プラスミドの維持
本発明は、プラスミドの安定した維持のための系、この系において用いるための宿主細胞、ならびに医療への適用において有用なプラスミドを得るためにこの系を用いる方法に関する。特に、本発明は、インビボでの宿主細胞におけるプラスミドの安定した維持のための方法を提供する。例えば、本発明の宿主細胞は、形質転換された宿主細胞であって、ｉ）細胞増殖を阻害する染色体遺伝子；およびｉｉ）アンチセンス配列をコードするプラスミド、を含み、該プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、該染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を許容する、形質転換された宿主細胞である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、プラスミドの安定した維持のための系、この系においての使用のための宿主細胞、ならびに医療への適用において有用なプラスミドを得るためにこの系を用いる方法に関する。
【０００２】
本明細書において引用される全ての文献は、参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
プラスミドは、組換えタンパク質の調製においておよび遺伝子治療目的のためのＤＮＡの調製において、慣用的に用いられる。宿主細胞内のプラスミドの安定した維持は、これらの産物の効率的な調製のために重要である。しかし、宿主細胞において運ばれる染色体外ＤＮＡは、プラスミドを含む細胞での、プラスミドが無い細胞に比べて増大した代謝的負荷に起因して、もともと不安定である。プラスミドの安定性を維持し代謝的負荷を軽減するため、プラスミドは、優性な選択マーカーを含むように操作されている。
【０００４】
培養中の細胞内にプラスミドを維持する従来の方法は、抗生物質耐性遺伝子をそのプラスミドに含め、そして適切な抗生物質の存在中でその細胞を培養することである。治療用途が意図される細胞もしくはプラスミドに関して、このことは、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドの使用が抗生物質耐性の拡がりの一因になり得るという不利益を有する。
【０００５】
いくつかのプラスミド維持法は、プラスミドによって運ばれる遺伝子（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ ｇｅｎｅ）によって制御される天然に存在する分離後殺傷（ｐｏｓｔ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）機構を利用することを試みてきた。例えば、ｈｏｋ／ｓｏｋ系、ｓｒｎＢ系、およびｐｎｄ系は、キラー（ｋｉｌｌｅｒ）タンパク質を含み、そのキラータンパク質は、安定なｍＲＮＡによってコードされ、キラーＲＮＡに結合してキラーＲＮＡを不活性化する小さい不安定なアンチセンスＲＮＡによって調節される。キラーＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡが分解された後、プラスミドが無い分離体（ｓｅｇｒｅｇａｎｔ）において保持され、致死タンパク質へと翻訳される。ｈｏｋ／ｓｏｋ系を用いるプラスミド維持は、弱毒化生ベクターワクチン株Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ＣＤＶ９０８ ｈｔｒ−Ａ（非特許文献１）において研究された。しかし、そのような分離後殺傷機構は、形質転換後のプラスミド選択を可能とせず、ゆえに依然としてプラスミドにおける抗生物質耐性遺伝子の存在に依存している。
【０００６】
抗生物質選択を用いずにプラスミドを維持するためおよびプラスミドを選択するためのいくつかの代替的な方法が開発されてきており、それらの方法においては、プラスミドが宿主細胞の栄養要求性を補完する遺伝子をコードする。例えば、宿主細胞は、必須アミノ酸代謝産物を合成することが出来ず、このアミノ酸の合成のための失われたエレメントをコードしている遺伝子を含むプラスミドが存在する場合においてのみ、そのアミノ酸を欠乏している培地中で生存し得る、変異細胞であり得る（非特許文献２）。しかし、このアプローチは、そのアミノ酸が省かれなければならないために、増殖培地の組成を制限する。複雑な培地において用いられ得る代替的な方法は、温度感受性のｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子を有する変異宿主細胞を用いる。この変異宿主細胞は、野生型ｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子を含むプラスミドが存在する場合のみ、非許容（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）温度で生存し得る（非特許文献３）。別の選択方法は、変異宿主細胞における必須な染色体遺伝子中のナンセンス変異を補完するプラスミドによって運ばれるｔＲＮＡ遺伝子を用いる（非特許文献４）。あるいは、ｐｉｌオペロンのような、細胞に対する代謝的負荷を増大する遺伝子が、対応するリプレッサータンパク質をコードするプラスミドの存在する場合においてのみ宿主細胞が生存するように、宿主の染色体に配置され得る（非特許文献５）。
【０００７】
特許文献１は、インビトロ培養中の宿主細胞内のプラスミドをオペレーターリプレッサータイトレーション（ｏｐｅｒａｔｏｒ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって維持する方法を説明している。その方法は、その宿主細胞が、リプレッサーをコードする第一の染色体遺伝子、および、その調節領域においてリプレッサーについてのオペレーター配列を有する細胞増殖のために必須である第二の染色体遺伝子を含むようにする、宿主細胞の操作を伴う。プラスミドが存在しない場合、第二の染色体遺伝子の発現は、リプレッサーのオペレーターへの結合によって阻害され、そしてその細胞は死ぬ。この宿主細胞における維持のためのプラスミドは、オペレーター配列を含むように操作されており、その結果、プラスミドが存在する場合、リプレッサーは細胞増殖のために必須である遺伝子のオペレーターから結合除去（ｔｉｔｒａｔｅ ａｗａｙ）され、その遺伝子が発現されその細胞が生存する。この機構はまた、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（非特許文献６）に、およびＣｒａｎｅｎｂｕｒｇｈら(非特許文献７）に、記載される。
【特許文献１】欧州特許第０８５１９３２号明細書
【非特許文献１】Ｇａｌｅｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９年、第６７巻、ｐ．６４２４−６４３３
【非特許文献２】Ｗａｎｇ Ｍ−Ｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７年、第１６９巻、ｐ．５６１０−５６１４
【非特許文献３】Ｓｋｏｇｍａｎら、Ｇｅｎｅ，１９８４年、第３１巻、ｐ．１１７−１２２
【非特許文献４】Ｚｅｎｇｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８１年、第１４５巻、ｐ．４５９−４６５
【非特許文献５】Ｏｇｄｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９２年、第４０巻、ｐ．１０２７−１０３８
【非特許文献６】Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９年、第２６巻、第９号、ｐ．２１２０−２１２４
【非特許文献７】Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１年、第２９巻、第５号、ｐ．ｅ２６−ｅ２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗生物質選択に依存しないプラスミドの維持および選択のいくつかの機構は公知であるが、治療への適用のためのＤＮＡおよび組換えタンパク質の産生におけるプラスミドの重要性が増大していることを考慮して、さらなる方法の開発についての必要性は存続する。加えて、今までに開発された、プラスミドの維持および選択の系は、これらの系における使用のために特別に改変されているプラスミドの使用を必要とする。抗生物質耐性を伴わず、当該分野において一般的であり特別な改変を必要としないプラスミドを使用する、プラスミドの維持および選択の系についての必要性が存続する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の第一の局面に従って、形質転換された宿主細胞が提供される。その宿主細胞は、
ｉ）細胞増殖を阻害する染色体遺伝子；および
ｉｉ）アンチセンス配列をコードするプラスミド
を含み、上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、上記染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を許容する。
【００１０】
上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、このプラスミドの他の領域によってコードされてもよいが、好ましくはこのプラスミドの複製起点によってコードされる。
【００１１】
本明細書において用いられる場合、用語「アンチセンス配列」とは、核酸配列であって、その核酸配列の標的配列に対して実質的に相補的であり、その標的配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する核酸配列を、指す。好ましくは、上記のプラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、ストリンジェントな条件下でそのアンチセンス配列の標的配列にハイブリダイズする。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、以下のように定義される：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％のデキストラン硫酸、および２０マイクログラム／ｍｌの変性剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、４２℃での一晩のインキュベーションと、その後の０．１×ＳＳＣ中でのおよそ６５℃でのフィルターの洗浄。
【００１２】
本明細書において用いられる場合、「細胞増殖」とは、培養培地中の細胞数の経時的な増加、および、生細胞の数が経時的に減少しない場合は、細胞の生存率を、指す。「細胞増殖を阻害する」によって、染色体遺伝子が細胞にとって致死性であり、その結果、培養培地中の生細胞の数が経時的に減少すること、または、染色体遺伝子が細胞増殖を妨げ、その結果、培養培地中の細胞の数が時間にわたって増加しないことが、意味される。
【００１３】
本発明のこの第一の局面に従う形質転換された宿主細胞の増殖は、プラスミドの存在に依存しており、このプラスミドを維持する細胞の選択をもたらす。宿主細胞からこのプラスミドが失われた場合、この染色体遺伝子の作用はもはやプラスミドによってコードされるアンチセンス配列によって妨げられず、細胞増殖が阻害される。いくつかの実施形態において、この染色体遺伝子の発現が阻害され、それによって細胞増殖を許容するためには、ほんの１コピー（ｃｏｐｙ）のこのプラスミドが必要であり得る。他の実施形態において、染色体遺伝子の発現が阻害されるために、プラスミドが複数コピーで存在することが必要であり得る。
【００１４】
この染色体遺伝子は、細胞増殖を直接的に阻害し得る。例えば、この染色体遺伝子の転写および翻訳は、トキシンのような、細胞にとって致死性のタンパク質を産生し得る。あるいは、この染色体遺伝子は、細胞増殖を間接的に阻害し得る。例えば、この染色体遺伝子の転写および翻訳は、第二の染色体遺伝子によってコードされる細胞増殖のために必須であるタンパク質の転写および翻訳を阻害するリプレッサータンパク質を、産生し得る。この染色体遺伝子の転写はまた、細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子の転写および／もしくは翻訳を、第二の染色体遺伝子に結合することまたは第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することのいずれかによって阻害するアンチセンス配列を、産生し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態において、この染色体遺伝子は、より複雑な反応カスケードによって細胞増殖を阻害し得る。例えば、この染色体遺伝子は、第二の染色体遺伝子の発現を活性化するアクチベータータンパク質をコードし得、この第二の染色体遺伝子は、次に、細胞増殖のために必須なタンパク質をコードする第三の染色体遺伝子の発現を阻害するリプレッサータンパク質をコードする。あるいは、第一の染色体遺伝子は、第二の染色体遺伝子のアンチセンスインヒビターをコードし得、この第二の染色体遺伝子のアンチセンスインヒビターは、次に、細胞増殖を阻害するタンパク質をコードする第三の染色体遺伝子の発現を抑制するリプレッサータンパク質をコードする。そのようなカスケードは三つより多くの染色体遺伝子を含み得る。例えば、そのようなカスケードは、４、５、６、７もしくはそれより多くの染色体遺伝子を含み得る。そのようなカスケードの全てにおいて、第一の染色体遺伝子を阻害するプラスミドが存在しないことにより、第一の染色体遺伝子にカスケード反応を開始させ、このことから最終的に細胞増殖の阻害がもたらされる。細胞増殖を阻害する適切な染色体遺伝子の例は、本明細書において提供される。
【００１６】
本発明の形質転換された宿主細胞は、好ましくは、治療用途が意図されるプラスミドを維持するために用いられる。従って、このプラスミドが目的の遺伝子の挿入のためのクローニング部位を含むことが、好ましい。好ましくは、このプラスミドはさらに、目的の遺伝子を含む。この目的の遺伝子は哺乳類細胞において、好ましくはヒト細胞において、発現し得ることが好ましい。この目的の遺伝子は、治療用途のために、目的のＲＮＡもしくは目的のタンパク質を発現し得る。プラスミドに含まれ得るそのような目的の遺伝子の例は、当該分野において公知であり、本明細書において提供される。
【００１７】
上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、上記染色体遺伝子自体に結合することによってこの染色体遺伝子の作用を阻害し得、それによってこの遺伝子の転写を阻害し得る。あるいは、上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、上記染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによってこの染色体遺伝子の作用を阻害し得る。この染色体遺伝子の性質に依存して、この染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡへの結合は、この染色体遺伝子の翻訳を阻害し得るか、もしくはこの染色体遺伝子にコードされるアンチセンス配列がこのアンチセンス配列の標的へ結合するのを妨ぎ得る。
【００１８】
本発明の第一の局面の好ましい実施形態において、調節配列は、上記染色体遺伝子と作動的（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）に連結される。「作動的に連結される」によって、この調節配列が、読み枠をあわせて（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）この染色体遺伝子と連結され、その結果、この調節配列がこの染色体遺伝子と同時に転写されることが、意味される。好ましくは、この調節配列は、この染色体遺伝子の上流に作動的に連結される。しかし、あるいはこの調節配列は、この染色体遺伝子の下流に作動的に連結されてもよい。この調節配列がこの染色体遺伝子の上流に作動的に連結された場合、この調節配列は、好ましくはリボソーム結合部位内に挿入される。あるいは、この調節配列は、リボソーム結合部位の上流に挿入されてもよい。この染色体遺伝子もしくは調節遺伝子に作動的に連結されたこの染色体遺伝子は、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。好ましくは、この染色体遺伝子もしくは調節遺伝子に作動的に連結されたこの染色体遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にある。
【００１９】
上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、この調節配列に結合することによってもしくはこの調節配列から転写されたｍＲＮＡに結合することによって、上記染色体遺伝子の作用を阻害し得る。本発明のこの実施形態において、上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、好ましくはこのプラスミドの複製起点によってコードされる。
【００２０】
全てのプラスミドの複製起点は、転写されたＲＮＡを産生する。いくつかの場合において、プラスミド（例えば、プラスミドＲ１、プラスミドＲＫ６、プラスミドｐＴ１８１、プラスミドｐＭＶ１５８、およびプラスミドｐＩＰ５０１）の複製起点から転写されたＲＮＡは、複製の調節に直接的に用いられる。他の場合において、転写されたＲＮＡは、翻訳されてプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＰＳ１０、ｐ１５Ａ、Ｆ、Ｒ１００、Ｒ４５３、Ｐ１、ＲＫ２、ＲＡ１、ＲＳＦ１０１１０、ｐＣｏｌＩＶ−Ｋ３０、ＣｏｌＥ２、ＣＯｌＥ３、Ｒｔｓ１、ｐＬＳ２０、およびｐＵＢ１１０）の複製のために必要とされるタンパク質を提供する（Ｓｏｌａｒら、１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：４３４−３６３を参照）。
【００２１】
本発明は、上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列がこれらのプラスミドのうちのいずれか一つの複製起点から転写されるＲＮＡである、形質転換された宿主細胞を含む。この実施形態によると、上記染色体遺伝子に作動的に連結された調節配列、もしくはこの調節配列から転写されるｍＲＮＡは、このプラスミドの複製起点から転写されるＲＮＡに対してアンチセンスである。このプラスミドが存在しない場合において、この染色体遺伝子に作動的に連結された調節配列は、転写され、そして／もしくは翻訳され、細胞増殖の阻害をもたらす。プラスミドが存在する場合において、複製起点から転写されるＲＮＡは、この染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を可能にする。
【００２２】
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、ＲＮＡＩであり、上記染色体遺伝子の上流にある調節配列は、ＲＮＡＩＩもしくはその一部をコードする。あるいは、このプラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、ＲＮＡＩＩであり、この染色体遺伝子の上流にある調節配列は、ＲＮＡＩもしくはその一部をコードする。
【００２３】
ＲＮＡＩおよびＲＮＡＩＩは、研究用途および商業的用途の事実上全てのプラスミドの複製起点によってコードされる、二つの重なるＲＮＡ転写産物である。ＲＮＡＩＩは、プラスミドＤＮＡ合成の開始を始め、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて自律的プラスミド複製がおこることを可能にする。ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩのアンチセンスインヒビターであり、過剰のプラスミド複製を妨げ、プラスミドのコピー数が、宿主細胞によって支持され得る数を上回らないことを保証する。現在、このアンチセンス機構が、形質転換された宿主細胞におけるプラスミド維持を促進するために利用され得ることが、見出されている。
【００２４】
この実施形態によれば、本発明は、形質転換された宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、
ｉ）染色体遺伝子に作動的に連結された、ＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部であって、その染色体遺伝子は細胞増殖を阻害する、ＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部：および
ｉｉ）ＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部を含む、プラスミド、
を含み、上記ＲＮＡＩコード領域もしくは上記ＲＮＡＩコード領域の一部から転写されるＲＮＡＩは、上記ＲＮＡＩＩコード領域もしくは上記ＲＮＡＩＩコード領域の一部から転写されるＲＮＡＩＩに結合し、上記染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を許容する。
【００２５】
上記染色体遺伝子に作動的に連結されたＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部は、転写されて、ＲＮＡＩＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡが生成される。ＲＮＡＩをコードするプラスミドが存在しない場合において、細胞増殖は阻害される。細胞増殖は、このＲＮＡＩＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡが、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子もしくはそのような第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによって阻害され得る。あるいは、このＲＮＡＩＩ−染色体遺伝子は翻訳され得、そしてこの染色体遺伝子によってコードされる毒性タンパク質により、もしくは、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子を阻害する、この染色体遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質により、細胞増殖が阻害され得る。このプラスミドが存在する場合において、このプラスミドから転写されたＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡ中のＲＮＡＩＩに結合し、染色体遺伝子が細胞増殖を阻害することを防ぐ。
【００２６】
本発明はさらに、形質転換された宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、
ｉ）染色体遺伝子に作動的に連結されたＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部であって、この染色体遺伝子は細胞増殖を阻害する、ＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部：および
ｉｉ）ＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部を含む、プラスミド、
を含み、上記ＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部から転写されるＲＮＡＩＩは、上記ＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部から転写されるＲＮＡＩに結合し、上記染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を許容する。
【００２７】
上記の染色体遺伝子に作動的に連結されたＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部は、転写されて、ＲＮＡＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡを生成する。ＲＮＡＩＩをコードするプラスミドが存在しない場合において、細胞増殖は阻害される。細胞増殖は、このＲＮＡＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡが、細胞増殖に必須な第二の染色体遺伝子もしくはそのような第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによって、阻害され得る。あるいは、このＲＮＡＩ−染色体遺伝子は翻訳され得、この染色体遺伝子によってコードされる毒性タンパク質によって、もしくは、細胞増殖に必須な第二の染色体遺伝子を阻害する、この染色体遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質によって、細胞増殖が阻害され得る。このプラスミドが存在する場合、このプラスミドから転写されるＲＮＡＩＩは、ＲＮＡＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡ中のＲＮＡＩに結合し、この染色体遺伝子が細胞増殖を阻害することを妨げる。
【００２８】
