一酸化窒素産生促進剤及びその利用
【課題】一酸化窒素産生促進剤を提供すること、また、その一酸化窒素産生促進剤を配合したＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成促進剤、Ｉ型コラーゲン線維束の合成促進用皮膚外用剤、生体機能回復／改善機能改善用皮膚外用剤を提供すること。
【解決手段】一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体に、安全に使用できる一酸化窒素産生促進剤としての機能、その一酸化窒素産生促進作用に起因する正常なコラーゲン形成に必須なＨＳＰ４７の合成促進剤としての機能及びＩ型コラーゲン線維束の合成促進機能、血流を促進するなど一酸化窒素産生促進能に起因する生体機能回復／改善機能を見出し、本発明を完成するに至った。
【解決手段】一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体に、安全に使用できる一酸化窒素産生促進剤としての機能、その一酸化窒素産生促進作用に起因する正常なコラーゲン形成に必須なＨＳＰ４７の合成促進剤としての機能及びＩ型コラーゲン線維束の合成促進機能、血流を促進するなど一酸化窒素産生促進能に起因する生体機能回復／改善機能を見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分として一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体を含有することが特徴の一酸化窒素産生促進剤に関する事であり、更には、この一酸化窒素産生促進剤を含有することを特徴とするＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成促進剤及びＩ型コラーゲン線維束の合成促進用皮膚外用剤、血流を促進するなど一酸化窒素産生促進能に起因する生体機能回復／改善機能作用皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素は、大気汚染の原因である窒素酸化物の一つとして、環境に悪影響を及ぼす物質として扱われてきたが、いまや一酸化窒素は、生理活性物質としての重要さが認識され、医学、生物学、生化学、薬学、化学など広い分野で研究されている。一酸化窒素は、当初、血管内皮細胞、一部の神経細胞、マクロファージといった特定の細胞で産生されると考えられてきたが、一酸化窒素合成酵素は体内の多くの細胞にあることが明らかになり、その作用も、細胞内のグアニル酸シクラーゼを活性化してサイクリックＧＭＰを産生するだけでなく、一酸化窒素自身が酵素やイオンチャネルに作用したり、活性酸素と反応して強力な酸化物質であるペルオキシナイトライトとなって作用したりと、多様であることが明らかとなってきた。つまり一酸化窒素は、生体機能の維持・調節に深く関係しており、生物にとって不可欠な物質であると言え、その主な機能は生体に対する種々の保護的作用であると考えられる。
【０００３】
過剰な一酸化窒素の存在は、組織の炎症や障害を引き起こしたり、過度のメラニン産生を惹起する作用が報告されていることから（非特許文献１、２）、従来は産生阻害剤の検討がなされてきた。しかしながら、上述のように一酸化窒素は、生体維持には必須なガス分子であるにもかかわらず、生体機能を回復・改善する目的でその産生量を促進する検討はほとんどなされてこなかった。一酸化窒素は、多岐にわたる作用の一つとして顕著な血管拡張作用を有することから、その産生促進剤は、既にインポテンツの改善薬としてＦＤＡ（Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ＝米国食品・医薬品認可局）により販売認可されており、また、化粧品では肌色改善の化粧料組成物として応用されている（特許文献１）。近年の研究では、一酸化窒素は、表皮細胞や線維芽細胞などの皮膚の細胞においても発生し、正常なＩ型コラーゲン線維束の合成に必須なＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の発現も促進することが明らかになっている。
【０００４】
一方、一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体は、医薬分野においては循環系機能障害予防改善剤、白内障治療薬、抗腫瘍剤として利用されてきただけでなく、食品分野においては酸化防止剤として、また、化粧品分野においては酸化防止剤や抗炎症剤として、さらに、皮膚老化防止剤、美白剤として利用されてきた（特許文献２〜８）。しかしながら、一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体が、一酸化窒素産生促進能をもつこと、そして一酸化窒素の産生を促進することで正常なコラーゲン形成に必須なＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成を促進してＩ型コラーゲン線維束の合成を促進すること、さらに、一酸化窒素産生促進能に起因する生体機能回復／改善機能をもつことは知られていない。
【非特許文献１】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００２年３月、第１巻、第１号、ｐ５３−６３
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年２月、第５０巻、第２号、ｐ１２５−１３３
【特許文献１】特開２００２−２２０３３５
【特許文献２】公開昭６１−２６３９６９号公報
【特許文献３】特開昭６３−３０１８１８号公報
【特許文献４】特開平０２−２３５８１３号公報
【特許文献５】特開昭６０−１３０５８２号公報
【特許文献６】特開平０１−２２８９７７号公報
【特許文献７】特開平０２−２０９８０７号公報
