がんへのホットスポット放射線の多段階送達のための組成物
本発明は、がんの症状を処置または緩和する組成物および方法を特徴とする。本発明の組成物および方法は、実質的にすべてのがん細胞型に対する、ホットスポットと呼ばれる致死線量を超える放射線照射に関する。１つの局面において、本発明は。置換された３−インドキシルホスフェート誘導体に連結された、抗ＥＧＦレセプター抗体、その誘導体またはそのフラグメントを含む組成物を提供する。別の局面において、本発明は、がんの症状を緩和する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はがんの処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
現在、がん処置のかなりの部分の世界的な研究努力は多様な細胞殺傷剤によるがん細胞の死滅にささげられている。放射活性化合物等の多数の医薬ががん細胞を殺滅することができることが示されてきた事実にもかかわらず、（１）それら薬剤はすべてのがん細胞に対する細胞毒特異性を示さないので、すべてのがん細胞を殺滅しない、（２）それら薬剤はがん細胞に対してだけに細胞毒特異性を示さないので正常な細胞も殺滅し、（３）それら薬剤は、許容可能な用量において耐性がん細胞を殺滅するためか、または細胞殺傷剤に順応して耐性となるがん細胞の能力を克服するためには十分な効力がないという３つの普遍的な現在の障害を回避することができないために、これら薬剤はがんをうまく処置できないことが多い。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要約）
本発明は、がんを処置するための組成物および方法を提供する。本発明の方法は、ホットスポットと呼ばれる、実質的にすべてのがんに対する局所的な致死線量を超える放射線照射に関する多段階の処置法である。
【０００４】
一つの局面において、本発明は、プラットフォーム構築材料に結合（例えば、共有結合）させた細胞標的剤を含有する工程１試薬を提供する。プラットフォーム構築材料は、細胞、例えばがん細胞への細胞標的剤の取り込みの際に該標的剤から切り離される。細胞標的剤からいったん切り離されたプラットフォーム構築材料は水不溶性となり、ナノプラットフォームを形成する。任意に、細胞標的剤は担体部分によりプラットフォーム構築材料に連結される。本発明の多様な局面において、プラットフォーム構築材料は、第２試薬、すなわち工程３試薬に特異的に結合することのできる付加的分子構造を有する。
【０００５】
細胞標的剤は細胞による試薬の取り込みを増強するもので、ポリペプチド、細胞表面リガンド、ペプチドまたは小分子である。ポリペプチドは、例えば、ＥＧＦレセプター抗体またはトランスフェリンレセプター抗体等の抗体、上皮細胞増殖因子またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ ＴＡＴタンパク質、（ＨＩＶ）１ ＴＡＴタンパク質の機能的に効果のある部分、またはＶＰ２２等のウイルスタンパク質である。細胞表面リガンドは、例えばトランスフェリン、上皮細胞増殖因子またはインターロイキンである。
【０００６】
ペプチドは、例えば、オキシトキシン、成長ホルモン放出ホルモン、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、ソマトスタチン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン、インシュリン、成長ホルモンまたはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド（ＲＧＤ）等のペプチドホルモンである。
【０００７】
小分子は、例えば、エストロゲン、カルシフェロールまたはテストステロン等のホルモン、核酸、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、ニコチン性アセチルコリンレセプターアゴニストまたは葉酸またはそのアナログまたは誘導体である。
【０００８】
プラットフォーム構築材料は、例えば、インドキシル、ポルフィリン、ＨＰＭＡ誘導体等のポリマー、デンドリマー、オピオ−メラニン（ｏｐｉｏ−ｍｅｌａｎｉｎ）、または多糖類、例えばデキストラン、アラビアゴム、セルロースまたはキチンである。インドキシルは、例えば、置換インドキシル、すなわち、モノ−インドキシル、ビス−インドキシルまたはポリインドキシルである。インドキシルはインジゴ、直鎖インジゴポリマーまたはポリインジゴ格子を形成する。
【０００９】
担体部分は、例えば、タンパク質；多糖；ポリマー、例えば、合成ポリマーまたはバイオポリマー、例えば、ポリリジン；デンドリマー；リポソーム；ナノ粒子；または高分子ミセルである。
【００１０】
例示的な工程１試薬としては、置換された３−インドキシルホスフェート誘導体に連結された抗ＥＧＦレセプター抗体、その誘導体またはそのフラグメントが挙げられる。抗体は、デキストラン等の担体部分により３−インドキシルホスフェート誘導体に連結される。さらに、ホスホエノールピルベート誘導体等のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼインヒビターが３−インドキシルホスフェート誘導体に連結される。
【００１１】
トランスフェリンポリペプチドまたはそのフラグメンは、グリコシド、例えば、ガラクトシド、グルコシドまたはグルクロニドまたはその誘導体に連結された。好ましくは、グリコシドは置換ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体である。トランスフェリンポリペプチドは、アルブミンポリペプチドまたはそのフラグメント等の担体部分によりグリコシドに連結される。さらに、変異β−ラクタマーゼインヒビターがビス−β−インドキシルグリコシド誘導体に連結される。変異β−ラクタマーゼインヒビターはカルバセフェムアナログ等のラクタム誘導体である。カルバセフェムアナログは、例えば、ロラカルベフである。
【００１２】
フォルメート誘導体は、ポルフィリン誘導体に連結された。葉酸誘導体は、免疫グロブリンポリペプチドまたはそのフラグメント等の担体部分によりポルフィリン誘導体に連結される。さらに、オルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、例えば、α−ジフルオロメチルオルニチンまたはアルギニンデカルボキシラーゼインヒビター、例えば、α−ジフルオロメチルアルギニンがポルフィリン誘導体に連結される。
【００１３】
フォルメート誘導体は、置換ビス−３−インドキシルガラクトシド誘導体に連結された。さらに、変異β−ラクタマーゼインヒビターが置換ビス−３−インドキシルガラクトシド誘導体に連結される。
【００１４】
表皮細胞増殖因子ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＨＰＭＡに連結された。さらに、置換インドキシルガラクトシド誘導体または変異βラクタマーゼインヒビターがＨＰＭＡに連結される。
【００１５】
本発明のさらに別の局面は、標的部分および同位元素捕捉部分を含有する二特異的試薬である工程３試薬を提供する。標的部分および同位元素捕捉部分は、例えば共有結合している。標的部分はナノプラットフォームに結合できる。例えば、標的部分はナノプラットフォーム上の付加的分子構造に結合する。同位元素捕捉部分は放射標識水溶性工程４試薬を捕捉することができる。
【００１６】
標的部分または同位元素捕捉部分は、ヒドラジン、ケトン、メルカプタンまたはマレイミジル等の有機官能基；ポリペプチド；ペプチド；またはレクチンである。ポリペプチドは、β−ラクタマーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ等の酵素；変異β−ラクタマーゼ等の変異酵素；または抗体またはそのフラグメントである。
【００１７】
例示的な工程３試薬として、ストレプトアビジンに連結されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼに連結された変異β−ラクタマーゼ、４−カルボキシベンズアルデヒドに連結されたオルニチンデカルボキシラーゼまたはアルギニンデカルボキシラーゼ、抗ＮＩＰ抗体に連結された変異β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼに連結された変異β−ラクタマーゼが挙げられる。
【００１８】
本発明の別の局面は工程１試薬および工程３試薬を含む１つ以上の容器に包装されたキットを提供する。任意に、キットは、工程２細胞殺傷剤および／または放射標識水溶性工程４試薬を含む。例示的な工程４試薬として、９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡ、１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド、１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジン、１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸および１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートが挙げられる。
【００１９】
（ａ）プラットフォーム構築材料に例えば共有結合させた細胞標的剤を含有する工程１試薬；（ｂ）標的部分および同位元素捕捉部分を含有する工程３試薬；および（ｃ）放射標識水溶性工程４試薬を被験体に投与することにより、がんを処置し、がんの症状を緩和する。細胞標的剤は細胞による工程１試薬の取り込みを増強する。プラットフォーム構築物質は、工程１試薬の細胞への取り込みの際に、細胞標的剤から分離され、工程３試薬の標的部分が結合する水不溶性ナノプラットフォームを形成する。工程３試薬の同位元素捕捉部分は、放射標識水溶性工程４試薬を、微小領域照射野（ホットスポット）を作って致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に供給するために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に捕捉する。
【００２０】
これら試薬は順次投与される。あるいは、これら試薬は同時に投与される。任意に、工程２細胞殺傷剤を工程３試薬の前、その後または同時に被験体に投与して、ナノプラットフォームを腫瘍細胞外マトリックスに再配置する。
【００２１】
１つの局面において、（ａ）３−インドキシルホスフェート誘導体に連結されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼインヒビターを有する置換された３−インドキシルホスフェート誘導体に連結された、抗ＥＧＦレセプター抗体、その誘導体またはフラグメントを含む組成物；（ｂ）ストレプトアビジンに連結されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼを含む組成物；および（ｃ）９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡを含む組成物を被験体に投与することによりがんを処置するか、またはがんの症状を緩和する。
【００２２】
別の局面において、（ａ）ビス−３−インドキシルグルコシド誘導体に連結された変異β−ラクタマーゼインヒビターを有する置換ビス−３−インドキシルグルコシル誘導体に連結された、トランスフェリンポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物；（ｂ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼに連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物；および（ｃ）１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドを含む組成物を被験体に投与することによりがんを処置するか、またはがんの症状を緩和する。
【００２３】
さらなる局面において、（ａ）ポルフィリン誘導体に連結された、オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターまたはアルギニンデカルボキシラーゼインヒビターのいずれかにを有するポルフィリン誘導体に連結されたフォルメート誘導体を含む組成物；（ｂ）４−カルボキシベンズアルデヒドに連結された、オルニチンデカルボキシラーゼまたはアルギニンデカルボキシラーゼインヒビターを含む組成物；および（ｃ）１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジドを含む組成物を被験体に投与することによりがんを処置するか、またはがんの症状を緩和する。
【００２４】
さらなる別の局面において、（ａ）ビス−３−インドキシルガラクトシド誘導体に連結された変異β−ラクタマーゼインヒビターを有する置換ビス−３−インドキシルガラクトシド誘導体に連結されたフォルメート誘導体を含む組成物；（ｂ）抗ＮＩＰ抗体に連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物；および（ｃ）１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸（１３１Ｉ−ＮＩＰ酸）を含む組成物を被験体に投与することによりがんを処置するか、がんの症状を緩和する。
【００２５】
別の形態において、（ａ）ＨＰＭＡに連結された置換インドキシルガラクトシド誘導体およびＨＰＭＡに連結された変異βラクタマーゼインヒビターを有するＨＰＭＡに連結された、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物；（ｂ）アルカリホスファターゼに連結されたβ−ラクタマーゼを含む組成物；および（ｃ）１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートを含む組成物を被験体に投与することによりがんを処置するか、またはがんの症状を緩和する。
【００２６】
被験体は、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタおよびフェレット等の哺乳動物である。被験体はがんに罹患している。がんは、例えば、乳がん、皮膚がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、肝臓がん、子宮頸がん、脳腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、または胃がんである。がんに罹患している被験体は、当該分野で公知の方法、例えば、理学的検査；ＰＳＡ等の特定のがん抗原に対する血液試験；ＭＲＩ；Ｘ線；またはマンモグラフィにより同定される。がんの症状として、疲労；悪心；頻尿；体重減少；乳房または精巣のしこりまたは肥厚；いぼまたは母斑の変化；治らない皮膚の痛みまたは持続性の咽頭炎；腸または膀胱習慣の変化；持続性の咳または咳嗽血；一定の消化不良または嚥下困難；異常な出血または膣分泌物；インフルエンザ様症状；挫傷；めまい；眠気；異常な眼球運動または視力変化が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
他に定義しない限り、ここで用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。ここに記載の方法および材料と類似物または等価物は本発明の実施または試験に用いることができるが、適当な方法および材料を以下に説明する。ここに挙げられたすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、本明細書中においてその全文が参考と援用される。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【００２８】
本発明の他の特徴と利点は以下の詳細な説明と請求の範囲から明らかになるだろう。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、局部照射の送達による被験体のがん細胞の不均質集団を処置する組成物および方法を提供する。本発明は、放射性ヨウ化物による甲状腺がんの非常に成功した処置の観察に一部基づく。甲状腺がんの成功した処置は、一部には、多くの悪性甲状腺細胞はヨウ素を捕捉することが可能であるという独特の生物学的機能を有するという事実による。従って、甲状腺がんの患者を放射性ヨウ化物で処置する場合、十分な比率のがん細胞は十分な量の放射性同位元素を吸収し、微小領域中のすべての細胞が殺される強烈な照射（「ホットスポット」と称される）が重なる微小領域を作るのに十分に長く放射性同位元素を蓄積する。これらのホットスポットのそれぞれの照射野は、放射性同位元素を取り込む細胞を超えて広がり、何千もの隣接細胞を殺滅する。これらのホットスポット内では放射線が非常に強いために、ホットスポット内において、放射線同位元素を吸収しない細胞を含んだすべてのがん細胞が死滅し、全腫瘍の根絶を可能とする。体内では、他のどの組織または細胞群もこれと同じヨウ素捕捉機構を有さないので、ホットスポットは正常および悪性の甲状腺組織のみに作られる。本発明の方法および組成物は、これらの放射性同位元素送達および捕捉の条件を非甲状腺がんに再現する。非甲状腺がんでの「ホットスポット」の発生は、顕著な全身毒性を引き起こすことなく実質的に腫瘍のみに重なるホットスポットを作る多段階プロセスである。これらの重なるホットスポット内のすべてのがん細胞は根絶される。根絶される細胞として、標的ではないがん細胞、耐性があり、超耐性でもあるがん細胞、および別な方法で処置に順応し、耐性となり得るがん細胞が挙げられる。したがって、本発明の方法は、がん細胞の不均質性および現在のがん標的剤の不完全な性質により阻止されることはない。
【００３０】
図１に示されるように、がんは、がん細胞１００の集団を含み、各細胞はがん細胞に特異的であって細胞標的剤に結合することのできる内在化構造１０１を有する。内在化構造１０１は、標的剤がそれらに結合するときに内在化することができる。標的化されたがん細胞の亜集団は、被験体の天然の系により死滅する高い感受性および／または実施される提供された細胞殺滅プロセスにより死滅する高い感受性も有する。
がんの処置方法
被験体に複数の試薬を複数の工程で投与することによりがんが処置されるか、がんの症状が緩和される。すべての種類のがんが処置に適する。処置されるがんとして、例えば、肺がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、膀胱がん、皮膚がん（例えば、黒色腫）、卵巣がん、子宮頸がん、頭部および頸部のがん、血液がん、肺がん、結腸／直腸／肛門がん、子宮頸がん、脳腫瘍、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、子宮がん、骨がん、食道がん、眼がん、カポジ肉腫、喉頭がん、口唇がん、上咽頭がん、中咽頭がん、口腔がん、精巣がん、甲状腺がん、肉腫、リンパ腫、副腎皮質がん、胆管がん、気管支がん、原発不明がん、胆嚢がん、生殖細胞がん、下咽頭がん、膵島細胞がん、中皮腫、多発性骨髄腫、鼻腔がん、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、唾液腺がん、小腸がん、胸腺がん、尿管がん、尿道がん、膣がん、外陰がんおよびウィルムス腫瘍が挙げられる。
【００３１】
被験体は哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシである。工程は連続して施される。任意に、１つ以上の工程が別の工程の前または同時に施される。各工程は少なくとも一回施される。あるいは、各工程は２、３、４、５、１０、１５回以上または連続した注入で施される。 例えば、工程２試薬は、当技術分野で知られている標準的な処置手順を用いて反復投与で施される。プラットフォーム構築材料に連結された細胞による試薬の取り込みを増強する細胞標的剤を含む試薬（本明細書中において工程１試薬という）；任意の細胞殺傷剤（本明細書中において工程２試薬という）；水不溶性ナノプラットフォームに結合可能な標的部分および同位元素捕捉部分を含む二特異的試薬（本明細書中において工程３試薬という）；および放射標識水溶性試薬（本明細書中において工程４試薬という）が被験体に投与される。
【００３２】
図２に示されるように、工程１試薬１０００は、細胞標的剤１１００、任意の担体部分１２００および付加的分子構造１４００を任意に取り付けられたプラットフォーム構築材料１３００を含む。図３に示されるように、工程１試薬の細胞標的剤部分１１００はがん細胞の標的内在化構造１０１に付着することにより、工程１試薬１０００をがん細胞１００内に輸送させる。がん細胞内への輸送により、工程１試薬は細胞内環境に曝される。図４に示されているように、標的細胞内にいったん入ると、細胞内環境によって、任意に取り付けられた付加的分子構造１４００を有するプラットフォーム構築材料１３００は標的剤１１００および担体部分１２００から切り離され、これによってプラットフォーム構築材料１３００を、標的がん細胞内で水溶性ナノプラットフォーム１５００に変換させることができる。（付加的分子構造１４００を有するか、有さない）水不溶性ナノプラットフォーム１５００は標的がん細胞内で安定であり、比較的無毒性である。安定であるということは、ナノプラットフォームが、１日間、２日間、３日間、４日間、６日間以上から１週間、２週間、３週間、４週間以上、がん細胞に捕捉されたままであるか、または細胞外マトリックスに取り囲まれたままであることを意味する。比較的無毒性であるとは、ナノプラットフォームが被験体に対して顕著な有害な効果を有さない、例えば、被験体に対して中程度または最小限の炎症を起こすか、および／または生命を脅かす効果を持たないことを意味する。付加的分子構造を有するか、または有さない水不溶性ナノプラットフォームは、ここでは「ナノプラットフォーム」と称する。
【００３３】
細胞内ナノプラットフォームの蓄積は、ステップ１試薬の被験体への投与を続けることによって達成され、その結果、より多くのプラットフォーム構築材料が標的がん細胞中に輸送される（図５を参照）。可溶性の化学物質または医薬とは対照的に、細胞内ナノプラットフォームは水不溶性で安定であるために標的がん細胞から離れないので時間とともに蓄積する。
【００３４】
図２５に示されているように、標的がん細胞におけるナノプラットフォームの蓄積に続いて、被験体に、工程２細胞殺傷剤７５が任意に投与される。工程２細胞殺傷剤は標的がん細胞の一部または全てを殺滅することができ、ナノプラットフォーム１５００が腫瘍の細胞外の空間に再配置され、保持される。いったん細胞外空間に出ると、ナノプラットフォーム１６００の表面上の付加的分子構造１４００は工程３二特異的試薬に接近して結合する。体の天然の免疫系による継続的ながん細胞の殺滅またはがん細胞が自発的に死滅することを引き起こすがん細胞の遺伝的な不安定さが、十分な細胞内ナノプラットフォームを腫瘍の細胞外空間に再配置させて全腫瘍を破壊するための十分な数のホットスポットを最終的に作るのに十分である場合、工程２殺細胞試薬は任意である。ホットスポットの位置のがん特異性は非常に低いレベルの工程２試薬の適用により高められるので、あるとしてもごく僅かの正常な細胞が殺されるだけで、全身毒性は避けられる。
【００３５】
第４工程は、放射性同位元素が工程３二特異的試薬により捕捉され、保持される細胞外の腫瘍マトリックスに放射性同位元素を運ぶように適合させた放射標識水溶性工程４試薬の投与をともなう。これは、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達する微小領域の放射野を作る。
【００３６】
多くの例では、工程間の２４〜４８時間の休息時間は、引き続く工程の試薬を投与する前に既に投与された試薬の広範なクリアランスを任意に可能とするだろうが、除去剤を投与して過剰な試薬の除去を促進する。例えば、工程２殺細胞試薬および工程３二特異的試薬の投与前に、除去剤を投与して、取り込まれていない工程１試薬の除去を促進する。同様に、工程４試薬の投与前に除去剤を投与して、細胞外ナノプラットフォームに結合しなかった工程３二特異的試薬の除去を促進する。除去剤は、被験体のマクロファージによる治療剤の認識を補助し、肝細胞によるプロセシングを増大する。除去剤は当該分野で公知である。除去剤として、工程１試薬か工程３試薬に結合するマンノシル化剤またはガラクトシル化剤が挙げられる。付加的な除去剤として、マクロファージまたは他のリンパ球による試薬のオプソニン化を増強する、工程１試薬か工程３試薬に対して作られた抗体が挙げられる。あるいは、これらの試薬を除去するためにアフィニティーカラムを用いて体外循環を確立する。
工程１試薬
工程１試薬は、プラットフォーム構築材料に連結された細胞標的剤を含む水溶性化合物である。
【００３７】
細胞標的剤は、化合物中に存在して化合物を所望の細胞目標に向けさせる化合物である。細胞標的剤は細胞内に移行することができる。細胞標的剤は、腫瘍細胞上の飲食作用レセプターまたは他の内部移行性ユニットに特異的に結合する。例えば、細胞標的剤は、典型的には食作用性ではなく、架橋またはキャッピングのプロセスにより内部に移行する化合物である。よって、細胞標的剤は、化合物に原形質膜を通過するように指令し、例えば、細胞の外側から、原形質膜を通過させて細胞質に入るように指令する。もしくは、またはそれに加えて、細胞標的剤は化合物を、細胞内の所望の位置、例えば、核、リボソーム、小胞体、リソソームまたはペルオキシソームに方向付けることができる。細胞標的剤として、抗体等のポリペプチド；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ＴＡＴタンパク質またはＶＰ２２等のウイルスタンパク質：細胞表面リガンド；ペプチドホルモン等のペプチド；またはホルモンまたは葉酸等の小分子が挙げられる。細胞標的剤に対するレセプターは正常細胞に比較して腫瘍細胞上に高濃度で発現するのが最適である。例えば、レセプターは、非腫瘍細胞に比較して、腫瘍細胞上で２、３、４、５倍またはそれ以上の濃度で発現する。
【００３８】
本明細書中において使用される「抗体」という用語は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性のある部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子をいう。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーまたはそれらから設計されたポリペプチドが挙げられる。適当な抗体として、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦＲ）等のよく特性付けられたレセプターに対する抗体ならびに他のレセプター、例えばインターロイキン４レセプター（ＩＬ−４Ｒ）、インシュリンレセプター、ＣＤ３０、ＣＤ３４およびＣＣＫ−Ａ、Ｂ、Ｃ／ガストリンレセプター等に対する抗体が挙げられる。さらに、抗体はムチンエピトープ；糖ペプチドおよび糖脂質、例えば（胸、結腸および肺のヒトのがんの多くに存在する）Ｌｅｙ関連エピトープ；ヒアルロナンレセプター／ＣＤ４４；ＢＣＧエピトープ；インテグリンレセプター；ＪＬ−１レセプター；ＧＭ１または他の脂質ラフト関連分子；および黒色腫上のＧＤ２に対して特異的である。がん特異的内在化ヒト抗体はＰｏｕｌらにより記載されたようにファージライブラリーからも選択される（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０１：１１４９−１１６１，２０００）。
【００３９】
細胞表面リガンドは、標的がん細胞上の内在化構造に対して特異的であるように適合した天然リガンドまたは一部の合成類似物である。例示的な細胞表面リガンドとして、トランスフェリン、上皮細胞増殖因子、インターロイキン類、インテグリン類、アンジオテンシンＩＩ、インシュリン、増殖因子アンタゴニスト、β−２−アドレナリン様リセプターリガンドまたはドーパミン放出タンパク質が挙げられる。例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）は上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を標的とするのに使用され、またはトランスフェリン（Ｔｆ）はトランスフェリンレセプターを標的とするのに使用される（例えば、ＴｆＲおよびＴｆＲ２）。
【００４０】
適当なペプチド細胞標的剤として、オキシトシン、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、成長ホルモン（ソマトトロピン）、インシュリン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンまたはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド等のペプチドホルモンが挙げられる。内面化レセプターに結合し、内在化するペプチドを同定する方法は当分野で知られている（Ｈａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４６８−１２４７４，１９９４）。
【００４１】
細胞標的剤として小分子が挙げられる。ここで使用される「小分子」は、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成を言及することとする。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機または無機の分子である。例えば、小分子は、エストロゲン、テストステロンおよびカルシフェロール等のホルモン；葉酸、または葉酸レセプターに結合するアナログ；ニコチン性アセチルコリンレセプターアゴニスト；またはオリゴヌクレオチドレセプターアゴニストである。
【００４２】
細胞標的剤は公知の膜転位配列から得られる。例えば、輸送ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＶ）１ＴＡＴタンパク質からの配列を含む。このタンパク質は、例えば、それぞれが本明細書中に参考として援用される米国特許第５，８０４，６０４号および同第５，６７４，９８０号に説明されている。細胞標的剤はＴＡＴタンパク質を作る全８６アミノ酸の一部または全てである。例えば、細胞への取り込み、および任意に細胞核への取り込みを示す８６個未満のアミノ酸を有するＴＡＴタンパク質の機能的に効果的なフラグメントまたは部分が使用される。細胞への侵入と取り込みを仲介する領域を含むＴＡＴペプチドはさらに公知の技術を用いて定義することができる。例えば、Ｆｒａｎｋｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８６：７３９７−７４０１（１９８９）を参照されたい。
【００４３】
天然に存在するＨＩＶ ＴＡＴタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、天然に存在するＴＡＴタンパク質に存在す少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失および／または置換により修飾して、修飾ＴＡＴタンパク質（本明細書中においてＴＡＴタンパク質とも称する）を作ることができる。増加または減少した安定性を有する修飾ＴＡＴタンパク質またはＴＡＴペプチドアナログは公知の技術を用いて作ることができる。一部の実施形態において、ＴＡＴタンパク質またはペプチドは、天然に存在するＴＡＴタンパク質またはその一部と実質的に類似であるが、同一ではないアミノ酸配列を含む。さらに、コレステロールまたは他の脂質誘導体をＴＡＴタンパク質に付加して、増加した膜溶解性を有する修飾ＴＡＴを作ることができる。
【００４４】
ＴＡＴタンパク質の変異体は工程１試薬の細胞内局在性を調節するために設計することができる。外から加えられる場合、そのような変異体を、ＴＡＴが細胞に入る能力が保持される（すなわち、変異ＴＡＴタンパク質またはペプチドの細胞への取り込みが天然に存在するＨＩＶ ＴＡＴに実質的に類似する）ように設計する。例えば、核局在化に重要と思われる基本領域の変更（例えば、Ｄａｎｇ ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８０１９−１８０２３（１９８９）；Ｈａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１１８１−１１８７（１９８９）；Ｒｕｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１−８（１９８９）を参照）はＴＡＴの、したがってプラットフォーム構築材料の細胞質配置または部分的に細胞質配置をもたらしうる。もしくは、ＴＡＴを保持するために、細胞質または他の成分または分画（例えば、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム小胞）に結合する配列をＴＡＴに導入することができ、プラットフォーム構築物質を細胞質または他の分画に導入して、ＴＡＴとプラットフォーム構築物質の取り込みの際の調節を付与する。
【００４５】
細胞標的部分の他の原料として、例えば、ＶＰ２２（例えばＷＯ９７／０５２６５； Ｅｌｌｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ ８８：２２３−２３３（１９９７）に記載）または非ウイルスタンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０６９１−１０６９５（１９９２））が挙げられる。
【００４６】
プラットフォーム構築材料は、細胞標的剤により細胞中に取り入れられたときに、細胞標的剤から分離され、水不溶性となる化合物である。水不溶性とは、水溶液中のナノプラットフォームの濃度が室温で０．０１ｍＭ未満であることを意味する。水溶液の濃度は、室温で、０．００１ｍＭ、０．０００１ｍＭ、０．００００１ｍＭ、または０．０００００１ｍＭ未満である。プラットフォーム構築材料は水不溶性ナノプラットフォームを自発的に形成する。もしくは、プラットフォーム構築材料は、さらなる化学反応の後に水不溶性ナノプラットフォームを形成する。化学反応として、例えば、内因性リソソーム酵素の作用、リソソームの酸性ｐＨ、他の細胞内酵素、細胞内の他の適当な領域内の他の条件、または細胞内の生物学的マクロ構造物への付着または挿入等、細胞環境内に存在する酵素または他の条件により促進される反応が挙げられる。
【００４７】
標的細胞内で細胞標的剤からいったん遊離されたプラットフォーム構築材料は、沈殿する分子状結合体を形成するか、または不溶性ポリマー、コロイド、蝋、オイル、または生物学的マクロ構造物に付着または挿入される物質等、他の水不溶性物質を形成する。例えば、ポリフィリン内でキレート化した適当な金属を有するか、有さないポルフィリン結合体は沈殿する分子結合体を自発的に形成する。さらに、インドキシルグリコシドは、水不溶性インジゴミクロ沈殿物を作り、ビス−インドキシルグリコシドは水不溶性ポリマーインジゴを作り、ポリ−インドキシルグリコシドは水不溶性インジゴイド格子を作る。
【００４８】
適当なプラットフォーム構築材料として、例えば、置換インドキシル；ポリフィリン；ＨＰＭＡ誘導体等のポリマー；デキストラン、アラビアゴムおよびキチン等の多糖；デンドリマー；およびオピオメラミンが挙げられる。
【００４９】
細胞標的剤はプラットフォーム構築材料に直接連結させる。もしくは、細胞標的剤を、例えば担体部分または架橋剤によりプラットフォーム構築材料に間接的に付着させる。この結合は共有性である。もしくは、この結合は非共有性である。この結合は、プラットフォーム構築材料が、細胞への内部移行後に細胞標的剤から引き離される（すなわち、分離される）ことを可能とするものである。例えば、結合は、（１）標的細胞内のリソソーム内に見られる細胞内酵素または酸性環境により切断されるか、（２）標的細胞内の他の環境内で酵素的または他の作用により放出されるか、および／または（３）標的細胞内の生物学的マクロ構造物に付着または挿入される。
【００５０】
担体部分は、さらに多くのプラットフォーム構築材料が、各細胞標的剤とともに標的がん細胞内に運ばれることを可能とする。担体部分として、例えば、血清アルブミン等のタンパク質；多糖、特に官能基を有するように修飾された多糖；ＨＰＭＡ誘導体等の合成ポリマーおよび共重合体；デンドリマー；ポリリジン等のポリペプチドを含む他のバイオポリマー；リポソーム；ナノ粒子；および高分子ミセルが挙げられる。（ａ）生物学的に適合性があり、（ｂ）複数のプラットフォーム構築材料が付着する多数の官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等）を有し；（ｃ）細胞標的剤を連結するための場所を有するどのような物質も担体部分として有用である。
【００５１】
任意に、得られた水不溶性ナノプラットフォームが続いて投与される工程３二特異的試薬に結合できる付加的分子構造を表すように、プラットフォーム構築材料は付加的分子構造を含有する。適当な付加的分子構造は、例えば、抗原エピトープ、新抗原エピトープ、タンパク質に結合するリガンド、ペプチドレクチン、またはコンビナトリアルケミストリーにより調製されたものを含む有機構造物が挙げられる。好ましくは、付加的分子構造は、ナノプラットフォーム上の付加的分子構造と、その後に投与される工程３二特異的試薬の標的部分との間で共有結合の形成を可能とする。
【００５２】
付加的分子構造の例：工程３試薬標的部分システムは、ナノプラットフォーム上の付加的分子構造が酵素の非可逆的インヒビターである場合に生じ、工程３二特異的試薬の標的部分は該酵素であり、非可逆的インヒビターが該酵素のアミノ酸残基の一つと共有結合を形成するために、工程３二特異的試薬を水不溶性ナノプラットフォームに共有結合させる。
【００５３】
もしくは、酵素は、酵素的反応が完了せず、基質が安定な結合体として修飾酵素に共有結合するようになるように特異的に修飾され、変更されているので、ナノプラットフォーム上の付加的分子構造は工程３二特異的試薬の標的部分である該酵素の非可逆的インヒビター基質である。そのような方法は当業者に知られている。記載される変異β−ラクタマーゼはそのような修飾酵素の一例である。
【００５４】
最適には、工程１試薬のプラットフォーム構築材料上の付加的分子構造として有用な非可逆的酵素インヒビターは、（１）非可逆的酵素インヒビターをプラットフォーム構築材料に結合させるために用いることのできる活性結合部分から離れた官能基；（２）細胞内および細胞外での循環血液中での相対的安定性；（３）付加的分子構造による担体部分と細胞標的剤へのプラットフォーム構築材料の付着中に、プラットフォーム構築材料の合成を含む工程１試薬の化学合成を容易にする安定的性質等の特性の１つ以上を有する。
【００５５】
例示的な酵素／非可逆的酵素インヒビターの対として、変異β−ラクタマーゼ／ペニシリンアナログまたはロラカルベフ；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ／ホスホマイシンまたはホスホエノールピルベート；オルニチンデカルボキシラーゼ／α−ジフルオロメチルアミノ酸；アルギニンデカルボキシラーゼ／α−ジフルオロメチルアミノ酸；酵母Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ／１，１’−（メチルエタンジイリジデンジニトリロ）−ビス（３−アミノグアニジン）；およびβ−ラクタマーゼＰＳＥ−４／クラブラン酸、スルバクタムおよびタゾバクタムが挙げられる。
【００５６】
工程１試薬の多様な成分は、特定のタイプのがんに合う成分の範囲から選択される。工程１試薬の多様な成分の選択においてこの多様性を有することで、本発明はほとんどすべての種類のがんに適用することができる。特定の腫瘍タイプの細胞標的剤の例示的な標的を表１に示し、ここで「ｘ」は、標的が特定の腫瘍上で同定されたことを示している。
【００５７】
【表１】
工程２試薬
工程２試薬は殺細胞試薬である。殺細胞試薬または細胞毒性化合物は細胞死を引き起こすことができる物質である。好ましくは、細胞死はアポトーシスの結果であるか、または細胞溶解をもたらして、ナノプラットフォームを腫瘍細胞外の空間に再配置して、続いて、またはその前か、または同時に投与された試薬に対して細胞外ナノプラットフォームを露出させ、接近可能とさせる。
【００５８】
細胞殺傷剤は細胞毒性化合物である。例えば、細胞殺傷剤は化学処置剤；毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的活性のある毒素またはそのフラグメント）；放射活性同位元素（すなわち、放射活性結合体）；または体外照射療法、温熱または超音波等の外部にかけられるエネルギーである。
【００５９】
もしくは、細胞殺傷剤は、ホルモン、抗ホルモン等の無毒剤、または被験体のホルモン状態の変更を導き、被験体のホルモン状態に感受性のある特定の細胞系統の細胞に向けられたアポトーシスと呼ばれる殺細胞プロセスをもたらす精巣摘除術等の操作である。例えば、精巣摘除術および／または抗アンドロゲンの投与は、多数の正常な前立腺細胞およびさまざまな数の前立腺がん細胞のアポトーシス死滅を引き起こす。
【００６０】
例えば、化学療法剤化合物は、パクリタキセル、タキソール、ロバスタチン、ミノシン、タモキシフェン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、エポチロン、ナベルビン、カンプトテシン、ダウノニビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシンまたはイダルビシンである。
【００６１】
工程２試薬として用いることのできる酵素活性のある毒素およびそのフラグメントとして、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類が挙げられる。
【００６２】
放射性複合抗体の生産のために多様な核種が利用可能である。実例として、２１２Ｂｉ，１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
【００６３】
工程２細胞殺傷剤の何れを使用するかにかかわらず、殺細胞試薬は、殺細胞試薬による死滅に対して過敏な特徴を有する少なくとも標的細胞を選択的に死滅させることができる。
工程３試薬
本発明は、さらに、工程３二特異的試薬２０００（図２６）を被験体に導入することからなる。工程３試薬は標的部分２１００および同位元素捕捉部分を含む化合物である。
【００６４】
標的部分は、水不溶性ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００に対して特異性および親和性をもって結合することができる。
【００６５】
同位元素捕捉部分２２００は放射標識水溶性工程４試薬を捕捉できる。
【００６６】
工程３試薬の標的部分は、例えば、ヒドラジド類、ケトン類、メルカプタン類、マレイミジル類等の有機官能基；抗体、そのフラグメントまたはその誘導体、または抗体結合部位のように挙動するように生物技術的に設計されたペプチド等のポリペプチド；ペプチド、酵素またはそのフラグメント；レクチン；または細胞外ナノプラットフォーム上の付加的分子構造に結合するように生物技術的に設計された分子である。
【００６７】
標的部分の選択は、工程１試薬上の付加的分子構造およびその得られるナノプラットフォームの選択の関数である。例えば、ナノプラットフォーム上の付加的分子構造が新生抗原または他の抗原エピトープである場合、標的部分は抗体結合部位のように挙動するように生物技術的に設計され、特異性および親和性をもって新生抗原または他の抗原エピトープに結合するように適合させた抗体または抗体フラグメントまたはペプチドである。工程３二特異的試薬の標的部分が細胞外ナノプラットフォーム上の付加的分子構造を標的とすることは、工程３二特異的試薬の標的部分と、細胞外ナノプラットフォームの表面上の付加的分子構造としての抗原エピトープとの非共有高親和性および／または高親和力結合の結果でもありうる。図３０は、表面上の付加的分子構造１４００として多くの抗原エピトープ１４０４を有する細胞外ナノプラットフォーム１６００を示す。工程３二親和性試薬２００４の標的部分２１００としてのこれらの抗原エピトープ１４０４に対する特異性を有する抗体２１０４は、細胞外ナノプラットフォーム１６００の表面上の付加的分子構造１４００としての抗原エピトープ１４０４に高親和性および／親和力２５０４をもって結合するので、工程３二特異的試薬２００４を細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合する。
【００６８】
