多光子励起測定装置
【課題】化学成分の識別を可能とする多光子励起測定装置を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の多光子励起測定装置は、高輝度の光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、波長の異なる複数の光パルスを出射する多波長光源と、前記多波長光源にて発生した前記波長の異なる複数の光パルスの光路を前記試料内で重ねて、重なった位置を試料内で走査する走査光学系と、前記光パルスの照射により前記試料から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器と、を有することを特徴とする。
【解決手段】本発明の多光子励起測定装置は、高輝度の光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、波長の異なる複数の光パルスを出射する多波長光源と、前記多波長光源にて発生した前記波長の異なる複数の光パルスの光路を前記試料内で重ねて、重なった位置を試料内で走査する走査光学系と、前記光パルスの照射により前記試料から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器と、を有することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピーク光強度の高い超短パルス光を試料に照射して、多光子吸収現象を用いて試料を測定する多光子励起測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡で蛍光観察を行う手段として、特許文献１に示すように特定のある波長の超短パルス光による多光子励起を利用した蛍光観察法が知られている。
【０００３】
多光子励起では、吸収波長のほぼ整数倍の波長を持つ光線を同時に蛍光体に照射することにより、本来の吸収波長と同等な励起現象が引き起こされる。多光子励起で用いられる励起光は一般に赤外光であり、紫外光や可視光の励起現象を計測する目的で用いられる。
【０００４】
一般に波長が長い光のほうが散乱しにくいという性質（レイリー散乱）を持つため、生体試料のような散乱性試料では、多光子励起を利用した方が試料のより深くまで光を入射させることが出来る。このことは、通常の可視光では観察することができなかった生体の深部まで観察することが可能になることを意味する。しかも、赤外光は紫外光や可視光よりも光毒性が低いので、生体試料をできる限り傷つけないで形態観察することができる。
【０００５】
例えばセロトニンという脳内物質は、紫外線領域に吸収波長を持つ自家蛍光特性を有する。しかしながら、紫外光は脳内の深部にまで到達することができず、また光毒性も強い。このような状況下で多光子励起レーザー走査型顕微鏡は有効に働く。紫外光と赤外光は波長が３倍程度離れているので、３光子励起を行えば赤外光を使ってセロトニンを励起できる。
【０００６】
以上のように多光子励起を利用した蛍光観察は大きなメリットを持っており、現在の形態観察において非常に有効な手段となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−００８９８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡は、ある特定の波長の光のみを用いた単一波長による多光子励起を応用したものである。そのため、いくつかの分子の吸収帯の波長領域が重複してしまうと、試料の化学成分の同定（機能観察）までは不可能である。
【０００９】
そこで本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、より多くの化学成分の識別を可能とする多光子励起測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の多光子励起測定装置は、高輝度の光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、波長の異なる複数の光パルスを出射する多波長光源と、多波長光源にて発生した波長の異なる複数の光パルスの光路を試料内で重ねて、重なった位置を試料内で走査する走査光学系と、光パルスの照射により試料から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の顕微鏡によれば、複数の波長の光による分子の吸収像、あるいは蛍光像を観察することにより、より多くの分子の区別が可能となる効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の第１、及び、第２の実施形態に係る多光子励起測定装置の要部の構成を示す図
【図２】図１に示した多波長光源の一例の要部構成を示す図
【図３】本発明の第１、及び、第２の実施形態に係る別の多光子励起測定装置の要部の構成を示す図
【図４】本発明の第３の実施形態に係る多光子励起測定装置の要部の構成を示す図
【図５】本発明の第３の実施形態に係る多光子励起測定装置の要部の構成を示す図
【図６】多波長光源から発生する複数の光パルスのスペクトル分布を示す図
【図７】本発明の第４の実施形態に係る多光子励起測定装置の要部の構成を示す図
【図８】図７に示した円筒ビーム形成器の要部の構成を示す図
【図９】図７に示した多波長光源の一例の要部構成を示す図
【図１０】図７に示した多波長励起測定装置内の面Ｃにおける光プロファイルを示す図
【図１１】蒸留水の透過スペクトルを示す図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００１４】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における多光子励起測定装置の概略構成を示す図である。この多光子励起測定装置１００は複数の波長の光を出射する多波長光源１０１と、レーザー走査光学ユニット１０２と、光ファイバ１０３とを有する。多波長光源１０１から発振した光パルスは、光ファイバ１０３を通してレーザー走査光学ユニット１０２に入射され、、試料１０４に集光する。ここで、光ファイバ１０３は、光ファイバコネクタ１０５、１０６によって、それぞれ多波長光源１０１、レーザー走査光学ユニット１０２と接続される。