【特許文献８】特開昭６２−２２６９１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一酸化窒素は血流を改善するほか、正常なコラーゲン形成に必須なＨＳＰ４７の合成を促進するなど、皮膚の恒常性を維持する上で良好な効果が期待できる。従って、本発明者等は、適度の一酸化窒素を産生することは重要であると考え、皮膚に対して刺激が少ない一酸化窒素産生促進剤を開発することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、皮膚に対して刺激が少ない一酸化窒素産生促進剤を提供すべく鋭意研究した結果、一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体に、安全に使用できる一酸化窒素産生促進剤としての機能、その一酸化窒素産生促進作用に起因する正常なコラーゲン形成に必須なＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成促進剤としての機能、Ｉ型コラーゲン線維束の合成促進機能、血流を促進するなど一酸化窒素産生促進能に起因する生体機能回復／改善機能を見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００７】
一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体を用いた、線維芽細胞の一酸化窒素合成に対する促進作用試験、線維芽細胞のＨＳＰ４７合成に対する促進作用試験、線維芽細胞のコラーゲン合成に対する促進作用試験を実施したところ、いずれもその効果が顕著であった。これらのＬ−アスコルビン酸誘導体を皮膚外用剤に配合することで、血流を促進するなどの生体機能回復／改善機能作用や、Ｉ型コラーゲン線維束の合成促進用など皮膚の恒常性を維持する上で良好な効果が期待できる低刺激の皮膚外用剤を可能ならしめるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体は公知の化合物であって、例えば、特開昭５８−１３１９７８号公報に記載の製造方法等により製造することができる。
【０００９】
本発明に用いる一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体の製造法のうち、例えば、３−Ｏ−置換アスコルビン酸誘導体の製造としては、アスコルビン酸または５，６−位を保護した５，６−イソプロピリデンアスコルビン酸をジメチルスルホキシド中で炭酸水素ナトリウム等のアルカリ存在下にアルキルハライドまたはアルキルメシラートによりアルキル化することで３−Ｏ−置換アスコルビン酸誘導体を製造できるが、特に合成法を制限する必要はない。
【００１０】
本発明の一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体の構成アルキル基又はアルケニル基は、特定はしないが、炭素数１〜２２の直鎖又は分岐のアルキル基、アルケニル基などが挙げられる。炭素数１〜２２の直鎖又は分岐のアルキル基、アルケニル基の具体例としては、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−デシル、イソデシル、ラウリル、ブチルオクチル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ヘキシルデシル、ｎ−オクタデシル、イソオクタデシル、ｎ−イコシル、オクチルドデシル、ｎ−ドコシルなどが挙げられるが、皮膚や細胞に対する親和性などを考慮すると、炭素数８〜２２の直鎖又は分岐のアルキル基、アルケニル基が好ましく、さらに炭素数１６以上のｎ−ヘキサデシル、ヘキシルデシル、ｎ−オクタデシル、オクチルドデシル、ｎ−ドコシルなどの直鎖又は分岐のアルキル基が好ましい。
【００１１】
本発明の一般式１（化１）に示すＬ−アスコルビン酸誘導体は、いずれも後で証明するように、一酸化窒素産生促進剤、線維芽細胞のＨＳＰ４７合成に対する促進剤、線維芽細胞のコラーゲン合成促進剤として有用である。
【００１２】
本発明の一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体は、いずれも皮膚外用剤に配合することで、一酸化窒素産生促進作用、線維芽細胞のＨＳＰ４７合成に対する促進作用、線維芽細胞のコラーゲン合成促進作用、血流を促進するなどの生体機能回復／改善機能作用など、一酸化窒素産生促進作用に起因する機能をもつ低刺激性皮膚外用剤などを調製することができる。
【００１３】
本発明の一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体を皮膚外用剤に配合して使用する場合のＬ−アスコルビン酸誘導体の配合量は特に限定されるものではないが、一般的には、皮膚外用剤中０．０００１質量％から３０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１質量％から２０質量％である。
【００１４】
本発明の一酸化窒素産生促進剤、ＨＳＰ４７の合成促進剤、Ｉ型コラーゲン線維束の合成促進用皮膚外用剤、及び、生体機能回復／改善機能改善用皮膚外用剤は、一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体を必須成分とするものであるが、本発明の一酸化窒素産生促進剤を皮膚外用剤に使用する場合、例えば、その皮膚外用剤には、油脂類、エステル類、炭化水素類、ロウ類、シリコーン系の油相成分、脂肪酸類、低級アルコール類、高級アルコール類、多価アルコール類、界面活性剤、水溶性高分子類、香料、水、各種溶媒等と併用することができ、さらに、老化防止剤、保湿剤、育毛剤、発毛剤、経皮吸収促進剤、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、抗炎症剤、その他生理活性成分、防腐防カビ剤等を配合することができる。
【００１５】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体の製造例：３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造