あるいは、ナノプラットフォーム上の付加的分子構造が非可逆的酵素インヒビターである場合、標的部分は、非可逆的酵素インヒビターに結合する対応する酵素、変異酵素、タンパク質またはペプチドである。図２９に示されるように、工程３試薬２００３は標的部分２１００として適当な酵素２１０３とともに導入され、ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００としての非可逆的酵素インヒビター１４０３と接触する。工程３二特異的試薬２００３の酵素２１０３標的部分２１００は非可逆的酵素インヒビター１４０３と相互作用して、非可逆的酵素インヒビターに対する共有結合により、酵素２１０３（および従って工程３二特異的試薬）を細胞外ナノプラットフォーム１６００に共有結合２５０３させることができる。工程３二特異的試薬の標的部分に適する酵素として、例えば、β−ラクタマーゼ、変異β−ラクタマーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ、またはナノプラットフォーム上の付加的分子構造としての基質が酵素に共有結合するが、基質を遊離させる触媒反応を完結させることができないようにその活性部位を修飾または変更させた特異的変異の酵素が挙げられる。
【００６９】
ナノプラットフォーム上の付加的分子構造がアルデヒド基またはケトン基等の反応性有機官能基である場合、工程３試薬の標的部分はヒドラジド基等の反応性有機官能基であるので、アルデヒド基またはケトン基をヒドラジド基と反応させてヒドラゾンを形成することにより、工程３試薬をナノプラットフォームに共有結合させる。図２７に示されるように、アルデヒド基は遊離アルデヒドとしてか、アセタールとして保護されてプラットフォーム構築材料に取り込まれる；後者が次に細胞内に存在する場合に、保護基がアセタールから除去され、遊離アルデヒド基を付加的分子構造１４０１として存在させるだろう。他の有機反応官能基として、図２８に示されるようにメルカプタン基およびマレイミジル基が挙げられる。Ｓ−アセチル保護メルカプタン等の保護メルカプタンは工程１試薬上の付加的分子構造であり、プラットフォーム構築材料に付着する。細胞内に存在する間、アセチル基は加水分解性酵素により除去されるので、ナノプラットフォーム１６００はその表面に遊離メルカプト基１４０２を有し得る（図２８中を参照）。工程３試薬２００２の対応する標的部分２１００はマレイミジル基２１０２であり、ナノプラットフォーム１６００上のメルカプト基１４０２に接触すると、チオエーテル結合２５０２を形成することによって、工程３試薬をナノプラットフォームに共有結合させる。
【００７０】
工程３二特異的試薬の同位元素捕捉剤は放射標識工程４試薬に結合することができる。同位元素捕捉部分２２００の化学組成物は放射標識工程４試薬により決まる。同位元素捕捉部分は、ナノプラットフォームの領域に隣接する腫瘍のマトリックス内の放射標識水溶性工程４試薬を捕捉するように適合させる。
【００７１】
腫瘍内への放射標識水溶性工程４試薬の捕捉は、放射標識水溶性工程４試薬を、細胞外ナノプラットフォーム上の工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分に直接に結合させ、それを、ホットスポットを作るために必要な時間結合し続けることにより達成する。適当な時間は使用される放射同位元素に依存し、当業者に明らかである。例えば、１３１Ｉ等の放射標識ヨウ素に適当な時間は少なくとも５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間以上である。９０Ｙ等の放射標識イットリウムに適当な時間は３日間、４日間、５日間または６日間以上である。
【００７２】
細胞外ナノプラットフォーム上の工程３試薬の同位元素捕捉部分に結合することのできる工程４試薬として、アルデヒド基と結合してヒドラゾンを形成するヒドラジド基等の工程３二特異的試薬の標的部分について既に述べた反応有機官能基が挙げられる。例えば、図３１に示されるように、細胞外ナノプラットフォーム１６００の表面に付着２５００させた工程３二特異的試薬２００５は同位体元素捕捉部分２２００としてアルデヒド基２２０１を有することができ、放射標識水溶性工程４試薬８０００は、分子構造に存在するヒドラジド基８００１によりアルデヒド基２２０１に付着してヒドラゾン７０００を形成することにより、放射標識水溶性工程４試薬を細胞外ナノプラットフォームに共有結合させることができるので、放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ）を腫瘍内の細胞外ナノプラットフォームに、長期間、例えば、放射性同位元素が半径１〜２ｍｍ内の腫瘍細胞に致死線量照射を曝すホットスポットを作る５〜１０日間保持させる。
【００７３】
あるいは、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分は酵素であり、放射標識水溶性工程４試薬は該酵素の放射標識非可逆的インヒビターである。例えば、図３２に示すように、工程３二特異的試薬２００６の同位元素捕捉部分２２００は、工程３二特異的試薬の標的部分２１００によりナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００に付着２５００させたβ−ラクタマーゼ酵素２００２である。この例において、放射標識水溶性工程４試薬８００２は、ペニシラン酸の１３１Ｉヨード誘導体またはリチウム１３１Ｉ−９−Ｏ−ｍ−ヨードフェニルクラブラネートであり（Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，１：８３−１０４，１９８６）、これらは循環血液中に導入されると、細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着したβ−ラクタマーゼ２２０２に接触し、β−ラクタマーゼ上の結合部位と相互作用し、非可逆的酵素インヒビター７００１としてβ−ラクタマーゼに結合することにより、水溶性工程４試薬放射性同位元素を、周囲腫瘍細胞に致死線量照射を曝すホットスポットを作るために必要な期間、腫瘍中の細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着させる。
【００７４】
あるいは、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分は、高親和性および／または高親和力をもって放射標識水溶性工程４試薬と結合することのできる抗体または抗体フラグメントまたはその誘導体、レクチン、または他のタンパク質または構造でもある。図３３に示されるように、工程３二特異的試薬２００７の同位元素捕捉部分２２００はストレプトアビジン２２０３であり、工程３二特異的試薬２００７は工程３二特異的試薬の標的部分２１００により細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合している。この例において、放射標識水溶性工程４試薬８００３は、９０Ｙ−ビオチン誘導体等のビオチン誘導体であってよい（Ｗｅｉｄｅｎ ａｎｄ Ｂｒｅｉｔｚ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４０：２７−５１，２００１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ， ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１６：２２７−２３５，２００１）。放射標識水溶性工程４試薬８００３が循環血液中に入る場合、非常に親和性をもって腫瘍内の細胞外ナノプラットフォームに付着したストレプトアビジンに結合７００３することにより、放射標識工程４試薬９０Ｙ放射性同位元素を、周囲腫瘍細胞に致死線量照射を曝すホットスポットを作るために必要な期間、腫瘍中の細胞外ナノプラットフォームに結合させて捕捉する。ストレプトアビジンはビオチンに対して４つの結合部位を有するので（Ｃｈａｌｅｔ ａｎｄ Ｗｏｌｆ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０６：１， １９６４）、腫瘍内に捕捉された放射性同位元素の量の４倍増幅は、ストレプトアビジンを工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として用いて放射標識ビオチン工程４試薬に結合し、それを捕捉することにより達成される。
【００７５】
抗体は、細胞外ナノプラットフォーム上の付加的分子構造として抗原エピトープに結合する工程３試薬の標的部分として、および放射標識水溶性工程４試薬に結合する工程３試薬の同位元素捕捉部分として用いることができるので、２つの結合活性は、二特異的抗体である工程３試薬を用いることにより一分子中で達成することができる。二特異的抗体の二分の一は、細胞外ナノプラットフォーム上の付加的分子構造として抗原エピトープに対して特異的な抗体でありえ、二特異的抗体の別の半分は放射標識水溶性工程４試薬上のハプテン構造に対して特異的な抗体でありうる。
【００７６】
あるいは、放射標識水溶性工程４試薬の腫瘍内への捕捉は、最も有利には工程３二特異的試薬の同位体元素捕捉部分である適当な酵素の触媒作用により、放射標識水溶性工程４試薬を放射標識水不溶性生成物に変換することにより達成される。この方法は腫瘍内に捕捉されうる放射性同位元素の量の大きな増幅を提供する。この増幅は、放射標識水溶性工程４試薬の濃度および放射標識水溶性工程４試薬基質の酵素のターンオーバー数により支配されるだろう。
【００７７】
好ましくは、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分は酵素であり、この酵素はその触媒作用により続いて投与される放射標識水溶性工程４試薬を、腫瘍マトリックス内に捕捉される放射標識水不溶性生成物に変換することができる。図３４に示されるように、工程３二特異的試薬２００８の同位元素捕捉部分２２００としての酵素は、例えば、工程３二特異的試薬２００８の標的部分２１００により細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合させたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ２２０４等のグリコシダーゼであり、インドキシル部分からガラクトシド部分を切断する酵素の触媒作用により１３１Ｉ−５−ヨードインドキシル−３−ガラクトシド８００４等の放射標識水溶性工程４試薬８００４を１３１Ｉ−５，５’−ジヨードインジゴ８００５等の放射標識水不溶性生成物に変換する。これは、自発的な酸化二量体化を受けて放射標識水不溶性インジゴ誘導体生成物８００５を形成する放射標識水溶性インドキシル誘導体である中間体をもたらす。これらの化合物は、細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合した工程３二特異的試薬２００８の同位元素捕捉部分２２００として酵素の非常に近くで沈殿物を迅速に形成し（Ｈｏｌｔ，Ｎａｔｕｒｅ １６９：２７１−２７３，１９５２；Ｈｏｌｔ ａｎｄ Ｓａｄｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｂ，１４８：４９５−５０５，１９５８）、腫瘍内に放射性同位元素を捕捉して、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に供給するホットスポットを形成する。沈殿物は水不溶性であるため、および腫瘍内に見られる欠如または制限されたリンパ腺のために（Ｊａｉｎ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２６：７１−９０，１９９７；Ｊａｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：８１４ｓ−８１９ｓ，１９９０；Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５：３０８４−３０８８，１９７５）、および腫瘍内に見られる欠如または限定された数の、または効果のない（さもなければ食作用により沈殿物を除去する）マクロファージのために（Ｂａｌｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ５４：１０１０−１０１５，１９８４；Ｖａａｇｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５０：６９−７４，１９９２；Ｂｉｎｇｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９６：２５４−２６５，２００２）、沈殿物は長期間にわたって腫瘍マトリックス内に所定の位置に存続する。工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として酵素をこの触媒方法で使用することは、腫瘍内に捕捉される放射性同位元素の量を増幅することができる点において、放射標識水溶性工程４試薬を直接結合する方法よりも利点があることによって、腫瘍細胞に供給できる致死線量照射の効果的用量を増加させ、腫瘍に対する効果的な処置の可能性を高めている。この触媒方法で工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として用いられる酵素は、好ましくは、ヒトの血液循環に見られる類似の酵素反応が存在せず、ヒトの血液循環に見られる基質が存在しない非哺乳類の酵素である；これらの酵素として、例えば、β−ラクタマーゼ、ペニシリンアシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼおよびシアリダーゼが挙げられる。しかし、ヒト酵素等の哺乳類の酵素でも、ヒト血液循環において顕著な量でホスト反応を触媒せず、かつ酵素に対して競合する天然基質が存在しない、またはその量が限定されており、かつ放射標識水溶性工程４試薬として用いられる基質と顕著な量で反応する循環酵素が存在しないのであればこの触媒方法に用いられる。哺乳類細胞に見られる特異性を示す幾つかの酵素は当分野で知られており、例えば、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。ヒト酵素は潜在的ホスト免疫学的反応を減少させるために、この触媒方法に使用される非哺乳類酵素によりも幾つかの利点があるだろう（Ｗｏｌｆｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：３８−４８，１９９９；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５８０４−１５８１６，１９９７；Ｌａｅｔｈｅｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３２：８−１８，１９９６；Ｈｏｕｂａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．５２：４５５−４６３，１９９６）。この触媒方法で工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分としての使用に適する酵素の選択の最も重要な面は、触媒される工程４反応が、周囲腫瘍細胞を致死線量照射に曝すホットスポットを作るのに必要な期間（多くの場合、腫瘍マトリックスに巻き込まれる沈殿物または高い疎水性の産物の形にある）腫瘍のマトリックス内に捕捉されたままにある放射標識水不溶性産物の形成を引き起こすことを確実とすることである。本発明の工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として適当な触媒酵素として、例えば、β−ラクタマーゼ；ペニシリン−Ｇおよびペニシリン−Ｖアミダーゼ；ニトロレダクターゼ；すべての種類のグリコシダーゼ、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、シアリダーゼ等；カルボキシペプチダーゼＡ；カルボキシペプチダーゼＧ２；シトシンデアミナーゼ；アルカリホスファターゼ；スルファターゼ；またはそのような酵素の遺伝子操作された変異体が挙げられる。
【００７８】
工程３二特異的試薬の標的部分および同位元素捕捉部分は共有結合している（図２６を参照）。もしくは、標的部分および同位元素捕捉部分は非共有的に結合している。反応性有機官能基（例えば、アルデヒド基またはヒドラジド基）を標的部分か同位元素捕捉部分のいずれかに用いる場合、反応性官能基としての標的部分または同位元素捕捉部分は、ほとんどの場合で高分子、しばしばタンパク質である、工程３二特異的試薬の他の部分に反応性有機官能基を付着させるために適当な官能基をも必要とするだろう。この適切な官能基は、標的部分または同位元素捕捉部分としての反応性有機官能基を、タンパク質としての他の部分のアミノ酸残基の１つにタンパク質の結合または酵素活性に影響を与えずに付着させる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６）。工程３二特異的試薬のための他の選択の多くで、工程３二特異的試薬の形成は２つの異なる巨大分子の結合を伴い、ヘテロ結合体を作りだす。結合操作は当該分野で公知である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ ＩＩ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６）。発現および精製の際に、適当な工程３二特異的試薬を提供することができる融合タンパク質を作るためにバイオエンジニアリングおよび組換え生物学技術を使用することもできる。
工程４試薬
工程４試薬は放射標識分子を含む。放射性同位元素は、工程４試薬に直接的に、すなわち共有結合する。あるいは、放射性同位元素は、工程４試薬に間接的に、例えば、キレート剤を介して結合する。放射性同位元素として、例えば、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、イットリウム−９０（９０Ｙ）、銅−６７（６７Ｃｕ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム−１８８（１８８Ｒｅ）、ルテチウム−１７７（１７７Ｌｕ）、アスタチン−２１１（２１１Ａｓ）、ビスマス−２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス−２１３（２１３Ｂｉ）、ロジウム−１０３ｍ（１０３ｍＲｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、およびインジウム−１１１（１１１Ｉｎ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ．６６（２）：１０７−１１７，２００３）が挙げられる。
【００７９】
好ましくは、放射標識工程４試薬は低分子量である。低分子量化合物は、良好な循環、体内分布、腫瘍侵入、および潜在的免疫原性の低下を提供する。さらに、腫瘍細胞外マトリックスに捕捉されない低分子量放射標識水溶性工程４試薬はさらに速く排泄されることにより全身毒性を減少させる。
【００８０】
低分子量とは、化合物が２５ｋＤ未満、好ましくは１０ｋＤ未満、より好ましくは５ｋＤ未満、最も好ましくは１ｋＤ未満であることを意味する。
【００８１】
工程４試薬は、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分に直接的および特異的に結合することにより、工程３試薬の同位元素捕捉部分により捕捉されるように適合させる。もしくは、工程４試薬は、工程３試薬の同位元素捕捉部分により、ナノプラットフォームに隣接する腫瘍細胞外マトリックス内に捕捉される放射標識水不溶性産物に酵素的に変換される。工程４試薬放射性同位元素の腫瘍細胞外マトリックス内の固定化は、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に供給する微小領域の照射野（ホットスポット）を作る。
【００８２】
工程４試薬は、工程３試薬の同位元素捕捉部分に結合することのできる活性反応基により、例えば、同位元素捕捉部分に直接結合する非可逆的酵素インヒビターとして、または同位元素捕捉部分に非常に高い親和性か高い親和力をもって結合するように適合させたハプテンまたはペプチド等の小分子として、同位元素捕捉部分に結合する。高親和力は少なくとも約１０１０モル−１以上のＫａにより定義される。好ましくは、Ｋａは約１０１２モル−１である。さらに好ましくは、Ｋａは約１０１５モル−１である。
【００８３】
反応性有機官能基として、例えば、他の試薬上の対応する有機反応官能基と反応するが、２つの試薬が通る経路上の被験体の循環内に存在する分子構造物とは容易に反応しないアルデヒド類、ケトン類、ヒドラジド類、メルカプタン類またはマレイミド基が挙げられる。例えば、工程３二特異的試薬の同位体捕捉部分がアルデヒド基である場合、放射標識水溶性工程４試薬はヒドラジド官能基を有する。放射標識水溶性工程４試薬上のヒドラジド基が、工程３試薬の同位元素捕捉部分としてのアルデヒド基と接触する場合、それはヒドラゾンを形成するために、放射標識水溶性工程４試薬をナノプラットフォームに共有結合させる。
【００８４】
工程３試薬の同位元素捕捉部分としての適当な酵素および工程４試薬としての非可逆的な酵素インヒビターは上記のように当技術でよく知られている。好ましくは、酵素の特異性は、ホスト種の循環または細胞外マトリックス内または工程３二特異的試薬が本発明での使用中に通る経路上で顕著な量で見られない基質に対するものである。有利には、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分は、ペニシリナーゼまたはペニシリンアミダーゼ等、ホスト種に一般的に見られない基質に対する特異性を有する非哺乳動物の酵素である。
【００８５】
工程４試薬として、２−ニトロ−５−ヨード−フェノール（ＮＩＰ）、４−（４’−ヨードフェニル）ベンゾエート、および４−（４’−ヨードフェニル）ベンゼンアルソネートが挙げられ、これら化合物中でヨード基は放射活性がある。あるいは、ペプチドは放射性同位元素を含むように放射標識する。放射標識された有機分子はペプチドに容易に結合させることができる。例えば、１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸は、アミドの形成によりペプチド上のα−アミノ基に結合させることができ、９０Ｙおよび他の金属放射性同位元素と非常に高い親和性により結合する１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）等のキレート剤はペプチドと結合体化させることができる。ペプチドはＬアミノ酸、Ｄアミノ酸、または両者の組合せのポリマーである。例えば、ペプチドはＤレトロ−インバーソペプチド（ｉｎｖｅｒｓｏ ｐｅｐｔｉｄｅ）である。「レトロ−インバーソ異性体（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ ｉｓｏｍｅｒ）」との用語は直鎖ペプチドの配列の向きが逆である異性体をいう；「Ｄ−レトロ−インバーソ異性体」との用語は、配列の向きが逆であり、各アミノ酸残基のキラリティーが逆である直鎖ペプチドの異性体をいう。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４）を参照されたい。Ｄ鏡像異性体と逆合成の組合せの最終結果として、各アミド結合のカルボニル基とアミノ基の位置が交換される一方で、各アルファ炭素の側鎖基の位置が保存される。例示的な工程４試薬／同位元素捕捉部分の対として、放射標識ビオチン／ストレプトアビジンまたは放射標識ＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ抗体が挙げられる。
【００８６】
工程４試薬として、同位元素捕捉部分により酵素的に変えられる付着した親水基を有する疎水性核からなる化合物が挙げられる。例えば、親水基が芳香族ＯＨ（ヒドロキシ）基に結合し、これはＯＨ基が放射標識水溶性工程４試薬の別の部分のヘテロ原子に水素結合をする位置に存在する場合に最も有利であろう。さらに、この種類の放射標識水溶性工程４試薬は放射性同位体、最も好ましくは、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として酵素に対して放射標識水溶性工程４試薬基質が反応することにより作られる放射標識水不溶性産物の疎水性を維持するヨード基等の放射性同位元素を含む。
【００８７】
このクラスの放射標識水溶性工程４試薬に対する潜在的な放射性同位元素含有分子構造の多くの（排他的であることは意味しない）共通する特徴は、例えば、ホスファターゼに対する基質グループとしてのホスフェート基、ガラクトシダーゼに対するガラクトース、グルコシダーゼに対するグルコース、グルクロニダーゼに対するグルクロニド２等を結合させることにより適切な酵素基質を調製するために用いられる芳香族核上のＯＨ（ヒドロキシル）基である。ＯＨ基はいったん付着基質の酵素的切断によって遊離すると、分子構造の一部である適当に位置するヘテロ原子とともに内部水素結合を形成することができる。例えば、放射標識および適当な基質グループが付加されるこれらの核構造物として、アルキルサリチル酸塩の誘導体、Ｎ−ベンジルサリチルアミド、２−（２’’−ヒドロキシフェニル）ベンズイミダゾール、５，６，７，８−β−テトラロールカルボン酸−β−ナフチルアミド、２−ヒドロキシベンゾフェノン、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸アニリド、ジヒドロキノフタロン、メナヒドロキノン、２−（２’−ヒドロキシフェニル）−４（３Ｈ）−キナゾリノン、２−（２’ヒドロキシフェニル）−ベンゾトリアゾール、ポルフィリン誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
酵素として、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分の触媒作用を利用する別の方法は、自発的に反応して放射標識水不溶性産物を形成する活性中間体への放射標識水溶性工程４試薬の酵素的変換であり、それにより微小領域の照射野（ホットスポット）を作って致死線量照射を周囲腫瘍細胞に供給するために必要とされる期間、腫瘍細胞外マトリックス内に捕捉されうる放射性同位元素の量を非常に増やす高い酵素ターンオーバー数の大きな増殖ポテンシャルを再び利用する。多くの分子構造は、酵素的切断が水不溶性ポリマーを形成するための活性中間体であるモノマーを作る酵素基質等、この種類の放射標識水溶性工程４試薬を作るために適する。そのような放射標識水溶性工程４試薬として用いることのできる適当な酵素基質の例として、１）ペンダント基の酵素的切断が酸化的二量体化を迅速に受ける反応性インドキシルを生じて、放射標識水不溶性インジゴ誘導体生成物を形成する放射標識水溶性インドキシル誘導体および２）ペニシリナーゼによる切断が、放射標識水不溶性生成物を放出する電子転位を導くペニシリンの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
試薬の調製
本発明の組成物は、当分野で公知の適当な方法での化学的結合により上記のそれぞれの基からの成分を結合させることにより調製される。多くの公知の化学的架橋方法は非特異的であり、すなわち、それら方法は結合点を標的部分上のいずれか特定の部位に向けることはない。その結果、非特異的架橋剤の使用は機能部位を攻撃するか、または立体的に活性部位をブロックして、複合タンパク質を生物学的に不活性にするだろう。
【００８９】
結合特異性を高める一つの方法は、架橋すべきポリペプチドの片方もしくは両方に一回のみまたはわずかに見られる官能基に直接に化学結合させることである。例えば、多くのタンパク質では、チオール基を含む唯一のタンパク質アミノ酸であるシステインはわずかに数回存在する。また、例えば、ポリペプチドがリジン残基を含まない場合、一級アミンに特異的な架橋剤は、該ポリペプチドのアミノ末端に対して選択性があるであろう。結合特異性を高めるこのアプローチの成功した利用は、ポリペプチドが、分子の生物学的活性の損失なしに変更されない分子の領域に適度に稀な反応性残基を有することを必要とする。
【００９０】
システイン残基は、架橋反応へのそれらの寄与がおそらく生物学的活性に干渉しないポリペプチド配列の一部に存在する場合に置き換えてよい。システイン残基が置き換わる場合、ポリペプチドの折り畳みの生じる変化を最小限にすることが典型的に望ましい。ポリペプチドの折り畳みの変化は、置換が化学的および立体的にシステインに類似である場合に最小化する。これらの理由から、セリンはシステインの置換として好ましい。下記の実施例に示されるように、システイン残基は、架橋の目的のためにポリペプチドのアミノ酸配列に導入してよい。システイン残基が導入される場合、アミノ末端またはカルボキシル末端での導入または該末端の近くの導入が好ましい。目的のポリペプチドが化学合成または組換えＤＮＡの発現のいずれかにより作られようとも、そのようなアミノ酸配列修飾に慣用の方法を利用することができる。
【００９１】
２構成成分の結合は、架橋剤または接合剤により達成することができる。利用することのできるいくつかの分子間架橋剤が存在する。例えば、Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ，ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，１９７４，ｐｐ．３９−４３を参照されたい。これらの試薬の中には、例えば、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（両者共にスルヒドリル基に対して非常に特異的であり、非可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６〜１１炭素メチレン架橋を有する他の相同体（これらはスルヒドリル基に対して比較的特異的である）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（これはアミノ基とチロシン基とともに非可逆的結合を形成する）が存在する。この目的に有用な他の架橋剤として、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（これはアミノ基およびフェノール基とともに非可逆的架橋を形成する）；ジメチルアジピミデート（これはアミノ基に対して特異性がある）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（これは主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（これは主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（これはいくつかの異なる側鎖と反応する）およびビスジアゾベンジジン（これは主にチロシンおよびヒスチジンと反応する）が挙げられる。
【００９２】
架橋剤はホモ二機能性、すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有する。好ましいホモ二機能性架橋剤はビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、温和な条件下（ｐＨ６．５〜７．７）でスルヒドリル含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含む。２つのマレイミド基は炭化水素鎖により連結させる。したがって、ＢＭＨはシステイン残基を含むポリペプチドの非可逆的架橋に有用である。
【００９３】
架橋剤はヘテロ二機能性であってもよい。ヘテロ二機能性架橋剤は、遊離のアミンとチオールをそれぞれ有する２つのタンパク質を架橋させる２つの異なる官能基、例えば、アミン反応基とチオール反応性基を有する。ヘテロ二官能性架橋剤の例はスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、およびスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）、ＭＢＳの延長鎖アナログである。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は一級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドはシステイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００９４】
架橋剤はしばしば水に対する低い溶解性を有する。スルホネート基等の親水部分はその水溶性を向上させるために架橋剤に加えてよい。スルホＭＢＳおよびスルホＳＭＣＣは水溶性のために修飾された架橋剤の例である。
【００９５】
多くの架橋剤は、細胞条件下で基本的に非切断性である複合物を生じる。しかし、一部の架橋剤は、細胞条件下で切断可能なジスルフィド等の共有結合を含む。例えば、Ｔｒａｕｔの試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（「ＤＳＰ」）およびＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（「ＳＰＤＰ」）はよく知られた切断可能な架橋剤である。切断可能な架橋剤の使用により、標的細胞への輸送後に積荷部分を輸送ポリペプチドから分離することができる。直接のジスルヒド結合も有用であろう。
【００９６】
上記した架橋剤等の多くの架橋剤が市販されている。それらの使用の詳細な説明は商業供給元から容易に入手可能である。タンパク質架橋および結合体調製物に関する一般的な参考文献は、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）である。
【００９７】
化学的な架橋はスペーサーアームの使用を伴うだろう。スペーサーアームは細胞間柔軟性を提供し、複合部分間の細胞内距離を調節することにより生物学的活性を保存するのに役立つだろう。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド部分の形態にあってよい。もしくは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」等における架橋剤の一部であってよい（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，ｃａｔ．Ｎｏ．２１６５１Ｈ）。
【００９８】
もしくは、本発明の組成物は、公知の適当なホスト細胞で好都合に発現させることのできる融合タンパク質として作られる。ここに記載のように融合タンパク質を、標準的な組換えＤＮＡ技術に類似するか、またはそれから容易に適合できる方法で形成し、用いることができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術にしたがって、例えば、連結のために平滑末端またはジグザグ末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端を埋めること、望まれない結合を避けるためにアルカリホスファターゼ処理および酵素的連結を用いることにより、ともにインフレームで連結する。融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置等の慣用の技術により合成する。もしくは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、引き続いてキメラ遺伝子配列を作るようにアニールし、再増幅することのできる２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的突出を生じさせるアンカープライマーを用いて実施する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２を参照）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが利用可能である。
医薬組成物
本発明の組成物は投与に適する医薬組成物に配合することができる。そのような組成物は典型的には工程１試薬、工程２試薬、工程３試薬または工程４試薬および薬学的に許容される担体を含む。ここで用いられる「薬学的に許容される担体」は、医薬投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含むことが意図される。適当な担体は、参照により本文に編入されるこの分野での標準的な参照教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈液の好ましい例として、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび不揮発性油等の非水性ビヒクルを用いてもよい。薬学的に活性のある物質のためにそのような媒体および物質を使用することは当分野においてよく知られている。慣用の媒体または物質が活性化合物と非適合性でない限り、本組成物におけるそれらの利用が意図される。補助の活性化合物も本組成物に配合することができる。
【００９９】
本発明の医薬組成物はその意図する投与経路に適合するように処方される。投与経路の例として、非経口、例えば、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経皮（局所）、経粘膜的、直腸投与および経口経路が挙げられる。本発明の処置薬は、適切な経路、例えば、点滴または迅速投与により、上皮層または粘膜皮膚層（例えば、口粘膜、直腸および小腸粘膜、等）により投与してよく、他の生物学的に活性のある物質とともに投与してよい。投与は全身または局所であってよい。
【０１００】
非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液として、下記成分：注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等の緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の等張性調節剤が挙げられる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基により調節することができる。非経口調製物はアンプル、使い捨て注射器またはガラスかプラスチック製の複数回投与バイアルに同封できる。
【０１０１】
注射可能な使用のために適する医薬組成物として、滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌注射可能な溶液または分散剤の即時調製用の分散物または滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与に適当な担体として、生理学的食塩水、静菌性水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合で、組成物は無菌でなければならず、容易な注射針通過が存在する程度に流動的でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌や真菌等の微生物の汚染作用から守る必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの利用により、分散液の場合は必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の利用により維持することができる。微生物の作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物に含ませるのが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることにより達成できる。
【０１０２】
無菌の注射液は、必要に応じて、上記成分の１つまたはそれらの組合せと共に、適当な溶媒中で必要とされる量の活性化合物（例えば、ＰＤＸポリペプチドまたはＰＤＸをコードする核酸）を配合し、次にろ過滅菌により調製することができる。一般的に、分散物は、基本分散媒および上記の必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を配合することにより調製される。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合、調製方法は、前もって無菌ろ過された溶液から有効成分と付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１０３】
経口組成物は通常、不活性の希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するか、錠剤へと圧縮することができる。経口処置薬投与の目的から、活性化合物を賦形剤に配合し、錠剤、トローチまたはカプセルの形で用いることができる。経口組成物は液体担体中の化合物が経口で供給され、クチャクチャとさせて吐き出すか、もしくは飲み込むうがい薬として使用するために液体担体を用いて調製することもできる。薬学的に適合性のある結合剤および／または補助物質を組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン等の結合剤；デンプンまたはラクトース等の賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ等の滑剤；コロイド状二酸化シリコン等の流動促進剤；スクロースまたはサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ調味料等の矯味矯臭剤等の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含むことができる。
【０１０４】
吸入による投与のために、化合物は、適当な高圧ガス、例えば二酸化炭素等のガスを含む加圧容器またはディスペンサー、または噴霧器からのエアゾールスプレーの形で供給される。
【０１０５】
全身投与は経粘膜または経皮膚手段によってもよい。経粘膜的または経皮膚投与のために、透過すべきバリヤーに適当な浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は一般的に知られ、例えば、経粘膜的投与のために、洗浄剤、胆汁酸およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜的投与は鼻内噴霧または座薬の使用により達成することができる。経皮的投与のために、活性化合物を当分野で一般的に知られているように軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに配合する。
【０１０６】
化合物は座薬（例えば、カカオ脂や他のグリセリド等の慣用の座薬基剤とともに）または直腸投与のために保持注腸剤の形で調製することもできる。一実施形態において、活性化合物は、移植物やマイクロカプセル化投与システムを含む制御放出製剤等、体からの速い排出に対して化合物を保護する担体とともに調製される。エチレンビニルアセテート、多無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生分解性で生体適合性のあるポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製方法は当業者に自明であろう。それら物質はＡｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからも市販され入手することができる。（モノクローナル抗体または他の細胞標的剤によりがん細胞を標的とするリポソームを含む）リポソーム懸濁液も薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、参照により本文に組み込まれる、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。
【０１０７】
投与のしやすさや投与量の均一性のために経口または非経口組成物を投与量単位形で処方することが特に有利である。ここで用いられる投与量単位形とは処置される被験体に対して単位投与量として適する物理的に分離した単位をいい、各単位が必要とされる薬学担体と関連して所望の治療効果を生むように計算された所定量の活性化合物を含んでいる。本発明の投与量単位形の明細は活性化合物の独自の特徴と達成されるべき特定の治療効果により決定され、またそれらに直接依存する。
【０１０８】
ここで用いられる「治療的有効量」との用語は、意義のある患者利益、すなわち、関連する医学的な病気の処置、治癒、予防または改善、またはそのような病気の処置、治癒、予防または改善の速度の増加を示すのに十分な医薬組成物または方法の各有効成分の総量を意味する。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、この用語は該成分のみをいう。組合せに適用される場合、この用語は、組合せて投与されようが、連続的または同時に投与されようが、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせた量をいう。
