アスタキサンチンの保存安定性が高い緑藻抽出物
【課題】緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性を高めるための手段、ならびに高い保存安定性を有するアスタキサンチンを含有する緑藻抽出物を提供すること。
【解決手段】本発明は、アスタキサンチンをフリー体換算で０．５から２０質量％の濃度および少なくとも１つのリン脂質を０．１から１５質量％の濃度で含む緑藻抽出物を提供する。この緑藻抽出物は、アスタキサンチンの保存安定性が高く、６０℃にて１週間保存した後であっても、約８０％以上のアスタキサンチンが残存し得る。
【解決手段】本発明は、アスタキサンチンをフリー体換算で０．５から２０質量％の濃度および少なくとも１つのリン脂質を０．１から１５質量％の濃度で含む緑藻抽出物を提供する。この緑藻抽出物は、アスタキサンチンの保存安定性が高く、６０℃にて１週間保存した後であっても、約８０％以上のアスタキサンチンが残存し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスタキサンチンが高い保存安定性を有するアスタキサンチン含有緑藻抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンは、赤色のカロチノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。そのため、魚類などの色揚げ用飼料、食材用色素、化粧品、健康食品などとして使用されている。
【０００３】
アスタキサンチンは、化学合成されるものの他、天然物由来のものがある。天然物由来のアスタキサンチンは、例えば、オキアミ、アマエビなどのエビ類、ファフィア酵母、藻類などから抽出される。しかし、オキアミ、アマエビ、カニなどの甲殻類、ファフィア酵母などはアスタキサンチン含量が少ないため、これらからのアスタキサンチンの収率は非常に低い。そのため、一般に、アスタキサンチン含量が高い藻類、例えば、ヘマトコッカス属の緑藻から抽出されている。
【０００４】
アスタキサンチンは、熱、酸素、光などに対して不安定であり、藻体の培養液をそのまま保存することは好ましくない。そのため、通常は、アスタキサンチンを含有する藻体は、乾燥形態で保存される（例えば、特許文献１および２参照）。しかし、これらの特許文献１および２においては、乾燥時における熱、酸素、光などに対するアスタキサンチン自身の安定性についての検討がなされていない。例えば、本発明者の研究によれば特許文献２に記載の乾燥方法を用いて単に藻体を乾燥させた場合、藻体中のアスタキサンチンが分解し、アスタキサンチン含量が低下する。
【０００５】
あるいは、アスタキサンチンは、藻体からの抽出物として保存される。アスタキサンチンの抽出は、その不安定性のため、藻体の培養直後に行われる場合が多い（例えば、特許文献３および４参照）。緑藻からのアスタキサンチンの抽出は、有機溶媒抽出法、超臨界抽出法などにより行われている。
【０００６】
ヘマトコッカス藻類から有機溶媒を用いてアスタキサンチンを抽出する場合、溶媒としてエタノール、アセトン、またはヘキサンを用いることが提案されている。得られた抽出物を食品添加物として用いる場合には抽出物中の残留溶媒濃度が考慮されなければならない。さらに、ヘマトコッカス藻類培養液中の栄養源、化学薬品類、クロロフィル類、リン脂質類、ステロール類などが混入するという問題がある（特許文献５参照）。
【０００７】
特許文献５では、有機溶媒抽出法によるアスタキサンチン抽出の欠点を回避する目的で、超臨界抽出法でのアスタキサンチンの抽出が検討されている。補助溶媒を適切に選択することにより、超臨界抽出法で抽出されたアスタキサンチンには、有機溶媒抽出法では避けられなかった、上記のリン脂質、タンパク質、クロロフィル、ステロールなどの混入がほとんどない。しかし、有機溶媒抽出法に比べて、コストアップとなり、工業的生産には不向きである。
【０００８】
さらに、いずれの方法によって抽出された場合でも、アスタキサンチンは、熱、酸素、光などに対して不安定であるため、従来法では、抽出物は窒素雰囲気下で光を遮断し、低温下で扱うことが好ましい。
【特許文献１】特開平７−８２１２号公報
【特許文献２】特開２００４−１２９５０４号公報
【特許文献３】特開平９−１１１１３９号公報
【特許文献４】特公昭５５−３２３５１号公報
【特許文献５】特開２００４−４１１４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性を高めるための手段を提供すること、ならびに高い保存安定性を有するアスタキサンチンを含有する緑藻抽出物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、アスタキサンチンを含む緑藻抽出物中において、従来は不純物であると思われていたリン脂質を、適切なレベルで含むように調整することによって、アスタキサンチンがより安定化され得ることを見い出したことに基づく。
【００１１】
本発明は、フリー体（非エステル化体）換算で０．５から２０質量％の濃度のアスタキサンチンおよび少なくとも１つのリン脂質を含み、該リン脂質の濃度が０．１から１５質量％である、緑藻抽出物を提供する。
【００１２】
ある実施態様では、上記リン脂質の濃度は、１質量％以上、２質量％以上、または２．５質量％以上であり、あるいは上記リン脂質の濃度は、１０質量％以下、７質量％以下、または５質量％以下である。
【００１３】
１つの実施態様では、上記緑藻抽出物はヘマトコッカス属に属する単細胞緑藻類の抽出物である。
【００１４】
さらなる実施態様では、上記緑藻抽出物は緑藻ヘマトコッカス・プルビアリスの抽出物である。
【００１５】
他の実施態様では、上記リン脂質は、ホスファチジルコリンである。
【００１６】
本発明はまた、緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性を高める方法を提供し、該方法は、緑藻抽出物中の少なくとも１つのリン脂質の濃度を測定する工程；少なくとも１つのリン脂質を元来含まない場合は該緑藻抽出物に少なくとも１つのリン脂質を添加する工程；および該緑藻抽出物中のリン脂質濃度を０．１から１５質量％に調整する工程を包含し、該緑藻抽出物は、アスタキサンチンをフリー体換算で０．５から２０質量％の濃度で含む。
【００１７】
本発明はさらに、上記のいずれかの緑藻抽出物を含む食品を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、所定の濃度のアスタキサンチンを含む緑藻抽出物中におけるリン脂質の量を所定の割合になるように調整することにより、緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性が高められる。したがって、アスタキサンチンを抽出物として長期保存することが可能であり、保存に低温を必要としないため、抽出物の取り扱いは容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（緑藻）
本発明に用いられる緑藻は、アスタキサンチンを生産し得る能力がある緑藻であれば、特に制限はない。例えば、ヘマトコッカス（Haematococcus）属に属する単細胞藻類が好ましく用いられる。好ましい緑藻としては、ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）、ヘマトコッカス・ラクストリス（H. lacustris）、ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）などが挙げられる。
