サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを有する相乗量の初代細胞由来生物製剤と、少なくとも１種の抗原を有する癌ワクチンとを含む、癌を治療するための組成物。少なくとも１種のアジュバントと組み合わせた相乗量の初代細胞由来生物製剤を含む組成物。この組成物を投与することによって癌を治療する方法。免疫抑制を逆転させ、癌に対する免疫を獲得する方法。外因性抗原に対する免疫応答を生成させる方法。少なくとも１種のアジュバントと組み合わせた初代細胞由来生物製剤を投与することによって患者における免疫応答を増強し、初代細胞由来生物製剤とアジュバントの相乗的な相互作用によって患者の免疫応答を増強する方法。免疫系の機能を高める方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン免疫療法に関する。特に、本発明は、癌または他の抗原産生疾患状態もしくは病変を有する患者における内因性または外因性抗原に対する免疫応答を誘発および増強するためのならびにアジュバントに対する免疫応答を誘発および増強するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの癌は、宿主の免疫系に働きかけられた場合に、腫瘍退縮を引き起こし得る抗原を有することがますます明らかになってきた。これらの抗原は、血清学的アプローチと細胞免疫アプローチの両方によって定義され、これらのアプローチにより、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープの両方が定義された（Ｓａｈｉｎ，１９９７；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｙｎｄｅ，１９９７；Ｗａｎｇ，１９９９）。これらの結果に基づいて、腫瘍の退縮を誘導することが、癌の免疫療法の専門家の目標になった。しかしながら、歴史的に、成功した試みはたまにしか見られず、概して、頻度と程度はわずかである。
【０００３】
癌患者を（すなわち、腫瘍抗原に対して）免疫しようとする試みの基本的な問題は、担腫瘍状態が腫瘍と宿主免疫系障害の両方に由来する免疫抑制機構と関連していることであり（Ｋａｖａｎａｕｇｈ，１９９６）、そのために免疫が難しくなり、今日まで一貫して不可能である。免疫抑制または免疫枯渇は、免疫系の応答能力の低下を伴う。そのような抑制は、薬物によって誘導されるか（すなわち、薬物治療によるもの）、ウイルスによって誘導されるか（例えば、ＡＩＤＳに見られるもの）、または疾患状態（例えば、癌）によって誘導されることがある。この状態における免疫系は効果的に停止させられる。疾患状態（例えば、癌）の場合、身体は、それ自身を腫瘍抗原から防御することができず、そのため、腫瘍が増殖し、場合によっては転移することがある。
【０００４】
種々の腫瘍免疫戦略が開発されている。これらの戦略は全て複雑であり、感染性疾患に用いられる従来の免疫戦略から大きくかけ離れている（例えば、Ｗｅｂｅｒ，２０００を参照されたい）。１つのそのような腫瘍免疫戦略は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とコンジュゲートされ、かつＤＥＴＯＸ（登録商標）マイコバクテリウムアジュバントおよび低用量シクロホスファミドとともに投与される、シアリルＴｎ多糖ムチン抗原のＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）（Ｂｉｏｍｉｒａ）を含む（Ｍａｃｌｅａｎ，１９９６）。このワクチンを転移性乳癌および卵巣癌患者で使用しても、大きな臨床的応答（すなわち、５０％を超える腫瘍縮小）は、わずかな割合の患者でしか生じなかった。
【０００５】
ウイルス構築物を、腫瘍抗原を発現する遺伝子の発現ベクターとして用いて、遺伝子療法も試みられている。例えば、改変型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６およびＥ７タンパク質配列をコードする組換えワクシニアウイルス構築物が、子宮頸癌患者の免疫に用いられている。この構築物のワクチン接種では、臨床的応答が生じるかどうかがはっきりしなかった（Ｂｏｒｙｓｉｅｗｉｃｋｚ，１９９６）。組換えワクシニア−ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）構築物が前立腺癌患者でワクチンとして使用された、Ｓａｎｄａ（１９９９）を参照されたい。
【０００６】
別のアプローチは樹状細胞媒介性療法である。例えば、この療法では、樹状細胞に前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のオリゴペプチド断片がパルスされた。次に、（ＰＳＭＡ抗原で初回刺激されたまたは初回刺激されていない）樹状細胞が転移性前立腺癌患者に投与された。大きな臨床的応答は、わずかな割合の患者でしか得られなかった（Ｍｕｒｐｈｙ，１９９９；また、Ｔｊｏａ，２０００も参照されたい）。
【０００７】
さらに、悪性黒色腫を有する癌患者を免疫するために、自己腫瘍が低用量シクロホスファミドおよびＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌）とともに用いられている。しかしながら、臨床的応答はほとんど報告されてなかった（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ，１９９６）。別の戦略には、種々のワクチンアジュバントとともにＭＡＧＥ抗原を使用することが含まれた。やはり、これについても、悪性黒色腫を有する癌患者で、あるとしても、わずかな応答しか生じなかった（私信、Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｂｏｏｎ）。
【０００８】
Ｄｏｙｌｅらに対するいくつかの特許（米国特許第５，５０３，８４１号；同第５，８００，８１０号；同第６，０６０，０６８号；同第５，６４３，５６５号；および同第５，１００，６６４号）には、インターロイキン２（ＩＬ−２）を用いて患者の免疫応答を増強する方法が開示されている。この方法は、感染性疾患に対する使用について開示されており、免疫原性であることが知られている抗原を用いて主に機能する。応用が限られていることも実証された。上で開示されたように、癌の治療には、様々なアプローチが必要となることが知られている。これまで、ＩＬ−２を用いた治療では、２つの癌（腎細胞癌および悪性黒色腫）においてわずかな効果しか示されていない（応答率２０％未満）。ＩＬ−２を用いた治療は、一般に、頭頸部扁平上皮癌および子宮頸癌ならびに前立腺癌では効果がないと考えられている。したがって、この治療は、これらの用途には認められていない。
【０００９】
健康患者において構造が複雑でかつ分子量が大きい既知の「古典的」抗原を用いる予防ワクチンと、免疫抑制患者（通常成功しない）において腫瘍抗原またはペプチド（通常成功しない）を用いる治療ワクチン（通常成功しない）とを対比することは重要である。前者は容易であり、我々の現在のウイルスワクチンはその効力を立証している。後者は、３０年間の懸命な努力にもかかわらず、日常的には不可能に近い。
【００１０】
効果的な癌ワクチンは、事によっては、抗体産生に優先してでも、細胞性免疫を刺激する必要がある。述べたように、様々な抗原、アジュバントおよびワクチン構築物を用いた数々の研究にもかかわらず、これまでの臨床試験データは期待はずれであった。Ｔ細胞媒介性の抗癌免疫応答にとっての極めて重要な事象は、主に腫瘍または免疫の部位のリンパを集めるリンパ節におけるＴ細胞への抗原提示と、それに続くＴ細胞の活性化および末梢部位への遊走である。実際、組織マクロファージ、好中球および／または樹状細胞による抗原の取込みならびにリンパ節におけるＴ細胞へのＭＨＣクラスＩ抗原およびクラスＩＩ抗原と組み合わせたプロセッシングされたペプチドの提示は、完全な免疫応答にとって極めて重要である。Ｔ細胞免疫活性化を成功させる秘訣は、ワクチンに対する免疫応答を駆動するための適切なサイトカイン環境を、免疫部位と流入領域リンパ節の両方において作り出すことである。免疫系の作用機序がこれまで完全には理解されていないという事実のために、現在利用可能な癌ワクチンはその完全な潜在能力を達成することができない。
【００１１】
免疫応答の動力学には２つの段階が含まれる。第１の段階は、抗原および可溶性タンパク質を、初期の免疫活性化が起こるリンパ節に流入させることである。２４〜４８時間後、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（より具体的には、樹状細胞）が免疫の部位から流入領域リンパ管を経てリンパ節に遊走し、そこで、抗原提示および活性化の第２の波が生じる。より具体的には、ＡＰＣは、共刺激受容体およびＴ細胞受容体の関与を通じて、リンパ節内で前駆体Ｔヘルパー細胞と相互作用し、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞および／またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞を生じさせる。これらのサブセットの比率は、その後の細胞性免疫応答または液性（抗体）免疫応答のいずれかの発生を制御する（Ｔｈ１がＤＴＨ／細胞傷害性にバイアスをかけるのに対し、Ｔｈ２は抗体産生にバイアスをかける）。これらの活性化Ｔ細胞が誘導された後、免疫応答は低下し、主に、抗原に再び曝露されたときに応答することができるメモリーＴ細胞が残る。
【００１２】
この経路における極めて重要な事象は、応答にバイアスをかけて液性免疫または細胞性免疫の方向に向かわせるサイトカインによって媒介される。局所的に産生されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＩＬ−８）は、免疫系細胞の動員、抗原の取込み、樹状細胞の成熟、Ｔ調節性細胞活性の抑制、Ｔ細胞の教育および増殖、ならびにＴｈ１細胞の発生と関連している（Ｎａｙｌｏｒ，２００３）。応答の相互依存とは、複数のサイトカインが同時に存在することによって、異なるサイトカインに対する細胞応答の動力学に応じて、注射部位と流入領域リンパ節の両方で異なる効果が得られるように、任意の所与のサイトカインの活性が前駆事象の発生に依存していることを意味する。
【００１３】
従来のワクチンで十分な免疫応答を惹起することができないことは、未だワクチン開発の課題として残っている。そのため、ワクチン接種に対する免疫応答を加速、増強、および延長し、また、１回の投与に必要な抗原の量を減少させるための、アジュバントが開発されている。アジュバントは約１００年間使用されてきた。Ｌｅ ＭｏｉｇｎｉｃとＰｉｎｏｙは、鉱油に懸濁したネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が免疫応答を増強することを１９１６年に初めて認識した。１９２６年、Ｒａｍｏｎは、寒天、タピオカ、レシチン、デンプン油、サポニン、およびパンくずなどの広範な物質によって、抗毒素応答を強化することができることを実証し、Ｇｌｅｎｎｙは、アルミニウム塩を用いて、免疫原性を向上させるジフテリアトキソイドを沈殿させ、現在使用されているミョウバンを得た。１９３６年、ＴｈｉｂａｕｄとＲｉｃｈｏｕは、Ｑｕｉｌ Ａにアジュバント特性があることが明らかにした。Ｑｕｉｌ Ａは、南米モニラのシャボンノキであるキラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の樹皮から抽出されるトリテルペノイドサポニンである。１９３７年、Ｆｒｅｕｎｄはまた、エマルジョンからアジュバントを開発した。それ以来、ほとんど進歩していない。上記のような免疫系を理解し始めるにつれて、アジュバントに関してさらなる進歩が見られている。いくつかのアジュバントがワクチン（癌ワクチンを含む）用に開発されているが、依然としてミョウバンしか世界中で成功を収めていない。ミョウバンはＴｈ２アジュバントであるが、Ｔｈ１応答をもたらすアジュバントも望まれている。アジュバントは、とりわけ、免疫応答障害のために従来のワクチンに十分には応答しない人口集団（例えば、高齢者または免疫抑制患者）に必要とされる。アジュバントには免疫寛容を克服する可能性があるが、これまで、免疫寛容を克服するのに大きな成功を収めたものはない。それゆえ、癌を含む様々な疾患のための効果的なアジュバントが依然として必要とされている。
【００１４】
本発明は、患者（例えば、癌患者または他の抗原産生病変もしくは疾患状態を有する他の患者）を免疫しかつ／または免疫を増強するために、出願人に発行された米国特許第５，６３２，９８３号および同第５，６９８，１９４号に開示されているような初代細胞由来生物製剤ＩＲＸ−２（以前は天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ）としても知られていた）を利用している。より具体的には、ＩＲＸ−２は、年老いた免疫抑制マウスにおけるＴ細胞の発達および機能を促進するのに効果的であることが以前に米国特許第５，６９８，１９４号で示されている。ＩＲＸ−２は、胸腺において、未成熟Ｔ細胞の割合を減少させ、成熟Ｔ細胞の割合を増加させることが示された。ＩＲＸ−２は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、および微量のＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７を含んでいた。
【００１５】
本発明のサイトカイン組成物およびそれを利用する方法は、対象となる任意の抗原（例えば、癌または腫瘍抗原、および他の持続性疾患状態または病変によって産生される抗原）に対する免疫応答の刺激に適用されることが本明細書に詳述される開示から明白となるであろう。本明細書で詳述するように、本発明のサイトカイン混合物は、アジュバントとして作用して、好ましくは、インビボでＴ細胞免疫を刺激する。
【００１６】
さらに、本発明は、インビボに存在し、かつインビボでＡＰＣ（例えば、樹状細胞）によってプロセッシングされ、提示される内因性抗原（すなわち、タンパク質もしくはペプチド）か、またはインビトロで単離および作製され、その後、樹状細胞が存在し、抗原を、例えば、Ｔ細胞に効果的に提示することができる環境（例えば、リンパ節）にインビボで投与される外因性抗原（すなわち、タンパク質またはペプチド）のいずれかに対する免疫応答を誘発することに関するものであるが、それだけに限定さるものではない。特に、ペプチド抗原に関して、この目標は、多くの免疫学者によって到達不可能であると考えられている。ペプチドは、一般に、効果的な免疫原となるにはあまりにも小さすぎると考えられており、その半減期は短く、また、ペプチドは、多くの場合、患者が免疫学的に寛容である非突然変異型の自己抗原である。したがって、そのような抗原に対する免疫応答を獲得することは、自己免疫を誘導することに等しい。
【００１７】
本明細書で記載するように、本発明は、一貫性のある、効果的なワクチン免疫療法の方法を開発するのに有用であり、この療法では、本発明のサイトカイン組成物を、腫瘍抗原およびペプチドを含む内因性および／または外因性の疾患関連抗原、ならびに他のアジュバントと組み合わせて用いて、免疫応答を患者（例えば、癌患者）に誘発する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを有する相乗量の初代細胞由来生物製剤と、少なくとも１種の抗原を有するワクチンとを含む、癌を治療するための組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを有する相乗量の初代細胞由来生物製剤を、少なくとも１種のアジュバントと組み合わせて含む、患者における免疫応答を増強するための組成物を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、癌を治療する方法であって、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む相乗量の初代細胞由来生物製剤と、少なくとも１種の抗原を含むワクチンとを含む組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
【００２１】
本発明は、免疫抑制を逆転させ、癌に対する免疫を獲得する方法であって、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む相乗量の初代細胞由来生物製剤と、少なくとも１種の抗原を含むワクチンとを含む組成物を投与する工程、ナイーブＴ細胞の産生を刺激する工程、未成熟な樹状細胞を成熟させる工程、得られた成熟樹状細胞によるナイーブＴ細胞への抗原の提示を可能にする工程を含み、それによって免疫抑制を逆転させ、癌に対する免疫を獲得する方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、患者における外因性抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む初代細胞由来生物製剤のアジュバントと、少なくとも１つの外因性抗原とを投与する工程（ここで、この外因性抗原は、通常は免疫応答を生じさせない）と、患者における免疫応答を生じさせる工程とを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明は、患者における免疫応答を増強する方法であって、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む初代細胞由来生物製剤を、少なくとも１種のアジュバントと組み合わせて投与する工程と、初代細胞由来生物製剤とアジュバントの相乗的な相互作用によって患者の免疫応答を増強する工程とを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、免疫系の機能を増大させる方法であって、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む初代細胞由来生物製剤を、少なくとも１種のアジュバントと組み合わせて投与する工程（ここで、アジュバントは、初代細胞由来生物製剤の作用機序とは異なる作用機序を有する）と、免疫応答の機能を増大させる工程とを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、初代細胞生物製剤アジュバント系を投与することによって、免疫系の機能を増大させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明の他の利点は、添付の図面と関連させて考慮したときに、以下の詳細な説明を参照することでより良く理解されるので、容易に理解されるであろう。
【００２７】
【図１】正常対照、癌対照またはＩＲＸ−２処置したＨ＆ＮＳＣＣを有する集団におけるリンパ節サイズを示す棒グラフである。
【００２８】
【図２Ａ】Ｔ細胞領域を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】正常対照、Ｈ＆ＮＳＣＣ対照およびＩＲＸ−２で処置したＨ＆ＮＳＣＣ患者における密度を示す。
【００２９】
【図３Ａ】Ｂ細胞領域を比較した棒グラフであある。
【図３Ｂ】３つの処置群における濾胞を比較した棒グラフである。
【００３０】
【図４Ａ】他の細胞の比較を示す。
【図４Ｂ】３つの処理群における洞組織球増殖（ＳＨ）の比較を示す。
【００３１】
【図５】リンパ節Ｂ＆Ｔ（Ｂ細胞およびＴ細胞）と腫瘍Ｂ＆Ｔのフィットプロットを示すグラフである。
【００３２】
【図６】４８カ月の時点での処置した患者の生存率を示すグラフである。
【００３３】
【図７】微応答者および不応答者と比較した完全応答者および部分応答者の生存を示すグラフである。
【００３４】
【図８】病理学指数と生存との関係を示すグラフである。
【００３５】
【図９】リンパ球浸潤と生存との関係性を示すグラフである。
【００３６】
【図１０】２４カ月の時点での処置した患者の生存率（用量応答）を示すグラフであり、ここで、「ｘ」は、約１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２に等しい。
【００３７】
【図１１】図１１Ａは、ＳＨ＋癌患者のリンパ節における一部成熟したＣＤ８３＋樹状細胞（ＤＣ）の蓄積を示す棒グラフである。
【００３８】
図１１Ｂは、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）で処置したときのＣＤ８６＋活性化ＤＣの数の増加を示す棒グラフである。
【００３９】
【図１２】ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）が、ＤＣ表面でのＣＤ８３発現の増大により検出されるＤＣ成熟を誘導することを示すグラフである。
【００４０】
【図１３】図１３Ａ−Ｂは、サイトスピン標本中の単球由来ＤＣの形態に対するＩＲＸ−２の効果を示す。ＩＲＸ−２で処理した細胞（図１３Ｂ）は、細胞突起および巨大で不規則な形状の核などの成熟ＤＣの形態学的特徴を示す。
【００４１】
【図１４】ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）とともにインキュベートした末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＣＤ１ａ抗原の下方調節ならびにＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）抗原発現の上方調節を示すヒストグラムを含む。これらの変化は、ＩＲＸ−２がＤＣの成熟を刺激することを示している。
【００４２】
【図１５】ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）が未成熟ＤＣのエンドサイトーシス活性を低下させることを示すグラフであり、この活性の低下はＤＣ成熟を示すものである。
【００４３】
【図１６】ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）がＤＣのＴ細胞刺激能を増強することを示すグラフであり、この増強はＤＣの成熟および活性化を示すものである。
【００４４】
【図１７Ａ】ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）が細胞内でＩＬ−１２を産生するＤＣの数を増加させることを示す棒グラフである。ＩＬ−１２は、成熟した活性化ＤＣによって産生されるサイトカインである。
【００４５】
【図１７Ｂ】ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）が、ＤＣにより分泌される生体活性ＩＬ−１２の総量を増加させることを示す棒グラフである。
【００４６】
【図１８】ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）がＤＣにおけるＶＥＧＦ媒介性アポトーシスを減少させ、ＤＣ生存に対するＩＲＸ−２の防御効果を示すことを示す棒グラフである。
【００４７】
【図１９】図１９Ａは、フローサイトメトリーで決定される、ＩＲＸ−２で接着性ＰＢＭＣを処理した後の、活性化マーカーのＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０の組合せが陽性の単球／マクロファージ染色の割合の増加を示す２つの棒グラフを含む。
【００４８】
図１９Ｂは、フローサイトメトリーで決定される、ＩＲＸ−２で接着性ＰＢＭＣを処理した後の、活性化マーカーのＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加を示す一連の棒グラフである。
【００４９】
図１９Ｃは、単球／マクロファージ由来のＣＤ４０およびＣＤ８０に対するＩＲＸ−２の効果を示す２つの棒グラフを示す。
【００５０】
【図２０】本発明のＩＲＸ−２が単球／マクロファージを活性化する、すなわち、ＴＮＦ−αを上回る程度に、活性化マーカーのＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０の発現を誘導することを示す棒グラフを含む。
【００５１】
【図２１】本発明のＩＲＸ−２が単球／マクロファージを活性化する、すなわち、免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の存在下でさえも、活性化マーカーのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ４０を誘導することを示す棒グラフを含む。ＩＲＸ−２は、ＩＬ−１０の存在下と非存在下の両方において、ＬＰＳよりも単球／マクロファージを活性化するのに優れている。
【００５２】
【図２２】本発明のＩＲＸ−２が活性化単球／マクロファージからのＴＮＦ−αの産生を刺激して、ＩＬ−１０の免疫抑制効果を克服すること、ＩＲＸ−２がＬＰＳよりも大きくＴＮＦ−αの産生を刺激したことを示す棒グラフである。
【００５３】
【図２３】様々なコンジュゲートとアジュバント（本発明のＩＲＸ−２（ＩＲＸ）を含む）とで免疫したマウスの前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ペプチドに特異的なＤＴＨ応答を示すチャートであり、ここで、この応答は、個々のマウス（点）および平均（棒）の腫れ（ｍｍで示す）として示され、アジュバントはｘ軸上に記載され、ナイーブは免疫されていないマウスを示し、他のマウス全ては、示した場合（ＫＬＨ）を除き、オボアルブミン−ＰＳＭＡペプチドコンジュゲートで免疫されている。
【００５４】
【図２４】図２４は、ＯＶＡ−ＰＳＭＡまたはＫＬＨ−ＰＳＭＡコンジュゲートのいずれかと組み合わせて本発明のＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）で免疫し、その後、ＤＴＨアッセイで（コンジュゲートを作製するのに使用された）ＰＳＭＡペプチドで刺激したマウスにおけるペプチド特異的ＤＴＨ免疫応答の増強を示す。個々のマウスの腫れの増加はデータ点によって表され、腫れの平均増加は影付きの四角によって表されている。図２４Ｂは、コンジュゲート免疫で使用された担体のみによる刺激に対するＤＴＨ応答を示す。
【００５５】
【図２５】ＯＶＡ−ＰＳＭＡコンジュゲートとＩＲＸ−２とで免疫したマウスにおけるペプチド特異的ＤＴＨ応答に対するシクロホスファミド処置の影響を示す。シクロホスファミド処置は、ＤＴＨ応答に対して効果がなかった。
【００５６】
【図２６】それぞれのアジュバントと組み合わせてＰＳＭＡコンジュゲートで免疫したマウスにおけるペプチド特異的ＤＴＨ応答に対する様々なアジュバント（本発明のＩＲＸ−２（ＩＲＸ）を含む）の効果の比較を示す。ＩＲＸ−２のアジュバント効果は、試験した他のアジュバントよりも大きかった。ナイーブマウス、すなわち、免疫されていないマウスは、陰性対照に相当する。
【００５７】
【図２７Ａ】ＩＲＸ−２（ＩＲＸ）またはミョウバンのいずれかをアジュバントとして組み合わせてＯＶＡ−ＰＳＭＡコンジュゲートで免疫した年老いたマウスと若いマウスのペプチド特異的ＤＴＨ応答を示す。本発明のＩＲＸ−２は、ミョウバンと比較したとき、年老いたマウスと若いマウスの両方においてより大きいペプチド特異的ＤＴＨ応答を刺激した。
【図２７Ｂ】ＩＲＸ−２（ＩＲＸ）またはミョウバンのいずれかをアジュバントとして組み合わせてＰＳＭＡコンジュゲートで免疫した年老いたマウスと若いマウスの担体特異的ＤＴＨ応答を示す。本発明のＩＲＸ−２は、年老いたマウスにおける担体特異的ＤＴＨ応答を若いマウスで観察される担体特異的ＤＴＨ応答まで回復させた。
【００５８】
【図２８】Ｔ細胞応答の増強を、ＫＬＨ−ＰＳＭＡコンジュゲートおよび本発明のＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）で免疫したマウス由来の脾臓細胞によって分泌されるＩＦＮ−γの形態で示しており、結果は、個々のマウス（データポイントマーカー）および平均応答（影付きの棒）について表されている。分泌されたＩＦＮ−γの増加は全て、ナイーブ対照と比較して統計的に有意であった。
【００５９】
【図２９Ａ】図２９Ａ〜Ｃは他のアジュバント（すなわち、ミョウバンおよびＣｐＧ）と比較して、本発明のＩＲＸ−２と組み合わせてＰＳＭＡコンジュゲートで免疫したマウスで観察された血清抗体応答を示す。図２９Ａは、ＯＶＡ−ＰＳＭＡコンジュゲートとＩＲＸ−２（ＩＲＸ）、ミョウバンまたはＣｐＧとで免疫したマウスにおけるＯＶＡ担体に対する血清抗体応答を示す。データは、１グループ当たり５〜１０匹のマウスの平均および平均の標準誤差として示されている。
【図２９Ｂ】ＯＶＡ−ＰＳＭＡコンジュゲートとＩＲＸ−２（ＩＲＸ）、ミョウバンまたはＣｐＧとで免疫したマウスにおけるＰＳＭＡペプチドに対する血清抗体応答を示す。
【図２９Ｃ】ＩＲＸ−２（ＩＲＸ）、ミョウバンまたはＰＢＳと組み合わせてＫＬＨ−ＰＳＭＡコンジュゲートで免疫したマウスにおけるＰＳＭＡペプチドに対する血清抗体応答を示す。結果はＥＬＩＳＡアッセイで測定され、光学密度として示されている。
【００６０】
【図３０】ＰＳＭＡペプチド抗原と組み合わせて本発明のＩＲＸ−２で処置された３人の前立腺癌患者における６カ月間にわたるＰＳＡレベルの安定化を示す。
【００６１】
【図３１】放射線照射したＰＳＭＡ発現３Ｔ３細胞で免疫したマウスのペプチド特異的ＤＴＨ応答の棒グラフである。
【００６２】
【図３２】ＰＳＭＡ−ＫＬＨと担体なしにおけるペプチド特異的ＤＴＨを示す棒グラフである。
【００６３】
【図３３Ａ】用量依存的に抗原への反応を増大させるＩＲＸ−２を示すグラフである。
【図３３Ｂ】抗原に対する免疫応答に対する追加のＩＲＸ−２の注射の効果の棒グラフである。
【００６４】
【図３４】ＩＲＸ−２と他のアジュバントを注射した、ＰＭＳＡペプチドで免疫したマウスのＤＴＨアッセイを示す棒グラフである。
【００６５】
【図３５】ペプチド抗原に応答したＩＦＮ−γ産生の棒グラフである。
【００６６】
【図３６】血清抗体応答のグラフである。
【００６７】
【図３７】ＩＲＸ−２と他のアジュバントの血清抗体応答のグラフである。
【００６８】
【図３８】図３８Ａはペプチド抗原に応答したＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の数のグラフである。図３８Ｂは、ペプチド抗原に応答したＩＦＮ−γ産生細胞の数とＩＦＮ−γの総産生を比較したグラフである。
【００６９】
【図３９】ペプチドワクチン接種に応答したＩＦＮ−γ産生の動力学のグラフである。
【００７０】
【図４０】図４０Ａは、ペプチドワクチン接種に応答した用量応答ＩＦＮ−γ産生のグラフである。図４０Ｂは、ＩＲＸ−２を様々に投与した後のＩＦＮ−γ産生細胞の数のグラフである。
【００７１】
【図４１】図４１Ａは、ＩＲＸ−２と他のアジュバントをワクチン接種した後のＩＦＮ−γ産生のグラフである。図４１Ｂは、ＩＲＸ−２と他のアジュバントをワクチン接種した後の抗体応答のグラフである。
【００７２】
【図４２】図４２Ａは、ＩＲＸ−２と全細胞ワクチンとで事前免疫した後の腫瘍増殖のグラフである。図４２Ｂは、ＩＲＸ−２とペプチドコンジュゲートワクチンで事前免疫した後の腫瘍増殖のグラフである。図４２Ｃは、ＩＲＸ−２とコンジュゲートのみで事前免疫した後の腫瘍増殖のグラフである。
【００７３】
【図４３】ＩＲＸ−２と他のアジュバントをワクチン接種した後のＴ細胞のＩＦＮ−γ産生のグラフである。
【００７４】
【図４４】ＩＲＸ−２と他のアジュバントをワクチン接種した後の抗原特異的細胞のグラフである。
【００７５】
【図４５】ＩＲＸ−２と他のアジュバントをワクチン接種した後のインビボ細胞傷害性のグラフである。
【００７６】
【図４６】ウイルスに基づくワクチンとＩＲＸ−２とをワクチン接種した後の血清抗体応答のグラフである。
【００７７】
【図４７】ウイルスに基づくワクチンとＩＲＸ−２とをワクチン接種した後のＴ細胞のＩＦＮ−γ応答のグラフである。
【００７８】
【図４８】ＴＲＩＣＯＭを発現するウイルスに基づくワクチンとＩＲＸ−２とをワクチン接種した後のＴ細胞のＩＦＮ−γ応答のグラフである。
【００７９】
【図４９】ウイルスに基づくワクチンとＩＲＸ−２とをワクチン接種した後のＴ細胞のＩＦＮ−γ応答のグラフである。
【００８０】
【図５０】ウイルスに基づくワクチンとＩＲＸ−２とをワクチン接種した後のＩｇＭ応答のグラフである。
