Ｚｉｎｇｉｂｅｒｚｅｒｕｍｂｅｔ（Ｌ．）Ｓｍｉｔｈの抗過敏性炎症及び抗アレルギー活性
【課題】ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根の抽出物を含む新しい栄養補助組成物、及び免疫系を制御するためのその使用を提供する。
【解決手段】本発明は、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根から溶媒抽出する工程を含む栄養補助組成物を調製する方法、及び免疫系を調節し、より詳細には、アレルギー性疾患を予防又は治療するためのこの製剤の使用を提供する。
【解決手段】本発明は、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根から溶媒抽出する工程を含む栄養補助組成物を調製する方法、及び免疫系を調節し、より詳細には、アレルギー性疾患を予防又は治療するためのこの製剤の使用を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根からの抽出物を含有する新しい栄養補助組成物及び免疫系を制御するためのその使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ロイコトリエン（ＬＴ）、詳細には、システイニルＬＴ、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、及びＬＴＥ４は、喘息の臨床経過、生理的変化、及び病原に関連する（１）。ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、及びＬＴＥ４は、強力な気管支収縮剤であり、血管、粘膜毛様体クリアランス、及び好酸球性炎症への付加的な作用に関わる（２）。更に、システイニルＬＴは、一般的に、好酸球及び肥満細胞を含む喘息に伴う細胞で形成される（３）。従って、気管支喘息の治療には、ロイコトリエン受容体拮抗剤が広く用いられている。しかし、新しい群の喘息薬、一般的にロイコトリエン受容体拮抗剤関連の肝臓傷害に関する公開されたデータでは、肝毒性の認識が高まっている（４）。すなわち、喘息の長期療法に医薬品としての可能性を有する薬草により、新たな窓が開かれる。末梢血液Ｔ細胞によるＴh細胞サイトカインは、喘息重症度に相関することが見出されている。近年の研究では、その受容体（ＩＬ−４Ｒ）に結合するインターロイキン−４（ＩＬ−４）が、喘息に存在する気道炎症の発現に不可欠であることが示されている（５）。１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）／イオノマイシン刺激後には、ＩＦＮ−γ−／ＩＬ−４産生ＣＤ４＋Ｔ細胞比が、アトピー性咳嗽及びアトピー性喘息の患者では正常被験者に比較して有意に低いことが見出されており、ＩＬ−４−産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が、アトピー性喘息の患者では正常の対照被験者よりも有意に高かった（６）。対照被験者に比較すると、急性喘息では、循環ＩＬ−４（ｐ＜０．００１）、ＩＬ−５（ｐ＜０．００１）、及びＩＬ−１３（ｐ＜０．００１）のレベルが有意に増大したが、血清ＩＦＮ−γ（ｐ＝０．０６９）の差は、境界有意性であった（７）。しかし、非常に低い血清レベルのこれらのサイトカインは、動物実験でしか検出可能ではなかった。従って、本出願人の研究室では、従来の薬草の治療的指標を正確に評価するために、免疫細胞のサイトカインの遺伝子発現を定量するための新しい廉価な生物工学試験である定量的競合的逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（ｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ）を開発した。医薬品として可能な薬草を探す時に、競合的システイニルロイコトリエン受容体拮抗剤は、新しい部類の喘息薬剤と見なされている（８）。近年、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍｉｔｈには、抗腫瘍促進剤活性があり（９）、マウスマクロファージ内に腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を放出すると共に誘導一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）が著しく減少することが見出された（１０）。
【０００３】
【非特許文献１】Ｗｅｎｚｅｌ ＳＥ著、喘息におけるロイコトリエンの役割、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ、２００３年、第６９巻、１４５〜５５頁
【非特許文献２】Ｌｅｆｆ ＡＲ著、喘息の管理におけるロイコトリエンの調節：生物学及び臨床療法、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ、２００１年、第５２巻、１〜１４頁
【非特許文献３】Ａｉｚａｗａ Ｔ、Ｔａｍｕｒａ Ｇ、Ｏｈｔｓｕ Ｈ、Ｔａｋｉｓｈｉｍａ Ｔ著、ロイコトリエンＣ４及びＢ４の好酸球及び好中球産生：喘息の被験者の細胞と健常供与者の細胞との比較、Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ、１９９０年、第６４巻、２８７〜９２頁
【非特許文献４】Ｄａｖｅｒｎ ＴＪ、Ｂａｓｓ ＮＭ著、ロイコトリエン拮抗剤、Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ、２００３年、第７巻、第２号、５０１〜１２頁ｖｉｉｉ
【非特許文献５】Ｂｅｇｈｅ Ｂ、Ｂａｒｔｏｎ Ｓ、Ｒｏｒｋｅ Ｓ、Ｐｅｎｇ Ｑ、Ｓａｙｅｒｓ Ｉ、Ｇａｕｎｔ Ｔ、Ｋｅｉｔｈ Ｔ、Ｃｌｏｕｇｈ Ｊ、Ｈｏｌｇａｔｅ Ｓ、Ｈｏｌｌｏｗａｙ Ｊ著、インターロイキン−４及びインターロイキン−４受容体α鎖遺伝子の多型性が白色人種における喘息及びアトピーの罹病生を与える、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００３年、第３３巻、１１１１〜１１１７頁
【非特許文献６】Ｓｈｉｒａｉ Ｔ、Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ、Ｉｎｕｉ Ｎ、Ｓｕｄａ Ｔ、Ｃｈｉｄａ Ｋ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｈ著、アトピー性咳嗽及びアトピー性喘息における末梢血液中のＴｈ１／Ｔｈ２プロフィール、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００３年、第３３巻、８４〜９頁
【非特許文献７】Ｌｅｅ ＹＣ、Ｌｅｅ ＫＨ、Ｌｅｅ ＨＢ、Ｒｈｅｅ ＹＫ著、急性喘息におけるインターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びインターフェロン−γの血清レベル、Ｊ Ａｓｔｈｍａ、２００１年、第３８巻、６６５〜７１頁
【非特許文献８】Ｋａｌｉｎ Ｐ著、西洋フキ（Ｐｅｔａｓｉｔｅｓ ｈｙｂｒｉｄｕｓ）−薬草のポートレート、Ｆｏｒｓｃｈ Ｋｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｍｅｄ Ｋｌａｓｓ Ｎａｔｕｒｈｅｉｌｋｄ、２００３年、第１０巻、補遺１、４１〜４頁
【非特許文献９】Ｖｉｍａｌａ Ｓ、Ｎｏｒｈａｎｏｍ ＡＷ、Ｙａｄａｖ Ｍ著、従来の医薬品に用いられるマレーシアショウガ根粒菌の抗腫瘍促進剤活性、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、１９９９年、第８０巻、１１０〜６頁
【非特許文献１０】Ｍｕｒａｋａｍｉ Ａ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｄ、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｔ、Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ Ｋ、Ｋｉｍ ＨＷ、Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ Ａ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ、Ｊｉｗａｊｉｎｄａ Ｓ、Ｔｅｒａｏ Ｊ、Ｏｈｉｇａｓｈｉ Ｈ著、ゼルンボン、すなわち東南アジアのショウガセスキテルペンがフリーラジカルの発生、炎症誘発性タンパクの産生、及びアポトーシスを伴うガン細胞増殖を著しく抑制する：α、β−不飽和カルボニル基が必須条件である、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００２年、第２３巻、７９５〜８０２頁、論評：Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００２年、第２３巻、１９６１頁に掲載、著者の回答、１９６３年
【発明の開示】
【０００４】
本発明者は、本明細書において、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔが炎症性媒介物の放出を阻害し、サイトカインネットワークの遺伝子発現に影響を及ぼすという有利な作用を有することを明らかにする。更に、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔの抽出物をヒトに使用してアレルギー性疾患を治療する例も説明する。
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ （Ｌ．） Ｓｍｉｔｈ（ＺＺ）の水性粗抽出物（ＡＣＥ）が抗過敏性及び抗炎症性を有する可能性をマウスで明らかにした。ＺＺ−ＡＣＥで治療したマウスの肺組織から放出されたロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）を測定したところ、ＺＺ−ＡＣＥが肺組織からのＬＴＣ４放出を効率的に抑制した。ＬＴＣ４を抑制する作用に基づき、活性化合物を、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンと同定した。
【０００５】
オバアルブミンを用いて、マウスに喘息性アレルギー反応を誘発した。ＺＺ−ＡＣＥで処理したマウスの脾細胞ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４遺伝子発現レベルの比は、対照群と比較して高かった（ｐ＜０．０５）。ゼルンボンはＩＦＮ−γ／ＩＬ−４遺伝子発現比を増大させる有効成分であることを確認した。
また、ボランティアに液体又はカプセルの形態のＺＺ−ＡＣＥを投与したときの抗アレルギー作用も観察した。
これらの結果は、エタノ−ル、水又はエタノールと水との混合物を溶媒として用いたＺＺの抽出物がアレルギー性炎症を予防又は治療する可能性を有する成分を含むことを示している。
本発明の他の目的及び特徴は、添付の図面と共に以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、図面は、例示のためだけを意図したもので本発明の範囲を定めるものではなく、本発明の範囲は、特許請求の範囲を参照すべきであることは理解されるものとする。更に、図面は必ずしも縮尺通りではなく、特に示さない限り、本明細書に説明した構造及び手順を概念的に示すことしか意図していないことも理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
材料と方法
機器：
カラムクロマトグラフィー用シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０、２３０〜４００メッシュＡＳＴＭ）及びＰＬＣ（０．５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４）は、Ｍｅｒｃｋから入手した。Ｖａｒｉａｎｓ５００によりプロトンＮＭＲスペクトルを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＬＣ−ＭＳにより質量スペクトルを測定した。
水抽出物としてのＺＺ−ＡＣＥ：
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ （Ｌ．） Ｓｍｉｔｈの乾燥根５０ｇを５００ｍｌの蒸留水（１０倍重量）と混合し、１００℃で４時間還流した。抽出物を濾過して１００ｍｌまで濃縮し、その後、凍結乾燥した。凍結乾燥した粉末は、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ （Ｌ．） Ｓｍｉｔｈの水性粗抽出物（aqueous crude extract, ＡＣＥ）又はＺＺ−ＡＣＥとして保存した。
エタノール抽出：
乾燥ＺＺを砕き、１０倍のエタノールと混合し（１０ｍｌエタノール／ｇＺＺ）、６０℃で４時間還流した。抽出物を濾過し、１／１０容量まで濃縮してから凍結乾燥し、エタノール抽出物として保存した。エタノール抽出物は、シリカゲルカラムを用いて更にある程度精製した。
【０００７】
カラムクロマトグラフィー：
エタノール抽出物（６５ｇ）を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、７．５ｃｍＩＤ×２０ｃｍＨ）上に載せた。ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（ｎ−Ｈｅｘ／ＥＡ）（１０００ｍｌ／２００ｍｌ）で溶媒ステップ勾配を開始し、連続的にｎ−Ｈｅｘ／ＥＡ（６００ｍｌ／４００ｍｌ）、ｎ−Ｈｅｘ／ＥＡ（４００ｍｌ／６００ｍｌ）、ＥＡ（１０００ｍｌ）、最後にメタノール（１０００ｍｌ）と続けた。溶出液（eluent）は、最初から５００ｍｌ／フラスコに収集した。流速は約３０ミリリットル／分であった。１２の分画を収集し、溶出順にＮＰ１〜ＮＰ１２とした。
