アスパラギニルヒドロキシラーゼ及びその修飾物質
ＦＩＨを模倣するか、それに結合する化学実体を同定、スクリーニング、特性決定又は設計する方法が記載されている。この方法は、ＦＩＨの構造モデルと、前記化学実体の構造モデルとを比較することを含み、その際、ＦＩＨの前記構造モデルは、ＦＩＨを含有する結晶をＸ線回折測定に掛けることにより決定された構造因子又は構造座標に由来する。このような化学実体は、高いか低いＨＩＦレベル又は活性を伴う状態を治療する際に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＩＨの結晶構造を使用してＦＩＨの阻害剤を設計する方法並びにＦＩＨの阻害剤及び虚血を治療する際のその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物の細胞では、最適なレベルよりも酸素が不足している環境にさらされると、低酸素応答が生じる。これらの低酸素細胞では、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）を必要とする転写カスケードの活性化が、酸素輸送を増強するか、酸素要求量を制限する一連の適応応答を指揮する。癌及び虚血性低酸素血管疾患でのＨＩＦの活性化によって、ヒト病理学でのその重要な役割が明らかとなり、ＨＩＦ活性の操作は重要な治療可能性を有することが証明されている。
【０００３】
ＨＩＦ転写複合体は、αβヘテロ二量体を含有し、式中、ＨＩＦ−βは、酸素調節ＨＩＦ−αサブユニットと二量化する構成核タンパク質である（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４，１９８３１９９１）。特異的ＨＩＦ−α残基を水酸化する一連のＦｅ（ＩＩ）及び２ＯＧ依存性ジオキシゲナーゼによって触媒される酸素依存性改変によって、ＨＩＦ−αの活性は抑制される。ヒトＨＩＦ−１αに酸素が存在すると、１セットのＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼアイソザイム（ＰＨＤ１〜３）によるＰｒｏ４０２又はＰｒｏ５６４の４−水酸化（Ｅｐｓｔｅｉｎら、（２００１年）Ｃｅｌｌ １０７、４３５４；Ｂｒｕｉｃｋ，Ｒ．Ｋ．，及びＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９４、１３３７１３４０）が、フォン・ヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）ユビキチンリガーゼ複合体によるその認識及びそれによるプロテアソーム破壊のターゲッティングを仲介する（Ｉｖａｎら、（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２、４６４４６８；Ｊａａｋｋｏｌａら（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２、４６８４７２、国際公開第０２／０７４９８１号パンフレット）。相補的メカニズムでは、ＦＩＨは、ＨＩＦ−１α Ａｓｎ８０３のβ−水酸化を触媒して（Ｌａｎｄｏら、（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９５、８５８８６１）転写補活性化体ｐ３００との相互作用をブロックする（Ｄａｍｅｓら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９、５２７１５２７６；Ｆｒｅｅｄｍａｎら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５３６７５３７２）。低酸素では、酵素の活性化が限られることにより、ＨＩＦ−αは、破壊を免れて、転写活性になる。
【０００４】
ＨＩＦヒドロキシラーゼの阻害は、酸素が存在する場合でも、ＨＩＦ転写カスケードを強力に活性化する（Ｅｐｓｔｅｉｎら（２００１年）Ｃｅｌｌ１０７、４３５４）。したがって、ＨＩＦヒドロキシラーゼの阻害は、前血管形成応答をもたらし、これは、心筋梗塞及び貧血を含む心血管疾患／虚血性低酸素血管疾患を治療する際に使用することができる。この手法での問題は、ヒト細胞が、ＨＩＦヒドロキシラーゼと同じファミリーに属する、即ち、ジオキシゲン（補基質）、２−オキソグルタレート（２ＯＧ）（補基質）及びＦｅ（ＩＩ）（補因子）を利用する他の酵素を含むことである。このような酵素の例は、フィタノイル補酵素Ａヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリル−４−ヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリル−３−ヒドロキシラーゼ、ガンマ−ブチロベタインヒドロキシラーゼ、ＡｌｋＢ（ＤＮＡ修復酵素）及びＦＩＨに類似するサブファミリーを含む配列分析を元に同定される予測された２ＯＧオキシゲナーゼを含む他のものである（Ｈｅｗｉｔｓｏｎら、Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ２７７（２９）：２６３５１〜２６３５５、２００２）。薬剤として使用される酵素阻害剤は、所望の効果を生じさせる際に必要なその所定のターゲット又は複数のターゲットに選択的であることが望ましいことは、通常、理解される。選択性の不足は、毒性副作用をもたらすことがあり、このことによって、特定の化合物がヒト又は動物治療で使用するために適さないものとなる。所定のターゲットに対して選択的である化合物を同定する１つの手法は、所定の薬剤の構造的、機械的又は他の分析を行い、得られた情報を使用して、ヒト又は動物で使用するための薬剤として使用するための選択的な化合物又はさらに選択的な化合物（既知の化合物に比べて）を調製する際に役立てることである。ここでは、我々は、ＦＩＨ及び類似酵素の選択的阻害剤の設計を可能にするＨＩＦヒドロキシラーゼの構造的又は他の研究を記載する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ＦＩＨによるＨＩＦ−１αのアスパラギン８０３の水酸化部位を同定した。加えて、本発明者らは、ＦＩＨとＨＩＦとの相互作用に関与する結合部位及び残基の同定を含むＦＩＨでの結晶構造を得た。
【０００６】
したがって、本発明は、ＦＩＨを模倣するか、それに結合する化学実体を同定、スクリーニング、特性決定又は設計する方法を提供し、この方法は、ＦＩＨの構造モデルと、前記化学実体の構造モデルとを比較することを含み、その際、ＦＩＨの前記構造モデルは、ＦＩＨを含有する結晶をＸ線回折測定に掛けることにより決定された構造因子又は構造座標に由来する。
【０００７】
本発明はさらに：
化学実体を同定、スクリーニング、特性決定、設計又は改変するための、ＦＩＨを含有する結晶をＸ線回折測定に掛け、その回折測定から構造座標を推測することにより得られた構造座標の使用；
ＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害する、本発明の方法により同定された化学実体；及び
治療法で使用するための本発明の化学実体
を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＦＩＨにより水酸化されるアスパラギン８０３の位置を同定した。加えて、発明者らは、ＦＩＨの結晶構造を同定した。したがって、この構造により、ＦＩＨとＨＩＦとが結合する際に必要なアミノ酸残基の同定が可能である。
【０００９】
相互作用及び構造の同定により、結合して、具体的にはＦＩＨを阻害しうる化学実体の特性決定又は同定が可能である。下記でより詳細に検討するように、数種の異なるタイプの阻害剤を同定することができる。
【００１０】
発明者らは、ヒトＦＩＨを結晶化することに成功した。これは初のＦＩＨの結晶化であり、これによって、結晶構造を決定することができた。結晶分析からの座標は、下記の表３に記載する。この研究により、ＨＩＦのアスパラギン−８０３の結合の分析及びＦＩＨとの結合部位でのＨＩＦのｃ末端活性化領域（ＣＡＤ）の配座の分析が可能になった。本発明は、化学実体を同定、特性決定、設計又はスクリーニングするためのＦＩＨの構造座標の使用を提供する。該当する化学実体は、ＦＩＨに結合する、具体的には、ＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害するものである。加えて、アスパラギンヒドロキシラーゼを改変する化学実体を、同定、特性決定又は設計することもできる。
【００１１】
通常、化学実体を同定、スクリーニング、特性決定、設計又は改変するために、ＦＩＨ又はその断片を含有する結晶をＸ線回折測定に掛け、その回折測定から構造座標を推測することにより、使用される構造座標を得ることができる。構造座標は、結晶内での個々の原子の位置を示し、化学実体を設計する際に、個々の原子の位置を調節するために利用可能なスペースの指示を与える。
【００１２】
Ｘ線回折法に掛けられる結晶は、ＦＩＨ又はその断片を含有する。ＦＩＨは、どのような源からであってもよいが、好ましくはヒトＦＩＨである。ＦＩＨは、改変された形態であってもよい。例えば、ＦＩＨは、挿入、欠失、ｎ末端若しくはＣ末端付与、又は他のアミノ酸によるアミノ酸の置換によって改変されていてもよい。アミノ酸置換は、保存的置換であってよい。通常、結晶化すると、ＦＩＨ突然変異体は、対応するＦＩＨがとる構造と同様の三次元構造をとる。突然変異体は、不活性ＦＩＨであってもよい。
【００１３】
本明細書において、ＦＩＨとは、ＦＩＨ及びその同族体を指す。アミノ酸残基は、ＦＩＨでの位置に関して定義される（例えば、Ｈｅｗｉｔｓｏｎら参照）。ＦＩＨの同族体の該当アミノ酸残基は、例えば、ＦＩＨに対する同族体の最良のアラインメントをベースとして、同等のアミノ酸残基である。
【００１４】
結晶化研究で使用するための適切な手段により、ＦＩＨを単離することができる。例えば、生化学的手段を使用して適切な源から、ＦＩＨを精製することができる。しかしながら通常は、細胞中でＦＩＨを過剰発現させて、これらの細胞からＦＩＨを精製することが簡便である。したがって、ＦＩＨをコードするポリヌクレオチドを、ベクターの構造中で使用することができる。当技術分野の専門家に知られている方法に従って、ＦＩＨを結晶化させることができる。適切な方法に従って、Ｘ線回折を実施することができる。適切な方法を使用して、Ｘ線回折実験から集められたデータを処理して、ＦＩＨの構造座標を推定することができる。
【００１５】
本発明は、化学実体を同定、特性決定、設計又はスクリーニングするために構造座標を使用することを提供する。化学実体は、ＦＩＨに結合するか、アスパラギニルヒドロキシラーゼ活性の阻害剤として作用するものであってよい。或いは、この化学実体は、ＦＩＨの活性を変化させるために改変されているＦＩＨであってもよい。
【００１６】
ＦＩＨに結合するか、それを阻害する化学実体は、ＦＩＨと会合を生じうる任意の化学実体である。結合又は阻害は、非特異的であってもよく、例えば、このような単位は、他の２ＯＧオキシゲナーゼに結合するか、それを阻害してもよい。或いは、アスパラギニルヒドロキシラーゼに特異的に結合するか、それを阻害する薬剤を設計又は同定することもできる。ＦＩＨの特異的阻害剤ではあるが、他のアスパラギニルヒドロキシラーゼの特異的阻害剤ではない薬剤を設計又は同定することもできる。
【００１７】
ＦＩＨの構造座標により、当業者であれば、どのアミノ酸が活性部位形成で重要であり、どのアミノ酸が、基質との接触で重要であるかを予測することができる。基質結合部位を、物理モデルにより生じるか、コンピュータスクリーン上に表示される二次元表示又は三次元表示として示すことができる。このような表示を使用して、ＦＩＨに結合するか、それを阻害する、或いはＦＩＨに結合するか、それを阻害すると予測される化学実体を設計、同定又はスクリーニングすることができる。このような表示を使用して、その活性特性を調節するＦＩＨの改変を同定することもできる。
【００１８】
ＦＩＨに対する改変の例には、その基質へのＦＩＨの結合を増大させるか、基質特異性を変更するための改変が含まれる。別の改変には、ＦＩＨの活性を調節する、例えば、アスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を除く改変が含まれる。
【００１９】
構造の表示を別の方法で使用することもできる。例えば、ＦＩＨ活性部位の表示を使用して、ＦＩＨが基質に結合すると、相互に接近する原子の間に共有結合がおそらく導入されることによる拘束をモデリングすることができる。活性部位の表示を使用して、ＦＩＨのどの残基が、立体障害に関与しているようであるかを予測することもできる。このような残基を改変、置換又は欠失させて、深部障害を減少させ、その基質に関するペプチドの活性を増大させることもできる。
【００２０】
通常、コンピュータをベースとする方法で本発明により得られる構造座標を処理して、所望の分子構造を有する化学実体を同定又は設計するか、その構造が該当する他の化学実体の全部又は一部を補足する化学実体を同定することが必要である。したがって、ＦＩＨと同様の構造を有する化学実体を、同定又は設計することができる。ＦＩＨに結合する化学実体を同定又は設計することもできる。好ましくは、このような化学実体は、ＦＩＨの活性部位に結合して、通常は、アスパラギニルヒドロキシラーゼ活性の阻害剤として作用しうる。
【００２１】
このようなコンピュータをベースとする方法は、２つの幅広い群に分類される：データベース法及びデノボ設計法。データベース法では、該当する化学実体を、その構造が同定された該当する化合物に多少でも似ている化学構造及び化学実体のデータベースに存在する全ての化学実体と比較する。データベース中の構造は、ＮＭＲ又はＸ線結晶学により生成した実験データ又は二次元データに基づく三次元構造のモデルをベースとしている。デノボ設計法では、既知の構造及び／又は理論的規則に由来する情報を使用して、例えば、ＦＩＨに結合するであろう化学実体のモデルを、コンピュータプログラムにより生成する。
【００２２】
同様に、ＦＩＨ構造座標を使用して、他のヒドロキシラーゼ、例えばプロリルヒドロキシラーゼの阻害剤などの修飾物質であると選択、設計又は判明している化学実体の予測活性をスクリーニングすることができる。例えば、化合物をスクリーニングして、付加的にＦＩＨヒドロキシラーゼを阻害するプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤の公算を評価することができる。ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼは選択的に阻害するが、ＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼは阻害しない薬剤を同定する際に、このようなスクリーニング法を利用することができる。
【００２３】
コンピュータ評価又は実験評価を使用して、本発明の方法により設計又は選択された化学実体を試験し且つ最適化することができる。アスパラギニルヒドロキシラーゼの活性に関してアッセイするための実験方法を下記で詳述する。
【００２４】
ＦＩＨの構造に基づき、幾つかの異なるタイプの阻害剤を同定することができる。これらの阻害剤を、下記で詳細に検討する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
二量化阻害剤
結晶学的不斉単位は、１個のＦＩＨ分子を含有する。しかしながら、結晶学的対称性の分析により、ＦＩＨの二量体形態が明らかになり、これは、本来のゲル電気泳動分析と一致した。二量体界面は、主に疎水性相互作用を伴うインターロック配置で各分子の２個のＣ末端らせんを伴う。この珍しい界面は、このサイズの他の二量体タンパク質に比較して、平均して広い３２１０Å２の表面積を占めている。二量化阻害剤には、Ｌｅｕ−３４０及びＩｌｅ−３４４などの３３０〜３４６から選択される残基を含む二量化界面を形成する残基に結合するものが含まれる。阻害剤には、二量化界面に関与するＦＩＨ残基の全部又は一部に対応するペプチド又はペプチド模倣物質が含まれる。
【００２６】
例えば、このような阻害剤は、例えば３４０〜３４４の残基、好ましくは残基３３０から３４６を含むＦＩＨの断片を含んでもよい。このような断片は通常、長さにおいて６又は１０個のアミノ酸、好ましくは長さにおいて１５又は２０個までのアミノ酸を有する。或いは、例えば１、２又はそれ以上の置換を伴う３４０〜３４４又は３３０〜３３６の残基に対する同族体を含むペプチド同族体を使用することもできる。さらなる薬剤には、二量化を妨害するように、結晶構造を元に設計することができるペプチド又はペプチド模倣物質が含まれる。
【００２７】
ＦＩＨでの金属結合を利用する阻害剤
構造研究により、ＦＩＨ及びおそらく関連するＨＩＦヒドロキシラーゼの活性部位にＦｅ（ＩＩ）が存在することが判明している。この鉄は、大抵八面体で、Ｈｉｓ１９９、Ａｓｐ２０１及びＨｉｓ２７９の側鎖、２ＯＧの２−オキソ及び１−カルボキシレート基により結合している。酵素−基質複合体では、Ｈｉｓ２７９の反対側に空の位置があり、これにより、この酵素は、二酸素結合のためにプライミングされていることが分かる。Ｈｉｓ２７９の反対側のリガンドの適応は、Ａｓｐ２０１とＣＡＤ Ａｓｎ８０３との水素結合の破壊を必要とすることがある（鉄及びＡｓｎ８０３β−炭素は、約４．９Åしか離れていない）。２ＯＧの後続の脱炭酸反応はおそらく、鉄−オキソ種［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ＜−＞Ｆｅ（ＩＩＩ）−Ｏ・］をもたらし、これは、ＨＩＦのＣ末端トランス活性化領域（ＣＡＤ）でのＡｓｎ−８０３の炭素での酸化をもたらす。
【００２８】
鉄に結合する官能基を含有する化合物は、ＦＩＨの阻害剤として役立つ。このような化合物の例には、チオール、アルコール、ケルシチン及びその誘導体などのフラボノイドを含むフェノール、炭水化物、ヒドロキサメート、イミダゾール並びに他の複素環、例えば窒素含有複素環が含まれる。
【００２９】
Ｚｎ（ＩＩ）は、Ｆｅ（ＩＩ）と同じ様にＦＩＨに結合し（構造３）、これは、金属仲介低酸素効果が、ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性部位からのＦｅ（ＩＩ）の置換によることと一致する。Ｚｎ（ＩＩ）も、ＦＩＨの他の金属阻害剤も、触媒作用での補因子としてＦｅ（ＩＩ）に取って代わることはできないので、ＦＩＨの活性部位で、鉄以外の金属［Ｚｎ（ＩＩ）など］の結合を優先的に促進する化合物は、阻害剤として作用する。
【００３０】
阻害剤の他の群は、活性部位での結合に関してＦｅ（ＩＩ）と拮抗することを介して作用する非金属阻害剤である。このような阻害剤は、触媒活性なＦＩＨの活性部位でＦｅ（ＩＩ）に結合する残基の三つ組（Ｈｉｓ−１９９、Ａｓｐ−２０１、Ｈｉｓ−２７９）のいずれか又は全てに結合しうる。
【００３１】
２ＯＧ結合部位を利用する阻害剤
ＮＯＧを伴うＦＩＨ：ＣＡＤ構造は、２ＯＧのように、二座で鉄に配位されることを示し、鉄結合過酸化物（スーパーオキシド）中間体によるか、金属への二酸素の結合を妨害することによる攻撃に対して感受性が低いことにより、阻害剤であることを示している。
【００３２】
ＦＩＨでの構造研究により、２ＯＧ及びＮＯＧに関する結合相互作用が判明している（例えば、図１参照）。２ＯＧ（及びＮＯＧの同等のカルボキシレート）の５−カルボキシレートは、Ｌｙｓ２１４、Ｔｈｒ１９６及びＴｙｒ１４５の側鎖と水素結合を形成し；このような相互作用は、２ＯＧオキシゲナーゼの他の構造では前例がなかった。さらに、Ｌｙｓ２１４が第４のＤＳＢＨ（二本鎖βらせん）β鎖である一方で、以前に与えられた塩基２ＯＧ−５−カルボキシレート結合残基は、第８のＤＳＢＨ鎖の開始点に存在することにおいて、ＦＩＨは珍しい。
【００３３】
構造研究により、その中に２ＯＧとＮＯＧとが結合するポケットを形成するＦＩＨ残基が判明している。前記に加えて、これらには、Ｉｌｅ−２８１、Ｌｅｕ−１８６、Ｌｅｕ−１８８、Ｐｈｅ−２０７、Ｔｈｒ−１９６の側鎖が含まれる。これらの相互作用を知ることにより、改善された（結合パラメーターにより測定される）選択的な阻害剤を設計することが可能である。したがって例えば、２ＯＧ結合ポケットでの阻害剤の結合は、Ｉｌｅ−２８１、Ｌｅｕ−１８６、Ｌｅｕ−１８８、Ｐｈｅ−２０７、Ｔｈｒ−１９６の側鎖のいずれか又は全てとの疎水性相互作用をもたらしうる。さらに、このことは、２ＯＧの５−カボキシレートの結合に関与する残基（Ｌｙｓ２１４、Ｔｈｒ１９６及びＴｙｒ１４５）との静電又は水素結合相互作用をもたらしうる。
【００３４】
２ＯＧ結合残基との阻害剤の相互作用を介してのＦＩＨの選択的阻害は、次のように例示される：Ｎ−オキサロイルアミノ酸をベースとした一連の阻害剤の反応速度分析により、Ｎ−オキサロイルアラニンのＲ−鏡像異性体（ＩＣ５００．４ｍＭ）は、Ｓ−鏡像異性体（ＩＣ５０２．５ｍＭ）よりもかなり強力であることが判明した。ＦＩＨ内の２ＯＧ結合ポケットの分析により、Ｓ−鏡像異性体の結合は、そのメチル基と、２ＯＧ結合ポケット内のＴｈｒ−１９６及びＩｌｅ−２８１の側鎖との相互作用により妨害されることが判明した。プロコラーゲンのプロリル−ヒドロキシラーゼ及びＰＨＤアイソザイムの両方に関しては、逆の選択性（即ち、Ｓ−鏡像異性体がより強力であった）が観察され、このことは、個々のタイプのＨＩＦヒドロキシラーゼに関して選択的阻害剤を開発することができるはずであることを証明している。このような阻害剤は、活性部位金属にキレート化してもよいし、しなくてもよい。
【００３５】
化合物には、一般式：
【化１】
のものが含まれる
［式中、
Ｒ’及びＲ”はそれぞれ同一又は異なって、Ｈ、Ｆ或いはＣ１からＣ３アルキル若しくは置換アルキル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ又はＣＯＮＨ２であり、Ｘは、ＣＯＯＨ、ＳＯＯＨ若しくはＣＯＮＨＨ又はそのエステル又は複素環であるか、或いはＬｙｓ−２１４、Ｔｈｒ−１９６及びＴｙｒ−１４５、即ち、結晶学的分析で判明したように、２ＯＧの５−カルボキシレートの結合に関与する残基の１つ又は複数の側鎖と好ましい相互作用をもたらす他の基であり、
Ｙは、−（ＣＲ’’’Ｒ’’’）ｎＺであり、Ｚは、
−ＮＲ’’’ＣＯＣＯＯＨ、−ＮＲ’’’ＣＳＣＯＯＨ、−ＮＲ’’’ＣＯＣＯＳＨ、−ＣＨＳＲ’’’ＣＯＮＲ’’’Ｒ’’’’、−ＣＨＯＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＯＲ’’’、−ＣＨＳＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＯＲ’’’又は−ＣＨＯＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＮＲ’’’ＯＲ’’’であり、Ｒ’’’はそれぞれ同一又は異なって、Ｈ、アルキル、ＯＨ又はＯ−アルキルであり、ｎは、０〜３であり、好ましくは０である］。
【化２】
［式中、Ｒ’’’’は、ＯＨ、ＯＲ’’’又はＮＨＣＯＲ’’’であり、Ｗは、Ｓ、ＮＨ又はＯである］。
【００３６】
Ｘは、Ｌｙｓ−２１４、Ｔｈｒ−１９６及びＴｙｒ−１４５、即ち、２ＯＧの５−カルボキシレートの結合に関与する残基の１つ又は複数の側鎖と好ましい相互作用を生じる基である。Ｘは、作用の望ましい部位に輸送されるか、望ましい薬物動態特性を有するようなプロドラッグとして官能化されていてもよい。前記で示したように、Ｘは、Ｘのカルボン酸バージョンのメチル若しくはエチルエステルなどのエステル又はアミド誘導体であってよい。
【００３７】
ｎが０である場合には、Ｙは通常、ＣＯＮＨＯＨ、ＣＯＮＨＮＨ２、ＮＲ’’’ＣＯＣＯＯＨ、ＮＲ’’’ＣＳＣＯＯＨ又はＮＲ’’’ＣＯＣＯＳＨである。Ｙは優先的に、活性部位金属にキレート化しうる一方で、結晶学分析により定義されるような２ＯＧ結合ポケットに存在する好ましい結合相互作用の全て又は一部を維持するようなサイズである。Ｘと同様に、Ｙは、プロドラッグとして官能化されていてもよい。
【００３８】
Ｙが、前記で示されているように芳香族環を含有する場合には、これは、アリール又は官能化アリール環、さらに複素環及び官能化複素環を含む他の環系を含有してもよい。前記環をさらに官能化して、ＦＩＨ活性部位での結合を最適化することもできる。
【００３９】
ペプチド基質結合部位を利用する阻害剤
２つの結合部位が存在
ＥＳ複合体構造によって、それぞれ１６４０Å２及び１０８０Å２の接触表面積を有するＣＡＤ７９５−８０６（即ち、ＨＩＦのＣ末端トランス活性領域の残基７９５〜８０６）（サイト１）及びＨＩＦのＣＡＤ８１３−８２２（サイト２）を含む２つの別々の結合部位が予期せず判明した（例は、図参照）。これらの領域のＣＡＤ残基は、全ての既知のＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２α配列に保存されている。サイト１での電子密度は、性質が良好であり、Ｔｙｒ７９８の側鎖でのみ、乏しいと定義される一方で、サイト２では、より低いレベル及び性質で、これはおそらく、このサイトでの弱い結合を反映している。密度が観察されなかったＣＡＤ８０４−８０６及びおそらくＣＡＤ８０７−８１１も、ＦＩＨとは直接的な相互作用を生じない。サイト１及びサイト２の相対的重要性を調べるために使用された反応速度分析により、サイト１のみを含有する断片はＦＩＨにより水酸化されるが、両方のサイトを含有するものよりも効率的でないことが判明し、これは、結合の際には両方が重要であり、両方を阻害研究で利用することができることを証明している。
【００４０】
サイト１では、ＣＡＤ７９５−８０３は、溝部に結合して、１０個の水素結合によりＦＩＨに結合する広く延びた配座をとる。ＣＡＤのＡｓｎ８０３は、活性でかなりを占めていて、Ｆｅ（ＩＩＩ）に直接隣接している。ＣＡＤ Ａｓｎ８０３及びＡｌａ８０４は、Ｖａｌ８０２の主鎖カルボニルとＡｌａ８０４のＮＨとの間の、Ａｓｎ８０３の側鎖をＦｅ（ＩＩ）に向ける水素結合により安定化されるしっかりとした回転を形成する。ＣＡＤ Ａｓｎ８０３の側鎖は、３個の水素結合により正確に配位されて、β−炭素のプロ−Ｓ位置での水酸化を可能にするが、これは、ＮＭＲ指定と一致する（前記参照）。ＣＡＤ Ａｓｎ８０３の１級アミドは、ＦＩＨ残基Ｔｙｒ１０２とＦｅ（ＩＩ）との間に挟まれていて、ＤＳＢＨモチーフへの挿入部に位置する残基であるＦＩＨ残基のＧｌｎ２３９及びＡｒｇ２３８の側鎖と水素結合を生じる。特に、基質とＦｅ（ＩＩ）との結合部位は、直接結合する。それというのも、ＣＡＤのＡｓｎ８０３の主鎖窒素も、鉄に複合化していないＡｓｐ２０１のカルボキシレート酸素と水素結合（約３Å）を形成するためである。６個の付加的な水素結合が、ＦＩＨとＣＡＤ７９５−８０１との結合を安定化する。
【００４１】
サイト１とは異なり、サイト２は、ＦＩＨ表面に位置し、２個の水素結合のみを伴う。サイト２のＣＡＤ８１６−８２３は、α−らせんを生じるが、これは、ＣＢＰ／ｐ３００との複合体でのこの領域の構造に全く一致する（Ｄａｍｅｓら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５２７１５２７６；Ｆｒｅｅｄｍａｎら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５３６７５３７２）。この複合体と同様に、高度に保存されているＬｅｕ８１８、Ｌｅｕ８１９及びＬｅｕ８２２は、ＦＩＨ表面の疎水性ポケットに位置し、結合相互作用のベースを形成するので、これらの残基が同時にＣＢＰ／ｐ３００及びＦＩＨに結合することは不可能である。
【００４２】
サイト１の所でＣＡＤ残基がとる広いループ構造は、ＣＢＰ／ｐ３００の第１の転写アダプター亜鉛結合領域（ＴＡＺ１）と複合化した場合に同じ残基がとるα−らせん構造とは対照的である（Ｄａｍｅｓら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５２７１５２７６；Ｆｒｅｅｄｍａｎら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５３６７５３７２）。したがって、溶液中で遊離した場合にＣＡＤ及び他のＨＩＦ−α残基で観察される乱れた構造は、様々なタンパク質と複合体を形成するために複数の構造をとる必要性を反映している。
【００４３】
結合によるＣＡＤの構造の変化は、ＦＩＨの変化により補足され、これは、誘導される適合結合プロセスを示している；ＦＩＨのＴｒｐ２９６は、約Ｃｂｅｔａ−Ｃａｌｐｈａの５０°の回転を受けて、ＣＡＤ Ｖａｌ８０２を調節する一方で、Ｔｙｒ１０２とＴｙｒ１０３の両方は、より整然となる。誘導される適合のさらなる証拠は、ＣＡＤ断片結合を伴って得られた構造と伴わずに得られた構造との間の分解能における著しい差異に由来し、これは、結合で生じるＦＩＨの配列を反映している（比較のために、構造４は、Ｆｅ（ＩＩ）及び２ＯＧのみと複合化したＦＩＨを示している）。低分子を使用することによるか、遺伝子又はタンパク質治療により、低酸素応答の際に必要な構造変化、特に、ＣＡＤ領域を伴う構造変化を妨害することにより、前血管形成又は抗血管形成応答が可能であるように低酸素応答を操作することができる。
【００４４】
