プラズモン共鳴および蛍光の同時イメージング装置及びイメージング方法
【課題】 蛍光免疫法と表面プラズモン共鳴法を同時におこなう方法では、固定される捕捉体が一種類であり、一回の測定では一種類の標的物質しか分析することは出来ないため、例えば、どの部位が癌であるかを特定できないという問題があった。
【解決手段】 誘電体基体上に形成された複数の島状の金属薄膜からなる金属アレイに複数の異なったリガンドを固定し、基板の裏面から光を照射して、表面プラズモン共鳴とエバネッセント波による蛍光とを同時に測定することで、複数項目を同時に測定するスクリーニングを可能とするものである。
【解決手段】 誘電体基体上に形成された複数の島状の金属薄膜からなる金属アレイに複数の異なったリガンドを固定し、基板の裏面から光を照射して、表面プラズモン共鳴とエバネッセント波による蛍光とを同時に測定することで、複数項目を同時に測定するスクリーニングを可能とするものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
タンパク質やＤＮＡなどの複数個の生体分子を一度にスクリーニングし、病原因となる分子を迅速に発見し診断を行なうイメージング装置およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中には、ガン・肝炎・糖尿病・骨粗しょう症など特定の疾患に対するマーカーが複数存在している。罹患した際には、平時より特定のタンパク質の濃度が増加する。これらを平時からモニターしておくことで、重大な病気を早期に発見することが出来るため、次世代の医療技術として期待されている。
【０００３】
未加工で未精製のタンパク質を分析するための方法の１つは、生物学的なリガンド−標的物質相互作用を利用して特定の化合物を識別するセンサーを基本としたものである。捕捉体−標的物質の組み合わせとしては、タンパク質同士の結合を利用した抗原抗体の複合体、核酸とその相補的なものが結合するＤＮＡ複合体、レセプターの複合体などが含まれている。
【０００４】
センサーには、蛍光免疫法、プラズモン共鳴法、光干渉法など幾つかの方式があるが、どの場合も捕捉体をセンサー表面に固定し、検体中の標的物質を高感度にかつ選択性よく選別して結合することにより夾雑物を排除し、目的とするタンパク質のみを高効率に基板表面に固定化することが共通のステップとなる。
【０００５】
蛍光免疫法では、捕捉体−標的物質複合体にさらに蛍光色素で標識した第二の捕捉体をさらに結合させ、蛍光色素を励起し、蛍光量を測定することで標的物質の濃度を測定する。プラズモン共鳴法では、金属プラズモンが界面物質の屈折率変化に高感度に反応することを利用して、金属薄膜や金属の微粒子の上に固定化されたリガンドに結合する標的物質の濃度を測定している。
【０００６】
蛍光免疫法は、感度よく測定できるが反応速度の測定をすることができない。一方、プラズモン共鳴法は、反応速度の測定をすることができるが、感度よく測定することや低分子を測定することは、やや難しいという特徴があった。これらの課題を克服する技術として、蛍光免疫法と表面プラズモン共鳴法を同時におこない、両手法の欠点を補う手法が、特開平１０−３０７１４１号公報（特許文献１）や特開２００２−６２２５５公報（特許文献２）に開示されている。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２００２−６２２５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１および２に示されている蛍光免疫法と表面プラズモン共鳴法を同時におこなう方法では、固定される捕捉体が一種類であり、一回の測定では一種類の標的物質しか分析することは出来ない。一方、現在発見されている腫瘍マーカーなどは、部位に特異的なものは少なく、例えばＣＥＡやＣＡ１９−９という腫瘍マーカーは胃、大腸、膵臓、肺など複数の臓器の細胞でつくられるため、一種類のマーカーを測定するだけではどの部位が癌であるかを特定できないという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記に挙げた課題は、以下に示す本発明によって解決される。すなわち本発明は、励起光を入射または出射させるための誘電体ブロックと、その上面に構成された金属膜のアレイと、金属膜の上に構成された特定の化学物質を捉えるリガンドと、金属膜に対してプラズモン共鳴を生じさせるための光源と、励起光を適切なビームに調整する光学系と、金属膜から反射してきた反射光を調整する光学系と、反射光を捕らえる検出器と、誘電体ブロック上面にイメージ信号を捕らえるための光学系と、イメージングする検出器とから構成され、複数のアレイに対し表面プラズモン共鳴角と蛍光の同時イメージングが可能であることを特徴とするイメージング装置に関するものである。
【０００９】
また、本発明は、励起光を入射または出射させるための誘電体ブロックと、その上面に構成された金属膜のアレイと、金属膜の上に構成された特定の化学物質を捉えるリガンドと、金属膜に対してプラズモン共鳴を生じさせるための光源と、励起光を適切なビームに調整する光学系と、金属膜から反射してきた反射光を調整する光学系と、反射光を捕らえる検出器と、誘電体ブロック上面にイメージ信号を捕らえるための光学系と、イメージングする検出器とから構成され、複数のアレイに対し表面プラズモン共鳴角と蛍光の同時イメージングが可能であることを特徴とするイメージング方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、複数の捕捉体標的物質複合体に対して、蛍光免疫法と表面プラズモン共鳴法を同時におこなうイメージング装置を提供することが出来、複数項目を同時に測定するスクリーニングが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、複数の捕捉体−標的物質複合体に対して、蛍光免疫法と表面プラズモン共鳴法とによる検査を同時に行うことができるイメージング装置およびその検査方法である。
【００１２】
図６は、本発明のイメージング装置の基板部の拡大模式図である。誘電体基板５０７上に形成したアレイ上の金属薄膜上に予め異なった捕捉体を配置し、該捕捉体と検体とを反応させ捕捉体標的物質複合体を形成させた後、基板の裏面側から光５０１を照射する。
【００１３】
光５０１の金属膜からの表面プラズモン共鳴である出射角５０４で出射される反射光５０３を、２次元光センサーを用いて検出する。表面プラズモン共鳴である反射光５０３は、島状の金属薄膜５０６に固定された捕捉体標的物質複合体の種類により、分子の重さによる反射光の屈折率の変化が異なるので入射角５０２と反射光５０３の出射角５０４とが同一の角度になるようにして角度を変化させ（スキャンさせ）、反射光強度の角度依存性をモニターすることで捕捉体標的物質複合体を判別することができる。
【００１４】
更に、光５０１を照射することで誘電体膜を介しエバネッセント光により金属薄膜５０６に固定された捕捉体標的物質複合体が励起され蛍光５０５を発する。この蛍光を、２次元光センサーを用いて検出する。
【００１５】
図７（ａ）は、基板上の発光状態を模式的に示す図で、図７（ｂ）は、２次元光センサー上に図７（ａ）の基板からの発光を受光した状態を示す図である。図７（ａ）で、基板６０１上に形成した島状の金属膜に固定された捕捉体標的物質複合体からの発光６０１を示している。
【００１６】
図７（ｂ）は、２次元光センサー６０３上に形成された受光領域６０４に基板からの発光６０１を受光した領域６０５を示している。
