ヘテロ二量体タンパク質結合組成物
本発明は、抗原結合ドメインに関してＦｃドメインを新たに方向付けするという目的上、ＩｇＧ Ｆａｂドメイン内のＨおよびＬ鎖の配列の交換により抗原結合およびエフェクター機能を最大化するための改変免疫グロブリン組成物の作成方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンタンパク質に由来するヘテロ二量体タンパク質結合組成物、こうしたヘテロ二量体タンパク質結合組成物の製造方法およびそれらの用途の分野に関する。より具体的には、本発明は、抗原結合ドメインに関してＦｃドメインを新たに方向付けし（ｒｅｏｒｉｅｎｔ）かつ決定的な（ｃｒｉｔｉｃａｌ）結合部位をより到達可能にするという目的上、ＩｇＧ Ｆａｂドメイン内のＨおよびＬ鎖の間で配列を交換することにより、抗原結合を保存しつつ免疫エフェクター機能を最大化するためのヘテロ二量体タンパク質結合組成物の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
数十年間、抗体は、それらの特異的結合特性および高安定性により、研究および診断、ならびにより最近は疾患の治療的処置において必須であった。モノクローナル抗体は、当初、選ばれたＢ細胞株を不死骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマ、すなわち該選択されたＢ細胞クローンの選択された抗体タイプのみを分泌する不死細胞を製造することにより生じられた。組換えＤＮＡ技術の使用は、抗体の新たな製造方法ならびに新たな抗体構築物の設計を可能にした。
【０００３】
構造上、各抗体は２本の同一の「Ｈ」鎖および２本の同一の「Ｌ」鎖の相互作用により形成され、それらの全部は結合してＹ形状分子を形成する（Ｈ鎖はＹ全体に、そしてＬ鎖は２本の腕のみにわたる）。免疫グロブリンＧ抗体分子は、抗原結合を決定する相補性決定領域（ＣＤＲ）、エフェクター機能を決定する定常領域、および枠組み領域を含有する。多様な定常領域が多様な生物学的効果の範囲全体を媒介し得る。例えばアレルギー反応はＩｇＥ結合に続く一方、ＩｇＭ結合は補体系の活性化に至り得る。
【０００４】
抗体は、Ｙ単位の数およびＨ鎖のタイプに基づき５クラスすなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥに分割し得る。いかなる抗体のＬ鎖もκ若しくはλタイプ（ポリペプチドの分子の特徴の記述）いずれかに分類され得るが；しかしながらＨ鎖は各抗体のサブクラスを決定する。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのＨ鎖はそれぞれγ、μ、α、δおよびεとして知られる。
【０００５】
最も一般に使用される抗体はＩｇＧであり、これはタンパク質分解酵素パパインにより３部分すなわち２個のＦ（ａｂ）領域および１個のＦｃ領域に、若しくはタンパク質分解酵素ペプシンにより２部分すなわち１個のＦ（ａｂ’）２および１個のＦｃに切断され得る。Ｆ（ａｂ）領域は、抗原結合に決定的に重要である抗体の「腕」を含んでなる。Ｆｃ領域は、抗体の「尾部」を構成しかつ免疫応答において役割を演じ、そしていくつかの免疫化学的手順の間に抗体を操作するための有用な「ハンドル」としてはたらく定常領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなる。抗体上のＦ（ａｂ）領域の数はそのサブクラスと対応し、そして抗体の「価」（大ざっぱに述べれば、抗体がその抗原を結合しうる「腕」の数）を決定する。
【０００６】
従って、抗体構築物は、限定されるものでないがＨ若しくはＬ鎖の最低１個のＣＤＲまたはそれらのリガンド結合部分、Ｈ鎖若しくはＬ鎖可変領域、Ｈ鎖若しくはＬ鎖定常領域、フレームワーク領域、あるいはそれらのいずれかの部分を挙げることができる、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含んでなるいかなるタンパク質若しくはペプチド含有分子も包含し得る。抗体フラグメントは、２個のＦａｂフラグメントを生じるＹ形状の抗体分子の「ヒンジ」領域で切断するプロテアーゼ、パパインでの抗体の切断により生成されるＣＤＲ抗原結合部位を含有する、Ｆａｂとして知られる免疫グロブリン分子のフラグ
メントを包含し得る。抗体は、限定されるものでないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類を挙げることができるいかなる哺乳動物若しくはそれらのいずれかの組合せも包含し得るか、若しくはそれら由来であり得る。
【０００７】
細胞表面の標的を結合する多数の治療的ＩｇＧ抗体は、それらの完全な治療能力を実現するために、隣接細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）への同時の結合に依存する。これは、ＦｃＲおよび抗原の同時の結合（抗体が細胞性免疫応答を体液性免疫応答に結びつける手段）が、抗原を発現する細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）若しくは食作用のようなエフェクター機能に至り得るからである。しかしながら、より多くの抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイで評価されるようになりつつあるので、数種の抗体が、ＦｃＲを発現するエフェクター細胞の存在下で、標的（抗原を発現する）細胞株への良好な結合を示し得るにもかかわらず標的細胞の細胞傷害性を誘発し得ないことが、ますます明らかになりつつある。他の可能な説明を予見し得るとは言え、少なくとも数種の抗体については、こうした抗体上のＦｃＲ結合部位が、これらの抗体がそれらの細胞表面抗原に結合される場合に隣接細胞上のＦｃＲに物理的に到達可能でないことがあることがありそうである（図１）。現在のデータおよびモデルは、Ｆｃドメインが、ヒンジ領域でのＦｃＲ結合に適応するためにＦａｂドメインに関しておよそ９０°曲がることを必要とすることを示唆している。抗原に結合される場合に細胞表面に「平行に」向けられている抗体にとって、とりわけ抗原が剛性でありかつ「波打つ」ことが不可能である場合に、原形質膜若しくは何らかの他の分子から立体障害を伴わずこの劇的な再配置をとることは可能でないかもしれない。同一の理由から、抗体上のＣ１ｑ結合部位は、Ｃ１ｑすなわち古典的補体固定経路の最初の成分に到達可能でないことがあり、補体溶解活性の欠如をもたらす。
【０００８】
ＩｇＧ抗体は、分子内のいくつかの部位、とりわけヒンジ領域で曲がる能力をもつ柔軟な分子である。抗体は、Ｆｃドメインに関してＦａｂドメインの捻れ／ターンを受けることもまた報告されている。この捻れ／ターン能力は隣接細胞上のＦｃＲへのＦｃＲ結合部位の到達可能性に影響を与えることがありそうであるとは言え、こうした可動性は制限され、従っていかなるＦｃＲ結合部位もＦｃＲに到達可能に十分にすることはありそうでない。結果、所定の抗体が所望の細胞表面抗原に対する高い親和性および特異性を有しうる一方、その完全な治療的能力は、抗原の結合に際してのその向きがＦｃに媒介されるエフェクター機能の動員に好都合でない場合になお制限されうる。ここに記述される本発明は、こうした抗体のこの問題の解決手段を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明は、免疫グロブリン分子のＨ鎖およびＬ鎖を有するヘテロ二量体タンパク質結合組成物であり、該ヘテロ二量体タンパク質結合組成物は、Ｌ鎖配列で置換されたＨ鎖配列およびＨ鎖配列で置換されたＬ鎖配列を有する。それらのＦｃＲ結合部位を隣接細胞上のＦｃＲに到達不可能に若しくはＣ１ｑ結合部位を可溶性Ｃ１ｑ補体タンパク質に到達不可能にしておくような様式で細胞表面（若しくは別の方法で不溶性の）抗原に結合する抗体は、ＡＤＣＣ、ＦｃＲ媒介性の食作用および補体溶解のようなエフェクター機能を動員するそれらの固有の能力を完全に利用し得ない。ここに記述される本発明は、抗原結合ドメインに関してＦｃ結合の相対位置およびＣ１ｑ結合ドメインを新たに方向付けすることにより、この問題に対する解決策を提供する。これは、抗体（Ａｂ）分子の残部を非常に異なる位置で新たに方向付けしつつ抗原結合ドメインの構造を保存する様式でＡｂのＨおよびＬ鎖の間でアミノ酸配列を交換することにより達成される。ＨおよびＬ鎖の間で交換されることによりこれを達成し得る配列の例は、ａ）Ｈ鎖のＦｄドメイン全体（ＶＨ−ＣＨ１）およびＬ鎖全体（ＶＬ−ＣＬ）、ｂ）Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）およびＬ鎖の可変領域（ＶＬ）、ならびにｃ）ＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）およびＶＬのＣＤＲを包含する。逆に、例えば免疫エフェクター機能が誘発されないようにこれらの結合部位がより少な
く到達可能であるために、そのＦｃＲ結合部位およびＣ１ｑ結合部位が容易に到達可能であるＡｂを改変することが望ましいことができる。これは、同一の型の上述された配列交換アプローチにより達成し得る。
【００１０】
従って、本発明により、免疫グロブリンのＨおよびＬ鎖からの配列の多様なサブセットを、抗原結合ドメインに関してＦｃドメインを新たに方向付けするという目的上、特定の１ＡｂのＨおよびＬ鎖の間で交換する。これらの配列を交換されている適切に製造されたＡｂバリアントは、抗原結合親和性および特異性を保持するはずであるが、しかし、抗原に関してそれらのＦｃドメインが「反転」されている。細胞表面抗原の場合、Ｆｃドメインのこの新たな向きは、ＡｂのＦｃＲ結合部位への乏しい到達可能性とＦｃＲ結合部位への良好な到達可能性の間の差違をなしうる（図２Ｂ）。到達可能性の問題は、原形質膜若しくは隣接分子による妨害によりＦｃＲ結合部位を露出させるために必要な配置をとることが可能でないＡｂに帰されうる。加えて、本発明は、多様なＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４）またはなお多様なＩｇクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ若しくはＩｇＭ）からのＦｃドメインを混合かつ一致させることによる付加的な調整を見込む。
【００１１】
本発明は、別の局面において、前述のヘテロ二量体タンパク質結合構築物をコードするポリヌクレオチドおよびそれらの最低１種の指定される配列、ドメイン、部分若しくはバリアントを含んでなる単離された核酸分子を提供する。本発明は、こうした核酸分子を含んでなる組換えベクター、こうした核酸および／若しくは組換えベクターを含有する宿主細胞、ならびにこうした核酸、ベクターおよび／若しくは宿主細胞の作成および／若しくは使用方法をさらに提供する。
【００１２】
本発明は、本明細書に記述されるところの宿主細胞を、最低１種のこうしたヘテロ二量体タンパク質結合構築物が検出可能かつ／若しくは回収可能な量で発現される条件下で培養することを含んでなる、宿主細胞中でのこうしたヘテロ二量体タンパク質結合構築物の発現方法もまた提供する。宿主細胞は、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、Ａｇ６５３、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫若しくはリンパ腫細胞、またはそれらのいずれかの派生物、不死化若しくは形質転換細胞から選択しうる。ヘテロ二量体タンパク質結合構築物が検出可能かつ／若しくは回収可能な量で発現されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｓｉｔｕの条件下で該構築物をコードする核酸を翻訳することを含んでなる、最低１種のこうしたヘテロ二量体タンパク質結合構築物の製造方法もまた提供される。
【００１３】
本発明は、本明細書に記述されるところの本発明の単離されたヘテロ二量体タンパク質結合構築物をコードする核酸および／若しくはタンパク質ならびに適する担体若しくは希釈剤の双方を含んでなる最低１種の組成物もまた提供する。該担体若しくは希釈剤は既知の担体若しくは希釈剤に従って製薬学的に許容できうる。該組成物は最低１種のさらなる化合物、タンパク質若しくは組成物もまた含み得る。
【００１４】
本発明は、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところの関連した状態の前、後若しくは間に細胞、組織、器官、動物若しくは患者における最低１種の疾患状態を調節若しくは処置するために治療的有効量の本発明のヘテロ二量体タンパク質結合構築物を投与するための最低１種の方法若しくは組成物をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、治療的若しくは予防的有効量の本発明の最低１種のヘテロ二量体タンパク質結合構築物の送達のための最低１種の組成物、装置および／若しくは方法もまた提供する。
【００１６】
本発明は、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところの関連した状態の前、後若しくは間に細胞、組織、器官、動物若しくは患者における最低１種の疾患状態を診断するための、最低１種のヘテロ二量体タンパク質結合構築物の方法若しくは組成物をさらに提供する。
【００１７】
本発明の最低１種のヘテロ二量体タンパク質結合構築物を含んでなる医療用具もまた提供され、該装置は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される最低１様式により該抗体構築物を接触若しくは投与するのに適する。
【００１８】
包装資材、および溶液若しくは凍結乾燥された形態の本発明の最低１種の単離されたヘテロ二量体タンパク質結合構築物を含んでなる容器を含んでなる、ヒトの製薬学的若しくは診断的使用のための製品もまた提供される。該製品は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮送達装置若しくは系の１成分として容器を有することを場合によっては含み得る。
【００１９】
本発明の最低１種の単離されたヘテロ二量体タンパク質結合構築物を回収可能な量で発現することが可能な宿主、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物若しくは植物細胞を含んでなる、該抗体の製造方法もまた提供される。上の方法により製造した最低１種のヘテロ二量体タンパク質結合構築物が本発明でさらに提供される。
【００２０】
本発明は、本明細書に記述されるいかなる発明もさらに提供する。
【００２１】
［発明の詳細な記述］
Ａ．定義
別の方法で定義されない限り、本発明に関して使用される科学および技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。
【００２２】
さらに、文脈により別の方法で必要とされない限り、単数形の用語は複数を包含し、かつ、複数の用語は単数を包含する。一般に、本明細書に記述される細胞および組織培養、分子生物学、タンパク質およびオリゴ若しくはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリダイゼーションに関してかつその技術において利用される学術用語は当該技術分野で公知かつ一般に使用されるものである。標準的技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば電気穿孔法、リポフェクション）に使用される。
【００２３】
酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般に達成されたところの、若しくは本明細書に記述されるところの、製造元の仕様に従って実施する。前述の技術および手順は、一般に、当該技術分野で公知のかつ引用かつ論考される多様な一般的およびより特殊な参考文献に記述されるところの慣習的方法に従って実施する。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー １９８９（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）本明細書に記述される実験室手順、ならびに分析、合
成有機、医薬品および製薬化学の技術に関して利用される学術用語は当該技術分野で公知かつ一般に使用されるものである。化学合成、化学分析、製薬学的製造、製剤、ならびに患者の送達および処置の標準的技術が使用される。
【００２４】
本出願で使用される全部の科学および技術用語は、別の方法で指定されない限り、当該技術分野で一般に使用される意味を有する。本出願で使用されるところの以下の語若しくは句は以下の意味を有する。
【００２５】
「抗体」、「Ａｂ」若しくは「抗体ペプチド（１種若しくは複数）」は、無傷の抗体、若しくは特異的結合について無傷の抗体と競合するその結合フラグメントを指す。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術、または無傷の抗体の酵素若しくは化学的切断により製造する。結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂｌ）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体を包含する。「二特異性」若しくは「二官能性」抗体以外の抗体は、同一のその結合部位のそれぞれを有することが理解される。抗体は、過剰の抗体が、対受容体に結合される受容体の量を最低約２０％、４０％、６０％若しくは８０％、およびより通常は約８５％以上（ｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイで測定されるところの）低下させる場合に、対受容体への受容体の接着を実質的に阻害する。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「ヘテロ二量体タンパク質結合組成物」；「改変Ｉｇ分子」；もしくは「交換ドメイン抗体構築物」は、改変された抗体が１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインがＬ鎖上のドメインに交換されかつ／またはＬ鎖の１個若しくはそれ以上のドメインがＨ鎖のドメインに交換されているために天然に存在するＩｇ分子と異なる免疫グロブリン（「Ｉｇ」）分子を意味しており；ここで、交換されたドメインは元の抗体と同一のクラス若しくは異なるＩｇクラスのいずれであってもよい。改変Ｉｇ分子は、例えば、選ばれた一列に配置されかつ細胞中で発現される、Ｉｇドメイン若しくはその部分をコードするポリヌクレオチドを使用する慣習的遺伝子組み換えにより作成し得る。あるいは、改変Ｉｇ分子は、慣習的ポリペプチド合成技術を使用して合成し得る。Ｉｇ分子は、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を包含する）、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥ分子であり得る。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「定常領域ドメイン」若しくは「定常ドメイン」は、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨおよびＣＨ４を包含するＩｇ分子の定常部分内の１ドメインを指す。本明細書で使用されるところの「可変領域ドメイン」若しくは「可変ドメイン」は、特定の一領域に対するＩｇの特異性を賦与するＩｇ分子の部分を指す。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「抗原」は、免疫グロブリン分子の抗原結合領域に結合すること若しくは免疫応答を導き出すことのいずれかが可能な物質を意味している。本明細書で使用されるところの「抗原」は、限定されるものでないが、抗原決定基、ハプテンおよび免疫源を挙げることができる。
【００２９】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン若しくはＴ細胞受容体への特異的結合が可能ないかなるタンパク質決定基も包含する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸若しくは糖側鎖のような分子の化学的に活性の表面グループ分けよりなり、そして、通常、特定の三次元構造の特徴ならびに特定の電荷の特徴を有する。抗体は、解離定数が１ｍＭ、好ましくは１００ｎＭおよび最も好ましくは１０ｎＭである場合に抗原を特異的に結合すると言われる。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「ベクター」は、宿主細胞中で目的の１種若しくはそれ以上の遺伝子若しくはポリヌクレオチド配列を送達しかつ好ましくは発現することが可能である構築物を意味している。ベクターの例は、限定されるものでないが、ウイルスベク
ター、裸のＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、陽イオン性縮合剤と会合したＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に被包化されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、および産生体細胞のようなある種の真核生物細胞を挙げることができる。
【００３１】
本明細書で使用されるところの「ポリヌクレオチド」若しくは「核酸」は、一若しくは二本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドポリマーを意味しており、そして、別の方法で制限されない限り、天然に存在するヌクレオチドに類似の様式で核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの既知のアナログを包含する。別の方法で示されない限り、特定の核酸配列は、場合によっては相補配列を包含する。ポリヌクレオチド配列は、免疫グロブリンの可変および／若しくは定常領域ドメインをコードしうる。本明細書で使用されるところの「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源のポリヌクレオチド、またはそれらの何らかの組合せを意味している。その起源のおかげで、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）該「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全部若しくは一部分と会合していないか、（２）天然に連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、若しくは（３）より大きな配列の一部として天然に存在しない。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」は、Ｉｇと組み合わせられる場合にＩｇが生物学的活性を保持することを可能にしかつ被験体の免疫系と非反応性であるいかなる物質も包含する。例は、限定されるものでないが、リン酸緩衝生理的食塩水溶液、水のような標準的製薬学的担体、油／水乳剤のような乳剤、および多様な型の湿潤剤のいずれも挙げることができる。エアゾル若しくは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理的食塩水若しくは通常の（０．８５％）生理的食塩水を包含する。
【００３３】
付随する請求の範囲で使用されるところの「ある（ａ）」は最低１を意味しておりかつ複数を包含し得る。本明細書で使用されるところの「作動可能に連結される」という用語は、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係にある位置を指す。コーディング配列に「作動可能に連結された」制御配列は、該制御配列のものと適合性の条件下で該コーディング配列の発現が達成されるような様式で連結される。
【００３４】
本明細書で使用されるところの「制御配列」という用語は、それらが連結されているコーディング配列の発現およびプロセシングを遂げるのに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。こうした制御配列の性質は宿主生物体に依存して異なり；原核生物中では、こうした制御配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位および転写終止配列を包含し；真核生物においては、こうした制御配列は一般にプロモーターおよび転写終止配列を包含する。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現およびプロセシングに不可欠である全成分を包含することを意図しており、また、例えば、その存在が有利である付加的な成分、リーダー配列および融合パートナー配列もまた包含し得る。
【００３５】
本明細書で使用されるところの２０種の慣習的アミノ酸およびそれらの略語は慣習的使用法に従う。本発明の改変された抗体を構成するアミノ酸はしばしば略記される。アミノ酸の呼称は、当該技術分野で十分に理解されるところのその一文字記号、その三文字記号、名称若しくは３ヌクレオチドコドン（１種若しくは複数）によりアミノ酸を呼称することにより示し得る（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第３版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９９４を参照されたい）。
【００３６】
ポリペプチドに適用されるところの「実質的同一性」という用語は、２種のペプチド配列を至適に整列する場合に最低８０％の配列同一性、好ましくは最低９０％の配列同一性、より好ましくは最低９５％の配列同一性、および最も好ましくは最低９９％の配列同一
性を共有することを意味している。
【００３７】
好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。
【００３８】
保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば：脂肪族側鎖を有するアミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸はセリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸はリシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；イオウ含有側鎖を有するアミノ酸はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は；バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００３９】
本明細書に論考されるとおり、抗体すなわち免疫グロブリン分子のアミノ酸配列中の小さな変動は、本発明により包含されるとして企図されるが、但し、アミノ酸配列中の変動は最低７５％、より好ましくは最低８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％を維持する。とりわけ保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、それらの側鎖が関係するアミノ酸の一族内で起こるものである。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般に、族：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）荷電していない極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分割される。より好ましい族は：脂肪族−ハイドロックス（ｈｙｄｒｏｘ）＝セリン、トレオニン；アミド含有＝アスパラギン、グルタミン；脂肪族＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；芳香族＝フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンである。例えば、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、トレオニンのセリンでの孤立した置換、または構造上関係するアミノ酸でのあるアミノ酸の類似の置換は、とりわけ該置換が枠組み部位内のアミノ酸を巻き込まない場合に、生じる分子の結合若しくは特性に対し大きな影響を有しないであろうと期待することは合理的である。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド派生物の比活性をアッセイすることにより容易に決定し得る。アッセイは本明細書に詳細に記述される。抗体すなわち免疫グロブリン分子のフラグメント若しくはアナログは当業者により容易に製造され得る。フラグメント若しくはアナログの好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くに存在する。
【００４０】
構造および機能ドメインは、ヌクレオチドおよび／若しくはアミノ酸配列データの公的若しくは占有の配列データベースとの比較により同定し得る。好ましくは、コンピュータ化比較方法を使用して、既知の構造および／若しくは機能の他のタンパク質中に存在する配列モチーフ若しくは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定する。既知の三次元構造に折り畳まるタンパク質配列の同定方法は既知である。（Ｂｏｗｉｅら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１））。従って、前述の例は、本発明により構造および機能ドメインを定義するのに使用しうる配列モチーフおよび構造的コンホメーションを当業者が認識し得ることを示す。
【００４１】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変え、（４）結合親和性を変え、および（４）こうしたアナログの他の物理化学若しくは機能特性を賦与する若しくは改変するものである。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の配列の多様なムテインを包含し得る。例えば、単一若しくは複数のアミノ酸置換
（好ましくは保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列中で（好ましくは分子間接触を形成するドメイン（１個若しくは複数）の外側のポリペプチドの部分で行いうる。
【００４２】
保存的アミノ酸置換は親配列の構造的特徴を実質的に変えないはずである（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に存在するらせんを破壊、若しくは親配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊する傾向がないはずである）。
【００４３】
（技術に認識されるポリペプチドの二次およびＳ三次構造の例は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク １９８４；Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎとＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク州ニューヨーク １９９１；Ｔｈｏｒｎｔｏｎら Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５ １９９１（それぞれ引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている）。
【００４４】
患者という用語はヒトおよび家畜の被験体を包含する。
【００４５】
Ｂ．抗体構造
基本的な抗体の構造単位は四量体を含んでなる。各四量体はポリペプチド鎖の２個の同一の対から構成され、各対は１本の「Ｌ」（約２５ｋＤａ）および１本の「Ｈ」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を司る約１００ないし１１０若しくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を司る定常領域を定義する。ヒトＬ鎖はκおよびλ Ｌ鎖と分類される。Ｈ鎖定常領域はμ、δ、γ、αおよびεと分類され、そして抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義する。
【００４６】
γ Ｈ鎖定常領域のそれぞれは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有し、γ−３中のヒンジドメインは４種の異なるエキソンによりコードされる。（ＭｏｒｒｉｏｓｎとＯｉ“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｉｇ Ｇｅｎｅｓ”、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ ｐｐ．２５９−２７４ Ｈｏｎｊｏら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ １９８９中）。ＬおよびＨ鎖内で、可変および定常領域は約１２若しくはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、Ｈ鎖は約１０より多いアミノ酸の「Ｄ」領域もまた包含する。（全般として：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク １９８９）（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。各Ｌ／Ｈ鎖対の可変領域が抗体の結合部位を形成する。従って無傷の抗体は２個の結合部位を有する。二官能性若しくは二特異性抗体でを除き、該２結合部位は同一である。該鎖は全部、相補性決定領域すなわちＣＤＲともまた呼ばれる３個の超可変領域により結合される比較的保存された枠組み領域（ＦＲ）の同一の一般構造を表す。
【００４７】
各対の２本の鎖からのＣＤＲは枠組み領域により整列され、特異的１エピトープに結合することを可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、ＬおよびＨ鎖双方がドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、免疫学的目的のタンパク質のＫａｂａｔ配列（Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（国立保健研究所 メリーランド州ベセスダ １９８７および１９９１；ＣｈｏｔｉａとＬｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７ １９８７；Ｃｈｏｔｈｉａら Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３ １９８９）の定義に従う。
【００４８】
二特異性若しくは二官能性抗体は、２種の異なるＨ／Ｌ鎖対および２個の異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合若しくはＦａｂ’フラグメントの連結を包含する多様な方法により製造し得る。（例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉとＬａｃｈｍａｎｎ Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１ １９９０；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３ １９９２を参照されたい）。
【００４９】
二特異性抗体の製造は、慣習的抗体の製造と比較して相対的に労働集約的過程であり得、そして収量および純度の程度は二特異性抗体について一般により低い。
【００５０】
二特異性抗体は単一結合部位を有するフラグメント（例えばＦａｂ、ＦａｂおよびＦｖ）の形態で存在しない。
【００５１】
Ｃ．本発明の抗体
本発明は、Ｆｃドメインを抗原結合ドメインに関して新たに方向付けするという目的上、１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインがＬ鎖上のドメインに交換されかつ／またはＬ鎖の１個若しくはそれ以上のドメインがＨ鎖のドメインに交換されている改変抗体を創製するための抗体分子の工作にとりわけ関する。
【００５２】
本発明により、抗体の定常領域のＬおよびＨ鎖からの１個若しくはそれ以上の免疫グロブリン定常ドメインを交換することによりＦｃ受容体と相互作用するその能力において抗体の特徴を改変するための、複数の天然の若しくは改変された免疫グロブリン（Ｉｇ）定常ドメインの利用方法が提供される。特定のＡｂのアミノ酸配列が一旦決定されれば、そのＡｂのＨおよびＬ鎖配列のいずれかの組合せをコードする遺伝子を製造するために、標準的組換えＤＮＡの方法および／若しくはＤＮＡ合成が当業者により使用され得る。抗原結合ドメインに関してＦｃドメインを新たに方向付けするという目的上、特定のＡｂのＨおよびＬ鎖の間で交換しうる配列の多様なサブセットが存在する。例は：
Ｈ鎖ＦｄおよびＬ鎖全体（図２Ａ）−ＶＬ−ＣＬ−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３を作成する
Ｈ鎖およびＶＨ−ＣＨ１ Ｌ鎖は最低量の工作を必要とするはずである。ＦｄとＬ鎖の間の全部の接触点が維持されるはずである。
Ｖ領域（図２Ａ）−ＶＬ−ＣＨ１−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ Ｈ鎖およびＶＨ−ＣＬ Ｌ鎖を作成するためにＨおよびＬ鎖のＶ領域を交換することは、Ｖドメインと隣接Ｃドメインの間の新たな界面を適応させるための小さな工作のみを必要とするはずである。
ＣＤＲ−Ａｂ上のこれらの抗原結合モチーフは理論上鎖間で交換し得るとは言え、抗原結合を保存することは、ＣＤＲに隣接する配列に対する広範囲の工作を必要とすることがありそうであるとみられる
を包含する。
【００５３】
これらの配列が交換されている適切に製造されたＡｂバリアントは抗原結合親和性および特異性を保持するはずであるが、しかしそれらのＦｃドメインが抗原に関して「反転（ｆｌｉｐｅｄ）」されている。細胞表面抗原の場合には、Ｆｃドメインのこの新たな向きは、ＦｃＲ結合部位への乏しい到達可能性と、ＡｂのＦｃＲ結合部位への良好な到達可能性の間の差違をなしうる（図２Ｂ）。到達可能性の問題は、原形質膜若しくは隣接分子による妨害によりＦｃＲ結合部位を露出させるために必要な配置を取ることが可能でないＡｂに帰されうる。
【００５４】
こうしたＡｂバリアントは、可溶性抗原若しくはウイルス、例えばＦｃＲ結合部位若しくはＣ１ｑ結合部位がエピトープ以外の標的の一部分からの立体障害により阻害されている大型標的に対する利点もまた賦与しうる。こうしたＡｂ上のＦｃＲ結合部位若しくはＣ１ｑ結合部位の到達不可能性は、免疫複合体のＦｃＲ媒介性の消失若しくは標的の補体媒
介性の溶解に影響し得る。
【００５５】
一方の鎖から他方に交差するためのアミノ酸配列中の正確な点の決定において若干の程度の柔軟性が存在することができる。ＶＬ−ＣＬ−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ Ｈ鎖およびＶＨ−ＣＨ１ Ｌ鎖の２例を図３に示す。
【００５６】
腫瘍細胞標的への良好な結合しかしわずかなＡＤＣＣ活性を示すＡｂは、Ｆｃドメインの新たな方向付けが腫瘍細胞に対する高められたＡＤＣＣ活性につながり得るため、本発明の良好な候補であるとみられる。再工作された遺伝子を製造し得、そしてその後、慣習的Ａｂに使用される同一の細胞系で発現させ得、そして、生じるＡｂ変異体を、慣習的Ａｂに使用される同一の方法、すなわちプロテインＡ若しくはプロテインＧクロマトグラフィーにより精製し得る。抗原結合能力について試験した後、ＡＤＣＣ若しくは補体溶解アッセイが、再工作したＡｂバリアントが元のＡｂより大きな細胞死滅活性を有したかどうかを示すとみられる。例えば固定した抗原に結合されるＡｂにＦｃＲ＋細胞がどのくらい良好に結合するかを評価することにより、元のＡｂに対し再工作されたものでのＦｃドメインの到達可能性を比較する生物物理的手段もまた存在しうる。
【００５７】