したがって、構造研究により、（ｉ）ＨＩＦのＣＡＤが結合する際に関与するＦＩＨ残基、（ｉｉ）ＣＡＤが結合した場合のＦＩＨの配座及び（ｉｉｉ）ＦＩＨに結合した場合のＣＡＤの構造が定義される。これらの結果は、ＦＩＨの選択的阻害剤及び関連酵素の設計で役立つ。ＦＩＨ結合部位の特徴を使用して、阻害剤とＦＩＨとのよりしっかりとした結合を仲介するか、ＦＩＨにしっかりと結合しない、即ちＦＩＨの阻害を回避しない阻害剤を得ることができる。
【００４５】
サイト１に、又はその近くに結合する阻害剤は、Ｔｙｒ−１０２、Ａｓｐ−１０４、Ｌｙｓ−１０６、Ａｓｐ−２０１、Ｇｌｕ−２０２、Ｇｌｎ−１４７、Ｇｌｎ−２３９、残基２９９〜３０３、Ｈｉｓ−３１３、Ａｌａ−３１７、Ｉｌｅ−３１８、Ａｓｎ−３２１、Ｌｙｓ−３２４、Ａｒｇ−２３８、Ｔｒｐ−２９６、Ａｓｎ−３２１〜Ｌｙｓ−３２４との静電水素結合及び／又は疎水性相互作用を利用することができる。サイト１での阻害剤結合は、サイト１に結合した場合にＣＡＤがとる回転構造を模倣するか、部分的に模倣してよい。
【００４６】
サイト２に、又はその近くに結合する阻害剤は、残基Ｔｈｒ−１４９、Ｌｅｕ−１５０、Ａｓｎ−１５１、Ａｓｐ−１５２及び残基Ｖａｌ−１５９、Ｐｈｅ−１６２、Ｌｅｕ−１６３、Ｔｒｐ−１６７、Ｇｌｎ−１８１、Ｌｅｕ−１８２、Ｔｈｒ−１８３、Ｓｅｒ−１８４、Ａｓｎ−１８５との静電水素結合及び／又は疎水性相互作用を利用することができる。サイト２での阻害剤結合は、サイト２に結合した場合にＣＡＤがとるらせん構造を模倣するか、部分的に模倣してよい。
【００４７】
阻害剤は、サイト１及びサイト２の両方に結合してもよいが、その必要はなく、サイト１が、サイト２よりも好ましいと認められる。
【００４８】
サイト１で結合するＣＡＤの残基８０１〜８０５、特に残基８０２〜８０５は、８０２の主鎖Ｃ＝Ｏと８０４の主鎖ＮＨとの距離が約２．８Åである回転構造を形成する。Ａｌａ−８０４のＮＨとＨＩＦ−１αＣＡＤのＶａｌ−８０２のカルボニルＯとの間に生じるＨ結合を含めて、この回転は、擬環中に７個の原子を含有する。
【００４９】
回転は、酵素阻害又は受容体結合に役立つ類似体による擬態に特に適している。医学的化学文献は、このような回転擬態の例を十分に備えている。既知の方法によりこれらを改変して、具体的にはターゲット構造に関する知識が得られている特定のターゲットに結合させることができる。
【００５０】
回転擬態及びその変種の例は、次のレビューで見ることができる：Ｈａｎｅｓｓｉａｎら、ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ５３：１２７８９−１２８５４ ＳＥＰ２２ １９９７年；Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲＳ４３：１９１−２１７ １９９７年；及びＢｕｒｇｅｓｓら、ＡＣＣＯＵＮＴＳ ＣＨＥＭ ＲＥＳ ３４：８２６−８３５ ２００１年）。回転に関する主要な報告の最近の例には、次のもの（及びその参照文献）が含まれる：Ｍａｉｅｒら、ＥＵＲ Ｊ ＯＲＧ ＣＨＥＭ：２６８６−２６８９、２００２年；Ｒｅｉｄら、Ｊ ＡＭ ＣＨＥＭ ＳＯＣ １２４：５６７３−５６８３、２００２年；Ｍａｈａｄｅｖａｎら、Ｊ ＢＩＯＭＯＬ ＳＴＲＵＣＴ ＤＹＮ １９：７７５−７８８ ２００２年；Ｅｇｕｃｈｉら、Ｊ ＭＥＤ ＣＨＥＭ ４５：１３９５−１３９８ ２００２年；Ｄｅ Ｂｏｒｇｇｒａｅｖｅら、ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴＥＲＳ ４２：５６９３−５６９５ ２００１年；Ｋｏｈｎら、ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴ ４２：４４５３−４４５７ ２００１年；Ｅｇｕｃｈｉら、ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴ ４２：１２３７−１２３９ ２００１年；Ｍａｎｚｏｎｉら、ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ５７：２４９−２５５ ２００１年；Ｊｉａｎｇら、ＨＥＬＶ ＣＨＩＭ ＡＣＴＡ８３：３０９７−３１１２ ２０００年；Ｄｅｒｒｅｒら、Ｊ ＣＨＥＭ ＳＯＣ ＰＥＲＫ Ｔ１：２９５７−２９６７ ２０００年；Ｂｅｌｖｉｓｉら、ＥＵＲ Ｊ ＯＲＧ ＣＨＥＭ：２５６３−２５６９ ２０００年；Ｃｌａｒｉｄｇｅら、ＢＩＯＯＲＧ ＭＥＤ ＣＨＥＭ ＬＥＴＴ ６：４８５−４９０ １９９６年。
【００５１】
これらには、一般式：
【化３】
の化合物が含まれる
［式中、Ｒ１は、Ｇｌｎ−２３７及び又はＡｒｇ−２３８と静電又はＨ−結合相互作用を生じうるもの、好ましくは、ＣＲ８Ｒ９ＣＯＮＨ２又はその類似体であり（式中、Ｒ８は、水素又はペプチド又はペプチド模倣物質（β−アミノ酸又はペプチドイソター（ｉｓｏｔｅｒｅ）からなるものなど）であり、Ｒ９は、水素、官能化されていてもよいアルキル、官能化されていてもよいアリール、ヘテロアリール又はＣＨ２ＣＯＮＨ２などのこれらの組合せである）、Ｒ２は、水素又はＦＩＨのＴｙｒ−１０２と有利に相互作用する基であり、Ｒ３は、Ｈ又はＡｓｐ−２０１とＨ−結合を生じうる基であり、Ｚ１は、＞Ｃ＝Ｏ又は＞ＣＲ５Ｒ９であり（式中、Ｒ５は、水素、官能化されていてもよいアルキル、アリール又はへテロアリール或いはこれらの組合せである）、Ｒ１２は、Ｒ５と同様に定義されるか、又はＮＨＲ６であり（式中、Ｒ６は、ＣＯＲ５又はＳＯ２Ｒ５である）、Ｘ１は、ＮＲ４、ＮＲ４Ｃ（Ｒ５）２、Ｃ（Ｒ５）２ＮＲ４或いはＯ又はＮＨである（式中、Ｒ４は、ＣＯＲ５又はＳＯ２Ｒ５である）］。この式又は他の式では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ、同じか、異なってよい。特に、これらの化合物は、式：
【化４】
のいずれかであってよい
［式中、基は前記と同様に定義され、Ｒ７及びＲ８は独立に、β−アミノ酸残基、ウレタン、スルホンアミド又はホスホンアミド結合を含有するか、それからなるもののようなペプチド又はペプチド模倣物質又は部分ペプチド模倣物質である］。
【００５２】
使用することができる他の化合物は、式：
【化５】
を有するものである
［式中、Ｑは、Ｈ又はＯＨであり、Ｒ７及びＲ８は前記と同様に定義される］。
【００５３】
使用することができる他の化合物は、式：
【化６】
を有するものである
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ９は前記と同様に定義され、Ｄは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ又はＣＨＲ９＝ＣＨＲ９である］。したがって、６員環に結合している環は、５員複素環又はアリール環である。
【００５４】
これらの式中、Ｒ８及びＲ９を最適化して、チャネル架橋の際に、２ＯＧとペプチド基質結合部位とを、又は２ＯＧ結合部位自体とを結合させることができる。
【００５５】
サイト１のＣＡＤがとる回転の模倣物質として作用する環式ペプチド。このシクロは、ペプチド結合、ジスルフィド結合又はＣ−Ｃ結合を介して生じさせることができる。
【００５６】
結合部位の組合せを利用する阻害剤
場合によっては二基質阻害剤とも称される、複数の基質又は補助基質結合部位での結合と拮抗する酵素阻害剤が有用であることは、よく知られている。例は、Ｗａｎｇら、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ−ＵＳ：１５６７６−１５６８３ ２００１年；及びＬｅｒｎｅｒら、ＡＮＧＥＷ ＣＨＥＭ ＩＮＴ ＥＤＩＴ４０、４０４０−４０４１、２００１年に見ることができる。
【００５７】
ＦＩＨ及び他の２ＯＧオキシゲナーゼの場合には、二基質阻害剤が有用である。それというのも、２ＯＧ結合の特徴は、複数の酵素に存在する一方で、ＣＡＤ基質は独特であるためである。したがって、両方の結合部位に結合する阻害剤は、２ＯＧ結合部位のみに結合するものを上回る改善された選択性を示しうる。構造分析により、このような二基質阻害剤を同定することができる。２ＯＧ及びＣＡＤ結合部位は、２ＯＧ（又はＮＯＧ）の２−オキソ基からＦＩＨ．Ｆｅ．２ＯＧ／ＮＯＧ．ＨＩＦ（ＣＡＤ）複合体中のβ−炭素Ａｓｎ−８０３へと延びる「チャネル」を介して相互に結合する。この構造では、この「チャネル」は、空のようだが、水分子によって占められていてもよい。２ＯＧの２−オキソ基のＣからＡｓｎ−８０３のβ−Ｃへの距離は、約６Åである。２ＯＧの３−ＣからＡｓｎ−８０３のβ−Ｃまでの距離は、約６．６Åである。構造分析からの情報により、次のものを含む二基質阻害剤を同定することができる：
これらは、前記式（ＩＩ）〜（ＩＶ）の化合物であるが、但し、これらは、結晶学情報により定義されるような２ＯＧ結合ポケットにも結合しうるように改変されている。したがって、Ｒ２又はＲ１が、２ＯＧ結合ポケットに結合しうるように改変されている。この改変は、Ｒ１又はＲ２の一般式がＡ−Ｘ（式中、Ｘは、前記と同様に定義され、Ａは、Ｘを（ＩＩ）に結合する）であるような形態である。Ａは、２ＯＧ結合部位を利用する表題の阻害剤下に、Ｘが式Ｉ、前記２ＯＧのカルボキシレートの残基に結合しうるような適切な長さを有する。
【００５８】
より一般的には、ＦＩＨの二基質阻害剤は、式：
Ｘ［Ｂ］−［Ｃ］
を有してよい［式中、Ｘは、前記と同様に定義され、Ｂは、リンカー基であり、Ｃは、ＦＩＨのＣＡＤ結合部位の一部に結合する単位、一般的にＣＯＮＨ２である］。
【００５９】
Ｂは通常、６〜８個の炭素原子を有するポリメチレン基又は炭素原子のうちの１個又は複数がヘテロ原子、特にＯ、Ｓ又はＮにより置換されている同等の基であり、例えば、チオール、アルコール、カルボキシレート、ヒドロキサム酸又はオキサレートで官能化されて、Ｆｅ結合を仲介してもよい。これは好ましくは、６から８個の炭素原子長さ又はそれに同等である。或いは、Ｂは、好ましくはＣが結合する５から７員の環を有する架橋基である。
【００６０】
２ＯＧ結合部位又はその一部並びにペプチド基質に結合する阻害剤
別の群の阻害剤は、酵素−基質複合体、即ちＦＩＨ．Ｆｅ（ＩＩ）．ＨＩＦ（ＣＡＤ）に結合する。構造分析により、このような阻害剤を同定することができる。前記ように、２ＯＧ及びＣＡＤ結合部位は、ＦＩＨ．Ｆｅ．２ＯＧ／ＮＯＧ．ＨＩＦ（ＣＡＤ）複合体中の２ＯＧ（又はＮＯＧ）の２−オキソ基からＡｓｎ−８０３のβ−炭素へと延びる「チャネル」を介して相互に結合する。
【００６１】
このタイプの阻害剤は、Ｘ−［Ｂ］−［Ｅ］と定義することができ、式中、Ｘは、前記と同様に定義され、Ｂは、前記ように定義されるリンカー基であり、Ｅは、ＨＩＦに結合する際にＣＡＤの一部に結合する単位である。Ｅは、ＣＡＤのＡｓｎ−８０３の主鎖カルボニル酸素に、さらにＡｓｎ−８０３の１級アミドのＮＨ２基に結合する。
【００６２】
阻害剤のベースとなっているメカニズム
他の群の阻害剤は、触媒サイクルの一部を受けうるが、中間体段階で停止するか、損傷又は抑制をもたらす異常反応を惹起することができる基質類似体をベースとしている。ＦＩＨは、β位でＡｓｎ−８０３の水酸化を触媒するという観察と、構造分析とにより、このような阻害剤を設計することができる。このような化合物には、Ａｓｎ−８０３がβ−フルオロ−アスパラギン、β−ジ−フルオロアスパラギン、β−メチル−アスパラギン、β−ジメチル−アスパラギン誘導体などの酸化を受けない類似体に置換されている基質の類似体（阻害剤）が含まれる。或いは、酸化を受けて、酸化されてエポキシド又は金属キレート化基などの不活性化基をもたらす薬剤をもたらす誘導体を調製することもできる（このようなメカニズムをベースとする阻害剤は時たま、自殺阻害剤と称される）。ＦＩＨの場合には、これらには、α−β−デヒドロアスパラギン及びβ−メチレンアスパラギンが含まれる。
【００６３】
これらには、式：
【化７】
を有する化合物が含まれる
［式中、Ｘは、バリン残基又はその類似体を表し、Ｙは、アラニン残基又はその類似体を表し、Ｒ１０は、フッ素又はＣ１〜Ｃ３アルキル、特にメチルであり、Ｒ１１は、フッ素、Ｃ１〜Ｃ３アルキル又は水素であり、即ち、前記残基は、β−モノ−若しくはジ−フルオロアスパラギン又はβ−モノ−若しくはジ−メチルアスパラギンである］。
【００６４】
或いは、前記化合物は、脱飽和されていてもよい、即ち、α／βデヒドロアミノ酸であるか（Ｒ１１が存在しない）、又はＲ１０及びＲ１１が、メチレン基で置換されていてもよい、即ち、残基は、α，β−デヒドロ−アスパラギン又はβ−メチレンアスパラギンである。
【００６５】
望ましい場合には、バリン残基は、ペプチドＤＥＳＧＬＰＱＬＴＳＹＤＣＥの１個又は複数の単位に所与の順序で、例えば、グルタミン酸（Ｅ）のみに、又はアスパラギン酸（Ｄ）−システイン（Ｃ）−グルタミン酸（Ｅ）−に、又はＰＱＬＴＳＹＤＣＥ−などのもっと長い鎖に接続している。
【００６６】
本発明の化合物では、適切なアリール環には、さらに官能化されているか、他の環系に縮合していてもよいフェニル及びナフタレニルが含まれる。適切な複素環には、官能化されているか、他の環系に縮合していてもよいチオフェン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、ピリミジン、ピラジン、ピロン、クロモン、クマリン、インドール、イソインドール、インドリジン、ベンゾフラン、ピリダジン、プリン、オキサゾール、ピラゾール、イソチアゾール、ピロリジン、ピペリジン、インドリン、ベンゾチアフェン、モルホリン、ベンズイミダゾール、アゼピン、アザシン（ａｚａｃｉｎｅ）、アゾイン（ａｚｏｉｎｅ）、オキセピン、オキソシン、オキソイン、ピペラジン、オキサジン、チアジン、チエピン、チオシン、チオイン、フラン、イミダゾール、アゾール、ジアゾール、トリアゾール及びテトラゾール環系が含まれる。
【００６７】
前記アルキル及びアリール基及び鎖は通常、アルコール、フッ素、チオール、カルボン酸、ホスホン酸若しくはホスフィン酸、スルホン酸又は他のキレート基により、鎖の場合には通常アルキル基を介して官能化されている。本願明細書に記載の式中では、分枝鎖又は直鎖Ｃ１からＣ６アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｔ−ペンチル又は１級、２級若しくは３級ヘキシル基であってよい。好ましくは、アルキル基は、メチルであり、好ましい複素環は、ピロリジン及びテトラヒドロピランであり、好ましい芳香環は、ベンゼン、ナフタレン及びピリジンである。
【００６８】
酸である化合物は、ナトリウム塩などの塩の形態で存在してもよい。
【００６９】
ＦＩＨの結晶構造により、ＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性に関与するそれらの残基を同定することができる。したがって結晶構造を使用して、例えば活性部位内の重要な残基を変異させることにより、例えばアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性が減っているか、活性のない改変ＦＩＨを設計することができる。或いは、基質結合に関与する残基を同定及び改変して、例えば、アスパラギニルヒドロキシラーゼがＨＩＦ以外の基質を許容できるようにすることができる。例えば、アスパラギン結合ポケットを広げるか、狭めることによって。標準的な技術を使用して、このように改変されたアスパラギニルヒドロキシラーゼを生じさせることができる。次いで、下記で詳述するように、予測された活性をアッセイして、例えば、ＨＩＦに対するヒドロキシラーゼ活性が、減ったか、除かれたかどうかを同定するか、或いは、他の基質に対するアスパラギニル活性又は結合を評価する。
【００７０】
本発明により同定された化合物をさらにアッセイで分析して、アスパラギンヒドロキシラーゼ酵素の活性を直接に監視することができる。ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を阻害又は低減する薬剤は、ＨＩＦ−αの水酸化を低減し、Ｐ３００、具体的に言うとＣＨ１領域との相互作用の増大を、したがって、転写活性をもたらす。次いでこのことは、血管形成、赤血球精製、エネルギー代謝、炎症、血管運動機能の促進を含みうる低酸素又は虚血に対する全身的な局所防衛の活性化をもたらし、アポトーシス／増殖応答に影響を及ぼす。
【００７１】
我々は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性又は本発明により同定されたＦＩＨ、具体的にはアスパラギンヒドロキシラーゼ活性の修飾物質、或いは細胞中でのｐ３００とのＨＩＦ−α相互作用の調節に影響を及ぼし、したがってＨＩＦ仲介活性に影響を及ぼす修飾物質の活性をアッセイするために実施することができる幾つかの異なるアッセイをさらに詳細に以下に記載する。これらのアッセイのうちの幾つかは、ＨＩＦポリペプチド及びＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼを利用する。通常、アッセイは、ＦＩＨなどのヒトＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ又はヒトＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの断片若しくは変異体を利用することができる。これらの成分は、以下に詳述する。必要な場合には、これらの各成分を精製又は未精製の形態で、例えば、細胞抽出物として、又はこのような抽出物からの関連成分の精製により用意することができる。或いは、組換え発現技術を使用して、該当成分を発現させ、アッセイで使用するために精製することができる。或いは、細胞ベースのアッセイで使用するための細胞での組換えにより、成分を発現させることができる。
【００７２】
通常、該当成分をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクター内に用意する。このような発現ベクターは普通に、当技術分野で構成され、例えば、プラスミドＤＮＡ並びに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び必要となることがあり、十分なタンパク質発現を可能にする正確な配置で位置するポリアデニル化シグナルなどの他の要素の使用を必要としうる。ＨＩＦヒドロキシラーゼを参考に本願明細書に詳細に記載されているものなどの適切なベクターは、当技術分野の専門家にはかなり簡単に分かるであろう。プロモーター配列は、選択されたアッセイフォーマットに応じて、誘導性又は構成性プロモーターであってよい。プロモーターは、組織特異性であってよい。発現ベクターで使用するためのプロモーター及び他のフランキング配列の例は、本発明のＨＩＦヒドロキシラーゼ及び特にヒトＨＩＦヒドロキシラーゼを参照してさらに詳細に記載する。
【００７３】
ＨＩＦポリペプチド及びペプチド類似体
本発明のアッセイは、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの基質、特に酵素のアスパラギン含有基質を使用することができる。特に、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ活性の修飾物質の活性を監視するためのアッセイで、このような基質を使用することができる。基質は、ＨＩＦポリペプチド又はそのペプチド類似体であってよい。通常は、ＨＩＦポリペプチドが基質として使用される。
【００７４】
アスパラギン残基がＦＩＨにより水酸化されている任意の適切な基質を使用することもできる。本発明の好ましい実施形態では、このような基質は、ＨＩＦ−１α若しくはＨＩＦ−２αサブユニットタンパク質などのＨＩＦポリペプチド、又はいずれかの断片、或いは該サブユニット又は断片のペプチド類似体である。好ましくは、ＨＩＦ−αペプチドは、酸素調節応答をもたらす。好ましくは、ＨＩＦ−αペプチドは、ＣＡＤ領域を有し、ｐ３００との酸素調節相互作用及びダウンストリーム転写活性が可能である。好ましくは、このようなＨＩＦ−αペプチドは、ｐ３００ＣＨ１領域と相互作用しうる。好ましくは、このようなＨＩＦポリペプチド、断片又はペプチド類似体は、ＨＩＦ−１αを参照して定義されたＡｓｎ８０３と同等のアスパラギン残基を包含する。ＨＩＦ変異体、断片又は類似体をＨＩＦ−１αの配列に並べて、最良の配列アラインメントを得、それにより、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３と同等のアスパラギンを同定することにより、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３と同等のアスパラギンを決定することができる。
【００７５】
ＨＩＦポリペプチドは、真核由来、特に、ヒト又は他の哺乳動物、ＨＩＦ−αサブユニットタンパク質若しくはその断片に由来してよい。或いは、ポリペプチドは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）由来であってよい。ｐ３００とのその相互作用を通してＨＩＦ−αの水酸化を監視するアッセイでは、ＨＩＦポリペプチドは、野生種全長ｐ３００タンパク質又はＣＨ１領域を含有するその断片に結合しうる。好ましくは、低酸素細胞環境では、このような結合は転写を活性化しうる。
【００７６】
幾つかのＨＩＦαサブユニットタンパク質がクローニングされている。これらには、その配列がＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ２２４３１として入手可能なＨＩＦ−１α、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ８１９８４として入手可能なＨＩＦ−２α、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＣ００７１９３及びＡＣ０７９１５４として入手可能なＨＩＦ−３αが含まれる。これらは全て、ヒトＨＩＦαサブユニットタンパク質であり、全て、本発明で使用することができる。ネズミＨＩＦ−１α（受入番号ＡＦ００３６９５、Ｕ５９４９６及びＸ９５５８０）、ラットＨＩＦ−１α（受入番号Ｙ０９５０７）、ネズミＨＩＦ−２α（受入番号Ｕ８１９８３及びＤ８９７８７）及びネズミＨＩＦ−３α（受入番号ＡＦ０６０１９４）を含む他の種からのＨＩＦ−αサブユニットタンパク質を、本発明で使用することもできる。
【００７７】
特に該当するＨＩＦ−αタンパク質の１種は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＨＩＦ−αサブユニットタンパク質である。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ系を本発明のアッセイでは使用することができる。
【００７８】
今日までに同定されている２種のＨＩＦ−αサブユニットタンパク質には、幾つかの共通する構造形態が存在することが判明している。これらの形態のうちの幾つかは、Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅら（１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４；２０６０−２０７１）に同定されており、ＨＩＦ−αサブユニットタンパク質のトランス活性化機能に関与しうる。これらの共通する構造形態のうちの１つ又は複数が、ＨＩＦ−ポリペプチドの好ましい形態である。
【００７９】
天然に生じるＨＩＦ−αサブユニット（特に例えば、ＨＩＦ−１αなどのヒトＨＩＦ−αサブユニット）に対して少なくとも４５％のアミノ酸同一率、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一率を有する合成変異体などの前記ＨＩＦ−αサブユニットの変異体を使用することができる。このような変異体は、ＨＩＦヒドロキシラーゼに関して、前記ような置換又は改変を含む。アミノ酸活性を、ＨＩＦヒドロキシラーゼに関して前記ように算出することもできる。
【００８０】
ＨＩＦ断片は、非ペプチジル官能基を含んでもよく、同一率のレベルが下がるようにアッセイのために最適化してもよい。このような官能基は、糖などのように共有結合しているか、金属イオンなどのように非共有結合していてもよい。
【００８１】
本願明細書に記載のＨＩＦαポリペプチドは、ＨＩＦ−αサブユニットタンパク質又はその変異体の断片であってもよいが、但し、前記断片は、野生種ｐ３００ＣＨ１領域と相互作用する能力を維持する。タンパク質アミノ酸残基を使用する場合には、これらの断片は望ましくは、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも４０個、５０個、７５個、１００個、２００個、２５０個又は４００個のアミノ酸サイズである。望ましくは、このような断片は、アスパラギン８０３を含有する。
【００８２】
本発明の細胞ベースのアッセイは、内生ＨＩＦ−αのアップレギュレーション又は組換え技術によるＨＩＦ−α、具体的にはＨＩＦ−１αの発現を必要とし得る。
【００８３】
アッセイ方法
本発明は、低酸素誘導因子のアスパラギン水酸化の修飾物質として同定される薬剤に関するアッセイ方法を提供する。この方法は、試験基質の不在下にアスパラギン水酸化が生じる条件下に、ヒドロキシラーゼの基質の存在下に、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼと試験物質とを接触させ、基質のアスパラギン水酸化を定量することを含む。別のアッセイでは、試験基質の不在下では水酸化が生じない条件下に、ヒドロキシラーゼの基質の存在下に、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼと試験物質とを接触させる。アスパラギン水酸化の定量を監視して、その薬剤がアスパラギンヒドロキシラーゼのプロモーターとして活性に作用するかどうかを同定する。
【００８４】
ＦＩＨは、ＣＡＤ領域内のアスパラギン残基の所でＨＩＦ−αを水酸化することが判明した。この水酸化がｐ３００結合を仲介し、特に、ｐ３００結合を減らす。このような結合により、転写の活性化がもたらされる。この相互作用及び活性化も、本発明のアッセイのためのベースとして使用することができる。
【００８５】
本発明のこのようなアッセイを使用して、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ活性の阻害剤の活性をアッセイすることができ、これを好ましくは、試験物質の不在下にアスパラギン水酸化が生じるであろう条件下に実施する。本発明のアッセイを使用して、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼに特異的で、他のヒドロキシラーゼ、例えば、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ又は他のアスパラギン／アスパルテーム酸ヒドロキシラーゼなどでは活性がないか、活性が低い阻害剤の活性をアッセイすることもできる。本発明のアッセイを使用して、構造モデリング研究ではＦＩＨに対して活性を有するとは予測されていないＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤などのヒドロキシラーゼ修飾物質の活性をアッセイするために使用することもでき、したがって、プロリルヒドロキシラーゼに対して特異的な阻害剤を同定するために使用することもできる。
【００８６】
改変を監視する方法
本発明のスクリーニング又はアッセイ法の正確なフォーマットは、当技術分野の専門家であれば、通常の技術及び知識を使用して変更することができる。専門家であれば、適切な制御実験を付加的に使用する必要性がよく分かるであろう。本発明のアッセイは、適切な基質のアスパラギン水酸化を監視すること、基質及び補基質の利用を監視すること、酵素とその基質との間で予測された生成物の産生を監視することを必要とし得る。本発明のアッセイ方法は、系の成分間の直接的な相互作用をスクリーニングすることを必要とすることもある。或いは、適切なリポーター構成を使用して、又はＨＩＦにより直接若しくは間接に調節されることが知られている遺伝子のアップレギュレーション又は遺伝子の発現パターンの変化を監視することにより、ｐ３００によるＨＩＦの結合などのダウンストリーム効果及びＨＩＦ仲介転写などのＨＩＦにより仲介されるダウンストリーム効果を監視するアッセイを実施することもできる。
【００８７】
水酸化を定量するための様々な方法が当技術分野では知られており、これらを、本願明細書に記載及び例示する。適切な方法を使用して、基質若しくは補基質の使用、ペプチド水酸化などの生成物の発生若しくは水酸化又は非水酸化生成物により仲介されるダウンストリーム効果などにより、ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性を定量することもできる。
【００８８】
アッセイを実施して、該当アスパラギン残基又は他の部分の水酸化を直接に監視することもできる。或いは、アッセイを実施して、補因子又は補基質の欠失を監視することもできる。或いは、このようなアッセイは、例えば、ＨＩＦとｐ３００との相互作用又はＨＩＦ仲介転写を監視することにより、ＨＩＦの水酸化のダウンストリーム効果又は実際に、ＨＩＦの水酸化の阻害を監視することもできる。或いは、ＨＩＦ調節プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子構成物を使用することもできる。ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの活性のエンハンサーを同定するためのアッセイも提供する。このようなエンハンサーを使用して、ＨＩＦα活性を減らすこともできる。