【００２０】
ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）としては、独立行政法人国立環境研究所に寄託されているＮＩＥＳ１４４株、米国テキサス大学藻類保存施設に寄託されているＵＴＥＸ２５０５株、デンマークのコペンハーゲン大学のScandinavian Culture Center for Algae and Protozoa, Botanical Instituteに保存されているＫ００８４株などが挙げられる。
【００２１】
ヘマトコッカス・ラクストリス（H. lacustris）としては、ＡＴＣＣに寄託されているＡＴＣＣ３０４０２株および同３０４５３株、東京大学分子細胞生物学研究所に寄託されているＩＡＭ Ｃ−３９２株、同Ｃ−３９３株、同Ｃ−３９４株および同Ｃ−３３９株、あるいはＵＴＥＸ １６株および同２９４株などが挙げられる。
【００２２】
ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）としては、ＵＴＥＸ ＬＢ１０２３株などが挙げられる。
【００２３】
ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）としては、ＵＴＥＸ ５５株が挙げられる。
【００２４】
ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）としては、ＵＴＥＸ ＬＢ１７５８株などが挙げられる。
【００２５】
本発明においては、ヘマトコッカス・プルビアリスが好ましく用いられる。
【００２６】
（緑藻の培養）
アスタキサンチンを含有する緑藻は、アスタキサンチンを生産できるような条件下で上記緑藻を培養することにより得られる。アスタキサンチンの生産条件に特に制限はない。例えば、光照射下、二酸化炭素を通気しつつ、窒素源および微量金属類を含有する培地中で藻体の栄養細胞を増殖させた後、増殖した藻体に、光照射による物理的ストレス、栄養飢餓による生物学的ストレス、過酸化水素および／または鉄化合物の添加による化学物質ストレスなどのストレスを、単独であるいは組み合わせて与えることにより、栄養細胞をシスト化に導く方法が挙げられる。また、炭素源として酢酸などを添加して暗培養を行って栄養増殖させ、次いでシスト化を行ってもよい。培養した緑藻は、遠心分離により回収され、必要に応じて水洗した後、以下で詳述する抽出工程に付される。
【００２７】
（緑藻抽出物）
本発明において「緑藻抽出物」とは、上記の緑藻中に含まれる油分をいい、アスタキサンチンの濃縮・精製が行われていない油分をいう。ここで、濃縮・精製とは、クロマトグラフィーなどの当業者が通常行う分離・精製手段によって、抽出された油分から、さらにアスタキサンチンを選択的に得ることをいう。
【００２８】
アスタキサンチンを含む油分の抽出手段には特に制限はなく、当業者が通常用いる手段が用いられる。例えば、上記のように培養した緑藻を、（１）機械的破砕（例えば、ビーズビーターなど）により破砕すると同時にまたは破砕した後に溶媒によって抽出、（２）機械的破砕後に圧搾によって抽出、および（３）これら（１）と（２）とを組み合わせた抽出が行われる。あるいは、アスタキサンチンは超臨界抽出法を用いて抽出してもよい。抽出に用いられる溶媒としては、クロロホルム、ヘキサン、アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒が挙げられる。抽出に溶媒を利用した場合は、抽出後、当業者が通常用いる手段によって、溶媒が除去される。
【００２９】
アスタキサンチンの抽出に一般に用いられる有機溶媒抽出では、アスタキサンチンは藻体中に存在する他の成分、例えば中性脂質とともに抽出される。抽出溶媒の種類、抽出操作などにもよるが、得られた緑藻抽出物中のアスタキサンチン濃度は、通常、フリー体換算で約０．５〜２０質量％、より通常には約０．５〜１８質量％であり得る。なお、緑藻抽出物中のアスタキサンチンは、培養条件にもよるが、アスタキサンチン脂肪酸モノエステルが主成分である。全アスタキサンチンのうち、アスタキサンチン脂肪酸ジエステルの濃度は１５〜３０質量％程度であり、遊離のアスタキサンチンの濃度は１質量％以下である場合が多い。アスタキサンチンはエステル体ならびにフリー体で存在し得るが、本発明の記載を通して、アスタキサンチンの質量の割合は、フリー体換算で表される。
【００３０】
（リン脂質）
本発明において、リン脂質とは、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびスフィンゴミエリンからなる群より選択される１以上のリン脂質をいう。これらの由来は特に限定されず、天然物由来であっても、化学合成されたものであってもよい。本発明においては、以下で説明するリン脂質の添加の際には、ホスファチジルコリン（レシチン）が好適に採用される。リン脂質は、藻体中に存在し得そしてアスタキサンチンとともに抽出され、あるいは緑藻抽出物に別途添加してもよい。
【００３１】
（緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性の向上）
本発明において、緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性を高める方法は、緑藻抽出物中の少なくとも１つのリン脂質の濃度を測定する工程；少なくとも１つのリン脂質を元来含まない場合は該緑藻抽出物に少なくとも１つのリン脂質を添加する工程；および該緑藻抽出物中においてリン脂質濃度を０．１から１５質量％に調整する工程を包含する。
【００３２】
本発明の緑藻抽出物中の調整されたリン脂質の濃度は、０．１質量％以上、通常０．２質量％以上、好ましくは０．３質量％以上、さらに好ましくは０．４５質量％以上、より好ましくは１質量％以上、なお好ましくは２質量％以上、よりさらに好ましくは２．５質量％以上であり、あるいは調整されたリン脂質の濃度は、１５質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは７質量％以下、さらに好ましくは５質量％以下である。緑藻抽出物中のリン脂質の割合（または濃度）が高すぎると、低温下で抽出物中に沈殿が生じる場合があるので、好ましくない。
【００３３】
リン脂質の濃度が調整された緑藻抽出物中のアスタキサンチン濃度は、フリー体換算で０．５質量％以上であり、好ましくは２質量％以上、より好ましくは３質量％以上、さらに好ましくは５質量％以上、さらにより好ましくは７質量％以上であり、あるいは、約１８質量％以下であり、好ましくは１５質量％以下であり、より好ましくは１２質量％以下である。
【００３４】
緑藻抽出物中のアスタキサンチン（フリー体換算）とリン脂質との割合は、質量比で１：３０〜１：０．００５、好ましくは１：５〜１：０．０５、より好ましくは１：３〜１：０．１である。
【００３５】
