アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物
天然原料よりＡＣＥ阻害活性に優れたペプチド及びその製造法を提供する。 大豆中の微量蛋白質である大豆ホエー蛋白質を基質にしてプロテアーゼで分解することにより、大豆の主要な貯蔵蛋白質であるβ−コングリシニンやグリシニンを基質としたペプチドよりもＡＣＥ阻害活性が高いペプチドを得られることを見出し、これに基づき本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧降下剤または高血圧予防食品等への利用に有用な、アンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ、以下「ＡＣＥ」と称する）阻害ペプチド含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
代表的な成人病とされている高血圧症は、年々その患者数が増加しており、以前からその原因究明および有効な対策について研究がなされて来た。高血圧症の発症には、レニン・アンジオテンシン系と呼ばれる昇圧酵素系（非特許文献１）とカリクイン・キニン系と呼ばれる降圧酵素系が重要な役割を果たしている。
【０００３】
それによると、その酵素系において、ＡＣＥは、アンジオテンシンＩを強力な昇圧ペプチドであるアンジオテンシンＩＩに変換するとともに、降圧ペプチドであるブラジキニンを不活性化する作用を示し、血圧上昇に深く関与する。
【０００４】
従って、ＡＣＥの活性を阻害することは血圧上昇を抑制する作用と密接な相関があり、この認識に立って、これまでＡＣＥ阻害活性を有する種々の物質が検索され、報告されてきた。
【０００５】
例えば、ゼラチンのコラギナーゼ消化物〔特許文献１〕、牛由来カゼインのトリプシン分解物〔特許文献２〜４〕、ゼイン（γ−ゼイン）のサーモライシン分解物〔特許文献５〕、分離大豆蛋白質のサーモライシン分解物〔特許文献６〕、イワシ筋肉のペプシン分解物〔特許文献７〕、あるいはカツオのサーモライシン分解物〔特許文献８〕に含まれるＡＣＥ阻害物質などが報告されている。
【０００６】
また大豆蛋白質を酵素加水分解した大豆ペプチドがＡＣＥ阻害活性を高めることも知られている〔特許文献６〕。この大豆ペプチドは大豆の主要な蛋白質である７Ｓグロブリン（β−コングリシニン）や１１Ｓグロブリン（グリシニン）が加水分解されたものを主成分とするものである。
【０００７】
【特許文献１】特開昭５２−１４８６３１号公報
【特許文献２】特開昭５７−１５４３５号公報
【特許文献３】特公昭６０−２３０８６号公報
【特許文献４】特公昭６０−２３０８７号公報
【特許文献５】特開平２−３６１２７号公報
【特許文献６】特開昭６２−１６９７３２号公報
【特許文献７】特開平３−１１０９７号公報
【特許文献８】特開平４−１４４６９６号公報
【非特許文献１】Ｉｔｏｈ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９１，２２６８（１９９３）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、これまでＡＣＥ阻害活性を有するペプチドは、多くの食品素材を原料に使用して検索され活性があることが報告されているが、高い活性のものを低コストで調製することを考えた場合、従来の高コストの食品素材では実用化にあたり課題も多いと考えられる。そこで本発明は、食品製造において排出される副産物のような安価な原料から高活性のＡＣＥ阻害物質を工業的に大量に提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑みて、本発明者らはより高活性のＡＣＥ阻害物質を得るための基質を大豆の特定の画分の中に求めたところ、画分によってＡＣＥ阻害活性に差異がある知見が得られた。そしてさらに鋭意研究を行った結果、大豆中の微量蛋白質である大豆ホエー蛋白を基質にしてプロテアーゼで分解することにより、大豆の主要な貯蔵蛋白質であるβ−コングリシニンやグリシニンを基質とした加水分解物よりもＡＣＥ阻害活性が高い加水分解物を得られることを見出した。そしてさらに、該加水分解物中に存在するＡＣＥ阻害ペプチドがレクチン由来のＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏからなるトリペプチドであることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち本発明は、
（１）大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させた加水分解物又はその分画物からなるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物、
（２）アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドがＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチドである上記（１）に記載の組成物、
（３）大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全固形分あたりの粗蛋白質含量が４０重量％以上である上記（１）に記載の組成物、
（４）大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質あたりのレクチン含量が１０重量％以上である上記（１）に記載の組成物、
（５）加水分解物又はその分画物中に含まれるペプチドの分子量が１００〜２０００である上記（１）に記載の組成物、
（６）大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質１ｇあたりのＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチドの含量が、０．２ｍｇ以上である上記（２）に記載の組成物。
（７）上記（１）に記載の組成物を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する血圧降下剤。
（８）上記（１）に記載の組成物を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する血圧降下用健康食品。
（９）上記（１）に記載の組成物の、血圧降下剤又は血圧降下用健康食品製造における使用。
（１０）高血圧の改善に有効量の上記（１）に記載の組成物を、高血圧の改善が必要な哺乳動物に与えることを特徴とする高血圧の改善方法。
（１１）大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物、又は該加熱凝集物をｐＨ４以下にさらして可溶物を除去したものにプロテアーゼを作用させ、不溶物を除去して大豆ホエー蛋白加水分解物を得ることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物の製造法、
（１２）大豆ホエー蛋白加水分解物からさらに分子量２００〜１０００のペプチドを分画する上記（１１）に記載の組成物の製造法、を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白を加水分解することにより、分離大豆蛋白を加水分解するよりもＡＣＥ阻害活性の高い、食品由来のペプチド含有組成物を得ることが可能となった。また本発明のペプチドの中に比較的多く認められるＡＣＥ阻害活性の高いトリペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏは、天然由来であるので、安全性が高く、食品として使用しても何ら問題ない。さらに本発明には各種大豆製品の副産物を有効利用することができるので、低コストでの製造が可能であり、環境の側面においても非常に有益なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させた加水分解物又はその分画物からなるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物である。以下本発明について、その実施態様を示す。