ゼルンボンの単離：分画ＮＰ２の内容物をメタノールで再結晶し、純結晶を得た。プロトンＮＭＲ及びＭＳスペクトル試験の結果から、この化学物質は、ゼルンボン（０．８ｇ）であると判断した。分画ＮＰ２を粗ゼルンボンと名付けた。
【０００８】
粗フラボノイド分画の調製：
ＮＰ１２（５ｇ）を別のカラム（ＳｉＯ2、２．５ｃｍＩＤ×１２ｃｍＨ）に載せた。溶出液を最初から２００ミリリットル／分画で収集した。流速は、約１０ミリリットル／分であった。溶媒勾配は、順にｎ−Ｈｅｘ（１００ｍｌ）、ｎ−Ｈｅｘ／ＥＡ（１００ｍｌ／１００ｍｌ）、ｎ−Ｈｅｘ／ＥＡ（１００ｍｌ／１５０ｍｌ）、ＥＡ（１００ｍｌ）、及びＥＡ／ＭｅＯＨ（１００ｍｌ／５０ｍｌ）とした。７つのフラスコを収集し、ＮＰ１２−１〜ＮＰ１２−７とした。分画ＮＰ１２−３を粗フラボノイドと名付けた。
５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンの単離：
ＮＰ１２−３（３０．２ｍｇ）を単離し、ＰＬＣに載せ、ジクロロメタン／メタノール（３０／１）で展開し、８つのストリップ（ＮＰ１２−３−１〜ＮＰ１２−３−８）を得た。ストリップＮＰ１２−３−３中の物質（３．４ｍｇ、ＰＬＣ精製フラボノイドと命名、純度９０％）を単離し、ｎ−Ｈｅｘ／アセトンで再結晶した。純フラボン類似体（１．５ｍｇ）を得、プロトンＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎｓ ５００）及びＬＣ−Ｍａｓｓスペクトルで、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンと同定した。
【０００９】
実験１：マウスでのＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ （Ｌ．） Ｓｍｉｔｈの水性粗抽出物（ＡＣＥ）の抗肺炎症活性
実験１の方法：
動物の取り扱い、薬物処理、及び肺組織試料収集：
４週齢のメスのＩＣＲマウス合計２０匹を国立実験動物センター（台湾の台北）から得た。マウスは、無作為に２つの群、すなわち、対照群とＺＺ−ＡＣＥ群に分けた。対照群のマウスに水を飲ませ、ＺＺ−ＡＣＥ群のマウスにＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ （Ｌ．） Ｓｍｉｔｈの水性粗抽出物（ＡＣＥ）（ＺＺ−ＡＣＥ、２８．８ｍｇ／ｍｌ）を０．２２μｍフィルタで濾過したものを飲ませた。全てのマウスに適宜餌を与えた。２８日餌を与えた後、全てのマウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔した。２０ｍｌのタイロード緩衝液を用いて、肺を潅流した。潅流後、各肺の同じ部分から０．５ｇの肺組織を採取した。肺組織は、第１１号外科用ブレードで刻み、その後、１０ｍｌのタイロード緩衝液に入れ、９５％Ｏ2、３７℃で４５分間培養した。培養後、培地中のロイコトリエンＣ4をＣ１８カートリッジで精製し、その後、ロイコトリエンＣ4ＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ミシガン州）により定量した。
【００１０】
実験１の結果：ＺＺ−ＡＣＥの抗肺炎症活性
マウスにおけるＺＺ−ＡＣＥの抗肺炎症活性：
ＺＺ−ＡＣＥ群のマウスの肺組織から放出されたロイコトリエンＣ4の量は有意に少なかった（表１）。ＬＴＣ４は、アナフィラキシーの遅反応物質と名付けられているので、ロイコトリエンＣ4の生成が減少することは、ＺＺ−ＡＣＥに薬用効果があることを示している。
【００１１】
表１．ＺＺ−ＡＣＥの投与の有無によるマウスの肺組織からのＬＴＣ４放出のレベル
*対象と比較して、有意差あり（Ｐ＜０．０５）
【００１２】
実験２：抗炎症化合物の５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンとしての単離
実験２の方法：抗炎症化合物の同定
細胞培養及び薬物処理：
ラット好塩基球性白血病−１（ＲＢＬ−１）を、食品産業研究及び開発研究所から購入し（ＣＣＲＣ ６０１９８、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１３７８）、ＭＥＭ−α培地（Ｇｉｂｃｏ、１２０００）で培養した。全トランスレチノイン酸（１μｇ／ｍｌ）を２×１０6細胞／２ｍｌ／ウェルで３．５ｃｍ直径のウェル（６ウェルプレート）に加えた。次に、プレートを空気中５％ＣＯ2で１６時間、３７℃で培養した。様々な容量のＺＺ試料をウェルに加えて、適切な最終濃度（０、０．５、５、５０μｇ／ｍｌ）にし、更に２時間培養した。Ａ２３１８７（カルシウムイオノホア）を各ウェルに入れて最終濃度を１０μＭにし、ＲＢＬ−１細胞を刺激してＬＴＣ４／ｃＬＴを１５分間放出させた。ウェル内の培地を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡアッセイのための上清液を得た。
【００１３】
ＬＴＣ４／ｃＬＴ ＥＬＩＳＡ法：
細胞培養物の上清液は、ＬＴＣ４／ｃＬＴのためのＥＩＡ分析の前に適切な濃度に希釈した。分析は、製造業者により供給される手順に従って行った。
ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］法：
細胞生存度を求めるために、培養した培地を除去し、１×ＰＢＳで細胞を洗った。次に、ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２１２８）を９６ウェルプレートに加えて濃度を０．５ｍｇ／ｍｌにした。３７℃で４時間培養した後、プレートに、ウェルあたり１５０μｌの酸性イソプロパノール（０．１Ｎ ＨＣｌ）を加え、紫の結晶を溶解した。一晩培養した後、５６０ｎｍでマイクロプレート読取装置を用い、ＯＤを求めた。
【００１４】
実験２の結果：抗炎症化合物の単離
Ａ２３１８７刺激ラット好塩基球性白血病−１（ＲＢＬ−１）細胞により、粗フラボノイド分画及び同定されたフラボノイドの両方でＣＬＴ／ＬＴＣ４分泌物が減少する：
表２Ａ及び表２Ｂは、対照と比較して、ＺＺエタノール抽出物及び粗フラボノイド分画の両方で、試験した白血病細胞のＣＬＴ及びＣＬＴ４分泌が効率的に減少したことを示しており、最も高い活性を示した分画は主要フラボノイドを含み、純度約９０％であることを確認した。このフラボノイドの構造を５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンであると決定した（図１参照）。
【００１５】
表２Ａ．細胞生存度及びＡ２３１８７刺激白血病細胞により放出されるＣＬＴのレベルに与えるＺＺ試料の影響
【００１６】
表２Ｂ．細胞生存度及びＡ２３１８７刺激白血病細胞により放出されるＬＴＣ４のレベルに与えるＺＺ試料の影響
【００１７】
実験３：マウスモデルを用いたＺＺ−ＡＣＥの抗アレルギー活性
実験３の方法：ＺＺ−ＡＣＥの抗アレルギー活性、マウスモデル、生体外
動物の取り扱い、処理、及び脾臓細胞の収集：
国立実験動物センター（台湾の台北）から得た合計２４匹のメスＩＣＲマウスを無作為に３つの群、すなわち、陰性対照群（ｎ＝４）、並列対照群（ｎ＝７）及びＺＺ−ＡＣＥ群（ｎ＝１０）に分けた。陰性対照群には、何の処理も行わずに適宜餌を与えた。並行対照群及びＺＺ−ＡＣＥ群のマウスには、計画的に喘息反応を起こしながら５６日間にわたってそれぞれ水又はＺＺ−ＡＣＥを与えた。最初に、マウスあたり２０μｇのオボアルブミン及び２ｍｇの水酸化アルミニウムを１００μｌの０．９％生理食塩水に入れたものをマウスに腹腔内投与して感作し、４２日目に開始して３日連続行うことによって喘息反応を誘発し、次いで１％オボアルブミンを含むエーロゾル１０μｌを各マウスの気管に滴下することによってアレルギー性喘息を誘発した。喘息を誘発して２０分後、マウスを屠殺した。マウス脾臓細胞を機械的に破壊して単離し、細胞懸濁液中で赤血球を低張溶解した。脾臓細胞を３７℃で２４時間、１２μｇのＣｏｎＡ／２×１０6細胞／ウェル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、米国ミズーリ州セントルイス）を用いるか又は用いずに刺激した。全てのＲＮＡ試料を培養脾細胞から単離し、定量的競合的−ＲＴ−ＰＣＲ（ｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ）により評価してこれらの遺伝子発現レベルを求めた。
【００１８】
ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の遺伝子発現を測定するためのｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲのプライマーデザイン：
インターフェロン−γ及びインターロイキン−４のためのプライマーを、それぞれ遺伝子銀行受入れ番号ＮＭ＿００８３３７及びＢＣ０２７５１４の配列に従ってデザインした（表３Ａ）。各遺伝子に対して、３’逆方向プライマーは同じであるが、５’順方向プライマーが異なる２対のプライマーをデザインした。第一の対のプライマーでは、５’順方向プライマー（標準プライマーと呼ばれる）のＤＮＡ配列は、標的遺伝子のセグメントと同一である。この対のプライマーをＰＣＲ増幅に用い、自然長のＤＮＡ断片（標準断片）を合成した。標準断片をクローン化し、標準プラスミドを形成した。第二の対のプライマーでは、５’順方向プライマー（競合プライマー）は、標準プライマーから構成されるＤＮＡ配列を有し、それに続いて、１００塩基対を超えて下流にある遺伝子配列と同一の短いセグメントの配列を有していた。この第二の対のプライマーをＰＣＲ増幅に用い、標準断片と５’及び３’配列が同じであるが、１００を超える塩基対よりも短いＤＮＡ断片（競合的断片と呼ぶ）を得た。競合的断片を用い、競合的プラスミドを構成した。ｍＩＦＮ−γ（図２参照）及びｍＩＬ−４（図３参照）のＤＮＡ配列を以下に示す。プライマーデザイン、予測されたＰＣＲ生成物の長さを表３Ａに示す。
【００１９】
表３Ａ．ｍＩＦＮ−γ及びｍＩＬ−４遺伝子発現のレベルを求めるためにｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ法に用いたプライマー
【００２０】
標準プラスミド及び競合プラスミドの調製：
ＰＣＲキット及びプライマーで増幅されたインターフェロン−γ又はインターロイキン−４のマウスｃＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）にクローン化し、これら２つの遺伝子の標準プラスミド及び競合プラスミドを構築した。標準プラスミド及び競合プラスミドの配列を全て決定し、挿入した配列の正確さを確認した。
標準曲線の確立：
ｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ法の原理に従い、既知の量の競合プラスミドを既知の量の標準プラスミドの希釈列に混合し、混合物をＰＣＲ増幅のための１対の標準プライマー及び３’逆方向プライマーを備えるＤＮＡテンプレートとして用いた。次に、ＰＣＲ反応から得られる標準断片及び競合的断片の両方を臭化エチジウムゲル電気泳動に用いた。断片のバンド強度比と各混合物に用いたプラスミドの量の比との間の相関関係を計算し、標準曲線を確立した。
【００２１】
定量的競合的−ＲＴ−ＰＣＲ（ｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ）により求めた脾細胞中のインターフェロン−γ及びインターロイキン−４の遺伝子発現：
遠心分離後、脾細胞の細胞ペレットを１ｍｌのトリゾル試薬と混合し、次に、トリゾルＲＮＡ抽出物キットにより総ＲＮＡ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を単離した。Ａ260nm／Ａ280nm比により各試料の総ＲＮＡの純度を評価した。逆転写酵素でｍＲＮＡをｃＤＮＡに転換し、次にｑｃ−ＰＣＲで分析した。１μｌ標準プライマー（順方向及び逆方向プライマー各０．５μｇ）、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２．５μｌのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、０．１μｌのＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、０．５μｌの試料ｃＤＮＡ及び０．５μｌの競合プラスミドの混合物を純水で総容量２５μｌに調節し、その混合物中でｑｃ−ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ生成物を、次に、ゲル電気泳動で分析した。ゲルの各バンドの臭化エチジウム密度を、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒで読取り、結果と、確立した標準曲線とを比較して脾細胞試料のｃＤＮＡのコピー数を計算した。
【００２２】
実験３の結果：ＺＺ−ＡＣＥの抗アレルギー活性、マウスモデル、生体外
Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答の均衡を取ることによるＺＺ−ＡＣＥの抗アレルギー活性：
マウスをＺＺ−ＡＣＥで処理した後、処理したマウスから脾細胞を収集し、ｑｃ−ＰＣＲを用いてＩＦＮ−γ及びＩＬ−４遺伝子の発現レベルを分析した。結果（表３Ｂ）は、対照と比較して、ＣｏｎＡ刺激を用いて処理したマウスも用いずに処理したマウスも脾細胞における遺伝子発現レベルは、ＩＦＮ−γ（ｐ＜０．０５）の遺伝子発現レベルが有意に増大し、ＩＬ−４（ｐ＜０．０５）の遺伝子発現レベルが有意に減少した。ＩＬ−４に対するＩＦＮ−γの遺伝子発現の比率が有意に増大したために、ＺＺ−ＡＣＥは、Ｔｈ１／Ｔｈ２均衡を調節することによってアレルギー反応を消失させるのに有利に働くことができる。従って、この実験の結果より、ＺＺ−ＡＣＥを６０日連続投与した後には、ＺＺ−ＡＣＥが、マウスの免疫細胞のサイトカイン遺伝子発現を調節することによってアレルギー反応を低減する可能性を有することが示された。ＩＦＮ−γ（図４）及びＩＬ−４（図５）遺伝子発現のためのｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲ生成物のゲル電気泳動写真の例を以下に示す。