【０１０９】
特定の疾患または病気の治療に効果的である本発明の治療薬の量は疾患または病気の性質に依存し、当分野内で平均的技量を有する者による標準的臨床技術により決定してよい。さらに、インビトロアッセイを任意に使用して、最適投与量範囲を同定するために役立ててよい。製剤に使用される正確な投与量は投与経路および病気または疾患の全体的な重症度にも依存し、開業医の判断および各患者の事情にしたがって決定しなければならない。最終的に、主治医は、各患者個人を処置する本発明のタンパク質剤の量を決定するだろう。最初に、主治医は低用量の本発明の試薬を投与し、患者の反応を観察する。さらに高い用量の本発明の試薬を、患者に対して最適治療効果が得られるまで投与し、その時の用量をさらに増加させない。しかし、本発明の治療薬の静脈内投与の適当な投与量範囲は、体重１キログラム（ｋｇ）あたり、通常、活性化合物の約０．０２０ミリグラム（ｍｇ）〜１グラムである。鼻腔内投与の適当な投与量範囲は、通常、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。効果的な用量はインビトロまたは動物模型試験系から得られた用量反応曲線から外挿してもよい。座薬は一般的に０．５重量％〜１０重量％の範囲の有効成分を含む；経口製剤は好ましくは１０％〜９５％の有効成分を含む。
【０１１０】
本発明の治療薬を用いる静脈内治療の期間は、処置される疾患の重症度および各患者個人の状態および潜在的な特異体質の反応に応じて変更する。本発明の試薬の各適用の期間は１〜２時間〜１５日間の連続的な静脈内投与の範囲にあると考えられる。最終的に、主治医は、本発明の医薬組成物を用いる静脈内処置の適当な期間を決定するだろう。
【０１１１】
医薬組成物は、投与説明書とともにキット、容器、包みまたはディスペンサーに入れてよい。
【０１１２】
下記の非限定の実例で本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：抗ＥＧＦ抗体−デキストラン−３−インドキシルホスフェート−ホスホエノールピルベート結合体の合成
工程１試薬を図６に示す。細胞標的剤１１１０は、ＥＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体であり；担体部分１２１０は多糖デキストランであり；そしてプラットフォーム構築材料１３１０は、ホスホエノールピルベート誘導体の付加的分子構造１４１０を結合させた置換された３−インドキシルホスフェート誘導体である。
【０１１４】
図６に示されるように、工程１試薬１０１０は、インジゴの会合体を結合させて微小沈殿物を形成することにより細胞内水不溶性ナノプラットフォーム１５１０を形成する。プラットフォーム構築材料の一部または全てとして、付加的分子構造１４１０が挙げられ、これは、工程３二特異的試薬の標的部分であるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ酵素の非可逆的インヒビターであるホスホエノールピルベートの誘導体である。インドキシルホスフェートプラットフォーム構築材料はデキストラン担体部分により標的部分に結合する。リンカー分子はインドキシルホスフェート誘導体プラットフォーム構築材料のホスフェート基に結合するので、インドキシル中間体の放出、およびインジゴ誘導体細胞内水不溶性ナノプラットフォームを形成するそれらの二量体化を干渉しない。
【０１１５】
工程１試薬の合成は次のように進む：図７に示されるように、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミデート５１０２を、ベンジル６−ヒドロキシヘキサノエート５１０１と、三級アミンの存在下、塩化メチレン中、０℃で１．５時間、次に室温で１／２時間反応させて、５１０３を得た。化合物５１０３上のジイソプロピルアミン基の１Ｈ−テトラゾールおよび水による加水分解後、亜リン酸塩５１０４をベンゼン中のＮ−クロロスクシンイミドにより１５時間室温で酸化して、クロロホスフェート５１０５を作った。反応混合物をドライアイス／アセトン浴中で冷却した後、５１０５を加えながら、Ｎ−ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル−５−ブロモ−３−ヒドロキシインドール５１０６のリチウム塩を得た。反応混合物をゆっくりと室温に戻して、５−ベンジルオキシカルボニルペンチル−２’−シアノエチル−Ｎ−ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル−５’’−ブロモ−３’’−インドリルホスフェート５１０７を得た。ベンジル保護基とニトロベンジルカルバメート保護基は、活性炭担持１０％パラジウムおよび大気圧下の水素を用いて１時間、室温で接触水素化することにより除去して、５−カルボキシペンチル２’−シアノエチル５’’−ブロモ−３’’−インドリルホスフェート５１０８を得た。
【０１１６】
プラットフォーム構築材料上の付加的分子構造であるホスホエノールピルベートの誘導体は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ酵素とともに共有結合体を形成する非可逆的酵素インヒビターであり（Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：４０６−４１２，１９９８；Ｓａｍｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１３１６２−１３１６９，１９９９；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１０６３８−１０６４５，１９９４）、これは続いて投与される工程３二特異的試薬の標的部分である。図８に示されるように、上記のインドキシル化合物のアナログである５−ベンジルオキシカルボニルペンチル２’−シアノエチルＮ−ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル−５’’−ヒドロキシ−３’’インドリルホスフェート５１０９を、リチウムジイソプロピルアミドとドライアイス／アセトン浴中で反応させる場合に、シアノエチル３−ブロモピルベートを加え、反応物をゆっくりと室温に戻して５１１０を作る。次に、この生成物５１１０をドライアイス／アセトン浴中でリチウムジイソプロピルアミドと反応させ、次にビスシアノエチルクロロホスフェートと反応させて、保護ホスホエノールピルベートインドキシルホスフェート誘導体５１１１を得る。次に、ニトロベンジルカルバメート保護基とベンジル保護基を活性炭担持１０％パラジウムおよび大気圧での水素を用いる１時間、室温での触媒水素化により除去して、非可逆的酵素インヒビターが付着した５１１２を有する保護プラットフォーム構築材料を得る。
【０１１７】
アミノ−デキストランを、Ｋａｍｉｚｕｒａら（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４２：２６６４−２６７２，２００１）により記載された操作にしたがってデキストランから調製した。デキストラン（分子量６４，０００〜７６，０００、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を４Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、６−ブロモへキサン酸と８０℃で３時間反応させた。低分子量試薬を透析により除去し、溶液を減圧下に濃縮した。カルボキシル基を、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを加えて活性化し、次にデキストランに対して１５Ｍ過剰のエチレンジアミンを滴下して、暗所にて１２時間室温で反応を進めた。溶液のｐＨを、その操作中、０．１Ｎ塩酸で５．０〜５．５に維持した。溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し、限外ろ過により濃縮した。アミノデキストラン上のアミノ基の数を、トリニトロベンゼンスルホン酸を用いて測定した（Ｂｕｂｎｉｓ ａｎｄ Ｏｆｎｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０７：１２９−１３３，１９９２；Ｓａｓｈｉｄｈａｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６７：１２１−１２７，１９９４；Ｈａｂｅｅｂ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：６５４−６６０，１９６６）。アミノ基の数に基づくと、８０％が、インドキシルホスフェート化合物の結合のために用いることができる。図９に示されているように、４部の５−カルボキシペンチル２’−シアノエチル５’’−ブロモ−３’’−インドリルホスフェートと１部の５−カルボキシペンチル２’−シアノエチル５’’−ホスホエノールピルベート−３’’−インドリルホスフェートの混合物（すなわち、５つのプラットフォーム構築材料のうち１つが非可逆的酵素インヒビターである付加的分子構造を有する）をＤＭＳＯに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを室温で２時間加えることによりＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５１１３および５１１４にそれぞれ変換する。次に、活性エステルの溶液をアミノ−デキストランの溶液に滴下しつつ、反応混合物のｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウムで１時間にわたって７〜８に維持して、５１１５を得る。低分子量副生成物をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対する完全な透析により除去する。次に、溶液のｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウムにより１０まで上げてこのｐＨを１時間維持してシアノエチル基の除去を行なう。ｐＨを７．５に下げ、アミノ−デキストラン結合体上の残りのアミノ基の一部をＳ−アセチルチオ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させる。１００ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテートをＤＭＳＯに溶解し、これを１グラムの誘導体化アミノ−デキストランに滴下しながら、反応混合物のｐＨを７〜８に維持して、５１１６を生成する。反応後、試料をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対して一晩透析する。図９ｂに示されているように、５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）中の５０ｍｇのデキストラン結合体を０．５ｍｌのヒドロキシルアミン−ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）に混合し、２時間反応させて、Ｓ−アセチルチオアセチル側鎖からアセチル基を除去して５１１７を得て、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体標的剤上のヘテロ二機能剤に結合するための遊離スルヒドリル基を与える。８ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に溶解した１００ｍｇの抗ＥＧＦＲモノクロナール抗体５１１８を５ｍｇのＮ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステルと３０分間室温で反応させながら、ｐＨを０．１Ｎ水酸化ナトリウムで７〜７．５に維持して、５１１９を生成する。ＮＡＰ２５カラムを通すことによりタンパク質を反応物から分離する。５１１９の溶液を５１１７の溶液に加え、５１１７の濃度が３ｍｇ／ｍＬになるまで希釈する。２時間室温で反応を進めて、工程１試薬である５１２０を得る。反応混合物を冷リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対して一晩透析する。結合体をセファクリル３００クロマトグラフィーで評価する。同様な調製物は、２８０ｎｍでの吸収単位に基づくタンパク質−デキストラン結合体５１２０として６０〜９５％を示す。
【０１１８】
実施例２：トランスフェリン−アルブミン−ビス−３−インドキシルグリコシド−ロラカルベフ結合体の合成
工程１試薬を図１０に示す。細胞標的剤１１２０はヒトトランスフェリンであり；担体部分１２２０はヒト血清アルブミンであり；プラットフォーム構築材料１３２０は、カルバセフェムアナログであるロラカルベフの付加的分子構造１４２０を結合させた置換ビス−３−インドキシルグリコシド（例えば、グルコシドまたはガラクトシド）誘導体である。
【０１１９】
さらに図１０にあるように、標的細胞内にいったん入ると、第二実施例における工程１試薬は、ポリインジゴの会合体を結合させて微小沈殿物を形成することにより細胞内水不溶性ナノプラットフォーム１５２０を形成する。プラットフォーム構築材料はビスインドキシルリジン誘導体である。プラットフォーム構築材料の一部または全てとして、付加的分子構造１４２０が挙げられ、これは、工程３二特異的試薬の標的部分である変異β−ラクタマーゼの非可逆的インヒビターであるロラカルベフの誘導体である。これらのビスインドキシルリジンプラットフォーム構築材料は、プラットフォーム構築材料のアミノ酸骨格（リジンまたはリシルグルタミン酸）中のカルボキシル基により、ヒト血清アルブミンである担体部分１２２０上のアミノ基に結合する。がん細胞１００上のトランスフェリンレセプター１０１ｂに結合するヒトトランスフェリンである標的剤１１２０を、ヘテロ二機能リンカー分子によりヒト血清アルブミン担体複合物に結合させる。この例において、プラットフォーム構築材料の重合性基はインドキシルグリコシドであり、リジンに対する結合はインドキシル環上の５位の置換基による。工程１試薬のこの第２実施例の合成は下記のように進みうる：図１１に示されるように、アセトニトリルに溶解したＮ−アセチル−５−ベンジルオキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−オン５２０１は０℃で１時間ｔ−ブトキシドカリウムと反応させて、次にアセトニトリルに溶解したアセトブロモガラクトースまたはアセトブロモグルコースを加えて、４時間、０℃で反応させて、１−アセチル−３−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトシドキシ）−５−ベンジルオキシインドール５２０２または１−アセチル−３−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−ガラクトシドキシ）−５−ベンジルオキシインドールを得る。活性炭担持１０％パラジウムおよび大気圧での水素を用いる接触水素化によりベンジル基を除去して５２０３を得た。５２０３上の遊離ヒドロキシル基をベンジルブロモアセテートと反応させて５２０４を得た。活性炭担持１０％パラジウムを用いる接触水素化によりベンジル基を除去して５２０５を得て、次にカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびジシクロヘキシルカルボジイミドを有する活性エステルに変換して５２０６を得た。活性エステル化合物５２０６をベンジル−Ｌ−リジン上の各アミノ基と反応させて、ビスペンタアセチルインドキシルガラクトシド−Ｌ−リジンまたはビスペンタアセチルインドキシルグルコシド−Ｌ−リジンのベンジルエステルを得た。活性炭担持１０％パラジウムおよび大気圧での水素を用いる接触水素化によりベンジル保護基を除去した。メタノール中のナトリウムエトキシドによるエステル交換によりアセチル保護基を除去して、ビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジン５２０７またはビスインドキシルグルコシル−Ｌ−リジンを得た。
【０１２０】
図１２に示されるように、プラットフォーム構築材料上の付加的分子構造として用いられる非可逆的酵素インヒビターは抗生物質ロラカルベフ５２１０である。最初に、ロラカルベフ５２１０を、保護グルタミン酸５２０８から調製されたＮα−ＢＯＣ−Ｏα−ベンジル−Ｏγ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルグルタメート５２０９と反応させて、ロラカルベフ−グルタメート結合体５２１１を得た。ロラカルベフ−グルタメート結合体５２１１上のカルボキシル基を、フェニルアセトキシメチルヨウ化物５２１２を用いてフェニルアセトキシメチルエステル５２１３として保護した。ＢＯＣ保護基をトリフルオロ酢酸により除去して、フェニルアセトキシメチルエステル５２１４を得た。ロラカルベフの誘導体５２１４を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびジシクロへキシルカルボジイミドと（５２０７、図１１）の反応から調製されたビスインドキシルガラクトシルリジン５２１５またはビスインドキシルグルコシル−Ｌ−リジンの活性エステルと反応させて、ロラカルベフ−ビスインドキシルガラクトシルリジン誘導体５２１６またはロラカルベフ−ビスインドキシルグルコシルリジン誘導体を得た。活性炭担持１０％パラジウムおよび大気圧下での水素を用いる接触水素化によりベンジル基を除去して、担体部分に結合させるために調製された非可逆的酵素インヒビターを有するプラットフォーム構築材料である５２１７を得た。
【０１２１】
複数のプラットフォーム構築材料を、図１３に示されるように担体部分（ヒト血清アルブミン）に付着させて、プラットフォーム構築材料の腫瘍への送達を高めた。わずかに１つのロラカルベフ結合部位が、得られるインジゴポリマー水不溶性ナノプラットフォーム上の５インジゴユニットごとに必要とされることが分かったので、プラットフォーム構築材料を、１（ロラカルベフ−ビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジン誘導体）に対して４（ビスインドキシガラクトシル−Ｌ−リジン）の比率でアルブミン担体部分に付着させた。同様な結合体を、グリコシド誘導体を用いて調製した。図１３に示されているように、ヒト血清アルブミン担体部分上の８０％のアミノ基を修飾することができる量を合計した２プラットフォーム構築材料を、４対１の比率で混合し、ＤＭＳＯに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを加えて活性化し、これを２〜４時間室温で進めて５２１８および５２１９をそれぞれ得た。ヒト血清アルブミンの溶液（リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中２０ｍｇ／ｍＬ）を、２プラットフォーム構築材料５２１８および５２１９の活性エステル溶液の滴下中、１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ７〜８に維持した。添加後、反応をさらに１時間室温で続けた。また、アルブミン上の８０％のアミノ基を修飾するためにロラカルベフ−リシル−ビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジン誘導体の活性エステルを用いて結合体を調製した。反応副産物はリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対する完全な透析により除去して、ヒト血清アルブミン担体部分−プラットフォーム構築材料結合体５２２０の溶液を得た。類似の担体結合体をロラカルベフ−リシル−ビスインドキシルグルコシル−Ｌ−リジン誘導体を用いて作った。０．５Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７〜８に維持しながら、２５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテートをＤＭＳＯに溶解し、これをアルブミン結合体の溶液に滴下した。反応後、溶液をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対して一晩透析して、５２２１の溶液を得た。
【０１２２】
透析後、１０００ユニットのペニシリンＧアシラーゼを加え、溶液を３７℃で一晩インキュベートし、ロラカルベフ側鎖（付加的分子構造）からフェニルアセチルメチル保護基を除去した。ヒドロキシルアミンを室温で加えることによりアセチル基をＳ−アセチルチオアセチル側鎖から除去して５２２２を得て、ヒトトランスフェリン細胞標的剤上のヘテロ二機能性剤に結合するための遊離スルヒドリル基を与える。ｐＨを７．０〜７．５に維持しながら、ヒトトランスフェリン（２００ｍｇ）を８ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に溶解し、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（１２ｍｇ）に反応させた。３０分間後、修飾ヒトトランスフェリン５２２３を、ＮＡＰ２５カラムを用いて反応物から分離した。マレイミジル基５２２３を有するヒトトランスフェリンを、アルブミン−プラットフォーム構築材料結合体５２２２と、各タンパク質に対して３ｍｇ／ｍＬの最終希釈で混合した。タンパク質から、工程１試薬である結合体５２２４を２時間、室温で形成させ、タンパク質溶液をリン酸緩衝塩溶液に対して４℃で一晩透析した。工程１試薬５２２４はセファクリル２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により特性付けた。典型的には、９０〜９５％のトランスフェリンおよびアルブミンは２８０ｎｍでのピーク吸収から予想されるように結合体化していた。インドキシルグリコシド誘導体を有する工程１試薬も調製した。
【０１２３】
実施例３：フォレート−免疫グロブリン−ポルフィリン−α−ジフルオロメチルオルニチン結合体の合成
工程１試薬を図１４に示す。この例において、工程１試薬１０３０は、葉酸誘導体である細胞標的剤１１３０；ヒト免疫グロブリンである担体部分１２３０；オルニチンデカルボキシラーゼ酵素の非可逆的インヒビターであるα−ジフルオロメチルオルニチンアナログ（Ｍｅｔｃａｌｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１００：２５５１−２５５３，１９７８）である付加的分子構造１４３０を付着させた適当なポルフィリン誘導体であるプラットフォーム構築材料１３３０から構成される。あるいは、類似するシステムは、アルギニンデカルボキシラーゼ酵素の非可逆的インヒビターであるα−ジフルオロメチルアルギニンである付加的分子構造を使用し得る。
【０１２４】
図１４に示されるように、工程１試薬は、工程１試薬から遊離したポルフィリンプラットフォーム構築材料の凝集により細胞内水不溶性ナノプラットフォーム１５３０を形成する。プラットフォーム構築材料はポルフィリン誘導体である。プラットフォーム構築材料の一部または全ては、工程３二特異的試薬の標的部分であるオルニチンデカルボキシラーゼ酵素の非可逆的インヒビターであるα−ジフルオロメチルオルニチンアナログ（Ｍｅｔｃａｌｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１００：２５５１−２５５３，１９７８）である付加的分子構造１４３０を含む。これらのポルフィリン誘導体プラットフォーム構築材料は、葉酸である細胞標的剤に付着させた担体部分であるヒト免疫グロブリンに付着させる。
【０１２５】
工程１試薬の合成は以下のように進む：図１５に示されるように、ポルフィリン誘導体の合成は、Ｊ．Ｌｉｎｄｓｅｙと彼の同僚により概説された操作に従う（Ｌｉｔｔｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：１３９１−１３９６，１９９９；Ｒａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：７３２３−７３４４，２０００）。ピロールおよび４−メチルベンズアルデヒドの混合物はアルゴン雰囲気下でトリフルオロ酢酸と反応して、５−（４−メチルフェニル）ジピロメタン５３０１を生成しうることが経験的に分かっている。臭化マグネシウムエチルの溶液をトルエン中の５−（４−メチルフェニル）ジピロメタン５３０１の冷却溶液にゆっくりと加え、さらに３０分間の反応後に、トルエン中の塩化ｐ−トルオイルの溶液を１０分間にわたって加えて、１，９−ビス（４−メチルベンゾイル）−５−（４−メチルフェニル）ジピロメタン５３０２を得る。上記と類似する反応を用いて、ピロールおよび４−カルボキシベンズアルデヒドの混合物をトリフルオロ酢酸と反応させて５−（４−カルボキシルフェニル）ジピロメタン５３０３を得ることができる。少量の水素化ホウ素ナトリウムを、テトラヒドロフラン／メタノール（３：１）中の１，９−ビス（４−メチルベンゾイル）−５−（４−メチルフェニル）ジピロメタン５３０２の溶液に滴下して、ジカルビノール５３０４を作る。ジカルビノール５３０４および５−（４−カルボキシフェニル）ジピロメタン５３０３を等モル量でアセトニトリルに溶解し、トリフルオロ酢酸と５分間反応させた後に２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ）による酸化を行って、５−（４−カルボキシフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−メチルフェニル）ポルフィリン５３０５を得る。
【０１２６】
第２ポルフィリン誘導体を、工程３二特異的試薬に結合するための付加的分子構造として非可逆的酵素インヒビターを結合するための付加的官能基を用いて構築する。図１６に示されるように、ピロールおよび４−アセトアミドベンズアルデヒドの混合物をアルゴン雰囲気下でトリフルオロ酢酸と反応させて５−（４−アセトアミドフェニル）ジピロメタン５３０６を得る。臭化マグネシウムエチルの溶液を、トルエン中の５−（４−アセトアミドフェニル）ジピロメタン５３０６の冷却溶液にゆっくりと加え、さらに３０分間の反応後に、トルエン中の塩化ｐ−トルオイルの溶液を１０分間にわたって加えて、１，９−ビス（４−メチルベンゾイル）−５−（４−アセトアミドフェニル）ジピロメタン５３０７を得る。少量の水素化ホウ素ナトリウムを、テトラヒドロフラン／メタノール（３：１）中の１，９−ビス（４−メチルベンゾイル）−５−（４−アセトアミドフェニル）ジピロメタン５３０７の溶液に滴下して、ジカルビノール５３０８を作る。ジカルビノール５３０８および５−（４−カルボキシフェニル）ジピロメタン５３０３（その合成は上記の通りである）を等モル量でアセトニトリルに溶解し、トリフルオロ酢酸と５分間反応させた後にＤＤＱによる酸化を行って、５−（４−アセトアミドフェニル）−１０，２０−ビス（４−メチルフェニル）−１５−（４−カルボキシフェニル）ポルフィリン５３０９を得る。アセチル保護基をメタノール中のナトリウムメトキシドにより除去して５３１０を得て、これをｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させて、マレイミジル置換ポルフィリン５３１１を得て、葉酸−ヒト免疫グロブリン−ポルフィリン結合体が調製された後に、α−ジフルオロメチルオルニチンアナログである非可逆的酵素インヒビターを結合するための適当な側鎖を提供する。
【０１２７】
図１７に示されるように、ポリフィリン誘導体、４部の５−（４−カルボキシフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−メチルフェニル）ポリフィリン５３０５（図１５）および１部のマレイミジルポルフィリン誘導体５３１１（図１６）の混合物をＤＭＳＯに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを用いてそれぞれの活性エステル５３１２および５３１３に変換する。１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを７〜８に維持しながら、ヒト免疫グロブリンをリン酸緩衝食塩水（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、次にタンパク質１モルあたり全５６モルの活性エステルを用いて、５３１２および５３１３の活性エステル溶液を１時間にわたって滴下して、ポルフィリン−免疫グロブリン結合体５３１４を得る。葉酸を、ジメチルスルホキシドに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドと１時間室温でインキュベートすることにより活性エステルに変換する。３０倍モル過剰の活性エステル溶液（Ｌａｅｍｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：５５７２−５５７６，１９９１）を、ポルフィリン−免疫グロブリン結合体５３１４に滴下しながら、１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて１時間、室温でｐＨを７〜８に維持して、葉酸−免疫グロブリン−ポルフィリン結合体５３１５を得る。非複合材料および試薬をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ６．０）に対する透析により除去する。葉酸−免疫グロブリン−ポルフィリン結合体５３１５のポルフィリン上のマレイミド基をα−ジフルオロメチルオルニチン５３２５のメルカプト誘導体（図１８）（その合成は下記に示す）と反応させて、腫瘍を有するホストに注入する準備のできた工程１試薬である付着非可逆的酵素インヒビター（付加的分子構造）５３１６を有し、葉酸標的ポルフィリンを有する免疫グロブリンを得る。
【０１２８】
α−ジフルオロメチルオルニチンのメルカプト誘導体を図１８に示されるように下記の通り調製する：アリルアルコール５３１７のテトラヒドロピラニルエーテルを、ｍ−クロロ過安息香酸を用いてエポキシド５３１８に酸化することができる。エポキシド環を水酸化アンモニウムで開環して、アミノアルコール誘導体５３１９を得て、その誘導体上のアミノ基を次にベンズアルデヒドによりシッフ塩基を形成することにより保護して、５３２０を得る。５３２０上のヒドロキシル基をリチウムジイソプロピルアミドと反応させながら、ドライアイス／アセトン浴で冷却した後、Ｓ−ベンジル−ｎ−プロピル臭化物を加えて、５３２１を得る。テトラヒドロピラニル基を酢酸と水で加水分解して５３２２を得て、次にヒドロキシル基を、塩化トシルを用いてトシル誘導体５３２３に変換する。メチルグリシン５３２６上のアミノ基を、ベンズアルデヒドを用いてシッフ塩基として保護して５３２７を得て、これを次にドライアイス／アセトン浴で冷却されたリチウムジイソプロピルアミドで処理した後にクロロジフルオロメタンと反応させて、グリシンの保護ジフルオロメチル誘導体５３２８を得る。ジフルオロメチル誘導体５３２８をリチウムジイソプロピルアミドと反応させながら、ドライアイス／アセトン浴で冷却した後、トシル誘導体５３２３を加えて保護オルニチン誘導体５３２４を得る。保護α−ジフルオロメチルオルニチン５３２４を１Ｎ塩酸による加水分解により脱保護して、メルカプト側鎖を有するオルニチン誘導体５３２５を得る。
【０１２９】
実施例４：フォルメート−ビス−３−インドキシルガラクトシド−ロラカルベフ結合体の合成
工程１試薬の例を図１９に示す。工程１試薬１０４０は、フォルメート誘導体である細胞標的剤１１４０、および変異β−ラクタマーゼの非可逆的インヒビターであるカルバセフェムアナログロラカルベフである付加的分子構造１４４０を付着させた置換ビス−３−インドキシルガラクトシド誘導体であるプラットフォーム構築材料１３４０から構成される。プラットフォーム構築材料を細胞標的剤に直接に付着させて、体内分布、循環および腫瘍侵入を向上させ、かつ潜在的な免疫原性を低減するのに十分に小さい低分子量工程１試薬を与える。
【０１３０】
図１９に示されるように、工程１試薬は、ポリインジゴの会合体を結合させて微小沈殿物を形成することにより細胞内水不溶性ナノプラットフォーム１５４０を形成する。プラットフォーム構築材料はビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジンである。プラットフォーム構築材料の一部または全ては、付加的分子構造１４４０であるロラカルベル−Ｌ−リシル基を含み、これは、工程３二特異的試薬の標的部分である変異β−ラクタマーゼの非可逆的インヒビターである。工程１試薬のこの第４実施例には、担体部分は存在せず、細胞標的剤１１４０は、プラットフォーム構築材料に直接付着させた葉酸誘導体である。葉酸結合体の適度な血漿レベルの４時間の維持は、１細胞あたり約７千万の結合体化分子を、１細胞あたり百万未満のレセプターを発現するがん細胞１００に送達することができ（Ｒｅｄｄｙ ａｎｄ Ｌｏｗ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒ．Ｓｙｓ．１５：５８７−６２７，１９９８）、葉酸レセプター１０１の迅速なターンオーバーが存在することを示す（図１）。
【０１３１】
工程１試薬の合成は下記の通り進む：図２０に示されるように、ビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジン５２０７は上記のように調製され、ジメチルスルホキシドに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスルシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを用いて活性エステル５２１５に変換する。活性エステル５２１５は過剰なエチレンジアミンと反応して、アミノ誘導体５４０１を作る。プテロイン酸５４０２は、そのカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスルシンイミドおよびジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて活性エステルに変換させることができ、その後のグリシルグリシンのベンジルエステルの付加によりグリシルグリシル付加物５４０３を得る。活性炭担持１０％パラジウムおよび水素を用いた接触水素化によるベンジル保護基の除去後に、カルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドにより活性エステル５４０４に変換する。次に、活性エステル５４０４を５４０１と反応させて、腫瘍細胞上の標的葉酸レセプターのために付着させたプテロイル標的剤を有するビスインドキシルガラクトシル誘導体５４０５を得る。
【０１３２】
図２１は、付加的分子構造ロラカルベフが付着したビスインドキシルガラクトシルプラットフォーム構築材料を調製する合成を示す。Ｎα−ＦＭＯＣ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−リジン５４０６はプテロイル−グリシル−グリシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５４０４と反応して、５４０７が得られる。ＦＭＯＣ保護基を塩基により５４０７から除去して５４０８を得て、ビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５２１５（図２０）と反応してＬ−リシル−Ｌ−リシル−グリシル−グリシル誘導体５４０９を得ることができる。ベンジル保護基を、活性炭担持１０％パラジウムと大気圧下での水素を用いる接触水素化により除去して、５４１０を得る。次に、５４１０上のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを用いて活性エステル５４１１に変換する。
【０１３３】
図２２に示されるように、ロラカルベフ５２１０上のカルボキシル基を、（ベンジルフェノンヒドラジンおよび酸化第二水銀）から調製されたビフェニルジアゾメタンを用いてベンズヒドリル基により保護して５４１２を得る。カルボキシル保護５４１２は活性エステル（５４１１、図２１）と反応して、５４１３が得られる。活性炭担持１０％パラジウムおよび水素を用いる接触水素化によるベンズヒドリル基の除去は、（付加的分子構造として）ロラカルベフを有するプテロイル標的プラットフォーム構築材料５４１４が得られる。５４０５（図２０）および５４１４（図２２）の混合物の注入により、フォルメートレセプターが２つの誘導体を腫瘍細胞に大量に内部移行することを可能とし（Ｒｅｄｄｙ ａｎｄ Ｌｏｗ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒ．Ｓｙｓ．１５：５８７−６２７，１９９８）、細胞内で、ガラクトシル基は酵素により加水分解され、得られたインドキシルは二量体化して、インジゴ誘導体を形成する。よって、ビスインドキシルガラクトシルプラットフォーム構築材料はポリインジゴ細胞内水不溶性ナノプラットフォームをもたらし、そのナノプラットフォーム上で、ロラカルベフ側鎖は工程３二特異的試薬の結合のための付加的分子構造として付着し、ロラカルベフ側鎖は５４１４から生じたプラットフォーム構築材料の１つが成長ポリマーに取り込まれるときはいつでも取り込まれる。
【０１３４】
実施例５：ＥＧＦ−ＨＰＭＡ−インドキシルガラクトシド−ロラカルベフ結合体の合成
工程１試薬を図２３に示す。工程１試薬１０５０は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）である細胞標的剤１１５０、および置換インドキシルインドキシルガラクトシド誘導体１３５５をその表面に付着させたＨＰＭＡの合成ポリマーであるプラットフォーム構築材料１３５０から構成され、さらにその表面に変異β−ラクタマーゼの非可逆的インヒビターであるカルバセフェムアナログのロラカルベフである付加的分子構造１４５０を有する。図２３に示されるように、工程１試薬は標的細胞１００に内部移行し、ＨＰＭＡプラットフォーム構築材料１３５０の表面上のインドキシル置換基１３５５はインジゴを形成し、その結果として、ＨＰＭＡプラットフォフォーム構築材料を架橋して細胞内水不溶性ナノプラットフォーム１５５０を形成する。
【０１３５】
工程１試薬は、ＨＰＭＡの表面に付着したインドキシル側鎖の二量体化により形成したインジゴ基を用いて、プラットフォーム構築材料であるＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）ポリマーを架橋することにより細胞内水不溶性ナノプラットフォームを形成する。ＨＰＭＡプラットフォーム構築材料として、工程３二特異的試薬の標的部分である変異β−ラクタマーゼの非可逆的インヒビターである付加的分子構造（ロラカルベフの誘導体）が挙げられる。ロラカルベフは、ＨＰＭＡの表面に付着させたインドキシルガラクトシド側鎖から分離側鎖としてＨＰＭＡの表面に付着する。付着インドキシルガラクトシド側鎖および付着ロラカルベフ側鎖を有するＨＰＭＡポリマーを、細胞標的剤上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を付着させることにより標的として、完全な工程１試薬を得る。
【０１３６】
図２４に示されるように、ＨＰＭＡポリマーは、インドキシルガラクトシド５５０３を含むモノマー単位およびアクリル酸のｐ−ニトロフェニルエステル５５０４であるモノマー単位を共重合することにより調製する。アクリル酸−インドキシルガラクトシドモノマー単位に関して、アクリル酸をジクロロへキシルカルボジイミドによりＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５５０１に変換し、２−（３−β−Ｄ−ガラクトシドキシ−インドール−５−オキシ）酢酸のエチレンジアミン誘導体５５０２と反応させて、インドキシルガラクトシドアクリレートモノマー単位５５０３を得る。アクリル酸を、ｐ−ニトロフェノールおよびジシクロへキシルカルボジイミドを用いてアクリル酸−ｐ−ニトロフェニルエステル５５０４に変換する。インドキシルガラクトシドおよび反応性ｐ−ニトロフェニルエステル基を含むポリマー前駆体をＫｏｐｅｃｅｋおよび彼の同僚（Ｏｍｅｌｙａｎｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．５２：２５−３７，１９９８）により記載されたように、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を開始剤として用いて、１０モル％のアクリル酸−インドキシルガラクトシドモノマー単位５５０３、２０モル％アクリル酸ｐ−ニトロフェニルエステルモノマー単位５５０４およびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）をアセトン／ジメチルスルホキシド中で、５０℃、２４時間を共重合することにより調製し、ポリマー中間体５５０５を得る。ロラカルベフはポリマー中間体５５０５のｐ−ニトロフェニルエステル基の一部と反応して、５５０６が得られる。５５０６上の残りのｐ−ニトロフェニルエステルはＥＧＦと反応して、ロラカルベフ付加分子構造５５０７を有するＥＧＦ標的ポリマーが得られる。
【０１３７】
実施例６：ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ−ストレプトアビジン結合体の合成
工程３二特異的試薬の標的部分はＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ酵素である。同位元素捕捉部分は、工程４試薬である放射標識ビオチン誘導体に結合するストレプトアビジンである。
【０１３８】
図３５に概要を示すように、大腸菌株ＪＬＭ１６から容易に単離される酵素ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ５１３０（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：１０６３８−１０６４５，１９９４）はＳ−アセチルチオ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応する。０．５Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７〜７．５に維持しながら、チオ酢酸エステルをＤＭＳＯに溶解し、一定分量ずつリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中のタンパク質に加える。反応を１時間進行させた後、修飾タンパク質５１３１を冷リン酸緩衝液に対して一晩透析する。０．５Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７〜７．５に維持しながら、ストレプトアビジン５１３３をマレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルにより３０分間活性化する。修飾タンパク質５１３４を、ＮＡＰ２５カラムを用いるクロマトグラフィーにより反応物から分離する。Ｓ−アセチルチオアセテート修飾ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ５１３１をヒドロキシルアミンに２時間曝してアセチル保護基を除去して５１３２を得て、次にカラムからのストレプトアビジン溶液５１３４を反応混合物に加えて、タンパク質からチオエーテル結合による結合体を形成させる。タンパク質を２時間反応させた後、溶液を冷リン酸緩衝塩溶液（ｐＨ７．２）に対して透析する。結合体をセファクリルＳ−３００に通して、未結合タンパク質から結合体を分離して、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ−ストレプトアビジン工程３二特異的試薬５１３５を得る。
【０１３９】
実施例７：変異β−ラクタマーゼ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合体の合成
工程３二特異的試薬の標的部分は変異β−ラクタマーゼである。工程３二特異的試薬の適当な同位元素捕捉部分を図２６に概略する（例えば、酵素的触媒作用により放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドを放射標識水不溶性生成物１３１Ｉ−５，５’−ジヨードインジゴに変換することのできるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）。
【０１４０】
工程３二特異的試薬を、組換え生物学を用いて融合タンパク質として調製した。タンパク質発現ベクターは、β−ラクタマーゼＥ１６６ＡおよびＥ１６６Ｎ変異体とのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ融合物の生成のために構築した。Ｅ１６６ＡおよびＥ１６６Ｎ β−ラクタマーゼ変異体は、ｕｎｇ−ｄｕｔ−突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２，１９８７）を用いて構築した一方で、Ｅ１６６Ｎ変異体はオーバーラップ伸長ＰＣＲ（Ｈｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９，１９８９）を用いて構築した。