超臨界抽出法により得られる緑藻抽出物には、リン脂質はほとんど含まれていない。そのため、緑藻抽出物に適切な量のリン脂質を添加することにより、リン脂質の割合を調整する。一方、溶媒抽出により得られた緑藻抽出物は、緑藻中に存在するリン脂質がアスタキサンチンとともに抽出され得るため、リン脂質を含む場合が多い。したがって、緑藻抽出物中に予め含まれているリン脂質の量（または濃度）に応じて、添加されるべきリン脂質の量が適宜決定される。いずれの場合も、最終的なリン脂質の割合が上記の範囲になるように調整される。本発明においては、緑藻抽出物中のリン脂質の濃度が適切であることを確認することも、リン脂質の割合の調整に包含される。したがって、抽出溶媒を適宜選択することによって、それぞれ本発明の所望の濃度でアスタキサンチンおよびリン脂質を含む緑藻抽出物を得てもよい。
【００３６】
一般的に、溶媒抽出により得られる緑藻抽出物に含まれるリン脂質の濃度を増加させるためには、溶媒中で、藻体をより細かく破砕することが好ましい。溶媒中で藻体をより細かく破砕することにより、細胞膜を構成するリン脂質がより抽出されやすくなる。藻体の破砕には、例えば、ビーズビーター、ホモジナイザーなどの装置が用いられ得る。抽出に用いる溶媒は、エタノールを単独で、またはエタノールと他の有機溶媒とを組み合わせて用いることが好ましいと考えられる。
【００３７】
本発明によれば、上記のようにして、高い保存安定性を有するアスタキサンチンを含有する緑藻抽出物が得られる。この緑藻抽出物を６０℃にて１週間遮光下で保存した場合、この緑藻抽出物中にアスタキサンチンは、初期濃度の少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なお好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％残存する。このように、リン脂質の濃度が適切に調整された緑藻抽出物は、熱に弱いアスタキサンチンの分解が抑制され、緑藻抽出物の保存安定性が高められている。
【００３８】
リン脂質は、生体成分であるだけでなく、食品添加物として、乳化剤として、そして食品として使用される物質である。そのため、緑藻抽出物中に少なくとも１つのリン脂質が存在しても、特に問題はなく、保存後にリン脂質を除去しなくてもよい。
【００３９】
（高い保存安定性を有するアスタキサンチンを含有する緑藻抽出物を含む食品）
本発明の食品は、リン脂質の濃度が所定の範囲になるように調整された緑藻抽出物を含む。このような緑藻抽出物は、そのまま食品として摂取してもよく、あるいは、例えば、食品としての摂取量を調節しやすいように、適切な植物油などで所定の濃度のアスタキサンチンを含む食品となるように希釈され得る。この場合、さらにリン脂質を添加して、アスタキサンチンの保存安定性を向上させてもよい。好適には、保存安定性が向上された緑藻抽出物は、そのままあるいは希釈されて、カプセル剤の形態に加工され得る。あるいは、乳化剤または可溶化剤とともに水溶液に緑藻抽出物を分散または溶解させて、飲料として提供され得る。
【実施例】
【００４０】
以下に、ヘマトコッカス・プルビアリスＫ００８４株を用いた実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に制限されない。なお、本実施例において、アスタキサンチン量、リン脂質量、および水分量は、以下の方法で測定した。
【００４１】
（アスタキサンチン量の測定）
緑藻抽出物中のアスタキサンチン量は、以下の方法で測定した。まず、所定量の緑藻抽出物をＤＭＳＯにて適宜希釈したのち、４９２ｎｍの吸光度を測定し、以下の式から希釈液中のアスタキサンチン濃度（フリー体換算）を求め、この値から希釈前の抽出物中のアスタキサンチン濃度を求めた。
【００４２】
アスタキサンチン濃度（質量％）＝（Ａ＊１００＊Ｆ）／（Ｗ＊２０８５）
ここで、Ａは、希釈液の４９２ｎｍにおける吸光度（光路長１ｃｍ）、
Ｆは、希釈液の希釈倍率、および
Ｗは、希釈液の質量（ｇ）である。
【００４３】
（リン脂質量の測定）
リンの定量に一般的に用いられているモリブデン青法（例えば、「衛生試験法・注解 ２００５」（日本薬学会編，金原出版）に記載のリンモリブデン酸によるリンの定量法）によって得られた測定値（リン量）に、２６．０３を乗じて得られた値をレシチン量とした。
【００４４】
（水分量の測定）
水分量は、常圧加熱乾燥法（例えば、「食品衛生検査指針 理化学編」（厚生労働省監修，社団法人 日本食品衛生協会，２００５年）に記載）によって測定した。すなわち、所定の温度に調節した定温乾燥機に秤量容器を蓋とともに入れ、１時間加熱後デシケーターに移す。放冷して秤量容器の温度が室温に達したら、直ちに０．１ｍｇ単位まで秤量する。恒量（Ｗ０ｇ）に達するまで、加熱、放冷、および秤量の操作を繰り返す。次いで、１〜２ｇの試料を素早く採取し、秤量容器上に平らに広げ、蓋をし、正確に秤量（Ｗ１ｇ）する。秤量容器を定温乾燥機の中に蓋をずらして入れる。定温乾燥機が１０５℃に達してから、３時間乾燥後、乾燥機中で素早く秤量容器に蓋をし、デシケーターに移し放冷する。室温に達したら直ちに秤量する（Ｗ２ｇ）。試料中の水分含量は以下の式で求められる。
試料中の水分（％）＝（Ｗ１−Ｗ２）／（Ｗ１−Ｗ０）×１００
【００４５】
（実施例１：緑藻抽出物の調製−１）
アスタキサンチンを生産するヘマトコッカス・プルビアリスＫ００８４株（以下、単にＫ００８４株という）を用いた。１．５Ｌ容のライトパス２５ｍｍの密閉式扁平培養瓶に、以下の表１に示す成分を有するＭＢＧ−１１培地を１Ｌ入れ、初発の濃度が０．６ｇ／ＬとなるようにＫ００８４株を培地に接種した。
【００４６】
【表１】
【００４７】
３容積％のＣＯ２を含むガスを６００ｍＬ／分の速度で（すなわち、０．６ｖｖｍで）通気しながら、培養温度２５℃、ｐＨを６〜８の間で調整し、以下に示す光照射条件下で５日間Ｋ００８４株を培養した。光照射は、光源として白色蛍光灯（松下電器産業株式会社製、ＦＬ４０ＳＳＷ／３７）を用いた。光照射の強度は、ＬＩＣＯＲ−１９０ＳＡ平面光量子センサーを用いて測定した培養槽受光方向の光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）が１００μｍｏｌ−ｐ／ｍ２ｓとなるように、光照射の強度を調整した。培養後のＫ００８４株は、緑色から茶〜茶褐色に変色しており、Ｋ００８４株がシスト化したことが確認された。
【００４８】
次いで、上記と同じ扁平培養瓶中に同じ培地（ＭＢＧ−１１培地）を入れ、初発の濃度が０．６ｇ／Ｌとなるようにシスト化したＫ００８４株を接種し、上記と同じ培養条件で２００時間培養した。
【００４９】
得られた緑藻を、遠心分離により回収し、水洗し、ビーズビーターに入れた。ヘキサンを加え、ビーズビーターで５分間破砕した。このように、溶媒中で緑藻を細かく破砕することによって、細胞膜成分であるレシチンがより多く抽出される。得られた混合物を、遠心分離機で上清と沈殿とに分け、上清を回収した。沈殿に再びヘキサンを加え上記と同様の操作を、沈殿の色がほぼ完全に白くなるまで繰り返した。回収したヘキサン画分を合わせ、ヘキサンを留去して緑藻抽出物を得た。得られた緑藻抽出物中のアスタキサンチン濃度は、フリー体換算で９質量％であり、リン脂質濃度は０．９質量％であり、そして水分量は０．２質量％であった。
【００５０】
（実施例２：リン脂質の含有量の検討−１）
上記実施例１で得られた緑藻抽出物（リン脂質：０．９質量％；アスタキサンチン：９質量％）に、リン脂質（大豆由来レシチン、和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ２．７質量％、４．５質量％、１０質量％、または１５質量％の濃度になるように添加して、試料を調製した。各試料の約５００ｍｇずつをそれぞれ２本の１０ｍＬ容のバイアル瓶に入れ、アスタキサンチンの初期濃度を上記のようにして測定した。次いで、これらを６０℃に設定した恒温器に入れた。１週間保存した後、再度アスタキサンチンの濃度を測定し、残存率を算出した。結果を図１に示す。