【００８９】
一実施形態では、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの適切な基質を提供する。これは、ＨＩＦ−α又は、ＣＡＤ領域を含有するか、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３に相当する残基を含むその断片であってもよい。基質は、Ａｓｎ８０３位で当初は水酸化されていなくてもよい。合成ポリペプチド基質を用意するか、或いは細菌細胞、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系でＨＩＦ−αポリペプチドを製造することにより、これは達成することができる。或いは、アッセイが経過する間に、当初は非水酸化形態で基質が生じるように選択された時間経過にわたって、アッセイを実施することもできる。
【００９０】
基質、酵素及び可能性のある阻害剤化合物を、阻害剤の不在下にＡｓｎ８０３の水酸化をもたらす条件下にインキュベーションして、基質の水酸化を定量することにより、阻害剤の効果を定量することができる。適切な手段により、これを達成することができる。少量のポリペプチド基質を回収して、質量分析又はクロマトグラフィーなどの物理的分析か、或いはｐ３００に結合しうる（又はｐ３００からのリポーター分子を置換する）可能性などの機能的分析に掛けることができる。当技術分野などで、このような方法は知られており、通常の技術及び知識を使用して実施することができる。定量は、量的でも、質的でもよい。いずれの場合にも、但し、特に後者では、適切な対照、例えば、可能性のある阻害剤なしにインキュベーションした基質と比較して、質的定量を実施することができる。
【００９１】
この方法で同定された阻害剤化合物を回収して、薬剤組成物として処方することができる。
【００９２】
本発明によるアッセイは、ｐ３００とＨＩＦとの相互作用に関して監視することを伴ってもよい。ＨＩＦとｐ３００との相互作用は、ＨＩＦの水酸化により仲介される。ＨＩＦの存在によりアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされることが知られている遺伝子の転写及び発現を監視することができるであろう。特に、ＨＩＦ調節遺伝子のアップレギュレーションにより、アスパラギン水酸化の阻害が証明される一方で、ダウンレギュレーションは、アスパラギン水酸化の増大又は促進を示唆している。
【００９３】
別の実施形態では、リポーター構成物を提供することができ、その際、ＨＩＦにより仲介されるプロモーターが、リポーター遺伝子に操作可能に結合されて提供される。例えば、酵素などの適切なリポーター遺伝子を使用することができ、次いでこれを、比色、蛍光、蛍光共鳴又は分光アッセイで使用することができる。
【００９４】
ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼは、２ＯＧ依存性オキシゲナーゼである。本願明細書に記載のアッセイ方法では通常、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ及びヒドロキシラーゼの基質を、２−オキソグルタレート（２ＯＧ）などの補基質の存在下に接触させる。ＨＩＦヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性は、補基質の代謝回転を定量することにより定量することができる。水酸化基質又はコハク酸などの反応生成物の存在及び／又は量を定量することにより、これを達成することができる。生成物の量を、基質の量に相対させて定量することができる。通常、このような実施形態では、基質は、ＨＩＦ−αポリペプチドであってよいか、例えば、測定される生成物は、水酸化ＨＩＦ−αポリペプチドであってよい。
【００９５】
或いは、終点定量は、ＨＩＦα又はＨＩＦαに由来するペプチド断片（合成及び組換えペプチドを含む）の検出可能な生成物への変換をベースとしてよい。ペプチドを、アッセイが簡略化されるように改変して、アッセイを、迅速に実施し、高処理量スクリーニングに適しているようにすることができる。
【００９６】
例えば、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８オクタデシルシランカラム）を使用して、ＨＩＦヒドロキシラーゼのための出発合成ペプチド基質とアスパラギン水酸化生成物とに分けることができる。それというのも、後者は、カラム中で比較的短い保持時間を有するためである。ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性に関するこのアッセイ又は別のアッセイの改変は、例えば、当技術分野でよく知られている質量分析技術、分光技術及び／又は蛍光技術を使用することができる（Ｍａｓｉｍｉｒｅｍｂｗａ Ｃ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（２００１年）４（３）２４５−２６３、Ｏｗｉｃｋｉ Ｊ．（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５（５）２９７−３０５、Ｇｅｒｓｈｋｏｖｉｃｈ Ａら（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｓ．３３（３）１３５−１６２、Ｋｒａａｆｔ Ｇ．ら（１９９４年）Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４１ ７０−８６）。蛍光技術では、分光又は蛍光アッセイを実施又は最適化するように改変された基質バージョンを使用することもできる。
【００９７】
例えば、ＨＩＦαポリペプチドを、例えばビーズ又はプレート上に固定化し、アスパラギン８０３が水酸化される場合と、残基が水酸化されない場合とで異なる親和性を有するＨＩＦαのＣＡＤ結合領域と結合する抗体又は他の結合分子を使用して、適切な残基の水酸化を検出することができる。当技術分野でよく知られている標準的な技術により、例えば、水酸化ＨＩＦαペプチドを使用して、このような抗体を得ることができる。
【００９８】
適切な標識の存在を定量することを含んでもよい当技術分野の専門家が利用可能な技術を使用して、ＨＩＦαポリペプチドの水酸化形態と非水酸化形態とを識別する分子の結合を評価することができる。
【００９９】
本発明のアッセイ方法は、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイの形態をとってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、該当するポリペプチド又はペプチドが細胞中に導入された１個又は複数のベクターから発現される酵母株などの細胞系で行うこともできる。
【０１００】
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
ｉｎ ｖｉｖｏで行われる細胞ベース、臓器ベース又は全動物アッセイを使用して、アッセイを実施することもできる。このようなアッセイは、ＨＩＦヒドロキシラーゼヌクレオチド及び／又はポリペプチドの内生発現を利用することができる。本発明の他の形態では、特異的な内生ＨＩＦヒドロキシラーゼのアップレギュレーションを、その発現の刺激物質により達成することができる。このような刺激物質は、特異的なＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼをアップレギュレーションする成長因子又は化学物質であってよい。アッセイの他の形態では、ヌクレオチド構成物を細胞又はトランスジェニック動物に導入して、１種又は複数の特異的ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの産生を増大させることができる。
【０１０１】
ｐ３００と複合化したＨＩＦは、前記ＨＩＦ複合体により調節される内生遺伝子のプロモーター及び／又はエンハンサーに存在する低酸素応答要素を活性化させる。このような低酸素応答要素を単離して、処理によってリポーター遺伝子に結合させて、リポーター遺伝子又はその生成物の検出及び／又は定量を介してＨＩＦ複合体の活性をアッセイすることができる。したがって、本発明の別の形態では、ＨＩＦ結合低酸素応答要素に機能的に結合している内生遺伝子又はリポーター遺伝子の発現に対するＨＩＦ複合体の効果を測定することにより、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼにより調節されるＨＩＦ−αポリペプチドの活性をアッセイする。こうして調節される内生遺伝子の例は、遺伝子発現の低酸素誘導でのアリール炭化水素核トランスロケーター（ＡＲＮＴ）の役割に見られるはずである。例えば、「ＡＲＮＴ欠失細胞の研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ＡＲＮＴ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）」、Ｓ．Ｍ．Ｗｏｏｄ，Ｊ．ｍ．Ｇｌｅａｄｌｅ，Ｃ．Ｗ．Ｐｕｇｈ、Ｏ．Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１（１９９６年）１５１１７〜１５１２３及び「腫瘍随伴炭酸脱水酵素の低酸素誘導発現（Ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｙｈｙｄｒａｓｅｓ）」，Ｃ．Ｃ．Ｗｙｋｏｆｆ，Ｎ．Ｊ．Ｐ．Ｂｅａｓｌｅｙ，Ｋ．Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｊ．Ｐａｓｔｏｒｅｋ，Ａ．Ｓｉｂｔａｉｎ，Ｇ．Ｄ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈ．Ｔｕｒｌｅｙ，Ｋ．Ｔａｌｋｓ，Ｐ．Ｈ．Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｃ．Ｗ．Ｐｕｇｈ，Ｐ．Ｊ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ，Ａ．Ｌ．Ｈａｒｒｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０（２０００）７０７５−７０８３参照。例には、これらに限られないが、グルコーストランスポーターアイソホーム１、ホスホグリセレートキナーゼ１、炭素アンヒドラーゼアイソホーム９、血管内皮成長因子が含まれる。前記各遺伝子は、１つ又は複数の低酸素応答要素を含有し、これは、単離して、１回又は複数回のコピーとして、ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性に従い変化するＨＩＦ−αポリペプチドの活性を測定するためのリポーター遺伝子に処理により結合することができる。
【０１０２】
ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性に従いＨＩＦ−αポリペプチドにより調節される遺伝子又は遺伝子産物の活性は、細胞、臓器及び動物生理に影響を及ぼす。ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性によるＨＩＦ−αポリペプチドの活性に従い調節される特異的機能応答を利用するアッセイを使用することもできる。このような応答には、代謝されないグルコース又はグルコース類似体の摂取率、血管形成による血管の成長、炭酸脱水酵素の活性が含まれる。細胞又は全身レベルで作用する多くの他の応答が、ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性によるＨＩＦ−αポリペプチドの活性により制御され、本発明の更なる態様での前記ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性のアッセイとして利用することもできることが理解される。
【０１０３】
ＨＩＦヒドロキシラーゼのための基質であるＨＩＦ−αポリペプチドは、他のポリペプチドに縮合して、縮合ペプチドの活性を調節する前記ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性をもたらしてもよい。したがって、本発明の他の形態では、縮合ポリペプチドの活性のアッセイを提供する。好ましい形態では、このような縮合ポリペプチドは、具体的にはＡｓｎ８０３又はＣＡＤ領域を含むＨＩＦ−αポリペプチドの全体又は一部を含有してもよい。アミノ酸１〜１４３と共にＧａｌ結合アップストリーム活性化配列（ＵＡＳ）を含有するＧａｌ４ＤＮＡ結合領域は、このような転写因子及び同源のＤＮＡ応答要素の例であり、その作用は、当技術分野の専門家であれば、アッセイすることができる。
【０１０４】
選択性
単一のターゲットとして、又は選択されたヒドロキシラーゼ群で、さらにはファミリー全体で、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシナーゼの選択性を調節することも有利である。したがって、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を調節する薬剤は好ましくは、特異的である。即ち、これらは、他の２ＯＧ依存性オキシゲナーゼに対してよりも、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼに対して高いか強い作用を有する。
【０１０５】
したがって本願明細書に記載のアッセイ方法は、試験化合物と１種又は複数の２ＯＧ依存性オキシゲナーゼとを、前記２ＯＧ依存性オキシゲナーゼが正常に活性である条件下に接触させ、前記オキシゲナーゼの活性を定量することをさらに含んでもよい。試験化合物が存在する場合と不在な場合とでの活性の差異は、その試験化合物が、１種又は複数の２ＯＧ依存性オキシゲナーゼの活性を調節することを示している。
【０１０６】
１種又は複数の２ＯＧ依存性オキシゲナーゼに対して、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの高いか強い調節をもたらす試験化合物は、ＨＩＦヒドロキシゲラーゼに対する選択性又は特異性を示す。
【０１０７】
２ＯＧ依存性オキシゲナーゼには例えば、クラバミンテ（ｃｌａｖａｍｉｎｔｅ）合成酵素、Ａｌｋ ＢデアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素、コラーゲン−プロリル−４−ヒドロキシラーゼ、コラーゲンプロリル−３−ヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、アスパルチルヒドロキシラーゼ、フィタノイルコエンザイムＡヒドロキシラーゼ又はガンマ−ブチロベタインヒドロキシラーゼが含まれうる。２ＯＧ依存性オキシゲナーゼは、哺乳動物、好ましくはヒトポリペプチドであってよい。
【０１０８】
本発明は、低いＨＩＦ活性を伴う状態を治療するための薬剤を製造する際にこのようなＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの選択的阻害剤を使用することを提供する。
【０１０９】
治療用途
ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性に影響を及ぼしうることが判明している化合物、物質又は薬剤、或いはＦＩＨ阻害剤と本願明細書で称されている化合物は、多くの状況で治療的及びその他の可能性を有する。治療処置では、このような化合物を、他の活性な物質と組み合わせて、例えば、抗腫瘍治療では他の抗腫瘍化合物若しくは放射線療法又は化学療法などの治療と組み合わせて使用することができる。
【０１１０】
１種又は複数の一次スクリーニングを使用して（例えば、無細胞系）、ＨＩＦヒドロキシラーゼのＨＩＦαアスパラギン水酸化活性を調節しうると同定された薬剤を、１種又は複数の二次スクリーニングを使用してさらに評価することができる。二次スクリーニングは、例えば、薬剤が不在の場合に対して薬剤が存在する場合に細胞に存在するＨＩＦターゲット遺伝子又はプロセスのレベルにより明らかなＨＩＦ−α又はＨＩＦ活性の量の増減を試験することを含む。
【０１１１】
抗体などの他の活性薬剤と組み合わせた場合を含む、全長ポリペプチド又はその断片或いは改変されたポリペプチド（例えば、安定性を高めるためか、ターゲッティングを保証するための）での処置を含む治療で、ＨＩＦヒドロキシラーゼ又はＨＩＦポリペプチドを使用することができる。例えば、Ａｓｎ８０３を別のアミノ酸残基に代えるためのＨＩＦ−１αの変異により、水酸化を防いで、ＨＩＦ−αとｐ３００との相互作用を促進し、転写活性を刺激する。
【０１１２】
通常、本発明による修飾物質である薬剤、化合物又は物質は、単離及び／又は精製された形態、即ち実質的に純粋な形態で提供される。これは、活性成分少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、さらに好ましくは少なくとも約９８％である組成物であることを含む。しかしながらこのような組成物は、活性薬剤の正確な輸送、放出及び／又は安定化のために必要なものなどの不活性な担体材料又は他の薬学的若しくは生理学的に許容できる賦形剤を含んでもよい。通常、このような組成物中での濃度は、組成物の重量に対して０．１から５０重量％、通常は０．５〜２０重量％、特に１から１０重量％である。前記ように、本発明による組成物は、開示されている修飾物質化合物に加えて、抗腫瘍薬剤などの治療用途の１種又は複数の他の分子を含有してもよい。
【０１１３】
本発明のアッセイにより得られた生成物
本発明はさらに、本発明の方法により得られたか、同定された化合物及び、この化合物が薬学的に許容できる担体又は希釈剤と混合されている薬剤組成物などの前記化合物を含有する組成物を提供する。担体は、液体、例えば、生理食塩水、エタノール、グリセリン及びこれらの混合物又は固体、例えば、錠剤の形態で、又はデポー処方物として処方されたゲルなどの半固体形態で、又は経皮パッチなどの経皮投与可能なビヒクルであってよい。
【０１１４】
本発明はさらに、ＨＩＦヒドロキシラーゼによるＨＩＦαポリペプチドのアスパラギンターゲット残基の水酸化を妨害する薬剤を患者に投与することを含む治療法を提供する。このような薬剤は、アスパラギンヒドロキシラーゼ活性の阻害剤を含んでもよい。さらに本発明は、前記で定義された化合物を患者に投与することを含む治療法を提供する。
【０１１５】
治療／予防目的は低いか、最適以下か、高いＨＩＦレベル又は活性を伴う状態或いはＨＩＦレベルは正常だが、ＨＩＦ活性を増大又は低減するなどのＨＩＦ活性の調節が望ましい状態を治療することに関連してよい；例えば：
（ｉ） 虚血状態、例えば、冠状、脳血管及び末梢血管不全を含む臓器虚血。治療を２つの方法で適用することができる；明らかな組織損傷、例えば、心筋梗塞の後に（組織損傷を限るために）、又は虚血を予防するために、例えば、アンギナを治療する際に冠状側枝を促進するために予防的に。
（ｉｉ） 創傷治癒及び臓器再生。
（ｉｉｉ） 自己−、同種及び異種移植。
（ｉｖ） 全身血圧。
（ｖ） 癌；ＨＩＦαは普通、腫瘍細胞ではアップレギュレーションされ、腫瘍成長及び血管形成に主な作用を有する。
（ｖｉ） 炎症性疾患。
（ｖｉｉ） 肺動脈圧、神経変性疾患。
【０１１６】
ヒト、臓器及び細胞群でのＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性の調節は、治療効果を得るための様々な方法で活用することができる：
（ａ） 非細胞自律：細胞は、他の細胞にシグナルを送る物質の産生に影響を及ぼすためにＨＩＦ系を使用する。これらのシグナルは、（ｉ）遠隔部位で（例えば、エリスロポイエチンは骨髄に作用する）又は（ｉｉ）局所で（血管由来成長因子は、血管の局所形成を増大する）作用を有しうる。したがって、ヒドロキシラーゼ活性を調節することを介しての非細胞自律行動の操作は、貧血並びに例えば眼、脳、心臓及び肢での局所虚血の治療で役立つ。生理的安定性の態様に関与する多くの他のシグナルは、ＨＩＦ活性化により調節されうるか、調節されることが知られている。したがって、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性の調節を使用して、治療効果に対して有用な応答を強化又は開始するか、有害な応答を予防又は緩和することができる。例えば、この手法を使用して、食欲或いは全身又は肺床での血圧を変更することができる。
【０１１７】
（ｂ） 細胞自律：細胞代謝、分化に関する決定、増殖及びアポトーシスを調節するためにも、細胞は、ＨＩＦ系を使用する。したがって、ＨＩＦ系の操作を使用して、細胞の生存及び行動を変更することができる。例えば、虚血組織で、ＨＩＦ活性を増大させることにより、細胞生存を増大させることができる。この手法を使用して、糖尿病が改善されるように膵臓β細胞生存を改善する際に、又はパーキンソン病、運動ニューロン疾患若しくは痴呆の形態でのニューロン群又は複数の群の生存又は機能を改善する際に使用することができる。別の手法では、ＨＩＦシグナルを操作して、細胞群の増殖を予防するか、その死又は分化を促進することができる。例えば、悪性腫瘍でのＨＩＦ系の一時的な活性化を使用して、腫瘍細胞のかなりの数の死を惹起することができる。
【０１１８】
薬剤組成物
様々な他の態様では、本発明は、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ阻害剤を含む１種又は複数の前記薬剤、化合物又は物質或いは１種又は複数の式（Ａ）から（Ｆ）の化合物又はその誘導体を含有する本明細書に記載の、このような目的のための薬剤組成物、薬剤、薬物又は他の組成物、医学的治療法でのこのような組成物の使用、例えば、前記ような医学的状態を治療（予防的治療も含んでよい）するためにこのような組成物を患者に投与することを含む方法、このような目的で、例えば、前記ような状態を治療するために投与するための組成物、薬剤又は薬物を製造する際のこのような薬剤化合物又は物質の使用、並びにこのような薬剤、化合物又は物質と薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクル又は担体及び場合によって他の成分とを混合することを含む薬剤組成物を製造する方法を提供する。
【０１１９】
一実施形態では、薬剤組成物を供給する方法は通常：
（ａ） 本発明に従い薬剤を同定すること；及び
（ｂ） こうして同定された薬剤を薬学的に許容できる賦形剤と処方すること
を含む。
【０１２０】
薬剤は、単独の活性薬剤としても、又は１種の他の若しくはいずれかの他の活性物質、例えば、抗腫瘍治療では他の抗腫瘍化合物或いは放射線療法又は化学療法などの治療と組み合わせて使用することもできる。
【０１２１】
本発明の医学的治療の方法で使用される薬剤であれば、投与は好ましくは、個人に利益を示すに十分な「予防有効量」又は「治療有効量」（場合によっては、予防も、治療と考えられうる）である。投与される実際量及び速度及び投与時間経過は、治療される対象の性質及び重度に左右される。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般的な開業医及びその他の医師の責任の範囲内である。
【０１２２】
薬剤又は組成物は、単独で又は他の治療と組み合わせて、例えば、前記ような治療される状態に応じて同時に又は連続して投与することができる。
【０１２３】
本発明による薬剤組成物及び本発明に従って使用するための薬剤組成物は、活性成分の他に、当技術分野の専門家によく知られている薬学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は他の材料を含有してもよい。特にこれらは、薬学的に許容できる賦形剤を含有してもよい。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害すべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、経口によるか、皮膚、皮下又は静脈内注射によってよい投与経路に左右される。組成物は通常、無菌である。
【０１２４】
経口投与のための薬剤組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形態であってよい。錠剤は、ゼラチン又は助剤などの固体担体を含有してもよい。液体薬剤組成物は通常、水、石油、動物油、植物油、鉱油又は合成油などの液体担体を含有する。生理学的食塩水、デキストロース又は他の糖類溶液若しくはエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれていてもよい。
【０１２５】
静脈内、皮膚又は皮下注射又は病気の部位での注射では、活性成分は、発熱物質不含であり、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する薬学的に許容できる水溶液の形態である。当技術分野の該当する専門家であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、乳酸加リンガー液などの等張性ビヒクルを使用して適切な溶液を調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤が必要に応じて含まれていてもよい。
【０１２６】
リポソーム、特に、カチオン性リポソームをキャリヤ処方物中で使用することができる。前記技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０年に見ることができる。
【０１２７】
物質又は組成物は、局所的に特定の部位に投与することもできるし、特定の細胞又は組織をターゲットとする方法で、例えば、動脈内ステントベース輸送を使用して輸送することもできる。
【０１２８】
ターゲッティング治療を使用して、抗体又は細胞特異的リガンドなどのターゲッティング系を使用することにより、活性物質をより特異的に、一定のタイプの細胞に輸送することができる。様々な理由で、例えば、薬剤が許容できない毒性を有する場合、又はそうしなければ、必要な投与量が多すぎる場合、又はそうしなければターゲット細胞に侵入することができない場合に、ターゲッティングが望ましくなりうる。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本発明は、高いか低いＨＩＦレベル又は活性を伴う状態を治療するための薬剤を製造する際に本発明の薬剤の使用を提供する。状態は例えば、虚血、創傷治癒、自己、同種及び異種移植、全身性高血圧、癌及び炎症性疾患からなる群から選択することができる。
【実施例１】
【０１３０】
水酸化されるヒトＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３での位置を、次に記載するように同定した。ＦＩＨ−１をコードするｃＤＮＡ配列を、ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎから）内でクローニングして、精製を容易にするためのＮ−末端Ｈｉｓ６タグを有するＦＩＨ−１タンパク質を得た。ニッケル親和性クロマトグラフィーによる粗製材料の精製、それに続くＨｉｓ６タグのトロンビン分離及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳｕｐｅｒｄｅｘＳ７５）により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると＞９５％純粋なタンパク質が得られた。質量分析により、単離された種の同一性が確認された。アスコルベート、ＤＴＴ、カタラーゼ、２−オキソグルタレート及び鉄（ＩＩ）の存在下に、ＦＩＨ−１ ＦＩＨ（Ｈｅｗｉｔｓｏｎら、Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ ２７７（２９）：２６３５１−２６３５５、２００２年）と共に３７℃で３０分間、好気インキュベーションすることにより、ヒトＨＩＦ−１αのアミノ酸７８８〜８０６を含有する１９残基ペプチドを改変した。４℃に冷却し、等容量のメタノールを加えることにより、反応をクエンチした。遠心分離により沈殿物を除去し、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４カラム（１５ｃｍ×４．６ｍｍ）を使用するＨＰＬＣにより、上澄みを精製した。０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの勾配を使用して、ペプチドを溶離し、アミノ酸及び質量分析のために、ＨＰＬＣ溶剤から凍結乾燥させた。ＮＭＲ分析のための調製の際に、試料をＤ２Ｏから２回凍結乾燥させた。
【０１３１】