【００８１】
【図５１】ウイルスに基づくワクチンとＩＲＸ−２とをワクチン接種した後のＩｇＧ_１およびＩｇＧ２_Ａ応答のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
本発明は、免疫療法および癌または他の抗原産生持続性病変もしくは疾患状態の治療の組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、癌または他の抗原産生疾患もしくは病変と関連する抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物および方法に関するものであり、ここで、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含む初代細胞由来生物製剤、および少なくとも１種の抗原を含む癌ワクチンは、患者における抗原に対する免疫応答を刺激するのに有効な量で患者に投与される。本発明によれば、抗原は好ましくは外因性抗原であり、初代細胞由来生物製剤は抗原とともにアジュバントとして作用して、患者における抗原に対する免疫応答を刺激する。初代細胞由来生物製剤は、本明細書に記載されるような他のアジュバントと組み合わせて使用することもできる。
【００８３】
定義
【００８４】
本明細書で使用する場合、「アジュバント」という用語は、特定の抗原に対する免疫応答を増強する能力を有する組成物を意味する。そのような能力は、免疫媒介性防御の顕著な増大により明らかにされる。効果的であるために、アジュバントは抗原の部位またはその近くに送達されなければならない。免疫の増強は、通常、抗原に対して生成される抗体の力価の顕著な（通常１０倍を上回る）増加および／または陽性皮膚試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、ＩＦＮ−γもしくはＩＬ−２のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、もしくは腫瘍へのＴ細胞浸潤によって測定することができる細胞性免疫の増強によって明らかにされる。本発明のサイトカイン組成物は、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答を増強するのに適している。本発明のサイトカイン組成物のアジュバント効果としては、ナイーブＴ細胞の生成、樹状細胞の分化および成熟の促進、単球およびマクロファージの刺激、また、癌患者の場合、腫瘍へのリンパ球浸潤の増大、腫瘍断片化、腫瘍退縮、およびリンパ節内での洞組織球増殖の低下が挙げられる。
【００８５】
本明細書で使用される「アジュバント系」は、一緒に作用するようにアジュバントを組み合わせて、最適に効果的でかつ安全な処方物を得ることを意味し、この処方物中では、ワクチン、抗原およびアジュバントの各部分が一緒に作用して、免疫応答を生じさせる。そのようなアジュバント系の例は、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ（ＧＳＫ）により製造されているＡＳＯ２、３および４処方ワクチンである。
【００８６】
本明細書で使用される「ワクチン」は、送達された抗原に対する免疫応答および好ましくはＴ細胞応答を生成させるために患者に投与される、少なくとも１種の抗原、好ましくは２種以上の抗原を含むワクチンを指す。ワクチンは、担体または他の刺激分子などの様々な他の成分を含むことができる。ワクチンは、様々なウイルス／細菌ベクターまたは細胞中にコードされたＤＮＡに基づくワクチン、ペプチドに基づくワクチン、またはタンパク質に基づくワクチンであることができる。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「有効量」は、本発明の所望の結果、すなわち、相乗的な様式で抗原に対する免疫応答を生じさせることを達成するのに必要とされる初代細胞由来生物製剤の量を指す。当業者は、特定の患者に投与すべき初代細胞由来生物製剤の有効量を決定することができる。
【００８８】
「ＩＲＸ−２」（別名、「サイトプルリキン」）は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびシプロフロキサシン（ＣＩＰＲＯ）によって刺激された純化されたヒト白血球（単核細胞）によって産生される、白血球由来の天然の初代細胞由来生物製剤である。定義によれば、ＩＲＸ−２はアジュバント系である。主な活性成分は、インターロイキン１β（ＩＬ−１β、また、本明細書ではＩＬ−１とも呼ばれる）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、およびγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）である。好ましくは、本発明で使用されるＩＲＸ−２は、これら６つの極めて重要なサイトカインを含む。ＩＲＸ−２はまた、以前に、米国特許第６，９７７，０７２号および同第７，１５３，４９９号において、「ＮＣＭ」（天然サイトカイン混合物）と呼ばれ、定義され、かつ明記されていた。ＩＲＸ−２、初代細胞由来生物製剤、およびＮＣＭという用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００８９】
簡潔に述べると、ＩＲＸ−２は、４−アミノキノロン抗生物質が常に存在し、かつマイトジェンが常にまたは間欠的に存在する中で調製され、マイトジェンは、好ましい実施形態では、ＰＨＡである。しかしながら、他のマイトジェンを使用することもできる。患者に投与するために産生されたＩＲＸ−２は、６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは１５０〜１，８００ｐｃｇ／ｍＬの範囲の濃度のＩＬ−１βと、６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは３，０００〜１２，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲の濃度のＩＬ−２と、２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲の濃度のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αとを含む。
【００９０】
ＩＲＸ−２はまた、６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは３００〜２，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲の濃度のＩＬ−６と、６０００〜６００，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは２０，０００〜１８０，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲の濃度のＩＬ−８と、２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍｌ、より好ましくは１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲の濃度のＴＮＦ−αとを含むことができる。組換えサイトカイン、天然サイトカインもしくはペグ化サイトカインを使用することもできるし、またはＩＲＸ−２は組換えサイトカイン、天然サイトカインもしくはペグ化サイトカインの混合物を含むことができる。ＩＲＸ−２は、上記のサイトカインしか含まないこともあるが、他のサイトカインを含むこともある。本発明のＩＲＸ−２はさらに、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ（１００〜１０，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは５００〜２，０００ｐｃｇ／ｍＬの範囲の濃度）、およびＧ−ＣＳＦなどの他の組換えサイトカイン、天然サイトカインまたはペグ化サイトカインを含むことができる。ＩＲＸ−２の製造方法は、上で引用した特許および米国仮特許出願第６１／０４４，６７４号に開示されている。
【００９１】
本明細書に開示したサイトカインと関連する誘導体、断片およびペプチドもまた、本発明により包含され、その場合、そのような誘導体、断片およびペプチドは、そのそれぞれのサイトカインの生物学的活性を保持している。
【００９２】
免疫抑制を促進するための組成物（例えば、化学的インヒビター、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、亜鉛およびそれらの組合せ）などの、他の化合物を、ＩＲＸ−２と一緒に投与することもできる。化学的インヒビターは、免疫抑制性でなく（好ましくは低用量で使用され）、かつ例えば、身体内の免疫抑制またはサプレッサー機構を阻害することによって免疫および／または免疫応答を増大させるように免疫調節効果を有する任意の化学療法剤であることができる。好ましい実施形態によれば、化学的インヒビターは、限定するものではないが、アルキル化剤、代謝拮抗剤および抗生物質をはじめとする抗新生物剤である。化学的インヒビターは、サリドマイドなどの免疫調節剤であることもできる。化学的インヒビターは、塩または他の複合体形態であることもできる。好ましくは、化学的インヒビターは、アルキル化剤のシクロホスファミド（ＣＹ）である。ＮＳＡＩＤは、ＣｏｘＩとＣｏｘＩＩの両方のインヒビターであるインドメタシン（ＩＮＤＯ）であることが好ましい。ＮＳＡＩＤは、イブプロフェンもしくはＣｏｘＩＩインヒビター（例えば、セレコキシブおよびロフェコキシブ）、またはそれらの組合せであることもできる。一緒に使用される４つの成分（すなわち、化学的インヒビター、ＮＳＡＩＤ、初代細胞由来生物製剤、および亜鉛）は、免疫標的によって作り出される抑制性環境に対処し、患者の細胞性免疫応答を回復させることができる。より具体的には、化学的インヒビターはＴ調節性細胞を阻害する。すなわち、ＮＳＡＩＤは、プロスタグランジンによる局所的免疫抑制を逆転させ、初代細胞由来生物製剤は、樹状細胞を活性化し、Ｔ細胞を刺激し、Ｔ細胞をアポトーシスから防御し、亜鉛は、図２に示すようなＴ細胞機能にとっての重要な栄養素を提供する。この組み合わされた作用は、内因性抗原と外因性抗原の両方に対する免疫応答を助長する。
【００９３】
本明細書で使用する場合、「内因性抗原」という用語は、本発明のサイトカイン組成物をインビボで投与した後に、サイトカインが患者内で抗原とともにアジュバントとして作用して、抗原に対する免疫応答を刺激するように、インビボで、すなわち、生物（例えば、患者）内で産生され、かつそこに位置する抗原を意味する。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「外因性抗原」という用語は、本発明のサイトカイン組成物をインビボで投与した後に、サイトカインが患者内で抗原とともにアジュバントとして作用して、抗原に対する免疫応答を刺激するように、インビトロで、すなわち、治療しようとする生物の外側で、産生、すなわち、単離または生成され、かつインビボで生物（すなわち、患者）に投与される抗原を意味する。外因性抗原は、化学合成されたもしくは遺伝子改変された化合物もしくは分子であることができるし、またはそのインビボ環境から抽出され、インビトロで単離された内因性抗原であることができる。抽出された抗原は、インビボに再導入するために処理するかまたは別の方法で修飾することができる。外因性抗原は、本発明のサイトカイン組成物とは別個の薬理学的製剤に含めてまたは同じ製剤に含めて投与することができる。下記の実施例１１および１２のデータによって示されるように、本発明のＩＲＸ−２組成物は、外因性の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）と組み合わせて、マウスとヒトの両方で免疫応答を促進するのに有効である。他の外因性抗原を、以下でさらに記載するようにＩＲＸ−２と組み合わせることができる。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「腫瘍関連抗原」という用語は、腫瘍に対する免疫応答を誘導することができるタンパク質またはペプチドまたは他の分子を意味する。これには、ＰＳＭＡペプチド、ＭＡＧＥペプチド（Ｓａｈｉｎ，１９９７；Ｗａｎｇ，１９９９）、パピローマウイルスペプチド（Ｅ６およびＥ７）、ＭＡＧＥ断片、ＮＹ ＥＳＯ−１または他の同様の抗原が含まれ得るが、これらに限定されない。これまで、これらの抗原は、そのサイズを根拠に（すなわち、それらは小さすぎると考えられていた）、またはそれらはこれまで免疫原性特性を欠くと考えられていたので（すなわち、それらは自己抗原と考えられていた）、患者を治療するのに有効であるとは考えられていなかった。
【００９６】
合成された長いペプチドは、２２〜４５アミノ酸のペプチド配列と定義される。合成された長いペプチドワクチンは、以下で説明される、最小限のペプチド配列ワクチンに優るいくつかの利点を提供する。ワクチン効力における重要な因子のうちの１つは、ペプチドが免疫系に提示される状況である。合成された長いペプチドは、ＭＨＣクラスＩに直接結合することはできないが、樹状細胞によって取り込まれ、プロセッシングされた後、細胞傷害性Ｔ細胞に提示される必要がある。対照的に、最小限の細胞傷害性Ｔ細胞ペプチド（８〜１０アミノ酸）は、細胞外でＭＨＣクラスＩ分子に直ちにロードされ、インビボでプロフェッショナルＡＰＣ（ＤＣ）と非プロフェッショナルＡＰＣ（Ｔ細胞およびＢ細胞）によって提示されることができる。非活性化Ｂ細胞への細胞傷害性Ｔ細胞ペプチドエピトープの提示は一過性の細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導し、その後、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞の欠失が起こる。ペプチドワクチンで活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞が互いに最小限の細胞傷害性Ｔ細胞ペプチドを提示するとき、ＩＦＡアジュバントによって誘導される徐放性でかつ長期にわたる（１００日を超える）抗原提示は、非プロフェッショナルＡＰＣによる非炎症性リンパ節における細胞傷害性Ｔ細胞ペプチドの最小限の提示と相まって、ＣＤ８＋Ｔ細胞寛容と同胞殺しを誘導する。対照的に、最小限のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドがＤＣに直接ロードされると、細胞傷害性Ｔ細胞を寛容化するペプチドが、腫瘍防御的な細胞傷害性Ｔ細胞応答の拡大を誘発するペプチドに変換され得る。同様に、細胞傷害性Ｔ細胞ペプチド配列を、ＤＣによるプロフェッショナルなプロセッシングを必要とする合成された長いペプチドに伸長させることには同じ効果がある。合成された長いペプチドは、主に、プロフェッショナルＡＰＣによってプロセッシングされ、提示されるので、炎症を起こした流入領域リンパという強い刺激性の環境において細胞傷害性Ｔ細胞を主に刺激する。合成された長いペプチドワクチンの最小限の細胞傷害性Ｔ細胞ペプチドワクチンに優る別の利点は、抗原流入領域リンパ節におけるインビボエピトープ提示の持続期間の延長であり、これは、クローン性拡大およびエフェクターＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生に重要である。合成された長いエピトープによるこの改善されたインビボ提示とそれに伴うＴ細胞拡大の誘導は、関係している細胞傷害性Ｔ細胞エピトープがより弱いＭＨＣクラスＩ結合を示す場合に、特に明白となる。それゆえ、最小限の細胞傷害性Ｔ細胞ペプチドを長いペプチドに変換することは、免疫原性を増大させるための細胞傷害性Ｔ細胞ペプチドの修飾などの方法に代わる選択肢を提供する。
【００９７】
ＨＰＶ用の合成された長いペプチドの例には、以下のものがある：
Ｅ６１〜３２：ＭＨＱＫＲＴＡＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：４）；
Ｅ６１９〜５０：ＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：５）；
Ｅ６４１〜６５：ＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：６）；
Ｅ６５５〜８０：ＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：７）；
Ｅ６７１〜９５：ＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：８）；
Ｅ６８５〜１０９：ＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：９）；
Ｅ６９１〜１２０：ＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＣＱＫＰＬＣＰＥＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１０）；
Ｅ６１０９〜１４０：ＲＣＩＮＣＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１１）；
Ｅ６１２７〜１５８：ＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１２）；
Ｅ７１〜３５：ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１３）；
Ｅ７２２〜５６：ＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１４）；
Ｅ７４３〜７７：ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１５）；
Ｅ７６４〜９８：ＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１６）．
【００９８】
より具体的には、本発明は、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを有する相乗量の初代細胞由来生物製剤（ＩＲＸ−２）と、少なくとも１種の抗原を含む癌ワクチンとを含む組成物を対象とする。ＩＲＸ−２は、単独でまたはワクチン中の外因性抗原に対する他のアジュバントと組み合わせて、アジュバントとして作用する。すなわち、ＩＲＸ−２は、外因性抗原に対する免疫応答を刺激する。言い換えると、ＩＲＸ−２は、外因性抗原と相乗的な様式で作用して、外因性抗原のみを投与することによって達成することができるよりも大きい免疫応答を生成する。ＩＲＸ−２は、免疫系が何らかの形でその完全な機能から抑制されている患者の免疫系を完全に「作動させる」というその効果によって、これまでのアジュバントに優る利点を提供する。免疫系の抑制を逆転させなければ、抗原を提示して、癌および他の疾患を効果的に治療することはできない。ＩＲＸ−２が免疫系を「作動させる」機序は、以下でさらに記載されている。
【００９９】
本組成物を用いて、癌（例えば、限定するものではないが、頭頸部扁平上皮癌（Ｈ＆ＮＳＣＣ）、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肺癌、脳腫瘍、結腸癌、卵巣癌、舌癌、咽頭癌、前立腺癌、および黒色腫）などの多くの異なる種類の疾患を治療することができる。さらに、本発明の組成物および方法を用いて、インビボで抗原を産生する感染性病変（例えば、皮膚もしくは全身性のカンジダ症、パピローマウイルス関連の性病いぼ、または子宮頸部の形成異常）などの非癌性の持続性病変を治療することができる。
【０１００】
ＩＲＸ−２は、本質的には、上の定義の節に記載された通りのものであり、場合によって、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γという６つの極めて重要なサイトカイン以外のさらなるサイトカインを含むことができ、また、本組成物は、場合によって、通常のＩＲＸ−２レジメンで投与される様々な他の化合物、すなわち、上でも記載されたような化学的インヒビター、ＮＳＡＩＤ、および亜鉛をさらに含むことができる。
【０１０１】
本発明のワクチンは、特定の抗原に対する免疫応答を刺激することによって癌を治療するために使用され、かつ通常、その特定の種類の癌で一般に産生される少なくとも１種の抗原を含む任意のワクチンである。本明細書で論じられる抗原は、「癌ワクチン」中にあるものとして言及されているが、この抗原はまた、本明細書に（例えば、実施例１１および１２に）記載されているのと同じように、個別にまたは従来の「ワクチン」中で組み合わせずに使用することができることが理解されるべきである。
【０１０２】
癌ワクチンで使用される一般的な抗原としては、ＡＦＰ、α−アクチニン−４、ＡＲＴＣ１、ＢＡＧＥ、ＢＣＲ−ａｂｌ、Ｂ−ＲＡＦ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、β−カテニン、癌胎児性抗原、修飾された癌胎児性抗原、癌関連突然変異ムチン、ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、クロモグラニンＡ、ＣＯＡ−１、サイクリン依存的キナーゼ−４、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ、伸長因子２、上皮増殖因子受容体ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エプスタインバーウイルスＥＢＮＡ遺伝子産物、ＥＴＡ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、ＧＡＧＥ、ガングリオシド、ＧＰＮＭＢ、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１、ｇｐ１００、Ｈ１ＦＴ、ＨＡＧＥ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質、ＨＩＰ−５５、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、キネシン２、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＬＫ−４、ＫＭ−ＨＮ−１、ＫＳＡ、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＭＡＧＥ、マンマグロビン−Ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ＭＡＲＴ−２、ＭＥ１、黒色腫プロテオグリカン、ミオシンクラスＩ、ＭＵＣ−１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ−８８、ＮＣＡＭ−１８０、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ−ＢＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐ１５、ｐ２１−ｒａｓ、ｐ５３、ｐ１８５ ＨＥＲ２／ｎｅｕ、パピローマウイルスＥ７、パピローマウイルスＥ６、ｐｍｉ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＲＡＢ３８、ＲＢＡＦ６００、ＳＡＧＥ、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ｓｐ１７、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合タンパク質、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡ ９０、ＴＡＧ、ＴＧＦ−β１抗アポトーシス因子、ＴＧＦ−βＲＩＩ、チログロブリン、ＴＲＡＧ−３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、腫瘍タンパク質Ｄ５２、チロシナーゼ、ＷＴ１、それらの断片、それらの誘導体、およびそれらの組合せが挙げられる。任意の他の好適な抗原を使用することもできる。
【０１０３】
投与される抗原は、天然タンパク質、組換えタンパク質、化学合成タンパク質、またはそれらの組合せの形態の抗原そのものであることもある。
【０１０４】
さらに、抗原は、ウイルスまたは細菌ベクター、すなわち、核酸ベクターにコードされていることもある。この場合、抗原は、核酸物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）にコードされている。核酸をコードするのに使用される一般的なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ポックスウイルスの例としては、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（ＭＡ）、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、ＴＲＯＶＡＸ、鶏痘、およびカナリア痘が挙げられる。カナリア痘の具体的な例としては、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）が挙げられる。当業者は、所望のベクターに抗原をコードさせることができる。
【０１０５】
本組成物は、Ｔ細胞を刺激するための共刺激分子をさらに含むことができる。Ｔ細胞は、完全に活性化されるようになるために、２つの異なるシグナルを必要とする。第１のシグナルは抗原特異的なものであり、抗原提示細胞の膜表面でペプチド−ＭＨＣ分子と相互作用するＴ細胞受容体から生じる。共刺激シグナルとなる第２のシグナルは、抗原非特異的なものであり、抗原提示細胞の膜表面に発現した共刺激分子とＴ細胞との相互作用によって得られる。共刺激分子は、天然に体内で見出すことができるが、免疫抑制患者では、さらなる分子を投与することができる。共刺激分子の例としては、アバタセプト、ベラタセプト、ＣＤ２８−ＳｕｐｅｒＭＡＢ、Ｂ７／ＣＤ２８共刺激分子、ＴＮＦスーパーファミリー共刺激分子、ＳＬＡＭファミリー共刺激分子およびその他のものが挙げられる。
【０１０６】
本組成物は、上記のような合成された長いペプチドを含むこともできる。この組合せは、新規の作用機序を有するワクチンを本発明の組成物と組み合わせて、２つの成分の組み合わされた作用機序によって相乗的な応答を得る例である。
【０１０７】
本組成物は、抑制性または負の調節免疫機構を阻止する化合物（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１または抗ＰＤＬ−１）を含むこともできる。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）ファミリーの受容体は、関与したときに、Ｔ細胞の活性化を阻害し、細胞周期停止を促進し、かつサイトカイン産生を減少させる。これは、過剰な免疫応答を防ぐための、正常に機能する免疫系における重要な機能である。しかしながら、抑制の一部を除去し、Ｔ細胞の活性化を刺激するためには、免疫抑制患者におけるＣＴＬＡ−４受容体を阻害することが望ましい。
【０１０８】
本組成物は、Ｔｒｅｇ枯渇化分子をさらに含むことができる。Ｔｒｅｇ、または調節性Ｔ細胞は、自己抗原と非自己抗原を区別し、免疫活性化を積極的に抑制する。Ｔｒｅｇの枯渇によって、免疫抑制患者における免疫系の抑制を低下させることができる。この枯渇は、限定するものではないが、デニロイキンジフィトックス（ＯＮＴＡＫ（登録商標）、Ｅｉｓａｉ Ｉｎｃ．）などのＴｒｅｇ枯渇化分子を投与することによって達成することができる。
【０１０９】
本組成物は、腫瘍の近くまたは内部で生じる血管新生過程を予防または阻害するために、血管新生関連抗原を含むことができる。血管新生関連抗原としては、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＴＧＦ−αをはじめとするＴＧＦ、エンドグリン、Ｉｄタンパク質、様々なプロテアーゼ、酸化窒素シンターゼ、アミノペプチダーゼ、トロンボスポンジン、ｋ−ｒａｓ、Ｗｎｔ、サイクリン依存的キナーゼ、微小管、熱ショックタンパク質、ヘパリン結合因子、シンターゼ、コラーゲン受容体、インテグリン、および表面プロテオグリカンＮＧ２を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１１０】
本組成物は、初代細胞由来生物製剤および癌ワクチンならびに上記の他の成分の効果を増強するための、増強剤ＣＤ８０、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３（別名、ＴＲＩＣＯＭ）をさらに含むことができる。増強剤の他の組合せとしては、ＩＬ−１２とＧＭ−ＣＳＦ；ＩＬ−１２とＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−α；ＣＤ８０とＩＬ−１２；およびＣＤ８６とＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１２が挙げられる。
【０１１１】
本発明はまた、内因性抗原と外因性抗原の両方の使用を包含する。すなわち、本組成物は、内因性抗原を有する患者にインビボで投与され、かつサイトカインは、外因性抗原と内因性抗原の両方とともにアジュバントとして作用して、患者における免疫応答を刺激する。例えば、内因性抗原は、所属リンパ節または腫瘍部位に存在することができる。
【０１１２】
本発明はまた、患者の免疫系を刺激するために、それ自体アジュバントとして作用する上記のような初代細胞由来生物製剤と、少なくとも１種の他のアジュバントとを含む組成物を対象とする。外因性抗原（例えば、癌ワクチンに含まれるもの）および上記の他の成分も組成物に含めることができる。言い換えると、本組成物は、抗原の効果をさらに増強する多重アジュバント組成物である。さらに、初代細胞由来生物製剤は、上記のような抗原の効果だけでなく、アジュバントの効果も増強する、すなわち、初代細胞由来生物製剤は、アジュバントと相乗的に作用する。
【０１１３】
２つの異なるクラスのアジュバント：ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）非依存的アジュバントおよびＴＬＲ依存的アジュバントがある。ＴＬＲ非依存的アジュバントは送達系として作用し、かつ抗原を濃縮し、それを抗原提示細胞にターゲッティングし、抗原と免疫増強剤を共局在させるのを助ける。ＴＬＲ依存的アジュバントは、ＴＬＲの活性化を通じて免疫系を直接刺激する。本発明の組成物は、ＴＬＲ非依存的アジュバント、ＴＬＲ依存的アジュバント、またはそれらの組合せとともに使用することができる。各種のアジュバントを用いて、免疫系の異なる部分を同時に刺激することができる。例えば、ＴＬＲ非依存的アジュバントは、抗原およびＴＬＲ依存的アジュバントをＡＰＣにを輸送して、抗原の取込みおよび安定性を刺激することができ、その一方で、ＴＬＲ依存的アジュバントは、ＴＬＲシグナル伝達の活性化を通じて免疫を直接増強し、ＴＬＲ依存的アジュバントをそのままで投与する潜在的な毒性を軽減する。また、複数のＴＬＲ依存的アジュバントを用いて、アジュバントの相乗効果をもたらすこともできる。
【０１１４】