アスコルビン酸１０．０ｇをジメチルスルホキシド６０ｍＬに溶解させ、炭酸水素ナトリウム６．７ｇ、１−ブロモヘキサデカン６．９ｇを加え６０℃で１５時間撹拌した。冷後水を加え希塩酸でｐＨ４とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水洗後、硫酸ナトリウムで脱水、これを減圧下に脱水した。得られた残渣を酢酸エチルで再結晶することにより３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸２．７ｇを得た。
【実施例２】
【００１７】
１．真皮線維芽細胞の一酸化窒素産生促進作用評価
１−１．方法
正常ヒト真皮線維芽細胞を、０．５％牛胎児血清含有ダルベッコ型変法ＭＥＭ培地を用いてコンフルエントな細胞密度にて培養した。この培地で２４時間培養した後に、３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸（本発明品）を添加し、さらに２４時間培養した。その後の培養上清中の一酸化窒素を測定することにより、一酸化窒素の産生量を求めた。一酸化窒素はＮＯ２−とＤＡＮ（２，３−Ｄｉａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ)の反応を利用して、試料中のＮＯを蛍光法で間接的に測定するキット（同仁化学）を用いて測定した。培養細胞の総蛋白質量をＢＣＡ法により測定して単位蛋白質量当たりの一酸化窒素生成量を（ｎｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）で表した。なお、比較品として、リン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムについても同様に試験をおこなった。
１−２．結果
３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸を培地に添加した細胞では、リン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムと比較して一酸化窒素の産生量は顕著に増加した（表１）。
【表１】
【００１８】
２．真皮線維芽細胞のＨＳＰ４７産生促進作用評価
２−１．方法
正常ヒト真皮線維芽細胞を、０．５％牛胎児血清含有ダルベッコ型変法ＭＥＭ培地を用いてコンフルエントな細胞密度にて培養した。２４時間培養した後に、３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸（本発明品）を添加し、さらに２４時間培養した。その後の細胞内のＨＳＰ４７蛋白量をｉｎ ｓｉｔｕ ＥＬＩＳＡ及びｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによりそれぞれ評価した。
２−２．結果
３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸を培地に添加した細胞では、ＨＳＰ４７蛋白量が顕著に増加した（表２、３）。
【表２】
【表３】
【００１９】
３．真皮線維芽細胞のコラーゲン合成促進作用評価
３−１．方法
正常ヒト真皮線維芽細胞を、０．５％牛胎児血清含有ダルベッコ型変法ＭＥＭ培地を用いてコンフルエントな細胞密度にて培養した。２４時間培養した後に、３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸（本発明品）を添加し、さらに２４時間培養した。その後の培養上清中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により定量することにより、Ｉ型コラーゲンの産生量を求めた。培養細胞の総蛋白質量をＢＣＡ法により測定して単位蛋白質量当たりのI型コラーゲン産生量をｎｇ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎで表した。
３−２．結果
３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸を培地に添加した細胞では、I型コラーゲンの産生量が顕著に増加した（表４）。
【表４】
【００２０】
以下に、本発明に係る一酸化窒素産生促進剤を配合した皮膚外用剤の応用例を挙げる。配合量は質量％を表す。実施例３〜８で得られた応用品はいずれも、一酸化窒素産生促進作用、一酸化窒素産生促進能に起因するＨＳＰ４７の合成促進作用剤、Ｉ型コラーゲン線維束の合成促進作用、及び、血流を促進するなどの生体機能回復／改善機能作用が認められた。また、実施例３〜８で得られた応用品はいずれも皮膚に対して刺激が少なかった。
【実施例３】
【００２１】
乳液
（Ａ相）
３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸 １．０％
モノミリスチン酸デカグリセリル ２．０％
精製水素添加大豆リン脂質 ０．５％
ステアリン酸 ０．５％
ベヘニルアルコール １．５％
パルミチン酸セチル １．０％
α−オレフィンオリゴマー ６．０％
２−エチルヘキサン酸セチル ６．０％
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル ６．０％
グリセリン ５．０％
防腐剤 適量
（Ｂ相）
防腐剤 適量
精製水 残部
（Ｃ相）
カルボキシビニルポリマー ０．１％
精製水 ９．９％
（Ｄ相）
水酸化ナトリウム ０．０４％
精製水 ４．９６％
（調製方法）
Ａ相、Ｂ相をそれぞれ８０℃に加温、混合する。Ａ相を撹拌しながらＢ相を徐々に添加する。撹拌しながら冷却し、Ｃ相、Ｄ相を順次加え、３５℃で調製を終了する。
【実施例４】
【００２２】
クリーム１
（Ａ相）
３−Ｏ−ドコシル−Ｌ−アスコルビン酸 ０．５％
モノステアリン酸ポリエチレングリコール １．０％
テトラオレイン酸ＰＯＥ（４０）ソルビット ０．５％
ステアリン酸グリセリル ２．０％
ステアリルアルコール ３．０％
セタノール ２．０％
オリーブスクワラン ７．５％
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル ７．５％
メチルポリシロキサン ５．５％
防腐剤 適量
（Ｂ相）
防腐剤 適量