ＨＩＦ−１αの残基７８８〜８０６に対応する合成１９残基ペプチドの触媒ＦＩＨ−１仲介水酸化を、ＨＰＬＣ精製された材料の質量分析により確認した：天然ペプチド１９マー［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１０２６．６７Ｄａ、改変ペプチド１９マー［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１０３４．６１Ｄａ、ペプチド中＋１６Ｄａに対応する（酸素）、二重に荷電されたイオンの＋８Ｄａの質量差異。生成物ペプチドのＮ末端エドマン分解により、次の配列が得られた：ＤＥＳＧＬＰＱＬＴＳＹＤＣＥＶｘＡ（式中、ｘは、アスパラギンではない）。エドマン分解のこの（１６）サイクルからのピークは、β−ヒドロキシアスパラギン標準と同じ位置まで達した。改変ペプチドの酸加水分解、それに続くアミノ酸分析により、β−ヒドロキシアスパラギン酸の存在だけが示された。
【０１３２】
１９マーペプチド基質とＨＰＬＣ精製されたインキュベーション生成物との１Ｈ及び１３Ｃ両方の化学シフト変化を、２Ｄ １Ｈ−１３Ｃ ＨＳＱＣ実験により評価した。基質で、４種のβ−ＣＨ２共鳴の組み分けを、１Ｈ及び１３ＣシフトによりＡｓｐ−１、Ｔｙｒ−１１、Ａｓｐ−１２及びＡｓｎ−１６に属するものとして分けた（Ｅｖａｎｓ，Ｊ．Ｎ．Ｓ．（１９９５年）Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）。生成物では、２Ｄ ＨＳＱＣ及び１Ｄプロトンスペクトルから、これら４種の共鳴のうちの３種のみが存在することが明確であった。これら２つのスペクトルの比較により、Ａｓｎ−１６β−炭素に該当するシグナル（基質ではδＨ２．８１３及び２．６９５ｐｐｍ及びδＣ３７．４０ｐｐｍ）は消滅することが判明し、これは、そのβ−炭素の所のアスパラギン残基の水酸化と一致した。２つのアスパラギン酸残基による共鳴は、おそらくプロトン付加状況の変化により若干シフトし、基質ではアスパラギンのβ−プロトンと同じ１Ｈ化学シフトで生じる。２種の試料でのシステインの酸化状態の差異は、システイニルβ−炭素及び水素でほぼ同一の化学シフトによるものではないようである。水酸化された残基のβ−水素での二重の二重項から単一の二重項への変化も可能性を除外され、ＮＭＲスペクトルで観察される変化は、凝集による。生成物スペクトルに２つの新たな共鳴が、δＨ４．９１３ｐｐｍ及びδＣ５６．２６ｐｐｍで、さらにδＨ４．６５４ｐｐｍ及びδＣ７２．２２ｐｐｍで生じた。これらの共鳴は、２Ｄ ＣＯＳＹスペクトルでは相互に関連しており、２．４Ｈｚの１Ｈ−１Ｈ結合定数を共有するので、水酸化アスパラギンのＣＨα−ＣＨβと指定される。これらの共鳴の出現も、基質スペクトルで観察されたδＨ４．７０６ｐｐｍ及びδＣ５１．４３ｐｐｍ共鳴の消失と一致し、したがってこれが、改変前の親アスパラギンのＣＨαとして指定される。水酸化Ａｓｎ−８０３で観察された２．４ＨｚのＣＨα−ＣＨβ結合定数と文献値との比較は、トレオ異性体が生じたことを示していた。
【０１３３】
前記ＮＭＲ実験をまとめると：ＨＳＱＣ実験により、ターゲットアスパラギンのβ−炭素で生じる水酸化の直接的な証拠が得られ、その際、水酸化されたβ−炭素は、著しい脱シールド（ｄｅｓｈｉｅｌｄｅｄ）（７２．２２ｐｐｍで）を示し、隣接するα−炭素は、親アスパラギンに比較してより少ない規模で脱シールドした（５６．２６ｐｐｍで）。１３Ｃ化学シフトでのこれらの規模の変化は、側鎖窒素の水酸化と一致しないが、β−炭素での水酸化と一致する。さらに、遊離ＤＬ−トレオ−β−ヒドロキシアスパラギンの１３Ｃスペクトルは（この研究）、α−及びβ−炭素に対応する５８．６３ｐｐｍ及び７３．８５ｐｐｍで共鳴を有する。生成物指定は、カルシウムが存在しない場合には、それぞれ４．４８ｐｐｍ及び４．３６ｐｐｍである（４．７５ｐｐｍでの水に対して）ＥＧＦ様領域でのβ−ヒドロキシアスパルチル残基でのα−及びβ−水素の１Ｈ−ＮＭＲ化学シフトとも一致する（Ｓｅｌａｎｄｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９、８１１１〜８１１８）。ここで報告されている結合定数の分析は、トレオ−異性体は、ＦＩＨ−１によるＡｓｎ−８０３の水酸化で生じたものであることを示している。
【０１３４】
２つの報告（Ｄａｍｅｓら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５２７１５２７６；Ｆｒｅｅｄｍａｎら（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９、５３６７５３７２）により、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ−８０３のβ−水酸化がどのようにして、ｐ３００との複合体形成にダメージを与えるかを示している。水酸化の位置は、いずれの報告でも同じではないが、いずれも、β−炭素のプロ−Ｓ位での、つまり、トレオ（２Ｓ、３Ｓ）−異性体をもたらす水酸化は、ＨＩＦ−１αの一部がとるα−らせん配座を維持し、ヒドロキシル基のエネルギー的に好ましくない脱溶媒に対する必要性をもたらす水素結合を妨害するであろうことを示している。挿入されたプロ−Ｓヒドロキシル基及びｐ３００のＩｌｅ−３５３（Ｄａｍｅｓら（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５２７１５２７６からのナンバリング）との間の立体クラッシュは、これら２つのタンパク質の相互作用を中断する。おそらく、同じメカニズムを使用して、ＨＩＦ−２αとｐ３００との相互作用を排除することもできる。Ａｓｎ−８０３のβ位置が改変されるという発見及び随伴するメカニズムの示唆を、ｐ３００に結合して、ＨＩＦ−αに代替する化合物を設計する際に、及びＦＩＨの阻害剤を設計する際に使用することができる（下記参照）；いずれの場合にも、前血管形成薬剤が可能となる。
【実施例２】
【０１３５】
ＣＡＤ又はＦｅ（ＩＩ）を酸化させることなく、Ｘ線分析に適したＦＩＨ：ＣＡＤ複合体を得るために、ＦＩＨ及び７〜５２残基の様々なＣＡＤ断片をＦｅ（ＩＩ）及び２ＯＧと共に嫌気性条件下に同時結晶化させた。Ｆｅ（ＩＩ）及びＮ−オキサロイルグリシン（ＮＯＧ、ＦＩＨ阻害剤）、（嫌気性）及びＺｎ（ＩＩ）及びＮＯＧ（好気性）と複合化したＦＩＨでの構造も得た。セレノメチオニン置換アポ−ＦＩＨでの多重異常分散により得られたモデルを使用して、これらの構造を、分子置換により解明した。ＣＡＤ７８６−８２６、Ｆｅ（ＩＩ）及びＮＯＧ又は２ＯＧ（構造１及び２、表１）、ＣＡＤ７７５−８２６とＺｎ（ＩＩ）及びＮＯＧ（構造３）で、結晶質ＦＩＨ：ＣＡＤ複合体を得た。ＣＡＤ７８７−８０６、ＣＡＤ８５０−８６２（ＨＩＦ−２α、ＨＩＦ−１αＣＡＤ８０２−８１４に等しい）及びＣＡＤ８００−８０６との結晶化の試みは、ＦＩＨ：ＣＡＤ複合体をもたらさなかった；溶解分析により、２０残基よりも短いＣＡＤ断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ基質では有効ではないことが示された。
【０１３６】
【表１】
【０１３７】
構造作業で使用される方法
タンパク質発現、精製及び結晶化
ＦＩＨ、ＣＡＤ７７５−８２６及びＣＡＤ７８６−８２６を記載されているように調製した（Ｈｅｗｉｔｓｏｎら、Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ ２７７（２９）：２６３５１−２６３５５、２００２年）。代謝阻害プロトコル及びＬ−セレノメチオニン５０ｍｇ／ｌを補足されているＬｅＭａｓｔｅｒ培地を使用して、セレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）置換されているＦＩＨを製造した。ＳｅＭｅｔ導入は、ＥＳＩ−ＭＳによると＞９５％であった。ＳｅＭｅｔ ＦＩＨの好気性結晶化（１１ｍｇ ｍｌ−１で）を懸滴蒸気拡散により１７℃で達成した。母液は、１．２Ｍの硫酸アンモニウム、４％のＰＥＧ４００及び０．１ＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５からなった。Ｂｅｌｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙグローブボックス中、アルゴンの嫌気性雰囲気下（Ｏ２０．３〜０．４ｐｐｍ）に、ＦＩＨ（１１ｍｇ ｍｌ−１で）、Ｆｅ２＋（１ｍＭ）、２ＯＧ／ＮＯＧ（２ｍＭ）及びＣＡＤ断片（１ｍＭ）を含有する同じ母液及び溶液を使用して、ＦＩＨ：Ｆｅ：ＣＡＤ断片複合体の結晶化を行った。ＦＩＨ：Ｚｎ：ＣＡＤ断片の結晶化を、同じ条件下に好気性で行った。ペプチドを、固相ペプチド合成により合成するか、Ｂｉｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．（サンディエゴ、米国）から購入した。
【０１３８】
結晶データ収集及び構造精密化
液体窒素に入れて結晶を冷凍し、窒素流を使用して１００ＫでＸ線データを集めた。１．２Ｍの硫酸アンモニウム、３％のＰＥＧ４００、０．１ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）及び１０％、続いて２４％のグリセリンを含有する溶液に連続して移すことにより、凍結保護を行った。三波長多重異常分散（ＭＡＤ）データセットを、Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ，Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ，Ｕ．Ｋ．のビームライン１４．２で２．９Å分解能まで集めた。ＦＩＨ：ＣＡＤ複合体の結晶からのデータを、ＡＤＳＣ Ｑｕａｎｔｕｍ４（１４．２及び９．６）又はＭａｒＣＣＤ検出器（９．５）を使用して、ビームライン１４．２、９．６又は９．５で集めた。全てのデータを、プログラムＭＯＳＦＬＭ及びＣＣＰ４スートを使用して処理した［Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０，７６０〜７６３（１９９４年）］。結晶は、スペース群Ｐ４１２１２に該当した。６個のセレニウム位を定め、プログラムＳＯＬＶＥを使用して相を算出した（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒら、Ｄ５５、８４９〜８６１、１９９９年）。ＲＥＳＯＬＶＥを使用して、０．５６から０．６６へとメリットの数値を高める密度改変を行った（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５６、９６５〜９７２、２０００）。
【０１３９】
プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７，１１０−１１９、１９９１年）を使用して、当初モデルを構築し、プログラムＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４，９０５〜９２１、１９９８）を使用して、ＳｅＭｅｔデータ（遠隔波長）を再び精密化した。シミュレートされたアニーリング、それに続くグループ化されたβ因子の精密化の１サイクルにより、Ｒｆｒｅｅを３６．２％にした。Ｒｆｒｅｅを３２．３％にするさらなる再構築及び精密化の後に、モデルを、２．１５Åデータセットに移した。Ｆｅ、基質及び溶剤分子を加えることを含むＲＥＦＭＡＣ５を使用する再構築及び精密化並びにＴＬＳパラメーターの精密化により、慣用のＲ因子を１７．８％に、Ｒｆｒｅｅを２１．３％にした。次の残基は、このモデルでは省かれている：ＦＩＨの１〜１５及び３０４〜３０６、ＣＡＤ断片の７８６〜７９４、８０７〜８１１及び８２４〜８２６。ＰＲＯＣＨＥＣＫによると、ラマチャンドラン異常値は存在せず、残基の９０．７％が、ほぼ好適な主鎖配座を有する。ＣＡＤペプチドでは、残基の７７．８％が、最も好適な領域に存在し、残りの２２．２％は、付加的に許される領域に存在する。
【０１４０】
２．１５Åデータからの座標を使用する分子置換及びＲＥＦＭＡＣ５を使用する精密化により、他の構造を解明した。全ての構造で、Ｆｅ及び２ＯＧ／ＮＯＧでの電子密度を、精密化を介して可視化した。鉄とＣＡＤ Ａｓｎ８０３β−炭素との間に、著しい明確な電子密度差が観察された。ＦＩＨとＣＡＤとのＢ因子差は、ＣＡＤが１００％占有ではないことを示しているので、このことは、基質不在下での１−カルボキシレート２ＯＧに関する別の結合モードを表しているが、これは、基質不在下でも水分子結合によるものでありうる。
【０１４１】
ＦＩＨ構造の概観
ＦＩＨの核は、８本のβ鎖、β８〜β１１及びβ１４〜β１７から生じる二本鎖βらせん（ＤＳＢＨ又はジェリーロール）モチーフを含む。残基２２０〜２５９は、ＤＳＢＨの鎖４及び５の間の挿入物を形成する。ＤＳＢＨの底面は、Ｎ−末端領域からの付加的な４本のβ鎖と並んで、８員の逆平行βシートを形成する。Ｎ−末端鎖β１は、活性部位とは逆のＤＳＢＨの面を二分する。このβ１鎖は、β１４とβ２とのその相互作用の間に、ＰＸＸＰ配列に位置する３６０°ねじれを有する。同様に位置するβ鎖は、常にタンパク質の同じ領域からではないが、大抵の２ＯＧオキシゲナーゼに存在する。β１、α１及びβ２により生じるシート−らせん−シートモチーフは、プロリン３−ヒドロキシラーゼを除くこの群の全ての酵素で保存されており、この領域の同様のフォールドが、関連するＣｕ（ＩＩ）利用クエルセチン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＱＤ）で判明している（Ｆｕｓｅｔｔｉら、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ１０（２）：２５９〜２６８、２００２年）。ＦＩＨのトポロジーにより明白に、これは、既にＱＤ及びＭｎ（ＩＩ）利用タイプＩＩホスホマンノースイソメラーゼを包含するクピン（ｃｕｐｉｎ）構造ファミリーの鉄結合員と定義される（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ，Ｐ．Ｍ．，及びＰｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６，７９）。
【０１４２】
ＦＩＨに関連する酵素
ＦＩＨは、ｊｕｍｏｎｊｉ転写因子のＪｍｊＣホモロジー領域と著しい配列相似性を有する（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ，Ｐ．Ｍ．，及びＰｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６，７９；Ｈｅｗｉｔｓｏｎら、Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ２７７（２９）：２６３５１−２６３５５、２００２年）。これらのタンパク質は、クピン構造スーパーファミリーのメンバーであり、細胞成長及び心臓の発達に関している。２ＯＧオキシゲナーゼ鉄結合残基は、幾つかのＪｍｊＣ領域に同定されるが、鉄結合モチーフとしては指定されていない。ＦＩＨ構造に関する配列探索により、このモチーフと、２ＯＧの５−カルボキシレートの結合に著しく関与するＦＩＨ残基Ｌｙｓ２１４及びＴｈｒ１９６との両方を含有する保存残基を有する多くのＪｍｊＣタンパク質が明らかになる。こうして、構造によって、ＦＩＨは、転写の調節に関与する鉄及び２ＯＧ依存性オキシゲナーゼの大きなファミリーのうちの１つであることが明らかになる。ＦＩＨ以外の指定されたＪｍｊＣ領域のうちの幾つかは、疾患及び特定の表現型に随伴するので、その（例えば）阻害は、治療的に有効でありうる（例えば、Ｈｕら、ＯＮＣＯＧＥＮＥ ２０（４７）：６９４６〜６９５４ＯＣＴ１８ ２００１年及びＣｌｉｓｓｏｌｄ，Ｐ．Ｍ．，及びＰｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６，７９及びその参照文献参照）。
【０１４３】
表２。タンパク質を含有するＪｍｊＣ領域の選択を伴うＦＩＨの部分配列アラインメント。ＦＩＨ二次構造は、アラインメントの上に示されている。ＦＩＨ中に存在する選択された２ＯＧ結合残基は、アラインメント下の濃い色の三角で、２個の鉄結合残基は薄い色の三角で示されている。ＳＷＡＬＬ受入番号は、アラインメントの左側に示されている。
【０１４４】
【表２】
【０１４５】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【表３−８】
【表３−９】
【表３−１０】
【表３−１１】
【表３−１２】
【表３−１３】
【表３−１４】
【表３−１５】
【表３−１６】
【表３−１７】
【表３−１８】
【表３−１９】
【表３−２０】
【表３−２１】
【表３−２２】
【表３−２３】
【表３−２４】
【表３−２５】
【表３−２６】
【表３−２７】
【表３−２８】
【表３−２９】
【表３−３０】
【表３−３１】
【表３−３２】
【表３−３３】
【表３−３４】
【表３−３５】
【表３−３６】
【表３−３７】
【表３−３８】
【表３−３９】
【表３−４０】
【表３−４１】
【表３−４２】
【表３−４３】
【表３−４４】
【表３−４５】
【表３−４６】
【表３−４７】
【表３−４８】
【表３−４９】
【表３−５０】
【表３−５１】
【表３−５２】
【表３−５３】
【表３−５４】
【表３−５５】
【表３−５６】
【表３−５７】
【表３−５８】
【表３−５９】
【表３−６０】
【表３−６１】
【表３−６２】
【表３−６３】
【表３−６４】
【表３−６５】
【表３−６６】
【表３−６７】
【表３−６８】
【表３−６９】
【表３−７０】
【表３−７１】
【表３−７２】
【表３−７３】
【表３−７４】
【表３−７５】
【表３−７６】
【表３−７７】
【表３−７８】
【表３−７９】
【表３−８０】
【表３−８１】
【表３−８２】
【表３−８３】
【表３−８４】
【表３−８５】
【表３−８６】
【表３−８７】
【表３−８８】
【表３−８９】
【表３−９０】
【表３−９１】
【表３−９２】
【表３−９３】
【表３−９４】
【表３−９５】
【表３−９６】
【表３−９７】
【表３−９８】
【表３−９９】
【表３−１００】
【表３−１０１】
【表３−１０２】
【表３−１０３】
【表３−１０４】
【表３−１０５】
【表３−１０６】
【表３−１０７】
【表３−１０８】
【表３−１０９】
【表３−１１０】
【表３−１１１】
【表３−１１２】
【表３−１１３】
【表３−１１４】
【表３−１１５】
【表３−１１６】
【表３−１１７】
【表３−１１８】
【表３−１１９】
【表３−１２０】
【表３−１２１】
【表３−１２２】
【表３−１２３】
【表３−１２４】
【表３−１２５】
【表３−１２６】
【表３−１２７】
【表３−１２８】
【表３−１２９】
【表３−１３０】
【表３−１３１】
【表３−１３２】
【表３−１３３】
【表３−１３４】
【表３−１３５】
【表３−１３６】
【表３−１３７】
【表３−１３８】
【表３−１３９】
【表３−１４０】
【表３−１４１】
【表３−１４２】
【表３−１４３】
【表３−１４４】
【表３−１４５】
【表３−１４６】
【表３−１４７】
【表３−１４８】
【表３−１４９】
【表３−１５０】
【表３−１５１】
【表３−１５２】
【表３−１５３】
【表３−１５４】
【表３−１５５】
【表３−１５６】
【表３−１５７】
【表３−１５８】
【表３−１５９】
【表３−１６０】
【表３−１６１】
【表３−１６２】
【表３−１６３】
【表３−１６４】
【表３−１６５】
【表３−１６６】
【表３−１６７】
【表３−１６８】
【表３−１６９】
【表３−１７０】
【表３−１７１】
【表３−１７２】
【表３−１７３】
【表３−１７４】
【表３−１７５】
【表３−１７６】
【表３−１７７】
【表３−１７８】
【表３−１７９】
【表３−１８０】
【表３−１８１】
【表３−１８２】
【表３−１８３】
【表３−１８４】
【表３−１８５】
【表３−１８６】
【表３−１８７】
【表３−１８８】
【表３−１８９】
【表３−１９０】
【表３−１９１】
【表３−１９２】
【表３−１９３】
【表３−１９４】
【表３−１９５】
【表３−１９６】
【表３−１９７】
【表３−１９８】
【表３−１９９】
【表３−２００】
【表３−２０１】
【表３−２０２】
【表３−２０３】
【表３−２０４】
【表３−２０５】
【表３−２０６】
【表３−２０７】
【表３−２０８】
【表３−２０９】
【表３−２１０】
【表３−２１１】
【表３−２１２】
【表３−２１３】
【表３−２１４】
【表３−２１５】
【表３−２１６】
【表３−２１７】
【表３−２１８】
【表３−２１９】
【表３−２２０】
【表３−２２１】
【表３−２２２】
【表３−２２３】
【表３−２２４】
【表３−２２５】
【表３−２２６】
【表３−２２７】
【表３−２２８】
【表３−２２９】
【表３−２３０】
【表３−２３１】
【表３−２３２】
【表３−２３３】
【表３−２３４】
【表３−２３５】
【表３−２３６】
【表３−２３７】
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】２ＯＧ結合部位を示す図である。
【図２】Ａｓｎ−８０３の結合を示す図である。
【図３】サイト１でのＣＡＤの配座を示す図である。
【図４】サイト２でのＣＡＤの配座を示す図である。
【図５】ＦＩＨの活性部位でＨＩＦ−ＣＡＤの８０２〜８０４により生じる回転を示す図である。
【図６】ＦＩＨの活性部位でＨＩＦ−ＣＡＤの残基８０２〜８０４により生じる回転の配座を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＩＨの結晶構造を使用してＦＩＨの阻害剤を設計する方法並びにＦＩＨの阻害剤及び虚血を治療する際のその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物の細胞では、最適なレベルよりも酸素が不足している環境にさらされると、低酸素応答が生じる。これらの低酸素細胞では、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）を必要とする転写カスケードの活性化が、酸素輸送を増強するか、酸素要求量を制限する一連の適応応答を指揮する。癌及び虚血性低酸素血管疾患でのＨＩＦの活性化によって、ヒト病理学でのその重要な役割が明らかとなり、ＨＩＦ活性の操作は重要な治療可能性を有することが証明されている。
【０００３】
ＨＩＦ転写複合体は、αβヘテロ二量体を含有し、式中、ＨＩＦ−βは、酸素調節ＨＩＦ−αサブユニットと二量化する構成核タンパク質である（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４，１９８３１９９１）。特異的ＨＩＦ−α残基を水酸化する一連のＦｅ（ＩＩ）及び２ＯＧ依存性ジオキシゲナーゼによって触媒される酸素依存性改変によって、ＨＩＦ−αの活性は抑制される。ヒトＨＩＦ−１αに酸素が存在すると、１セットのＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼアイソザイム（ＰＨＤ１〜３）によるＰｒｏ４０２又はＰｒｏ５６４の４−水酸化（Ｅｐｓｔｅｉｎら、（２００１年）Ｃｅｌｌ １０７、４３５４；Ｂｒｕｉｃｋ，Ｒ．Ｋ．，及びＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９４、１３３７１３４０）が、フォン・ヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）ユビキチンリガーゼ複合体によるその認識及びそれによるプロテアソーム破壊のターゲッティングを仲介する（Ｉｖａｎら、（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２、４６４４６８；Ｊａａｋｋｏｌａら（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２、４６８４７２、国際公開第０２／０７４９８１号パンフレット）。相補的メカニズムでは、ＦＩＨは、ＨＩＦ−１α Ａｓｎ８０３のβ−水酸化を触媒して（Ｌａｎｄｏら、（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９５、８５８８６１）転写補活性化体ｐ３００との相互作用をブロックする（Ｄａｍｅｓら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９、５２７１５２７６；Ｆｒｅｅｄｍａｎら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５３６７５３７２）。低酸素では、酵素の活性化が限られることにより、ＨＩＦ−αは、破壊を免れて、転写活性になる。
【０００４】
ＨＩＦヒドロキシラーゼの阻害は、酸素が存在する場合でも、ＨＩＦ転写カスケードを強力に活性化する（Ｅｐｓｔｅｉｎら（２００１年）Ｃｅｌｌ１０７、４３５４）。したがって、ＨＩＦヒドロキシラーゼの阻害は、前血管形成応答をもたらし、これは、心筋梗塞及び貧血を含む心血管疾患／虚血性低酸素血管疾患を治療する際に使用することができる。この手法での問題は、ヒト細胞が、ＨＩＦヒドロキシラーゼと同じファミリーに属する、即ち、ジオキシゲン（補基質）、２−オキソグルタレート（２ＯＧ）（補基質）及びＦｅ（ＩＩ）（補因子）を利用する他の酵素を含むことである。このような酵素の例は、フィタノイル補酵素Ａヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリル−４−ヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリル−３−ヒドロキシラーゼ、ガンマ−ブチロベタインヒドロキシラーゼ、ＡｌｋＢ（ＤＮＡ修復酵素）及びＦＩＨに類似するサブファミリーを含む配列分析を元に同定される予測された２ＯＧオキシゲナーゼを含む他のものである（Ｈｅｗｉｔｓｏｎら、Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ２７７（２９）：２６３５１〜２６３５５、２００２）。薬剤として使用される酵素阻害剤は、所望の効果を生じさせる際に必要なその所定のターゲット又は複数のターゲットに選択的であることが望ましいことは、通常、理解される。選択性の不足は、毒性副作用をもたらすことがあり、このことによって、特定の化合物がヒト又は動物治療で使用するために適さないものとなる。所定のターゲットに対して選択的である化合物を同定する１つの手法は、所定の薬剤の構造的、機械的又は他の分析を行い、得られた情報を使用して、ヒト又は動物で使用するための薬剤として使用するための選択的な化合物又はさらに選択的な化合物（既知の化合物に比べて）を調製する際に役立てることである。ここでは、我々は、ＦＩＨ及び類似酵素の選択的阻害剤の設計を可能にするＨＩＦヒドロキシラーゼの構造的又は他の研究を記載する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ＦＩＨによるＨＩＦ−１αのアスパラギン８０３の水酸化部位を同定した。加えて、本発明者らは、ＦＩＨとＨＩＦとの相互作用に関与する結合部位及び残基の同定を含むＦＩＨでの結晶構造を得た。
【０００６】
したがって、本発明は、ＦＩＨを模倣するか、それに結合する化学実体を同定、スクリーニング、特性決定又は設計する方法を提供し、この方法は、ＦＩＨの構造モデルと、前記化学実体の構造モデルとを比較することを含み、その際、ＦＩＨの前記構造モデルは、ＦＩＨを含有する結晶をＸ線回折測定に掛けることにより決定された構造因子又は構造座標に由来する。
【０００７】
本発明はさらに：
化学実体を同定、スクリーニング、特性決定、設計又は改変するための、ＦＩＨを含有する結晶をＸ線回折測定に掛け、その回折測定から構造座標を推測することにより得られた構造座標の使用；
ＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害する、本発明の方法により同定された化学実体；及び
治療法で使用するための本発明の化学実体
を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＦＩＨにより水酸化されるアスパラギン８０３の位置を同定した。加えて、発明者らは、ＦＩＨの結晶構造を同定した。したがって、この構造により、ＦＩＨとＨＩＦとが結合する際に必要なアミノ酸残基の同定が可能である。
【０００９】
相互作用及び構造の同定により、結合して、具体的にはＦＩＨを阻害しうる化学実体の特性決定又は同定が可能である。下記でより詳細に検討するように、数種の異なるタイプの阻害剤を同定することができる。
【００１０】
発明者らは、ヒトＦＩＨを結晶化することに成功した。これは初のＦＩＨの結晶化であり、これによって、結晶構造を決定することができた。結晶分析からの座標は、下記の表３に記載する。この研究により、ＨＩＦのアスパラギン−８０３の結合の分析及びＦＩＨとの結合部位でのＨＩＦのｃ末端活性化領域（ＣＡＤ）の配座の分析が可能になった。本発明は、化学実体を同定、特性決定、設計又はスクリーニングするためのＦＩＨの構造座標の使用を提供する。該当する化学実体は、ＦＩＨに結合する、具体的には、ＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害するものである。加えて、アスパラギンヒドロキシラーゼを改変する化学実体を、同定、特性決定又は設計することもできる。
【００１１】