【００５１】
図１からわかるように、緑藻抽出物が２．７質量％の割合でリン脂質を含む場合、６０℃という苛酷な条件下で１週間保存しても、９０％以上のアスタキサンチンが残存し、緑藻抽出物が０．９質量％の割合でリン脂質を含む場合、少なくとも７５％のアスタキサンチンが残存していた。特に、緑藻抽出物にリン脂質を追加した場合、非常にアスタキサンチンの残存率が高いことがわかる。
【００５２】
（実施例３：リン脂質の含有量の検討−２）
上記実施例１で得られた緑藻抽出物の一部を、大豆油（日清オイリオグループ株式会社製）で２倍希釈して、アスタキサンチンをフリー体換算で４．５質量％の濃度で含む希釈抽出物を得た。希釈した緑藻抽出物（リン脂質：０．４５質量％）について、リン脂質（大豆由来レシチン、和光純薬工業株式会社製）を０．９質量％、２．７質量％、４．５質量％、１０質量％、または１５質量％の濃度になるように添加して、試料を調製した。また、上記実施例１で得られた緑藻抽出物の一部を、大豆油で３倍および９倍希釈して、それぞれリン脂質濃度が０．３質量％（アスタキサンチン：３質量％）および０．１質量％（アスタキサンチン：１質量％）の希釈抽出物を得た。各試料の約５００ｍｇずつをそれぞれ２本の１０ｍＬ容のバイアル瓶に入れ、アスタキサンチンの初期濃度を上記のようにして測定した。次いで、これらを６０℃に設定した恒温器に入れた。１週間保存した後、再度アスタキサンチンの濃度を測定し、残存率を算出した。結果を図２に示す。
【００５３】
図２からわかるように、緑藻抽出物が０．４５質量％以上の割合でリン脂質を含む場合、６０℃という苛酷な条件下で１週間保存しても、約８０％以上のアスタキサンチンが残存していた。一方、リン脂質濃度が低くなるほど、アスタキサンチンの残存率が低下していた。なお、アスタキサンチンをフリー体換算で１２質量％の割合で含む緑藻抽出物についても同様の実験を行い、同様の結果を得た。
【００５４】
（比較例１：リン脂質を含まない試料におけるアスタキサンチンの安定性の検討）
上記実施例１と同様の操作によって培養して得られたシスト化したＫ００８４株を、遠心分離により回収した。乾燥藻体５ｇを同量の珪藻土と混合し、乳鉢で破砕し、超臨界ＣＯ２抽出装置「Ｓｐｅ−ｅｄ ＳＦＥ」（朝日ライフサイエンス株式会社）を用いて超臨界抽出した。抽出は、圧力４００ｂａｒ、抽出温度５０℃、二酸化炭素流量１Ｌ／ｍｉｎで超臨界ＣＯ２を供給して行った。得られた超臨界抽出物中のアスタキサンチン濃度は、フリー体換算で３０質量％であり、リン脂質濃度は検出限界（０．０１質量％）以下であった。
【００５５】
得られた超臨界抽出物の約５００ｍｇずつをそれぞれ２本の１０ｍＬ容のバイアル瓶に入れ、アスタキサンチンの初期濃度を上記のようにして測定した。次いで、これらを６０℃に設定した恒温器に入れた。１週間保存した後、再度アスタキサンチンの濃度を測定した。その結果、アスタキサンチンの残存率は０．２％であり、この抽出物中のアスタキサンチンの安定性が非常に悪いことがわかった。
【００５６】
（実施例４：ＵＶ照射に対する安定性の検討）
上記実施例１で得られた緑藻抽出物の一部を、オリーブ油（日清オイリオグループ株式会社製）で２倍希釈して、アスタキサンチンをフリー体換算で４．５質量％の濃度で含む希釈抽出物を得た。緑藻抽出物（リン脂質：０．９質量％；アスタキサンチン：９質量％）および希釈抽出物（リン脂質：０．４５質量％；アスタキサンチン：４．５質量％）のそれぞれについて、リン脂質（大豆由来レシチン、和光純薬工業株式会社製）を０．９質量％、２．７質量％、４．５質量％、１０質量％、または１５質量％の濃度になるように添加して、試料を調製した。各試料の約５００ｍｇずつをそれぞれ２本の１０ｍＬ容のバイアル瓶に入れた。次いで、これらのバイアル瓶を、ＵＶ照射装置（卓上照射装置ＤＴ−３５ＬＰ：アトー株式会社製）上に載せ、３６５ｎｍで１週間照射した。１週間保存した後、アスタキサンチンの濃度を測定した。その結果、リン脂質を添加した場合にはいずれもアスタキサンチンの残存率が高く（約８０％以上残存）、上記実施例２および３と同様の傾向がみられた。
【００５７】
（実施例５：緑藻抽出物の調製−２）
抽出溶媒としてヘキサンの代わりにエタノールを用いたこと以外は、上記実施例１と同様に操作して、緑藻抽出物を得た。得られた緑藻抽出物中のアスタキサンチン濃度は、フリー体換算で８．１質量％であり、リン脂質濃度は１．７質量％であり、そして水分量は０．３質量％であった。次いで、これを６０℃に設定した恒温器に入れて１週間保存した後、再度アスタキサンチンの濃度を測定した。その結果、アスタキサンチンの残存率は高かった（８５％）。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によれば、緑藻抽出物中のリン脂質の濃度を特定のレベルに調整することにより、高い保存安定性を有するアスタキサンチンを含有する緑藻抽出物が提供される。したがって、アスタキサンチンを抽出物として長期保存することが可能であり、保存に低温を必要としないため、取り扱いが容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】６０℃にて１週間保存した本発明の緑藻抽出物中のアスタキサンチン残存率とリン脂質（レシチン）濃度との関係を示すグラフである。
【図２】６０℃にて１週間保存した希釈した本発明の緑藻抽出物中のアスタキサンチン残存率とリン脂質（レシチン）濃度との関係を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスタキサンチンが高い保存安定性を有するアスタキサンチン含有緑藻抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンは、赤色のカロチノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。そのため、魚類などの色揚げ用飼料、食材用色素、化粧品、健康食品などとして使用されている。
【０００３】
アスタキサンチンは、化学合成されるものの他、天然物由来のものがある。天然物由来のアスタキサンチンは、例えば、オキアミ、アマエビなどのエビ類、ファフィア酵母、藻類などから抽出される。しかし、オキアミ、アマエビ、カニなどの甲殻類、ファフィア酵母などはアスタキサンチン含量が少ないため、これらからのアスタキサンチンの収率は非常に低い。そのため、一般に、アスタキサンチン含量が高い藻類、例えば、ヘマトコッカス属の緑藻から抽出されている。
【０００４】
アスタキサンチンは、熱、酸素、光などに対して不安定であり、藻体の培養液をそのまま保存することは好ましくない。そのため、通常は、アスタキサンチンを含有する藻体は、乾燥形態で保存される（例えば、特許文献１および２参照）。しかし、これらの特許文献１および２においては、乾燥時における熱、酸素、光などに対するアスタキサンチン自身の安定性についての検討がなされていない。例えば、本発明者の研究によれば特許文献２に記載の乾燥方法を用いて単に藻体を乾燥させた場合、藻体中のアスタキサンチンが分解し、アスタキサンチン含量が低下する。
【０００５】