【００１５】
試料１０４は、例えばシトクロムＣ（タンパク質）が生細胞内に存在するミトコンドリアであり、試料１０４に集光された光パルスは、シトクロムＣでの多光子吸収により強い共鳴ラマン散乱を示す。
【００１６】
図２は、図１に示した多波長光源１０１の一例の部分構成を示す図である。この多波長光源１０１は、パルスジェネレータ２０１、２０２、半導体レーザー２０３、２０４、ファイバ増幅器２０５、２０６、パルス幅圧縮機２０７、２０８、反射ミラー２０９、ダイクロイックプリズム２１０、及び光ファイバコネクタ１０５を有する。パルスジェネレータ２０１、２０２は、共に数ｎｓ以下の電気パルスを発生し、この電気パルスにより、それぞれ半導体レーザー２０３、２０４に電流を注入する。
【００１７】
半導体レーザー２０３、２０４は、パルスジェネレータ２０１、２０２からの電気パルスにより注入される電流によって、利得が瞬間的に発生又は消滅する、いわゆるゲインスイッチ動作をする。これにより半導体レーザー２０３、２０５は、短波長から長波長へと時間的にチャープした数十ピコ秒幅の光パルスを発生する。半導体レーザー２０３、２０４は、例えば、面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）、量子井戸分布帰還型レーザーダイオード（ＱＷＤＦＢＬＤ）、量子ドット分布帰還型レーザーダイオード（ＱＤＤＦＢＬＤ）などが使用可能であるが、本実施の形態ではＶＣＳＥＬを使用する。また、光パルスの波長は、試料１０４の多光子吸収により共鳴ラマン散乱光が発生する波長であればよい。例えば、可視から近赤外光、赤外光が使用可能であるが、ここでは、半導体レーザー２０３から１０６４ｎｍ帯、半導体レーザー２０４から１１００ｎｍ帯の近赤外光が発振することとする。
【００１８】
半導体レーザー２０３，２０４から発生した光パルスは、ファイバ増幅器２０５，２０６にて増幅する。ファイバ増幅器２０５，２０６は、ファイバレーザーまたは、半導体レーザーで励起され、被励起媒質として、Ｎｄ，Ｙｂ，Ｔｍ，Ｅｒなどをドープしたシングルクラッド、または、ダブルクラッドの光ファイバ、あるいは、断面に空隙がある光ファイバを用いる。ここで、被励起媒質としてＹｂがドープされたシングルクラッド光ファイバを用いる。
【００１９】
ファイバ増幅器２０５，２０６によって、半導体レーザー２０３，２０４にて発振した光パルスは平均出力が数十ｍＷから数Ｗの光パルスに増幅する。
【００２０】
増幅後の１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯の二つの光パルスは、例えば、１１００ｎｍ帯の光パルスを反射ミラー２０９で、１０６４ｎｍ帯の光パルスに光路が直行する用に反射させる。そして、二つの光パルスの光路が直行する部分に設置した、１０６４ｎｍ帯の光を透過し、１１００ｎｍ帯の光を反射するダイクロイックプリズム２１０を用いて、２つの光パルスの光路を同一伝搬路に合成する。合成された光パルスは、光ファイバコネクタ１０５を経て多波長光源１０１から出射する。
【００２１】
光ファイバコネクタ１０５は、ＳＣ型、ＦＣ型、ＳＴ型、ＭＵ型、ＬＣ型の各種コネクタが使用可能であるが、本実施の形態では、ＦＣ型を用いる。
【００２２】
多波長光源１０１より出射した光パルスは、図１に示すように光ファイバ１０３を伝搬し、光ファイバコネクタ１０６を介して、レーザー走査光学ユニット１０２に入射する。ここで、光ファイバコネクタ１０６も光ファイバコネクタ１０５と同様にＦＣ型を用いる。
【００２３】
レーザー走査光学ユニット１０２内に入射した光パルスは、自由空間に出射され、二次元走査ミラー１０７に入射する。ここで、走査ミラーは、光パルスの走査方向を変化させ、光の伝播角度が操作される。二次元走査ミラー１０７は、例えば、互いに直行する２本の軸周りに揺動可能な２枚のガル場のミラーで構成される。
【００２４】
二次元走査ミラー１０７を経た光パルスは、瞳投影レンズ１０８により集光されて中間像として結像された後、結像レンズ１０９により平行光とされ、ダイクロイックミラー１１０と透過して、対物レンズ１１１により試料１０４に集光される。これにより、試料１０４に含まれるシトクロムＣが多光子励起されて、ラマン散乱光が発せられる。試料１０４から発せられた光は、対物レンズ１１１を経て、特定波長帯の光（波長帯は、試料１０４に集光される光パルスとの波長とは異なる）を反射するダイクロイックミラー１１０に入射する。この光は試料１０４に集光させる光パルスの波長と異なるため、ダイクロイックミラー１１０で反射され、集光レンズ１１２により検出器１１３に集光されて、電気信号に変換される。
【００２５】
また、検出器１１３は回折光学素子やプリズムなどの波長分離手段を備えた、いわゆる分光光度計であることがより望ましい。これにより、シトクロムＣの分布画像がより正確に得られる。
【００２６】
光パルスの集光位置は、二次元走査ミラー１０７によって、試料１０４内をＸＹ方向に走査される。ここで、光パルスの試料１０４上での集光位置の座標と、検出器１１３により検出された電気信号とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子励起ラマン散乱画像を得ることができる。例えば、二次元走査ミラーをMEMSで構成する場合は、MEMSに設けられたそれぞれの電極へ印加した電圧量から、二次元走査ミラーの角度や光の走査角度（もしくは試料１０４での集光位置の座標）を算出することができる。
【００２７】
また、集光位置をＺ方向に変化させる手段を備えることが、より望ましく、例えば、対物レンズ１１１をＰＺＴやＫＴＮを用いた可変焦点レンズとすることで３次元的な多光子励起ラマン散乱画像を高速に取得することが可能となる。
【００２８】