【００１７】
反射光５０３は、捕捉体標的物質複合体による表面プラズモン共鳴の生じない領域からの反射強度は一定であるので金属膜からの反射光５０５を受光している部位を除いた画素領域の受光強度は略同一といえる。同様に、蛍光５０５も捕捉体標的物質複合体以外からは発せられないので蛍光５０５を受光している部位を除いた画素領域の受光強度は略同一といえる。
【００１８】
２次元光センサーにより検出し、検出された２次元の光情報を例えばＣＲＴ（カソード・レイ・チューブ：ブラウン管）あるいは液晶表示装置のような表示装置に表示（イメージング）する。
【００１９】
表示装置への表示は、それぞれの光情報を後述の演算装置を用いて合成して１画面に表示させることも、画面を分割して、各々の光情報を表示させる等が可能であり、使用する目的で表示装置に表示する画像を選択することができる。
【００２０】
２次元光センサーは、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ：電荷結合素子）あるいはＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：相補型金属酸化物半導体）センサーを用いることができる。
【００２１】
捕捉体（リガンド）には、タンパク質あるいは核酸を用いることができる。
【００２２】
リガンドとして用いるタンパク質としては、抗体等が使われ、核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を用いることができる。
【００２３】
図８に、検出部の概略構成を示す。
【００２４】
図８（ａ）は、ｎ×ｍの画素で構成されるＣＣＤエリアセンサーの画素部を示す概略図である。エリアセンサーは、エリアセンサーから得られる電気情報から画素の位置が決定できるので、例えば下記のようにすることで分離することができる。
１．金属薄膜の位置関係は、基板を交換しても同じであるとして、島状の金属薄膜からなる金属アレイの反射光を測定し、予め、金属アレイに対応する画素を記憶させる。
２．検査毎に、反射光から、画素の位置を決定し、決定された画素を記憶させる。
【００２５】
上記のいずれかの方法で記憶された情報に基づいて、金属薄膜の表面プラズモン共鳴による反射光、あるいはエバネッセント波による蛍光からのアレイに対応する信号を分離する。
【００２６】
反射光の場合、縦と横の比率が変わっているので、蛍光との比較のために縦横比を予め求めとおきノーマライズしても良い。
【００２７】
図８（ｂ）は、エリアセンサーからの信号から画素単位の信号を分離するための信号分離部の概念図である。エリアセンサーはＣＣＤを用いたものとして説明するが、エリアセンサーは、ＣＣＤ以外であっても、受光素子を、アレイ状には位置したセンサーであっても、ＣＭＯＳセンサーであっても構わないことはいうまでもない。
【００２８】
画像処理用コンピュータ７１０は、ＣＣＤセンサー７０１及び７０２の信号から金属アレイに対応する画素を決定するための演算部と決定された画素の位置情報を記憶部とを有する演算装置７０３と、ＣＣＤセンサー７０１及び７０２の光情報を該金属アレイに対応する記憶された画素情報に基づいて演算装置の演算部で演算し、その結果を画面上に表示する表示装置７０３から構成されている。
【００２９】
ＣＣＤセンサー７０１と７０２との演算された光情報を表示装置７０１で表示する場合、各々光情報を、画面を分割して表示する、あるいは、ＣＣＤセンサー７０１と７０２との光情報を予め演算装置７０１の記憶部に記憶された処理方法により演算部で演算処理を行って１画像として表示する、あるいは、検査工程毎に必要とする画像を表示するようにすることができる。
実質的には演算して表示することになります。
【００３０】
更に、演算部は図示していないが、表面プラズモン共鳴を測定するために、上述の光源からの出射光となる光５０１の光軸と反射光５０３を受光する受光部の光軸の入射角５０２と反射角５０４とが同一の角度になるように例えば、アーム等の機構（不図示）を制御させることができる。演算部を介してアームを動かす場合、表面プラズモン共鳴の角度依存性を演算する際の角度情報を演算装置７０３に外部から角度情報を入力しないですむので演算部からアーム制御を行うことが好ましい。
【００３１】
詳細は後述するが、基板をプリズム上にセット後、例えば、下記のようなプロトコールで検査が行なわれる。
（１）標識化抗体を、予め抗原と反応させ、標識された抗原抗体ペアを作成する。
（２）蛍光標識した抗体を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（３）標識抗体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（４）標識された抗原が混入している検体を流路に導入する。
（５）レーザー光を導入し、各金属薄膜ドットから表面プラズモン共鳴曲線ならびに蛍光信号の時間変化を検出する。
（６）各金属薄膜ドットからの蛍光信号の時間変化をプロットすると、図９に示すような結果が得られる。
【００３２】
上記の、抗体の流入・インキュベート・洗浄・抗原の流入・インキュベート・洗浄・標識光体の流入・インキュベート・洗浄との工程を演算装置から制御する、あるいは、該工程の制御信号を演算装置７０３に入力することで必要であれば各工程後とに検査を行いその結果を表示することができる。
【００３３】
以下、図１の概略図を参照しながら本発明に関わる実施形態に係わる測定装置を詳細に説明する。尚、本発明が、ここに記した内容に限定されるものではないことは言うまでも無い。
【００３４】
本実施例に用いる３角柱型の直角プリズム１０１の各面を図１（ｂ）のようにＡ、Ｂ、Ｃと名前を付ける。図１（ａ）には、測定器の側面と基板の俯瞰図が示されている。測定器は、少なくとも、プリズム１０１、微小な金属アレイ１０２、基板１０３、捕捉体−標的物質複合体１０４、光源１０５、レーザー光１０６、コリメートレンズ１０７、偏光フィルター１１５、反射光１０８、集光レンズ１０９、検出器１１０、蛍光１１１、集光レンズ１１２、フィルター１１３および検出器１１４で構成されている。
【００３５】
プリズム１０１のＡ面に、基板１０３が固定されている。基板１０３を上面から俯瞰すると、基板上１０３上に、異なる捕捉体が固定化された微小な金属がアレイ状に配列されている。アレイ状に配列された金属（以下、金属アレイ１０２と称す）に光源（レーザー光源）１０５から出射されたレーザー光１０６を照射する。レーザー光１０６は、コリメートレンズ１０７で平行光に変換されプリズム１０１のＢ面に入射する。プリズム１０１のＢ面に入射したレーザー光は、プリズム１０１のＡ面で反射するとともに基板１０３上のリガンドに固定された検体による表面プラズモン共鳴による反射光１０８が、プリズム１０１のＣ面から出射される。
【００３６】
プリズム１０１のＢ面から出射された反射光１０８は、集光レンズ１０９により集光され２次元光センサーからなる検出器１１０に入射する。
【００３７】
基板１０３上に形成された微小な金属アレイ１０２は、異なる捕捉体が固定化されている。微小な金属アレイ１０２上に固定された異なる捕捉体により捕捉された検体が、プリズム１０１のＡ面に入射されたレーザー光１０６により励起され、蛍光１０１を発する。蛍光１０１は、集光レンズ１１２により集光されフィルター１１３により所望の波長のみが検出器１１４に入射する。
【００３８】
尚、図１では、金属アレイ１０２が形成された基板１０３とプリズム１０１とになっているが、プリズムのＡ面に金属アレイ１０２を直接形成することができることはいうまでもない。