アジュバントは、限定するものではないが、以下のアジュバントであることができる。ＴＬＲ非依存的アジュバント：ミョウバン（リン酸アルミニウム／水酸化アルミニウム）は、様々な適応を示す無機塩である。ＡＳ０３（ＧＳＫ；スクアレン）（１０．６８ｍｇ）、ＤＬ−α−トコフェロール（１１．８６ｍｇ）、およびポリソルベート８０（４．８５ｍｇ））は、パンデミックインフルエンザに使用される水中油型エマルジョンである。ＭＦ５９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；４〜５％（ｗ／ｖ）スクアレン、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０、０．５％Ｓｐａｎ ８５、任意で可変量のムラムルトリペプチドホスファチジル−エタノールアミン（ＭＴＰ−ＰＥ））は、インフルエンザに使用される水中油型エマルジョンである。プロバックス（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ；スクアレン＋プルロニックＬ１２１）は水中油型エマルジョンである。モンタニド（Ｓｅｐｐｉｃ ＳＡ；Ｂｉｏｖｅｎ；Ｃａｎｃｅｒｖａｘ；オレイン酸マンニドおよび鉱油）は、マラリアおよび癌の治療において使用される油中水型エマルジョンである。ＴｉｔｅｒＭａｘ（ＣｙｔＲｘ；スクアレン＋ＣＲＬ−８９４１）は、油中水型エマルジョンである。Ａｄｖａｘ（Ｖａｘｉｎｅ Ｐｔｙ；イヌリンのナノ結晶粒子）は、Ｂ型肝炎（予防的および治療的）、インフルエンザ、炭疽菌、赤痢菌、日本脳炎、狂犬病、ハチ毒、アレルギーに対するワクチン、および癌免疫療法において使用される生体ポリマーである。ＱＳ２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ；Ｑｕｉｌ Ａの画分）は、黒色腫、マラリア、ＨＩＶ、およびインフルエンザの治療において使用される植物由来組成物である。Ｑｕｉｌ Ａ（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；キラヤの精製画分）は、様々な治療において使用される植物由来組成物である。ＩＳＣＯＭ（ＣＳＬ；Ｉｓｃｏｎｏｖａ；サポニン＋ステロール＋場合により、リン脂質）は、インフルエンザをはじめとする様々な治療において使用される植物由来組成物である。リポソーム（Ｃｒｕｃｅｌｌ；Ｎａｓｖａｘ；脂質からなる合成リン脂質球）は様々な疾患の治療において使用される。
【０１１５】
ＴＬＲ依存的アジュバント：Ａｍｐｌｉｇｅｎ（Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｘ；規則的に現われるミスマッチ領域を含む特異的に構成された合成二本鎖ＲＮＡ）は、ＴＬＲ３の活性化により作用し、パンデミックインフルエンザに対するワクチンとして使用される。ＡＳ０１（ＧＳＫ；ＭＰＬ、リポソーム、およびＱＳ−２１）は、ＴＬＲ４のＭＰＬ活性化により作用し、リポソームは、ＡＰＣへの抗原送達の促進をもたらし、ＱＳ−２１は、ＡＰＣへの抗原提示の増強および細胞傷害性Ｔ細胞の誘導をもたらし、また、これは、マラリアおよび結核に対するワクチンとして使用される。ＡＳ０２（ＧＳＫ；ＭＰＬ、ｏ／ｗエマルジョン、およびＱＳ−２１）は、ＴＬＲ４のＭＰＬ活性化により作用し、ｏ／ｗエマルジョンは、自然炎症応答、ＡＰＣの動員および活性化、注射部位における抗原持続の増強、免疫適格細胞への提示、様々なパターンのサイトカインの誘発をもたらし、ＱＳ−２１は、ＡＰＣへの抗原提示の増強および細胞傷害性Ｔ細胞の誘導をもたらし、また、これは、マラリア、結核、ＨＢＶ、およびＨＩＶに対するワクチンとして使用される。ＡＳ０４（ＧＳＫ；ＭＰＬ、水酸化アルミニウム／リン酸アルミニウム）は、ＴＬＲ４のＭＰＬ活性化により作用し、ミョウバンは、デポ効果、局所炎症、およびＡＰＣによる抗原取込みの増加をもたらし、また、これは、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＲＳＶ、およびＥＢＶに対するワクチンとして使用される。ＭＰＬ ＲＣ−５２９（Ｄｙｎａｖａｘ；ＭＰＬ）は、ＴＬＲ４の活性化により作用し、ＨＢＶに対するワクチンとして使用される。Ｅ６０２０（Ｅｉｓａ／Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ；合成リン脂質二量体）は、ＴＬＲ４の活性化により作用する。ＴＬＲ−テクノロジー（Ｖａｘｉｎｎａｔｅ；抗原およびフラジェリン）は、ＴＬＲ５の活性化により作用し、インフルエンザに対するワクチンにおいて使用される。ＰＦ−３５１２６７６（ＣｐＧ ７９０９）（Ｃｏｌｅｙ／Ｐｆｉｚｅｒ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ；免疫調節合成オリゴヌクレオチド）は、ＴＬＲ９の活性化により作用し、ＨＢＶ、インフルエンザ、マラリア、および炭疽菌に対するワクチンにおいて使用される。ＩＳＳ（Ｄｙｎａｖａｘ；短いＤＮＡ配列）は、ＴＬＲ９の活性化により作用し、ＨＢＶおよびインフルエンザに対するワクチンにおいて使用される。ＩＣ３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ；ペプチドおよびオリゴヌクレオチド）は、ＴＬＲ９の活性化、注射部位デポの形成、およびＡＰＣへの抗原取込みの増強により作用し、インフルエンザ、結核、マラリア、髄膜炎、アレルギー、および癌適応症に対するワクチンとして使用される。
【０１１６】
初代細胞由来生物製剤とアジュバントの組合せは、上記のアジュバントに対して現在推奨されている適応症とは異なる適応症に使用することができ、かつそれらは、とりわけ、本明細書に記載したような癌適応症に使用することができることも理解されるべきである。したがって、初代細胞由来生物製剤とアジュバントの組合せは、免疫系を増強し、特にこのアジュバントの適応症となる疾患のいずれかまたは本明細書に記載の任意の他の疾患を治療するために使用することができる。
【０１１７】
さらに、本発明は、初代細胞由来生物製剤と、初代細胞由来生物製剤の作用機序とは異なる作用機序を有する上記のような別のアジュバントとを含むことができる。初代細胞由来生物製剤は、未成熟な樹状細胞を成熟させることによって免疫系を効果的に「作動させ」、ナイーブＴ細胞の産生を刺激し、抗原をナイーブＴ細胞に効果的に提示させるよう作用する。この作用機序は以下でさらに記載されている。免疫系の別の部分に対して作用するアジュバントと組み合わせた場合、初代細胞由来生物製剤とアジュバントは、免疫系の複数の部分を同時に刺激することによって、免疫系における相乗的な応答を生じさせることができる。
【０１１８】
本発明は、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む相乗量の初代細胞由来生物製剤と、少なくとも１種の抗原を含む癌ワクチンとを含む上記の組成物を投与することによって、癌を治療するための方法を提供する。初代細胞由来生物製剤と抗原が相乗的な様式で相互作用して、抗原をＴ細胞に提示し、免疫系を活性化するので、本組成物は癌の治療に効果的である。一般に、初代細胞由来生物製剤は、ナイーブＴ細胞の産生を刺激し、未成熟な樹状細胞を成熟させ、得られた成熟樹状細胞によるナイーブＴ細胞への癌ワクチン中の外因性抗原の提示を可能にするように作用する。この作用機序は以下でさらに記載されている。言い換えると、初代細胞由来生物製剤の作用がなければ、免疫系が抑制されたままになるので、この癌ワクチンは、患者における癌に対する免疫を生成させるのに効果的でなくなる。この投与工程は、以下でさらに記載するように、および好ましくは１日１回の外リンパ注射によって達成することができる。
【０１１９】
上記のような共刺激分子を投与することによって患者のＴ細胞を共刺激し、Ｔ細胞に対する抗原非特異的シグナルを発生させることもできる。上記のようなＴ細胞をさらに刺激するために、上記のような抗ＣＴＬＡ−４を投与することによって、Ｔ細胞の阻害を妨げることができる。上記のような免疫系の抑制をさらに軽減するために、Ｔｒｅｇ枯渇化分子を投与することによって、Ｔｒｅｇを枯渇させることができる。上記のような血管新生関連抗原を投与することによって、腫瘍内血管の誘導および持続的発達を予防することができる。上記のような成分および組成物の効果を増強する増強剤を投与することができる。
【０１２０】
癌の治療方法は、化学療法、放射線、抗血管新生療法、およびそれらの組合せなどの治療法の実施をさらに含むことができる。これらの治療法は各々、単独で実施される場合よりも本発明の組成物と組み合わせて実施される場合に効果的である。
【０１２１】
本発明はまた、免疫抑制を逆転させ、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む相乗量の初代細胞由来生物製剤と、少なくとも１種の抗原を含む癌ワクチンとを含む上記の組成物を投与することによって癌に対する免疫を獲得し、ナイーブＴ細胞の産生を刺激し、未成熟な樹状細胞を成熟させ、かつ得られた成熟樹状細胞によるナイーブＴ細胞への癌ワクチン中の外因性抗原の提示を可能にし、それにより免疫抑制を逆転させ、癌に対する免疫を獲得する方法を提供する。言い換えると、初代細胞由来生物製剤と癌ワクチンは、免疫抑制患者における免疫系を効果的に作動させ、かつ外因性抗原に基づく癌に対する免疫を刺激するために、一緒に作用する。
【０１２２】
上記の方法と同様に、上記のような共刺激分子を投与することによって患者のＴ細胞を共刺激し、Ｔ細胞に対する抗原非特異的シグナルを発生させることもできる。上記のようなＴ細胞をさらに刺激するために、上記のような抗ＣＴＬＡ−４を投与することによって、Ｔ細胞の阻害を妨げることができる。上記のような免疫系の抑制をさらに軽減するために、Ｔｒｅｇ枯渇化分子を投与することによって、Ｔｒｅｇを枯渇させることができる。上記のような血管新生関連抗原を投与することによって、腫瘍内血管の誘導および持続的発達を予防することができる。上記のような成分および組成物の効果を増強する増強剤を投与することができる。
【０１２３】
免疫抑制を逆転させ、癌に対する免疫を獲得する方法は、化学療法、放射線、抗血管新生療法、およびそれらの組合せなどの治療法を実施することをさらに含むことができる。これらの治療法は各々、単独で実施される場合よりも本発明の組成物と組み合わせて実施される場合に効果的である。
【０１２４】
本発明はまた、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む初代細胞由来生物製剤のアジュバントと、少なくとも１つの外因性抗原（ここで、この外因性抗原は、通常は免疫応答を生じさせない）とを投与することと、患者における免疫応答を生じさせることとによって、患者における外因性抗原に対する免疫応答を生じさせる方法を提供する。外因性抗原は、通常は患者において免疫応答を生じさせない上記の抗原のいずれかであることができる。実施例１２は、ＩＲＸ−２が、通常は効果がないＰＳＭＡペプチドで免疫応答を生じさせるのに効果的であることを示す。この方法は、上記のような工程または化合物のいずれかとさらに組み合わせることができる。
【０１２５】
本発明は、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む初代細胞由来生物製剤を、少なくとも１種のアジュバントと組み合わせて投与することによって、患者における免疫応答を増強する方法を提供する。初代細胞由来生物製剤は上に記載されている。アジュバントは、ＴＬＲ非依存的アジュバント、ＴＬＲ依存的アジュバント、またはそれらの組合せであることができる。次に、本方法は、ＴＬＲ非依存的アジュバントを投与することによって、抗原を送達および濃縮し、抗原を抗原提示細胞にターゲッティングし、抗原および免疫増強剤を共局在させる工程を含むことができる。本方法はまた、ＴＬＲ依存的アジュバントを投与することによってＴＬＲを活性化することにより、免疫系を直接刺激する工程を含むことができる。上記のように、初代細胞由来生物製剤は、他のアジュバントと相乗的に作用し、抗原に応答して免疫系をより効果的に刺激する。好ましくは、外因性抗原を上記のように（例えば、癌ワクチンに含めて）投与することもできる。この方法は、上記のような工程または化合物のいずれかとさらに組み合わせることができる。アジュバントは、上記のような初代細胞由来生物製剤とは異なる作用機序を有することができる。
【０１２６】
本発明はさらに、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む初代細胞由来生物製剤を、少なくとも１種のアジュバント（ここで、このアジュバントは、初代細胞由来生物製剤の作用機序とは異なる作用機序を有する）と組み合わせて投与することと、免疫応答の機能を増大させることとによって、免疫系の機能を増大させる方法を提供する。言い換えると、初代細胞由来生物製剤とアジュバントは相乗的に相互作用して、初代細胞由来生物製剤またはアジュバントのみから得られるものを超えて免疫機能を増大させるが、それは、各々の成分が免疫系の様々な部分を「作動させ」て、より大きい免疫応答を生じさせるからである。この方法は、上記のような工程または化合物のいずれかとさらに組み合わせることができる。
ＩＲＸ−２の作用機序
【０１２７】
上で定義したように、本発明の初代細胞由来生物製剤はアジュバントとして作用する、すなわち、特定の抗原に対する患者の免疫応答を刺激または増強する。さらに、本発明のＩＲＸ−２組成物および方法は、Ｔ細胞媒介性免疫応答を刺激するのに特に適している。本発明の組成物および方法によって促進される免疫応答としては、ナイーブＴ細胞の誘導または生成、（例えば、リンパ節における）Ｔ細胞への適切な抗原提示を可能にする樹状細胞の分化および成熟、ならびに単球およびマクロファージの活性化が挙げられる。特に癌患者では、本発明の組成物および方法によって促進される免疫応答として、リンパ球による腫瘍浸潤、腫瘍の断片化および退縮ならびに（存在する場合）洞組織球増殖の低下が挙げられる。本質的には、初代細胞由来生物製剤は、免疫の生成を誘導し、かつ免疫の破壊を阻止する。初代細胞由来生物製剤の作用機序は、出願人に対する米国特許出願第１２／３２３，５９５号でさらに記載されている。
【０１２８】
より具体的には、本発明の組成物および方法は、ナイーブＴ細胞の産生を誘導することによって、患者における免疫低下／抑制を克服するのを助ける。本明細書で定義される「ナイーブ」Ｔ細胞という用語は、新たに産生されるＴ細胞を意味し、このＴ細胞は未だ抗原に曝露されたことがない。そのようなＴ細胞は非特異的であるが、抗原（例えば、腫瘍ペプチド）がその表面に露出している成熟樹状細胞による抗原提示によって特異的になることができる。したがって、本発明の組成物および方法は、新しいＴ細胞を補充するかまたは生成する（下記の実施例２および８を参照されたい）。
【０１２９】
さらに、特に腫瘍を有する癌患者において、本組成物および方法は、腫瘍内へのリンパ球浸潤、それに伴う顕著な腫瘍の断片化および退縮を可能にする。例えば、下記の実施例２〜７を参照されたい。そのような浸潤は、臨床的応答の最大化および生存率の最大増加のために重要である。例えば、９０：１０の比率のリンパ球：顆粒球浸潤またはマクロファージ浸潤が最適であり、Ｔ細胞および／またはＢ細胞の浸潤は、広汎性でかつ非常に強く、また、末梢性でないことが好ましい。組織学的試料における腫瘍の低下および断片化は良好な免疫応答を反映し、本発明の組成物によるアジュバント効果を示すものである。
【０１３０】
さらに、特定のリンパ節の変化（例えば、リンパ節腫脹）も、効果的な免疫応答、すなわち、腫瘍誘導性のサイズの低下の逆転だけでなく、正常な節サイズと比較した全体的なサイズの増加、ならびにＴ細胞およびＢ細胞領域の増加も示す。さらに、癌患者のリンパ節は、多くの場合、洞組織球増殖（ＳＨ）とも呼ばれる大きな組織球の類洞内蓄積を含む。ＳＨは、腫瘍抗原を取り込んで、プロセッシングしたが、成熟することができず、これらの腫瘍ペプチドをナイーブＴ細胞に提示することができない未成熟な樹状細胞が蓄積することであると考えられている。Ｔ細胞への適切な抗原提示がなければ、これらのＴ細胞は、Ｔｈ１およびＴｈ２エフェクター細胞を刺激することができない。通常、この刺激によって、それぞれ、細胞性免疫および抗体性免疫が体内で生じる。下記の実施例２〜７に示すように、本発明のサイトカイン組成物および方法は、癌患者のリンパ節におけるＳＨを低下させ、上記の様々なリンパ変化を生じさせ、これも、本発明の組成物によるアジュバント効果を示している。
【０１３１】
樹状細胞は、インビボでの適切な免疫応答の生成における抗原提示において、そのような重要な役割を果たすことが知られているので、樹状細胞成熟に対する刺激効果を有する薬剤は、抗原に対する良好な免疫応答を誘発する際にアジュバントとして作用するであろう。下記の実施例９に示すように、本発明のサイトカイン組成物は、樹状細胞成熟を促進する。さらに、実施例２のデータは、本発明のサイトカイン組成物が、すなわち、ＤＣ成熟を促進することによって、ＳＨをもたらす樹状細胞の欠陥も取り除き、したがって、特に癌患者において、本発明の組成物が、すなわち、リンパ節内のＳＨにおいてＤＣを取り除き、かつＤＣ成熟を全体に促進する際に複数のアジュバント効果を提供することを示す。
【０１３２】
本発明のサイトカイン組成物はまた、単球／マクロファージの強力なアクチベーターとして作用することによって、さらなるアジュバント効果を提供する。単球は、体内のＤＣとマクロファージの両方の前駆体であり、したがって、単球／マクロファージ活性化を促進する薬剤は、インビボの免疫応答に対するアジュバント効果を有する。下記の実施例１０を参照されたい。
【０１３３】
初代細胞由来生物製剤はまた、活性化Ｔ細胞をアポトーシスから防御することによって免疫破壊を阻止する。腫瘍エスケープの機構の１つは、腫瘍由来微小胞（ＭＶ）によって媒介されるアポトーシスを通じたＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の標的排除を含む。免疫抑制性ＭＶは、癌患者から得られた新生物性病変、血清、腹水および胸水中に見出されており、これらの患者のエフェクターＴ細胞におけるアポトーシスおよびＴＣＲ変化と関連付けられている。ＭＶが促進する、抗腫瘍宿主防御に必要なエフェクターＴ細胞の排除は、腫瘍エスケープおよび癌進行の一因である。それゆえ、抗腫瘍エフェクター細胞を機能障害や死から防御することが免疫療法の主な目的である。臨床データおよび実験データにより、特定のサイトカイン（とりわけ、共通の受容体γ鎖を用いる生存サイトカイン）は、活性化Ｔ細胞を腫瘍誘導性の死から防御し、その抗腫瘍活性を増強することができることが示されている。
【０１３４】
より具体的には、初代細胞由来生物製剤がＴ細胞をアポトーシスから防御するいくつかのやり方がある。抗アポトーシスシグナル伝達分子（すなわち、ＪＡＫ−３およびホスホ−Ａｋｔ）の発現を上方調節し、アポトーシス促進性分子（すなわち、ＳＯＣＳ−２）の発現を下方調節する。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるカスパーゼの活性化を減少させ、ｃＦＬＩＰ発現を増大させる。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ生存経路の阻害をＩＲＸ−２によって弱める。Ｔ細胞を外因性のアポトーシス（ＭＶ誘導性のアポトーシスおよびＦａｓＬ誘導性のアポトーシス）と内因性のミトコンドリアアポトーシスの両方から防御する。
【０１３５】
外因性ＭＶ誘導性のアポトーシスからの防御は、ＪＡＫ３、ＣＤ３−ζ、およびＳＴＡＴ５の下方調節を妨げ、Ａｋｔ−１／２の脱リン酸化を阻害し、かつＢａｘ／Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ−Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＢｉｍ／Ｍｃｌ−１の比率のバランスを維持することによってさらに達成される。ＭＶ誘導性のアポトーシスからの防御はまた、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７の活性の誘導を妨げることによって達成される。より具体的には、ミトコンドリア膜電位の喪失となるような、活性のある切断型カスパーゼ−３の誘導が阻止される。核ＤＮＡの断片化が阻害される。初代細胞由来生物製剤による内因性アポトーシスからの防御は、スタウロスポリン誘導性のアポトーシスからの活性化Ｔ細胞の防御によって示される。
【０１３６】
重要なことに、初代細胞由来生物製剤のサイトカインは、活性化Ｔ細胞をアポトーシスから相乗的な様式で防御する。言い換えると、初代細胞由来生物製剤におけるサイトカインの組合せによって、個々のサイトカインの単独投与で見られるよりも大きな効果が生じる。
【０１３７】
上記を考慮して、本発明の組成物および方法は、効果的なペプチド抗原提示をもたらす樹状細胞のインビボ成熟ならびに単球およびマクロファージの活性化ならびにナイーブな未分化Ｔ細胞の産生を含む、複数の効果によって免疫系を刺激する。適切な抗原提示は、Ｔ細胞およびＢ細胞のクローン性拡大をもたらし、患者における免疫を生成する。癌患者の場合、上述の効果は、（例えば、血行性伝播による）腫瘍内への（例えば、リンパ球の）浸潤ならびに腫瘍の縮小および／または破壊をもたらす。結果は、下記のデータによって示されるように、免疫記憶による生存の延長である（例えば、下記の実施例３を参照されたい）。
【０１３８】
上記の実施形態のいずれについても、治療のための以下の投与の詳細および／またはプロトコルが使用される。
【０１３９】
好ましくは、本発明のサイトカイン組成物を、病変（例えば、治療を受けている腫瘍または他の持続性病変）の所属リンパ節に流入するリンパ管周辺に注射する。より具体的には、局所外リンパ注射または当業者に公知の他の注射を、免疫療法製剤の十分な局在化がもたらされるように投与する。頭頸部癌の場合、注射を頸部に投与するが、治療することになっている疾患の要件に応じて、他の場所に適用することができる。そのような治療は、高い割合の頭頸部癌患者において臨床的な退縮を誘発し、これらの患者は、改善された無再発生存も示した（Ｈａｄｄｅｎ，１９９４；Ｍｅｎｅｓｅｓ，１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ，２０００；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，１９９３）。対照的に、頭頸部癌患者における組換えインターロイキン−２の腫瘍内注射（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，ｅｔ ａｌ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：５６５４−５６６２，１９９３））はＴ細胞リンパ球の浸潤を生じさせたが、目立った臨床的応答はなかった。同様に、外リンパ注射と組み合わせたマルチカイン（Ｃｅｌｓｃｉのウェブサイト）の腫瘍周辺注射は、１１人の患者でしか顕著な腫瘍応答（すなわち、５０％を上回る腫瘍の縮小）をもたらさず、その応答率は１０％未満であった。さらに、腫瘍周辺注射と腫瘍内注射は、最初はサイトカインプロトコルに対する陽性の応答を有していた患者ですらも、疾患の進行を伴うことがあり、したがって、その効果を取り消した。したがって、腫瘍周辺注射または腫瘍内注射は禁忌である。
【０１４０】
本発明の組成物を投与するための１０日間の注射スキームが好ましいが、２０日間の注射プロトコルを使用することができる。両側注射が効果的である。根治的頸部廓清を行なった場合、片側注射が効果的である。
【０１４１】
外因性抗原を利用することになっている実施形態では、外から与えられる合成抗原または抽出抗原（例えば、腫瘍抗原およびペプチド）（Ｂｅｌｌｏｎｅ，１９９８を参照されたい）を、別個の製剤に含めてまたは本発明のサイトカイン組成物の一部として、事前に初回刺激されたまたは同時に初回刺激された所属リンパ節または遠位リンパ節に投与することができる。
【０１４２】
例えば癌または他の免疫抑制性疾患によって引き起こされ得る内因性のＴ細胞抑制を、低用量シクロホスファミド（ＣＹ）と非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の共投与によって（すなわち、本発明のサイトカイン組成物と組み合わせて）阻止することができる。ＮＳＡＩＤはインドメタシン（ＩＮＤＯ）であることが好ましいが、イブプロフェンまたはＣｏｘＩＩインヒビター（例えば、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））もしくはロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ（登録商標）））またはそれらの組合せを使用することもできる。ＮＳＡＩＤの副作用をプロトンインヒビターおよびプロスタグランジンＥ類似体で積極的に治療することができる。Ｔ細胞免疫を回復させるために、亜鉛およびマルチビタミン（場合によっては、セレンの添加を含む）を作用物質として添加することもできる。好ましくは、亜鉛の用量は１５〜７５ｍｇである。標準的なマルチビタミンを投与することができる。亜鉛は、入手可能なグルコン酸塩であることができる。
【０１４３】
本発明のサイトカイン組成物を、手術、放射線療法、化学療法、またはそれらの組合せの前または後に投与することができる。本発明の組成物を、腫瘍の再発期間中に、すなわち、腫瘍が消失したと考えられたかまたは寛解期にあった時期の後に腫瘍増殖が再び生じている期間中に投与することができる。
【０１４４】
本発明のサイトカイン組成物を、個々の患者の臨床的状態、投与の部位および方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、および体重を考慮に入れて、外因性抗原または内因性抗原のいずれかに対する最適な免疫を促進するために、投与および投薬する。したがって、本明細書における目的での薬学的「有効量」は、当技術分野で知られているようなそのような考慮すべき事項によって決定される。この量は、免疫を促進し、例えば、腫瘍の縮小、腫瘍の断片化および白血球の浸潤、再発の遅延もしくは生存率の改善、または症状の改善もしくは消失（Ｔ細胞数の増加を含む）をもたらすのに効果的であるべきである。
【０１４５】
本発明の方法において、本発明の組成物を様々な形で投与することができる。本発明の組成物において使用されるサイトカインまたは外因性抗原を、その標準的な形態でまたは薬学的に許容される誘導体として投与することができ、かつ単独でまたは薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントおよびビヒクルと組み合わせた活性成分として投与することができることに留意すべきである。さらに、本発明の組成物を、皮内もしくは皮下に、またはリンパ周辺もしくはリンパ内に、リンパ節内もしくは脾臓内もしくは筋肉内に、腹腔内に、および胸腔内に投与することができる。治療を受けている患者は温血動物であり、特に、ヒトを含む哺乳動物である。薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントおよびビヒクルならびにインプラント担体は、通常、本発明の活性成分と反応しない、不活性で、無毒な固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化材料を指す。
【０１４６】
用量は、単回用量または数日間にわたる複数回用量であることができる。本発明の組成物を投与する場合、それらは通常、注射用単位投薬形態（例えば、溶液、懸濁液、またはエマルジョン）として処方される。注射に好適な薬学的製剤としては、滅菌水性溶液または分散液と、滅菌注射用溶液または分散液に再構成される滅菌粉末とが挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、または植物油を含む、溶媒または分散媒であることができる。
【０１４７】
例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散媒の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。水性ビヒクル（例えば、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、またはピーナッツ油）およびエステル類（例えば、ミリスチン酸イソプロピル）を本発明の組成物の溶媒系として使用することもできる。さらに、抗微生物防腐剤、抗酸化剤、キレート化剤、および緩衝剤をはじめとする、組成物の安定性、滅菌性、および等張性を高める様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）によって保証することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖類、塩化ナトリウムなど）を含めることが望ましい。吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を使用することによって、注射用薬学的形態の持続的吸収をもたらすことができる。しかしながら、本発明によれば、使用されるビヒクル、希釈剤または添加剤はいずれも、本発明のサイトカインまたは外因性抗原と適合性でなければならない。
【０１４８】
滅菌注射溶液は、本発明を実施する際に利用されるサイトカインまたは外因性抗原を、望ましい場合、他の成分のうちのいくつかとともに、所要量の適切な溶媒中に組み込むことによって調製することができる。
【０１４９】
本発明の薬理学的製剤を、任意の適合性の担体（例えば、様々なビヒクル、添加剤、および希釈剤）を含む注射用製剤に含めて患者に投与することができるか、または本発明において利用されるサイトカインおよび／もしくは外因性抗原を、徐放性の皮下インプラントもしくは標的送達系（例えば、モノクローナル抗体、有向送達、イオン導入、ポリマーマトリックス、リポソーム、およびミクロスフェア）の形態で患者に非経口的に投与することができる。本発明において有用な送達系の例としては、米国特許第５，２２５，１８２号；同第５，１６９，３８３号；同第５，１６７，６１６号；同第４，９５９，２１７号；同第４，９２５，６７８号；同第４，４８７，６０３号；同第４，４８６，１９４号；同第４，４４７，２３３号；同第４，４４７，２２４号；同第４，４３９，１９６号；および同第４，４７５，１９６号に開示されているものが挙げられる。多くの他のそのようなインプラント、送達系、およびモジュールは当業者に周知である。
【０１５０】
本発明の組成物および方法は、上で考察されたような、抗原産生疾患（例えば、癌、感染性疾患または持続性病変）の治療に有用であることが明白となるはずである。本組成物および方法は、患者における免疫応答をインビボで刺激することにより、これらの疾患によって産生される抗原に対する免疫を促進し、この免疫応答は、患者における疾患の症状および効果を緩和するかまたは消失させるのを助ける。
【０１５１】
上記の考察から、本発明を使用するための事実的根拠が与えられる。本明細書に開示された用途で使用される本発明の組成物および方法は、以下の非限定的な実施例および添付の図面によって示すことができる。
【０１５２】
下記に示す実施例には、本発明によるサイトカイン混合物であるＩＲＸ−２の調製、癌患者における免疫応答を刺激するためにＩＲＸ−２を内因性腫瘍抗原とともにアジュバントとして使用することを示す臨床試験からのデータならびにインビボで免疫応答を刺激するために本発明のサイトカイン混合物を外因性抗原とともに使用することを示すマウスおよびヒトにおける実験が記載されている。
【０１５３】
より具体的には、下記の実施例１には、本発明によるサイトカイン組成物のＩＲＸ−２の産生が記載されている。ＩＲＸ−２の産生は、米国特許第５，６３２，９８３号および同第５，６９８，１９４号に十分に開示されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５４】
下記の実施例２には、（低用量シクロホスファミド（ＣＹ）、インドメタシン（ＩＮＤＯ）および亜鉛と組み合わせて）ＩＲＸ−２で処置されたＨ＆Ｎ ＳＣＣ患者が、免疫を示すリンパ節の変化（例えば、リンパ節サイズの増大および洞組織球増殖の減少）、リンパ球による腫瘍浸潤、ならびに腫瘍の縮小および断片化をはじめとする、顕著な臨床的および病理学的応答を示した臨床試験データが開示されている。実施例４〜７は、さらなる癌患者、すなわち、リンパ腫、子宮頸癌、肝癌、および陰茎扁平上皮癌（ヒトパピローマウイルス関連）の患者に関するものであり、これらの患者は全て、本発明のＩＲＸ−２で処置され、その処置に対する顕著な臨床的応答を示した。実施例３は、これらの研究の癌患者の生存の延長（最長２年）に関するデータを提供している。
【０１５５】
実施例２に示すように、ＩＲＸ−２による治療はまた、Ｔリンパ球減少患者におけるＴリンパ球数の著しい増加および対応するナイーブＴ細胞（抗原に曝露されていない新たに生成されたＴ細胞）の増加をもたらした。さらに、下記の実施例８のデータによって示されるように、これらの研究で観察されたＴ細胞の増加は、特に、本発明のサイトカイン組成物での処置によるものであった。より具体的には、実施例８には、ＩＲＸ−２のみ（ＣＹおよび／またはＩＮＤＯの投与を伴わない）によるリンパ球減少Ｈ＆Ｎ ＳＣＣ癌患者の治療のデータが提供されており、この治療では、リンパ球数全体ならびに特定のＣＤ３＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット集団の有意な増加が得られた。