【００１３】
本発明において大豆ホエーは、脱脂大豆や大豆から水抽出時又は水抽出後に、大豆の主要貯蔵蛋白質の大部分が除去され、他の微量蛋白質が濃縮されたものである。具体的には各種大豆加工製品の製造時に発生する副産物、すなわち分離大豆蛋白の酸沈殿後の上清や、濃縮大豆蛋白〔酸コンセントレート等〕の洗浄液、豆腐やしょうゆの製造時に生ずる廃液などが含まれる。以下に大豆ホエーの一般的な製造例であるが、大豆の主要貯蔵蛋白質の大部分が除去され、他の微量蛋白質が濃縮される方法であれば、特に限定されるものではない。
【００１４】
（分離大豆蛋白ホエー）
脱脂大豆フレークを水又は希アルカリ水溶液（約ｐＨ８〜９）で抽出し、遠心分離により残渣を除去し、上清を回収して脱脂豆乳を得る。これに塩酸を加えてｐＨ４．５前後に調整し、遠心分離によりホエー画分と酸沈殿画分に分離する。得られた酸沈殿画分を水分散させ、アルカリ水溶液で中和後、噴霧乾燥して分離大豆蛋白を得る。副産物としてホエー画分である分離大豆蛋白ホエーを得る。
【００１５】
（濃縮大豆蛋白ホエー）
脱脂大豆に水を加え、塩酸でｐＨ４．５前後に調整しつつ洗浄し、不溶性画分を回収して中和後、乾燥粉砕し、希酸洗浄による濃縮大豆蛋白（酸コンセントレート）を得る。副産物として可溶性画分である濃縮大豆蛋白ホエーを得る。
【００１６】
上記大豆ホエーには、調製方法にもよるが、通常は粗蛋白質が全固形分あたり約１５〜３０重量％程度含まれる。その組成は大豆の主要な貯蔵蛋白質とは異なり、全蛋白質中レクチンが１０〜２０％、クニッツ型トリプシンインヒビターが３０〜５０％、その他βアミラーゼ、リポキシゲナーゼなどの微量蛋白質が主成分となっている。そして大豆の主要な貯蔵蛋白質であるβ−コングリシニン及びグリシニンの組成は全蛋白質中１０％にも満たないものである。
【００１７】
本発明のＡＣＥ変換酵素阻害ペプチド含有組成物を得るための原料としては、上記大豆ホエーをそのまま用いるか、又は蛋白質を濃縮した大豆ホエー蛋白を用いることができる。大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全固形分あたり粗蛋白質は多いほど好ましく、少なくとも１５重量％以上、より好ましくは４５重量％以上、さらに好ましくは７５重量％以上含有することが適当である。粗蛋白質が１５重量％未満になるとＡＣＥ阻害ペプチドを多く含有する組成物が得られない。また大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中には、ＡＣＥ阻害ペプチドの主要な供給源であるレクチンの含量が多いほど好ましく、大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質あたり少なくとも１０重量％以上、より好ましくは１５重量％以上、さらに好ましくは２０重量％以上含有することが適当である。
【００１８】
上記大豆ホエー蛋白を得る方法については特に限定されず、大豆ホエーから低分子の糖などをさらに除去したもの、さらにそれらの中の灰分を除いたもの、または非蛋白質を大部分除いたものなど、目的に合わせて精製度を変えることができる。例えば下記のように加熱して変性した加熱凝集物を回収する方法やさらに加熱凝集物を酸性下にさらし、不純物を洗浄して蛋白質を濃縮する方法を用いることが好ましい。
【００１９】
以下に大豆ホエー蛋白の好ましい調製方法を示す。例えば大豆ホエーを加熱し、加熱凝集する大豆ホエー蛋白を回収する。加熱温度は大豆ホエー蛋白が変性するに十分な温度とし、好ましくは８０〜１２０℃、より好ましくは８５〜１００℃で行う。加熱温度が８０度未満であると凝集塊への成長が不十分であり、加熱温度が１２０℃を超えると褐変などによる着色が出やすくなる。加熱時間は凝集物の形成に十分な時間とすればよく、温度により異なるが、５〜６０分の範囲で行えば十分である。また大豆ホエーを加熱する際に、予めカルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属イオンを大豆ホエー量に対して０．０２〜１重量％共存させると大豆ホエー蛋白の沈殿が促進される。加熱を行う際の大豆ホエーのｐＨは２〜９、好ましくはｐＨ５〜６とすることが適当である。得られた大豆ホエー蛋白は全固形分あたり粗蛋白質が４５〜５５重量％程度、灰分が３０重量％程度含有するものである。
【００２０】
またさらに、上記の加熱凝集させた大豆ホエー蛋白に加水し、塩酸等の酸を用いてｐＨ４以下、より好ましくはｐＨ３以下にさらすことによって、可溶化した灰分等の不純物を除去する。次にｐＨ６．５〜９、好ましくはｐＨ７〜８に中和後、１００〜１５０℃、好ましくは１１０〜１２０℃で加熱することによって可溶化させることにより、さらに高純度の大豆ホエー蛋白を得ることができる。得られた大豆ホエー蛋白は全固形分あたり粗蛋白質が７５〜８５重量％も含有し、灰分が１０重量％以下に低減されたものである。
【００２１】
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物は、上記大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させ、加水分解物としたものである。またさらに該加水分解物をゲルろ過、膜ろ過等の手段により分子量で分画する手段、あるいは吸着樹脂やイオン交換樹脂などの吸着特性を利用した分画手段を使用して分画し、特定の画分を分取することによって、分画物としたものである。
【００２２】
該加水分解物又はその分画物に含まれるペプチドの分子量は１００〜２０００、好ましくは２００〜１０００、さらに好ましくは２００〜５００であることが適当である。そして、該ペプチドにおいて、ＡＣＥ阻害活性を示すペプチドは、アミノ酸シーケンサーによる分析の結果、「Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ」なるアミノ酸配列からなるトリペプチドであり、ＡＣＥ阻害率のＩＣ５０値は０．１３μＭである。該トリペプチドは、大豆ホエー蛋白質の内、レクチンに由来するものであり、大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白の加水分解物又はその分画物中の全蛋白質１ｇあたり、０．２ｍｇ以上、好ましくは０．２〜１０ｍｇ含まれる。
【００２３】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させ、加水分解物を得る方法としては、プロテアーゼを作用させた後、ｐＨを酸性（好ましくはｐＨ４〜５）にして加熱し、不溶画分を取り除いて、可溶画分を回収する方法が好ましい。使用するプロテアーゼとしては特に限定されないが、より高いＡＣＥ阻害活性を得るために、微生物由来、植物由来又は動物由来のエンド型プロテアーゼが好ましく、具体的には金属プロテアーゼ（サーモライシンなど）、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、ズブチリシンなど）、チオールプロテアーゼ（パパイン、フィシン、ブロメライン、カテプシンＢなど）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、キモシン、カテプシンＤなど）などを用いることができる。特にサーモライシン、ズブリチシン、パパイン、ブロメラインが好ましい。