本発明では、既述のように、１０６４ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の光パルスを試料１０４入射させる。これにより、それぞれ２光子励起によって、５３２ｎｍ帯と５５０ｎｍ帯の可視光による励起と同様の効果を与えることとなる。
【００２９】
ここで、酸化型タンパク質と還元型タンパク質は、ラマン散乱の波長依存特性が異なっている。例えば、酸化型タンパク質は入射波長が増大するにつれて増加する特性を示し、還元型タンパク質は入射波長が増大するにつれて減少する特性を示す。増加、及び減少の特性は上述のものに限られず、逆になっていても良いが、いずれにせよ酸化型タンパク質と還元型タンパク質は、５３２ｎｍ帯の光励起によるラマン散乱と、５５０ｎｍ帯の光励起によるラマン散乱スペクトルが異なり、また、ラマン散乱量と波長の関係式は異なる式で表される。なお、物質のスペクトル特性を示す式は物質に応じて予め決定されている。
【００３０】
ここで、５３２nm帯のラマン散乱量と、５５０ｎｍ帯のラマン散乱量には、それぞれ酸化型タンパク質のラマン散乱と還元型タンパク質のラマン散乱量が含まれている。この５３２nm帯のラマン散乱量と５５０ｎｍ帯のラマン散乱量の値、及び酸化型タンパク質と還元型タンパク質のラマン散乱特性の波長依存性（ラマン散乱スペクトルの関係式）を用いて、酸化型タンパク質及び還元型タンパク質の、５３２ｎｍ帯及び５５０ｎｍ帯のラマン散乱量をそれぞれ算出することができる。これにより、異なる物質のラマン散乱スペクトルの波長領域が重複している場合にも、各波長帯における特定物質のラマン散乱量を算出することができる。
【００３１】
以上のように、複数波長のラマン散乱光の光量比較により多変量解析による成分分析が可能になる。
【００３２】
また、上述のように試料１０４上での光パルスの集光位置の座標が検出器１１３により検出された電気信号を対応づけて記憶されおり、画像化を行うことで各物質の濃度分布を画像化することができる。
【００３３】
上記構成により、酸化型タンパク質と還元型タンパク質を識別し、それぞれの濃度分布を画像化すること（機能観察）が可能となる。
【００３４】
また、本発明の多光子励起測定装置では、試料の観察部分（光パルス集光位置）以外の部分に対して低侵襲であり、安価に（共焦点光学系を必要とせず）、光伝搬方向（光軸方向）の解像度を高めることが可能となる。
【００３５】
また、本実施の形態において、１０６４ｎｍ帯の光パルスと１１００ｎｍ帯の光パルスの発振を同期させて、且つ、集光位置を一致させて、試料１０４に照射することで、二つの光の相互作用による多光子吸収現象が引き起こされる。すなわち、和周波である５４１ｎｍ帯の可視光励起によるラマン散乱画像を得ることも可能となる。
【００３６】
ここで、和周波は２波長の光パルスの集光点を含むごく限られた領域にのみ発生する。そのため、和周波と同じ周波数を有する単一波長の光パルスを試料１０４に入射した場合と比較すると、和周派が発生する場合の方が、ラマン散乱が発生する領域が限定される。そのため、複数波長の光パルスを入射させて和周波を発生させることで、測定の分解能をより向上させることができる。
【００３７】
このように、波長の異なる二つの光パルスが重なり合うことで引き起こされる２光子吸収、言い換えると、エネルギーが異なる二つの光子が出合って引き起こす２光子吸収を、以降、本明細書では『和光子吸収』とし、それによる励起を『和光子励起』とする。
【００３８】
また、試料内で発生するラマン散乱光は、試料内で偏光方向が回転し、試料入射前の光パルスと異なる偏光成分を含むため、ダイクロイックミラー１１０の代わりに偏光分離ミラーを用いてもよい。ダイクロイックミラーを用いることで、全ての偏光成分のラマン散乱光の出力を求めることが可能となる。その結果、より高精度な機能画像観察が可能となる。一方、偏光分離ミラーを用いる場合は、ミラーの固定角度尤度がより広くなり、対振動性や耐熱性に優れた顕微鏡となる。本発明では、複数の波長の光パルスを試料に照射し、それらのラマン散乱光を計測する必要があり、偏光分離ミラーを用いることによる耐振動性や耐熱性の向上の効果が大きい。
【００３９】
なお、本実施の形態は２光子吸収をベースに説明したが、３光子吸収以上の多光子吸収であってもよい。また、本実施の形態は２つの異なる波長の光を用いて説明したが、多波長光源１０１は３つ以上の波長の光を使用するものであってもよい。
【００４０】
（実施の形態２）
本実施の形態１では、１０３０ｎｍ帯、１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯などの赤外光（光パルス）をミトコンドリア（試料）に照射し、試料内のシトクロムＣによって発生したラマン散乱光を計測する例について示した。しかし、本発明の多光子励起測定装置は、任意の試料（材料）に対して、その試料が異なる光学特性を示す複数の異なる波長の光を照射することで同様の効果を得ることが可能となる。
【００４１】
例えば、本実施の形態では、１４００ｎｍ帯と１８６７ｎｍ帯の波長の光パルスを発振する図２と同様の構成の多波長光源を用い、人体を試料とする図１と同様の構成の多光子励起測定装置について説明する。本実施の形態では、人体内部のヘモグロビン濃度分布（形態画像）と、ヘモグロビンの酸素化の割合（機能画像）の両方を取得することが可能となる。
【００４２】
より詳細には下記に示す。
【００４３】
本実施の形態により、１４００ｎｍ帯と１８６７ｎｍ帯の二つの光の２光子吸収を利用して７００ｎｍ帯と９３３ｎｍ帯の二つの波長の吸光度を求めることが可能となる。また更に、１４００ｎｍ帯と１８６７ｎｍ帯の和光子吸収を利用して８００ｎｍ帯の吸光度を求めることが可能となる。また、波長８００ｎｍ帯の酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の吸光度は等しく、７００ｎｍ帯の吸光度は脱酸素化ヘモグロビンの方が高く、９３３ｎｍ帯の吸光度は酸素化ヘモグロビンの方が高い。このため、少なくとも８００ｎｍ帯の波長の吸光度を求めることで、酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の総和であるヘモグロビンの濃度が求められる。