【０１５６】
同様に、実施例９のデータは、ＩＲＸ−２が、形態学的基準、表現型基準および機能的基準によって測定されるような、樹状細胞の分化および成熟を促進することを示している。上述のように、樹状細胞（ＤＣ）は、抗原に対する、すなわち、抗原を適切なＴ細胞に提示することによる、患者の免疫において極めて重要な役割を果たすことが知られている。より具体的には、実施例９は、ＩＲＸ−２が、成熟を示すＤＣの形態学的変化を促進することを示している。ＩＲＸ−２は、ＤＣ細胞表面でのＣＤ１ａ抗原発現を下方調節し、ＤＣ細胞表面でのＣＤ８３およびＭＨＣ ＩＩ抗原発現を上方調製し、かつＤＣ細胞表面でのＴ細胞共刺激分子ならびに接着分子（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１））発現を増大させることも示された。さらに、ＩＲＸ−２は、（ＤＣの成熟と一致する）ＤＣエンドサイトーシス活性を下方調節し、（ＭＬＲ活性の増加によって示されるような）ＤＣのＴ細胞刺激活性を増強し、かつＤＣからのＩＬ−１２の産生を増大させることが示された。ＩＬ−１２それ自体は、ナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の（Ｔｈ１細胞への）分化ならびに免疫系の細胞成分および食細胞成分の活性化および増殖に不可欠な因子である。最後に、ＩＲＸ−２は、ＶＥＧＦ誘導性のＤＣのアポトーシスを低下させることが示された。ＩＲＸ−２のこの抗アポトーシス効果は、腫瘍環境内で成熟ＤＣの生存を維持し、腫瘍抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の持続的な抗原提示および活性化を可能にする上で極めて重要な役割を果たし得る。
【０１５７】
下記の実施例１０のデータは、ＩＲＸ−２が単球およびマクロファージの強力なアクチベーターであることをさらに示している。例えば、ＩＲＸ−２は、単球／マクロファージの活性化マーカー、すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０を顕著に増大させる。さらに、ＩＲＸ−２は、ＴＮＦ−αまたはＬＰＳよりも強力な単球／マクロファージのアクチベーターであることが示され、ＩＲＸ−２は、免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の存在下ですら細胞を活性化し続けることができた。
【０１５８】
下記の実施例１１は、サイトカイン組成物を外因性前立腺特異的膜（ＰＳＭＡ）ペプチド抗原コンジュゲートと組み合わせて投与した後に、マウスにおける免疫応答を、すなわち、ＤＴＨ応答および抗体応答の形態で誘発するＩＲＸ−２の能力を示している。ＩＲＸ−２は、進行前立腺癌を有するヒトにおいて、コンジュゲートされていないＰＳＭＡペプチドに対するＤＴＨ応答を刺激するのにも効果的である。
【０１５９】
下記の実施例１２はさらに、ＰＳＭＡ外因性抗原と組み合わせたＩＲＸ−２の有効性を示している。さらに、ＩＲＸ−２を、放射線照射したＰＳＭＡ発現細胞に基づくワクチンまたは合成ペプチドコンジュゲートワクチンと組み合わせて投与し、これらの抗原に対するインビボでのＴ細胞免疫応答を増強することができた。
【０１６０】
下記の実施例１３はさらに、これらの抗原に対するインビボでのＴ細胞免疫応答を増強する際のペプチドおよび不完全フロイントアジュバントと組み合わせたＩＲＸ−２の有効性を示している。これらの実験の結果は、ＩＲＸ−２を多重抗原癌ワクチンおよび細胞に基づくワクチンと効果的に組み合わせることができることを示している。
【０１６１】
下記の実施例１４はさらに、ＣｐＧ、ポリＩ：Ｃ、ＩＦＮ−γおよび不完全フロイントアジュバントをはじめとする他のアジュバントと組み合わせたＩＲＸ−２の有効性を示している。さらに、ＩＲＸ−２は、これらの他のアジュバントと組み合わせて、インビボでの抗原特異的Ｔ細胞応答および抗原特異的Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強することができた。ＩＲＸ−２は、ＣｐＧ、ポリＩ：Ｃ、ＩＦＮ−γおよび不完全フロイントアジュバントを含むワクチンの一部として含まれた場合、１回の接種として投与されたときに、抗原特異的Ｔ細胞応答を増強するのに効果的であった。
【０１６２】
下記の実施例１５はさらに、ウイルスに基づくワクチンと組み合わせてＢ細胞応答およびＴ細胞応答を増強する際のＩＲＸ−２の有効性を示している。さらに、ＩＲＸ−２は、３つ組の共刺激分子ＴＲＩＣＯＭを発現するウイルスに基づくワクチンと組み合わせて使用されたとき、Ｂ細胞応答およびＴ細胞応答を増強する。
【実施例】
【０１６３】
細胞培養に関連する工程は全て滅菌条件下で行なわれる。本明細書に記載されていない細胞免疫学の一般的な方法は、細胞免疫学の手法についての一般的な参考文献（例えば、Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８１））に記載されている通りに行なわれ、また、これらの方法は当業者に周知である。
実施例１
【０１６４】
初代細胞由来生物製剤（ＩＲＸ−２）の調製
【０１６５】
初代細胞由来生物製剤の製造方法は、一般に、米国仮特許出願第６１／０４４，６７４号に記載されている。白血球をリンパ球分離培地（ＬＳＭ）の上に載せ、この培地を遠心分離することによって単核細胞（ＭＮＣ）を純化して夾雑細胞を除去し、自動化された細胞の処理および洗浄システムを用いて純化されたＭＮＣを得る。その後、ＭＮＣをＦＥＰリンパ球保存バッグで一晩保存する。ＭＮＣの誘導混合物を使い捨ての細胞培養装置中でマイトジェン、好ましくはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と、シプロフロキサシンとで刺激し、初代細胞由来生物製剤をＭＮＣから産生する。マイトジェンを濾過および接線流濾過の手法により誘導混合物から除去し、その後、誘導混合物をインキュベートする。誘導混合物を濾過により清澄化して、初代細胞由来生物製剤上清を得る。最後に、陰イオン交換クロマトグラフィーと、１５ナノメーター濾過と、場合により、紫外線Ｃ（ＵＶＣ）による不活化とを適用して、初代細胞由来生物製剤上清をＤＮＡおよび外来性の作用因子から除去する。その後、将来患者に投与するために、最終産物をバイアルに入れて、保存する。
実施例２
【０１６６】
低用量ＣＹ（３００ｍｇ／ｍ２）、ＩＮＤＯ（２５ｍｇ、経口で１日３回）、および亜鉛（硫酸塩としての元素亜鉛６５ｍｇ、経口で１日１回）による処置に加えた、頸部へのＩＲＸ−２の局所外リンパ注射により、高い割合の頭頸部扁平上皮癌患者（Ｈ＆ＮＳＣＣ）における臨床的退縮が誘発され（Ｈａｄｄｅｎ，１９９４；Ｍｅｎｅｓｅｓ，１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ，２０００；Ｈａｄｄｅｎ，２００３；Ｍｅｎｅｓｉｓ，２００３）、改善された無再発生存が示された。病理標本における微応答（２５％〜５０％）、腫瘍の収縮および腫瘍の縮小を含めて、全体として、９０％超が応答を示し、大半は５０％を上回る腫瘍の縮小を示した。
【０１６７】
これらの応答は、Ｂリンパ球とＴリンパ球の両方が腫瘍に浸潤することが観察されたため、免疫退縮により媒介されると推測される。この治療法は、顕著な毒性を伴わなかった。ＩＲＸ−２と組み合わせたリンパ球減少癌患者の処置は、著しいリンパ球の動員をもたらした。解析すると、これらの患者は、ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞（すなわち、ナイーブＴ細胞（下記の表Ｉを参照されたい））の増加を示した。さらに、Ｈ＆ＮＳＣＣ患者におけるＩＲＸ−２の腫瘍内注射または腫瘍周辺注射は、免疫療法誘導性の腫瘍退縮の逆転または腫瘍の進行のいずれかを引き起こした。したがって、腫瘍は免疫の部位ではない。それどころか、所属リンパ節の解析により、所属リンパ節が想定上の腫瘍抗原に対する免疫の部位であることが明らかとなった（Ｍｅｎｅｓｅｓ，２００３；図１〜５を参照されたい）。ＩＲＸ−２で処置されたこれらの患者は誰も、臨床的に患者の１５％および病理学的に５０％まで予想される転移を発症しなかった。これらの結果は、単なる局所免疫ではなく全身性免疫が誘導されたことを示す。患者は、処置の前に０．１ｍｌのＩＲＸ−２に対して皮膚試験で予備試験され、陽性の皮膚試験（２４時間で＞０．３ｍｍ）を示した者の９０％よりも多くが、頑健な臨床的および病理学的応答を有した。陰性の皮膚試験を示した患者は、弱い応答または無応答であった。したがって、皮膚試験は良好な応答者を選別する。
【０１６８】
Ｔリンパ球数（ＣＤ３）の大きな増加（７５２→１０２０）がこれらのＴリンパ球減少患者において観察された（Ｔ細胞数７５２対１６００（正常））。重要なことに、「ナイーブ」ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞が対応して増加した（５３２→７８２）。先に述べたように、これらの増加は、特に、ＩＲＸ−２のような薬理療法では成人に生じないと一般に考えられている。これらの細胞はおそらく、胸腺遊出（ｔｈｙｍｉｃ ｅｍｉｇｒｅ）したばかりであり、腫瘍抗原のような新しい抗原に応答する主要な新能力と考えることができる。既存のＣＤ４５ＲＡ陽性細胞は腫瘍抗原に応答しなかった。これらの細胞は、腫瘍誘導性の免疫抑制（アネルギー）のために、そうすることができなかったのかも知れない。
【表１】

【０１６９】
文献（Ｈａｄｄｅｎ ＪＷ，Ｉｎｔ’ｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ １１／１２：６２９−６４４，１９９７；Ｈａｄｄｅｎ ＪＷ，Ｉｎｔ’ｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ ２１：７９−１０１，１９９９）は、２つの主要な型の癌であるＳＣＣと腺癌の両方について、所属リンパ節が、洞組織球増殖と、リンパ枯渇と、しばしば（ＩＬ−２で）腫瘍細胞に反応することができる腫瘍関連リンパ球の存在とを含む、腫瘍に関連する異常を反映することを示している。転移に伴って、リンパ枯渇および機能低下が起こる。１０人のＨ＆ＮＳＣＣ患者の非病変頸部リンパ節の未発表の解析により、平均リンパ節サイズの減少およびＨ＆ＮＳＣＣと関連する洞組織球増殖の増加が示された（本出願の図１〜４ＡおよびＢの対照を参照されたい）。
【０１７０】
１サイクルのＩＲＸ−２プロトコル（Ｈａｄｄｅｎ，１９９４；Ｍｅｎｅｓｅｓ，１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ，２０００）による処置の後、非病変頸部リンパ節は図１〜４に示す変化を示した。ＩＲＸ−２で処置していないＨ＆ＮＳＣＣ患者の所属リンパ節と比較すると、これらの節は、サイズ、Ｔ細胞の領域および密度の顕著な増加を示し、かつ洞組織球増殖および鬱血の減少を示した。処置した患者のリンパ節は全て刺激され、対照リンパ節より大きく、Ｔ細胞の領域および密度は増加した。したがって、これらのリンパ節は正常にまで回復するだけでなく、Ｈ＆ＮＳＣＣの生存と正に相関することが知られているＴ細胞優勢の証拠を示した（Ｈａｄｄｅｎ，１９９７）。
【０１７１】
重要なことに、Ｂ細胞およびＴ細胞の領域に関連するリンパ節の変化がＴ細胞およびＢ細胞の浸潤を反映する腫瘍の変化と相関する場合、Ｔ細胞（ｐ．＜０．０１）およびＢ細胞（＜０．０１）および全リンパ球の存在（ｐ．＜０．００１）について高度の相関関係が得られた（図５）。同様に、これらの変化は病理学的基準および臨床的基準による腫瘍の縮小と相関した。これらの発見は、腫瘍の反応がリンパ節の変化と直接にかつ正に相関すること、および腫瘍の反応が従属変数としてのリンパ節の変化を反映することを示す。これらの発見は、免疫系が一般的にどのように機能するかについての知識（Ｒｏｉｔｔ，１９８９）、およびサイトカイン遺伝子による以下の腫瘍トランスフェクション（Ｍａａｓｓ，１９９５）と併せて、ＩＲＸ−２プロトコルがリンパ節のレベルで内因性腫瘍抗原に対してこれらの患者を免疫することを示す。自己腫瘍抗原による免疫を反映するリンパ節の変化についての証拠はこれまで提示されていなかった。これにより、本発明が、遠隔転移の退縮をもたらす作用においてこれまで効果がなかったかまたは効果に乏しかった腫瘍抗原で免疫を誘導することができることが確認されている。
実施例３
【０１７２】
前述の臨床試験データ研究の臨床的、病理学的および生存のデータのさらなる分析から、自身の自己腫瘍抗原に対する癌患者の免疫および得られる腫瘍の免疫退縮に関するような本発明の性質についてのより多くの洞察が得られる。図６は、ＩＲＸ−２プロトコルによる処置が、４８カ月での生存の延長（ｐ＜０．０１）を伴うことを示す。図７は、陽性の臨床的応答が生存と相関する、すなわち、完全応答（ＣＲ）および部分応答（ＰＲ）（＞５０％の腫瘍の縮小）の患者が、微応答（ＭＲ）（＜５０％だが、＞２５％の腫瘍の縮小）または無応答（ＮＲ）（＜２５％）の患者よりも良好な生存を示す（ｐ＜０．０１）ことを示す。図８は、より強い病理学的応答（指標６〜９）の患者がより弱い病理学的応答（＜６）の患者よりも良好な生存を示すことを示す（ｐ＜０．０２）。図９は、単一変数としての腫瘍へのリンパ球浸潤が生存を予測する（ｐ＜０．０１）ことを示す。臨床的応答と病理学的応答との関係に関するカイ二乗分析は極めて有意な関係を示し（ｐ＜０．０１）、これは、この２つが互いにおよび生存と相関し、したがって、臨床的応答、免疫退縮パラメータ、および生存に相関するデータの統計的三角測量を提供することを示す。そのような関係がヒトの癌の免疫療法について示されたことはこれまでなかった。
【０１７３】
最後に、図１０は、用量と２４カ月での全体的な生存を関連付ける、本発明のＩＲＸ−２についての用量応答曲線を示す。ＩＲＸ−２処置は、約１００〜２３３国際単位のＩＬ−２当量で生存に最適な効果を与える。
実施例４
【０１７４】
頭頸部のリンパ腫を有する２人の患者を上記のようなプロトコルに従って治療した。以下のスキームに従った。
【０１７５】
処置の前に、患者の前腕に０．１ｍｌのＩＲＸ−２を皮下注射して皮膚試験し、その領域に印を付け、２４時間後に試験を読み取った。この試験は、誘導および紅斑が３ｍｍ以上である場合に陽性とみなされた。
【０１７６】
症例１：
【０１７７】
患者は、左顎下腺領域に腫瘍が３カ月存在する既往歴を示し、他の症状はない２３歳の男性であった。応急処置室で、患者は、深いレベルで一部固定された、硬質性の直径約６．５ｃｍの左顎下三角のリンパ節腫脹を有していることが分かった。残りの身体検査は正常であった。切開生検でホジキンリンパ腫が示された。病変の病期はＥＣＩＩＡとされた。１サイクルのＩＲＸ−２処置が施され、リンパ節腫脹のサイズが直径１ｃｍだけ減少する微応答が得られた。ＩＲＸ−２処置の後に得られた生検報告では、病変の６０％が正常なリンパ球の浸潤を示し、新生物の残り（４０％）は壊死を示した。生存する腫瘍細胞は見当たらなかった。
【０１７８】
この後、患者は頸部に３６００ラドの放射線治療を受けた。患者は、２年経って無病であった。
【０１７９】
症例２：
【０１８０】
患者は、２カ月の有痛性中頸部腫瘤、および１０ｋｇの体重減少の既往歴を示した８２歳の男性である。身体検査で、患者は右口蓋扁桃に腫瘍を示し、この腫瘍は、約４×３ｃｍまで肥大し、扁桃腺の中心に潰瘍があった。頸部で、右顎下リンパ節は約２×２ｃｍと測定され、レベルＩＩおよびレベルＩＩＩのリンパ節腫瘤は約５×５ｃｍであった。残りの検査は正常であった。扁桃腺および頸部リンパ節の１つの切開生検で、中悪性度の明確な混合型非ホジキンリンパ腫であることが示された。
【０１８１】
患者は２サイクルのＩＲＸ−２を受け、サイクルの最後に扁桃腺および頸部のリンパ節腫脹に直径１ｃｍの減少が観察された。ＩＲＸ−２処置後の病理報告では、生存腫瘍が２０％、腫瘍断片化および壊死が３０％、ならびに正常なリンパ球浸潤が５０％であることが示された。
【０１８２】
患者に、６サイクルの化学療法（ＣＨＯＰ）、次いで全用量４６００ラドの外部放射線療法（ＲＴ）を施した。患者は、ＲＴの８カ月後に後頭部に腺肥大を再発した。患者は、頸部疾患の所見が見られた３カ月後に亡くなった。
実施例５
【０１８３】
未処置の初期子宮頸癌を有する１０人の患者（臨床病期はＩＢ１、ＩＢ２、およびＩＩＡ）を、ＩＲＸ−２の局所外リンパ注射（毎日１０回の注射）と、それに続く２１日目での放射線子宮摘出術で処置した。ＩＲＸ２処置を開始する１日前に、患者に、単回ＩＶ用量のＣＹを３００ｍｇ／ｍで投与した。ＩＮＤＯまたはイブプロフェンおよび硫酸亜鉛を１日目から２１日目まで経口投与した。臨床的および病理学的応答、毒性ならびに無病生存率を評価した。
【０１８４】
患者全員がＩＲＸ−２処置を完了し、応答および毒性について評価された。臨床的応答は患者の５０％に見られた（３人が部分応答（ＰＲ）、２人が微応答（ＭＲ）（＞２５％＜５０％の減少））。７人の患者が手術を受けた。病理学的に、腫瘍断片化を伴う腫瘍の縮小は５人の症例で見られた。腫瘍に浸潤する細胞型のパターンは不均一であり、リンパ球、形質細胞、好中球、マクロファージおよび好酸球が含まれた。処置は、注射時の軽度の疼痛および少量の出血とＩＮＤＯに対する胃の不耐性を除いて、十分に耐えられるものであった。２４カ月の経過観察で、９人の患者は無病であった。
【０１８５】
この研究は、ＩＲＸ−２処置によって、初期の未処置の子宮頸癌における免疫媒介性の腫瘍応答が誘導されることを示している。
実施例６
【０１８６】
原発性肝細胞癌からの肝転移を有する２人の患者を、脾臓内ＩＲＸ−２（１回または３回の注射）で処置した。プロトコルは、Ｈ＆ＮＳＣＣ、子宮頸部、またはリンパ腫の症例について先に記載した通りであった。１人の進行性肝細胞癌患者は、断層撮影法で確認される部分応答を有した。もう一人は手術で確認される部分応答を有した。組織学的試験は、腫瘍の縮小、断片化、およびリンパ球浸潤を示した。
実施例７
【０１８７】
陰茎の扁平上皮癌（ヒトパピローマウイルスが関連するもの）を有する４人の患者を上記のようなＩＲＸ−２プロトコルで処置した。４人全員が臨床的に部分応答を有し、手術標本は、Ｈ＆ＮＳＣＣ癌患者に特徴的な腫瘍の縮小および断片化ならびにリンパ球浸潤を示した。
実施例８
【０１８８】
ＩＲＸ−２によるＴリンパ球減少の矯正
【０１８９】
以下の実験の目的は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αという６つのサイトカイン（１１５ユニットのＩＬ−２当量／日）を含むＩＲＸ−２を毎日１０日間注射する処置がリンパ球減少患者のリンパ球数（ＬＣ）に与える効果を評価することであった。これらの患者は、過去の頭頸部癌の手術および放射線療法から回復し、平均数４４１細胞／ｍｍ３の持続性リンパ球減少を示していた。ＬＣの正常レベルは２０００細胞／ｍｍ３である。処置の時点で、患者には癌がなかった。ＬＣを０日目と１３日目に得た。Ｔリンパ球（ＣＤ３＋）およびＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）をサイトフルオロメトリーで評価した。表ＩＩに、５人の応答患者のデータを示す。有意な増加は、ＬＣ、ＣＤ３＋、およびＣＤ４＋Ｔ細胞について観察された。
【表２】

【０１９０】
これらの変化は、リンパ球減少ＡＩＤＳ患者においてはるかに高用量のペグ化インターロイキン２（３×１０^６ユニットの組換えＩＬ−２）で達成された変化（Ｔ．Ｍｅｒｉｇａｎ、私信）よりも優れているが、毒性はより低い。これらの変化は、ＡＩＤＳ患者において＞１０×１０^６ユニット／日のＩＬ−２を８日間注入することにより達成された変化よりは小さい。しかしながら、後者は、多大な費用、不自由を要求し、また、毒性が大きかった（Ｋｏｖａｋｓ，１９９７）。ＩＲＸ−２によるこれらの結果は、ＩＮＤＯおよびＣＹの非存在下で得られたものであり、したがって、このレジメンのＬＣに対する効果が本発明のＩＲＸ−２組成物の効果であることを示している。
実施例９
ＩＲＸ−２は樹状細胞の成熟および活性化を刺激する：
【０１９１】
先の実験では、ＩＲＸ−２で処置した５人のＨ＆ＮＳＣＣ患者および未処置の５人のＨ＆ＮＳＣＣ対照患者からのリンパ節を単離し、細胞成分を、樹状細胞の細胞表面マーカーのパネル（すなわち、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋、およびＣＤ６８＋）を用いてフローサイトメトリーで解析した。上述のように、洞組織球増殖は、一部の癌患者に見られるリンパ節病理であり、これは、未成熟な樹状細胞に相当する巨大な組織球がリンパ節内で蓄積することを特徴とする。図１１Ａに示すように、ＳＨ（ＳＨ＋）患者では、リンパ節にＣＤ６８＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６−のＤＣが蓄積しているが、目立ったＳＨのない患者では、ＣＤ８３＋細胞がほとんどない。しかしながら、ＩＲＸ−２処置により、未処置の癌対照と比較して（ＣＤ６８＋、ＣＤ８３＋と同時に）ＣＤ８６＋ＤＣの数が５倍増加し、「活性化」ＤＣ表現型への転換が示された。対照は、ＩＲＸ−２で処置した癌患者と比較される未処置のＨ＆ＮＳＣＣ患者である（図１１Ｂ参照）。
【０１９２】
洞組織球増殖は、内因性腫瘍ペプチドを担持すると考えられる一部成熟したＤＣが蓄積することを表すので、共刺激受容体ＣＤ８６の発現による完全な成熟および活性化により、本発明のＩＲＸ−２を用いて、成熟に関するこの欠陥が矯正され、かつＴ細胞への効果的な抗原提示が可能になることが示されている。したがって、本発明のＩＲＸ−２は、洞組織球増殖を逆転させ、ナイーブＴ細胞の効果的な免疫をもたらす。
【０１９３】
上記のデータおよびＭｅｎｅｓｅｓら（２００３）に含まれる後のデータは、外リンパＩＲＸ−２、低用量ＣＹ、およびＩＮＤＯを用いたＨ＆ＮＳＣＣ患者の処置が、この癌および他の癌のリンパ節に現われることが多い洞組織球増殖を逆転させることを示した。しかしながら、上記の薬剤ＩＲＸ−２、ＣＹ、および／またはＩＮＤＯのうちのどれがこの欠陥を矯正するのかということは、このデータからは明らかでなかった。
【０１９４】
以下のデータは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αという６つのサイトカインを含むＩＲＸ−２が、ＣＹおよび／またはＩＮＤＯの非存在下でＤＣの成熟および活性化を誘導する証拠を示している。これらの実験で使用されるＩＲＸ−２は、上に列挙されたかまたは下記の表ＩＩＩに示すような６つのサイトカインを含む。これらの実験の目的のために、ＩＲＸ−２濃度を、ＩＲＸ−２に含まれるＴＮＦ−αの濃度として表す。ＴＮＦ−αを含むＩＲＸ−２中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡで測定した。組換えＴＮＦ−αの純度は＞９５％である。滴定を除く全ての実験について、ＩＲＸ−２を１ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【表３】

【０１９５】
使用した培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０であった（全ての試薬をＣｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡから購入した）。ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＶＥＧＦ１６５は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）から購入した。Ｘ−ＶＩＶＯ １０は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ＬＰＳは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。製造者の指示に従って高感度のカブトガニ血球抽出物アッセイ（ＬＡＬアッセイ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を用いて、全ての試薬をエンドトキシン汚染について検査し、陰性であることが分かった。全ての溶液は、最小検出限界の０．０６ＥＵ／ｍｌ未満しか含まないことが分かった。さらに、全てのプラスチック製品は、パイロジェンフリーであった。
【０１９６】
これらの実験で使用されるＰＢＭＣを、フィコール−ハイパック遠心分離（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）を用いる遠心分離によって、健康ドナーの白血球濃縮バフィーコート３０ｍｌから得、低密度画分を４２．５〜５０％界面から回収した。細胞を培養培地に再懸濁し、６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に接着させた。３７℃で２時間後、非接着細胞を洗浄により除去し、接着細胞（約９０％がＣＤ１４＋細胞、すなわち、単球）を、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）および５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）を補充した３ｍｌの培地中で培養した。
【０１９７】
表面マーカー解析のために、以下の蛍光色素コンジュゲートｍＡｂ（全てＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ製）を使用した：ＣＤ８６−ＰＥ、ＣＤ８０−ＦＩＴＣ、ＣＤ５４−ＡＰＣ、ＣＤ８３−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１ａ−ＡＰＣ、ＣＤ４０−ＦＩＴＣおよび適切なアイソタイプ対照。ＦＡＣＳを用いて免疫表現型の解析を行なった。細胞（０．２５×１０^６個）を２％のＦＢＳおよび０．１％のＮａＮ３を補充したＰＢＳ（ＦＡＣＳ洗浄バッファー）で洗浄し、ＡＰＣ−、ＰＥ−、もしくはＦＩＴＣ−コンジュゲートｍＡｂまたは対応するアイソタイプ一致ｍＡｂとともに室温で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ洗浄バッファー中で洗浄して余分なｍＡｂを除去した。結果を、平均蛍光強度または特定の抗原を発現する細胞のパーセンテージのいずれかとして表した。１０，０００事象を取得した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で蛍光解析を行ない、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて解析した。
【０１９８】
図１２に示すように、本発明のＩＲＸ−２組成物は、ＤＣ成熟の重要なマーカーであるＣＤ８３抗原を有するＤＣの数を増加させた。より具体的には、接着性ＰＢＭＣを上記のようにＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で７日間培養し、その後、増加量の組換えＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）またはＩＲＸ−２のいずれかで刺激した。４８時間後、細胞を洗浄し、ＣＤ８３発現についてフローサイトメトリーで解析した。図１２は、ＣＤ８３＋細胞の増加から明らかなように、ＩＲＸ−２がＤＣ成熟を誘導する活性があることを示している。さらに、ＩＲＸ−２は、ＤＣ成熟を誘導する活性が等用量のＴＮＦ−αのみよりも大きかった。図１２のデータは、５回の個別の実験の平均−／＋ＳＥＭとして表されている（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによる）。
【０１９９】
これらのデータは、ＩＲＸ−２がＤＣの成熟を促進し、かつＤＣ成熟に作用することが知られている、ＩＲＸ−２混合物に含まれるどの単一のサイトカインでも説明できないような形でＤＣの成熟を促進することを示している。例えば、ＰＢＭＣの通常のインビトロ分化には、１００〜５００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）および５００〜１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在が必要とされる。これにより、ＤＣ系統に分化しているが、比較的未成熟な状態にある（低い／中程度のＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ発現、ＣＤ８３は未発現）細胞の集団が生成される。未希釈のＩＲＸ−２は検出不可能な量のＩＬ−４を含み、かつＤＣのインビトロ分化に必要とされるよりも１０〜５０倍低い濃度のＧＭ−ＣＳＦ（約１．１ｎｇ／ｍｌ）を含む。したがって、ＩＲＸ−２中の個々のＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦサイトカインは、図１２の培養で産生されるＣＤ８３＋細胞を説明するものとはなり得ない。
【０２００】
ＴＮＦ−αは、そのような細胞を誘導することができるが、本発明のＩＲＸ−２に含まれる濃度をはるかに上回る濃度でしか誘導できない（図１２参照）。例えば、（インビトロで数日間のＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４によって）樹状細胞系統に最初に分化させた後、「危険信号」（例えば、病原性因子（例えば、ＬＰＳ）に由来するもの）を後から添加することによって、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲの高／強発現、およびＣＤ８３の存在を含む、完全に成熟した樹状細胞表現型が誘導される。２０〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲のＴＮＦ−αは、そのような病原性因子に由来する危険信号を大部分模倣し、同じマーカーの上方調節をもたらすことができる。しかしながら、未希釈のＩＲＸ−２混合物は、完全なＤＣ成熟に必要とされるＴＮＦ−α濃度をはるかに下回る、平均２．８ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αしか含まない。したがって、図１２に示す結果は、この実験で使用されるＴＮＦ−α当量濃度では、ＩＲＸ−２によるＣＤ８３マーカーの誘導をＩＲＸ−２混合物にＴＮＦ−αが存在することのみのせいにすることができないことを明白に示している。
【０２０１】
ＤＣが未成熟細胞から成熟細胞へと進むにつれて、明確な形態学的変化を遂げることが知られているので、ＩＲＸ−２処理によって細胞の形態が変化するかどうかを明らかにするために、未成熟ＤＣをＩＲＸ−２で処理した。より具体的には、接着性ＰＢＭＣを上記のようにＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）の存在下で４日間増殖させ（この処理により未成熟ＤＣが得られることが知られている）、次に、ＩＲＸ−２で処理するかまたは対照として処理しないで維持するかのいずれかにした。３日後、細胞をライト染色および検鏡で可視化した。図１３に示すように、ＩＲＸ−２で処理した細胞（図１３Ｂ）は、成熟ＤＣの特徴的な細胞突起と運動性を示し、細胞突起および細胞膜（ｖｅｉｌ）を連続的に伸縮させた。これらの細胞は、未処理対照と比較して、巨大で不規則な形の核、多数の小胞、比較的少ない細胞質顆粒、および顕著でかつ多数の細胞突起を有していた（図１３Ａ）。したがって、ＩＲＸ−２処理は、典型的な成熟ＤＣの形態を有するＤＣを生じさせた。
【０２０２】
さらに、未成熟ＤＣから成熟ＤＣへの原型的な移行が、特定の細胞表面抗原のよく特徴付けられている増加および減少をもたらすことが知られている。例えば、未成熟ＤＣは高レベルのＣＤ１ａを発現しており、刺激（例えば、サイトカインまたは細菌産物）に直面すると、このマーカーが下方調節される。したがって、ＩＲＸ−２処理が、ＤＣの活性化および成熟と関連する細胞表面マーカーの獲得または喪失をもたらしたかどうかを明らかにするために、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で処理した接着性ＰＢＭＣ（単球）（上記）を７日間培養し、その後、ＩＲＸ−２とともにまたはＩＲＸ−２なしで、４８時間インキュベートした。ＣＤ１ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ５４の発現をフローサイトメトリーで調べ、平均蛍光強度として表した。