全てのプラスミドは、複製起点から転写されるＲＮＡを産生し、ほとんどの商業的に入手し得るプラスミドは、ＲＮＡＩコード領域およびＲＮＡＩＩコード領域を含む複製起点を含む。用いられるプラスミド内へのｌａｃオペレーター系のクローニングにプラスミドの維持を依存している、ＥＰ０８５１９３２において開示される系とは異なり、本発明は、形質転換される宿主細胞における、任意の複製起点を含む任意の商業的に入手し得るプラスミドの維持を可能にし、これらのプラスミド内に任意のさらなる配列をクローニングすることを必要とせずに、これらのプラスミドを維持する宿主細胞の選択を可能にする。このことは、プラスミドの大きさが縮小されて、ＤＮＡワクチンおよび遺伝子治療への適用におけるプラスミドの有効用量を増加するという利点を有する。不必要な細菌ＤＮＡの除去もまた、ＣｐＧジヌクレオチドに対する、免疫応答の危険性を低下させる。
【００２９】
加えて、プラスミドの維持は、抗生物質選択を用いずに達成され得る。このプラスミドは、それゆえに、抗生物質耐性遺伝子の存在を必要としない。このプラスミドに抗生物質耐性遺伝子が存在しないことは、特にこのプラスミドもしくはこのプラスミドによってコードされる産物が治療に用いられることが意図される状況において、多くの利点を有している。第一に、このプラスミドに抗生物質耐性遺伝子が存在しないことは、抗生物質耐性遺伝子が潜在的な病原体を含めた環境内生物体に移動する危険性を取り除く。このプラスミドに抗生物質耐性遺伝子が存在しないことは、また、細胞から単離されたプラスミドがプラスミド選択のために用いられた残留抗生物質によって汚染されることを防止し、従って、残留抗生物質の存在についてプラスミドを試験する必要性、および抗生物質耐性遺伝子が患者の細胞において有害な効果をもたらす危険性を、取り除く。選択が抗生物質耐性に依存しないという事実は、培養中の抗生物質分解に起因するプラスミド選択圧の欠如の問題を回避する。
【００３０】
本発明において使用するためのプラスミドとしては、複製起点から転写されるＲＮＡが複製の調節に直接的に用いられるプラスミド（例えば、プラスミドＲ１、ＲＫ６、ｐＴ１８１、ｐＭＶ１５８、およびｐＩＰ５０１）、および、複製起点から転写されるＲＮＡが翻訳されてプラスミドの複製のために必要とされるタンパク質を提供するプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＰＳ１０、ｐ１５Ａ、Ｆ、Ｒ１００、Ｒ４５３、Ｐ１、ＲＫ２、ＲＡ１、ＲＳＦ１０１１０、ｐＣｏｌＩＶ−Ｋ３０、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、Ｒｔｓ１、ｐＬＳ２０、およびｐＵＢ１１０）が挙げられる。好ましくは、本発明において使用するためのプラスミドは、ＲＮＡＩコード領域およびＲＮＡＩＩコード領域を含む複製起点を、含む。ＲＮＡＩコード領域およびＲＮＡＩＩコード領域を含む複製起点を含むプラスミドとしては、ＣｏｌＥ１ｏｒｉおよびｐＭＢ１ｏｒｉのような、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉを含むプラスミドが挙げられる。
【００３１】
細胞増殖を阻害する染色体遺伝子に作動的に連結された、ＲＮＡＩＩコード領域、ＲＮＡＩコード領域、もしくはそれらの一部は、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。好ましくは、細胞増殖を阻害する染色体遺伝子に作動的に連結された、ＲＮＡＩＩコード領域、ＲＮＡＩコード領域、もしくはそれらの一部は、構成的プロモーターの制御下にある。適切な構成的プロモーターは、当該分野において公知であり、適切な構成的プロモーターとしては、例えば、ｔｒｃプロモーターのようなＥ．ｃｏｌｉプロモーターからの−３５配列および−１０配列を含むプロモーターが挙げられる。
【００３２】
本発明の第二の局面によれば、細胞増殖を阻害する染色体遺伝子を含む宿主細胞が提供され、この染色体遺伝子は、その上流に位置する調節配列に作動的に連結されており、この調節配列は、プラスミドの複製起点から転写されるＲＮＡの配列に対してアンチセンスである配列を含むか、もしくは、この調節配列は、プラスミド複製起点から転写されるＲＮＡの配列に対してアンチセンスであるＲＮＡ配列をコードする。この調節配列の性質は、この宿主細胞が形質転換されることが意図されるプラスミドの特性に依存する。適切なプラスミド複製起点の例は、上記に提供される。これらの複製起点から転写されるＲＮＡに対してアンチセンスである調節配列を設計する方法は、当業者にとって明らかである。
【００３３】
好ましくは、この調節配列は、ＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部、またはＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部を含む。細胞増殖を阻害する染色体遺伝子に作動的に連結された、これらのＲＮＡＩＩコード領域、ＲＮＡＩコード領域、もしくはそれらの一部は、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。好ましくは、細胞増殖を阻害する染色体遺伝子に作動的に連結された、これらのＲＮＡＩＩコード領域、ＲＮＡＩコード領域、もしくはそれらの一部は、構成的プロモーターの制御下にある。適切な構成的プロモーターは、当該分野において公知であり、適切な構成的プロモーターとしては、例えば、ｔｒｃプロモーターのような、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターからの−３５配列および−１０配列を含むプロモーターが挙げられる。
【００３４】
本発明のこの第二の局面による宿主細胞は、本発明の第一の局面による形質転換された宿主細胞を産生するために、ＲＮＡＩコード領域およびＲＮＡＩＩコード領域を含むプラスミドを用いて形質転換されてもよい。
【００３５】
本発明のこの宿主細胞および形質転換された宿主細胞は、インビトロにおいて培養中であってもよい。適切な宿主細胞の例は、本明細書中に提供される。
【００３６】
本発明の第三の局面によれば、インビトロで宿主細胞内にプラスミドを維持する方法が提供され、この方法は、上記において記載されるように形質転換された宿主細胞を、この細胞が増殖することを許容するのに十分な条件下で培養する工程を含む。この方法は、抗生物質耐性が存在しない場合において、プラスミドの維持および選択が行われることを可能にし、このことは、この方法を治療への適用のためのプラスミドＤＮＡもしくは組換えタンパク質の産生のために特に適切にする。本発明の第四の局面によれば、プラスミドＤＮＡを産生する方法が提供され、この方法は、本発明の第三の局面の方法をおこなう工程およびプラスミドＤＮＡを単離する工程を包含する。本発明の第五の局面によれば、組換えタンパク質を産生する方法が提供され、この方法は、本発明の第三の局面の方法に従う目的のタンパク質をコードするプラスミドを含む形質転換された宿主細胞を培養する工程、およびそのタンパク質をその細胞から単離する工程、を包含する。
【００３７】
本発明の形質転換された宿主細胞および宿主細胞は、それら自体が治療への適用を有し得る。本発明の第六の局面によれば、治療における使用のための、本発明の第一の局面による形質転換された宿主細胞が提供される。
【００３８】
本発明の第七の局面によれば、薬学的組成物が提供され、この薬学的組成物は、本発明の第一の局面による形質転換された宿主細胞と、それに加えて、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤もしくは緩衝剤（例えば、当業者にとって周知である薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤もしくは緩衝剤）を含む。この局面の一つの実施形態によれば、この薬学的組成物は、ワクチン組成物である。このワクチン組成物は、賦形剤、希釈剤もしくは緩衝剤に加えて、一つ以上のアジュバントを含んでもよい。
【００３９】
本発明の第八の局面によれば、薬の製造において、本発明の第一の局面による形質転換された宿主細胞の使用が、提供される。好ましくは、この形質転換された宿主細胞は、遺伝子送達系として用いられてもよい。例えば、この形質転換された宿主細胞は、遺伝子治療目的でプラスミドにある目的の遺伝子を送達するために用いられてもよい。この形質転換された細胞はまた、プラスミドにある目的の（その転写産物が治療的効果を有する）遺伝子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を送達するために、もしくは治療的効果を有するタンパク質をコードする目的の遺伝子を送達するために、用いられてもよい。
【００４０】
あるいは、この形質転換された宿主細胞は、免疫原を送達するために用いられてもよい。この実施形態において、プラスミドにある目的の遺伝子は、免疫応答を惹起する一つ以上の抗原をコードしてもよい。当業者は、免疫応答を惹起する抗原をコードしていて本発明の形質転換された細胞内のプラスミドに含まれ得る、目的の遺伝子が分かる。
【００４１】
本発明の第九の局面によれば、処置の方法が提供され、この処置の方法は、上記に記載された形質転換された宿主細胞、もしくはそれらを含む組成物を患者に投与する工程を、包含する。特に、目的の遺伝子を患者に送達する方法が提供され、この方法は、上記に記載される形質転換された宿主細胞もしくはそれらを含む組成物を患者に投与する工程を、包含する。上記に記載されるように、形質転換された宿主細胞内のプラスミドにある目的の遺伝子は、それ自体が遺伝子治療目的のために有用であってもよく、または、この目的の遺伝子の転写産物もしくは転写および翻訳の産物が、治療的特性を有してもよい。
【００４２】
本発明の第十の局面によれば、病原体によって引き起こされる疾患に対して患者を免疫化する方法が提供され、この方法は、上記に記載される形質転換された宿主細胞もしくはそれらを含む組成物を患者に投与する工程を、包含する。この細胞内のプラスミドにおいて見出される目的の遺伝子は、この病原体に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする。細胞の性質および目的の遺伝子の発現を制御するプロモーターの性質によって、この抗原はこの細胞が患者に投与される前にこの細胞において発現されてもよく、もしくは、投与後に患者において発現されるこの抗原と共に、このプラスミドを含む細胞が患者に投与されてもよい。好ましくは、上記で記載したように、この細胞は細菌細胞であり、この目的の遺伝子は、細菌のプロモーターもしくは真核細胞のプロモーターのいずれかに機能的に連結される。
【００４３】
本発明の第十一の局面によれば、インビボの宿主細胞内にプラスミドを維持する方法が提供され、この方法は、本発明の第一の局面による形質転換された宿主細胞をレシピエント生物体に供給する工程を包含する。好ましくは、このレシピエント生物体は哺乳類、好ましくはヒトである。本発明のこの局面によれば、上記染色体遺伝子は、好ましくは、インビボで細胞増殖を阻害し、その結果、このプラスミドを維持する宿主細胞のみが、レシピエント生物体においてインビボで生存する。例えば、この染色体遺伝子は、この細胞の完全性にとって必須であるタンパク質をコードする第二の染色体遺伝子についてのリプレッサータンパク質をコードしてもよい。
【００４４】
本発明における使用のために適切なプラスミドに運ばれる目的の遺伝子、宿主細胞、および細胞増殖を阻害する染色体遺伝子の例、ならびに本発明の形質転換された宿主細胞の医療への適用についての情報は、以下に提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
（染色体遺伝子）
本発明の宿主細胞および形質転換された宿主細胞内に含まれる染色体遺伝子は、増殖を阻害する任意の遺伝子であり得る。
【００４６】
（増殖を直接的に阻害する染色体遺伝子）
細胞増殖を直接的に阻害する好ましい染色体遺伝子としては、トキシンをコードする遺伝子が挙げられる。本発明において用いられ得る、トキシンをコードする遺伝子の例としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのｓａｃＢ遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉのＦプラスミド内のｃｃｄＢによってコードされるＣｃｄＢ、プラスミドＲＫ２からのｐａｒＤ遺伝子によってコードされるＫｉｄタンパク質、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子および抗生物質遺伝子が挙げられる。
【００４７】
（増殖のために必須の遺伝子を阻害することによって増殖を間接的に阻害する染色体遺伝子）
増殖を間接的に阻害する好ましい染色体遺伝子としては、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子を阻害するタンパク質リプレッサーをコードする染色体遺伝子、および、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子を阻害するアンチセンス配列をコードする染色体遺伝子が挙げられる。本発明の一つの実施形態において、この第二の染色体遺伝子は、細胞増殖のために条件的に必須である。
【００４８】
この染色体遺伝子がタンパク質リプレッサーをコードする場合、第二の染色体遺伝子は、好ましくは、そのリプレッサーによって従来的に阻害されるオペレーターおよびプロモーターに作動的に連結される。
【００４９】
例えば、この染色体遺伝子がタンパク質リプレッサーＬａｃＩをコードするならば、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子は、好ましくはｌａｃオペレーターおよびｌａｃプロモーターに作動的に連結される。Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃリプレッサーは、「Ｔｈｅ Ｌａｃｔｏｓｅ Ｏｐｅｒｏｎ」（Ｊ．Ｂｅｃｋｗｉｔｈ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍら編、１９８７年、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ．、１４４４〜１４５２頁）およびＤｉｃｋｓｏｎら（１９７５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ １８７：２７−３５）において記載される。ｌａｃオペロンは以下のように調節される。非誘導条件下（例えば、ブドウ糖での増殖）では、ＬａｃＩはｌａｃオペロンのオペレーターに結合し、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ラクトースパーミアーゼ（ＬａｃＹ）、およびトランスアセチラーゼ（ＬａｃＡ）の転写を妨げる。誘導性条件下（例えば、ラクトースでの増殖、もしくは代謝できないアナログであるＩＰＴＧの添加）では、リプレッサーはもはやオペレーターに結合せず、転写が起こる。オペロンの発現は、β−ガラクトシダーゼについてのアッセイによって容易に検出される。
【００５０】
本発明に従う有用な他のリプレッサー系としては、真核細胞における遺伝子活性の調節において用いるためのｔｅｔリプレッサー系（Ｇｏｓｓｅｎら（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，５１６−５２０）が挙げられる。ｔｅｔリプレッサー系は、酵母、タマホコリカビ（ｄｉｃｔｉｏｓｔｅｌｉｕｍ）、植物細胞およびタバコ植物において用いられている。本発明に従うさらなる有用なリプレッサー系は、ＡｒｇＲＮＶリプレッサー系（Ｂｕｒｋｅら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３，６０９−６１８）である。ＡｒｇＲリプレッサーは、正常にはアルギニンが存在する場合においてのみそのオペレーターに結合する。しかし、変異ＡｒｇＲＮＶリプレッサーは、アルギニンが存在しない場合においてそのオペレーターに結合し、アルギニンが存在する場合においても結合したままであり、トランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）効果を有する。二つの対称なＡｒｇボックスを有する理想化されたＡｒｇＲ結合部位（オペレーター）は、目的のプラスミド内へ操作され得、ＡｒｇＲ結合部位によって発現が制御される必須遺伝子からの、ＡｒｇＲＮＶの結合除去を可能とする。
【００５１】
本発明に従えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐリプレッサーもまた有用である（「Ｔｈｅ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｏｐｅｒｏｎ」、Ｙａｎｏｆ ｓｋｙおよびＣｒａｗｆｏｒｄ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍら編、１９８７年、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ．、１４５３〜１４７２頁を参照）。ｔｒｐリプレッサーは、約５０コピー／細胞で存在し、発酵培地中にリプレッサー結合の誘導因子としてトリプトファンの存在を必要とする。
【００５２】
本発明に従えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｇａｌＲリプレッサーは有用である（「Ｔｈｅ Ｇａｌａｃｔｏｓｅ Ｏｐｅｒｏｎ」、Ｓ．Ａｄｈｙａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍら編、１９８７年、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ．、１５０３〜１５１２頁を参照）。
【００５３】
本発明に従えば、Ｅ．ｃｏｌｉのａｒａＣリプレッサーもまた有用である（「Ｔｈｅ Ｌ−Ａｒａｂｉｎｏｓｅ Ｏｐｅｒｏｎ」、Ｒ．Ｓｃｈｌｉｅｆ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍら編、１９８７年、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ．、１４７３〜１４８１頁；Ｄｕｎｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．８１：５０１７−５０２０を参照）。ａｒａＣリプレッサーは、アラビノースの存在する場合において結合親和性が増大する。
【００５４】
最後に、本発明に従えば、Ａリプレッサーは有用である（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｌａｍｂｄａ Ｐｈａｇｅｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年、第３節、ユニット１．９；Ｈｏｃｈｓｃｈｉｌｄら、１９８６年、Ｃｅｌｌ ４７（５）：８０７−８１６）。
【００５５】
細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子は、細胞の代謝産物の生合成に関係する産物をコードする遺伝子、その遺伝子の産物が炭素代謝に関与する遺伝子、または、高分子の生合成もしくは調節をコードする遺伝子（例えば、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡの合成機能および複製機能のために必須の遺伝子）であってもよい。
【００５６】
細胞の構成要素の供給、特に細胞壁の前駆体の供給と関与する酵素をコードする特定の遺伝子は、細胞増殖のために必須であり、本発明に従って、有用である。例えば、細菌の細胞壁は、メソジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を含み、この構成要素を合成することが出来ないことは、溶菌をもたらす。ＤＡＰ生合成経路内の遺伝子、すなわち、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子、ｄａｐＣ遺伝子、ｄａｐＤ遺伝子、およびｄａｐＥ遺伝子は、それゆえ、第一の染色体遺伝子によって阻害される、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子として用いられ得る。ｄａｐＡおよびｄａｐＢは、クローニングされて塩基配列が決定されており、ｄａｐＢはひとつのシストロンとして利用可能である（Ｒｉｃｈａｕｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２９７−３００，１９８６年；Ｂｏｕｖｉｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１４８２９−１４８３４，１９８４年）。
【００５７】
他の細胞壁構成要素の生合成（例えば、Ｄ−アラニン生合成）に関与する遺伝子もまた本発明に従って有用である（Ｗａｌｓｈ、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（５）：２３９３−２３９６）。
【００５８】
脂肪酸生合成に関与する遺伝子もまた、本発明に従って有用である。一つの例は、ｆａｂＡであり、ｆａｂＡは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰデヒドラーゼをコードしており、不飽和脂肪酸生合成と飽和脂肪酸生合成とが分岐する点での、伸長する脂肪酸鎖への二重結合の導入の原因である（Ｃｒｏｎａｎ Ｊｒ．Ｊ．Ｅ．およびＲｏｃｋ．Ｃ．Ｏ．（１９８７）Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄｓ、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」。Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ．Ｆ．Ｃ．編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）。この酵素は比較的高い濃度で存在し、ｆａｂＡ変異体は、不飽和脂肪酸が補われないと溶菌する。
【００５９】
あるいは、細胞増殖に必須の第二の染色体遺伝子は、炭素源の利用と関与する遺伝子であってもよい。具体的には、この第二の染色体遺伝子は、ラクトースオペロンの遺伝子を含んでもよく、その結果、ラクトースが唯一の炭素源である条件において、プラスミドを維持しておりｌａｃオペロンの遺伝子が発現される細胞のみが、生存し得る。他の改変は、当業者にとって明らかである。
【００６０】
グルタミンシンテターゼは、ＮＳＯミエローマ細胞株（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，１６９−１７５）のような真核細胞にとっての必須遺伝子であって、好ましくは、宿主細胞が真核細胞である場合に第二の染色体遺伝子として用いられる。
【００６１】
この第二の染色体遺伝子はまた、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの合成タンパク質または複製タンパク質をコードする必須遺伝子であってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａのような細菌におけるこれらの必須機能に関するそのような遺伝子の例は、ＭｃＭａｃｋｅｎら（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ，，Ｗａｓｈ．Ｄ．Ｃ．，１９８７年、５６４〜６１２頁）において提供され、以下の遺伝子を含むが、以下の遺伝子に限定されない：ｄｎａＡ、ｄｎａＢ、ｄｎａＣ、ｓｓｂ、ｄｎａＧ、ｐｏｌＣ（ｄｎａＥ）、ｄｎａＱ（ｍｕｔＤ）、ｄｎａＮ、ｄｎａＺＸ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｐｏｌＡ、ｌｉｇ、ｄｎａＴ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、およびｒｐｏＤ。
【００６２】
好ましくないが、この第二の染色体遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子であってもよく、その結果、プラスミドを用いるその株の形質転換が、その抗生物質の存在する場合における増殖を可能にする。
【００６３】
医療への適用に使用するための形質転換された宿主細胞に対して、投与経路に依存して、局所環境内の多くの要因が選択圧をかけ得る。そのような圧力に抵抗する能力が同定される遺伝子に連鎖しているならば、この遺伝子は、選択マーカーとして用いられ得る。例えば、細胞、特に経口で投与されることになる細菌細胞にとって、胃の内容物の低いｐＨへの抵抗性は、重要な選択的利点を構成する。このことと関連することが示される遺伝子のうちには、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓのｕｖｒＡ遺伝子（Ｈａｎｎａら、２００１年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８３：５９６４）、Ｅ．ｃｏｌｉ．のｇａｄＡ遺伝子、ｇａｄＢ遺伝子、ｇａｄＣ遺伝子（Ｃａｓｔａｎｉｅ−ＣｏｒｎｅｔおよびＦｏｓｔｅｒ、２００１年 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７：７０９）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｒｐｏＳ遺伝子、ｆｕｒ遺伝子、ａｔｐ遺伝子、およびａｔｂＲ遺伝子（Ｂａｉｋら、１９９６年 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４２：３１９５）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉのｌｅｐＡ遺伝子、Ｆｒａｓｅｌ遺伝子、ｃｚｃＡ遺伝子、ｕｖｒＡ遺伝子、ａｔｐＦ’遺伝子、およびアルド−ケトレダクターゼ遺伝子（Ｂｉｊｌｓｍａら、２０００年、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １８２：１５６６）、ならびに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのＦ０Ｆ１ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子（Ｃｏｔｔｅｒら、２０００年、Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ６０：１３７）がある。