【００２４】
上記により得られた加水分解物をさらにゲルろ過、膜ろ過等の手段により分子量で分画する手段、あるいは吸着樹脂やイオン交換樹脂などの吸着特性を利用した分画手段を使用し、分子量２００〜１０００、より好ましくは２００〜５００の分画物として得ることもできる。
【００２５】
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物は、例えば分離大豆蛋白のように大豆グロブリンを主要成分とするものから調製した加水分解物に比べ、極めて高いＡＣＥ阻害活性を示す。したがって少量の添加であっても強いＡＣＥ阻害効果を発揮することが可能である。
【００２６】
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物を基礎原料として使用し、その他公知の原材料を使用して、公知の製法により、錠剤・液剤・顆粒剤・粉剤などに製剤化してＡＣＥ阻害作用を有する血圧降下剤とすることができる。この血圧降下剤は高血圧症のヒトに対して投与することが血圧降下に有効である。
【００２７】
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物を基礎原料として使用し、その他公知の原材料を使用して、公知の製法により、焼き菓子、キャンデー、ガム、スナック、タブレット、飲料、ゼリー等の種々の食品を製造して、ＡＣＥ阻害作用を有する血圧降下用途の特定保健用食品、保健機能食品等の健康食品とすることができる。この健康食品は高血圧症のヒトや血圧が高い傾向にあるヒトに摂取させることが高血圧の改善に有効である。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明は、この実施例にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【００２９】
◎実施例１（大豆ホエー蛋白加水分解物の調製）
脱脂大豆２ｋｇに１０倍の水（２０Ｌ）を加え、攪拌しながら塩酸にてｐＨを４．３に調整後、遠心分離して不溶物を除き、上清１６Ｌを回収した。
次に消石灰を加えて、ｐＨを５．３に調整し、９５℃に加熱して不溶化凝集する蛋白質分を遠心分離にて回収した。得られた沈澱物に水を２Ｌ添加し、塩酸を加えてｐＨを２．０に調整し、遠心分離（１０００ｇ×５分）で酸可溶性成分を除去した。さらに沈澱物に０．２Ｌの水を加え、ｐＨを水酸化ナトリウムで８．５に調整後、１２０℃、１０分の加熱を行い、蛋白質を可溶化し、大豆ホエー蛋白を得た。該蛋白の全固形分中の粗蛋白質含量は８１重量％であった。電気泳動によれば大豆の主要な貯蔵蛋白質である大豆グロブリン（グリシニンやβ−コングリシニン）はほとんど存在せず、主に大豆レクチンとクニッツ型トリプシンインヒビターが存在した。そのうち、レクチン含量はアミノ酸組成分析から、全蛋白質あたり１６〜２０重量％と推測された。
【００３０】
得られたホエー蛋白質粗精製物に粗蛋白質含量あたり１％のサーモライシンを添加し、ｐＨを７．５以上８．５以下に保ちつつ５０℃で４時間反応させた。反応液は、塩酸でｐＨを４．５に調整し、９５℃、２０分加熱して反応を止め、遠心分離（１０００ｇ×５分）を行い、上澄みを回収し、大豆ホエー蛋白加水分解物（ＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物）を得た。
【００３１】
◎比較例１（分離大豆蛋白加水分解物の調製）
脱脂大豆２ｋｇに１０倍の水（２０Ｌ）を加え、攪拌しながら水酸化ナトリウムにてｐＨを７．５に調整後、遠心分離（１０００ｇ×５分）して不溶物を除き、脱脂豆乳１７Ｌを回収した。
次に塩酸を加えて、ｐＨを４．５に調整し、不溶化凝集する大豆グロブリン蛋白質を遠心分離（１０００ｇ×５分）にて回収した。得られた沈澱物に水を１６Ｌ添加し、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．０に調整して溶解した。その後、１２０℃、１０分の加熱を行い、分離大豆蛋白質（主に大豆グロブリン）の溶液とした。電気泳動によれば、ホエー蛋白質は除去されており、主にグリシニン、β−コングリシニンのほか、微量蛋白質として、γ−コングリシニン、膜タンパク質、リポキシゲナーゼなどが認められた。該蛋白の全固形分中の粗蛋白質含量は８６重量％であった。
【００３２】
分離大豆蛋白溶液に粗蛋白質量あたり１％のサーモライシンを添加し、ｐＨを７．５以上８．５以下に保ちつつ５０℃で４時間反応させた。反応液を塩酸でｐＨ４．５に調整し、９５℃、２０分加熱して反応を止め、遠心分離（１０００ｇ×５分）を行い、上澄みを回収し、分離大豆蛋白加水分解物を得た。
【００３３】
実施例１、比較例１で得られた各加水分解物のＡＣＥ阻害活性を公知の測定法（Ｃｕｓｈｍａｎ−ｃｈｅｕｎｇ法）に準じて測定した。ラビット由来ＡＣＥ（シグマ社製）を５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、０．１Ｕｎｉｔ／ｍｌになるように調製した。一方、基質としては、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（シグマ社製）を４．２ｍＭになるようにＮａＣｌを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）で溶解した。また、阻害活性を測定するサンプルは、ローリー法でタンパク分解物の濃度を測定し、濃度が既知のものを用意した。それぞれ基質溶液１５０μｌ、サンプル溶液５０μｌ、ＡＣＥ溶液５０μｌを混合し、３７℃、３０分反応させた。この反応液中の最終濃度は、基質２．５ｍＭ、ＮａＣｌ３００ｍＭである。次いで１規定の塩酸を２５０μｌ加えて、反応を停止し、１．５ｍｌの酢酸エチルを加えて１０秒間攪拌し、さらに３０００Ｇ×２分間遠心し、酢酸エチル層を１ｍｌ採取した。そしてブロックヒーターにより、１２０℃、３０分加熱し、蒸発乾固させ、これに１ｍｌの蒸留水を加えて、抽出されたヒプリル酸の吸収（２２８ｎｍの吸光度）を測定した。アンジオテンシン変換酵素阻害率は下記の〔１〕式によって求めるようにした。但し、ＯＤｓは上記のようにしてサンプルを加えて測定したときの吸光度、ＯＤｓｂは上記の混合溶液を反応させる前に１規定の塩酸を２５０μｌ添加させて測定した時の吸光度、ＯＤｃは上記の混合溶液にサンプルを加えずに測定した時の吸光度、ＯＤｃｂは上記の混合溶液にサンプルを加えずに反応させる前に１規定の塩酸を２５０μｌ添加させて測定した時の吸光度である。
【００３４】
【００３５】
そして求められた阻害率から、各サンプルの阻害活性を確認すべく、その分解物のＡＣＥ阻害率が５０％となる濃度（ＩＣ５０）を求めた。得られた結果を表１に示す。
【００３６】
【００３７】
実験結果より、プロテアーゼは両者ともサーモライシン（対蛋白質当り１％を添加、５０℃、４時間）を使用したが、ＩＣ５０は比較例１の分離大豆蛋白加水分解物が５０μｇ／ｍｌであるのに対し、実施例１の大豆ホエー蛋白加水分解物は２８μｇ／ｍｌであり、大豆ホエー蛋白加水分解物は、分離大豆蛋白加水分解物に比べて低濃度においても、顕著にＡＣＥ阻害活性が高いことがわかった。このように明らかに酵素分解の基質として大豆ホエー蛋白を使用した加水分解物の方が高いＡＣＥ阻害活性を示した。
【００３８】
◎実施例２（大豆ホエー蛋白加水分解物のゲル濾過による分画）