【００３９】
プリズム１０１としては、屈折率１．４〜２．０までのものを用いることが出来るが、本構成では１．５以上のものであることが好ましい。微小金属アレイ１０２としては、直径が５０μｍ〜５ｍｍ程度、厚みが２０〜３００ｎｍ程度のものを用いることが出来るが、本構成では、直径１００μｍφ程度、膜厚５０ｎｍ程度が好ましい。基板１０３としては、プリズム１０１と屈折率がほぼ同じであるものが好ましい。捕捉体標的物質複合体１０４を構成する物質としては、抗原と抗体の組み合わせ、ＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡなどを選択して用いることができる。光源１０５としては、波長が２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲のレーザーダイオードまたはガスレーザを選択して用いることができる。本構成では波長が８００ｎｍ以下のものを用いることが好ましい。
【００４０】
コリメートレンズ１０７、１０９は、非球面レンズ、セルフォックレンズ、平凸もしくは両凸レンズ群、顕微鏡用対物レンズなどを用いることが出来る。本構成では、平凸または非球面レンズを用いることが好ましい。光センサー１１０としては、フォトダイオードアレイ、ＣＣＤアレイ、ＣＭＯＳアレイ等の２次元画素が配置された光センサーを用いることができる。本構成では、検体の濃度によってフォトダイオード、ＣＣＤアレイが適宜選択される。
【００４１】
集光レンズ１０９、１１２としては、平凸シリンダーレンズ、平凹シリンダーレンズ、非球面レンズ、平凸もしくは両凸球面レンズ群、顕微鏡用対物レンズおよびセルフォックレンズを用いることが出来る。本構成では平凸シリンダーレンズまたは平凹シリンダーレンズを用いることが好ましい。光学フィルター１１３としては色ガラスフィルター、ダイクロイックフィルター、ゼラチンフィルター、ロングパスフィルター、可視光ブロックフィルターおよびＩＲパスフィルターを用いることが出来る。本構成ではダイクロイックフィルター、もしくは色ガラスフィルターを用いることが好ましい。フィルター１１５としては、偏光フィルターが用いられる。
【実施例】
【００４２】
以下本発明の実施例を述べるが、本発明はここに記述した内容だけに制限を受けるものではない。
【００４３】
（実施例１）
図２を参照しながら説明する。プリズム２０１（部材：ＢＫ７、形状：Ａ≒２８．３ｍｍ、Ｂ＝Ｃ＝２０（ｍｍ））のＡ面に、プリズム２０１と同じ屈折率を持ったインデックスマッチングオイル（ニューポート社，Ｆ−ＩＭＦ−１０５）を塗布し、１００μｍφの金属アレイ２０２を形成した基板２０３を密着させた。
【００４４】
更に、その上に、検体や洗浄液を導入する透明な溶液セル２０４を接着した。光源２０５としては、レーザーダイオード（三洋電機製、ＤＬ３０３８−０３３）を用い、コリメートレンズ２０７としては、平凸レンズ（シグマ光機製、平凸レンズ５ｍｍφ）を用い、フィルター２２１としては偏光フィルター（シグマ光機製、ＳＰＦ−３０Ｃ−３２）を用いた。
【００４５】
これら入射光学系を、アーム２１９に固定した。光センサー２１０は、ＣＣＤエリアイメージセンサ（浜松フォトニクス製、Ｓ７０３０−０９０６）、コリメートレンズ２０９は、平凸レンズ（シグマ光機製、平凸レンズ５ｍｍφ）を用いた。これら受光光学系は、アーム２２０に固定され、測定時に、基板への入射角と反射角とが同じ角度になるようスキャンされる。また、反応セル２２１の上側には、蛍光光を集光する集光レンズ２１３（シグマ光機、平凸レンズ５ｍｍφ）、ＣＣＤエリアイメージセンサ（浜松フォトニクス製、Ｓ７０３０−０９０６）を設置した。
【００４６】
センサーの光学特性を確認する為に、以下の検討をおこなった。濃度が１ｘ１０-7ｍｏｌ／ＬのＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の蛍光色素）溶液に金属膜アレイ基板２０３を浸漬したあと、完成した光学系に設置した。レーザーダイオードからレーザー光（波長：約６３８ｎｍ、実効強度：３ｍＷ、１ｋＨｚの矩形波で変調）を導入し、アーム２１９、２２０を同期してスキャンさせプラズモンの共鳴特性と蛍光特性を測定すると、感度よく測定できることが確認された。
【００４７】
次に、癌のマーカーとして知られているＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＰＡＰの各種抗原について検出を試みる。まず各金属アレイにストレプトアビジンを付着させる。それからビオチン修飾した抗ＣＥＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＰＡＰ抗体を吸着させ、免疫センサーを用意した。
【００４８】
図３は、図２の構成を斜視図によって示したものである。図２と同じ構成に対しては同じ番号が付与されている。
【００４９】
図２と同様に、プリズム２０１と同じ屈折率を持ったインデックスマッチングオイルを塗布し、１００μｍφの金属アレイ２０２を形成した基板２０３を密着させた。
【００５０】
更に、その上に、検体や洗浄液を導入する透明な溶液セル２０４を接着した。光源２０５としては、レーザーダイオード、コリメートレンズ２０７としては、平凸レンズを用い、フィルター２２１としては偏光フィルターを用いた。
【００５１】
これら入射光学系を、アーム２１９に固定した。光センサー２１０は、ＣＣＤエリアイメージセンサ、コリメートレンズ２０９は、平凸レンズを用いた。これら受光光学系は、アーム２２０に固定され、測定時に、基板への入射角と反射角とが同じ角度になるようスキャンされる。また、反応セル２２１の上側には、蛍光光を集光する集光レンズ２１３、ＣＣＤエリアイメージセンサを設置した。
【００５２】
図４を用いて詳細に説明する。図４は、基板３０１上に金属薄膜からなる金属アレイ３０２が形成され、金属アレイ３０２上にリガンドとなる抗ＣＥＡ抗体３０３、抗ＡＦＰ抗体３０５、抗ＰＳＡ抗体３０４及び抗ＰＡＰ抗体３０６が固定されている状態を示す概念図である。抗体を基板に固定化させる方法は、アビジンをＳＨ基を介して金基板に吸着させ、抗体をビオチン化しアビジンビオチンで固定化させる方法を用いた。
【００５３】
基板３０１を蛍光分析装置にセットする。そして図１０に示すプロトコールで測定をおこなった。
（１）Ｃｙ５色素で蛍光標識した上記４種類の抗体を、各抗原と反応させ、標識された抗原を作成する。
（２）Ｃｙ５色素で蛍光標識した抗体を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（３）標識抗体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（４）標識されたＣＥＡ抗原、ＰＳＡ抗原、ＡＦＰ抗原、ＰＡＰ抗原が混入している検体を流路に導入する。
（５）レーザー光を導入し、各金属薄膜ドットから表面プラズモン共鳴曲線ならびに蛍光信号の時間変化を検出する。
【００５４】
各金属薄膜ドットからの蛍光信号の時間変化をプロットすると、図９が得られる。また、反応して固定化された量としては、吸着反応と乖離が終了した蛍光強度から見積もることができ、反応量としては表１が得られる。図９のプロファイルおよび表１の固定化量をデーターベースのデータと比較することにより、癌の部位を高い精度で特定することが可能となる。
【００５５】