【００６４】
細胞内での生存を与える遺伝子（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのＳｖｐＡ（Ｂｏｒｅｚｅｅら、２００１年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７：２９１３）もしくは、リソソームのような特定の細胞内局在に対する抵抗力もまた、適切な宿主細胞において有用であり得る。
【００６５】
細胞増殖を間接的に阻害する好ましい遺伝子としては、細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子に結合することによって、または細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによって、この第二の染色体遺伝子を阻害するアンチセンス配列をコードする、染色体遺伝子も挙げられる。
【００６６】
アンチセンス配列とは、このアンチセンス配列の標的配列に実質的に相補的である配列であって、その標的配列に特異的にハイブリダイゼーションする能力を有する。このアンチセンス配列は、細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子に直接的に結合するか、またはその第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することのいずれかによって作用し得るので、この標的配列は、この第二の染色体のコード鎖もしくは非コード鎖のいずれかの配列、またはそれらの配列の一部であってもよい。標的配列に特異的にハイブリダイゼーションする能力を有するアンチセンス配列を調製する方法は、当業者によって公知である（例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１０，４３５（１９８９）、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６，５６０（１９９１）；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ５６，５６０（１９９１）；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ６，３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１，１３６０（１９９１）を参照）。
【００６７】
好ましくは、このアンチセンス配列は、ストリンジェントな条件の下で、その標的配列にハイブリダイゼーションする。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、以下のように定義される：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％のデキストラン硫酸、および２０マイクログラム／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、４２℃での一晩のインキュベーションと、その後の０．１×ＳＳＣ中でのおよそ６５℃でのフィルターの洗浄。
【００６８】
上記に示されるように、第一の染色体遺伝子は、細胞増殖のために必須な遺伝子の阻害もしくは細胞増殖を阻害する遺伝子の活性化を最終的にもたらす、多くの遺伝子を含む反応のカスケードを開始することによって、細胞増殖を阻害し得る。例えば、この第一の染色体遺伝子は、第二の染色体遺伝子を阻害するリプレッサータンパク質をコードし得、この第二の遺伝子は、細胞増殖のために必須な第三の染色体遺伝子を他の状態では活性化するアクチベーターをコードする。あるいは、この第一の染色体遺伝子は、第二の染色体遺伝子を阻害するリプレッサータンパク質をコードし得、この第二の染色体遺伝子は、細胞増殖を阻害する第三の染色体遺伝子を他の状態では阻害するアンチセンス配列をコードする。これらが本発明の必要条件を満たす遺伝子の多くのカスケードの例に過ぎないことは、当業者にとって明らかである。
【００６９】
（改変された宿主細胞の産生）
上記の細胞増殖を阻害する染色体遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に天然に存在する遺伝子であってもよく、あるいは外来遺伝子であってもよい。
【００７０】
プラスミドによってコードされるアンチセンス配列が、上記の染色体遺伝子に作動的に連結される調節配列に結合することによってこの染色体遺伝子を阻害する場合、この染色体遺伝子は、外因性の調節配列に作動的に連結されている、天然に存在する遺伝子であってもよい。例えば、天然に存在するトキシン遺伝子の発現を通常では制御する配列が除去されてもよく、このトキシン遺伝子が代わりに、構成的プロモーターの制御下で、外因性のＲＮＡＩコード配列に作動的に結合されてもよい。同様に、天然に存在するリプレッサータンパク質の発現を通常では制御する配列が除去されてもよく、このリプレッサータンパク質遺伝子が代わりに、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの制御下で、外因性のＲＮＡＩＩコード配列に作動的に連結されてもよい。従って、本明細書中の実施例２において、天然に存在するリプレッサータンパク質であるｌａｃＩは、ＲＮＡＩＩコード領域に作動的に結合される。
【００７１】
あるいは、この調節配列がＲＮＡＩコード配列もしくはＲＮＡＩＩコード配列であって、この染色体遺伝子が細胞増殖のために必要である第二の染色体遺伝子を阻害するアンチセンス配列をコードする場合のように、この調節配列およびこの染色体遺伝子の両方が外因性であってもよい。
【００７２】
細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子が存在するならば、この第二の染色体遺伝子もまた、天然に存在する遺伝子または外来遺伝子のいずれであってもよい。
【００７３】
細胞増殖を阻害する染色体遺伝子は、特に宿主細胞が真核細胞の宿主細胞である場合において、この細胞のゲノム内に複数コピーで存在し得る。
【００７４】
本発明において用いるために適切な宿主細胞を産生するために、細胞を操作する方法は、当業者にとって明らかである。
【００７５】
（宿主細胞）
本発明は、動物細胞（例えば、哺乳類細胞および昆虫細胞）、植物細胞、真菌（例えば、酵母）、細菌、および古細菌を含む、全ての細胞型に対して適用され得る。
【００７６】
宿主細胞が細菌細胞である場合、この宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞であってもよく、グラム陽性細菌細胞であってもよい。この細胞がグラム陰性細菌細胞である場合、この細胞は、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞もしくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である。この細胞がグラム陽性細菌細胞である場合、この細胞は、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、もしくはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞である。
【００７７】
特に有用であるのは、レシピエント生物体における治療用途が自由な、受容可能な程度にまで副作用が無いように弱毒化されている、弱毒化された宿主細胞である。この細胞の特性に依存して、この細胞は、獣医学的用途もしくはヒトの治療用途のために適切であり得る。
【００７８】
入手し得る弱毒化された細菌の中では、以下のものがある：
ＳＬ３２６１株（ａｒｏＡ変異体、Ｔｉｔｂａｌｌら、１９９７年、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：１９２６、Ｔｉｔｂａｌｌら、１９９５年、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３：５６３）、ＶＮＰ２０００９株
（ｐｕｒｌおよびｍｓｂＢの変異体、Ｔｏｓｏら、２００２年、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０：１４２）を含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；
ＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡ株、χ４０７３株、χ４６３２株、Ｔｙ８００株、ＣＶＤ ９０９株、およびＣＶＤ ９１５株を含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（Ｇａｌｅｎら、１９９９年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：６４２４−６４３３；Ｍｏｒｏｎａら、１９９１年、Ｇｅｎｅ １０７：１３９−１４４；Ｔａｃｋｅｔら、１９９７年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：３３８１−３３８５；Ｇａｒｍｏｒｙら、２００２年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２６：３３９−３５３）；
９Ｒ株を含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（鳥類のワクチン接種のため、Ｆｅｂｅｒｗｅｅら、２００１年、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ ４５：１０２４）；
ａｒｏＡ変異体、ｃｎｆｌ変異体、およびＯＭＰ変異体を含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｒｉｐｐｅｒｅ−Ｌａｍｐｅら、２００１年、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６９：３９５４）；
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ｇｕａＢＡ株を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（Ａｌｔｂｏｕｍら、２００１年、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６９：３１５０）；
Ｐｅｒｕ２株を含む、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ（Ｒｙａｎら、２０００年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：２２１−２２６）；
ＰｒｆＡ変異体およびＳｖｐＡ変異体を含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｓｈｅｅｈａｎら、１９９６年、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０：７８５；Ｂｏｒｅｚｅｅら、２００１年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４７：２９１３）；
ＲＢ５１株を含む、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ（Ｖｅｍｕｌａｐａｌｌｉら、２０００年、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６８：３２９０）；
Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）株を含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ；および
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ。
【００７９】
（本発明に従って有用である、プラスミドによって運ばれる遺伝子）
本発明の形質転換された宿主細胞内のプラスミドで運ばれる目的の遺伝子は、任意の遺伝子であり得る。この遺伝子は、レシピエント生物体に送達された場合に治療効果を有する遺伝子であり得る。例えば、遺伝子治療目的のためにレシピエント生物体にこの遺伝子を送達することが所望され得る。
【００８０】
あるいは、遺伝子の転写産物もしくは転写および翻訳の産物が治療効果を有するので、この遺伝子をレシピエント生物体に送達することが所望され得る。例えば、目的の遺伝子の転写産物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよく、あるいは、この目的の遺伝子は、治療効果を有する抗原をコードしてもよい。特に、目的の遺伝子は、レシピエント生物体において免疫応答を惹起する一つ以上の抗原をコードしてもよい。レシピエント生物体において免疫応答を誘導するためにプラスミドに含まれ得る目的の遺伝子の例は、ｃａｆオペロンのｃａｆＩ遺伝子、ｃａｆ１Ａ遺伝子、ｃａｆ１Ｍ遺伝子がある。
【００８１】
目的の遺伝子が転写されるもしくは転写されて翻訳されることが望ましい場合、この目的の遺伝子は、好ましくはプロモーターと機能的に結合する。好ましくは、このプロモーターは真核生物のプロモーターもしくは細菌のプロモーターである。目的の遺伝子と機能的に結合するプロモーターの選択、および宿主細胞の選択は、宿主細胞において、レシピエント生物体への投与に先立って、もしくはレシピエント生物体への投与の後でのみ、目的の遺伝子が転写されるか、または転写されて翻訳されるかを決定する。
【００８２】
いくつかの場合において、目的の遺伝子を既に発現している宿主細胞に送達することが、所望され得る。この場合において、この目的の遺伝子と機能的に結合しているプロモーターは、その結果として、このプロモーターがこの宿主細胞内で作動し、この宿主細胞内におけるこの目的の遺伝子の転写および翻訳を促進するように、選択される。例えば、この宿主細胞が細菌細胞である場合、この状況においてこの目的の遺伝子と機能的に結合しているプロモーターは、細菌のプロモーターであってもよい。
【００８３】
他の場合において、この目的の遺伝子を含むプラスミドを含む宿主細胞をレシピエント生物体に送達するが、この目的の遺伝子の発現をこの細胞のレシピエント生物体への送達後にまで遅延させることが、所望され得る。例えば、この宿主細胞が細菌細胞である場合、この状況においてこの目的遺伝子と機能的に結合しているプロモーターは、この宿主細胞においてこの目的の遺伝子の転写および翻訳を促進しないが、レシピエント生物体への投与の後にこの目的の遺伝子の転写および翻訳を促進する、真核生物のプロモーターであってもよい。
【００８４】
（本発明に従って有用であるワクチン接種の方法）
本発明によって形質転換された宿主細胞を用いるワクチン接種は、多くの投与経路のいずれによってであってもよいことが、予想される。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍについては、例えば、有用な経路は、皮内注射もしくは皮下注射によってである。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、もしくはＥ．ｃｏｌｉのような腸内細菌については、経口投与（特に、耐酸性形質転換体の経口投与）または直腸投与が好ましい。いくつかの状況においては、粘膜投与、静脈内投与、もしくは腹腔内投与が、好適であり得る。
【００８５】
（他のインビボでの適用のための投与）
非ワクチン接種適用のための多くの投与方法が用いられ得ることが、予想される。
【００８６】
ワクチン接種のために用いられる経腸投与経路および非経口投与経路に加えて、非ワクチン適用は、他の手順を必要とし得る。他の手順の中では、本発明による細胞が中に含まれる移植可能な浸透性の容器の使用がある。
【００８７】
本発明は、ここで、一例としてプラスミドの複製起点を選択マーカーとして使用するプラスミド維持系を参照して、さらに詳細に記載される。実施例において記載される系に対して変更がなされ得ることが、理解される。
【実施例】
【００８８】
本発明は、複製起点（ｐＭＢ１ ｏｒｉもしくはＣｏｌＥＩ ｏｒｉ）のみを選択マーカーとして用いてプラスミドの選択およびプラスミドの維持を可能とし、本明細書中でｏｒｉＳＥＬＥＣＴと言及される。図１において示すように、これらのＣｏｌＥＩ適合性ｏｒｉは、二つの重なるＲＮＡ転写産物をコードする：ＲＮＡＩＩは、プラスミドＤＮＡ合成の開始を始め、ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩのアンチセンスインヒビターである（Ｓｃｏｔｔら、１９８４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８：１−２３；Ｃｈａｎら、１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８９２５−８９３５）。研究用途もしくは商業的用途の事実上全てのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ内での自律複製をこれらの複製起点に依存している。
【００８９】
本発明は、あるオペロンにおいて阻害的遺伝子エレメントに連結されたＲＮＡＩＩコード領域を含むようにゲノムが改変されているＥ．ｃｏｌｉの形質転換株の構築を、含み得る。プラスミド産生性ＲＮＡＩのＲＮＡＩＩ−ｍＲＮＡ融合体へ結合は、その阻害遺伝子ｍＲＮＡの転写を妨害し、それによって細胞の生存および増殖を可能にする。このプラスミド維持系の３つの提案される機構は、以下に記載される。
【００９０】
（実施例１：リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴ）
図２において示すように、リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおける使用のための宿主細胞のゲノムは、リプレッサー遺伝子シストロンに連結されたＲＮＡＩＩコード領域を含み、ＲＮＡＩＩコード領域およびリプレッサー遺伝子シストロンの両方は、構成的ＲＮＡＩＩプロモーターの制御下にある。リプレッサーシストロンに連結されたＲＮＡＩＩコード領域はまた、図８において示されるような、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｒｃプロモーターにおいて見出される−１０配列および−３５配列ならびにスペーシングに基づくプロモーターのような、代替的な構成的プロモーターの制御下にあり得る。宿主細胞のゲノムはまた、誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下での細胞増殖のために必須な遺伝子を含む（図８においては示さない）。
【００９１】
プラスミドが無い場合において、リプレッサータンパク質が発現し、そして必須遺伝子（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ）の発現を制御するオペレーター／プロモーターに結合することによって必須遺伝子を抑制し、細胞増殖を阻害する。プラスミド産生性ＲＮＡＩの、ＲＮＡＩＩ−リプレッサーｍＲＮＡ融合体内のＲＮＡＩＩ転写産物への結合は、リプレッサーの翻訳を妨げ、必須遺伝子の発現を可能にし、それによって細胞増殖を可能にする。
【００９２】
リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおける使用のためにこの宿主細胞を構築するために、ｄａｐＤ（Ｒｉｃｈａｕｄら、１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１４８２４−１４８２８）もしくはｆａｂＡ（Ｃｒｏｎａｎら、１９８７，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄｓ、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）のような必須遺伝子を、細菌株の染色体から欠失させ、誘導性プロモーター（例えば、Ｐｌａｃ）の制御下に置き、そしてその染色体内へ挿入し戻す。その誘導性プロモーターに結合している、リプレッサーをコードしている遺伝子（この場合においてはｌａｃＩ）を、染色体から欠失させる。このリプレッサー遺伝子を、両方の転写を駆動する構成的ＲＮＡＩＩプロモーター（もしくは任意の他の構成的プロモーター、例えばＥ．ｃｏｌｉのｔｒｃプロモーターにおいて見出される−１０配列および−３５配列ならびにスペーシングに基づくプロモーター）と共に、ＲＮＡＩＩの一部をコードしている領域の下流のオペロン内に置く。ＲＮＡＩＩコード領域の３’末端を、リプレッサーのリボソーム結合部位を含むように改変し、このためＲＮＡＩＩコード領域の３’末端は重なり、ＲＮＡＩによって妨げられる。いくつかの場合においては、ＲＮＡＩＩコード領域の３’末端とｌａｃのリボソーム結合部位との間の距離を増大させることによって、ＬａｃＩリプレッサータンパク質の発現を増加させ得る。この構築物を、染色体の中へ挿入する。
【００９３】
その細胞はそれからリプレッサーを構成的に産生する。リプレッサータンパク質は、必須遺伝子を制御している染色体オペレーターに結合し、それによって細胞増殖を妨害する。その細胞をＣｏｌＥＩ適合性ｏｒｉを含むプラスミドを用いて形質転換するとき、ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩに結合し、そして下流のリプレッサー遺伝子の翻訳を妨げ、細胞増殖を可能にする。
【００９４】
染色体の必須遺伝子がその必須遺伝子自体の結合したリプレッサーを有するのであれば、このリプレッサー（マイナスそのリプレッサーのプロモーター）をＲＮＡＩＩの下流のオペロン内へ操作してもよく、そしてこのオペロンを野生型リプレッサーと置き換えさせるために細菌の染色体内へ挿入してもよい。
【００９５】
上記の必須遺伝子は、条件的に必須な外来遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）であり得る。
【００９６】
必須な外来遺伝子が誘導性であり、かつその遺伝子自体の結合した外来リプレッサーを有するのであれば、このリプレッサー遺伝子をＲＮＡＩＩの下流のオペロン内へ操作してもよく、そしてこのオペロンを細菌の染色体内へ挿入してもよい。
【００９７】
（実施例２：トキシン遺伝子ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ）
図３において示すように、トキシン遺伝子ｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおける使用のための宿主細胞のゲノムは、ＲＮＡＩＩの下流に配置されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからのレバンスクラーゼ（Ｌｉｎｋら、１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６２２８−６２３７）をコードするｓａｃＢ遺伝子を含む。ショ糖が存在する場合において、ｓａｃＢは毒性の産物を合成し、ＲＮＡＩを発現するプラスミドを導入しなければ、細胞は死ぬ。誘導性プロモーターによって調節される別の毒性遺伝子を、ｓａｃＢの代わりにＲＮＡＩＩコード領域へ融合してもよい。
【００９８】
構築物を、ＲＮＡＩＩコード領域およびｓａｃＢをコードする下流の遺伝子からなるオペロンを用いて操作する。ＲＮＡＩＩコード領域の３’末端を、ｓａｃＢのリボソーム結合部位を含むように改変する。構成的ＲＮＡＩＩプロモーターは、遺伝子発現を駆動する。構成的ＲＮＡＩＩプロモーターを細菌の染色体内へ挿入する場合、その細胞は、ショ糖がない場合においても増殖し得るが、ショ糖を加えると、トキシンが産生されそして細胞は死ぬ。その細胞を、ＣｏｌＥＩ適合性ｏｒｉを含むプラスミドを用いて形質転換する場合、ＲＮＡＩがＲＮＡＩＩ−トキシン遺伝子ｍＲＮＡに結合し、そして翻訳を妨げ、ショ糖が存在する場合においても細胞増殖を可能にする。
【００９９】
温度感受性プロモーターもしくは化学的に誘導されるプロモーターを、ＲＮＡＩＩ−トキシン遺伝子融合体の発現を駆動するために用いてもよい。許容温度において、もしくは誘導物質が存在する場合においては、ＲＮＡＩを発現するプラスミドを導入しなければ、細胞は死ぬ。
【０１００】
（実施例３：二重アンチセンスｏｒｉＳＥＬＥＣＴ）
図４において示すように、二重アンチセンスｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて、宿主細胞のゲノムは、細胞増殖のために必須である遺伝子、および細胞増殖のために必須である遺伝子に対するアンチセンスである遺伝子に連結されたＲＮＡＩＩコード領域を、含む。
【０１０１】
必須遺伝子（例えば、ｄａｐＤもしくはｆａｂＡ）のアンチセンスバージョンを、ＲＮＡＩＩコード領域の下流のオペロン内に、必須遺伝子のアンチセンスバージョンおよびＲＮＡＩＩコード領域の両方の転写を駆動する構成的ＲＮＡＩＩプロモーターと共に置く。ＲＮＡＩコード領域の３’末端を、必須遺伝子アンチセンス転写産物の一部を含むように、それによってＲＮＡＩコード領域の３’末端がＲＮＡＩＩと部分的に重なるように改変してもよい。この構築物を、細菌の染色体内へ挿入する。
【０１０２】
その細胞はそれからＲＮＡＩＩおよびアンチセンスＲＮＡを構成的に産生する。アンチセンスＲＮＡは、必須遺伝子ｍＲＮＡに結合し、それによって必須遺伝子の翻訳および細胞増殖を妨害する。