【００２３】
表３Ｂ．ＺＺ−ＡＣＥを飲ませたか又は飲ませずに喘息誘発を行ったか又は行わなかったマウスから収集した脾細胞のＣｏｎＡ刺激を用いたか又は用いなかったＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の遺伝子発現のレベル1
1同じ列の異なる上付き文字は、有意差（ｐ＜０．０５）を示している。
2値は、最初に、各マウスからＩＦＮ−γ／ＩＬ−４の比を計算し、次に、その比を平均することによって計算した。
【００２４】
実験４：活性化合物がＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答の均衡を調節するときのゼルンボンの同定
実験４の方法：
活性化合物の同定：
最初に、乾燥ＺＺ根をエタノールで抽出し（エタノール抽出物）、次に、シリカゲル及びＰＬＣでクロマトグラフにより抽出物を更に精製し、試験管内生理活性スクリーニング（以下の実験４Ａ〜実験４Ｅに説明する手順）で分析して強力な抗アレルギー活性を含む精製分画を同定した（結果は以下の実験４Ａ〜実験４Ｅに説明する）。次に、同定した活性分画から活性化合物を単離した。
実験４の結果：
活性化合物がＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答の均衡を調節するときのゼルンボンの同定
活性化合物の同定：
活性分画の化合物をゼルンボンと同定した。ゼルンボンの構造は図６を参照されたい。
【００２５】
４Ａ：ＩＬ−１３／ＴＮＦ−α刺激ヒトＢＥＡＳ−２Ｂ細胞によるエオタキシン分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
実験４Ａの方法：
細胞培養、ＺＺ試料での処理、及びエオタキシン発現のための刺激：
ＳＶ４０形質転換ヒト気管支上皮細胞ＢＥＡＳ−２ＢをＦ１２／ＤＭＥＭ培地と共に９６ウェルプレートに蒔き、３７℃で培養して集密させた。次に、細胞を種々の濃度のＺＺ試料で処理した。２０分処理した後、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００−１３）及び１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００−０１Ａ）を用い、３７℃で２２時間刺激した。培養培地を収集し、そのエオタキシン濃度を測定した。
サイトカインエオタキシンのためのＥＬＩＳＡアッセイ：
エオタキシン濃度をＯｐｔ ＥＩＡ Ｓｅｔセットを用いて求めた。ヒトエオタキシンはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ製２６２３ＫＩ、９６ウェルプレートはＩＷＡＫＩ製３８０１−０９６であった。分析は、製造業者の指示書に従って行った。
【００２６】
実験４Ａの結果：
ＳＶ４０形質転換ヒト気管支上皮細胞ＢＥＡＳ−２ＢをＺＺ試料で処理し、ヒトＴＮＦ−αで刺激してエオタキシンを発現させた後、培養培地を収集してそのエオタキシン濃度をＥＬＩＳＡキットで測定した。結果を表４Ａにまとめた。エオタキシン阻害活性は、エタノール抽出物分画に豊富に存在し、ゼルンボンを含む分画に更に豊富に存在することがわかった。
【００２７】
表４Ａ．ＩＬ−１３／ＴＮＦ−α刺激ヒトＢＥＡＳ−２Ｂ細胞によるエオタキシン分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
【００２８】
４Ｂ：ネズミ腹膜マクロファージによるＴＮＦ−α分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
実験４Ｂの方法：
細胞培養：
１ｍｌの４％ブルーアーのチオグリコレート培地（Ｓｉｇｍａ、Ｂ２５５１）をオスのＢＡＬＢ／ｃマウス（週齢６〜１０）の腹膜空洞にｉ．ｐ．（腹腔内）注射することによってマウス腹膜マクロファージを誘発した。腹膜細胞を、注射後７日目に、氷温ＲＰＭＩ−１６４０培地で腹膜洗浄することによって得た。
薬物処理：
ネズミ腹膜マクロファージ（１×１０5）は、ＲＰＭＩ−１６４０培地と共に平底９６ウェルプレートに蒔いた。細胞は、種々の濃度のＺＺ−ＡＣＥ試料で２０分間処理し、次に、１．５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポ多糖類）（Ｓｉｇｍａ、Ｌ−２８８０）で更に２２時間刺激した後、ＴＮＦα法のために培地を収集した。
ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡアッセイ：
ＴＮＦ−αを、Ｒ＆Ｄマウス ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏｓｅｔ、ＤＹ４１０）を用い、製造業者により推奨される手順に従って求めた。
【００２９】
実験４Ｂの結果：
マウス腹膜マクロファージを種々の濃度のＺＺ−ＡＣＥ試料により試験管内で処理し、次に、ＬＰＳで刺激した後、ＴＮＦαアッセイのために培地を収集したところ、ＺＺ−ＡＣＥとゼルンボンが豊富な精製分画との両方がＴＮＦα放出に阻害活性を示した。
【００３０】
表４Ｂ．ＬＰＳ刺激ネズミ腹膜マクロファージによるＴＮＦ−α分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
【００３１】
４Ｃ：試験管内でのＬＰＳ刺激マウス脾細胞のＢ細胞増殖のレベルに与えるＺＺ試料の影響
実験４Ｃの方法：
脾細胞の調製：
オスのＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１２週齢）からマウス脾臓を収集した。脾臓は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０４−００１−１Ｂ）、５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０３５−１Ｂ）、１μｇ／ｍｌのカナマイシン（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０４９−１Ｂ）、１．２ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、１１３６０−０７０）、０．１２ｍＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０−０５０）、０．２ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７５２２）及び２ｇ／ｌの重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ５７６１）を補充した１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯカタログ番号２３４００−０１３）中で１０ｍｌシリンジのプランジャを用いてすり潰した。次に、１５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（０．１５ＭのＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ3、０．１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）を加え、赤血球を溶解した。ＡＣＫ溶解緩衝液処理後、脾細胞を、４℃、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって収集した。次に、１０ｍｌの細胞培養培地で洗浄し、最後に、培養培地に再懸濁した。
【００３２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞のＢ細胞増殖に与える薬物の影響
脾細胞の薬物処理及びＢ細胞増殖のための刺激：
平底９６ウェルプレートに、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地と共に脾細胞（１．５×１０5）を蒔いた。脾細胞を、３７℃で２時間、様々な濃度のＺＺ試料で処理し、その後、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中１５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｌ２８８０）を用い、３７℃で６６時間刺激してＢ細胞増殖を促進し、その後分析した。
Ｂ細胞のための増殖分析：
増殖は、Ｒｏｃｈｅ ＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ、１６４７２２９）を用いて測定した。９６ウェルプレート内の細胞を、最初に、３７℃で６時間、１００μＭのＢｒｄＵで処理した。次に、プレートを、４℃、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞を乱すことなく上清を除去した。プレートを６０℃で１時間培養し、次に、ウェルあたり２００μｌのＦｉｘＤｅｎａｔを加えた。室温で３０分培養した後、ＦｉｘＤｅｎａｔを廃棄し、ウェルあたり３００μｌのブロッキング溶液を加えた。プレートを室温に１時間保持し、ウェルあたり３００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、その後、１００μｌ／ウェルの抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤを加えた。室温で１時間培養した後、プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、その後、ウェルあたり１００μｌの基質を加え、室温で５分間、暗所で培養した。ウェルあたり２５μｌの保存液を加えることによって反応を終了させ、４５０ｎｍでマイクロプレート読取装置を用いることによりＯＤを測定した。
実験４Ｃの結果：
【００３３】
表４Ｃ．試験管内でのＬＰＳ刺激マウス脾細胞のＢ細胞増殖レベルに与えるＺＺ試料の影響
【００３４】
４Ｄ：ＣｏｎＡ刺激マウス脾細胞によるＩＮＦ−γ分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の試験管内での影響
実験４Ｄの方法：
脾細胞の調製及び薬物処理：
調製した脾細胞（実験４Ｃ参照）を６×１０5細胞／１００μｌまで希釈し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を備えた平底９６ウェルプレートに蒔いた。次に、脾細胞を様々な濃度のＺＺ試料（３０μｌ）で３７℃で２時間処理し、最後に、１μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）で１８時間刺激した。培地中のＩＦＮ−ν濃度をＥＬＩＳＡアッセイにより求め、細胞生存度をＭＴＴアッセイにより測定した。
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ：
マウスＩＦＮ−γをＲ＆ＤマウスＩＦＮ−γ（Ｄｕｏｓｅｔ、ＤＹ４８５）キットを用いることによって求めた。ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者により推奨される手順に従って行った。
実験４Ｄの結果：
ＺＺ試料がＣｏｎＡ刺激マウス脾細胞によるＩＮＦ−γ分泌物のレベルに及ぼす影響を表４Ｄにまとめた。ＺＺ−ＡＣＥ及びエタノール抽出分画の両方とも、培養培地中のＩＦＮ−γ濃度を上昇させる能力を示した。
【００３５】
表４Ｄ．試験管内でのＣｏｎＡ刺激マウス脾細胞によるＩＮＦ−γ分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
【００３６】
４Ｅ：ＰＭＡ／Ａ２３１８７刺激マウスＥＬ−４細胞によるＩＬ−４分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
実験４Ｅの方法：
細胞培養：
３７℃の５％ＣＯ2中、７５ｃｍ2培養フラスコで１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、１μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、１．２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１２ｍＭの非必須アミノ酸、０．２ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｇ／ｌの重炭酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中でＥＬ−４細胞を培養した。
薬物処理：
ＥＬ−４細胞（１×１０4細胞／１００μｌ）を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を備えた平底９６ウェルプレートに蒔いた。細胞を、３７℃で２時間、様々な濃度のＺＺ−ＡＣＥ試料（３０μｌ）で処理し、次に、３７℃で２２時間、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（総容量１５０μｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中の１．５ｎｇ／ウェルのＰＭＡ及び１５ｎｇ／ウェルのＡ２３１８７で刺激した。細胞を含有しない上清中のＩＬ−４分泌物のレベルをＥＬＩＳＡアッセイにより求め、細胞生存度をＭＴＴアッセイにより測定した。