あるいは、アスタキサンチンは、藻体からの抽出物として保存される。アスタキサンチンの抽出は、その不安定性のため、藻体の培養直後に行われる場合が多い（例えば、特許文献３および４参照）。緑藻からのアスタキサンチンの抽出は、有機溶媒抽出法、超臨界抽出法などにより行われている。
【０００６】
ヘマトコッカス藻類から有機溶媒を用いてアスタキサンチンを抽出する場合、溶媒としてエタノール、アセトン、またはヘキサンを用いることが提案されている。得られた抽出物を食品添加物として用いる場合には抽出物中の残留溶媒濃度が考慮されなければならない。さらに、ヘマトコッカス藻類培養液中の栄養源、化学薬品類、クロロフィル類、リン脂質類、ステロール類などが混入するという問題がある（特許文献５参照）。
【０００７】
特許文献５では、有機溶媒抽出法によるアスタキサンチン抽出の欠点を回避する目的で、超臨界抽出法でのアスタキサンチンの抽出が検討されている。補助溶媒を適切に選択することにより、超臨界抽出法で抽出されたアスタキサンチンには、有機溶媒抽出法では避けられなかった、上記のリン脂質、タンパク質、クロロフィル、ステロールなどの混入がほとんどない。しかし、有機溶媒抽出法に比べて、コストアップとなり、工業的生産には不向きである。
【０００８】
さらに、いずれの方法によって抽出された場合でも、アスタキサンチンは、熱、酸素、光などに対して不安定であるため、従来法では、抽出物は窒素雰囲気下で光を遮断し、低温下で扱うことが好ましい。
【特許文献１】特開平７−８２１２号公報
【特許文献２】特開２００４−１２９５０４号公報
【特許文献３】特開平９−１１１１３９号公報
【特許文献４】特公昭５５−３２３５１号公報
【特許文献５】特開２００４−４１１４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性を高めるための手段を提供すること、ならびに高い保存安定性を有するアスタキサンチンを含有する緑藻抽出物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、アスタキサンチンを含む緑藻抽出物中において、従来は不純物であると思われていたリン脂質を、適切なレベルで含むように調整することによって、アスタキサンチンがより安定化され得ることを見い出したことに基づく。
【００１１】
本発明は、フリー体（非エステル化体）換算で０．５から２０質量％の濃度のアスタキサンチンおよび少なくとも１つのリン脂質を含み、該リン脂質の濃度が０．１から１５質量％である、緑藻抽出物を提供する。
【００１２】
ある実施態様では、上記リン脂質の濃度は、１質量％以上、２質量％以上、または２．５質量％以上であり、あるいは上記リン脂質の濃度は、１０質量％以下、７質量％以下、または５質量％以下である。
【００１３】
１つの実施態様では、上記緑藻抽出物はヘマトコッカス属に属する単細胞緑藻類の抽出物である。
【００１４】
さらなる実施態様では、上記緑藻抽出物は緑藻ヘマトコッカス・プルビアリスの抽出物である。
【００１５】
他の実施態様では、上記リン脂質は、ホスファチジルコリンである。
【００１６】
本発明はまた、緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性を高める方法を提供し、該方法は、緑藻抽出物中の少なくとも１つのリン脂質の濃度を測定する工程；少なくとも１つのリン脂質を元来含まない場合は該緑藻抽出物に少なくとも１つのリン脂質を添加する工程；および該緑藻抽出物中のリン脂質濃度を０．１から１５質量％に調整する工程を包含し、該緑藻抽出物は、アスタキサンチンをフリー体換算で０．５から２０質量％の濃度で含む。
【００１７】
本発明はさらに、上記のいずれかの緑藻抽出物を含む食品を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、所定の濃度のアスタキサンチンを含む緑藻抽出物中におけるリン脂質の量を所定の割合になるように調整することにより、緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性が高められる。したがって、アスタキサンチンを抽出物として長期保存することが可能であり、保存に低温を必要としないため、抽出物の取り扱いは容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（緑藻）
本発明に用いられる緑藻は、アスタキサンチンを生産し得る能力がある緑藻であれば、特に制限はない。例えば、ヘマトコッカス（Haematococcus）属に属する単細胞藻類が好ましく用いられる。好ましい緑藻としては、ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）、ヘマトコッカス・ラクストリス（H. lacustris）、ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）などが挙げられる。
【００２０】
ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）としては、独立行政法人国立環境研究所に寄託されているＮＩＥＳ１４４株、米国テキサス大学藻類保存施設に寄託されているＵＴＥＸ２５０５株、デンマークのコペンハーゲン大学のScandinavian Culture Center for Algae and Protozoa, Botanical Instituteに保存されているＫ００８４株などが挙げられる。
【００２１】
ヘマトコッカス・ラクストリス（H. lacustris）としては、ＡＴＣＣに寄託されているＡＴＣＣ３０４０２株および同３０４５３株、東京大学分子細胞生物学研究所に寄託されているＩＡＭ Ｃ−３９２株、同Ｃ−３９３株、同Ｃ−３９４株および同Ｃ−３３９株、あるいはＵＴＥＸ １６株および同２９４株などが挙げられる。
【００２２】
ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）としては、ＵＴＥＸ ＬＢ１０２３株などが挙げられる。
【００２３】
ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）としては、ＵＴＥＸ ５５株が挙げられる。
【００２４】
ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）としては、ＵＴＥＸ ＬＢ１７５８株などが挙げられる。
【００２５】
本発明においては、ヘマトコッカス・プルビアリスが好ましく用いられる。
【００２６】
（緑藻の培養）
アスタキサンチンを含有する緑藻は、アスタキサンチンを生産できるような条件下で上記緑藻を培養することにより得られる。アスタキサンチンの生産条件に特に制限はない。例えば、光照射下、二酸化炭素を通気しつつ、窒素源および微量金属類を含有する培地中で藻体の栄養細胞を増殖させた後、増殖した藻体に、光照射による物理的ストレス、栄養飢餓による生物学的ストレス、過酸化水素および／または鉄化合物の添加による化学物質ストレスなどのストレスを、単独であるいは組み合わせて与えることにより、栄養細胞をシスト化に導く方法が挙げられる。また、炭素源として酢酸などを添加して暗培養を行って栄養増殖させ、次いでシスト化を行ってもよい。培養した緑藻は、遠心分離により回収され、必要に応じて水洗した後、以下で詳述する抽出工程に付される。
【００２７】
（緑藻抽出物）