実施例１で得られた大豆ホエー蛋白加水分解物について、表２の条件にてゲル濾過（ＦＰＬＣ）による分画を行い、画分Ｉ：Ｆｒ．６−９、画分ＩＩ：Ｆｒ．１０−１５、画分ＩＩＩ：Ｆｒ．１６−２０、画分ＩＶ：Ｆｒ．２１−２５の４画分に分画した。各画分を回収し、８０〜１００℃で蒸発乾固し、１．５ｍｌの水で溶解した。このＦＰＬＣによる溶出パターンを図１に示した。
【００３９】
【００４０】
得られた画分Ｉ〜ＩＶのローリー法による回収率を表３に、また、各画分のＡＣＥ阻害率を表４に示した。その結果、多くの活性が画分ＩＩＩ：Ｆｒ．１６−２０に認められ、この画分の分子量は１５００以下であると推測された。
【００４１】
【００４２】
【００４３】
◎実施例３（画分ＩＩＩのゲル濾過による再分画）
実施例２で得られた画分ＩＩＩについて実施例２と同じ条件にて再度ゲル濾過（ＦＰＬＣ）を行い、画分ＩＩＩ−１：Ｆｒ．１３−１５、ＩＩＩ−２：Ｆｒ．１６−１８、ＩＩＩ−３：Ｆｒ．１９−２１、ＩＩＩ−４：Ｆｒ．２２−２４の４画分に分画した。各画分を収集し、８０〜１００℃で蒸発乾固し、１．０ｍｌの水で溶解した。実施例１で得られた酵素分解物上澄みのＦＰＬＣによる溶出パターンを図２に示した。
【００４４】
得られたＩＩＩ−１〜ＩＩＩ−４画分のローリー法による回収率を表５に、また、各画分のＡＣＥ阻害活性を表６に示した。その結果、多くの活性が画分ＩＩＩ−３：Ｆｒ．１９−２１に認められた。
【００４５】
【００４６】
【００４７】
◎実施例４（ＩＩＩ−３画分の逆相クロマトによる分画）
実施例３にて得られたＡＣＥ阻害活性の強いＩＩＩ−３画分から、逆相カラムを用いたＨＰＬＣにてＡＣＥ阻害関与ペプチドを精製した。
まず、ＩＩＩ−３画分の０．１％溶液を５０μｌを表７の条件にてＨＰＬＣに供し、図３の溶出パターンに示す通り、Ｏ．Ｄ．２２０ｎｍで検出した。この中で１４．４８分のピークに高いＡＣＥ阻害活性を認めたので、このピークを分取した。
【００４８】
【００４９】
◎実施例５（１４．４８分ピーク物質の逆相クロマトによる精製）
次に、１４．４８分のピークを採取後、表８の条件にてさらにＨＰＬＣに供し、図４の溶出パターンに示す通り、ピーク１〜３が検出され、ピーク１にＡＣＥ阻害活性が認められた。このピークを分取し、表９に示す条件にてゲルろ過に供したところ、図５の溶出パターンに示す通り、分子量３００の単一ピークが得られた。このピーク１について、アミノ酸シーケンサーでアミノ酸配列を調べた結果、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（以下、「ＬＡＰ」と略する。）の配列からなるトリペプチドであることが判明した。
【００５０】
【００５１】
【００５２】
精製されたＬＡＰの濃度をＴＮＢＳ法で測定し、濃度当りの逆相ＨＰＬＣのピーク面積を求めると１μＭの溶液を５０μｌ注入した場合、ピーク面積は約２８０００を示した。これをもとに各画分の回収率及びピーク面積から分解物中に含まれるＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏトリペプチドの量を計算した。
【００５３】
ＩＩＩ−３画分：０．１％液５０μｌ注入でピーク面積１１６万であるので、０．１％液の本トリペプチドの濃度は、１１６万×０．７（純度）÷２．８万＝２９μＭ＝８．７μｇ／ｍｌとなり、蛋白質固形分当りの含有量は、８．７ｍｇ／ｇ（ＩＩＩ−３画分）となる。ＩＩＩ−３画分の分解物上澄中の含有量は、７．７％なので、ＩＩＩ−３画分由来の本トリペプチドの分解物上澄中の蛋白質固形分当りの含有量は、０．６７ｍｇ／ｇ（分解物上澄）となる。また、ＩＶ画分もＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏトリペプチドが認められた。
【００５４】
ＩＶ画分：０．１％液５０μｌ注入でピーク面積１１０万であるので、０．１％液の本トリペプチドの濃度は、１１０万×０．３（純度）÷２．８万＝１２μＭ＝３．５μｇ／ｍｌとなり、蛋白質固形分当りの含有量は、３．５ｍｇ／ｇ（ＩＶ画分）となる。ＩＶ画分の分解物上澄中の含有量は、１１％なので、ＩＶ画分由来の本トリペプチドの分解物上澄中の蛋白質固形分当りの含有量は、０．３９ｍｇ／ｇ（分解物上澄）となる。この２画分由来のものを合わせると少なくとも分解物上澄中の蛋白質固形分１ｇ当りの本トリペプチドの含有量は、１．０６ｍｇとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
［図１］実施例２の蛋白質加水分解物上澄のゲルろ過（ＦＰＬＣ）による溶出パターンである。
［図２］実施例３の画分ＩＩＩのゲルろ過（ＦＰＬＣ）による溶出パターンである。
［図３］実施例４の画分ＩＩＩ−３の逆相ＨＰＬＣによる溶出パターンである。
［図４］実施例５のピーク１４．４８分の逆相ＨＰＬＣによる溶出パターンである。
［図５］実施例６のピーク１のゲルろ過ＨＰＬＣによる溶出パターンである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧降下剤または高血圧予防食品等への利用に有用な、アンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ、以下「ＡＣＥ」と称する）阻害ペプチド含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
代表的な成人病とされている高血圧症は、年々その患者数が増加しており、以前からその原因究明および有効な対策について研究がなされて来た。高血圧症の発症には、レニン・アンジオテンシン系と呼ばれる昇圧酵素系（非特許文献１）とカリクイン・キニン系と呼ばれる降圧酵素系が重要な役割を果たしている。
【０００３】
それによると、その酵素系において、ＡＣＥは、アンジオテンシンＩを強力な昇圧ペプチドであるアンジオテンシンＩＩに変換するとともに、降圧ペプチドであるブラジキニンを不活性化する作用を示し、血圧上昇に深く関与する。
【０００４】
従って、ＡＣＥの活性を阻害することは血圧上昇を抑制する作用と密接な相関があり、この認識に立って、これまでＡＣＥ阻害活性を有する種々の物質が検索され、報告されてきた。
【０００５】
例えば、ゼラチンのコラギナーゼ消化物〔特許文献１〕、牛由来カゼインのトリプシン分解物〔特許文献２〜４〕、ゼイン（γ−ゼイン）のサーモライシン分解物〔特許文献５〕、分離大豆蛋白質のサーモライシン分解物〔特許文献６〕、イワシ筋肉のペプシン分解物〔特許文献７〕、あるいはカツオのサーモライシン分解物〔特許文献８〕に含まれるＡＣＥ阻害物質などが報告されている。
【０００６】
また大豆蛋白質を酵素加水分解した大豆ペプチドがＡＣＥ阻害活性を高めることも知られている〔特許文献６〕。この大豆ペプチドは大豆の主要な蛋白質である７Ｓグロブリン（β−コングリシニン）や１１Ｓグロブリン（グリシニン）が加水分解されたものを主成分とするものである。
【０００７】
【特許文献１】特開昭５２−１４８６３１号公報
【特許文献２】特開昭５７−１５４３５号公報
【特許文献３】特公昭６０−２３０８６号公報
【特許文献４】特公昭６０−２３０８７号公報
【特許文献５】特開平２−３６１２７号公報
【特許文献６】特開昭６２−１６９７３２号公報
【特許文献７】特開平３−１１０９７号公報
【特許文献８】特開平４−１４４６９６号公報