【００３７】
ＩＬ−４ ＥＬＩＳＡ：
ＩＬ−４を、Ｒ＆Ｄマウス ＩＬ−４ ＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏｓｅｔ、ＤＹ４０４）を用いて測定した。９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ、３８０１−０９６）を、１００μｌ／ウェルの捕捉抗体（ＰＢＳ中に４μｇ／ｍｌ）で被覆し、室温で一晩培養した。次に、プレートを、洗浄緩衝液（０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、室温で１時間、３００μｌのブロッキング緩衝液／ウェル（１％ウシ血清アルブミン及び５％ショ糖を含むＰＢＳ）で培養することによって遮断した。プレートを、洗浄緩衝液で３回洗浄してから、１００μｌの試験液又は標準液をウェルに加えた。プレートを、室温で２時間培養して洗浄し、検出抗体［ウェルあたり２００ｎｇ／ｍｌ試薬希釈剤（１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）１００μｌ］と共に室温で２時間培養した。洗浄後、各ウェルに１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰを加え、室温で２０分間培養し、洗浄後、ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ）と共に２０分間培養した。反応を、１００μｌの１ＮのＨＣｌ／ウェルを加えることによって終了させ、４５０ｎｍでマイクロプレート読取装置を用いることによってＯＤを測定した。
実験４Ｅの結果：
【００３８】
表４Ｅ．ＰＭＡ／Ａ２３１８７刺激マウスＥＬ−４細胞によるＩＬ−４分泌物に与えるＺＺ試料の影響
【００３９】
実験５：アレルギー性鼻炎に対してＺＺ−ＡＣＥを用いたヒトボランティア
５人のボランティアが、アレルギー性鼻炎を治療するためにＺＺ−ＡＣＥを摂取した。その経験をここにまとめた。
ボランティアＡ：
Ｗｅｎ氏は、何年も重症のアレルギー性鼻炎に罹っている。鼻炎を治療するために、毎日、新しく収穫したＺＺ根（乾燥前）３００ｇｍを水に入れて調理し、そのスープを飲ませた。１つの治療コースとして、治療を７日間繰返した。治療終了時には、症状は有意に軽減した。３ヵ月後、症状がぶり返し、治療コースを繰返して成功した。
ボランティアＢ：
もうひとりのＷｅｎ氏（ボランティアＡの父親）は、ボランティアＡの治療コースに従いアレルギー性鼻炎の症状を軽減するのに成功した。後に、アレルギーの時期になる度に治療コースを繰返した。
ボランティアＣ：
Ｌｅｅ氏は、１０００ｇｍの湿った新鮮なＺＺ根を調理し、スープを密封容器に入れて冷蔵保存した。Ｌｅｅ氏は、約１／４のスープを４日間毎日飲み、アレルギー性鼻炎を治療した。結果は、満足することができるものであった。後に症状がぶり返すと、同じ治療コースを繰返して成功した。
ボランティアＤ：
Ｄｕ氏は、ＺＺカプセルを毎日、朝６カプセル、夕方６カプセル２ヶ月服用し、非常に重症のアレルギー性鼻炎を治療することに成功した。
ＺＺカプセルは、以下の手順により調製した。乾燥ＺＺ根を１０倍の水（重量対重量比）で調理した。スープをほぼ５倍に濃縮し、次に、デンプンを賦形剤として用い、乾燥して顆粒にした。顆粒を用いてカプセルを充填した。各カプセルは、約２．０ｇｍの乾燥ＺＺ根又は約２０ｇｍの新たに収穫したＺＺ根に相当する０．５ｇｍの顆粒を含む。
ボランティアＥ：
また、ボランティアＤが用いた同じバッチのＺＺカプセルを用いて、３カプセル／日で約１８０日間にわたってボランティアＥのＨｕａｎｇ氏も治療した。１８０日の間、このボランティアは、以前よりもアレルギー問題が軽減した。
本発明は、単に例示的に挙げたものである上述の実施形態に限定されないものとするが、特許請求の範囲によって規定される保護の範囲内で様々に変更することができる。
【００４０】
参考文献：
１．Ｗｅｎｚｅｌ ＳＥ著喘息におけるロイコトリエンの役割、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ、２００３年、第６９巻、１４５〜５５頁
２．Ｌｅｆｆ ＡＲ著喘息の管理におけるロイコトリエンの調節：生物学及び臨床療法、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ、２００１年、第５２巻、１〜１４頁
３．Ａｉｚａｗａ Ｔ、Ｔａｍｕｒａ Ｇ、Ｏｈｔｓｕ Ｈ、Ｔａｋｉｓｈｉｍａ Ｔ著ロイコトリエンＣ４及びＢ４の好酸球及び好中球産生：喘息の被験者の細胞と健常供与者の細胞との比較、Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ、１９９０年、第６４巻、２８７〜９２頁
４．Ｄａｖｅｒｎ ＴＪ、Ｂａｓｓ ＮＭ著ロイコトリエン拮抗剤、Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ、２００３年、第７巻、第２号、５０１〜１２頁ｖｉｉｉ
５．Ｂｅｇｈｅ Ｂ、Ｂａｒｔｏｎ Ｓ、Ｒｏｒｋｅ Ｓ、Ｐｅｎｇ Ｑ、Ｓａｙｅｒｓ Ｉ、Ｇａｕｎｔ Ｔ、Ｋｅｉｔｈ Ｔ、Ｃｌｏｕｇｈ Ｊ、Ｈｏｌｇａｔｅ Ｓ、Ｈｏｌｌｏｗａｙ Ｊ著インターロイキン−４及びインターロイキン−４受容体α鎖遺伝子の多型性が白色人種における喘息及びアトピーの罹病生を与える、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００３年、第３３巻、１１１１〜１１１７頁
６．Ｓｈｉｒａｉ Ｔ、Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ、Ｉｎｕｉ Ｎ、Ｓｕｄａ Ｔ、Ｃｈｉｄａ Ｋ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｈ著アトピー性咳嗽及びアトピー性喘息における末梢血液中のＴｈ１／Ｔｈ２プロフィール、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００３年、第３３巻、８４〜９頁
７．Ｌｅｅ ＹＣ、Ｌｅｅ ＫＨ、Ｌｅｅ ＨＢ、Ｒｈｅｅ ＹＫ著急性喘息におけるインターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びインターフェロン−γの血清レベル、Ｊ Ａｓｔｈｍａ、２００１年、第３８巻、６６５〜７１頁
８．Ｋａｌｉｎ Ｐ著西洋フキ（Ｐｅｔａｓｉｔｅｓ ｈｙｂｒｉｄｕｓ）−薬草のポートレート、Ｆｏｒｓｃｈ Ｋｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｍｅｄ Ｋｌａｓｓ Ｎａｔｕｒｈｅｉｌｋｄ、２００３年、第１０巻、補遺１、４１〜４頁
９．Ｖｉｍａｌａ Ｓ、Ｎｏｒｈａｎｏｍ ＡＷ、Ｙａｄａｖ Ｍ著従来の医薬品に用いられるマレーシアショウガ根粒菌の抗腫瘍促進剤活性、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、１９９９年、第８０巻、１１０〜６頁
１０．Ｍｕｒａｋａｍｉ Ａ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｄ、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｔ、Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ Ｋ、Ｋｉｍ ＨＷ、Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ Ａ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ、Ｊｉｗａｊｉｎｄａ Ｓ、Ｔｅｒａｏ Ｊ、Ｏｈｉｇａｓｈｉ Ｈ著ゼルンボン、すなわち東南アジアのショウガセスキテルペンがフリーラジカルの発生、炎症誘発性タンパクの産生、及びアポトーシスを伴うガン細胞増殖を著しく抑制する：α、β−不飽和カルボニル基が必須条件である、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００２年、第２３巻、７９５〜８０２頁、論評：Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００２年、第２３巻、１９６１頁に掲載、著者の回答、１９６３年
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンの化学構造（分子構造Ｃ16Ｈ12Ｏ6、分子量300.27）を示す図である。
【図２】用いたプライマーに対応する配列に下線を引いた、ｍＩＦＮ−γ遺伝子（遺伝子銀行受入れ番号ＮＭ＿００８３３７）のＤＮＡ配列を示す図である。
【図３】ｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーに対応する配列に下線を引いた、ＤＮＡ配列ｍＩＬ−４（遺伝子銀行受入れ番号ＢＣ０２７５１４）の図である。
【図４】レーン１〜８が、ＤＮＡテンプレートとして脾細胞ｃＤＮＡ試料及び競合プラスミドを用いたＰＣＲ生成物であり、レーンＭが、マーカ（１００ｂｐラダー）であり、レーンＳ１〜Ｓ５が、標準曲線を確立するためにＤＮＡテンプレートとして標準及び競合プラスミドを用いたＰＣＲ生成物である、マウス脾細胞でのＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現レベルを求めるためのｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動の図である。
【図５】ＩＬ−４ｍＲＮＡの検出が、マウス脾細胞でのｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲによるものであり、レーン１〜９が、脾細胞ｃＤＮＡ試料及び競合プラスミドをＤＮＡテンプレートとして用いたＰＣＲ生成物であり、レーンＭが、マーカ（１００ｂｐラダー）であり、レーンＳ１〜Ｓ７が、標準曲線を確立するために標準及び競合プラスミドをＤＮＡテンプレートとして用いたＰＣＲ生成物である、マウス脾細胞でのＩＬ−４ｍＲＮＡ発現レベルを求めるためのｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動を示す図である。
【図６】ゼルンボンの化学構造を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根からの抽出物を含有する新しい栄養補助組成物及び免疫系を制御するためのその使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ロイコトリエン（ＬＴ）、詳細には、システイニルＬＴ、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、及びＬＴＥ４は、喘息の臨床経過、生理的変化、及び病原に関連する（１）。ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、及びＬＴＥ４は、強力な気管支収縮剤であり、血管、粘膜毛様体クリアランス、及び好酸球性炎症への付加的な作用に関わる（２）。更に、システイニルＬＴは、一般的に、好酸球及び肥満細胞を含む喘息に伴う細胞で形成される（３）。従って、気管支喘息の治療には、ロイコトリエン受容体拮抗剤が広く用いられている。しかし、新しい群の喘息薬、一般的にロイコトリエン受容体拮抗剤関連の肝臓傷害に関する公開されたデータでは、肝毒性の認識が高まっている（４）。すなわち、喘息の長期療法に医薬品としての可能性を有する薬草により、新たな窓が開かれる。末梢血液Ｔ細胞によるＴh細胞サイトカインは、喘息重症度に相関することが見出されている。近年の研究では、その受容体（ＩＬ−４Ｒ）に結合するインターロイキン−４（ＩＬ−４）が、喘息に存在する気道炎症の発現に不可欠であることが示されている（５）。１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）／イオノマイシン刺激後には、ＩＦＮ−γ−／ＩＬ−４産生ＣＤ４＋Ｔ細胞比が、アトピー性咳嗽及びアトピー性喘息の患者では正常被験者に比較して有意に低いことが見出されており、ＩＬ−４−産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が、アトピー性喘息の患者では正常の対照被験者よりも有意に高かった（６）。対照被験者に比較すると、急性喘息では、循環ＩＬ−４（ｐ＜０．００１）、ＩＬ−５（ｐ＜０．００１）、及びＩＬ−１３（ｐ＜０．００１）のレベルが有意に増大したが、血清ＩＦＮ−γ（ｐ＝０．０６９）の差は、境界有意性であった（７）。しかし、非常に低い血清レベルのこれらのサイトカインは、動物実験でしか検出可能ではなかった。従って、本出願人の研究室では、従来の薬草の治療的指標を正確に評価するために、免疫細胞のサイトカインの遺伝子発現を定量するための新しい廉価な生物工学試験である定量的競合的逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（ｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ）を開発した。医薬品として可能な薬草を探す時に、競合的システイニルロイコトリエン受容体拮抗剤は、新しい部類の喘息薬剤と見なされている（８）。近年、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍｉｔｈには、抗腫瘍促進剤活性があり（９）、マウスマクロファージ内に腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を放出すると共に誘導一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）が著しく減少することが見出された（１０）。
【０００３】