本発明では、複数の抗原抗体反応を同時測定することができ、更に、プラズモン共鳴で生じさせた電場を用いて、蛍光強度の時間変化を測定することができる。この結果、従来はなしえなかった、複数の抗原抗体反応の同時測定を行い、反応の時間プロファイルならびに反応量から値をもとめることができる。
【００５６】
【表１】
【００５７】
（実施例２）
実施例１で使用した光学系を用いて、ＤＮＡのハイブリダイゼーション測定をおこなった。各金属アレイ表面にストレプトアビジンを付着させ、ビオチン修飾した２０量体ＤＮＡを４種類吸着させ、核酸センサーを用意した。
【００５８】
図５を用いて詳細に説明する
図５の平面図に示すように、基板４０１上に形成された２×２の金属アレイ４０２上に、４種類のビオチン修飾した２０量体ＤＮＡが固定されている。そして次のプロトコールをおこなった。
【００５９】
金属アレイに異なったリガンドの固定は、特許文献１と同様に行った。
（１）塩基配列が固定ＤＮＡ４０５（プローブＰ）と対応する捕捉ＤＮＡ（ターゲットＴ１、２０量体）にＣｙ５色素で蛍光標識した複合体４種類（Ａ＊、Ｂ＊、Ｃ＊、Ｄ＊）４０３と、塩基配列が一つだけ異なっている２０量体ＤＮＡ４種類（ターゲットＴ２、２０量体、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’）をＣｙ３色素で標識した複合体４種類４０４が混入している検体液を用意する。
（２）検体液を流路に導入した後、５分間インキュベートする。
（３）検体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（４）リン酸緩衝液を流路に注入する。
【００６０】
（４）の操作のあとレーザー光を導入し、プラズモン共鳴ならびに蛍光強度を測定すると、プラズモン共鳴曲線には、ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応前後で差異が見られなかった。一方、蛍光測定では、ＤＮＡの濃度１ｎＭまで感度よく測定されることが確認された。蛍光のスペクトルを分光器（不図示）で測定してみると６７０ｎｍ付近にピークをもつ色素のみが蛍光を発していることが確認され、Ｔ１のＤＮＡだけが特異的に結合していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の実施形態のプラズモン共鳴および蛍光の同時イメージング装置を表す図である。
【図２】本発明の実施例１のプラズモン共鳴および蛍光の同時イメージング装置を説明する為の図である。
【図３】本発明の実施例１のプラズモン共鳴および蛍光の同時イメージング装置の斜視図である。
【図４】金属アレイ上にリガンドが固定された状態を模式的に示す図である。
【図５】２×２の金属アレイ上にリガンドが固定された状態を模式的に示す図である。
【図６】本発明のイメージング装置の基板部の拡大模式図である。
【図７】本発明の基板上の発光状態を模式的に示す図である。
【図８】本発明の検出部の概略構成を示す図である。
【図９】本発明の実施例１を説明するための図である。
【図１０】実施例１のプロトコールを示す図。
【符号の説明】
【００６２】
１０１ プリズム
１０２ 金属アレイ
１０３ 基板
１０４ 捕捉体標的物質複合体
１０５ 光源
１０６ 励起光
１０７ コリメートレンズ
１０８ 反射光
１０９ 集光レンズ
１１０ 検出器
１１１ 蛍光
１１２ 集光レンズ
１１３ フィルター
１１４ 検出器
１１５ 偏光フィルター
２０１ プリズム
２０２ 金属アレイ
２０３ 基板
２０４ 溶液セルカバー
２０５ 半導体レーザー
２０６ 励起光
２０７ コリメートレンズ
２０８ 反射光
２０９ 集光レンズ
２１０ 検出器
２１１ 蛍光
２１２ 集光レンズ
２１４ フィルター
２１５、２１６ 検体もしくは洗浄液の注入口、または排出口
２１７ リード線
２１８ データ処理装置
２１９ 励起光学系固定用アーム
２２０ 反射光学系固定用アーム
２２１ 偏光フィルター
３０１ 基板
３０２ 金属アレイ
３０３ 抗ＣＥＡ抗体
３０４ 抗ＰＳＡ抗体
３０５ 抗ＡＦＰ抗体
３０６ 抗ＰＡＰ抗体
４０１ 基板
４０２ 金属アレイ
４０３ ターゲットＤＮＡ（Ｔ１）
４０４ ターゲットと塩基配列が異なるＤＮＡ（Ｔ２）
４０５ プローブＤＮＡ（Ｐ）
５０１ 入射光
５０２ 入射角
５０３ 反射光
５０４ 出射角
５０５ 蛍光
５０６ 金属薄膜
５０７ 誘電体基板
６０２ 基板
６０１ 発光
６０３ ２次元光センサー
６０４ 受光領域
６０５ 発光を受光した領域
７０１、７０２ 光センサー
７０３ 演算装置
７０４ 表示装置
７１０ 画像処理用コンピュウター
【技術分野】
【０００１】
タンパク質やＤＮＡなどの複数個の生体分子を一度にスクリーニングし、病原因となる分子を迅速に発見し診断を行なうイメージング装置およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中には、ガン・肝炎・糖尿病・骨粗しょう症など特定の疾患に対するマーカーが複数存在している。罹患した際には、平時より特定のタンパク質の濃度が増加する。これらを平時からモニターしておくことで、重大な病気を早期に発見することが出来るため、次世代の医療技術として期待されている。
【０００３】
未加工で未精製のタンパク質を分析するための方法の１つは、生物学的なリガンド−標的物質相互作用を利用して特定の化合物を識別するセンサーを基本としたものである。捕捉体−標的物質の組み合わせとしては、タンパク質同士の結合を利用した抗原抗体の複合体、核酸とその相補的なものが結合するＤＮＡ複合体、レセプターの複合体などが含まれている。
【０００４】
センサーには、蛍光免疫法、プラズモン共鳴法、光干渉法など幾つかの方式があるが、どの場合も捕捉体をセンサー表面に固定し、検体中の標的物質を高感度にかつ選択性よく選別して結合することにより夾雑物を排除し、目的とするタンパク質のみを高効率に基板表面に固定化することが共通のステップとなる。
【０００５】
蛍光免疫法では、捕捉体−標的物質複合体にさらに蛍光色素で標識した第二の捕捉体をさらに結合させ、蛍光色素を励起し、蛍光量を測定することで標的物質の濃度を測定する。プラズモン共鳴法では、金属プラズモンが界面物質の屈折率変化に高感度に反応することを利用して、金属薄膜や金属の微粒子の上に固定化されたリガンドに結合する標的物質の濃度を測定している。
【０００６】
蛍光免疫法は、感度よく測定できるが反応速度の測定をすることができない。一方、プラズモン共鳴法は、反応速度の測定をすることができるが、感度よく測定することや低分子を測定することは、やや難しいという特徴があった。これらの課題を克服する技術として、蛍光免疫法と表面プラズモン共鳴法を同時におこない、両手法の欠点を補う手法が、特開平１０−３０７１４１号公報（特許文献１）や特開２００２−６２２５５公報（特許文献２）に開示されている。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２００２−６２２５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１および２に示されている蛍光免疫法と表面プラズモン共鳴法を同時におこなう方法では、固定される捕捉体が一種類であり、一回の測定では一種類の標的物質しか分析することは出来ない。一方、現在発見されている腫瘍マーカーなどは、部位に特異的なものは少なく、例えばＣＥＡやＣＡ１９−９という腫瘍マーカーは胃、大腸、膵臓、肺など複数の臓器の細胞でつくられるため、一種類のマーカーを測定するだけではどの部位が癌であるかを特定できないという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記に挙げた課題は、以下に示す本発明によって解決される。すなわち本発明は、励起光を入射または出射させるための誘電体ブロックと、その上面に構成された金属膜のアレイと、金属膜の上に構成された特定の化学物質を捉えるリガンドと、金属膜に対してプラズモン共鳴を生じさせるための光源と、励起光を適切なビームに調整する光学系と、金属膜から反射してきた反射光を調整する光学系と、反射光を捕らえる検出器と、誘電体ブロック上面にイメージ信号を捕らえるための光学系と、イメージングする検出器とから構成され、複数のアレイに対し表面プラズモン共鳴角と蛍光の同時イメージングが可能であることを特徴とするイメージング装置に関するものである。