【００４４】
更に、７００ｎｍ帯、９３３ｎｍ帯のうち、何れかの吸光度を計測し、８００ｎｍ帯の吸光度と比較することで、酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）それぞれの濃度を算出することができる。これにより、ヘモグロビンの酸素化の割合を求めることが可能となる。
【００４５】
例えば、酸素化ヘモグロビンの濃度をｘ、脱酸素化ヘモグロビンの濃度をｙとするとし、酸素化ヘモグロビン、脱酸素化ヘモグロビンの濃度に対する８００ｎｍの光の吸光度の関数をｆとし、脱酸素化ヘモグロビンの濃度に対する７００ｎｍの光の吸光度の関数をｇとし、脱酸素化ヘモグロビンの濃度に対する７００ｎｍの光の吸光度の関数をｈとすると、
ｆ（ｘ+ｙ）＝（８００ｎｍの吸光度）
ｇ（ｘ）+ｈ（ｙ）＝（７００ｎｍの吸光度）
として連立方程式を解くことで、ヘモグロビンの酸素化の割合を求めることが可能になる。
【００４６】
なお、上述の例では８００ｎｍ帯の吸光度を利用したが、７００ｎｍ帯、９３３ｎｍ帯で得られた吸光度量を使用して、酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の各濃度を算出してもよい。また、ヘモグロビン濃度の総和を求める差異に８００ｎｍ帯の吸光度を利用したが、７００ｎｍ帯、９３３ｎｍ帯の吸光度量を利用して得られた酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）のそれぞれの濃度からヘモグロビンの総和を算出しても良い。
【００４７】
本発明では直接７００ｎｍ帯、８００ｎｍ帯、９３３ｎｍ帯の光を生体に照射する場合に比べて、多光子励起現象を用いることで、より生体の透過率が高い長波長の赤外光を用いることが可能であり、生体のより深い部分のヘモグロビン濃度や酸素化の割合を調べることが可能となるため望ましい。
【００４８】
また、本実施の形態では、実施の形態１と同様に、試料に光パルスを照射し、返ってきた光の出力を計測する構成をとってもよいが、試料に入射させる光パルスと試料から返ってきた光の波長は同じであり、ダイクロイックミラー１１０の変わりに偏光分離ミラーを用いることが望ましい。これによって、試料から返ってきた光を検出器１１３に導き、試料内での減衰量（吸光度）が求められる。
【００４９】
また、図３に示すように、レーザー走査光学ユニット１０２からダイクロイックミラー１１０を省いたレーザー走査光学ユニット３０２を用いて、試料１０４に光パルスを照射し、レーザー走査光学ユニット３０２と反対側に検出器３０３を備える多光子励起測定装置３００としてもよい。この構成により、より正確に吸光度を調べることが可能となり、より正確なヘモグロビン濃度分布や酸素化割合を求めることが可能となる（より高精度な機能画像観察が可能となる）ため望ましい。
【００５０】
また、試料１０４と検出器の間には集光レンズ３０１を設置することで、更に測定の精度が向上するため望ましい。
【００５１】
なお、図１の構成では、光の透過率が低い試料や散乱が多い試料においても機能画像観察が可能となる。そのため、観察可能な資料の種類は図３の構成より多くすることができるというメリットを有している。
【００５２】
（実施の形態３）
図４は、本発明の実施の形態３における多光子励起測定装置の概略構成を示す図である。この多光子励起測定装置４００は、図１に示す多光子励起測定装置１００と同様に、多波長光源１０１にて発振した波長の異なる二つの光パルスを、光ファイバ１０３を通してレーザー走査光学ユニットに入射させて、試料１０４（シトクロムＣを生細胞内に含んだミトコンドリア）に照射する構成となる。
【００５３】
ただし、本実施形態に示すレーザー走査光学ユニット４０２では、入射した光パルスは自由空間に出射され、回折格子４０１に入射する。ここで、回折格子４０１は二つの波長の異なる光パルスを、その波長に応じて反射角が異なるように回折するため、例えば、図４の点線と破線で示すように光路が分離される。波長によって光路が分離された二つの波長の光パルスは共に、対物レンズ４０４により試料１０４内に入射する。対物レンズ４０４は、光路が分離された２つの光パルスを試料内で再び重ねあわせるように設計されており、光パルスは試料１０４内で同じ位置に集光される。この対物レンズは、例えば、回折格子から対物レンズまでの距離をａとし、対物レンズと資料内の集光位置までの距離をｂとし、対物レンズの焦点距離をｆとすると、
1／ｆ ＝ 1／ａ + １／ｂ
の関係になるようなｆの対物レンズを選択すればよい。
【００５４】
これにより、試料１０４に含まれるシトクロムＣが多光子励起されて、ラマン散乱光が発せられる。
【００５５】
二つの光パルスが重なる（交わる）位置では、実施の形態１と同様に、それぞれの光パルスの２光子吸収（励起）と共に、二つの波長の異なる光パルスの和光子吸収（励起）現象が発生し、そこで発生するラマン散乱光を検出器１１３にて電気信号に変換する。
【００５６】
本実施の形態では、対物レンズ４０４がＸＹ方向に並進運動することで、二つの波長の異なる光パルスの重なる位置は、試料１０４内をＸＹ方向に走査する。
【００５７】
また、検出器１１３も回折光学素子やプリズムなどの波長分離手段を備えた、いわゆる分光光度計であることがより望ましい。これにより、シトクロムＣの分布画像がより正確に得られる。
【００５８】
光パルスの試料１０４上での交わる位置の座標と、検出器１１３により検出されたラマン散乱光のスペクトルとを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子励起ラマン散乱画像を得ることができる。これにより、ミトコンドリア中におけるシトクロムCの濃度分布を観測することができる。
【００５９】
また、本実施の形態では、回折格子４０１の格子面上に二つの光パルスの焦点が位置するように集光レンズ４０３を備えることが望ましい。
【００６０】