【０２０３】
図１４のヒストグラムによって示されるように、未成熟ＤＣのＩＲＸ−２処理（ヒストグラム中の実線で示したもの）は、ＣＤ１ａ発現の下方調節（１４７対６２）およびＭＨＣＩＩ発現の上方調節（４５５対６６２）をもたらした。さらに、ＩＲＸ−２処理は、細胞のサイズの増大および粒度の減少をもたらした（データは示さない）。未処理対照は、各ヒストグラム中の破線で示されている。未処理ＤＣの平均値は、パネルの左上隅に示されている。ＩＲＸ−２で処理したＤＣのそれぞれの値は、右上隅に示されている。示したヒストグラムは代表的な実験からのものであり、値は、少なくとも１０回の個別の実験の平均の結果を表す（^＊＝ｐ＜０．０５、^＊＊＝ｐ＜０．００２、^＊＊＊＝ｐ＜０．００００５、対応スチューデントｔ検定）。図１４によってさらに示されるように、ＩＲＸ−２処理は、共刺激表面分子ＣＤ８６（別名Ｂ７−２）（１９３対３９０）、ＣＤ４０（４６対７５）、およびＣＤ５４（別名、細胞内接着分子１またはＩＣＡＭ−１）（１８４０対３７７９）の発現を増強した。これらの表面マーカー発現の変化は全て、本発明のＩＲＸ−２がＤＣ活性化の強力なエフェクターであることを示している。
【０２０４】
抗原提示細胞としてのその役割と一致して、未成熟ＤＣは、高いエンドサイトーシス活性を有し、活発に抗原を取り込む。成熟すると、この活性は下方調節され、そしてすぐに、ＤＣは抗原のプロセッシングおよび提示に関与する。生理的条件下では、ＡＰＣエンドサイトーシスの下方調節は、表面上のペプチド／ＭＨＣ複合体の増加を伴い、Ｔ細胞刺激の増強をもたらす。エンドサイトーシスに対するＩＲＸ−２の影響を検討するために、ＤＣを増加量のＩＲＸ−２とともにインキュベートし、ＦＩＴＣ−デキストランを内在化する能力を決定した。より具体的には、接着性ＰＢＭＣ（単球）をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（上記）で４日間処理し、その後、ＴＮＦ−α（１μｇ／ｍｌ）または１ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α相当までの増加濃度のＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）で刺激した。１８時間後、細胞をＦＩＴＣ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともにインキュベートした。ＦＩＴＣ−デキストランは最終濃度１ｍｇ／ｍｌまで添加した。細胞を３７℃で３０分間培養した。インキュベーション後、細胞を氷冷したＰＢＳで４回洗浄し、上記のようにフローサイトメトリーで解析した。
【０２０５】
図１５に示すように、ＩＲＸ−２とともにインキュベートした未成熟ＤＣ（黒丸）は、用量依存的にエンドサイトーシスを下方調節した。ＩＲＸ−２中に見られる対応する用量でのＴＮＦ−α処理（白丸）は最小限の効果を示した。より大量のＴＮＦ−α（１０〜２５ｎｇ／ｍｌ）で未成熟ＤＣを処理すると、予期された通り、エンドサイトーシス活性の下方調節がもたらされた（データは示さない）。図１５のデータは、刺激したＤＣと刺激していないＤＣの平均蛍光強度のパーセンテージとして示されており、これは、４回の独立した実験の平均−／＋ＳＥＭ（ｐ＜０．００００１、ＡＮＯＶＡによる）である。これらの実験は、本発明のＩＲＸ−２によって、ＤＣ成熟を示すＤＣのエンドサイトーシス活性の下方調節が生じることを示している。
【０２０６】
次に、ＤＣのＴ細胞刺激能を増強するＩＲＸ−２の能力を評価した。活性化した成熟ＤＣは、ナイーブＴ細胞の強力なスティミュレーターである。ＩＲＸ−２処理が機能的効果ならびに上述の表現型変化および形態学的変化に変換されることを示すために、ＤＣのＴ細胞刺激能に対するＩＲＸ−２の影響を混合リンパ球反応（ＭＬＲ）増殖アッセイで評価した。
【０２０７】
より具体的には、接着性ＰＢＭＣ（単球）をまずＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（上記）で７日間処理し、その後、ＩＲＸ−２を用いてまたはＩＲＸ−２を用いずに刺激した。４８時間後、ＩＲＸ−２処理したＤＣまたはＩＲＸ−２処理していないＤＣを回収し、次のようにＭＬＲでアッセイした。純化したＤＣを無関係なドナー由来の１×１０^５個のＴ細胞と、１：５、１：１０、１：３０、および１：１００のＤＣ：Ｔ細胞の比で共培養した。フィコール−ハイパック勾配遠心分離によってバフィーコートから純化したＰＢＭＣをナイロンウールカラムに通して、同種異系Ｔ細胞を調製した。３つ複製して丸底９６ウェルプレート中でアッセイを行なった。ＭＬＲアッセイの間は、ＩＲＸ−２は存在しなかった。ＤＣ−Ｔ細胞共培養の５日後、これらのウェルにＢｒＤＵを１８時間パルスした。比色ＢｒＤＵ取込みアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、ＢｒＤＵの取込みを測定した。
【０２０８】
図１６に示すように、共培養の２日前にＩＲＸ−２に曝露されたＤＣ（黒四角）は、未処理のＤＣ（白丸）よりもＴ細胞増殖応答を誘導するのが強力であり、これにより、ＩＲＸ−２処理したＤＣは機能的に適格であることが確認された。図１６のデータは、（（ｏ．ｄ．ＤＣで刺激されたＴ細胞−ｏ．ｄ．ＤＣのみ）／ｏ．ｄ．休止Ｔ細胞）−／＋ＳＥＭとして定義される刺激指数として表されており、かつ４回の個別の実験の平均の結果である（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡによる）。
【０２０９】
これらの共培養ではＩＲＸ−２は存在せず、観察されたＴ細胞刺激の増大は、ＩＲＸ−２のＴ細胞に対する直接的な効果ではなく、ＩＲＸ−２のＤＣに対する刺激効果によるものであったことに留意することが重要である。したがって、本発明のＩＲＸ−２は、同種異系ＭＬＲ反応における増殖の増強によって示されるように、ＤＣのＴ細胞刺激活性を増強する。さらに、ＩＲＸ−２は、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の発現を増大させることが上で示された。この細胞表面アクセサリーリガンドは、ＬＦＡ−１を介するシグナル伝達に関与することが示されており、また、このリガンドは、Ｔｈ１表現型への偏りをもたらす（Ｒｏｇｅｒｓ，２０００）。癌の状況では、これらの効果の機能的結果は、ＩＲＸ−２処理したＤＣが、Ｔ細胞応答をＴｈ１表現型に偏らせ、腫瘍特異的ＣＴＬ活性の活性化に有利に働き、それによって腫瘍拒絶を促進するということである。
【０２１０】
本発明者らのデータは、ＩＲＸ−２がＤＣからのＩＬ−１２の産生を刺激することも示している。ＩＬ−１２は、感染期に病原体に応答したＤＣによって分泌される強力なＴｈ１極性化サイトカインである。しかしながら、腫瘍拒絶を仲介する際のＤＣの最も重要な役割のうちの１つは、Ｔｈ１に偏った抗腫瘍Ｔ細胞応答を効果的にかつ効率的に刺激することであり、この応答を導く際に極めて重要なサイトカインのうちの１つがＩＬ−１２である。ＩＬ−１２は活性化ＤＣによって産生され、また、ナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞への分化に関与する必須因子である。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌し、これらのサイトカインはＩＬ−１２とともに、免疫系の細胞成分および食細胞成分（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））の活性化および増殖を媒介する。
【０２１１】
ＩＲＸ−２がＤＣにおけるＩＬ−１２産生を誘導することができるかどうかを明らかにするために、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４で培養した単球をＩＲＸ−２で１８時間刺激し、細胞内ＩＬ−１２ ｐ７０産生についてアッセイした。より具体的には、接着性ＰＢＭＣをＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（上記）中で４日間増殖させ、その後、ＩＲＸ−２もしくはＬＰＳを用いてまたはこれらを用いずに１８時間処理した。ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ；１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を最後の４時間添加して、サイトカインの大半をゴルジ複合体に蓄積させた。細胞を固定し、製造者の指示に従って、Ｆｉｘ ａｎｄ Ｐｅｒｍ（Ｃａｌｔａｇ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて透過処理し、その後、ＩＬ−１２ ｐ７０（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に対するＦＩＴＣ標識ｍＡｂまたは適切なアイソタイプ対照（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識した。細胞をフローサイトメトリーで解析した。
【０２１２】
図１７Ａに示すように、ＩＲＸ−２は、ＩＬ−１２を産生するＤＣのパーセンテージを平均４．５％陽性から２２．５％に増大させた。ＤＣにおけるＩＬ−１２産生のスティミュレーターであるＬＰＳを陽性対照として使用し、ＩＲＸ−２と比べて同様のレベルの誘導が生じた（２７％±１１）。図１７Ａのデータは、４回の独立した実験の平均であり、ＩＬ−１２陽性の細胞染色のパーセンテージ−／＋ＳＥＭ（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）として表されている。ＩＬ−１２の細胞内産生の増大が生体活性ＩＬ−１２の分泌の増大と対応していたことを確認するために、（上記のようなＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で最初に４日間培養し、ＩＲＸ−２とともに４８時間インキュベートした）ＩＲＸ−２処理ＤＣの上清における生体活性ＩＬ−１２の濃度を、生体活性ｐ７０ヘテロ二量体を検出する市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。その結果、図１７Ｂに示すように、ＩＲＸ−２への曝露から４８時間後、ＤＣ上清は、対照処理したＤＣよりも有意に多くの生体活性ＩＬ−１２を含んでいた。図１７Ｂのデータは、６回の独立した実験の平均（−／＋ＳＥＭ）（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）である。
【０２１３】
最後に、本発明者らのデータは、ＩＲＸ−２が、ＤＣにおけるＶＥＧＦ誘導性のアポトーシスを低下させることを示した。ＶＥＧＦはＤＣ成熟のインヒビターであり、成熟中のＤＣにおけるアポトーシスレベルを増大させることが示されている。ＩＲＸ−２がＶＥＧＦの効果を緩和することができるかどうかを明らかにするために、ＤＣをＩＲＸ−２とともにまたはＩＲＸ−２なしでＶＥＧＦで処理し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合によりアポトーシスのレベルを決定した。より具体的には、接着性ＰＢＭＣをＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で７日間処理し、その後、ＩＲＸ−２とともに（１：３）またはＩＲＸ−２なしで、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、さらに２日間インキュベートした。細胞を回収し、氷冷したＰＢＳ中で２回洗浄し、アネキシン結合バッファー（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に再懸濁した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびヨウ化プロピジウムを添加し、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリーで解析した。
【０２１４】
図１８に示すように、アポトーシスレベルは、対照と比較してＶＥＧＦ処理した細胞で増大した。しかしながら、ＩＲＸ−２は、ＶＥＧＦ処理した細胞におけるアポトーシスのレベルを低下させた。図１８のデータは４回の独立した実験の結果であり、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性の細胞染色のパーセンテージ（−／＋ＳＥＭ）として表されている。このデータは、ＩＲＸ−２が、その刺激能に加えて、成熟ＤＣに対する防御効果も有することを示唆している。さらに、欠損したＤＣ機能と数は、腫瘍による異常なＶＥＧＦ発現によって一部媒介され得る（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，１９９６ｂ；Ｓａｉｔｏ，１９９９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２００４）。腫瘍によるＶＥＧＦ産生は、Ｈ＆ＮＳＣＣ、肺癌、胃癌、および骨肉腫をはじめとするいくつかの癌における不良な予後の予測因子であることが示された（Ｇａｌｌｏ，２００１；Ｋａｙａ，２０００；Ｍｉｙａｋｅ，１９９２；Ｓａｉｔｏ，１９９８；Ｓｍｉｔｈ，２０００）。本明細書に含まれるデータは、ＩＲＸ−２が、ＶＥＧＦ媒介性のＤＣのアポトーシスを逆転させ、それによって腫瘍環境内での成熟ＤＣの生存を促進し、かつ腫瘍抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の持続的な抗原提示および活性化を可能にすることができることを示している。
【０２１５】
ＤＣを用いたこれまでの研究では、エクスビボで産生されるＤＣに基づく癌ワクチンに使用されるＤＣを成熟させるために、単球馴化培地（ＭＣＭ）などの天然サイトカイン混合物またはＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＰＧＥ２を含む組換え炎症性サイトカインの混合物が利用されている（Ｒｏｍａｎｉ，１９９６；Ｂｅｎｄｅｒ，１９９６；Ｓｏｒｇ，２００３）。ＩＲＸ−２と他の研究で使用されるサイトカイン混合物の極めて重要な違いは、この研究で使用されるサイトカインのレベルが１０〜１００倍低いことであり、これは、ＩＲＸ−２の特有のサイトカイン成分同士の顕著な相乗作用を示唆する。さらに、これらの他の混合物によって成熟させたＤＣの使用に関しては大きな問題がある。例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＰＧＥ２の存在下で成熟したＤＣは、ＩＬ−１２を少ししか産生しないかまたは全く産生せず、不適切に活性化された場合、寛容原性となり得る（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２００２；Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐ，２０００）。さらに、エクスビボで生成された完全に成熟したＤＣが「使い果たされる」可能性があり、効果的なＴ細胞応答を効率的にプライミングすることができないという懸念がある（Ｋａｌｉｎｓｋｉ，２００１）。エクスビボ法によって成熟させたＤＣで処置した患者に見られる低い臨床的応答レベルは、これらの懸念を支持する（Ｈｏｌｔｌ，２００２；Ｓｃｈｕｌｅｒ−Ｔｈｕｒｎｅｒ，２００２；Ｔｈｕｒｎｅｒ，１９９９）。
【０２１６】
本明細書で提示した証拠により、ＩＲＸ−２が樹状細胞の強力なアクチベーターであることが確認される。このデータは、ＩＲＸ−２のＴ細胞に対する既知の効果（Ｈａｄｄｅｎ，１９９５ｂ）と組み合わせて、ＩＲＸ−２が癌患者に見られるＡＰＣとＴ細胞の欠陥を克服することができることを示唆し、出願人の臨床試験で見られる、成功した臨床転帰の機序を説明するものである。ＤＣは現在、癌を標的とした免疫療法における主役として認められているが、免疫系の単一の要素を個別に操作すること（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞ワクチン接種戦略または腫瘍抗原でパルスしたＤＣだけを再導入すること）は、患者の顕著な臨床的改善をもたらさないことがますます明らかになってきている（Ｒｉｄｇｗａｙ，２００３；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２００４）。より有益な治療計画は、いくつかの協調して働く細胞型（例えば、Ｔ細胞およびＤＣ）の活性を同時に増強して、相互作用を強化し、機能的カスケードが、腫瘍の様々な免疫抑制戦略によって遮断されるのではなく、持続される可能性が高くなることを可能にすることであり得る。この状況において、本発明のＩＲＸ−２は、腫瘍抗原をロードした内在性ＤＣと腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の両方を刺激し、効果的な免疫応答と腫瘍拒絶をもたらすように作用している可能性がある。まとめると、これらの結果は、本発明のサイトカイン組成物が、内因性腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発する強力な臨床的ツールであり得るか、または癌ワクチンの設定で外から添加される腫瘍抗原と併せて使用され得ることを示している。
実施例１０
ＩＲＸ−２は単球／マクロファージ活性化を刺激する
【０２１７】
サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含む本発明のＩＲＸ−２は、単球／マクロファージの強力なアクチベーターでもある。より具体的には、接着性ＰＢＭＣ（約９０％の単球）をＸ−ＶＩＶＯ １０培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中で一晩増殖させ、ＩＲＸ−２（１：３の最終濃度）で２４時間刺激し、活性化マクロファージの表面に通常見られる様々な活性化マーカーの発現についてフローサイトメトリーでアッセイした。対照として、細胞をＩＲＸ−２を欠く培地中で２４時間インキュベートした。図１９に示すように、ＩＲＸ−２を用いる細胞処理とサイトカインを添加しない細胞処理によって、ＨＬＡ−ＣＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０（全て単球／マクロファージの活性化マーカーである）が陽性の細胞染色のパーセンテージの有意な増加（図１９Ａ）とＨＬＡ−ＣＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０の平均蛍光指数（ＭＦＩ）の増加（図１９Ｂ）（ｐ＜．０３）がもたらされた。図１９に示すデータは、３回の独立した実験／３人の独立したドナーからの平均値＋／−ＳＥＭを表す。
【０２１８】
さらに、本発明のＩＲＸ−２はＴＮＦ−αを上回る程度に単球を活性化することが分かった。より具体的には、接着性ＰＢＭＣをＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）（１：３の最終濃度；約１ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α）またはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで刺激し、活性化マーカーの発現についてフローサイトメトリーでアッセイした。図２０に示すように、ＩＲＸ−２は、ＴＮＦ−αよりも統計的に大きいＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０の発現を誘導した（ｐ＜．０３）。図２０に示すデータは、３回の独立した実験／３人の独立したドナーからの平均値＋／−ＳＥＭを表す。
【０２１９】
同様に、少ない用量のＬＰＳ（活性化するが、最大限ではない）を用いて行なわれた研究もまた、ＩＲＸ−２が比較的強い活性化シグナルであることを示した。より具体的には、接着性ＰＢＭＣを、ＩＬ−１０（５ｎｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下において、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）（１：３の最終濃度）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで刺激し、活性化マーカーの発現についてフローサイトメトリーでアッセイした。図２１に示すように、ＩＲＸ−２は、ＬＰＳよりも大きい単球／マクロファージ成熟マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、およびＣＤ４０の発現の増大をもたらした。さらに、免疫抑制性サイトカインのＩＬ−１０の存在下において、ＩＲＸ−２が依然として単球を刺激することができたのに対し、ＬＰＳは単球を刺激することができなかった（ｐ＜．０２）。図２１に示すデータは、３回の独立した実験／３人の独立したドナーからの平均値＋／−ＳＥＭを表す。
【０２２０】
最後に、単球は、活性化シグナルに応答してＴＮＦ−αを分泌し、この分泌が、単球／マクロファージの非特異的殺活性と関連することが知られている。図２１に示すデータは、本発明のＩＲＸ−２が単球からのＴＮＦ−αの産生を刺激し、ＩＬ−１０の免疫抑制効果を克服することを示している。より具体的には、接着性ＰＢＭＣを、ＩＬ−１０（５ｎｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下において、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）（１：３の最終濃度）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで刺激し、ＴＮＦ−α産生について細胞内染色およびフローサイトメトリーでアッセイした。図２２に示すように、ＩＲＸ−２は、ＬＰＳまたは対照よりも大きいＴＮＦ−α産生の増大をもたらした。ＩＬ−１０の存在下において、ＩＲＸ−２が依然として単球を刺激し、ＴＮＦ−αを産生することができたのに対し、ＬＰＳはもはや単球を刺激し、ＴＮＦ−αを産生することができなかった（ｐ＜．０５）。図２２に示すデータは、５回の独立した実験／５人の独立したドナーからの平均値＋／−ＳＥＭを表す。
実施例１１
【０２２１】
以下に詳述する実験は、本発明のＩＲＸ−２組成物が外因性抗原との組合せで作用し、マウスにおいて抗原に対する改善された免疫応答（細胞に基づくものと抗体に基づくものの両方）を誘発する能力を示している。
【０２２２】
外因性腫瘍抗原の投与
【０２２３】
マウス：
【０２２４】
この手順は、オボアルブミン（ＯＶＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のいずれかにコンジュゲートした、ＰＳＭＡ（ＬＬＨ＆ＡＬＦ）の予測されるＴ細胞エピトープに基づく前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ペプチド（１００μｇ＠）でマウスを免疫することであった。単離された非コンジュゲートペプチドを用いた過去の試みはマウスにおいて不成功に終わった。低用量ＣＹ（４００μｇ／マウス）を投与した後、ＩＲＸ−２（０．１ｍｌ）を単回免疫として両方のコンジュゲート抗原とともに投与し、その後、抗原なしでＩＲＸ−２（０．１ｍｌ）を９日間毎日注射し、一方、ＣｐＧ、ミョウバン、またはＲＩＢＩ−Ｃｏｒｉｘａアジュバントを単回一次免疫としてＯＶＡコンジュゲートとともに投与した。２１日目と２８日目に、各マウス群に対して、２回の追加免疫（上記のようなコンジュゲート＋アジュバント）を施した。最後の追加免疫から９日後に、Ｔ細胞ペプチドに対するＤＴＨ反応を測定し、１５日目〜２１日目の屠殺時に血清を採取した。
【０２２５】
図２３は、抗原刺激として、個々のＡＬＦおよびＬＬＨペプチド（１０μｇ＠）を使用した、すなわち、コンジュゲートを使用しない、マウスの皮膚試験のＤＴＨ結果を示している。図によって示されるように、ＩＲＸ−２は、両方のコンジュゲートによる免疫の後、また、ＯＶＡコンジュゲートについては、ミョウバンとともに投与されたときに、抗原に対する顕著なＤＴＨ応答を誘導する。ミョウバン、ＲＩＢＩ−Ｃｏｒｉｘａ、およびＣｐＧは、活性をほとんど示さなかった。
【０２２６】
血清抗体の結果：
【０２２７】
血清を示されたように希釈し、ペプチド（ＡＬＦもしくはＬＬＨ）またはオボアルブミンのいずれかをコーティングしたマイクロプレートのウェルに添加した。結果を５つのマウス群についての平均ＯＤ４０５として表す。データを下記の表ＩＶに示す。
【０２２８】
より具体的には、ＩＲＸ−２と組み合わせたＫＬＨコンジュゲートで免疫したマウスは、オボアルブミン抗体が陰性であったが、ペプチドが陽性であった。ＯＶＡコンジュゲートとＩＲＸ−２とで免疫したマウスは、ＯＶＡとペプチドの両方の抗体が陽性であったが、ＯＶＡコンジュゲート＋ＣｐＧで免疫したマウスは、ＯＶＡのみが陽性であった。これらの結果は、ＩＲＸ−２が、ペプチドに特異的なＤＴＨとＩｇＧ応答の両方を刺激するコンジュゲートＰＳＭＡペプチドの能力を増強する際にアジュバントとして作用するが、ミョウバン、ＲＩＢＩ−Ｃｏｒｉｘａ、およびＣｐＧのような他のアジュバントは、活性がなかったかまたは活性が乏しかったことを示している。
【表４】

【０２２９】
上記の結果を確認し、かつ本発明のＩＲＸ−２組成物が、若いマウスと年老いたマウスの両方においてＴ細胞特異的免疫応答を増強することを示すために、追加の実験を行なった。下記の実験では、以下の方法および材料を用いた。
【０２３０】
試薬：
【０２３１】
前立腺特異的膜抗原ペプチド（ペプチド１：Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１）；ペプチド２：Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：２））は、ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，Ｔｘ）により合成された。オボアルブミンおよびシクロホスファミドはＳｉｇｍａから、ＫＬＨはＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。ＲＡＳとも呼ばれるＲＩＢＩアジュバント系（Ｒ−７００）は、Ｃｏｒｉｘａから購入し、ミョウバン（各４０ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムおよび水酸化マグネシウム）は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ＲＡＳは、モノホスホリル脂質Ａ（０．５ｍｇ）および合成トレハロースジコリノミコラート（０．５ｍｇ）と、４４μｌのスクアレンおよびＴｗｅｅｎ−８０とからなっていた。ＣｐＧオリゴヌクレオチド（マウス特異的配列）は、ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓにより合成された。ＣｐＧ配列は、ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：３）であり、かつホスホチオナート誘導体であった。マウスにおけるＣｐＧの生体活性は、マウス脾臓細胞の増殖およびマウス接着細胞によるＴＮＦ−αの産生を測定することによって確認された（データは示さない）。
【０２３２】
ＩＲＸ−２（本明細書ではＩＲＸ−２とも呼ばれる）は、ＰＨＡおよびシプロフロキサシンでヒト末梢血単核細胞を刺激した後、２４時間にわたって産生される規定のサイトカイン混合物である。ＰＨＡは、サイトカインを含む上清を回収する前に除去される。２つのウイルス除去工程が後の処理に含まれる（イオン交換および二重ナノ濾過）。バイオアッセイとＥＬＩＳＡの両方によるサイトカインレベルの測定を含む厳しいＱＣ検査により、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）の一貫性が保証される。滅菌性、ＤＮＡ、マイコプラズマ、エンドトキシンに関する安全性検査ならびにＣＭＶおよびＥＢＶのウイルス検査も、このプロセスの一部である。ＩＲＸ−２のいくつかのロットをこれらの研究中に使用した。ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）のロットに含まれるいくつかのサイトカインのレベルを下記の表Ｖに掲載する。表中、^＊は、これらの研究で使用した５つのロットのＩＲＸ−２についての平均サイトカインレベルを表し、^＊＊は、全てのロットで測定したレベルではなく、一番最近のロットのみについてのレベルを表す。ｐｇ／ｍｌの範囲で存在するさらなるサイトカインとしては、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０が挙げられる。Ｔｈ２にバイアスをかける典型的なサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７およびＩＦＮ−α）は存在しない。２つのロットを同じ実験で試験したとき、それらの活性は常に類似していた（データは示さない）。
【表５】

【０２３３】
抗原ペプチドのコンジュゲーション：
【０２３４】
上記のペプチド１および２を、担体分子（例えば、上記のようなオボアルブミンまたはＫＬＨ担体）にコンジュゲートした。両方のペプチドを、各々の担体に、すなわち、単一の作用物質としてコンジュゲートした。例えば、これらの研究で使用されるＯＶＡ−ＰＳＭＡコンジュゲートまたはＫＬＨ−ＰＳＭＡコンジュゲートは、担体分子に連結された両方のペプチドを含んでいた。これらのペプチドを、カルボジイミド法（ＯＤＣ；Ｐｉｅｒｃｅ ＥＤＣキット ７７５０２，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）を用いて、それぞれの担体にコンジュゲートした。初期の研究では、グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を利用したが、これら２つの方法に免疫原性の違いはなかった（データは示さない）ので、後の研究では、より制御された方法として、カルボジイミドカップリングを選んだ。Ｓｅｐｈａｄｅｘ精製カラムからの画分中でＯＤ２８０と２１５を測定することにより、コンジュゲーションを特徴付けた。カラムからの２８０ＯＤのピークはオボアルブミンまたはＫＬＨコンジュゲートを表し、これをコンジュゲートとして回収した。投与量は、カラムから回収されたときの担体濃度を基にした。ＯＤ２１５をモニタリングすると、遊離ペプチドを表すテーリングピークが示され、コンジュゲーション手順において余分なペプチドが存在するという確認が得られた。
【０２３５】
免疫：
【０２３６】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒまたはＨａｒｌａｎのどちらかから購入し、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＣＳＨＬ）が世話をした。手順は全て、ＣＳＨＬのＡＬＡＣ委員会によって承認された。いくつかの実験では、ＩＲＸ−２処置の３日前に、シクロホスファミド（４００または２０００μｇ／１００μｌ、ＩＰ）を注射した。後の研究で、シクロホスファミドには、マウスにおける応答のＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）増強に対して統計的に有意な効果がないことが示された（データは示さない）。免疫を以下のように行なった。所属リンパ節への速やかな流入をもたらすために、１００μｌのアジュバント（例えば、ＩＲＸ−２もしくはミョウバン）とともに１００μｇのＰＳＭＡコンジュゲートを含む２００μｌ／マウス、またはＰＢＳを尻尾の付け根に皮下注射した。一次免疫の後には必ず、９回の追加のＩＲＸ−２（１００μｌ＝６〜８ＩＵのＩＬ−２当量）注射を（２、３、４、５、８、９、１０、１１、および１２日目に）行なった。ミョウバンまたはＲＩＢＩとは異なり、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）を同じ部位に繰り返し注射しても、その部位での大きな炎症は生じなかった（未発表の観察結果）。ＤＴＨ活性を評価する前に、コンジュゲート＋アジュバントで２回の追加免疫（１４日目と２８日目）を行なった。追加免疫ではさらなるＩＲＸ−２を投与しなかった。