【０１０３】
その細胞をＣｏｌＥＩ適合性ｏｒｉを含むプラスミドを用いて形質転換する場合、ＲＮＡＩはＲＮＡＩＩ−アンチセンスＲＮＡに結合し、ＲＮＡＩＩ−アンチセンスＲＮＡが必須遺伝子ｍＲＮＡに結合することを妨害し、細胞増殖を可能にする。
【０１０４】
（実施例４：リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株の製作）
ＯＲＴ株ＤＨ１ｌａｃｋａｎ（Ｗｉｌｌｉａｎｓら、１９９８）、ＤＨ１ｌａｃｄａｐＤおよびＤＨ１ｌａｃＰ２ｄａｐＤ（Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈら、２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９：ｅ２６）を、ＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩオペロンの染色体のｌａｃＩリプレッサー遺伝子への組込みによって（そしてそれによってＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩオペロンで染色体ｌａｃＩリプレッサー遺伝子を置き換えることによって）ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株に転換してもよい。ｐＫＯ３組込み系（Ｌｉｎｋら、１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６２２８−６２３７）に基づいて構築された単一プラスミドは、以下のように、全てのＯＲＴ株において、野生型ｌａｃＩをＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩで置換するために用いられる。
【０１０５】
１．ｌａｃＩを取り囲む染色体ｌａｃオペロンの一部を、ＰＣＲによって増幅し、クローニングする；
２．ｌａｃＩリプレッサー遺伝子の上流に挿入されたＲＮＡＩＩコード領域からなるオペロンを操作し、天然のプロモーターと置き換える。ｌａｃＩのリボソーム結合部位は、ｍＲＮＡ上でアンチセンスＲＮＡＩＩの結合によって妨げられるように、配置されるべきである。
【０１０６】
３．ＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩオペロンの遺伝子座を、組込みプラスミドｐＫＯ３内へクローニングする。
【０１０７】
４．ＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩオペロンの遺伝子座を、ＤＨ１ｌａｃｋａｎ、ＤＨ１ｌａｃｄａｐＤ、およびＤＨ１ｌａｃＰ２ｄａｐＤの野生型ｌａｃオペロンの遺伝子座内へ組込んで、ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株を産生する。
【０１０８】
５．これらの株におけるプラスミドの選択およびプラスミドの維持を、ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１ ｏｒｉ配列を保有しかつｌａｃＯ配列を保有しない（ＯＲＴ選択を避けるため）プラスミドを用いて試験する。
【０１０９】
このｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株の構築のために必要であるクローニングの工程を、より詳細に以下に記載する。
【０１１０】
（ＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩ融合体を産生するスプライシングＰＣＲ）
１．図５において示すように、ｐＵＣ１８から、ＲＮＡＩＩの５’末端の一部を、以下のプライマー（産物＝１７６ｂｐ）を用いるＰＣＲによって増幅する。
【０１１１】
５ＲＮＡＩＩ：ＧＡＡＴＧＣＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡ（２６ｎｔ）
３ＲＮＡＩＩ：ＡＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡ（４２ｎｔ）。
【０１１２】
２．図６に示すように、ＤＨ１ ｇＤＮＡから、ｌａｃＩの５’末端の一部を、以下のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する（産物＝５９７ｂｐ）。
【０１１３】
５ｌａｃＩ：ＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡ（４２ｎｔ）
３ｌａｃＩ：ＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣＧＣＴＡＡＣＡ（２５ｎｔ）。
【０１１４】
３．図７において示すように、５ＲＮＡＩＩプライマーおよび３ｌａｃＩプライマーを用いて、一回のＰＣＲにおいてこれら二つのＰＣＲ産物を組み合わせ、増幅して、７４９ｂｐのＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩ遺伝子融合体ＰＣＲ産物（以下の５ＲＮＡＩＩプライマーと３ｌａｃＩプライマーとの間の領域）を生成する。
【０１１５】
４．スプライシングされたＰＣＲ産物を、ＮｓｉＩおよびＡｐａＩを用いて切断して、ｌａｃＩプロモーターおよび５’末端の位置においてラクトースオペロン内へクローニングするための断片を生成する。
【０１１６】
（ラクトースオペロンの一部のクローニング、およびＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩの挿入）
１．ＤＨ１ ｇＤＮＡからのｌａｃオペロンを、以下のプライマーを用いて増幅する。
【０１１７】
【化１】
プライマー５ＬＯは、天然のＳａｌＩ部位（下線）を含むが、３ＬＯは、１ヌクレオチド変化（太字）を有するＳａｌＩ部位を導入する。総ＰＣＲ産物の大きさは、５８０３ｂｐである。
【０１１８】
２．上記のＰＣＲ産物をＳａｌＩで切断し、そしてＳａｌＩを用いて切断されたｐＵＣ１８内へクローニングする。
【０１１９】
３．このプラスミドをＮｓｉＩおよびＡｐａＩで切断し、そして工程４による断片にクローニングし、プロモーターおよびｌａｃＩの５’末端をＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩ遺伝子融合体で置換する。
【０１２０】
４．挿入部分をＳａｌＩを用いて切断し、そしてＳａｌＩを用いて切断されたｐＫＯ３ｒｅｃＡ内へライゲーションする。
【０１２１】
５．ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株を産生するために、ＤＨ１ｌａｃｄａｐＤ、ＤＨ１ｌａｃＰ２ｄａｐＤ、およびＤＨ１ｌａｃｋａｎの染色体内へ組込む。
【０１２２】
６．ｐＭＢ１複製起点を有するプラスミドを用いて、プラスミドの選択およびプラスミドの維持を試験する。
【０１２３】
ＲＮＡＩＩ構成的プロモーターをＲＮＡＩＩ−遺伝子融合体発現を駆動するために用いる場合、必要であれば、任意の他の構成的プロモーターを置換してもよい。そのＲＮＡＩＩプロモーターをこれらの実施例において既に存在するものとして用いる。代替的な好ましい構成的プロモーターは、至適なＥ．ｃｏｌｉのｔｒｃプロモーターにおいて見出される−１０配列および−３５配列ならびにスペーシングに基づくプロモーターである。このＥ．ｃｏｌｉプロモーターは、ＲＮＡＩＩプロモーターより強く、それゆえに、より大量のＬａｃＩリプレッサータンパク質を産生し、それによってプラスミドが存在しない場合において増殖が妨げられることを保証することが望まれる場合に用いてもよい。ＬａｃＩリプレッサータンパク質の発現はまた、ＲＮＡＩＩコード領域の３’末端とｌａｃｉＩのリボソーム結合部位との間の距離を長くすることによって増大されてもよい。
【０１２４】
また、遺伝子カセットを挿入する代替的な方法を、上記に記載したｐＫＯ３法の代わりに用いてもよいことが理解される。例えば、ラムダＲｅｄ組換え系を用いて、直鎖状ＰＣＲ産物としてこのカセットを組込んでもよい（Ｍｕｒｐｈｙ，１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：２０６３−２０７１）。
【０１２５】
これらの実施例は、アンチセンスインヒビターとして機能するＲＮＡＩを用いるＲＮＡＩＩ−遺伝子融合体発現カセットに基づく。このことは、なぜなら、プラスミドを含む細胞においては、ＲＮＡＩはＲＮＡＩＩを五倍の過剰量で上回って存在するからであり（Ｌｉａｎｇら、１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：１９−３７）、ゆえに、モル過剰のＲＮＡＩが利用可能であるかのように、ＲＮＡＩがより効果的なインヒビターとして働き得るからである。しかし、ＲＮＡＩＩよりもＲＮＡＩを用いて遺伝子融合物を構築することが有利である状況はあり得る。この場合において、アンチセンスインヒビターとして働くのは、プラスミドからのＲＮＡＩＩ転写産物である。
【０１２６】
ＣｏｌＥＩ／ｐＭＢ１ ｏｒｉからのＲｏｍタンパク質を発現する遺伝子の染色体組込みは、この染色体組み込みがＲＮＡＩのＲＮＡＩＩとの結合親和性を上昇させるので、ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株において必要であり得る（Ｃｈａｎら、１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８９２５−８９３５）。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】ｐＵＣ１８ｏｒｉの図であり、ＲＮＡＩ転写産物およびＲＮＡＩＩ転写産物の位置を示す。ＲＮＡＩＩは、プラスミドのＤＮＡ合成の開始を始め、ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩのアンチセンスインヒビターである。
【図２】リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて用いるための宿主細胞のゲノムの例。宿主細胞のゲノムは、リプレッサー遺伝子のシストロンに連結されたＲＮＡＩＩコード領域を含み、これらの両方が構成的ＲＮＡＩＩプロモーターの制御下にある。このゲノムはさらに、誘導性プロモーターの制御下にある必須遺伝子を含む。プラスミドが存在しない場合において、リプレッサータンパク質が発現され、必須遺伝子を抑制し、細胞増殖を阻害する。プラスミドによって生成されるＲＮＡＩの、ＲＮＡＩＩ−リプレッサーｍＲＮＡ融合体のＲＮＡＩＩ転写産物への結合は、リプレッサータンパク質の翻訳を遮断し、必須遺伝子の発現および細胞増殖を可能にする。
【図３】トキシン遺伝子ｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて用いるための宿主細胞のゲノムの例。このゲノムは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のレバンスクラーゼをコードし（Ｌｉｎｋら、１９９７年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６２２８−６２３７）ＲＮＡＩＩの下流に配置されたｓａｃＢ遺伝子を含む。ショ糖が存在する場合において、ｓａｃＢは毒性の産物を合成し、トキシン遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を遮断するＲＮＡＩを発現するプラスミドが存在しない限り、ショ糖が存在する場合においてその細胞は殺される。
【図４】アンチセンスｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて用いるための宿主細胞のゲノムの例。この宿主細胞のゲノムは、細胞増殖のために必須である遺伝子、および、細胞増殖のために必須な遺伝子に対するアンチセンスである遺伝子に連結されたＲＮＡＩＩコード領域を含む。プラスミドが存在しない場合において、このアンチセンスＲＮＡは必須遺伝子のｍＲＮＡに結合し、それによってこの必須遺伝子の翻訳および細胞増殖を妨げる。この細胞がＲＮＡＩを与えるプラスミドを用いて形質転換される場合、ＲＮＡＩはＲＮＡＩＩ−アンチセンスＲＮＡに結合し、ＲＮＡＩＩ−アンチセンスＲＮＡが必須遺伝子のｍＲＮＡに結合することを妨げ、細胞増殖を可能にする。
【図５】ＰＣＲによるｐＵＣ１８からのＲＮＡＩＩの５’末端の増幅。ＲＮＡＩ転写産物およびＲＮＡＩＩ転写産物の位置は、リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて用いるための宿主細胞のゲノムへの挿入のための、リプレッサーｌａｃＩをコードする遺伝子の上流へのＲＮＡＩＩの挿入に先立って、ＲＡＮＩＩの５’末端を増幅するために用いられるプライマーの位置であるとして、示される。
【図６】ＰＣＲを用いる、ＤＨ１ ＯＲＴ株のゲノムＤＮＡ由来のｌａｃＩの５’末端の増幅。この増幅において用いられるプライマー５ｌａｃＩおよび３ｌａｃＩの位置が示される。
【図７】図５中のプライマーを用いて産生されるＲＮＡＩＩ増幅産物と、図６中のプライマーを用いて産生されるｌａｃＩ増幅物とを組み合わせることによって形成される産物。この組合せ産物の増幅において用いられるプライマーの位置が示される。
【図８】リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて用いるための宿主細胞のゲノムのさらなる例。この宿主細胞のゲノムは、リプレッサー遺伝子のシストロン（ｌａｃＩ）に連結されたＲＮＡＩＩコード領域を含み、これらの両方が、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｃプロモーターにおいて見出される−１０配列および−３５配列ならびにスペーシングに基づく構成的プロモーターの制御下にある。このゲノムはさらに、誘導性プロモーターの制御下にある必須遺伝子を含む（示さず）。プラスミドが存在しない場合において、このリプレッサータンパク質が発現され、必須遺伝子を抑制し、細胞増殖を阻害する。プラスミドによって生成されるＲＮＡＩの、ＲＮＡＩＩ−リプレッサーｍＲＮＡ融合体のＲＮＡＩＩ転写産物への結合は、リプレッサータンパク質の翻訳を遮断し、必須遺伝子の発現および細胞増殖を可能にする。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、プラスミドの安定した維持のための系、この系においての使用のための宿主細胞、ならびに医療への適用において有用なプラスミドを得るためにこの系を用いる方法に関する。
【０００２】
本明細書において引用される全ての文献は、参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
プラスミドは、組換えタンパク質の調製においておよび遺伝子治療目的のためのＤＮＡの調製において、慣用的に用いられる。宿主細胞内のプラスミドの安定した維持は、これらの産物の効率的な調製のために重要である。しかし、宿主細胞において運ばれる染色体外ＤＮＡは、プラスミドを含む細胞での、プラスミドが無い細胞に比べて増大した代謝的負荷に起因して、もともと不安定である。プラスミドの安定性を維持し代謝的負荷を軽減するため、プラスミドは、優性な選択マーカーを含むように操作されている。
【０００４】
培養中の細胞内にプラスミドを維持する従来の方法は、抗生物質耐性遺伝子をそのプラスミドに含め、そして適切な抗生物質の存在中でその細胞を培養することである。治療用途が意図される細胞もしくはプラスミドに関して、このことは、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドの使用が抗生物質耐性の拡がりの一因になり得るという不利益を有する。
【０００５】
いくつかのプラスミド維持法は、プラスミドによって運ばれる遺伝子（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ ｇｅｎｅ）によって制御される天然に存在する分離後殺傷（ｐｏｓｔ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）機構を利用することを試みてきた。例えば、ｈｏｋ／ｓｏｋ系、ｓｒｎＢ系、およびｐｎｄ系は、キラー（ｋｉｌｌｅｒ）タンパク質を含み、そのキラータンパク質は、安定なｍＲＮＡによってコードされ、キラーＲＮＡに結合してキラーＲＮＡを不活性化する小さい不安定なアンチセンスＲＮＡによって調節される。キラーＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡが分解された後、プラスミドが無い分離体（ｓｅｇｒｅｇａｎｔ）において保持され、致死タンパク質へと翻訳される。ｈｏｋ／ｓｏｋ系を用いるプラスミド維持は、弱毒化生ベクターワクチン株Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ＣＤＶ９０８ ｈｔｒ−Ａ（非特許文献１）において研究された。しかし、そのような分離後殺傷機構は、形質転換後のプラスミド選択を可能とせず、ゆえに依然としてプラスミドにおける抗生物質耐性遺伝子の存在に依存している。
【０００６】
抗生物質選択を用いずにプラスミドを維持するためおよびプラスミドを選択するためのいくつかの代替的な方法が開発されてきており、それらの方法においては、プラスミドが宿主細胞の栄養要求性を補完する遺伝子をコードする。例えば、宿主細胞は、必須アミノ酸代謝産物を合成することが出来ず、このアミノ酸の合成のための失われたエレメントをコードしている遺伝子を含むプラスミドが存在する場合においてのみ、そのアミノ酸を欠乏している培地中で生存し得る、変異細胞であり得る（非特許文献２）。しかし、このアプローチは、そのアミノ酸が省かれなければならないために、増殖培地の組成を制限する。複雑な培地において用いられ得る代替的な方法は、温度感受性のｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子を有する変異宿主細胞を用いる。この変異宿主細胞は、野生型ｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子を含むプラスミドが存在する場合のみ、非許容（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）温度で生存し得る（非特許文献３）。別の選択方法は、変異宿主細胞における必須な染色体遺伝子中のナンセンス変異を補完するプラスミドによって運ばれるｔＲＮＡ遺伝子を用いる（非特許文献４）。あるいは、ｐｉｌオペロンのような、細胞に対する代謝的負荷を増大する遺伝子が、対応するリプレッサータンパク質をコードするプラスミドの存在する場合においてのみ宿主細胞が生存するように、宿主の染色体に配置され得る（非特許文献５）。
【０００７】
特許文献１は、インビトロ培養中の宿主細胞内のプラスミドをオペレーターリプレッサータイトレーション（ｏｐｅｒａｔｏｒ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって維持する方法を説明している。その方法は、その宿主細胞が、リプレッサーをコードする第一の染色体遺伝子、および、その調節領域においてリプレッサーについてのオペレーター配列を有する細胞増殖のために必須である第二の染色体遺伝子を含むようにする、宿主細胞の操作を伴う。プラスミドが存在しない場合、第二の染色体遺伝子の発現は、リプレッサーのオペレーターへの結合によって阻害され、そしてその細胞は死ぬ。この宿主細胞における維持のためのプラスミドは、オペレーター配列を含むように操作されており、その結果、プラスミドが存在する場合、リプレッサーは細胞増殖のために必須である遺伝子のオペレーターから結合除去（ｔｉｔｒａｔｅ ａｗａｙ）され、その遺伝子が発現されその細胞が生存する。この機構はまた、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（非特許文献６）に、およびＣｒａｎｅｎｂｕｒｇｈら(非特許文献７）に、記載される。
【特許文献１】欧州特許第０８５１９３２号明細書
【非特許文献１】Ｇａｌｅｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９年、第６７巻、ｐ．６４２４−６４３３
【非特許文献２】Ｗａｎｇ Ｍ−Ｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７年、第１６９巻、ｐ．５６１０−５６１４
【非特許文献３】Ｓｋｏｇｍａｎら、Ｇｅｎｅ，１９８４年、第３１巻、ｐ．１１７−１２２
【非特許文献４】Ｚｅｎｇｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８１年、第１４５巻、ｐ．４５９−４６５
【非特許文献５】Ｏｇｄｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９２年、第４０巻、ｐ．１０２７−１０３８
【非特許文献６】Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９年、第２６巻、第９号、ｐ．２１２０−２１２４
【非特許文献７】Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１年、第２９巻、第５号、ｐ．ｅ２６−ｅ２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗生物質選択に依存しないプラスミドの維持および選択のいくつかの機構は公知であるが、治療への適用のためのＤＮＡおよび組換えタンパク質の産生におけるプラスミドの重要性が増大していることを考慮して、さらなる方法の開発についての必要性は存続する。加えて、今までに開発された、プラスミドの維持および選択の系は、これらの系における使用のために特別に改変されているプラスミドの使用を必要とする。抗生物質耐性を伴わず、当該分野において一般的であり特別な改変を必要としないプラスミドを使用する、プラスミドの維持および選択の系についての必要性が存続する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の第一の局面に従って、形質転換された宿主細胞が提供される。その宿主細胞は、
ｉ）細胞増殖を阻害する染色体遺伝子；および
ｉｉ）アンチセンス配列をコードするプラスミド
を含み、上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、上記染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を許容する。
【００１０】
上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、このプラスミドの他の領域によってコードされてもよいが、好ましくはこのプラスミドの複製起点によってコードされる。
【００１１】
本明細書において用いられる場合、用語「アンチセンス配列」とは、核酸配列であって、その核酸配列の標的配列に対して実質的に相補的であり、その標的配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する核酸配列を、指す。好ましくは、上記のプラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、ストリンジェントな条件下でそのアンチセンス配列の標的配列にハイブリダイズする。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、以下のように定義される：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％のデキストラン硫酸、および２０マイクログラム／ｍｌの変性剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、４２℃での一晩のインキュベーションと、その後の０．１×ＳＳＣ中でのおよそ６５℃でのフィルターの洗浄。
【００１２】
本明細書において用いられる場合、「細胞増殖」とは、培養培地中の細胞数の経時的な増加、および、生細胞の数が経時的に減少しない場合は、細胞の生存率を、指す。「細胞増殖を阻害する」によって、染色体遺伝子が細胞にとって致死性であり、その結果、培養培地中の生細胞の数が経時的に減少すること、または、染色体遺伝子が細胞増殖を妨げ、その結果、培養培地中の細胞の数が時間にわたって増加しないことが、意味される。
【００１３】
本発明のこの第一の局面に従う形質転換された宿主細胞の増殖は、プラスミドの存在に依存しており、このプラスミドを維持する細胞の選択をもたらす。宿主細胞からこのプラスミドが失われた場合、この染色体遺伝子の作用はもはやプラスミドによってコードされるアンチセンス配列によって妨げられず、細胞増殖が阻害される。いくつかの実施形態において、この染色体遺伝子の発現が阻害され、それによって細胞増殖を許容するためには、ほんの１コピー（ｃｏｐｙ）のこのプラスミドが必要であり得る。他の実施形態において、染色体遺伝子の発現が阻害されるために、プラスミドが複数コピーで存在することが必要であり得る。
【００１４】