通常、化学実体を同定、スクリーニング、特性決定、設計又は改変するために、ＦＩＨ又はその断片を含有する結晶をＸ線回折測定に掛け、その回折測定から構造座標を推測することにより、使用される構造座標を得ることができる。構造座標は、結晶内での個々の原子の位置を示し、化学実体を設計する際に、個々の原子の位置を調節するために利用可能なスペースの指示を与える。
【００１２】
Ｘ線回折法に掛けられる結晶は、ＦＩＨ又はその断片を含有する。ＦＩＨは、どのような源からであってもよいが、好ましくはヒトＦＩＨである。ＦＩＨは、改変された形態であってもよい。例えば、ＦＩＨは、挿入、欠失、ｎ末端若しくはＣ末端付与、又は他のアミノ酸によるアミノ酸の置換によって改変されていてもよい。アミノ酸置換は、保存的置換であってよい。通常、結晶化すると、ＦＩＨ突然変異体は、対応するＦＩＨがとる構造と同様の三次元構造をとる。突然変異体は、不活性ＦＩＨであってもよい。
【００１３】
本明細書において、ＦＩＨとは、ＦＩＨ及びその同族体を指す。アミノ酸残基は、ＦＩＨでの位置に関して定義される（例えば、Ｈｅｗｉｔｓｏｎら参照）。ＦＩＨの同族体の該当アミノ酸残基は、例えば、ＦＩＨに対する同族体の最良のアラインメントをベースとして、同等のアミノ酸残基である。
【００１４】
結晶化研究で使用するための適切な手段により、ＦＩＨを単離することができる。例えば、生化学的手段を使用して適切な源から、ＦＩＨを精製することができる。しかしながら通常は、細胞中でＦＩＨを過剰発現させて、これらの細胞からＦＩＨを精製することが簡便である。したがって、ＦＩＨをコードするポリヌクレオチドを、ベクターの構造中で使用することができる。当技術分野の専門家に知られている方法に従って、ＦＩＨを結晶化させることができる。適切な方法に従って、Ｘ線回折を実施することができる。適切な方法を使用して、Ｘ線回折実験から集められたデータを処理して、ＦＩＨの構造座標を推定することができる。
【００１５】
本発明は、化学実体を同定、特性決定、設計又はスクリーニングするために構造座標を使用することを提供する。化学実体は、ＦＩＨに結合するか、アスパラギニルヒドロキシラーゼ活性の阻害剤として作用するものであってよい。或いは、この化学実体は、ＦＩＨの活性を変化させるために改変されているＦＩＨであってもよい。
【００１６】
ＦＩＨに結合するか、それを阻害する化学実体は、ＦＩＨと会合を生じうる任意の化学実体である。結合又は阻害は、非特異的であってもよく、例えば、このような単位は、他の２ＯＧオキシゲナーゼに結合するか、それを阻害してもよい。或いは、アスパラギニルヒドロキシラーゼに特異的に結合するか、それを阻害する薬剤を設計又は同定することもできる。ＦＩＨの特異的阻害剤ではあるが、他のアスパラギニルヒドロキシラーゼの特異的阻害剤ではない薬剤を設計又は同定することもできる。
【００１７】
ＦＩＨの構造座標により、当業者であれば、どのアミノ酸が活性部位形成で重要であり、どのアミノ酸が、基質との接触で重要であるかを予測することができる。基質結合部位を、物理モデルにより生じるか、コンピュータスクリーン上に表示される二次元表示又は三次元表示として示すことができる。このような表示を使用して、ＦＩＨに結合するか、それを阻害する、或いはＦＩＨに結合するか、それを阻害すると予測される化学実体を設計、同定又はスクリーニングすることができる。このような表示を使用して、その活性特性を調節するＦＩＨの改変を同定することもできる。
【００１８】
ＦＩＨに対する改変の例には、その基質へのＦＩＨの結合を増大させるか、基質特異性を変更するための改変が含まれる。別の改変には、ＦＩＨの活性を調節する、例えば、アスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を除く改変が含まれる。
【００１９】
構造の表示を別の方法で使用することもできる。例えば、ＦＩＨ活性部位の表示を使用して、ＦＩＨが基質に結合すると、相互に接近する原子の間に共有結合がおそらく導入されることによる拘束をモデリングすることができる。活性部位の表示を使用して、ＦＩＨのどの残基が、立体障害に関与しているようであるかを予測することもできる。このような残基を改変、置換又は欠失させて、深部障害を減少させ、その基質に関するペプチドの活性を増大させることもできる。
【００２０】
通常、コンピュータをベースとする方法で本発明により得られる構造座標を処理して、所望の分子構造を有する化学実体を同定又は設計するか、その構造が該当する他の化学実体の全部又は一部を補足する化学実体を同定することが必要である。したがって、ＦＩＨと同様の構造を有する化学実体を、同定又は設計することができる。ＦＩＨに結合する化学実体を同定又は設計することもできる。好ましくは、このような化学実体は、ＦＩＨの活性部位に結合して、通常は、アスパラギニルヒドロキシラーゼ活性の阻害剤として作用しうる。
【００２１】
このようなコンピュータをベースとする方法は、２つの幅広い群に分類される：データベース法及びデノボ設計法。データベース法では、該当する化学実体を、その構造が同定された該当する化合物に多少でも似ている化学構造及び化学実体のデータベースに存在する全ての化学実体と比較する。データベース中の構造は、ＮＭＲ又はＸ線結晶学により生成した実験データ又は二次元データに基づく三次元構造のモデルをベースとしている。デノボ設計法では、既知の構造及び／又は理論的規則に由来する情報を使用して、例えば、ＦＩＨに結合するであろう化学実体のモデルを、コンピュータプログラムにより生成する。
【００２２】
同様に、ＦＩＨ構造座標を使用して、他のヒドロキシラーゼ、例えばプロリルヒドロキシラーゼの阻害剤などの修飾物質であると選択、設計又は判明している化学実体の予測活性をスクリーニングすることができる。例えば、化合物をスクリーニングして、付加的にＦＩＨヒドロキシラーゼを阻害するプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤の公算を評価することができる。ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼは選択的に阻害するが、ＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼは阻害しない薬剤を同定する際に、このようなスクリーニング法を利用することができる。
【００２３】
コンピュータ評価又は実験評価を使用して、本発明の方法により設計又は選択された化学実体を試験し且つ最適化することができる。アスパラギニルヒドロキシラーゼの活性に関してアッセイするための実験方法を下記で詳述する。
【００２４】
ＦＩＨの構造に基づき、幾つかの異なるタイプの阻害剤を同定することができる。これらの阻害剤を、下記で詳細に検討する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
二量化阻害剤
結晶学的不斉単位は、１個のＦＩＨ分子を含有する。しかしながら、結晶学的対称性の分析により、ＦＩＨの二量体形態が明らかになり、これは、本来のゲル電気泳動分析と一致した。二量体界面は、主に疎水性相互作用を伴うインターロック配置で各分子の２個のＣ末端らせんを伴う。この珍しい界面は、このサイズの他の二量体タンパク質に比較して、平均して広い３２１０Å２の表面積を占めている。二量化阻害剤には、Ｌｅｕ−３４０及びＩｌｅ−３４４などの３３０〜３４６から選択される残基を含む二量化界面を形成する残基に結合するものが含まれる。阻害剤には、二量化界面に関与するＦＩＨ残基の全部又は一部に対応するペプチド又はペプチド模倣物質が含まれる。
【００２６】
例えば、このような阻害剤は、例えば３４０〜３４４の残基、好ましくは残基３３０から３４６を含むＦＩＨの断片を含んでもよい。このような断片は通常、長さにおいて６又は１０個のアミノ酸、好ましくは長さにおいて１５又は２０個までのアミノ酸を有する。或いは、例えば１、２又はそれ以上の置換を伴う３４０〜３４４又は３３０〜３３６の残基に対する同族体を含むペプチド同族体を使用することもできる。さらなる薬剤には、二量化を妨害するように、結晶構造を元に設計することができるペプチド又はペプチド模倣物質が含まれる。
【００２７】
ＦＩＨでの金属結合を利用する阻害剤
構造研究により、ＦＩＨ及びおそらく関連するＨＩＦヒドロキシラーゼの活性部位にＦｅ（ＩＩ）が存在することが判明している。この鉄は、大抵八面体で、Ｈｉｓ１９９、Ａｓｐ２０１及びＨｉｓ２７９の側鎖、２ＯＧの２−オキソ及び１−カルボキシレート基により結合している。酵素−基質複合体では、Ｈｉｓ２７９の反対側に空の位置があり、これにより、この酵素は、二酸素結合のためにプライミングされていることが分かる。Ｈｉｓ２７９の反対側のリガンドの適応は、Ａｓｐ２０１とＣＡＤ Ａｓｎ８０３との水素結合の破壊を必要とすることがある（鉄及びＡｓｎ８０３β−炭素は、約４．９Åしか離れていない）。２ＯＧの後続の脱炭酸反応はおそらく、鉄−オキソ種［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ＜−＞Ｆｅ（ＩＩＩ）−Ｏ・］をもたらし、これは、ＨＩＦのＣ末端トランス活性化領域（ＣＡＤ）でのＡｓｎ−８０３の炭素での酸化をもたらす。
【００２８】
鉄に結合する官能基を含有する化合物は、ＦＩＨの阻害剤として役立つ。このような化合物の例には、チオール、アルコール、ケルシチン及びその誘導体などのフラボノイドを含むフェノール、炭水化物、ヒドロキサメート、イミダゾール並びに他の複素環、例えば窒素含有複素環が含まれる。
【００２９】
Ｚｎ（ＩＩ）は、Ｆｅ（ＩＩ）と同じ様にＦＩＨに結合し（構造３）、これは、金属仲介低酸素効果が、ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性部位からのＦｅ（ＩＩ）の置換によることと一致する。Ｚｎ（ＩＩ）も、ＦＩＨの他の金属阻害剤も、触媒作用での補因子としてＦｅ（ＩＩ）に取って代わることはできないので、ＦＩＨの活性部位で、鉄以外の金属［Ｚｎ（ＩＩ）など］の結合を優先的に促進する化合物は、阻害剤として作用する。
【００３０】
阻害剤の他の群は、活性部位での結合に関してＦｅ（ＩＩ）と拮抗することを介して作用する非金属阻害剤である。このような阻害剤は、触媒活性なＦＩＨの活性部位でＦｅ（ＩＩ）に結合する残基の三つ組（Ｈｉｓ−１９９、Ａｓｐ−２０１、Ｈｉｓ−２７９）のいずれか又は全てに結合しうる。
【００３１】
２ＯＧ結合部位を利用する阻害剤
ＮＯＧを伴うＦＩＨ：ＣＡＤ構造は、２ＯＧのように、二座で鉄に配位されることを示し、鉄結合過酸化物（スーパーオキシド）中間体によるか、金属への二酸素の結合を妨害することによる攻撃に対して感受性が低いことにより、阻害剤であることを示している。
【００３２】
ＦＩＨでの構造研究により、２ＯＧ及びＮＯＧに関する結合相互作用が判明している（例えば、図１参照）。２ＯＧ（及びＮＯＧの同等のカルボキシレート）の５−カルボキシレートは、Ｌｙｓ２１４、Ｔｈｒ１９６及びＴｙｒ１４５の側鎖と水素結合を形成し；このような相互作用は、２ＯＧオキシゲナーゼの他の構造では前例がなかった。さらに、Ｌｙｓ２１４が第４のＤＳＢＨ（二本鎖βらせん）β鎖である一方で、以前に与えられた塩基２ＯＧ−５−カルボキシレート結合残基は、第８のＤＳＢＨ鎖の開始点に存在することにおいて、ＦＩＨは珍しい。
【００３３】
構造研究により、その中に２ＯＧとＮＯＧとが結合するポケットを形成するＦＩＨ残基が判明している。前記に加えて、これらには、Ｉｌｅ−２８１、Ｌｅｕ−１８６、Ｌｅｕ−１８８、Ｐｈｅ−２０７、Ｔｈｒ−１９６の側鎖が含まれる。これらの相互作用を知ることにより、改善された（結合パラメーターにより測定される）選択的な阻害剤を設計することが可能である。したがって例えば、２ＯＧ結合ポケットでの阻害剤の結合は、Ｉｌｅ−２８１、Ｌｅｕ−１８６、Ｌｅｕ−１８８、Ｐｈｅ−２０７、Ｔｈｒ−１９６の側鎖のいずれか又は全てとの疎水性相互作用をもたらしうる。さらに、このことは、２ＯＧの５−カボキシレートの結合に関与する残基（Ｌｙｓ２１４、Ｔｈｒ１９６及びＴｙｒ１４５）との静電又は水素結合相互作用をもたらしうる。
【００３４】
２ＯＧ結合残基との阻害剤の相互作用を介してのＦＩＨの選択的阻害は、次のように例示される：Ｎ−オキサロイルアミノ酸をベースとした一連の阻害剤の反応速度分析により、Ｎ−オキサロイルアラニンのＲ−鏡像異性体（ＩＣ５００．４ｍＭ）は、Ｓ−鏡像異性体（ＩＣ５０２．５ｍＭ）よりもかなり強力であることが判明した。ＦＩＨ内の２ＯＧ結合ポケットの分析により、Ｓ−鏡像異性体の結合は、そのメチル基と、２ＯＧ結合ポケット内のＴｈｒ−１９６及びＩｌｅ−２８１の側鎖との相互作用により妨害されることが判明した。プロコラーゲンのプロリル−ヒドロキシラーゼ及びＰＨＤアイソザイムの両方に関しては、逆の選択性（即ち、Ｓ−鏡像異性体がより強力であった）が観察され、このことは、個々のタイプのＨＩＦヒドロキシラーゼに関して選択的阻害剤を開発することができるはずであることを証明している。このような阻害剤は、活性部位金属にキレート化してもよいし、しなくてもよい。
【００３５】
化合物には、一般式：
【化１】
のものが含まれる
［式中、
Ｒ’及びＲ”はそれぞれ同一又は異なって、Ｈ、Ｆ或いはＣ１からＣ３アルキル若しくは置換アルキル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ又はＣＯＮＨ２であり、Ｘは、ＣＯＯＨ、ＳＯＯＨ若しくはＣＯＮＨＨ又はそのエステル又は複素環であるか、或いはＬｙｓ−２１４、Ｔｈｒ−１９６及びＴｙｒ−１４５、即ち、結晶学的分析で判明したように、２ＯＧの５−カルボキシレートの結合に関与する残基の１つ又は複数の側鎖と好ましい相互作用をもたらす他の基であり、
Ｙは、−（ＣＲ’’’Ｒ’’’）ｎＺであり、Ｚは、
−ＮＲ’’’ＣＯＣＯＯＨ、−ＮＲ’’’ＣＳＣＯＯＨ、−ＮＲ’’’ＣＯＣＯＳＨ、−ＣＨＳＲ’’’ＣＯＮＲ’’’Ｒ’’’’、−ＣＨＯＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＯＲ’’’、−ＣＨＳＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＯＲ’’’又は−ＣＨＯＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＮＲ’’’ＯＲ’’’であり、Ｒ’’’はそれぞれ同一又は異なって、Ｈ、アルキル、ＯＨ又はＯ−アルキルであり、ｎは、０〜３であり、好ましくは０である］。
【化２】
［式中、Ｒ’’’’は、ＯＨ、ＯＲ’’’又はＮＨＣＯＲ’’’であり、Ｗは、Ｓ、ＮＨ又はＯである］。
【００３６】
Ｘは、Ｌｙｓ−２１４、Ｔｈｒ−１９６及びＴｙｒ−１４５、即ち、２ＯＧの５−カルボキシレートの結合に関与する残基の１つ又は複数の側鎖と好ましい相互作用を生じる基である。Ｘは、作用の望ましい部位に輸送されるか、望ましい薬物動態特性を有するようなプロドラッグとして官能化されていてもよい。前記で示したように、Ｘは、Ｘのカルボン酸バージョンのメチル若しくはエチルエステルなどのエステル又はアミド誘導体であってよい。
【００３７】
ｎが０である場合には、Ｙは通常、ＣＯＮＨＯＨ、ＣＯＮＨＮＨ２、ＮＲ’’’ＣＯＣＯＯＨ、ＮＲ’’’ＣＳＣＯＯＨ又はＮＲ’’’ＣＯＣＯＳＨである。Ｙは優先的に、活性部位金属にキレート化しうる一方で、結晶学分析により定義されるような２ＯＧ結合ポケットに存在する好ましい結合相互作用の全て又は一部を維持するようなサイズである。Ｘと同様に、Ｙは、プロドラッグとして官能化されていてもよい。
【００３８】
Ｙが、前記で示されているように芳香族環を含有する場合には、これは、アリール又は官能化アリール環、さらに複素環及び官能化複素環を含む他の環系を含有してもよい。前記環をさらに官能化して、ＦＩＨ活性部位での結合を最適化することもできる。
【００３９】
ペプチド基質結合部位を利用する阻害剤
２つの結合部位が存在
ＥＳ複合体構造によって、それぞれ１６４０Å２及び１０８０Å２の接触表面積を有するＣＡＤ７９５−８０６（即ち、ＨＩＦのＣ末端トランス活性領域の残基７９５〜８０６）（サイト１）及びＨＩＦのＣＡＤ８１３−８２２（サイト２）を含む２つの別々の結合部位が予期せず判明した（例は、図参照）。これらの領域のＣＡＤ残基は、全ての既知のＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２α配列に保存されている。サイト１での電子密度は、性質が良好であり、Ｔｙｒ７９８の側鎖でのみ、乏しいと定義される一方で、サイト２では、より低いレベル及び性質で、これはおそらく、このサイトでの弱い結合を反映している。密度が観察されなかったＣＡＤ８０４−８０６及びおそらくＣＡＤ８０７−８１１も、ＦＩＨとは直接的な相互作用を生じない。サイト１及びサイト２の相対的重要性を調べるために使用された反応速度分析により、サイト１のみを含有する断片はＦＩＨにより水酸化されるが、両方のサイトを含有するものよりも効率的でないことが判明し、これは、結合の際には両方が重要であり、両方を阻害研究で利用することができることを証明している。
【００４０】
サイト１では、ＣＡＤ７９５−８０３は、溝部に結合して、１０個の水素結合によりＦＩＨに結合する広く延びた配座をとる。ＣＡＤのＡｓｎ８０３は、活性でかなりを占めていて、Ｆｅ（ＩＩＩ）に直接隣接している。ＣＡＤ Ａｓｎ８０３及びＡｌａ８０４は、Ｖａｌ８０２の主鎖カルボニルとＡｌａ８０４のＮＨとの間の、Ａｓｎ８０３の側鎖をＦｅ（ＩＩ）に向ける水素結合により安定化されるしっかりとした回転を形成する。ＣＡＤ Ａｓｎ８０３の側鎖は、３個の水素結合により正確に配位されて、β−炭素のプロ−Ｓ位置での水酸化を可能にするが、これは、ＮＭＲ指定と一致する（前記参照）。ＣＡＤ Ａｓｎ８０３の１級アミドは、ＦＩＨ残基Ｔｙｒ１０２とＦｅ（ＩＩ）との間に挟まれていて、ＤＳＢＨモチーフへの挿入部に位置する残基であるＦＩＨ残基のＧｌｎ２３９及びＡｒｇ２３８の側鎖と水素結合を生じる。特に、基質とＦｅ（ＩＩ）との結合部位は、直接結合する。それというのも、ＣＡＤのＡｓｎ８０３の主鎖窒素も、鉄に複合化していないＡｓｐ２０１のカルボキシレート酸素と水素結合（約３Å）を形成するためである。６個の付加的な水素結合が、ＦＩＨとＣＡＤ７９５−８０１との結合を安定化する。
【００４１】
サイト１とは異なり、サイト２は、ＦＩＨ表面に位置し、２個の水素結合のみを伴う。サイト２のＣＡＤ８１６−８２３は、α−らせんを生じるが、これは、ＣＢＰ／ｐ３００との複合体でのこの領域の構造に全く一致する（Ｄａｍｅｓら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５２７１５２７６；Ｆｒｅｅｄｍａｎら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５３６７５３７２）。この複合体と同様に、高度に保存されているＬｅｕ８１８、Ｌｅｕ８１９及びＬｅｕ８２２は、ＦＩＨ表面の疎水性ポケットに位置し、結合相互作用のベースを形成するので、これらの残基が同時にＣＢＰ／ｐ３００及びＦＩＨに結合することは不可能である。
【００４２】
サイト１の所でＣＡＤ残基がとる広いループ構造は、ＣＢＰ／ｐ３００の第１の転写アダプター亜鉛結合領域（ＴＡＺ１）と複合化した場合に同じ残基がとるα−らせん構造とは対照的である（Ｄａｍｅｓら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５２７１５２７６；Ｆｒｅｅｄｍａｎら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５３６７５３７２）。したがって、溶液中で遊離した場合にＣＡＤ及び他のＨＩＦ−α残基で観察される乱れた構造は、様々なタンパク質と複合体を形成するために複数の構造をとる必要性を反映している。
【００４３】
結合によるＣＡＤの構造の変化は、ＦＩＨの変化により補足され、これは、誘導される適合結合プロセスを示している；ＦＩＨのＴｒｐ２９６は、約Ｃｂｅｔａ−Ｃａｌｐｈａの５０°の回転を受けて、ＣＡＤ Ｖａｌ８０２を調節する一方で、Ｔｙｒ１０２とＴｙｒ１０３の両方は、より整然となる。誘導される適合のさらなる証拠は、ＣＡＤ断片結合を伴って得られた構造と伴わずに得られた構造との間の分解能における著しい差異に由来し、これは、結合で生じるＦＩＨの配列を反映している（比較のために、構造４は、Ｆｅ（ＩＩ）及び２ＯＧのみと複合化したＦＩＨを示している）。低分子を使用することによるか、遺伝子又はタンパク質治療により、低酸素応答の際に必要な構造変化、特に、ＣＡＤ領域を伴う構造変化を妨害することにより、前血管形成又は抗血管形成応答が可能であるように低酸素応答を操作することができる。
【００４４】
したがって、構造研究により、（ｉ）ＨＩＦのＣＡＤが結合する際に関与するＦＩＨ残基、（ｉｉ）ＣＡＤが結合した場合のＦＩＨの配座及び（ｉｉｉ）ＦＩＨに結合した場合のＣＡＤの構造が定義される。これらの結果は、ＦＩＨの選択的阻害剤及び関連酵素の設計で役立つ。ＦＩＨ結合部位の特徴を使用して、阻害剤とＦＩＨとのよりしっかりとした結合を仲介するか、ＦＩＨにしっかりと結合しない、即ちＦＩＨの阻害を回避しない阻害剤を得ることができる。
【００４５】
サイト１に、又はその近くに結合する阻害剤は、Ｔｙｒ−１０２、Ａｓｐ−１０４、Ｌｙｓ−１０６、Ａｓｐ−２０１、Ｇｌｕ−２０２、Ｇｌｎ−１４７、Ｇｌｎ−２３９、残基２９９〜３０３、Ｈｉｓ−３１３、Ａｌａ−３１７、Ｉｌｅ−３１８、Ａｓｎ−３２１、Ｌｙｓ−３２４、Ａｒｇ−２３８、Ｔｒｐ−２９６、Ａｓｎ−３２１〜Ｌｙｓ−３２４との静電水素結合及び／又は疎水性相互作用を利用することができる。サイト１での阻害剤結合は、サイト１に結合した場合にＣＡＤがとる回転構造を模倣するか、部分的に模倣してよい。
【００４６】
サイト２に、又はその近くに結合する阻害剤は、残基Ｔｈｒ−１４９、Ｌｅｕ−１５０、Ａｓｎ−１５１、Ａｓｐ−１５２及び残基Ｖａｌ−１５９、Ｐｈｅ−１６２、Ｌｅｕ−１６３、Ｔｒｐ−１６７、Ｇｌｎ−１８１、Ｌｅｕ−１８２、Ｔｈｒ−１８３、Ｓｅｒ−１８４、Ａｓｎ−１８５との静電水素結合及び／又は疎水性相互作用を利用することができる。サイト２での阻害剤結合は、サイト２に結合した場合にＣＡＤがとるらせん構造を模倣するか、部分的に模倣してよい。
【００４７】
阻害剤は、サイト１及びサイト２の両方に結合してもよいが、その必要はなく、サイト１が、サイト２よりも好ましいと認められる。
【００４８】
サイト１で結合するＣＡＤの残基８０１〜８０５、特に残基８０２〜８０５は、８０２の主鎖Ｃ＝Ｏと８０４の主鎖ＮＨとの距離が約２．８Åである回転構造を形成する。Ａｌａ−８０４のＮＨとＨＩＦ−１αＣＡＤのＶａｌ−８０２のカルボニルＯとの間に生じるＨ結合を含めて、この回転は、擬環中に７個の原子を含有する。
【００４９】
回転は、酵素阻害又は受容体結合に役立つ類似体による擬態に特に適している。医学的化学文献は、このような回転擬態の例を十分に備えている。既知の方法によりこれらを改変して、具体的にはターゲット構造に関する知識が得られている特定のターゲットに結合させることができる。
【００５０】
回転擬態及びその変種の例は、次のレビューで見ることができる：Ｈａｎｅｓｓｉａｎら、ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ５３：１２７８９−１２８５４ ＳＥＰ２２ １９９７年；Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲＳ４３：１９１−２１７ １９９７年；及びＢｕｒｇｅｓｓら、ＡＣＣＯＵＮＴＳ ＣＨＥＭ ＲＥＳ ３４：８２６−８３５ ２００１年）。回転に関する主要な報告の最近の例には、次のもの（及びその参照文献）が含まれる：Ｍａｉｅｒら、ＥＵＲ Ｊ ＯＲＧ ＣＨＥＭ：２６８６−２６８９、２００２年；Ｒｅｉｄら、Ｊ ＡＭ ＣＨＥＭ ＳＯＣ １２４：５６７３−５６８３、２００２年；Ｍａｈａｄｅｖａｎら、Ｊ ＢＩＯＭＯＬ ＳＴＲＵＣＴ ＤＹＮ １９：７７５−７８８ ２００２年；Ｅｇｕｃｈｉら、Ｊ ＭＥＤ ＣＨＥＭ ４５：１３９５−１３９８ ２００２年；Ｄｅ Ｂｏｒｇｇｒａｅｖｅら、ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴＥＲＳ ４２：５６９３−５６９５ ２００１年；Ｋｏｈｎら、ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴ ４２：４４５３−４４５７ ２００１年；Ｅｇｕｃｈｉら、ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴ ４２：１２３７−１２３９ ２００１年；Ｍａｎｚｏｎｉら、ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ５７：２４９−２５５ ２００１年；Ｊｉａｎｇら、ＨＥＬＶ ＣＨＩＭ ＡＣＴＡ８３：３０９７−３１１２ ２０００年；Ｄｅｒｒｅｒら、Ｊ ＣＨＥＭ ＳＯＣ ＰＥＲＫ Ｔ１：２９５７−２９６７ ２０００年；Ｂｅｌｖｉｓｉら、ＥＵＲ Ｊ ＯＲＧ ＣＨＥＭ：２５６３−２５６９ ２０００年；Ｃｌａｒｉｄｇｅら、ＢＩＯＯＲＧ ＭＥＤ ＣＨＥＭ ＬＥＴＴ ６：４８５−４９０ １９９６年。
【００５１】
これらには、一般式：
【化３】
の化合物が含まれる
［式中、Ｒ１は、Ｇｌｎ−２３７及び又はＡｒｇ−２３８と静電又はＨ−結合相互作用を生じうるもの、好ましくは、ＣＲ８Ｒ９ＣＯＮＨ２又はその類似体であり（式中、Ｒ８は、水素又はペプチド又はペプチド模倣物質（β−アミノ酸又はペプチドイソター（ｉｓｏｔｅｒｅ）からなるものなど）であり、Ｒ９は、水素、官能化されていてもよいアルキル、官能化されていてもよいアリール、ヘテロアリール又はＣＨ２ＣＯＮＨ２などのこれらの組合せである）、Ｒ２は、水素又はＦＩＨのＴｙｒ−１０２と有利に相互作用する基であり、Ｒ３は、Ｈ又はＡｓｐ−２０１とＨ−結合を生じうる基であり、Ｚ１は、＞Ｃ＝Ｏ又は＞ＣＲ５Ｒ９であり（式中、Ｒ５は、水素、官能化されていてもよいアルキル、アリール又はへテロアリール或いはこれらの組合せである）、Ｒ１２は、Ｒ５と同様に定義されるか、又はＮＨＲ６であり（式中、Ｒ６は、ＣＯＲ５又はＳＯ２Ｒ５である）、Ｘ１は、ＮＲ４、ＮＲ４Ｃ（Ｒ５）２、Ｃ（Ｒ５）２ＮＲ４或いはＯ又はＮＨである（式中、Ｒ４は、ＣＯＲ５又はＳＯ２Ｒ５である）］。この式又は他の式では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ、同じか、異なってよい。特に、これらの化合物は、式：
【化４】
のいずれかであってよい
［式中、基は前記と同様に定義され、Ｒ７及びＲ８は独立に、β−アミノ酸残基、ウレタン、スルホンアミド又はホスホンアミド結合を含有するか、それからなるもののようなペプチド又はペプチド模倣物質又は部分ペプチド模倣物質である］。
【００５２】
使用することができる他の化合物は、式：
【化５】
を有するものである
［式中、Ｑは、Ｈ又はＯＨであり、Ｒ７及びＲ８は前記と同様に定義される］。
【００５３】
使用することができる他の化合物は、式：
【化６】
を有するものである
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ９は前記と同様に定義され、Ｄは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ又はＣＨＲ９＝ＣＨＲ９である］。したがって、６員環に結合している環は、５員複素環又はアリール環である。
【００５４】
これらの式中、Ｒ８及びＲ９を最適化して、チャネル架橋の際に、２ＯＧとペプチド基質結合部位とを、又は２ＯＧ結合部位自体とを結合させることができる。
【００５５】
サイト１のＣＡＤがとる回転の模倣物質として作用する環式ペプチド。このシクロは、ペプチド結合、ジスルフィド結合又はＣ−Ｃ結合を介して生じさせることができる。
【００５６】
結合部位の組合せを利用する阻害剤
場合によっては二基質阻害剤とも称される、複数の基質又は補助基質結合部位での結合と拮抗する酵素阻害剤が有用であることは、よく知られている。例は、Ｗａｎｇら、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ−ＵＳ：１５６７６−１５６８３ ２００１年；及びＬｅｒｎｅｒら、ＡＮＧＥＷ ＣＨＥＭ ＩＮＴ ＥＤＩＴ４０、４０４０−４０４１、２００１年に見ることができる。
【００５７】
ＦＩＨ及び他の２ＯＧオキシゲナーゼの場合には、二基質阻害剤が有用である。それというのも、２ＯＧ結合の特徴は、複数の酵素に存在する一方で、ＣＡＤ基質は独特であるためである。したがって、両方の結合部位に結合する阻害剤は、２ＯＧ結合部位のみに結合するものを上回る改善された選択性を示しうる。構造分析により、このような二基質阻害剤を同定することができる。２ＯＧ及びＣＡＤ結合部位は、２ＯＧ（又はＮＯＧ）の２−オキソ基からＦＩＨ．Ｆｅ．２ＯＧ／ＮＯＧ．ＨＩＦ（ＣＡＤ）複合体中のβ−炭素Ａｓｎ−８０３へと延びる「チャネル」を介して相互に結合する。この構造では、この「チャネル」は、空のようだが、水分子によって占められていてもよい。２ＯＧの２−オキソ基のＣからＡｓｎ−８０３のβ−Ｃへの距離は、約６Åである。２ＯＧの３−ＣからＡｓｎ−８０３のβ−Ｃまでの距離は、約６．６Åである。構造分析からの情報により、次のものを含む二基質阻害剤を同定することができる：