１，３−ブチレングリコール ５．０％
ヒドロキシエチルセルロース ０．２％
精製水 残部
（Ｃ相）
エデト酸二ナトリウム ０．１％
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
精製水 ３．０％
（調製方法）
Ａ相、Ｂ相をそれぞれ加温、溶解する。Ａ相を撹拌しながらＢ相を徐々に添加する。パド攪拌しながら冷却し、４０℃でＣ相を添加する。３５℃で調製を終了する。
【実施例５】
【００２３】
クリーム２
（Ａ相）
２−Ｏ−オクタデシル−Ｌ−アスコルビン酸 ０．２％
モノステアリン酸グリセリル １．０％
モノミリスチン酸デカグリセリル ２．０％
デカオレイン酸デカグリセリル ０．５％
ステアリン酸 ３．０％
ベヘニルアルコール ２．０％
精製水素添加大豆リン脂質 ０．５％
ヘキサメチルテトラコサン ２．０％
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル ５．０％
メチルポリシロキサン ２．０％
グリチルレチン酸ステアリル ０．１％
防腐剤 適量
（Ｂ相）
カルボキシビニルポリマー（２％水溶液） ５．０％
１，３−ブチレングリコール ５．０％
グリセリン ２．０％
防腐剤 適量
精製水 残部
（Ｃ相）
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
精製水 ４．８％
（調製方法）
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相を加熱溶解する。Ｂ相をＡ相に加え、直ちにＣ相も加え撹拌乳化する。攪拌しながら冷却する。
【実施例６】
【００２４】
クリーム３
（Ａ相）
２−Ｏ−イソオクチル−Ｌ−アスコルビン酸 ０．５％
ペンタステアリン酸デカグリセリル １．０％
ステアリン酸 ３．５％
ベヘニルアルコール ２．５％
パルミチン酸セチル ３．０％
ヘキサメチルテトラコサン ８．０％
マカデミアナッツ油 ８．０％
メチルポリシロキサン ０．２％
γ−オリザノール １．０％
防腐剤 適量
（Ｂ相）
１，３−ブチレングリコール ３．０％
グリセリン ３．０％
精製水 残部
（調製方法）
Ａ相を加熱溶解し、５０℃まで冷却する。Ａ相を攪拌しながら、Ｂ相を徐々に添加する。
【実施例７】
【００２５】
皮膚機能改善用クリーム
（Ａ相）
３−Ｏ−オクチルドデシル−Ｌ−アスコルビン酸 １．０％
モノステアリン酸グリセリル ２．０％
ＰＯＥ（８０）硬化ヒマシ油 ３．０％
ステアリン酸 ２．０％
ステアリルアルコール ２．０％
パルミチン酸セチル ２．０％
ヘキサメチルテトラコサン ５．０％
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリトール ５．０％
マカデミアナッツ油 ２．０％
メチルポリシロキサン １．０％
酢酸トコフェロール ０．１％
グリチルリチン酸ジカリウム ０．０５％
防腐剤 適量
（Ｂ相）
３−Ｏ−エチル−Ｌ−アスコルビン酸 １．０％
グリセリン ５．０％
１，３−ブチレングリコール ５．０％
ポリエチレングリコール１５００ １．０％
エデト酸二ナトリウム ０．０５％
防腐剤 適量
精製水 残部
（調製方法）
Ａ相、Ｂ相を加熱溶解する。Ａ相にＢ相を加え攪拌乳化する。
【実施例８】
【００２６】
外用剤（軟膏製剤）
３−Ｏ−オクタデシル−Ｌ−アスコルビン酸 ０．５％
ＰＯＥ（３０）セチルエーテル ２．０％
モノステアリン酸グリセリル １０．０％
流動パラフィン １０．０％
白色ワセリン ５．０％
セタノール ６．０％
プロピレングリコール １０．０％
防腐剤 適量
精製水 残部
（調整方法）
軟膏組成物の製造方法の常法に従い、乳化組成物を調製した。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体が極めて優れた一酸化窒素産生促進剤として利用でき、更には、この一酸化窒素産生促進剤を含有することを特徴とするＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成促進剤及びＩ型コラーゲン線維束の合成促進用皮膚外用剤、血流を促進するなど一酸化窒素産生促進能に起因する生体機能回復／改善機能作用を有する皮膚外用剤など、皮膚の恒常性を維持する上で良好な効果をもつ低刺激の皮膚外用剤を提供ならしめるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分として一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体を含有することが特徴の一酸化窒素産生促進剤に関する事であり、更には、この一酸化窒素産生促進剤を含有することを特徴とするＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成促進剤及びＩ型コラーゲン線維束の合成促進用皮膚外用剤、血流を促進するなど一酸化窒素産生促進能に起因する生体機能回復／改善機能作用皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素は、大気汚染の原因である窒素酸化物の一つとして、環境に悪影響を及ぼす物質として扱われてきたが、いまや一酸化窒素は、生理活性物質としての重要さが認識され、医学、生物学、生化学、薬学、化学など広い分野で研究されている。一酸化窒素は、当初、血管内皮細胞、一部の神経細胞、マクロファージといった特定の細胞で産生されると考えられてきたが、一酸化窒素合成酵素は体内の多くの細胞にあることが明らかになり、その作用も、細胞内のグアニル酸シクラーゼを活性化してサイクリックＧＭＰを産生するだけでなく、一酸化窒素自身が酵素やイオンチャネルに作用したり、活性酸素と反応して強力な酸化物質であるペルオキシナイトライトとなって作用したりと、多様であることが明らかとなってきた。つまり一酸化窒素は、生体機能の維持・調節に深く関係しており、生物にとって不可欠な物質であると言え、その主な機能は生体に対する種々の保護的作用であると考えられる。
【０００３】