この染色体遺伝子は、細胞増殖を直接的に阻害し得る。例えば、この染色体遺伝子の転写および翻訳は、トキシンのような、細胞にとって致死性のタンパク質を産生し得る。あるいは、この染色体遺伝子は、細胞増殖を間接的に阻害し得る。例えば、この染色体遺伝子の転写および翻訳は、第二の染色体遺伝子によってコードされる細胞増殖のために必須であるタンパク質の転写および翻訳を阻害するリプレッサータンパク質を、産生し得る。この染色体遺伝子の転写はまた、細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子の転写および／もしくは翻訳を、第二の染色体遺伝子に結合することまたは第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することのいずれかによって阻害するアンチセンス配列を、産生し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態において、この染色体遺伝子は、より複雑な反応カスケードによって細胞増殖を阻害し得る。例えば、この染色体遺伝子は、第二の染色体遺伝子の発現を活性化するアクチベータータンパク質をコードし得、この第二の染色体遺伝子は、次に、細胞増殖のために必須なタンパク質をコードする第三の染色体遺伝子の発現を阻害するリプレッサータンパク質をコードする。あるいは、第一の染色体遺伝子は、第二の染色体遺伝子のアンチセンスインヒビターをコードし得、この第二の染色体遺伝子のアンチセンスインヒビターは、次に、細胞増殖を阻害するタンパク質をコードする第三の染色体遺伝子の発現を抑制するリプレッサータンパク質をコードする。そのようなカスケードは三つより多くの染色体遺伝子を含み得る。例えば、そのようなカスケードは、４、５、６、７もしくはそれより多くの染色体遺伝子を含み得る。そのようなカスケードの全てにおいて、第一の染色体遺伝子を阻害するプラスミドが存在しないことにより、第一の染色体遺伝子にカスケード反応を開始させ、このことから最終的に細胞増殖の阻害がもたらされる。細胞増殖を阻害する適切な染色体遺伝子の例は、本明細書において提供される。
【００１６】
本発明の形質転換された宿主細胞は、好ましくは、治療用途が意図されるプラスミドを維持するために用いられる。従って、このプラスミドが目的の遺伝子の挿入のためのクローニング部位を含むことが、好ましい。好ましくは、このプラスミドはさらに、目的の遺伝子を含む。この目的の遺伝子は哺乳類細胞において、好ましくはヒト細胞において、発現し得ることが好ましい。この目的の遺伝子は、治療用途のために、目的のＲＮＡもしくは目的のタンパク質を発現し得る。プラスミドに含まれ得るそのような目的の遺伝子の例は、当該分野において公知であり、本明細書において提供される。
【００１７】
上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、上記染色体遺伝子自体に結合することによってこの染色体遺伝子の作用を阻害し得、それによってこの遺伝子の転写を阻害し得る。あるいは、上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、上記染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによってこの染色体遺伝子の作用を阻害し得る。この染色体遺伝子の性質に依存して、この染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡへの結合は、この染色体遺伝子の翻訳を阻害し得るか、もしくはこの染色体遺伝子にコードされるアンチセンス配列がこのアンチセンス配列の標的へ結合するのを妨ぎ得る。
【００１８】
本発明の第一の局面の好ましい実施形態において、調節配列は、上記染色体遺伝子と作動的（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）に連結される。「作動的に連結される」によって、この調節配列が、読み枠をあわせて（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）この染色体遺伝子と連結され、その結果、この調節配列がこの染色体遺伝子と同時に転写されることが、意味される。好ましくは、この調節配列は、この染色体遺伝子の上流に作動的に連結される。しかし、あるいはこの調節配列は、この染色体遺伝子の下流に作動的に連結されてもよい。この調節配列がこの染色体遺伝子の上流に作動的に連結された場合、この調節配列は、好ましくはリボソーム結合部位内に挿入される。あるいは、この調節配列は、リボソーム結合部位の上流に挿入されてもよい。この染色体遺伝子もしくは調節遺伝子に作動的に連結されたこの染色体遺伝子は、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。好ましくは、この染色体遺伝子もしくは調節遺伝子に作動的に連結されたこの染色体遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にある。
【００１９】
上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、この調節配列に結合することによってもしくはこの調節配列から転写されたｍＲＮＡに結合することによって、上記染色体遺伝子の作用を阻害し得る。本発明のこの実施形態において、上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、好ましくはこのプラスミドの複製起点によってコードされる。
【００２０】
全てのプラスミドの複製起点は、転写されたＲＮＡを産生する。いくつかの場合において、プラスミド（例えば、プラスミドＲ１、プラスミドＲＫ６、プラスミドｐＴ１８１、プラスミドｐＭＶ１５８、およびプラスミドｐＩＰ５０１）の複製起点から転写されたＲＮＡは、複製の調節に直接的に用いられる。他の場合において、転写されたＲＮＡは、翻訳されてプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＰＳ１０、ｐ１５Ａ、Ｆ、Ｒ１００、Ｒ４５３、Ｐ１、ＲＫ２、ＲＡ１、ＲＳＦ１０１１０、ｐＣｏｌＩＶ−Ｋ３０、ＣｏｌＥ２、ＣＯｌＥ３、Ｒｔｓ１、ｐＬＳ２０、およびｐＵＢ１１０）の複製のために必要とされるタンパク質を提供する（Ｓｏｌａｒら、１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：４３４−３６３を参照）。
【００２１】
本発明は、上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列がこれらのプラスミドのうちのいずれか一つの複製起点から転写されるＲＮＡである、形質転換された宿主細胞を含む。この実施形態によると、上記染色体遺伝子に作動的に連結された調節配列、もしくはこの調節配列から転写されるｍＲＮＡは、このプラスミドの複製起点から転写されるＲＮＡに対してアンチセンスである。このプラスミドが存在しない場合において、この染色体遺伝子に作動的に連結された調節配列は、転写され、そして／もしくは翻訳され、細胞増殖の阻害をもたらす。プラスミドが存在する場合において、複製起点から転写されるＲＮＡは、この染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を可能にする。
【００２２】
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、上記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、ＲＮＡＩであり、上記染色体遺伝子の上流にある調節配列は、ＲＮＡＩＩもしくはその一部をコードする。あるいは、このプラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、ＲＮＡＩＩであり、この染色体遺伝子の上流にある調節配列は、ＲＮＡＩもしくはその一部をコードする。
【００２３】
ＲＮＡＩおよびＲＮＡＩＩは、研究用途および商業的用途の事実上全てのプラスミドの複製起点によってコードされる、二つの重なるＲＮＡ転写産物である。ＲＮＡＩＩは、プラスミドＤＮＡ合成の開始を始め、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて自律的プラスミド複製がおこることを可能にする。ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩのアンチセンスインヒビターであり、過剰のプラスミド複製を妨げ、プラスミドのコピー数が、宿主細胞によって支持され得る数を上回らないことを保証する。現在、このアンチセンス機構が、形質転換された宿主細胞におけるプラスミド維持を促進するために利用され得ることが、見出されている。
【００２４】
この実施形態によれば、本発明は、形質転換された宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、
ｉ）染色体遺伝子に作動的に連結された、ＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部であって、その染色体遺伝子は細胞増殖を阻害する、ＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部：および
ｉｉ）ＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部を含む、プラスミド、
を含み、上記ＲＮＡＩコード領域もしくは上記ＲＮＡＩコード領域の一部から転写されるＲＮＡＩは、上記ＲＮＡＩＩコード領域もしくは上記ＲＮＡＩＩコード領域の一部から転写されるＲＮＡＩＩに結合し、上記染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を許容する。
【００２５】
上記染色体遺伝子に作動的に連結されたＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部は、転写されて、ＲＮＡＩＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡが生成される。ＲＮＡＩをコードするプラスミドが存在しない場合において、細胞増殖は阻害される。細胞増殖は、このＲＮＡＩＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡが、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子もしくはそのような第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによって阻害され得る。あるいは、このＲＮＡＩＩ−染色体遺伝子は翻訳され得、そしてこの染色体遺伝子によってコードされる毒性タンパク質により、もしくは、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子を阻害する、この染色体遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質により、細胞増殖が阻害され得る。このプラスミドが存在する場合において、このプラスミドから転写されたＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡ中のＲＮＡＩＩに結合し、染色体遺伝子が細胞増殖を阻害することを防ぐ。
【００２６】
本発明はさらに、形質転換された宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、
ｉ）染色体遺伝子に作動的に連結されたＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部であって、この染色体遺伝子は細胞増殖を阻害する、ＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部：および
ｉｉ）ＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部を含む、プラスミド、
を含み、上記ＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部から転写されるＲＮＡＩＩは、上記ＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部から転写されるＲＮＡＩに結合し、上記染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を許容する。
【００２７】
上記の染色体遺伝子に作動的に連結されたＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部は、転写されて、ＲＮＡＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡを生成する。ＲＮＡＩＩをコードするプラスミドが存在しない場合において、細胞増殖は阻害される。細胞増殖は、このＲＮＡＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡが、細胞増殖に必須な第二の染色体遺伝子もしくはそのような第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによって、阻害され得る。あるいは、このＲＮＡＩ−染色体遺伝子は翻訳され得、この染色体遺伝子によってコードされる毒性タンパク質によって、もしくは、細胞増殖に必須な第二の染色体遺伝子を阻害する、この染色体遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質によって、細胞増殖が阻害され得る。このプラスミドが存在する場合、このプラスミドから転写されるＲＮＡＩＩは、ＲＮＡＩ−染色体遺伝子ｍＲＮＡ中のＲＮＡＩに結合し、この染色体遺伝子が細胞増殖を阻害することを妨げる。
【００２８】
全てのプラスミドは、複製起点から転写されるＲＮＡを産生し、ほとんどの商業的に入手し得るプラスミドは、ＲＮＡＩコード領域およびＲＮＡＩＩコード領域を含む複製起点を含む。用いられるプラスミド内へのｌａｃオペレーター系のクローニングにプラスミドの維持を依存している、ＥＰ０８５１９３２において開示される系とは異なり、本発明は、形質転換される宿主細胞における、任意の複製起点を含む任意の商業的に入手し得るプラスミドの維持を可能にし、これらのプラスミド内に任意のさらなる配列をクローニングすることを必要とせずに、これらのプラスミドを維持する宿主細胞の選択を可能にする。このことは、プラスミドの大きさが縮小されて、ＤＮＡワクチンおよび遺伝子治療への適用におけるプラスミドの有効用量を増加するという利点を有する。不必要な細菌ＤＮＡの除去もまた、ＣｐＧジヌクレオチドに対する、免疫応答の危険性を低下させる。
【００２９】
加えて、プラスミドの維持は、抗生物質選択を用いずに達成され得る。このプラスミドは、それゆえに、抗生物質耐性遺伝子の存在を必要としない。このプラスミドに抗生物質耐性遺伝子が存在しないことは、特にこのプラスミドもしくはこのプラスミドによってコードされる産物が治療に用いられることが意図される状況において、多くの利点を有している。第一に、このプラスミドに抗生物質耐性遺伝子が存在しないことは、抗生物質耐性遺伝子が潜在的な病原体を含めた環境内生物体に移動する危険性を取り除く。このプラスミドに抗生物質耐性遺伝子が存在しないことは、また、細胞から単離されたプラスミドがプラスミド選択のために用いられた残留抗生物質によって汚染されることを防止し、従って、残留抗生物質の存在についてプラスミドを試験する必要性、および抗生物質耐性遺伝子が患者の細胞において有害な効果をもたらす危険性を、取り除く。選択が抗生物質耐性に依存しないという事実は、培養中の抗生物質分解に起因するプラスミド選択圧の欠如の問題を回避する。
【００３０】
本発明において使用するためのプラスミドとしては、複製起点から転写されるＲＮＡが複製の調節に直接的に用いられるプラスミド（例えば、プラスミドＲ１、ＲＫ６、ｐＴ１８１、ｐＭＶ１５８、およびｐＩＰ５０１）、および、複製起点から転写されるＲＮＡが翻訳されてプラスミドの複製のために必要とされるタンパク質を提供するプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＰＳ１０、ｐ１５Ａ、Ｆ、Ｒ１００、Ｒ４５３、Ｐ１、ＲＫ２、ＲＡ１、ＲＳＦ１０１１０、ｐＣｏｌＩＶ−Ｋ３０、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、Ｒｔｓ１、ｐＬＳ２０、およびｐＵＢ１１０）が挙げられる。好ましくは、本発明において使用するためのプラスミドは、ＲＮＡＩコード領域およびＲＮＡＩＩコード領域を含む複製起点を、含む。ＲＮＡＩコード領域およびＲＮＡＩＩコード領域を含む複製起点を含むプラスミドとしては、ＣｏｌＥ１ｏｒｉおよびｐＭＢ１ｏｒｉのような、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉを含むプラスミドが挙げられる。
【００３１】
細胞増殖を阻害する染色体遺伝子に作動的に連結された、ＲＮＡＩＩコード領域、ＲＮＡＩコード領域、もしくはそれらの一部は、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。好ましくは、細胞増殖を阻害する染色体遺伝子に作動的に連結された、ＲＮＡＩＩコード領域、ＲＮＡＩコード領域、もしくはそれらの一部は、構成的プロモーターの制御下にある。適切な構成的プロモーターは、当該分野において公知であり、適切な構成的プロモーターとしては、例えば、ｔｒｃプロモーターのようなＥ．ｃｏｌｉプロモーターからの−３５配列および−１０配列を含むプロモーターが挙げられる。
【００３２】
本発明の第二の局面によれば、細胞増殖を阻害する染色体遺伝子を含む宿主細胞が提供され、この染色体遺伝子は、その上流に位置する調節配列に作動的に連結されており、この調節配列は、プラスミドの複製起点から転写されるＲＮＡの配列に対してアンチセンスである配列を含むか、もしくは、この調節配列は、プラスミド複製起点から転写されるＲＮＡの配列に対してアンチセンスであるＲＮＡ配列をコードする。この調節配列の性質は、この宿主細胞が形質転換されることが意図されるプラスミドの特性に依存する。適切なプラスミド複製起点の例は、上記に提供される。これらの複製起点から転写されるＲＮＡに対してアンチセンスである調節配列を設計する方法は、当業者にとって明らかである。
【００３３】
好ましくは、この調節配列は、ＲＮＡＩコード領域もしくはＲＮＡＩコード領域の一部、またはＲＮＡＩＩコード領域もしくはＲＮＡＩＩコード領域の一部を含む。細胞増殖を阻害する染色体遺伝子に作動的に連結された、これらのＲＮＡＩＩコード領域、ＲＮＡＩコード領域、もしくはそれらの一部は、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。好ましくは、細胞増殖を阻害する染色体遺伝子に作動的に連結された、これらのＲＮＡＩＩコード領域、ＲＮＡＩコード領域、もしくはそれらの一部は、構成的プロモーターの制御下にある。適切な構成的プロモーターは、当該分野において公知であり、適切な構成的プロモーターとしては、例えば、ｔｒｃプロモーターのような、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターからの−３５配列および−１０配列を含むプロモーターが挙げられる。
【００３４】
本発明のこの第二の局面による宿主細胞は、本発明の第一の局面による形質転換された宿主細胞を産生するために、ＲＮＡＩコード領域およびＲＮＡＩＩコード領域を含むプラスミドを用いて形質転換されてもよい。
【００３５】
本発明のこの宿主細胞および形質転換された宿主細胞は、インビトロにおいて培養中であってもよい。適切な宿主細胞の例は、本明細書中に提供される。
【００３６】
本発明の第三の局面によれば、インビトロで宿主細胞内にプラスミドを維持する方法が提供され、この方法は、上記において記載されるように形質転換された宿主細胞を、この細胞が増殖することを許容するのに十分な条件下で培養する工程を含む。この方法は、抗生物質耐性が存在しない場合において、プラスミドの維持および選択が行われることを可能にし、このことは、この方法を治療への適用のためのプラスミドＤＮＡもしくは組換えタンパク質の産生のために特に適切にする。本発明の第四の局面によれば、プラスミドＤＮＡを産生する方法が提供され、この方法は、本発明の第三の局面の方法をおこなう工程およびプラスミドＤＮＡを単離する工程を包含する。本発明の第五の局面によれば、組換えタンパク質を産生する方法が提供され、この方法は、本発明の第三の局面の方法に従う目的のタンパク質をコードするプラスミドを含む形質転換された宿主細胞を培養する工程、およびそのタンパク質をその細胞から単離する工程、を包含する。
【００３７】
本発明の形質転換された宿主細胞および宿主細胞は、それら自体が治療への適用を有し得る。本発明の第六の局面によれば、治療における使用のための、本発明の第一の局面による形質転換された宿主細胞が提供される。
【００３８】
本発明の第七の局面によれば、薬学的組成物が提供され、この薬学的組成物は、本発明の第一の局面による形質転換された宿主細胞と、それに加えて、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤もしくは緩衝剤（例えば、当業者にとって周知である薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤もしくは緩衝剤）を含む。この局面の一つの実施形態によれば、この薬学的組成物は、ワクチン組成物である。このワクチン組成物は、賦形剤、希釈剤もしくは緩衝剤に加えて、一つ以上のアジュバントを含んでもよい。
【００３９】
本発明の第八の局面によれば、薬の製造において、本発明の第一の局面による形質転換された宿主細胞の使用が、提供される。好ましくは、この形質転換された宿主細胞は、遺伝子送達系として用いられてもよい。例えば、この形質転換された宿主細胞は、遺伝子治療目的でプラスミドにある目的の遺伝子を送達するために用いられてもよい。この形質転換された細胞はまた、プラスミドにある目的の（その転写産物が治療的効果を有する）遺伝子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を送達するために、もしくは治療的効果を有するタンパク質をコードする目的の遺伝子を送達するために、用いられてもよい。
【００４０】
あるいは、この形質転換された宿主細胞は、免疫原を送達するために用いられてもよい。この実施形態において、プラスミドにある目的の遺伝子は、免疫応答を惹起する一つ以上の抗原をコードしてもよい。当業者は、免疫応答を惹起する抗原をコードしていて本発明の形質転換された細胞内のプラスミドに含まれ得る、目的の遺伝子が分かる。
【００４１】
本発明の第九の局面によれば、処置の方法が提供され、この処置の方法は、上記に記載された形質転換された宿主細胞、もしくはそれらを含む組成物を患者に投与する工程を、包含する。特に、目的の遺伝子を患者に送達する方法が提供され、この方法は、上記に記載される形質転換された宿主細胞もしくはそれらを含む組成物を患者に投与する工程を、包含する。上記に記載されるように、形質転換された宿主細胞内のプラスミドにある目的の遺伝子は、それ自体が遺伝子治療目的のために有用であってもよく、または、この目的の遺伝子の転写産物もしくは転写および翻訳の産物が、治療的特性を有してもよい。
【００４２】
本発明の第十の局面によれば、病原体によって引き起こされる疾患に対して患者を免疫化する方法が提供され、この方法は、上記に記載される形質転換された宿主細胞もしくはそれらを含む組成物を患者に投与する工程を、包含する。この細胞内のプラスミドにおいて見出される目的の遺伝子は、この病原体に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする。細胞の性質および目的の遺伝子の発現を制御するプロモーターの性質によって、この抗原はこの細胞が患者に投与される前にこの細胞において発現されてもよく、もしくは、投与後に患者において発現されるこの抗原と共に、このプラスミドを含む細胞が患者に投与されてもよい。好ましくは、上記で記載したように、この細胞は細菌細胞であり、この目的の遺伝子は、細菌のプロモーターもしくは真核細胞のプロモーターのいずれかに機能的に連結される。
【００４３】
本発明の第十一の局面によれば、インビボの宿主細胞内にプラスミドを維持する方法が提供され、この方法は、本発明の第一の局面による形質転換された宿主細胞をレシピエント生物体に供給する工程を包含する。好ましくは、このレシピエント生物体は哺乳類、好ましくはヒトである。本発明のこの局面によれば、上記染色体遺伝子は、好ましくは、インビボで細胞増殖を阻害し、その結果、このプラスミドを維持する宿主細胞のみが、レシピエント生物体においてインビボで生存する。例えば、この染色体遺伝子は、この細胞の完全性にとって必須であるタンパク質をコードする第二の染色体遺伝子についてのリプレッサータンパク質をコードしてもよい。
【００４４】
本発明における使用のために適切なプラスミドに運ばれる目的の遺伝子、宿主細胞、および細胞増殖を阻害する染色体遺伝子の例、ならびに本発明の形質転換された宿主細胞の医療への適用についての情報は、以下に提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
（染色体遺伝子）
本発明の宿主細胞および形質転換された宿主細胞内に含まれる染色体遺伝子は、増殖を阻害する任意の遺伝子であり得る。
【００４６】
（増殖を直接的に阻害する染色体遺伝子）
細胞増殖を直接的に阻害する好ましい染色体遺伝子としては、トキシンをコードする遺伝子が挙げられる。本発明において用いられ得る、トキシンをコードする遺伝子の例としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのｓａｃＢ遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉのＦプラスミド内のｃｃｄＢによってコードされるＣｃｄＢ、プラスミドＲＫ２からのｐａｒＤ遺伝子によってコードされるＫｉｄタンパク質、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子および抗生物質遺伝子が挙げられる。
【００４７】
（増殖のために必須の遺伝子を阻害することによって増殖を間接的に阻害する染色体遺伝子）