本発明において「緑藻抽出物」とは、上記の緑藻中に含まれる油分をいい、アスタキサンチンの濃縮・精製が行われていない油分をいう。ここで、濃縮・精製とは、クロマトグラフィーなどの当業者が通常行う分離・精製手段によって、抽出された油分から、さらにアスタキサンチンを選択的に得ることをいう。
【００２８】
アスタキサンチンを含む油分の抽出手段には特に制限はなく、当業者が通常用いる手段が用いられる。例えば、上記のように培養した緑藻を、（１）機械的破砕（例えば、ビーズビーターなど）により破砕すると同時にまたは破砕した後に溶媒によって抽出、（２）機械的破砕後に圧搾によって抽出、および（３）これら（１）と（２）とを組み合わせた抽出が行われる。あるいは、アスタキサンチンは超臨界抽出法を用いて抽出してもよい。抽出に用いられる溶媒としては、クロロホルム、ヘキサン、アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒が挙げられる。抽出に溶媒を利用した場合は、抽出後、当業者が通常用いる手段によって、溶媒が除去される。
【００２９】
アスタキサンチンの抽出に一般に用いられる有機溶媒抽出では、アスタキサンチンは藻体中に存在する他の成分、例えば中性脂質とともに抽出される。抽出溶媒の種類、抽出操作などにもよるが、得られた緑藻抽出物中のアスタキサンチン濃度は、通常、フリー体換算で約０．５〜２０質量％、より通常には約０．５〜１８質量％であり得る。なお、緑藻抽出物中のアスタキサンチンは、培養条件にもよるが、アスタキサンチン脂肪酸モノエステルが主成分である。全アスタキサンチンのうち、アスタキサンチン脂肪酸ジエステルの濃度は１５〜３０質量％程度であり、遊離のアスタキサンチンの濃度は１質量％以下である場合が多い。アスタキサンチンはエステル体ならびにフリー体で存在し得るが、本発明の記載を通して、アスタキサンチンの質量の割合は、フリー体換算で表される。
【００３０】
（リン脂質）
本発明において、リン脂質とは、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびスフィンゴミエリンからなる群より選択される１以上のリン脂質をいう。これらの由来は特に限定されず、天然物由来であっても、化学合成されたものであってもよい。本発明においては、以下で説明するリン脂質の添加の際には、ホスファチジルコリン（レシチン）が好適に採用される。リン脂質は、藻体中に存在し得そしてアスタキサンチンとともに抽出され、あるいは緑藻抽出物に別途添加してもよい。
【００３１】
（緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性の向上）
本発明において、緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性を高める方法は、緑藻抽出物中の少なくとも１つのリン脂質の濃度を測定する工程；少なくとも１つのリン脂質を元来含まない場合は該緑藻抽出物に少なくとも１つのリン脂質を添加する工程；および該緑藻抽出物中においてリン脂質濃度を０．１から１５質量％に調整する工程を包含する。
【００３２】
本発明の緑藻抽出物中の調整されたリン脂質の濃度は、０．１質量％以上、通常０．２質量％以上、好ましくは０．３質量％以上、さらに好ましくは０．４５質量％以上、より好ましくは１質量％以上、なお好ましくは２質量％以上、よりさらに好ましくは２．５質量％以上であり、あるいは調整されたリン脂質の濃度は、１５質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは７質量％以下、さらに好ましくは５質量％以下である。緑藻抽出物中のリン脂質の割合（または濃度）が高すぎると、低温下で抽出物中に沈殿が生じる場合があるので、好ましくない。
【００３３】
リン脂質の濃度が調整された緑藻抽出物中のアスタキサンチン濃度は、フリー体換算で０．５質量％以上であり、好ましくは２質量％以上、より好ましくは３質量％以上、さらに好ましくは５質量％以上、さらにより好ましくは７質量％以上であり、あるいは、約１８質量％以下であり、好ましくは１５質量％以下であり、より好ましくは１２質量％以下である。
【００３４】
緑藻抽出物中のアスタキサンチン（フリー体換算）とリン脂質との割合は、質量比で１：３０〜１：０．００５、好ましくは１：５〜１：０．０５、より好ましくは１：３〜１：０．１である。
【００３５】
超臨界抽出法により得られる緑藻抽出物には、リン脂質はほとんど含まれていない。そのため、緑藻抽出物に適切な量のリン脂質を添加することにより、リン脂質の割合を調整する。一方、溶媒抽出により得られた緑藻抽出物は、緑藻中に存在するリン脂質がアスタキサンチンとともに抽出され得るため、リン脂質を含む場合が多い。したがって、緑藻抽出物中に予め含まれているリン脂質の量（または濃度）に応じて、添加されるべきリン脂質の量が適宜決定される。いずれの場合も、最終的なリン脂質の割合が上記の範囲になるように調整される。本発明においては、緑藻抽出物中のリン脂質の濃度が適切であることを確認することも、リン脂質の割合の調整に包含される。したがって、抽出溶媒を適宜選択することによって、それぞれ本発明の所望の濃度でアスタキサンチンおよびリン脂質を含む緑藻抽出物を得てもよい。
【００３６】
一般的に、溶媒抽出により得られる緑藻抽出物に含まれるリン脂質の濃度を増加させるためには、溶媒中で、藻体をより細かく破砕することが好ましい。溶媒中で藻体をより細かく破砕することにより、細胞膜を構成するリン脂質がより抽出されやすくなる。藻体の破砕には、例えば、ビーズビーター、ホモジナイザーなどの装置が用いられ得る。抽出に用いる溶媒は、エタノールを単独で、またはエタノールと他の有機溶媒とを組み合わせて用いることが好ましいと考えられる。
【００３７】
本発明によれば、上記のようにして、高い保存安定性を有するアスタキサンチンを含有する緑藻抽出物が得られる。この緑藻抽出物を６０℃にて１週間遮光下で保存した場合、この緑藻抽出物中にアスタキサンチンは、初期濃度の少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なお好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％残存する。このように、リン脂質の濃度が適切に調整された緑藻抽出物は、熱に弱いアスタキサンチンの分解が抑制され、緑藻抽出物の保存安定性が高められている。
【００３８】
リン脂質は、生体成分であるだけでなく、食品添加物として、乳化剤として、そして食品として使用される物質である。そのため、緑藻抽出物中に少なくとも１つのリン脂質が存在しても、特に問題はなく、保存後にリン脂質を除去しなくてもよい。
【００３９】
（高い保存安定性を有するアスタキサンチンを含有する緑藻抽出物を含む食品）
本発明の食品は、リン脂質の濃度が所定の範囲になるように調整された緑藻抽出物を含む。このような緑藻抽出物は、そのまま食品として摂取してもよく、あるいは、例えば、食品としての摂取量を調節しやすいように、適切な植物油などで所定の濃度のアスタキサンチンを含む食品となるように希釈され得る。この場合、さらにリン脂質を添加して、アスタキサンチンの保存安定性を向上させてもよい。好適には、保存安定性が向上された緑藻抽出物は、そのままあるいは希釈されて、カプセル剤の形態に加工され得る。あるいは、乳化剤または可溶化剤とともに水溶液に緑藻抽出物を分散または溶解させて、飲料として提供され得る。
【実施例】
【００４０】