【非特許文献１】Ｗｅｎｚｅｌ ＳＥ著、喘息におけるロイコトリエンの役割、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ、２００３年、第６９巻、１４５〜５５頁
【非特許文献２】Ｌｅｆｆ ＡＲ著、喘息の管理におけるロイコトリエンの調節：生物学及び臨床療法、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ、２００１年、第５２巻、１〜１４頁
【非特許文献３】Ａｉｚａｗａ Ｔ、Ｔａｍｕｒａ Ｇ、Ｏｈｔｓｕ Ｈ、Ｔａｋｉｓｈｉｍａ Ｔ著、ロイコトリエンＣ４及びＢ４の好酸球及び好中球産生：喘息の被験者の細胞と健常供与者の細胞との比較、Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ、１９９０年、第６４巻、２８７〜９２頁
【非特許文献４】Ｄａｖｅｒｎ ＴＪ、Ｂａｓｓ ＮＭ著、ロイコトリエン拮抗剤、Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ、２００３年、第７巻、第２号、５０１〜１２頁ｖｉｉｉ
【非特許文献５】Ｂｅｇｈｅ Ｂ、Ｂａｒｔｏｎ Ｓ、Ｒｏｒｋｅ Ｓ、Ｐｅｎｇ Ｑ、Ｓａｙｅｒｓ Ｉ、Ｇａｕｎｔ Ｔ、Ｋｅｉｔｈ Ｔ、Ｃｌｏｕｇｈ Ｊ、Ｈｏｌｇａｔｅ Ｓ、Ｈｏｌｌｏｗａｙ Ｊ著、インターロイキン−４及びインターロイキン−４受容体α鎖遺伝子の多型性が白色人種における喘息及びアトピーの罹病生を与える、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００３年、第３３巻、１１１１〜１１１７頁
【非特許文献６】Ｓｈｉｒａｉ Ｔ、Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ、Ｉｎｕｉ Ｎ、Ｓｕｄａ Ｔ、Ｃｈｉｄａ Ｋ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｈ著、アトピー性咳嗽及びアトピー性喘息における末梢血液中のＴｈ１／Ｔｈ２プロフィール、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００３年、第３３巻、８４〜９頁
【非特許文献７】Ｌｅｅ ＹＣ、Ｌｅｅ ＫＨ、Ｌｅｅ ＨＢ、Ｒｈｅｅ ＹＫ著、急性喘息におけるインターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びインターフェロン−γの血清レベル、Ｊ Ａｓｔｈｍａ、２００１年、第３８巻、６６５〜７１頁
【非特許文献８】Ｋａｌｉｎ Ｐ著、西洋フキ（Ｐｅｔａｓｉｔｅｓ ｈｙｂｒｉｄｕｓ）−薬草のポートレート、Ｆｏｒｓｃｈ Ｋｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｍｅｄ Ｋｌａｓｓ Ｎａｔｕｒｈｅｉｌｋｄ、２００３年、第１０巻、補遺１、４１〜４頁
【非特許文献９】Ｖｉｍａｌａ Ｓ、Ｎｏｒｈａｎｏｍ ＡＷ、Ｙａｄａｖ Ｍ著、従来の医薬品に用いられるマレーシアショウガ根粒菌の抗腫瘍促進剤活性、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、１９９９年、第８０巻、１１０〜６頁
【非特許文献１０】Ｍｕｒａｋａｍｉ Ａ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｄ、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｔ、Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ Ｋ、Ｋｉｍ ＨＷ、Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ Ａ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ、Ｊｉｗａｊｉｎｄａ Ｓ、Ｔｅｒａｏ Ｊ、Ｏｈｉｇａｓｈｉ Ｈ著、ゼルンボン、すなわち東南アジアのショウガセスキテルペンがフリーラジカルの発生、炎症誘発性タンパクの産生、及びアポトーシスを伴うガン細胞増殖を著しく抑制する：α、β−不飽和カルボニル基が必須条件である、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００２年、第２３巻、７９５〜８０２頁、論評：Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００２年、第２３巻、１９６１頁に掲載、著者の回答、１９６３年
【発明の開示】
【０００４】
本発明者は、本明細書において、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔが炎症性媒介物の放出を阻害し、サイトカインネットワークの遺伝子発現に影響を及ぼすという有利な作用を有することを明らかにする。更に、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔの抽出物をヒトに使用してアレルギー性疾患を治療する例も説明する。
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ （Ｌ．） Ｓｍｉｔｈ（ＺＺ）の水性粗抽出物（ＡＣＥ）が抗過敏性及び抗炎症性を有する可能性をマウスで明らかにした。ＺＺ−ＡＣＥで治療したマウスの肺組織から放出されたロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）を測定したところ、ＺＺ−ＡＣＥが肺組織からのＬＴＣ４放出を効率的に抑制した。ＬＴＣ４を抑制する作用に基づき、活性化合物を、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンと同定した。
【０００５】
オバアルブミンを用いて、マウスに喘息性アレルギー反応を誘発した。ＺＺ−ＡＣＥで処理したマウスの脾細胞ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４遺伝子発現レベルの比は、対照群と比較して高かった（ｐ＜０．０５）。ゼルンボンはＩＦＮ−γ／ＩＬ−４遺伝子発現比を増大させる有効成分であることを確認した。
また、ボランティアに液体又はカプセルの形態のＺＺ−ＡＣＥを投与したときの抗アレルギー作用も観察した。
これらの結果は、エタノ−ル、水又はエタノールと水との混合物を溶媒として用いたＺＺの抽出物がアレルギー性炎症を予防又は治療する可能性を有する成分を含むことを示している。
本発明の他の目的及び特徴は、添付の図面と共に以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、図面は、例示のためだけを意図したもので本発明の範囲を定めるものではなく、本発明の範囲は、特許請求の範囲を参照すべきであることは理解されるものとする。更に、図面は必ずしも縮尺通りではなく、特に示さない限り、本明細書に説明した構造及び手順を概念的に示すことしか意図していないことも理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
材料と方法
機器：
カラムクロマトグラフィー用シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０、２３０〜４００メッシュＡＳＴＭ）及びＰＬＣ（０．５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４）は、Ｍｅｒｃｋから入手した。Ｖａｒｉａｎｓ５００によりプロトンＮＭＲスペクトルを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＬＣ−ＭＳにより質量スペクトルを測定した。
水抽出物としてのＺＺ−ＡＣＥ：
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ （Ｌ．） Ｓｍｉｔｈの乾燥根５０ｇを５００ｍｌの蒸留水（１０倍重量）と混合し、１００℃で４時間還流した。抽出物を濾過して１００ｍｌまで濃縮し、その後、凍結乾燥した。凍結乾燥した粉末は、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ （Ｌ．） Ｓｍｉｔｈの水性粗抽出物（aqueous crude extract, ＡＣＥ）又はＺＺ−ＡＣＥとして保存した。
エタノール抽出：
乾燥ＺＺを砕き、１０倍のエタノールと混合し（１０ｍｌエタノール／ｇＺＺ）、６０℃で４時間還流した。抽出物を濾過し、１／１０容量まで濃縮してから凍結乾燥し、エタノール抽出物として保存した。エタノール抽出物は、シリカゲルカラムを用いて更にある程度精製した。
【０００７】
カラムクロマトグラフィー：
エタノール抽出物（６５ｇ）を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、７．５ｃｍＩＤ×２０ｃｍＨ）上に載せた。ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（ｎ−Ｈｅｘ／ＥＡ）（１０００ｍｌ／２００ｍｌ）で溶媒ステップ勾配を開始し、連続的にｎ−Ｈｅｘ／ＥＡ（６００ｍｌ／４００ｍｌ）、ｎ−Ｈｅｘ／ＥＡ（４００ｍｌ／６００ｍｌ）、ＥＡ（１０００ｍｌ）、最後にメタノール（１０００ｍｌ）と続けた。溶出液（eluent）は、最初から５００ｍｌ／フラスコに収集した。流速は約３０ミリリットル／分であった。１２の分画を収集し、溶出順にＮＰ１〜ＮＰ１２とした。
ゼルンボンの単離：分画ＮＰ２の内容物をメタノールで再結晶し、純結晶を得た。プロトンＮＭＲ及びＭＳスペクトル試験の結果から、この化学物質は、ゼルンボン（０．８ｇ）であると判断した。分画ＮＰ２を粗ゼルンボンと名付けた。
【０００８】
粗フラボノイド分画の調製：
ＮＰ１２（５ｇ）を別のカラム（ＳｉＯ2、２．５ｃｍＩＤ×１２ｃｍＨ）に載せた。溶出液を最初から２００ミリリットル／分画で収集した。流速は、約１０ミリリットル／分であった。溶媒勾配は、順にｎ−Ｈｅｘ（１００ｍｌ）、ｎ−Ｈｅｘ／ＥＡ（１００ｍｌ／１００ｍｌ）、ｎ−Ｈｅｘ／ＥＡ（１００ｍｌ／１５０ｍｌ）、ＥＡ（１００ｍｌ）、及びＥＡ／ＭｅＯＨ（１００ｍｌ／５０ｍｌ）とした。７つのフラスコを収集し、ＮＰ１２−１〜ＮＰ１２−７とした。分画ＮＰ１２−３を粗フラボノイドと名付けた。
５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンの単離：
ＮＰ１２−３（３０．２ｍｇ）を単離し、ＰＬＣに載せ、ジクロロメタン／メタノール（３０／１）で展開し、８つのストリップ（ＮＰ１２−３−１〜ＮＰ１２−３−８）を得た。ストリップＮＰ１２−３−３中の物質（３．４ｍｇ、ＰＬＣ精製フラボノイドと命名、純度９０％）を単離し、ｎ−Ｈｅｘ／アセトンで再結晶した。純フラボン類似体（１．５ｍｇ）を得、プロトンＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎｓ ５００）及びＬＣ−Ｍａｓｓスペクトルで、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンと同定した。
【０００９】
実験１：マウスでのＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ （Ｌ．） Ｓｍｉｔｈの水性粗抽出物（ＡＣＥ）の抗肺炎症活性
実験１の方法：
動物の取り扱い、薬物処理、及び肺組織試料収集：
４週齢のメスのＩＣＲマウス合計２０匹を国立実験動物センター（台湾の台北）から得た。マウスは、無作為に２つの群、すなわち、対照群とＺＺ−ＡＣＥ群に分けた。対照群のマウスに水を飲ませ、ＺＺ−ＡＣＥ群のマウスにＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ （Ｌ．） Ｓｍｉｔｈの水性粗抽出物（ＡＣＥ）（ＺＺ−ＡＣＥ、２８．８ｍｇ／ｍｌ）を０．２２μｍフィルタで濾過したものを飲ませた。全てのマウスに適宜餌を与えた。２８日餌を与えた後、全てのマウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔した。２０ｍｌのタイロード緩衝液を用いて、肺を潅流した。潅流後、各肺の同じ部分から０．５ｇの肺組織を採取した。肺組織は、第１１号外科用ブレードで刻み、その後、１０ｍｌのタイロード緩衝液に入れ、９５％Ｏ2、３７℃で４５分間培養した。培養後、培地中のロイコトリエンＣ4をＣ１８カートリッジで精製し、その後、ロイコトリエンＣ4ＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ミシガン州）により定量した。
【００１０】
実験１の結果：ＺＺ−ＡＣＥの抗肺炎症活性
マウスにおけるＺＺ−ＡＣＥの抗肺炎症活性：
ＺＺ−ＡＣＥ群のマウスの肺組織から放出されたロイコトリエンＣ4の量は有意に少なかった（表１）。ＬＴＣ４は、アナフィラキシーの遅反応物質と名付けられているので、ロイコトリエンＣ4の生成が減少することは、ＺＺ−ＡＣＥに薬用効果があることを示している。
【００１１】
表１．ＺＺ−ＡＣＥの投与の有無によるマウスの肺組織からのＬＴＣ４放出のレベル
*対象と比較して、有意差あり（Ｐ＜０．０５）
【００１２】
実験２：抗炎症化合物の５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンとしての単離
実験２の方法：抗炎症化合物の同定
細胞培養及び薬物処理：