【非特許文献１】Ｉｔｏｈ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９１，２２６８（１９９３）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、これまでＡＣＥ阻害活性を有するペプチドは、多くの食品素材を原料に使用して検索され活性があることが報告されているが、高い活性のものを低コストで調製することを考えた場合、従来の高コストの食品素材では実用化にあたり課題も多いと考えられる。そこで本発明は、食品製造において排出される副産物のような安価な原料から高活性のＡＣＥ阻害物質を工業的に大量に提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑みて、本発明者らはより高活性のＡＣＥ阻害物質を得るための基質を大豆の特定の画分の中に求めたところ、画分によってＡＣＥ阻害活性に差異がある知見が得られた。そしてさらに鋭意研究を行った結果、大豆中の微量蛋白質である大豆ホエー蛋白を基質にしてプロテアーゼで分解することにより、大豆の主要な貯蔵蛋白質であるβ−コングリシニンやグリシニンを基質とした加水分解物よりもＡＣＥ阻害活性が高い加水分解物を得られることを見出した。そしてさらに、該加水分解物中に存在するＡＣＥ阻害ペプチドがレクチン由来のＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏからなるトリペプチドであることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち本発明は、
（１）大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させた加水分解物又はその分画物からなるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物、
（２）アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドがＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチドである上記（１）に記載の組成物、
（３）大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全固形分あたりの粗蛋白質含量が４０重量％以上である上記（１）に記載の組成物、
（４）大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質あたりのレクチン含量が１０重量％以上である上記（１）に記載の組成物、
（５）加水分解物又はその分画物中に含まれるペプチドの分子量が１００〜２０００である上記（１）に記載の組成物、
（６）大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質１ｇあたりのＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチドの含量が、０．２ｍｇ以上である上記（２）に記載の組成物。
（７）上記（１）に記載の組成物を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する血圧降下剤。
（８）上記（１）に記載の組成物を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する血圧降下用健康食品。
（９）上記（１）に記載の組成物の、血圧降下剤又は血圧降下用健康食品製造における使用。
（１０）高血圧の改善に有効量の上記（１）に記載の組成物を、高血圧の改善が必要な哺乳動物に与えることを特徴とする高血圧の改善方法。
（１１）大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物、又は該加熱凝集物をｐＨ４以下にさらして可溶物を除去したものにプロテアーゼを作用させ、不溶物を除去して大豆ホエー蛋白加水分解物を得ることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物の製造法、
（１２）大豆ホエー蛋白加水分解物からさらに分子量２００〜１０００のペプチドを分画する上記（１１）に記載の組成物の製造法、を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白を加水分解することにより、分離大豆蛋白を加水分解するよりもＡＣＥ阻害活性の高い、食品由来のペプチド含有組成物を得ることが可能となった。また本発明のペプチドの中に比較的多く認められるＡＣＥ阻害活性の高いトリペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏは、天然由来であるので、安全性が高く、食品として使用しても何ら問題ない。さらに本発明には各種大豆製品の副産物を有効利用することができるので、低コストでの製造が可能であり、環境の側面においても非常に有益なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させた加水分解物又はその分画物からなるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物である。以下本発明について、その実施態様を示す。
【００１３】
本発明において大豆ホエーは、脱脂大豆や大豆から水抽出時又は水抽出後に、大豆の主要貯蔵蛋白質の大部分が除去され、他の微量蛋白質が濃縮されたものである。具体的には各種大豆加工製品の製造時に発生する副産物、すなわち分離大豆蛋白の酸沈殿後の上清や、濃縮大豆蛋白〔酸コンセントレート等〕の洗浄液、豆腐やしょうゆの製造時に生ずる廃液などが含まれる。以下に大豆ホエーの一般的な製造例であるが、大豆の主要貯蔵蛋白質の大部分が除去され、他の微量蛋白質が濃縮される方法であれば、特に限定されるものではない。
【００１４】
（分離大豆蛋白ホエー）
脱脂大豆フレークを水又は希アルカリ水溶液（約ｐＨ８〜９）で抽出し、遠心分離により残渣を除去し、上清を回収して脱脂豆乳を得る。これに塩酸を加えてｐＨ４．５前後に調整し、遠心分離によりホエー画分と酸沈殿画分に分離する。得られた酸沈殿画分を水分散させ、アルカリ水溶液で中和後、噴霧乾燥して分離大豆蛋白を得る。副産物としてホエー画分である分離大豆蛋白ホエーを得る。
【００１５】
（濃縮大豆蛋白ホエー）
脱脂大豆に水を加え、塩酸でｐＨ４．５前後に調整しつつ洗浄し、不溶性画分を回収して中和後、乾燥粉砕し、希酸洗浄による濃縮大豆蛋白（酸コンセントレート）を得る。副産物として可溶性画分である濃縮大豆蛋白ホエーを得る。
【００１６】
上記大豆ホエーには、調製方法にもよるが、通常は粗蛋白質が全固形分あたり約１５〜３０重量％程度含まれる。その組成は大豆の主要な貯蔵蛋白質とは異なり、全蛋白質中レクチンが１０〜２０％、クニッツ型トリプシンインヒビターが３０〜５０％、その他βアミラーゼ、リポキシゲナーゼなどの微量蛋白質が主成分となっている。そして大豆の主要な貯蔵蛋白質であるβ−コングリシニン及びグリシニンの組成は全蛋白質中１０％にも満たないものである。
【００１７】
本発明のＡＣＥ変換酵素阻害ペプチド含有組成物を得るための原料としては、上記大豆ホエーをそのまま用いるか、又は蛋白質を濃縮した大豆ホエー蛋白を用いることができる。大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全固形分あたり粗蛋白質は多いほど好ましく、少なくとも１５重量％以上、より好ましくは４５重量％以上、さらに好ましくは７５重量％以上含有することが適当である。粗蛋白質が１５重量％未満になるとＡＣＥ阻害ペプチドを多く含有する組成物が得られない。また大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中には、ＡＣＥ阻害ペプチドの主要な供給源であるレクチンの含量が多いほど好ましく、大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質あたり少なくとも１０重量％以上、より好ましくは１５重量％以上、さらに好ましくは２０重量％以上含有することが適当である。
【００１８】