本発明は、従って、ＩｇＧ Ａｂ上のＦｃＲ結合部位およびＣ１ｑ結合部位を新たに方向付けしかつおそらくはるかにより到達可能にする新規手段を提供する。数種のＡｂの効力は、これらの部位を到達可能にすることにより劇的に高められることがありそうである（とりわけ、ＡＤＣＣ、食作用若しくは補体活性化がその作用機序の一部であるＡｂ）。それらの作用機序の一部としてこうした免疫エフェクター機能を動員しないなお他のＡｂもまた、同時のＦｃＲ結合の効果によりその細胞表面若しくは別の方法で固定された抗原に対するより高い親和性を実現することにより、本発明により利益を得るとみられる。同時のＦｃＲ結合が大きくなるほど、その抗原から直ちに解離するいかなるＡｂもその抗原に緊密な近接でＦｃＲにより保持されることができ、それにより再会合の機会を大きく増大させることがよりありそうになる。このアプローチは、しばしば、より好都合な向きで結合する同一抗原に対する完全に異なるＡｂについて検索することより魅力的な選択肢であることができる。
【００５８】
抗体ドメインの物理的結合はいずれかの慣習的技術を利用して達成しうる。好ましい態様において、ドメインの物理的連結は組換え的に達成され、すなわち、こうしたドメインをコードする遺伝子構築物が、それからの発現に際して該分子の正しい集成を可能にする様式で発現系に導入される。前述の例を図２および３に描く。
【００５９】
こうした改変Ｉｇを構築するため、一般に、改変されるべきＡｂの選択されたＨＣ若しくはＬＣドメインをコードするＤＮＡを、容易に単離、工作および同一Ａｂの他の鎖をコードする遺伝子中の選択した部位にクローン化し得る。例えば、１アプローチにおいて、ＨＣのＶＨおよびＣＨ１コーディング配列を同時にＰＣＲ増幅しかつＣＨ１コーディング配列の直後に翻訳終止コドンを含有するように改変し得る。コードされるポリペプチドは改変されたＡｂのＬＣを構成し得る。同時に、同一ＡｂのＶＬおよびＣＬコーディング配列を同時にＰＣＲ増幅し、そしてＨＣのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする配列に、例えばこうしたコーディング配列のオーバーラップＰＣＲアプローチにより正確に結合することを可能にするように工作し得る。こうした遺伝子によりコードされるポリペプチドが改変ＡｂのＨＣを構成し得る。ＬおよびＨ鎖のこれらの構築物をその後、発現のため適する細胞株にトランスフェクトする。この様式で、図２Ｂおよび３に描かれる分子を製造し得る。
【００６０】
以下の実施例において、ヒトＶＬおよびＣＬドメインをコードする配列を、同一ＡｂのＨ鎖分子上のＶＨおよびＣＨ１ドメインの代わりに挿入した。同時に、ＶＨおよびＣＨ１
ドメインを、同一ＡｂのＶＬおよびＣＬドメインの代わりに挿入した。他の好ましい態様は、別のＡｂのＶＨおよびＣＨ１若しくはＶＬおよびＣＬコーディング配列（おそらく元のＡｂと同一の抗原若しくは異なる抗原を認識するもの）を使用することを包含し得る。こうした戦略は、例えばＦｃＲ結合を変えることに加え、他の動物種からの対応する抗原に対するより大きな反応性を与えることにより、抗原特異性を変え得る。交換されたドメインは、ＩｇＤのような別のＩｇアイソタイプのＬ鎖からのドメインでもまたありうる。通常、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインはＬ鎖定常領域と緊密に会合されており、そしてこの会合は、Ｈ鎖およびＬ鎖双方上の疎水性の面を埋める。
【００６１】
さらに、交換された定常領域は、天然の抗体中に存在する天然の形態の定常領域に制限されることを必要としない。むしろ、本発明での使用のための交換された定常領域ドメインは、例えば定常領域ドメインの突然変異誘発、次いで高められた活性についてスクリーニングすることにより生成し得るか、若しくは合成で製造し得る。
【００６２】
本発明は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、ラット、ハムスター若しくはマウスのような多様な種からの抗体で実施し得る。他の可能性は、ＣＤ４のようなＡｂ以外のタンパク質から免疫グロブリンドメインを挿入することであるとみられる。挿入される配列は、免疫グロブリンドメインであることを必要としないことがある。他の配列は、Ａｂの効力を改良するために必要とされる柔軟性若しくは空間配置を賦与することが可能でありうる。例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３のようなグリシンおよびセリン残基から構成されるポリペプチドリンカーを包含する。
【００６３】
本発明が、全般として受容体とそのリガンドの間の相互作用を高めることのためにもまた応用可能であることが認識されるであろう。この点に関して、受容体若しくはリガンド部分のいずれかを、受容体およびリガンドの親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）、親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）若しくは単に相互作用する能力を高める１部分以上を有する分子を生成するように改変しうる。別の方法を述べたので、本発明は、Ｆｃ受容体結合ドメインの空間的特徴を改変することにより、そのＦｃ標的に対する分子の親和性の増大方法を提供する。最終結果は、改変された分子がＦｃ受容体に対するより大きい親和性を有することができることである。加えて、免疫グロブリンドメインを交換することは外来タンパク質配列を導入しないため、該改変された分子は免疫原性であることがより少なくありそうである。
【００６４】
Ｅ．改変抗体の設計
上で論考したとおり、本発明の好ましい改変抗体構築物を製造するのに使用される基本設計は、１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインを抗体のＬ鎖定常領域に置換しかつ／または１個若しくはそれ以上のＬ鎖ドメインをＨ鎖定常領域に置換することである。本発明の１構築物は、ＨおよびＬ鎖Ｖ領域を交換して、ＶＬ−ＣＨ１−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ Ｈ鎖およびＶＨ−ＣＬ Ｌ鎖を作成することである（図２Ａに示されるとおり）。改変されるべきである抗体は、ヒト、げっ歯類若しくは他の供給源のいかなる抗体からも選択してよく、そしてキメラ、ヒト化、ヒト若しくは合成抗体でありうる。一態様において、改変されるべきである抗体は、正常若しくはトランスジェニックマウスの免疫化により生成しうる。該抗体は当該技術分野で既知の多数の方法のいずれによってもさらに改変しうる。一般に、改変抗体は、交換された定常ドメイン若しくは他の挿入配列をコードするポリヌクレオチドを、抗体の定常領域をコードするプラスミドに単純に置換すること、および改変抗体を製造するための適する宿主細胞中で該プラスミドを発現することにより製造しうる。該挿入物は直接作成しても若しくはリンカー分子を伴ってもよい。挿入物およびリンカーの性質は、意図される機能を実施する、すなわち抗体分子のＦｃ受容体結合を改変するのに必要なように設計し得る。抗体免疫グロブリン分子を改変する挿入物のアミノ酸組成および長さは、当該技術分野の既知のところの多様な異なる配列を含有する構築物を試験することにより決定しうる。
【００６５】
ある種の特徴を有する改変された分子が望ましい場合、その特徴をなんらかの方法で改良するように、定常領域挿入物にある種の突然変異を導入することが望ましいことができるか若しくは必要でありうる。しかしながら、ヒトでの使用のための抗体が望ましい場合には、免疫原性を低下させるために挿入物をヒト配列に可能な限り近づけることが望ましい。従って、免疫原性を生成することを回避するように、可能な限り少ないアミノ酸変化を改変された分子に導入することが一般に望ましい。
【００６６】
最低２種の異なる抗原に対する結合特異性を有する二特異性、ヘテロ特異性、ヘテロ複合物若しくは類似のモノクローナルのヒト化抗体もまた使用し得る。こうした場合は、結合特異性の一方を１種の抗原に対しかつ他方のものをいずれかの他の抗原に対し指定しうる。二特異性抗体の作成方法は当該技術分野で既知である。伝統的に、二特異性抗体の組換え製造は、２本のＨ鎖が異なる特異性を有する２本の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく（ＭｉｌｓｔｅｉｎとＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７ １９８３）。免疫グロブリンＨおよびＬ鎖の無作為な取り合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じ、それらのうち１種のみが正しい二特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー段階により通常なされる正しい分子の精製はむしろ厄介であり、そして生成物の収量は低い。類似の手順が開示されている、（例えば、第ＷＯ ９３／０８８２９号、米国特許第６２１０６６８号、同第６１９３９６７号、同第６１３２９９２号、同第６１０６８３３号、同第６０６０２８５号、同第６０３７４５３号、同第６０１０９０２号、同第５９８９５３０号、同第５９５９０８４号、同第５９５９０８３号、同第５９３２４４８号、同第５８３３９８５号、同第５８２１３３３号、同第５８０７７０６号、同第５６４３７５９号、同第５６０１８１９号、同第５５８２９９６号、同第５４９６５４９号、同第４６７６９８０号、第ＷＯ ９１／００３６０号、同第ＷＯ ９２／００３７３号、欧州特許第ＥＰ ０３０８９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５ １９９１；Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０ １９８６（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる））。
【００６７】
以下の実施例において、改変Ａｂは、Ｈ鎖Ｆｄ領域をコードするＤＮＡ配列を置換してＶＬ−ＣＬ１−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ Ｈ鎖およびＶＨ−ＣＨ１−ｈｇ−ＣＬ２−ＣＬ３
Ｌ鎖を作成するための組換えＤＮＡの方法を使用して製造した。
【００６８】
それが由来した未改変マウス抗体に比較した改変抗体の配列を図３に示す。
【００６９】
好ましくは、改変抗体構築物またはそれらのリガンド結合部分若しくはバリアントは最低１種のタンパク質リガンド若しくは受容体を結合し、そしてそれにより対応するタンパク質若しくはそのフラグメントの最低１種の生物学的活性を提供する。多様な治療上若しくは診断上意義のあるタンパク質が当該技術分野で公知であり、そして、こうしたタンパク質の適するアッセイ若しくは生物学的活性もまた当該技術分野で公知である。いずれかの数の生物学的に活性のタンパク質を結合する改変抗体を本発明とともに使用しうる。ＴＮＦ、レプチン、インターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−２３など）のいずれか、および補体活性化（例えばＣ３ｂ）に関与するタンパク質に結合しかつ従ってそれらの活性を調節する抗体がとりわけ興味深い。腫瘍上で発現されるタンパク質などを包含する、ある種の疾患状態で差別的に発現されるターゲッティングタンパク質もまた興味深い。これらの分類のリガンドの全部は、本明細で引用される参考文献および他の参考文献に記述される方法により発見されうる。改変抗体のとりわけ好ましい一群はサイトカイン受容体に結合するものである。サイトカインは最近、それらの受容体記号に従って分類された（Ｉｎｇｌｏｔ １９９７、Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ ４５：３５３−７（ここに引用することによりそっく
りそのまま組み込まれる）を参照されたい）。
【００７０】
改変定常領域を含んでなる本発明の改変抗体は、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところの、ハイブリドーマ、ファージディスプレイ（Ｋａｔｓｕｂｅ，Ｙ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ、１（５）：８６３−８６８ １９９８）のようないずれかの適する方法、若しくはトランスジェニック動物を使用する方法から得られる抗体を使用して製造し得る。
【００７１】
本発明の改変抗体構築物は、それが由来した親抗体からの天然の突然変異若しくは人的操作のいずれかからの１個若しくはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を包含し得る。
【００７２】
別の局面において、本明細書に記述されるところの改変抗体構築物は有機部分の共有結合によりさらに改変しうる。こうした改変は、改良された薬物動態特性（例えば増大されたｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期）を伴う抗体若しくは抗原結合フラグメントを生じ得る。有機部分は、直鎖状若しくは分枝状の親水ポリマー基、脂肪酸基若しくは脂肪酸エステル基であり得る。特定の態様において、親水ポリマー基は約８００ないし約１２０，０００ダルトンの分子量を有し得、そしてポリアルカングリコール（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー若しくはポリビニルピロリドンであり得、また、脂肪酸若しくは脂肪酸エステル基は約８から約４０個までの炭素原子を含み得る。
【００７３】
本発明の改変抗体および抗原結合フラグメントは、抗体に直接若しくは間接的に共有結合されている１個若しくはそれ以上の有機部分を含み得る。本発明の抗体若しくは抗原結合フラグメントに結合されている各有機部分は、独立に、親水ポリマー基、脂肪酸基若しくは脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用されるところの「脂肪酸」という用語はモノカルボン酸およびジカルボン酸を包含する。該用語が本明細書で使用されるところの「親水ポリマー基」は、オクタン中でよりも水中でより溶解性である有機ポリマーを指す。例えばポリリシンはオクタン中でよりも水中でより溶解性である。従ってポリリシンの共有結合により改変された抗体が本発明により包含される。本発明の抗体を改変するのに適する親水ポリマーは直鎖状若しくは分枝状であり得、そして、例えばポリアルカングリコール（例えばＰＥＧ、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えばデキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えばポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド（例えばポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）およびポリビニルピロリドンを包含する。好ましくは、本発明の抗体を改変する親水ポリマーは、別個の分子実体として約８００ないし約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えばＰＥＧ５０００およびＰＥＧ２０，０００（ここで下付き文字はポリマーの平均分子量（ダルトン）である）を使用し得る。親水ポリマー基は１ないし約６個のアルキル、脂肪酸若しくは脂肪酸エステル基で置換し得る。脂肪酸若しくは脂肪酸エステル基で置換される親水ポリマーは、適する方法を使用することにより製造し得る。例えば、アミン基を含んでなるポリマーを脂肪酸若しくは脂肪酸エステルのカルボキシレートに結合し得、そして、脂肪酸若しくは脂肪酸エステル上の活性化されたカルボキシレート（例えばＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化された）をポリマー上のヒドロキシル基に結合し得る。
【００７４】
本発明の抗体を改変するのに適する脂肪酸および脂肪酸エステルは飽和であり得るか、または１個若しくはそれ以上の不飽和単位を含有し得る。本発明の抗体を改変するのに適する脂肪酸は、例えば、ｎ−ドデカノエート（Ｃ１２、ラウレート）、ｎ−テトラデカノエート（Ｃ１４、ミリステート）、ｎ−オクタデカノエート（Ｃ１８、ステアレート）、
ｎ−エイコサノエート（Ｃ２０、アラキデート）、ｎ−ドコサノエート（Ｃ２２、ベヘネート）、ｎ−トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタノエート（Ｃ４０）、ｃｉｓα α９−オクタデカノエート（Ｃ１８、オレエート）、全ｃｉｓα５，８，１１，１４−エイコサテトラエノエート（Ｃ２０、アラキドネート）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などを包含する。適する脂肪酸エステルは、直鎖状若しくは分枝状の低級アルキル基を含んでなるジカルボン酸のモノエステルを包含する。低級アルキル基は１から約１２まで、好ましくは１ないし約６個の炭素原子を含み得る。
【００７５】
改変ヒト抗体および抗原結合フラグメントは、１種若しくはそれ以上の修飾剤との反応によるような適する方法を使用して製造し得る。該用語が本明細書で使用されるところの「修飾剤」は、活性化基を含んでなる適する有機基（例えば親水ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件下で第二の化学基と反応してそれにより修飾剤と該第二の化学基の間に共有結合を形成し得る化学部分若しくは官能基である。例えば、アミン反応性の活性化基は、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などのような親電子基を包含する。チオールと反応し得る活性化基は、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などを包含する。アルデヒド官能基をアミン若しくはヒドラジド含有分子に結合し得、また、アジド基は三価のリン基と反応してホスホルアミデート若しくはホスホルイミド結合を形成し得る。活性化基の分子への適する導入方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ カリフォルニア州サンディエゴ １９９６を参照されたい）。活性化基は、有機基（例えば親水ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接、またはリンカー部分、例えば１個若しくはそれ以上の炭素原子が酸素、窒素若しくはイオウのようなヘテロ原子により置換されている二価のＣ１−Ｃ１２基により結合され得る。適するリンカー部分は、例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−を包含する。リンカー部分を含んでなる修飾剤は、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下にモノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えばモノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を脂肪酸と反応させて、遊離アミンと脂肪酸のカルボキシレートの間にアミド結合を形成することにより製造し得る。Ｂｏｃ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により生成物から除去して、記述されるところの別のカルボキシレートに結合され得る一級アミンを露出させ得るか、若しくは、無水マレイン酸と反応され得、そして生じる生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生じさせ得る。（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、第ＷＯ ９２／１６２２１号明細書（その教示全体は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
【００７６】
本発明の改変抗体は、ヒト抗体若しくは抗原結合フラグメントを修飾剤と反応させることにより製造し得る。例えば、有機部分を、アミン反応性の修飾剤、例えばＰＥＧのＮＨＳエステルを使用することにより部位非特異的様式で抗体に結合し得る。改変ヒト抗体若しくは抗原結合フラグメントは、抗体若しくは抗原結合フラグメントのジスルフィド結合（例えば鎖内ジスルフィド結合）を還元することによってもまた製造し得る。還元された抗体若しくは抗原結合フラグメントをその後、チオール反応性の修飾剤と反応させて、本発明の改変抗体を製造し得る。本発明の抗体の特定部位に結合されている有機部分を含んでなる改変ヒト抗体および抗原結合フラグメントは、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、３：１４７−１５３ １９９２；Ｗｅｒｌｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５：４１１−４１７ １９９４；Ｋｕｍａｒａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３−２２４１ １９９７；Ｉｔ
ｏｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２４（１）：５９−６８ １９９６；Ｃａｐｅｌｌａｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、５６（４）：４５６−４６３ １９９７；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ カリフォルニア州サンディエゴ １９９６に記述される方法）のような適する方法を使用して製造し得る。
【００７７】
Ｆ．改変抗体の製造
本発明のキメラ抗体の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子、フラグメントおよび領域を、ヒト胎児肝ライブラリーから既知の方法により得ることができる。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現かつ産生するものを包含するいかなるヒト細胞からも得ることができる。ヒトＣＨ領域は、γ、μ、α、δ、εを包含するヒトＨ鎖の既知のクラス若しくはアイソタイプ、ならびにＧ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４のようなそれらのサブタイプのいずれからも得ることができる。Ｈ鎖アイソタイプが抗体の多様なエフェクター機能を司るため、ＣＨ領域の選択は、補体固定若しくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における活性のような所望のエフェクター機能により導かれることができる。好ましくは、ＣＨ領域はγ１（ＩｇＧ１）に由来する。ヒトＣＬ領域はいずれかのヒトＬ鎖アイソタイプすなわちκ若しくはλ、好ましくはκに由来し得る。
【００７８】
ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子は、標準的クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー １９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８７−１９９３）によりヒト細胞から得られる。ヒトＣ領域遺伝子は、２クラスのＬ鎖、５クラスのＨ鎖、およびそれらのサブクラスを表す遺伝子を含有する既知のクローンから容易に入手可能である。Ｆ（ａｂｌ）２およびＦａｂのようなキメラ抗体フラグメントは、適切に切断されているキメラＨ鎖遺伝子を設計することにより製造し得る。例えば、Ｆ（ａｂｌ）２フラグメントのＨ鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメインおよびＨ鎖のヒンジ領域、次いで切断された分子を生じるための転写終止コドンをコードするＤＮＡ配列を包含するとみられる。
【００７９】
一般に、本発明のマウス、ヒト若しくはマウスおよびキメラ抗体、フラグメントおよび領域は、特定の抗体のＨおよびＬ鎖抗原結合領域をコードするＤＮＡセグメントをクローン化すること、ならびにこれらのＤＮＡセグメントをそれぞれＣＨおよびＣＬ領域をコードするＤＮＡセグメントに結合してマウス、ヒト若しくはキメラの免疫グロブリンをコードする遺伝子を生じることにより製造される。
【００８０】
従って、好ましい一態様において、交換された配列を含有するヒトＣ領域の少なくとも一部分をコードする第二のＤＮＡセグメントに連結された、結合（Ｊ）セグメントを伴う機能的に再配列されたＶ領域のような、ヒト若しくはヒト以外の起源の抗体の少なくとも抗原結合領域をコードする第一のＤＮＡセグメントを含んでなる融合キメラ遺伝子が創製される。
【００８１】
可変、定常若しくは挿入物配列の配列は、該キメラ抗体が目的の抗原に結合しかつそれを阻害する能力を維持する程度まで、挿入、置換および欠失により改変しうる。当業者は、適用可能な機能アッセイを実施することによりこの活性の維持を確かめ得る。
【００８２】
本発明の抗体構築物は、場合によっては、当該技術分野で公知のところの細胞株、混合細胞株、不死化細胞若しくは不死化細胞のクローン集団により産生され得る。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク １９８７−２００１；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー １９８９；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー １９８９；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク １９９４−２００１；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク １９９７−２００１（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。）
【００８３】
１アプローチにおいて、ハイブリドーマは、適する不死細胞株（例えば、限定されるものでないが、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳ／Ｏ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ ＳＡ３、Ｓｐ２ ＭＡＩ、Ｓｐ２ ＳＳ１、Ｓｐ２ ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ１４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａなどを挙げることができる骨髄腫細胞株、若しくはヘテロミエローマ、それらの融合生成物、またはそれら由来のいずれかの細胞若しくは融合細胞、あるいは当該技術分野で既知のところのいずれかの他の適する細胞株。（例えばｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍを参照されたい）などを、限定されるものでないが単離若しくはクローン化された脾、末梢血、リンパ、扁桃、または他の免疫若しくはＢ細胞含有細胞、あるいは組換え若しくは内因性のウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、は虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯類、ウマ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ヤギ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、霊長類、真核生物のゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ若しくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖若しくは三本鎖、ハイブリダイズされたなど、またはそれらのいずれかの組合せのような内因性若しくは異種いずれかの核酸としてＨ若しくはＬ鎖定常若しくは可変または枠組みまたはＣＤＲ配列を発現するいずれかの他の細胞を挙げることができる抗体産生細胞と融合することにより製造される。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、およびＣｏｌｌｉｇａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記、第２章（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。）
【００８４】
いずれかの他の適する宿主細胞もまた、本発明の改変された抗体、その指定されるフラグメント若しくはバリアントをコードする異種若しくは内因性核酸を発現させるために使用し得る。融合（ハイブリドーマ）若しくは組換え細胞は、選択的培養条件若しくは他の適する既知の方法を使用して単離し得、そして、限界希釈、細胞分取若しくは他の既知の方法によりクローン化し得る。所望の特異性をもつ抗体を産生する細胞は適するアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）により選択し得る。
【００８５】
ヒト以外の若しくはヒトの抗体の工作すなわちヒト化方法を使用し得、そして当該技術分野で公知である。一般に、ヒト化すなわち工作された抗体はヒト以外である供給源からの１個若しくはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と称され、典型的には、既知のヒト配列の「輸入」可変、定常若しくは他のドメインから採用される。既知のヒトＩｇ配列は開示されている；（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／〜
ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／〜ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ＡＥＰＳｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／〜ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍａｒｔｉｎ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／〜ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｅａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋｉ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；
Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国保健省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ）１９８３（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）。）
【００８６】
こうした輸入された配列を使用して、免疫原性を低下させ得るか、または、結合、親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）、オン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、オフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）、特異性、半減期、若しくは当該技術分野で既知のところのいずれかの他の適する特徴を低下し得るか、高め得るか、若しくは改変し得る。一般に、ヒト以外若しくはヒトのＣＤＲ配列の一部若しくは全部が維持される一方、可変および定常領域のヒト以外の配列がヒト若しくは他のアミノ酸で置換される。抗体はまた、抗原に対する高親和性および他の好都合な生物学的特性の保持を伴いヒト化し得る。この最終目標を達成するため、ヒト化抗体は、場合によっては、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列および多様な概念的ヒト化産物の分析の方法により製造し得る。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能でありかつ当業者になじみがある。選択した候補免疫グロブリン配列のありそうな三次元コンホメーション構造を具体的に説明しかつ表示するコンピュータプログラムを利用可能である。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原を結合する能力に影響する残基の解析を可能にする。こうして、標的抗原（１種
若しくは複数）に対する増大された親和性のような所望の抗体の特徴が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサスおよび輸入配列から選択しかつ組合せ得る。一般に、ＣＤＲ残基は抗原結合に影響することに直接かつ最も実質的に関与する。本発明の抗体のヒト化若しくは工作は、限定されるものでないが：（Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ
３２１：５２２ １９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３ １９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ １９８８；Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６ １９９３；ＣｈｏｔｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１ １９８７；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５ １９９２；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３ １９９３；米国特許第５７２３３２３号、同第５９７６８６２号、同第５８２４５１４号、同第５８１７４８３号、同第５８１４４７６号、同第５７６３１９２号、同第５７２３３２３号、同第５，７６６８８６号、同第５７１４３５２号、同第６２０４０２３号、同第６１８０３７０号、同第５６９３７６２号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５２２５５３９号；同第４８１６５６７号明細書、ＰＣＴ／：第ＵＳ９８／１６２８０号、第ＵＳ９６／１８９７８号、第ＵＳ９１／０９６３０号、第ＵＳ９１／０５９３９号、第ＵＳ９４／０１２３４号、第ＧＢ８９／０１３３４号、第ＧＢ９１／０１１３４号、第ＧＢ９２／０１７５５号明細書；第ＷＯ９０／１４４４３号、同第ＷＯ９０／１４４２４号、同第ＷＯ９０／１４４３０号明細書、欧州特許第ＥＰ ２２９２４６号明細書（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）、その中に引用される包含される参考文献）に記述されるものを挙げることができるいずれかの既知の方法を使用して実施し得る。
【００８７】
本発明の抗体は、それらの乳中でこうした抗体を産生するヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどのようなトランスジェニック動物すなわち哺乳動物を提供するために最低１種の抗体構築物をコードする核酸を使用してもまた製造し得る。こうした動物は既知の方法を使用して提供し得る。（例えば、限定されるものでないが米国特許第５，８２７，６９０号；同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号、同第５，５６５，３６２号；同第５，３０４，４８９号など（それらのそれぞれは引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
【００８８】
本発明の抗体は、加えて、植物部分若しくはそれから培養される細胞中でこうした抗体、指定される部分若しくはバリアントを産生するトランスジェニック植物および培養植物細胞（限定されるものでないがタバコおよびトウモロコシを挙げることができる）を提供するために、最低１種の抗体構築物をコードする核酸を使用して製造し得る。制限しない一例として、組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉が、例えば誘導可能なプロモーターを使用して大量の組換えタンパク質を提供するのに成功裏に使用されている。（例えば、Ｃｒａｍｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５−１１８ １９９９を参照されたい）およびその中に引用される参考文献。また、トランスジェニックトウモロコシが、他の組換え系で産生されるか若しくは天然の供給源から精製されるものと同等の生物学的活性を伴い、商業生産レベルで哺乳動物タンパク質を発現するのに使用されている。（例えば、Ｈｏｏｄら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７−１４７ １９９９およびその中に引用される参考文献を参照されたい。）一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のような抗体フラグメントを包含する抗体はまた、タバコ種子およびバレイショ塊茎を包含するトランスジェニック植物種子からも大量に産生されている。（例えば、Ｃｏｎｒａｄら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１−１０９ １９９８およびその中に引用される参考文献を参照されたい。）従って、本発明の抗体は、既知の方法に従ってトランスジェニック植物を使用してもまた製造し得る。（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０：９９−１９８、Ｏｃｔ．、１９９９；Ｍａら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．１３：５２２−７ １９９；Ｍａら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１−６ １９９５；Ｗｈｉｔｅｌａｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０−９４４ １９９４；およびその中に引用される参考文献もまた参照されたい；上の参考文献のそれぞれは引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。）
【００８９】
抗原に対する抗体の親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）若しくは親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）はいずれかの適する方法を使用して実験的に決定し得る。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ ニューヨーク州ニューヨーク １９８４中；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ニューヨーク州ニューヨーク １９９２；および本明細書に記述される方法を参照されたい。）特定の抗体−抗原相互作用の測定される親和性は、多様な条件（例えば塩濃度、ｐＨ）下で測定される場合に変動し得る。従って、親和性および他の抗原結合パラメータ（例えばＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は、好ましくは抗体および抗原の標準化された溶液、ならびに本明細書に記述される緩衝液のような標準化された緩衝液を用いて行う。
【００９０】
Ｇ．核酸分子
本明細書に提供される情報を使用して、本発明の抗体構築物をコードする本発明の核酸分子を、本明細書に記述される若しくは当該技術分野で既知のところの方法を使用して得ることができる。
【００９１】