ラット好塩基球性白血病−１（ＲＢＬ−１）を、食品産業研究及び開発研究所から購入し（ＣＣＲＣ ６０１９８、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１３７８）、ＭＥＭ−α培地（Ｇｉｂｃｏ、１２０００）で培養した。全トランスレチノイン酸（１μｇ／ｍｌ）を２×１０6細胞／２ｍｌ／ウェルで３．５ｃｍ直径のウェル（６ウェルプレート）に加えた。次に、プレートを空気中５％ＣＯ2で１６時間、３７℃で培養した。様々な容量のＺＺ試料をウェルに加えて、適切な最終濃度（０、０．５、５、５０μｇ／ｍｌ）にし、更に２時間培養した。Ａ２３１８７（カルシウムイオノホア）を各ウェルに入れて最終濃度を１０μＭにし、ＲＢＬ−１細胞を刺激してＬＴＣ４／ｃＬＴを１５分間放出させた。ウェル内の培地を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡアッセイのための上清液を得た。
【００１３】
ＬＴＣ４／ｃＬＴ ＥＬＩＳＡ法：
細胞培養物の上清液は、ＬＴＣ４／ｃＬＴのためのＥＩＡ分析の前に適切な濃度に希釈した。分析は、製造業者により供給される手順に従って行った。
ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］法：
細胞生存度を求めるために、培養した培地を除去し、１×ＰＢＳで細胞を洗った。次に、ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２１２８）を９６ウェルプレートに加えて濃度を０．５ｍｇ／ｍｌにした。３７℃で４時間培養した後、プレートに、ウェルあたり１５０μｌの酸性イソプロパノール（０．１Ｎ ＨＣｌ）を加え、紫の結晶を溶解した。一晩培養した後、５６０ｎｍでマイクロプレート読取装置を用い、ＯＤを求めた。
【００１４】
実験２の結果：抗炎症化合物の単離
Ａ２３１８７刺激ラット好塩基球性白血病−１（ＲＢＬ−１）細胞により、粗フラボノイド分画及び同定されたフラボノイドの両方でＣＬＴ／ＬＴＣ４分泌物が減少する：
表２Ａ及び表２Ｂは、対照と比較して、ＺＺエタノール抽出物及び粗フラボノイド分画の両方で、試験した白血病細胞のＣＬＴ及びＣＬＴ４分泌が効率的に減少したことを示しており、最も高い活性を示した分画は主要フラボノイドを含み、純度約９０％であることを確認した。このフラボノイドの構造を５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンであると決定した（図１参照）。
【００１５】
表２Ａ．細胞生存度及びＡ２３１８７刺激白血病細胞により放出されるＣＬＴのレベルに与えるＺＺ試料の影響
【００１６】
表２Ｂ．細胞生存度及びＡ２３１８７刺激白血病細胞により放出されるＬＴＣ４のレベルに与えるＺＺ試料の影響
【００１７】
実験３：マウスモデルを用いたＺＺ−ＡＣＥの抗アレルギー活性
実験３の方法：ＺＺ−ＡＣＥの抗アレルギー活性、マウスモデル、生体外
動物の取り扱い、処理、及び脾臓細胞の収集：
国立実験動物センター（台湾の台北）から得た合計２４匹のメスＩＣＲマウスを無作為に３つの群、すなわち、陰性対照群（ｎ＝４）、並列対照群（ｎ＝７）及びＺＺ−ＡＣＥ群（ｎ＝１０）に分けた。陰性対照群には、何の処理も行わずに適宜餌を与えた。並行対照群及びＺＺ−ＡＣＥ群のマウスには、計画的に喘息反応を起こしながら５６日間にわたってそれぞれ水又はＺＺ−ＡＣＥを与えた。最初に、マウスあたり２０μｇのオボアルブミン及び２ｍｇの水酸化アルミニウムを１００μｌの０．９％生理食塩水に入れたものをマウスに腹腔内投与して感作し、４２日目に開始して３日連続行うことによって喘息反応を誘発し、次いで１％オボアルブミンを含むエーロゾル１０μｌを各マウスの気管に滴下することによってアレルギー性喘息を誘発した。喘息を誘発して２０分後、マウスを屠殺した。マウス脾臓細胞を機械的に破壊して単離し、細胞懸濁液中で赤血球を低張溶解した。脾臓細胞を３７℃で２４時間、１２μｇのＣｏｎＡ／２×１０6細胞／ウェル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、米国ミズーリ州セントルイス）を用いるか又は用いずに刺激した。全てのＲＮＡ試料を培養脾細胞から単離し、定量的競合的−ＲＴ−ＰＣＲ（ｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ）により評価してこれらの遺伝子発現レベルを求めた。
【００１８】
ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の遺伝子発現を測定するためのｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲのプライマーデザイン：
インターフェロン−γ及びインターロイキン−４のためのプライマーを、それぞれ遺伝子銀行受入れ番号ＮＭ＿００８３３７及びＢＣ０２７５１４の配列に従ってデザインした（表３Ａ）。各遺伝子に対して、３’逆方向プライマーは同じであるが、５’順方向プライマーが異なる２対のプライマーをデザインした。第一の対のプライマーでは、５’順方向プライマー（標準プライマーと呼ばれる）のＤＮＡ配列は、標的遺伝子のセグメントと同一である。この対のプライマーをＰＣＲ増幅に用い、自然長のＤＮＡ断片（標準断片）を合成した。標準断片をクローン化し、標準プラスミドを形成した。第二の対のプライマーでは、５’順方向プライマー（競合プライマー）は、標準プライマーから構成されるＤＮＡ配列を有し、それに続いて、１００塩基対を超えて下流にある遺伝子配列と同一の短いセグメントの配列を有していた。この第二の対のプライマーをＰＣＲ増幅に用い、標準断片と５’及び３’配列が同じであるが、１００を超える塩基対よりも短いＤＮＡ断片（競合的断片と呼ぶ）を得た。競合的断片を用い、競合的プラスミドを構成した。ｍＩＦＮ−γ（図２参照）及びｍＩＬ−４（図３参照）のＤＮＡ配列を以下に示す。プライマーデザイン、予測されたＰＣＲ生成物の長さを表３Ａに示す。
【００１９】
表３Ａ．ｍＩＦＮ−γ及びｍＩＬ−４遺伝子発現のレベルを求めるためにｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ法に用いたプライマー
【００２０】
標準プラスミド及び競合プラスミドの調製：
ＰＣＲキット及びプライマーで増幅されたインターフェロン−γ又はインターロイキン−４のマウスｃＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）にクローン化し、これら２つの遺伝子の標準プラスミド及び競合プラスミドを構築した。標準プラスミド及び競合プラスミドの配列を全て決定し、挿入した配列の正確さを確認した。
標準曲線の確立：
ｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ法の原理に従い、既知の量の競合プラスミドを既知の量の標準プラスミドの希釈列に混合し、混合物をＰＣＲ増幅のための１対の標準プライマー及び３’逆方向プライマーを備えるＤＮＡテンプレートとして用いた。次に、ＰＣＲ反応から得られる標準断片及び競合的断片の両方を臭化エチジウムゲル電気泳動に用いた。断片のバンド強度比と各混合物に用いたプラスミドの量の比との間の相関関係を計算し、標準曲線を確立した。
【００２１】
定量的競合的−ＲＴ−ＰＣＲ（ｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ）により求めた脾細胞中のインターフェロン−γ及びインターロイキン−４の遺伝子発現：
遠心分離後、脾細胞の細胞ペレットを１ｍｌのトリゾル試薬と混合し、次に、トリゾルＲＮＡ抽出物キットにより総ＲＮＡ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を単離した。Ａ260nm／Ａ280nm比により各試料の総ＲＮＡの純度を評価した。逆転写酵素でｍＲＮＡをｃＤＮＡに転換し、次にｑｃ−ＰＣＲで分析した。１μｌ標準プライマー（順方向及び逆方向プライマー各０．５μｇ）、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２．５μｌのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、０．１μｌのＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、０．５μｌの試料ｃＤＮＡ及び０．５μｌの競合プラスミドの混合物を純水で総容量２５μｌに調節し、その混合物中でｑｃ−ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ生成物を、次に、ゲル電気泳動で分析した。ゲルの各バンドの臭化エチジウム密度を、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒで読取り、結果と、確立した標準曲線とを比較して脾細胞試料のｃＤＮＡのコピー数を計算した。
【００２２】
実験３の結果：ＺＺ−ＡＣＥの抗アレルギー活性、マウスモデル、生体外
Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答の均衡を取ることによるＺＺ−ＡＣＥの抗アレルギー活性：
マウスをＺＺ−ＡＣＥで処理した後、処理したマウスから脾細胞を収集し、ｑｃ−ＰＣＲを用いてＩＦＮ−γ及びＩＬ−４遺伝子の発現レベルを分析した。結果（表３Ｂ）は、対照と比較して、ＣｏｎＡ刺激を用いて処理したマウスも用いずに処理したマウスも脾細胞における遺伝子発現レベルは、ＩＦＮ−γ（ｐ＜０．０５）の遺伝子発現レベルが有意に増大し、ＩＬ−４（ｐ＜０．０５）の遺伝子発現レベルが有意に減少した。ＩＬ−４に対するＩＦＮ−γの遺伝子発現の比率が有意に増大したために、ＺＺ−ＡＣＥは、Ｔｈ１／Ｔｈ２均衡を調節することによってアレルギー反応を消失させるのに有利に働くことができる。従って、この実験の結果より、ＺＺ−ＡＣＥを６０日連続投与した後には、ＺＺ−ＡＣＥが、マウスの免疫細胞のサイトカイン遺伝子発現を調節することによってアレルギー反応を低減する可能性を有することが示された。ＩＦＮ−γ（図４）及びＩＬ−４（図５）遺伝子発現のためのｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲ生成物のゲル電気泳動写真の例を以下に示す。
【００２３】
表３Ｂ．ＺＺ−ＡＣＥを飲ませたか又は飲ませずに喘息誘発を行ったか又は行わなかったマウスから収集した脾細胞のＣｏｎＡ刺激を用いたか又は用いなかったＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の遺伝子発現のレベル1
1同じ列の異なる上付き文字は、有意差（ｐ＜０．０５）を示している。
2値は、最初に、各マウスからＩＦＮ−γ／ＩＬ−４の比を計算し、次に、その比を平均することによって計算した。
【００２４】
実験４：活性化合物がＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答の均衡を調節するときのゼルンボンの同定
実験４の方法：
活性化合物の同定：
最初に、乾燥ＺＺ根をエタノールで抽出し（エタノール抽出物）、次に、シリカゲル及びＰＬＣでクロマトグラフにより抽出物を更に精製し、試験管内生理活性スクリーニング（以下の実験４Ａ〜実験４Ｅに説明する手順）で分析して強力な抗アレルギー活性を含む精製分画を同定した（結果は以下の実験４Ａ〜実験４Ｅに説明する）。次に、同定した活性分画から活性化合物を単離した。
実験４の結果：
活性化合物がＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答の均衡を調節するときのゼルンボンの同定
活性化合物の同定：
活性分画の化合物をゼルンボンと同定した。ゼルンボンの構造は図６を参照されたい。
【００２５】
４Ａ：ＩＬ−１３／ＴＮＦ−α刺激ヒトＢＥＡＳ−２Ｂ細胞によるエオタキシン分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
実験４Ａの方法：
細胞培養、ＺＺ試料での処理、及びエオタキシン発現のための刺激：
ＳＶ４０形質転換ヒト気管支上皮細胞ＢＥＡＳ−２ＢをＦ１２／ＤＭＥＭ培地と共に９６ウェルプレートに蒔き、３７℃で培養して集密させた。次に、細胞を種々の濃度のＺＺ試料で処理した。２０分処理した後、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００−１３）及び１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００−０１Ａ）を用い、３７℃で２２時間刺激した。培養培地を収集し、そのエオタキシン濃度を測定した。
サイトカインエオタキシンのためのＥＬＩＳＡアッセイ：
エオタキシン濃度をＯｐｔ ＥＩＡ Ｓｅｔセットを用いて求めた。ヒトエオタキシンはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ製２６２３ＫＩ、９６ウェルプレートはＩＷＡＫＩ製３８０１−０９６であった。分析は、製造業者の指示書に従って行った。
【００２６】
実験４Ａの結果：
ＳＶ４０形質転換ヒト気管支上皮細胞ＢＥＡＳ−２ＢをＺＺ試料で処理し、ヒトＴＮＦ−αで刺激してエオタキシンを発現させた後、培養培地を収集してそのエオタキシン濃度をＥＬＩＳＡキットで測定した。結果を表４Ａにまとめた。エオタキシン阻害活性は、エタノール抽出物分画に豊富に存在し、ゼルンボンを含む分画に更に豊富に存在することがわかった。
【００２７】
表４Ａ．ＩＬ−１３／ＴＮＦ−α刺激ヒトＢＥＡＳ−２Ｂ細胞によるエオタキシン分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
【００２８】
４Ｂ：ネズミ腹膜マクロファージによるＴＮＦ−α分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
実験４Ｂの方法：
細胞培養：
１ｍｌの４％ブルーアーのチオグリコレート培地（Ｓｉｇｍａ、Ｂ２５５１）をオスのＢＡＬＢ／ｃマウス（週齢６〜１０）の腹膜空洞にｉ．ｐ．（腹腔内）注射することによってマウス腹膜マクロファージを誘発した。腹膜細胞を、注射後７日目に、氷温ＲＰＭＩ−１６４０培地で腹膜洗浄することによって得た。
薬物処理：