【０２３７】
若いマウスにおける比較アジュバント研究では、ＲＡＳ（Ｒ−７００＝スクアレン／Ｔｗｅｅｎ ８０中のＭＰＬ＋ＴＤＭ）を（推奨されるプロトコルの通りに）１ｍｌのＰＢＳで再構成し、その後、１ｍｌのコンジュゲート（１ｍｇ／ｍｌ）と混合した。ミョウバンを抗原と１：１で混合した。ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、マウスについて公表されているプロトコル（マウス１匹当たり２０μｇのＣｐＧと１００μｇのコンジュゲート）の通りにコンジュゲートと混合した。
【０２３８】
ＤＴＨアッセイ：
【０２３９】
ＤＴＨアッセイのためのインビボ抗原刺激は、２種のＰＳＭＡペプチドの混合物（担体を含まない）（２０μｌ中１００μｇ）または担体のみ（オボアルブミンもしくはＫＬＨ）（２０μｌ中５０〜１００μｇ）のいずれかによるものであった。追加免疫の９日後、マウスに対して、左足蹠に刺激抗原を、右足蹠にＰＢＳを皮下注射した。２４時間後、デジタル読取り式キャリパー（Ｐｒｅｉｓｓｅｒ ＤＩＧＩ−ＭＥＴ Ｍｏｄｅｌ １８３１４，Ｓｔｏｆｉｔｉｎｇ Ｃｏ．，Ｗｏｏｄｄａｌｅ，ＩＬ）を用いて、右足蹠および左足蹠の厚さを測定した。左足蹠の厚さ（実験応答）から右足蹠の厚さ（ベースライン）を差し引くことにより、腫れ応答を算出した。データを個々のマウスの腫れおよび平均＋／−平均の標準誤差として表した。統計分析はスチューデントのｔ検定またはＡＮＯＶＡによった。
【０２４０】
抗原／マイトジェン誘導性のサイトカイン産生および測定：
【０２４１】
これらの研究のために、追加免疫の１４〜２１日後に脾臓を摘出し、ワイヤースクリーンに通して分散させることにより単離した。脾臓細胞を取り出し、それらをプラスチックに９０分間接着させておくことにより、接着細胞を得た。単離された接着細胞をプールし、その後、さらなる抗原提示細胞を得るために、培養物に添加した。１ウェル当たり約６×１０^５個のリンパ球に２×１０^４個の接着細胞を添加した。
【０２４２】
抗原またはマイトジェン誘導性のリンパ球活性化によるサイトカイン放出を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎ．，ＭＮ）製のＤｕｏ−Ｓｅｔｓ ＥＬＩＳＡ試薬を用いて上清中で測定した。抗原で刺激した細胞から上清を回収するのに最適な日は６日目であったが（ＩＦＮ−γの場合）、ＰＨＡで刺激したＩＬ−２産生は３日目に最適であった（データは示さない）。
【０２４３】
オボアルブミンおよびペプチドに対する血清抗体：
【０２４４】
屠殺時の血清を後にＥＬＩＳＡアッセイで使用するために凍結させた。ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ−４，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に、対象となる抗原（オボアルブミン、ＫＬＨ、コンジュゲートまたは個々のペプチド）を一晩コーティングした。ブロッキングし、洗浄したウェルに血清の希釈液を添加し、一晩インキュベートした。抗マウスビオチンおよびビオチン−アルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＢｉｏＴｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を順次添加し、ｐＮＰＰ基質を添加した後、ＯＤを測定し、血清の希釈に対してプロットした。
【０２４５】
以下に詳述するようなこれらの研究の結果は、本発明のＩＲＸ−２が、若いマウスと年老いたマウスの両方における腫瘍抗原特異的免疫応答をインビボで刺激することを示している。より具体的には、下記の実験において、インビボＤＴＨ（遅延型過敏症）アッセイをＴ細胞活性化の指標として利用した。癌抗原に対するＤＴＨ応答は、動物モデルおよび臨床試験において腫瘍の消失とよく相関し、したがって、Ｔ細胞免疫応答のインビボ関連因子として有用である（例えば、Ｓｔｕａｒｔ，１９８７；Ｓｗｅａｔ，１９９８を参照されたい）。本実験により示されるように、本発明のＩＲＸ−２組成物は、若いマウスにおけるＴ細胞免疫応答をインビボで刺激する際に、前立腺特異的腫瘍抗原とともにアジュバントとして作用する。さらに、本実験は、ＩＲＸ−２が、若いマウスにおいてＴ細胞ペプチドに対する免疫応答を増大させるだけでなく、Ｔ細胞が損なわれた年老いたマウスにおいてＴ細胞免疫応答を回復させることも示した。したがって、以下に詳述する実験では、年老いたマウスを、免疫機能障害、すなわち、マウスとヒトの両方で起こる加齢関連の免疫機能低下のモデルとして用いた。さらに、この免疫機能障害は、ヒトにおいて年齢の増加とともに起こる癌発生の増加の主な理由であると考えられている。
【０２４６】
若いマウスにおけるペプチド特異的ＤＴＨ応答のＩＲＸ−２増強：
【０２４７】
上記のようなＯＶＡ−ＰＳＭＡまたはＫＬＨ−ＰＳＭＡコンジュゲートのいずれかと組み合わせたＩＲＸ−２（または陰性対照としてのＰＢＳ）（例えば、１００μｌのＩＲＸ−２またはＰＢＳとともに１００μｇのコンジュゲートを含む、２００μｌ／マウス）で若いマウスを免疫した。所属リンパ節への速やかな流入をもたらすために、免疫を尻尾の付け根への皮下注射として施した。その後、ＰＳＭＡペプチド（図２４Ａ）またはそれぞれのコンジュゲート免疫において使用される担体（図２４Ｂ）のいずれかを刺激抗原として用いて、上記のようなＤＴＨアッセイにおいて、マウスを刺激した。
【０２４８】
図２４Ａに示すように、ＯＶＡ−ＰＳＭＡまたはＫＬＨ−ＰＳＭＡコンジュゲートと組み合わせたＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）による若いマウス（６〜８週齢）の免疫によって、担体にかかわらず、ペプチド特異的ＤＴＨ応答が増強された。これらのペプチドを、ＩＲＸ−２とともに、しかし、コンジュゲーションせずに共投与したとき、ペプチド特異的ＤＴＨ応答は測定されなかった（データは示さない）。担体（オボアルブミンまたはＫＬＨのいずれか）に対するＤＴＨ応答はペプチドに対する応答よりも強く、ＩＲＸ−２とともに投与しても、ＤＴＨ活性は増強しなかった（図２４Ｂ）。ミョウバンをＩＲＸ−２−ペプチドコンジュゲート免疫に追加しても、陽性のペプチド特異的ＤＴＨ応答は修飾されなかった（データは示さない）。
【０２４９】
初期の研究では、免疫の３日前のシクロホスファミドによる単回前処置と組み合わせて、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）を使用した。より具体的には、マウスを、一次免疫の３日前のシクロホスファミド（４００μｇ／マウスまたは２ｍｇ／マウスのいずれか）の投与を伴ってまたは伴わずに、ＯＶＡ−ＰＳＭＡコンジュゲートおよびＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）で免疫した。２回の追加免疫（１４日目と２８日目）の後、ＤＴＨアッセイを上記のように行なった。
【０２５０】
図２５に示すように、シクロホスファミドによる前処置はペプチド特異的応答には必要とされず、後の実験では使用されなかった。さらに、この実験により、マウスがシクロホスファミドで前処置されたか、されなかったかにかかわらず、ペプチドコンジュゲートと組み合わせたＩＲＸ−２処置が、ミョウバンまたはＰＢＳを使用するよりも有意に大きい程度にペプチド特異的ＤＴＨ応答を増強させる（ｐ＜０．０５）ことが確認された。このアッセイの結果を平均の腫れ（図２５中の棒）および個々のマウスの腫れ（図２５中の菱形のデータ点）として表した。さらに、これらのマウス研究の結果は全て、一次免疫後に９日間の追加のＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）注射を利用したものであるが、４回の追加処置は、９回の追加処置と統計的に差がなかった（データは示さない）。
【０２５１】
さらに、ＰＳＭＡコンジュゲートに対するペプチド特異的免疫応答を刺激するＩＲＸ−２の能力を、３つの他のアジュバント：ミョウバン、ＲＩＢＩアジュバント系（またはＲＡＳ）、およびＣｐＧの能力と比較した。より具体的には、マウスを、これらの様々なアジュバントと組み合わせたＯＶＡ−ペプチドコンジュゲートで免疫した。２回の追加免疫（１４日目と２８日目）の後、（追加免疫後の９日目に）ＤＴＨアッセイを上記のように行なった。この研究の結果を図２６に示し、平均の腫れ（棒）および個々のマウスの腫れ（菱形のデータ点）として表す。
【０２５２】
図２６に示すように、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）のアジュバント効果は、試験した他のアジュバントの効果よりも大きかった（ｐ＜０．００１）。全てのアジュバントが、ナイーブマウスと比較して担体タンパク質に対する応答を増強させたが（データは示さない）、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）だけが腫瘍ペプチド特異的免疫応答を増強させた。
【０２５３】
老齢マウスにおけるペプチド特異的免疫応答のＩＲＸ−２増強
【０２５４】
本発明者らはまず、マイトジェン（ＰＨＡ）で刺激した年老いたマウス由来の脾臓細胞が、若いマウス由来の応答と比較したとき、２種の主要なＴ細胞サイトカインであるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの分泌に関して損なわれている（ＩＬ−２：２８５対７５ｐｇ／ｍｌおよびＩＦＮ−γ：１５３５対１２８ｐｇ／ｍｌ）ことを示すことによって、年老いたマウス（＞１８カ月齢）におけるＴ細胞免疫応答が、若いマウス（８〜１６週齢）における応答と比較して欠損していることを確認した。
【０２５５】
次に、本発明者らは、ＰＳＭＡコンジュゲートと、アジュバントとしてのＩＲＸ−２またはミョウバンのいずれかとで免疫し、次いで上記のＤＴＨアッセイを用いて抗原刺激した、年老いたマウスと若いマウスにおけるＤＴＨ応答を試験した。より具体的には、年老いたマウス（研究を開始した時点で１８〜２０カ月齢）および若いマウス（研究を開始した時点で６〜８週齢）を、上記のように、アジュバントとしてのＩＲＸ−２またはミョウバンと組み合わせたＰＳＭＡコンジュゲートのＯＶＡ−ＰＳＭＡで免疫した。その後、上記のＤＴＨアッセイに従って、マウスを抗原で刺激した。
【０２５６】
図２７Ａによって示されるように、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）は、ペプチド特異的ＤＴＨ応答に関して、年老いたマウスの免疫活性を若いマウスの免疫活性にまで回復させた。これらの結果を、１群当たり９〜１５匹のマウスの平均についての、ＰＢＳを注射した足と抗原を注射した足の腫れの差として表す。ＩＲＸ−２で処置した年老いた群および若い群の平均の腫れは、ペプチド特異的応答に関して統計的に差がなかった。しかしながら、ＩＲＸ−２で処置した若い群とＩＲＸ−２で処置した年老いた群の両方のＤＴＨ応答は、ミョウバンで処置したマウスで見られる応答よりも有意に大きかった（^＊ｐ＜０．００５、スチューデントのｔ検定）。
【０２５７】
ＯＶＡ担体特異的ＤＴＨ応答に関して、図２７Ｂは、この応答について若いマウスと比較すると年老いたマウスは欠損しているが（ｐ＜０．０５）、ＩＲＸ−２処置によって、オボアルブミン特異的ＤＴＨ応答が年老いたマウスで回復したことを示している（図２７Ｂ）。オボアルブミンに対する若いマウスの応答は、ミョウバンで最適であり、それゆえ、ＩＲＸ−２によって改善されなかった。
【０２５８】
これらの実験は、年老いたマウスと若いマウスの両方における特異的な抗腫瘍抗原Ｔ細胞免疫応答をインビボで刺激する際の本発明のＩＲＸ−２組成物のアジュバント効果を示している。実際、本発明のＩＲＸ−２は、試験した他のアジュバントと比較してより大きい腫瘍抗原特異的Ｔ細胞免疫応答をもたらした。
【０２５９】
Ｔ細胞サイトカインのＩＦＮ−γの産生に対するＩＲＸ−２処置の効果を測定するために、下記のようなさらなる実験を行なった。ＩＦＮ−γの産生は、免疫刺激のもう１つの指標である。
【０２６０】
脾臓Ｔ細胞のエクスビボ応答に対するＩＲＸ−２の効果
【０２６１】
上に述べたように、ＩＲＸ−２とＰＳＭＡコンジュゲートとで免疫したマウスに対するＩＲＸ−２処置のアジュバント効果を、免疫したマウス由来の脾臓細胞によるＩＦＮ−γの分泌を測定することにより明らかにした。より具体的には、ＫＬＨ−ＰＳＭＡコンジュゲート（上記）とＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）とで免疫したマウス由来の脾臓細胞を回収し、コンジュゲート（ＫＬＨ−ＰＳＭＡ）、担体（ＫＬＨ）またはペプチド（ＰＳＭＡ）とともにエクスビボでインキュベートした。培養６日後に脾臓細胞由来の上清を回収し、上の節の方法および材料に記載されたように、ＩＦＮ−γ分泌について測定した。図２８に示すように、ＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍｌで示す）の産生の形で示すＴ細胞応答は、ナイーブマウスと比較したとき、コンジュゲートとＩＲＸ−２とで免疫したマウスにおいて、３つ全ての抗原について、より大きかった。
【０２６２】
血清抗体力価に対するアジュバントの効果
【０２６３】
さらに、ＩＲＸ−２処置が、インビボでの抗体産生に対するアジュバント効果を有するかどうかを明らかにするために、実験を行なった。より具体的には、マウスを、上記のようなＰＳＭＡ−コンジュゲートと以下のアジュバント：ＩＲＸ−２、ミョウバンまたはＣｐＧとで免疫した。ＰＢＳをアジュバントの陰性対照として用いた。これらのマウス由来の血清を、３回目の免疫の１５日後（データは図２９ＡおよびＢに示す）または３回目の追加免疫の８および１５日後（図２９Ｃのデータ）の屠殺時に得た。血清を抗体についてＥＬＩＳＡでアッセイし、その結果を希釈対光学密度（図２９ＡおよびＢ）または最適希釈（１／４００）時の光学密度（図２９Ｃ）として表した。
【０２６４】
担体（オボアルブミンか、ＫＬＨかを問わない）に対する血清抗体力価を測定し、それにより、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）、ミョウバンおよびＣｐＧがオボアルブミンに対するよく似た力価を誘導し、その応答は、ＣｐＧ＞ミョウバン＞ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）であることが示された（図２９Ａおよびデータは示さない）。ＫＬＨコンジュゲートで免疫したマウスは、予想した通り、オボアルブミンに対する力価を生じさせず、ＥＬＩＳＡアッセイの特異性が確認された（例えば、図２９Ａを参照されたい）。しかしながら、図２９Ｂに示すようなペプチド特異的抗体応答に関して、ＯＶＡ−ＰＳＭＡペプチドコンジュゲートと組み合わせたＩＲＸ−２は、ミョウバンおよびＣｐＧとは対照的に、両方のペプチドに対する血清抗体を誘導した。図２９Ｂのデータは、ＡＬＦペプチドに関するものであり、ＩＲＸ−２対ミョウバンおよびＣｐＧについて、ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５である。同様の応答がＬＬＨペプチドについて測定された（データは示さない）。図２９Ｃに示すように、ＫＬＨをペプチドの担体としてコンジュゲート中で使用した場合、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）は、アジュバントなし（ＰＢＳ）またはミョウバンよりも高いペプチド抗体応答を誘導した（ＩＲＸ−２対ミョウバンおよびＰＢＳについて、ｐ＜０．００１）。図２９Ｃのマーカーは個々のマウスを示している。上記のようなアッセイ法において、抗体応答は、両方のペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で測定された。
【０２６５】
上記の研究は、本発明のＩＲＸ−２が、インビボでのＴ細胞ペプチド特異的ＤＴＨ応答およびプロトタイプの前立腺ペプチドワクチンモデルにおけるエクスビボでの脾臓細胞のＴ細胞応答を増強することを示している。（ほんの数種からなる活性とは対照的に）サイトカイン混合物の重要な性質は、単球を欠き、それゆえ、単球由来サイトカインに欠損のある細胞培養物から作製された製剤がペプチド特異的ＤＴＨ応答またはインビトロでの脾臓細胞のＴ細胞応答を増強しなかったという観察によって確認されている。ＩＲＸ−２の新規の性質は、ＩＲＸ−２を様々な作用機序を代表するように選択された他のアジュバントと比較することによって、さらに示された。例えば、ＣｐＧは、ＡＰＣのＴＬＲアゴニストであり、ＴＬＲ活性化アジュバントを代表するのに対し、ＲＡＳ系は、オイルと細菌成分を含むアジュバントの代表であり、マウスモデルにおけるより安全なフロイントアジュバント代替物である。ミョウバンは、大部分のＦＤＡ承認ワクチンで利用されているアジュバントである。本研究では、ＩＲＸ−２はペプチド特異的ＤＴＨ応答を増強したが、ミョウバン、ＣｐＧおよびＲＡＳは増強しなかった。さらに、インビボでのＴ細胞ペプチド特異的ＤＴＨ応答のＩＲＸ−２増強は、抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌によって規定されるようなエクスビボでの脾臓細胞によるＴ細胞応答の増強と相関した。最後に、全てのアジュバントが（ＰＢＳと比較して）担体に対する抗体応答を増強したが、ＩＲＸ−２のみが、担体にコンジュゲートしたペプチドに対する抗体応答を増強した。
【０２６６】
ＡＰＣの動員、貪食、増殖、活性化、成熟および遊走ならびにＴ細胞の動員、増殖、分化および成熟は全て、サイトカインによる影響を受けるので、ＩＲＸ−２中のサイトカインがＤＴＨアッセイによって規定されるようなペプチド特異的免疫応答を増強するように作用する機序は複雑である可能性が極めて高い。しかしながら、これらの研究で観察されたＤＴＨ応答のペプチド特異的な性質は、抗原提示ならびにそれに続くＴ細胞増殖および末梢への遊走に対するＩＲＸ−２の影響の結果であると考えられている。また、ＩＲＸ−２のサイトカインが、ＤＣ寛容またはＴ調節性バランスをＴ細胞エピトープに対する応答の活性化へと転換すると考えられている。ＩＲＸ−２は、担体中のＴ細胞ヘルパーエピトープを増強して、効果的なＴ細胞免疫応答の発達をさらに刺激している可能性もある。本明細書に示すように（実施例９および１０を参照されたい）、本発明のＩＲＸ−２は、樹状細胞の成熟および活性化を刺激し、これにより、（樹状細胞による）抗原提示および強力なＴｈ１分極化サイトカインであるＩＬ−１２の分泌が促進される。ＩＲＸ−２は、単球およびマクロファージの強力なアクチベーターでもある。
【０２６７】
ＩＲＸ−２は、ＩＲＸ−２中に存在するサイトカインの既知の影響力に基づく、Ｔ細胞に対するさらなる効果を有する。上記の実施例２および８に示したように、本発明のＩＲＸ−２は、ナイーブＴ細胞の産生を含め、リンパ球減少患者におけるＴリンパ球数を増加させる。さらに、ＩＬ−１（ＩＲＸ−２中に存在する）は、リンパ球の走化性因子および他のサイトカインの産生のスティミュレーターであることが知られている。既知の活性としては、ＩＬ−２分泌の誘導による休止Ｔ細胞の増殖および活性化の増大と、ＩＲＸ−２の活性にとってより重要な、ＩＬ−２受容体の上方調節とが挙げられる。さらに、ＴＮＦ−α（これもＩＲＸ−２中に存在する）は、他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−８およびＣＳＦ）の活性を増強するのと同様に、ＩＬ−１の活性を増強する。ＩＬ−８は、Ｔ細胞、好塩基球および好中球を含む、複数の細胞の走化性因子としても作用する。ＩＬ−２は、受容体を通じて刺激するだけでなく、さらなるＩＬ−２受容体およびさらなるサイトカインの受容体を上方調節することによっても、活性化細胞の増殖を増強するように作用する。このように、本発明のＩＲＸ−２組成物のサイトカインは多面的であり、単球、樹状細胞およびＴ細胞に影響を与える。
【０２６８】
本発明のＩＲＸ−２中に生理的レベルで存在するサイトカインの活性の部位は局所であり、注射部位と注射部位に関連するリンパ節の両方を含む。ＩＲＸ−２は毎日投与することができるので、全てのサイトカインの高い局所レベルを維持することができる。本発明のＩＲＸ−２をアジュバントとして用いるＤＴＨ応答のペプチド特異的な性質は、将来的なＴ細胞ワクチンにおけるＩＲＸ−２の使用を支持するものである。
【０２６９】
さらに、本研究は、本発明のＩＲＸ−２が、老齢マウスにおけるＴ細胞サイトカイン欠損を矯正することを示している。癌が、免疫系が衰えつつあることがわかっている高齢者に発生することが非常に多いことに留意するのは重要である。さらに、腫瘍に対する現在の治療法（放射線照射および化学療法）の多くはそれ自体、免疫抑制的であり、患者の免疫適格性をさらに低下させ得る。したがって、多くの患者に対する癌ワクチンは、加齢、癌治療および癌の防御機構と関連する免疫不全を回復させる可能性を有する薬剤から恩恵を受ける可能性がある。高齢者におけるワクチンの使用に対するこの潜在的な障害を考慮して、ＩＲＸ−２を老齢の免疫適格マウスおよび若い免疫適格マウスにおける効力について本研究で評価した。年老いたマウス由来の脾臓細胞は、若いマウスと比較したとき、ＩＬ−２とＩＦＮ−γの両方のサイトカイン産生が欠損していることがまず確認された。ＤＴＨ応答はオボアルブミンに関しても損なわれていた。本発明のＩＲＸ−２組成物は、担体に対する弱い応答を回復させることができただけでなく、若いマウスの応答と同様のレベルにまでペプチド特異的応答を回復させるのに効果的でもあった。
【０２７０】
ワクチンモデルにおいてＩＲＸ−２を使用するためのプロトコルは、頭頸部癌患者でＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）を用いた第Ｉ相／第ＩＩ相臨床研究と、免疫応答に関する既知の動力学に基づいている（例えば、Ｍｅｎｅｓｅｓ，２００３；Ｈｉｌｌｍａｎ，１９９５）。臨床試験では、低用量シクロホスファミドの前注射および１０日間のＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）投与と組み合わせて、腫瘍流入領域リンパ節をターゲッティングすることにより、腫瘍のリンパ球浸潤の増強、腫瘍構造の断片化および腫瘍サイズの低下がもたらされた（上記の実施例２〜７を参照されたい）。上記のように、マウスでのワクチンモデルにおいて、初期の研究ではシクロホスファミドの前注射が使用されたが、その後の研究で、シクロホスファミドの前注射は健康な非担腫瘍マウスでは必要ないことが確認された（図２５）。さらに、一次免疫（４〜９日間）後にＩＲＸ−２を毎日投与することが重要であるように思われるが、それは、そのような毎日の投与が、注射部位、および後に、流入領域リンパ節に、活性化期間からメモリー移行期間までのＴ細胞免疫応答の最適な刺激に十分なサイトカインレベルが存在することを保証するからである。サイトカインのレベルが低いので、注射部位における明らかな炎症応答はない。これは、腫れと炎症が注射部位で顕著であったミョウバンとＲＩＢＩアジュバント系の両方とは対照的である（未発表の観察結果）。
【０２７１】
担体へのコンジュゲーションをしていないＰＳＭＡペプチドを用いた第Ｉ相／第ＩＩ相研究について報告されたデータに基づくと、本明細書に記載の提案されるペプチド−担体ワクチンは、治療的ワクチンとして臨床的に大いに有望である（Ｔｏｊａ，２０００；Ｏ’Ｈａｇａｎ，２００１；Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ，２０００；およびＮａｙｌｏｒ，１９９１）。この２つのペプチドは、コンピュータモデリングと前立腺癌患者由来のリンパ球の応答の両方に基づくＴ細胞エピトープである。患者をペプチドのみまたはペプチドをパルスした樹状細胞で処置したとき、臨床的応答およびＴ細胞応答の改善が第Ｉ相／第ＩＩ相試験で見られた。しかしながら、第Ｉ相試験では、アジュバントなしのペプチドは、ペプチドをパルスした樹状細胞よりも効果が小さかった。ＩＲＸ−２をペプチド−コンジュゲートとともに投与したときに観察されるペプチド特異的応答の増強および多種多様な臨床試験におけるＫＬＨ−コンジュゲートの安全性を考慮すると、ペプチドとＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）とを用いる臨床試験が当然必要とされる。
【０２７２】
癌ペプチドワクチンマウスモデルを用いた本明細書に提示された研究および本発明のＩＲＸ−２を用いた内因性抗原に対する活発な抗腫瘍応答を示すヒト臨床データは、腫瘍特異的破壊を媒介するのに十分な免疫応答を生成させるための腫瘍ワクチンにおける本発明のＩＲＸ−２組成物の使用を支持するものである。さらに、ＩＲＸ−２は、若いマウスと年老いたマウスの両方におけるＴ細胞特異的応答を増強するよう作用するので、ＩＲＸ−２は、その目標としてＴ細胞免疫応答の増強を含む、どの癌ワクチン（とりわけ、高齢癌患者用のもの）にも含まれる成分の候補である。
【０２７３】
ヒト：
【０２７４】
３人の進行前立腺癌患者に対して、低用量ＣＹ（３００ｍｇ／ｍ２）および毎日のＩＮＤＯ（２５ｍｇ、１日３回）の後に、ＩＲＸ−２（１ｍｌ−１００ユニットのＩＬ−２当量）とともに、コンジュゲートしていないＡＬＦペプチドおよびＬＬＨペプチド（１００μｇ＠）を投与し、追加でＩＲＸ−２（１ｍｌ）をさらに９回注射した。１５日目に、ＩＲＸ−２＋ペプチドの追加免疫を施した。追加の患者（＃４）に対しては、このレジメンにおいてＯＶＡコンジュゲートペプチドを投与した。皮内皮膚試験（２４時間で紅斑のセンチメートルと持続期間の単位で読み取る）により、ＩＲＸ−２（０．１ｍｌ）、ＡＬＦまたはＬＬＨ（１０μｇ）の場合の遅延型過敏反応（ＤＴＨ）を測定した。結果を表ＶＩに示す。
【表６】

【０２７５】
これらのデータは、ＩＲＸ−２レジメンが、進行前立腺癌を有する人におけるコンジュゲートしていないＰＳＭＡペプチドおよびコンジュゲートしたＰＳＭＡペプチドに対するＤＴＨ反応を誘導するのに効果的であることを示している。この結果は、単離されたペプチドで失敗した大半のこれまでの試みの結果とは異なっている。
【０２７６】
さらなる実験により、本発明のＩＲＸ−２が、ＰＳＭＡペプチド抗原とともにアジュバントとして作用して、疾患の安定化をもたらすことができることが示された。より具体的には、３人の進行前立腺癌を有するＨＬＡ−Ａ２陽性の男性を、ＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）（１１５ユニットのＩＬ−２当量）と上記の２種のＰＳＭＡペプチド（各１００μｇ）とで処置した。最初の免疫を頸部への注射によって行ない、次いでＩＲＸ−２（ＩＲＸ−２）を９回注射し（上記の実施例２のプロトコルと同様、低用量シクロホスファミド、インドメタシンおよび亜鉛をプラスした）、その後、ＩＲＸ−２＋２種のペプチドを、月１回５カ月間、追加免疫した。
【０２７７】
表ＶＩＩに、病歴（Ｈｘ）と治療に対する応答（Ｒｘ）を簡潔にまとめる。患者は３人とも、（他の薬に加えて）４〜１０年前に前立腺切除と睾丸切除を受け、再発していた。全員、４カ月からおよそ６カ月の間、ＰＳＡ上昇が倍加している段階にあった。２人には骨痛の症状があった。ＩＲＸ−２＋ペプチドで免疫し、次いで追加免疫の注射をすると、症状は誘発されなかった。
【０２７８】
骨痛を示した２人の患者では痛みが解消した。（患者＃２が大腿骨の骨折を患い、一時悪化したことを除き）患者は３人とも、臨床的に安定した。３人とも、単離されたＰＳＭＡペプチド（ＡおよびＢ；各１０μｇ）を用いる皮膚試験に対して一過性の皮膚反応を示した。３人とも、ＩＲＸ−２またはＰＨＡを用いる皮膚試験に対する反応性の増大を示した。これらの結果は、本発明のＩＲＸ−２が、免疫および追加免疫の間に、これらの患者をＰＳＭＡペプチドに対して免疫し、疾患を安定化させたことを示している。６カ月間にわたるこれら３人の患者におけるＰＳＡ抗原レベルの安定化を示す図３０も参照されたい。上記の追加の患者＃４は、一過性のＰＳＡ安定化と臨床的安定化を示したが、臨床情報は不完全である。ＰＳＡレベルの早期再発を有するさらなる追加の患者（７）は、正常レベルへの復帰を示し、このレベルは、２年の経過観察の間、追加の治療なしで持続した（完全応答）。
【表７】


実施例１２
【０２７９】
以下の研究において、ＩＲＸ−２が前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）由来の２つのＴ細胞特異的ペプチドに対するＴ細胞応答を増幅することが示された。ＩＲＸ−２は、放射線照射したＰＳＭＡ発現３Ｔ３細胞（細胞に基づくワクチン）でおよびペプチド−担体コンジュゲートワクチンに対して免疫したマウスのＰＳＭＡペプチド特異的な遅延型過敏症「ＤＴＨ」応答を増強した。これは、ＰＳＭＡペプチドに対するＴ細胞応答の生成において活性がなかったミョウバン、ＲＩＢＩアジュバント系（ＲＡＳ（登録商標），ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）およびＣｐＧなどのアジュバントとは対照的であった。Ｔ細胞特異的なインビボ活性は、免疫マウスから回収した脾臓細胞によるペプチド特異的なＩＦＮ−γ分泌の増加を示すことにより確認された。他のアジュバントとは対照的に、ＩＲＸ−２は、ペプチドに対するＢ細胞応答も増強した。
【０２８０】
材料および方法
【０２８１】
試薬および細胞
【０２８２】
前立腺特異的膜抗原ペプチド（ペプチド１＝Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ（配列番号１）；ペプチド２＝Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（配列番号２））は、ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）により合成された。オボアルブミン、シクロホスファミドおよびＲＩＢＩアジュバント系（ＲＡＳ；Ｒ−７００）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＫＬＨおよびミョウバン（各４０ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムおよび水酸化マグネシウム）はＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ）から購入した。ＲＡＳは、モノホスホリル脂質Ａ（０．５ｍｇ）および合成トレハロースジコリノミコラート（０．５ｍｇ）と、４４μｌのスクアレンおよびＴｗｅｅｎ−８０とからなっていた。ＣｐＧオリゴヌクレオチド（マウス特異的配列）は、ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）により合成された。ＣｐＧは、ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号３）であり、かつホスホチオナート誘導体であった。マウスにおけるＣｐＧの生体活性は、マウス脾臓細胞の増殖およびマウス接着細胞によるＴＮＦ−αの産生を測定することによって確認された（データは示さない）。
【０２８３】
ＰＳＭＡ挿入物を安定にトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％のＦＢＳを補充したＭＥＭを用いて培養した。この挿入物の発現は、ジェネティシン耐性と免疫組織化学およびフローサイトメトリーによるＰＳＭＡの発現とを示すことによって確認された。セシウム源を用いて細胞に８００Ｇｙの放射線を照射し、細胞に基づくワクチンとして使用するまで−２０℃で凍結させた。
【０２８４】
