シワ形成阻害剤
【課題】特定の属の植物から抽出された抽出物が皮膚真皮組織中のエラスターゼ活性、メイラード反応を優位に抑制することで、肌のシワ形成を抑える皮膚外用剤において、シモニロの抽出物を利用して得られる有効性の高いの外用剤を提供する。
【解決手段】シモニロの抽出物がエラスターゼ活性、メイラード反応を優位に抑制することがわかり、肌のシワ形成を抑えるのに有効な皮膚の外用剤を提供。
【解決手段】シモニロの抽出物がエラスターゼ活性、メイラード反応を優位に抑制することがわかり、肌のシワ形成を抑えるのに有効な皮膚の外用剤を提供。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明品は、特定の属の植物から抽出された抽出物が皮膚真皮組織中のエラスターゼ活性、メイラード反応を優位に抑制することで、肌のシワ形成を抑える皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
シモニロ（Conyza filaginoides）はキク科の植物でメキシコの植物で生薬として利用され、また化粧料の原料として公知されている。（特許文献１参照）
【０００３】
皮膚の組成は大きく三つに分類され、外層から表皮、真皮、皮下組織から形成されており、それぞれは身体の恒常維持、外界からの防御など、種々役割を担っている。なかでも、皮膚真皮の機能は、外界からの衝撃を吸収するいわばクッションの役割を果たしている。このクッションの効果、すなわち、真皮の厚さ、柔軟性は老化とともに失われていく傾向にあり、皮膚科学的にも皮膚のはりの消失にともない、しわ、たるみの発生が起こる。真皮の老化は、外観の老化に直結するものである。
【０００４】
真皮の構成成分は主に、コラーゲン、エラスチン、線維芽細胞でそのほとんどを占めており、老化とともにコラーゲン、エラスチンの劣化、減少あるいは変性により、はりの消失、しわ、たるみの形成などの老化症状が現れる。健常な真皮中ではコラーゲンおよびエラスチンは古くなったものは吸収・排出される一方、新たにコラーゲンおよびエラスチンが線維芽細胞から生産され、一定した質および量を恒常的に保っている。しかし、年齢を重ねると、外的および内的な要因において、その恒常性は崩れ、線維芽細胞由来のエラスターゼが必要以上にエラスチンを分解することにより、老化症状が促進する。
一方、肌は外界と皮膚内からの酸化に曝されており、その原因としては紫外線や乾燥、細胞の代謝の際に生じる活性酸素やフリーラジカルなどがあげられる。活性酸素やフリーラジカルはコラーゲン線維にたんぱく質と糖の化学結合を促進するという異常な架橋形成をもたらし（メイラード反応）、それによって真皮が硬直化し、本来の弾力性に富むはりが失われてしまう。この真皮の硬直化による肌のはりの低下は、他の種々の原因とあいまってしわを形成させる一因と考えられている。
【特許文献１】特開２００１−０４８７３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、有効性の高いシモニロの抽出物に関して有効に活用するために種々検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、シモニロにエラスターゼ活性、メイラード反応を優位に抑制することを見出した。更には皮膚外用剤としてのその効果が発せられると、シワ、たるみを予防・改善することがわかった。
【０００７】
シモニロの抽出物の形態はなんら限定されるものではないが、好ましくはシモニロ（全草）を陰乾し、粉砕後、抽出溶媒（例えばエタノール等のアルコール、水またはこれら混合）とともに、３日間浸漬または２時間１００度にて加温、冷却、ろ過した液を使用する。
【０００８】
試験例１；エラスターゼ活性阻害試験
繊維芽細胞をフラスコまたはシャーレ（100 mm）にて80〜90%コンフルエントになるまで培養後、無血清培地に交換し、0.4 ng/mLになるようにIL-1を加え、48時間培養する。培地を廃棄し、0.1 % Triton-X100／0.1 Mトリス-HCl緩衝液 pH 8.3にて細胞を剥離し、氷冷下で超音波処理を行い遠心分離した上澄みを酵素溶液とした。
試験は、サンプル（Sample）、バックグラウンド（BG）、コントロール（Cont.）、ブランク（BL）及び陽性対照（EDTA）で行った。