ネズミ腹膜マクロファージ（１×１０5）は、ＲＰＭＩ−１６４０培地と共に平底９６ウェルプレートに蒔いた。細胞は、種々の濃度のＺＺ−ＡＣＥ試料で２０分間処理し、次に、１．５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポ多糖類）（Ｓｉｇｍａ、Ｌ−２８８０）で更に２２時間刺激した後、ＴＮＦα法のために培地を収集した。
ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡアッセイ：
ＴＮＦ−αを、Ｒ＆Ｄマウス ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏｓｅｔ、ＤＹ４１０）を用い、製造業者により推奨される手順に従って求めた。
【００２９】
実験４Ｂの結果：
マウス腹膜マクロファージを種々の濃度のＺＺ−ＡＣＥ試料により試験管内で処理し、次に、ＬＰＳで刺激した後、ＴＮＦαアッセイのために培地を収集したところ、ＺＺ−ＡＣＥとゼルンボンが豊富な精製分画との両方がＴＮＦα放出に阻害活性を示した。
【００３０】
表４Ｂ．ＬＰＳ刺激ネズミ腹膜マクロファージによるＴＮＦ−α分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
【００３１】
４Ｃ：試験管内でのＬＰＳ刺激マウス脾細胞のＢ細胞増殖のレベルに与えるＺＺ試料の影響
実験４Ｃの方法：
脾細胞の調製：
オスのＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１２週齢）からマウス脾臓を収集した。脾臓は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０４−００１−１Ｂ）、５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０３５−１Ｂ）、１μｇ／ｍｌのカナマイシン（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０４９−１Ｂ）、１．２ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、１１３６０−０７０）、０．１２ｍＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０−０５０）、０．２ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７５２２）及び２ｇ／ｌの重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ５７６１）を補充した１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯカタログ番号２３４００−０１３）中で１０ｍｌシリンジのプランジャを用いてすり潰した。次に、１５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（０．１５ＭのＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ3、０．１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）を加え、赤血球を溶解した。ＡＣＫ溶解緩衝液処理後、脾細胞を、４℃、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって収集した。次に、１０ｍｌの細胞培養培地で洗浄し、最後に、培養培地に再懸濁した。
【００３２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞のＢ細胞増殖に与える薬物の影響
脾細胞の薬物処理及びＢ細胞増殖のための刺激：
平底９６ウェルプレートに、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地と共に脾細胞（１．５×１０5）を蒔いた。脾細胞を、３７℃で２時間、様々な濃度のＺＺ試料で処理し、その後、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中１５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｌ２８８０）を用い、３７℃で６６時間刺激してＢ細胞増殖を促進し、その後分析した。
Ｂ細胞のための増殖分析：
増殖は、Ｒｏｃｈｅ ＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ、１６４７２２９）を用いて測定した。９６ウェルプレート内の細胞を、最初に、３７℃で６時間、１００μＭのＢｒｄＵで処理した。次に、プレートを、４℃、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞を乱すことなく上清を除去した。プレートを６０℃で１時間培養し、次に、ウェルあたり２００μｌのＦｉｘＤｅｎａｔを加えた。室温で３０分培養した後、ＦｉｘＤｅｎａｔを廃棄し、ウェルあたり３００μｌのブロッキング溶液を加えた。プレートを室温に１時間保持し、ウェルあたり３００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、その後、１００μｌ／ウェルの抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤを加えた。室温で１時間培養した後、プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、その後、ウェルあたり１００μｌの基質を加え、室温で５分間、暗所で培養した。ウェルあたり２５μｌの保存液を加えることによって反応を終了させ、４５０ｎｍでマイクロプレート読取装置を用いることによりＯＤを測定した。
実験４Ｃの結果：
【００３３】
表４Ｃ．試験管内でのＬＰＳ刺激マウス脾細胞のＢ細胞増殖レベルに与えるＺＺ試料の影響
【００３４】
４Ｄ：ＣｏｎＡ刺激マウス脾細胞によるＩＮＦ−γ分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の試験管内での影響
実験４Ｄの方法：
脾細胞の調製及び薬物処理：
調製した脾細胞（実験４Ｃ参照）を６×１０5細胞／１００μｌまで希釈し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を備えた平底９６ウェルプレートに蒔いた。次に、脾細胞を様々な濃度のＺＺ試料（３０μｌ）で３７℃で２時間処理し、最後に、１μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）で１８時間刺激した。培地中のＩＦＮ−ν濃度をＥＬＩＳＡアッセイにより求め、細胞生存度をＭＴＴアッセイにより測定した。
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ：
マウスＩＦＮ−γをＲ＆ＤマウスＩＦＮ−γ（Ｄｕｏｓｅｔ、ＤＹ４８５）キットを用いることによって求めた。ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者により推奨される手順に従って行った。
実験４Ｄの結果：
ＺＺ試料がＣｏｎＡ刺激マウス脾細胞によるＩＮＦ−γ分泌物のレベルに及ぼす影響を表４Ｄにまとめた。ＺＺ−ＡＣＥ及びエタノール抽出分画の両方とも、培養培地中のＩＦＮ−γ濃度を上昇させる能力を示した。
【００３５】
表４Ｄ．試験管内でのＣｏｎＡ刺激マウス脾細胞によるＩＮＦ−γ分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
【００３６】
４Ｅ：ＰＭＡ／Ａ２３１８７刺激マウスＥＬ−４細胞によるＩＬ−４分泌物のレベルに与えるＺＺ試料の影響
実験４Ｅの方法：
細胞培養：
３７℃の５％ＣＯ2中、７５ｃｍ2培養フラスコで１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、１μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、１．２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１２ｍＭの非必須アミノ酸、０．２ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｇ／ｌの重炭酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中でＥＬ−４細胞を培養した。
薬物処理：
ＥＬ−４細胞（１×１０4細胞／１００μｌ）を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を備えた平底９６ウェルプレートに蒔いた。細胞を、３７℃で２時間、様々な濃度のＺＺ−ＡＣＥ試料（３０μｌ）で処理し、次に、３７℃で２２時間、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（総容量１５０μｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中の１．５ｎｇ／ウェルのＰＭＡ及び１５ｎｇ／ウェルのＡ２３１８７で刺激した。細胞を含有しない上清中のＩＬ−４分泌物のレベルをＥＬＩＳＡアッセイにより求め、細胞生存度をＭＴＴアッセイにより測定した。
【００３７】
ＩＬ−４ ＥＬＩＳＡ：
ＩＬ−４を、Ｒ＆Ｄマウス ＩＬ−４ ＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏｓｅｔ、ＤＹ４０４）を用いて測定した。９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ、３８０１−０９６）を、１００μｌ／ウェルの捕捉抗体（ＰＢＳ中に４μｇ／ｍｌ）で被覆し、室温で一晩培養した。次に、プレートを、洗浄緩衝液（０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、室温で１時間、３００μｌのブロッキング緩衝液／ウェル（１％ウシ血清アルブミン及び５％ショ糖を含むＰＢＳ）で培養することによって遮断した。プレートを、洗浄緩衝液で３回洗浄してから、１００μｌの試験液又は標準液をウェルに加えた。プレートを、室温で２時間培養して洗浄し、検出抗体［ウェルあたり２００ｎｇ／ｍｌ試薬希釈剤（１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）１００μｌ］と共に室温で２時間培養した。洗浄後、各ウェルに１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰを加え、室温で２０分間培養し、洗浄後、ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ）と共に２０分間培養した。反応を、１００μｌの１ＮのＨＣｌ／ウェルを加えることによって終了させ、４５０ｎｍでマイクロプレート読取装置を用いることによってＯＤを測定した。
実験４Ｅの結果：
【００３８】
表４Ｅ．ＰＭＡ／Ａ２３１８７刺激マウスＥＬ−４細胞によるＩＬ−４分泌物に与えるＺＺ試料の影響
【００３９】
実験５：アレルギー性鼻炎に対してＺＺ−ＡＣＥを用いたヒトボランティア
５人のボランティアが、アレルギー性鼻炎を治療するためにＺＺ−ＡＣＥを摂取した。その経験をここにまとめた。
ボランティアＡ：
Ｗｅｎ氏は、何年も重症のアレルギー性鼻炎に罹っている。鼻炎を治療するために、毎日、新しく収穫したＺＺ根（乾燥前）３００ｇｍを水に入れて調理し、そのスープを飲ませた。１つの治療コースとして、治療を７日間繰返した。治療終了時には、症状は有意に軽減した。３ヵ月後、症状がぶり返し、治療コースを繰返して成功した。
ボランティアＢ：
もうひとりのＷｅｎ氏（ボランティアＡの父親）は、ボランティアＡの治療コースに従いアレルギー性鼻炎の症状を軽減するのに成功した。後に、アレルギーの時期になる度に治療コースを繰返した。
ボランティアＣ：
Ｌｅｅ氏は、１０００ｇｍの湿った新鮮なＺＺ根を調理し、スープを密封容器に入れて冷蔵保存した。Ｌｅｅ氏は、約１／４のスープを４日間毎日飲み、アレルギー性鼻炎を治療した。結果は、満足することができるものであった。後に症状がぶり返すと、同じ治療コースを繰返して成功した。
ボランティアＤ：
Ｄｕ氏は、ＺＺカプセルを毎日、朝６カプセル、夕方６カプセル２ヶ月服用し、非常に重症のアレルギー性鼻炎を治療することに成功した。
ＺＺカプセルは、以下の手順により調製した。乾燥ＺＺ根を１０倍の水（重量対重量比）で調理した。スープをほぼ５倍に濃縮し、次に、デンプンを賦形剤として用い、乾燥して顆粒にした。顆粒を用いてカプセルを充填した。各カプセルは、約２．０ｇｍの乾燥ＺＺ根又は約２０ｇｍの新たに収穫したＺＺ根に相当する０．５ｇｍの顆粒を含む。
ボランティアＥ：
また、ボランティアＤが用いた同じバッチのＺＺカプセルを用いて、３カプセル／日で約１８０日間にわたってボランティアＥのＨｕａｎｇ氏も治療した。１８０日の間、このボランティアは、以前よりもアレルギー問題が軽減した。
本発明は、単に例示的に挙げたものである上述の実施形態に限定されないものとするが、特許請求の範囲によって規定される保護の範囲内で様々に変更することができる。
【００４０】
参考文献：
１．Ｗｅｎｚｅｌ ＳＥ著喘息におけるロイコトリエンの役割、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ、２００３年、第６９巻、１４５〜５５頁
２．Ｌｅｆｆ ＡＲ著喘息の管理におけるロイコトリエンの調節：生物学及び臨床療法、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ、２００１年、第５２巻、１〜１４頁
３．Ａｉｚａｗａ Ｔ、Ｔａｍｕｒａ Ｇ、Ｏｈｔｓｕ Ｈ、Ｔａｋｉｓｈｉｍａ Ｔ著ロイコトリエンＣ４及びＢ４の好酸球及び好中球産生：喘息の被験者の細胞と健常供与者の細胞との比較、Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ、１９９０年、第６４巻、２８７〜９２頁