これらは、前記式（ＩＩ）〜（ＩＶ）の化合物であるが、但し、これらは、結晶学情報により定義されるような２ＯＧ結合ポケットにも結合しうるように改変されている。したがって、Ｒ２又はＲ１が、２ＯＧ結合ポケットに結合しうるように改変されている。この改変は、Ｒ１又はＲ２の一般式がＡ−Ｘ（式中、Ｘは、前記と同様に定義され、Ａは、Ｘを（ＩＩ）に結合する）であるような形態である。Ａは、２ＯＧ結合部位を利用する表題の阻害剤下に、Ｘが式Ｉ、前記２ＯＧのカルボキシレートの残基に結合しうるような適切な長さを有する。
【００５８】
より一般的には、ＦＩＨの二基質阻害剤は、式：
Ｘ［Ｂ］−［Ｃ］
を有してよい［式中、Ｘは、前記と同様に定義され、Ｂは、リンカー基であり、Ｃは、ＦＩＨのＣＡＤ結合部位の一部に結合する単位、一般的にＣＯＮＨ２である］。
【００５９】
Ｂは通常、６〜８個の炭素原子を有するポリメチレン基又は炭素原子のうちの１個又は複数がヘテロ原子、特にＯ、Ｓ又はＮにより置換されている同等の基であり、例えば、チオール、アルコール、カルボキシレート、ヒドロキサム酸又はオキサレートで官能化されて、Ｆｅ結合を仲介してもよい。これは好ましくは、６から８個の炭素原子長さ又はそれに同等である。或いは、Ｂは、好ましくはＣが結合する５から７員の環を有する架橋基である。
【００６０】
２ＯＧ結合部位又はその一部並びにペプチド基質に結合する阻害剤
別の群の阻害剤は、酵素−基質複合体、即ちＦＩＨ．Ｆｅ（ＩＩ）．ＨＩＦ（ＣＡＤ）に結合する。構造分析により、このような阻害剤を同定することができる。前記ように、２ＯＧ及びＣＡＤ結合部位は、ＦＩＨ．Ｆｅ．２ＯＧ／ＮＯＧ．ＨＩＦ（ＣＡＤ）複合体中の２ＯＧ（又はＮＯＧ）の２−オキソ基からＡｓｎ−８０３のβ−炭素へと延びる「チャネル」を介して相互に結合する。
【００６１】
このタイプの阻害剤は、Ｘ−［Ｂ］−［Ｅ］と定義することができ、式中、Ｘは、前記と同様に定義され、Ｂは、前記ように定義されるリンカー基であり、Ｅは、ＨＩＦに結合する際にＣＡＤの一部に結合する単位である。Ｅは、ＣＡＤのＡｓｎ−８０３の主鎖カルボニル酸素に、さらにＡｓｎ−８０３の１級アミドのＮＨ２基に結合する。
【００６２】
阻害剤のベースとなっているメカニズム
他の群の阻害剤は、触媒サイクルの一部を受けうるが、中間体段階で停止するか、損傷又は抑制をもたらす異常反応を惹起することができる基質類似体をベースとしている。ＦＩＨは、β位でＡｓｎ−８０３の水酸化を触媒するという観察と、構造分析とにより、このような阻害剤を設計することができる。このような化合物には、Ａｓｎ−８０３がβ−フルオロ−アスパラギン、β−ジ−フルオロアスパラギン、β−メチル−アスパラギン、β−ジメチル−アスパラギン誘導体などの酸化を受けない類似体に置換されている基質の類似体（阻害剤）が含まれる。或いは、酸化を受けて、酸化されてエポキシド又は金属キレート化基などの不活性化基をもたらす薬剤をもたらす誘導体を調製することもできる（このようなメカニズムをベースとする阻害剤は時たま、自殺阻害剤と称される）。ＦＩＨの場合には、これらには、α−β−デヒドロアスパラギン及びβ−メチレンアスパラギンが含まれる。
【００６３】
これらには、式：
【化７】
を有する化合物が含まれる
［式中、Ｘは、バリン残基又はその類似体を表し、Ｙは、アラニン残基又はその類似体を表し、Ｒ１０は、フッ素又はＣ１〜Ｃ３アルキル、特にメチルであり、Ｒ１１は、フッ素、Ｃ１〜Ｃ３アルキル又は水素であり、即ち、前記残基は、β−モノ−若しくはジ−フルオロアスパラギン又はβ−モノ−若しくはジ−メチルアスパラギンである］。
【００６４】
或いは、前記化合物は、脱飽和されていてもよい、即ち、α／βデヒドロアミノ酸であるか（Ｒ１１が存在しない）、又はＲ１０及びＲ１１が、メチレン基で置換されていてもよい、即ち、残基は、α，β−デヒドロ−アスパラギン又はβ−メチレンアスパラギンである。
【００６５】
望ましい場合には、バリン残基は、ペプチドＤＥＳＧＬＰＱＬＴＳＹＤＣＥの１個又は複数の単位に所与の順序で、例えば、グルタミン酸（Ｅ）のみに、又はアスパラギン酸（Ｄ）−システイン（Ｃ）−グルタミン酸（Ｅ）−に、又はＰＱＬＴＳＹＤＣＥ−などのもっと長い鎖に接続している。
【００６６】
本発明の化合物では、適切なアリール環には、さらに官能化されているか、他の環系に縮合していてもよいフェニル及びナフタレニルが含まれる。適切な複素環には、官能化されているか、他の環系に縮合していてもよいチオフェン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、ピリミジン、ピラジン、ピロン、クロモン、クマリン、インドール、イソインドール、インドリジン、ベンゾフラン、ピリダジン、プリン、オキサゾール、ピラゾール、イソチアゾール、ピロリジン、ピペリジン、インドリン、ベンゾチアフェン、モルホリン、ベンズイミダゾール、アゼピン、アザシン（ａｚａｃｉｎｅ）、アゾイン（ａｚｏｉｎｅ）、オキセピン、オキソシン、オキソイン、ピペラジン、オキサジン、チアジン、チエピン、チオシン、チオイン、フラン、イミダゾール、アゾール、ジアゾール、トリアゾール及びテトラゾール環系が含まれる。
【００６７】
前記アルキル及びアリール基及び鎖は通常、アルコール、フッ素、チオール、カルボン酸、ホスホン酸若しくはホスフィン酸、スルホン酸又は他のキレート基により、鎖の場合には通常アルキル基を介して官能化されている。本願明細書に記載の式中では、分枝鎖又は直鎖Ｃ１からＣ６アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｔ−ペンチル又は１級、２級若しくは３級ヘキシル基であってよい。好ましくは、アルキル基は、メチルであり、好ましい複素環は、ピロリジン及びテトラヒドロピランであり、好ましい芳香環は、ベンゼン、ナフタレン及びピリジンである。
【００６８】
酸である化合物は、ナトリウム塩などの塩の形態で存在してもよい。
【００６９】
ＦＩＨの結晶構造により、ＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性に関与するそれらの残基を同定することができる。したがって結晶構造を使用して、例えば活性部位内の重要な残基を変異させることにより、例えばアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性が減っているか、活性のない改変ＦＩＨを設計することができる。或いは、基質結合に関与する残基を同定及び改変して、例えば、アスパラギニルヒドロキシラーゼがＨＩＦ以外の基質を許容できるようにすることができる。例えば、アスパラギン結合ポケットを広げるか、狭めることによって。標準的な技術を使用して、このように改変されたアスパラギニルヒドロキシラーゼを生じさせることができる。次いで、下記で詳述するように、予測された活性をアッセイして、例えば、ＨＩＦに対するヒドロキシラーゼ活性が、減ったか、除かれたかどうかを同定するか、或いは、他の基質に対するアスパラギニル活性又は結合を評価する。
【００７０】
本発明により同定された化合物をさらにアッセイで分析して、アスパラギンヒドロキシラーゼ酵素の活性を直接に監視することができる。ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を阻害又は低減する薬剤は、ＨＩＦ−αの水酸化を低減し、Ｐ３００、具体的に言うとＣＨ１領域との相互作用の増大を、したがって、転写活性をもたらす。次いでこのことは、血管形成、赤血球精製、エネルギー代謝、炎症、血管運動機能の促進を含みうる低酸素又は虚血に対する全身的な局所防衛の活性化をもたらし、アポトーシス／増殖応答に影響を及ぼす。
【００７１】
我々は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性又は本発明により同定されたＦＩＨ、具体的にはアスパラギンヒドロキシラーゼ活性の修飾物質、或いは細胞中でのｐ３００とのＨＩＦ−α相互作用の調節に影響を及ぼし、したがってＨＩＦ仲介活性に影響を及ぼす修飾物質の活性をアッセイするために実施することができる幾つかの異なるアッセイをさらに詳細に以下に記載する。これらのアッセイのうちの幾つかは、ＨＩＦポリペプチド及びＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼを利用する。通常、アッセイは、ＦＩＨなどのヒトＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ又はヒトＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの断片若しくは変異体を利用することができる。これらの成分は、以下に詳述する。必要な場合には、これらの各成分を精製又は未精製の形態で、例えば、細胞抽出物として、又はこのような抽出物からの関連成分の精製により用意することができる。或いは、組換え発現技術を使用して、該当成分を発現させ、アッセイで使用するために精製することができる。或いは、細胞ベースのアッセイで使用するための細胞での組換えにより、成分を発現させることができる。
【００７２】
通常、該当成分をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクター内に用意する。このような発現ベクターは普通に、当技術分野で構成され、例えば、プラスミドＤＮＡ並びに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び必要となることがあり、十分なタンパク質発現を可能にする正確な配置で位置するポリアデニル化シグナルなどの他の要素の使用を必要としうる。ＨＩＦヒドロキシラーゼを参考に本願明細書に詳細に記載されているものなどの適切なベクターは、当技術分野の専門家にはかなり簡単に分かるであろう。プロモーター配列は、選択されたアッセイフォーマットに応じて、誘導性又は構成性プロモーターであってよい。プロモーターは、組織特異性であってよい。発現ベクターで使用するためのプロモーター及び他のフランキング配列の例は、本発明のＨＩＦヒドロキシラーゼ及び特にヒトＨＩＦヒドロキシラーゼを参照してさらに詳細に記載する。
【００７３】
ＨＩＦポリペプチド及びペプチド類似体
本発明のアッセイは、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの基質、特に酵素のアスパラギン含有基質を使用することができる。特に、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ活性の修飾物質の活性を監視するためのアッセイで、このような基質を使用することができる。基質は、ＨＩＦポリペプチド又はそのペプチド類似体であってよい。通常は、ＨＩＦポリペプチドが基質として使用される。
【００７４】
アスパラギン残基がＦＩＨにより水酸化されている任意の適切な基質を使用することもできる。本発明の好ましい実施形態では、このような基質は、ＨＩＦ−１α若しくはＨＩＦ−２αサブユニットタンパク質などのＨＩＦポリペプチド、又はいずれかの断片、或いは該サブユニット又は断片のペプチド類似体である。好ましくは、ＨＩＦ−αペプチドは、酸素調節応答をもたらす。好ましくは、ＨＩＦ−αペプチドは、ＣＡＤ領域を有し、ｐ３００との酸素調節相互作用及びダウンストリーム転写活性が可能である。好ましくは、このようなＨＩＦ−αペプチドは、ｐ３００ＣＨ１領域と相互作用しうる。好ましくは、このようなＨＩＦポリペプチド、断片又はペプチド類似体は、ＨＩＦ−１αを参照して定義されたＡｓｎ８０３と同等のアスパラギン残基を包含する。ＨＩＦ変異体、断片又は類似体をＨＩＦ−１αの配列に並べて、最良の配列アラインメントを得、それにより、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３と同等のアスパラギンを同定することにより、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３と同等のアスパラギンを決定することができる。
【００７５】
ＨＩＦポリペプチドは、真核由来、特に、ヒト又は他の哺乳動物、ＨＩＦ−αサブユニットタンパク質若しくはその断片に由来してよい。或いは、ポリペプチドは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）由来であってよい。ｐ３００とのその相互作用を通してＨＩＦ−αの水酸化を監視するアッセイでは、ＨＩＦポリペプチドは、野生種全長ｐ３００タンパク質又はＣＨ１領域を含有するその断片に結合しうる。好ましくは、低酸素細胞環境では、このような結合は転写を活性化しうる。
【００７６】
幾つかのＨＩＦαサブユニットタンパク質がクローニングされている。これらには、その配列がＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ２２４３１として入手可能なＨＩＦ−１α、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ８１９８４として入手可能なＨＩＦ−２α、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＣ００７１９３及びＡＣ０７９１５４として入手可能なＨＩＦ−３αが含まれる。これらは全て、ヒトＨＩＦαサブユニットタンパク質であり、全て、本発明で使用することができる。ネズミＨＩＦ−１α（受入番号ＡＦ００３６９５、Ｕ５９４９６及びＸ９５５８０）、ラットＨＩＦ−１α（受入番号Ｙ０９５０７）、ネズミＨＩＦ−２α（受入番号Ｕ８１９８３及びＤ８９７８７）及びネズミＨＩＦ−３α（受入番号ＡＦ０６０１９４）を含む他の種からのＨＩＦ−αサブユニットタンパク質を、本発明で使用することもできる。
【００７７】
特に該当するＨＩＦ−αタンパク質の１種は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＨＩＦ−αサブユニットタンパク質である。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ系を本発明のアッセイでは使用することができる。
【００７８】
今日までに同定されている２種のＨＩＦ−αサブユニットタンパク質には、幾つかの共通する構造形態が存在することが判明している。これらの形態のうちの幾つかは、Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅら（１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４；２０６０−２０７１）に同定されており、ＨＩＦ−αサブユニットタンパク質のトランス活性化機能に関与しうる。これらの共通する構造形態のうちの１つ又は複数が、ＨＩＦ−ポリペプチドの好ましい形態である。
【００７９】
天然に生じるＨＩＦ−αサブユニット（特に例えば、ＨＩＦ−１αなどのヒトＨＩＦ−αサブユニット）に対して少なくとも４５％のアミノ酸同一率、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一率を有する合成変異体などの前記ＨＩＦ−αサブユニットの変異体を使用することができる。このような変異体は、ＨＩＦヒドロキシラーゼに関して、前記ような置換又は改変を含む。アミノ酸活性を、ＨＩＦヒドロキシラーゼに関して前記ように算出することもできる。
【００８０】
ＨＩＦ断片は、非ペプチジル官能基を含んでもよく、同一率のレベルが下がるようにアッセイのために最適化してもよい。このような官能基は、糖などのように共有結合しているか、金属イオンなどのように非共有結合していてもよい。
【００８１】
本願明細書に記載のＨＩＦαポリペプチドは、ＨＩＦ−αサブユニットタンパク質又はその変異体の断片であってもよいが、但し、前記断片は、野生種ｐ３００ＣＨ１領域と相互作用する能力を維持する。タンパク質アミノ酸残基を使用する場合には、これらの断片は望ましくは、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも４０個、５０個、７５個、１００個、２００個、２５０個又は４００個のアミノ酸サイズである。望ましくは、このような断片は、アスパラギン８０３を含有する。
【００８２】
本発明の細胞ベースのアッセイは、内生ＨＩＦ−αのアップレギュレーション又は組換え技術によるＨＩＦ−α、具体的にはＨＩＦ−１αの発現を必要とし得る。
【００８３】
アッセイ方法
本発明は、低酸素誘導因子のアスパラギン水酸化の修飾物質として同定される薬剤に関するアッセイ方法を提供する。この方法は、試験基質の不在下にアスパラギン水酸化が生じる条件下に、ヒドロキシラーゼの基質の存在下に、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼと試験物質とを接触させ、基質のアスパラギン水酸化を定量することを含む。別のアッセイでは、試験基質の不在下では水酸化が生じない条件下に、ヒドロキシラーゼの基質の存在下に、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼと試験物質とを接触させる。アスパラギン水酸化の定量を監視して、その薬剤がアスパラギンヒドロキシラーゼのプロモーターとして活性に作用するかどうかを同定する。
【００８４】
ＦＩＨは、ＣＡＤ領域内のアスパラギン残基の所でＨＩＦ−αを水酸化することが判明した。この水酸化がｐ３００結合を仲介し、特に、ｐ３００結合を減らす。このような結合により、転写の活性化がもたらされる。この相互作用及び活性化も、本発明のアッセイのためのベースとして使用することができる。
【００８５】
本発明のこのようなアッセイを使用して、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ活性の阻害剤の活性をアッセイすることができ、これを好ましくは、試験物質の不在下にアスパラギン水酸化が生じるであろう条件下に実施する。本発明のアッセイを使用して、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼに特異的で、他のヒドロキシラーゼ、例えば、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ又は他のアスパラギン／アスパルテーム酸ヒドロキシラーゼなどでは活性がないか、活性が低い阻害剤の活性をアッセイすることもできる。本発明のアッセイを使用して、構造モデリング研究ではＦＩＨに対して活性を有するとは予測されていないＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤などのヒドロキシラーゼ修飾物質の活性をアッセイするために使用することもでき、したがって、プロリルヒドロキシラーゼに対して特異的な阻害剤を同定するために使用することもできる。
【００８６】
改変を監視する方法
本発明のスクリーニング又はアッセイ法の正確なフォーマットは、当技術分野の専門家であれば、通常の技術及び知識を使用して変更することができる。専門家であれば、適切な制御実験を付加的に使用する必要性がよく分かるであろう。本発明のアッセイは、適切な基質のアスパラギン水酸化を監視すること、基質及び補基質の利用を監視すること、酵素とその基質との間で予測された生成物の産生を監視することを必要とし得る。本発明のアッセイ方法は、系の成分間の直接的な相互作用をスクリーニングすることを必要とすることもある。或いは、適切なリポーター構成を使用して、又はＨＩＦにより直接若しくは間接に調節されることが知られている遺伝子のアップレギュレーション又は遺伝子の発現パターンの変化を監視することにより、ｐ３００によるＨＩＦの結合などのダウンストリーム効果及びＨＩＦ仲介転写などのＨＩＦにより仲介されるダウンストリーム効果を監視するアッセイを実施することもできる。
【００８７】
水酸化を定量するための様々な方法が当技術分野では知られており、これらを、本願明細書に記載及び例示する。適切な方法を使用して、基質若しくは補基質の使用、ペプチド水酸化などの生成物の発生若しくは水酸化又は非水酸化生成物により仲介されるダウンストリーム効果などにより、ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性を定量することもできる。
【００８８】
アッセイを実施して、該当アスパラギン残基又は他の部分の水酸化を直接に監視することもできる。或いは、アッセイを実施して、補因子又は補基質の欠失を監視することもできる。或いは、このようなアッセイは、例えば、ＨＩＦとｐ３００との相互作用又はＨＩＦ仲介転写を監視することにより、ＨＩＦの水酸化のダウンストリーム効果又は実際に、ＨＩＦの水酸化の阻害を監視することもできる。或いは、ＨＩＦ調節プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子構成物を使用することもできる。ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの活性のエンハンサーを同定するためのアッセイも提供する。このようなエンハンサーを使用して、ＨＩＦα活性を減らすこともできる。
【００８９】
一実施形態では、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの適切な基質を提供する。これは、ＨＩＦ−α又は、ＣＡＤ領域を含有するか、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３に相当する残基を含むその断片であってもよい。基質は、Ａｓｎ８０３位で当初は水酸化されていなくてもよい。合成ポリペプチド基質を用意するか、或いは細菌細胞、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系でＨＩＦ−αポリペプチドを製造することにより、これは達成することができる。或いは、アッセイが経過する間に、当初は非水酸化形態で基質が生じるように選択された時間経過にわたって、アッセイを実施することもできる。
【００９０】
基質、酵素及び可能性のある阻害剤化合物を、阻害剤の不在下にＡｓｎ８０３の水酸化をもたらす条件下にインキュベーションして、基質の水酸化を定量することにより、阻害剤の効果を定量することができる。適切な手段により、これを達成することができる。少量のポリペプチド基質を回収して、質量分析又はクロマトグラフィーなどの物理的分析か、或いはｐ３００に結合しうる（又はｐ３００からのリポーター分子を置換する）可能性などの機能的分析に掛けることができる。当技術分野などで、このような方法は知られており、通常の技術及び知識を使用して実施することができる。定量は、量的でも、質的でもよい。いずれの場合にも、但し、特に後者では、適切な対照、例えば、可能性のある阻害剤なしにインキュベーションした基質と比較して、質的定量を実施することができる。
【００９１】
この方法で同定された阻害剤化合物を回収して、薬剤組成物として処方することができる。
【００９２】
本発明によるアッセイは、ｐ３００とＨＩＦとの相互作用に関して監視することを伴ってもよい。ＨＩＦとｐ３００との相互作用は、ＨＩＦの水酸化により仲介される。ＨＩＦの存在によりアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされることが知られている遺伝子の転写及び発現を監視することができるであろう。特に、ＨＩＦ調節遺伝子のアップレギュレーションにより、アスパラギン水酸化の阻害が証明される一方で、ダウンレギュレーションは、アスパラギン水酸化の増大又は促進を示唆している。
【００９３】
別の実施形態では、リポーター構成物を提供することができ、その際、ＨＩＦにより仲介されるプロモーターが、リポーター遺伝子に操作可能に結合されて提供される。例えば、酵素などの適切なリポーター遺伝子を使用することができ、次いでこれを、比色、蛍光、蛍光共鳴又は分光アッセイで使用することができる。
【００９４】
ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼは、２ＯＧ依存性オキシゲナーゼである。本願明細書に記載のアッセイ方法では通常、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ及びヒドロキシラーゼの基質を、２−オキソグルタレート（２ＯＧ）などの補基質の存在下に接触させる。ＨＩＦヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性は、補基質の代謝回転を定量することにより定量することができる。水酸化基質又はコハク酸などの反応生成物の存在及び／又は量を定量することにより、これを達成することができる。生成物の量を、基質の量に相対させて定量することができる。通常、このような実施形態では、基質は、ＨＩＦ−αポリペプチドであってよいか、例えば、測定される生成物は、水酸化ＨＩＦ−αポリペプチドであってよい。
【００９５】
或いは、終点定量は、ＨＩＦα又はＨＩＦαに由来するペプチド断片（合成及び組換えペプチドを含む）の検出可能な生成物への変換をベースとしてよい。ペプチドを、アッセイが簡略化されるように改変して、アッセイを、迅速に実施し、高処理量スクリーニングに適しているようにすることができる。
【００９６】
例えば、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８オクタデシルシランカラム）を使用して、ＨＩＦヒドロキシラーゼのための出発合成ペプチド基質とアスパラギン水酸化生成物とに分けることができる。それというのも、後者は、カラム中で比較的短い保持時間を有するためである。ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性に関するこのアッセイ又は別のアッセイの改変は、例えば、当技術分野でよく知られている質量分析技術、分光技術及び／又は蛍光技術を使用することができる（Ｍａｓｉｍｉｒｅｍｂｗａ Ｃ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（２００１年）４（３）２４５−２６３、Ｏｗｉｃｋｉ Ｊ．（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５（５）２９７−３０５、Ｇｅｒｓｈｋｏｖｉｃｈ Ａら（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｓ．３３（３）１３５−１６２、Ｋｒａａｆｔ Ｇ．ら（１９９４年）Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４１ ７０−８６）。蛍光技術では、分光又は蛍光アッセイを実施又は最適化するように改変された基質バージョンを使用することもできる。
【００９７】
例えば、ＨＩＦαポリペプチドを、例えばビーズ又はプレート上に固定化し、アスパラギン８０３が水酸化される場合と、残基が水酸化されない場合とで異なる親和性を有するＨＩＦαのＣＡＤ結合領域と結合する抗体又は他の結合分子を使用して、適切な残基の水酸化を検出することができる。当技術分野でよく知られている標準的な技術により、例えば、水酸化ＨＩＦαペプチドを使用して、このような抗体を得ることができる。
【００９８】
適切な標識の存在を定量することを含んでもよい当技術分野の専門家が利用可能な技術を使用して、ＨＩＦαポリペプチドの水酸化形態と非水酸化形態とを識別する分子の結合を評価することができる。
【００９９】
本発明のアッセイ方法は、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイの形態をとってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、該当するポリペプチド又はペプチドが細胞中に導入された１個又は複数のベクターから発現される酵母株などの細胞系で行うこともできる。
【０１００】
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
ｉｎ ｖｉｖｏで行われる細胞ベース、臓器ベース又は全動物アッセイを使用して、アッセイを実施することもできる。このようなアッセイは、ＨＩＦヒドロキシラーゼヌクレオチド及び／又はポリペプチドの内生発現を利用することができる。本発明の他の形態では、特異的な内生ＨＩＦヒドロキシラーゼのアップレギュレーションを、その発現の刺激物質により達成することができる。このような刺激物質は、特異的なＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼをアップレギュレーションする成長因子又は化学物質であってよい。アッセイの他の形態では、ヌクレオチド構成物を細胞又はトランスジェニック動物に導入して、１種又は複数の特異的ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの産生を増大させることができる。
【０１０１】