ＩＲＸ−２は、上記のような活性のある複数のサイトカインからなる初代細胞由来生物製剤である。ＩＲＸ−２投与量はＩＬ−２含量に基づく。２つのロットを同じ実験において等しいＩＬ−２含量で試験したとき、それらの活性は常に等しかった（データは示さない）。ＩＲＸ−２のいくつかのロットをこれらの研究中に使用した。これらの研究で使用されたＩＲＸ−２のロットにおける潜在的な免疫増強サイトカインの平均レベルは、ＩＬ−２（５．５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１（０．５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−γ（１．５ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（２．７ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−８（４６．２ｎｇ／ｍｌ）であった。
【０２８５】
コンジュゲーション
【０２８６】
カルボジイミド法（ＯＤＣ；Ｐｉｅｒｃｅ ＥＤＣキット ７７５０２，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）を用いて、ペプチドをオボアルブミンまたはＫＬＨにコンジュゲートした。カラムからの２８０ｎｍのピークは担体を特定するものであり、これをコンジュゲートとして回収した。２１５ｎｍの光学密度をモニタリングすると、遊離ペプチドを表すテーリングピークが示され、コンジュゲーション手順において余分なペプチドが存在するという確認が得られた。投与量は、カラムから回収されたときの担体濃度を基にした。
【０２８７】
免疫
【０２８８】
Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）またはＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のどちらかから購入し、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣＳＨＬ）Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（動物福祉保証証明書第Ａ３２８０−０１号）の世話の下で飼育した。手順は全て、ＣＳＨＬのＡＬＡＣ委員会によって承認された。所属リンパ節への速やかな流入をもたらすために、免疫（１００μｌのアジュバントまたはＰＢＳとともに１００μｇのコンジュゲートを含む２００μｌ／マウス）を尻尾の付け根に皮下投与した。一次免疫の後に、９回の追加のＩＲＸ−２注射を行なった（２、３、４、５、８、９、１０、１１、および１２日目）。ミョウバンまたはＲＩＢＩ（これらの場合、単回注射するとその部位での炎症が起こる）とは異なり、ＩＲＸ−２を同じ部位に繰り返し注射しても、その部位での大きな炎症は起こらなかった（未発表の観察結果）。ＤＴＨ活性を評価する前に、コンジュゲート＋アジュバントで追加免疫（１４日目と２８日目）を行なった。追加免疫後に、毎日のＩＲＸ−２をさらには投与しなかった。放射線照射細胞をワクチンとして使用する場合は、細胞をＰＢＳまたはＩＲＸ−２のいずれかに懸濁し、１０^３〜１０^５細胞／マウスの用量を用いて皮下注射した。免疫スケジュールは、ペプチドコンジュゲートワクチンで使用したものと同じであった。
【０２８９】
マウスにおける比較アジュバント研究では、ＲＡＳ（Ｒ７００＝スクアレン／Ｔｗｅｅｎ ８０中のＭＰＬ＋ＴＤＭ）を（推奨されるプロトコルの通りに）１ｍｌのＰＢＳで再構成し、その後、１ｍｌのコンジュゲート（１ｍｇ／ｍｌ）と混合した。ミョウバンを抗原と１：１で混合した。ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、公表されているマウスでのプロトコル（マウス１匹当たり２０μｇのＣｐＧと１００μｇのコンジュゲート）の通りにペプチドコンジュゲートと混合した。
【０２９０】
ＤＴＨアッセイ
【０２９１】
ＤＴＨアッセイのためのインビボ抗原刺激を追加免疫の９日後に評価した。マウスに対して、左足蹠に刺激抗原を、右足蹠にＰＢＳを皮下注射した。抗原刺激は、ペプチド（２０μｌ中１００μｇ）または担体（オボアルブミンもしくはＫＬＨ）（２０μｌ中５０μｇ）のいずれかであった。２４時間後、デジタル読取り式キャリパー（Ｐｒｅｉｓｓｅｒ ＤＩＧＩ−ＭＥＴ Ｍｏｄｅｌ １８３１４，Ｓｔｏｆｉｔｉｎｇ Ｃｏ．，Ｗｏｏｄｄａｌｅ，ＩＬ）を用いて、右足蹠および左足蹠の厚さを測定した。左足蹠の厚さ（実験応答）から右足蹠の厚さ（ベースライン）を差し引くことにより、腫れ応答を算出した。データを平均＋／−平均の標準誤差として表す。統計分析はスチューデントのｔ検定によった。
【０２９２】
抗原刺激ＩＦＮ−γアッセイ
【０２９３】
２回目の追加免疫の７〜１４日後に脾臓を摘出し、ワイヤースクリーンに通して分散させることにより単離した。脾臓細胞を取り出し、それらをプラスチックに９０分間接着させておくことにより、接着細胞を得た。さらなる抗原提示細胞を得るために、単離された接着細胞を培養物に添加した（１ウェル当たり約６×１０^５個のリンパ球に２×１０^４個の接着細胞を添加した）。抗原誘導性のリンパ球活性化によるＩＦＮ−γ放出を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製のＤｕｏ−Ｓｅｔｓ ＥＬＩＳＡ試薬を用いて、６日目に回収した上清中で測定した。
【０２９４】
担体およびペプチドに対する血清抗体
【０２９５】
３回目の追加免疫の７〜２１日後に血清を得、後にＥＬＩＳＡアッセイで使用するまで凍結させた。ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ−４，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に対象となる抗原（オボアルブミン、ＫＬＨ、コンジュゲートまたはペプチド）を一晩コーティングした。ブロッキングし、洗浄したウェルに血清の希釈液を添加し、一晩インキュベートした。ビオチン標識抗マウスＩｇＧおよびアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＢｉｏＴｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を順次添加し、ｐＮＰＰ基質を添加した後、ＯＤを測定し、血清の希釈に対してプロットした。
【０２９６】
結果
【０２９７】
ＩＲＸ−２は全細胞に基づくワクチンに対する免疫応答を増大させる
【０２９８】
ＰＳＭＡをトランスフェクトした３Ｔ３細胞を用いてマウスを免疫し、ＰＳＭＡペプチドのプロセッシングと提示を確認した。ペプチドに対する免疫応答を遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイにより評価した。図３１に示すように、放射線照射したＰＳＭＡ発現細胞は、この２つのＰＳＭＡペプチドで刺激したときに、マウスにおいてＤＴＨ応答を生成させた。マウスに対して、放射線照射したＰＳＭＡ発現３Ｔ３細胞とＩＲＸ−２（青色）を投与するか、または放射線照射したＰＳＭＡ発現３Ｔ３細胞をアジュバントなし（ＰＢＳ、赤紫色）で投与することによってワクチン接種し、２回目の追加免疫の９日後に、ペプチド刺激後のＤＴＨ応答を測定した。結果を５〜１５匹のマウスからなる群の平均（＋／−ＳＥＭ）として表す。足蹠の腫れの増大は、アジュバントなし（ＰＢＳ）のマウスと比較したときの、投与された放射線照射細胞およびＩＲＸ−２の用量の関数であった。ＩＲＸ群とアジュバントなし（ＰＢＳ）の群の統計的な差の判定をスチューデントのｔ検定で評価した。両側有意は１０^４および１０^５細胞／マウスについてｐ＜０．００１であり、片側有意は１０^３についてｐ＜０．０５であった。応答は用量関連性であり、アジュバントなしと比較して、ワクチンをＩＲＸ−２とともに投与したときに増強した。
【０２９９】
ＰＳＭＡ−コンジュゲートで免疫したマウスにおけるペプチド特異的ＤＴＨのＩＲＸ−２増強：コンジュゲートおよびＩＲＸ−２の投与
【０３００】
ＩＲＸ−２とともにまたはＩＲＸ−２なしで、様々な用量のペプチドのみまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体にコンジュゲートしたペプチドでマウスを免疫した。抗原の最適用量を規定するために、ペプチドまたはコンジュゲート刺激後のＴ細胞応答を評価した。ペプチド特異的ＤＴＨ応答については用量依存的応答があったが、担体に対する応答は、コンジュゲートの用量によって影響を受けなかった（図３２）。図３２は、免疫したマウスのペプチド（左側）またはＫＬＨ（担体；右側）に対するＤＴＨ応答を示している。応答を１群につき５〜１０匹のマウスの平均＋／−ＳＥＭとして表す。アジュバントなし（Ｎｏ Ａｄｊ）は、応答が最適な用量のコンジュゲートおよびＰＢＳで免疫したマウスで測定されたことを示す。ペプチド応答は用量関連性であったが、担体に対する応答は用量関連性でなかった。１００μｇおよび２５μｇのＰＳＭＡ−ＫＬＨコンジュゲート用量に対するペプチド特異的応答は、アジュバントなしと比べて有意差があった（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による）。ＫＬＨ応答（これは、ＩＲＸ−２の場合の応答と同様であった）と比較したとき、アジュバントなしで試験された最大用量のコンジュゲートは、ペプチド特異的アッセイにおいて活性がなかった。コンジュゲーションしていないペプチドをＩＲＸ−２と共投与したとき、ペプチド特異的ＤＴＨ応答は観察されなかった（データは示さない）。
【０３０１】
ＩＲＸ−２は抗原に対する応答を用量依存的に増大させる
【０３０２】
最適なペプチド特異的ＤＴＨ応答を生じさせるのに必要なＩＲＸ−２の用量を評価した（図３３Ａおよび３３Ｂ）。マウスを最適なコンジュゲートワクチン（１００μｇ／マウス）と様々な用量のＩＲＸ−２とで免疫した。ＩＲＸ−２は複数のサイトカインを含むので、ＩＲＸ−２の用量は、マウス１匹当たりのＩＲＸ−２中のＩＬ−２濃度としてプロットする。ＩＬ−２の濃度を２つの相互交換可能な測定のどちらかによって表す（ＩＵ＝国際単位または純粋な組換え標準を基にしたｐｇ／ｍｌ）。Ｔ細胞特異的ペプチド応答をＤＴＨアッセイで評価した。これを、ペプチド刺激による腫れの増大（＋／−平均の標準誤差）として表す。最適用量（２００〜８００ｐｇ／マウス；４〜１６ＩＵ／マウス）での応答間の相違は、アッセイで試験されたＩＲＸ−２なし（０）ならびに最小用量（７０ｐｇ／ｍｌ）および最大用量（２１００ｐｇ／ｍｌ）と比べて統計的に有意であった（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による）。ＩＲＸ−２の投与量は、ＥＬＩＳＡで測定したときのＩＬ−２のレベルによって規定した。マウス１匹当たり２００〜８００ｐｇのＩＬ−２当量の用量が、ＤＴＨアッセイでＴ細胞応答を増強するのに効果的であった。
【０３０３】
ＩＲＸ−２の複数回注射は抗原に対する免疫応答を改善する
【０３０４】
４回または９回のいずれかの追加のＩＲＸ−２注射は、ペプチド特異的ＤＴＨの増強に関して同様であったが、後のＩＲＸ−２注射を伴わない単回投与のみでは、抗原に対するＴ細胞特異的応答は増強されなかった（図３３Ａおよび３３Ｂおよびデータは示さない）。
【０３０５】
ＩＲＸ−２は抗原に対するＴ細胞応答を媒介する上で他のアジュバントよりも優れている
【０３０６】
ＩＲＸ−２と比較するために、異なる作用機序を有する３つのアジュバントを選択した。ミョウバン（大部分のＦＤＡ承認ワクチンで利用されているアジュバント）、Ｒｉｂｉアジュバント系（オイルと細菌成分を含むアジュバントを代表するもの）およびＣｐＧ（Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化アジュバントを代表するもの）を公表されているプロトコルの通りに投与した。Ｔ細胞ペプチド特異的応答のＩＲＸ−２増強は、ミョウバン、Ｒｉｂｉ（登録商標）またはＣｐＧアジュバントのいずれかよりも優れていた（図３４）。マウスをＰＳＭＡペプチドコンジュゲートと示したアジュバントとで免疫した。２回の追加免疫（１４日目と２８日目）の後、最後の追加免疫の９日後にＤＴＨアッセイを行なった。結果をペプチド注射した足と対照の足の腫れの平均増加（＋／−ＳＥＭ）として表す。ＩＲＸ−２応答は、他の全てよりも大きかった（ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。
【０３０７】
ＩＲＸ−２はペプチド抗原に応答してＩＦＮ−γ産生を増大させる
【０３０８】
マウスを様々な用量のＫＬＨ−ＰＳＭＡコンジュゲートとＩＲＸ−２とで免疫した。ＩＦＮ−γの分泌を測定することにより、免疫したマウス由来の脾臓細胞を、ペプチドによる刺激に対する応答についてエクスビボで評価した。ＩＲＸ−２は、脾臓細胞によるペプチド特異的なＩＦＮ−γ分泌を増大させ、この応答は、免疫に使用したコンジュゲート濃度に対して用量依存的であり、また、その増強は、アジュバント処置していないマウス（（ＰＢＳ）図３５）と有意差があった。ＩＦＮ−γを培養６日後の上清中で測定し、結果をコンジュゲートワクチンの所与の用量でのマウスについての平均（＝／−ＳＥＭ）として表した。２５および１００μｇコンジュゲートでの増加は、アジュバントなしの対照（ＰＢＳ）と比べて統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。比較目的で、下のパネルは、同様の用量のコンジュゲートについてのペプチド特異的ＤＴＨ応答を表す。
【０３０９】
ＩＲＸ−２はペプチド抗原に対する抗体応答を増強する
【０３１０】
放射線照射細胞に基づくワクチンで免疫したマウスはペプチドに対する血清抗体を示し、免疫したマウスの抗体応答は、より低い用量のワクチンでＩＲＸ−２により増強した（図３６）。放射線照射細胞ワクチンで免疫したマウス由来のペプチド特異的血清抗体。血清抗体応答は、方法において記載されたようなＥＬＩＳＡアッセイでマウスＩｇＧ特異的抗体を用いて、血清の希釈における光学密度として測定した。ワクチン＋ＩＲＸ−２で免疫したマウスは、ワクチンの用量がアジュバントを含まない次善最適であったときに、ペプチド特異的応答の増強を示している。この応答は、ワクチン用量がより大きく血清希釈がより小さい場合のＩＲＸ−２でも有意差があった。ＫＬＨ−ペプチドコンジュゲートワクチンを評価した場合、ＩＲＸ−２はまた、ミョウバンとアジュバントなしの両方と比較してペプチド特異的応答を増強した（データは示さない）。
【０３１１】
ＩＲＸ−２はコンジュゲートペプチドに対する抗体応答の刺激において他のアジュバントよりも優れている
【０３１２】
オボアルブミン−ペプチドコンジュゲートとともに投与されたＩＲＸ−２は、ペプチドに対する抗体を生じさせたが、コンジュゲートとともに投与されたＣｐＧもミョウバンもペプチドに対する抗体を生じさせなかった（図３７）。このデータは、ＡＬＦで始まる配列を有するペプチドについてのものであり、有意性は、ＩＲＸ−２対ミョウバンおよびＣｐＧについて、ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５であった。これらの結果は、コンジュゲートワクチンとともに投与されたＩＲＸ−２だけがペプチド特異的ＤＴＨ応答をもたらしたＴ細胞アジュバント比較研究と一致する（比較のために、図３４を参照されたい）。
【０３１３】
実施例１３
【０３１４】
以下の研究において、ＩＲＸ−２は、不完全フロイントアジュバントを含むワクチン中のＰＳＭＡの優性マウスエピトープに対するＴ細胞応答を増幅することが示された。ＩＲＸ−２は、不完全フロイントアジュバント中のＰＳＭＡペプチドで免疫したマウスのＰＳＭＡペプチド特異的ＩＦＮ−γ応答を増強した。Ｔ細胞特異的なインビボ活性は、免疫したマウスから回収された脾臓細胞によるペプチド特異的なＩＦＮ−γの分泌および抗原特異的Ｔ細胞の数の全体的な増加によって確認された。他のアジュバントとは対照的に、ＩＲＸ−２は、ペプチドに対するＢ細胞応答も増強した。
【０３１５】
材料および方法
【０３１６】
試薬および細胞
【０３１７】
これらの研究で使用されるＮＦＴペプチドは、ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ Ｔｘ）により合成された。ＮＦＴペプチド配列は、ＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦ（ヒトタンパク質由来）であった。マウスＰＳＭＡは類似の配列（ＮＦＴＲＴＰＨＬＡＧＴＱＮＮＦ）を有するが、太字でないアミノ酸によって示されるような非同一性も有しており、このことは、これらの研究が寛容の破壊を示すために特にデザインされたものではないことを意味する。これらの研究のための陰性対照の免疫ペプチドは、Ｃ５７ｂｌ／６マウスのクラスＩＩインフルエンザエピトープ（ＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ）であった。オボアルブミン、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、および組合せアジュバント（スクアレン／Ｔｗｅｅｎ ８０中のＭＰＬ＋ＴＤＭ、別名、Ｒｉｂｉアジュバント系またはＳｉｇｍａアジュバント系カタログ番号Ｓ６３２２）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。組合せアジュバントは、最終容量１ｍｌのＰＢＳ中のモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ；０．５ｍｇ）および合成トレハロースジミコラート（ＴＤＭ；０．５ｍｇ）と、４４μｌのスクアレンおよび２００μｌのＴｗｅｅｎ−８０（すなわち、水中油）とからなっていた。フロイントの不完全アジュバントは、モノオレイン酸マンニドと組み合わせたパラフィン油（０．８５ｍＬのパラフィン油と０．１５ｍＬのモノオレイン酸マンニド）からなっている。市販され、フロイント完全アジュバントに似ているが、毒性がないので、このアジュバントを選択した。
【０３１８】
免疫
【０３１９】
Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）またはＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のどちらかから購入し、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣＳＨＬ）Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（動物福祉保証証明書第Ａ３２８０−０１号）の世話の下で飼育した。手順は全て、ＣＳＨＬのＡＬＡＣ委員会によって承認された。所属リンパ節への速やかな流入をもたらすために、免疫（通常、１００μｌのアジュバント、ＰＢＳまたはＸ−Ｖｉｖｏ １０培地とともに１００μｇの抗原を含む２００μｌ／マウス）を尻尾の付け根に皮下投与した。注記した場合を除き、一次免疫（０日目と表す）の後に、尻尾の付け根に９回の追加のＩＲＸ−２注射を行ない、その結果、抗原を含まないＩＲＸ−２を１、２、３、４、７、８、９、１０、１１日目に投与した。マウスを操作する際の潜在的なストレスについてコントロールするために、ＩＲＸ−２を投与されないマウスには、ＰＢＳまたはＸ−Ｖｉｖｏ １０培地のいずれかを１、２、３、４、７、８、９、１０、１１日目に投与した。抗原とともに投与したとき、ＰＢＳとＸ−Ｖｉｖｏは両方とも、ＩＲＸ−２と比較して非刺激性であった。本テキストおよび図では、抗原＋ＰＢＳまたはＸ−Ｖｉｖｏを投与されたマウスを「対照」またはアジュバントなしのマウスと呼ぶ。投与量は、ＩＲＸ−２中のＩＬ−２レベルに基づいて規定され、別途示さない限り、７００ｐｇ／マウス（１５ＩＵ／マウス）であった。抗原＋アジュバントによる追加免疫を１４日目に投与し、ＤＴＨアッセイについては、２８日目に繰り返した。追加免疫の後、毎日のＩＲＸ−２注射をさらには投与しなかった。放射線照射細胞をワクチンとして使用する場合は、細胞をＰＢＳまたはＩＲＸ−２のいずれかに懸濁し、１０^３〜１０^６細胞／マウスの用量を用いて皮下注射した。
【０３２０】
ＩＦＡを１部のペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）、１部のＩＦＡ、および１部のＩＲＸ−２またはＰＢＳ／Ｘ−ＶＩＶＯとして混合した。２本のシリンジを接続するメス：メスルアーロックに通して乳化した後、各マウスに３００μｌを皮下投与した。組合せアジュバント（スクアレン／Ｔｗｅｅｎ ８０中のＭＰＬ＋ＴＤＭ）を（推奨されたプロトコルの通りに）２ｍｌのＰＢＳで再構成し、その後、２ｍｌのコンジュゲート（１ｍｇ／ｍｌ）および２ｍｌのＩＲＸ−２または対照のいずれかと混合した。組合せアジュバントをボルテックス処理によってＩＲＸ−２と混合し、各マウスに３００μｌを皮下投与して、追加容量のＩＦＡとした。
【０３２１】
抗原刺激ＩＦＮ−γアッセイ
【０３２２】
リンパ節と脾臓を示した時点で（最初の追加免疫の３〜２４日後に）摘出し、細胞をワイヤースクリーンに通して分散させることにより単離した。脾臓内の赤血球を塩化アンモニウム溶解バッファー（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて溶解させた。脾臓細胞をプレーティングし、それらをプラスチックに９０分間接着させておくことにより、リンパ節細胞培養物に添加するための接着細胞を得た。さらなる抗原提示細胞を得るために、単離された接着細胞を培養物に添加した（１ウェル当たり２〜６×１０^５個のリンパ球を２〜４×１０^４個の接着細胞に添加した）。抗原誘導性のリンパ球活性化によるＩＦＮ−γ放出を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製のＤｕｏ−Ｓｅｔｓ ＥＬＩＳＡ試薬を用いて、６日目に回収した上清中で測定した。
【０３２３】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
【０３２４】
脾臓細胞について１ウェル当たり２×１０^５リンパ球またはリンパ節細胞について１ウェル当たり３×１０^５リンパ球のいずれかで細胞をプレーティングした。ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）をＰＢＳにて捕捉抗体（ＭＡＢ−１８、ＭａｂＴｅｃｈ（Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ，ＯＨ）製）で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、抗原と細胞を添加し、その後、３７℃で１８時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで激しく洗浄して細胞を除去し、ビオチン化二次抗体（ＭａｂＴｅｃｈ）をさらに１８時間のインキュベーションの間添加した。ビオチン−ＡＰとＤＡＢ基質を順次用いてプレートを発色させた。ＺｅｌｌＮｅｔ（Ｆｏｒｔ Ｌｅｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）製のデジタル変換ソフトウェアを備えた顕微鏡を用いて、プレートを読み取った。
【０３２５】
結果
【０３２６】
ＩＲＸ−２活性を規定するためのＩＦＡ中のＴ細胞ペプチドによる免疫
【０３２７】
タンパク質抗原の優性ペプチドエピトープに対するＴ細胞応答は、通常、これらのペプチドを不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）に含めて投与することによって評価される。ＩＦＡは、そのデポ効果および当該部位で炎症反応を生成させるその潜在能力の結果として効果的である。ＩＦＡ中の優性ＮＦＴペプチドで免疫したマウスは免疫応答を起こし、これは、リンパ節および脾臓細胞についてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定したとき、ＩＲＸ−２での処置によって増強された（図３８Ａ）。ＩＲＸ−２の有無にかかわらず、ＩＦＡを含まないペプチドでは、ナイーブマウスと有意差がなかった（データは示さない）。図３８Ｂにより、ＩＲＸ−２誘導性の脾臓細胞ＥＬＩＳｐｏｔ応答の増大は、ＩＦＮ−γ分泌アッセイでも反映されたことが確認される。図３９Ａと３９Ｂは、追加免疫の後、マウスから経時的に回収した細胞のＥＬＩｓｐｏｔアッセイで明確にされたＴ細胞応答の一過性の発達を示している。ＩＲＸ−２は、全ての時点のリンパ節において、抗原のみの対照と比較して免疫応答を増大させる。脾臓細胞では、応答は、１７〜１９日目にのみ増強された。また、ＩＲＸ−２の最適投与量を測定するために、ＩＦＡ中のＮＦＴを用いるＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用した。図４０Ａに示すように、ＩＲＸ−２の最適用量は、７００ｐｇのＩＬ−２当量／マウスの１０日間毎日の投与であった。最適用量を用いて、９回と４回の追加用量のＩＲＸ−２の両方が同様であることが分かった（図４０Ｂ）。ＩＲＸ−２の単回投与は、Ｔ細胞応答を増強するのに十分ではない（図４０Ｂ）。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイとＤＴＨアッセイの両方でペプチド−コンジュゲートを免疫原として用いて同様の結果が得られた（データは示さない）。
【０３２８】
ＩＲＸ−２はＴ細胞応答を優先的に増強する
【０３２９】
ＮＦＴペプチド−コンジュゲートを用いて、ＩＲＸ−２を市販の組合せアジュバント（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋スクアレン＋Ｔｗｅｅｎ ８０）と比較し、ＮＦＴに対するＴ細胞応答と、担体として用いたオボアルブミンまたはＫＬＨに対するＢ細胞応答とを測定することにより評価した。ＭＰＬ＋ＴＤＭに基づくアジュバントはＳＩＧＭＡから市販されているが、これは、かつてはＲＩＢＩ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能で、その後、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙにより販売されたＲＩＢＩアジュバントと類似している。このアジュバントは、古典的なフロイントアジュバントと同等であるが、毒性のある副作用がないので、強力なアジュバントのプロトタイプ例と考えられる。コンジュゲートとともに使用された１００μｇ／ｍｌ用量のＫＬＨに対する抗体力価は、ＫＬＨの強力な活性のために、アジュバントによって増大しなかった（データは示さない）。これらの研究では、オボアルブミンに対する応答を用いて、アジュバントのＢ細胞活性を評価した。追加免疫後３日目のＮＦＴ−コンジュゲートに対するＴ細胞応答の増大は、ＩＲＸ−２および組合せアジュバントについて陽性であったが（図４１Ａ）、ＩＲＸ−２は組合せアジュバントよりも優れていた。逆に、ＩＲＸ−２はＢ細胞応答を増強したが、血清中の抗体力価に関しては、組合せアジュバントほど効果的ではなかった（図４１Ｂ）。
【０３３０】
予防腫瘍ワクチン研究
【０３３１】
これまでの研究で、本発明者らの研究で使用したよりも高い用量の放射線照射したｈＰＳＭＡ発現３Ｔ３細胞（Ｐ−３Ｔ３）で免疫したマウスは、ｎｅｏ−ベクターのみを含む３Ｔ３細胞で免疫したマウスと比較したとき、ＰＳＭＡ発現ＲＥＮＣＡ細胞（Ｐ−ＲＥＮＣＡ）による腫瘍刺激から防御されることが示された。本発明者らは、ＩＲＸ−２処置したまたはＩＲＸ−２処置していないｈＰＳＭＡ発現３Ｔ３細胞を用い、その後、Ｐ−ＲＥＮＣＡ細胞で刺激して、これらの研究を確認し、敷延した。これまでに報告されたように、高用量の細胞（＞１０^６細胞／マウス）で免疫したマウスは、アジュバントなしでも完全に防御された（データは示さない）。より低い用量の１０^５細胞／マウスで免疫したマウスでは腫瘍増殖が遅延し、ＩＲＸ−２が防御を増強した（図４２）。ＩＲＸ−２による生存の改善はあったが、ごくわずかのマウスだけがＩＲＸ−２群で腫瘍を発達させなかった。優性エピトープが防御的であるかどうかを評価するために、マウスをＮＦＴ−ＫＬＨコンジュゲート（ＩＲＸ−２の有無を問わない）で免疫した。１組の対照マウスをＫＬＨのみ（ＩＲＸ−２の有無を問わない）で免疫した。図４２Ａ〜Ｃに示すように、ＮＦＴ−ＫＬＨ＋ＩＲＸ−２で免疫したマウスは、他の３つの群（アジュバントなしのＮＦＴ−ＫＬＨまたはＩＲＸ−２ありのＫＬＨまたはＩＲＸ−２なしのＫＬＨ）と比較したとき、早い腫瘍増殖遅延を示した。腫瘍を完全に拒絶したマウスはなく、腫瘍増殖によって明確にされたような早い防御は、生存の延長にはつながらなかった。
【０３３２】
ＩＲＸ−２はペプチドコンジュゲートワクチン系において他のアジュバントよりも優れている
【０３３３】
８〜１０週齢の年老いたマウス（１群につき５〜８匹）を、ＮＦＴ−ＫＬＨコンジュゲートと、ＩＲＸ−２、組合せアジュバントであるスクアレン／Ｔｗｅｅｎ ８０中のモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）＋トレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）、または対照のいずれかとで免疫した。追加免疫の３日後に得られたリンパ節細胞を用いてＮＦＴ特異的ＥＬＩＳｐｏｔ応答を測定した。図４３に示すように、ＩＲＸ−２は、ＩＦＮ−γ分泌細胞によって測定されるようなインビボでの抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するのに、ＭＰＬ＋ＴＤＭワクチンよりも優れていた。データをＮＦＴ特異的ＥＬＩＳｐｏｔの増加（平均＋／−ＳＥＭ）として表す。
実施例１４
【０３３４】
感染性生物または腫瘍に由来する規定の抗原からなるサブユニットワクチンの開発は、ＣＤ８Ｔ細胞およびＴｈ１を誘導する効果的なアジュバントがないために、大いに妨げられている。これらの応答は協調して効果的な細胞性免疫を媒介し、感染した細胞または悪性宿主細胞の排除をもたらす。実際、現在使用されている大半のワクチンは今も、生きた弱毒化生物からなり、これは、製造が難しく、また、安全性と貯蔵の潜在的な問題がある可能性がある。アジュバント（例えば、鉱油、マイコバクテリア、およびミョウバン）は、多くの場合、獲得免疫を増幅するために必要とされる。最も効果的なものは、一般に、ＣＦＡと考えられているが、これは、動物でしか使用することができず、有害な皮膚炎症を引き起こすことがある。下記の研究は、ＩＲＸ−２をＴＬＲ依存的アジュバントとＴＬＲ非依存的アジュバントとからなる多重アジュバントワクチンに付加すると、極めて高いレベルの抗原特異的Ｔ細胞免疫が誘導されることを示している。
【０３３５】
以下の実施例は、ＴＬＲ依存的機構とＴＬＲ非依存的機構の両方によって機能する他のアジュバントと組み合わせたＩＲＸ−２がペプチドワクチンを増強することを示している。さらに、ＩＲＸ−２は、多成分ワクチンを接種した後にインビボで抗原特異的Ｔ細胞の数を増大させただけでなく、抗原特異的Ｔ細胞の細胞傷害活性も増大させた。
【０３３６】
材料および方法
【０３３７】
アジュバント組合せおよびワクチン接種手順
【０３３８】
Ｃ５７ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ）をＰＢＳ中の以下の試薬の組合せ（マウス１匹当たり）：ＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）ペプチド（１００μｇ；ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）、ＩＦＮ−γ（１００ｎｇ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）＋トレハロース６，６’−ジミコラート（ＴＤＭ）エマルジョン（Ｒｉｂｉアジュバント、製造者の指示の通りに使用；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣｐＧ １８２６（２５μｇ；ＶＨ Ｂｉｏ）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ；５０μｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＭＰＬ（５０μｇ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で皮内（ｉ．ｄ．）免疫し、最終的なワクチン容量は２００μｌ（１００μｌ／脇腹）とし、ワクチンを３７℃に温め、注射前に激しく振盪した。０日目にマウスに初回刺激し、別途示さない限り、同じ用量のＡｇ／アジュバントで９〜１１日目に追加免疫した。ＭＰＬ＋ＴＤＭと、さらなるＴＬＲアゴニストと、ＩＦＮ−γと、抗ＣＤ４０、クラスＩＩペプチド、または全タンパク質のいずれかとを含む組合せアジュバントを、細胞性免疫の相乗的活性化のための組合せアジュバント（ＣＡＳＡＣ）と呼ぶ。別途示さない限り、５量体解析のために血液サンプルを１９〜２１日目に採取した。別途示さない限り、インビボＣＴＬアッセイを２０〜２２日目に行なった。