増殖を間接的に阻害する好ましい染色体遺伝子としては、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子を阻害するタンパク質リプレッサーをコードする染色体遺伝子、および、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子を阻害するアンチセンス配列をコードする染色体遺伝子が挙げられる。本発明の一つの実施形態において、この第二の染色体遺伝子は、細胞増殖のために条件的に必須である。
【００４８】
この染色体遺伝子がタンパク質リプレッサーをコードする場合、第二の染色体遺伝子は、好ましくは、そのリプレッサーによって従来的に阻害されるオペレーターおよびプロモーターに作動的に連結される。
【００４９】
例えば、この染色体遺伝子がタンパク質リプレッサーＬａｃＩをコードするならば、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子は、好ましくはｌａｃオペレーターおよびｌａｃプロモーターに作動的に連結される。Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃリプレッサーは、「Ｔｈｅ Ｌａｃｔｏｓｅ Ｏｐｅｒｏｎ」（Ｊ．Ｂｅｃｋｗｉｔｈ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍら編、１９８７年、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ．、１４４４〜１４５２頁）およびＤｉｃｋｓｏｎら（１９７５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ １８７：２７−３５）において記載される。ｌａｃオペロンは以下のように調節される。非誘導条件下（例えば、ブドウ糖での増殖）では、ＬａｃＩはｌａｃオペロンのオペレーターに結合し、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ラクトースパーミアーゼ（ＬａｃＹ）、およびトランスアセチラーゼ（ＬａｃＡ）の転写を妨げる。誘導性条件下（例えば、ラクトースでの増殖、もしくは代謝できないアナログであるＩＰＴＧの添加）では、リプレッサーはもはやオペレーターに結合せず、転写が起こる。オペロンの発現は、β−ガラクトシダーゼについてのアッセイによって容易に検出される。
【００５０】
本発明に従う有用な他のリプレッサー系としては、真核細胞における遺伝子活性の調節において用いるためのｔｅｔリプレッサー系（Ｇｏｓｓｅｎら（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，５１６−５２０）が挙げられる。ｔｅｔリプレッサー系は、酵母、タマホコリカビ（ｄｉｃｔｉｏｓｔｅｌｉｕｍ）、植物細胞およびタバコ植物において用いられている。本発明に従うさらなる有用なリプレッサー系は、ＡｒｇＲＮＶリプレッサー系（Ｂｕｒｋｅら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３，６０９−６１８）である。ＡｒｇＲリプレッサーは、正常にはアルギニンが存在する場合においてのみそのオペレーターに結合する。しかし、変異ＡｒｇＲＮＶリプレッサーは、アルギニンが存在しない場合においてそのオペレーターに結合し、アルギニンが存在する場合においても結合したままであり、トランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）効果を有する。二つの対称なＡｒｇボックスを有する理想化されたＡｒｇＲ結合部位（オペレーター）は、目的のプラスミド内へ操作され得、ＡｒｇＲ結合部位によって発現が制御される必須遺伝子からの、ＡｒｇＲＮＶの結合除去を可能とする。
【００５１】
本発明に従えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐリプレッサーもまた有用である（「Ｔｈｅ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｏｐｅｒｏｎ」、Ｙａｎｏｆ ｓｋｙおよびＣｒａｗｆｏｒｄ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍら編、１９８７年、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ．、１４５３〜１４７２頁を参照）。ｔｒｐリプレッサーは、約５０コピー／細胞で存在し、発酵培地中にリプレッサー結合の誘導因子としてトリプトファンの存在を必要とする。
【００５２】
本発明に従えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｇａｌＲリプレッサーは有用である（「Ｔｈｅ Ｇａｌａｃｔｏｓｅ Ｏｐｅｒｏｎ」、Ｓ．Ａｄｈｙａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍら編、１９８７年、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ．、１５０３〜１５１２頁を参照）。
【００５３】
本発明に従えば、Ｅ．ｃｏｌｉのａｒａＣリプレッサーもまた有用である（「Ｔｈｅ Ｌ−Ａｒａｂｉｎｏｓｅ Ｏｐｅｒｏｎ」、Ｒ．Ｓｃｈｌｉｅｆ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍら編、１９８７年、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ．、１４７３〜１４８１頁；Ｄｕｎｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．８１：５０１７−５０２０を参照）。ａｒａＣリプレッサーは、アラビノースの存在する場合において結合親和性が増大する。
【００５４】
最後に、本発明に従えば、Ａリプレッサーは有用である（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｌａｍｂｄａ Ｐｈａｇｅｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年、第３節、ユニット１．９；Ｈｏｃｈｓｃｈｉｌｄら、１９８６年、Ｃｅｌｌ ４７（５）：８０７−８１６）。
【００５５】
細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子は、細胞の代謝産物の生合成に関係する産物をコードする遺伝子、その遺伝子の産物が炭素代謝に関与する遺伝子、または、高分子の生合成もしくは調節をコードする遺伝子（例えば、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡの合成機能および複製機能のために必須の遺伝子）であってもよい。
【００５６】
細胞の構成要素の供給、特に細胞壁の前駆体の供給と関与する酵素をコードする特定の遺伝子は、細胞増殖のために必須であり、本発明に従って、有用である。例えば、細菌の細胞壁は、メソジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を含み、この構成要素を合成することが出来ないことは、溶菌をもたらす。ＤＡＰ生合成経路内の遺伝子、すなわち、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子、ｄａｐＣ遺伝子、ｄａｐＤ遺伝子、およびｄａｐＥ遺伝子は、それゆえ、第一の染色体遺伝子によって阻害される、細胞増殖のために必須の第二の染色体遺伝子として用いられ得る。ｄａｐＡおよびｄａｐＢは、クローニングされて塩基配列が決定されており、ｄａｐＢはひとつのシストロンとして利用可能である（Ｒｉｃｈａｕｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２９７−３００，１９８６年；Ｂｏｕｖｉｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１４８２９−１４８３４，１９８４年）。
【００５７】
他の細胞壁構成要素の生合成（例えば、Ｄ−アラニン生合成）に関与する遺伝子もまた本発明に従って有用である（Ｗａｌｓｈ、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（５）：２３９３−２３９６）。
【００５８】
脂肪酸生合成に関与する遺伝子もまた、本発明に従って有用である。一つの例は、ｆａｂＡであり、ｆａｂＡは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰデヒドラーゼをコードしており、不飽和脂肪酸生合成と飽和脂肪酸生合成とが分岐する点での、伸長する脂肪酸鎖への二重結合の導入の原因である（Ｃｒｏｎａｎ Ｊｒ．Ｊ．Ｅ．およびＲｏｃｋ．Ｃ．Ｏ．（１９８７）Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄｓ、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」。Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ．Ｆ．Ｃ．編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）。この酵素は比較的高い濃度で存在し、ｆａｂＡ変異体は、不飽和脂肪酸が補われないと溶菌する。
【００５９】
あるいは、細胞増殖に必須の第二の染色体遺伝子は、炭素源の利用と関与する遺伝子であってもよい。具体的には、この第二の染色体遺伝子は、ラクトースオペロンの遺伝子を含んでもよく、その結果、ラクトースが唯一の炭素源である条件において、プラスミドを維持しておりｌａｃオペロンの遺伝子が発現される細胞のみが、生存し得る。他の改変は、当業者にとって明らかである。
【００６０】
グルタミンシンテターゼは、ＮＳＯミエローマ細胞株（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，１６９−１７５）のような真核細胞にとっての必須遺伝子であって、好ましくは、宿主細胞が真核細胞である場合に第二の染色体遺伝子として用いられる。
【００６１】
この第二の染色体遺伝子はまた、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの合成タンパク質または複製タンパク質をコードする必須遺伝子であってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａのような細菌におけるこれらの必須機能に関するそのような遺伝子の例は、ＭｃＭａｃｋｅｎら（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ，，Ｗａｓｈ．Ｄ．Ｃ．，１９８７年、５６４〜６１２頁）において提供され、以下の遺伝子を含むが、以下の遺伝子に限定されない：ｄｎａＡ、ｄｎａＢ、ｄｎａＣ、ｓｓｂ、ｄｎａＧ、ｐｏｌＣ（ｄｎａＥ）、ｄｎａＱ（ｍｕｔＤ）、ｄｎａＮ、ｄｎａＺＸ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｐｏｌＡ、ｌｉｇ、ｄｎａＴ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、およびｒｐｏＤ。
【００６２】
好ましくないが、この第二の染色体遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子であってもよく、その結果、プラスミドを用いるその株の形質転換が、その抗生物質の存在する場合における増殖を可能にする。
【００６３】
医療への適用に使用するための形質転換された宿主細胞に対して、投与経路に依存して、局所環境内の多くの要因が選択圧をかけ得る。そのような圧力に抵抗する能力が同定される遺伝子に連鎖しているならば、この遺伝子は、選択マーカーとして用いられ得る。例えば、細胞、特に経口で投与されることになる細菌細胞にとって、胃の内容物の低いｐＨへの抵抗性は、重要な選択的利点を構成する。このことと関連することが示される遺伝子のうちには、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓのｕｖｒＡ遺伝子（Ｈａｎｎａら、２００１年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８３：５９６４）、Ｅ．ｃｏｌｉ．のｇａｄＡ遺伝子、ｇａｄＢ遺伝子、ｇａｄＣ遺伝子（Ｃａｓｔａｎｉｅ−ＣｏｒｎｅｔおよびＦｏｓｔｅｒ、２００１年 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７：７０９）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｒｐｏＳ遺伝子、ｆｕｒ遺伝子、ａｔｐ遺伝子、およびａｔｂＲ遺伝子（Ｂａｉｋら、１９９６年 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４２：３１９５）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉのｌｅｐＡ遺伝子、Ｆｒａｓｅｌ遺伝子、ｃｚｃＡ遺伝子、ｕｖｒＡ遺伝子、ａｔｐＦ’遺伝子、およびアルド−ケトレダクターゼ遺伝子（Ｂｉｊｌｓｍａら、２０００年、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １８２：１５６６）、ならびに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのＦ０Ｆ１ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子（Ｃｏｔｔｅｒら、２０００年、Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ６０：１３７）がある。
【００６４】
細胞内での生存を与える遺伝子（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのＳｖｐＡ（Ｂｏｒｅｚｅｅら、２００１年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７：２９１３）もしくは、リソソームのような特定の細胞内局在に対する抵抗力もまた、適切な宿主細胞において有用であり得る。
【００６５】
細胞増殖を間接的に阻害する好ましい遺伝子としては、細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子に結合することによって、または細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによって、この第二の染色体遺伝子を阻害するアンチセンス配列をコードする、染色体遺伝子も挙げられる。
【００６６】
アンチセンス配列とは、このアンチセンス配列の標的配列に実質的に相補的である配列であって、その標的配列に特異的にハイブリダイゼーションする能力を有する。このアンチセンス配列は、細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子に直接的に結合するか、またはその第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することのいずれかによって作用し得るので、この標的配列は、この第二の染色体のコード鎖もしくは非コード鎖のいずれかの配列、またはそれらの配列の一部であってもよい。標的配列に特異的にハイブリダイゼーションする能力を有するアンチセンス配列を調製する方法は、当業者によって公知である（例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１０，４３５（１９８９）、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６，５６０（１９９１）；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ５６，５６０（１９９１）；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ６，３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１，１３６０（１９９１）を参照）。
【００６７】
好ましくは、このアンチセンス配列は、ストリンジェントな条件の下で、その標的配列にハイブリダイゼーションする。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、以下のように定義される：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％のデキストラン硫酸、および２０マイクログラム／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、４２℃での一晩のインキュベーションと、その後の０．１×ＳＳＣ中でのおよそ６５℃でのフィルターの洗浄。
【００６８】
上記に示されるように、第一の染色体遺伝子は、細胞増殖のために必須な遺伝子の阻害もしくは細胞増殖を阻害する遺伝子の活性化を最終的にもたらす、多くの遺伝子を含む反応のカスケードを開始することによって、細胞増殖を阻害し得る。例えば、この第一の染色体遺伝子は、第二の染色体遺伝子を阻害するリプレッサータンパク質をコードし得、この第二の遺伝子は、細胞増殖のために必須な第三の染色体遺伝子を他の状態では活性化するアクチベーターをコードする。あるいは、この第一の染色体遺伝子は、第二の染色体遺伝子を阻害するリプレッサータンパク質をコードし得、この第二の染色体遺伝子は、細胞増殖を阻害する第三の染色体遺伝子を他の状態では阻害するアンチセンス配列をコードする。これらが本発明の必要条件を満たす遺伝子の多くのカスケードの例に過ぎないことは、当業者にとって明らかである。
【００６９】
（改変された宿主細胞の産生）
上記の細胞増殖を阻害する染色体遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に天然に存在する遺伝子であってもよく、あるいは外来遺伝子であってもよい。
【００７０】
プラスミドによってコードされるアンチセンス配列が、上記の染色体遺伝子に作動的に連結される調節配列に結合することによってこの染色体遺伝子を阻害する場合、この染色体遺伝子は、外因性の調節配列に作動的に連結されている、天然に存在する遺伝子であってもよい。例えば、天然に存在するトキシン遺伝子の発現を通常では制御する配列が除去されてもよく、このトキシン遺伝子が代わりに、構成的プロモーターの制御下で、外因性のＲＮＡＩコード配列に作動的に結合されてもよい。同様に、天然に存在するリプレッサータンパク質の発現を通常では制御する配列が除去されてもよく、このリプレッサータンパク質遺伝子が代わりに、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの制御下で、外因性のＲＮＡＩＩコード配列に作動的に連結されてもよい。従って、本明細書中の実施例２において、天然に存在するリプレッサータンパク質であるｌａｃＩは、ＲＮＡＩＩコード領域に作動的に結合される。
【００７１】
あるいは、この調節配列がＲＮＡＩコード配列もしくはＲＮＡＩＩコード配列であって、この染色体遺伝子が細胞増殖のために必要である第二の染色体遺伝子を阻害するアンチセンス配列をコードする場合のように、この調節配列およびこの染色体遺伝子の両方が外因性であってもよい。
【００７２】
細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子が存在するならば、この第二の染色体遺伝子もまた、天然に存在する遺伝子または外来遺伝子のいずれであってもよい。
【００７３】
細胞増殖を阻害する染色体遺伝子は、特に宿主細胞が真核細胞の宿主細胞である場合において、この細胞のゲノム内に複数コピーで存在し得る。
【００７４】
本発明において用いるために適切な宿主細胞を産生するために、細胞を操作する方法は、当業者にとって明らかである。
【００７５】
（宿主細胞）
本発明は、動物細胞（例えば、哺乳類細胞および昆虫細胞）、植物細胞、真菌（例えば、酵母）、細菌、および古細菌を含む、全ての細胞型に対して適用され得る。
【００７６】
宿主細胞が細菌細胞である場合、この宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞であってもよく、グラム陽性細菌細胞であってもよい。この細胞がグラム陰性細菌細胞である場合、この細胞は、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞もしくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である。この細胞がグラム陽性細菌細胞である場合、この細胞は、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、もしくはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞である。
【００７７】
特に有用であるのは、レシピエント生物体における治療用途が自由な、受容可能な程度にまで副作用が無いように弱毒化されている、弱毒化された宿主細胞である。この細胞の特性に依存して、この細胞は、獣医学的用途もしくはヒトの治療用途のために適切であり得る。
【００７８】
入手し得る弱毒化された細菌の中では、以下のものがある：
ＳＬ３２６１株（ａｒｏＡ変異体、Ｔｉｔｂａｌｌら、１９９７年、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：１９２６、Ｔｉｔｂａｌｌら、１９９５年、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３：５６３）、ＶＮＰ２０００９株
（ｐｕｒｌおよびｍｓｂＢの変異体、Ｔｏｓｏら、２００２年、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０：１４２）を含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；
ＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡ株、χ４０７３株、χ４６３２株、Ｔｙ８００株、ＣＶＤ ９０９株、およびＣＶＤ ９１５株を含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（Ｇａｌｅｎら、１９９９年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：６４２４−６４３３；Ｍｏｒｏｎａら、１９９１年、Ｇｅｎｅ １０７：１３９−１４４；Ｔａｃｋｅｔら、１９９７年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：３３８１−３３８５；Ｇａｒｍｏｒｙら、２００２年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２６：３３９−３５３）；
９Ｒ株を含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（鳥類のワクチン接種のため、Ｆｅｂｅｒｗｅｅら、２００１年、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ ４５：１０２４）；
ａｒｏＡ変異体、ｃｎｆｌ変異体、およびＯＭＰ変異体を含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｒｉｐｐｅｒｅ−Ｌａｍｐｅら、２００１年、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６９：３９５４）；
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ｇｕａＢＡ株を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（Ａｌｔｂｏｕｍら、２００１年、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６９：３１５０）；
Ｐｅｒｕ２株を含む、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ（Ｒｙａｎら、２０００年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：２２１−２２６）；
ＰｒｆＡ変異体およびＳｖｐＡ変異体を含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｓｈｅｅｈａｎら、１９９６年、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０：７８５；Ｂｏｒｅｚｅｅら、２００１年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４７：２９１３）；
ＲＢ５１株を含む、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ（Ｖｅｍｕｌａｐａｌｌｉら、２０００年、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６８：３２９０）；
Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）株を含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ；および
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ。
【００７９】
（本発明に従って有用である、プラスミドによって運ばれる遺伝子）