過剰な一酸化窒素の存在は、組織の炎症や障害を引き起こしたり、過度のメラニン産生を惹起する作用が報告されていることから（非特許文献１、２）、従来は産生阻害剤の検討がなされてきた。しかしながら、上述のように一酸化窒素は、生体維持には必須なガス分子であるにもかかわらず、生体機能を回復・改善する目的でその産生量を促進する検討はほとんどなされてこなかった。一酸化窒素は、多岐にわたる作用の一つとして顕著な血管拡張作用を有することから、その産生促進剤は、既にインポテンツの改善薬としてＦＤＡ（Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ＝米国食品・医薬品認可局）により販売認可されており、また、化粧品では肌色改善の化粧料組成物として応用されている（特許文献１）。近年の研究では、一酸化窒素は、表皮細胞や線維芽細胞などの皮膚の細胞においても発生し、正常なＩ型コラーゲン線維束の合成に必須なＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の発現も促進することが明らかになっている。
【０００４】
一方、一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体は、医薬分野においては循環系機能障害予防改善剤、白内障治療薬、抗腫瘍剤として利用されてきただけでなく、食品分野においては酸化防止剤として、また、化粧品分野においては酸化防止剤や抗炎症剤として、さらに、皮膚老化防止剤、美白剤として利用されてきた（特許文献２〜８）。しかしながら、一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体が、一酸化窒素産生促進能をもつこと、そして一酸化窒素の産生を促進することで正常なコラーゲン形成に必須なＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成を促進してＩ型コラーゲン線維束の合成を促進すること、さらに、一酸化窒素産生促進能に起因する生体機能回復／改善機能をもつことは知られていない。
【非特許文献１】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００２年３月、第１巻、第１号、ｐ５３−６３
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年２月、第５０巻、第２号、ｐ１２５−１３３
【特許文献１】特開２００２−２２０３３５
【特許文献２】公開昭６１−２６３９６９号公報
【特許文献３】特開昭６３−３０１８１８号公報
【特許文献４】特開平０２−２３５８１３号公報
【特許文献５】特開昭６０−１３０５８２号公報
【特許文献６】特開平０１−２２８９７７号公報
【特許文献７】特開平０２−２０９８０７号公報
【特許文献８】特開昭６２−２２６９１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一酸化窒素は血流を改善するほか、正常なコラーゲン形成に必須なＨＳＰ４７の合成を促進するなど、皮膚の恒常性を維持する上で良好な効果が期待できる。従って、本発明者等は、適度の一酸化窒素を産生することは重要であると考え、皮膚に対して刺激が少ない一酸化窒素産生促進剤を開発することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、皮膚に対して刺激が少ない一酸化窒素産生促進剤を提供すべく鋭意研究した結果、一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体に、安全に使用できる一酸化窒素産生促進剤としての機能、その一酸化窒素産生促進作用に起因する正常なコラーゲン形成に必須なＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成促進剤としての機能、Ｉ型コラーゲン線維束の合成促進機能、血流を促進するなど一酸化窒素産生促進能に起因する生体機能回復／改善機能を見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００７】
一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体を用いた、線維芽細胞の一酸化窒素合成に対する促進作用試験、線維芽細胞のＨＳＰ４７合成に対する促進作用試験、線維芽細胞のコラーゲン合成に対する促進作用試験を実施したところ、いずれもその効果が顕著であった。これらのＬ−アスコルビン酸誘導体を皮膚外用剤に配合することで、血流を促進するなどの生体機能回復／改善機能作用や、Ｉ型コラーゲン線維束の合成促進用など皮膚の恒常性を維持する上で良好な効果が期待できる低刺激の皮膚外用剤を可能ならしめるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体は公知の化合物であって、例えば、特開昭５８−１３１９７８号公報に記載の製造方法等により製造することができる。
【０００９】
本発明に用いる一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体の製造法のうち、例えば、３−Ｏ−置換アスコルビン酸誘導体の製造としては、アスコルビン酸または５，６−位を保護した５，６−イソプロピリデンアスコルビン酸をジメチルスルホキシド中で炭酸水素ナトリウム等のアルカリ存在下にアルキルハライドまたはアルキルメシラートによりアルキル化することで３−Ｏ−置換アスコルビン酸誘導体を製造できるが、特に合成法を制限する必要はない。
【００１０】
本発明の一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体の構成アルキル基又はアルケニル基は、特定はしないが、炭素数１〜２２の直鎖又は分岐のアルキル基、アルケニル基などが挙げられる。炭素数１〜２２の直鎖又は分岐のアルキル基、アルケニル基の具体例としては、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−デシル、イソデシル、ラウリル、ブチルオクチル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ヘキシルデシル、ｎ−オクタデシル、イソオクタデシル、ｎ−イコシル、オクチルドデシル、ｎ−ドコシルなどが挙げられるが、皮膚や細胞に対する親和性などを考慮すると、炭素数８〜２２の直鎖又は分岐のアルキル基、アルケニル基が好ましく、さらに炭素数１６以上のｎ−ヘキサデシル、ヘキシルデシル、ｎ−オクタデシル、オクチルドデシル、ｎ−ドコシルなどの直鎖又は分岐のアルキル基が好ましい。