【０１４１】
２つの異なるベクターを用いて、β−Ｄ−ガラクトシダーゼとβ−ラクタマーゼ変異体との融合物を作り出した。１つの系はファージディスプレイプラスミドｐＴＰ１４５を用いて構築した（Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２５１：１８７−１９７，２０００）（図３６）。このプラスミドの重要な特徴は、独自のＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が、シグナル配列の下流にあるβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）中に前もって設計されたということである（Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２５８：６８８−７０３，１９９６）。このことにより、ＳａｌＩ部位での挿入遺伝子により遺伝子融合物を構築することができる。しかし、このプラスミドはタンパク質の発現のためには設計されていないので、幾つかの付加的な変化が必要とされた。バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩ配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化によりｐＴＰ１４５から除去して、１３６５塩基対（ｂｐ）ＤＮＡフラグメントを遊離させた。酵素により作られた５’突出を、ｄＮＴＰおよびクレノウＤＮＡポリメラーゼによる処理により平滑末端とした。図３６に見られるように、プラスミドをＤＮＡリガーゼにより再環状化してプラスミドｐＣ３を作り出した。次に、ｌａｃＺ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ｂｌａ遺伝子に存在するＳａｌＩ部位に挿入して、プラスミドｐＬａｃＣ３中に遺伝子融合を作り出した。このプラスミドを大腸菌に導入し、これらの細胞における発現融合タンパク質の存在を、抗β−ラクタマーゼ抗体を用いる免疫ブロット法により確認した。最後に、ｂｌａ変異を導入して、Ｅ１６６Ａ置換とＥ１６６Ｎ置換を作り出して、ｐＬａｃＺｂｌａＥ１６６プラスミドを作り出した（図３６）。ＤＮＡ配列決定を実施して、ＤＮＡ配列が正しいことを裏付けた。
【０１４２】
第２の発現系は、市販のプラスミドｐＡＸ４ａ＋（ＭｏＢｉＴｅｃ，Ｉｎｃ．）を用いて開発した。図３７に見られるように、このプラスミドは目的のタンパク質をｌａｃＺ遺伝子に特異的に融合させるために開発された。ｌａｃＺ遺伝子を、β−Ｇａｌタンパク質と目的の融合タンパク質との間のスペーサーとしてコラーゲン領域をコードする配列に融合させる。Ｅ１６６Ｎ変異体をコードするｂｌａ遺伝子はＰＣＲで増幅し、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限酵素フラグメントとして挿入してｂｌａＥ１６６−ｐＡＸ４ａ＋プラスミドを作り出した。ＤＮＡ配列決定を実施して、ｂｌａ遺伝子が他の変異を含まないこと、および融合配列が正確であることを裏付けた。このプラスミドを大腸菌に導入し、タンパク質の発現を抗β−ラクタマーゼ抗体を用いる免疫ブロット法により実証した。これらの大腸菌の調製用増殖により変異β−ラクタマーゼ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ工程３二特異的試薬をアフィニティークロマトグラフィーにより単離することが可能となった。
【０１４３】
実施例８：４−カルボキシベンズアルデヒドにより修飾されたオルニチンデカルボキシラーゼの合成
工程３二特異的試薬の標的部分はオルニチンデカルボキシラーゼ酵素である。同位元素標的部分は、ヒドラジド誘導体である放射標識水溶性工程４試薬およびヒドラゾンの形成により共有結合することのできる反応性有機官能基（アルデヒド基）を有する小有機分子の４−カルボキシベンズアルデヒドである。
【０１４４】
工程３二特異的試薬の調製（図３８）は、反応性有機官能基（アルデヒド基）を有する小有機分子の４−カルボキシベンズアルデヒド５３３０を、工程３二特異的試薬の標的部分であるオルニチンデカルボキシラーゼ５３３２酵素上のアミノ酸残基の一部に、酵素の酵素活性に影響を与えることなく、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として付加させることをともなう。テレフタルアルデヒド酸（４−カルボキシベンズアルデヒド５３３０）をジメチルスルホキシドに溶解し、これを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドにより２時間活性化して５３３１を得る。１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて反応物のｐＨを７〜７．５に維持しながら、オルニチンデカルボキシラーゼをリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、活性化４−カルボキシベンズアルデヒド５３３１を含む反応混合物を１００μＬずつ加える。反応後、タンパク質溶液を４℃にてリン酸緩衝食塩水（ｐＨ６．５）中で透析して、低分子量試薬を除去する。
【０１４５】
実施例９：変異β−ラクタマーゼ−抗ＮＩＰ抗体結合体の合成
工程３二特異的試薬の標的部分は変異β−ラクタマーゼである。同位元素捕捉部分は、抗ＮＩＰモノクローナル抗体の結合部位により認識されるハプテン構造１３１Ｉ−６−ニトロ−２−ヨードフェノール（１３１Ｉ−ＮＩＰ）を含有する放射標識水溶性工程４試薬に結合することのできる抗ＮＩＰモノクローナル抗体である。
【０１４６】
ＮＩＰ等の構造に対する適当なモノクローナル抗体は最先端のモノクローナル抗体技術により容易に調製される。そのような抗体からの一本鎖結合領域に対応する遺伝子を調製し、それらを上記の実施例７で論じたように融合タンパク質の産生において変異β−ラクタマーゼ遺伝子とともに使用する操作が開発された。ヒト化抗体を調製し、処置に使用されるそのようなタンパク質に対する免疫応答を低減するマウス抗体で開発された高い親和結合部位を用いることができる技術も開発された。さらに、配列技術を用いて、特定の抗原に対して高い特異性を有するヒト抗体を単離するための方法が実施された。したがって、工程３二特異的試薬に用いられる適切な抗体を作る多数の方法が存在する。図３９に示されるように、０．５Ｎ水酸化ナトリウムで３０分間ｐＨを７〜７．５に維持しながら、抗ＮＩＰモノクローナル抗体５４３３がマレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルと反応できることが経験的に分かっている。修飾タンパク質５４３４を、ＮＡＰ２５カラムを通すことにより試薬から分離する。０．５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを７〜７．５に維持しながら、ＤＭＳＯ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテートの溶液を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の変異β−ラクタマーゼ５４３０の溶液に少しずつ加える。タンパク質溶液５４３１をリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して４℃で透析する。ヒドロキシルアミンの溶液をラクタマーゼ溶液５４３１に加え、２時間反応させて、アセチル保護基を除去して５４３２を得て、次にマレイミジル修飾抗ＮＩＰ抗体溶液５４３４を加えて、２タンパク質を２時間反応させる。溶液を冷リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して４℃で一晩透析する。セファクリルＳ−３００クロマトグラフィーを用いてラクタマーゼ−抗体結合体５４３５をモノマータンパク質から分離して、変異β−ラクタマーゼ−抗ＮＩＰ抗体工程３二特異的試薬５４３５を得る。
【０１４７】
実施例１０：変異β−ラクタマーゼ−アルカリホスファターゼ結合体の合成
工程３二特異的試薬の標的部分は変異β−ラクタマーゼである。工程３二特異的試薬の同位体元素捕捉部分は、酵素触媒反応により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートを放射標識水不溶性生成物１３１Ｉ−５，５’−ジヨードインジゴに変換するアルカリホスファターゼ酵素である。
【０１４８】
図４０に示されるように、０．５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを７〜７．５に３０分間維持しながら、変異β−ラクタマーゼ５５３３はマレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルと反応する。修飾タンパク質５５３４をＮＡＰ２５カラムに通すことにより試薬から分離する。０．５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを７〜７．５に維持しながら、ＤＭＳＯ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテートの溶液を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中のアルカリホスファターゼ５５３０の溶液に少しずつ加える。タンパク質溶液５５３１をリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して４℃で透析する。ヒドロキシルアミンの溶液をアルカリホスファターゼ溶液５５３１に加え、２時間反応させてアセチル保護基を除去して５５３２を得て、次にマレイミジル修飾変異β−ラクタマーゼ溶液５５３４を加えて、２タンパク質を２時間反応させる。溶液を冷リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して４℃で一晩透析する。ラクタマーゼ−アルカリホスファターゼ結合体５５３５を、セファクリルＳ−３００を用いてモノマータンパク質から分離して、工程３二特異的試薬５５３５である変異β−ラクタマーゼ−アルカリホスファターゼを得る。
【０１４９】
実施例１１：９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡの合成
放射標識水溶性工程４試薬の合成の概要を図４１に示す。既に、抗ＥＧＦ抗体−デキストラン−３−インドキシルホスフェート−ホスホエノールピルベート工程１試薬を用いて、付加的分子構造１４００としてインジゴの会合体からなる細胞内ナノプラットフォームを、それらの表面上のホスホエノールピルベート誘導体１４１３とともに作った。この細胞内ナノプラットフォームは、細胞外ナノプラットフォーム１６００を形成する工程２殺細胞試薬および／または天然のがん細胞死滅の作用によりがんの細胞外空間に再配置された。工程３二特異的試薬２０１０であるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ２１１３−ストレプトアビジン２２１３結合体の投与により、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ標的部分２１１３を、細胞外ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００としてその非可逆的酵素インヒビターホスホエノールピルベート誘導体１４１３に共有結合させることにより細胞外ナノプラットフォームに共有結合させることが可能であり、これによってストレプトアビジン同位元素捕捉部分２２１３を細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着させた。放射標識水溶性工程４試薬９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡ８００３の投与により、細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着させたストレプトアビジン同位元素捕捉部分２２１３上の４結合部位の幾つかに対するビオチン部分の結合を介して非常に高い親和性を有する結合ができるようになるので、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達するための微小領域照射野（ホットスポット）を作るために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に放射標識水溶性工程４試薬９０Ｙ放射同位元素を捕捉する。
【０１５０】
９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡ５１４３の合成の概略を図４２に示す。ＤＯＴＡ５１４０（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸）上のカルボキシル基の１つを、Ｎ−（５−アミノペンチル）ビオチンアミド５１４１と反応してビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡ５１４２（Ｋａｒａｃａｙ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８：５８５−５９４，１９９７）を形成することのできるＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１２：３２０−３２４，２００１）として活性化する。９０ＹＣｌ３に曝すことにより、分子に９０Ｙ放射性同位元素を固く結合したキレートとして積み込んで、放射標識水溶性工程４試薬９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡ５１４３を得る。
【０１５１】
実施例１２：１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドの合成
放射標識水溶性工程４試薬の合成の概略を図４３に示す。既に、トランスフェリン−ヒト血清アルブミン−ビス−３−インドキシルグリコシド−ロラカルベフ工程１試薬を用いて、付加的分子構造としてポリインジゴの会合体からなる細胞内ナノプラットフォームを、それらの表面上のロラカルベフ基とともに作った。この細胞内ナノプラットフォームは、細胞外ナノプラットフォーム１６００を形成する工程２殺細胞試薬および／または天然のがん細胞死滅の作用によりがんの細胞外空間に再配置された。工程３二特異的試薬変異β−ラクタマーゼ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ２０２０の投与により、変異β−ラクタマーゼ標的部分２１２３を、細胞外ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００としてその非可逆的インヒビターロラカルベフ１４２３に共有結合させることにより、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ同位体捕捉部分２２２４を細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合させる。放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド８００４の投与により、細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着させたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ同位元素捕捉部分２２２４に接触させ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ同位体元素捕捉部分２２２４の触媒作用により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド８００４からガラクトシジル基を切断して１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルを遊離させ、これは迅速に酸化二量体化を受けて、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達するための微小領域照射野（ホットスポット）を作るために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に捕捉される放射標識水不溶性生成物１３１Ｉ−５，５’−ジヨードインジゴ８００５を形成する。
【０１５２】
１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド５２４３の合成の概略を図４４に示す。アセチル保護５−ブロモ−３−インドキシルガラクトシド５２４０を、還流トルエン中でビス（トリブチルスズ）およびパラジウムテトラキストリフェニルホスフィンで処理して、トリブチルスズ誘導体５２４１を得て、これをＮａ１３１ＩおよびＮ−クロロスクシンイミドで処理して、アセチル保護放射標識１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド５２４２を得た。メタノール中のナトリウムメトキシドによるアセチル保護基の除去により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド５２４３を得る。
【０１５３】
実施例１３：１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジドの合成
放射標識水溶性工程４試薬の合成の概要を図４５に示す。既に、葉酸−ヒト免疫アルブミン−ポリフィリン−α−ジフルオロメチルオルニチン工程１試薬を用いて、付加的分子構造としてポルフィリンの会合体からなる細胞内ナノプラットフォームを、それらの表面上のα−ジフルオロメチルオルニチン基とともに作った。続いて、この細胞内ナノプラットフォームを、細胞外ナノプラットフォーム１６００を形成する工程２殺細胞試薬および／または天然のがん細胞死滅の作用によりがんの細胞外空間に再配置させた。付着ベンズアルデヒド基２２３１を有するオリニチンデカルボキシラーゼ２１３３である工程３二特異的試薬２０３０の投与により、オルニチンデカルボキシラーゼ標的部分２１３３を、細胞外ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００としてその非可逆的インヒビターα−ジフルオロメチルオルニチン１４３３と共有結合することにより細胞外ナノプラットフォーム１６００と共有結合することが可能であるので、ベンズアルデヒド基同位体元素捕捉部分２２３１を細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着させた。放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジド８０００の投与により、ヒドラゾン７０００として、ヒドラジド基８００１を介して細胞外水不溶性ナノプラットフォーム１６００に付着したベンズアルデヒド基同位元素捕捉部分２２３１と共有結合するので、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達するための微小領域照射野（ホットスポット）を作るために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に放射標識水溶性工程４試薬放射同位元素を捕捉する。
【０１５４】
１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジド５３４５の合成の概略を図４６に示す。メチル−ｐ−ヨードベンゾエート５３４０はヒドラジンと反応してｐ−ヨード安息香酸ヒドラジド５３４１を得る。次に、ヒドラジドを、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボネートを用いてｔ−Ｂｏｃ誘導体５３４２として保護する。ヨード基を、還流トルエン中でビス（トリブチルスズ）およびパラジウムテトラキストリフェニルホスフィンを用いて置換して、トリブチルスズ誘導体５３４３を得て、これをＮａ１３１ＩおよびＮ−クロロスクシンイミドで処理してｔ−Ｂｏｃ保護放射標識１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジド５３４４を得る。トリフルオロ酢酸によるｔ−Ｂｏｃ保護基の除去により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジド５３４５を得ることができる。
【０１５５】
実施例１４：１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸の合成
放射標識水溶性工程４試薬の合成の概要を図４７に示す。既に、フォルメート−ビス−３−インドキシルガラクトシド−ロラカルベフ工程１試薬を用いて、付加的分子構造としてポリインジゴの会合体から構成される細胞内ナノプラットフォームを、それらの表面上のロラカルベフ基とともに作った。続いて、この細胞内ナノプラットフォームを、細胞外ナノプラットフォーム１６００を形成する工程２殺細胞試薬および／または天然のがん細胞死滅の作用によりがんの細胞外空間に再配置させた。工程３二特異的試薬２０４０変異β−ラクタマーゼ−抗ＮＩＰ抗体の投与により、細胞外ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００として変異β−ラクタマーゼ標的部分２１４３をその非可逆的インヒビターロラカルベフ１４４３により共有結合させることにより細胞外ナノプラットフォーム１６００に共有結合させて、抗ＮＩＰ抗体同位元素捕捉部分２２４５を細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合させる。抗ＮＩＰ抗体に対する放射標識ハプテンである放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸８００５（１３１Ｉ−ＮＩＰ酸）の投与により、抗ＮＩＰ抗体同位元素捕捉部分２２４５と高親和性をもって結合するので、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達するための微小領域照射野（ホットスポット）を作るために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に放射標識水溶性工程４試薬放射同位元素を捕捉させる。
【０１５６】
１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸５４４４（１３１Ｉ−ＮＩＰ酸）の合成の概略を図４８に示す。当然のことながら、４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸５４４０（ＮＩＰ酸）上のカルボキシ基とフェノール基は、塩化メチレン中のイソブチレンおよび硫酸を用いるｔ−ブチル基の結合により保護して５４４１を生じる。ヨード基を、還流トルエン中でビス（トリブチルスズ）およびパラジウムテトラキストリフェニルホスフィンを用いて置換して、トリブチルスズ誘導体５４４２を得て、これをＮａ１３１ＩおよびＮ−クロロスクシンイミドで処理してｔ−ブチル保護放射標識１３１Ｉ−放射標識ＮＩＰ酸５４４３を得る。トリフルオロ酢酸による保護基の除去により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸（１３１Ｉ−ＮＩＰ酸）５４４４を得ることができる。
【０１５７】
実施例１５：１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートの合成
放射標識水溶性工程４試薬の合成の概要を図４９に示す。既に、ＥＧＦ−ＨＰＭＡ−３−インドキシルガラクトシド−ロラカルベフ工程１試薬を用いて、付加的分子構造として、（ジッパーのような）インジゴ基により架橋されたＨＰＭＡポリマーからなる細胞内ナノプラットフォームを、それらの表面上のロラカルベフ基とともに作った。続いて、この細胞内ナノプラットフォームを、細胞外ナノプラットフォーム１６００を形成する工程２殺細胞試薬および／または天然のがん細胞死滅の作用によりがんの細胞外空間に再配置させた。工程３二特異的試薬２０５０変異β−ラクタマーゼ−アルカリホスファターゼの投与により、細胞外ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００として変異β−ラクタマーゼ標的部分２１５３をその非可逆的インヒビターロラカルベフ１４５３へ共有結合させることにより細胞外ナノプラットフォーム１６００に共有結合させて、アルカリホスファターゼ同位元素捕捉部分２２５６を細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合させる。放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェート８００６の投与により、細胞外水不溶性ナノプラットフォーム１６００に付着するアルカリホスファターゼ同位元素捕捉部分２２５６に接触させ、アルカリホスファターゼ同位元素捕捉部分２２５６の触媒作用により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェート８００６からリン酸基を切断して１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルを遊離し、これは迅速に酸化二量体化を受けて、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達するための微小領域照射野（ホットスポット）を作るために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に捕捉される放射標識水不溶性生成物１３１Ｉ−５，５’−ジヨードインジゴ８００５を形成する。
【０１５８】
１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェート５５４３の合成の概略を図５０に示す。ベンジル保護５−ブロモ−３−インドキシルホスフェート５５４０を、還流トルエン中でビス（トリブチルスズ）およびパラジウムテトラキストリフェニルホスフィンで処理して、トリブチルスズ誘導体５５４１を得て、これをＮａ１３１ＩおよびＮ−クロロスクシンイミドで処理して、ベンジル保護放射標識１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェート５５４２を得た。トリフルオロ酢酸によるベンジル保護基の除去により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェート５５４３を得た。
等価物
本発明の特定の実施形態の前記の詳細な説明から、独自の組成物が記載されてきたことが明らかであるに違いない。特定の実施形態が本明細書中において詳細に開示してきたが、これは例示のみの目的のために一例としてなされたものであり、添付の下記請求の範囲に関する限定を意図するものではない。特に、多様な置換、変更および改良が、請求の範囲に定義される発明の精神と範囲から逸脱することなく本発明に対して行なってよいことが本発明により意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、レセプターを有するがん細胞を表す説明図である。
【図２】図２は、工程１試薬を表す説明図である。
【図３】図３は、がん細胞におけるステップ１試薬の蓄積を表す説明図である。
【図４】図４は、がん細胞における水不溶性ナノプラットフォームの形成を表す説明図である。
【図５】図５は、がん細胞におけるナノプラットフォームの継続的な蓄積を表す説明図である。
【図６】図６は、工程１試薬の第１実施例についての工程１試薬を表す説明図である。
【図７】図７は、リンカー分子によるブロモ−インドキシルホスフェートの合成を表す説明図である。
【図８】図８は、工程１試薬の第１実施例についての非可逆的酵素インヒビターによるプラットフォーム構築材料の合成を表す説明図である。
【図９】図９は、工程１試薬の第１実施例についてのプラットフォーム構築材料の結合体化を表す説明図である。
【図９ｂ】図９は、工程１試薬の第１実施例についてのプラットフォーム構築材料の結合体化を表す説明図である。図９ｂ：工程１試薬の第１実施例に関する工程１試薬。
【図１０】図１０は、第２実施例に関する工程１試薬を表す説明図である。
【図１１】図１１は、工程１試薬の第２実施例についてのプラットフォーム構築材料に対するビス−インドキシルの合成を表す説明図である。
【図１２】図１２は、工程１試薬の第２実施例についての非可逆的酵素インヒビターを有するプラットフォーム構築材料の合成を表す説明図である。
【図１３】図１３は、工程１試薬の第２実施例についてのプラットフォーム構築材料の結合体化を表す説明図である。図１３ｂ：工程１試薬の第２実施例に関する工程１試薬。
【図１３ｂ】図１３は、工程１試薬の第２実施例についてのプラットフォーム構築材料の結合体化を表す説明図である。図１３ｂ：工程１試薬の第２実施例に関する工程１試薬。
【図１４】図１４は、工程１試薬の第３実施例についての工程１試薬を表す説明図である。
【図１５】図１５は、工程１試薬の第３実施例についてのプラットフォーム構築材料に対するポルフィリン誘導体の合成を表す説明図である。
【図１６】図１６は、工程１試薬の第３実施例についての非可逆的酵素インヒビターによるプラットフォーム構築材料の合成を表す説明図である。
【図１７】図１７は、工程１試薬の第３実施例についての工程１試薬を表す説明図である。
【図１８】図１８は、工程１試薬の第３実施例についての非可逆的酵素インヒビター誘導体の合成を表す説明図である。
【図１９】図１９は、工程１試薬の第４実施例についての工程１試薬を表す説明図である。
【図２０】図２０は、工程１試薬の第４実施例についての、細胞標的剤によるプラットフォーム構築材料の合成を示す説明図である。
【図２１】図２１は、工程１試薬の第４実施例についての、細胞標的剤によるプラットフォーム構築材料の合成および非可逆的酵素インヒビターに対する位置を表す説明図である。
【図２２】図２２は、工程１試薬の第４実施例についての工程１試薬の合成を表す説明図である。
【図２３】図２３は、工程１試薬の第５実施例についての工程１試薬を表す説明図である。
【図２４】図２４は、工程１試薬の第５実施例についての工程１試薬の合成を表す説明図である。
【図２５】図２５は、工程２細胞殺滅プロセス表す説明図である。
【図２６】図２６は、工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図２７】図２７は、工程３二特異的試薬をナノプラットフォームに固定するヒドラゾンの形成を表す説明図である。
【図２８】図２８は、工程３二特異的試薬をナノプラットフォームに固定するチオエーテルの形成を表す説明図である。
【図２９】図２９は、非可逆的酵素インヒビターに共有結合した工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３０】図３０は、特異的抗体を介してナノプラットフォームに結合した工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３１】図３１は、ヒドラジドである工程４試薬を結合する工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３２】図３２は、非可逆的酵素インヒビターである工程４試薬を結合する工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３３】図３３は、高親和性レセプターを介して工程４試薬を結合する工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３４】図３４は、インドキシルガラクトシドをインジゴ誘導体に変換する酵素を同位体捕捉部分として有する工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３５】図３５は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼおよびストレプトアビジンから構成される工程３二特異的試薬の合成を表す説明図である。
【図３６】図３６は、β−ラクタマーゼ変異体についてのプラスミドの調製を表す説明図である。
【図３７】図３７は、工程３試薬である変異β−ラクタマーゼ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼについてのプラスミドの調製を表す説明図である。
【図３８】図３８は、工程３二特異的試薬であるアルデヒド側鎖を有するオルニチンデカルボキシラーゼ（すなわち、オルニチンデカルボキシラーゼ−４−カルボキシベンズアルデヒド）の調製を表す説明図である。
【図３９】図３９は、工程３二特異的試薬である変異β−ラクタマーゼ−抗ＮＩＰ抗体の調製を表す説明図である。
【図４０】図４０は、工程３二特異的試薬である変異β−ラクタマーゼ−アルカリホスファターゼの調製を表す説明図である。
【図４１】図４１は、工程４試薬の第１実施例の調製を表す説明図である。
【図４２】図４２は、工程４試薬として用いられる９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡの調製を表す説明図である。
【図４３】図４３は、工程４試薬の第２実施例の調製を表す説明図である。
【図４４】図４４は、工程４試薬として用いられる１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドの調製を表す説明図である。
【図４５】図４５は、工程４試薬の第３実施例の調製を表す説明図である。
【図４６】図４６は、工程４試薬として用いられる１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジドの調製を表す説明図である。
【図４７】図４７は、工程４試薬の第４実施例の調製を表す説明図である。
【図４８】図４８は、工程４試薬として用いられる１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸（１３１Ｉ−ＮＩＰ酸）の調製を表す説明図である。
【図４９】図４９は、工程４試薬の第５実施例の調製を表す説明図である。
【図５０】図５０は、工程４試薬として用いられる１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートの調製を表す説明図である。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はがんの処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
現在、がん処置のかなりの部分の世界的な研究努力は多様な細胞殺傷剤によるがん細胞の死滅にささげられている。放射活性化合物等の多数の医薬ががん細胞を殺滅することができることが示されてきた事実にもかかわらず、（１）それら薬剤はすべてのがん細胞に対する細胞毒特異性を示さないので、すべてのがん細胞を殺滅しない、（２）それら薬剤はがん細胞に対してだけに細胞毒特異性を示さないので正常な細胞も殺滅し、（３）それら薬剤は、許容可能な用量において耐性がん細胞を殺滅するためか、または細胞殺傷剤に順応して耐性となるがん細胞の能力を克服するためには十分な効力がないという３つの普遍的な現在の障害を回避することができないために、これら薬剤はがんをうまく処置できないことが多い。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要約）
本発明は、がんを処置するための組成物および方法を提供する。本発明の方法は、ホットスポットと呼ばれる、実質的にすべてのがんに対する局所的な致死線量を超える放射線照射に関する多段階の処置法である。
【０００４】
一つの局面において、本発明は、プラットフォーム構築材料に結合（例えば、共有結合）させた細胞標的剤を含有する工程１試薬を提供する。プラットフォーム構築材料は、細胞、例えばがん細胞への細胞標的剤の取り込みの際に該標的剤から切り離される。細胞標的剤からいったん切り離されたプラットフォーム構築材料は水不溶性となり、ナノプラットフォームを形成する。任意に、細胞標的剤は担体部分によりプラットフォーム構築材料に連結される。本発明の多様な局面において、プラットフォーム構築材料は、第２試薬、すなわち工程３試薬に特異的に結合することのできる付加的分子構造を有する。
【０００５】
細胞標的剤は細胞による試薬の取り込みを増強するもので、ポリペプチド、細胞表面リガンド、ペプチドまたは小分子である。ポリペプチドは、例えば、ＥＧＦレセプター抗体またはトランスフェリンレセプター抗体等の抗体、上皮細胞増殖因子またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ ＴＡＴタンパク質、（ＨＩＶ）１ ＴＡＴタンパク質の機能的に効果のある部分、またはＶＰ２２等のウイルスタンパク質である。細胞表面リガンドは、例えばトランスフェリン、上皮細胞増殖因子またはインターロイキンである。
【０００６】
ペプチドは、例えば、オキシトキシン、成長ホルモン放出ホルモン、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、ソマトスタチン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン、インシュリン、成長ホルモンまたはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド（ＲＧＤ）等のペプチドホルモンである。
【０００７】
小分子は、例えば、エストロゲン、カルシフェロールまたはテストステロン等のホルモン、核酸、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、ニコチン性アセチルコリンレセプターアゴニストまたは葉酸またはそのアナログまたは誘導体である。
【０００８】
プラットフォーム構築材料は、例えば、インドキシル、ポルフィリン、ＨＰＭＡ誘導体等のポリマー、デンドリマー、オピオ−メラニン（ｏｐｉｏ−ｍｅｌａｎｉｎ）、または多糖類、例えばデキストラン、アラビアゴム、セルロースまたはキチンである。インドキシルは、例えば、置換インドキシル、すなわち、モノ−インドキシル、ビス−インドキシルまたはポリインドキシルである。インドキシルはインジゴ、直鎖インジゴポリマーまたはポリインジゴ格子を形成する。
【０００９】
担体部分は、例えば、タンパク質；多糖；ポリマー、例えば、合成ポリマーまたはバイオポリマー、例えば、ポリリジン；デンドリマー；リポソーム；ナノ粒子；または高分子ミセルである。
【００１０】
例示的な工程１試薬としては、置換された３−インドキシルホスフェート誘導体に連結された抗ＥＧＦレセプター抗体、その誘導体またはそのフラグメントが挙げられる。抗体は、デキストラン等の担体部分により３−インドキシルホスフェート誘導体に連結される。さらに、ホスホエノールピルベート誘導体等のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼインヒビターが３−インドキシルホスフェート誘導体に連結される。
【００１１】
トランスフェリンポリペプチドまたはそのフラグメンは、グリコシド、例えば、ガラクトシド、グルコシドまたはグルクロニドまたはその誘導体に連結された。好ましくは、グリコシドは置換ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体である。トランスフェリンポリペプチドは、アルブミンポリペプチドまたはそのフラグメント等の担体部分によりグリコシドに連結される。さらに、変異β−ラクタマーゼインヒビターがビス−β−インドキシルグリコシド誘導体に連結される。変異β−ラクタマーゼインヒビターはカルバセフェムアナログ等のラクタム誘導体である。カルバセフェムアナログは、例えば、ロラカルベフである。
【００１２】
フォルメート誘導体は、ポルフィリン誘導体に連結された。葉酸誘導体は、免疫グロブリンポリペプチドまたはそのフラグメント等の担体部分によりポルフィリン誘導体に連結される。さらに、オルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、例えば、α−ジフルオロメチルオルニチンまたはアルギニンデカルボキシラーゼインヒビター、例えば、α−ジフルオロメチルアルギニンがポルフィリン誘導体に連結される。
【００１３】
フォルメート誘導体は、置換ビス−３−インドキシルガラクトシド誘導体に連結された。さらに、変異β−ラクタマーゼインヒビターが置換ビス−３−インドキシルガラクトシド誘導体に連結される。
【００１４】
表皮細胞増殖因子ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＨＰＭＡに連結された。さらに、置換インドキシルガラクトシド誘導体または変異βラクタマーゼインヒビターがＨＰＭＡに連結される。
【００１５】
本発明のさらに別の局面は、標的部分および同位元素捕捉部分を含有する二特異的試薬である工程３試薬を提供する。標的部分および同位元素捕捉部分は、例えば共有結合している。標的部分はナノプラットフォームに結合できる。例えば、標的部分はナノプラットフォーム上の付加的分子構造に結合する。同位元素捕捉部分は放射標識水溶性工程４試薬を捕捉することができる。
【００１６】
標的部分または同位元素捕捉部分は、ヒドラジン、ケトン、メルカプタンまたはマレイミジル等の有機官能基；ポリペプチド；ペプチド；またはレクチンである。ポリペプチドは、β−ラクタマーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ等の酵素；変異β−ラクタマーゼ等の変異酵素；または抗体またはそのフラグメントである。
【００１７】
例示的な工程３試薬として、ストレプトアビジンに連結されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼに連結された変異β−ラクタマーゼ、４−カルボキシベンズアルデヒドに連結されたオルニチンデカルボキシラーゼまたはアルギニンデカルボキシラーゼ、抗ＮＩＰ抗体に連結された変異β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼに連結された変異β−ラクタマーゼが挙げられる。
【００１８】
本発明の別の局面は工程１試薬および工程３試薬を含む１つ以上の容器に包装されたキットを提供する。任意に、キットは、工程２細胞殺傷剤および／または放射標識水溶性工程４試薬を含む。例示的な工程４試薬として、９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡ、１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド、１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジン、１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸および１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートが挙げられる。
【００１９】
（ａ）プラットフォーム構築材料に例えば共有結合させた細胞標的剤を含有する工程１試薬；（ｂ）標的部分および同位元素捕捉部分を含有する工程３試薬；および（ｃ）放射標識水溶性工程４試薬を被験体に投与することにより、がんを処置し、がんの症状を緩和する。細胞標的剤は細胞による工程１試薬の取り込みを増強する。プラットフォーム構築物質は、工程１試薬の細胞への取り込みの際に、細胞標的剤から分離され、工程３試薬の標的部分が結合する水不溶性ナノプラットフォームを形成する。工程３試薬の同位元素捕捉部分は、放射標識水溶性工程４試薬を、微小領域照射野（ホットスポット）を作って致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に供給するために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に捕捉する。
【００２０】
これら試薬は順次投与される。あるいは、これら試薬は同時に投与される。任意に、工程２細胞殺傷剤を工程３試薬の前、その後または同時に被験体に投与して、ナノプラットフォームを腫瘍細胞外マトリックスに再配置する。
【００２１】