本発明の核酸は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ若しくはいずれかの他の形態のようなＲＮＡの形態、または限定されるものでないがクローニングにより得られるか若しくは合成で製造されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを挙げることができるＤＮＡの形態、あるいはそれらのいずれかの組合せであり得る。ＤＮＡは三本鎖、二本鎖若しくは一本鎖、またはそれらのいずれかの組合せであり得る。ＤＮＡ若しくはＲＮＡの少なくとも１本の鎖のいずれかの部分が、センス鎖としてもまた知られるコーディング鎖であり得るか、または、それはアンチセンス鎖ともまた称される非コーディング鎖であり得る。
【００９２】
本発明の単離された核酸分子は、１種若しくはそれ以上のイントロン、改変された抗体構築物のコーディング配列を含んでなる最低１種のＨ鎖若しくはＬ鎖核酸分子のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／若しくはＣＤＲ３のような最低１個のＣＤＲの最低１個の指定される部分、ならびに、上述されたものと実質的に異なるヌクレオチド配列を含んでなるがしかし遺伝暗号の縮重により本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところの最低１種のこうした改変抗体構築物をなおコードする核酸分子を場合によっては含む１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでなる核酸分子を包含し得る。もちろん遺伝暗号は当該技術分野で公知である。従って、本発明の特定の抗体をコードするこうした縮重核酸バリアントを生成することが当業者にとって慣例であるとみられる。（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）、そしてこうした核酸バリアントは本発明に包含される。
【００９３】
本明細書で示されるとおり、抗体構築物をコードする核酸を含んでなる本発明の核酸分子は、限定されるものでないが、抗体フラグメントのアミノ酸配列を独力でコードするもの、該抗体全体若しくはその一部分のコーディング配列、抗体、フラグメント若しくは部分のコーディング配列、ならびに、限定されるものでないが、転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル（例えば−リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を包含するｍＲＮＡプロセシングである役割を演じる転写され翻訳されない配列のような非コーディング５’および３’配列を挙げることができる付加的な非コーディング配列と一緒の最
低１種のイントロンのような前述の付加的なコーディング配列を伴う若しくは伴わない最低１個のシグナルリーダー若しくは融合ペプチドのコーディング配列のような付加的な配列；付加的な官能性を提供するもののような付加的なアミノ酸をコードする付加的なコーディング配列を挙げることができる。従って、抗体をコードする配列は、抗体のフラグメント若しくは一部分を含んでなる融合抗体の精製を容易にするペプチドをコードする配列のようなマーカー配列に融合し得る。
【００９４】
核酸の構築
本発明の単離された核酸は、当該技術分野で公知のところの（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術若しくはそれらの組合せを使用して作成し得る。
【００９５】
該核酸は本発明のポリヌクレオチドに加えて配列を便宜的に含み得る。例えば、１個若しくはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含んでなるマルチクローニング部位を、ポリヌクレオチドの単離で補助するために核酸に挿入し得る。また、翻訳可能な配列を、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離で補助するために挿入し得る。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するための便宜的手段を提供する。本発明の核酸（コーディング配列を除外する）は、場合によっては、本発明のポリヌクレオチドをクローン化かつ／若しくは発現するためのベクター、アダプター若しくはリンカーである。
【００９６】
付加的な配列を、クローニングおよび／若しくは発現でのそれらの機能を至適化するため、ポリヌクレオチドの単離で補助するため、または細胞中へのポリヌクレオチドの導入を改良するために、こうしたクローニングおよび／若しくは発現配列に付加し得る。クローニングベクター、発現ベクター、アダプターおよびリンカーの使用は当該技術分野で公知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）
【００９７】
核酸の組換え構築方法
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、若しくはそれらのいずれかの組合せのような本発明の単離された核酸組成物は、当業者に既知のいずれかの数のクローニング方法論を使用して生物学的供給源から得ることができる。いくつかの態様において、ストリンジェント条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の配列を同定する。ＲＮＡの単離ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築は当業者に公知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）
【００９８】
核酸のスクリーニングおよび単離方法
ｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーを、本明細書に開示されるもののような本発明のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを使用してスクリーニングし得る。ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて同一若しくは異なる生物体中の相同な遺伝子を単離するためにプローブを使用し得る。当業者は、ハイブリダイゼーションの多様な程度のストリンジェントを該アッセイで使用し得；そしてハイブリダイゼーション若しくは洗浄媒体のいずれかがストリンジェントであり得ることを認識するであろう。ハイブリダイゼーションの条件がよりストリンジェントになる際に、二重鎖形成が起こるためにプローブと標的の間のより大きな程度の相補性が存在しなければならない。ストリンジェントの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、およびホルムアミドのような部分的変性溶媒の存在により制御し得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェントは、０％ないし５０％の範囲内のホルムアミドの濃度の操作により反応体溶液の極性を変化させることにより便宜的に変動させ得る。検出可能な結合に必要とされる相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒体および／若しくは洗浄媒体のストリンジェントに従
って変動することができる。相補性の程度は、至適には１００％、若しくは７０〜１００％、またはその中のいずれかの範囲若しくは値であることができる。しかしながら、プローブおよびプライマー中の小さな配列の変動は、ハイブリダイゼーションおよび／若しくは洗浄媒体のストリンジェントを低下させることにより補償され得ることが理解されるべきである。
【００９９】
ＲＮＡ若しくはＤＮＡの増幅方法は当該技術分野で公知であり、そして本明細書に提示される教示および手引きに基づき、過度の実験を伴わずに本発明により使用し得る。
【０１００】
ＤＮＡ若しくはＲＮＡの既知の増幅方法は、限定されるものでないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関係する増幅方法（例えば、Ｍｕｌｌｉｓらへの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号；Ｔａｂｏｒへの同第４，７９５，６９９号および同第４，９２１，７９４号；Ｉｎｎｉｓへの同第５，１４２，０３３号；Ｗｉｌｓｏｎらへの同第５，１２２，４６４号；Ｉｎｎｉｓへの同第５，０９１，３１０号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎらへの同第５，０６６，５８４号；Ｇｅｌｆａｎｄらへの同第４，８８９，８１８号；Ｓｉｌｖｅｒらへの同第４，９９４，３７０号；Ｂｉｓｗａｓへの同第４，７６６，０６７号；Ｒｉｎｇｏｌｄへの同第４，６５６，１３４号明細書を参照されたい）、ならびに、二本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型として標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ媒介性の増幅（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記；商品名ＮＡＳＢＡをもつＭａｌｅｋらへの米国特許第５，１３０，２３８号明細書（それらの参考文献の内容全体は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を挙げることができる。
【０１０１】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドおよび関連遺伝子の配列をゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリーから直接増幅し得る。ＰＣＲおよび他のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法もまた、例えば発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローン化するため、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を作成するため、核酸配列決定のため、若しくは他の目的上有用であり得る。（ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法により当業者を指図するのに十分な技術の例は：Ｂｅｒｇｅｒ、上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号 １９８７；Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ １９９０に見出される。）ゲノムＰＣＲ増幅のために商業的に入手可能なキットは当該技術分野で既知である。例えばＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノムＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照されたい。加えて、例えばＴ４の遺伝子３２プロテイン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、長いＰＣＲ産物の収量を向上させるのに使用し得る。
【０１０２】
核酸の合成構築方法
本発明の単離された核酸は、既知の方法（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）を使用する直接化学合成によってもまた製造し得る。化学合成は、一般に一本鎖オリゴヌクレオチドを生じ、それが相補配列とのハイブリダイゼーション若しくは鋳型として該一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼでの重合により、二本鎖ＤＮＡに転化され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成は約１００若しくはそれ以上の塩基の配列に制限され得る一方で、より長い配列をより短い配列の連結により得ることができることを認識するであろう。
【０１０３】
Ｈ．組換え発現カセット
本発明はさらに、本発明の核酸を含んでなる組換え発現カセットを提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明の抗体をコードするｃＤＮＡ若しくはゲノム配列を使用して、最低１種の所望の宿主細胞に導入し得る組換え発現カセットを構築し得る。組換え発現カセットは、典型的に、意図される宿主細胞中での該ポリヌクレオチドの転写を指図することができる転写開始制御配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含むことができる。異種および非異種（すなわち内因性）双方のプロモーターを、本発明の核酸の発現を指図するのに使用し得る。
【０１０４】
いくつかの態様において、プロモーター、エンハンサー若しくは他の要素としてはたらく単離された核酸を、本発明のポリヌクレオチドの発現を上方若しくは下方制御するように、非異種の形態の本発明のポリヌクレオチドの適切な位置（上流、下流若しくはイントロン中）に導入し得る。例えば、内因性プロモーターを突然変異、欠失および／若しくは置換によりｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで変えることができる。
【０１０５】
Ｉ．ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明の単離された核酸分子を包含するベクター、該組換えベクターで遺伝子的に工作されている宿主細胞、および当該技術分野で公知であるところの組換え技術による本発明の最低１種の抗体構築物の製造にもまた関する。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
【０１０６】
ポリヌクレオチドは、場合によっては、宿主中での増殖のための選択可能なマーカーを含有するベクターに結合し得る。一般に、プラスミドベクターはリン酸カルシウム沈殿のような沈殿物中で若しくは荷電した脂質との複合体で導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してそれをｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングし得、そしてその後宿主細胞に移入し得る。
【０１０７】
ＤＮＡ挿入物は適切なプロモーターに効果的に連結すべきである。発現構築物は、転写開始、終止のための部位、および転写された領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することができる。該構築物により発現される成熟転写物のコーディング部分は、好ましくは、始めの翻訳開始、および翻訳されるべきｍＲＮＡの端に適切に配置された終止コドン（例えばＵＡＡ、ＵＧＡ若しくはＵＡＧ）を包含することができ、ＵＡＡおよびＵＡＧが哺乳動物若しくは真核生物細胞発現に好ましい。
【０１０８】
発現ベクターは、好ましくは、しかし場合によっては最低１種の選択可能なマーカーを包含することができる。こうしたマーカーは、限定されるものでないが、真核生物培養物についてメトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；同第４，６５６，１３４号；同第４，９５６，２８８号；同第５，１４９，６３６号；同第５，１７９，０１７号明細書、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ミコフェノール酸若しくはグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号明細書）耐性、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌若しくは原核生物中で培養するためのテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性遺伝子を挙げることができる（上の特許はここに引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）。上述された宿主細胞の適切な培地および培養条件は当該技術分野で既知である。適するベクターは当業者に容易に明らかであろう。宿主細胞中へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染若しくは他の既知の方法により遂げることができる。（こうした方法は当該技術分野すなわちＳａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１〜４および１６〜１８章；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１、９、１３、
１５、１６章に記述されている。）
【０１０９】
本発明の最低１種の抗体は、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして、分泌シグナルのみならず、しかしまた付加的な異種機能領域も包含し得る。例えば、付加的なアミノ酸、とりわけ荷電したアミノ酸の一領域を抗体のＮ末端に付加して、精製の間若しくはその後の取扱および保存の間の宿主細胞中での安定性および持続性を改良し得る。また、ペプチド部分を本発明の抗体に付加して精製を容易にし得る。こうした領域は抗体若しくはその最低１フラグメントの最終精製の前に除去し得る。（こうした方法は多くの標準的実験室手引書、すなわちＳａｍｂｒｏｏｋ、上記；第１７．２９−１７．４２および１８．１−１８．７４章；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１６、１７および１８章に記述されている。）
【０１１０】
当業者は、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系を知っている。あるいは、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含有する宿主細胞において（操作により）スイッチを入れることにより宿主細胞中で発現させ得る。（こうした方法は、例えば米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号および同第５，７３３，７６１号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり当該技術分野で公知である。）
【０１１１】
抗体、それらの指定される部分若しくはバリアントの製造に有用な細胞培養物の具体的説明は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、しばしば細胞の単層の形態にあることができるとは言え、哺乳動物細胞懸濁液若しくはバイオリアクターもまた使用し得る。無傷のグリコシル化タンパク質を発現することが可能な多数の適する宿主細胞株が当該技術分野で開発されており、そして、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサス（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である、ＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）およびＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６）細胞株、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などを包含する。好ましい宿主細胞は、骨髄腫およびリンパ腫細胞のようなリンパ系起源の細胞を包含する。とりわけ好ましい宿主細胞はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８０）およびＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１８５１）である。とりわけ好ましい一態様において、組換え細胞はＰ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３若しくはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である。
【０１１２】
これらの細胞の発現ベクターは、限定されるものでないが、複製起点；プロモーター（例えば後期若しくは初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；同第５，３８５，８３９号明細書）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号明細書）、最低１種のヒト免疫グロブリンプロモーター；エンハンサー、および／若しくはリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えばＳＶ４０ラージＴ ＡｇポリＡ付加部位）のようなプロセシング情報部位、ならびに転写終止配列を挙げることができる発現制御配列の１種若しくはそれ以上を包含し得る。例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい。）本発明の核酸若しくはタンパク質の産生に有用な他の細胞は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの細胞株およびハイブリドーマカタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）または他の既知の若しくは商業的供給源から既知かつ／若
しくは入手可能である。
【０１１３】
真核生物宿主細胞を使用する場合、ポリアデニル化若しくは転写終止配列が典型的にベクター中に組み込まれる。終止配列の一例はウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列もまた包含され得る。スプライシング配列の一例はＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３−７８１ １９８３）。加えて、宿主細胞中で複製を制御するための遺伝子配列を、当該技術分野で既知のとおり、ベクターに組み込み得る。
【０１１４】
Ｊ．抗体構築物のクローン化および哺乳動物細胞中での発現
典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する最低１種のプロモーター要素、抗体コーディング配列、ならびに転写の終止および転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルを含有する。付加的な要素は、エンハンサー、コザック配列、ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位により隣接される介在配列を包含する。高効率の転写はＳＶ４０からの初期および後期プロモーター、レトロウイルス、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターで達成し得る。しかしながら細胞要素もまた使用し得る（例えばヒトアクチンプロモーター）。本発明の実施における使用に適する発現ベクターは、例えば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ若しくはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）若しくはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬおよびＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン・ウプサラ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）ならびにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターを包含する。使用し得る哺乳動物宿主細胞は、ヒトＨｅｌａ ２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １、Ｃｏｓ ７およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を包含する。
【０１１５】
あるいは、該遺伝子は染色体に組込まれた遺伝子を含有する安定細胞株で発現し得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン若しくはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーとのコトランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０１１６】
トランスフェクトされた遺伝子は、大量のコードされた抗体を発現するようにまた増幅もし得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカーは、数百若しくはなお数千コピーの目的の遺伝子を運搬する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカーは酵素グルタミン合成酵素（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２７：２７７−２７９ １９９１；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１０：１６９−１７５ １９９２）。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そして最高の耐性を伴う細胞を選択する。これらの細胞株は染色体中に組込まれた増幅された遺伝子（１種若しくは複数）を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞がしばしば抗体の製造に使用される。
【０１１７】
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７ １９８５）およびＣＭＶ−エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ １９８５）を含有する。例えば制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８を含むマルチクローニング部位が目的の遺伝子のクローニングを容易にする。該ベクターは、３’イントロンに加え、ラットプレプロインスリン遺伝子のポリ
アデニル化および終止シグナルを含有する。
【０１１８】
Ｋ．ＣＨＯ細胞中でのクローニングおよび発現
ベクターｐＣ４を抗体構築物の発現に使用しうる。プラスミドｐＣ４はプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の派生物である。該プラスミドはＳＶ４０初期プロモーターの制御下にマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。これらのプラスミドでトランスフェクトされている、ジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣若しくは他の細胞を、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地（例えばα−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲイタースバーグ）中で該細胞を増殖させることにより選択し得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性の細胞中でのＤＨＦＲ遺伝子の増幅は十分に報告されている（例えばＦ．Ｗ．Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０ １９７８；Ｊ．Ｌ．ＨａｍｌｉｎとＣ．Ｍａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０９７：１０７−１４３ １９９０；およびＭ．Ｊ．ＰａｇｅとＭ．Ａ．Ｓｙｄｅｎｈａｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８ １９９１を参照されたい）。増大する濃度のＭＴＸ中で増殖された細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することにより該薬物に対する耐性を発生させる。第二の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結されている場合、それは通常共増幅かつ過剰発現される。このアプローチを使用して１，０００コピー以上の増幅された遺伝子（１種若しくは複数）を運搬する細胞株を開発し得ることが当該技術分野で既知である。その後、メトトレキセートを除去する場合に、宿主細胞の１種若しくはそれ以上の染色体に組込まれた増幅された遺伝子を含有する細胞株が得られる。
【０１１９】
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７ １９８５）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ １９８５）を含有する。プロモーターの下流に遺伝子の組込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８制限酵素切断部位がある。これらのクローニング部位の後に、該プラスミドは、３’イントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化部位を含有する。他の高効率プロモーター、例えばヒトｂ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期若しくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス、例えばＨＩＶおよびＨＴＬＶＩからの末端反復配列もまた発現に使用し得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系および類似の系を使用して、改変抗体構築物を哺乳動物細胞中で調節された様式で発現させ得る（Ｍ．ＧｏｓｓｅｎとＨ．Ｂｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１ １９９２）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のため、例えばヒト成長ホルモン若しくはグロビンからの他のシグナル遺伝子を同様に使用し得る。染色体中に組込まれた目的の遺伝子を運搬する安定細胞株もまた、ｇｐｔ、Ｇ４１８若しくはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーとのコトランスフェクションに際して選択し得る。最初に１種以上の選択可能なマーカー、例えばＧ４１８およびメトトレキサートを使用することが有利である。
【０１２０】
プラスミドｐＣ４を制限酵素で消化し、そしてその後、当該技術分野で既知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。該ベクターをその後１％アガロースゲルから単離する。
【０１２１】
例えば、本発明の改変抗体構築物のＨＣおよびＬＣ可変領域に対応する、配列番号７および８に提示されるところの完全な改変抗体構築物をコードするＤＮＡ配列を、既知の方法段階に従って使用する。適するヒト定常領域（すなわちＨＣおよびＬＣ領域）をコードする単離された核酸もまた本構築物で使用する。
【０１２２】
単離された可変および定常領域をコードするＤＮＡ配列ならびに脱リン酸化したベクターをその後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１若しくはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞をその後形質転換し、そして、例えば制限酵素分析を使用して、プラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含有する細菌を同定する。
【０１２３】
活性のＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、０．５□ｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏとともにリポフェクションを使用してコトランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは、優勢な選択可能なマーカー、すなわちＧ４１８を包含する抗生物質の一群に対する耐性を賦与する酵素をコードするＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子を含有する。該細胞を、１μｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したα−ＭＥＭに接種する。２日後に細胞をトリプシン処理し、そして、１０、２５若しくは５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１μｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したα−ＭＥＭ中でハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に接種する。約１０〜１４日後に、単一クローンをトリプシン処理し、そしてその後、異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して６ウェルペトリ皿若しくは１０ｍｌフラスコに接種する。最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンをその後、なおより高濃度のメトトレキサート（１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含有する新たな６ウェルプレートに移す。１００〜２００ｍＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで、同一の手順を反復する。所望の遺伝子産物の発現を、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット、若しくは逆相ＨＰＬＣ分析により分析する。
【０１２４】
Ｌ．抗体の精製
改変抗体構築物は、限定されるものでないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを挙げることができる公知の方法により、組換え細胞培養物から回収かつ精製し得る。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）もまた精製に使用し得る。（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、若しくはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９７−２００１、第１、４、６、８、９、１０章（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
【０１２５】
Ｊ．利用性
本発明の単離された核酸は、細胞、組織、器官若しくは動物（哺乳動物およびヒトを包含する）での効果を測定する、限定されるものでないが免疫障害若しくは疾患、心血管系障害若しくは疾患、感染性、悪性および／若しくは神経学的障害若しくは疾患、アレルギー性障害若しくは疾患；皮膚障害若しくは疾患；血液学的障害若しくは疾患；ならびに／または肺障害若しくは疾患、あるいは他の既知の若しくは指定される状態の最低１種から選択される最低１種の状態の発生を診断、監視、調節、処置、軽減、予防することを助ける、またはそれらの症状を低下させるのに使用し得る、最低１種の抗体構築物若しくはその指定されるバリアントの製造に使用し得る。
【０１２６】
こうした方法は、最低１種の改変抗体構築物を含んでなる組成物若しくは製薬学的組成物の有効量を、症状、効果若しくは機構のこうした調節、処置、軽減、予防若しくは低下の必要な細胞、組織、器官、動物若しくは患者に投与することを含み得る。該有効量は、本明細書に記述されるか若しくは関連技術分野で既知のところの既知の方法を使用して行
われかつ測定されるところの、単一（例えばボーラス）、複数若しくは連続投与あたり約０．００１ないし５００ｍｇ／ｋｇの、または単一、複数若しくは連続投与あたり０．０１〜５０００μｇ／ｍｌ血清濃度、あるいはその中のいずれかの有効な範囲若しくは値の血清濃度を達成するための量を含み得る。
【０１２７】
Ｋ．改変抗体構築物組成物
本発明はまた、天然に存在しない組成物、混合物若しくは形態で提供される、本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところの、最低１、最低２、最低３、最低４，最低５、最低６若しくはそれ以上のそれらの抗体を含んでなる、最低１種の抗体構築物組成物もまた提供する。こうした組成物は、製薬学的に許容できる担体とともに本発明の最低１種の改変抗体を含んでなる、天然に存在しない組成物を含んでなる。こうした抗体構築物組成物は、４０〜９９％からのどこかの本発明の改変抗体構築物を包含し得る。こうした組成物のパーセントは、当該技術分野で既知若しくは本明細書に記述されるところの、液体若しくは乾燥溶液、混合物、懸濁液、乳液若しくはコロイドとして重量、容量、濃度、モル濃度若しくは重量モル濃度である。
【０１２８】
本発明の改変抗体構築物または指定される部分若しくはバリアントの組成物は、限定されるものでないが希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、補助物質などを挙げることができるいずれかの適する補助物質の最低１種をさらに含み得る。製薬学的に許容できる補助物質が好ましい。こうした滅菌溶液の制限しない例および製造方法は当該技術分野で公知である；（Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．ペンシルバニア州イーストン １９９０。）当該技術分野で公知若しくは本明細書に記述されるところの、改変抗体構築物組成物の投与様式、溶解性および／若しくは安定性に適する製薬学的に許容できる担体は慣例に選択し得る。
【０１２９】
本組成物で有用な製薬学的賦形剤および添加物は、単独で若しくは組合せで１〜９９．９９重量若しくは容量％を含んでなる、単独で若しくは組合せで存在し得る、限定されるものでないがタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、ならびに炭水化物（例えば、単糖、二、三、四およびオリゴ糖を包含する糖；アルジトール、アルドン酸のような誘導体化糖、エステル化糖など；ならびに多糖若しくは糖ポリマー）を挙げることができる。例示的タンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを包含する。緩衝能力においてもまた機能し得る代表的アミノ酸／改変抗体構築物または指定された部分若しくはバリアントの成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどを包含する。好ましい１アミノ酸はグリシンである。
【０１３０】
本発明での使用に適する炭水化物賦形剤は、例えば、果糖、麦芽糖、ガラクトース、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、ソルボースなどのような単糖；乳糖、ショ糖、トレハロース、セロビオースなどのような二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどのような多糖；およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルチトール）、ミオイノシトールなどのようなアルジトールを包含する。本発明での使用に好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロースおよびラフィノースである。
【０１３１】
改変抗体構築物組成物は緩衝剤若しくはｐＨ調節剤もまた包含し得；典型的には、緩衝剤は有機酸若しくは塩基から調製される塩である。代表的緩衝剤は、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸若しくはフタル酸の塩のような有機
酸の塩；トリス、塩酸トロメタミン若しくはリン酸緩衝剤を包含する。本組成物中での使用に好ましい緩衝剤はクエン酸塩のような有機酸の塩である。