【０３３９】
インビボ細胞傷害性アッセイ
【０３４０】
初回刺激していないＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞に、１０μｇ／ｍｌの抗原性ペプチドを培養液中で１時間パルスした。その後、これらの細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、０．３μＭのＣＦＳＥで１０分間標識した。対照細胞を培地のみで培養し、３μＭのＣＦＳＥで標識した。対照細胞および標的細胞（各１０^７個）を混合し、免疫したレシピエントまたは対照レシピエントにｉ．ｖ．移入した。１８時間後、本発明者らは、脾臓を摘出し、フローサイトメトリーでＣＦＳＥを解析した。回収した標的（ＣＦＳＥｌｏｗ）細胞と対照（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）細胞の数を用いて、以下の式により、殺傷率を算出した：殺傷（％）＝１−［（免疫した動物内の標的細胞の数／対照細胞の数）／（対照動物内の標的細胞の数／対照細胞の数）］×１００。
【０３４１】
結果
【０３４２】
ＩＲＸ−２はペプチドワクチン中の他のアジュバントと相乗的に作用する
【０３４３】
図４４に示すように、多重アジュバント製剤（ＣｐＧ、ポリＩ：Ｃ、ＩＦＮ−γを含むオイルエマルジョン）と組み合わせたＩＲＸ−２は、抗原特異的Ｔ細胞を生成させるのに、アジュバントの組合せのみよりも優れている。図４４Ａに示すように、ワクチン接種後の抗原特異的Ｔ細胞の割合は、ＩＲＸ−２をワクチンに追加したときに増加した。さらに、図４４Ｂに示すように、Ｔ細胞当たりの抗原特異的ＭＨＣ分子の数は、ＩＲＸ−２をワクチンに追加したときに増加した。
【０３４４】
ＩＲＸ−２は、ＴＬＲ依存的アジュバントとＴＬＲ非依存的アジュバントとを含むペプチドワクチンに追加したとき、抗原特異的Ｔ細胞の細胞傷害性を増大させる。
【０３４５】
図４５に示すように、多重アジュバント製剤（ＣｐＧ、ポリＩ：Ｃ、ＩＦＮ−γを含むオイルエマルジョン）と組み合わせたＩＲＸ−２は、ワクチンの接種によって生成される抗原特異的Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強するのに、アジュバントの組合せのみよりも優れている。さらに、ＩＲＸ−２を多重アジュバントワクチンに追加したとき、１回の注射しか必要ないことが図４５で示された。
【０３４６】
実施例１５
【０３４７】
カナリア痘ウイルスベクター（ＡＬＶＡＣ）によって発現されたオボアルブミンに対する免疫応答のＩＲＸ−２増強
【０３４８】
以下の実施例は、ＩＲＸ−２が、ウイルスに基づくワクチン中で発現された抗原に対するＴ細胞応答を増強することができることを示している。さらに、ＩＲＸ−２は、３つ組の刺激分子ＴＲＩＣＯＭでさらに増強される、ウイルスに基づくワクチンに対するＴ細胞応答を増強することが示された。
【０３４９】
ＯＶＡ−ＡＬＶＡＣは、オボアルブミンタンパク質を発現するように「改変された」カナリア痘ウイルスである。この構築物の推定される利点は、このウイルスが、ＴＬＲアジュバントを不要にする「炎症応答」を生じさせるはずであるということである。ＯＶＡ−ＡＬＶＡＣは、当該部位の全ての細胞（交差提示を必要とせずに、プロセッシングした抗原を提示する抗原提示細胞（ＤＣ）を含む）に感染する。当該部位のリンパを集めるリンパ節は、感染した細胞によって分泌されるオボアルブミンと炎症部位から遊走してきたＤＣの両方を受容する。リンパ節に侵入したＡＰＣは、Ｔ細胞（ヘルパーＴおよび細胞傷害性Ｔ）の主な駆動因子であり、当該部位からリンパ節に流入したオボアルブミンは、抗体産生細胞の生成に必要とされる。２つの異なるオボアルブミン発現構築物：ＯＶＡ−ＡＬＶＡＣおよびＯＶＡ−ＴｒｉＣｏｍ−ＡＬＶＡＣが評価用に利用可能であった。ＴｒｉＣｏｍ構築物は、オボアルブミンの他に、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１およびＢ７．１を発現するよう改変されたものである。これらの３つのタンパク質は、重要な共刺激タンパク質の過剰発現をもたらすことによって免疫応答を増強すると仮定される。
【０３５０】
材料および方法
【０３５１】
免疫応答を評価するためのモデルは、一次免疫と、それに続く１４日目の追加免疫であった。両方の日にＩＲＸ−２をＡＬＶＡＣ構築物とともに送達した。追加のＩＲＸ−２を一次免疫の後に９日間投与した。本報告に添付する図の中に示された日に、マウスを屠殺したかまたはマウスから採血した。３つの用量のＯＶＡ−ＡＬＶＡＣを本研究で使用した（マウス１匹当たり３×１０^７（標準用量）、３×１０^６、３×１０^５ＰＦＵ）。２つの用量のＯＶＡ−ＴｒｉＣｏｍ−ＡＬＶＡＣも本研究で評価した（マウス１匹当たり３×１０^６（標準用量）、３×１０^５ＰＦＵ）。リンパ節および脾臓におけるＴ細胞応答を、マウス優性エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を用いるＥＬＩＳｐｏｔで測定した。Ｂ細胞応答を、オボアルブミンコーティングプレートと免疫したマウス由来の血清とを用いるＥＬＩＳＡで測定した。
【０３５２】
結果
【０３５３】
ＩＲＸ−２はウイルスに基づくワクチンを接種した後に抗体応答を増大させる
【０３５４】
図４６に示すように、ウイルスワクチンを接種した後の抗体応答は、ＩＲＸ−２の追加によって増強した。ＩＲＸ−２は、対照と比較してペプチド特異的Ｔ細胞応答を全ての時点で一貫して増大させた。
【０３５５】
ＩＲＸ−２はウイルスに基づくワクチンを接種した後にＴ細胞応答を増大させる
【０３５６】
図４７に示すように、ＩＲＸ−２は、ウイルスに基づくワクチンを接種した後に抗原特異的Ｔ細胞応答を増強した。
【０３５７】
ＩＲＸ−２はＴＲＩＣＯＭを発現するウイルスに基づくワクチンを接種した後にＴ細胞応答を増強させる
【０３５８】
ＩＲＸ−２は、より低い用量のＯＶＡ−ＴｒｉＣｏｍ−ＡＬＶＡＣ構築物で免疫したマウスに対するＴ細胞応答を増強させた。より低い用量のＯＶＡ−ＴｒｉＣｏｍ−ＡＬＶＡＣでより低いＴ細胞応答が生じたので、Ｔ細胞応答は用量依存的であった。図４８に示すように、ＩＲＸ−２は、マウス１匹当たり３×１０^５ｐｆｕで免疫したマウスの対照と比較するとＴ細胞応答を増強したが、より高い用量のＯＶＡ−ＴｒｉＣｏｍ−ＡＬＶＡＣ（マウス１匹当たり３×１０^６ｐｆｕ）で免疫したマウスの対照と比較するとＴ細胞応答を増強しなかった。
【０３５９】
ＩＲＸ−２はウイルスに基づくワクチンを接種した後に抗原特異的メモリーＴ細胞の拡大を増強する
【０３６０】
図４９に示すように、ＩＲＸ−２は、対照と比較してペプチド陽性メモリーＴ細胞を増大させた。１０^６ＰＦＵで免疫したマウスと１０^５ＰＦＵで免疫したマウスは両方とも、ＩＲＸ−２をワクチンに含めた場合により強い応答を示した。より高い用量のワクチンでの一次応答と拡大応答の差は、一次応答が活性Ｔ細胞を測定するものであるのに対し、拡大応答はメモリー細胞に注目するものであることによる可能性がある。
【０３６１】
ＩＲＸ−２はウイルスに基づくワクチンを接種した後にＩｇＭ抗体応答を増強する
【０３６２】
図５０に示すように、ＩＲＸ−２は、全ての時点および全てのＯＶＡ−ＡＬＶＡＣ用量において、オボアルブミン特異的ＩｇＭ抗体の応答を増強する。
【０３６３】
ＩＲＸ−２はウイルスに基づくワクチンを接種した後にＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ａ抗体応答を増強する
【０３６４】
図５１に示すように、血清の希釈対ＯＤとしてプロットした場合、ＩｇＧ_１応答とＩｇＧ２_Ａ応答は、対照と比較してＩＲＸ−２で免疫したマウスにおいてより大きかった。
【０３６５】
考察
【０３６６】
本研究の結果は、癌ワクチンまたは感染性疾患ワクチン中の外から投与される腫瘍抗原に対する細胞性免疫応答を開始させるのに使用することができる強力な治療法としてのＩＲＸ−２を提示するものである。放射線照射したＰＳＭＡ発現細胞に基づくワクチンまたは合成ペプチドコンジュゲートワクチンとともに投与されたＩＲＸ−２は、これらの抗原に対するインビボでのＴ細胞免疫応答を増強することができた。ＩＲＸ−２活性のこの新規の性質は、ＩＲＸ−２と、様々な作用機序を代表するように選択された他のアジュバントとを比較することにより確認された。ミョウバンを評価したのは、それが広く使用されているＦＤＡ承認アジュバントであるからであり、ＣｐＧを評価したのは、それが抗原提示細胞を標的とするＴＬＲアゴニストであるからであり、ＲＩＢＩアジュバント系（ＲＡＳ）を評価したのは、それが複数のアジュバント活性を含んでおり、かつマウスモデルにおけるより安全なフロイントアジュバント代替物であるからであった。ＩＲＸ−２は、コンジュゲートワクチンに対するペプチド特異的ＤＴＨ応答を増強したが、ミョウバン、ＣｐＧまたはＲＡＳは、コンジュゲートワクチンに対するペプチド特異的ＤＴＨ応答を増強しなかった。インビボでのＴ細胞ペプチド特異的ＤＴＨ応答のＩＲＸ−２増強は、ＩＦＮ−γ分泌によって測定されるような、エクスビボでの特異的抗原に対する脾臓細胞のＴ細胞応答の増強を伴った。これらの結果と並行して、ペプチドに対する抗体応答があった。（ＰＢＳと比較したとき）全てのアジュバントがタンパク質担体に対する抗体応答およびＤＴＨ応答を増強したが、ＩＲＸ−２だけが、担体にコンジュゲートしたペプチドに対する抗体応答を増強した。ＩＲＸ−２は、放射線照射したＰＳＭＡ発現細胞を免疫原として使用したときのペプチド特異的抗体応答も増強した。これらの観察は、ヒトとマウスのタンパク質に８０％の相同性があり、また、ペプチドに対する寛容が、他のアジュバントと比較して、ＩＲＸ−２によって克服される可能性があることを示すので、重要である。
【０３６７】
ここに報告された研究は、ＩＲＸ−２が外因性抗原に対するＴ細胞免疫応答を増強し、かつ治療用癌ワクチン中の複数の抗原タイプと組み合わせて使用することができることを示す重要な前臨床データを提供している。放射線照射細胞とコンジュゲートワクチンの両方に対するＴ細胞ペプチド特異的応答という独特の性質は、ＩＲＸ−２の作用の多重標的様式とサイトカイン同士の相乗作用の結果である。ＩＲＸ−２は、抗原提示の増加だけでなく、その後のＴ細胞分化、増殖および末梢への遊走の刺激も含む複数の活性を有するワクチンをもたらすＴ細胞アジュバントプラットフォームを提供する。これらのサイトカインはまた、ＤＣ寛容または調節性Ｔ細胞バランスをＴ細胞エピトープに対する応答の活性化へと転換し、メモリーＴ細胞の産生を増強する。ＩＲＸ−２はまた、担体または放射線照射細胞におけるＴ細胞ヘルパーエピトープを増強し、効果的なＴ細胞応答の発達をさらに刺激する。
【０３６８】
本出願の全体を通して、米国特許を含む様々な刊行物は、著者および年および特許番号により参照される。これらの刊行物についての完全な引用を以下に列挙する。これらの刊行物および特許の完全な形での開示は、本発明が関係する技術の状態をより十分に記載するために、参照により本出願に組み込まれる。
【０３６９】
本発明は説明的な様式で記載されており、使用された専門用語は、単語の限定する性質ではなく、説明する性質を持つことを意図することが理解されるべきである。
【０３７０】
本発明の多数の修飾および変形が上記の教示に鑑みて可能であることは明らかである。したがって、記載された発明の範囲内において、本発明は具体的に記載されたものとは別の方法で実施され得ることが理解されるべきである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む相乗量の初代細胞由来生物製剤と、少なくとも１種の抗原を含む癌ワクチンとを含む組成物。
【請求項２】
前記組成物は、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肺癌、脳腫瘍、結腸癌、卵巣癌、舌癌、咽頭癌、前立腺癌、および黒色腫からなる群から選択される癌の治療用である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原が、天然タンパク質、組換えタンパク質、化学合成タンパク質、またはそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原が、ＡＦＰ、α−アクチニン−４、ＡＲＴＣ１、ＢＡＧＥ、ＢＣＲ−ａｂｌ、Ｂ−ＲＡＦ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、β−カテニン、癌胎児性抗原、修飾された癌胎児性抗原、癌関連突然変異ムチン、ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、クロモグラニンＡ、ＣＯＡ−１、サイクリン依存的キナーゼ−４、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ、伸長因子２、上皮増殖因子受容体ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エプスタインバーウイルスＥＢＮＡ遺伝子産物、ＥＴＡ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、ＧＡＧＥ、ガングリオシド、ＧＰＮＭＢ、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１、ｇｐ１００、Ｈ１ＦＴ、ＨＡＧＥ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質、ＨＩＰ−５５、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、キネシン２、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＬＫ−４、ＫＭ−ＨＮ−１、ＫＳＡ、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＭＡＧＥ、マンマグロビン−Ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ＭＡＲＴ−２、ＭＥ１、黒色腫プロテオグリカン、ミオシンクラスＩ、ＭＵＣ−１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ−８８、ＮＣＡＭ−１８０、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ−ＢＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐ１５、ｐ２１−ｒａｓ、ｐ５３、ｐ１８５ ＨＥＲ２／ｎｅｕ、パピローマウイルスＥ７、パピローマウイルスＥ６、ｐｍｉ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＲＡＢ３８、ＲＢＡＦ６００、ＳＡＧＥ、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ｓｐ１７、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合タンパク質、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡ ９０、ＴＡＧ、ＴＧＦ−β１抗アポトーシス因子、ＴＧＦ−βＲＩＩ、チログロブリン、ＴＲＡＧ−３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、腫瘍タンパク質Ｄ５２、チロシナーゼ、ＷＹ−１、それらの断片、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ワクチンが、ウイルスベクター中にコードされた少なくとも１種の抗原を含むものとしてさらに規定される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（ＭＡ）、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、ＴＲＯＶＡＸ、鶏痘、およびカナリア痘からなる群から選択されるポックスウイルスである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記カナリア痘が、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
アバタセプト、ベラタセプト、ＣＤ２８−ＳｕｐｅｒＭＡＢ、Ｂ７／ＣＤ２８共刺激分子、ＴＮＦスーパーファミリー共刺激分子、ＳＬＡＭファミリー共刺激分子、およびそれらの組合せからなる群から選択される共刺激分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
抗ＣＴＬＡ−４をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｔｒｅｇ枯渇化分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｔｒｅｇ枯渇化分子がデニロイキンジフチトクスである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
血管新生関連抗原をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
（１）ＣＤ８０、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３；（２）ＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦ；（３）ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−α；（４）ＣＤ８０およびＩＬ−１２；ならびに（５）ＣＤ８６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１２からなる群から選択される増強剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
化学療法、放射線、抗血管新生療法、およびそれらの組合せからなる群から選択される治療とさらに組み合わせた、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、１日１回の両側性外リンパ注射によって投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記初代細胞由来生物製剤が、前記サイトカインＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
内因性抗原をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
有効量の化学的インヒビターならびにインドメタシン（ＩＮＤＯ）、イブプロフェン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ＣｏｘＩＩインヒビター、およびそれらの組合せからなる群から選択される非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
ＩＬ−１が６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−２が６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−８が６０００〜６００，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度で存在し、かつＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
ｔｏｌｌ様受容体非依存的アジュバント、ｔｏｌｌ様受容体依存的アジュバント、およびそれらの組合せからなる群から選択されるアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む相乗量の初代細胞由来生物製剤を、少なくとも１種のアジュバントと組み合わせて含む、患者における免疫応答を増強するための組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１種のアジュバントが、ｔｏｌｌ様受容体非依存的アジュバント、ｔｏｌｌ様受容体依存的アジュバント、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記アジュバントが、前記初代細胞由来生物製剤の作用機序とは異なる作用機序を有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む相乗量の初代細胞由来生物製剤と、少なくとも１種の抗原を含むワクチンとを含む組成物を投与する工程を含む、ワクチン接種方法。
【請求項２６】
前記抗原が、ＡＦＰ、α−アクチニン−４、ＡＲＴＣ１、ＢＡＧＥ、ＢＣＲ−ａｂｌ、Ｂ−ＲＡＦ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、β−カテニン、癌胎児性抗原、修飾された癌胎児性抗原、癌関連突然変異ムチン、ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、クロモグラニンＡ、ＣＯＡ−１、サイクリン依存的キナーゼ−４、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ、伸長因子２、上皮増殖因子受容体ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エプスタインバーウイルスＥＢＮＡ遺伝子産物、ＥＴＡ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、ＧＡＧＥ、ガングリオシド、ＧＰＮＭＢ、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１、ｇｐ１００、Ｈ１ＦＴ、ＨＡＧＥ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質、ＨＩＰ−５５、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、キネシン２、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＬＫ−４、ＫＭ−ＨＮ−１、ＫＳＡ、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＭＡＧＥ、マンマグロビン−Ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ＭＡＲＴ−２、ＭＥ１、黒色腫プロテオグリカン、ミオシンクラスＩ、ＭＵＣ−１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ−８８、ＮＣＡＭ−１８０、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ−ＢＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐ１５、ｐ２１−ｒａｓ、ｐ５３、ｐ１８５ ＨＥＲ２／ｎｅｕ、パピローマウイルスＥ７、パピローマウイルスＥ６、ｐｍｉ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＲＡＢ３８、ＲＢＡＦ６００、ＳＡＧＥ、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ｓｐ１７、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合タンパク質、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡ ９０、ＴＡＧ、ＴＧＦ−β１抗アポトーシス因子、ＴＧＦ−βＲＩＩ、チログロブリン、ＴＲＡＧ−３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、腫瘍タンパク質Ｄ５２、チロシナーゼ、ＷＹ−１、それらの断片、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
共刺激分子を投与することによってＴ細胞を共刺激する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
抗ＣＴＬＡ−４を投与することによってＴ細胞の阻害を妨げる工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
Ｔｒｅｇ枯渇化分子を投与することによってＴｒｅｇを枯渇させる工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
血管新生関連抗原を投与することによって腫瘍内血管の誘導および持続的発達を予防する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
増強剤を投与する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
化学療法、放射線、抗血管新生療法、およびそれらの組合せからなる群から選択される治療を行なう工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与工程が、１日１回の外リンパ注射による前記組成物の投与としてさらに定義される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記初代細胞由来生物製剤が、前記サイトカインＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が内因性抗原をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、有効量の化学的インヒビターと、インドメタシン（ＩＮＤＯ）、イブプロフェン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ＣｏｘＩＩインヒビター、およびそれらの組合せからなる群から選択される非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
ＩＬ−１が６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−２が６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−８が６０００〜６００，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度で存在し、かつＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
ナイーブＴ細胞の産生を刺激する工程と、未成熟な樹状細胞を成熟させる工程と、得られた成熟樹状細胞による前記ナイーブＴ細胞への前記抗原の提示を可能にする工程とをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
ｔｏｌｌ様受容体非依存的アジュバント、ｔｏｌｌ様受容体依存的アジュバント、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種のアジュバントを投与する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
免疫抑制を逆転させ、癌に対する免疫を獲得する方法であって、
サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む相乗量の初代細胞由来生物製剤と、少なくとも１種の抗原を含む癌ワクチンとを含む組成物を投与する工程と
ナイーブＴ細胞の産生を刺激する工程と
未成熟な樹状細胞を成熟させる工程と
得られた成熟樹状細胞による前記ナイーブＴ細胞への前記抗原の提示を可能にする工程と
を含み、それによって免疫抑制を逆転させ、前記癌に対する免疫を獲得する方法。
【請求項４１】
患者における外因性抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、
サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む初代細胞由来生物製剤のアジュバントと、少なくとも１つの外因性抗原とを投与する工程（ここで、前記外因性抗原は、通常は免疫応答を生じさせない）と
前記患者において免疫応答を生じさせる工程と
を含む方法。
【請求項４２】
患者における免疫応答を増強する方法であって、
サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む初代細胞由来生物製剤を、少なくとも１種のアジュバントと組み合わせて投与する工程と、
前記初代細胞由来生物製剤と前記アジュバントの相乗的な相互作用によって前記患者の前記免疫応答を増強する工程と
を含む方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１種のアジュバントが、ＴＬＲ非依存的アジュバント、ＴＬＲ依存的アジュバント、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＴＬＲ非依存的アジュバントを投与することによって、抗原を送達および濃縮し、抗原を抗原提示細胞にターゲッティングし、かつ抗原および免疫増強物質を共局在させる工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ＴＬＲ依存的アジュバントを投与してＴＬＲを活性化させることによって、前記患者の免疫系を直接刺激する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１つの外因性抗原を投与する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記アジュバントが前記初代細胞由来生物製剤の作用機序とは異なる作用機序を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
免疫系の機能を増大させる方法であって、
サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを含む初代細胞由来生物製剤を、少なくとも１種のアジュバントと組み合わせて投与する工程（ここで、前記アジュバントは、前記初代細胞由来生物製剤の作用機序とは異なる作用機序を有する）と
前記免疫応答の機能を増大させる工程と
を含む方法。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【図２８】

【図２９Ａ】

【図２９Ｂ】

【図２９Ｃ】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３Ａ】

【図３３Ｂ】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【公表番号】特表２０１２−５２６８５３（Ｐ２０１２−５２６８５３Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１０６４（Ｐ２０１２−５１１０６４）
【出願日】平成２２年５月１７日（２０１０．５．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５０６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３２８６７
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５０５４０１６８７）アイ　アール　エックス　セーラピューティクス，　インコーポレイテッド (10)
【Ｆターム（参考）】