１つの局面において、（ａ）３−インドキシルホスフェート誘導体に連結されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼインヒビターを有する置換された３−インドキシルホスフェート誘導体に連結された、抗ＥＧＦレセプター抗体、その誘導体またはフラグメントを含む組成物；（ｂ）ストレプトアビジンに連結されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼを含む組成物；および（ｃ）９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡを含む組成物を被験体に投与することによりがんを処置するか、またはがんの症状を緩和する。
【００２２】
別の局面において、（ａ）ビス−３−インドキシルグルコシド誘導体に連結された変異β−ラクタマーゼインヒビターを有する置換ビス−３−インドキシルグルコシル誘導体に連結された、トランスフェリンポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物；（ｂ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼに連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物；および（ｃ）１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドを含む組成物を被験体に投与することによりがんを処置するか、またはがんの症状を緩和する。
【００２３】
さらなる局面において、（ａ）ポルフィリン誘導体に連結された、オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターまたはアルギニンデカルボキシラーゼインヒビターのいずれかにを有するポルフィリン誘導体に連結されたフォルメート誘導体を含む組成物；（ｂ）４−カルボキシベンズアルデヒドに連結された、オルニチンデカルボキシラーゼまたはアルギニンデカルボキシラーゼインヒビターを含む組成物；および（ｃ）１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジドを含む組成物を被験体に投与することによりがんを処置するか、またはがんの症状を緩和する。
【００２４】
さらなる別の局面において、（ａ）ビス−３−インドキシルガラクトシド誘導体に連結された変異β−ラクタマーゼインヒビターを有する置換ビス−３−インドキシルガラクトシド誘導体に連結されたフォルメート誘導体を含む組成物；（ｂ）抗ＮＩＰ抗体に連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物；および（ｃ）１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸（１３１Ｉ−ＮＩＰ酸）を含む組成物を被験体に投与することによりがんを処置するか、がんの症状を緩和する。
【００２５】
別の形態において、（ａ）ＨＰＭＡに連結された置換インドキシルガラクトシド誘導体およびＨＰＭＡに連結された変異βラクタマーゼインヒビターを有するＨＰＭＡに連結された、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物；（ｂ）アルカリホスファターゼに連結されたβ−ラクタマーゼを含む組成物；および（ｃ）１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートを含む組成物を被験体に投与することによりがんを処置するか、またはがんの症状を緩和する。
【００２６】
被験体は、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタおよびフェレット等の哺乳動物である。被験体はがんに罹患している。がんは、例えば、乳がん、皮膚がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、肝臓がん、子宮頸がん、脳腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、または胃がんである。がんに罹患している被験体は、当該分野で公知の方法、例えば、理学的検査；ＰＳＡ等の特定のがん抗原に対する血液試験；ＭＲＩ；Ｘ線；またはマンモグラフィにより同定される。がんの症状として、疲労；悪心；頻尿；体重減少；乳房または精巣のしこりまたは肥厚；いぼまたは母斑の変化；治らない皮膚の痛みまたは持続性の咽頭炎；腸または膀胱習慣の変化；持続性の咳または咳嗽血；一定の消化不良または嚥下困難；異常な出血または膣分泌物；インフルエンザ様症状；挫傷；めまい；眠気；異常な眼球運動または視力変化が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
他に定義しない限り、ここで用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。ここに記載の方法および材料と類似物または等価物は本発明の実施または試験に用いることができるが、適当な方法および材料を以下に説明する。ここに挙げられたすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、本明細書中においてその全文が参考と援用される。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【００２８】
本発明の他の特徴と利点は以下の詳細な説明と請求の範囲から明らかになるだろう。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、局部照射の送達による被験体のがん細胞の不均質集団を処置する組成物および方法を提供する。本発明は、放射性ヨウ化物による甲状腺がんの非常に成功した処置の観察に一部基づく。甲状腺がんの成功した処置は、一部には、多くの悪性甲状腺細胞はヨウ素を捕捉することが可能であるという独特の生物学的機能を有するという事実による。従って、甲状腺がんの患者を放射性ヨウ化物で処置する場合、十分な比率のがん細胞は十分な量の放射性同位元素を吸収し、微小領域中のすべての細胞が殺される強烈な照射（「ホットスポット」と称される）が重なる微小領域を作るのに十分に長く放射性同位元素を蓄積する。これらのホットスポットのそれぞれの照射野は、放射性同位元素を取り込む細胞を超えて広がり、何千もの隣接細胞を殺滅する。これらのホットスポット内では放射線が非常に強いために、ホットスポット内において、放射線同位元素を吸収しない細胞を含んだすべてのがん細胞が死滅し、全腫瘍の根絶を可能とする。体内では、他のどの組織または細胞群もこれと同じヨウ素捕捉機構を有さないので、ホットスポットは正常および悪性の甲状腺組織のみに作られる。本発明の方法および組成物は、これらの放射性同位元素送達および捕捉の条件を非甲状腺がんに再現する。非甲状腺がんでの「ホットスポット」の発生は、顕著な全身毒性を引き起こすことなく実質的に腫瘍のみに重なるホットスポットを作る多段階プロセスである。これらの重なるホットスポット内のすべてのがん細胞は根絶される。根絶される細胞として、標的ではないがん細胞、耐性があり、超耐性でもあるがん細胞、および別な方法で処置に順応し、耐性となり得るがん細胞が挙げられる。したがって、本発明の方法は、がん細胞の不均質性および現在のがん標的剤の不完全な性質により阻止されることはない。
【００３０】
図１に示されるように、がんは、がん細胞１００の集団を含み、各細胞はがん細胞に特異的であって細胞標的剤に結合することのできる内在化構造１０１を有する。内在化構造１０１は、標的剤がそれらに結合するときに内在化することができる。標的化されたがん細胞の亜集団は、被験体の天然の系により死滅する高い感受性および／または実施される提供された細胞殺滅プロセスにより死滅する高い感受性も有する。
がんの処置方法
被験体に複数の試薬を複数の工程で投与することによりがんが処置されるか、がんの症状が緩和される。すべての種類のがんが処置に適する。処置されるがんとして、例えば、肺がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、膀胱がん、皮膚がん（例えば、黒色腫）、卵巣がん、子宮頸がん、頭部および頸部のがん、血液がん、肺がん、結腸／直腸／肛門がん、子宮頸がん、脳腫瘍、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、子宮がん、骨がん、食道がん、眼がん、カポジ肉腫、喉頭がん、口唇がん、上咽頭がん、中咽頭がん、口腔がん、精巣がん、甲状腺がん、肉腫、リンパ腫、副腎皮質がん、胆管がん、気管支がん、原発不明がん、胆嚢がん、生殖細胞がん、下咽頭がん、膵島細胞がん、中皮腫、多発性骨髄腫、鼻腔がん、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、唾液腺がん、小腸がん、胸腺がん、尿管がん、尿道がん、膣がん、外陰がんおよびウィルムス腫瘍が挙げられる。
【００３１】
被験体は哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシである。工程は連続して施される。任意に、１つ以上の工程が別の工程の前または同時に施される。各工程は少なくとも一回施される。あるいは、各工程は２、３、４、５、１０、１５回以上または連続した注入で施される。 例えば、工程２試薬は、当技術分野で知られている標準的な処置手順を用いて反復投与で施される。プラットフォーム構築材料に連結された細胞による試薬の取り込みを増強する細胞標的剤を含む試薬（本明細書中において工程１試薬という）；任意の細胞殺傷剤（本明細書中において工程２試薬という）；水不溶性ナノプラットフォームに結合可能な標的部分および同位元素捕捉部分を含む二特異的試薬（本明細書中において工程３試薬という）；および放射標識水溶性試薬（本明細書中において工程４試薬という）が被験体に投与される。
【００３２】
図２に示されるように、工程１試薬１０００は、細胞標的剤１１００、任意の担体部分１２００および付加的分子構造１４００を任意に取り付けられたプラットフォーム構築材料１３００を含む。図３に示されるように、工程１試薬の細胞標的剤部分１１００はがん細胞の標的内在化構造１０１に付着することにより、工程１試薬１０００をがん細胞１００内に輸送させる。がん細胞内への輸送により、工程１試薬は細胞内環境に曝される。図４に示されているように、標的細胞内にいったん入ると、細胞内環境によって、任意に取り付けられた付加的分子構造１４００を有するプラットフォーム構築材料１３００は標的剤１１００および担体部分１２００から切り離され、これによってプラットフォーム構築材料１３００を、標的がん細胞内で水溶性ナノプラットフォーム１５００に変換させることができる。（付加的分子構造１４００を有するか、有さない）水不溶性ナノプラットフォーム１５００は標的がん細胞内で安定であり、比較的無毒性である。安定であるということは、ナノプラットフォームが、１日間、２日間、３日間、４日間、６日間以上から１週間、２週間、３週間、４週間以上、がん細胞に捕捉されたままであるか、または細胞外マトリックスに取り囲まれたままであることを意味する。比較的無毒性であるとは、ナノプラットフォームが被験体に対して顕著な有害な効果を有さない、例えば、被験体に対して中程度または最小限の炎症を起こすか、および／または生命を脅かす効果を持たないことを意味する。付加的分子構造を有するか、または有さない水不溶性ナノプラットフォームは、ここでは「ナノプラットフォーム」と称する。
【００３３】
細胞内ナノプラットフォームの蓄積は、ステップ１試薬の被験体への投与を続けることによって達成され、その結果、より多くのプラットフォーム構築材料が標的がん細胞中に輸送される（図５を参照）。可溶性の化学物質または医薬とは対照的に、細胞内ナノプラットフォームは水不溶性で安定であるために標的がん細胞から離れないので時間とともに蓄積する。
【００３４】
図２５に示されているように、標的がん細胞におけるナノプラットフォームの蓄積に続いて、被験体に、工程２細胞殺傷剤７５が任意に投与される。工程２細胞殺傷剤は標的がん細胞の一部または全てを殺滅することができ、ナノプラットフォーム１５００が腫瘍の細胞外の空間に再配置され、保持される。いったん細胞外空間に出ると、ナノプラットフォーム１６００の表面上の付加的分子構造１４００は工程３二特異的試薬に接近して結合する。体の天然の免疫系による継続的ながん細胞の殺滅またはがん細胞が自発的に死滅することを引き起こすがん細胞の遺伝的な不安定さが、十分な細胞内ナノプラットフォームを腫瘍の細胞外空間に再配置させて全腫瘍を破壊するための十分な数のホットスポットを最終的に作るのに十分である場合、工程２殺細胞試薬は任意である。ホットスポットの位置のがん特異性は非常に低いレベルの工程２試薬の適用により高められるので、あるとしてもごく僅かの正常な細胞が殺されるだけで、全身毒性は避けられる。
【００３５】
第４工程は、放射性同位元素が工程３二特異的試薬により捕捉され、保持される細胞外の腫瘍マトリックスに放射性同位元素を運ぶように適合させた放射標識水溶性工程４試薬の投与をともなう。これは、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達する微小領域の放射野を作る。
【００３６】
多くの例では、工程間の２４〜４８時間の休息時間は、引き続く工程の試薬を投与する前に既に投与された試薬の広範なクリアランスを任意に可能とするだろうが、除去剤を投与して過剰な試薬の除去を促進する。例えば、工程２殺細胞試薬および工程３二特異的試薬の投与前に、除去剤を投与して、取り込まれていない工程１試薬の除去を促進する。同様に、工程４試薬の投与前に除去剤を投与して、細胞外ナノプラットフォームに結合しなかった工程３二特異的試薬の除去を促進する。除去剤は、被験体のマクロファージによる治療剤の認識を補助し、肝細胞によるプロセシングを増大する。除去剤は当該分野で公知である。除去剤として、工程１試薬か工程３試薬に結合するマンノシル化剤またはガラクトシル化剤が挙げられる。付加的な除去剤として、マクロファージまたは他のリンパ球による試薬のオプソニン化を増強する、工程１試薬か工程３試薬に対して作られた抗体が挙げられる。あるいは、これらの試薬を除去するためにアフィニティーカラムを用いて体外循環を確立する。
工程１試薬
工程１試薬は、プラットフォーム構築材料に連結された細胞標的剤を含む水溶性化合物である。
【００３７】
細胞標的剤は、化合物中に存在して化合物を所望の細胞目標に向けさせる化合物である。細胞標的剤は細胞内に移行することができる。細胞標的剤は、腫瘍細胞上の飲食作用レセプターまたは他の内部移行性ユニットに特異的に結合する。例えば、細胞標的剤は、典型的には食作用性ではなく、架橋またはキャッピングのプロセスにより内部に移行する化合物である。よって、細胞標的剤は、化合物に原形質膜を通過するように指令し、例えば、細胞の外側から、原形質膜を通過させて細胞質に入るように指令する。もしくは、またはそれに加えて、細胞標的剤は化合物を、細胞内の所望の位置、例えば、核、リボソーム、小胞体、リソソームまたはペルオキシソームに方向付けることができる。細胞標的剤として、抗体等のポリペプチド；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ＴＡＴタンパク質またはＶＰ２２等のウイルスタンパク質：細胞表面リガンド；ペプチドホルモン等のペプチド；またはホルモンまたは葉酸等の小分子が挙げられる。細胞標的剤に対するレセプターは正常細胞に比較して腫瘍細胞上に高濃度で発現するのが最適である。例えば、レセプターは、非腫瘍細胞に比較して、腫瘍細胞上で２、３、４、５倍またはそれ以上の濃度で発現する。
【００３８】
本明細書中において使用される「抗体」という用語は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性のある部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子をいう。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーまたはそれらから設計されたポリペプチドが挙げられる。適当な抗体として、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦＲ）等のよく特性付けられたレセプターに対する抗体ならびに他のレセプター、例えばインターロイキン４レセプター（ＩＬ−４Ｒ）、インシュリンレセプター、ＣＤ３０、ＣＤ３４およびＣＣＫ−Ａ、Ｂ、Ｃ／ガストリンレセプター等に対する抗体が挙げられる。さらに、抗体はムチンエピトープ；糖ペプチドおよび糖脂質、例えば（胸、結腸および肺のヒトのがんの多くに存在する）Ｌｅｙ関連エピトープ；ヒアルロナンレセプター／ＣＤ４４；ＢＣＧエピトープ；インテグリンレセプター；ＪＬ−１レセプター；ＧＭ１または他の脂質ラフト関連分子；および黒色腫上のＧＤ２に対して特異的である。がん特異的内在化ヒト抗体はＰｏｕｌらにより記載されたようにファージライブラリーからも選択される（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０１：１１４９−１１６１，２０００）。
【００３９】
細胞表面リガンドは、標的がん細胞上の内在化構造に対して特異的であるように適合した天然リガンドまたは一部の合成類似物である。例示的な細胞表面リガンドとして、トランスフェリン、上皮細胞増殖因子、インターロイキン類、インテグリン類、アンジオテンシンＩＩ、インシュリン、増殖因子アンタゴニスト、β−２−アドレナリン様リセプターリガンドまたはドーパミン放出タンパク質が挙げられる。例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）は上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を標的とするのに使用され、またはトランスフェリン（Ｔｆ）はトランスフェリンレセプターを標的とするのに使用される（例えば、ＴｆＲおよびＴｆＲ２）。
【００４０】
適当なペプチド細胞標的剤として、オキシトシン、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、成長ホルモン（ソマトトロピン）、インシュリン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンまたはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド等のペプチドホルモンが挙げられる。内面化レセプターに結合し、内在化するペプチドを同定する方法は当分野で知られている（Ｈａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４６８−１２４７４，１９９４）。
【００４１】
細胞標的剤として小分子が挙げられる。ここで使用される「小分子」は、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成を言及することとする。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機または無機の分子である。例えば、小分子は、エストロゲン、テストステロンおよびカルシフェロール等のホルモン；葉酸、または葉酸レセプターに結合するアナログ；ニコチン性アセチルコリンレセプターアゴニスト；またはオリゴヌクレオチドレセプターアゴニストである。
【００４２】
細胞標的剤は公知の膜転位配列から得られる。例えば、輸送ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＶ）１ＴＡＴタンパク質からの配列を含む。このタンパク質は、例えば、それぞれが本明細書中に参考として援用される米国特許第５，８０４，６０４号および同第５，６７４，９８０号に説明されている。細胞標的剤はＴＡＴタンパク質を作る全８６アミノ酸の一部または全てである。例えば、細胞への取り込み、および任意に細胞核への取り込みを示す８６個未満のアミノ酸を有するＴＡＴタンパク質の機能的に効果的なフラグメントまたは部分が使用される。細胞への侵入と取り込みを仲介する領域を含むＴＡＴペプチドはさらに公知の技術を用いて定義することができる。例えば、Ｆｒａｎｋｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８６：７３９７−７４０１（１９８９）を参照されたい。
【００４３】
天然に存在するＨＩＶ ＴＡＴタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、天然に存在するＴＡＴタンパク質に存在す少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失および／または置換により修飾して、修飾ＴＡＴタンパク質（本明細書中においてＴＡＴタンパク質とも称する）を作ることができる。増加または減少した安定性を有する修飾ＴＡＴタンパク質またはＴＡＴペプチドアナログは公知の技術を用いて作ることができる。一部の実施形態において、ＴＡＴタンパク質またはペプチドは、天然に存在するＴＡＴタンパク質またはその一部と実質的に類似であるが、同一ではないアミノ酸配列を含む。さらに、コレステロールまたは他の脂質誘導体をＴＡＴタンパク質に付加して、増加した膜溶解性を有する修飾ＴＡＴを作ることができる。
【００４４】
ＴＡＴタンパク質の変異体は工程１試薬の細胞内局在性を調節するために設計することができる。外から加えられる場合、そのような変異体を、ＴＡＴが細胞に入る能力が保持される（すなわち、変異ＴＡＴタンパク質またはペプチドの細胞への取り込みが天然に存在するＨＩＶ ＴＡＴに実質的に類似する）ように設計する。例えば、核局在化に重要と思われる基本領域の変更（例えば、Ｄａｎｇ ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８０１９−１８０２３（１９８９）；Ｈａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１１８１−１１８７（１９８９）；Ｒｕｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１−８（１９８９）を参照）はＴＡＴの、したがってプラットフォーム構築材料の細胞質配置または部分的に細胞質配置をもたらしうる。もしくは、ＴＡＴを保持するために、細胞質または他の成分または分画（例えば、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム小胞）に結合する配列をＴＡＴに導入することができ、プラットフォーム構築物質を細胞質または他の分画に導入して、ＴＡＴとプラットフォーム構築物質の取り込みの際の調節を付与する。
【００４５】
細胞標的部分の他の原料として、例えば、ＶＰ２２（例えばＷＯ９７／０５２６５； Ｅｌｌｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ ８８：２２３−２３３（１９９７）に記載）または非ウイルスタンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０６９１−１０６９５（１９９２））が挙げられる。
【００４６】
プラットフォーム構築材料は、細胞標的剤により細胞中に取り入れられたときに、細胞標的剤から分離され、水不溶性となる化合物である。水不溶性とは、水溶液中のナノプラットフォームの濃度が室温で０．０１ｍＭ未満であることを意味する。水溶液の濃度は、室温で、０．００１ｍＭ、０．０００１ｍＭ、０．００００１ｍＭ、または０．０００００１ｍＭ未満である。プラットフォーム構築材料は水不溶性ナノプラットフォームを自発的に形成する。もしくは、プラットフォーム構築材料は、さらなる化学反応の後に水不溶性ナノプラットフォームを形成する。化学反応として、例えば、内因性リソソーム酵素の作用、リソソームの酸性ｐＨ、他の細胞内酵素、細胞内の他の適当な領域内の他の条件、または細胞内の生物学的マクロ構造物への付着または挿入等、細胞環境内に存在する酵素または他の条件により促進される反応が挙げられる。
【００４７】
標的細胞内で細胞標的剤からいったん遊離されたプラットフォーム構築材料は、沈殿する分子状結合体を形成するか、または不溶性ポリマー、コロイド、蝋、オイル、または生物学的マクロ構造物に付着または挿入される物質等、他の水不溶性物質を形成する。例えば、ポリフィリン内でキレート化した適当な金属を有するか、有さないポルフィリン結合体は沈殿する分子結合体を自発的に形成する。さらに、インドキシルグリコシドは、水不溶性インジゴミクロ沈殿物を作り、ビス−インドキシルグリコシドは水不溶性ポリマーインジゴを作り、ポリ−インドキシルグリコシドは水不溶性インジゴイド格子を作る。
【００４８】
適当なプラットフォーム構築材料として、例えば、置換インドキシル；ポリフィリン；ＨＰＭＡ誘導体等のポリマー；デキストラン、アラビアゴムおよびキチン等の多糖；デンドリマー；およびオピオメラミンが挙げられる。
【００４９】
細胞標的剤はプラットフォーム構築材料に直接連結させる。もしくは、細胞標的剤を、例えば担体部分または架橋剤によりプラットフォーム構築材料に間接的に付着させる。この結合は共有性である。もしくは、この結合は非共有性である。この結合は、プラットフォーム構築材料が、細胞への内部移行後に細胞標的剤から引き離される（すなわち、分離される）ことを可能とするものである。例えば、結合は、（１）標的細胞内のリソソーム内に見られる細胞内酵素または酸性環境により切断されるか、（２）標的細胞内の他の環境内で酵素的または他の作用により放出されるか、および／または（３）標的細胞内の生物学的マクロ構造物に付着または挿入される。
【００５０】
担体部分は、さらに多くのプラットフォーム構築材料が、各細胞標的剤とともに標的がん細胞内に運ばれることを可能とする。担体部分として、例えば、血清アルブミン等のタンパク質；多糖、特に官能基を有するように修飾された多糖；ＨＰＭＡ誘導体等の合成ポリマーおよび共重合体；デンドリマー；ポリリジン等のポリペプチドを含む他のバイオポリマー；リポソーム；ナノ粒子；および高分子ミセルが挙げられる。（ａ）生物学的に適合性があり、（ｂ）複数のプラットフォーム構築材料が付着する多数の官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等）を有し；（ｃ）細胞標的剤を連結するための場所を有するどのような物質も担体部分として有用である。
【００５１】
任意に、得られた水不溶性ナノプラットフォームが続いて投与される工程３二特異的試薬に結合できる付加的分子構造を表すように、プラットフォーム構築材料は付加的分子構造を含有する。適当な付加的分子構造は、例えば、抗原エピトープ、新抗原エピトープ、タンパク質に結合するリガンド、ペプチドレクチン、またはコンビナトリアルケミストリーにより調製されたものを含む有機構造物が挙げられる。好ましくは、付加的分子構造は、ナノプラットフォーム上の付加的分子構造と、その後に投与される工程３二特異的試薬の標的部分との間で共有結合の形成を可能とする。
【００５２】
付加的分子構造の例：工程３試薬標的部分システムは、ナノプラットフォーム上の付加的分子構造が酵素の非可逆的インヒビターである場合に生じ、工程３二特異的試薬の標的部分は該酵素であり、非可逆的インヒビターが該酵素のアミノ酸残基の一つと共有結合を形成するために、工程３二特異的試薬を水不溶性ナノプラットフォームに共有結合させる。
【００５３】
もしくは、酵素は、酵素的反応が完了せず、基質が安定な結合体として修飾酵素に共有結合するようになるように特異的に修飾され、変更されているので、ナノプラットフォーム上の付加的分子構造は工程３二特異的試薬の標的部分である該酵素の非可逆的インヒビター基質である。そのような方法は当業者に知られている。記載される変異β−ラクタマーゼはそのような修飾酵素の一例である。
【００５４】
最適には、工程１試薬のプラットフォーム構築材料上の付加的分子構造として有用な非可逆的酵素インヒビターは、（１）非可逆的酵素インヒビターをプラットフォーム構築材料に結合させるために用いることのできる活性結合部分から離れた官能基；（２）細胞内および細胞外での循環血液中での相対的安定性；（３）付加的分子構造による担体部分と細胞標的剤へのプラットフォーム構築材料の付着中に、プラットフォーム構築材料の合成を含む工程１試薬の化学合成を容易にする安定的性質等の特性の１つ以上を有する。
【００５５】
例示的な酵素／非可逆的酵素インヒビターの対として、変異β−ラクタマーゼ／ペニシリンアナログまたはロラカルベフ；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ／ホスホマイシンまたはホスホエノールピルベート；オルニチンデカルボキシラーゼ／α−ジフルオロメチルアミノ酸；アルギニンデカルボキシラーゼ／α−ジフルオロメチルアミノ酸；酵母Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ／１，１’−（メチルエタンジイリジデンジニトリロ）−ビス（３−アミノグアニジン）；およびβ−ラクタマーゼＰＳＥ−４／クラブラン酸、スルバクタムおよびタゾバクタムが挙げられる。
【００５６】
工程１試薬の多様な成分は、特定のタイプのがんに合う成分の範囲から選択される。工程１試薬の多様な成分の選択においてこの多様性を有することで、本発明はほとんどすべての種類のがんに適用することができる。特定の腫瘍タイプの細胞標的剤の例示的な標的を表１に示し、ここで「ｘ」は、標的が特定の腫瘍上で同定されたことを示している。
【００５７】
【表１】
工程２試薬
工程２試薬は殺細胞試薬である。殺細胞試薬または細胞毒性化合物は細胞死を引き起こすことができる物質である。好ましくは、細胞死はアポトーシスの結果であるか、または細胞溶解をもたらして、ナノプラットフォームを腫瘍細胞外の空間に再配置して、続いて、またはその前か、または同時に投与された試薬に対して細胞外ナノプラットフォームを露出させ、接近可能とさせる。
【００５８】
細胞殺傷剤は細胞毒性化合物である。例えば、細胞殺傷剤は化学処置剤；毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的活性のある毒素またはそのフラグメント）；放射活性同位元素（すなわち、放射活性結合体）；または体外照射療法、温熱または超音波等の外部にかけられるエネルギーである。
【００５９】
もしくは、細胞殺傷剤は、ホルモン、抗ホルモン等の無毒剤、または被験体のホルモン状態の変更を導き、被験体のホルモン状態に感受性のある特定の細胞系統の細胞に向けられたアポトーシスと呼ばれる殺細胞プロセスをもたらす精巣摘除術等の操作である。例えば、精巣摘除術および／または抗アンドロゲンの投与は、多数の正常な前立腺細胞およびさまざまな数の前立腺がん細胞のアポトーシス死滅を引き起こす。
【００６０】
例えば、化学療法剤化合物は、パクリタキセル、タキソール、ロバスタチン、ミノシン、タモキシフェン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、エポチロン、ナベルビン、カンプトテシン、ダウノニビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシンまたはイダルビシンである。
【００６１】
工程２試薬として用いることのできる酵素活性のある毒素およびそのフラグメントとして、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類が挙げられる。
【００６２】
放射性複合抗体の生産のために多様な核種が利用可能である。実例として、２１２Ｂｉ，１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
【００６３】
工程２細胞殺傷剤の何れを使用するかにかかわらず、殺細胞試薬は、殺細胞試薬による死滅に対して過敏な特徴を有する少なくとも標的細胞を選択的に死滅させることができる。
工程３試薬
本発明は、さらに、工程３二特異的試薬２０００（図２６）を被験体に導入することからなる。工程３試薬は標的部分２１００および同位元素捕捉部分を含む化合物である。
【００６４】
標的部分は、水不溶性ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００に対して特異性および親和性をもって結合することができる。
【００６５】
同位元素捕捉部分２２００は放射標識水溶性工程４試薬を捕捉できる。
【００６６】
工程３試薬の標的部分は、例えば、ヒドラジド類、ケトン類、メルカプタン類、マレイミジル類等の有機官能基；抗体、そのフラグメントまたはその誘導体、または抗体結合部位のように挙動するように生物技術的に設計されたペプチド等のポリペプチド；ペプチド、酵素またはそのフラグメント；レクチン；または細胞外ナノプラットフォーム上の付加的分子構造に結合するように生物技術的に設計された分子である。
【００６７】
標的部分の選択は、工程１試薬上の付加的分子構造およびその得られるナノプラットフォームの選択の関数である。例えば、ナノプラットフォーム上の付加的分子構造が新生抗原または他の抗原エピトープである場合、標的部分は抗体結合部位のように挙動するように生物技術的に設計され、特異性および親和性をもって新生抗原または他の抗原エピトープに結合するように適合させた抗体または抗体フラグメントまたはペプチドである。工程３二特異的試薬の標的部分が細胞外ナノプラットフォーム上の付加的分子構造を標的とすることは、工程３二特異的試薬の標的部分と、細胞外ナノプラットフォームの表面上の付加的分子構造としての抗原エピトープとの非共有高親和性および／または高親和力結合の結果でもありうる。図３０は、表面上の付加的分子構造１４００として多くの抗原エピトープ１４０４を有する細胞外ナノプラットフォーム１６００を示す。工程３二親和性試薬２００４の標的部分２１００としてのこれらの抗原エピトープ１４０４に対する特異性を有する抗体２１０４は、細胞外ナノプラットフォーム１６００の表面上の付加的分子構造１４００としての抗原エピトープ１４０４に高親和性および／親和力２５０４をもって結合するので、工程３二特異的試薬２００４を細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合する。
【００６８】
あるいは、ナノプラットフォーム上の付加的分子構造が非可逆的酵素インヒビターである場合、標的部分は、非可逆的酵素インヒビターに結合する対応する酵素、変異酵素、タンパク質またはペプチドである。図２９に示されるように、工程３試薬２００３は標的部分２１００として適当な酵素２１０３とともに導入され、ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００としての非可逆的酵素インヒビター１４０３と接触する。工程３二特異的試薬２００３の酵素２１０３標的部分２１００は非可逆的酵素インヒビター１４０３と相互作用して、非可逆的酵素インヒビターに対する共有結合により、酵素２１０３（および従って工程３二特異的試薬）を細胞外ナノプラットフォーム１６００に共有結合２５０３させることができる。工程３二特異的試薬の標的部分に適する酵素として、例えば、β−ラクタマーゼ、変異β−ラクタマーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ、またはナノプラットフォーム上の付加的分子構造としての基質が酵素に共有結合するが、基質を遊離させる触媒反応を完結させることができないようにその活性部位を修飾または変更させた特異的変異の酵素が挙げられる。
【００６９】
ナノプラットフォーム上の付加的分子構造がアルデヒド基またはケトン基等の反応性有機官能基である場合、工程３試薬の標的部分はヒドラジド基等の反応性有機官能基であるので、アルデヒド基またはケトン基をヒドラジド基と反応させてヒドラゾンを形成することにより、工程３試薬をナノプラットフォームに共有結合させる。図２７に示されるように、アルデヒド基は遊離アルデヒドとしてか、アセタールとして保護されてプラットフォーム構築材料に取り込まれる；後者が次に細胞内に存在する場合に、保護基がアセタールから除去され、遊離アルデヒド基を付加的分子構造１４０１として存在させるだろう。他の有機反応官能基として、図２８に示されるようにメルカプタン基およびマレイミジル基が挙げられる。Ｓ−アセチル保護メルカプタン等の保護メルカプタンは工程１試薬上の付加的分子構造であり、プラットフォーム構築材料に付着する。細胞内に存在する間、アセチル基は加水分解性酵素により除去されるので、ナノプラットフォーム１６００はその表面に遊離メルカプト基１４０２を有し得る（図２８中を参照）。工程３試薬２００２の対応する標的部分２１００はマレイミジル基２１０２であり、ナノプラットフォーム１６００上のメルカプト基１４０２に接触すると、チオエーテル結合２５０２を形成することによって、工程３試薬をナノプラットフォームに共有結合させる。
【００７０】
工程３二特異的試薬の同位元素捕捉剤は放射標識工程４試薬に結合することができる。同位元素捕捉部分２２００の化学組成物は放射標識工程４試薬により決まる。同位元素捕捉部分は、ナノプラットフォームの領域に隣接する腫瘍のマトリックス内の放射標識水溶性工程４試薬を捕捉するように適合させる。
【００７１】
腫瘍内への放射標識水溶性工程４試薬の捕捉は、放射標識水溶性工程４試薬を、細胞外ナノプラットフォーム上の工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分に直接に結合させ、それを、ホットスポットを作るために必要な時間結合し続けることにより達成する。適当な時間は使用される放射同位元素に依存し、当業者に明らかである。例えば、１３１Ｉ等の放射標識ヨウ素に適当な時間は少なくとも５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間以上である。９０Ｙ等の放射標識イットリウムに適当な時間は３日間、４日間、５日間または６日間以上である。
【００７２】
細胞外ナノプラットフォーム上の工程３試薬の同位元素捕捉部分に結合することのできる工程４試薬として、アルデヒド基と結合してヒドラゾンを形成するヒドラジド基等の工程３二特異的試薬の標的部分について既に述べた反応有機官能基が挙げられる。例えば、図３１に示されるように、細胞外ナノプラットフォーム１６００の表面に付着２５００させた工程３二特異的試薬２００５は同位体元素捕捉部分２２００としてアルデヒド基２２０１を有することができ、放射標識水溶性工程４試薬８０００は、分子構造に存在するヒドラジド基８００１によりアルデヒド基２２０１に付着してヒドラゾン７０００を形成することにより、放射標識水溶性工程４試薬を細胞外ナノプラットフォームに共有結合させることができるので、放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ）を腫瘍内の細胞外ナノプラットフォームに、長期間、例えば、放射性同位元素が半径１〜２ｍｍ内の腫瘍細胞に致死線量照射を曝すホットスポットを作る５〜１０日間保持させる。
【００７３】
あるいは、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分は酵素であり、放射標識水溶性工程４試薬は該酵素の放射標識非可逆的インヒビターである。例えば、図３２に示すように、工程３二特異的試薬２００６の同位元素捕捉部分２２００は、工程３二特異的試薬の標的部分２１００によりナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００に付着２５００させたβ−ラクタマーゼ酵素２００２である。この例において、放射標識水溶性工程４試薬８００２は、ペニシラン酸の１３１Ｉヨード誘導体またはリチウム１３１Ｉ−９−Ｏ−ｍ−ヨードフェニルクラブラネートであり（Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，１：８３−１０４，１９８６）、これらは循環血液中に導入されると、細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着したβ−ラクタマーゼ２２０２に接触し、β−ラクタマーゼ上の結合部位と相互作用し、非可逆的酵素インヒビター７００１としてβ−ラクタマーゼに結合することにより、水溶性工程４試薬放射性同位元素を、周囲腫瘍細胞に致死線量照射を曝すホットスポットを作るために必要な期間、腫瘍中の細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着させる。
【００７４】
あるいは、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分は、高親和性および／または高親和力をもって放射標識水溶性工程４試薬と結合することのできる抗体または抗体フラグメントまたはその誘導体、レクチン、または他のタンパク質または構造でもある。図３３に示されるように、工程３二特異的試薬２００７の同位元素捕捉部分２２００はストレプトアビジン２２０３であり、工程３二特異的試薬２００７は工程３二特異的試薬の標的部分２１００により細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合している。この例において、放射標識水溶性工程４試薬８００３は、９０Ｙ−ビオチン誘導体等のビオチン誘導体であってよい（Ｗｅｉｄｅｎ ａｎｄ Ｂｒｅｉｔｚ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４０：２７−５１，２００１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ， ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１６：２２７−２３５，２００１）。放射標識水溶性工程４試薬８００３が循環血液中に入る場合、非常に親和性をもって腫瘍内の細胞外ナノプラットフォームに付着したストレプトアビジンに結合７００３することにより、放射標識工程４試薬９０Ｙ放射性同位元素を、周囲腫瘍細胞に致死線量照射を曝すホットスポットを作るために必要な期間、腫瘍中の細胞外ナノプラットフォームに結合させて捕捉する。ストレプトアビジンはビオチンに対して４つの結合部位を有するので（Ｃｈａｌｅｔ ａｎｄ Ｗｏｌｆ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０６：１， １９６４）、腫瘍内に捕捉された放射性同位元素の量の４倍増幅は、ストレプトアビジンを工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として用いて放射標識ビオチン工程４試薬に結合し、それを捕捉することにより達成される。
【００７５】
抗体は、細胞外ナノプラットフォーム上の付加的分子構造として抗原エピトープに結合する工程３試薬の標的部分として、および放射標識水溶性工程４試薬に結合する工程３試薬の同位元素捕捉部分として用いることができるので、２つの結合活性は、二特異的抗体である工程３試薬を用いることにより一分子中で達成することができる。二特異的抗体の二分の一は、細胞外ナノプラットフォーム上の付加的分子構造として抗原エピトープに対して特異的な抗体でありえ、二特異的抗体の別の半分は放射標識水溶性工程４試薬上のハプテン構造に対して特異的な抗体でありうる。
【００７６】
あるいは、放射標識水溶性工程４試薬の腫瘍内への捕捉は、最も有利には工程３二特異的試薬の同位体元素捕捉部分である適当な酵素の触媒作用により、放射標識水溶性工程４試薬を放射標識水不溶性生成物に変換することにより達成される。この方法は腫瘍内に捕捉されうる放射性同位元素の量の大きな増幅を提供する。この増幅は、放射標識水溶性工程４試薬の濃度および放射標識水溶性工程４試薬基質の酵素のターンオーバー数により支配されるだろう。
【００７７】