酵素溶液 178μL、サンプル20μLを500 μLエッペンチューブに入れ（BG、BLは酵素溶液の代わりに0.1 % Triton-X100／0.1 Mトリス-HCl緩衝液 pH 8.3を加える。Cont.とEDTAはサンプルの代わりに水もしくは100 mmol/L EDTA-2Na水溶液を加える）、37℃で保温した後、基質溶液（100 mM Suc-Ala-Ala-Ala-pNa メチル-2-ピロリドン溶媒） 2 μLを加え、37℃で1時間反応させる。酢酸 100μLを加え、反応停止後、卓上遠心機で遠心分離した上澄みの405 nmの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定し、以下の式にて阻害率を算出した。
【０００９】
【数１】
【００１０】
試験品は以下に示し、
シモニロＥ：シモニロ（全草）（２０ｇ）のエタノール（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
シモニロＥＷ：シモニロ（全草）（２０ｇ）の５０％エタノール−水（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
シモニロＷ：シモニロ（全草）（２０ｇ）の熱水（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
。試験結果を表１に示す。
【００１１】
【表１】
【００１２】
試験例２；メイラード反応阻害試験
メイラード反応の中間物であるケトアミンを測定するＮＢＴ還元法により、シモニロ(Conyza filaginoides)の抽出物についてメイラード反応阻害作用を調べた。水で調製した試験品50μｌに精製水100μｌ、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)500μｌを加え、２Ｍのグルコース水溶液を100μｌ添加した。さらに4mg/ml ＢＳＡ水溶液200μｌを添加、攪拌し、60℃で30時間インキュベートした。30時間後、反応液300μlに0.2mg/0.9ml[リン酸緩衝液（pH10.3）]NBT溶液を2.7ml添加、37℃で30分間インキュベートし、Abs.530nmにて吸光度(A)を測定した。同様に、BSA水溶液の代替として水を用いた場合の吸光度(B)、試験品の代替として水を用いた場合の吸光度(C)、BSA水溶液の代替として水をかつ試験品の代替として水を用いた場合の吸光度(D)を測定し、下記の数式よりメイラード反応阻害率(%)を算出した。
メイラード反応阻害率(%)=[1-(A-B)/(C-D)]×100
試験品は以下に示し、試験結果を表２に示す。
シモニロＥ：シモニロ（全草）（２０ｇ）のエタノール（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
シモニロＥＷ：シモニロ（全草）（２０ｇ）の５０％エタノール−水（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
シモニロＷ：シモニロ（全草）（２０ｇ）の熱水（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
なお、作用濃度は０．０１５％で行った。
【００１３】
【表２】
【００１４】
シモニロ(Conyza filaginoides)の抽出物は0.001〜10重量%で配合すれば阻害効果等を十分発揮することから、この濃度で配合することが望ましい。
【００１５】
本発明の皮膚外用剤は、常法に従い、通常の皮膚外用剤として知られる種々の形態の基材に配合して調製することができる。
【００１６】
外用剤の形態としては、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、水溶液、パック等の任意の剤形を選択することができる。
【００１７】
本発明の皮膚外用剤には、上記した必須成分の他に通常の外用剤に配合される成分、例えば、油剤、粉体、精製水、高分子化合物、ゲル化剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、酸化防止剤、色素、防腐剤、香料、美容成分を本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択して用いることができる。
【実施例】
【００１８】
次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらになんら制約されるものではない。また、使用した薬剤の抽出液についての抽出方法は何ら限定されるものではない。
実施例及び比較例の処方を表３から表５に示す。作成方法は常法により行った。なお、表３はローション、表４は美容液、表５はクリームの処方であり、配合量は重量部で示す。