これによって、試料１０４内で二つの光パルスが交わる位置とそれぞれの光パルスの焦点の位置が一致するため、より強い多光子励起現象が発生し、よりノイズの少ないシトクロムＣの濃度分布画像を取得することが可能となる。
【００６１】
本実施の形態では、波長の異なる二つの光パルスの光路が異なるため、交わる部分のみで和光子励起現象が発生する。このため、和光子励起によるラマン散乱スペクトルを計測することによって、散乱スペクトルの観測点を増加させることが出来る。また、和周派の発生領域が集光点付近に限定されるため、和周派を発生させて散乱スペクトルを計測することで、より高分解能のシトクロムＣ濃度分布画像が得られる。
【００６２】
本実施の形態では、実施の形態１と同様に、１０６４ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の光パルスを試料１０４入射させることで、５３２ｎｍ帯、５４１ｎｍ帯、５５０ｎｍ帯の可視光による励起と同様の効果を与えることとなる。１０６４ｎｍ帯の光パルスで励起した場合と、１１００ｎｍ帯の光パルスで励起した場合の、ラマン散乱画像を比較することで、酸化型タンパク質と還元型タンパク質を識別し、それぞれの濃度分布を画像化すること（機能観察）が可能となる。
【００６３】
また、本実施の形態の多光子励起測定装置も、試料の観察部分（光パルス集光位置）以外の部分に対して低侵襲であり、安価に（共焦点光学系を必要とせず）、光伝搬方向（光軸方向）の解像度を高めることが可能となる。
【００６４】
また、本実施の形態では、光ファイバ１０３を通してレーザー走査光学ユニット４０２に入射した光パルスを集光レンズ４０３に通して、２次元走査回折格子４０１の反射面で集光させることが望ましい。
【００６５】
これによって、２次元走査回折格子４０１の反射面をより小さくすることが可能となり、より低コストで、より低消費電力の２次元走査が可能となる。
【００６６】
また、試料１０４内における二つの光パルスがそれぞれの集光位置で重なるため、より高コントラストな機能画像が得られる。
【００６７】
また、対物レンズ４０４の手前の光パルス光路に略垂直な二面（Ａ面、Ｂ面）において、Ａ面とＢ面での二つの光パルスのビーム径の拡大率と、二つの光パルス光路の間隔の拡大率がほぼ一致することが望ましい。なお、ビーム径の拡大率とは、Ｂ面でのビーム径÷Ａ面でのビーム径を意味する。これによって、試料１０４内において、二つの光パルスはそれぞれの集光位置で重なる。つまり、最も光強度が高い位置で和光子吸収（和光子励起）を行うことが可能となり、得られるラマン散乱スペクトルも強くなる。その結果、より高コントラストな機能画像が得られる。
【００６８】
また、本実施の形態は、図５に示す構成を採用しても良い。すなわち、試料１０４内にて発生したラマン散乱光を、試料１０４に入射させた光パルス光路を逆走させて、対物レンズ４０４からレーザー走査光学ユニット内に再び取り込み、回折格子４０１で反射させる。多光子励起測定装置５００は、その後ダイクロイックミラー１１０を用いて試料１０４に入射する前の光パルスと試料１０４で反射した光の光路を分離し、検出器１１３に入射させるレーザー走査光学ユニット５０１を備えたとしてもよい。
【００６９】
図４の構成のほうが、より多くの試料からの光を受光することが可能となり、電気ノイズが少なく、より正確（再現性が高い）シトクロムＣの濃度分布、酸化／還元の割合の画像が得られるため望ましい。しかし、図５の構成では、より正確に分光光度を計測することが可能となり、成分分析の正確性が増すため望ましい。
【００７０】
また、言うまでもなく、本実施の形態の光学構成を実施の形態２と同様に、生体内のヘモグロビンの濃度や酸素化の割合を調べる多光子励起測定装置として用いてもよく、更に、別の試料の機能画像観察や形態画像観察に用いてもよい。
【００７１】
本実施の形態の多光子励起測定装置では、実施の形態１、２に示すように二つの波長の光パルスが同光路の構成に比べて、Ｚ方向の解像度が高くなるため望ましい。また、実施の形態１，２の構成の多光子励起測定装置は、より光学系が単純で安価な構成とすることが可能となるため望ましい。
【００７２】
（実施の形態４）
図７は、本発明の実施の形態４における多光子励起測定装置の概略構成を示す図である。この多光子励起測定装置７００は、多波長光源７０１にて発振した波長の異なる二つの光パルスを、それぞれ別の光ファイバ１０３、７０３を通してレーザー走査光学ユニット７０２に入射させて、試料１０４（シトクロムＣを生細胞内に含んだミトコンドリア）に照射する構成となる。
【００７３】
ここで、光ファイバ１０３は、光ファイバコネクタ１０５、１０６によって、それぞれ多波長光源１０１、レーザー走査光学ユニット７０２と接続される。
【００７４】
試料１０４は、シトクロムＣ（タンパク質）が生細胞内に存在するミトコンドリアであり、試料１０４に集光された光パルスは、シトクロムＣでの多光子吸収により強い共鳴ラマン散乱を示す。
【００７５】
図９は、図７に示した多波長光源７０１の一例の部分構成を示す図である。この多波長光源７０１は、パルスジェネレータ２０１、２０２、半導体レーザー２０３、２０４、ファイバ増幅器２０５、２０６、パルス幅圧縮機２０７、２０８、及び、光ファイバコネクタ１０５、７０５を有する。
【００７６】
パルスジェネレータ２０１、２０２は、共に数ｎｓ以下の電気パルスを発生し、この電気パルスにより、それぞれ半導体レーザー２０３、２０４に電流を注入する。
【００７７】
半導体レーザー２０３、２０４は、パルスジェネレータ２０１、２０２からの電気パルスにより注入される電流によって利得が瞬間的に発生消滅する、いわゆるゲインスイッチ動作し、これにより短波長から長波長へと時間的にチャープした数十ピコ秒幅の光パルスを発生する。半導体レーザー２０３、２０４は、例えば、面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）、量子井戸分布帰還型レーザーダイオード（ＱＷＤＦＢＬＤ）、量子ドット分布帰還型レーザーダイオード（ＱＤＤＦＢＬＤ）などが使用可能であるが、本実施の形態ではＶＣＳＥＬを使用する。また、光パルスの波長は、試料１０４の多光子吸収により共鳴ラマン散乱する波長であればよく、可視から近赤外光、赤外光が使用可能である。ここでは、半導体レーザー２０３から１０６４ｎｍ帯、半導体レーザー２０４から１１００ｎｍ帯の近赤外光が発振することとする。