好ましくは、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分は酵素であり、この酵素はその触媒作用により続いて投与される放射標識水溶性工程４試薬を、腫瘍マトリックス内に捕捉される放射標識水不溶性生成物に変換することができる。図３４に示されるように、工程３二特異的試薬２００８の同位元素捕捉部分２２００としての酵素は、例えば、工程３二特異的試薬２００８の標的部分２１００により細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合させたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ２２０４等のグリコシダーゼであり、インドキシル部分からガラクトシド部分を切断する酵素の触媒作用により１３１Ｉ−５−ヨードインドキシル−３−ガラクトシド８００４等の放射標識水溶性工程４試薬８００４を１３１Ｉ−５，５’−ジヨードインジゴ８００５等の放射標識水不溶性生成物に変換する。これは、自発的な酸化二量体化を受けて放射標識水不溶性インジゴ誘導体生成物８００５を形成する放射標識水溶性インドキシル誘導体である中間体をもたらす。これらの化合物は、細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合した工程３二特異的試薬２００８の同位元素捕捉部分２２００として酵素の非常に近くで沈殿物を迅速に形成し（Ｈｏｌｔ，Ｎａｔｕｒｅ １６９：２７１−２７３，１９５２；Ｈｏｌｔ ａｎｄ Ｓａｄｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｂ，１４８：４９５−５０５，１９５８）、腫瘍内に放射性同位元素を捕捉して、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に供給するホットスポットを形成する。沈殿物は水不溶性であるため、および腫瘍内に見られる欠如または制限されたリンパ腺のために（Ｊａｉｎ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２６：７１−９０，１９９７；Ｊａｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：８１４ｓ−８１９ｓ，１９９０；Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５：３０８４−３０８８，１９７５）、および腫瘍内に見られる欠如または限定された数の、または効果のない（さもなければ食作用により沈殿物を除去する）マクロファージのために（Ｂａｌｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ５４：１０１０−１０１５，１９８４；Ｖａａｇｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５０：６９−７４，１９９２；Ｂｉｎｇｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９６：２５４−２６５，２００２）、沈殿物は長期間にわたって腫瘍マトリックス内に所定の位置に存続する。工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として酵素をこの触媒方法で使用することは、腫瘍内に捕捉される放射性同位元素の量を増幅することができる点において、放射標識水溶性工程４試薬を直接結合する方法よりも利点があることによって、腫瘍細胞に供給できる致死線量照射の効果的用量を増加させ、腫瘍に対する効果的な処置の可能性を高めている。この触媒方法で工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として用いられる酵素は、好ましくは、ヒトの血液循環に見られる類似の酵素反応が存在せず、ヒトの血液循環に見られる基質が存在しない非哺乳類の酵素である；これらの酵素として、例えば、β−ラクタマーゼ、ペニシリンアシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼおよびシアリダーゼが挙げられる。しかし、ヒト酵素等の哺乳類の酵素でも、ヒト血液循環において顕著な量でホスト反応を触媒せず、かつ酵素に対して競合する天然基質が存在しない、またはその量が限定されており、かつ放射標識水溶性工程４試薬として用いられる基質と顕著な量で反応する循環酵素が存在しないのであればこの触媒方法に用いられる。哺乳類細胞に見られる特異性を示す幾つかの酵素は当分野で知られており、例えば、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。ヒト酵素は潜在的ホスト免疫学的反応を減少させるために、この触媒方法に使用される非哺乳類酵素によりも幾つかの利点があるだろう（Ｗｏｌｆｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：３８−４８，１９９９；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５８０４−１５８１６，１９９７；Ｌａｅｔｈｅｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３２：８−１８，１９９６；Ｈｏｕｂａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．５２：４５５−４６３，１９９６）。この触媒方法で工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分としての使用に適する酵素の選択の最も重要な面は、触媒される工程４反応が、周囲腫瘍細胞を致死線量照射に曝すホットスポットを作るのに必要な期間（多くの場合、腫瘍マトリックスに巻き込まれる沈殿物または高い疎水性の産物の形にある）腫瘍のマトリックス内に捕捉されたままにある放射標識水不溶性産物の形成を引き起こすことを確実とすることである。本発明の工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として適当な触媒酵素として、例えば、β−ラクタマーゼ；ペニシリン−Ｇおよびペニシリン−Ｖアミダーゼ；ニトロレダクターゼ；すべての種類のグリコシダーゼ、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、シアリダーゼ等；カルボキシペプチダーゼＡ；カルボキシペプチダーゼＧ２；シトシンデアミナーゼ；アルカリホスファターゼ；スルファターゼ；またはそのような酵素の遺伝子操作された変異体が挙げられる。
【００７８】
工程３二特異的試薬の標的部分および同位元素捕捉部分は共有結合している（図２６を参照）。もしくは、標的部分および同位元素捕捉部分は非共有的に結合している。反応性有機官能基（例えば、アルデヒド基またはヒドラジド基）を標的部分か同位元素捕捉部分のいずれかに用いる場合、反応性官能基としての標的部分または同位元素捕捉部分は、ほとんどの場合で高分子、しばしばタンパク質である、工程３二特異的試薬の他の部分に反応性有機官能基を付着させるために適当な官能基をも必要とするだろう。この適切な官能基は、標的部分または同位元素捕捉部分としての反応性有機官能基を、タンパク質としての他の部分のアミノ酸残基の１つにタンパク質の結合または酵素活性に影響を与えずに付着させる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６）。工程３二特異的試薬のための他の選択の多くで、工程３二特異的試薬の形成は２つの異なる巨大分子の結合を伴い、ヘテロ結合体を作りだす。結合操作は当該分野で公知である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ ＩＩ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６）。発現および精製の際に、適当な工程３二特異的試薬を提供することができる融合タンパク質を作るためにバイオエンジニアリングおよび組換え生物学技術を使用することもできる。
工程４試薬
工程４試薬は放射標識分子を含む。放射性同位元素は、工程４試薬に直接的に、すなわち共有結合する。あるいは、放射性同位元素は、工程４試薬に間接的に、例えば、キレート剤を介して結合する。放射性同位元素として、例えば、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、イットリウム−９０（９０Ｙ）、銅−６７（６７Ｃｕ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム−１８８（１８８Ｒｅ）、ルテチウム−１７７（１７７Ｌｕ）、アスタチン−２１１（２１１Ａｓ）、ビスマス−２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス−２１３（２１３Ｂｉ）、ロジウム−１０３ｍ（１０３ｍＲｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、およびインジウム−１１１（１１１Ｉｎ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ．６６（２）：１０７−１１７，２００３）が挙げられる。
【００７９】
好ましくは、放射標識工程４試薬は低分子量である。低分子量化合物は、良好な循環、体内分布、腫瘍侵入、および潜在的免疫原性の低下を提供する。さらに、腫瘍細胞外マトリックスに捕捉されない低分子量放射標識水溶性工程４試薬はさらに速く排泄されることにより全身毒性を減少させる。
【００８０】
低分子量とは、化合物が２５ｋＤ未満、好ましくは１０ｋＤ未満、より好ましくは５ｋＤ未満、最も好ましくは１ｋＤ未満であることを意味する。
【００８１】
工程４試薬は、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分に直接的および特異的に結合することにより、工程３試薬の同位元素捕捉部分により捕捉されるように適合させる。もしくは、工程４試薬は、工程３試薬の同位元素捕捉部分により、ナノプラットフォームに隣接する腫瘍細胞外マトリックス内に捕捉される放射標識水不溶性産物に酵素的に変換される。工程４試薬放射性同位元素の腫瘍細胞外マトリックス内の固定化は、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に供給する微小領域の照射野（ホットスポット）を作る。
【００８２】
工程４試薬は、工程３試薬の同位元素捕捉部分に結合することのできる活性反応基により、例えば、同位元素捕捉部分に直接結合する非可逆的酵素インヒビターとして、または同位元素捕捉部分に非常に高い親和性か高い親和力をもって結合するように適合させたハプテンまたはペプチド等の小分子として、同位元素捕捉部分に結合する。高親和力は少なくとも約１０１０モル−１以上のＫａにより定義される。好ましくは、Ｋａは約１０１２モル−１である。さらに好ましくは、Ｋａは約１０１５モル−１である。
【００８３】
反応性有機官能基として、例えば、他の試薬上の対応する有機反応官能基と反応するが、２つの試薬が通る経路上の被験体の循環内に存在する分子構造物とは容易に反応しないアルデヒド類、ケトン類、ヒドラジド類、メルカプタン類またはマレイミド基が挙げられる。例えば、工程３二特異的試薬の同位体捕捉部分がアルデヒド基である場合、放射標識水溶性工程４試薬はヒドラジド官能基を有する。放射標識水溶性工程４試薬上のヒドラジド基が、工程３試薬の同位元素捕捉部分としてのアルデヒド基と接触する場合、それはヒドラゾンを形成するために、放射標識水溶性工程４試薬をナノプラットフォームに共有結合させる。
【００８４】
工程３試薬の同位元素捕捉部分としての適当な酵素および工程４試薬としての非可逆的な酵素インヒビターは上記のように当技術でよく知られている。好ましくは、酵素の特異性は、ホスト種の循環または細胞外マトリックス内または工程３二特異的試薬が本発明での使用中に通る経路上で顕著な量で見られない基質に対するものである。有利には、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分は、ペニシリナーゼまたはペニシリンアミダーゼ等、ホスト種に一般的に見られない基質に対する特異性を有する非哺乳動物の酵素である。
【００８５】
工程４試薬として、２−ニトロ−５−ヨード−フェノール（ＮＩＰ）、４−（４’−ヨードフェニル）ベンゾエート、および４−（４’−ヨードフェニル）ベンゼンアルソネートが挙げられ、これら化合物中でヨード基は放射活性がある。あるいは、ペプチドは放射性同位元素を含むように放射標識する。放射標識された有機分子はペプチドに容易に結合させることができる。例えば、１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸は、アミドの形成によりペプチド上のα−アミノ基に結合させることができ、９０Ｙおよび他の金属放射性同位元素と非常に高い親和性により結合する１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）等のキレート剤はペプチドと結合体化させることができる。ペプチドはＬアミノ酸、Ｄアミノ酸、または両者の組合せのポリマーである。例えば、ペプチドはＤレトロ−インバーソペプチド（ｉｎｖｅｒｓｏ ｐｅｐｔｉｄｅ）である。「レトロ−インバーソ異性体（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ ｉｓｏｍｅｒ）」との用語は直鎖ペプチドの配列の向きが逆である異性体をいう；「Ｄ−レトロ−インバーソ異性体」との用語は、配列の向きが逆であり、各アミノ酸残基のキラリティーが逆である直鎖ペプチドの異性体をいう。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４）を参照されたい。Ｄ鏡像異性体と逆合成の組合せの最終結果として、各アミド結合のカルボニル基とアミノ基の位置が交換される一方で、各アルファ炭素の側鎖基の位置が保存される。例示的な工程４試薬／同位元素捕捉部分の対として、放射標識ビオチン／ストレプトアビジンまたは放射標識ＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ抗体が挙げられる。
【００８６】
工程４試薬として、同位元素捕捉部分により酵素的に変えられる付着した親水基を有する疎水性核からなる化合物が挙げられる。例えば、親水基が芳香族ＯＨ（ヒドロキシ）基に結合し、これはＯＨ基が放射標識水溶性工程４試薬の別の部分のヘテロ原子に水素結合をする位置に存在する場合に最も有利であろう。さらに、この種類の放射標識水溶性工程４試薬は放射性同位体、最も好ましくは、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として酵素に対して放射標識水溶性工程４試薬基質が反応することにより作られる放射標識水不溶性産物の疎水性を維持するヨード基等の放射性同位元素を含む。
【００８７】
このクラスの放射標識水溶性工程４試薬に対する潜在的な放射性同位元素含有分子構造の多くの（排他的であることは意味しない）共通する特徴は、例えば、ホスファターゼに対する基質グループとしてのホスフェート基、ガラクトシダーゼに対するガラクトース、グルコシダーゼに対するグルコース、グルクロニダーゼに対するグルクロニド２等を結合させることにより適切な酵素基質を調製するために用いられる芳香族核上のＯＨ（ヒドロキシル）基である。ＯＨ基はいったん付着基質の酵素的切断によって遊離すると、分子構造の一部である適当に位置するヘテロ原子とともに内部水素結合を形成することができる。例えば、放射標識および適当な基質グループが付加されるこれらの核構造物として、アルキルサリチル酸塩の誘導体、Ｎ−ベンジルサリチルアミド、２−（２’’−ヒドロキシフェニル）ベンズイミダゾール、５，６，７，８−β−テトラロールカルボン酸−β−ナフチルアミド、２−ヒドロキシベンゾフェノン、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸アニリド、ジヒドロキノフタロン、メナヒドロキノン、２−（２’−ヒドロキシフェニル）−４（３Ｈ）−キナゾリノン、２−（２’ヒドロキシフェニル）−ベンゾトリアゾール、ポルフィリン誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
酵素として、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分の触媒作用を利用する別の方法は、自発的に反応して放射標識水不溶性産物を形成する活性中間体への放射標識水溶性工程４試薬の酵素的変換であり、それにより微小領域の照射野（ホットスポット）を作って致死線量照射を周囲腫瘍細胞に供給するために必要とされる期間、腫瘍細胞外マトリックス内に捕捉されうる放射性同位元素の量を非常に増やす高い酵素ターンオーバー数の大きな増殖ポテンシャルを再び利用する。多くの分子構造は、酵素的切断が水不溶性ポリマーを形成するための活性中間体であるモノマーを作る酵素基質等、この種類の放射標識水溶性工程４試薬を作るために適する。そのような放射標識水溶性工程４試薬として用いることのできる適当な酵素基質の例として、１）ペンダント基の酵素的切断が酸化的二量体化を迅速に受ける反応性インドキシルを生じて、放射標識水不溶性インジゴ誘導体生成物を形成する放射標識水溶性インドキシル誘導体および２）ペニシリナーゼによる切断が、放射標識水不溶性生成物を放出する電子転位を導くペニシリンの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
試薬の調製
本発明の組成物は、当分野で公知の適当な方法での化学的結合により上記のそれぞれの基からの成分を結合させることにより調製される。多くの公知の化学的架橋方法は非特異的であり、すなわち、それら方法は結合点を標的部分上のいずれか特定の部位に向けることはない。その結果、非特異的架橋剤の使用は機能部位を攻撃するか、または立体的に活性部位をブロックして、複合タンパク質を生物学的に不活性にするだろう。
【００８９】
結合特異性を高める一つの方法は、架橋すべきポリペプチドの片方もしくは両方に一回のみまたはわずかに見られる官能基に直接に化学結合させることである。例えば、多くのタンパク質では、チオール基を含む唯一のタンパク質アミノ酸であるシステインはわずかに数回存在する。また、例えば、ポリペプチドがリジン残基を含まない場合、一級アミンに特異的な架橋剤は、該ポリペプチドのアミノ末端に対して選択性があるであろう。結合特異性を高めるこのアプローチの成功した利用は、ポリペプチドが、分子の生物学的活性の損失なしに変更されない分子の領域に適度に稀な反応性残基を有することを必要とする。
【００９０】
システイン残基は、架橋反応へのそれらの寄与がおそらく生物学的活性に干渉しないポリペプチド配列の一部に存在する場合に置き換えてよい。システイン残基が置き換わる場合、ポリペプチドの折り畳みの生じる変化を最小限にすることが典型的に望ましい。ポリペプチドの折り畳みの変化は、置換が化学的および立体的にシステインに類似である場合に最小化する。これらの理由から、セリンはシステインの置換として好ましい。下記の実施例に示されるように、システイン残基は、架橋の目的のためにポリペプチドのアミノ酸配列に導入してよい。システイン残基が導入される場合、アミノ末端またはカルボキシル末端での導入または該末端の近くの導入が好ましい。目的のポリペプチドが化学合成または組換えＤＮＡの発現のいずれかにより作られようとも、そのようなアミノ酸配列修飾に慣用の方法を利用することができる。
【００９１】
２構成成分の結合は、架橋剤または接合剤により達成することができる。利用することのできるいくつかの分子間架橋剤が存在する。例えば、Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ，ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，１９７４，ｐｐ．３９−４３を参照されたい。これらの試薬の中には、例えば、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（両者共にスルヒドリル基に対して非常に特異的であり、非可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６〜１１炭素メチレン架橋を有する他の相同体（これらはスルヒドリル基に対して比較的特異的である）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（これはアミノ基とチロシン基とともに非可逆的結合を形成する）が存在する。この目的に有用な他の架橋剤として、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（これはアミノ基およびフェノール基とともに非可逆的架橋を形成する）；ジメチルアジピミデート（これはアミノ基に対して特異性がある）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（これは主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（これは主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（これはいくつかの異なる側鎖と反応する）およびビスジアゾベンジジン（これは主にチロシンおよびヒスチジンと反応する）が挙げられる。
【００９２】
架橋剤はホモ二機能性、すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有する。好ましいホモ二機能性架橋剤はビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、温和な条件下（ｐＨ６．５〜７．７）でスルヒドリル含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含む。２つのマレイミド基は炭化水素鎖により連結させる。したがって、ＢＭＨはシステイン残基を含むポリペプチドの非可逆的架橋に有用である。
【００９３】
架橋剤はヘテロ二機能性であってもよい。ヘテロ二機能性架橋剤は、遊離のアミンとチオールをそれぞれ有する２つのタンパク質を架橋させる２つの異なる官能基、例えば、アミン反応基とチオール反応性基を有する。ヘテロ二官能性架橋剤の例はスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、およびスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）、ＭＢＳの延長鎖アナログである。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は一級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドはシステイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００９４】
架橋剤はしばしば水に対する低い溶解性を有する。スルホネート基等の親水部分はその水溶性を向上させるために架橋剤に加えてよい。スルホＭＢＳおよびスルホＳＭＣＣは水溶性のために修飾された架橋剤の例である。
【００９５】
多くの架橋剤は、細胞条件下で基本的に非切断性である複合物を生じる。しかし、一部の架橋剤は、細胞条件下で切断可能なジスルフィド等の共有結合を含む。例えば、Ｔｒａｕｔの試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（「ＤＳＰ」）およびＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（「ＳＰＤＰ」）はよく知られた切断可能な架橋剤である。切断可能な架橋剤の使用により、標的細胞への輸送後に積荷部分を輸送ポリペプチドから分離することができる。直接のジスルヒド結合も有用であろう。
【００９６】
上記した架橋剤等の多くの架橋剤が市販されている。それらの使用の詳細な説明は商業供給元から容易に入手可能である。タンパク質架橋および結合体調製物に関する一般的な参考文献は、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）である。
【００９７】
化学的な架橋はスペーサーアームの使用を伴うだろう。スペーサーアームは細胞間柔軟性を提供し、複合部分間の細胞内距離を調節することにより生物学的活性を保存するのに役立つだろう。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド部分の形態にあってよい。もしくは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」等における架橋剤の一部であってよい（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，ｃａｔ．Ｎｏ．２１６５１Ｈ）。
【００９８】
もしくは、本発明の組成物は、公知の適当なホスト細胞で好都合に発現させることのできる融合タンパク質として作られる。ここに記載のように融合タンパク質を、標準的な組換えＤＮＡ技術に類似するか、またはそれから容易に適合できる方法で形成し、用いることができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術にしたがって、例えば、連結のために平滑末端またはジグザグ末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端を埋めること、望まれない結合を避けるためにアルカリホスファターゼ処理および酵素的連結を用いることにより、ともにインフレームで連結する。融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置等の慣用の技術により合成する。もしくは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、引き続いてキメラ遺伝子配列を作るようにアニールし、再増幅することのできる２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的突出を生じさせるアンカープライマーを用いて実施する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２を参照）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが利用可能である。
医薬組成物
本発明の組成物は投与に適する医薬組成物に配合することができる。そのような組成物は典型的には工程１試薬、工程２試薬、工程３試薬または工程４試薬および薬学的に許容される担体を含む。ここで用いられる「薬学的に許容される担体」は、医薬投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含むことが意図される。適当な担体は、参照により本文に編入されるこの分野での標準的な参照教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈液の好ましい例として、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび不揮発性油等の非水性ビヒクルを用いてもよい。薬学的に活性のある物質のためにそのような媒体および物質を使用することは当分野においてよく知られている。慣用の媒体または物質が活性化合物と非適合性でない限り、本組成物におけるそれらの利用が意図される。補助の活性化合物も本組成物に配合することができる。
【００９９】
本発明の医薬組成物はその意図する投与経路に適合するように処方される。投与経路の例として、非経口、例えば、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経皮（局所）、経粘膜的、直腸投与および経口経路が挙げられる。本発明の処置薬は、適切な経路、例えば、点滴または迅速投与により、上皮層または粘膜皮膚層（例えば、口粘膜、直腸および小腸粘膜、等）により投与してよく、他の生物学的に活性のある物質とともに投与してよい。投与は全身または局所であってよい。
【０１００】
非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液として、下記成分：注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等の緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の等張性調節剤が挙げられる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基により調節することができる。非経口調製物はアンプル、使い捨て注射器またはガラスかプラスチック製の複数回投与バイアルに同封できる。
【０１０１】
注射可能な使用のために適する医薬組成物として、滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌注射可能な溶液または分散剤の即時調製用の分散物または滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与に適当な担体として、生理学的食塩水、静菌性水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合で、組成物は無菌でなければならず、容易な注射針通過が存在する程度に流動的でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌や真菌等の微生物の汚染作用から守る必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの利用により、分散液の場合は必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の利用により維持することができる。微生物の作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物に含ませるのが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることにより達成できる。
【０１０２】
無菌の注射液は、必要に応じて、上記成分の１つまたはそれらの組合せと共に、適当な溶媒中で必要とされる量の活性化合物（例えば、ＰＤＸポリペプチドまたはＰＤＸをコードする核酸）を配合し、次にろ過滅菌により調製することができる。一般的に、分散物は、基本分散媒および上記の必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を配合することにより調製される。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合、調製方法は、前もって無菌ろ過された溶液から有効成分と付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１０３】
経口組成物は通常、不活性の希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するか、錠剤へと圧縮することができる。経口処置薬投与の目的から、活性化合物を賦形剤に配合し、錠剤、トローチまたはカプセルの形で用いることができる。経口組成物は液体担体中の化合物が経口で供給され、クチャクチャとさせて吐き出すか、もしくは飲み込むうがい薬として使用するために液体担体を用いて調製することもできる。薬学的に適合性のある結合剤および／または補助物質を組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン等の結合剤；デンプンまたはラクトース等の賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ等の滑剤；コロイド状二酸化シリコン等の流動促進剤；スクロースまたはサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ調味料等の矯味矯臭剤等の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含むことができる。
【０１０４】
吸入による投与のために、化合物は、適当な高圧ガス、例えば二酸化炭素等のガスを含む加圧容器またはディスペンサー、または噴霧器からのエアゾールスプレーの形で供給される。
【０１０５】
全身投与は経粘膜または経皮膚手段によってもよい。経粘膜的または経皮膚投与のために、透過すべきバリヤーに適当な浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は一般的に知られ、例えば、経粘膜的投与のために、洗浄剤、胆汁酸およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜的投与は鼻内噴霧または座薬の使用により達成することができる。経皮的投与のために、活性化合物を当分野で一般的に知られているように軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに配合する。
【０１０６】
化合物は座薬（例えば、カカオ脂や他のグリセリド等の慣用の座薬基剤とともに）または直腸投与のために保持注腸剤の形で調製することもできる。一実施形態において、活性化合物は、移植物やマイクロカプセル化投与システムを含む制御放出製剤等、体からの速い排出に対して化合物を保護する担体とともに調製される。エチレンビニルアセテート、多無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生分解性で生体適合性のあるポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製方法は当業者に自明であろう。それら物質はＡｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからも市販され入手することができる。（モノクローナル抗体または他の細胞標的剤によりがん細胞を標的とするリポソームを含む）リポソーム懸濁液も薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、参照により本文に組み込まれる、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。
【０１０７】
投与のしやすさや投与量の均一性のために経口または非経口組成物を投与量単位形で処方することが特に有利である。ここで用いられる投与量単位形とは処置される被験体に対して単位投与量として適する物理的に分離した単位をいい、各単位が必要とされる薬学担体と関連して所望の治療効果を生むように計算された所定量の活性化合物を含んでいる。本発明の投与量単位形の明細は活性化合物の独自の特徴と達成されるべき特定の治療効果により決定され、またそれらに直接依存する。
【０１０８】
ここで用いられる「治療的有効量」との用語は、意義のある患者利益、すなわち、関連する医学的な病気の処置、治癒、予防または改善、またはそのような病気の処置、治癒、予防または改善の速度の増加を示すのに十分な医薬組成物または方法の各有効成分の総量を意味する。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、この用語は該成分のみをいう。組合せに適用される場合、この用語は、組合せて投与されようが、連続的または同時に投与されようが、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせた量をいう。
【０１０９】
特定の疾患または病気の治療に効果的である本発明の治療薬の量は疾患または病気の性質に依存し、当分野内で平均的技量を有する者による標準的臨床技術により決定してよい。さらに、インビトロアッセイを任意に使用して、最適投与量範囲を同定するために役立ててよい。製剤に使用される正確な投与量は投与経路および病気または疾患の全体的な重症度にも依存し、開業医の判断および各患者の事情にしたがって決定しなければならない。最終的に、主治医は、各患者個人を処置する本発明のタンパク質剤の量を決定するだろう。最初に、主治医は低用量の本発明の試薬を投与し、患者の反応を観察する。さらに高い用量の本発明の試薬を、患者に対して最適治療効果が得られるまで投与し、その時の用量をさらに増加させない。しかし、本発明の治療薬の静脈内投与の適当な投与量範囲は、体重１キログラム（ｋｇ）あたり、通常、活性化合物の約０．０２０ミリグラム（ｍｇ）〜１グラムである。鼻腔内投与の適当な投与量範囲は、通常、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。効果的な用量はインビトロまたは動物模型試験系から得られた用量反応曲線から外挿してもよい。座薬は一般的に０．５重量％〜１０重量％の範囲の有効成分を含む；経口製剤は好ましくは１０％〜９５％の有効成分を含む。
【０１１０】
本発明の治療薬を用いる静脈内治療の期間は、処置される疾患の重症度および各患者個人の状態および潜在的な特異体質の反応に応じて変更する。本発明の試薬の各適用の期間は１〜２時間〜１５日間の連続的な静脈内投与の範囲にあると考えられる。最終的に、主治医は、本発明の医薬組成物を用いる静脈内処置の適当な期間を決定するだろう。
【０１１１】
医薬組成物は、投与説明書とともにキット、容器、包みまたはディスペンサーに入れてよい。
【０１１２】
下記の非限定の実例で本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：抗ＥＧＦ抗体−デキストラン−３−インドキシルホスフェート−ホスホエノールピルベート結合体の合成
工程１試薬を図６に示す。細胞標的剤１１１０は、ＥＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体であり；担体部分１２１０は多糖デキストランであり；そしてプラットフォーム構築材料１３１０は、ホスホエノールピルベート誘導体の付加的分子構造１４１０を結合させた置換された３−インドキシルホスフェート誘導体である。
【０１１４】
図６に示されるように、工程１試薬１０１０は、インジゴの会合体を結合させて微小沈殿物を形成することにより細胞内水不溶性ナノプラットフォーム１５１０を形成する。プラットフォーム構築材料の一部または全てとして、付加的分子構造１４１０が挙げられ、これは、工程３二特異的試薬の標的部分であるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ酵素の非可逆的インヒビターであるホスホエノールピルベートの誘導体である。インドキシルホスフェートプラットフォーム構築材料はデキストラン担体部分により標的部分に結合する。リンカー分子はインドキシルホスフェート誘導体プラットフォーム構築材料のホスフェート基に結合するので、インドキシル中間体の放出、およびインジゴ誘導体細胞内水不溶性ナノプラットフォームを形成するそれらの二量体化を干渉しない。
【０１１５】
工程１試薬の合成は次のように進む：図７に示されるように、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミデート５１０２を、ベンジル６−ヒドロキシヘキサノエート５１０１と、三級アミンの存在下、塩化メチレン中、０℃で１．５時間、次に室温で１／２時間反応させて、５１０３を得た。化合物５１０３上のジイソプロピルアミン基の１Ｈ−テトラゾールおよび水による加水分解後、亜リン酸塩５１０４をベンゼン中のＮ−クロロスクシンイミドにより１５時間室温で酸化して、クロロホスフェート５１０５を作った。反応混合物をドライアイス／アセトン浴中で冷却した後、５１０５を加えながら、Ｎ−ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル−５−ブロモ−３−ヒドロキシインドール５１０６のリチウム塩を得た。反応混合物をゆっくりと室温に戻して、５−ベンジルオキシカルボニルペンチル−２’−シアノエチル−Ｎ−ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル−５’’−ブロモ−３’’−インドリルホスフェート５１０７を得た。ベンジル保護基とニトロベンジルカルバメート保護基は、活性炭担持１０％パラジウムおよび大気圧下の水素を用いて１時間、室温で接触水素化することにより除去して、５−カルボキシペンチル２’−シアノエチル５’’−ブロモ−３’’−インドリルホスフェート５１０８を得た。
【０１１６】
プラットフォーム構築材料上の付加的分子構造であるホスホエノールピルベートの誘導体は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ酵素とともに共有結合体を形成する非可逆的酵素インヒビターであり（Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：４０６−４１２，１９９８；Ｓａｍｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１３１６２−１３１６９，１９９９；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１０６３８−１０６４５，１９９４）、これは続いて投与される工程３二特異的試薬の標的部分である。図８に示されるように、上記のインドキシル化合物のアナログである５−ベンジルオキシカルボニルペンチル２’−シアノエチルＮ−ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル−５’’−ヒドロキシ−３’’インドリルホスフェート５１０９を、リチウムジイソプロピルアミドとドライアイス／アセトン浴中で反応させる場合に、シアノエチル３−ブロモピルベートを加え、反応物をゆっくりと室温に戻して５１１０を作る。次に、この生成物５１１０をドライアイス／アセトン浴中でリチウムジイソプロピルアミドと反応させ、次にビスシアノエチルクロロホスフェートと反応させて、保護ホスホエノールピルベートインドキシルホスフェート誘導体５１１１を得る。次に、ニトロベンジルカルバメート保護基とベンジル保護基を活性炭担持１０％パラジウムおよび大気圧での水素を用いる１時間、室温での触媒水素化により除去して、非可逆的酵素インヒビターが付着した５１１２を有する保護プラットフォーム構築材料を得る。
【０１１７】
アミノ−デキストランを、Ｋａｍｉｚｕｒａら（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４２：２６６４−２６７２，２００１）により記載された操作にしたがってデキストランから調製した。デキストラン（分子量６４，０００〜７６，０００、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を４Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、６−ブロモへキサン酸と８０℃で３時間反応させた。低分子量試薬を透析により除去し、溶液を減圧下に濃縮した。カルボキシル基を、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを加えて活性化し、次にデキストランに対して１５Ｍ過剰のエチレンジアミンを滴下して、暗所にて１２時間室温で反応を進めた。溶液のｐＨを、その操作中、０．１Ｎ塩酸で５．０〜５．５に維持した。溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し、限外ろ過により濃縮した。アミノデキストラン上のアミノ基の数を、トリニトロベンゼンスルホン酸を用いて測定した（Ｂｕｂｎｉｓ ａｎｄ Ｏｆｎｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０７：１２９−１３３，１９９２；Ｓａｓｈｉｄｈａｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６７：１２１−１２７，１９９４；Ｈａｂｅｅｂ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：６５４−６６０，１９６６）。アミノ基の数に基づくと、８０％が、インドキシルホスフェート化合物の結合のために用いることができる。図９に示されているように、４部の５−カルボキシペンチル２’−シアノエチル５’’−ブロモ−３’’−インドリルホスフェートと１部の５−カルボキシペンチル２’−シアノエチル５’’−ホスホエノールピルベート−３’’−インドリルホスフェートの混合物（すなわち、５つのプラットフォーム構築材料のうち１つが非可逆的酵素インヒビターである付加的分子構造を有する）をＤＭＳＯに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを室温で２時間加えることによりＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５１１３および５１１４にそれぞれ変換する。次に、活性エステルの溶液をアミノ−デキストランの溶液に滴下しつつ、反応混合物のｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウムで１時間にわたって７〜８に維持して、５１１５を得る。低分子量副生成物をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対する完全な透析により除去する。次に、溶液のｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウムにより１０まで上げてこのｐＨを１時間維持してシアノエチル基の除去を行なう。ｐＨを７．５に下げ、アミノ−デキストラン結合体上の残りのアミノ基の一部をＳ−アセチルチオ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させる。１００ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテートをＤＭＳＯに溶解し、これを１グラムの誘導体化アミノ−デキストランに滴下しながら、反応混合物のｐＨを７〜８に維持して、５１１６を生成する。反応後、試料をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対して一晩透析する。図９ｂに示されているように、５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）中の５０ｍｇのデキストラン結合体を０．５ｍｌのヒドロキシルアミン−ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）に混合し、２時間反応させて、Ｓ−アセチルチオアセチル側鎖からアセチル基を除去して５１１７を得て、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体標的剤上のヘテロ二機能剤に結合するための遊離スルヒドリル基を与える。８ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に溶解した１００ｍｇの抗ＥＧＦＲモノクロナール抗体５１１８を５ｍｇのＮ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステルと３０分間室温で反応させながら、ｐＨを０．１Ｎ水酸化ナトリウムで７〜７．５に維持して、５１１９を生成する。ＮＡＰ２５カラムを通すことによりタンパク質を反応物から分離する。５１１９の溶液を５１１７の溶液に加え、５１１７の濃度が３ｍｇ／ｍＬになるまで希釈する。２時間室温で反応を進めて、工程１試薬である５１２０を得る。反応混合物を冷リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対して一晩透析する。結合体をセファクリル３００クロマトグラフィーで評価する。同様な調製物は、２８０ｎｍでの吸収単位に基づくタンパク質−デキストラン結合体５１２０として６０〜９５％を示す。