【００１９】
【表３】
【００２０】
【表４】
【００２１】
【表５】
【００２２】
（注１）シモニロ抽出液１はシモニロ（全草乾燥物）１０ｇに精製水２００ｍｌを加えて１時間煮沸した後、ろ過した抽出液を用いた。
（注２）シモニロ抽出液２はシモニロ（全草乾燥物）１０ｇに精製水１００ｍｌとエタノール１００ｍｌを加えて３日間攪拌した後、ろ過した抽出液を用いた。
（注３）シモニロ抽出液３はシモニロ（全草乾燥物）１０ｇにエタノール２００ｍｌを加えて３日間攪拌した後、ろ過した抽出液を用いた。
（注４）加水分解コンキオリン液はコンキオリンを硫酸分解し、分子量１０００以下のものを用いた。
（注５）タブノキ抽出液はマチルス抽出液 [丸善製薬（株）製]を用いた。
（注６）ホオノキ抽出液はファルコレックスホオノキE[一丸ファルコス（株）製]を用いた。
（注７）グァバ抽出液はグァバの葉１０ｇにエタノール３００ｍｌを加えて５日間放置後、ろ過した抽出液を用いた。
（注８）西河柳抽出液は西河柳エキス[日本精化株]製]を用いた。
（注９）海藻抽出液はマリンパージ[一丸ファルコス（株）製]を用いた。
（注10）アカシア樹皮抽出液は樹皮１０ｇにエタノール３００ｍｌを加えて５日間放置後、ろ過した抽出液を用いた。
（注11）ムラヤコエンギイ抽出液はムラヤコエンギイ]抽出液[山川貿易（株）製を用いた。
（注12）オオバナサルスベリ抽出液はオオバナサルスベリ抽出液 [山川貿易（株）製]を用いた。
【００２３】
表３〜表５記載の実施例及び比較例の効果試験を実施した。試験方法は４５〜６４才の女性２０名をパネルとし、毎日朝と夜の２回、１２週間にわたって洗顔後に被験外用剤の適量を顔面に塗布した。塗布による肌悩み改善効果の結果を表６に示す。
【００２４】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
本発明品は、特定の属の植物から抽出された抽出物が皮膚真皮組織中のエラスターゼ活性、メイラード反応を優位に抑制することで、肌のシワ形成を抑える皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
シモニロ（Conyza filaginoides）はキク科の植物でメキシコの植物で生薬として利用され、また化粧料の原料として公知されている。（特許文献１参照）
【０００３】
皮膚の組成は大きく三つに分類され、外層から表皮、真皮、皮下組織から形成されており、それぞれは身体の恒常維持、外界からの防御など、種々役割を担っている。なかでも、皮膚真皮の機能は、外界からの衝撃を吸収するいわばクッションの役割を果たしている。このクッションの効果、すなわち、真皮の厚さ、柔軟性は老化とともに失われていく傾向にあり、皮膚科学的にも皮膚のはりの消失にともない、しわ、たるみの発生が起こる。真皮の老化は、外観の老化に直結するものである。
【０００４】
真皮の構成成分は主に、コラーゲン、エラスチン、線維芽細胞でそのほとんどを占めており、老化とともにコラーゲン、エラスチンの劣化、減少あるいは変性により、はりの消失、しわ、たるみの形成などの老化症状が現れる。健常な真皮中ではコラーゲンおよびエラスチンは古くなったものは吸収・排出される一方、新たにコラーゲンおよびエラスチンが線維芽細胞から生産され、一定した質および量を恒常的に保っている。しかし、年齢を重ねると、外的および内的な要因において、その恒常性は崩れ、線維芽細胞由来のエラスターゼが必要以上にエラスチンを分解することにより、老化症状が促進する。
一方、肌は外界と皮膚内からの酸化に曝されており、その原因としては紫外線や乾燥、細胞の代謝の際に生じる活性酸素やフリーラジカルなどがあげられる。活性酸素やフリーラジカルはコラーゲン線維にたんぱく質と糖の化学結合を促進するという異常な架橋形成をもたらし（メイラード反応）、それによって真皮が硬直化し、本来の弾力性に富むはりが失われてしまう。この真皮の硬直化による肌のはりの低下は、他の種々の原因とあいまってしわを形成させる一因と考えられている。
【特許文献１】特開２００１−０４８７３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、有効性の高いシモニロの抽出物に関して有効に活用するために種々検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、シモニロにエラスターゼ活性、メイラード反応を優位に抑制することを見出した。更には皮膚外用剤としてのその効果が発せられると、シワ、たるみを予防・改善することがわかった。