【０１３２】
加えて、本発明の改変抗体構築物または指定される部分若しくはバリアントの組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）（例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン）、ポリエチレングリコールのようなポリマー賦形剤／添加物、着香料、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば「ＴＷＥＥＮ ２０」および「ＴＷＥＥＮ ８０」のようなポリソルベート）、脂質（例えばリン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えばコレステロール）、ならびにキレート剤（例えばＥＤＴＡ）を包含し得る。
【０１３３】
本発明の改変抗体構築物組成物での使用に適するこれらおよび付加的な既知の製薬学的賦形剤および／若しくは添加物は当該技術分野で既知である、（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ、１９９５；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ、ニュージャージー州モントベール １９９８（それらの開示は引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）に列挙されるとおり。）好ましい担体若しくは賦形剤物質は、炭水化物（例えば糖およびアルジトール）ならびに緩衝剤（例えばクエン酸塩）若しくはポリマー剤である。
【０１３４】
Ｌ．製剤
上に示されたとおり、本発明は、製薬学的に許容できる製剤中に最低１種の改変抗体構築物を含んでなる、製薬学的若しくは家畜の使用に適する、好ましくは生理的食塩水若しくは選ばれた塩を含むリン酸緩衝液ならびに保存された溶液である安定な製剤、および保存剤を含有する製剤、ならびに複数回使用の保存される製剤を提供する。保存される製剤は、最低１種の既知の、または最低１種のフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール若しくはそれらの混合物よりなる群から場合によっては選択される保存剤を水性希釈剤中に含有する。限定されるものでないが０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９またはその中のいずれかの範囲若しくは値を挙げることができる、０．００１〜５％またはその中のいずれかの範囲若しくは値のような、当該技術分野で既知のところのいかなる適する濃度若しくは混合物も使用し得る。制限しない例は、保存剤なし、０．１〜２％ｍ−クレゾール（例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．９、１．０％）、０．１〜３％ベンジルアルコール（例えば０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、０．００１〜０．５％チメロサール（例えば０．００５、０．０１）、０．００１〜２．０％フェノール（例えば０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５〜１．０％アルキルパラベン（１種若しくは複数）（例えば０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などを包含する。
【０１３５】
上に示されたとおり、本発明は、包装資材、ならびに、場合によっては水性希釈剤中の処方された緩衝剤および／若しくは保存剤とともに最低１種の改変抗体構築物の溶液を含んでなる最低１本のバイアルを含んでなる製品を提供し、前記包装資材は、こうした溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間若しくはそれ以上の期間にわたり保持し得ることを示すラベルを含んでなる。本発明はさらに、包装資材、凍結乾燥された最低１種の改変抗体構築物を含んでなる第一のバイアル、および処方された緩衝剤若しくは保存剤の水性希釈剤を含んでなる第二のバイアルを含んでなる製品を含んでなり、前記包装資材は、該最低１種の改変抗体構築物を該水性希釈剤中で再構成して２４時間若しくはそれ以上の期間にわたり保持し得る溶液を形成することを患者に指示するラベルを含んでなる。
【０１３６】
本発明の製品中の最低１種の改変抗体構築物の範囲は、再構成に際して、水分を含む／乾燥系での場合に約１．０μｇ／ｍｌから約１０００ｍｇ／ｍｌまでの濃度を生じる量を包含するとは言え、より低いおよびより高い濃度が操作可能であり、そして、意図される送達ベヒクルに依存し、例えば溶液製剤は経皮貼付剤、肺、経粘膜、または浸透圧若しくは微小ポンプ法と異なることができる。
【０１３７】
好ましくは、該水性希釈剤は、場合によっては製薬学的に許容できる保存剤をさらに含んでなる。好ましい保存剤は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール若しくはそれらの混合物よりなる群から選択されるものを包含する。該製剤中で使用される保存剤の濃度は抗菌効果を生じるのに十分な濃度である。こうした濃度は選択される保存剤に依存し、そして当業者により容易に決定される。
【０１３８】
他の賦形剤、例えば等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存増強剤を、場合によってはかつ好ましくは希釈剤に添加し得る。グリセリンのような等張剤が既知濃度で一般に使用される。生理学的に耐えられる緩衝剤を、好ましくは改良されたｐＨ制御を提供するように添加する。該製剤は、約ｐＨ４から約ｐＨ１０までのような広範なｐＨ、および約ｐＨ５から約ｐＨ９までの好ましい範囲、ならびに約６．０ないし約８．０の最も好ましい範囲を包括し得る。好ましくは、本発明の製剤は約６．８と約７．８の間のｐＨを有する。好ましい緩衝剤は、リン酸緩衝液、最も好ましくはリン酸ナトリウム、とりわけリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を包含する。
【０１３９】
Ｔｗｅｅｎ ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、ＴＷＥＥＮ ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）およびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような製薬学的に許容できる可溶化剤、あるいはポリソルベート２０若しくは８０またはポロキサマー１８４若しくは１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｒ）ポリル、他のブロックコポリマーのような非イオン性界面活性剤、ならびにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡのようなキレート剤のような他の添加物を、凝集を低下させるために製剤若しくは組成物に場合によっては添加し得る。これらの添加物は、ポンプ若しくはプラスチック容器を使用して該製剤を投与する場合にとりわけ有用である。製薬学的に許容できる界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を緩和する。
【０１４０】
本発明の製剤は、最低１種の抗体構築物、ならびにフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール若しくはそれらの混合物よりなる群か
ら選択される保存剤を水性希釈剤中で混合することを含んでなる方法により製造し得る。最低１種の抗体構築物および保存剤を水性希釈剤中で混合することは、慣習的溶解および混合手順を使用して実施する。適する製剤を製造するために、例えば、緩衝溶液中の測定した量の最低１種の抗体構築物を、該タンパク質および保存剤を所望の濃度で提供するのに十分な量で緩衝溶液中で所望の保存剤と組み合わせる。この方法の変形物が当業者により認識されるであろう。例えば、成分を添加する順序、付加的な添加物を使用するかどうか、製剤を製造する温度およびｐＨは、全部、使用される濃度および投与手段について至適化し得る因子である。
【０１４１】
特許請求される製剤は、澄明な溶液として、または、水、保存剤および／若しくは賦形剤、好ましくはリン酸緩衝液ならびに／若しくは生理的食塩水および選ばれた塩を水性希釈剤中に含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された最低１種の抗体構築物のバイアルを含んでなる二本のバイアルとして、患者に提供し得る。単一溶液バイアル若しくは再構成を必要とする二本のバイアルのいずれも複数回再使用し得、そして単一若しくは複数周期の患者処置に十分であり得、そして従って現在利用可能よりも便宜的な処置レジメンを提供し得る。
【０１４２】
本特許請求される製品は、即座ないし２４時間若しくはそれ以上の期間にわたる投与に有用である。従って、現在特許請求される製品は患者に大きな利点を提供する。本発明の製剤は、場合によっては、約２℃から約４０℃までの温度で安全に保存し得、かつ、タンパク質の生物学的活性を長期間保持し得、従って、該溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２若しくは９６時間またはそれ以上の期間にわたり保持かつ／若しくは使用し得ることを示す包装ラベルを可能にする。保存される希釈剤を使用する場合、こうしたラベルは１〜１２か月、半年、１年半および／若しくは２年までの使用を包含し得る。
【０１４３】
本発明における最低１種の改変抗体構築物の溶液は、最低１種の抗体を水性希釈剤中で混合することを含んでなる方法により製造し得る。混合することは慣習的溶解および混合手順を使用して実施する。適する希釈剤を調製するため、例えば、水若しくは緩衝剤中の測定した量の最低１種の抗体を、該タンパク質および場合によっては保存剤若しくは緩衝剤を所望の濃度で提供するのに十分な量で組み合わせる。この方法の変形物が当業者により認識されるであろう。例えば、成分を添加する順序、付加的な添加物を使用するかどうか、製剤を製造する温度およびｐＨは、全部、使用される濃度および投与手段について至適化し得る因子である。
【０１４４】
特許請求される製品は、澄明な溶液として、または水性希釈剤を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された最低１種の抗改変抗体構築物のバイアルを含んでなる二本のバイアルとして患者に提供し得る。単一の溶液バイアル若しくは再構成を必要とする二本のバイアルのいずれも複数回再使用し得、かつ、単一若しくは複数周期の患者処置に十分であり得、そして従って現在利用可能よりも便宜的な処置レジメンを提供する。
【０１４５】
特許請求される製品は、薬局、診察室、若しくは他のこうした施設（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）および施設（ｆａｃｉｌｉｔｙ）に澄明な溶液、若しくは水性希釈剤を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された最低１種の改変抗体構築物のバイアルを含んでなる二本のバイアルを提供することにより、患者に間接的に提供し得る。この場合の澄明な溶液は大きさが１リットルまでもしくはなおより大きくあり得、それから最低１種の抗体溶液のより小さな部分をより小さいバイアルへの移動のため１回若しくは複数回取得しかつ薬局若しくは診療所によりそれらの顧客および／若しくは患者に提供し得る大型リザーバを提供する。
【０１４６】
これらの単一バイアル系を含んでなる認識される装置は、例えばＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｅｎｓｅｎ（ニュージャージー州フランクリンレイクス、ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（スイス・ブルクドルフ、ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ；Ｂｉｏｊｅｃｔ、オレゴン州ポートランド（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ（英国ピータースボロ、ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ Ｃｏｒｐ（ミネソタ州ミネアポリス、ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）により作成若しくは開発されるところの、ＢＤ Ｐｅｎ、ＢＤ Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（Ｒ）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（Ｒ）、ＮｏｖｏＰｅｎ（Ｒ）、Ｂ−Ｄ（Ｒ）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（Ｒ）およびＯｐｔｉＰｅｎ（Ｒ）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（Ｒ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ Ｐｅｎ（Ｒ）、Ｈｕｍａｔｒｏ Ｐｅｎ（Ｒ）、Ｒｅｃｏ−Ｐｅｎ（Ｒ）、Ｒｏｆｅｒｏｎ Ｐｅｎ（Ｒ）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（Ｒ）、ｉｊｅｃｔ（Ｒ）、Ｊ−ｔｉｐ Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ｒ）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（Ｒ）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ（Ｒ）のような溶液の送達のためのペン注入器装置を包含する。二本のバイアル系を含んでなる認識される装置は、ＨｕｍａｔｒｏＰｅｎ（Ｒ）のような再構成した溶液の送達のためのカートリッジ中で凍結乾燥した薬物を再構成するためのペン注入器装置を包含する。
【０１４７】
現在特許請求される製品は包装資材を包含する。包装資材は、規制当局により要求される情報に加え、該製品を使用し得る条件を提供する。本発明の包装資材は、２本のバイアルの水分を含む／乾燥生成物について、該最低１種の抗改変抗体構築物を水性希釈剤中で再構成して溶液を形成しかつ２〜２４時間若しくはそれ以上の時間にわたり該溶液を使用するための患者に対する説明書を提供する。単一バイアルの溶液製品について、該ラベルは、こうした溶液を２〜２４時間若しくはそれ以上の時間にわたり使用し得ることを示す。現在特許請求される製品はヒトの製薬学的生成物の使用に有用である。
【０１４８】
本発明の製剤は、最低１種の改変抗体構築物および選択された緩衝液、好ましくは生理的食塩水若しくは選ばれた塩を含有するリン酸緩衝液を混合することを含んでなる方法により製造し得る。最低１種の抗体および緩衝剤を水性希釈剤中で混合することは、慣習的溶解および混合手順を使用して実施する。適する製剤を製造するため、例えば、水若しくは緩衝液中の測定した量の最低１種の抗体を、該タンパク質および緩衝剤を所望の濃度で提供するのに十分な量で水中で所望の緩衝剤と組み合わせる。本方法の変形物が当業者により認識されるであろう。例えば、成分を添加する順序、付加的な添加物を使用するかどうか、製剤を製造する温度およびｐＨは、全部、使用される濃度および投与手段について至適化し得る因子である。
【０１４９】
特許請求される安定なすなわち保存される製剤は、澄明な溶液として、または保存剤若しくは緩衝剤および賦形剤を水性溶液中に含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された最低１種の抗改変抗体構築物のバイアルを含んでなる二本のバイアルとして患者に提供し得る。単一の溶液バイアル若しくは再構成を必要とする二本のバイアルのいずれも複数回再使用し得、かつ、単一若しくは複数周期の患者処置に十分であり得、そして従って現在利用可能よりも便宜的な処置レジメンを提供する。
【０１５０】
本明細書に記述される安定なすなわち保存される製剤または溶液のいずれか中の最低１種の改変抗体構築物は、ＳＣ若しくはＩＭ注入；経皮、肺、経粘膜、植込物、浸透圧ポンプ、カートリッジ、微小ポンプ、若しくは当該技術分野で公知のところの当業者により認識される他の手段を包含する多様な送達方法を介して、本発明により患者に投与し得る。
【０１５１】
Ｍ．治療的応用
本発明は、本発明の最低１種の改変抗体構築物を使用する、当該技術分野で既知の若しくは本明細書に記述されるところの細胞、組織、器官、動物若しくは患者における疾患の調節若しくは処置方法もまた提供する。
【０１５２】
本発明は、限定されるものでないが肥満、免疫関連疾患、心血管系疾患、感染性疾患、悪性疾患若しくは神経学的疾患の最低１種を挙げることができる、細胞、組織、器官、動物若しくは患者における最低１種の疾患の調節若しくは処置方法もまた提供する。
【０１５３】
典型的には、病理学的状態の処置は、該組成物に含有されるの比活性に依存して、平均して用量あたり患者１キログラムあたり最低約０．０１から５００ミリグラムまでの範囲の最低１種の抗サンティボディ（Ｓａｎｔｉｂｏｄｙ）、および好ましくは単一若しくは複数回投与あたり患者１キログラムあたり最低約０．１から１００ミリグラムまでの改変抗体構築物に合計でなる最低１種の改変抗体構築物組成物の有効量若しくは投薬量を投与することにより遂げられる。あるいは、有効血清濃度は単一若しくは複数回投与あたり０．１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を含み得る。適する投薬量は医学実務者に既知であり、そしてもちろん、特定の疾患状態、投与されている組成物の比活性、および処置を受けている特定の患者に依存することができる。いくつかの場合には、所望の治療量を達成するために、反復投与、すなわち、所望の１日用量若しくは効果が達成されるまで個々の投与を反復する特定のモニター若しくは計量された用量の反復個別投与を提供することが必要であり得る。
【０１５４】
好ましい用量は、場合によっては、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／投与、またはそのいずれかの範囲、値若しくは画分、あるいは、単一若しくは複数回投与あたり０．１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度またはそのいずれかの範囲、値若しくは画分の血清濃度を達成するためを包含し得る。
【０１５５】
あるいは、投与される投薬量は、特定の剤の薬力学的特徴ならびにその投与様式および経路；受領者の齢、健康状態および重量；症状の性質および程度、付随する処置の種類、処置の頻度、ならびに所望の効果のような既知の因子に依存して変動し得る。通常、有効成分の投薬量は体重１キログラムあたり約０．１ないし１００ミリグラムであり得る。投与あたり若しくは徐放形態物中で通常１キログラムあたり０．１ないし５０、および好ましくは０．１ないし１０ミリグラムが、所望の結果を得るのに有効である。
【０１５６】
内的投与に適する投薬形態物（組成物）は、一般に、単位若しくは容器あたり約０．１ミリグラムから約５００ミリグラムまでの有効成分を含有する。これらの製薬学的組成物中で、有効成分は通常、組成物の総重量に基づき約０．５〜９９．９９９重量％の量で存在することができる。
【０１５７】
非経口投与のためには、該抗体は、溶液、懸濁液、乳液、若しくは製薬学的に許容できる非経口ベヒクルを伴うか若しくは別個に提供される凍結乾燥粉末として処方し得る。こうしたベヒクルの例は、水、生理的食塩水、リンゲル液、Ｄ−ブドウ糖溶液、および１〜１０％ヒト血清アルブミンである。リポソーム、および不揮発性油のような非水性ベヒクルもまた使用し得る。ベヒクル若しくは凍結乾燥粉末は、等張性（例えば塩化ナトリウム、マンニトール）ならびに化学的安定性（例えば緩衝剤および保存剤）を維持する添加物を含有し得る。該製剤は既知の若しくは適する技術により滅菌する。
【０１５８】
適する製薬学的担体は、この分野の標準的参照教科書、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａ．Ｏｓｏｌの最新版に記述されている。
【０１５９】
本発明を全般的に記述したので、それは、具体的説明として提供されかつ制限するとして意図していない以下の実施例を参照して、より容易に理解されるであろう。
【実施例１】
【０１６０】
改変抗体の製造
改変Ａｂをコードする遺伝子は、ａ）ＩｇＧ１，ｋ ＡｂのＶＨおよびＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を同一ＡｂのＶＬおよびＣＬドメインをコードするＤＮＡ配列で、ならびにｂ）同一ＡｂのＶＬおよびＣＬドメインをコードするＤＮＡ配列を同一ＡｂのＶＨおよびＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列で置換するため、ＰＣＲ増幅および組換えＤＮＡ技術を使用することにより製造した。
【０１６１】
ＶＬ−ＣＬ−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ ＨＣをコードするプラスミドを製造するため、元のＬＣ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐ３１２３を、ＡＴＧ翻訳開始コドンからシグナル配列、Ｖ、およびＣＬドメインまで伸長する７６５ｂｐのフラグメントを増幅したオーバーラップＰＣＲプロトコルで鋳型として使用した。該反応をプライミングするのに使用した下流のオリゴヌクレオチドは、Ｃｋコーディング配列の直後の天然に存在する翻訳終止コドンを、ＩｇＧ１ ＨＣヒンジ配列の最初の２３塩基をコードするＤＮＡ配列で置換するようにさらにはたらいた。元のＨＣ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐ３１２２をその後、ＣＬコーディング配列（上流のオリゴヌクレオチドプライマー中に組み込まれる）の最後の２２塩基、次いでヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする配列を包含した７１５ｂｐのフラグメントを増幅した第二のＰＣＲ反応で使用した。下流のオリゴヌクレオチドプライマーがＮｏｔＩ制限部位を提供した。該２種のＰＣＲ産物を、７６５ｂｐおよび７１５ｂｐの増幅産物、第一のＰＣＲ反応からの上流のオリゴヌクレオチドプライマー、および第二のＰＣＲ反応からの下流のオリゴヌクレオチドプライマーを含有した第三のＰＣＲ反応で効果的に結合した。増幅は、従って、それら双方が含有したオーバーラップ配列の２２ｂｐで交差アニーリングする２フラグメントに依存した。生じる増幅産物は長さが１４８０ｂｐであり、そしてＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限部位によりそれぞれ隣接されるＶＬ−ＣＬ−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３をコードした。該増幅されたＤＮＡをＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてベクターｐ２１０６のＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位の間にクローン化して、新たなＨＣをコードする最終発現プラスミドｐ４０３４を形成した。ベクターｐ２１０６は、ＣＭＶ前初期プロモーター、およびＡＴＧ開始コドンの上流のイントロンＡ、ならびにＳＶ４０由来の転写終止配列を提供する。
【０１６２】
ＶＨ−ＣＨ１ ＬＣをコードするプラスミドを製造するため、元のＨＣ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐ３１２２を、ＡＴＧ翻訳開始コドンからシグナル配列、ＶおよびＣＨ１ドメインまで伸長する８０８ｂｐのフラグメントを増幅したオリゴヌクレオチドにプライミングされるＰＣＲ反応で鋳型として使用した。該増幅産物は、ＣＨ１ドメインのＣ末端のＤＫＫＶアミノ酸配列の直後に翻訳終止コドンを含有した。該オリゴヌクレオチドプライマーはまた、クローニングの目的上、ＡＴＧ開始コドンの上流のＸｂａＩ制限部位および終止コドンの下流のＮｏｔＩ制限部位も提供した。増幅されたＤＮＡをＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして切断されたＤＮＡをプラスミドベクターｐ２１０６のＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位の間にクローン化して、新たなＬＣをコードする最終発現プラスミドｐ４０３３を形成した。
【０１６３】
新たなＨＣおよび新たなＬＣプラスミドの共発現により改変Ａｂを製造するため、ヒトＨＥＫ ２９３細胞をリポフェクションによりプラスミドｐ４０３３およびｐ４０３４で一過性にトランスフェクトした。簡潔には、トランスフェクション前日に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させた細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、そして５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で一夜インキュベートした。翌日、１００μｌの無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ）に再懸濁した各１μｇのｐ４０３３およびｐ４０３４を１０μｌのリポフェクション試薬と混合し、そして室温で１０分間放置した。培地を細胞から吸引し、そして１０％ＦＢＳを含む新鮮ＤＭＥＭを添加した。インキュベーション後にＤＮＡ／リポフェクション試薬複合体を細胞に添加し、そして穏やかに回転させて混合し
た。抗体発現および分泌のための時間を可能にするための５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で７２時間のさらなるインキュベーション後に、細胞上清を収集しかつ遠心分離して細胞破片を除去した。
【０１６４】
細胞上清中の改変Ａｂの存在について試験するため、４種の異なる捕捉試薬を使用するＥＬＩＳＡアッセイを実施した。９６ウェルＥＩＡプレートを、ａ）ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ ＦｃフラグメントＡｂ、ｂ）元のＡｂのＶ領域に特異的なＣ５０８モノクローナルＡｂ、ｃ）元のＡｂのＶ領域のイディオタイプ部分（抗原結合）に特異的なＣ５８５モノクローナルＡｂ、ならびにｄ）Ｃ５０８およびＣ５８５と同一のアイソタイプ（マウスＩｇＧ２ｂｋ）の陰性対照モノクローナルＡｂいずれかで被覆した。被覆は０．０５Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５中で実施し、そして４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳ中１％ＢＳＡを使用してプレートをブロッキングした。ＨＥＫ ２９３細胞の一過性トランスフェクションからの細胞上清を連続希釈し、そしてブロッキングしたプレートに添加した。対照サンプルは、元の未改変Ａｂをコードするプラスミドｐ３１２２およびｐ３１２３で同時にトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３からの細胞上清、ならびに標準曲線を作成するのに使用した精製した元のＡｂを包含した。捕捉されたタンパク質を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ−γ抗体およびＴＭＢ基質を使用して検出した。発色反応を０．５Ｍ ＨＣｌで停止した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０１６５】
抗ヒトＩｇＧ ＦｃフラグメントＡｂを捕捉試薬として使用した場合に得られた陽性のＥＬＩＳＡシグナルは、改変ＨＣおよび改変ＬＣでトランスフェクトしていた細胞の上清中にＡｂ様分子が実際に存在したことを示した。ＨＣは、それらがＬＣと会合しない限り細胞から通常分泌されないため、この結果単独は、改変ＨＣおよびＬＣが相互と会合してＩｇＧ Ａｂに典型的な（ＨＬ）２の４本鎖複合体を形成したことをありそうにした。それはまた、改変ＡｂのＦｃドメイン上のエピトープが、ヤギ抗ヒトＦｃ Ａｂにより良好に認識されたことも示した。ヤギ抗ヒトＦｃ Ａｂが改変Ａｂおよび未改変Ａｂと等しく良好に反応したという仮定を使用すれば、元のＡｂの標準曲線を使用するＥＬＩＳＡデータからの計算は、改変Ａｂの発現レベル（約２．７μｇ／ｍｌ）が未改変Ａｂの発現レベル（約２．０μｇ／ｍｌ）に類似であることを示した。
【０１６６】
未改変のＡｂ標準由来の濃度を使用して、抗Ｖ領域Ａｂ Ｃ５０８およびＣ５８５への改変および未改変Ａｂサンプルの結合をタンパク質濃度に対しプロットした。該結果は、改変および未改変のＡｂによる結合が識別不可能であることが見出されたことを示した。これは、Ｃ５０８およびＣ５８５モノクローナルＡｂのＶ領域の結合部位が改変Ａｂで完全に保存されているかもしれないことを示唆している。
‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐
改変Ａｂ遺伝子を製造するのに使用したオリゴヌクレオチドプライマー−
【０１６７】
【化１】
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
本明細の一部分を形成する図面において、
【図１】細胞表面抗原および隣接細胞上のＦｃＲへのＡｂによる同時結合が、該抗原の移動性およびＡｂの向きによりどのように影響され得るかの図解である。
【図２】ＡｂのＨおよびＬ鎖の間の配列を交換することの効果を示す図である。Ｆｄ＝ＨＣのＶＨ−ＣＨ１ドメイン。
【図３】未改変Ａｂの関連するアミノ酸配列が、本発明の改変Ａｂにどのように比較しうるかを示す。アミノ酸は一文字記号で表す。ＨＣから発するアミノ酸は大文字で示し、また、ＬＣから発するアミノ酸は小文字で示す。「Ｘ」は鎖の交差の点に印を付ける。
【図４】未改変Ａｂ若しくは改変Ａｂいずれかを含有するトランスフェクトした細胞からの細胞上清を、未改変Ａｂ若しくは陰性対照Ａｂの抗原結合領域に特異的なｍＡｂ（Ｃ５０８若しくはＣ５８５）で被覆したプレートとともにインキュベートすることにより得られる結合データを示す。細胞上清中の未改変および改変Ａｂの濃度は、精製した未改変Ａｂを標準として用いる抗ヒトＦｃ ＥＬＩＳＡを使用して予め測定した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンタンパク質に由来するヘテロ二量体タンパク質結合組成物、こうしたヘテロ二量体タンパク質結合組成物の製造方法およびそれらの用途の分野に関する。より具体的には、本発明は、抗原結合ドメインに関してＦｃドメインを新たに方向付けし（ｒｅｏｒｉｅｎｔ）かつ決定的な（ｃｒｉｔｉｃａｌ）結合部位をより到達可能にするという目的上、ＩｇＧ Ｆａｂドメイン内のＨおよびＬ鎖の間で配列を交換することにより、抗原結合を保存しつつ免疫エフェクター機能を最大化するためのヘテロ二量体タンパク質結合組成物の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
数十年間、抗体は、それらの特異的結合特性および高安定性により、研究および診断、ならびにより最近は疾患の治療的処置において必須であった。モノクローナル抗体は、当初、選ばれたＢ細胞株を不死骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマ、すなわち該選択されたＢ細胞クローンの選択された抗体タイプのみを分泌する不死細胞を製造することにより生じられた。組換えＤＮＡ技術の使用は、抗体の新たな製造方法ならびに新たな抗体構築物の設計を可能にした。
【０００３】
構造上、各抗体は２本の同一の「Ｈ」鎖および２本の同一の「Ｌ」鎖の相互作用により形成され、それらの全部は結合してＹ形状分子を形成する（Ｈ鎖はＹ全体に、そしてＬ鎖は２本の腕のみにわたる）。免疫グロブリンＧ抗体分子は、抗原結合を決定する相補性決定領域（ＣＤＲ）、エフェクター機能を決定する定常領域、および枠組み領域を含有する。多様な定常領域が多様な生物学的効果の範囲全体を媒介し得る。例えばアレルギー反応はＩｇＥ結合に続く一方、ＩｇＭ結合は補体系の活性化に至り得る。
【０００４】
抗体は、Ｙ単位の数およびＨ鎖のタイプに基づき５クラスすなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥに分割し得る。いかなる抗体のＬ鎖もκ若しくはλタイプ（ポリペプチドの分子の特徴の記述）いずれかに分類され得るが；しかしながらＨ鎖は各抗体のサブクラスを決定する。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのＨ鎖はそれぞれγ、μ、α、δおよびεとして知られる。
【０００５】
最も一般に使用される抗体はＩｇＧであり、これはタンパク質分解酵素パパインにより３部分すなわち２個のＦ（ａｂ）領域および１個のＦｃ領域に、若しくはタンパク質分解酵素ペプシンにより２部分すなわち１個のＦ（ａｂ’）２および１個のＦｃに切断され得る。Ｆ（ａｂ）領域は、抗原結合に決定的に重要である抗体の「腕」を含んでなる。Ｆｃ領域は、抗体の「尾部」を構成しかつ免疫応答において役割を演じ、そしていくつかの免疫化学的手順の間に抗体を操作するための有用な「ハンドル」としてはたらく定常領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなる。抗体上のＦ（ａｂ）領域の数はそのサブクラスと対応し、そして抗体の「価」（大ざっぱに述べれば、抗体がその抗原を結合しうる「腕」の数）を決定する。
【０００６】
従って、抗体構築物は、限定されるものでないがＨ若しくはＬ鎖の最低１個のＣＤＲまたはそれらのリガンド結合部分、Ｈ鎖若しくはＬ鎖可変領域、Ｈ鎖若しくはＬ鎖定常領域、フレームワーク領域、あるいはそれらのいずれかの部分を挙げることができる、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含んでなるいかなるタンパク質若しくはペプチド含有分子も包含し得る。抗体フラグメントは、２個のＦａｂフラグメントを生じるＹ形状の抗体分子の「ヒンジ」領域で切断するプロテアーゼ、パパインでの抗体の切断により生成されるＣＤＲ抗原結合部位を含有する、Ｆａｂとして知られる免疫グロブリン分子のフラグ
メントを包含し得る。抗体は、限定されるものでないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類を挙げることができるいかなる哺乳動物若しくはそれらのいずれかの組合せも包含し得るか、若しくはそれら由来であり得る。
【０００７】
細胞表面の標的を結合する多数の治療的ＩｇＧ抗体は、それらの完全な治療能力を実現するために、隣接細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）への同時の結合に依存する。これは、ＦｃＲおよび抗原の同時の結合（抗体が細胞性免疫応答を体液性免疫応答に結びつける手段）が、抗原を発現する細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）若しくは食作用のようなエフェクター機能に至り得るからである。しかしながら、より多くの抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイで評価されるようになりつつあるので、数種の抗体が、ＦｃＲを発現するエフェクター細胞の存在下で、標的（抗原を発現する）細胞株への良好な結合を示し得るにもかかわらず標的細胞の細胞傷害性を誘発し得ないことが、ますます明らかになりつつある。他の可能な説明を予見し得るとは言え、少なくとも数種の抗体については、こうした抗体上のＦｃＲ結合部位が、これらの抗体がそれらの細胞表面抗原に結合される場合に隣接細胞上のＦｃＲに物理的に到達可能でないことがあることがありそうである（図１）。現在のデータおよびモデルは、Ｆｃドメインが、ヒンジ領域でのＦｃＲ結合に適応するためにＦａｂドメインに関しておよそ９０°曲がることを必要とすることを示唆している。抗原に結合される場合に細胞表面に「平行に」向けられている抗体にとって、とりわけ抗原が剛性でありかつ「波打つ」ことが不可能である場合に、原形質膜若しくは何らかの他の分子から立体障害を伴わずこの劇的な再配置をとることは可能でないかもしれない。同一の理由から、抗体上のＣ１ｑ結合部位は、Ｃ１ｑすなわち古典的補体固定経路の最初の成分に到達可能でないことがあり、補体溶解活性の欠如をもたらす。
【０００８】
ＩｇＧ抗体は、分子内のいくつかの部位、とりわけヒンジ領域で曲がる能力をもつ柔軟な分子である。抗体は、Ｆｃドメインに関してＦａｂドメインの捻れ／ターンを受けることもまた報告されている。この捻れ／ターン能力は隣接細胞上のＦｃＲへのＦｃＲ結合部位の到達可能性に影響を与えることがありそうであるとは言え、こうした可動性は制限され、従っていかなるＦｃＲ結合部位もＦｃＲに到達可能に十分にすることはありそうでない。結果、所定の抗体が所望の細胞表面抗原に対する高い親和性および特異性を有しうる一方、その完全な治療的能力は、抗原の結合に際してのその向きがＦｃに媒介されるエフェクター機能の動員に好都合でない場合になお制限されうる。ここに記述される本発明は、こうした抗体のこの問題の解決手段を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明は、免疫グロブリン分子のＨ鎖およびＬ鎖を有するヘテロ二量体タンパク質結合組成物であり、該ヘテロ二量体タンパク質結合組成物は、Ｌ鎖配列で置換されたＨ鎖配列およびＨ鎖配列で置換されたＬ鎖配列を有する。それらのＦｃＲ結合部位を隣接細胞上のＦｃＲに到達不可能に若しくはＣ１ｑ結合部位を可溶性Ｃ１ｑ補体タンパク質に到達不可能にしておくような様式で細胞表面（若しくは別の方法で不溶性の）抗原に結合する抗体は、ＡＤＣＣ、ＦｃＲ媒介性の食作用および補体溶解のようなエフェクター機能を動員するそれらの固有の能力を完全に利用し得ない。ここに記述される本発明は、抗原結合ドメインに関してＦｃ結合の相対位置およびＣ１ｑ結合ドメインを新たに方向付けすることにより、この問題に対する解決策を提供する。これは、抗体（Ａｂ）分子の残部を非常に異なる位置で新たに方向付けしつつ抗原結合ドメインの構造を保存する様式でＡｂのＨおよびＬ鎖の間でアミノ酸配列を交換することにより達成される。ＨおよびＬ鎖の間で交換されることによりこれを達成し得る配列の例は、ａ）Ｈ鎖のＦｄドメイン全体（ＶＨ−ＣＨ１）およびＬ鎖全体（ＶＬ−ＣＬ）、ｂ）Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）およびＬ鎖の可変領域（ＶＬ）、ならびにｃ）ＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）およびＶＬのＣＤＲを包含する。逆に、例えば免疫エフェクター機能が誘発されないようにこれらの結合部位がより少な
く到達可能であるために、そのＦｃＲ結合部位およびＣ１ｑ結合部位が容易に到達可能であるＡｂを改変することが望ましいことができる。これは、同一の型の上述された配列交換アプローチにより達成し得る。
【００１０】
従って、本発明により、免疫グロブリンのＨおよびＬ鎖からの配列の多様なサブセットを、抗原結合ドメインに関してＦｃドメインを新たに方向付けするという目的上、特定の１ＡｂのＨおよびＬ鎖の間で交換する。これらの配列を交換されている適切に製造されたＡｂバリアントは、抗原結合親和性および特異性を保持するはずであるが、しかし、抗原に関してそれらのＦｃドメインが「反転」されている。細胞表面抗原の場合、Ｆｃドメインのこの新たな向きは、ＡｂのＦｃＲ結合部位への乏しい到達可能性とＦｃＲ結合部位への良好な到達可能性の間の差違をなしうる（図２Ｂ）。到達可能性の問題は、原形質膜若しくは隣接分子による妨害によりＦｃＲ結合部位を露出させるために必要な配置をとることが可能でないＡｂに帰されうる。加えて、本発明は、多様なＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４）またはなお多様なＩｇクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ若しくはＩｇＭ）からのＦｃドメインを混合かつ一致させることによる付加的な調整を見込む。