【００１１】
本発明の一般式１（化１）に示すＬ−アスコルビン酸誘導体は、いずれも後で証明するように、一酸化窒素産生促進剤、線維芽細胞のＨＳＰ４７合成に対する促進剤、線維芽細胞のコラーゲン合成促進剤として有用である。
【００１２】
本発明の一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体は、いずれも皮膚外用剤に配合することで、一酸化窒素産生促進作用、線維芽細胞のＨＳＰ４７合成に対する促進作用、線維芽細胞のコラーゲン合成促進作用、血流を促進するなどの生体機能回復／改善機能作用など、一酸化窒素産生促進作用に起因する機能をもつ低刺激性皮膚外用剤などを調製することができる。
【００１３】
本発明の一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体を皮膚外用剤に配合して使用する場合のＬ−アスコルビン酸誘導体の配合量は特に限定されるものではないが、一般的には、皮膚外用剤中０．０００１質量％から３０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１質量％から２０質量％である。
【００１４】
本発明の一酸化窒素産生促進剤、ＨＳＰ４７の合成促進剤、Ｉ型コラーゲン線維束の合成促進用皮膚外用剤、及び、生体機能回復／改善機能改善用皮膚外用剤は、一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体を必須成分とするものであるが、本発明の一酸化窒素産生促進剤を皮膚外用剤に使用する場合、例えば、その皮膚外用剤には、油脂類、エステル類、炭化水素類、ロウ類、シリコーン系の油相成分、脂肪酸類、低級アルコール類、高級アルコール類、多価アルコール類、界面活性剤、水溶性高分子類、香料、水、各種溶媒等と併用することができ、さらに、老化防止剤、保湿剤、育毛剤、発毛剤、経皮吸収促進剤、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、抗炎症剤、その他生理活性成分、防腐防カビ剤等を配合することができる。
【００１５】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体の製造例：３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造
アスコルビン酸１０．０ｇをジメチルスルホキシド６０ｍＬに溶解させ、炭酸水素ナトリウム６．７ｇ、１−ブロモヘキサデカン６．９ｇを加え６０℃で１５時間撹拌した。冷後水を加え希塩酸でｐＨ４とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水洗後、硫酸ナトリウムで脱水、これを減圧下に脱水した。得られた残渣を酢酸エチルで再結晶することにより３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸２．７ｇを得た。
【実施例２】
【００１７】
１．真皮線維芽細胞の一酸化窒素産生促進作用評価
１−１．方法
正常ヒト真皮線維芽細胞を、０．５％牛胎児血清含有ダルベッコ型変法ＭＥＭ培地を用いてコンフルエントな細胞密度にて培養した。この培地で２４時間培養した後に、３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸（本発明品）を添加し、さらに２４時間培養した。その後の培養上清中の一酸化窒素を測定することにより、一酸化窒素の産生量を求めた。一酸化窒素はＮＯ２−とＤＡＮ（２，３−Ｄｉａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ)の反応を利用して、試料中のＮＯを蛍光法で間接的に測定するキット（同仁化学）を用いて測定した。培養細胞の総蛋白質量をＢＣＡ法により測定して単位蛋白質量当たりの一酸化窒素生成量を（ｎｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）で表した。なお、比較品として、リン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムについても同様に試験をおこなった。
１−２．結果
３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸を培地に添加した細胞では、リン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムと比較して一酸化窒素の産生量は顕著に増加した（表１）。
【表１】
【００１８】
２．真皮線維芽細胞のＨＳＰ４７産生促進作用評価
２−１．方法
正常ヒト真皮線維芽細胞を、０．５％牛胎児血清含有ダルベッコ型変法ＭＥＭ培地を用いてコンフルエントな細胞密度にて培養した。２４時間培養した後に、３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸（本発明品）を添加し、さらに２４時間培養した。その後の細胞内のＨＳＰ４７蛋白量をｉｎ ｓｉｔｕ ＥＬＩＳＡ及びｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによりそれぞれ評価した。
２−２．結果
３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸を培地に添加した細胞では、ＨＳＰ４７蛋白量が顕著に増加した（表２、３）。
【表２】
【表３】
【００１９】
３．真皮線維芽細胞のコラーゲン合成促進作用評価
３−１．方法