【０００７】
シモニロの抽出物の形態はなんら限定されるものではないが、好ましくはシモニロ（全草）を陰乾し、粉砕後、抽出溶媒（例えばエタノール等のアルコール、水またはこれら混合）とともに、３日間浸漬または２時間１００度にて加温、冷却、ろ過した液を使用する。
【０００８】
試験例１；エラスターゼ活性阻害試験
繊維芽細胞をフラスコまたはシャーレ（100 mm）にて80〜90%コンフルエントになるまで培養後、無血清培地に交換し、0.4 ng/mLになるようにIL-1を加え、48時間培養する。培地を廃棄し、0.1 % Triton-X100／0.1 Mトリス-HCl緩衝液 pH 8.3にて細胞を剥離し、氷冷下で超音波処理を行い遠心分離した上澄みを酵素溶液とした。
試験は、サンプル（Sample）、バックグラウンド（BG）、コントロール（Cont.）、ブランク（BL）及び陽性対照（EDTA）で行った。
酵素溶液 178μL、サンプル20μLを500 μLエッペンチューブに入れ（BG、BLは酵素溶液の代わりに0.1 % Triton-X100／0.1 Mトリス-HCl緩衝液 pH 8.3を加える。Cont.とEDTAはサンプルの代わりに水もしくは100 mmol/L EDTA-2Na水溶液を加える）、37℃で保温した後、基質溶液（100 mM Suc-Ala-Ala-Ala-pNa メチル-2-ピロリドン溶媒） 2 μLを加え、37℃で1時間反応させる。酢酸 100μLを加え、反応停止後、卓上遠心機で遠心分離した上澄みの405 nmの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定し、以下の式にて阻害率を算出した。
【０００９】
【数１】
【００１０】
試験品は以下に示し、
シモニロＥ：シモニロ（全草）（２０ｇ）のエタノール（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
シモニロＥＷ：シモニロ（全草）（２０ｇ）の５０％エタノール−水（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
シモニロＷ：シモニロ（全草）（２０ｇ）の熱水（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
。試験結果を表１に示す。
【００１１】
【表１】
【００１２】
試験例２；メイラード反応阻害試験
メイラード反応の中間物であるケトアミンを測定するＮＢＴ還元法により、シモニロ(Conyza filaginoides)の抽出物についてメイラード反応阻害作用を調べた。水で調製した試験品50μｌに精製水100μｌ、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)500μｌを加え、２Ｍのグルコース水溶液を100μｌ添加した。さらに4mg/ml ＢＳＡ水溶液200μｌを添加、攪拌し、60℃で30時間インキュベートした。30時間後、反応液300μlに0.2mg/0.9ml[リン酸緩衝液（pH10.3）]NBT溶液を2.7ml添加、37℃で30分間インキュベートし、Abs.530nmにて吸光度(A)を測定した。同様に、BSA水溶液の代替として水を用いた場合の吸光度(B)、試験品の代替として水を用いた場合の吸光度(C)、BSA水溶液の代替として水をかつ試験品の代替として水を用いた場合の吸光度(D)を測定し、下記の数式よりメイラード反応阻害率(%)を算出した。
メイラード反応阻害率(%)=[1-(A-B)/(C-D)]×100
試験品は以下に示し、試験結果を表２に示す。
シモニロＥ：シモニロ（全草）（２０ｇ）のエタノール（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
シモニロＥＷ：シモニロ（全草）（２０ｇ）の５０％エタノール−水（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
シモニロＷ：シモニロ（全草）（２０ｇ）の熱水（１００ml）エキス（凍結乾燥物）
なお、作用濃度は０．０１５％で行った。
【００１３】
【表２】
【００１４】
シモニロ(Conyza filaginoides)の抽出物は0.001〜10重量%で配合すれば阻害効果等を十分発揮することから、この濃度で配合することが望ましい。
【００１５】
本発明の皮膚外用剤は、常法に従い、通常の皮膚外用剤として知られる種々の形態の基材に配合して調製することができる。
【００１６】