【０００９】
また、本発明は、励起光を入射または出射させるための誘電体ブロックと、その上面に構成された金属膜のアレイと、金属膜の上に構成された特定の化学物質を捉えるリガンドと、金属膜に対してプラズモン共鳴を生じさせるための光源と、励起光を適切なビームに調整する光学系と、金属膜から反射してきた反射光を調整する光学系と、反射光を捕らえる検出器と、誘電体ブロック上面にイメージ信号を捕らえるための光学系と、イメージングする検出器とから構成され、複数のアレイに対し表面プラズモン共鳴角と蛍光の同時イメージングが可能であることを特徴とするイメージング方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、複数の捕捉体標的物質複合体に対して、蛍光免疫法と表面プラズモン共鳴法を同時におこなうイメージング装置を提供することが出来、複数項目を同時に測定するスクリーニングが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、複数の捕捉体−標的物質複合体に対して、蛍光免疫法と表面プラズモン共鳴法とによる検査を同時に行うことができるイメージング装置およびその検査方法である。
【００１２】
図６は、本発明のイメージング装置の基板部の拡大模式図である。誘電体基板５０７上に形成したアレイ上の金属薄膜上に予め異なった捕捉体を配置し、該捕捉体と検体とを反応させ捕捉体標的物質複合体を形成させた後、基板の裏面側から光５０１を照射する。
【００１３】
光５０１の金属膜からの表面プラズモン共鳴である出射角５０４で出射される反射光５０３を、２次元光センサーを用いて検出する。表面プラズモン共鳴である反射光５０３は、島状の金属薄膜５０６に固定された捕捉体標的物質複合体の種類により、分子の重さによる反射光の屈折率の変化が異なるので入射角５０２と反射光５０３の出射角５０４とが同一の角度になるようにして角度を変化させ（スキャンさせ）、反射光強度の角度依存性をモニターすることで捕捉体標的物質複合体を判別することができる。
【００１４】
更に、光５０１を照射することで誘電体膜を介しエバネッセント光により金属薄膜５０６に固定された捕捉体標的物質複合体が励起され蛍光５０５を発する。この蛍光を、２次元光センサーを用いて検出する。
【００１５】
図７（ａ）は、基板上の発光状態を模式的に示す図で、図７（ｂ）は、２次元光センサー上に図７（ａ）の基板からの発光を受光した状態を示す図である。図７（ａ）で、基板６０１上に形成した島状の金属膜に固定された捕捉体標的物質複合体からの発光６０１を示している。
【００１６】
図７（ｂ）は、２次元光センサー６０３上に形成された受光領域６０４に基板からの発光６０１を受光した領域６０５を示している。
【００１７】
反射光５０３は、捕捉体標的物質複合体による表面プラズモン共鳴の生じない領域からの反射強度は一定であるので金属膜からの反射光５０５を受光している部位を除いた画素領域の受光強度は略同一といえる。同様に、蛍光５０５も捕捉体標的物質複合体以外からは発せられないので蛍光５０５を受光している部位を除いた画素領域の受光強度は略同一といえる。
【００１８】
２次元光センサーにより検出し、検出された２次元の光情報を例えばＣＲＴ（カソード・レイ・チューブ：ブラウン管）あるいは液晶表示装置のような表示装置に表示（イメージング）する。
【００１９】
表示装置への表示は、それぞれの光情報を後述の演算装置を用いて合成して１画面に表示させることも、画面を分割して、各々の光情報を表示させる等が可能であり、使用する目的で表示装置に表示する画像を選択することができる。
【００２０】
２次元光センサーは、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ：電荷結合素子）あるいはＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：相補型金属酸化物半導体）センサーを用いることができる。
【００２１】
捕捉体（リガンド）には、タンパク質あるいは核酸を用いることができる。
【００２２】
リガンドとして用いるタンパク質としては、抗体等が使われ、核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を用いることができる。
【００２３】
図８に、検出部の概略構成を示す。
【００２４】
図８（ａ）は、ｎ×ｍの画素で構成されるＣＣＤエリアセンサーの画素部を示す概略図である。エリアセンサーは、エリアセンサーから得られる電気情報から画素の位置が決定できるので、例えば下記のようにすることで分離することができる。
１．金属薄膜の位置関係は、基板を交換しても同じであるとして、島状の金属薄膜からなる金属アレイの反射光を測定し、予め、金属アレイに対応する画素を記憶させる。
２．検査毎に、反射光から、画素の位置を決定し、決定された画素を記憶させる。
【００２５】
上記のいずれかの方法で記憶された情報に基づいて、金属薄膜の表面プラズモン共鳴による反射光、あるいはエバネッセント波による蛍光からのアレイに対応する信号を分離する。
【００２６】
反射光の場合、縦と横の比率が変わっているので、蛍光との比較のために縦横比を予め求めとおきノーマライズしても良い。
【００２７】
図８（ｂ）は、エリアセンサーからの信号から画素単位の信号を分離するための信号分離部の概念図である。エリアセンサーはＣＣＤを用いたものとして説明するが、エリアセンサーは、ＣＣＤ以外であっても、受光素子を、アレイ状には位置したセンサーであっても、ＣＭＯＳセンサーであっても構わないことはいうまでもない。
【００２８】
画像処理用コンピュータ７１０は、ＣＣＤセンサー７０１及び７０２の信号から金属アレイに対応する画素を決定するための演算部と決定された画素の位置情報を記憶部とを有する演算装置７０３と、ＣＣＤセンサー７０１及び７０２の光情報を該金属アレイに対応する記憶された画素情報に基づいて演算装置の演算部で演算し、その結果を画面上に表示する表示装置７０３から構成されている。
【００２９】
ＣＣＤセンサー７０１と７０２との演算された光情報を表示装置７０１で表示する場合、各々光情報を、画面を分割して表示する、あるいは、ＣＣＤセンサー７０１と７０２との光情報を予め演算装置７０１の記憶部に記憶された処理方法により演算部で演算処理を行って１画像として表示する、あるいは、検査工程毎に必要とする画像を表示するようにすることができる。
実質的には演算して表示することになります。
【００３０】