【００１１】
本発明は、別の局面において、前述のヘテロ二量体タンパク質結合構築物をコードするポリヌクレオチドおよびそれらの最低１種の指定される配列、ドメイン、部分若しくはバリアントを含んでなる単離された核酸分子を提供する。本発明は、こうした核酸分子を含んでなる組換えベクター、こうした核酸および／若しくは組換えベクターを含有する宿主細胞、ならびにこうした核酸、ベクターおよび／若しくは宿主細胞の作成および／若しくは使用方法をさらに提供する。
【００１２】
本発明は、本明細書に記述されるところの宿主細胞を、最低１種のこうしたヘテロ二量体タンパク質結合構築物が検出可能かつ／若しくは回収可能な量で発現される条件下で培養することを含んでなる、宿主細胞中でのこうしたヘテロ二量体タンパク質結合構築物の発現方法もまた提供する。宿主細胞は、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、Ａｇ６５３、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫若しくはリンパ腫細胞、またはそれらのいずれかの派生物、不死化若しくは形質転換細胞から選択しうる。ヘテロ二量体タンパク質結合構築物が検出可能かつ／若しくは回収可能な量で発現されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｓｉｔｕの条件下で該構築物をコードする核酸を翻訳することを含んでなる、最低１種のこうしたヘテロ二量体タンパク質結合構築物の製造方法もまた提供される。
【００１３】
本発明は、本明細書に記述されるところの本発明の単離されたヘテロ二量体タンパク質結合構築物をコードする核酸および／若しくはタンパク質ならびに適する担体若しくは希釈剤の双方を含んでなる最低１種の組成物もまた提供する。該担体若しくは希釈剤は既知の担体若しくは希釈剤に従って製薬学的に許容できうる。該組成物は最低１種のさらなる化合物、タンパク質若しくは組成物もまた含み得る。
【００１４】
本発明は、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところの関連した状態の前、後若しくは間に細胞、組織、器官、動物若しくは患者における最低１種の疾患状態を調節若しくは処置するために治療的有効量の本発明のヘテロ二量体タンパク質結合構築物を投与するための最低１種の方法若しくは組成物をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、治療的若しくは予防的有効量の本発明の最低１種のヘテロ二量体タンパク質結合構築物の送達のための最低１種の組成物、装置および／若しくは方法もまた提供する。
【００１６】
本発明は、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところの関連した状態の前、後若しくは間に細胞、組織、器官、動物若しくは患者における最低１種の疾患状態を診断するための、最低１種のヘテロ二量体タンパク質結合構築物の方法若しくは組成物をさらに提供する。
【００１７】
本発明の最低１種のヘテロ二量体タンパク質結合構築物を含んでなる医療用具もまた提供され、該装置は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される最低１様式により該抗体構築物を接触若しくは投与するのに適する。
【００１８】
包装資材、および溶液若しくは凍結乾燥された形態の本発明の最低１種の単離されたヘテロ二量体タンパク質結合構築物を含んでなる容器を含んでなる、ヒトの製薬学的若しくは診断的使用のための製品もまた提供される。該製品は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮送達装置若しくは系の１成分として容器を有することを場合によっては含み得る。
【００１９】
本発明の最低１種の単離されたヘテロ二量体タンパク質結合構築物を回収可能な量で発現することが可能な宿主、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物若しくは植物細胞を含んでなる、該抗体の製造方法もまた提供される。上の方法により製造した最低１種のヘテロ二量体タンパク質結合構築物が本発明でさらに提供される。
【００２０】
本発明は、本明細書に記述されるいかなる発明もさらに提供する。
【００２１】
［発明の詳細な記述］
Ａ．定義
別の方法で定義されない限り、本発明に関して使用される科学および技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。
【００２２】
さらに、文脈により別の方法で必要とされない限り、単数形の用語は複数を包含し、かつ、複数の用語は単数を包含する。一般に、本明細書に記述される細胞および組織培養、分子生物学、タンパク質およびオリゴ若しくはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリダイゼーションに関してかつその技術において利用される学術用語は当該技術分野で公知かつ一般に使用されるものである。標準的技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば電気穿孔法、リポフェクション）に使用される。
【００２３】
酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般に達成されたところの、若しくは本明細書に記述されるところの、製造元の仕様に従って実施する。前述の技術および手順は、一般に、当該技術分野で公知のかつ引用かつ論考される多様な一般的およびより特殊な参考文献に記述されるところの慣習的方法に従って実施する。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー １９８９（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）本明細書に記述される実験室手順、ならびに分析、合
成有機、医薬品および製薬化学の技術に関して利用される学術用語は当該技術分野で公知かつ一般に使用されるものである。化学合成、化学分析、製薬学的製造、製剤、ならびに患者の送達および処置の標準的技術が使用される。
【００２４】
本出願で使用される全部の科学および技術用語は、別の方法で指定されない限り、当該技術分野で一般に使用される意味を有する。本出願で使用されるところの以下の語若しくは句は以下の意味を有する。
【００２５】
「抗体」、「Ａｂ」若しくは「抗体ペプチド（１種若しくは複数）」は、無傷の抗体、若しくは特異的結合について無傷の抗体と競合するその結合フラグメントを指す。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術、または無傷の抗体の酵素若しくは化学的切断により製造する。結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂｌ）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体を包含する。「二特異性」若しくは「二官能性」抗体以外の抗体は、同一のその結合部位のそれぞれを有することが理解される。抗体は、過剰の抗体が、対受容体に結合される受容体の量を最低約２０％、４０％、６０％若しくは８０％、およびより通常は約８５％以上（ｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイで測定されるところの）低下させる場合に、対受容体への受容体の接着を実質的に阻害する。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「ヘテロ二量体タンパク質結合組成物」；「改変Ｉｇ分子」；もしくは「交換ドメイン抗体構築物」は、改変された抗体が１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインがＬ鎖上のドメインに交換されかつ／またはＬ鎖の１個若しくはそれ以上のドメインがＨ鎖のドメインに交換されているために天然に存在するＩｇ分子と異なる免疫グロブリン（「Ｉｇ」）分子を意味しており；ここで、交換されたドメインは元の抗体と同一のクラス若しくは異なるＩｇクラスのいずれであってもよい。改変Ｉｇ分子は、例えば、選ばれた一列に配置されかつ細胞中で発現される、Ｉｇドメイン若しくはその部分をコードするポリヌクレオチドを使用する慣習的遺伝子組み換えにより作成し得る。あるいは、改変Ｉｇ分子は、慣習的ポリペプチド合成技術を使用して合成し得る。Ｉｇ分子は、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を包含する）、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥ分子であり得る。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「定常領域ドメイン」若しくは「定常ドメイン」は、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨおよびＣＨ４を包含するＩｇ分子の定常部分内の１ドメインを指す。本明細書で使用されるところの「可変領域ドメイン」若しくは「可変ドメイン」は、特定の一領域に対するＩｇの特異性を賦与するＩｇ分子の部分を指す。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「抗原」は、免疫グロブリン分子の抗原結合領域に結合すること若しくは免疫応答を導き出すことのいずれかが可能な物質を意味している。本明細書で使用されるところの「抗原」は、限定されるものでないが、抗原決定基、ハプテンおよび免疫源を挙げることができる。
【００２９】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン若しくはＴ細胞受容体への特異的結合が可能ないかなるタンパク質決定基も包含する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸若しくは糖側鎖のような分子の化学的に活性の表面グループ分けよりなり、そして、通常、特定の三次元構造の特徴ならびに特定の電荷の特徴を有する。抗体は、解離定数が１ｍＭ、好ましくは１００ｎＭおよび最も好ましくは１０ｎＭである場合に抗原を特異的に結合すると言われる。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「ベクター」は、宿主細胞中で目的の１種若しくはそれ以上の遺伝子若しくはポリヌクレオチド配列を送達しかつ好ましくは発現することが可能である構築物を意味している。ベクターの例は、限定されるものでないが、ウイルスベク
ター、裸のＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、陽イオン性縮合剤と会合したＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に被包化されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、および産生体細胞のようなある種の真核生物細胞を挙げることができる。
【００３１】
本明細書で使用されるところの「ポリヌクレオチド」若しくは「核酸」は、一若しくは二本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドポリマーを意味しており、そして、別の方法で制限されない限り、天然に存在するヌクレオチドに類似の様式で核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの既知のアナログを包含する。別の方法で示されない限り、特定の核酸配列は、場合によっては相補配列を包含する。ポリヌクレオチド配列は、免疫グロブリンの可変および／若しくは定常領域ドメインをコードしうる。本明細書で使用されるところの「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源のポリヌクレオチド、またはそれらの何らかの組合せを意味している。その起源のおかげで、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）該「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全部若しくは一部分と会合していないか、（２）天然に連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、若しくは（３）より大きな配列の一部として天然に存在しない。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」は、Ｉｇと組み合わせられる場合にＩｇが生物学的活性を保持することを可能にしかつ被験体の免疫系と非反応性であるいかなる物質も包含する。例は、限定されるものでないが、リン酸緩衝生理的食塩水溶液、水のような標準的製薬学的担体、油／水乳剤のような乳剤、および多様な型の湿潤剤のいずれも挙げることができる。エアゾル若しくは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理的食塩水若しくは通常の（０．８５％）生理的食塩水を包含する。
【００３３】
付随する請求の範囲で使用されるところの「ある（ａ）」は最低１を意味しておりかつ複数を包含し得る。本明細書で使用されるところの「作動可能に連結される」という用語は、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係にある位置を指す。コーディング配列に「作動可能に連結された」制御配列は、該制御配列のものと適合性の条件下で該コーディング配列の発現が達成されるような様式で連結される。
【００３４】
本明細書で使用されるところの「制御配列」という用語は、それらが連結されているコーディング配列の発現およびプロセシングを遂げるのに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。こうした制御配列の性質は宿主生物体に依存して異なり；原核生物中では、こうした制御配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位および転写終止配列を包含し；真核生物においては、こうした制御配列は一般にプロモーターおよび転写終止配列を包含する。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現およびプロセシングに不可欠である全成分を包含することを意図しており、また、例えば、その存在が有利である付加的な成分、リーダー配列および融合パートナー配列もまた包含し得る。
【００３５】
本明細書で使用されるところの２０種の慣習的アミノ酸およびそれらの略語は慣習的使用法に従う。本発明の改変された抗体を構成するアミノ酸はしばしば略記される。アミノ酸の呼称は、当該技術分野で十分に理解されるところのその一文字記号、その三文字記号、名称若しくは３ヌクレオチドコドン（１種若しくは複数）によりアミノ酸を呼称することにより示し得る（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第３版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９９４を参照されたい）。
【００３６】
ポリペプチドに適用されるところの「実質的同一性」という用語は、２種のペプチド配列を至適に整列する場合に最低８０％の配列同一性、好ましくは最低９０％の配列同一性、より好ましくは最低９５％の配列同一性、および最も好ましくは最低９９％の配列同一
性を共有することを意味している。
【００３７】
好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。
【００３８】
保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば：脂肪族側鎖を有するアミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸はセリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸はリシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；イオウ含有側鎖を有するアミノ酸はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は；バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００３９】
本明細書に論考されるとおり、抗体すなわち免疫グロブリン分子のアミノ酸配列中の小さな変動は、本発明により包含されるとして企図されるが、但し、アミノ酸配列中の変動は最低７５％、より好ましくは最低８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％を維持する。とりわけ保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、それらの側鎖が関係するアミノ酸の一族内で起こるものである。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般に、族：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）荷電していない極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分割される。より好ましい族は：脂肪族−ハイドロックス（ｈｙｄｒｏｘ）＝セリン、トレオニン；アミド含有＝アスパラギン、グルタミン；脂肪族＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；芳香族＝フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンである。例えば、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、トレオニンのセリンでの孤立した置換、または構造上関係するアミノ酸でのあるアミノ酸の類似の置換は、とりわけ該置換が枠組み部位内のアミノ酸を巻き込まない場合に、生じる分子の結合若しくは特性に対し大きな影響を有しないであろうと期待することは合理的である。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド派生物の比活性をアッセイすることにより容易に決定し得る。アッセイは本明細書に詳細に記述される。抗体すなわち免疫グロブリン分子のフラグメント若しくはアナログは当業者により容易に製造され得る。フラグメント若しくはアナログの好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くに存在する。
【００４０】
構造および機能ドメインは、ヌクレオチドおよび／若しくはアミノ酸配列データの公的若しくは占有の配列データベースとの比較により同定し得る。好ましくは、コンピュータ化比較方法を使用して、既知の構造および／若しくは機能の他のタンパク質中に存在する配列モチーフ若しくは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定する。既知の三次元構造に折り畳まるタンパク質配列の同定方法は既知である。（Ｂｏｗｉｅら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１））。従って、前述の例は、本発明により構造および機能ドメインを定義するのに使用しうる配列モチーフおよび構造的コンホメーションを当業者が認識し得ることを示す。
【００４１】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変え、（４）結合親和性を変え、および（４）こうしたアナログの他の物理化学若しくは機能特性を賦与する若しくは改変するものである。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の配列の多様なムテインを包含し得る。例えば、単一若しくは複数のアミノ酸置換
（好ましくは保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列中で（好ましくは分子間接触を形成するドメイン（１個若しくは複数）の外側のポリペプチドの部分で行いうる。
【００４２】
保存的アミノ酸置換は親配列の構造的特徴を実質的に変えないはずである（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に存在するらせんを破壊、若しくは親配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊する傾向がないはずである）。
【００４３】
（技術に認識されるポリペプチドの二次およびＳ三次構造の例は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク １９８４；Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎとＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク州ニューヨーク １９９１；Ｔｈｏｒｎｔｏｎら Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５ １９９１（それぞれ引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている）。
【００４４】
患者という用語はヒトおよび家畜の被験体を包含する。
【００４５】
Ｂ．抗体構造
基本的な抗体の構造単位は四量体を含んでなる。各四量体はポリペプチド鎖の２個の同一の対から構成され、各対は１本の「Ｌ」（約２５ｋＤａ）および１本の「Ｈ」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を司る約１００ないし１１０若しくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を司る定常領域を定義する。ヒトＬ鎖はκおよびλ Ｌ鎖と分類される。Ｈ鎖定常領域はμ、δ、γ、αおよびεと分類され、そして抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義する。
【００４６】
γ Ｈ鎖定常領域のそれぞれは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有し、γ−３中のヒンジドメインは４種の異なるエキソンによりコードされる。（ＭｏｒｒｉｏｓｎとＯｉ“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｉｇ Ｇｅｎｅｓ”、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ ｐｐ．２５９−２７４ Ｈｏｎｊｏら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ １９８９中）。ＬおよびＨ鎖内で、可変および定常領域は約１２若しくはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、Ｈ鎖は約１０より多いアミノ酸の「Ｄ」領域もまた包含する。（全般として：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク １９８９）（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。各Ｌ／Ｈ鎖対の可変領域が抗体の結合部位を形成する。従って無傷の抗体は２個の結合部位を有する。二官能性若しくは二特異性抗体でを除き、該２結合部位は同一である。該鎖は全部、相補性決定領域すなわちＣＤＲともまた呼ばれる３個の超可変領域により結合される比較的保存された枠組み領域（ＦＲ）の同一の一般構造を表す。
【００４７】
各対の２本の鎖からのＣＤＲは枠組み領域により整列され、特異的１エピトープに結合することを可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、ＬおよびＨ鎖双方がドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、免疫学的目的のタンパク質のＫａｂａｔ配列（Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（国立保健研究所 メリーランド州ベセスダ １９８７および１９９１；ＣｈｏｔｉａとＬｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７ １９８７；Ｃｈｏｔｈｉａら Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３ １９８９）の定義に従う。
【００４８】
二特異性若しくは二官能性抗体は、２種の異なるＨ／Ｌ鎖対および２個の異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合若しくはＦａｂ’フラグメントの連結を包含する多様な方法により製造し得る。（例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉとＬａｃｈｍａｎｎ Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１ １９９０；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３ １９９２を参照されたい）。
【００４９】
二特異性抗体の製造は、慣習的抗体の製造と比較して相対的に労働集約的過程であり得、そして収量および純度の程度は二特異性抗体について一般により低い。
【００５０】
二特異性抗体は単一結合部位を有するフラグメント（例えばＦａｂ、ＦａｂおよびＦｖ）の形態で存在しない。
【００５１】
Ｃ．本発明の抗体
本発明は、Ｆｃドメインを抗原結合ドメインに関して新たに方向付けするという目的上、１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインがＬ鎖上のドメインに交換されかつ／またはＬ鎖の１個若しくはそれ以上のドメインがＨ鎖のドメインに交換されている改変抗体を創製するための抗体分子の工作にとりわけ関する。
【００５２】
本発明により、抗体の定常領域のＬおよびＨ鎖からの１個若しくはそれ以上の免疫グロブリン定常ドメインを交換することによりＦｃ受容体と相互作用するその能力において抗体の特徴を改変するための、複数の天然の若しくは改変された免疫グロブリン（Ｉｇ）定常ドメインの利用方法が提供される。特定のＡｂのアミノ酸配列が一旦決定されれば、そのＡｂのＨおよびＬ鎖配列のいずれかの組合せをコードする遺伝子を製造するために、標準的組換えＤＮＡの方法および／若しくはＤＮＡ合成が当業者により使用され得る。抗原結合ドメインに関してＦｃドメインを新たに方向付けするという目的上、特定のＡｂのＨおよびＬ鎖の間で交換しうる配列の多様なサブセットが存在する。例は：
Ｈ鎖ＦｄおよびＬ鎖全体（図２Ａ）−ＶＬ−ＣＬ−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３を作成する
Ｈ鎖およびＶＨ−ＣＨ１ Ｌ鎖は最低量の工作を必要とするはずである。ＦｄとＬ鎖の間の全部の接触点が維持されるはずである。
Ｖ領域（図２Ａ）−ＶＬ−ＣＨ１−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ Ｈ鎖およびＶＨ−ＣＬ Ｌ鎖を作成するためにＨおよびＬ鎖のＶ領域を交換することは、Ｖドメインと隣接Ｃドメインの間の新たな界面を適応させるための小さな工作のみを必要とするはずである。
ＣＤＲ−Ａｂ上のこれらの抗原結合モチーフは理論上鎖間で交換し得るとは言え、抗原結合を保存することは、ＣＤＲに隣接する配列に対する広範囲の工作を必要とすることがありそうであるとみられる
を包含する。
【００５３】
これらの配列が交換されている適切に製造されたＡｂバリアントは抗原結合親和性および特異性を保持するはずであるが、しかしそれらのＦｃドメインが抗原に関して「反転（ｆｌｉｐｅｄ）」されている。細胞表面抗原の場合には、Ｆｃドメインのこの新たな向きは、ＦｃＲ結合部位への乏しい到達可能性と、ＡｂのＦｃＲ結合部位への良好な到達可能性の間の差違をなしうる（図２Ｂ）。到達可能性の問題は、原形質膜若しくは隣接分子による妨害によりＦｃＲ結合部位を露出させるために必要な配置を取ることが可能でないＡｂに帰されうる。
【００５４】
こうしたＡｂバリアントは、可溶性抗原若しくはウイルス、例えばＦｃＲ結合部位若しくはＣ１ｑ結合部位がエピトープ以外の標的の一部分からの立体障害により阻害されている大型標的に対する利点もまた賦与しうる。こうしたＡｂ上のＦｃＲ結合部位若しくはＣ１ｑ結合部位の到達不可能性は、免疫複合体のＦｃＲ媒介性の消失若しくは標的の補体媒
介性の溶解に影響し得る。
【００５５】
一方の鎖から他方に交差するためのアミノ酸配列中の正確な点の決定において若干の程度の柔軟性が存在することができる。ＶＬ−ＣＬ−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ Ｈ鎖およびＶＨ−ＣＨ１ Ｌ鎖の２例を図３に示す。
【００５６】
腫瘍細胞標的への良好な結合しかしわずかなＡＤＣＣ活性を示すＡｂは、Ｆｃドメインの新たな方向付けが腫瘍細胞に対する高められたＡＤＣＣ活性につながり得るため、本発明の良好な候補であるとみられる。再工作された遺伝子を製造し得、そしてその後、慣習的Ａｂに使用される同一の細胞系で発現させ得、そして、生じるＡｂ変異体を、慣習的Ａｂに使用される同一の方法、すなわちプロテインＡ若しくはプロテインＧクロマトグラフィーにより精製し得る。抗原結合能力について試験した後、ＡＤＣＣ若しくは補体溶解アッセイが、再工作したＡｂバリアントが元のＡｂより大きな細胞死滅活性を有したかどうかを示すとみられる。例えば固定した抗原に結合されるＡｂにＦｃＲ＋細胞がどのくらい良好に結合するかを評価することにより、元のＡｂに対し再工作されたものでのＦｃドメインの到達可能性を比較する生物物理的手段もまた存在しうる。
【００５７】
本発明は、従って、ＩｇＧ Ａｂ上のＦｃＲ結合部位およびＣ１ｑ結合部位を新たに方向付けしかつおそらくはるかにより到達可能にする新規手段を提供する。数種のＡｂの効力は、これらの部位を到達可能にすることにより劇的に高められることがありそうである（とりわけ、ＡＤＣＣ、食作用若しくは補体活性化がその作用機序の一部であるＡｂ）。それらの作用機序の一部としてこうした免疫エフェクター機能を動員しないなお他のＡｂもまた、同時のＦｃＲ結合の効果によりその細胞表面若しくは別の方法で固定された抗原に対するより高い親和性を実現することにより、本発明により利益を得るとみられる。同時のＦｃＲ結合が大きくなるほど、その抗原から直ちに解離するいかなるＡｂもその抗原に緊密な近接でＦｃＲにより保持されることができ、それにより再会合の機会を大きく増大させることがよりありそうになる。このアプローチは、しばしば、より好都合な向きで結合する同一抗原に対する完全に異なるＡｂについて検索することより魅力的な選択肢であることができる。
【００５８】
抗体ドメインの物理的結合はいずれかの慣習的技術を利用して達成しうる。好ましい態様において、ドメインの物理的連結は組換え的に達成され、すなわち、こうしたドメインをコードする遺伝子構築物が、それからの発現に際して該分子の正しい集成を可能にする様式で発現系に導入される。前述の例を図２および３に描く。
【００５９】
こうした改変Ｉｇを構築するため、一般に、改変されるべきＡｂの選択されたＨＣ若しくはＬＣドメインをコードするＤＮＡを、容易に単離、工作および同一Ａｂの他の鎖をコードする遺伝子中の選択した部位にクローン化し得る。例えば、１アプローチにおいて、ＨＣのＶＨおよびＣＨ１コーディング配列を同時にＰＣＲ増幅しかつＣＨ１コーディング配列の直後に翻訳終止コドンを含有するように改変し得る。コードされるポリペプチドは改変されたＡｂのＬＣを構成し得る。同時に、同一ＡｂのＶＬおよびＣＬコーディング配列を同時にＰＣＲ増幅し、そしてＨＣのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする配列に、例えばこうしたコーディング配列のオーバーラップＰＣＲアプローチにより正確に結合することを可能にするように工作し得る。こうした遺伝子によりコードされるポリペプチドが改変ＡｂのＨＣを構成し得る。ＬおよびＨ鎖のこれらの構築物をその後、発現のため適する細胞株にトランスフェクトする。この様式で、図２Ｂおよび３に描かれる分子を製造し得る。
【００６０】
以下の実施例において、ヒトＶＬおよびＣＬドメインをコードする配列を、同一ＡｂのＨ鎖分子上のＶＨおよびＣＨ１ドメインの代わりに挿入した。同時に、ＶＨおよびＣＨ１
ドメインを、同一ＡｂのＶＬおよびＣＬドメインの代わりに挿入した。他の好ましい態様は、別のＡｂのＶＨおよびＣＨ１若しくはＶＬおよびＣＬコーディング配列（おそらく元のＡｂと同一の抗原若しくは異なる抗原を認識するもの）を使用することを包含し得る。こうした戦略は、例えばＦｃＲ結合を変えることに加え、他の動物種からの対応する抗原に対するより大きな反応性を与えることにより、抗原特異性を変え得る。交換されたドメインは、ＩｇＤのような別のＩｇアイソタイプのＬ鎖からのドメインでもまたありうる。通常、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインはＬ鎖定常領域と緊密に会合されており、そしてこの会合は、Ｈ鎖およびＬ鎖双方上の疎水性の面を埋める。
【００６１】
さらに、交換された定常領域は、天然の抗体中に存在する天然の形態の定常領域に制限されることを必要としない。むしろ、本発明での使用のための交換された定常領域ドメインは、例えば定常領域ドメインの突然変異誘発、次いで高められた活性についてスクリーニングすることにより生成し得るか、若しくは合成で製造し得る。
【００６２】
本発明は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、ラット、ハムスター若しくはマウスのような多様な種からの抗体で実施し得る。他の可能性は、ＣＤ４のようなＡｂ以外のタンパク質から免疫グロブリンドメインを挿入することであるとみられる。挿入される配列は、免疫グロブリンドメインであることを必要としないことがある。他の配列は、Ａｂの効力を改良するために必要とされる柔軟性若しくは空間配置を賦与することが可能でありうる。例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３のようなグリシンおよびセリン残基から構成されるポリペプチドリンカーを包含する。
【００６３】
本発明が、全般として受容体とそのリガンドの間の相互作用を高めることのためにもまた応用可能であることが認識されるであろう。この点に関して、受容体若しくはリガンド部分のいずれかを、受容体およびリガンドの親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）、親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）若しくは単に相互作用する能力を高める１部分以上を有する分子を生成するように改変しうる。別の方法を述べたので、本発明は、Ｆｃ受容体結合ドメインの空間的特徴を改変することにより、そのＦｃ標的に対する分子の親和性の増大方法を提供する。最終結果は、改変された分子がＦｃ受容体に対するより大きい親和性を有することができることである。加えて、免疫グロブリンドメインを交換することは外来タンパク質配列を導入しないため、該改変された分子は免疫原性であることがより少なくありそうである。
【００６４】
Ｅ．改変抗体の設計
上で論考したとおり、本発明の好ましい改変抗体構築物を製造するのに使用される基本設計は、１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインを抗体のＬ鎖定常領域に置換しかつ／または１個若しくはそれ以上のＬ鎖ドメインをＨ鎖定常領域に置換することである。本発明の１構築物は、ＨおよびＬ鎖Ｖ領域を交換して、ＶＬ−ＣＨ１−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ Ｈ鎖およびＶＨ−ＣＬ Ｌ鎖を作成することである（図２Ａに示されるとおり）。改変されるべきである抗体は、ヒト、げっ歯類若しくは他の供給源のいかなる抗体からも選択してよく、そしてキメラ、ヒト化、ヒト若しくは合成抗体でありうる。一態様において、改変されるべきである抗体は、正常若しくはトランスジェニックマウスの免疫化により生成しうる。該抗体は当該技術分野で既知の多数の方法のいずれによってもさらに改変しうる。一般に、改変抗体は、交換された定常ドメイン若しくは他の挿入配列をコードするポリヌクレオチドを、抗体の定常領域をコードするプラスミドに単純に置換すること、および改変抗体を製造するための適する宿主細胞中で該プラスミドを発現することにより製造しうる。該挿入物は直接作成しても若しくはリンカー分子を伴ってもよい。挿入物およびリンカーの性質は、意図される機能を実施する、すなわち抗体分子のＦｃ受容体結合を改変するのに必要なように設計し得る。抗体免疫グロブリン分子を改変する挿入物のアミノ酸組成および長さは、当該技術分野の既知のところの多様な異なる配列を含有する構築物を試験することにより決定しうる。
【００６５】
ある種の特徴を有する改変された分子が望ましい場合、その特徴をなんらかの方法で改良するように、定常領域挿入物にある種の突然変異を導入することが望ましいことができるか若しくは必要でありうる。しかしながら、ヒトでの使用のための抗体が望ましい場合には、免疫原性を低下させるために挿入物をヒト配列に可能な限り近づけることが望ましい。従って、免疫原性を生成することを回避するように、可能な限り少ないアミノ酸変化を改変された分子に導入することが一般に望ましい。
【００６６】
最低２種の異なる抗原に対する結合特異性を有する二特異性、ヘテロ特異性、ヘテロ複合物若しくは類似のモノクローナルのヒト化抗体もまた使用し得る。こうした場合は、結合特異性の一方を１種の抗原に対しかつ他方のものをいずれかの他の抗原に対し指定しうる。二特異性抗体の作成方法は当該技術分野で既知である。伝統的に、二特異性抗体の組換え製造は、２本のＨ鎖が異なる特異性を有する２本の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく（ＭｉｌｓｔｅｉｎとＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７ １９８３）。免疫グロブリンＨおよびＬ鎖の無作為な取り合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じ、それらのうち１種のみが正しい二特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー段階により通常なされる正しい分子の精製はむしろ厄介であり、そして生成物の収量は低い。類似の手順が開示されている、（例えば、第ＷＯ ９３／０８８２９号、米国特許第６２１０６６８号、同第６１９３９６７号、同第６１３２９９２号、同第６１０６８３３号、同第６０６０２８５号、同第６０３７４５３号、同第６０１０９０２号、同第５９８９５３０号、同第５９５９０８４号、同第５９５９０８３号、同第５９３２４４８号、同第５８３３９８５号、同第５８２１３３３号、同第５８０７７０６号、同第５６４３７５９号、同第５６０１８１９号、同第５５８２９９６号、同第５４９６５４９号、同第４６７６９８０号、第ＷＯ ９１／００３６０号、同第ＷＯ ９２／００３７３号、欧州特許第ＥＰ ０３０８９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５ １９９１；Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０ １９８６（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる））。
【００６７】
以下の実施例において、改変Ａｂは、Ｈ鎖Ｆｄ領域をコードするＤＮＡ配列を置換してＶＬ−ＣＬ１−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ Ｈ鎖およびＶＨ−ＣＨ１−ｈｇ−ＣＬ２−ＣＬ３