【００７８】
半導体レーザー２０３，２０４から発生した光パルスは、ファイバ増幅器２０５，２０６にて増幅する。ファイバ増幅器２０５、２０６は、ファイバレーザーまたは、半導体レーザーで励起される。ファイバレーザー中の被励起媒質として、Ｎｄ，Ｙｂ，Ｔｍ，Ｅｒなどをドープしたシングルクラッド、または、ダブルクラッドの光ファイバ、あるいは、断面に空隙がある光ファイバを用いる。ここで、被励起媒質としてＹｂがドープされたシングルクラッド光ファイバを用い、波長９４０ｎｍの半導体レーザーを用いて励起する。
【００７９】
ここで、ファイバ増幅器２０５，２０６によって、半導体レーザー２０３，２０４にて発振した光パルスは平均出力が数十ｍＷから数Ｗの光パルスに増幅する。
【００８０】
増幅後の１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯の二つの光パルスは、それぞれ、光ファイバコネクタ１０５、７０５を経て多波長光源７０１から出射する。
【００８１】
光ファイバコネクタ７０５も、本実施の形態では、ＦＣ型とする。
【００８２】
多波長光源７０１より出射した光パルスは、図７に示すように光ファイバ１０３、７０３を伝搬し、光ファイバコネクタ１０６、７０６を介して、レーザー走査光学ユニット７０２に入射する。ここで、光ファイバコネクタ７０６も光ファイバコネクタ７０５と同様にＦＣ型を用いる。
【００８３】
本実施形態に示すレーザー走査光学ユニット７０２では、入射した２つの光パルスはともに自由空間に放出され、コリメートレンズ７０７，７０８を通して平行光となる。
【００８４】
その後、多波長光源７０１にて発振した波長の異なる二つの光パルスのうち、片方（ここでは１１００ｎｍ帯の光パルスとする）を円筒ビーム形成器７０４に入射する。ここで、円筒ビーム形成器７０４は図８に示すように、向かい合った一対のアキシコレンズ（円錐レンズ）８０１、８０２で構成され、アキシコレンズ８０１の平面側から入射したガウシアンビーム８０３を円筒ビーム８０４に変換する構成となる。
【００８５】
円筒ビーム形成器７０４から出射した１１００ｎｍ帯の光パルスは図７に示すように、反射ミラー２０９とダイクロイックプリズム２１０で反射させて、円筒ビーム形成器７０４に入射させなかった、もう一方の光パルス（１０６４ｎｍ帯の光パルス）と同一伝搬路に重ねあわされる。
【００８６】
光路が一致した二つの波長の異なる光パルスは、二次元走査ミラー１０７に入射する。ここで、伝播角度が走査される。
【００８７】
二次元走査ミラー１０７を経た光パルスは、瞳投影レンズ１０８により集光されて中間像として結像された後、結像レンズ１０９により平行光とされ、対物レンズ１１１により試料１０４に集光される。これにより、試料１０４に含まれるシトクロムＣが多光子励起されて、ラマン散乱光が発せられる。
【００８８】
ここで、対物レンズ１１１直後の面Ｃにおける、光パルスのプロファイル（光強度分布）を図１０に示す。１０６４ｎｍ帯の光パルスのプロファイル１００１は光軸を中心としてガウシアン分布を示す。また、１１００ｎｍ帯の光パルスのプロファイル１００２も同様に光軸を中心とするが、円環状の光強度分布を示す。また、図１０では、１１００ｎｍ帯の光強度のうち、１１００ｎｍ帯の光の最高強度のe＾-2以上の光強度の部分を斜線部で示している。また、１０６４ｎｍ帯の光強度のうち、１０６４ｎｍ帯の光の最高強度のe＾-2以上の光強度の部分を斜線部で示している。
【００８９】
１１００ｎｍ帯の光パルスのプロファイル１００２において、内径ａ、外径ｂは、円筒ビーム形成器７０４におけるアキシコレンズ８０１とアキシコレンズ８０２の間隔を広げることで拡大することが可能である。１１００ｎｍ帯の光パルスのプロファイル１００２における内径ａが１０６４ｎｍ帯の光パルスのビーム径（光強度が最も高い位置の光強度のｅ-２倍の部分と光軸との距離）より大きくなるように二つのアキシコレンズを配置することで、二つの光パルスのプロファイルの重なりを抑制することが可能となる。このように、対物レンズ直後の面Ｃにおける二つの光パルスのプロファイルの重なりを無くすと、１１００ｎｍ帯の光パルスの集光位置以外で、二つの光パルスのプロファイルの重なりが無くなる。ただし、１１００ｎｍ帯の光パルスのプロファイルも集光位置では光軸中真付近にピーク光強度を持つ１ピークのプロファイルとなる。つまり、１１００ｎｍ帯の光パルスと１０６４ｎｍ帯の光パルスは、１１００ｎｍ帯の光パルスの集光位置でのみ重なり合うこととなる。
【００９０】
このため、１１００ｎｍ帯の光パルスの集光位置でのみ、和光子励起によるラマン散乱光が発生する。そのため、測定の分解能を向上させることが可能になる。
【００９１】
この和光子励起によるラマン散乱光は、試料１０４後方の集光レンズ３０１により検出器３０３に集光されて、電気信号に変換される。二次元走査ミラー１０７によって、光パルスの集光位置は試料１０４内をＸＹ方向に走査され、光パルスの試料１０４上での集光位置の座標と、検出器１１３により検出された電気信号とを対応づけて記憶することにより、２次元的な和光子励起ラマン散乱画像を得ることができる。
【００９２】
本発明では、既述のように、１０６４ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の光パルスを試料１０４入射させる。これにより、それぞれ２光子励起によって、５３２ｎｍ帯と５５０ｎｍ帯の可視光による励起と同様の効果を与えることとなる。
【００９３】
酸化型タンパク質と還元型タンパク質は、５３２ｎｍ帯の光励起によるラマン散乱と、５５０ｎｍ帯の光励起によるラマン散乱スペクトルが異なるため、上記構成により、酸化型タンパク質と還元型タンパク質を識別し、それぞれの濃度分布を画像化すること（機能観察）が可能となる。
【００９４】