更に、演算部は図示していないが、表面プラズモン共鳴を測定するために、上述の光源からの出射光となる光５０１の光軸と反射光５０３を受光する受光部の光軸の入射角５０２と反射角５０４とが同一の角度になるように例えば、アーム等の機構（不図示）を制御させることができる。演算部を介してアームを動かす場合、表面プラズモン共鳴の角度依存性を演算する際の角度情報を演算装置７０３に外部から角度情報を入力しないですむので演算部からアーム制御を行うことが好ましい。
【００３１】
詳細は後述するが、基板をプリズム上にセット後、例えば、下記のようなプロトコールで検査が行なわれる。
（１）標識化抗体を、予め抗原と反応させ、標識された抗原抗体ペアを作成する。
（２）蛍光標識した抗体を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（３）標識抗体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（４）標識された抗原が混入している検体を流路に導入する。
（５）レーザー光を導入し、各金属薄膜ドットから表面プラズモン共鳴曲線ならびに蛍光信号の時間変化を検出する。
（６）各金属薄膜ドットからの蛍光信号の時間変化をプロットすると、図９に示すような結果が得られる。
【００３２】
上記の、抗体の流入・インキュベート・洗浄・抗原の流入・インキュベート・洗浄・標識光体の流入・インキュベート・洗浄との工程を演算装置から制御する、あるいは、該工程の制御信号を演算装置７０３に入力することで必要であれば各工程後とに検査を行いその結果を表示することができる。
【００３３】
以下、図１の概略図を参照しながら本発明に関わる実施形態に係わる測定装置を詳細に説明する。尚、本発明が、ここに記した内容に限定されるものではないことは言うまでも無い。
【００３４】
本実施例に用いる３角柱型の直角プリズム１０１の各面を図１（ｂ）のようにＡ、Ｂ、Ｃと名前を付ける。図１（ａ）には、測定器の側面と基板の俯瞰図が示されている。測定器は、少なくとも、プリズム１０１、微小な金属アレイ１０２、基板１０３、捕捉体−標的物質複合体１０４、光源１０５、レーザー光１０６、コリメートレンズ１０７、偏光フィルター１１５、反射光１０８、集光レンズ１０９、検出器１１０、蛍光１１１、集光レンズ１１２、フィルター１１３および検出器１１４で構成されている。
【００３５】
プリズム１０１のＡ面に、基板１０３が固定されている。基板１０３を上面から俯瞰すると、基板上１０３上に、異なる捕捉体が固定化された微小な金属がアレイ状に配列されている。アレイ状に配列された金属（以下、金属アレイ１０２と称す）に光源（レーザー光源）１０５から出射されたレーザー光１０６を照射する。レーザー光１０６は、コリメートレンズ１０７で平行光に変換されプリズム１０１のＢ面に入射する。プリズム１０１のＢ面に入射したレーザー光は、プリズム１０１のＡ面で反射するとともに基板１０３上のリガンドに固定された検体による表面プラズモン共鳴による反射光１０８が、プリズム１０１のＣ面から出射される。
【００３６】
プリズム１０１のＢ面から出射された反射光１０８は、集光レンズ１０９により集光され２次元光センサーからなる検出器１１０に入射する。
【００３７】
基板１０３上に形成された微小な金属アレイ１０２は、異なる捕捉体が固定化されている。微小な金属アレイ１０２上に固定された異なる捕捉体により捕捉された検体が、プリズム１０１のＡ面に入射されたレーザー光１０６により励起され、蛍光１０１を発する。蛍光１０１は、集光レンズ１１２により集光されフィルター１１３により所望の波長のみが検出器１１４に入射する。
【００３８】
尚、図１では、金属アレイ１０２が形成された基板１０３とプリズム１０１とになっているが、プリズムのＡ面に金属アレイ１０２を直接形成することができることはいうまでもない。
【００３９】
プリズム１０１としては、屈折率１．４〜２．０までのものを用いることが出来るが、本構成では１．５以上のものであることが好ましい。微小金属アレイ１０２としては、直径が５０μｍ〜５ｍｍ程度、厚みが２０〜３００ｎｍ程度のものを用いることが出来るが、本構成では、直径１００μｍφ程度、膜厚５０ｎｍ程度が好ましい。基板１０３としては、プリズム１０１と屈折率がほぼ同じであるものが好ましい。捕捉体標的物質複合体１０４を構成する物質としては、抗原と抗体の組み合わせ、ＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡなどを選択して用いることができる。光源１０５としては、波長が２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲のレーザーダイオードまたはガスレーザを選択して用いることができる。本構成では波長が８００ｎｍ以下のものを用いることが好ましい。
【００４０】
コリメートレンズ１０７、１０９は、非球面レンズ、セルフォックレンズ、平凸もしくは両凸レンズ群、顕微鏡用対物レンズなどを用いることが出来る。本構成では、平凸または非球面レンズを用いることが好ましい。光センサー１１０としては、フォトダイオードアレイ、ＣＣＤアレイ、ＣＭＯＳアレイ等の２次元画素が配置された光センサーを用いることができる。本構成では、検体の濃度によってフォトダイオード、ＣＣＤアレイが適宜選択される。
【００４１】
集光レンズ１０９、１１２としては、平凸シリンダーレンズ、平凹シリンダーレンズ、非球面レンズ、平凸もしくは両凸球面レンズ群、顕微鏡用対物レンズおよびセルフォックレンズを用いることが出来る。本構成では平凸シリンダーレンズまたは平凹シリンダーレンズを用いることが好ましい。光学フィルター１１３としては色ガラスフィルター、ダイクロイックフィルター、ゼラチンフィルター、ロングパスフィルター、可視光ブロックフィルターおよびＩＲパスフィルターを用いることが出来る。本構成ではダイクロイックフィルター、もしくは色ガラスフィルターを用いることが好ましい。フィルター１１５としては、偏光フィルターが用いられる。
【実施例】
【００４２】
以下本発明の実施例を述べるが、本発明はここに記述した内容だけに制限を受けるものではない。
【００４３】
（実施例１）
図２を参照しながら説明する。プリズム２０１（部材：ＢＫ７、形状：Ａ≒２８．３ｍｍ、Ｂ＝Ｃ＝２０（ｍｍ））のＡ面に、プリズム２０１と同じ屈折率を持ったインデックスマッチングオイル（ニューポート社，Ｆ−ＩＭＦ−１０５）を塗布し、１００μｍφの金属アレイ２０２を形成した基板２０３を密着させた。
【００４４】
更に、その上に、検体や洗浄液を導入する透明な溶液セル２０４を接着した。光源２０５としては、レーザーダイオード（三洋電機製、ＤＬ３０３８−０３３）を用い、コリメートレンズ２０７としては、平凸レンズ（シグマ光機製、平凸レンズ５ｍｍφ）を用い、フィルター２２１としては偏光フィルター（シグマ光機製、ＳＰＦ−３０Ｃ−３２）を用いた。
【００４５】
これら入射光学系を、アーム２１９に固定した。光センサー２１０は、ＣＣＤエリアイメージセンサ（浜松フォトニクス製、Ｓ７０３０−０９０６）、コリメートレンズ２０９は、平凸レンズ（シグマ光機製、平凸レンズ５ｍｍφ）を用いた。これら受光光学系は、アーム２２０に固定され、測定時に、基板への入射角と反射角とが同じ角度になるようスキャンされる。また、反応セル２２１の上側には、蛍光光を集光する集光レンズ２１３（シグマ光機、平凸レンズ５ｍｍφ）、ＣＣＤエリアイメージセンサ（浜松フォトニクス製、Ｓ７０３０−０９０６）を設置した。
【００４６】