正常ヒト真皮線維芽細胞を、０．５％牛胎児血清含有ダルベッコ型変法ＭＥＭ培地を用いてコンフルエントな細胞密度にて培養した。２４時間培養した後に、３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸（本発明品）を添加し、さらに２４時間培養した。その後の培養上清中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により定量することにより、Ｉ型コラーゲンの産生量を求めた。培養細胞の総蛋白質量をＢＣＡ法により測定して単位蛋白質量当たりのI型コラーゲン産生量をｎｇ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎで表した。
３−２．結果
３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸を培地に添加した細胞では、I型コラーゲンの産生量が顕著に増加した（表４）。
【表４】
【００２０】
以下に、本発明に係る一酸化窒素産生促進剤を配合した皮膚外用剤の応用例を挙げる。配合量は質量％を表す。実施例３〜８で得られた応用品はいずれも、一酸化窒素産生促進作用、一酸化窒素産生促進能に起因するＨＳＰ４７の合成促進作用剤、Ｉ型コラーゲン線維束の合成促進作用、及び、血流を促進するなどの生体機能回復／改善機能作用が認められた。また、実施例３〜８で得られた応用品はいずれも皮膚に対して刺激が少なかった。
【実施例３】
【００２１】
乳液
（Ａ相）
３−Ｏ−ヘキサデシル−Ｌ−アスコルビン酸 １．０％
モノミリスチン酸デカグリセリル ２．０％
精製水素添加大豆リン脂質 ０．５％
ステアリン酸 ０．５％
ベヘニルアルコール １．５％
パルミチン酸セチル １．０％
α−オレフィンオリゴマー ６．０％
２−エチルヘキサン酸セチル ６．０％
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル ６．０％
グリセリン ５．０％
防腐剤 適量
（Ｂ相）
防腐剤 適量
精製水 残部
（Ｃ相）
カルボキシビニルポリマー ０．１％
精製水 ９．９％
（Ｄ相）
水酸化ナトリウム ０．０４％
精製水 ４．９６％
（調製方法）
Ａ相、Ｂ相をそれぞれ８０℃に加温、混合する。Ａ相を撹拌しながらＢ相を徐々に添加する。撹拌しながら冷却し、Ｃ相、Ｄ相を順次加え、３５℃で調製を終了する。
【実施例４】
【００２２】
クリーム１
（Ａ相）
３−Ｏ−ドコシル−Ｌ−アスコルビン酸 ０．５％
モノステアリン酸ポリエチレングリコール １．０％
テトラオレイン酸ＰＯＥ（４０）ソルビット ０．５％
ステアリン酸グリセリル ２．０％
ステアリルアルコール ３．０％
セタノール ２．０％
オリーブスクワラン ７．５％
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル ７．５％
メチルポリシロキサン ５．５％
防腐剤 適量
（Ｂ相）
防腐剤 適量
１，３−ブチレングリコール ５．０％
ヒドロキシエチルセルロース ０．２％
精製水 残部
（Ｃ相）
エデト酸二ナトリウム ０．１％
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
精製水 ３．０％
（調製方法）
Ａ相、Ｂ相をそれぞれ加温、溶解する。Ａ相を撹拌しながらＢ相を徐々に添加する。パド攪拌しながら冷却し、４０℃でＣ相を添加する。３５℃で調製を終了する。
【実施例５】
【００２３】
クリーム２
（Ａ相）
２−Ｏ−オクタデシル−Ｌ−アスコルビン酸 ０．２％
モノステアリン酸グリセリル １．０％
モノミリスチン酸デカグリセリル ２．０％
デカオレイン酸デカグリセリル ０．５％
ステアリン酸 ３．０％
ベヘニルアルコール ２．０％
精製水素添加大豆リン脂質 ０．５％
ヘキサメチルテトラコサン ２．０％
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル ５．０％
メチルポリシロキサン ２．０％
グリチルレチン酸ステアリル ０．１％
防腐剤 適量
（Ｂ相）
カルボキシビニルポリマー（２％水溶液） ５．０％
１，３−ブチレングリコール ５．０％
グリセリン ２．０％
防腐剤 適量
精製水 残部
（Ｃ相）
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
精製水 ４．８％
（調製方法）
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相を加熱溶解する。Ｂ相をＡ相に加え、直ちにＣ相も加え撹拌乳化する。攪拌しながら冷却する。
【実施例６】
【００２４】
クリーム３
（Ａ相）
２−Ｏ−イソオクチル−Ｌ−アスコルビン酸 ０．５％
ペンタステアリン酸デカグリセリル １．０％
ステアリン酸 ３．５％
ベヘニルアルコール ２．５％
パルミチン酸セチル ３．０％
ヘキサメチルテトラコサン ８．０％
マカデミアナッツ油 ８．０％
メチルポリシロキサン ０．２％
γ−オリザノール １．０％
防腐剤 適量
（Ｂ相）
１，３−ブチレングリコール ３．０％
グリセリン ３．０％
精製水 残部
（調製方法）
Ａ相を加熱溶解し、５０℃まで冷却する。Ａ相を攪拌しながら、Ｂ相を徐々に添加する。
【実施例７】
【００２５】
皮膚機能改善用クリーム
（Ａ相）
３−Ｏ−オクチルドデシル−Ｌ−アスコルビン酸 １．０％
モノステアリン酸グリセリル ２．０％
ＰＯＥ（８０）硬化ヒマシ油 ３．０％
ステアリン酸 ２．０％
ステアリルアルコール ２．０％
パルミチン酸セチル ２．０％
ヘキサメチルテトラコサン ５．０％
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリトール ５．０％
マカデミアナッツ油 ２．０％
メチルポリシロキサン １．０％
酢酸トコフェロール ０．１％
グリチルリチン酸ジカリウム ０．０５％
防腐剤 適量
（Ｂ相）
３−Ｏ−エチル−Ｌ−アスコルビン酸 １．０％
グリセリン ５．０％
１，３−ブチレングリコール ５．０％
ポリエチレングリコール１５００ １．０％