Ｌ鎖を作成するための組換えＤＮＡの方法を使用して製造した。
【００６８】
それが由来した未改変マウス抗体に比較した改変抗体の配列を図３に示す。
【００６９】
好ましくは、改変抗体構築物またはそれらのリガンド結合部分若しくはバリアントは最低１種のタンパク質リガンド若しくは受容体を結合し、そしてそれにより対応するタンパク質若しくはそのフラグメントの最低１種の生物学的活性を提供する。多様な治療上若しくは診断上意義のあるタンパク質が当該技術分野で公知であり、そして、こうしたタンパク質の適するアッセイ若しくは生物学的活性もまた当該技術分野で公知である。いずれかの数の生物学的に活性のタンパク質を結合する改変抗体を本発明とともに使用しうる。ＴＮＦ、レプチン、インターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−２３など）のいずれか、および補体活性化（例えばＣ３ｂ）に関与するタンパク質に結合しかつ従ってそれらの活性を調節する抗体がとりわけ興味深い。腫瘍上で発現されるタンパク質などを包含する、ある種の疾患状態で差別的に発現されるターゲッティングタンパク質もまた興味深い。これらの分類のリガンドの全部は、本明細で引用される参考文献および他の参考文献に記述される方法により発見されうる。改変抗体のとりわけ好ましい一群はサイトカイン受容体に結合するものである。サイトカインは最近、それらの受容体記号に従って分類された（Ｉｎｇｌｏｔ １９９７、Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ ４５：３５３−７（ここに引用することによりそっく
りそのまま組み込まれる）を参照されたい）。
【００７０】
改変定常領域を含んでなる本発明の改変抗体は、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところの、ハイブリドーマ、ファージディスプレイ（Ｋａｔｓｕｂｅ，Ｙ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ、１（５）：８６３−８６８ １９９８）のようないずれかの適する方法、若しくはトランスジェニック動物を使用する方法から得られる抗体を使用して製造し得る。
【００７１】
本発明の改変抗体構築物は、それが由来した親抗体からの天然の突然変異若しくは人的操作のいずれかからの１個若しくはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を包含し得る。
【００７２】
別の局面において、本明細書に記述されるところの改変抗体構築物は有機部分の共有結合によりさらに改変しうる。こうした改変は、改良された薬物動態特性（例えば増大されたｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期）を伴う抗体若しくは抗原結合フラグメントを生じ得る。有機部分は、直鎖状若しくは分枝状の親水ポリマー基、脂肪酸基若しくは脂肪酸エステル基であり得る。特定の態様において、親水ポリマー基は約８００ないし約１２０，０００ダルトンの分子量を有し得、そしてポリアルカングリコール（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー若しくはポリビニルピロリドンであり得、また、脂肪酸若しくは脂肪酸エステル基は約８から約４０個までの炭素原子を含み得る。
【００７３】
本発明の改変抗体および抗原結合フラグメントは、抗体に直接若しくは間接的に共有結合されている１個若しくはそれ以上の有機部分を含み得る。本発明の抗体若しくは抗原結合フラグメントに結合されている各有機部分は、独立に、親水ポリマー基、脂肪酸基若しくは脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用されるところの「脂肪酸」という用語はモノカルボン酸およびジカルボン酸を包含する。該用語が本明細書で使用されるところの「親水ポリマー基」は、オクタン中でよりも水中でより溶解性である有機ポリマーを指す。例えばポリリシンはオクタン中でよりも水中でより溶解性である。従ってポリリシンの共有結合により改変された抗体が本発明により包含される。本発明の抗体を改変するのに適する親水ポリマーは直鎖状若しくは分枝状であり得、そして、例えばポリアルカングリコール（例えばＰＥＧ、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えばデキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えばポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド（例えばポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）およびポリビニルピロリドンを包含する。好ましくは、本発明の抗体を改変する親水ポリマーは、別個の分子実体として約８００ないし約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えばＰＥＧ５０００およびＰＥＧ２０，０００（ここで下付き文字はポリマーの平均分子量（ダルトン）である）を使用し得る。親水ポリマー基は１ないし約６個のアルキル、脂肪酸若しくは脂肪酸エステル基で置換し得る。脂肪酸若しくは脂肪酸エステル基で置換される親水ポリマーは、適する方法を使用することにより製造し得る。例えば、アミン基を含んでなるポリマーを脂肪酸若しくは脂肪酸エステルのカルボキシレートに結合し得、そして、脂肪酸若しくは脂肪酸エステル上の活性化されたカルボキシレート（例えばＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化された）をポリマー上のヒドロキシル基に結合し得る。
【００７４】
本発明の抗体を改変するのに適する脂肪酸および脂肪酸エステルは飽和であり得るか、または１個若しくはそれ以上の不飽和単位を含有し得る。本発明の抗体を改変するのに適する脂肪酸は、例えば、ｎ−ドデカノエート（Ｃ１２、ラウレート）、ｎ−テトラデカノエート（Ｃ１４、ミリステート）、ｎ−オクタデカノエート（Ｃ１８、ステアレート）、
ｎ−エイコサノエート（Ｃ２０、アラキデート）、ｎ−ドコサノエート（Ｃ２２、ベヘネート）、ｎ−トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタノエート（Ｃ４０）、ｃｉｓα α９−オクタデカノエート（Ｃ１８、オレエート）、全ｃｉｓα５，８，１１，１４−エイコサテトラエノエート（Ｃ２０、アラキドネート）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などを包含する。適する脂肪酸エステルは、直鎖状若しくは分枝状の低級アルキル基を含んでなるジカルボン酸のモノエステルを包含する。低級アルキル基は１から約１２まで、好ましくは１ないし約６個の炭素原子を含み得る。
【００７５】
改変ヒト抗体および抗原結合フラグメントは、１種若しくはそれ以上の修飾剤との反応によるような適する方法を使用して製造し得る。該用語が本明細書で使用されるところの「修飾剤」は、活性化基を含んでなる適する有機基（例えば親水ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件下で第二の化学基と反応してそれにより修飾剤と該第二の化学基の間に共有結合を形成し得る化学部分若しくは官能基である。例えば、アミン反応性の活性化基は、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などのような親電子基を包含する。チオールと反応し得る活性化基は、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などを包含する。アルデヒド官能基をアミン若しくはヒドラジド含有分子に結合し得、また、アジド基は三価のリン基と反応してホスホルアミデート若しくはホスホルイミド結合を形成し得る。活性化基の分子への適する導入方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ カリフォルニア州サンディエゴ １９９６を参照されたい）。活性化基は、有機基（例えば親水ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接、またはリンカー部分、例えば１個若しくはそれ以上の炭素原子が酸素、窒素若しくはイオウのようなヘテロ原子により置換されている二価のＣ１−Ｃ１２基により結合され得る。適するリンカー部分は、例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−を包含する。リンカー部分を含んでなる修飾剤は、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下にモノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えばモノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を脂肪酸と反応させて、遊離アミンと脂肪酸のカルボキシレートの間にアミド結合を形成することにより製造し得る。Ｂｏｃ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により生成物から除去して、記述されるところの別のカルボキシレートに結合され得る一級アミンを露出させ得るか、若しくは、無水マレイン酸と反応され得、そして生じる生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生じさせ得る。（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、第ＷＯ ９２／１６２２１号明細書（その教示全体は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
【００７６】
本発明の改変抗体は、ヒト抗体若しくは抗原結合フラグメントを修飾剤と反応させることにより製造し得る。例えば、有機部分を、アミン反応性の修飾剤、例えばＰＥＧのＮＨＳエステルを使用することにより部位非特異的様式で抗体に結合し得る。改変ヒト抗体若しくは抗原結合フラグメントは、抗体若しくは抗原結合フラグメントのジスルフィド結合（例えば鎖内ジスルフィド結合）を還元することによってもまた製造し得る。還元された抗体若しくは抗原結合フラグメントをその後、チオール反応性の修飾剤と反応させて、本発明の改変抗体を製造し得る。本発明の抗体の特定部位に結合されている有機部分を含んでなる改変ヒト抗体および抗原結合フラグメントは、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、３：１４７−１５３ １９９２；Ｗｅｒｌｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５：４１１−４１７ １９９４；Ｋｕｍａｒａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３−２２４１ １９９７；Ｉｔ
ｏｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２４（１）：５９−６８ １９９６；Ｃａｐｅｌｌａｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、５６（４）：４５６−４６３ １９９７；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ カリフォルニア州サンディエゴ １９９６に記述される方法）のような適する方法を使用して製造し得る。
【００７７】
Ｆ．改変抗体の製造
本発明のキメラ抗体の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子、フラグメントおよび領域を、ヒト胎児肝ライブラリーから既知の方法により得ることができる。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現かつ産生するものを包含するいかなるヒト細胞からも得ることができる。ヒトＣＨ領域は、γ、μ、α、δ、εを包含するヒトＨ鎖の既知のクラス若しくはアイソタイプ、ならびにＧ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４のようなそれらのサブタイプのいずれからも得ることができる。Ｈ鎖アイソタイプが抗体の多様なエフェクター機能を司るため、ＣＨ領域の選択は、補体固定若しくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における活性のような所望のエフェクター機能により導かれることができる。好ましくは、ＣＨ領域はγ１（ＩｇＧ１）に由来する。ヒトＣＬ領域はいずれかのヒトＬ鎖アイソタイプすなわちκ若しくはλ、好ましくはκに由来し得る。
【００７８】
ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子は、標準的クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー １９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８７−１９９３）によりヒト細胞から得られる。ヒトＣ領域遺伝子は、２クラスのＬ鎖、５クラスのＨ鎖、およびそれらのサブクラスを表す遺伝子を含有する既知のクローンから容易に入手可能である。Ｆ（ａｂｌ）２およびＦａｂのようなキメラ抗体フラグメントは、適切に切断されているキメラＨ鎖遺伝子を設計することにより製造し得る。例えば、Ｆ（ａｂｌ）２フラグメントのＨ鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメインおよびＨ鎖のヒンジ領域、次いで切断された分子を生じるための転写終止コドンをコードするＤＮＡ配列を包含するとみられる。
【００７９】
一般に、本発明のマウス、ヒト若しくはマウスおよびキメラ抗体、フラグメントおよび領域は、特定の抗体のＨおよびＬ鎖抗原結合領域をコードするＤＮＡセグメントをクローン化すること、ならびにこれらのＤＮＡセグメントをそれぞれＣＨおよびＣＬ領域をコードするＤＮＡセグメントに結合してマウス、ヒト若しくはキメラの免疫グロブリンをコードする遺伝子を生じることにより製造される。
【００８０】
従って、好ましい一態様において、交換された配列を含有するヒトＣ領域の少なくとも一部分をコードする第二のＤＮＡセグメントに連結された、結合（Ｊ）セグメントを伴う機能的に再配列されたＶ領域のような、ヒト若しくはヒト以外の起源の抗体の少なくとも抗原結合領域をコードする第一のＤＮＡセグメントを含んでなる融合キメラ遺伝子が創製される。
【００８１】
可変、定常若しくは挿入物配列の配列は、該キメラ抗体が目的の抗原に結合しかつそれを阻害する能力を維持する程度まで、挿入、置換および欠失により改変しうる。当業者は、適用可能な機能アッセイを実施することによりこの活性の維持を確かめ得る。
【００８２】
本発明の抗体構築物は、場合によっては、当該技術分野で公知のところの細胞株、混合細胞株、不死化細胞若しくは不死化細胞のクローン集団により産生され得る。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク １９８７−２００１；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー １９８９；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー １９８９；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク １９９４−２００１；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク １９９７−２００１（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。）
【００８３】
１アプローチにおいて、ハイブリドーマは、適する不死細胞株（例えば、限定されるものでないが、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳ／Ｏ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ ＳＡ３、Ｓｐ２ ＭＡＩ、Ｓｐ２ ＳＳ１、Ｓｐ２ ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ１４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａなどを挙げることができる骨髄腫細胞株、若しくはヘテロミエローマ、それらの融合生成物、またはそれら由来のいずれかの細胞若しくは融合細胞、あるいは当該技術分野で既知のところのいずれかの他の適する細胞株。（例えばｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍを参照されたい）などを、限定されるものでないが単離若しくはクローン化された脾、末梢血、リンパ、扁桃、または他の免疫若しくはＢ細胞含有細胞、あるいは組換え若しくは内因性のウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、は虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯類、ウマ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ヤギ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、霊長類、真核生物のゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ若しくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖若しくは三本鎖、ハイブリダイズされたなど、またはそれらのいずれかの組合せのような内因性若しくは異種いずれかの核酸としてＨ若しくはＬ鎖定常若しくは可変または枠組みまたはＣＤＲ配列を発現するいずれかの他の細胞を挙げることができる抗体産生細胞と融合することにより製造される。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、およびＣｏｌｌｉｇａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記、第２章（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。）
【００８４】
いずれかの他の適する宿主細胞もまた、本発明の改変された抗体、その指定されるフラグメント若しくはバリアントをコードする異種若しくは内因性核酸を発現させるために使用し得る。融合（ハイブリドーマ）若しくは組換え細胞は、選択的培養条件若しくは他の適する既知の方法を使用して単離し得、そして、限界希釈、細胞分取若しくは他の既知の方法によりクローン化し得る。所望の特異性をもつ抗体を産生する細胞は適するアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）により選択し得る。
【００８５】
ヒト以外の若しくはヒトの抗体の工作すなわちヒト化方法を使用し得、そして当該技術分野で公知である。一般に、ヒト化すなわち工作された抗体はヒト以外である供給源からの１個若しくはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と称され、典型的には、既知のヒト配列の「輸入」可変、定常若しくは他のドメインから採用される。既知のヒトＩｇ配列は開示されている；（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／〜
ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／〜ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ＡＥＰＳｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／〜ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍａｒｔｉｎ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／〜ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｅａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋｉ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；
Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国保健省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ）１９８３（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）。）
【００８６】
こうした輸入された配列を使用して、免疫原性を低下させ得るか、または、結合、親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）、オン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、オフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）、特異性、半減期、若しくは当該技術分野で既知のところのいずれかの他の適する特徴を低下し得るか、高め得るか、若しくは改変し得る。一般に、ヒト以外若しくはヒトのＣＤＲ配列の一部若しくは全部が維持される一方、可変および定常領域のヒト以外の配列がヒト若しくは他のアミノ酸で置換される。抗体はまた、抗原に対する高親和性および他の好都合な生物学的特性の保持を伴いヒト化し得る。この最終目標を達成するため、ヒト化抗体は、場合によっては、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列および多様な概念的ヒト化産物の分析の方法により製造し得る。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能でありかつ当業者になじみがある。選択した候補免疫グロブリン配列のありそうな三次元コンホメーション構造を具体的に説明しかつ表示するコンピュータプログラムを利用可能である。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原を結合する能力に影響する残基の解析を可能にする。こうして、標的抗原（１種
若しくは複数）に対する増大された親和性のような所望の抗体の特徴が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサスおよび輸入配列から選択しかつ組合せ得る。一般に、ＣＤＲ残基は抗原結合に影響することに直接かつ最も実質的に関与する。本発明の抗体のヒト化若しくは工作は、限定されるものでないが：（Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ
３２１：５２２ １９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３ １９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ １９８８；Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６ １９９３；ＣｈｏｔｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１ １９８７；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５ １９９２；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３ １９９３；米国特許第５７２３３２３号、同第５９７６８６２号、同第５８２４５１４号、同第５８１７４８３号、同第５８１４４７６号、同第５７６３１９２号、同第５７２３３２３号、同第５，７６６８８６号、同第５７１４３５２号、同第６２０４０２３号、同第６１８０３７０号、同第５６９３７６２号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５２２５５３９号；同第４８１６５６７号明細書、ＰＣＴ／：第ＵＳ９８／１６２８０号、第ＵＳ９６／１８９７８号、第ＵＳ９１／０９６３０号、第ＵＳ９１／０５９３９号、第ＵＳ９４／０１２３４号、第ＧＢ８９／０１３３４号、第ＧＢ９１／０１１３４号、第ＧＢ９２／０１７５５号明細書；第ＷＯ９０／１４４４３号、同第ＷＯ９０／１４４２４号、同第ＷＯ９０／１４４３０号明細書、欧州特許第ＥＰ ２２９２４６号明細書（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）、その中に引用される包含される参考文献）に記述されるものを挙げることができるいずれかの既知の方法を使用して実施し得る。
【００８７】
本発明の抗体は、それらの乳中でこうした抗体を産生するヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどのようなトランスジェニック動物すなわち哺乳動物を提供するために最低１種の抗体構築物をコードする核酸を使用してもまた製造し得る。こうした動物は既知の方法を使用して提供し得る。（例えば、限定されるものでないが米国特許第５，８２７，６９０号；同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号、同第５，５６５，３６２号；同第５，３０４，４８９号など（それらのそれぞれは引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
【００８８】
本発明の抗体は、加えて、植物部分若しくはそれから培養される細胞中でこうした抗体、指定される部分若しくはバリアントを産生するトランスジェニック植物および培養植物細胞（限定されるものでないがタバコおよびトウモロコシを挙げることができる）を提供するために、最低１種の抗体構築物をコードする核酸を使用して製造し得る。制限しない一例として、組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉が、例えば誘導可能なプロモーターを使用して大量の組換えタンパク質を提供するのに成功裏に使用されている。（例えば、Ｃｒａｍｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５−１１８ １９９９を参照されたい）およびその中に引用される参考文献。また、トランスジェニックトウモロコシが、他の組換え系で産生されるか若しくは天然の供給源から精製されるものと同等の生物学的活性を伴い、商業生産レベルで哺乳動物タンパク質を発現するのに使用されている。（例えば、Ｈｏｏｄら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７−１４７ １９９９およびその中に引用される参考文献を参照されたい。）一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のような抗体フラグメントを包含する抗体はまた、タバコ種子およびバレイショ塊茎を包含するトランスジェニック植物種子からも大量に産生されている。（例えば、Ｃｏｎｒａｄら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１−１０９ １９９８およびその中に引用される参考文献を参照されたい。）従って、本発明の抗体は、既知の方法に従ってトランスジェニック植物を使用してもまた製造し得る。（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０：９９−１９８、Ｏｃｔ．、１９９９；Ｍａら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．１３：５２２−７ １９９；Ｍａら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１−６ １９９５；Ｗｈｉｔｅｌａｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０−９４４ １９９４；およびその中に引用される参考文献もまた参照されたい；上の参考文献のそれぞれは引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。）
【００８９】
抗原に対する抗体の親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）若しくは親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）はいずれかの適する方法を使用して実験的に決定し得る。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ ニューヨーク州ニューヨーク １９８４中；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ニューヨーク州ニューヨーク １９９２；および本明細書に記述される方法を参照されたい。）特定の抗体−抗原相互作用の測定される親和性は、多様な条件（例えば塩濃度、ｐＨ）下で測定される場合に変動し得る。従って、親和性および他の抗原結合パラメータ（例えばＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は、好ましくは抗体および抗原の標準化された溶液、ならびに本明細書に記述される緩衝液のような標準化された緩衝液を用いて行う。
【００９０】
Ｇ．核酸分子
本明細書に提供される情報を使用して、本発明の抗体構築物をコードする本発明の核酸分子を、本明細書に記述される若しくは当該技術分野で既知のところの方法を使用して得ることができる。
【００９１】
本発明の核酸は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ若しくはいずれかの他の形態のようなＲＮＡの形態、または限定されるものでないがクローニングにより得られるか若しくは合成で製造されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを挙げることができるＤＮＡの形態、あるいはそれらのいずれかの組合せであり得る。ＤＮＡは三本鎖、二本鎖若しくは一本鎖、またはそれらのいずれかの組合せであり得る。ＤＮＡ若しくはＲＮＡの少なくとも１本の鎖のいずれかの部分が、センス鎖としてもまた知られるコーディング鎖であり得るか、または、それはアンチセンス鎖ともまた称される非コーディング鎖であり得る。
【００９２】
本発明の単離された核酸分子は、１種若しくはそれ以上のイントロン、改変された抗体構築物のコーディング配列を含んでなる最低１種のＨ鎖若しくはＬ鎖核酸分子のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／若しくはＣＤＲ３のような最低１個のＣＤＲの最低１個の指定される部分、ならびに、上述されたものと実質的に異なるヌクレオチド配列を含んでなるがしかし遺伝暗号の縮重により本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところの最低１種のこうした改変抗体構築物をなおコードする核酸分子を場合によっては含む１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでなる核酸分子を包含し得る。もちろん遺伝暗号は当該技術分野で公知である。従って、本発明の特定の抗体をコードするこうした縮重核酸バリアントを生成することが当業者にとって慣例であるとみられる。（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）、そしてこうした核酸バリアントは本発明に包含される。
【００９３】
本明細書で示されるとおり、抗体構築物をコードする核酸を含んでなる本発明の核酸分子は、限定されるものでないが、抗体フラグメントのアミノ酸配列を独力でコードするもの、該抗体全体若しくはその一部分のコーディング配列、抗体、フラグメント若しくは部分のコーディング配列、ならびに、限定されるものでないが、転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル（例えば−リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を包含するｍＲＮＡプロセシングである役割を演じる転写され翻訳されない配列のような非コーディング５’および３’配列を挙げることができる付加的な非コーディング配列と一緒の最
低１種のイントロンのような前述の付加的なコーディング配列を伴う若しくは伴わない最低１個のシグナルリーダー若しくは融合ペプチドのコーディング配列のような付加的な配列；付加的な官能性を提供するもののような付加的なアミノ酸をコードする付加的なコーディング配列を挙げることができる。従って、抗体をコードする配列は、抗体のフラグメント若しくは一部分を含んでなる融合抗体の精製を容易にするペプチドをコードする配列のようなマーカー配列に融合し得る。
【００９４】
核酸の構築
本発明の単離された核酸は、当該技術分野で公知のところの（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術若しくはそれらの組合せを使用して作成し得る。
【００９５】
該核酸は本発明のポリヌクレオチドに加えて配列を便宜的に含み得る。例えば、１個若しくはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含んでなるマルチクローニング部位を、ポリヌクレオチドの単離で補助するために核酸に挿入し得る。また、翻訳可能な配列を、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離で補助するために挿入し得る。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するための便宜的手段を提供する。本発明の核酸（コーディング配列を除外する）は、場合によっては、本発明のポリヌクレオチドをクローン化かつ／若しくは発現するためのベクター、アダプター若しくはリンカーである。
【００９６】
付加的な配列を、クローニングおよび／若しくは発現でのそれらの機能を至適化するため、ポリヌクレオチドの単離で補助するため、または細胞中へのポリヌクレオチドの導入を改良するために、こうしたクローニングおよび／若しくは発現配列に付加し得る。クローニングベクター、発現ベクター、アダプターおよびリンカーの使用は当該技術分野で公知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）
【００９７】
核酸の組換え構築方法
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、若しくはそれらのいずれかの組合せのような本発明の単離された核酸組成物は、当業者に既知のいずれかの数のクローニング方法論を使用して生物学的供給源から得ることができる。いくつかの態様において、ストリンジェント条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の配列を同定する。ＲＮＡの単離ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築は当業者に公知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）
【００９８】
核酸のスクリーニングおよび単離方法
ｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーを、本明細書に開示されるもののような本発明のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを使用してスクリーニングし得る。ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて同一若しくは異なる生物体中の相同な遺伝子を単離するためにプローブを使用し得る。当業者は、ハイブリダイゼーションの多様な程度のストリンジェントを該アッセイで使用し得；そしてハイブリダイゼーション若しくは洗浄媒体のいずれかがストリンジェントであり得ることを認識するであろう。ハイブリダイゼーションの条件がよりストリンジェントになる際に、二重鎖形成が起こるためにプローブと標的の間のより大きな程度の相補性が存在しなければならない。ストリンジェントの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、およびホルムアミドのような部分的変性溶媒の存在により制御し得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェントは、０％ないし５０％の範囲内のホルムアミドの濃度の操作により反応体溶液の極性を変化させることにより便宜的に変動させ得る。検出可能な結合に必要とされる相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒体および／若しくは洗浄媒体のストリンジェントに従
って変動することができる。相補性の程度は、至適には１００％、若しくは７０〜１００％、またはその中のいずれかの範囲若しくは値であることができる。しかしながら、プローブおよびプライマー中の小さな配列の変動は、ハイブリダイゼーションおよび／若しくは洗浄媒体のストリンジェントを低下させることにより補償され得ることが理解されるべきである。
【００９９】
ＲＮＡ若しくはＤＮＡの増幅方法は当該技術分野で公知であり、そして本明細書に提示される教示および手引きに基づき、過度の実験を伴わずに本発明により使用し得る。
【０１００】
ＤＮＡ若しくはＲＮＡの既知の増幅方法は、限定されるものでないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関係する増幅方法（例えば、Ｍｕｌｌｉｓらへの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号；Ｔａｂｏｒへの同第４，７９５，６９９号および同第４，９２１，７９４号；Ｉｎｎｉｓへの同第５，１４２，０３３号；Ｗｉｌｓｏｎらへの同第５，１２２，４６４号；Ｉｎｎｉｓへの同第５，０９１，３１０号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎらへの同第５，０６６，５８４号；Ｇｅｌｆａｎｄらへの同第４，８８９，８１８号；Ｓｉｌｖｅｒらへの同第４，９９４，３７０号；Ｂｉｓｗａｓへの同第４，７６６，０６７号；Ｒｉｎｇｏｌｄへの同第４，６５６，１３４号明細書を参照されたい）、ならびに、二本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型として標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ媒介性の増幅（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記；商品名ＮＡＳＢＡをもつＭａｌｅｋらへの米国特許第５，１３０，２３８号明細書（それらの参考文献の内容全体は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を挙げることができる。
