３３６９４
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００３／０００８１５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３３６９４
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
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