エデト酸二ナトリウム ０．０５％
防腐剤 適量
精製水 残部
（調製方法）
Ａ相、Ｂ相を加熱溶解する。Ａ相にＢ相を加え攪拌乳化する。
【実施例８】
【００２６】
外用剤（軟膏製剤）
３−Ｏ−オクタデシル−Ｌ−アスコルビン酸 ０．５％
ＰＯＥ（３０）セチルエーテル ２．０％
モノステアリン酸グリセリル １０．０％
流動パラフィン １０．０％
白色ワセリン ５．０％
セタノール ６．０％
プロピレングリコール １０．０％
防腐剤 適量
精製水 残部
（調整方法）
軟膏組成物の製造方法の常法に従い、乳化組成物を調製した。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
一般式１（化１）で示されるＬ−アスコルビン酸誘導体が極めて優れた一酸化窒素産生促進剤として利用でき、更には、この一酸化窒素産生促進剤を含有することを特徴とするＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成促進剤及びＩ型コラーゲン線維束の合成促進用皮膚外用剤、血流を促進するなど一酸化窒素産生促進能に起因する生体機能回復／改善機能作用を有する皮膚外用剤など、皮膚の恒常性を維持する上で良好な効果をもつ低刺激の皮膚外用剤を提供ならしめるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１（化１）から選ばれた１種以上のＬ−アスコルビン酸誘導体からなる一酸化窒素産生促進剤。
【化１】
Ｒ１、Ｒ２は、水素、炭素数１〜２２の直鎖又は分岐のアルキル基、アルケニル基を示す。（Ｒ１及びＲ２の両方が水素を除く）
【請求項２】
前記Ｌ−アスコルビン酸誘導体の化１に示すＲ１、Ｒ２が水素、炭素数８〜２２の直鎖又は分岐のアルキル基、アルケニル基であることを特徴とする請求項１に記載の一酸化窒素産生促進剤。（Ｒ１及びＲ２の両方が水素を除く）
【請求項３】
前記Ｌ−アスコルビン酸誘導体の化１に示すＲ１、Ｒ２のいずれかが水素で、もう一方が、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−デシル、イソデシル、ラウリル、ブチルオクチル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ヘキシルデシル、ｎ−オクタデシル、イソオクタデシル、ｎ−イコシル、オクチルドデシル又はｎ−ドコシルであることを特徴とする請求項１又は２に記載の一酸化窒素産生促進剤。（Ｒ１及びＲ２の両方が水素を除く）
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の一酸化窒素産生促進剤を含むことを特徴とするＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の一酸化窒素産生促進剤を含むことを特徴とするＩ型コラーゲン線維束の合成促進用皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の一酸化窒素産生促進剤を含むことを特徴とする生体機能回復／改善機能改善用皮膚外用剤。
【請求項１】
下記一般式１（化１）から選ばれた１種以上のＬ−アスコルビン酸誘導体からなる一酸化窒素産生促進剤。
【化１】
Ｒ１、Ｒ２は、水素、炭素数１〜２２の直鎖又は分岐のアルキル基、アルケニル基を示す。（Ｒ１及びＲ２の両方が水素を除く）
【請求項２】
前記Ｌ−アスコルビン酸誘導体の化１に示すＲ１、Ｒ２が水素、炭素数８〜２２の直鎖又は分岐のアルキル基、アルケニル基であることを特徴とする請求項１に記載の一酸化窒素産生促進剤。（Ｒ１及びＲ２の両方が水素を除く）
【請求項３】
前記Ｌ−アスコルビン酸誘導体の化１に示すＲ１、Ｒ２のいずれかが水素で、もう一方が、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−デシル、イソデシル、ラウリル、ブチルオクチル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ヘキシルデシル、ｎ−オクタデシル、イソオクタデシル、ｎ−イコシル、オクチルドデシル又はｎ−ドコシルであることを特徴とする請求項１又は２に記載の一酸化窒素産生促進剤。（Ｒ１及びＲ２の両方が水素を除く）
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の一酸化窒素産生促進剤を含むことを特徴とするＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７（ＨＳＰ４７）の合成促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の一酸化窒素産生促進剤を含むことを特徴とするＩ型コラーゲン線維束の合成促進用皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の一酸化窒素産生促進剤を含むことを特徴とする生体機能回復／改善機能改善用皮膚外用剤。
【公開番号】特開２００８−９４７７４（Ｐ２００８−９４７７４Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７９６５７（Ｐ２００６−２７９６５７）
【出願日】平成１８年１０月１３日（２００６．１０．１３）
【出願人】（０００２２６４３７）日光ケミカルズ株式会社 (60)
【出願人】（０００２２８７２９）日本サーファクタント工業株式会社 (44)
【出願人】（３０１０６８１１４）株式会社コスモステクニカルセンター (57)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１３日（２００６．１０．１３）
【出願人】（０００２２６４３７）日光ケミカルズ株式会社 (60)
【出願人】（０００２２８７２９）日本サーファクタント工業株式会社 (44)
【出願人】（３０１０６８１１４）株式会社コスモステクニカルセンター (57)
【Ｆターム（参考）】
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