【０１０１】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドおよび関連遺伝子の配列をゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリーから直接増幅し得る。ＰＣＲおよび他のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法もまた、例えば発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローン化するため、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を作成するため、核酸配列決定のため、若しくは他の目的上有用であり得る。（ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法により当業者を指図するのに十分な技術の例は：Ｂｅｒｇｅｒ、上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号 １９８７；Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ １９９０に見出される。）ゲノムＰＣＲ増幅のために商業的に入手可能なキットは当該技術分野で既知である。例えばＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノムＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照されたい。加えて、例えばＴ４の遺伝子３２プロテイン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、長いＰＣＲ産物の収量を向上させるのに使用し得る。
【０１０２】
核酸の合成構築方法
本発明の単離された核酸は、既知の方法（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）を使用する直接化学合成によってもまた製造し得る。化学合成は、一般に一本鎖オリゴヌクレオチドを生じ、それが相補配列とのハイブリダイゼーション若しくは鋳型として該一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼでの重合により、二本鎖ＤＮＡに転化され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成は約１００若しくはそれ以上の塩基の配列に制限され得る一方で、より長い配列をより短い配列の連結により得ることができることを認識するであろう。
【０１０３】
Ｈ．組換え発現カセット
本発明はさらに、本発明の核酸を含んでなる組換え発現カセットを提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明の抗体をコードするｃＤＮＡ若しくはゲノム配列を使用して、最低１種の所望の宿主細胞に導入し得る組換え発現カセットを構築し得る。組換え発現カセットは、典型的に、意図される宿主細胞中での該ポリヌクレオチドの転写を指図することができる転写開始制御配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含むことができる。異種および非異種（すなわち内因性）双方のプロモーターを、本発明の核酸の発現を指図するのに使用し得る。
【０１０４】
いくつかの態様において、プロモーター、エンハンサー若しくは他の要素としてはたらく単離された核酸を、本発明のポリヌクレオチドの発現を上方若しくは下方制御するように、非異種の形態の本発明のポリヌクレオチドの適切な位置（上流、下流若しくはイントロン中）に導入し得る。例えば、内因性プロモーターを突然変異、欠失および／若しくは置換によりｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで変えることができる。
【０１０５】
Ｉ．ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明の単離された核酸分子を包含するベクター、該組換えベクターで遺伝子的に工作されている宿主細胞、および当該技術分野で公知であるところの組換え技術による本発明の最低１種の抗体構築物の製造にもまた関する。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
【０１０６】
ポリヌクレオチドは、場合によっては、宿主中での増殖のための選択可能なマーカーを含有するベクターに結合し得る。一般に、プラスミドベクターはリン酸カルシウム沈殿のような沈殿物中で若しくは荷電した脂質との複合体で導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してそれをｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングし得、そしてその後宿主細胞に移入し得る。
【０１０７】
ＤＮＡ挿入物は適切なプロモーターに効果的に連結すべきである。発現構築物は、転写開始、終止のための部位、および転写された領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することができる。該構築物により発現される成熟転写物のコーディング部分は、好ましくは、始めの翻訳開始、および翻訳されるべきｍＲＮＡの端に適切に配置された終止コドン（例えばＵＡＡ、ＵＧＡ若しくはＵＡＧ）を包含することができ、ＵＡＡおよびＵＡＧが哺乳動物若しくは真核生物細胞発現に好ましい。
【０１０８】
発現ベクターは、好ましくは、しかし場合によっては最低１種の選択可能なマーカーを包含することができる。こうしたマーカーは、限定されるものでないが、真核生物培養物についてメトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；同第４，６５６，１３４号；同第４，９５６，２８８号；同第５，１４９，６３６号；同第５，１７９，０１７号明細書、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ミコフェノール酸若しくはグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号明細書）耐性、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌若しくは原核生物中で培養するためのテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性遺伝子を挙げることができる（上の特許はここに引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）。上述された宿主細胞の適切な培地および培養条件は当該技術分野で既知である。適するベクターは当業者に容易に明らかであろう。宿主細胞中へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染若しくは他の既知の方法により遂げることができる。（こうした方法は当該技術分野すなわちＳａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１〜４および１６〜１８章；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１、９、１３、
１５、１６章に記述されている。）
【０１０９】
本発明の最低１種の抗体は、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして、分泌シグナルのみならず、しかしまた付加的な異種機能領域も包含し得る。例えば、付加的なアミノ酸、とりわけ荷電したアミノ酸の一領域を抗体のＮ末端に付加して、精製の間若しくはその後の取扱および保存の間の宿主細胞中での安定性および持続性を改良し得る。また、ペプチド部分を本発明の抗体に付加して精製を容易にし得る。こうした領域は抗体若しくはその最低１フラグメントの最終精製の前に除去し得る。（こうした方法は多くの標準的実験室手引書、すなわちＳａｍｂｒｏｏｋ、上記；第１７．２９−１７．４２および１８．１−１８．７４章；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１６、１７および１８章に記述されている。）
【０１１０】
当業者は、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系を知っている。あるいは、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含有する宿主細胞において（操作により）スイッチを入れることにより宿主細胞中で発現させ得る。（こうした方法は、例えば米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号および同第５，７３３，７６１号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり当該技術分野で公知である。）
【０１１１】
抗体、それらの指定される部分若しくはバリアントの製造に有用な細胞培養物の具体的説明は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、しばしば細胞の単層の形態にあることができるとは言え、哺乳動物細胞懸濁液若しくはバイオリアクターもまた使用し得る。無傷のグリコシル化タンパク質を発現することが可能な多数の適する宿主細胞株が当該技術分野で開発されており、そして、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサス（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である、ＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）およびＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６）細胞株、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などを包含する。好ましい宿主細胞は、骨髄腫およびリンパ腫細胞のようなリンパ系起源の細胞を包含する。とりわけ好ましい宿主細胞はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８０）およびＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１８５１）である。とりわけ好ましい一態様において、組換え細胞はＰ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３若しくはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である。
【０１１２】
これらの細胞の発現ベクターは、限定されるものでないが、複製起点；プロモーター（例えば後期若しくは初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；同第５，３８５，８３９号明細書）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号明細書）、最低１種のヒト免疫グロブリンプロモーター；エンハンサー、および／若しくはリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えばＳＶ４０ラージＴ ＡｇポリＡ付加部位）のようなプロセシング情報部位、ならびに転写終止配列を挙げることができる発現制御配列の１種若しくはそれ以上を包含し得る。例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい。）本発明の核酸若しくはタンパク質の産生に有用な他の細胞は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの細胞株およびハイブリドーマカタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）または他の既知の若しくは商業的供給源から既知かつ／若
しくは入手可能である。
【０１１３】
真核生物宿主細胞を使用する場合、ポリアデニル化若しくは転写終止配列が典型的にベクター中に組み込まれる。終止配列の一例はウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列もまた包含され得る。スプライシング配列の一例はＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３−７８１ １９８３）。加えて、宿主細胞中で複製を制御するための遺伝子配列を、当該技術分野で既知のとおり、ベクターに組み込み得る。
【０１１４】
Ｊ．抗体構築物のクローン化および哺乳動物細胞中での発現
典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する最低１種のプロモーター要素、抗体コーディング配列、ならびに転写の終止および転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルを含有する。付加的な要素は、エンハンサー、コザック配列、ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位により隣接される介在配列を包含する。高効率の転写はＳＶ４０からの初期および後期プロモーター、レトロウイルス、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターで達成し得る。しかしながら細胞要素もまた使用し得る（例えばヒトアクチンプロモーター）。本発明の実施における使用に適する発現ベクターは、例えば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ若しくはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）若しくはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬおよびＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン・ウプサラ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）ならびにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターを包含する。使用し得る哺乳動物宿主細胞は、ヒトＨｅｌａ ２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １、Ｃｏｓ ７およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を包含する。
【０１１５】
あるいは、該遺伝子は染色体に組込まれた遺伝子を含有する安定細胞株で発現し得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン若しくはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーとのコトランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０１１６】
トランスフェクトされた遺伝子は、大量のコードされた抗体を発現するようにまた増幅もし得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカーは、数百若しくはなお数千コピーの目的の遺伝子を運搬する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカーは酵素グルタミン合成酵素（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２７：２７７−２７９ １９９１；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１０：１６９−１７５ １９９２）。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そして最高の耐性を伴う細胞を選択する。これらの細胞株は染色体中に組込まれた増幅された遺伝子（１種若しくは複数）を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞がしばしば抗体の製造に使用される。
【０１１７】
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７ １９８５）およびＣＭＶ−エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ １９８５）を含有する。例えば制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８を含むマルチクローニング部位が目的の遺伝子のクローニングを容易にする。該ベクターは、３’イントロンに加え、ラットプレプロインスリン遺伝子のポリ
アデニル化および終止シグナルを含有する。
【０１１８】
Ｋ．ＣＨＯ細胞中でのクローニングおよび発現
ベクターｐＣ４を抗体構築物の発現に使用しうる。プラスミドｐＣ４はプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の派生物である。該プラスミドはＳＶ４０初期プロモーターの制御下にマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。これらのプラスミドでトランスフェクトされている、ジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣若しくは他の細胞を、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地（例えばα−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲイタースバーグ）中で該細胞を増殖させることにより選択し得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性の細胞中でのＤＨＦＲ遺伝子の増幅は十分に報告されている（例えばＦ．Ｗ．Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０ １９７８；Ｊ．Ｌ．ＨａｍｌｉｎとＣ．Ｍａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０９７：１０７−１４３ １９９０；およびＭ．Ｊ．ＰａｇｅとＭ．Ａ．Ｓｙｄｅｎｈａｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８ １９９１を参照されたい）。増大する濃度のＭＴＸ中で増殖された細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することにより該薬物に対する耐性を発生させる。第二の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結されている場合、それは通常共増幅かつ過剰発現される。このアプローチを使用して１，０００コピー以上の増幅された遺伝子（１種若しくは複数）を運搬する細胞株を開発し得ることが当該技術分野で既知である。その後、メトトレキセートを除去する場合に、宿主細胞の１種若しくはそれ以上の染色体に組込まれた増幅された遺伝子を含有する細胞株が得られる。
【０１１９】
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７ １９８５）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ １９８５）を含有する。プロモーターの下流に遺伝子の組込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８制限酵素切断部位がある。これらのクローニング部位の後に、該プラスミドは、３’イントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化部位を含有する。他の高効率プロモーター、例えばヒトｂ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期若しくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス、例えばＨＩＶおよびＨＴＬＶＩからの末端反復配列もまた発現に使用し得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系および類似の系を使用して、改変抗体構築物を哺乳動物細胞中で調節された様式で発現させ得る（Ｍ．ＧｏｓｓｅｎとＨ．Ｂｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１ １９９２）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のため、例えばヒト成長ホルモン若しくはグロビンからの他のシグナル遺伝子を同様に使用し得る。染色体中に組込まれた目的の遺伝子を運搬する安定細胞株もまた、ｇｐｔ、Ｇ４１８若しくはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーとのコトランスフェクションに際して選択し得る。最初に１種以上の選択可能なマーカー、例えばＧ４１８およびメトトレキサートを使用することが有利である。
【０１２０】
プラスミドｐＣ４を制限酵素で消化し、そしてその後、当該技術分野で既知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。該ベクターをその後１％アガロースゲルから単離する。
【０１２１】
例えば、本発明の改変抗体構築物のＨＣおよびＬＣ可変領域に対応する、配列番号７および８に提示されるところの完全な改変抗体構築物をコードするＤＮＡ配列を、既知の方法段階に従って使用する。適するヒト定常領域（すなわちＨＣおよびＬＣ領域）をコードする単離された核酸もまた本構築物で使用する。
【０１２２】
単離された可変および定常領域をコードするＤＮＡ配列ならびに脱リン酸化したベクターをその後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１若しくはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞をその後形質転換し、そして、例えば制限酵素分析を使用して、プラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含有する細菌を同定する。
【０１２３】
活性のＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、０．５□ｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏとともにリポフェクションを使用してコトランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは、優勢な選択可能なマーカー、すなわちＧ４１８を包含する抗生物質の一群に対する耐性を賦与する酵素をコードするＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子を含有する。該細胞を、１μｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したα−ＭＥＭに接種する。２日後に細胞をトリプシン処理し、そして、１０、２５若しくは５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１μｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したα−ＭＥＭ中でハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に接種する。約１０〜１４日後に、単一クローンをトリプシン処理し、そしてその後、異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して６ウェルペトリ皿若しくは１０ｍｌフラスコに接種する。最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンをその後、なおより高濃度のメトトレキサート（１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含有する新たな６ウェルプレートに移す。１００〜２００ｍＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで、同一の手順を反復する。所望の遺伝子産物の発現を、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット、若しくは逆相ＨＰＬＣ分析により分析する。
【０１２４】
Ｌ．抗体の精製
改変抗体構築物は、限定されるものでないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを挙げることができる公知の方法により、組換え細胞培養物から回収かつ精製し得る。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）もまた精製に使用し得る。（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、若しくはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９７−２００１、第１、４、６、８、９、１０章（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
【０１２５】
Ｊ．利用性
本発明の単離された核酸は、細胞、組織、器官若しくは動物（哺乳動物およびヒトを包含する）での効果を測定する、限定されるものでないが免疫障害若しくは疾患、心血管系障害若しくは疾患、感染性、悪性および／若しくは神経学的障害若しくは疾患、アレルギー性障害若しくは疾患；皮膚障害若しくは疾患；血液学的障害若しくは疾患；ならびに／または肺障害若しくは疾患、あるいは他の既知の若しくは指定される状態の最低１種から選択される最低１種の状態の発生を診断、監視、調節、処置、軽減、予防することを助ける、またはそれらの症状を低下させるのに使用し得る、最低１種の抗体構築物若しくはその指定されるバリアントの製造に使用し得る。
【０１２６】
こうした方法は、最低１種の改変抗体構築物を含んでなる組成物若しくは製薬学的組成物の有効量を、症状、効果若しくは機構のこうした調節、処置、軽減、予防若しくは低下の必要な細胞、組織、器官、動物若しくは患者に投与することを含み得る。該有効量は、本明細書に記述されるか若しくは関連技術分野で既知のところの既知の方法を使用して行
われかつ測定されるところの、単一（例えばボーラス）、複数若しくは連続投与あたり約０．００１ないし５００ｍｇ／ｋｇの、または単一、複数若しくは連続投与あたり０．０１〜５０００μｇ／ｍｌ血清濃度、あるいはその中のいずれかの有効な範囲若しくは値の血清濃度を達成するための量を含み得る。
【０１２７】
Ｋ．改変抗体構築物組成物
本発明はまた、天然に存在しない組成物、混合物若しくは形態で提供される、本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところの、最低１、最低２、最低３、最低４，最低５、最低６若しくはそれ以上のそれらの抗体を含んでなる、最低１種の抗体構築物組成物もまた提供する。こうした組成物は、製薬学的に許容できる担体とともに本発明の最低１種の改変抗体を含んでなる、天然に存在しない組成物を含んでなる。こうした抗体構築物組成物は、４０〜９９％からのどこかの本発明の改変抗体構築物を包含し得る。こうした組成物のパーセントは、当該技術分野で既知若しくは本明細書に記述されるところの、液体若しくは乾燥溶液、混合物、懸濁液、乳液若しくはコロイドとして重量、容量、濃度、モル濃度若しくは重量モル濃度である。
【０１２８】
本発明の改変抗体構築物または指定される部分若しくはバリアントの組成物は、限定されるものでないが希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、補助物質などを挙げることができるいずれかの適する補助物質の最低１種をさらに含み得る。製薬学的に許容できる補助物質が好ましい。こうした滅菌溶液の制限しない例および製造方法は当該技術分野で公知である；（Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．ペンシルバニア州イーストン １９９０。）当該技術分野で公知若しくは本明細書に記述されるところの、改変抗体構築物組成物の投与様式、溶解性および／若しくは安定性に適する製薬学的に許容できる担体は慣例に選択し得る。
【０１２９】
本組成物で有用な製薬学的賦形剤および添加物は、単独で若しくは組合せで１〜９９．９９重量若しくは容量％を含んでなる、単独で若しくは組合せで存在し得る、限定されるものでないがタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、ならびに炭水化物（例えば、単糖、二、三、四およびオリゴ糖を包含する糖；アルジトール、アルドン酸のような誘導体化糖、エステル化糖など；ならびに多糖若しくは糖ポリマー）を挙げることができる。例示的タンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを包含する。緩衝能力においてもまた機能し得る代表的アミノ酸／改変抗体構築物または指定された部分若しくはバリアントの成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどを包含する。好ましい１アミノ酸はグリシンである。
【０１３０】
本発明での使用に適する炭水化物賦形剤は、例えば、果糖、麦芽糖、ガラクトース、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、ソルボースなどのような単糖；乳糖、ショ糖、トレハロース、セロビオースなどのような二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどのような多糖；およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルチトール）、ミオイノシトールなどのようなアルジトールを包含する。本発明での使用に好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロースおよびラフィノースである。
【０１３１】
改変抗体構築物組成物は緩衝剤若しくはｐＨ調節剤もまた包含し得；典型的には、緩衝剤は有機酸若しくは塩基から調製される塩である。代表的緩衝剤は、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸若しくはフタル酸の塩のような有機
酸の塩；トリス、塩酸トロメタミン若しくはリン酸緩衝剤を包含する。本組成物中での使用に好ましい緩衝剤はクエン酸塩のような有機酸の塩である。
【０１３２】
加えて、本発明の改変抗体構築物または指定される部分若しくはバリアントの組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）（例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン）、ポリエチレングリコールのようなポリマー賦形剤／添加物、着香料、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば「ＴＷＥＥＮ ２０」および「ＴＷＥＥＮ ８０」のようなポリソルベート）、脂質（例えばリン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えばコレステロール）、ならびにキレート剤（例えばＥＤＴＡ）を包含し得る。
【０１３３】
本発明の改変抗体構築物組成物での使用に適するこれらおよび付加的な既知の製薬学的賦形剤および／若しくは添加物は当該技術分野で既知である、（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ、１９９５；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ、ニュージャージー州モントベール １９９８（それらの開示は引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）に列挙されるとおり。）好ましい担体若しくは賦形剤物質は、炭水化物（例えば糖およびアルジトール）ならびに緩衝剤（例えばクエン酸塩）若しくはポリマー剤である。
【０１３４】
Ｌ．製剤
上に示されたとおり、本発明は、製薬学的に許容できる製剤中に最低１種の改変抗体構築物を含んでなる、製薬学的若しくは家畜の使用に適する、好ましくは生理的食塩水若しくは選ばれた塩を含むリン酸緩衝液ならびに保存された溶液である安定な製剤、および保存剤を含有する製剤、ならびに複数回使用の保存される製剤を提供する。保存される製剤は、最低１種の既知の、または最低１種のフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール若しくはそれらの混合物よりなる群から場合によっては選択される保存剤を水性希釈剤中に含有する。限定されるものでないが０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９またはその中のいずれかの範囲若しくは値を挙げることができる、０．００１〜５％またはその中のいずれかの範囲若しくは値のような、当該技術分野で既知のところのいかなる適する濃度若しくは混合物も使用し得る。制限しない例は、保存剤なし、０．１〜２％ｍ−クレゾール（例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．９、１．０％）、０．１〜３％ベンジルアルコール（例えば０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、０．００１〜０．５％チメロサール（例えば０．００５、０．０１）、０．００１〜２．０％フェノール（例えば０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５〜１．０％アルキルパラベン（１種若しくは複数）（例えば０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などを包含する。
【０１３５】
上に示されたとおり、本発明は、包装資材、ならびに、場合によっては水性希釈剤中の処方された緩衝剤および／若しくは保存剤とともに最低１種の改変抗体構築物の溶液を含んでなる最低１本のバイアルを含んでなる製品を提供し、前記包装資材は、こうした溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間若しくはそれ以上の期間にわたり保持し得ることを示すラベルを含んでなる。本発明はさらに、包装資材、凍結乾燥された最低１種の改変抗体構築物を含んでなる第一のバイアル、および処方された緩衝剤若しくは保存剤の水性希釈剤を含んでなる第二のバイアルを含んでなる製品を含んでなり、前記包装資材は、該最低１種の改変抗体構築物を該水性希釈剤中で再構成して２４時間若しくはそれ以上の期間にわたり保持し得る溶液を形成することを患者に指示するラベルを含んでなる。
【０１３６】
本発明の製品中の最低１種の改変抗体構築物の範囲は、再構成に際して、水分を含む／乾燥系での場合に約１．０μｇ／ｍｌから約１０００ｍｇ／ｍｌまでの濃度を生じる量を包含するとは言え、より低いおよびより高い濃度が操作可能であり、そして、意図される送達ベヒクルに依存し、例えば溶液製剤は経皮貼付剤、肺、経粘膜、または浸透圧若しくは微小ポンプ法と異なることができる。
【０１３７】
好ましくは、該水性希釈剤は、場合によっては製薬学的に許容できる保存剤をさらに含んでなる。好ましい保存剤は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール若しくはそれらの混合物よりなる群から選択されるものを包含する。該製剤中で使用される保存剤の濃度は抗菌効果を生じるのに十分な濃度である。こうした濃度は選択される保存剤に依存し、そして当業者により容易に決定される。
【０１３８】
他の賦形剤、例えば等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存増強剤を、場合によってはかつ好ましくは希釈剤に添加し得る。グリセリンのような等張剤が既知濃度で一般に使用される。生理学的に耐えられる緩衝剤を、好ましくは改良されたｐＨ制御を提供するように添加する。該製剤は、約ｐＨ４から約ｐＨ１０までのような広範なｐＨ、および約ｐＨ５から約ｐＨ９までの好ましい範囲、ならびに約６．０ないし約８．０の最も好ましい範囲を包括し得る。好ましくは、本発明の製剤は約６．８と約７．８の間のｐＨを有する。好ましい緩衝剤は、リン酸緩衝液、最も好ましくはリン酸ナトリウム、とりわけリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を包含する。
【０１３９】
Ｔｗｅｅｎ ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、ＴＷＥＥＮ ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）およびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような製薬学的に許容できる可溶化剤、あるいはポリソルベート２０若しくは８０またはポロキサマー１８４若しくは１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｒ）ポリル、他のブロックコポリマーのような非イオン性界面活性剤、ならびにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡのようなキレート剤のような他の添加物を、凝集を低下させるために製剤若しくは組成物に場合によっては添加し得る。これらの添加物は、ポンプ若しくはプラスチック容器を使用して該製剤を投与する場合にとりわけ有用である。製薬学的に許容できる界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を緩和する。
【０１４０】
本発明の製剤は、最低１種の抗体構築物、ならびにフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール若しくはそれらの混合物よりなる群か
ら選択される保存剤を水性希釈剤中で混合することを含んでなる方法により製造し得る。最低１種の抗体構築物および保存剤を水性希釈剤中で混合することは、慣習的溶解および混合手順を使用して実施する。適する製剤を製造するために、例えば、緩衝溶液中の測定した量の最低１種の抗体構築物を、該タンパク質および保存剤を所望の濃度で提供するのに十分な量で緩衝溶液中で所望の保存剤と組み合わせる。この方法の変形物が当業者により認識されるであろう。例えば、成分を添加する順序、付加的な添加物を使用するかどうか、製剤を製造する温度およびｐＨは、全部、使用される濃度および投与手段について至適化し得る因子である。
【０１４１】
特許請求される製剤は、澄明な溶液として、または、水、保存剤および／若しくは賦形剤、好ましくはリン酸緩衝液ならびに／若しくは生理的食塩水および選ばれた塩を水性希釈剤中に含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された最低１種の抗体構築物のバイアルを含んでなる二本のバイアルとして、患者に提供し得る。単一溶液バイアル若しくは再構成を必要とする二本のバイアルのいずれも複数回再使用し得、そして単一若しくは複数周期の患者処置に十分であり得、そして従って現在利用可能よりも便宜的な処置レジメンを提供し得る。
【０１４２】
本特許請求される製品は、即座ないし２４時間若しくはそれ以上の期間にわたる投与に有用である。従って、現在特許請求される製品は患者に大きな利点を提供する。本発明の製剤は、場合によっては、約２℃から約４０℃までの温度で安全に保存し得、かつ、タンパク質の生物学的活性を長期間保持し得、従って、該溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２若しくは９６時間またはそれ以上の期間にわたり保持かつ／若しくは使用し得ることを示す包装ラベルを可能にする。保存される希釈剤を使用する場合、こうしたラベルは１〜１２か月、半年、１年半および／若しくは２年までの使用を包含し得る。
【０１４３】
本発明における最低１種の改変抗体構築物の溶液は、最低１種の抗体を水性希釈剤中で混合することを含んでなる方法により製造し得る。混合することは慣習的溶解および混合手順を使用して実施する。適する希釈剤を調製するため、例えば、水若しくは緩衝剤中の測定した量の最低１種の抗体を、該タンパク質および場合によっては保存剤若しくは緩衝剤を所望の濃度で提供するのに十分な量で組み合わせる。この方法の変形物が当業者により認識されるであろう。例えば、成分を添加する順序、付加的な添加物を使用するかどうか、製剤を製造する温度およびｐＨは、全部、使用される濃度および投与手段について至適化し得る因子である。