ｐ３００と複合化したＨＩＦは、前記ＨＩＦ複合体により調節される内生遺伝子のプロモーター及び／又はエンハンサーに存在する低酸素応答要素を活性化させる。このような低酸素応答要素を単離して、処理によってリポーター遺伝子に結合させて、リポーター遺伝子又はその生成物の検出及び／又は定量を介してＨＩＦ複合体の活性をアッセイすることができる。したがって、本発明の別の形態では、ＨＩＦ結合低酸素応答要素に機能的に結合している内生遺伝子又はリポーター遺伝子の発現に対するＨＩＦ複合体の効果を測定することにより、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼにより調節されるＨＩＦ−αポリペプチドの活性をアッセイする。こうして調節される内生遺伝子の例は、遺伝子発現の低酸素誘導でのアリール炭化水素核トランスロケーター（ＡＲＮＴ）の役割に見られるはずである。例えば、「ＡＲＮＴ欠失細胞の研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ＡＲＮＴ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）」、Ｓ．Ｍ．Ｗｏｏｄ，Ｊ．ｍ．Ｇｌｅａｄｌｅ，Ｃ．Ｗ．Ｐｕｇｈ、Ｏ．Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１（１９９６年）１５１１７〜１５１２３及び「腫瘍随伴炭酸脱水酵素の低酸素誘導発現（Ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｙｈｙｄｒａｓｅｓ）」，Ｃ．Ｃ．Ｗｙｋｏｆｆ，Ｎ．Ｊ．Ｐ．Ｂｅａｓｌｅｙ，Ｋ．Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｊ．Ｐａｓｔｏｒｅｋ，Ａ．Ｓｉｂｔａｉｎ，Ｇ．Ｄ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈ．Ｔｕｒｌｅｙ，Ｋ．Ｔａｌｋｓ，Ｐ．Ｈ．Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｃ．Ｗ．Ｐｕｇｈ，Ｐ．Ｊ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ，Ａ．Ｌ．Ｈａｒｒｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０（２０００）７０７５−７０８３参照。例には、これらに限られないが、グルコーストランスポーターアイソホーム１、ホスホグリセレートキナーゼ１、炭素アンヒドラーゼアイソホーム９、血管内皮成長因子が含まれる。前記各遺伝子は、１つ又は複数の低酸素応答要素を含有し、これは、単離して、１回又は複数回のコピーとして、ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性に従い変化するＨＩＦ−αポリペプチドの活性を測定するためのリポーター遺伝子に処理により結合することができる。
【０１０２】
ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性に従いＨＩＦ−αポリペプチドにより調節される遺伝子又は遺伝子産物の活性は、細胞、臓器及び動物生理に影響を及ぼす。ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性によるＨＩＦ−αポリペプチドの活性に従い調節される特異的機能応答を利用するアッセイを使用することもできる。このような応答には、代謝されないグルコース又はグルコース類似体の摂取率、血管形成による血管の成長、炭酸脱水酵素の活性が含まれる。細胞又は全身レベルで作用する多くの他の応答が、ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性によるＨＩＦ−αポリペプチドの活性により制御され、本発明の更なる態様での前記ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性のアッセイとして利用することもできることが理解される。
【０１０３】
ＨＩＦヒドロキシラーゼのための基質であるＨＩＦ−αポリペプチドは、他のポリペプチドに縮合して、縮合ペプチドの活性を調節する前記ＨＩＦヒドロキシラーゼの活性をもたらしてもよい。したがって、本発明の他の形態では、縮合ポリペプチドの活性のアッセイを提供する。好ましい形態では、このような縮合ポリペプチドは、具体的にはＡｓｎ８０３又はＣＡＤ領域を含むＨＩＦ−αポリペプチドの全体又は一部を含有してもよい。アミノ酸１〜１４３と共にＧａｌ結合アップストリーム活性化配列（ＵＡＳ）を含有するＧａｌ４ＤＮＡ結合領域は、このような転写因子及び同源のＤＮＡ応答要素の例であり、その作用は、当技術分野の専門家であれば、アッセイすることができる。
【０１０４】
選択性
単一のターゲットとして、又は選択されたヒドロキシラーゼ群で、さらにはファミリー全体で、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシナーゼの選択性を調節することも有利である。したがって、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を調節する薬剤は好ましくは、特異的である。即ち、これらは、他の２ＯＧ依存性オキシゲナーゼに対してよりも、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼに対して高いか強い作用を有する。
【０１０５】
したがって本願明細書に記載のアッセイ方法は、試験化合物と１種又は複数の２ＯＧ依存性オキシゲナーゼとを、前記２ＯＧ依存性オキシゲナーゼが正常に活性である条件下に接触させ、前記オキシゲナーゼの活性を定量することをさらに含んでもよい。試験化合物が存在する場合と不在な場合とでの活性の差異は、その試験化合物が、１種又は複数の２ＯＧ依存性オキシゲナーゼの活性を調節することを示している。
【０１０６】
１種又は複数の２ＯＧ依存性オキシゲナーゼに対して、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの高いか強い調節をもたらす試験化合物は、ＨＩＦヒドロキシゲラーゼに対する選択性又は特異性を示す。
【０１０７】
２ＯＧ依存性オキシゲナーゼには例えば、クラバミンテ（ｃｌａｖａｍｉｎｔｅ）合成酵素、Ａｌｋ ＢデアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素、コラーゲン−プロリル−４−ヒドロキシラーゼ、コラーゲンプロリル−３−ヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、アスパルチルヒドロキシラーゼ、フィタノイルコエンザイムＡヒドロキシラーゼ又はガンマ−ブチロベタインヒドロキシラーゼが含まれうる。２ＯＧ依存性オキシゲナーゼは、哺乳動物、好ましくはヒトポリペプチドであってよい。
【０１０８】
本発明は、低いＨＩＦ活性を伴う状態を治療するための薬剤を製造する際にこのようなＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼの選択的阻害剤を使用することを提供する。
【０１０９】
治療用途
ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性に影響を及ぼしうることが判明している化合物、物質又は薬剤、或いはＦＩＨ阻害剤と本願明細書で称されている化合物は、多くの状況で治療的及びその他の可能性を有する。治療処置では、このような化合物を、他の活性な物質と組み合わせて、例えば、抗腫瘍治療では他の抗腫瘍化合物若しくは放射線療法又は化学療法などの治療と組み合わせて使用することができる。
【０１１０】
１種又は複数の一次スクリーニングを使用して（例えば、無細胞系）、ＨＩＦヒドロキシラーゼのＨＩＦαアスパラギン水酸化活性を調節しうると同定された薬剤を、１種又は複数の二次スクリーニングを使用してさらに評価することができる。二次スクリーニングは、例えば、薬剤が不在の場合に対して薬剤が存在する場合に細胞に存在するＨＩＦターゲット遺伝子又はプロセスのレベルにより明らかなＨＩＦ−α又はＨＩＦ活性の量の増減を試験することを含む。
【０１１１】
抗体などの他の活性薬剤と組み合わせた場合を含む、全長ポリペプチド又はその断片或いは改変されたポリペプチド（例えば、安定性を高めるためか、ターゲッティングを保証するための）での処置を含む治療で、ＨＩＦヒドロキシラーゼ又はＨＩＦポリペプチドを使用することができる。例えば、Ａｓｎ８０３を別のアミノ酸残基に代えるためのＨＩＦ−１αの変異により、水酸化を防いで、ＨＩＦ−αとｐ３００との相互作用を促進し、転写活性を刺激する。
【０１１２】
通常、本発明による修飾物質である薬剤、化合物又は物質は、単離及び／又は精製された形態、即ち実質的に純粋な形態で提供される。これは、活性成分少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、さらに好ましくは少なくとも約９８％である組成物であることを含む。しかしながらこのような組成物は、活性薬剤の正確な輸送、放出及び／又は安定化のために必要なものなどの不活性な担体材料又は他の薬学的若しくは生理学的に許容できる賦形剤を含んでもよい。通常、このような組成物中での濃度は、組成物の重量に対して０．１から５０重量％、通常は０．５〜２０重量％、特に１から１０重量％である。前記ように、本発明による組成物は、開示されている修飾物質化合物に加えて、抗腫瘍薬剤などの治療用途の１種又は複数の他の分子を含有してもよい。
【０１１３】
本発明のアッセイにより得られた生成物
本発明はさらに、本発明の方法により得られたか、同定された化合物及び、この化合物が薬学的に許容できる担体又は希釈剤と混合されている薬剤組成物などの前記化合物を含有する組成物を提供する。担体は、液体、例えば、生理食塩水、エタノール、グリセリン及びこれらの混合物又は固体、例えば、錠剤の形態で、又はデポー処方物として処方されたゲルなどの半固体形態で、又は経皮パッチなどの経皮投与可能なビヒクルであってよい。
【０１１４】
本発明はさらに、ＨＩＦヒドロキシラーゼによるＨＩＦαポリペプチドのアスパラギンターゲット残基の水酸化を妨害する薬剤を患者に投与することを含む治療法を提供する。このような薬剤は、アスパラギンヒドロキシラーゼ活性の阻害剤を含んでもよい。さらに本発明は、前記で定義された化合物を患者に投与することを含む治療法を提供する。
【０１１５】
治療／予防目的は低いか、最適以下か、高いＨＩＦレベル又は活性を伴う状態或いはＨＩＦレベルは正常だが、ＨＩＦ活性を増大又は低減するなどのＨＩＦ活性の調節が望ましい状態を治療することに関連してよい；例えば：
（ｉ） 虚血状態、例えば、冠状、脳血管及び末梢血管不全を含む臓器虚血。治療を２つの方法で適用することができる；明らかな組織損傷、例えば、心筋梗塞の後に（組織損傷を限るために）、又は虚血を予防するために、例えば、アンギナを治療する際に冠状側枝を促進するために予防的に。
（ｉｉ） 創傷治癒及び臓器再生。
（ｉｉｉ） 自己−、同種及び異種移植。
（ｉｖ） 全身血圧。
（ｖ） 癌；ＨＩＦαは普通、腫瘍細胞ではアップレギュレーションされ、腫瘍成長及び血管形成に主な作用を有する。
（ｖｉ） 炎症性疾患。
（ｖｉｉ） 肺動脈圧、神経変性疾患。
【０１１６】
ヒト、臓器及び細胞群でのＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性の調節は、治療効果を得るための様々な方法で活用することができる：
（ａ） 非細胞自律：細胞は、他の細胞にシグナルを送る物質の産生に影響を及ぼすためにＨＩＦ系を使用する。これらのシグナルは、（ｉ）遠隔部位で（例えば、エリスロポイエチンは骨髄に作用する）又は（ｉｉ）局所で（血管由来成長因子は、血管の局所形成を増大する）作用を有しうる。したがって、ヒドロキシラーゼ活性を調節することを介しての非細胞自律行動の操作は、貧血並びに例えば眼、脳、心臓及び肢での局所虚血の治療で役立つ。生理的安定性の態様に関与する多くの他のシグナルは、ＨＩＦ活性化により調節されうるか、調節されることが知られている。したがって、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性の調節を使用して、治療効果に対して有用な応答を強化又は開始するか、有害な応答を予防又は緩和することができる。例えば、この手法を使用して、食欲或いは全身又は肺床での血圧を変更することができる。
【０１１７】
（ｂ） 細胞自律：細胞代謝、分化に関する決定、増殖及びアポトーシスを調節するためにも、細胞は、ＨＩＦ系を使用する。したがって、ＨＩＦ系の操作を使用して、細胞の生存及び行動を変更することができる。例えば、虚血組織で、ＨＩＦ活性を増大させることにより、細胞生存を増大させることができる。この手法を使用して、糖尿病が改善されるように膵臓β細胞生存を改善する際に、又はパーキンソン病、運動ニューロン疾患若しくは痴呆の形態でのニューロン群又は複数の群の生存又は機能を改善する際に使用することができる。別の手法では、ＨＩＦシグナルを操作して、細胞群の増殖を予防するか、その死又は分化を促進することができる。例えば、悪性腫瘍でのＨＩＦ系の一時的な活性化を使用して、腫瘍細胞のかなりの数の死を惹起することができる。
【０１１８】
薬剤組成物
様々な他の態様では、本発明は、ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ阻害剤を含む１種又は複数の前記薬剤、化合物又は物質或いは１種又は複数の式（Ａ）から（Ｆ）の化合物又はその誘導体を含有する本明細書に記載の、このような目的のための薬剤組成物、薬剤、薬物又は他の組成物、医学的治療法でのこのような組成物の使用、例えば、前記ような医学的状態を治療（予防的治療も含んでよい）するためにこのような組成物を患者に投与することを含む方法、このような目的で、例えば、前記ような状態を治療するために投与するための組成物、薬剤又は薬物を製造する際のこのような薬剤化合物又は物質の使用、並びにこのような薬剤、化合物又は物質と薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクル又は担体及び場合によって他の成分とを混合することを含む薬剤組成物を製造する方法を提供する。
【０１１９】
一実施形態では、薬剤組成物を供給する方法は通常：
（ａ） 本発明に従い薬剤を同定すること；及び
（ｂ） こうして同定された薬剤を薬学的に許容できる賦形剤と処方すること
を含む。
【０１２０】
薬剤は、単独の活性薬剤としても、又は１種の他の若しくはいずれかの他の活性物質、例えば、抗腫瘍治療では他の抗腫瘍化合物或いは放射線療法又は化学療法などの治療と組み合わせて使用することもできる。
【０１２１】
本発明の医学的治療の方法で使用される薬剤であれば、投与は好ましくは、個人に利益を示すに十分な「予防有効量」又は「治療有効量」（場合によっては、予防も、治療と考えられうる）である。投与される実際量及び速度及び投与時間経過は、治療される対象の性質及び重度に左右される。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般的な開業医及びその他の医師の責任の範囲内である。
【０１２２】
薬剤又は組成物は、単独で又は他の治療と組み合わせて、例えば、前記ような治療される状態に応じて同時に又は連続して投与することができる。
【０１２３】
本発明による薬剤組成物及び本発明に従って使用するための薬剤組成物は、活性成分の他に、当技術分野の専門家によく知られている薬学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は他の材料を含有してもよい。特にこれらは、薬学的に許容できる賦形剤を含有してもよい。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害すべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、経口によるか、皮膚、皮下又は静脈内注射によってよい投与経路に左右される。組成物は通常、無菌である。
【０１２４】
経口投与のための薬剤組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形態であってよい。錠剤は、ゼラチン又は助剤などの固体担体を含有してもよい。液体薬剤組成物は通常、水、石油、動物油、植物油、鉱油又は合成油などの液体担体を含有する。生理学的食塩水、デキストロース又は他の糖類溶液若しくはエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれていてもよい。
【０１２５】
静脈内、皮膚又は皮下注射又は病気の部位での注射では、活性成分は、発熱物質不含であり、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する薬学的に許容できる水溶液の形態である。当技術分野の該当する専門家であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、乳酸加リンガー液などの等張性ビヒクルを使用して適切な溶液を調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤が必要に応じて含まれていてもよい。
【０１２６】
リポソーム、特に、カチオン性リポソームをキャリヤ処方物中で使用することができる。前記技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０年に見ることができる。
【０１２７】
物質又は組成物は、局所的に特定の部位に投与することもできるし、特定の細胞又は組織をターゲットとする方法で、例えば、動脈内ステントベース輸送を使用して輸送することもできる。
【０１２８】
ターゲッティング治療を使用して、抗体又は細胞特異的リガンドなどのターゲッティング系を使用することにより、活性物質をより特異的に、一定のタイプの細胞に輸送することができる。様々な理由で、例えば、薬剤が許容できない毒性を有する場合、又はそうしなければ、必要な投与量が多すぎる場合、又はそうしなければターゲット細胞に侵入することができない場合に、ターゲッティングが望ましくなりうる。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本発明は、高いか低いＨＩＦレベル又は活性を伴う状態を治療するための薬剤を製造する際に本発明の薬剤の使用を提供する。状態は例えば、虚血、創傷治癒、自己、同種及び異種移植、全身性高血圧、癌及び炎症性疾患からなる群から選択することができる。
【実施例１】
【０１３０】
水酸化されるヒトＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３での位置を、次に記載するように同定した。ＦＩＨ−１をコードするｃＤＮＡ配列を、ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎから）内でクローニングして、精製を容易にするためのＮ−末端Ｈｉｓ６タグを有するＦＩＨ−１タンパク質を得た。ニッケル親和性クロマトグラフィーによる粗製材料の精製、それに続くＨｉｓ６タグのトロンビン分離及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳｕｐｅｒｄｅｘＳ７５）により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると＞９５％純粋なタンパク質が得られた。質量分析により、単離された種の同一性が確認された。アスコルベート、ＤＴＴ、カタラーゼ、２−オキソグルタレート及び鉄（ＩＩ）の存在下に、ＦＩＨ−１ ＦＩＨ（Ｈｅｗｉｔｓｏｎら、Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ ２７７（２９）：２６３５１−２６３５５、２００２年）と共に３７℃で３０分間、好気インキュベーションすることにより、ヒトＨＩＦ−１αのアミノ酸７８８〜８０６を含有する１９残基ペプチドを改変した。４℃に冷却し、等容量のメタノールを加えることにより、反応をクエンチした。遠心分離により沈殿物を除去し、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４カラム（１５ｃｍ×４．６ｍｍ）を使用するＨＰＬＣにより、上澄みを精製した。０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの勾配を使用して、ペプチドを溶離し、アミノ酸及び質量分析のために、ＨＰＬＣ溶剤から凍結乾燥させた。ＮＭＲ分析のための調製の際に、試料をＤ２Ｏから２回凍結乾燥させた。
【０１３１】
ＨＩＦ−１αの残基７８８〜８０６に対応する合成１９残基ペプチドの触媒ＦＩＨ−１仲介水酸化を、ＨＰＬＣ精製された材料の質量分析により確認した：天然ペプチド１９マー［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１０２６．６７Ｄａ、改変ペプチド１９マー［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１０３４．６１Ｄａ、ペプチド中＋１６Ｄａに対応する（酸素）、二重に荷電されたイオンの＋８Ｄａの質量差異。生成物ペプチドのＮ末端エドマン分解により、次の配列が得られた：ＤＥＳＧＬＰＱＬＴＳＹＤＣＥＶｘＡ（式中、ｘは、アスパラギンではない）。エドマン分解のこの（１６）サイクルからのピークは、β−ヒドロキシアスパラギン標準と同じ位置まで達した。改変ペプチドの酸加水分解、それに続くアミノ酸分析により、β−ヒドロキシアスパラギン酸の存在だけが示された。
【０１３２】
１９マーペプチド基質とＨＰＬＣ精製されたインキュベーション生成物との１Ｈ及び１３Ｃ両方の化学シフト変化を、２Ｄ １Ｈ−１３Ｃ ＨＳＱＣ実験により評価した。基質で、４種のβ−ＣＨ２共鳴の組み分けを、１Ｈ及び１３ＣシフトによりＡｓｐ−１、Ｔｙｒ−１１、Ａｓｐ−１２及びＡｓｎ−１６に属するものとして分けた（Ｅｖａｎｓ，Ｊ．Ｎ．Ｓ．（１９９５年）Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）。生成物では、２Ｄ ＨＳＱＣ及び１Ｄプロトンスペクトルから、これら４種の共鳴のうちの３種のみが存在することが明確であった。これら２つのスペクトルの比較により、Ａｓｎ−１６β−炭素に該当するシグナル（基質ではδＨ２．８１３及び２．６９５ｐｐｍ及びδＣ３７．４０ｐｐｍ）は消滅することが判明し、これは、そのβ−炭素の所のアスパラギン残基の水酸化と一致した。２つのアスパラギン酸残基による共鳴は、おそらくプロトン付加状況の変化により若干シフトし、基質ではアスパラギンのβ−プロトンと同じ１Ｈ化学シフトで生じる。２種の試料でのシステインの酸化状態の差異は、システイニルβ−炭素及び水素でほぼ同一の化学シフトによるものではないようである。水酸化された残基のβ−水素での二重の二重項から単一の二重項への変化も可能性を除外され、ＮＭＲスペクトルで観察される変化は、凝集による。生成物スペクトルに２つの新たな共鳴が、δＨ４．９１３ｐｐｍ及びδＣ５６．２６ｐｐｍで、さらにδＨ４．６５４ｐｐｍ及びδＣ７２．２２ｐｐｍで生じた。これらの共鳴は、２Ｄ ＣＯＳＹスペクトルでは相互に関連しており、２．４Ｈｚの１Ｈ−１Ｈ結合定数を共有するので、水酸化アスパラギンのＣＨα−ＣＨβと指定される。これらの共鳴の出現も、基質スペクトルで観察されたδＨ４．７０６ｐｐｍ及びδＣ５１．４３ｐｐｍ共鳴の消失と一致し、したがってこれが、改変前の親アスパラギンのＣＨαとして指定される。水酸化Ａｓｎ−８０３で観察された２．４ＨｚのＣＨα−ＣＨβ結合定数と文献値との比較は、トレオ異性体が生じたことを示していた。
【０１３３】
前記ＮＭＲ実験をまとめると：ＨＳＱＣ実験により、ターゲットアスパラギンのβ−炭素で生じる水酸化の直接的な証拠が得られ、その際、水酸化されたβ−炭素は、著しい脱シールド（ｄｅｓｈｉｅｌｄｅｄ）（７２．２２ｐｐｍで）を示し、隣接するα−炭素は、親アスパラギンに比較してより少ない規模で脱シールドした（５６．２６ｐｐｍで）。１３Ｃ化学シフトでのこれらの規模の変化は、側鎖窒素の水酸化と一致しないが、β−炭素での水酸化と一致する。さらに、遊離ＤＬ−トレオ−β−ヒドロキシアスパラギンの１３Ｃスペクトルは（この研究）、α−及びβ−炭素に対応する５８．６３ｐｐｍ及び７３．８５ｐｐｍで共鳴を有する。生成物指定は、カルシウムが存在しない場合には、それぞれ４．４８ｐｐｍ及び４．３６ｐｐｍである（４．７５ｐｐｍでの水に対して）ＥＧＦ様領域でのβ−ヒドロキシアスパルチル残基でのα−及びβ−水素の１Ｈ−ＮＭＲ化学シフトとも一致する（Ｓｅｌａｎｄｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９、８１１１〜８１１８）。ここで報告されている結合定数の分析は、トレオ−異性体は、ＦＩＨ−１によるＡｓｎ−８０３の水酸化で生じたものであることを示している。
【０１３４】
２つの報告（Ｄａｍｅｓら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５２７１５２７６；Ｆｒｅｅｄｍａｎら（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９、５３６７５３７２）により、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ−８０３のβ−水酸化がどのようにして、ｐ３００との複合体形成にダメージを与えるかを示している。水酸化の位置は、いずれの報告でも同じではないが、いずれも、β−炭素のプロ−Ｓ位での、つまり、トレオ（２Ｓ、３Ｓ）−異性体をもたらす水酸化は、ＨＩＦ−１αの一部がとるα−らせん配座を維持し、ヒドロキシル基のエネルギー的に好ましくない脱溶媒に対する必要性をもたらす水素結合を妨害するであろうことを示している。挿入されたプロ−Ｓヒドロキシル基及びｐ３００のＩｌｅ−３５３（Ｄａｍｅｓら（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，５２７１５２７６からのナンバリング）との間の立体クラッシュは、これら２つのタンパク質の相互作用を中断する。おそらく、同じメカニズムを使用して、ＨＩＦ−２αとｐ３００との相互作用を排除することもできる。Ａｓｎ−８０３のβ位置が改変されるという発見及び随伴するメカニズムの示唆を、ｐ３００に結合して、ＨＩＦ−αに代替する化合物を設計する際に、及びＦＩＨの阻害剤を設計する際に使用することができる（下記参照）；いずれの場合にも、前血管形成薬剤が可能となる。
【実施例２】
【０１３５】
ＣＡＤ又はＦｅ（ＩＩ）を酸化させることなく、Ｘ線分析に適したＦＩＨ：ＣＡＤ複合体を得るために、ＦＩＨ及び７〜５２残基の様々なＣＡＤ断片をＦｅ（ＩＩ）及び２ＯＧと共に嫌気性条件下に同時結晶化させた。Ｆｅ（ＩＩ）及びＮ−オキサロイルグリシン（ＮＯＧ、ＦＩＨ阻害剤）、（嫌気性）及びＺｎ（ＩＩ）及びＮＯＧ（好気性）と複合化したＦＩＨでの構造も得た。セレノメチオニン置換アポ−ＦＩＨでの多重異常分散により得られたモデルを使用して、これらの構造を、分子置換により解明した。ＣＡＤ７８６−８２６、Ｆｅ（ＩＩ）及びＮＯＧ又は２ＯＧ（構造１及び２、表１）、ＣＡＤ７７５−８２６とＺｎ（ＩＩ）及びＮＯＧ（構造３）で、結晶質ＦＩＨ：ＣＡＤ複合体を得た。ＣＡＤ７８７−８０６、ＣＡＤ８５０−８６２（ＨＩＦ−２α、ＨＩＦ−１αＣＡＤ８０２−８１４に等しい）及びＣＡＤ８００−８０６との結晶化の試みは、ＦＩＨ：ＣＡＤ複合体をもたらさなかった；溶解分析により、２０残基よりも短いＣＡＤ断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ基質では有効ではないことが示された。
【０１３６】
【表１】
【０１３７】
構造作業で使用される方法
タンパク質発現、精製及び結晶化
ＦＩＨ、ＣＡＤ７７５−８２６及びＣＡＤ７８６−８２６を記載されているように調製した（Ｈｅｗｉｔｓｏｎら、Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ ２７７（２９）：２６３５１−２６３５５、２００２年）。代謝阻害プロトコル及びＬ−セレノメチオニン５０ｍｇ／ｌを補足されているＬｅＭａｓｔｅｒ培地を使用して、セレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）置換されているＦＩＨを製造した。ＳｅＭｅｔ導入は、ＥＳＩ−ＭＳによると＞９５％であった。ＳｅＭｅｔ ＦＩＨの好気性結晶化（１１ｍｇ ｍｌ−１で）を懸滴蒸気拡散により１７℃で達成した。母液は、１．２Ｍの硫酸アンモニウム、４％のＰＥＧ４００及び０．１ＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５からなった。Ｂｅｌｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙグローブボックス中、アルゴンの嫌気性雰囲気下（Ｏ２０．３〜０．４ｐｐｍ）に、ＦＩＨ（１１ｍｇ ｍｌ−１で）、Ｆｅ２＋（１ｍＭ）、２ＯＧ／ＮＯＧ（２ｍＭ）及びＣＡＤ断片（１ｍＭ）を含有する同じ母液及び溶液を使用して、ＦＩＨ：Ｆｅ：ＣＡＤ断片複合体の結晶化を行った。ＦＩＨ：Ｚｎ：ＣＡＤ断片の結晶化を、同じ条件下に好気性で行った。ペプチドを、固相ペプチド合成により合成するか、Ｂｉｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．（サンディエゴ、米国）から購入した。