本発明の形質転換された宿主細胞内のプラスミドで運ばれる目的の遺伝子は、任意の遺伝子であり得る。この遺伝子は、レシピエント生物体に送達された場合に治療効果を有する遺伝子であり得る。例えば、遺伝子治療目的のためにレシピエント生物体にこの遺伝子を送達することが所望され得る。
【００８０】
あるいは、遺伝子の転写産物もしくは転写および翻訳の産物が治療効果を有するので、この遺伝子をレシピエント生物体に送達することが所望され得る。例えば、目的の遺伝子の転写産物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよく、あるいは、この目的の遺伝子は、治療効果を有する抗原をコードしてもよい。特に、目的の遺伝子は、レシピエント生物体において免疫応答を惹起する一つ以上の抗原をコードしてもよい。レシピエント生物体において免疫応答を誘導するためにプラスミドに含まれ得る目的の遺伝子の例は、ｃａｆオペロンのｃａｆＩ遺伝子、ｃａｆ１Ａ遺伝子、ｃａｆ１Ｍ遺伝子がある。
【００８１】
目的の遺伝子が転写されるもしくは転写されて翻訳されることが望ましい場合、この目的の遺伝子は、好ましくはプロモーターと機能的に結合する。好ましくは、このプロモーターは真核生物のプロモーターもしくは細菌のプロモーターである。目的の遺伝子と機能的に結合するプロモーターの選択、および宿主細胞の選択は、宿主細胞において、レシピエント生物体への投与に先立って、もしくはレシピエント生物体への投与の後でのみ、目的の遺伝子が転写されるか、または転写されて翻訳されるかを決定する。
【００８２】
いくつかの場合において、目的の遺伝子を既に発現している宿主細胞に送達することが、所望され得る。この場合において、この目的の遺伝子と機能的に結合しているプロモーターは、その結果として、このプロモーターがこの宿主細胞内で作動し、この宿主細胞内におけるこの目的の遺伝子の転写および翻訳を促進するように、選択される。例えば、この宿主細胞が細菌細胞である場合、この状況においてこの目的の遺伝子と機能的に結合しているプロモーターは、細菌のプロモーターであってもよい。
【００８３】
他の場合において、この目的の遺伝子を含むプラスミドを含む宿主細胞をレシピエント生物体に送達するが、この目的の遺伝子の発現をこの細胞のレシピエント生物体への送達後にまで遅延させることが、所望され得る。例えば、この宿主細胞が細菌細胞である場合、この状況においてこの目的遺伝子と機能的に結合しているプロモーターは、この宿主細胞においてこの目的の遺伝子の転写および翻訳を促進しないが、レシピエント生物体への投与の後にこの目的の遺伝子の転写および翻訳を促進する、真核生物のプロモーターであってもよい。
【００８４】
（本発明に従って有用であるワクチン接種の方法）
本発明によって形質転換された宿主細胞を用いるワクチン接種は、多くの投与経路のいずれによってであってもよいことが、予想される。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍについては、例えば、有用な経路は、皮内注射もしくは皮下注射によってである。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、もしくはＥ．ｃｏｌｉのような腸内細菌については、経口投与（特に、耐酸性形質転換体の経口投与）または直腸投与が好ましい。いくつかの状況においては、粘膜投与、静脈内投与、もしくは腹腔内投与が、好適であり得る。
【００８５】
（他のインビボでの適用のための投与）
非ワクチン接種適用のための多くの投与方法が用いられ得ることが、予想される。
【００８６】
ワクチン接種のために用いられる経腸投与経路および非経口投与経路に加えて、非ワクチン適用は、他の手順を必要とし得る。他の手順の中では、本発明による細胞が中に含まれる移植可能な浸透性の容器の使用がある。
【００８７】
本発明は、ここで、一例としてプラスミドの複製起点を選択マーカーとして使用するプラスミド維持系を参照して、さらに詳細に記載される。実施例において記載される系に対して変更がなされ得ることが、理解される。
【実施例】
【００８８】
本発明は、複製起点（ｐＭＢ１ ｏｒｉもしくはＣｏｌＥＩ ｏｒｉ）のみを選択マーカーとして用いてプラスミドの選択およびプラスミドの維持を可能とし、本明細書中でｏｒｉＳＥＬＥＣＴと言及される。図１において示すように、これらのＣｏｌＥＩ適合性ｏｒｉは、二つの重なるＲＮＡ転写産物をコードする：ＲＮＡＩＩは、プラスミドＤＮＡ合成の開始を始め、ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩのアンチセンスインヒビターである（Ｓｃｏｔｔら、１９８４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８：１−２３；Ｃｈａｎら、１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８９２５−８９３５）。研究用途もしくは商業的用途の事実上全てのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ内での自律複製をこれらの複製起点に依存している。
【００８９】
本発明は、あるオペロンにおいて阻害的遺伝子エレメントに連結されたＲＮＡＩＩコード領域を含むようにゲノムが改変されているＥ．ｃｏｌｉの形質転換株の構築を、含み得る。プラスミド産生性ＲＮＡＩのＲＮＡＩＩ−ｍＲＮＡ融合体へ結合は、その阻害遺伝子ｍＲＮＡの転写を妨害し、それによって細胞の生存および増殖を可能にする。このプラスミド維持系の３つの提案される機構は、以下に記載される。
【００９０】
（実施例１：リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴ）
図２において示すように、リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおける使用のための宿主細胞のゲノムは、リプレッサー遺伝子シストロンに連結されたＲＮＡＩＩコード領域を含み、ＲＮＡＩＩコード領域およびリプレッサー遺伝子シストロンの両方は、構成的ＲＮＡＩＩプロモーターの制御下にある。リプレッサーシストロンに連結されたＲＮＡＩＩコード領域はまた、図８において示されるような、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｒｃプロモーターにおいて見出される−１０配列および−３５配列ならびにスペーシングに基づくプロモーターのような、代替的な構成的プロモーターの制御下にあり得る。宿主細胞のゲノムはまた、誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下での細胞増殖のために必須な遺伝子を含む（図８においては示さない）。
【００９１】
プラスミドが無い場合において、リプレッサータンパク質が発現し、そして必須遺伝子（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ）の発現を制御するオペレーター／プロモーターに結合することによって必須遺伝子を抑制し、細胞増殖を阻害する。プラスミド産生性ＲＮＡＩの、ＲＮＡＩＩ−リプレッサーｍＲＮＡ融合体内のＲＮＡＩＩ転写産物への結合は、リプレッサーの翻訳を妨げ、必須遺伝子の発現を可能にし、それによって細胞増殖を可能にする。
【００９２】
リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおける使用のためにこの宿主細胞を構築するために、ｄａｐＤ（Ｒｉｃｈａｕｄら、１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１４８２４−１４８２８）もしくはｆａｂＡ（Ｃｒｏｎａｎら、１９８７，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄｓ、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）のような必須遺伝子を、細菌株の染色体から欠失させ、誘導性プロモーター（例えば、Ｐｌａｃ）の制御下に置き、そしてその染色体内へ挿入し戻す。その誘導性プロモーターに結合している、リプレッサーをコードしている遺伝子（この場合においてはｌａｃＩ）を、染色体から欠失させる。このリプレッサー遺伝子を、両方の転写を駆動する構成的ＲＮＡＩＩプロモーター（もしくは任意の他の構成的プロモーター、例えばＥ．ｃｏｌｉのｔｒｃプロモーターにおいて見出される−１０配列および−３５配列ならびにスペーシングに基づくプロモーター）と共に、ＲＮＡＩＩの一部をコードしている領域の下流のオペロン内に置く。ＲＮＡＩＩコード領域の３’末端を、リプレッサーのリボソーム結合部位を含むように改変し、このためＲＮＡＩＩコード領域の３’末端は重なり、ＲＮＡＩによって妨げられる。いくつかの場合においては、ＲＮＡＩＩコード領域の３’末端とｌａｃのリボソーム結合部位との間の距離を増大させることによって、ＬａｃＩリプレッサータンパク質の発現を増加させ得る。この構築物を、染色体の中へ挿入する。
【００９３】
その細胞はそれからリプレッサーを構成的に産生する。リプレッサータンパク質は、必須遺伝子を制御している染色体オペレーターに結合し、それによって細胞増殖を妨害する。その細胞をＣｏｌＥＩ適合性ｏｒｉを含むプラスミドを用いて形質転換するとき、ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩに結合し、そして下流のリプレッサー遺伝子の翻訳を妨げ、細胞増殖を可能にする。
【００９４】
染色体の必須遺伝子がその必須遺伝子自体の結合したリプレッサーを有するのであれば、このリプレッサー（マイナスそのリプレッサーのプロモーター）をＲＮＡＩＩの下流のオペロン内へ操作してもよく、そしてこのオペロンを野生型リプレッサーと置き換えさせるために細菌の染色体内へ挿入してもよい。
【００９５】
上記の必須遺伝子は、条件的に必須な外来遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）であり得る。
【００９６】
必須な外来遺伝子が誘導性であり、かつその遺伝子自体の結合した外来リプレッサーを有するのであれば、このリプレッサー遺伝子をＲＮＡＩＩの下流のオペロン内へ操作してもよく、そしてこのオペロンを細菌の染色体内へ挿入してもよい。
【００９７】
（実施例２：トキシン遺伝子ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ）
図３において示すように、トキシン遺伝子ｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおける使用のための宿主細胞のゲノムは、ＲＮＡＩＩの下流に配置されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからのレバンスクラーゼ（Ｌｉｎｋら、１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６２２８−６２３７）をコードするｓａｃＢ遺伝子を含む。ショ糖が存在する場合において、ｓａｃＢは毒性の産物を合成し、ＲＮＡＩを発現するプラスミドを導入しなければ、細胞は死ぬ。誘導性プロモーターによって調節される別の毒性遺伝子を、ｓａｃＢの代わりにＲＮＡＩＩコード領域へ融合してもよい。
【００９８】
構築物を、ＲＮＡＩＩコード領域およびｓａｃＢをコードする下流の遺伝子からなるオペロンを用いて操作する。ＲＮＡＩＩコード領域の３’末端を、ｓａｃＢのリボソーム結合部位を含むように改変する。構成的ＲＮＡＩＩプロモーターは、遺伝子発現を駆動する。構成的ＲＮＡＩＩプロモーターを細菌の染色体内へ挿入する場合、その細胞は、ショ糖がない場合においても増殖し得るが、ショ糖を加えると、トキシンが産生されそして細胞は死ぬ。その細胞を、ＣｏｌＥＩ適合性ｏｒｉを含むプラスミドを用いて形質転換する場合、ＲＮＡＩがＲＮＡＩＩ−トキシン遺伝子ｍＲＮＡに結合し、そして翻訳を妨げ、ショ糖が存在する場合においても細胞増殖を可能にする。
【００９９】
温度感受性プロモーターもしくは化学的に誘導されるプロモーターを、ＲＮＡＩＩ−トキシン遺伝子融合体の発現を駆動するために用いてもよい。許容温度において、もしくは誘導物質が存在する場合においては、ＲＮＡＩを発現するプラスミドを導入しなければ、細胞は死ぬ。
【０１００】
（実施例３：二重アンチセンスｏｒｉＳＥＬＥＣＴ）
図４において示すように、二重アンチセンスｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて、宿主細胞のゲノムは、細胞増殖のために必須である遺伝子、および細胞増殖のために必須である遺伝子に対するアンチセンスである遺伝子に連結されたＲＮＡＩＩコード領域を、含む。
【０１０１】
必須遺伝子（例えば、ｄａｐＤもしくはｆａｂＡ）のアンチセンスバージョンを、ＲＮＡＩＩコード領域の下流のオペロン内に、必須遺伝子のアンチセンスバージョンおよびＲＮＡＩＩコード領域の両方の転写を駆動する構成的ＲＮＡＩＩプロモーターと共に置く。ＲＮＡＩコード領域の３’末端を、必須遺伝子アンチセンス転写産物の一部を含むように、それによってＲＮＡＩコード領域の３’末端がＲＮＡＩＩと部分的に重なるように改変してもよい。この構築物を、細菌の染色体内へ挿入する。
【０１０２】
その細胞はそれからＲＮＡＩＩおよびアンチセンスＲＮＡを構成的に産生する。アンチセンスＲＮＡは、必須遺伝子ｍＲＮＡに結合し、それによって必須遺伝子の翻訳および細胞増殖を妨害する。
【０１０３】
その細胞をＣｏｌＥＩ適合性ｏｒｉを含むプラスミドを用いて形質転換する場合、ＲＮＡＩはＲＮＡＩＩ−アンチセンスＲＮＡに結合し、ＲＮＡＩＩ−アンチセンスＲＮＡが必須遺伝子ｍＲＮＡに結合することを妨害し、細胞増殖を可能にする。
【０１０４】
（実施例４：リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株の製作）
ＯＲＴ株ＤＨ１ｌａｃｋａｎ（Ｗｉｌｌｉａｎｓら、１９９８）、ＤＨ１ｌａｃｄａｐＤおよびＤＨ１ｌａｃＰ２ｄａｐＤ（Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈら、２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９：ｅ２６）を、ＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩオペロンの染色体のｌａｃＩリプレッサー遺伝子への組込みによって（そしてそれによってＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩオペロンで染色体ｌａｃＩリプレッサー遺伝子を置き換えることによって）ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株に転換してもよい。ｐＫＯ３組込み系（Ｌｉｎｋら、１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６２２８−６２３７）に基づいて構築された単一プラスミドは、以下のように、全てのＯＲＴ株において、野生型ｌａｃＩをＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩで置換するために用いられる。
【０１０５】
１．ｌａｃＩを取り囲む染色体ｌａｃオペロンの一部を、ＰＣＲによって増幅し、クローニングする；
２．ｌａｃＩリプレッサー遺伝子の上流に挿入されたＲＮＡＩＩコード領域からなるオペロンを操作し、天然のプロモーターと置き換える。ｌａｃＩのリボソーム結合部位は、ｍＲＮＡ上でアンチセンスＲＮＡＩＩの結合によって妨げられるように、配置されるべきである。
【０１０６】
３．ＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩオペロンの遺伝子座を、組込みプラスミドｐＫＯ３内へクローニングする。
【０１０７】
４．ＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩオペロンの遺伝子座を、ＤＨ１ｌａｃｋａｎ、ＤＨ１ｌａｃｄａｐＤ、およびＤＨ１ｌａｃＰ２ｄａｐＤの野生型ｌａｃオペロンの遺伝子座内へ組込んで、ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株を産生する。
【０１０８】
５．これらの株におけるプラスミドの選択およびプラスミドの維持を、ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１ ｏｒｉ配列を保有しかつｌａｃＯ配列を保有しない（ＯＲＴ選択を避けるため）プラスミドを用いて試験する。
【０１０９】
このｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株の構築のために必要であるクローニングの工程を、より詳細に以下に記載する。
【０１１０】
（ＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩ融合体を産生するスプライシングＰＣＲ）
１．図５において示すように、ｐＵＣ１８から、ＲＮＡＩＩの５’末端の一部を、以下のプライマー（産物＝１７６ｂｐ）を用いるＰＣＲによって増幅する。
【０１１１】
５ＲＮＡＩＩ：ＧＡＡＴＧＣＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡ（２６ｎｔ）
３ＲＮＡＩＩ：ＡＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡ（４２ｎｔ）。
【０１１２】
２．図６に示すように、ＤＨ１ ｇＤＮＡから、ｌａｃＩの５’末端の一部を、以下のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する（産物＝５９７ｂｐ）。
【０１１３】
５ｌａｃＩ：ＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡ（４２ｎｔ）
３ｌａｃＩ：ＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣＧＣＴＡＡＣＡ（２５ｎｔ）。
【０１１４】
３．図７において示すように、５ＲＮＡＩＩプライマーおよび３ｌａｃＩプライマーを用いて、一回のＰＣＲにおいてこれら二つのＰＣＲ産物を組み合わせ、増幅して、７４９ｂｐのＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩ遺伝子融合体ＰＣＲ産物（以下の５ＲＮＡＩＩプライマーと３ｌａｃＩプライマーとの間の領域）を生成する。
【０１１５】
４．スプライシングされたＰＣＲ産物を、ＮｓｉＩおよびＡｐａＩを用いて切断して、ｌａｃＩプロモーターおよび５’末端の位置においてラクトースオペロン内へクローニングするための断片を生成する。
【０１１６】
（ラクトースオペロンの一部のクローニング、およびＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩの挿入）
１．ＤＨ１ ｇＤＮＡからのｌａｃオペロンを、以下のプライマーを用いて増幅する。
【０１１７】
【化１】
プライマー５ＬＯは、天然のＳａｌＩ部位（下線）を含むが、３ＬＯは、１ヌクレオチド変化（太字）を有するＳａｌＩ部位を導入する。総ＰＣＲ産物の大きさは、５８０３ｂｐである。
【０１１８】
２．上記のＰＣＲ産物をＳａｌＩで切断し、そしてＳａｌＩを用いて切断されたｐＵＣ１８内へクローニングする。
【０１１９】
３．このプラスミドをＮｓｉＩおよびＡｐａＩで切断し、そして工程４による断片にクローニングし、プロモーターおよびｌａｃＩの５’末端をＲＮＡＩＩ−ｌａｃＩ遺伝子融合体で置換する。
【０１２０】
４．挿入部分をＳａｌＩを用いて切断し、そしてＳａｌＩを用いて切断されたｐＫＯ３ｒｅｃＡ内へライゲーションする。
【０１２１】
５．ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株を産生するために、ＤＨ１ｌａｃｄａｐＤ、ＤＨ１ｌａｃＰ２ｄａｐＤ、およびＤＨ１ｌａｃｋａｎの染色体内へ組込む。
【０１２２】
６．ｐＭＢ１複製起点を有するプラスミドを用いて、プラスミドの選択およびプラスミドの維持を試験する。
【０１２３】
ＲＮＡＩＩ構成的プロモーターをＲＮＡＩＩ−遺伝子融合体発現を駆動するために用いる場合、必要であれば、任意の他の構成的プロモーターを置換してもよい。そのＲＮＡＩＩプロモーターをこれらの実施例において既に存在するものとして用いる。代替的な好ましい構成的プロモーターは、至適なＥ．ｃｏｌｉのｔｒｃプロモーターにおいて見出される−１０配列および−３５配列ならびにスペーシングに基づくプロモーターである。このＥ．ｃｏｌｉプロモーターは、ＲＮＡＩＩプロモーターより強く、それゆえに、より大量のＬａｃＩリプレッサータンパク質を産生し、それによってプラスミドが存在しない場合において増殖が妨げられることを保証することが望まれる場合に用いてもよい。ＬａｃＩリプレッサータンパク質の発現はまた、ＲＮＡＩＩコード領域の３’末端とｌａｃｉＩのリボソーム結合部位との間の距離を長くすることによって増大されてもよい。
【０１２４】
また、遺伝子カセットを挿入する代替的な方法を、上記に記載したｐＫＯ３法の代わりに用いてもよいことが理解される。例えば、ラムダＲｅｄ組換え系を用いて、直鎖状ＰＣＲ産物としてこのカセットを組込んでもよい（Ｍｕｒｐｈｙ，１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：２０６３−２０７１）。
【０１２５】
これらの実施例は、アンチセンスインヒビターとして機能するＲＮＡＩを用いるＲＮＡＩＩ−遺伝子融合体発現カセットに基づく。このことは、なぜなら、プラスミドを含む細胞においては、ＲＮＡＩはＲＮＡＩＩを五倍の過剰量で上回って存在するからであり（Ｌｉａｎｇら、１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：１９−３７）、ゆえに、モル過剰のＲＮＡＩが利用可能であるかのように、ＲＮＡＩがより効果的なインヒビターとして働き得るからである。しかし、ＲＮＡＩＩよりもＲＮＡＩを用いて遺伝子融合物を構築することが有利である状況はあり得る。この場合において、アンチセンスインヒビターとして働くのは、プラスミドからのＲＮＡＩＩ転写産物である。
【０１２６】
ＣｏｌＥＩ／ｐＭＢ１ ｏｒｉからのＲｏｍタンパク質を発現する遺伝子の染色体組込みは、この染色体組み込みがＲＮＡＩのＲＮＡＩＩとの結合親和性を上昇させるので、ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ株において必要であり得る（Ｃｈａｎら、１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８９２５−８９３５）。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】ｐＵＣ１８ｏｒｉの図であり、ＲＮＡＩ転写産物およびＲＮＡＩＩ転写産物の位置を示す。ＲＮＡＩＩは、プラスミドのＤＮＡ合成の開始を始め、ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩのアンチセンスインヒビターである。
【図２】リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて用いるための宿主細胞のゲノムの例。宿主細胞のゲノムは、リプレッサー遺伝子のシストロンに連結されたＲＮＡＩＩコード領域を含み、これらの両方が構成的ＲＮＡＩＩプロモーターの制御下にある。このゲノムはさらに、誘導性プロモーターの制御下にある必須遺伝子を含む。プラスミドが存在しない場合において、リプレッサータンパク質が発現され、必須遺伝子を抑制し、細胞増殖を阻害する。プラスミドによって生成されるＲＮＡＩの、ＲＮＡＩＩ−リプレッサーｍＲＮＡ融合体のＲＮＡＩＩ転写産物への結合は、リプレッサータンパク質の翻訳を遮断し、必須遺伝子の発現および細胞増殖を可能にする。
【図３】トキシン遺伝子ｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて用いるための宿主細胞のゲノムの例。このゲノムは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のレバンスクラーゼをコードし（Ｌｉｎｋら、１９９７年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６２２８−６２３７）ＲＮＡＩＩの下流に配置されたｓａｃＢ遺伝子を含む。ショ糖が存在する場合において、ｓａｃＢは毒性の産物を合成し、トキシン遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を遮断するＲＮＡＩを発現するプラスミドが存在しない限り、ショ糖が存在する場合においてその細胞は殺される。
【図４】アンチセンスｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて用いるための宿主細胞のゲノムの例。この宿主細胞のゲノムは、細胞増殖のために必須である遺伝子、および、細胞増殖のために必須な遺伝子に対するアンチセンスである遺伝子に連結されたＲＮＡＩＩコード領域を含む。プラスミドが存在しない場合において、このアンチセンスＲＮＡは必須遺伝子のｍＲＮＡに結合し、それによってこの必須遺伝子の翻訳および細胞増殖を妨げる。この細胞がＲＮＡＩを与えるプラスミドを用いて形質転換される場合、ＲＮＡＩはＲＮＡＩＩ−アンチセンスＲＮＡに結合し、ＲＮＡＩＩ−アンチセンスＲＮＡが必須遺伝子のｍＲＮＡに結合することを妨げ、細胞増殖を可能にする。