【０１４４】
特許請求される製品は、澄明な溶液として、または水性希釈剤を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された最低１種の抗改変抗体構築物のバイアルを含んでなる二本のバイアルとして患者に提供し得る。単一の溶液バイアル若しくは再構成を必要とする二本のバイアルのいずれも複数回再使用し得、かつ、単一若しくは複数周期の患者処置に十分であり得、そして従って現在利用可能よりも便宜的な処置レジメンを提供する。
【０１４５】
特許請求される製品は、薬局、診察室、若しくは他のこうした施設（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）および施設（ｆａｃｉｌｉｔｙ）に澄明な溶液、若しくは水性希釈剤を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された最低１種の改変抗体構築物のバイアルを含んでなる二本のバイアルを提供することにより、患者に間接的に提供し得る。この場合の澄明な溶液は大きさが１リットルまでもしくはなおより大きくあり得、それから最低１種の抗体溶液のより小さな部分をより小さいバイアルへの移動のため１回若しくは複数回取得しかつ薬局若しくは診療所によりそれらの顧客および／若しくは患者に提供し得る大型リザーバを提供する。
【０１４６】
これらの単一バイアル系を含んでなる認識される装置は、例えばＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｅｎｓｅｎ（ニュージャージー州フランクリンレイクス、ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（スイス・ブルクドルフ、ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ；Ｂｉｏｊｅｃｔ、オレゴン州ポートランド（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ（英国ピータースボロ、ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ Ｃｏｒｐ（ミネソタ州ミネアポリス、ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）により作成若しくは開発されるところの、ＢＤ Ｐｅｎ、ＢＤ Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（Ｒ）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（Ｒ）、ＮｏｖｏＰｅｎ（Ｒ）、Ｂ−Ｄ（Ｒ）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（Ｒ）およびＯｐｔｉＰｅｎ（Ｒ）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（Ｒ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ Ｐｅｎ（Ｒ）、Ｈｕｍａｔｒｏ Ｐｅｎ（Ｒ）、Ｒｅｃｏ−Ｐｅｎ（Ｒ）、Ｒｏｆｅｒｏｎ Ｐｅｎ（Ｒ）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（Ｒ）、ｉｊｅｃｔ（Ｒ）、Ｊ−ｔｉｐ Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ｒ）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（Ｒ）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ（Ｒ）のような溶液の送達のためのペン注入器装置を包含する。二本のバイアル系を含んでなる認識される装置は、ＨｕｍａｔｒｏＰｅｎ（Ｒ）のような再構成した溶液の送達のためのカートリッジ中で凍結乾燥した薬物を再構成するためのペン注入器装置を包含する。
【０１４７】
現在特許請求される製品は包装資材を包含する。包装資材は、規制当局により要求される情報に加え、該製品を使用し得る条件を提供する。本発明の包装資材は、２本のバイアルの水分を含む／乾燥生成物について、該最低１種の抗改変抗体構築物を水性希釈剤中で再構成して溶液を形成しかつ２〜２４時間若しくはそれ以上の時間にわたり該溶液を使用するための患者に対する説明書を提供する。単一バイアルの溶液製品について、該ラベルは、こうした溶液を２〜２４時間若しくはそれ以上の時間にわたり使用し得ることを示す。現在特許請求される製品はヒトの製薬学的生成物の使用に有用である。
【０１４８】
本発明の製剤は、最低１種の改変抗体構築物および選択された緩衝液、好ましくは生理的食塩水若しくは選ばれた塩を含有するリン酸緩衝液を混合することを含んでなる方法により製造し得る。最低１種の抗体および緩衝剤を水性希釈剤中で混合することは、慣習的溶解および混合手順を使用して実施する。適する製剤を製造するため、例えば、水若しくは緩衝液中の測定した量の最低１種の抗体を、該タンパク質および緩衝剤を所望の濃度で提供するのに十分な量で水中で所望の緩衝剤と組み合わせる。本方法の変形物が当業者により認識されるであろう。例えば、成分を添加する順序、付加的な添加物を使用するかどうか、製剤を製造する温度およびｐＨは、全部、使用される濃度および投与手段について至適化し得る因子である。
【０１４９】
特許請求される安定なすなわち保存される製剤は、澄明な溶液として、または保存剤若しくは緩衝剤および賦形剤を水性溶液中に含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された最低１種の抗改変抗体構築物のバイアルを含んでなる二本のバイアルとして患者に提供し得る。単一の溶液バイアル若しくは再構成を必要とする二本のバイアルのいずれも複数回再使用し得、かつ、単一若しくは複数周期の患者処置に十分であり得、そして従って現在利用可能よりも便宜的な処置レジメンを提供する。
【０１５０】
本明細書に記述される安定なすなわち保存される製剤または溶液のいずれか中の最低１種の改変抗体構築物は、ＳＣ若しくはＩＭ注入；経皮、肺、経粘膜、植込物、浸透圧ポンプ、カートリッジ、微小ポンプ、若しくは当該技術分野で公知のところの当業者により認識される他の手段を包含する多様な送達方法を介して、本発明により患者に投与し得る。
【０１５１】
Ｍ．治療的応用
本発明は、本発明の最低１種の改変抗体構築物を使用する、当該技術分野で既知の若しくは本明細書に記述されるところの細胞、組織、器官、動物若しくは患者における疾患の調節若しくは処置方法もまた提供する。
【０１５２】
本発明は、限定されるものでないが肥満、免疫関連疾患、心血管系疾患、感染性疾患、悪性疾患若しくは神経学的疾患の最低１種を挙げることができる、細胞、組織、器官、動物若しくは患者における最低１種の疾患の調節若しくは処置方法もまた提供する。
【０１５３】
典型的には、病理学的状態の処置は、該組成物に含有されるの比活性に依存して、平均して用量あたり患者１キログラムあたり最低約０．０１から５００ミリグラムまでの範囲の最低１種の抗サンティボディ（Ｓａｎｔｉｂｏｄｙ）、および好ましくは単一若しくは複数回投与あたり患者１キログラムあたり最低約０．１から１００ミリグラムまでの改変抗体構築物に合計でなる最低１種の改変抗体構築物組成物の有効量若しくは投薬量を投与することにより遂げられる。あるいは、有効血清濃度は単一若しくは複数回投与あたり０．１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を含み得る。適する投薬量は医学実務者に既知であり、そしてもちろん、特定の疾患状態、投与されている組成物の比活性、および処置を受けている特定の患者に依存することができる。いくつかの場合には、所望の治療量を達成するために、反復投与、すなわち、所望の１日用量若しくは効果が達成されるまで個々の投与を反復する特定のモニター若しくは計量された用量の反復個別投与を提供することが必要であり得る。
【０１５４】
好ましい用量は、場合によっては、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／投与、またはそのいずれかの範囲、値若しくは画分、あるいは、単一若しくは複数回投与あたり０．１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度またはそのいずれかの範囲、値若しくは画分の血清濃度を達成するためを包含し得る。
【０１５５】
あるいは、投与される投薬量は、特定の剤の薬力学的特徴ならびにその投与様式および経路；受領者の齢、健康状態および重量；症状の性質および程度、付随する処置の種類、処置の頻度、ならびに所望の効果のような既知の因子に依存して変動し得る。通常、有効成分の投薬量は体重１キログラムあたり約０．１ないし１００ミリグラムであり得る。投与あたり若しくは徐放形態物中で通常１キログラムあたり０．１ないし５０、および好ましくは０．１ないし１０ミリグラムが、所望の結果を得るのに有効である。
【０１５６】
内的投与に適する投薬形態物（組成物）は、一般に、単位若しくは容器あたり約０．１ミリグラムから約５００ミリグラムまでの有効成分を含有する。これらの製薬学的組成物中で、有効成分は通常、組成物の総重量に基づき約０．５〜９９．９９９重量％の量で存在することができる。
【０１５７】
非経口投与のためには、該抗体は、溶液、懸濁液、乳液、若しくは製薬学的に許容できる非経口ベヒクルを伴うか若しくは別個に提供される凍結乾燥粉末として処方し得る。こうしたベヒクルの例は、水、生理的食塩水、リンゲル液、Ｄ−ブドウ糖溶液、および１〜１０％ヒト血清アルブミンである。リポソーム、および不揮発性油のような非水性ベヒクルもまた使用し得る。ベヒクル若しくは凍結乾燥粉末は、等張性（例えば塩化ナトリウム、マンニトール）ならびに化学的安定性（例えば緩衝剤および保存剤）を維持する添加物を含有し得る。該製剤は既知の若しくは適する技術により滅菌する。
【０１５８】
適する製薬学的担体は、この分野の標準的参照教科書、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａ．Ｏｓｏｌの最新版に記述されている。
【０１５９】
本発明を全般的に記述したので、それは、具体的説明として提供されかつ制限するとして意図していない以下の実施例を参照して、より容易に理解されるであろう。
【実施例１】
【０１６０】
改変抗体の製造
改変Ａｂをコードする遺伝子は、ａ）ＩｇＧ１，ｋ ＡｂのＶＨおよびＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を同一ＡｂのＶＬおよびＣＬドメインをコードするＤＮＡ配列で、ならびにｂ）同一ＡｂのＶＬおよびＣＬドメインをコードするＤＮＡ配列を同一ＡｂのＶＨおよびＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列で置換するため、ＰＣＲ増幅および組換えＤＮＡ技術を使用することにより製造した。
【０１６１】
ＶＬ−ＣＬ−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ ＨＣをコードするプラスミドを製造するため、元のＬＣ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐ３１２３を、ＡＴＧ翻訳開始コドンからシグナル配列、Ｖ、およびＣＬドメインまで伸長する７６５ｂｐのフラグメントを増幅したオーバーラップＰＣＲプロトコルで鋳型として使用した。該反応をプライミングするのに使用した下流のオリゴヌクレオチドは、Ｃｋコーディング配列の直後の天然に存在する翻訳終止コドンを、ＩｇＧ１ ＨＣヒンジ配列の最初の２３塩基をコードするＤＮＡ配列で置換するようにさらにはたらいた。元のＨＣ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐ３１２２をその後、ＣＬコーディング配列（上流のオリゴヌクレオチドプライマー中に組み込まれる）の最後の２２塩基、次いでヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする配列を包含した７１５ｂｐのフラグメントを増幅した第二のＰＣＲ反応で使用した。下流のオリゴヌクレオチドプライマーがＮｏｔＩ制限部位を提供した。該２種のＰＣＲ産物を、７６５ｂｐおよび７１５ｂｐの増幅産物、第一のＰＣＲ反応からの上流のオリゴヌクレオチドプライマー、および第二のＰＣＲ反応からの下流のオリゴヌクレオチドプライマーを含有した第三のＰＣＲ反応で効果的に結合した。増幅は、従って、それら双方が含有したオーバーラップ配列の２２ｂｐで交差アニーリングする２フラグメントに依存した。生じる増幅産物は長さが１４８０ｂｐであり、そしてＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限部位によりそれぞれ隣接されるＶＬ−ＣＬ−ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３をコードした。該増幅されたＤＮＡをＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてベクターｐ２１０６のＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位の間にクローン化して、新たなＨＣをコードする最終発現プラスミドｐ４０３４を形成した。ベクターｐ２１０６は、ＣＭＶ前初期プロモーター、およびＡＴＧ開始コドンの上流のイントロンＡ、ならびにＳＶ４０由来の転写終止配列を提供する。
【０１６２】
ＶＨ−ＣＨ１ ＬＣをコードするプラスミドを製造するため、元のＨＣ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐ３１２２を、ＡＴＧ翻訳開始コドンからシグナル配列、ＶおよびＣＨ１ドメインまで伸長する８０８ｂｐのフラグメントを増幅したオリゴヌクレオチドにプライミングされるＰＣＲ反応で鋳型として使用した。該増幅産物は、ＣＨ１ドメインのＣ末端のＤＫＫＶアミノ酸配列の直後に翻訳終止コドンを含有した。該オリゴヌクレオチドプライマーはまた、クローニングの目的上、ＡＴＧ開始コドンの上流のＸｂａＩ制限部位および終止コドンの下流のＮｏｔＩ制限部位も提供した。増幅されたＤＮＡをＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして切断されたＤＮＡをプラスミドベクターｐ２１０６のＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位の間にクローン化して、新たなＬＣをコードする最終発現プラスミドｐ４０３３を形成した。
【０１６３】
新たなＨＣおよび新たなＬＣプラスミドの共発現により改変Ａｂを製造するため、ヒトＨＥＫ ２９３細胞をリポフェクションによりプラスミドｐ４０３３およびｐ４０３４で一過性にトランスフェクトした。簡潔には、トランスフェクション前日に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させた細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、そして５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で一夜インキュベートした。翌日、１００μｌの無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ）に再懸濁した各１μｇのｐ４０３３およびｐ４０３４を１０μｌのリポフェクション試薬と混合し、そして室温で１０分間放置した。培地を細胞から吸引し、そして１０％ＦＢＳを含む新鮮ＤＭＥＭを添加した。インキュベーション後にＤＮＡ／リポフェクション試薬複合体を細胞に添加し、そして穏やかに回転させて混合し
た。抗体発現および分泌のための時間を可能にするための５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で７２時間のさらなるインキュベーション後に、細胞上清を収集しかつ遠心分離して細胞破片を除去した。
【０１６４】
細胞上清中の改変Ａｂの存在について試験するため、４種の異なる捕捉試薬を使用するＥＬＩＳＡアッセイを実施した。９６ウェルＥＩＡプレートを、ａ）ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ ＦｃフラグメントＡｂ、ｂ）元のＡｂのＶ領域に特異的なＣ５０８モノクローナルＡｂ、ｃ）元のＡｂのＶ領域のイディオタイプ部分（抗原結合）に特異的なＣ５８５モノクローナルＡｂ、ならびにｄ）Ｃ５０８およびＣ５８５と同一のアイソタイプ（マウスＩｇＧ２ｂｋ）の陰性対照モノクローナルＡｂいずれかで被覆した。被覆は０．０５Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５中で実施し、そして４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳ中１％ＢＳＡを使用してプレートをブロッキングした。ＨＥＫ ２９３細胞の一過性トランスフェクションからの細胞上清を連続希釈し、そしてブロッキングしたプレートに添加した。対照サンプルは、元の未改変Ａｂをコードするプラスミドｐ３１２２およびｐ３１２３で同時にトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３からの細胞上清、ならびに標準曲線を作成するのに使用した精製した元のＡｂを包含した。捕捉されたタンパク質を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ−γ抗体およびＴＭＢ基質を使用して検出した。発色反応を０．５Ｍ ＨＣｌで停止した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０１６５】
抗ヒトＩｇＧ ＦｃフラグメントＡｂを捕捉試薬として使用した場合に得られた陽性のＥＬＩＳＡシグナルは、改変ＨＣおよび改変ＬＣでトランスフェクトしていた細胞の上清中にＡｂ様分子が実際に存在したことを示した。ＨＣは、それらがＬＣと会合しない限り細胞から通常分泌されないため、この結果単独は、改変ＨＣおよびＬＣが相互と会合してＩｇＧ Ａｂに典型的な（ＨＬ）２の４本鎖複合体を形成したことをありそうにした。それはまた、改変ＡｂのＦｃドメイン上のエピトープが、ヤギ抗ヒトＦｃ Ａｂにより良好に認識されたことも示した。ヤギ抗ヒトＦｃ Ａｂが改変Ａｂおよび未改変Ａｂと等しく良好に反応したという仮定を使用すれば、元のＡｂの標準曲線を使用するＥＬＩＳＡデータからの計算は、改変Ａｂの発現レベル（約２．７μｇ／ｍｌ）が未改変Ａｂの発現レベル（約２．０μｇ／ｍｌ）に類似であることを示した。
【０１６６】
未改変のＡｂ標準由来の濃度を使用して、抗Ｖ領域Ａｂ Ｃ５０８およびＣ５８５への改変および未改変Ａｂサンプルの結合をタンパク質濃度に対しプロットした。該結果は、改変および未改変のＡｂによる結合が識別不可能であることが見出されたことを示した。これは、Ｃ５０８およびＣ５８５モノクローナルＡｂのＶ領域の結合部位が改変Ａｂで完全に保存されているかもしれないことを示唆している。
‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐
改変Ａｂ遺伝子を製造するのに使用したオリゴヌクレオチドプライマー−
【０１６７】
【化１】
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
本明細の一部分を形成する図面において、
【図１】細胞表面抗原および隣接細胞上のＦｃＲへのＡｂによる同時結合が、該抗原の移動性およびＡｂの向きによりどのように影響され得るかの図解である。
【図２】ＡｂのＨおよびＬ鎖の間の配列を交換することの効果を示す図である。Ｆｄ＝ＨＣのＶＨ−ＣＨ１ドメイン。
【図３】未改変Ａｂの関連するアミノ酸配列が、本発明の改変Ａｂにどのように比較しうるかを示す。アミノ酸は一文字記号で表す。ＨＣから発するアミノ酸は大文字で示し、また、ＬＣから発するアミノ酸は小文字で示す。「Ｘ」は鎖の交差の点に印を付ける。
【図４】未改変Ａｂ若しくは改変Ａｂいずれかを含有するトランスフェクトした細胞からの細胞上清を、未改変Ａｂ若しくは陰性対照Ａｂの抗原結合領域に特異的なｍＡｂ（Ｃ５０８若しくはＣ５８５）で被覆したプレートとともにインキュベートすることにより得られる結合データを示す。細胞上清中の未改変および改変Ａｂの濃度は、精製した未改変Ａｂを標準として用いる抗ヒトＦｃ ＥＬＩＳＡを使用して予め測定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨおよびＬ鎖を有する改変免疫グロブリン分子を含んでなるヘテロ二量体タンパク質結合組成物であって、１個若しくはそれ以上のＬ鎖ドメインが免疫グロブリンＨ鎖上の１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインの代わりに用いられており、そして／または、１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインが免疫グロブリン分子の免疫グロブリンＬ鎖上の１個若しくはそれ以上のＬ鎖ドメインの代わりに用いられている、上記組成物。
【請求項２】
ＶＬ−ＣＬ Ｌ鎖ドメインが、免疫グロブリンＨ鎖のＶＨ−ＣＨ１領域の代わりに用いられており、そして、Ｈ鎖のＶＨ−ＣＨ１ドメインが免疫グロブリンＬ鎖のＶＬ−ＣＬ Ｌ鎖領域の代わりに用いられている、請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子。
【請求項３】
免疫グロブリン分子がＩｇＧ１である、請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子。
【請求項４】
抗原結合領域をさらに含んでなる、請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子。
【請求項５】
免疫グロブリン分子が、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ若しくはＩｇＤ分子である、請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子。
【請求項６】
請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項８】
請求項８に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を培養すること、およびそのように産生された改変免疫グロブリン分子を回収することを含んでなる、改変免疫グロブリン分子の製造方法。
【請求項１０】
細胞が真核生物若しくは原核生物細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、哺乳動物、鳥類、は虫類、昆虫、植物、細菌、真菌若しくは酵母細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞が、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター若しくはウシ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ／０、ＨｅＬａ、他の骨髄腫細胞若しくはリンパ腫細胞、またはそれらのいずれかの誘導、不死化若しくは形質転換細胞から選択される最低１種である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子および製薬学的に許容できる担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物を被験体に投与することを含んでなる、被験体における感染症に対する処置若しくは保護方法。
【請求項１６】
請求項６に記載の単離された核酸および担体若しくは希釈剤を含んでなる核酸組成物。
【請求項１７】
ベクターが、後期若しくは初期ＳＶ４９０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ
ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ヒト免疫グロブリンプロモーター若しくはＥＦ−１αプロモーターよりなる群から選択される最低１個のプロモーターを含んでなる、請求項７に記載の抗体ベクター。
【請求項１８】
ベクターが、メトトレキサート（ＭＴＸ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ネオマイシン（Ｇ４１８）若しくはグルタミン合成酵素（ＧＳ）の最低１種から選択される最低１種の選択遺伝子若しくはその一部分を含んでなる、請求項７に記載の抗体ベクター。
【請求項１９】
改変免疫グロブリンが検出可能若しくは回収可能な量で発現されるような、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｓｉｔｕの条件下で、請求項６に記載の核酸またはそれにストリンジェント条件下でハイブリダイズする内因性核酸を翻訳することを含んでなる、請求項１に記載の改変免疫グロブリンの製造方法。
【請求項２０】
障害若しくは状態を調節する有効量の請求項１に記載の最低１種の改変免疫グロブリンを細胞、組織、器官若しくは動物と接触若しくはそれらに投与することを含んでなる、前記細胞、組織、器官若しくは動物における最低１種の障害若しくは状態の調節方法。
【請求項２１】
前記有効量が、前記細胞、組織、器官若しくは動物１キログラムあたり０．０１〜１００ｍｇである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記接触すること若しくは前記投与することが、静脈内、筋肉内、コーラス（ｃｏｌｕｓ）、皮下、呼吸、吸入、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される最低１様式による、請求項２０〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
水性希釈剤中に、請求項１に記載の最低１種の改変免疫グロブリン、および滅菌水、滅菌緩衝水から選択される最低１種、またはフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールよりなる群から選択される最低１種の保存剤若しくはそれらの混合物を含んでなる製剤。
【請求項２４】
改変免疫グロブリンの濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌないし約１００ｍｇ／ｍｌである、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
等張剤をさらに含んでなる、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
生理学的に許容できる緩衝剤をさらに含んでなる、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
第一の容器中の凍結乾燥された形態の請求項１に記載の最低１種の改変免疫グロブリン、および、水性希釈剤中の滅菌水、滅菌緩衝水、またはフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールよりなる群から選択される最低１種の保存剤若しくはそれらの混合物を含んでなる任意の第二の容器を含んでなる製剤。
【請求項２８】
請求項２４に記載の製剤をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、患者における疾患若しくは状態の処置方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の最低１種の改変免疫グロブリンの製造方法であって、前記抗体または指定される部分若しくはバリアントを回収可能な量で発現することが可能な宿主細胞若しくはトランスジェニック動物若しくはトランスジェニック植物若しくは植物細胞を提供することを含んでなる、上記方法。
【請求項３０】
宿主細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞若しくは酵母細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
トランスジェニック動物が哺乳動物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
トランスジェニック哺乳動物が、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ウマおよびヒト以外の霊長類から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１に記載の最低１種の抗体を発現するトランスジェニック動物若しくは植物。
【請求項３４】
請求項２９に記載の方法により製造された最低１種の改変免疫グロブリン。
【請求項３５】
ＡＤＣＣ、ＦｃＲ媒介性食作用および補体溶解のようなエフェクター機能を動員するＦｃＲ結合およびＣ１ｑ結合ドメインを有する免疫グロブリン分子の能力の改変方法であって、免疫グロブリンＨ鎖上の１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインの代わりに１個若しくはそれ以上のＬ鎖ドメインを用い、かつ／または免疫グロブリン分子の免疫グロブリンＬ鎖上の１個若しくはそれ以上のＬ鎖ドメインの代わりに１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインを用いて、それにより該免疫グロブリン分子の抗原結合ドメインに関してＦｃＲ結合およびＣ１ｑ結合ドメインの相対位置を新たに方向付けすることを含んでなる、上記方法。
【請求項１】
ＨおよびＬ鎖を有する改変免疫グロブリン分子を含んでなるヘテロ二量体タンパク質結合組成物であって、１個若しくはそれ以上のＬ鎖ドメインが免疫グロブリンＨ鎖上の１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインの代わりに用いられており、そして／または、１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインが免疫グロブリン分子の免疫グロブリンＬ鎖上の１個若しくはそれ以上のＬ鎖ドメインの代わりに用いられている、上記組成物。
【請求項２】
ＶＬ−ＣＬ Ｌ鎖ドメインが、免疫グロブリンＨ鎖のＶＨ−ＣＨ１領域の代わりに用いられており、そして、Ｈ鎖のＶＨ−ＣＨ１ドメインが免疫グロブリンＬ鎖のＶＬ−ＣＬ Ｌ鎖領域の代わりに用いられている、請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子。
【請求項３】
免疫グロブリン分子がＩｇＧ１である、請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子。
【請求項４】
抗原結合領域をさらに含んでなる、請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子。
【請求項５】
免疫グロブリン分子が、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ若しくはＩｇＤ分子である、請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子。
【請求項６】
請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項８】
請求項８に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を培養すること、およびそのように産生された改変免疫グロブリン分子を回収することを含んでなる、改変免疫グロブリン分子の製造方法。
【請求項１０】
細胞が真核生物若しくは原核生物細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、哺乳動物、鳥類、は虫類、昆虫、植物、細菌、真菌若しくは酵母細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞が、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター若しくはウシ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ／０、ＨｅＬａ、他の骨髄腫細胞若しくはリンパ腫細胞、またはそれらのいずれかの誘導、不死化若しくは形質転換細胞から選択される最低１種である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の改変免疫グロブリン分子および製薬学的に許容できる担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物を被験体に投与することを含んでなる、被験体における感染症に対する処置若しくは保護方法。
【請求項１６】
請求項６に記載の単離された核酸および担体若しくは希釈剤を含んでなる核酸組成物。
【請求項１７】
ベクターが、後期若しくは初期ＳＶ４９０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ
ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ヒト免疫グロブリンプロモーター若しくはＥＦ−１αプロモーターよりなる群から選択される最低１個のプロモーターを含んでなる、請求項７に記載の抗体ベクター。
【請求項１８】
ベクターが、メトトレキサート（ＭＴＸ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ネオマイシン（Ｇ４１８）若しくはグルタミン合成酵素（ＧＳ）の最低１種から選択される最低１種の選択遺伝子若しくはその一部分を含んでなる、請求項７に記載の抗体ベクター。
【請求項１９】
改変免疫グロブリンが検出可能若しくは回収可能な量で発現されるような、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｓｉｔｕの条件下で、請求項６に記載の核酸またはそれにストリンジェント条件下でハイブリダイズする内因性核酸を翻訳することを含んでなる、請求項１に記載の改変免疫グロブリンの製造方法。
【請求項２０】
障害若しくは状態を調節する有効量の請求項１に記載の最低１種の改変免疫グロブリンを細胞、組織、器官若しくは動物と接触若しくはそれらに投与することを含んでなる、前記細胞、組織、器官若しくは動物における最低１種の障害若しくは状態の調節方法。
【請求項２１】
前記有効量が、前記細胞、組織、器官若しくは動物１キログラムあたり０．０１〜１００ｍｇである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記接触すること若しくは前記投与することが、静脈内、筋肉内、コーラス（ｃｏｌｕｓ）、皮下、呼吸、吸入、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される最低１様式による、請求項２０〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
水性希釈剤中に、請求項１に記載の最低１種の改変免疫グロブリン、および滅菌水、滅菌緩衝水から選択される最低１種、またはフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールよりなる群から選択される最低１種の保存剤若しくはそれらの混合物を含んでなる製剤。
【請求項２４】
改変免疫グロブリンの濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌないし約１００ｍｇ／ｍｌである、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
等張剤をさらに含んでなる、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
生理学的に許容できる緩衝剤をさらに含んでなる、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
第一の容器中の凍結乾燥された形態の請求項１に記載の最低１種の改変免疫グロブリン、および、水性希釈剤中の滅菌水、滅菌緩衝水、またはフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールよりなる群から選択される最低１種の保存剤若しくはそれらの混合物を含んでなる任意の第二の容器を含んでなる製剤。
【請求項２８】
請求項２４に記載の製剤をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、患者における疾患若しくは状態の処置方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の最低１種の改変免疫グロブリンの製造方法であって、前記抗体または指定される部分若しくはバリアントを回収可能な量で発現することが可能な宿主細胞若しくはトランスジェニック動物若しくはトランスジェニック植物若しくは植物細胞を提供することを含んでなる、上記方法。
【請求項３０】
宿主細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞若しくは酵母細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
トランスジェニック動物が哺乳動物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
トランスジェニック哺乳動物が、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ウマおよびヒト以外の霊長類から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１に記載の最低１種の抗体を発現するトランスジェニック動物若しくは植物。
【請求項３４】
請求項２９に記載の方法により製造された最低１種の改変免疫グロブリン。
【請求項３５】
ＡＤＣＣ、ＦｃＲ媒介性食作用および補体溶解のようなエフェクター機能を動員するＦｃＲ結合およびＣ１ｑ結合ドメインを有する免疫グロブリン分子の能力の改変方法であって、免疫グロブリンＨ鎖上の１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインの代わりに１個若しくはそれ以上のＬ鎖ドメインを用い、かつ／または免疫グロブリン分子の免疫グロブリンＬ鎖上の１個若しくはそれ以上のＬ鎖ドメインの代わりに１個若しくはそれ以上のＨ鎖ドメインを用いて、それにより該免疫グロブリン分子の抗原結合ドメインに関してＦｃＲ結合およびＣ１ｑ結合ドメインの相対位置を新たに方向付けすることを含んでなる、上記方法。
【図３】
【図４】
【図１】
【図２】
【図４】
【図１】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５３１０４９（Ｐ２００８−５３１０４９Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５８０７３（Ｐ２００７−５５８０７３）
【出願日】平成１８年２月２４日（２００６．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００６４３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９３７９４
【国際公開日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２４日（２００６．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００６４３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９３７９４
【国際公開日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
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