以下に、ヘマトコッカス・プルビアリスＫ００８４株を用いた実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に制限されない。なお、本実施例において、アスタキサンチン量、リン脂質量、および水分量は、以下の方法で測定した。
【００４１】
（アスタキサンチン量の測定）
緑藻抽出物中のアスタキサンチン量は、以下の方法で測定した。まず、所定量の緑藻抽出物をＤＭＳＯにて適宜希釈したのち、４９２ｎｍの吸光度を測定し、以下の式から希釈液中のアスタキサンチン濃度（フリー体換算）を求め、この値から希釈前の抽出物中のアスタキサンチン濃度を求めた。
【００４２】
アスタキサンチン濃度（質量％）＝（Ａ＊１００＊Ｆ）／（Ｗ＊２０８５）
ここで、Ａは、希釈液の４９２ｎｍにおける吸光度（光路長１ｃｍ）、
Ｆは、希釈液の希釈倍率、および
Ｗは、希釈液の質量（ｇ）である。
【００４３】
（リン脂質量の測定）
リンの定量に一般的に用いられているモリブデン青法（例えば、「衛生試験法・注解 ２００５」（日本薬学会編，金原出版）に記載のリンモリブデン酸によるリンの定量法）によって得られた測定値（リン量）に、２６．０３を乗じて得られた値をレシチン量とした。
【００４４】
（水分量の測定）
水分量は、常圧加熱乾燥法（例えば、「食品衛生検査指針 理化学編」（厚生労働省監修，社団法人 日本食品衛生協会，２００５年）に記載）によって測定した。すなわち、所定の温度に調節した定温乾燥機に秤量容器を蓋とともに入れ、１時間加熱後デシケーターに移す。放冷して秤量容器の温度が室温に達したら、直ちに０．１ｍｇ単位まで秤量する。恒量（Ｗ０ｇ）に達するまで、加熱、放冷、および秤量の操作を繰り返す。次いで、１〜２ｇの試料を素早く採取し、秤量容器上に平らに広げ、蓋をし、正確に秤量（Ｗ１ｇ）する。秤量容器を定温乾燥機の中に蓋をずらして入れる。定温乾燥機が１０５℃に達してから、３時間乾燥後、乾燥機中で素早く秤量容器に蓋をし、デシケーターに移し放冷する。室温に達したら直ちに秤量する（Ｗ２ｇ）。試料中の水分含量は以下の式で求められる。
試料中の水分（％）＝（Ｗ１−Ｗ２）／（Ｗ１−Ｗ０）×１００
【００４５】
（実施例１：緑藻抽出物の調製−１）
アスタキサンチンを生産するヘマトコッカス・プルビアリスＫ００８４株（以下、単にＫ００８４株という）を用いた。１．５Ｌ容のライトパス２５ｍｍの密閉式扁平培養瓶に、以下の表１に示す成分を有するＭＢＧ−１１培地を１Ｌ入れ、初発の濃度が０．６ｇ／ＬとなるようにＫ００８４株を培地に接種した。
【００４６】
【表１】
【００４７】
３容積％のＣＯ２を含むガスを６００ｍＬ／分の速度で（すなわち、０．６ｖｖｍで）通気しながら、培養温度２５℃、ｐＨを６〜８の間で調整し、以下に示す光照射条件下で５日間Ｋ００８４株を培養した。光照射は、光源として白色蛍光灯（松下電器産業株式会社製、ＦＬ４０ＳＳＷ／３７）を用いた。光照射の強度は、ＬＩＣＯＲ−１９０ＳＡ平面光量子センサーを用いて測定した培養槽受光方向の光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）が１００μｍｏｌ−ｐ／ｍ２ｓとなるように、光照射の強度を調整した。培養後のＫ００８４株は、緑色から茶〜茶褐色に変色しており、Ｋ００８４株がシスト化したことが確認された。
【００４８】
次いで、上記と同じ扁平培養瓶中に同じ培地（ＭＢＧ−１１培地）を入れ、初発の濃度が０．６ｇ／Ｌとなるようにシスト化したＫ００８４株を接種し、上記と同じ培養条件で２００時間培養した。
【００４９】
得られた緑藻を、遠心分離により回収し、水洗し、ビーズビーターに入れた。ヘキサンを加え、ビーズビーターで５分間破砕した。このように、溶媒中で緑藻を細かく破砕することによって、細胞膜成分であるレシチンがより多く抽出される。得られた混合物を、遠心分離機で上清と沈殿とに分け、上清を回収した。沈殿に再びヘキサンを加え上記と同様の操作を、沈殿の色がほぼ完全に白くなるまで繰り返した。回収したヘキサン画分を合わせ、ヘキサンを留去して緑藻抽出物を得た。得られた緑藻抽出物中のアスタキサンチン濃度は、フリー体換算で９質量％であり、リン脂質濃度は０．９質量％であり、そして水分量は０．２質量％であった。
【００５０】
（実施例２：リン脂質の含有量の検討−１）
上記実施例１で得られた緑藻抽出物（リン脂質：０．９質量％；アスタキサンチン：９質量％）に、リン脂質（大豆由来レシチン、和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ２．７質量％、４．５質量％、１０質量％、または１５質量％の濃度になるように添加して、試料を調製した。各試料の約５００ｍｇずつをそれぞれ２本の１０ｍＬ容のバイアル瓶に入れ、アスタキサンチンの初期濃度を上記のようにして測定した。次いで、これらを６０℃に設定した恒温器に入れた。１週間保存した後、再度アスタキサンチンの濃度を測定し、残存率を算出した。結果を図１に示す。
【００５１】
図１からわかるように、緑藻抽出物が２．７質量％の割合でリン脂質を含む場合、６０℃という苛酷な条件下で１週間保存しても、９０％以上のアスタキサンチンが残存し、緑藻抽出物が０．９質量％の割合でリン脂質を含む場合、少なくとも７５％のアスタキサンチンが残存していた。特に、緑藻抽出物にリン脂質を追加した場合、非常にアスタキサンチンの残存率が高いことがわかる。
【００５２】
（実施例３：リン脂質の含有量の検討−２）
上記実施例１で得られた緑藻抽出物の一部を、大豆油（日清オイリオグループ株式会社製）で２倍希釈して、アスタキサンチンをフリー体換算で４．５質量％の濃度で含む希釈抽出物を得た。希釈した緑藻抽出物（リン脂質：０．４５質量％）について、リン脂質（大豆由来レシチン、和光純薬工業株式会社製）を０．９質量％、２．７質量％、４．５質量％、１０質量％、または１５質量％の濃度になるように添加して、試料を調製した。また、上記実施例１で得られた緑藻抽出物の一部を、大豆油で３倍および９倍希釈して、それぞれリン脂質濃度が０．３質量％（アスタキサンチン：３質量％）および０．１質量％（アスタキサンチン：１質量％）の希釈抽出物を得た。各試料の約５００ｍｇずつをそれぞれ２本の１０ｍＬ容のバイアル瓶に入れ、アスタキサンチンの初期濃度を上記のようにして測定した。次いで、これらを６０℃に設定した恒温器に入れた。１週間保存した後、再度アスタキサンチンの濃度を測定し、残存率を算出した。結果を図２に示す。
【００５３】
図２からわかるように、緑藻抽出物が０．４５質量％以上の割合でリン脂質を含む場合、６０℃という苛酷な条件下で１週間保存しても、約８０％以上のアスタキサンチンが残存していた。一方、リン脂質濃度が低くなるほど、アスタキサンチンの残存率が低下していた。なお、アスタキサンチンをフリー体換算で１２質量％の割合で含む緑藻抽出物についても同様の実験を行い、同様の結果を得た。
【００５４】
（比較例１：リン脂質を含まない試料におけるアスタキサンチンの安定性の検討）
上記実施例１と同様の操作によって培養して得られたシスト化したＫ００８４株を、遠心分離により回収した。乾燥藻体５ｇを同量の珪藻土と混合し、乳鉢で破砕し、超臨界ＣＯ２抽出装置「Ｓｐｅ−ｅｄ ＳＦＥ」（朝日ライフサイエンス株式会社）を用いて超臨界抽出した。抽出は、圧力４００ｂａｒ、抽出温度５０℃、二酸化炭素流量１Ｌ／ｍｉｎで超臨界ＣＯ２を供給して行った。得られた超臨界抽出物中のアスタキサンチン濃度は、フリー体換算で３０質量％であり、リン脂質濃度は検出限界（０．０１質量％）以下であった。