センサーの光学特性を確認する為に、以下の検討をおこなった。濃度が１ｘ１０-7ｍｏｌ／ＬのＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の蛍光色素）溶液に金属膜アレイ基板２０３を浸漬したあと、完成した光学系に設置した。レーザーダイオードからレーザー光（波長：約６３８ｎｍ、実効強度：３ｍＷ、１ｋＨｚの矩形波で変調）を導入し、アーム２１９、２２０を同期してスキャンさせプラズモンの共鳴特性と蛍光特性を測定すると、感度よく測定できることが確認された。
【００４７】
次に、癌のマーカーとして知られているＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＰＡＰの各種抗原について検出を試みる。まず各金属アレイにストレプトアビジンを付着させる。それからビオチン修飾した抗ＣＥＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＰＡＰ抗体を吸着させ、免疫センサーを用意した。
【００４８】
図３は、図２の構成を斜視図によって示したものである。図２と同じ構成に対しては同じ番号が付与されている。
【００４９】
図２と同様に、プリズム２０１と同じ屈折率を持ったインデックスマッチングオイルを塗布し、１００μｍφの金属アレイ２０２を形成した基板２０３を密着させた。
【００５０】
更に、その上に、検体や洗浄液を導入する透明な溶液セル２０４を接着した。光源２０５としては、レーザーダイオード、コリメートレンズ２０７としては、平凸レンズを用い、フィルター２２１としては偏光フィルターを用いた。
【００５１】
これら入射光学系を、アーム２１９に固定した。光センサー２１０は、ＣＣＤエリアイメージセンサ、コリメートレンズ２０９は、平凸レンズを用いた。これら受光光学系は、アーム２２０に固定され、測定時に、基板への入射角と反射角とが同じ角度になるようスキャンされる。また、反応セル２２１の上側には、蛍光光を集光する集光レンズ２１３、ＣＣＤエリアイメージセンサを設置した。
【００５２】
図４を用いて詳細に説明する。図４は、基板３０１上に金属薄膜からなる金属アレイ３０２が形成され、金属アレイ３０２上にリガンドとなる抗ＣＥＡ抗体３０３、抗ＡＦＰ抗体３０５、抗ＰＳＡ抗体３０４及び抗ＰＡＰ抗体３０６が固定されている状態を示す概念図である。抗体を基板に固定化させる方法は、アビジンをＳＨ基を介して金基板に吸着させ、抗体をビオチン化しアビジンビオチンで固定化させる方法を用いた。
【００５３】
基板３０１を蛍光分析装置にセットする。そして図１０に示すプロトコールで測定をおこなった。
（１）Ｃｙ５色素で蛍光標識した上記４種類の抗体を、各抗原と反応させ、標識された抗原を作成する。
（２）Ｃｙ５色素で蛍光標識した抗体を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（３）標識抗体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（４）標識されたＣＥＡ抗原、ＰＳＡ抗原、ＡＦＰ抗原、ＰＡＰ抗原が混入している検体を流路に導入する。
（５）レーザー光を導入し、各金属薄膜ドットから表面プラズモン共鳴曲線ならびに蛍光信号の時間変化を検出する。
【００５４】
各金属薄膜ドットからの蛍光信号の時間変化をプロットすると、図９が得られる。また、反応して固定化された量としては、吸着反応と乖離が終了した蛍光強度から見積もることができ、反応量としては表１が得られる。図９のプロファイルおよび表１の固定化量をデーターベースのデータと比較することにより、癌の部位を高い精度で特定することが可能となる。
【００５５】
本発明では、複数の抗原抗体反応を同時測定することができ、更に、プラズモン共鳴で生じさせた電場を用いて、蛍光強度の時間変化を測定することができる。この結果、従来はなしえなかった、複数の抗原抗体反応の同時測定を行い、反応の時間プロファイルならびに反応量から値をもとめることができる。
【００５６】
【表１】
【００５７】
（実施例２）
実施例１で使用した光学系を用いて、ＤＮＡのハイブリダイゼーション測定をおこなった。各金属アレイ表面にストレプトアビジンを付着させ、ビオチン修飾した２０量体ＤＮＡを４種類吸着させ、核酸センサーを用意した。
【００５８】
図５を用いて詳細に説明する
図５の平面図に示すように、基板４０１上に形成された２×２の金属アレイ４０２上に、４種類のビオチン修飾した２０量体ＤＮＡが固定されている。そして次のプロトコールをおこなった。
【００５９】
金属アレイに異なったリガンドの固定は、特許文献１と同様に行った。
（１）塩基配列が固定ＤＮＡ４０５（プローブＰ）と対応する捕捉ＤＮＡ（ターゲットＴ１、２０量体）にＣｙ５色素で蛍光標識した複合体４種類（Ａ＊、Ｂ＊、Ｃ＊、Ｄ＊）４０３と、塩基配列が一つだけ異なっている２０量体ＤＮＡ４種類（ターゲットＴ２、２０量体、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’）をＣｙ３色素で標識した複合体４種類４０４が混入している検体液を用意する。
（２）検体液を流路に導入した後、５分間インキュベートする。
（３）検体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（４）リン酸緩衝液を流路に注入する。
【００６０】
（４）の操作のあとレーザー光を導入し、プラズモン共鳴ならびに蛍光強度を測定すると、プラズモン共鳴曲線には、ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応前後で差異が見られなかった。一方、蛍光測定では、ＤＮＡの濃度１ｎＭまで感度よく測定されることが確認された。蛍光のスペクトルを分光器（不図示）で測定してみると６７０ｎｍ付近にピークをもつ色素のみが蛍光を発していることが確認され、Ｔ１のＤＮＡだけが特異的に結合していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の実施形態のプラズモン共鳴および蛍光の同時イメージング装置を表す図である。
【図２】本発明の実施例１のプラズモン共鳴および蛍光の同時イメージング装置を説明する為の図である。
【図３】本発明の実施例１のプラズモン共鳴および蛍光の同時イメージング装置の斜視図である。
【図４】金属アレイ上にリガンドが固定された状態を模式的に示す図である。
【図５】２×２の金属アレイ上にリガンドが固定された状態を模式的に示す図である。
【図６】本発明のイメージング装置の基板部の拡大模式図である。
【図７】本発明の基板上の発光状態を模式的に示す図である。
【図８】本発明の検出部の概略構成を示す図である。
【図９】本発明の実施例１を説明するための図である。
【図１０】実施例１のプロトコールを示す図。
【符号の説明】
【００６２】
１０１ プリズム
１０２ 金属アレイ
１０３ 基板
１０４ 捕捉体標的物質複合体
１０５ 光源
１０６ 励起光
１０７ コリメートレンズ
１０８ 反射光
１０９ 集光レンズ
１１０ 検出器
１１１ 蛍光
１１２ 集光レンズ
１１３ フィルター
１１４ 検出器
１１５ 偏光フィルター
２０１ プリズム
２０２ 金属アレイ
２０３ 基板
２０４ 溶液セルカバー
２０５ 半導体レーザー
２０６ 励起光
２０７ コリメートレンズ
２０８ 反射光
２０９ 集光レンズ
２１０ 検出器
２１１ 蛍光
２１２ 集光レンズ
２１４ フィルター
２１５、２１６ 検体もしくは洗浄液の注入口、または排出口
２１７ リード線
２１８ データ処理装置
２１９ 励起光学系固定用アーム
２２０ 反射光学系固定用アーム
２２１ 偏光フィルター
３０１ 基板
３０２ 金属アレイ
３０３ 抗ＣＥＡ抗体
３０４ 抗ＰＳＡ抗体
３０５ 抗ＡＦＰ抗体