【０１１８】
実施例２：トランスフェリン−アルブミン−ビス−３−インドキシルグリコシド−ロラカルベフ結合体の合成
工程１試薬を図１０に示す。細胞標的剤１１２０はヒトトランスフェリンであり；担体部分１２２０はヒト血清アルブミンであり；プラットフォーム構築材料１３２０は、カルバセフェムアナログであるロラカルベフの付加的分子構造１４２０を結合させた置換ビス−３−インドキシルグリコシド（例えば、グルコシドまたはガラクトシド）誘導体である。
【０１１９】
さらに図１０にあるように、標的細胞内にいったん入ると、第二実施例における工程１試薬は、ポリインジゴの会合体を結合させて微小沈殿物を形成することにより細胞内水不溶性ナノプラットフォーム１５２０を形成する。プラットフォーム構築材料はビスインドキシルリジン誘導体である。プラットフォーム構築材料の一部または全てとして、付加的分子構造１４２０が挙げられ、これは、工程３二特異的試薬の標的部分である変異β−ラクタマーゼの非可逆的インヒビターであるロラカルベフの誘導体である。これらのビスインドキシルリジンプラットフォーム構築材料は、プラットフォーム構築材料のアミノ酸骨格（リジンまたはリシルグルタミン酸）中のカルボキシル基により、ヒト血清アルブミンである担体部分１２２０上のアミノ基に結合する。がん細胞１００上のトランスフェリンレセプター１０１ｂに結合するヒトトランスフェリンである標的剤１１２０を、ヘテロ二機能リンカー分子によりヒト血清アルブミン担体複合物に結合させる。この例において、プラットフォーム構築材料の重合性基はインドキシルグリコシドであり、リジンに対する結合はインドキシル環上の５位の置換基による。工程１試薬のこの第２実施例の合成は下記のように進みうる：図１１に示されるように、アセトニトリルに溶解したＮ−アセチル−５−ベンジルオキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−オン５２０１は０℃で１時間ｔ−ブトキシドカリウムと反応させて、次にアセトニトリルに溶解したアセトブロモガラクトースまたはアセトブロモグルコースを加えて、４時間、０℃で反応させて、１−アセチル−３−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトシドキシ）−５−ベンジルオキシインドール５２０２または１−アセチル−３−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−ガラクトシドキシ）−５−ベンジルオキシインドールを得る。活性炭担持１０％パラジウムおよび大気圧での水素を用いる接触水素化によりベンジル基を除去して５２０３を得た。５２０３上の遊離ヒドロキシル基をベンジルブロモアセテートと反応させて５２０４を得た。活性炭担持１０％パラジウムを用いる接触水素化によりベンジル基を除去して５２０５を得て、次にカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびジシクロヘキシルカルボジイミドを有する活性エステルに変換して５２０６を得た。活性エステル化合物５２０６をベンジル−Ｌ−リジン上の各アミノ基と反応させて、ビスペンタアセチルインドキシルガラクトシド−Ｌ−リジンまたはビスペンタアセチルインドキシルグルコシド−Ｌ−リジンのベンジルエステルを得た。活性炭担持１０％パラジウムおよび大気圧での水素を用いる接触水素化によりベンジル保護基を除去した。メタノール中のナトリウムエトキシドによるエステル交換によりアセチル保護基を除去して、ビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジン５２０７またはビスインドキシルグルコシル−Ｌ−リジンを得た。
【０１２０】
図１２に示されるように、プラットフォーム構築材料上の付加的分子構造として用いられる非可逆的酵素インヒビターは抗生物質ロラカルベフ５２１０である。最初に、ロラカルベフ５２１０を、保護グルタミン酸５２０８から調製されたＮα−ＢＯＣ−Ｏα−ベンジル−Ｏγ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルグルタメート５２０９と反応させて、ロラカルベフ−グルタメート結合体５２１１を得た。ロラカルベフ−グルタメート結合体５２１１上のカルボキシル基を、フェニルアセトキシメチルヨウ化物５２１２を用いてフェニルアセトキシメチルエステル５２１３として保護した。ＢＯＣ保護基をトリフルオロ酢酸により除去して、フェニルアセトキシメチルエステル５２１４を得た。ロラカルベフの誘導体５２１４を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびジシクロへキシルカルボジイミドと（５２０７、図１１）の反応から調製されたビスインドキシルガラクトシルリジン５２１５またはビスインドキシルグルコシル−Ｌ−リジンの活性エステルと反応させて、ロラカルベフ−ビスインドキシルガラクトシルリジン誘導体５２１６またはロラカルベフ−ビスインドキシルグルコシルリジン誘導体を得た。活性炭担持１０％パラジウムおよび大気圧下での水素を用いる接触水素化によりベンジル基を除去して、担体部分に結合させるために調製された非可逆的酵素インヒビターを有するプラットフォーム構築材料である５２１７を得た。
【０１２１】
複数のプラットフォーム構築材料を、図１３に示されるように担体部分（ヒト血清アルブミン）に付着させて、プラットフォーム構築材料の腫瘍への送達を高めた。わずかに１つのロラカルベフ結合部位が、得られるインジゴポリマー水不溶性ナノプラットフォーム上の５インジゴユニットごとに必要とされることが分かったので、プラットフォーム構築材料を、１（ロラカルベフ−ビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジン誘導体）に対して４（ビスインドキシガラクトシル−Ｌ−リジン）の比率でアルブミン担体部分に付着させた。同様な結合体を、グリコシド誘導体を用いて調製した。図１３に示されているように、ヒト血清アルブミン担体部分上の８０％のアミノ基を修飾することができる量を合計した２プラットフォーム構築材料を、４対１の比率で混合し、ＤＭＳＯに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを加えて活性化し、これを２〜４時間室温で進めて５２１８および５２１９をそれぞれ得た。ヒト血清アルブミンの溶液（リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中２０ｍｇ／ｍＬ）を、２プラットフォーム構築材料５２１８および５２１９の活性エステル溶液の滴下中、１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ７〜８に維持した。添加後、反応をさらに１時間室温で続けた。また、アルブミン上の８０％のアミノ基を修飾するためにロラカルベフ−リシル−ビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジン誘導体の活性エステルを用いて結合体を調製した。反応副産物はリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対する完全な透析により除去して、ヒト血清アルブミン担体部分−プラットフォーム構築材料結合体５２２０の溶液を得た。類似の担体結合体をロラカルベフ−リシル−ビスインドキシルグルコシル−Ｌ−リジン誘導体を用いて作った。０．５Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７〜８に維持しながら、２５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテートをＤＭＳＯに溶解し、これをアルブミン結合体の溶液に滴下した。反応後、溶液をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対して一晩透析して、５２２１の溶液を得た。
【０１２２】
透析後、１０００ユニットのペニシリンＧアシラーゼを加え、溶液を３７℃で一晩インキュベートし、ロラカルベフ側鎖（付加的分子構造）からフェニルアセチルメチル保護基を除去した。ヒドロキシルアミンを室温で加えることによりアセチル基をＳ−アセチルチオアセチル側鎖から除去して５２２２を得て、ヒトトランスフェリン細胞標的剤上のヘテロ二機能性剤に結合するための遊離スルヒドリル基を与える。ｐＨを７．０〜７．５に維持しながら、ヒトトランスフェリン（２００ｍｇ）を８ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に溶解し、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（１２ｍｇ）に反応させた。３０分間後、修飾ヒトトランスフェリン５２２３を、ＮＡＰ２５カラムを用いて反応物から分離した。マレイミジル基５２２３を有するヒトトランスフェリンを、アルブミン−プラットフォーム構築材料結合体５２２２と、各タンパク質に対して３ｍｇ／ｍＬの最終希釈で混合した。タンパク質から、工程１試薬である結合体５２２４を２時間、室温で形成させ、タンパク質溶液をリン酸緩衝塩溶液に対して４℃で一晩透析した。工程１試薬５２２４はセファクリル２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により特性付けた。典型的には、９０〜９５％のトランスフェリンおよびアルブミンは２８０ｎｍでのピーク吸収から予想されるように結合体化していた。インドキシルグリコシド誘導体を有する工程１試薬も調製した。
【０１２３】
実施例３：フォレート−免疫グロブリン−ポルフィリン−α−ジフルオロメチルオルニチン結合体の合成
工程１試薬を図１４に示す。この例において、工程１試薬１０３０は、葉酸誘導体である細胞標的剤１１３０；ヒト免疫グロブリンである担体部分１２３０；オルニチンデカルボキシラーゼ酵素の非可逆的インヒビターであるα−ジフルオロメチルオルニチンアナログ（Ｍｅｔｃａｌｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１００：２５５１−２５５３，１９７８）である付加的分子構造１４３０を付着させた適当なポルフィリン誘導体であるプラットフォーム構築材料１３３０から構成される。あるいは、類似するシステムは、アルギニンデカルボキシラーゼ酵素の非可逆的インヒビターであるα−ジフルオロメチルアルギニンである付加的分子構造を使用し得る。
【０１２４】
図１４に示されるように、工程１試薬は、工程１試薬から遊離したポルフィリンプラットフォーム構築材料の凝集により細胞内水不溶性ナノプラットフォーム１５３０を形成する。プラットフォーム構築材料はポルフィリン誘導体である。プラットフォーム構築材料の一部または全ては、工程３二特異的試薬の標的部分であるオルニチンデカルボキシラーゼ酵素の非可逆的インヒビターであるα−ジフルオロメチルオルニチンアナログ（Ｍｅｔｃａｌｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１００：２５５１−２５５３，１９７８）である付加的分子構造１４３０を含む。これらのポルフィリン誘導体プラットフォーム構築材料は、葉酸である細胞標的剤に付着させた担体部分であるヒト免疫グロブリンに付着させる。
【０１２５】
工程１試薬の合成は以下のように進む：図１５に示されるように、ポルフィリン誘導体の合成は、Ｊ．Ｌｉｎｄｓｅｙと彼の同僚により概説された操作に従う（Ｌｉｔｔｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：１３９１−１３９６，１９９９；Ｒａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：７３２３−７３４４，２０００）。ピロールおよび４−メチルベンズアルデヒドの混合物はアルゴン雰囲気下でトリフルオロ酢酸と反応して、５−（４−メチルフェニル）ジピロメタン５３０１を生成しうることが経験的に分かっている。臭化マグネシウムエチルの溶液をトルエン中の５−（４−メチルフェニル）ジピロメタン５３０１の冷却溶液にゆっくりと加え、さらに３０分間の反応後に、トルエン中の塩化ｐ−トルオイルの溶液を１０分間にわたって加えて、１，９−ビス（４−メチルベンゾイル）−５−（４−メチルフェニル）ジピロメタン５３０２を得る。上記と類似する反応を用いて、ピロールおよび４−カルボキシベンズアルデヒドの混合物をトリフルオロ酢酸と反応させて５−（４−カルボキシルフェニル）ジピロメタン５３０３を得ることができる。少量の水素化ホウ素ナトリウムを、テトラヒドロフラン／メタノール（３：１）中の１，９−ビス（４−メチルベンゾイル）−５−（４−メチルフェニル）ジピロメタン５３０２の溶液に滴下して、ジカルビノール５３０４を作る。ジカルビノール５３０４および５−（４−カルボキシフェニル）ジピロメタン５３０３を等モル量でアセトニトリルに溶解し、トリフルオロ酢酸と５分間反応させた後に２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ）による酸化を行って、５−（４−カルボキシフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−メチルフェニル）ポルフィリン５３０５を得る。
【０１２６】
第２ポルフィリン誘導体を、工程３二特異的試薬に結合するための付加的分子構造として非可逆的酵素インヒビターを結合するための付加的官能基を用いて構築する。図１６に示されるように、ピロールおよび４−アセトアミドベンズアルデヒドの混合物をアルゴン雰囲気下でトリフルオロ酢酸と反応させて５−（４−アセトアミドフェニル）ジピロメタン５３０６を得る。臭化マグネシウムエチルの溶液を、トルエン中の５−（４−アセトアミドフェニル）ジピロメタン５３０６の冷却溶液にゆっくりと加え、さらに３０分間の反応後に、トルエン中の塩化ｐ−トルオイルの溶液を１０分間にわたって加えて、１，９−ビス（４−メチルベンゾイル）−５−（４−アセトアミドフェニル）ジピロメタン５３０７を得る。少量の水素化ホウ素ナトリウムを、テトラヒドロフラン／メタノール（３：１）中の１，９−ビス（４−メチルベンゾイル）−５−（４−アセトアミドフェニル）ジピロメタン５３０７の溶液に滴下して、ジカルビノール５３０８を作る。ジカルビノール５３０８および５−（４−カルボキシフェニル）ジピロメタン５３０３（その合成は上記の通りである）を等モル量でアセトニトリルに溶解し、トリフルオロ酢酸と５分間反応させた後にＤＤＱによる酸化を行って、５−（４−アセトアミドフェニル）−１０，２０−ビス（４−メチルフェニル）−１５−（４−カルボキシフェニル）ポルフィリン５３０９を得る。アセチル保護基をメタノール中のナトリウムメトキシドにより除去して５３１０を得て、これをｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させて、マレイミジル置換ポルフィリン５３１１を得て、葉酸−ヒト免疫グロブリン−ポルフィリン結合体が調製された後に、α−ジフルオロメチルオルニチンアナログである非可逆的酵素インヒビターを結合するための適当な側鎖を提供する。
【０１２７】
図１７に示されるように、ポリフィリン誘導体、４部の５−（４−カルボキシフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−メチルフェニル）ポリフィリン５３０５（図１５）および１部のマレイミジルポルフィリン誘導体５３１１（図１６）の混合物をＤＭＳＯに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを用いてそれぞれの活性エステル５３１２および５３１３に変換する。１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを７〜８に維持しながら、ヒト免疫グロブリンをリン酸緩衝食塩水（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、次にタンパク質１モルあたり全５６モルの活性エステルを用いて、５３１２および５３１３の活性エステル溶液を１時間にわたって滴下して、ポルフィリン−免疫グロブリン結合体５３１４を得る。葉酸を、ジメチルスルホキシドに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドと１時間室温でインキュベートすることにより活性エステルに変換する。３０倍モル過剰の活性エステル溶液（Ｌａｅｍｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：５５７２−５５７６，１９９１）を、ポルフィリン−免疫グロブリン結合体５３１４に滴下しながら、１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて１時間、室温でｐＨを７〜８に維持して、葉酸−免疫グロブリン−ポルフィリン結合体５３１５を得る。非複合材料および試薬をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ６．０）に対する透析により除去する。葉酸−免疫グロブリン−ポルフィリン結合体５３１５のポルフィリン上のマレイミド基をα−ジフルオロメチルオルニチン５３２５のメルカプト誘導体（図１８）（その合成は下記に示す）と反応させて、腫瘍を有するホストに注入する準備のできた工程１試薬である付着非可逆的酵素インヒビター（付加的分子構造）５３１６を有し、葉酸標的ポルフィリンを有する免疫グロブリンを得る。
【０１２８】
α−ジフルオロメチルオルニチンのメルカプト誘導体を図１８に示されるように下記の通り調製する：アリルアルコール５３１７のテトラヒドロピラニルエーテルを、ｍ−クロロ過安息香酸を用いてエポキシド５３１８に酸化することができる。エポキシド環を水酸化アンモニウムで開環して、アミノアルコール誘導体５３１９を得て、その誘導体上のアミノ基を次にベンズアルデヒドによりシッフ塩基を形成することにより保護して、５３２０を得る。５３２０上のヒドロキシル基をリチウムジイソプロピルアミドと反応させながら、ドライアイス／アセトン浴で冷却した後、Ｓ−ベンジル−ｎ−プロピル臭化物を加えて、５３２１を得る。テトラヒドロピラニル基を酢酸と水で加水分解して５３２２を得て、次にヒドロキシル基を、塩化トシルを用いてトシル誘導体５３２３に変換する。メチルグリシン５３２６上のアミノ基を、ベンズアルデヒドを用いてシッフ塩基として保護して５３２７を得て、これを次にドライアイス／アセトン浴で冷却されたリチウムジイソプロピルアミドで処理した後にクロロジフルオロメタンと反応させて、グリシンの保護ジフルオロメチル誘導体５３２８を得る。ジフルオロメチル誘導体５３２８をリチウムジイソプロピルアミドと反応させながら、ドライアイス／アセトン浴で冷却した後、トシル誘導体５３２３を加えて保護オルニチン誘導体５３２４を得る。保護α−ジフルオロメチルオルニチン５３２４を１Ｎ塩酸による加水分解により脱保護して、メルカプト側鎖を有するオルニチン誘導体５３２５を得る。
【０１２９】
実施例４：フォルメート−ビス−３−インドキシルガラクトシド−ロラカルベフ結合体の合成
工程１試薬の例を図１９に示す。工程１試薬１０４０は、フォルメート誘導体である細胞標的剤１１４０、および変異β−ラクタマーゼの非可逆的インヒビターであるカルバセフェムアナログロラカルベフである付加的分子構造１４４０を付着させた置換ビス−３−インドキシルガラクトシド誘導体であるプラットフォーム構築材料１３４０から構成される。プラットフォーム構築材料を細胞標的剤に直接に付着させて、体内分布、循環および腫瘍侵入を向上させ、かつ潜在的な免疫原性を低減するのに十分に小さい低分子量工程１試薬を与える。
【０１３０】
図１９に示されるように、工程１試薬は、ポリインジゴの会合体を結合させて微小沈殿物を形成することにより細胞内水不溶性ナノプラットフォーム１５４０を形成する。プラットフォーム構築材料はビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジンである。プラットフォーム構築材料の一部または全ては、付加的分子構造１４４０であるロラカルベル−Ｌ−リシル基を含み、これは、工程３二特異的試薬の標的部分である変異β−ラクタマーゼの非可逆的インヒビターである。工程１試薬のこの第４実施例には、担体部分は存在せず、細胞標的剤１１４０は、プラットフォーム構築材料に直接付着させた葉酸誘導体である。葉酸結合体の適度な血漿レベルの４時間の維持は、１細胞あたり約７千万の結合体化分子を、１細胞あたり百万未満のレセプターを発現するがん細胞１００に送達することができ（Ｒｅｄｄｙ ａｎｄ Ｌｏｗ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒ．Ｓｙｓ．１５：５８７−６２７，１９９８）、葉酸レセプター１０１の迅速なターンオーバーが存在することを示す（図１）。
【０１３１】
工程１試薬の合成は下記の通り進む：図２０に示されるように、ビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジン５２０７は上記のように調製され、ジメチルスルホキシドに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスルシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを用いて活性エステル５２１５に変換する。活性エステル５２１５は過剰なエチレンジアミンと反応して、アミノ誘導体５４０１を作る。プテロイン酸５４０２は、そのカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスルシンイミドおよびジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて活性エステルに変換させることができ、その後のグリシルグリシンのベンジルエステルの付加によりグリシルグリシル付加物５４０３を得る。活性炭担持１０％パラジウムおよび水素を用いた接触水素化によるベンジル保護基の除去後に、カルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドにより活性エステル５４０４に変換する。次に、活性エステル５４０４を５４０１と反応させて、腫瘍細胞上の標的葉酸レセプターのために付着させたプテロイル標的剤を有するビスインドキシルガラクトシル誘導体５４０５を得る。
【０１３２】
図２１は、付加的分子構造ロラカルベフが付着したビスインドキシルガラクトシルプラットフォーム構築材料を調製する合成を示す。Ｎα−ＦＭＯＣ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−リジン５４０６はプテロイル−グリシル−グリシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５４０４と反応して、５４０７が得られる。ＦＭＯＣ保護基を塩基により５４０７から除去して５４０８を得て、ビスインドキシルガラクトシル−Ｌ−リジンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５２１５（図２０）と反応してＬ−リシル−Ｌ−リシル−グリシル−グリシル誘導体５４０９を得ることができる。ベンジル保護基を、活性炭担持１０％パラジウムと大気圧下での水素を用いる接触水素化により除去して、５４１０を得る。次に、５４１０上のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドを用いて活性エステル５４１１に変換する。
【０１３３】
図２２に示されるように、ロラカルベフ５２１０上のカルボキシル基を、（ベンジルフェノンヒドラジンおよび酸化第二水銀）から調製されたビフェニルジアゾメタンを用いてベンズヒドリル基により保護して５４１２を得る。カルボキシル保護５４１２は活性エステル（５４１１、図２１）と反応して、５４１３が得られる。活性炭担持１０％パラジウムおよび水素を用いる接触水素化によるベンズヒドリル基の除去は、（付加的分子構造として）ロラカルベフを有するプテロイル標的プラットフォーム構築材料５４１４が得られる。５４０５（図２０）および５４１４（図２２）の混合物の注入により、フォルメートレセプターが２つの誘導体を腫瘍細胞に大量に内部移行することを可能とし（Ｒｅｄｄｙ ａｎｄ Ｌｏｗ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒ．Ｓｙｓ．１５：５８７−６２７，１９９８）、細胞内で、ガラクトシル基は酵素により加水分解され、得られたインドキシルは二量体化して、インジゴ誘導体を形成する。よって、ビスインドキシルガラクトシルプラットフォーム構築材料はポリインジゴ細胞内水不溶性ナノプラットフォームをもたらし、そのナノプラットフォーム上で、ロラカルベフ側鎖は工程３二特異的試薬の結合のための付加的分子構造として付着し、ロラカルベフ側鎖は５４１４から生じたプラットフォーム構築材料の１つが成長ポリマーに取り込まれるときはいつでも取り込まれる。
【０１３４】
実施例５：ＥＧＦ−ＨＰＭＡ−インドキシルガラクトシド−ロラカルベフ結合体の合成
工程１試薬を図２３に示す。工程１試薬１０５０は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）である細胞標的剤１１５０、および置換インドキシルインドキシルガラクトシド誘導体１３５５をその表面に付着させたＨＰＭＡの合成ポリマーであるプラットフォーム構築材料１３５０から構成され、さらにその表面に変異β−ラクタマーゼの非可逆的インヒビターであるカルバセフェムアナログのロラカルベフである付加的分子構造１４５０を有する。図２３に示されるように、工程１試薬は標的細胞１００に内部移行し、ＨＰＭＡプラットフォーム構築材料１３５０の表面上のインドキシル置換基１３５５はインジゴを形成し、その結果として、ＨＰＭＡプラットフォフォーム構築材料を架橋して細胞内水不溶性ナノプラットフォーム１５５０を形成する。
【０１３５】
工程１試薬は、ＨＰＭＡの表面に付着したインドキシル側鎖の二量体化により形成したインジゴ基を用いて、プラットフォーム構築材料であるＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）ポリマーを架橋することにより細胞内水不溶性ナノプラットフォームを形成する。ＨＰＭＡプラットフォーム構築材料として、工程３二特異的試薬の標的部分である変異β−ラクタマーゼの非可逆的インヒビターである付加的分子構造（ロラカルベフの誘導体）が挙げられる。ロラカルベフは、ＨＰＭＡの表面に付着させたインドキシルガラクトシド側鎖から分離側鎖としてＨＰＭＡの表面に付着する。付着インドキシルガラクトシド側鎖および付着ロラカルベフ側鎖を有するＨＰＭＡポリマーを、細胞標的剤上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を付着させることにより標的として、完全な工程１試薬を得る。
【０１３６】
図２４に示されるように、ＨＰＭＡポリマーは、インドキシルガラクトシド５５０３を含むモノマー単位およびアクリル酸のｐ−ニトロフェニルエステル５５０４であるモノマー単位を共重合することにより調製する。アクリル酸−インドキシルガラクトシドモノマー単位に関して、アクリル酸をジクロロへキシルカルボジイミドによりＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５５０１に変換し、２−（３−β−Ｄ−ガラクトシドキシ−インドール−５−オキシ）酢酸のエチレンジアミン誘導体５５０２と反応させて、インドキシルガラクトシドアクリレートモノマー単位５５０３を得る。アクリル酸を、ｐ−ニトロフェノールおよびジシクロへキシルカルボジイミドを用いてアクリル酸−ｐ−ニトロフェニルエステル５５０４に変換する。インドキシルガラクトシドおよび反応性ｐ−ニトロフェニルエステル基を含むポリマー前駆体をＫｏｐｅｃｅｋおよび彼の同僚（Ｏｍｅｌｙａｎｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．５２：２５−３７，１９９８）により記載されたように、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を開始剤として用いて、１０モル％のアクリル酸−インドキシルガラクトシドモノマー単位５５０３、２０モル％アクリル酸ｐ−ニトロフェニルエステルモノマー単位５５０４およびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）をアセトン／ジメチルスルホキシド中で、５０℃、２４時間を共重合することにより調製し、ポリマー中間体５５０５を得る。ロラカルベフはポリマー中間体５５０５のｐ−ニトロフェニルエステル基の一部と反応して、５５０６が得られる。５５０６上の残りのｐ−ニトロフェニルエステルはＥＧＦと反応して、ロラカルベフ付加分子構造５５０７を有するＥＧＦ標的ポリマーが得られる。
【０１３７】
実施例６：ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ−ストレプトアビジン結合体の合成
工程３二特異的試薬の標的部分はＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ酵素である。同位元素捕捉部分は、工程４試薬である放射標識ビオチン誘導体に結合するストレプトアビジンである。
【０１３８】
図３５に概要を示すように、大腸菌株ＪＬＭ１６から容易に単離される酵素ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ５１３０（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：１０６３８−１０６４５，１９９４）はＳ−アセチルチオ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応する。０．５Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７〜７．５に維持しながら、チオ酢酸エステルをＤＭＳＯに溶解し、一定分量ずつリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中のタンパク質に加える。反応を１時間進行させた後、修飾タンパク質５１３１を冷リン酸緩衝液に対して一晩透析する。０．５Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７〜７．５に維持しながら、ストレプトアビジン５１３３をマレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルにより３０分間活性化する。修飾タンパク質５１３４を、ＮＡＰ２５カラムを用いるクロマトグラフィーにより反応物から分離する。Ｓ−アセチルチオアセテート修飾ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ５１３１をヒドロキシルアミンに２時間曝してアセチル保護基を除去して５１３２を得て、次にカラムからのストレプトアビジン溶液５１３４を反応混合物に加えて、タンパク質からチオエーテル結合による結合体を形成させる。タンパク質を２時間反応させた後、溶液を冷リン酸緩衝塩溶液（ｐＨ７．２）に対して透析する。結合体をセファクリルＳ−３００に通して、未結合タンパク質から結合体を分離して、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ−ストレプトアビジン工程３二特異的試薬５１３５を得る。
【０１３９】
実施例７：変異β−ラクタマーゼ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合体の合成
工程３二特異的試薬の標的部分は変異β−ラクタマーゼである。工程３二特異的試薬の適当な同位元素捕捉部分を図２６に概略する（例えば、酵素的触媒作用により放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドを放射標識水不溶性生成物１３１Ｉ−５，５’−ジヨードインジゴに変換することのできるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）。
【０１４０】
工程３二特異的試薬を、組換え生物学を用いて融合タンパク質として調製した。タンパク質発現ベクターは、β−ラクタマーゼＥ１６６ＡおよびＥ１６６Ｎ変異体とのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ融合物の生成のために構築した。Ｅ１６６ＡおよびＥ１６６Ｎ β−ラクタマーゼ変異体は、ｕｎｇ−ｄｕｔ−突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２，１９８７）を用いて構築した一方で、Ｅ１６６Ｎ変異体はオーバーラップ伸長ＰＣＲ（Ｈｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９，１９８９）を用いて構築した。
【０１４１】
２つの異なるベクターを用いて、β−Ｄ−ガラクトシダーゼとβ−ラクタマーゼ変異体との融合物を作り出した。１つの系はファージディスプレイプラスミドｐＴＰ１４５を用いて構築した（Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２５１：１８７−１９７，２０００）（図３６）。このプラスミドの重要な特徴は、独自のＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が、シグナル配列の下流にあるβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）中に前もって設計されたということである（Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２５８：６８８−７０３，１９９６）。このことにより、ＳａｌＩ部位での挿入遺伝子により遺伝子融合物を構築することができる。しかし、このプラスミドはタンパク質の発現のためには設計されていないので、幾つかの付加的な変化が必要とされた。バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩ配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化によりｐＴＰ１４５から除去して、１３６５塩基対（ｂｐ）ＤＮＡフラグメントを遊離させた。酵素により作られた５’突出を、ｄＮＴＰおよびクレノウＤＮＡポリメラーゼによる処理により平滑末端とした。図３６に見られるように、プラスミドをＤＮＡリガーゼにより再環状化してプラスミドｐＣ３を作り出した。次に、ｌａｃＺ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ｂｌａ遺伝子に存在するＳａｌＩ部位に挿入して、プラスミドｐＬａｃＣ３中に遺伝子融合を作り出した。このプラスミドを大腸菌に導入し、これらの細胞における発現融合タンパク質の存在を、抗β−ラクタマーゼ抗体を用いる免疫ブロット法により確認した。最後に、ｂｌａ変異を導入して、Ｅ１６６Ａ置換とＥ１６６Ｎ置換を作り出して、ｐＬａｃＺｂｌａＥ１６６プラスミドを作り出した（図３６）。ＤＮＡ配列決定を実施して、ＤＮＡ配列が正しいことを裏付けた。
【０１４２】
第２の発現系は、市販のプラスミドｐＡＸ４ａ＋（ＭｏＢｉＴｅｃ，Ｉｎｃ．）を用いて開発した。図３７に見られるように、このプラスミドは目的のタンパク質をｌａｃＺ遺伝子に特異的に融合させるために開発された。ｌａｃＺ遺伝子を、β−Ｇａｌタンパク質と目的の融合タンパク質との間のスペーサーとしてコラーゲン領域をコードする配列に融合させる。Ｅ１６６Ｎ変異体をコードするｂｌａ遺伝子はＰＣＲで増幅し、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限酵素フラグメントとして挿入してｂｌａＥ１６６−ｐＡＸ４ａ＋プラスミドを作り出した。ＤＮＡ配列決定を実施して、ｂｌａ遺伝子が他の変異を含まないこと、および融合配列が正確であることを裏付けた。このプラスミドを大腸菌に導入し、タンパク質の発現を抗β−ラクタマーゼ抗体を用いる免疫ブロット法により実証した。これらの大腸菌の調製用増殖により変異β−ラクタマーゼ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ工程３二特異的試薬をアフィニティークロマトグラフィーにより単離することが可能となった。
【０１４３】
実施例８：４−カルボキシベンズアルデヒドにより修飾されたオルニチンデカルボキシラーゼの合成
工程３二特異的試薬の標的部分はオルニチンデカルボキシラーゼ酵素である。同位元素標的部分は、ヒドラジド誘導体である放射標識水溶性工程４試薬およびヒドラゾンの形成により共有結合することのできる反応性有機官能基（アルデヒド基）を有する小有機分子の４−カルボキシベンズアルデヒドである。
【０１４４】
工程３二特異的試薬の調製（図３８）は、反応性有機官能基（アルデヒド基）を有する小有機分子の４−カルボキシベンズアルデヒド５３３０を、工程３二特異的試薬の標的部分であるオルニチンデカルボキシラーゼ５３３２酵素上のアミノ酸残基の一部に、酵素の酵素活性に影響を与えることなく、工程３二特異的試薬の同位元素捕捉部分として付加させることをともなう。テレフタルアルデヒド酸（４−カルボキシベンズアルデヒド５３３０）をジメチルスルホキシドに溶解し、これを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドにより２時間活性化して５３３１を得る。１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて反応物のｐＨを７〜７．５に維持しながら、オルニチンデカルボキシラーゼをリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、活性化４−カルボキシベンズアルデヒド５３３１を含む反応混合物を１００μＬずつ加える。反応後、タンパク質溶液を４℃にてリン酸緩衝食塩水（ｐＨ６．５）中で透析して、低分子量試薬を除去する。
【０１４５】
実施例９：変異β−ラクタマーゼ−抗ＮＩＰ抗体結合体の合成
工程３二特異的試薬の標的部分は変異β−ラクタマーゼである。同位元素捕捉部分は、抗ＮＩＰモノクローナル抗体の結合部位により認識されるハプテン構造１３１Ｉ−６−ニトロ−２−ヨードフェノール（１３１Ｉ−ＮＩＰ）を含有する放射標識水溶性工程４試薬に結合することのできる抗ＮＩＰモノクローナル抗体である。
【０１４６】
ＮＩＰ等の構造に対する適当なモノクローナル抗体は最先端のモノクローナル抗体技術により容易に調製される。そのような抗体からの一本鎖結合領域に対応する遺伝子を調製し、それらを上記の実施例７で論じたように融合タンパク質の産生において変異β−ラクタマーゼ遺伝子とともに使用する操作が開発された。ヒト化抗体を調製し、処置に使用されるそのようなタンパク質に対する免疫応答を低減するマウス抗体で開発された高い親和結合部位を用いることができる技術も開発された。さらに、配列技術を用いて、特定の抗原に対して高い特異性を有するヒト抗体を単離するための方法が実施された。したがって、工程３二特異的試薬に用いられる適切な抗体を作る多数の方法が存在する。図３９に示されるように、０．５Ｎ水酸化ナトリウムで３０分間ｐＨを７〜７．５に維持しながら、抗ＮＩＰモノクローナル抗体５４３３がマレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルと反応できることが経験的に分かっている。修飾タンパク質５４３４を、ＮＡＰ２５カラムを通すことにより試薬から分離する。０．５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを７〜７．５に維持しながら、ＤＭＳＯ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテートの溶液を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の変異β−ラクタマーゼ５４３０の溶液に少しずつ加える。タンパク質溶液５４３１をリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して４℃で透析する。ヒドロキシルアミンの溶液をラクタマーゼ溶液５４３１に加え、２時間反応させて、アセチル保護基を除去して５４３２を得て、次にマレイミジル修飾抗ＮＩＰ抗体溶液５４３４を加えて、２タンパク質を２時間反応させる。溶液を冷リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して４℃で一晩透析する。セファクリルＳ−３００クロマトグラフィーを用いてラクタマーゼ−抗体結合体５４３５をモノマータンパク質から分離して、変異β−ラクタマーゼ−抗ＮＩＰ抗体工程３二特異的試薬５４３５を得る。
【０１４７】
実施例１０：変異β−ラクタマーゼ−アルカリホスファターゼ結合体の合成
工程３二特異的試薬の標的部分は変異β−ラクタマーゼである。工程３二特異的試薬の同位体元素捕捉部分は、酵素触媒反応により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートを放射標識水不溶性生成物１３１Ｉ−５，５’−ジヨードインジゴに変換するアルカリホスファターゼ酵素である。
【０１４８】
図４０に示されるように、０．５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを７〜７．５に３０分間維持しながら、変異β−ラクタマーゼ５５３３はマレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルと反応する。修飾タンパク質５５３４をＮＡＰ２５カラムに通すことにより試薬から分離する。０．５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを７〜７．５に維持しながら、ＤＭＳＯ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテートの溶液を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中のアルカリホスファターゼ５５３０の溶液に少しずつ加える。タンパク質溶液５５３１をリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して４℃で透析する。ヒドロキシルアミンの溶液をアルカリホスファターゼ溶液５５３１に加え、２時間反応させてアセチル保護基を除去して５５３２を得て、次にマレイミジル修飾変異β−ラクタマーゼ溶液５５３４を加えて、２タンパク質を２時間反応させる。溶液を冷リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して４℃で一晩透析する。ラクタマーゼ−アルカリホスファターゼ結合体５５３５を、セファクリルＳ−３００を用いてモノマータンパク質から分離して、工程３二特異的試薬５５３５である変異β−ラクタマーゼ−アルカリホスファターゼを得る。
【０１４９】
実施例１１：９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡの合成