上記大豆ホエー蛋白を得る方法については特に限定されず、大豆ホエーから低分子の糖などをさらに除去したもの、さらにそれらの中の灰分を除いたもの、または非蛋白質を大部分除いたものなど、目的に合わせて精製度を変えることができる。例えば下記のように加熱して変性した加熱凝集物を回収する方法やさらに加熱凝集物を酸性下にさらし、不純物を洗浄して蛋白質を濃縮する方法を用いることが好ましい。
【００１９】
以下に大豆ホエー蛋白の好ましい調製方法を示す。例えば大豆ホエーを加熱し、加熱凝集する大豆ホエー蛋白を回収する。加熱温度は大豆ホエー蛋白が変性するに十分な温度とし、好ましくは８０〜１２０℃、より好ましくは８５〜１００℃で行う。加熱温度が８０度未満であると凝集塊への成長が不十分であり、加熱温度が１２０℃を超えると褐変などによる着色が出やすくなる。加熱時間は凝集物の形成に十分な時間とすればよく、温度により異なるが、５〜６０分の範囲で行えば十分である。また大豆ホエーを加熱する際に、予めカルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属イオンを大豆ホエー量に対して０．０２〜１重量％共存させると大豆ホエー蛋白の沈殿が促進される。加熱を行う際の大豆ホエーのｐＨは２〜９、好ましくはｐＨ５〜６とすることが適当である。得られた大豆ホエー蛋白は全固形分あたり粗蛋白質が４５〜５５重量％程度、灰分が３０重量％程度含有するものである。
【００２０】
またさらに、上記の加熱凝集させた大豆ホエー蛋白に加水し、塩酸等の酸を用いてｐＨ４以下、より好ましくはｐＨ３以下にさらすことによって、可溶化した灰分等の不純物を除去する。次にｐＨ６．５〜９、好ましくはｐＨ７〜８に中和後、１００〜１５０℃、好ましくは１１０〜１２０℃で加熱することによって可溶化させることにより、さらに高純度の大豆ホエー蛋白を得ることができる。得られた大豆ホエー蛋白は全固形分あたり粗蛋白質が７５〜８５重量％も含有し、灰分が１０重量％以下に低減されたものである。
【００２１】
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物は、上記大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させ、加水分解物としたものである。またさらに該加水分解物をゲルろ過、膜ろ過等の手段により分子量で分画する手段、あるいは吸着樹脂やイオン交換樹脂などの吸着特性を利用した分画手段を使用して分画し、特定の画分を分取することによって、分画物としたものである。
【００２２】
該加水分解物又はその分画物に含まれるペプチドの分子量は１００〜２０００、好ましくは２００〜１０００、さらに好ましくは２００〜５００であることが適当である。そして、該ペプチドにおいて、ＡＣＥ阻害活性を示すペプチドは、アミノ酸シーケンサーによる分析の結果、「Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ」なるアミノ酸配列からなるトリペプチドであり、ＡＣＥ阻害率のＩＣ５０値は０．１３μＭである。該トリペプチドは、大豆ホエー蛋白質の内、レクチンに由来するものであり、大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白の加水分解物又はその分画物中の全蛋白質１ｇあたり、０．２ｍｇ以上、好ましくは０．２〜１０ｍｇ含まれる。
【００２３】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させ、加水分解物を得る方法としては、プロテアーゼを作用させた後、ｐＨを酸性（好ましくはｐＨ４〜５）にして加熱し、不溶画分を取り除いて、可溶画分を回収する方法が好ましい。使用するプロテアーゼとしては特に限定されないが、より高いＡＣＥ阻害活性を得るために、微生物由来、植物由来又は動物由来のエンド型プロテアーゼが好ましく、具体的には金属プロテアーゼ（サーモライシンなど）、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、ズブチリシンなど）、チオールプロテアーゼ（パパイン、フィシン、ブロメライン、カテプシンＢなど）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、キモシン、カテプシンＤなど）などを用いることができる。特にサーモライシン、ズブリチシン、パパイン、ブロメラインが好ましい。
【００２４】
上記により得られた加水分解物をさらにゲルろ過、膜ろ過等の手段により分子量で分画する手段、あるいは吸着樹脂やイオン交換樹脂などの吸着特性を利用した分画手段を使用し、分子量２００〜１０００、より好ましくは２００〜５００の分画物として得ることもできる。
【００２５】
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物は、例えば分離大豆蛋白のように大豆グロブリンを主要成分とするものから調製した加水分解物に比べ、極めて高いＡＣＥ阻害活性を示す。したがって少量の添加であっても強いＡＣＥ阻害効果を発揮することが可能である。
【００２６】
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物を基礎原料として使用し、その他公知の原材料を使用して、公知の製法により、錠剤・液剤・顆粒剤・粉剤などに製剤化してＡＣＥ阻害作用を有する血圧降下剤とすることができる。この血圧降下剤は高血圧症のヒトに対して投与することが血圧降下に有効である。
【００２７】
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物を基礎原料として使用し、その他公知の原材料を使用して、公知の製法により、焼き菓子、キャンデー、ガム、スナック、タブレット、飲料、ゼリー等の種々の食品を製造して、ＡＣＥ阻害作用を有する血圧降下用途の特定保健用食品、保健機能食品等の健康食品とすることができる。この健康食品は高血圧症のヒトや血圧が高い傾向にあるヒトに摂取させることが高血圧の改善に有効である。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明は、この実施例にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【００２９】
◎実施例１（大豆ホエー蛋白加水分解物の調製）
脱脂大豆２ｋｇに１０倍の水（２０Ｌ）を加え、攪拌しながら塩酸にてｐＨを４．３に調整後、遠心分離して不溶物を除き、上清１６Ｌを回収した。
次に消石灰を加えて、ｐＨを５．３に調整し、９５℃に加熱して不溶化凝集する蛋白質分を遠心分離にて回収した。得られた沈澱物に水を２Ｌ添加し、塩酸を加えてｐＨを２．０に調整し、遠心分離（１０００ｇ×５分）で酸可溶性成分を除去した。さらに沈澱物に０．２Ｌの水を加え、ｐＨを水酸化ナトリウムで８．５に調整後、１２０℃、１０分の加熱を行い、蛋白質を可溶化し、大豆ホエー蛋白を得た。該蛋白の全固形分中の粗蛋白質含量は８１重量％であった。電気泳動によれば大豆の主要な貯蔵蛋白質である大豆グロブリン（グリシニンやβ−コングリシニン）はほとんど存在せず、主に大豆レクチンとクニッツ型トリプシンインヒビターが存在した。そのうち、レクチン含量はアミノ酸組成分析から、全蛋白質あたり１６〜２０重量％と推測された。
【００３０】
得られたホエー蛋白質粗精製物に粗蛋白質含量あたり１％のサーモライシンを添加し、ｐＨを７．５以上８．５以下に保ちつつ５０℃で４時間反応させた。反応液は、塩酸でｐＨを４．５に調整し、９５℃、２０分加熱して反応を止め、遠心分離（１０００ｇ×５分）を行い、上澄みを回収し、大豆ホエー蛋白加水分解物（ＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物）を得た。