【００５５】
得られた超臨界抽出物の約５００ｍｇずつをそれぞれ２本の１０ｍＬ容のバイアル瓶に入れ、アスタキサンチンの初期濃度を上記のようにして測定した。次いで、これらを６０℃に設定した恒温器に入れた。１週間保存した後、再度アスタキサンチンの濃度を測定した。その結果、アスタキサンチンの残存率は０．２％であり、この抽出物中のアスタキサンチンの安定性が非常に悪いことがわかった。
【００５６】
（実施例４：ＵＶ照射に対する安定性の検討）
上記実施例１で得られた緑藻抽出物の一部を、オリーブ油（日清オイリオグループ株式会社製）で２倍希釈して、アスタキサンチンをフリー体換算で４．５質量％の濃度で含む希釈抽出物を得た。緑藻抽出物（リン脂質：０．９質量％；アスタキサンチン：９質量％）および希釈抽出物（リン脂質：０．４５質量％；アスタキサンチン：４．５質量％）のそれぞれについて、リン脂質（大豆由来レシチン、和光純薬工業株式会社製）を０．９質量％、２．７質量％、４．５質量％、１０質量％、または１５質量％の濃度になるように添加して、試料を調製した。各試料の約５００ｍｇずつをそれぞれ２本の１０ｍＬ容のバイアル瓶に入れた。次いで、これらのバイアル瓶を、ＵＶ照射装置（卓上照射装置ＤＴ−３５ＬＰ：アトー株式会社製）上に載せ、３６５ｎｍで１週間照射した。１週間保存した後、アスタキサンチンの濃度を測定した。その結果、リン脂質を添加した場合にはいずれもアスタキサンチンの残存率が高く（約８０％以上残存）、上記実施例２および３と同様の傾向がみられた。
【００５７】
（実施例５：緑藻抽出物の調製−２）
抽出溶媒としてヘキサンの代わりにエタノールを用いたこと以外は、上記実施例１と同様に操作して、緑藻抽出物を得た。得られた緑藻抽出物中のアスタキサンチン濃度は、フリー体換算で８．１質量％であり、リン脂質濃度は１．７質量％であり、そして水分量は０．３質量％であった。次いで、これを６０℃に設定した恒温器に入れて１週間保存した後、再度アスタキサンチンの濃度を測定した。その結果、アスタキサンチンの残存率は高かった（８５％）。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によれば、緑藻抽出物中のリン脂質の濃度を特定のレベルに調整することにより、高い保存安定性を有するアスタキサンチンを含有する緑藻抽出物が提供される。したがって、アスタキサンチンを抽出物として長期保存することが可能であり、保存に低温を必要としないため、取り扱いが容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】６０℃にて１週間保存した本発明の緑藻抽出物中のアスタキサンチン残存率とリン脂質（レシチン）濃度との関係を示すグラフである。
【図２】６０℃にて１週間保存した希釈した本発明の緑藻抽出物中のアスタキサンチン残存率とリン脂質（レシチン）濃度との関係を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリー体換算で０．５から２０質量％の濃度のアスタキサンチンおよび少なくとも１つのリン脂質を含み、該リン脂質の濃度が０．１から１５質量％である、緑藻抽出物。
【請求項２】
前記リン脂質の濃度が、１質量％以上である、請求項１に記載の緑藻抽出物。
【請求項３】
前記リン脂質の濃度が、２質量％以上である、請求項２に記載の緑藻抽出物。
【請求項４】
前記リン脂質の濃度が、２．５質量％以上である、請求項３に記載の緑藻抽出物。
【請求項５】
前記リン脂質の濃度が、１０質量％以下である、請求項１から４いずれかに記載の緑藻抽出物。
【請求項６】
前記リン脂質の濃度が、７質量％以下である、請求項５に記載の緑藻抽出物。
【請求項７】
前記リン脂質の濃度が、５質量％以下である、請求項６に記載の緑藻抽出物。
【請求項８】
ヘマトコッカス属に属する単細胞緑藻類の抽出物である、請求項１から７のいずれかに記載の緑藻抽出物。
【請求項９】
緑藻ヘマトコッカス・プルビアリスの抽出物である、請求項８に記載の緑藻抽出物。
【請求項１０】
前記リン脂質が、ホスファチジルコリンである、請求項１から９のいずれかに記載の緑藻抽出物。
【請求項１１】
緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性を高める方法であって、緑藻抽出物中の少なくとも１つのリン脂質の濃度を測定する工程；少なくとも１つのリン脂質を元来含まない場合は該緑藻抽出物に少なくとも１つのリン脂質を添加する工程；および該緑藻抽出物中のリン脂質濃度を０．１から１５質量％に調整する工程を包含し、該緑藻抽出物がアスタキサンチンをフリー体換算で０．５から２０質量％の濃度で含む、方法。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれかに記載の緑藻抽出物を含む、食品。
【請求項１】
フリー体換算で０．５から２０質量％の濃度のアスタキサンチンおよび少なくとも１つのリン脂質を含み、該リン脂質の濃度が０．１から１５質量％である、緑藻抽出物。
【請求項２】
前記リン脂質の濃度が、１質量％以上である、請求項１に記載の緑藻抽出物。
【請求項３】
前記リン脂質の濃度が、２質量％以上である、請求項２に記載の緑藻抽出物。
【請求項４】
前記リン脂質の濃度が、２．５質量％以上である、請求項３に記載の緑藻抽出物。
【請求項５】
前記リン脂質の濃度が、１０質量％以下である、請求項１から４いずれかに記載の緑藻抽出物。
【請求項６】
前記リン脂質の濃度が、７質量％以下である、請求項５に記載の緑藻抽出物。
【請求項７】
前記リン脂質の濃度が、５質量％以下である、請求項６に記載の緑藻抽出物。
【請求項８】
ヘマトコッカス属に属する単細胞緑藻類の抽出物である、請求項１から７のいずれかに記載の緑藻抽出物。
【請求項９】
緑藻ヘマトコッカス・プルビアリスの抽出物である、請求項８に記載の緑藻抽出物。
【請求項１０】
前記リン脂質が、ホスファチジルコリンである、請求項１から９のいずれかに記載の緑藻抽出物。
【請求項１１】
緑藻抽出物中のアスタキサンチンの保存安定性を高める方法であって、緑藻抽出物中の少なくとも１つのリン脂質の濃度を測定する工程；少なくとも１つのリン脂質を元来含まない場合は該緑藻抽出物に少なくとも１つのリン脂質を添加する工程；および該緑藻抽出物中のリン脂質濃度を０．１から１５質量％に調整する工程を包含し、該緑藻抽出物がアスタキサンチンをフリー体換算で０．５から２０質量％の濃度で含む、方法。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれかに記載の緑藻抽出物を含む、食品。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−２５４４５９（Ｐ２００７−２５４４５９Ａ）
【公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９５８５（Ｐ２００７−２９５８５）
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（００００１００７６）ヤマハ発動機株式会社 (3,045)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（００００１００７６）ヤマハ発動機株式会社 (3,045)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]