外用剤の形態としては、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、水溶液、パック等の任意の剤形を選択することができる。
【００１７】
本発明の皮膚外用剤には、上記した必須成分の他に通常の外用剤に配合される成分、例えば、油剤、粉体、精製水、高分子化合物、ゲル化剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、酸化防止剤、色素、防腐剤、香料、美容成分を本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択して用いることができる。
【実施例】
【００１８】
次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらになんら制約されるものではない。また、使用した薬剤の抽出液についての抽出方法は何ら限定されるものではない。
実施例及び比較例の処方を表３から表５に示す。作成方法は常法により行った。なお、表３はローション、表４は美容液、表５はクリームの処方であり、配合量は重量部で示す。
【００１９】
【表３】
【００２０】
【表４】
【００２１】
【表５】
【００２２】
（注１）シモニロ抽出液１はシモニロ（全草乾燥物）１０ｇに精製水２００ｍｌを加えて１時間煮沸した後、ろ過した抽出液を用いた。
（注２）シモニロ抽出液２はシモニロ（全草乾燥物）１０ｇに精製水１００ｍｌとエタノール１００ｍｌを加えて３日間攪拌した後、ろ過した抽出液を用いた。
（注３）シモニロ抽出液３はシモニロ（全草乾燥物）１０ｇにエタノール２００ｍｌを加えて３日間攪拌した後、ろ過した抽出液を用いた。
（注４）加水分解コンキオリン液はコンキオリンを硫酸分解し、分子量１０００以下のものを用いた。
（注５）タブノキ抽出液はマチルス抽出液 [丸善製薬（株）製]を用いた。
（注６）ホオノキ抽出液はファルコレックスホオノキE[一丸ファルコス（株）製]を用いた。
（注７）グァバ抽出液はグァバの葉１０ｇにエタノール３００ｍｌを加えて５日間放置後、ろ過した抽出液を用いた。
（注８）西河柳抽出液は西河柳エキス[日本精化株]製]を用いた。
（注９）海藻抽出液はマリンパージ[一丸ファルコス（株）製]を用いた。
（注10）アカシア樹皮抽出液は樹皮１０ｇにエタノール３００ｍｌを加えて５日間放置後、ろ過した抽出液を用いた。
（注11）ムラヤコエンギイ抽出液はムラヤコエンギイ]抽出液[山川貿易（株）製を用いた。
（注12）オオバナサルスベリ抽出液はオオバナサルスベリ抽出液 [山川貿易（株）製]を用いた。
【００２３】
表３〜表５記載の実施例及び比較例の効果試験を実施した。試験方法は４５〜６４才の女性２０名をパネルとし、毎日朝と夜の２回、１２週間にわたって洗顔後に被験外用剤の適量を顔面に塗布した。塗布による肌悩み改善効果の結果を表６に示す。
【００２４】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シモニロ(Conyza filaginoides)の抽出物を配合することを特徴とするシワ形成阻害剤
【請求項２】
シモニロ(Conyza filaginoides)の抽出物を配合することを特徴とするエラスターゼ活性阻害剤
【請求項３】
シモニロ(Conyza filaginoides)の抽出物を配合することを特徴とするメイラード反応抑制剤
【請求項１】
シモニロ(Conyza filaginoides)の抽出物を配合することを特徴とするシワ形成阻害剤
【請求項２】
シモニロ(Conyza filaginoides)の抽出物を配合することを特徴とするエラスターゼ活性阻害剤
【請求項３】
シモニロ(Conyza filaginoides)の抽出物を配合することを特徴とするメイラード反応抑制剤
【公開番号】特開２００６−２１９４４７（Ｐ２００６−２１９４４７Ａ）
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３５９２５（Ｐ２００５−３５９２５）
【出願日】平成１７年２月１４日（２００５．２．１４）
【出願人】（０００１６６９５９）御木本製薬株式会社 (66)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１４日（２００５．２．１４）
【出願人】（０００１６６９５９）御木本製薬株式会社 (66)
【Ｆターム（参考）】
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