【０１３８】
結晶データ収集及び構造精密化
液体窒素に入れて結晶を冷凍し、窒素流を使用して１００ＫでＸ線データを集めた。１．２Ｍの硫酸アンモニウム、３％のＰＥＧ４００、０．１ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）及び１０％、続いて２４％のグリセリンを含有する溶液に連続して移すことにより、凍結保護を行った。三波長多重異常分散（ＭＡＤ）データセットを、Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ，Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ，Ｕ．Ｋ．のビームライン１４．２で２．９Å分解能まで集めた。ＦＩＨ：ＣＡＤ複合体の結晶からのデータを、ＡＤＳＣ Ｑｕａｎｔｕｍ４（１４．２及び９．６）又はＭａｒＣＣＤ検出器（９．５）を使用して、ビームライン１４．２、９．６又は９．５で集めた。全てのデータを、プログラムＭＯＳＦＬＭ及びＣＣＰ４スートを使用して処理した［Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０，７６０〜７６３（１９９４年）］。結晶は、スペース群Ｐ４１２１２に該当した。６個のセレニウム位を定め、プログラムＳＯＬＶＥを使用して相を算出した（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒら、Ｄ５５、８４９〜８６１、１９９９年）。ＲＥＳＯＬＶＥを使用して、０．５６から０．６６へとメリットの数値を高める密度改変を行った（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５６、９６５〜９７２、２０００）。
【０１３９】
プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７，１１０−１１９、１９９１年）を使用して、当初モデルを構築し、プログラムＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４，９０５〜９２１、１９９８）を使用して、ＳｅＭｅｔデータ（遠隔波長）を再び精密化した。シミュレートされたアニーリング、それに続くグループ化されたβ因子の精密化の１サイクルにより、Ｒｆｒｅｅを３６．２％にした。Ｒｆｒｅｅを３２．３％にするさらなる再構築及び精密化の後に、モデルを、２．１５Åデータセットに移した。Ｆｅ、基質及び溶剤分子を加えることを含むＲＥＦＭＡＣ５を使用する再構築及び精密化並びにＴＬＳパラメーターの精密化により、慣用のＲ因子を１７．８％に、Ｒｆｒｅｅを２１．３％にした。次の残基は、このモデルでは省かれている：ＦＩＨの１〜１５及び３０４〜３０６、ＣＡＤ断片の７８６〜７９４、８０７〜８１１及び８２４〜８２６。ＰＲＯＣＨＥＣＫによると、ラマチャンドラン異常値は存在せず、残基の９０．７％が、ほぼ好適な主鎖配座を有する。ＣＡＤペプチドでは、残基の７７．８％が、最も好適な領域に存在し、残りの２２．２％は、付加的に許される領域に存在する。
【０１４０】
２．１５Åデータからの座標を使用する分子置換及びＲＥＦＭＡＣ５を使用する精密化により、他の構造を解明した。全ての構造で、Ｆｅ及び２ＯＧ／ＮＯＧでの電子密度を、精密化を介して可視化した。鉄とＣＡＤ Ａｓｎ８０３β−炭素との間に、著しい明確な電子密度差が観察された。ＦＩＨとＣＡＤとのＢ因子差は、ＣＡＤが１００％占有ではないことを示しているので、このことは、基質不在下での１−カルボキシレート２ＯＧに関する別の結合モードを表しているが、これは、基質不在下でも水分子結合によるものでありうる。
【０１４１】
ＦＩＨ構造の概観
ＦＩＨの核は、８本のβ鎖、β８〜β１１及びβ１４〜β１７から生じる二本鎖βらせん（ＤＳＢＨ又はジェリーロール）モチーフを含む。残基２２０〜２５９は、ＤＳＢＨの鎖４及び５の間の挿入物を形成する。ＤＳＢＨの底面は、Ｎ−末端領域からの付加的な４本のβ鎖と並んで、８員の逆平行βシートを形成する。Ｎ−末端鎖β１は、活性部位とは逆のＤＳＢＨの面を二分する。このβ１鎖は、β１４とβ２とのその相互作用の間に、ＰＸＸＰ配列に位置する３６０°ねじれを有する。同様に位置するβ鎖は、常にタンパク質の同じ領域からではないが、大抵の２ＯＧオキシゲナーゼに存在する。β１、α１及びβ２により生じるシート−らせん−シートモチーフは、プロリン３−ヒドロキシラーゼを除くこの群の全ての酵素で保存されており、この領域の同様のフォールドが、関連するＣｕ（ＩＩ）利用クエルセチン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＱＤ）で判明している（Ｆｕｓｅｔｔｉら、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ１０（２）：２５９〜２６８、２００２年）。ＦＩＨのトポロジーにより明白に、これは、既にＱＤ及びＭｎ（ＩＩ）利用タイプＩＩホスホマンノースイソメラーゼを包含するクピン（ｃｕｐｉｎ）構造ファミリーの鉄結合員と定義される（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ，Ｐ．Ｍ．，及びＰｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６，７９）。
【０１４２】
ＦＩＨに関連する酵素
ＦＩＨは、ｊｕｍｏｎｊｉ転写因子のＪｍｊＣホモロジー領域と著しい配列相似性を有する（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ，Ｐ．Ｍ．，及びＰｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６，７９；Ｈｅｗｉｔｓｏｎら、Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ２７７（２９）：２６３５１−２６３５５、２００２年）。これらのタンパク質は、クピン構造スーパーファミリーのメンバーであり、細胞成長及び心臓の発達に関している。２ＯＧオキシゲナーゼ鉄結合残基は、幾つかのＪｍｊＣ領域に同定されるが、鉄結合モチーフとしては指定されていない。ＦＩＨ構造に関する配列探索により、このモチーフと、２ＯＧの５−カルボキシレートの結合に著しく関与するＦＩＨ残基Ｌｙｓ２１４及びＴｈｒ１９６との両方を含有する保存残基を有する多くのＪｍｊＣタンパク質が明らかになる。こうして、構造によって、ＦＩＨは、転写の調節に関与する鉄及び２ＯＧ依存性オキシゲナーゼの大きなファミリーのうちの１つであることが明らかになる。ＦＩＨ以外の指定されたＪｍｊＣ領域のうちの幾つかは、疾患及び特定の表現型に随伴するので、その（例えば）阻害は、治療的に有効でありうる（例えば、Ｈｕら、ＯＮＣＯＧＥＮＥ ２０（４７）：６９４６〜６９５４ＯＣＴ１８ ２００１年及びＣｌｉｓｓｏｌｄ，Ｐ．Ｍ．，及びＰｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６，７９及びその参照文献参照）。
【０１４３】
表２。タンパク質を含有するＪｍｊＣ領域の選択を伴うＦＩＨの部分配列アラインメント。ＦＩＨ二次構造は、アラインメントの上に示されている。ＦＩＨ中に存在する選択された２ＯＧ結合残基は、アラインメント下の濃い色の三角で、２個の鉄結合残基は薄い色の三角で示されている。ＳＷＡＬＬ受入番号は、アラインメントの左側に示されている。
【０１４４】
【表２】
【０１４５】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【表３−８】
【表３−９】
【表３−１０】
【表３−１１】
【表３−１２】
【表３−１３】
【表３−１４】
【表３−１５】
【表３−１６】
【表３−１７】
【表３−１８】
【表３−１９】
【表３−２０】
【表３−２１】
【表３−２２】
【表３−２３】
【表３−２４】
【表３−２５】
【表３−２６】
【表３−２７】
【表３−２８】
【表３−２９】
【表３−３０】
【表３−３１】
【表３−３２】
【表３−３３】
【表３−３４】
【表３−３５】
【表３−３６】
【表３−３７】
【表３−３８】
【表３−３９】
【表３−４０】
【表３−４１】
【表３−４２】
【表３−４３】
【表３−４４】
【表３−４５】
【表３−４６】
【表３−４７】
【表３−４８】
【表３−４９】
【表３−５０】
【表３−５１】
【表３−５２】
【表３−５３】
【表３−５４】
【表３−５５】
【表３−５６】
【表３−５７】
【表３−５８】
【表３−５９】
【表３−６０】
【表３−６１】
【表３−６２】
【表３−６３】
【表３−６４】
【表３−６５】
【表３−６６】
【表３−６７】
【表３−６８】
【表３−６９】
【表３−７０】
【表３−７１】
【表３−７２】
【表３−７３】
【表３−７４】
【表３−７５】
【表３−７６】
【表３−７７】
【表３−７８】
【表３−７９】
【表３−８０】
【表３−８１】
【表３−８２】
【表３−８３】
【表３−８４】
【表３−８５】
【表３−８６】
【表３−８７】
【表３−８８】
【表３−８９】
【表３−９０】
【表３−９１】
【表３−９２】
【表３−９３】
【表３−９４】
【表３−９５】
【表３−９６】
【表３−９７】
【表３−９８】
【表３−９９】
【表３−１００】
【表３−１０１】
【表３−１０２】
【表３−１０３】
【表３−１０４】
【表３−１０５】
【表３−１０６】
【表３−１０７】
【表３−１０８】
【表３−１０９】
【表３−１１０】
【表３−１１１】
【表３−１１２】
【表３−１１３】
【表３−１１４】
【表３−１１５】
【表３−１１６】
【表３−１１７】
【表３−１１８】
【表３−１１９】
【表３−１２０】
【表３−１２１】
【表３−１２２】
【表３−１２３】
【表３−１２４】
【表３−１２５】
【表３−１２６】
【表３−１２７】
【表３−１２８】
【表３−１２９】
【表３−１３０】
【表３−１３１】
【表３−１３２】
【表３−１３３】
【表３−１３４】
【表３−１３５】
【表３−１３６】
【表３−１３７】
【表３−１３８】
【表３−１３９】
【表３−１４０】
【表３−１４１】
【表３−１４２】
【表３−１４３】
【表３−１４４】
【表３−１４５】
【表３−１４６】
【表３−１４７】
【表３−１４８】
【表３−１４９】
【表３−１５０】
【表３−１５１】
【表３−１５２】
【表３−１５３】
【表３−１５４】
【表３−１５５】
【表３−１５６】
【表３−１５７】
【表３−１５８】
【表３−１５９】
【表３−１６０】
【表３−１６１】
【表３−１６２】
【表３−１６３】
【表３−１６４】
【表３−１６５】
【表３−１６６】
【表３−１６７】
【表３−１６８】
【表３−１６９】
【表３−１７０】
【表３−１７１】
【表３−１７２】
【表３−１７３】
【表３−１７４】
【表３−１７５】
【表３−１７６】
【表３−１７７】
【表３−１７８】
【表３−１７９】
【表３−１８０】
【表３−１８１】
【表３−１８２】
【表３−１８３】
【表３−１８４】
【表３−１８５】
【表３−１８６】
【表３−１８７】
【表３−１８８】
【表３−１８９】
【表３−１９０】
【表３−１９１】
【表３−１９２】
【表３−１９３】
【表３−１９４】
【表３−１９５】
【表３−１９６】
【表３−１９７】
【表３−１９８】
【表３−１９９】
【表３−２００】
【表３−２０１】
【表３−２０２】
【表３−２０３】
【表３−２０４】
【表３−２０５】
【表３−２０６】
【表３−２０７】
【表３−２０８】
【表３−２０９】
【表３−２１０】
【表３−２１１】
【表３−２１２】
【表３−２１３】
【表３−２１４】
【表３−２１５】
【表３−２１６】
【表３−２１７】
【表３−２１８】
【表３−２１９】
【表３−２２０】
【表３−２２１】
【表３−２２２】
【表３−２２３】
【表３−２２４】
【表３−２２５】
【表３−２２６】
【表３−２２７】
【表３−２２８】
【表３−２２９】
【表３−２３０】
【表３−２３１】
【表３−２３２】
【表３−２３３】
【表３−２３４】
【表３−２３５】
【表３−２３６】
【表３−２３７】
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】２ＯＧ結合部位を示す図である。
【図２】Ａｓｎ−８０３の結合を示す図である。
【図３】サイト１でのＣＡＤの配座を示す図である。
【図４】サイト２でのＣＡＤの配座を示す図である。
【図５】ＦＩＨの活性部位でＨＩＦ−ＣＡＤの８０２〜８０４により生じる回転を示す図である。
【図６】ＦＩＨの活性部位でＨＩＦ−ＣＡＤの残基８０２〜８０４により生じる回転の配座を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＩＨを模倣するか、それに結合する化学実体を同定、スクリーニング、特性決定又は設計する方法であって、ＦＩＨの構造モデルと、前記化学実体の構造モデルとを比較することを含み、ＦＩＨの前記構造モデルは、ＦＩＨを含有する結晶をＸ線回折測定に掛けることにより決定された構造因子又は構造座標に由来する方法。
【請求項２】
化学実体を同定、スクリーニング、特性決定、設計又は改変するための、ＦＩＨを含有する結晶をＸ線回折測定に掛け、前記回折測定から構造座標を推測することにより得られる構造座標の使用。
【請求項３】
前記構造座標が、表３に示されているものである、請求項１又は２に記載の方法又は使用。
【請求項４】
前記化学実体は、ＦＩＨに結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項５】
前記化学実体は、ＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害するために選択されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項６】
前記化学実体を、ＨＩＦ又はその断片或いはアスパラギン８０３を包含するいずれかの同族体と共に、ＦＩＨ又はＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を維持しているその同族体と接触させ、アスパラギン８０３の水酸化を監視することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項７】
前記化学実体は、ＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害する、前記請求項のいずれか一項に記載の使用のための方法により同定される化学実体。
【請求項８】
前記化学実体は、ＦＩＨによるＨＩＦのアスパラギン部分８０３の水酸化を阻害する、請求項７に記載の化学実体。
【請求項９】
前記化学実体は、ＦＩＨの二量化を阻害する、請求項７に記載の化学実体。
【請求項１０】
前記化学実体は、ＦＩＨの残基３３０〜３４６から選択されるＦＩＨの二量化界面を形成する残基に結合する、請求項９に記載の化学実体。
【請求項１１】
前記化学実体は、鉄に結合するか、Ｆｅ（ＩＩ）がＦＩＨに結合することを妨げる、請求項７に記載の化学実体。
【請求項１２】
前記化学実体は、鉄に結合するチオール、アルコール、フェノール、カルボキシレート、ヒドロキサメート、イミダゾール又は他の複素環式化合物から選択される化合物である、請求項１１に記載の化学実体。
【請求項１３】
前記化学実体は、ＦＩＨへの２−オキソグルタレートの結合を中断させる、請求項７に記載の化学実体。
【請求項１４】
前記化学実体は、Ｎ−オキサロイルアラニンのＲ−エンチオマー、プロコラーゲンプロリル−ヒドロキシラーゼ及びＰＨＤアイソザイムである、請求項１３に記載の化学実体。
【請求項１５】
前記化学実体は、下式の（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物である、請求項１３に記載の化学実体：
【化１】
［式中、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ同一又は異なって、Ｈ、Ｆ或いはＣ１からＣ３アルキル若しくは置換アルキル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ又はＣＯＮＨ２であり、Ｘは、ＣＯＯＨ、ＳＯＯＨ若しくはＣＯＮＨＨ又はそのエステルであるか、或いはＬｙｓ−２１４、Ｔｈｒ−１９６及びＴｙｒ−１４５のうちの１つ又は複数の側鎖と好ましい相互作用をもたらす他の基であり、
Ｙは、−（ＣＲ’’’Ｒ’’’）ｎＺであり、Ｚは、
−ＮＲ’’’ＣＯＣＯＯＨ、−ＮＲ’’’ＣＳＣＯＯＨ、−ＮＲ’’’ＣＯＣＯＳＨ、−ＣＨＳＲ’’’ＣＯＮＲ’’’Ｒ’’’’、−ＣＨＯＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＯＲ’’’、−ＣＨＳＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＯＲ’’’又は−ＣＨＯＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＮＲ’’’ＯＲ’’’であり、Ｒ’’’はそれぞれ同一又は異なって、Ｈ、アルキル、ＯＨ又はＯ−アルキルであり、ｎは、０〜３である］。
【化２】
［式中、Ｒ’’’’は、ＯＨ、ＯＲ’’’又はＮＨＣＯＲ’’’であり、Ｗは、Ｓ、ＮＨ又はＯである］。
【請求項１６】
前記化学実体は、ＦＩＨの残基２１４、１９６及び１４５での相互作用を妨害するか、２ＯＧとＦＩＨの残基２８１、１８６、１８８、２０７又は１９６との相互作用を中断する、請求項１３又は１５に記載の化学実体。
【請求項１７】
前記化学実体は、好ましくはＨＩＦの残基１０２、２３９又は２３８でのＨＩＦの結合を妨害することにより、ＦＩＨとＨＩＦのＡｓｎ８０３との結合を中断する、請求項１６に記載の化学実体。
【請求項１８】
ＨＩＦのＣＡＤとＦＩＨとのサイト１結合を妨害し、ＦＩＨの１０２、１０４、１０６、２０１、２０２、１４７、２３９、２９９〜３０３、３１３、３１７、３１８、３２１、３２４、２３８、２９６又は３２１〜３２４から選択される１個又は複数の残基との静電水素結合及び／又は疎水性相互作用を利用する、請求項１７に記載の化学実体。
【請求項１９】
前記化学実体は、ＨＩＦのＣＡＤとＦＩＨとの結合をサイト２で妨害し、残基１４９、１５０、１５１、１５２、１５９、１６２、１６３、１６７、１８１、１８２、１８３、１８４又は１８５との静電水素結合及び／又は疎水性相互作用を利用する、請求項１７に記載の化学実体。
【請求項２０】
前記化学実体は、下式の化合物である、請求項１７に記載の化学実体：
【化３】
【請求項２１】
前記化学実体は、下式の化合物である、請求項１７に記載の化学実体：
【化４】
【請求項２２】
前記化学実体は、下式の化合物である、請求項１７に記載の化学実体：
【化５】
【請求項２３】
前記化学実体は、式：
Ｘ［Ｂ］−［Ｃ］
の化合物である、請求項１７に記載の化学実体
［式中、Ｘは、前記と同様に定義され、Ｂは、リンカー基であり、Ｃは、ＦＩＨのＣＡＤ結合部位の一部に結合する単位である］。
【請求項２４】
前記化学実体は、式：
Ｘ−［Ｂ］−［Ｅ］
の化合物である、請求項１７に記載の化学実体
［式中、Ｘ及びＢは、前記と同様に定義され、Ｅは、ＨＩＦに結合する場合には、ＣＡＤの一部に結合する単位である］。
【請求項２５】
前記化学実体は、下式の化合物である、請求項７に記載の化学実体：
【化６】
［式中、Ｘは、バリン残基又はその類似体を表し、Ｙは、アラニン残基又はその類似体を表し、Ｒ１０は、フッ素又はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、Ｒ１１は、フッ素、Ｃ１〜Ｃ３アルキル又は水素であり、或いは対応する化合物Ｒ１１は存在しないか、又はＲ１０及びＲ１１は、メチレン基を形成する］。
【請求項２６】
治療法で使用するための、請求項７から２５までのいずれか一項に記載の化学実体。
【請求項２７】
低いか、高いＨＩＦレベル又は活性を伴う状態を治療するか、或いはＨＩＦ活性を調節することが望ましい状態を治療する際に使用するための、請求項７から２５までのいずれかに記載の化学実体。
【請求項２８】
前記状態は、虚血、創傷治癒、自己移植、同種移植又は異種移植、全身性高血圧、癌或いは炎症性障害である、請求項２７に記載の化学実体。
【請求項１】
ＦＩＨを模倣するか、それに結合する化学実体を同定、スクリーニング、特性決定又は設計する方法であって、ＦＩＨの構造モデルと、前記化学実体の構造モデルとを比較することを含み、ＦＩＨの前記構造モデルは、ＦＩＨを含有する結晶をＸ線回折測定に掛けることにより決定された構造因子又は構造座標に由来する方法。
【請求項２】
化学実体を同定、スクリーニング、特性決定、設計又は改変するための、ＦＩＨを含有する結晶をＸ線回折測定に掛け、前記回折測定から構造座標を推測することにより得られる構造座標の使用。
【請求項３】
前記構造座標が、表３に示されているものである、請求項１又は２に記載の方法又は使用。
【請求項４】
前記化学実体は、ＦＩＨに結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項５】
前記化学実体は、ＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害するために選択されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項６】
前記化学実体を、ＨＩＦ又はその断片或いはアスパラギン８０３を包含するいずれかの同族体と共に、ＦＩＨ又はＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を維持しているその同族体と接触させ、アスパラギン８０３の水酸化を監視することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項７】
前記化学実体は、ＦＩＨのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害する、前記請求項のいずれか一項に記載の使用のための方法により同定される化学実体。
【請求項８】
前記化学実体は、ＦＩＨによるＨＩＦのアスパラギン部分８０３の水酸化を阻害する、請求項７に記載の化学実体。
【請求項９】
前記化学実体は、ＦＩＨの二量化を阻害する、請求項７に記載の化学実体。
【請求項１０】
前記化学実体は、ＦＩＨの残基３３０〜３４６から選択されるＦＩＨの二量化界面を形成する残基に結合する、請求項９に記載の化学実体。
【請求項１１】
前記化学実体は、鉄に結合するか、Ｆｅ（ＩＩ）がＦＩＨに結合することを妨げる、請求項７に記載の化学実体。
【請求項１２】
前記化学実体は、鉄に結合するチオール、アルコール、フェノール、カルボキシレート、ヒドロキサメート、イミダゾール又は他の複素環式化合物から選択される化合物である、請求項１１に記載の化学実体。
【請求項１３】
前記化学実体は、ＦＩＨへの２−オキソグルタレートの結合を中断させる、請求項７に記載の化学実体。
【請求項１４】
前記化学実体は、Ｎ−オキサロイルアラニンのＲ−エンチオマー、プロコラーゲンプロリル−ヒドロキシラーゼ及びＰＨＤアイソザイムである、請求項１３に記載の化学実体。
【請求項１５】
前記化学実体は、下式の（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物である、請求項１３に記載の化学実体：
【化１】
［式中、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ同一又は異なって、Ｈ、Ｆ或いはＣ１からＣ３アルキル若しくは置換アルキル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ又はＣＯＮＨ２であり、Ｘは、ＣＯＯＨ、ＳＯＯＨ若しくはＣＯＮＨＨ又はそのエステルであるか、或いはＬｙｓ−２１４、Ｔｈｒ−１９６及びＴｙｒ−１４５のうちの１つ又は複数の側鎖と好ましい相互作用をもたらす他の基であり、
Ｙは、−（ＣＲ’’’Ｒ’’’）ｎＺであり、Ｚは、
−ＮＲ’’’ＣＯＣＯＯＨ、−ＮＲ’’’ＣＳＣＯＯＨ、−ＮＲ’’’ＣＯＣＯＳＨ、−ＣＨＳＲ’’’ＣＯＮＲ’’’Ｒ’’’’、−ＣＨＯＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＯＲ’’’、−ＣＨＳＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＯＲ’’’又は−ＣＨＯＲ’’’ＣＯＮＲ’’’ＮＲ’’’ＯＲ’’’であり、Ｒ’’’はそれぞれ同一又は異なって、Ｈ、アルキル、ＯＨ又はＯ−アルキルであり、ｎは、０〜３である］。
【化２】
［式中、Ｒ’’’’は、ＯＨ、ＯＲ’’’又はＮＨＣＯＲ’’’であり、Ｗは、Ｓ、ＮＨ又はＯである］。
【請求項１６】
前記化学実体は、ＦＩＨの残基２１４、１９６及び１４５での相互作用を妨害するか、２ＯＧとＦＩＨの残基２８１、１８６、１８８、２０７又は１９６との相互作用を中断する、請求項１３又は１５に記載の化学実体。
【請求項１７】
前記化学実体は、好ましくはＨＩＦの残基１０２、２３９又は２３８でのＨＩＦの結合を妨害することにより、ＦＩＨとＨＩＦのＡｓｎ８０３との結合を中断する、請求項１６に記載の化学実体。
【請求項１８】
ＨＩＦのＣＡＤとＦＩＨとのサイト１結合を妨害し、ＦＩＨの１０２、１０４、１０６、２０１、２０２、１４７、２３９、２９９〜３０３、３１３、３１７、３１８、３２１、３２４、２３８、２９６又は３２１〜３２４から選択される１個又は複数の残基との静電水素結合及び／又は疎水性相互作用を利用する、請求項１７に記載の化学実体。
【請求項１９】
前記化学実体は、ＨＩＦのＣＡＤとＦＩＨとの結合をサイト２で妨害し、残基１４９、１５０、１５１、１５２、１５９、１６２、１６３、１６７、１８１、１８２、１８３、１８４又は１８５との静電水素結合及び／又は疎水性相互作用を利用する、請求項１７に記載の化学実体。
【請求項２０】
前記化学実体は、下式の化合物である、請求項１７に記載の化学実体：
【化３】
【請求項２１】
前記化学実体は、下式の化合物である、請求項１７に記載の化学実体：
【化４】
【請求項２２】
前記化学実体は、下式の化合物である、請求項１７に記載の化学実体：
【化５】
【請求項２３】
前記化学実体は、式：
Ｘ［Ｂ］−［Ｃ］
の化合物である、請求項１７に記載の化学実体
［式中、Ｘは、前記と同様に定義され、Ｂは、リンカー基であり、Ｃは、ＦＩＨのＣＡＤ結合部位の一部に結合する単位である］。
【請求項２４】
前記化学実体は、式：
Ｘ−［Ｂ］−［Ｅ］
の化合物である、請求項１７に記載の化学実体
［式中、Ｘ及びＢは、前記と同様に定義され、Ｅは、ＨＩＦに結合する場合には、ＣＡＤの一部に結合する単位である］。
【請求項２５】
前記化学実体は、下式の化合物である、請求項７に記載の化学実体：
【化６】
［式中、Ｘは、バリン残基又はその類似体を表し、Ｙは、アラニン残基又はその類似体を表し、Ｒ１０は、フッ素又はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、Ｒ１１は、フッ素、Ｃ１〜Ｃ３アルキル又は水素であり、或いは対応する化合物Ｒ１１は存在しないか、又はＲ１０及びＲ１１は、メチレン基を形成する］。
【請求項２６】
治療法で使用するための、請求項７から２５までのいずれか一項に記載の化学実体。
【請求項２７】
低いか、高いＨＩＦレベル又は活性を伴う状態を治療するか、或いはＨＩＦ活性を調節することが望ましい状態を治療する際に使用するための、請求項７から２５までのいずれかに記載の化学実体。
【請求項２８】
前記状態は、虚血、創傷治癒、自己移植、同種移植又は異種移植、全身性高血圧、癌或いは炎症性障害である、請求項２７に記載の化学実体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００６−５０４４１５（Ｐ２００６−５０４４１５Ａ）
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４４４８５（Ｐ２００４−５４４４８５）
【出願日】平成１５年１０月１６日（２００３．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００４４９２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５８１２
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５００１８９２９６）イシス イノベイション リミテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月１６日（２００３．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００４４９２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５８１２
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５００１８９２９６）イシス イノベイション リミテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
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