３０６ 抗ＰＡＰ抗体
４０１ 基板
４０２ 金属アレイ
４０３ ターゲットＤＮＡ（Ｔ１）
４０４ ターゲットと塩基配列が異なるＤＮＡ（Ｔ２）
４０５ プローブＤＮＡ（Ｐ）
５０１ 入射光
５０２ 入射角
５０３ 反射光
５０４ 出射角
５０５ 蛍光
５０６ 金属薄膜
５０７ 誘電体基板
６０２ 基板
６０１ 発光
６０３ ２次元光センサー
６０４ 受光領域
６０５ 発光を受光した領域
７０１、７０２ 光センサー
７０３ 演算装置
７０４ 表示装置
７１０ 画像処理用コンピュウター
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体基体と、
該基体上に形成された複数の島状の金属薄膜からなる金属アレイと、
前記複数の島状の金属薄膜上に形成された特定の化学物質を捉える複数の異なった捕捉体と、
基体の前記金属アレイの形成された面と対向する面側に形成された第一の光学系と、
前記基板の金属膜が形成された面側に形成された第二の光学系とを有し、
前記第一の光学系は、第一の光源と前記第一の光源からの出射光の前記基体からの反射光を検出する２次元光センサーからなる第一の検出手段とからなり、
前記第二の光学系は、前記第一の光源により励起された捕捉体−標的物質複合体からの蛍光を検出する２次元光センサーからなる第二の検出手段とからなり、
前記第一の検出手段により検出された２次元の光情報を表示する第一の表示手段と、
前記第二の検出手段により検出された２次元の光情報を表示する第二の表示手段とを有することを特徴とするイメージング装置。
【請求項２】
前記特定の化学物質を捉える捕捉体がタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のイメージング装置。
【請求項３】
前記特定の化学物質を捉える捕捉体が核酸であることを特徴とする請求項１記載のイメージング装置。
【請求項４】
前記第一の光源の光軸の前記基体となす角と前記第一の検出手段の光軸の前記基体となす角度とが同一の角度を保持するようにスキャンされることを特徴とする請求項１記載のイメージング装置。
【請求項５】
励起光を入射または出射させるための誘電体基体と、
該基体上に形成された複数の島状の金属薄膜からなる金属アレイと、
前記複数の島状の金属薄膜上に形成された特定の化学物質を捉える複数の異なったリガンドと、
基板の前記金属膜アレイの形成された面と対向する面側に形成された第一の光学系と、前記基板の金属膜が形成された面側に形成された第二の光学系とを有し、
前記第一の光学系の第一の光源から前記基体へ前記第一の光源からの出射光を入射する工程と、
前記入射光の前記基体からの反射光を２次元光センサーにより検出する第一の検出工程と、
前記入射光により励起された前記捕捉体−標的物質複合体からの蛍光を検出する第二の検出工程と、
前記第一の検出工程で得られた第一の２次元光情報を２次元の表示装置により表示する第一の表示工程と、
前記第二の検出工程で得られた第二の２次元光情報を２次元の表示装置により表示する第二の表示工程とを有することを特徴とするイメージング方法。
【請求項６】
前記特定の化学物質を捉える捕捉体がタンパク質であることを特徴とする請求項５記載のイメージング方法。
【請求項７】
前記特定の化学物質を捉える捕捉体が核酸であることを特徴とする請求項５記載のイメージング方法。
【請求項８】
前記第一の光源の光軸の前記基体となす角と前記第一の検出手段の光軸の前記基体となす角度とが同一の角度を保持するようにスキャンされることを特徴とする請求項５記載のイメージング方法。
【請求項１】
誘電体基体と、
該基体上に形成された複数の島状の金属薄膜からなる金属アレイと、
前記複数の島状の金属薄膜上に形成された特定の化学物質を捉える複数の異なった捕捉体と、
基体の前記金属アレイの形成された面と対向する面側に形成された第一の光学系と、
前記基板の金属膜が形成された面側に形成された第二の光学系とを有し、
前記第一の光学系は、第一の光源と前記第一の光源からの出射光の前記基体からの反射光を検出する２次元光センサーからなる第一の検出手段とからなり、
前記第二の光学系は、前記第一の光源により励起された捕捉体−標的物質複合体からの蛍光を検出する２次元光センサーからなる第二の検出手段とからなり、
前記第一の検出手段により検出された２次元の光情報を表示する第一の表示手段と、
前記第二の検出手段により検出された２次元の光情報を表示する第二の表示手段とを有することを特徴とするイメージング装置。
【請求項２】
前記特定の化学物質を捉える捕捉体がタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のイメージング装置。
【請求項３】
前記特定の化学物質を捉える捕捉体が核酸であることを特徴とする請求項１記載のイメージング装置。
【請求項４】
前記第一の光源の光軸の前記基体となす角と前記第一の検出手段の光軸の前記基体となす角度とが同一の角度を保持するようにスキャンされることを特徴とする請求項１記載のイメージング装置。
【請求項５】
励起光を入射または出射させるための誘電体基体と、
該基体上に形成された複数の島状の金属薄膜からなる金属アレイと、
前記複数の島状の金属薄膜上に形成された特定の化学物質を捉える複数の異なったリガンドと、
基板の前記金属膜アレイの形成された面と対向する面側に形成された第一の光学系と、前記基板の金属膜が形成された面側に形成された第二の光学系とを有し、
前記第一の光学系の第一の光源から前記基体へ前記第一の光源からの出射光を入射する工程と、
前記入射光の前記基体からの反射光を２次元光センサーにより検出する第一の検出工程と、
前記入射光により励起された前記捕捉体−標的物質複合体からの蛍光を検出する第二の検出工程と、
前記第一の検出工程で得られた第一の２次元光情報を２次元の表示装置により表示する第一の表示工程と、
前記第二の検出工程で得られた第二の２次元光情報を２次元の表示装置により表示する第二の表示工程とを有することを特徴とするイメージング方法。
【請求項６】
前記特定の化学物質を捉える捕捉体がタンパク質であることを特徴とする請求項５記載のイメージング方法。
【請求項７】
前記特定の化学物質を捉える捕捉体が核酸であることを特徴とする請求項５記載のイメージング方法。
【請求項８】
前記第一の光源の光軸の前記基体となす角と前記第一の検出手段の光軸の前記基体となす角度とが同一の角度を保持するようにスキャンされることを特徴とする請求項５記載のイメージング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−２０８２９４（Ｐ２００６−２０８２９４Ａ）
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３５１７（Ｐ２００５−２３５１７）
【出願日】平成１７年１月３１日（２００５．１．３１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．セルフォック
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月３１日（２００５．１．３１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．セルフォック
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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