【００３１】
◎比較例１（分離大豆蛋白加水分解物の調製）
脱脂大豆２ｋｇに１０倍の水（２０Ｌ）を加え、攪拌しながら水酸化ナトリウムにてｐＨを７．５に調整後、遠心分離（１０００ｇ×５分）して不溶物を除き、脱脂豆乳１７Ｌを回収した。
次に塩酸を加えて、ｐＨを４．５に調整し、不溶化凝集する大豆グロブリン蛋白質を遠心分離（１０００ｇ×５分）にて回収した。得られた沈澱物に水を１６Ｌ添加し、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．０に調整して溶解した。その後、１２０℃、１０分の加熱を行い、分離大豆蛋白質（主に大豆グロブリン）の溶液とした。電気泳動によれば、ホエー蛋白質は除去されており、主にグリシニン、β−コングリシニンのほか、微量蛋白質として、γ−コングリシニン、膜タンパク質、リポキシゲナーゼなどが認められた。該蛋白の全固形分中の粗蛋白質含量は８６重量％であった。
【００３２】
分離大豆蛋白溶液に粗蛋白質量あたり１％のサーモライシンを添加し、ｐＨを７．５以上８．５以下に保ちつつ５０℃で４時間反応させた。反応液を塩酸でｐＨ４．５に調整し、９５℃、２０分加熱して反応を止め、遠心分離（１０００ｇ×５分）を行い、上澄みを回収し、分離大豆蛋白加水分解物を得た。
【００３３】
実施例１、比較例１で得られた各加水分解物のＡＣＥ阻害活性を公知の測定法（Ｃｕｓｈｍａｎ−ｃｈｅｕｎｇ法）に準じて測定した。ラビット由来ＡＣＥ（シグマ社製）を５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、０．１Ｕｎｉｔ／ｍｌになるように調製した。一方、基質としては、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（シグマ社製）を４．２ｍＭになるようにＮａＣｌを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）で溶解した。また、阻害活性を測定するサンプルは、ローリー法でタンパク分解物の濃度を測定し、濃度が既知のものを用意した。それぞれ基質溶液１５０μｌ、サンプル溶液５０μｌ、ＡＣＥ溶液５０μｌを混合し、３７℃、３０分反応させた。この反応液中の最終濃度は、基質２．５ｍＭ、ＮａＣｌ３００ｍＭである。次いで１規定の塩酸を２５０μｌ加えて、反応を停止し、１．５ｍｌの酢酸エチルを加えて１０秒間攪拌し、さらに３０００Ｇ×２分間遠心し、酢酸エチル層を１ｍｌ採取した。そしてブロックヒーターにより、１２０℃、３０分加熱し、蒸発乾固させ、これに１ｍｌの蒸留水を加えて、抽出されたヒプリル酸の吸収（２２８ｎｍの吸光度）を測定した。アンジオテンシン変換酵素阻害率は下記の〔１〕式によって求めるようにした。但し、ＯＤｓは上記のようにしてサンプルを加えて測定したときの吸光度、ＯＤｓｂは上記の混合溶液を反応させる前に１規定の塩酸を２５０μｌ添加させて測定した時の吸光度、ＯＤｃは上記の混合溶液にサンプルを加えずに測定した時の吸光度、ＯＤｃｂは上記の混合溶液にサンプルを加えずに反応させる前に１規定の塩酸を２５０μｌ添加させて測定した時の吸光度である。
【００３４】
【００３５】
そして求められた阻害率から、各サンプルの阻害活性を確認すべく、その分解物のＡＣＥ阻害率が５０％となる濃度（ＩＣ５０）を求めた。得られた結果を表１に示す。
【００３６】
【００３７】
実験結果より、プロテアーゼは両者ともサーモライシン（対蛋白質当り１％を添加、５０℃、４時間）を使用したが、ＩＣ５０は比較例１の分離大豆蛋白加水分解物が５０μｇ／ｍｌであるのに対し、実施例１の大豆ホエー蛋白加水分解物は２８μｇ／ｍｌであり、大豆ホエー蛋白加水分解物は、分離大豆蛋白加水分解物に比べて低濃度においても、顕著にＡＣＥ阻害活性が高いことがわかった。このように明らかに酵素分解の基質として大豆ホエー蛋白を使用した加水分解物の方が高いＡＣＥ阻害活性を示した。
【００３８】
◎実施例２（大豆ホエー蛋白加水分解物のゲル濾過による分画）
実施例１で得られた大豆ホエー蛋白加水分解物について、表２の条件にてゲル濾過（ＦＰＬＣ）による分画を行い、画分Ｉ：Ｆｒ．６−９、画分ＩＩ：Ｆｒ．１０−１５、画分ＩＩＩ：Ｆｒ．１６−２０、画分ＩＶ：Ｆｒ．２１−２５の４画分に分画した。各画分を回収し、８０〜１００℃で蒸発乾固し、１．５ｍｌの水で溶解した。このＦＰＬＣによる溶出パターンを図１に示した。
【００３９】
【００４０】
得られた画分Ｉ〜ＩＶのローリー法による回収率を表３に、また、各画分のＡＣＥ阻害率を表４に示した。その結果、多くの活性が画分ＩＩＩ：Ｆｒ．１６−２０に認められ、この画分の分子量は１５００以下であると推測された。
【００４１】
【００４２】
【００４３】
◎実施例３（画分ＩＩＩのゲル濾過による再分画）
実施例２で得られた画分ＩＩＩについて実施例２と同じ条件にて再度ゲル濾過（ＦＰＬＣ）を行い、画分ＩＩＩ−１：Ｆｒ．１３−１５、ＩＩＩ−２：Ｆｒ．１６−１８、ＩＩＩ−３：Ｆｒ．１９−２１、ＩＩＩ−４：Ｆｒ．２２−２４の４画分に分画した。各画分を収集し、８０〜１００℃で蒸発乾固し、１．０ｍｌの水で溶解した。実施例１で得られた酵素分解物上澄みのＦＰＬＣによる溶出パターンを図２に示した。
【００４４】
得られたＩＩＩ−１〜ＩＩＩ−４画分のローリー法による回収率を表５に、また、各画分のＡＣＥ阻害活性を表６に示した。その結果、多くの活性が画分ＩＩＩ−３：Ｆｒ．１９−２１に認められた。
【００４５】
【００４６】
【００４７】
◎実施例４（ＩＩＩ−３画分の逆相クロマトによる分画）
実施例３にて得られたＡＣＥ阻害活性の強いＩＩＩ−３画分から、逆相カラムを用いたＨＰＬＣにてＡＣＥ阻害関与ペプチドを精製した。
まず、ＩＩＩ−３画分の０．１％溶液を５０μｌを表７の条件にてＨＰＬＣに供し、図３の溶出パターンに示す通り、Ｏ．Ｄ．２２０ｎｍで検出した。この中で１４．４８分のピークに高いＡＣＥ阻害活性を認めたので、このピークを分取した。
【００４８】
【００４９】
◎実施例５（１４．４８分ピーク物質の逆相クロマトによる精製）
次に、１４．４８分のピークを採取後、表８の条件にてさらにＨＰＬＣに供し、図４の溶出パターンに示す通り、ピーク１〜３が検出され、ピーク１にＡＣＥ阻害活性が認められた。このピークを分取し、表９に示す条件にてゲルろ過に供したところ、図５の溶出パターンに示す通り、分子量３００の単一ピークが得られた。このピーク１について、アミノ酸シーケンサーでアミノ酸配列を調べた結果、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（以下、「ＬＡＰ」と略する。）の配列からなるトリペプチドであることが判明した。
【００５０】
【００５１】
【００５２】
精製されたＬＡＰの濃度をＴＮＢＳ法で測定し、濃度当りの逆相ＨＰＬＣのピーク面積を求めると１μＭの溶液を５０μｌ注入した場合、ピーク面積は約２８０００を示した。これをもとに各画分の回収率及びピーク面積から分解物中に含まれるＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏトリペプチドの量を計算した。
【００５３】
ＩＩＩ−３画分：０．１％液５０μｌ注入でピーク面積１１６万であるので、０．１％液の本トリペプチドの濃度は、１１６万×０．７（純度）÷２．８万＝２９μＭ＝８．７μｇ／ｍｌとなり、蛋白質固形分当りの含有量は、８．７ｍｇ／ｇ（ＩＩＩ−３画分）となる。ＩＩＩ−３画分の分解物上澄中の含有量は、７．７％なので、ＩＩＩ−３画分由来の本トリペプチドの分解物上澄中の蛋白質固形分当りの含有量は、０．６７ｍｇ／ｇ（分解物上澄）となる。また、ＩＶ画分もＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏトリペプチドが認められた。