また、本発明の多光子励起測定装置では、試料の観察部分（光パルス集光位置）以外の部分に対して低侵襲であり、安価に（共焦点光学系を必要とせず）、光伝搬方向（光軸方向）の解像度を高めることが可能となる。
【００９５】
また、実施の形態１と同様に、二つの異なる波長の光が重なり合う集光位置においては、５４１ｎｍ帯の光励起によるラマン散乱スペクトル画像を得ることも可能となる。
【００９６】
また、本実施の形態では、検出器３０３にピンホールを備え、共焦点光学系を採用することにより、１０６４ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の光パルスの集光位置で発生したラマン散乱光のみを計測することが可能となる。
【００９７】
これにより、同位置における、５３２ｎｍ，５４１ｎｍ，５５０ｎｍの三つの波長の光の吸光度を比較することが可能となるため望ましい。
【００９８】
以上、実施の形態１から４では、波長の異なる光を発振する複数のパルス光源を備えた多波長光源の例を示したが、波長可変の一つのパルス光源を備えた多波長光源を用いた場合であっても、複数の波長の多光子吸収率を計測することが可能となる。つまり、形態画像観察だけでなく機能画像観察が可能な多光子励起測定装置となる。
【００９９】
しかし、実施の形態１から４に示したように、本発明の多光子励起測定装置では、複数のパルス光源を備えた多波長光源を用い、波長の異なる複数の光を同時に発振することで、それぞれの２光子吸収、３光子吸収…現象だけでなく、和光子吸収現象を利用することが可能となるためより多くの波長の多光子吸収率を計測することが可能となるため望ましい。
【０１００】
更に、実施の形態３、４に示すように波長の異なる複数の光の光路を変えて、ある一部分でのみ重ならせる構成とすることによって、解像度を高めることも可能となる。
【０１０１】
また、本発明の実施の形態１から４について、Ｚ方向の解像度は実施の形態１、２ ＜ 実施の形態４ ＜ 実施の形態３ であり、光学系部分の価格についても、実施の形態１、２ ＜ 実施の形態４ ＜ 実施の形態３ となるため、用途に応じて適した実施の形態を用いることが望ましい。
【０１０２】
また、実施の形態１から４について、共通して下記のことが言える。
【０１０３】
まず、言うまでもなく多波長光源１０１の代わりに、任意の波長の光パルスを発振する多波長光源を用いることにより、任意の波長励起の光学特性画像を得ることが可能となる。
【０１０４】
例えば、試料がミトコンドリア内のシトクロムＣであって、試料のラマン散乱スペクトルを観察する場合は、図２における半導体レーザー２０１の代わりに１０３０ｎｍ帯の光パルスを発振する半導体レーザーを用いてもよい。試料に１０３０ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の光パルスを照射することが可能となり、１０３０ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯のそれぞれの光パルスの２光子励起と１０３０ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の和光子励起により、５１５ｎｍ帯、５３２ｎｍ帯、５５０ｎｍ帯の三つの波長の可視光励起によるラマン散乱画像を得ることが可能となる。
【０１０５】
シトクロムＣは５１５ｎｍ帯の光パルス励起によるラマン散乱による強いラマンピーク（７５３，１１２７，１３１４，１５８３ｃｍ−１）が観察されるため望ましい。上述の１０６４ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の二つの波長の光パルスを照射する構成に比べて、より正確にシトクロムＣの分布画像観察（形態画像観察）が可能となる。この特徴は、１０４５ｎｍ未満の波長の光パルスと１０４５ｎｍより長波長の光パルスをシトクロムＣに照射するすべての本発明の構成に適用可能となる。
【０１０６】
また、１０８０ｎｍ未満の波長の光パルスと１０８０ｎｍより長波長の光パルスを照射する構成では、シトクロムＣの酸化／還元の比率をより正確に求めることが可能となるため望ましい。
【０１０７】
また、実施の形態１から４では、半導体レーザーとファイバーアンプからなる多波長光源を用いたが、一般的に多光子励起測定装置に用いられるチタンサファイアレーザー光源などを用いてもよい。
【０１０８】
また、ＹｂやＮｄなどの希土類を添加したＹＡＧ、ＹＶＯ４などのレーザー媒質を用いたＱスイッチ短パルス固体レーザーを用いてもよい。
【０１０９】
ただし、半導体レーザーとファイバーアンプからなるパルス光源を用いることによって、より安価に様々な波長の光パルス発振が可能となるため望ましく、より多種類の化学物質の同定が可能となる。
【０１１０】
また、チタンサファイアレーザー光源や、Ｑスイッチ短パルス固体レーザーを用いることによって、より高ピークの光パルスを試料に照射することが可能となるため、化学物質の濃度計測精度が向上するため望ましい。
【０１１１】
また、試料が生体の場合には、生体への光透過特性に優れているクロム・フォルステライトレーザー光源などのファイバレーザーを用いることで、より生体の深部まで高精度に形態画像観察や機能画像観察が可能となるため望ましい。
【０１１２】
また、実施の形態１から４に示す多光子励起測定装置において、３つ以上の波長が異なる光パルスを試料に照射することが望ましく、更に、形態画像の正確性と機能画像のコントラストが向上する。
【０１１３】
ただし、試料に照射する光パルスのスペクトルは、図６に示すように、最も短波長のものから、それぞれ、中心波長をλ１、λ２…λｎ、λｎ+１とし、波長の半値全幅をΔλ１、Δλ２…Δλｎ、Δλｎ+１とすると、少なくとも一つのｎ（ｎは自然数）に対して下記の数式１を満たすことが望ましい。
【０１１４】
【数１】
【０１１５】
これにより、隣り合う波長の光のｍ光子励起（ｍは２以上の自然数）による光学特性の切り分けの精度が大きく向上するため、得られる機能画像の高コントラスト化が可能となる。
【０１１６】
また、より望ましくは、少なくとも一つの波長に対して数式２を満たすことが望ましい。