放射標識水溶性工程４試薬の合成の概要を図４１に示す。既に、抗ＥＧＦ抗体−デキストラン−３−インドキシルホスフェート−ホスホエノールピルベート工程１試薬を用いて、付加的分子構造１４００としてインジゴの会合体からなる細胞内ナノプラットフォームを、それらの表面上のホスホエノールピルベート誘導体１４１３とともに作った。この細胞内ナノプラットフォームは、細胞外ナノプラットフォーム１６００を形成する工程２殺細胞試薬および／または天然のがん細胞死滅の作用によりがんの細胞外空間に再配置された。工程３二特異的試薬２０１０であるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ２１１３−ストレプトアビジン２２１３結合体の投与により、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼ標的部分２１１３を、細胞外ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００としてその非可逆的酵素インヒビターホスホエノールピルベート誘導体１４１３に共有結合させることにより細胞外ナノプラットフォームに共有結合させることが可能であり、これによってストレプトアビジン同位元素捕捉部分２２１３を細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着させた。放射標識水溶性工程４試薬９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡ８００３の投与により、細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着させたストレプトアビジン同位元素捕捉部分２２１３上の４結合部位の幾つかに対するビオチン部分の結合を介して非常に高い親和性を有する結合ができるようになるので、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達するための微小領域照射野（ホットスポット）を作るために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に放射標識水溶性工程４試薬９０Ｙ放射同位元素を捕捉する。
【０１５０】
９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡ５１４３の合成の概略を図４２に示す。ＤＯＴＡ５１４０（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸）上のカルボキシル基の１つを、Ｎ−（５−アミノペンチル）ビオチンアミド５１４１と反応してビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡ５１４２（Ｋａｒａｃａｙ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８：５８５−５９４，１９９７）を形成することのできるＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１２：３２０−３２４，２００１）として活性化する。９０ＹＣｌ３に曝すことにより、分子に９０Ｙ放射性同位元素を固く結合したキレートとして積み込んで、放射標識水溶性工程４試薬９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡ５１４３を得る。
【０１５１】
実施例１２：１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドの合成
放射標識水溶性工程４試薬の合成の概略を図４３に示す。既に、トランスフェリン−ヒト血清アルブミン−ビス−３−インドキシルグリコシド−ロラカルベフ工程１試薬を用いて、付加的分子構造としてポリインジゴの会合体からなる細胞内ナノプラットフォームを、それらの表面上のロラカルベフ基とともに作った。この細胞内ナノプラットフォームは、細胞外ナノプラットフォーム１６００を形成する工程２殺細胞試薬および／または天然のがん細胞死滅の作用によりがんの細胞外空間に再配置された。工程３二特異的試薬変異β−ラクタマーゼ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ２０２０の投与により、変異β−ラクタマーゼ標的部分２１２３を、細胞外ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００としてその非可逆的インヒビターロラカルベフ１４２３に共有結合させることにより、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ同位体捕捉部分２２２４を細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合させる。放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド８００４の投与により、細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着させたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ同位元素捕捉部分２２２４に接触させ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ同位体元素捕捉部分２２２４の触媒作用により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド８００４からガラクトシジル基を切断して１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルを遊離させ、これは迅速に酸化二量体化を受けて、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達するための微小領域照射野（ホットスポット）を作るために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に捕捉される放射標識水不溶性生成物１３１Ｉ−５，５’−ジヨードインジゴ８００５を形成する。
【０１５２】
１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド５２４３の合成の概略を図４４に示す。アセチル保護５−ブロモ−３−インドキシルガラクトシド５２４０を、還流トルエン中でビス（トリブチルスズ）およびパラジウムテトラキストリフェニルホスフィンで処理して、トリブチルスズ誘導体５２４１を得て、これをＮａ１３１ＩおよびＮ−クロロスクシンイミドで処理して、アセチル保護放射標識１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド５２４２を得た。メタノール中のナトリウムメトキシドによるアセチル保護基の除去により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシド５２４３を得る。
【０１５３】
実施例１３：１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジドの合成
放射標識水溶性工程４試薬の合成の概要を図４５に示す。既に、葉酸−ヒト免疫アルブミン−ポリフィリン−α−ジフルオロメチルオルニチン工程１試薬を用いて、付加的分子構造としてポルフィリンの会合体からなる細胞内ナノプラットフォームを、それらの表面上のα−ジフルオロメチルオルニチン基とともに作った。続いて、この細胞内ナノプラットフォームを、細胞外ナノプラットフォーム１６００を形成する工程２殺細胞試薬および／または天然のがん細胞死滅の作用によりがんの細胞外空間に再配置させた。付着ベンズアルデヒド基２２３１を有するオリニチンデカルボキシラーゼ２１３３である工程３二特異的試薬２０３０の投与により、オルニチンデカルボキシラーゼ標的部分２１３３を、細胞外ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００としてその非可逆的インヒビターα−ジフルオロメチルオルニチン１４３３と共有結合することにより細胞外ナノプラットフォーム１６００と共有結合することが可能であるので、ベンズアルデヒド基同位体元素捕捉部分２２３１を細胞外ナノプラットフォーム１６００に付着させた。放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジド８０００の投与により、ヒドラゾン７０００として、ヒドラジド基８００１を介して細胞外水不溶性ナノプラットフォーム１６００に付着したベンズアルデヒド基同位元素捕捉部分２２３１と共有結合するので、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達するための微小領域照射野（ホットスポット）を作るために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に放射標識水溶性工程４試薬放射同位元素を捕捉する。
【０１５４】
１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジド５３４５の合成の概略を図４６に示す。メチル−ｐ−ヨードベンゾエート５３４０はヒドラジンと反応してｐ−ヨード安息香酸ヒドラジド５３４１を得る。次に、ヒドラジドを、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボネートを用いてｔ−Ｂｏｃ誘導体５３４２として保護する。ヨード基を、還流トルエン中でビス（トリブチルスズ）およびパラジウムテトラキストリフェニルホスフィンを用いて置換して、トリブチルスズ誘導体５３４３を得て、これをＮａ１３１ＩおよびＮ−クロロスクシンイミドで処理してｔ−Ｂｏｃ保護放射標識１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジド５３４４を得る。トリフルオロ酢酸によるｔ−Ｂｏｃ保護基の除去により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジド５３４５を得ることができる。
【０１５５】
実施例１４：１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸の合成
放射標識水溶性工程４試薬の合成の概要を図４７に示す。既に、フォルメート−ビス−３−インドキシルガラクトシド−ロラカルベフ工程１試薬を用いて、付加的分子構造としてポリインジゴの会合体から構成される細胞内ナノプラットフォームを、それらの表面上のロラカルベフ基とともに作った。続いて、この細胞内ナノプラットフォームを、細胞外ナノプラットフォーム１６００を形成する工程２殺細胞試薬および／または天然のがん細胞死滅の作用によりがんの細胞外空間に再配置させた。工程３二特異的試薬２０４０変異β−ラクタマーゼ−抗ＮＩＰ抗体の投与により、細胞外ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００として変異β−ラクタマーゼ標的部分２１４３をその非可逆的インヒビターロラカルベフ１４４３により共有結合させることにより細胞外ナノプラットフォーム１６００に共有結合させて、抗ＮＩＰ抗体同位元素捕捉部分２２４５を細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合させる。抗ＮＩＰ抗体に対する放射標識ハプテンである放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸８００５（１３１Ｉ−ＮＩＰ酸）の投与により、抗ＮＩＰ抗体同位元素捕捉部分２２４５と高親和性をもって結合するので、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達するための微小領域照射野（ホットスポット）を作るために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に放射標識水溶性工程４試薬放射同位元素を捕捉させる。
【０１５６】
１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸５４４４（１３１Ｉ−ＮＩＰ酸）の合成の概略を図４８に示す。当然のことながら、４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸５４４０（ＮＩＰ酸）上のカルボキシ基とフェノール基は、塩化メチレン中のイソブチレンおよび硫酸を用いるｔ−ブチル基の結合により保護して５４４１を生じる。ヨード基を、還流トルエン中でビス（トリブチルスズ）およびパラジウムテトラキストリフェニルホスフィンを用いて置換して、トリブチルスズ誘導体５４４２を得て、これをＮａ１３１ＩおよびＮ−クロロスクシンイミドで処理してｔ−ブチル保護放射標識１３１Ｉ−放射標識ＮＩＰ酸５４４３を得る。トリフルオロ酢酸による保護基の除去により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸（１３１Ｉ−ＮＩＰ酸）５４４４を得ることができる。
【０１５７】
実施例１５：１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートの合成
放射標識水溶性工程４試薬の合成の概要を図４９に示す。既に、ＥＧＦ−ＨＰＭＡ−３−インドキシルガラクトシド−ロラカルベフ工程１試薬を用いて、付加的分子構造として、（ジッパーのような）インジゴ基により架橋されたＨＰＭＡポリマーからなる細胞内ナノプラットフォームを、それらの表面上のロラカルベフ基とともに作った。続いて、この細胞内ナノプラットフォームを、細胞外ナノプラットフォーム１６００を形成する工程２殺細胞試薬および／または天然のがん細胞死滅の作用によりがんの細胞外空間に再配置させた。工程３二特異的試薬２０５０変異β−ラクタマーゼ−アルカリホスファターゼの投与により、細胞外ナノプラットフォーム１６００上の付加的分子構造１４００として変異β−ラクタマーゼ標的部分２１５３をその非可逆的インヒビターロラカルベフ１４５３へ共有結合させることにより細胞外ナノプラットフォーム１６００に共有結合させて、アルカリホスファターゼ同位元素捕捉部分２２５６を細胞外ナノプラットフォーム１６００に結合させる。放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェート８００６の投与により、細胞外水不溶性ナノプラットフォーム１６００に付着するアルカリホスファターゼ同位元素捕捉部分２２５６に接触させ、アルカリホスファターゼ同位元素捕捉部分２２５６の触媒作用により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェート８００６からリン酸基を切断して１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルを遊離し、これは迅速に酸化二量体化を受けて、致死線量照射を周囲の腫瘍細胞に送達するための微小領域照射野（ホットスポット）を作るために必要とされる時間、腫瘍細胞外マトリックス内に捕捉される放射標識水不溶性生成物１３１Ｉ−５，５’−ジヨードインジゴ８００５を形成する。
【０１５８】
１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェート５５４３の合成の概略を図５０に示す。ベンジル保護５−ブロモ−３−インドキシルホスフェート５５４０を、還流トルエン中でビス（トリブチルスズ）およびパラジウムテトラキストリフェニルホスフィンで処理して、トリブチルスズ誘導体５５４１を得て、これをＮａ１３１ＩおよびＮ−クロロスクシンイミドで処理して、ベンジル保護放射標識１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェート５５４２を得た。トリフルオロ酢酸によるベンジル保護基の除去により、放射標識水溶性工程４試薬１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェート５５４３を得た。
等価物
本発明の特定の実施形態の前記の詳細な説明から、独自の組成物が記載されてきたことが明らかであるに違いない。特定の実施形態が本明細書中において詳細に開示してきたが、これは例示のみの目的のために一例としてなされたものであり、添付の下記請求の範囲に関する限定を意図するものではない。特に、多様な置換、変更および改良が、請求の範囲に定義される発明の精神と範囲から逸脱することなく本発明に対して行なってよいことが本発明により意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、レセプターを有するがん細胞を表す説明図である。
【図２】図２は、工程１試薬を表す説明図である。
【図３】図３は、がん細胞におけるステップ１試薬の蓄積を表す説明図である。
【図４】図４は、がん細胞における水不溶性ナノプラットフォームの形成を表す説明図である。
【図５】図５は、がん細胞におけるナノプラットフォームの継続的な蓄積を表す説明図である。
【図６】図６は、工程１試薬の第１実施例についての工程１試薬を表す説明図である。
【図７】図７は、リンカー分子によるブロモ−インドキシルホスフェートの合成を表す説明図である。
【図８】図８は、工程１試薬の第１実施例についての非可逆的酵素インヒビターによるプラットフォーム構築材料の合成を表す説明図である。
【図９】図９は、工程１試薬の第１実施例についてのプラットフォーム構築材料の結合体化を表す説明図である。
【図９ｂ】図９は、工程１試薬の第１実施例についてのプラットフォーム構築材料の結合体化を表す説明図である。図９ｂ：工程１試薬の第１実施例に関する工程１試薬。
【図１０】図１０は、第２実施例に関する工程１試薬を表す説明図である。
【図１１】図１１は、工程１試薬の第２実施例についてのプラットフォーム構築材料に対するビス−インドキシルの合成を表す説明図である。
【図１２】図１２は、工程１試薬の第２実施例についての非可逆的酵素インヒビターを有するプラットフォーム構築材料の合成を表す説明図である。
【図１３】図１３は、工程１試薬の第２実施例についてのプラットフォーム構築材料の結合体化を表す説明図である。図１３ｂ：工程１試薬の第２実施例に関する工程１試薬。
【図１３ｂ】図１３は、工程１試薬の第２実施例についてのプラットフォーム構築材料の結合体化を表す説明図である。図１３ｂ：工程１試薬の第２実施例に関する工程１試薬。
【図１４】図１４は、工程１試薬の第３実施例についての工程１試薬を表す説明図である。
【図１５】図１５は、工程１試薬の第３実施例についてのプラットフォーム構築材料に対するポルフィリン誘導体の合成を表す説明図である。
【図１６】図１６は、工程１試薬の第３実施例についての非可逆的酵素インヒビターによるプラットフォーム構築材料の合成を表す説明図である。
【図１７】図１７は、工程１試薬の第３実施例についての工程１試薬を表す説明図である。
【図１８】図１８は、工程１試薬の第３実施例についての非可逆的酵素インヒビター誘導体の合成を表す説明図である。
【図１９】図１９は、工程１試薬の第４実施例についての工程１試薬を表す説明図である。
【図２０】図２０は、工程１試薬の第４実施例についての、細胞標的剤によるプラットフォーム構築材料の合成を示す説明図である。
【図２１】図２１は、工程１試薬の第４実施例についての、細胞標的剤によるプラットフォーム構築材料の合成および非可逆的酵素インヒビターに対する位置を表す説明図である。
【図２２】図２２は、工程１試薬の第４実施例についての工程１試薬の合成を表す説明図である。
【図２３】図２３は、工程１試薬の第５実施例についての工程１試薬を表す説明図である。
【図２４】図２４は、工程１試薬の第５実施例についての工程１試薬の合成を表す説明図である。
【図２５】図２５は、工程２細胞殺滅プロセス表す説明図である。
【図２６】図２６は、工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図２７】図２７は、工程３二特異的試薬をナノプラットフォームに固定するヒドラゾンの形成を表す説明図である。
【図２８】図２８は、工程３二特異的試薬をナノプラットフォームに固定するチオエーテルの形成を表す説明図である。
【図２９】図２９は、非可逆的酵素インヒビターに共有結合した工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３０】図３０は、特異的抗体を介してナノプラットフォームに結合した工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３１】図３１は、ヒドラジドである工程４試薬を結合する工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３２】図３２は、非可逆的酵素インヒビターである工程４試薬を結合する工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３３】図３３は、高親和性レセプターを介して工程４試薬を結合する工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３４】図３４は、インドキシルガラクトシドをインジゴ誘導体に変換する酵素を同位体捕捉部分として有する工程３二特異的試薬を表す説明図である。
【図３５】図３５は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼおよびストレプトアビジンから構成される工程３二特異的試薬の合成を表す説明図である。
【図３６】図３６は、β−ラクタマーゼ変異体についてのプラスミドの調製を表す説明図である。
【図３７】図３７は、工程３試薬である変異β−ラクタマーゼ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼについてのプラスミドの調製を表す説明図である。
【図３８】図３８は、工程３二特異的試薬であるアルデヒド側鎖を有するオルニチンデカルボキシラーゼ（すなわち、オルニチンデカルボキシラーゼ−４−カルボキシベンズアルデヒド）の調製を表す説明図である。
【図３９】図３９は、工程３二特異的試薬である変異β−ラクタマーゼ−抗ＮＩＰ抗体の調製を表す説明図である。
【図４０】図４０は、工程３二特異的試薬である変異β−ラクタマーゼ−アルカリホスファターゼの調製を表す説明図である。
【図４１】図４１は、工程４試薬の第１実施例の調製を表す説明図である。
【図４２】図４２は、工程４試薬として用いられる９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡの調製を表す説明図である。
【図４３】図４３は、工程４試薬の第２実施例の調製を表す説明図である。
【図４４】図４４は、工程４試薬として用いられる１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドの調製を表す説明図である。
【図４５】図４５は、工程４試薬の第３実施例の調製を表す説明図である。
【図４６】図４６は、工程４試薬として用いられる１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジドの調製を表す説明図である。
【図４７】図４７は、工程４試薬の第４実施例の調製を表す説明図である。
【図４８】図４８は、工程４試薬として用いられる１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸（１３１Ｉ−ＮＩＰ酸）の調製を表す説明図である。
【図４９】図４９は、工程４試薬の第５実施例の調製を表す説明図である。
【図５０】図５０は、工程４試薬として用いられる１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートの調製を表す説明図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
置換された３−インドキシルホスフェート誘導体に連結された、抗ＥＧＦレセプター抗体、その誘導体またはそのフラグメントを含む組成物。
【請求項２】
前記抗体が前記３−インドキシルホスフェート誘導体に担体部分により連結された、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記担体部分がデキストランである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
さらに、前記３−インドキシルホスフェート誘導体に連結されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼインヒビターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼインヒビターがホスホノエノールピルベート誘導体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
グリコシドまたはその誘導体に連結されたトランスフェリンポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物。
【請求項７】
前記グリコシドがガラクトシド、グルコシドまたはグルクロニドである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記グリコシドが置換ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記トランスフェリンポリペプチドが前記グルコシドに担体部分により連結された、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記担体部分がアルブミンポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
さらに、前記ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体に連結された変異β−ラクタマーゼインヒビターを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記変異β−ラクタマーゼインヒビターがラクタム誘導体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ラクタム誘導体がカルバセフェムアナログである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記カルバセフェムアナログがロラカルベフである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ポルフィリン誘導体に連結されたフォレート誘導体を含む組成物。
【請求項１６】
前記フォレート誘導体が前記ポルフィリン誘導体に担体部分により連結された、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記担体部分が免疫グロブリンポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
さらに、前記ポルフィリン誘導体に連結されたオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターまたはアルギニンデカルボキシラーゼインヒビターを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターがα−ジフルオロメチルオルニチンである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記アルギニンデカルボキシラーゼインヒビターがα−ジフルオロメチルアルギニンである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
置換ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体に連結されたフォレート誘導体を含む組成物。
【請求項２２】
さらに、前記置換ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体に連結された変異β−ラクタマーゼインヒビターを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ＨＰＭＡに連結された上皮細胞増殖因子ポリペプチドを含む組成物。
【請求項２４】
さらに、前記ＨＰＭＡに連結された置換されたインドキシルグリコシド誘導体を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
さらに、前記ＨＰＭＡに連結された変異β−ラクタマーゼインヒビターを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
ストレプトアビジンに連結されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼを含む組成物。
【請求項２７】
β−Ｄ−ガラクトシダーゼに連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物。
【請求項２８】
４−カルボキシベンズアルデヒドに連結された、オルニチンデカルボキシラーゼまたはアルギニンデカルボキシラーゼを含む組成物。
【請求項２９】
抗ＮＩＰ抗体に連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物。
【請求項３０】
アルカリホスファターゼに連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載の組成物および請求項２６に記載の組成物を備えるキット。
【請求項３２】
さらに、９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡを備える、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
さらに、細胞殺傷剤を備える、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
請求項６に記載の組成物および請求項２７に記載の組成物を備えるキット。
【請求項３５】
さらに、１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドを備える、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
さらに、細胞殺傷剤を備える請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
請求項１５に記載の組成物および請求項２８に記載の組成物を備えるキット。
【請求項３８】
さらに、１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジドを備える、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
さらに、細胞殺傷剤を備える請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
請求項２１に記載の組成物および請求項２９に記載の組成物を備えるキット。
【請求項４１】
さらに、１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸を備える、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
さらに、細胞殺傷剤を備える請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
請求項２３に記載の組成物および請求項３０に記載の組成物を備えるキット。
【請求項４４】
さらに、１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートを備える、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
さらに、細胞殺傷剤を備える請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
がんの症状を緩和する方法であって、該がんに罹患した被験体に、
ａ．置換ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体に連結された、トランスフェリンポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物、ここで、変異β−ラクタマーゼインヒビターがビス−３−インドキシルグリコシド誘導体に連結されている、組成物；
ｂ．β−Ｄ−ガラクトシダーゼに連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物；および
ｃ．１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドを含む組成物
を投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
さらに、前記（ｂ）の投与前に細胞殺傷剤を投与する工程を包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
さらに、前記（ｂ）の投与後に細胞殺傷剤を投与する工程を包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
さらに、前記（ｂ）の投与と同時に細胞殺傷剤を投与する工程を包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項１】
置換された３−インドキシルホスフェート誘導体に連結された、抗ＥＧＦレセプター抗体、その誘導体またはそのフラグメントを含む組成物。
【請求項２】
前記抗体が前記３−インドキシルホスフェート誘導体に担体部分により連結された、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記担体部分がデキストランである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
さらに、前記３−インドキシルホスフェート誘導体に連結されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼインヒビターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼインヒビターがホスホノエノールピルベート誘導体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
グリコシドまたはその誘導体に連結されたトランスフェリンポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物。
【請求項７】
前記グリコシドがガラクトシド、グルコシドまたはグルクロニドである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記グリコシドが置換ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記トランスフェリンポリペプチドが前記グルコシドに担体部分により連結された、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記担体部分がアルブミンポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
さらに、前記ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体に連結された変異β−ラクタマーゼインヒビターを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記変異β−ラクタマーゼインヒビターがラクタム誘導体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ラクタム誘導体がカルバセフェムアナログである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記カルバセフェムアナログがロラカルベフである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ポルフィリン誘導体に連結されたフォレート誘導体を含む組成物。
【請求項１６】
前記フォレート誘導体が前記ポルフィリン誘導体に担体部分により連結された、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記担体部分が免疫グロブリンポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
さらに、前記ポルフィリン誘導体に連結されたオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターまたはアルギニンデカルボキシラーゼインヒビターを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターがα−ジフルオロメチルオルニチンである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記アルギニンデカルボキシラーゼインヒビターがα−ジフルオロメチルアルギニンである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
置換ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体に連結されたフォレート誘導体を含む組成物。
【請求項２２】
さらに、前記置換ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体に連結された変異β−ラクタマーゼインヒビターを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ＨＰＭＡに連結された上皮細胞増殖因子ポリペプチドを含む組成物。
【請求項２４】
さらに、前記ＨＰＭＡに連結された置換されたインドキシルグリコシド誘導体を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
さらに、前記ＨＰＭＡに連結された変異β−ラクタマーゼインヒビターを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
ストレプトアビジンに連結されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエノールピルボイルトランスフェラーゼを含む組成物。
【請求項２７】
β−Ｄ−ガラクトシダーゼに連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物。
【請求項２８】
４−カルボキシベンズアルデヒドに連結された、オルニチンデカルボキシラーゼまたはアルギニンデカルボキシラーゼを含む組成物。
【請求項２９】
抗ＮＩＰ抗体に連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物。
【請求項３０】
アルカリホスファターゼに連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載の組成物および請求項２６に記載の組成物を備えるキット。
【請求項３２】
さらに、９０Ｙ−ビオチン−ペンチル−ＤＯＴＡを備える、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
さらに、細胞殺傷剤を備える、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
請求項６に記載の組成物および請求項２７に記載の組成物を備えるキット。
【請求項３５】
さらに、１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドを備える、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
さらに、細胞殺傷剤を備える請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
請求項１５に記載の組成物および請求項２８に記載の組成物を備えるキット。
【請求項３８】
さらに、１３１Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸ヒドラジドを備える、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
さらに、細胞殺傷剤を備える請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
請求項２１に記載の組成物および請求項２９に記載の組成物を備えるキット。
【請求項４１】
さらに、１３１Ｉ−４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸を備える、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
さらに、細胞殺傷剤を備える請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
請求項２３に記載の組成物および請求項３０に記載の組成物を備えるキット。
【請求項４４】
さらに、１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルホスフェートを備える、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
さらに、細胞殺傷剤を備える請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
がんの症状を緩和する方法であって、該がんに罹患した被験体に、
ａ．置換ビス−３−インドキシルグリコシド誘導体に連結された、トランスフェリンポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物、ここで、変異β−ラクタマーゼインヒビターがビス−３−インドキシルグリコシド誘導体に連結されている、組成物；
ｂ．β−Ｄ−ガラクトシダーゼに連結された変異β−ラクタマーゼを含む組成物；および
ｃ．１３１Ｉ−５−ヨード−３−インドキシルガラクトシドを含む組成物
を投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
さらに、前記（ｂ）の投与前に細胞殺傷剤を投与する工程を包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
さらに、前記（ｂ）の投与後に細胞殺傷剤を投与する工程を包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
さらに、前記（ｂ）の投与と同時に細胞殺傷剤を投与する工程を包含する、請求項４６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１３ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１３ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【公表番号】特表２００８−５０７５６２（Ｐ２００８−５０７５６２Ａ）
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２２８３２（Ｐ２００７−５２２８３２）
【出願日】平成１７年７月２５日（２００５．７．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２６２４８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１０１６５
【国際公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【出願人】（５０７０１９９８３）オンコロジック， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２５日（２００５．７．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２６２４８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１０１６５
【国際公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【出願人】（５０７０１９９８３）オンコロジック， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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