【００５４】
ＩＶ画分：０．１％液５０μｌ注入でピーク面積１１０万であるので、０．１％液の本トリペプチドの濃度は、１１０万×０．３（純度）÷２．８万＝１２μＭ＝３．５μｇ／ｍｌとなり、蛋白質固形分当りの含有量は、３．５ｍｇ／ｇ（ＩＶ画分）となる。ＩＶ画分の分解物上澄中の含有量は、１１％なので、ＩＶ画分由来の本トリペプチドの分解物上澄中の蛋白質固形分当りの含有量は、０．３９ｍｇ／ｇ（分解物上澄）となる。この２画分由来のものを合わせると少なくとも分解物上澄中の蛋白質固形分１ｇ当りの本トリペプチドの含有量は、１．０６ｍｇとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
［図１］実施例２の蛋白質加水分解物上澄のゲルろ過（ＦＰＬＣ）による溶出パターンである。
［図２］実施例３の画分ＩＩＩのゲルろ過（ＦＰＬＣ）による溶出パターンである。
［図３］実施例４の画分ＩＩＩ−３の逆相ＨＰＬＣによる溶出パターンである。
［図４］実施例５のピーク１４．４８分の逆相ＨＰＬＣによる溶出パターンである。
［図５］実施例６のピーク１のゲルろ過ＨＰＬＣによる溶出パターンである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させた加水分解物又はその分画物からなるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物。
【請求項２】
アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドがＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチドである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全固形分あたりの粗蛋白質含量が４０重量％以上である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質あたりのレクチン含量が１０重量％以上である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
加水分解物又はその分画物中に含まれるペプチドの分子量が１００〜２０００である請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質１ｇあたりのＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチドの含量が、０．２ｍｇ以上である請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する血圧降下剤。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する血圧降下用健康食品。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物の、血圧降下剤又は血圧降下用健康食品製造における使用。
【請求項１０】
高血圧の改善に有効量の請求項１に記載の組成物を、高血圧の改善が必要な哺乳動物に与えることを特徴とする高血圧の改善方法。
【請求項１１】
大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物、又は該加熱凝集物をｐＨ４以下にさらして可溶物を除去したものにプロテアーゼを作用させ、不溶物を除去して大豆ホエー蛋白加水分解物を得ることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物の製造法。
【請求項１２】
大豆ホエー蛋白加水分解物からさらに分子量２００〜１０００のペプチドを分画する請求項１１に記載の組成物の製造法。
【請求項１】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させた加水分解物又はその分画物からなるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物。
【請求項２】
アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドがＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチドである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全固形分あたりの粗蛋白質含量が４０重量％以上である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質あたりのレクチン含量が１０重量％以上である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
加水分解物又はその分画物中に含まれるペプチドの分子量が１００〜２０００である請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質１ｇあたりのＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチドの含量が、０．２ｍｇ以上である請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する血圧降下剤。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する血圧降下用健康食品。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物の、血圧降下剤又は血圧降下用健康食品製造における使用。
【請求項１０】
高血圧の改善に有効量の請求項１に記載の組成物を、高血圧の改善が必要な哺乳動物に与えることを特徴とする高血圧の改善方法。
【請求項１１】
大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物、又は該加熱凝集物をｐＨ４以下にさらして可溶物を除去したものにプロテアーゼを作用させ、不溶物を除去して大豆ホエー蛋白加水分解物を得ることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物の製造法。
【請求項１２】
大豆ホエー蛋白加水分解物からさらに分子量２００〜１０００のペプチドを分画する請求項１１に記載の組成物の製造法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４０２７
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６３２７（Ｐ２００５−５０６３２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６５２７
【国際出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【出願人】（０００２３６７６８）不二製油株式会社 (386)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６５２７
【国際出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【出願人】（０００２３６７６８）不二製油株式会社 (386)
【Ｆターム（参考）】
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