【図５】ＰＣＲによるｐＵＣ１８からのＲＮＡＩＩの５’末端の増幅。ＲＮＡＩ転写産物およびＲＮＡＩＩ転写産物の位置は、リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて用いるための宿主細胞のゲノムへの挿入のための、リプレッサーｌａｃＩをコードする遺伝子の上流へのＲＮＡＩＩの挿入に先立って、ＲＡＮＩＩの５’末端を増幅するために用いられるプライマーの位置であるとして、示される。
【図６】ＰＣＲを用いる、ＤＨ１ ＯＲＴ株のゲノムＤＮＡ由来のｌａｃＩの５’末端の増幅。この増幅において用いられるプライマー５ｌａｃＩおよび３ｌａｃＩの位置が示される。
【図７】図５中のプライマーを用いて産生されるＲＮＡＩＩ増幅産物と、図６中のプライマーを用いて産生されるｌａｃＩ増幅物とを組み合わせることによって形成される産物。この組合せ産物の増幅において用いられるプライマーの位置が示される。
【図８】リプレッサーｏｒｉＳＥＬＥＣＴにおいて用いるための宿主細胞のゲノムのさらなる例。この宿主細胞のゲノムは、リプレッサー遺伝子のシストロン（ｌａｃＩ）に連結されたＲＮＡＩＩコード領域を含み、これらの両方が、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｃプロモーターにおいて見出される−１０配列および−３５配列ならびにスペーシングに基づく構成的プロモーターの制御下にある。このゲノムはさらに、誘導性プロモーターの制御下にある必須遺伝子を含む（示さず）。プラスミドが存在しない場合において、このリプレッサータンパク質が発現され、必須遺伝子を抑制し、細胞増殖を阻害する。プラスミドによって生成されるＲＮＡＩの、ＲＮＡＩＩ−リプレッサーｍＲＮＡ融合体のＲＮＡＩＩ転写産物への結合は、リプレッサータンパク質の翻訳を遮断し、必須遺伝子の発現および細胞増殖を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換された宿主細胞であって、
ｉ）細胞増殖を阻害する染色体遺伝子；および
ｉｉ）アンチセンス配列をコードするプラスミド、
を含み、該プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、該染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を許容する、形質転換された宿主細胞。
【請求項２】
前記プラスミドは目的の遺伝子の挿入のためのクローニング部位を含む、請求項１に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項３】
前記プラスミドはさらに目的の遺伝子を含む、請求項１もしくは請求項２に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、前記染色体遺伝子に結合することによって該染色体遺伝子の作用を阻害する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、前記染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによって該染色体遺伝子の作用を阻害する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
調節配列が前記染色体遺伝子に作動的に連結される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、前記調節配列に結合することによって前記染色体遺伝子の作用を阻害する、請求項６に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、前記調節配列から転写されるｍＲＮＡに結合することによって前記染色体遺伝子の作用を阻害する、請求項６に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、該プラスミドの複製起点によってコードされる、請求項８に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、ＲＮＡＩもしくはＲＮＡＩの一部であり、前記染色体遺伝子に作動的に連結される調節配列は、ＲＮＡＩＩもしくはＲＮＡＩＩの一部をコードする、請求項９に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、ＲＮＡＩＩもしくはＲＮＡＩＩの一部であり、前記染色体遺伝子に作動的に連結される調節配列は、ＲＮＡＩもしくはＲＮＡＩの一部である、請求項１０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
細胞増殖を阻害する染色体遺伝子を含む宿主細胞であって、該染色体遺伝子は、該染色体遺伝子の上流に位置する調節配列に作動的に連結されており、該調節配列は、ＲＮＡＩ遺伝子もしくはＲＮＡＩ遺伝子の一部、またはＲＮＡＩＩ遺伝子もしくはＲＮＡＩＩ遺伝子の一部をコードする、宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞はインビトロで培養中である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞、もしくは請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
原核細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞、もしくは請求項１２および請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
細菌細胞である、請求項１４に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項１６】
前記細胞はグラム陰性細菌細胞である、請求項１５に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項１７】
前記細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞もしくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である、請求項１６に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項１８】
前記細胞はグラム陽性細菌細胞である、請求項１５に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項１９】
前記細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ細胞である、請求項１８に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２０】
弱毒化された細胞である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２１】
前記細胞は真核細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２２】
前記細胞は酵母のような真菌である、請求項２１に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２３】
前記細胞は植物細胞である、請求項２１に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
前記細胞は、哺乳類細胞もしくは昆虫細胞のような動物細胞である、請求項２１に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
前記染色体遺伝子はトキシン遺伝子である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２６】
前記トキシン遺伝子はｓａｃＢである、請求項２５に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２７】
前記染色体遺伝子は、細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子の発現を阻害するリプレッサータンパク質をコードする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２８】
前記第二の染色体遺伝子は、細胞増殖のために条件的に必須である、請求項２７に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２９】
前記染色体遺伝子はリプレッサーｌａｃＩをコードし、前記第二の染色体遺伝子はｌａｃＩのオペレーターおよびプロモーターに作動的に連結される、請求項２７もしくは請求項２８に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３０】
前記染色体遺伝子はｄａｐＤもしくはｆａｂＡである、請求項２７もしくは請求項２８に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３１】
前記染色体遺伝子は、細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子の発現を阻害するアンチセンス配列をコードする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３２】
前記染色体遺伝子によってコードされるアンチセンス配列は、前記第二の染色体遺伝子に結合することによって該第二の染色体遺伝子の発現を阻害する、請求項３１に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３３】
前記染色体遺伝子によってコードされるアンチセンス配列は、前記第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによって該第二の染色体遺伝子の発現を阻害する、請求項３１に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３４】
前記第二の染色体遺伝子は、細胞増殖のために条件的に必須である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３５】
前記第二の染色体遺伝子は、ｄａｐＤもしくはｆａｂＡである、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３６】
前記染色体遺伝子もしくは前記調節配列−染色体遺伝子融合体は、構成的プロモーターの制御下にある、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３７】
前記染色体遺伝子、もしくは前記調節配列−染色体遺伝子融合体は、誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３８】
インビトロで宿主細胞内にプラスミドを維持する方法であって、該方法は、請求項１〜１１のいずれか１項もしくは請求項１３〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞を、該細胞が増殖することを許容するために十分な条件下で培養する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
プラスミドＤＮＡを産生する方法であって、該方法は、形質転換された宿主細胞を請求項３８に記載の方法に従って培養する工程、および該プラスミドＤＮＡを単離する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
組換えタンパク質を産生する方法であって、該方法は、目的のタンパク質をコードするプラスミドを含む形質転換された宿主細胞を請求項３８に記載の方法に従って培養する工程、および該タンパク質を該細胞から単離する工程を包含する、方法。
【請求項４１】
薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞を、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、もしくは緩衝剤と共に含む、薬学的組成物。
【請求項４２】
治療用途のための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項４３】
遺伝子送達もしくはタンパク質送達のための薬の製造における、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞の使用。
【請求項４４】
目的の遺伝子を患者に送達する方法であって、該方法は、請求項３〜１１もしくは請求項１３〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
レシピエント生物体内にプラスミドを維持する方法であって、該方法は、請求項１〜１１もしくは請求項１３〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞を該生物体内へ導入する工程を包含し、該形質転換された宿主細胞内の前記染色体遺伝子は、インビボでの細胞増殖のために必須である、方法。
【請求項１】
形質転換された宿主細胞であって、
ｉ）細胞増殖を阻害する染色体遺伝子；および
ｉｉ）アンチセンス配列をコードするプラスミド、
を含み、該プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、該染色体遺伝子の作用を阻害し、それによって細胞増殖を許容する、形質転換された宿主細胞。
【請求項２】
前記プラスミドは目的の遺伝子の挿入のためのクローニング部位を含む、請求項１に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項３】
前記プラスミドはさらに目的の遺伝子を含む、請求項１もしくは請求項２に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、前記染色体遺伝子に結合することによって該染色体遺伝子の作用を阻害する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、前記染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによって該染色体遺伝子の作用を阻害する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
調節配列が前記染色体遺伝子に作動的に連結される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、前記調節配列に結合することによって前記染色体遺伝子の作用を阻害する、請求項６に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、前記調節配列から転写されるｍＲＮＡに結合することによって前記染色体遺伝子の作用を阻害する、請求項６に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、該プラスミドの複製起点によってコードされる、請求項８に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、ＲＮＡＩもしくはＲＮＡＩの一部であり、前記染色体遺伝子に作動的に連結される調節配列は、ＲＮＡＩＩもしくはＲＮＡＩＩの一部をコードする、請求項９に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
前記プラスミドによってコードされるアンチセンス配列は、ＲＮＡＩＩもしくはＲＮＡＩＩの一部であり、前記染色体遺伝子に作動的に連結される調節配列は、ＲＮＡＩもしくはＲＮＡＩの一部である、請求項１０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
細胞増殖を阻害する染色体遺伝子を含む宿主細胞であって、該染色体遺伝子は、該染色体遺伝子の上流に位置する調節配列に作動的に連結されており、該調節配列は、ＲＮＡＩ遺伝子もしくはＲＮＡＩ遺伝子の一部、またはＲＮＡＩＩ遺伝子もしくはＲＮＡＩＩ遺伝子の一部をコードする、宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞はインビトロで培養中である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞、もしくは請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
原核細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞、もしくは請求項１２および請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
細菌細胞である、請求項１４に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項１６】
前記細胞はグラム陰性細菌細胞である、請求項１５に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項１７】
前記細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞もしくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である、請求項１６に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項１８】
前記細胞はグラム陽性細菌細胞である、請求項１５に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項１９】
前記細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ細胞である、請求項１８に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２０】
弱毒化された細胞である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２１】
前記細胞は真核細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２２】
前記細胞は酵母のような真菌である、請求項２１に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２３】
前記細胞は植物細胞である、請求項２１に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
前記細胞は、哺乳類細胞もしくは昆虫細胞のような動物細胞である、請求項２１に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
前記染色体遺伝子はトキシン遺伝子である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２６】
前記トキシン遺伝子はｓａｃＢである、請求項２５に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２７】
前記染色体遺伝子は、細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子の発現を阻害するリプレッサータンパク質をコードする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２８】
前記第二の染色体遺伝子は、細胞増殖のために条件的に必須である、請求項２７に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項２９】
前記染色体遺伝子はリプレッサーｌａｃＩをコードし、前記第二の染色体遺伝子はｌａｃＩのオペレーターおよびプロモーターに作動的に連結される、請求項２７もしくは請求項２８に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３０】
前記染色体遺伝子はｄａｐＤもしくはｆａｂＡである、請求項２７もしくは請求項２８に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３１】
前記染色体遺伝子は、細胞増殖のために必須な第二の染色体遺伝子の発現を阻害するアンチセンス配列をコードする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３２】
前記染色体遺伝子によってコードされるアンチセンス配列は、前記第二の染色体遺伝子に結合することによって該第二の染色体遺伝子の発現を阻害する、請求項３１に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３３】
前記染色体遺伝子によってコードされるアンチセンス配列は、前記第二の染色体遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合することによって該第二の染色体遺伝子の発現を阻害する、請求項３１に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３４】
前記第二の染色体遺伝子は、細胞増殖のために条件的に必須である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３５】
前記第二の染色体遺伝子は、ｄａｐＤもしくはｆａｂＡである、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３６】
前記染色体遺伝子もしくは前記調節配列−染色体遺伝子融合体は、構成的プロモーターの制御下にある、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３７】
前記染色体遺伝子、もしくは前記調節配列−染色体遺伝子融合体は、誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項３８】
インビトロで宿主細胞内にプラスミドを維持する方法であって、該方法は、請求項１〜１１のいずれか１項もしくは請求項１３〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞を、該細胞が増殖することを許容するために十分な条件下で培養する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
プラスミドＤＮＡを産生する方法であって、該方法は、形質転換された宿主細胞を請求項３８に記載の方法に従って培養する工程、および該プラスミドＤＮＡを単離する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
組換えタンパク質を産生する方法であって、該方法は、目的のタンパク質をコードするプラスミドを含む形質転換された宿主細胞を請求項３８に記載の方法に従って培養する工程、および該タンパク質を該細胞から単離する工程を包含する、方法。
【請求項４１】
薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞を、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、もしくは緩衝剤と共に含む、薬学的組成物。
【請求項４２】
治療用途のための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞。
【請求項４３】
遺伝子送達もしくはタンパク質送達のための薬の製造における、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞もしくは宿主細胞の使用。
【請求項４４】
目的の遺伝子を患者に送達する方法であって、該方法は、請求項３〜１１もしくは請求項１３〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
レシピエント生物体内にプラスミドを維持する方法であって、該方法は、請求項１〜１１もしくは請求項１３〜３７のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞を該生物体内へ導入する工程を包含し、該形質転換された宿主細胞内の前記染色体遺伝子は、インビボでの細胞増殖のために必須である、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５１１２３６（Ｐ２００７−５１１２３６Ａ）
【公表日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４０６０１（Ｐ２００６−５４０６０１）
【出願日】平成１６年１１月２２日（２００４．１１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００４９２９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５２１６７
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（５０６１７０５９１）コブラ バイオロジックス リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２２日（２００４．１１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００４９２９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５２１６７
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（５０６１７０５９１）コブラ バイオロジックス リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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