４．Ｄａｖｅｒｎ ＴＪ、Ｂａｓｓ ＮＭ著ロイコトリエン拮抗剤、Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ、２００３年、第７巻、第２号、５０１〜１２頁ｖｉｉｉ
５．Ｂｅｇｈｅ Ｂ、Ｂａｒｔｏｎ Ｓ、Ｒｏｒｋｅ Ｓ、Ｐｅｎｇ Ｑ、Ｓａｙｅｒｓ Ｉ、Ｇａｕｎｔ Ｔ、Ｋｅｉｔｈ Ｔ、Ｃｌｏｕｇｈ Ｊ、Ｈｏｌｇａｔｅ Ｓ、Ｈｏｌｌｏｗａｙ Ｊ著インターロイキン−４及びインターロイキン−４受容体α鎖遺伝子の多型性が白色人種における喘息及びアトピーの罹病生を与える、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００３年、第３３巻、１１１１〜１１１７頁
６．Ｓｈｉｒａｉ Ｔ、Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ、Ｉｎｕｉ Ｎ、Ｓｕｄａ Ｔ、Ｃｈｉｄａ Ｋ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｈ著アトピー性咳嗽及びアトピー性喘息における末梢血液中のＴｈ１／Ｔｈ２プロフィール、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００３年、第３３巻、８４〜９頁
７．Ｌｅｅ ＹＣ、Ｌｅｅ ＫＨ、Ｌｅｅ ＨＢ、Ｒｈｅｅ ＹＫ著急性喘息におけるインターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びインターフェロン−γの血清レベル、Ｊ Ａｓｔｈｍａ、２００１年、第３８巻、６６５〜７１頁
８．Ｋａｌｉｎ Ｐ著西洋フキ（Ｐｅｔａｓｉｔｅｓ ｈｙｂｒｉｄｕｓ）−薬草のポートレート、Ｆｏｒｓｃｈ Ｋｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｍｅｄ Ｋｌａｓｓ Ｎａｔｕｒｈｅｉｌｋｄ、２００３年、第１０巻、補遺１、４１〜４頁
９．Ｖｉｍａｌａ Ｓ、Ｎｏｒｈａｎｏｍ ＡＷ、Ｙａｄａｖ Ｍ著従来の医薬品に用いられるマレーシアショウガ根粒菌の抗腫瘍促進剤活性、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、１９９９年、第８０巻、１１０〜６頁
１０．Ｍｕｒａｋａｍｉ Ａ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｄ、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｔ、Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ Ｋ、Ｋｉｍ ＨＷ、Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ Ａ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ、Ｊｉｗａｊｉｎｄａ Ｓ、Ｔｅｒａｏ Ｊ、Ｏｈｉｇａｓｈｉ Ｈ著ゼルンボン、すなわち東南アジアのショウガセスキテルペンがフリーラジカルの発生、炎症誘発性タンパクの産生、及びアポトーシスを伴うガン細胞増殖を著しく抑制する：α、β−不飽和カルボニル基が必須条件である、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００２年、第２３巻、７９５〜８０２頁、論評：Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００２年、第２３巻、１９６１頁に掲載、著者の回答、１９６３年
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンの化学構造（分子構造Ｃ16Ｈ12Ｏ6、分子量300.27）を示す図である。
【図２】用いたプライマーに対応する配列に下線を引いた、ｍＩＦＮ−γ遺伝子（遺伝子銀行受入れ番号ＮＭ＿００８３３７）のＤＮＡ配列を示す図である。
【図３】ｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーに対応する配列に下線を引いた、ＤＮＡ配列ｍＩＬ−４（遺伝子銀行受入れ番号ＢＣ０２７５１４）の図である。
【図４】レーン１〜８が、ＤＮＡテンプレートとして脾細胞ｃＤＮＡ試料及び競合プラスミドを用いたＰＣＲ生成物であり、レーンＭが、マーカ（１００ｂｐラダー）であり、レーンＳ１〜Ｓ５が、標準曲線を確立するためにＤＮＡテンプレートとして標準及び競合プラスミドを用いたＰＣＲ生成物である、マウス脾細胞でのＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現レベルを求めるためのｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動の図である。
【図５】ＩＬ−４ｍＲＮＡの検出が、マウス脾細胞でのｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲによるものであり、レーン１〜９が、脾細胞ｃＤＮＡ試料及び競合プラスミドをＤＮＡテンプレートとして用いたＰＣＲ生成物であり、レーンＭが、マーカ（１００ｂｐラダー）であり、レーンＳ１〜Ｓ７が、標準曲線を確立するために標準及び競合プラスミドをＤＮＡテンプレートとして用いたＰＣＲ生成物である、マウス脾細胞でのＩＬ−４ｍＲＮＡ発現レベルを求めるためのｑｃ−ＲＴ−ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動を示す図である。
【図６】ゼルンボンの化学構造を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
栄養補助組成物を調製する方法であって、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根から溶媒抽出する工程を含み、前記抽出溶媒は、水に等しいか又はそれよりも低い極性を有することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記溶媒が、エタノール、水、又はエタノールと水との任意の比率の混合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫系を調節する方法であって、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根からの溶媒抽出物を含む栄養補助組成物を投与する工程を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項４】
アレルギー性疾患を予防又は治療するために前記免疫系を調節することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎、喘息及び湿疹から成る群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｔｈ１及びＴｈ２免疫応答間の均衡を調節するための請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ＩＦＮ−γの濃度を上方制御するか又は炎症性媒介物ＴＮＦ−α、ＩＬ−４及びエオタキシンを下方制御するための請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記溶媒抽出物は、活性免疫調節化合物としてゼルンボンを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ロイコトリエン合成を阻害する方法であって、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根からの溶媒抽出物を含む栄養補助組成物を投与する工程を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１０】
ＬＴＣ４合成が阻害されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抽出物が、７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
アレルギー性疾患を予防又は治療する方法であって、有効な量の５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンを投与する工程を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１３】
前記アレルギー性疾患がアナフィラキシーであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
有効な量のゼルンボンを投与する工程を更に含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アレルギー性疾患がアナフィラキシーであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
栄養補助組成物を調製する方法であって、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根から溶媒抽出する工程を含み、前記抽出溶媒は、水に等しいか又はそれよりも低い極性を有することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記溶媒が、エタノール、水、又はエタノールと水との任意の比率の混合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫系を調節する方法であって、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根からの溶媒抽出物を含む栄養補助組成物を投与する工程を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項４】
アレルギー性疾患を予防又は治療するために前記免疫系を調節することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎、喘息及び湿疹から成る群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｔｈ１及びＴｈ２免疫応答間の均衡を調節するための請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ＩＦＮ−γの濃度を上方制御するか又は炎症性媒介物ＴＮＦ−α、ＩＬ−４及びエオタキシンを下方制御するための請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記溶媒抽出物は、活性免疫調節化合物としてゼルンボンを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ロイコトリエン合成を阻害する方法であって、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ Ｓｍの根からの溶媒抽出物を含む栄養補助組成物を投与する工程を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１０】
ＬＴＣ４合成が阻害されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抽出物が、７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
アレルギー性疾患を予防又は治療する方法であって、有効な量の５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−メトキシ−クロメン−４−オンを投与する工程を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１３】
前記アレルギー性疾患がアナフィラキシーであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
有効な量のゼルンボンを投与する工程を更に含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アレルギー性疾患がアナフィラキシーであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５０７５２７（Ｐ２００８−５０７５２７Ａ）
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２２６２８（Ｐ２００７−５２２６２８）
【出願日】平成１７年７月１８日（２００５．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５４５８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２０２４６
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０７０２４０９１）ウォルサム ライフ サイエンス カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１８日（２００５．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５４５８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２０２４６
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０７０２４０９１）ウォルサム ライフ サイエンス カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]