【０１１７】
【数２】
【０１１８】
これにより、隣り合う波長の光の和光子励起による光学特性の切り分け精度も大きく向上するため、得られる機能画像の更なる高コントラスト化が可能となる。
【０１１９】
また、試料がシトクロムＣを含む場合には、
（１）１０４５ｎｍより短波長
（２）１０４５ｎｍより長波長で１０８０ｎｍより短波長
（３）１０８０ｎｍより長波長
の三つの波長領域の光パルスを少なくとも一つづつ含むことで、形態画像の正確性と機能画像のコントラストが共に最も高くなるため望ましい。
【０１２０】
多波長光源からの波長に関係なく、複数波長の光短パルスを試料に照射する多光子励起測定装置において、波長が異なる複数の光パルスを同時に試料に照射する場合と、別々に試料に照射する場合に、試料から出射する光（実施の形態１ではラマン散乱光。蛍光などの場合も同様。）を計測し、比較することが望ましい。これにより、更に高コントラストな機能画像観察が可能となる。
【０１２１】
例えば、実施の形態１を例にとると、まず、１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯の光パルスをそれぞれ別々（のタイミングで）に試料１０４に照射し、５３２ｎｍ帯、５５０ｎｍ帯の可視光励起によるラマン散乱画像を取得する。次に、１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯の光パルスを同時に試料１０４に照射し、５４１ｎｍ帯の可視光励起によるラマン散乱画像を取得する。
【０１２２】
これにより、より正確に、５３２ｎｍ帯、５４１ｎｍ帯、５５０ｎｍ帯、それぞれの波長によるラマン散乱光の切り分けができる。つまり、より正確なそれぞれの波長のラマン散乱画像を取得することが可能となり、機能画像観察の正確性（再現性）を高めることが可能となる。図示しないが、各光パルスの発振タイミングを制御するタイミング制御手段を備えていてもよい。
【０１２３】
また、更に望ましくは、複数波長の光パルスの光強度をそれぞれ独立に変えて試料に照射し、試料から出射する光を計測して比較することが望ましく、これによって、２光子励起による光学特性と３光子励起による光学特性（ラマン散乱、吸光特性、蛍光特性）、さらに多光子励起による光学特性を切り分けることが可能となる。
【０１２４】
例えば、ラマン散乱光を計測する場合は、２光子励起によるラマン散乱、３光子励起によるラマン散乱、更に、高次のラマン散乱の切り分けが可能となるため、より高コントラストの機能画像観察が可能となる。また、同様に、蛍光とラマン散乱の切り分けも可能となるため、更に、機能画像のコントラスト向上に繋がる。
【０１２５】
また、同様に、二つの波長の光パルスのパルス波形を変形させる手段を備えることが望ましい。パルス波形を変形させ、且つ、二つの光パルス発振のタイミングを調節することにより、二つの光パルス光路が重なり合う位置におけるそれぞれの光パルスの２光子吸収、３光子吸収、和光子吸収の吸収率を任意に調節することが可能となり、機能画像のコントラスト向上が可能となる。
【０１２６】
また、増幅後の二つの波長の光パルス（実施の形態１の一つ目の例では、１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯の二つの光パルス）光路に、それぞれ、図２に示すようなパルス幅圧縮機２０７、２０８を設置し、より短パルス化してもよい。試料１０５内の対抗し励起現象が、より顕著に起こるため、より高精度な機能画像観察が可能となる。パルス幅圧縮機２０７、２０８について、詳細を図示しないが、波長分散特性を示す光ファイバや、回折格子とミラーを組み合わせて、波長によって光路長が異なる分散補償手段などを用いることが可能となる。半導体レーザーをゲインスイッチ動作させて発生させる光パルスは、短波長から長波長へと時間的にチャープした波長特性を示すため、上述のように、波長によって光学距離が異なる構成のパルス幅圧縮機を用いて、パルス幅の圧縮が可能となるため望ましい。より安価な多波長光源が可能となる。
【０１２７】
また、ファイバ増幅器２０５、２０６は、複数のファイバ増幅器を直列に繋いだ多段増幅器であってもよい。ファイバ増幅器１段ごとの増幅率は１０００倍以下が望ましく、これによって、ノイズが少なく、高効率な光パルス増幅が可能となるため、より正確な形態画像が得られる。
【０１２８】
また、一段ごとの増幅率は５０倍以上が望ましく、より安価に、検体の多光子励起が可能となる。
【０１２９】
また、生体内のヘモグロビン濃度や酸素化割合を求める応用の場合は、水に吸収が少ない波長の光を用いることが望ましい。図１１には、セル長１ｃｍの蒸留水の透過スペクトルを示す。図１１に示すように、波長１４４０ｎｍ以下の光パルスと波長１６２５ｎｍ以上の光パルスを用いて、生体に照射することが望ましい。これにより生体内のより深い位置のヘモグロビン濃度や酸素化割合を求めることが可能となる。
【０１３０】
また、酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンは、８００ｎｍ付近の光に対して吸光度が等しい。このため、８００ｎｍ付近の光の吸光度と８００ｎｍ帯より短波の吸光度、８００ｎｍ帯より長波の吸光度を求めることが望ましい。つまり、二つの波長の異なる光パルスによる和光子励起によって８００ｎｍの波長の光の吸光度を求める構成とすることが望ましく、多波長光源にて生成する二つの光パルスの波長をλ１[ｎｍ]、λ２[ｎｍ]とすると、下記条件（１）〜（３）をすべて満たすことが望ましく、それによって、ヘモグロビンの酸素化割合をより正確に計測することが可能となる。
【０１３１】
（１）λ１ ＜ １４４０
（２）１６２５ ＜ λ２ ＜ １９２５
（３）λ１ ＝ （λ３*λ２）／（λ２−λ３）
ここで、λ３は８００ｎｍに略同一であって、７９０ｎｍから８１０ｎｍの範囲において、略同一とみなし、同様の効果を得る。
【０１３２】
また、（２）と（３）の条件を満たすために、
（４）１３４０ ＜ λ１
も満たすことが必要となる。
【０１３３】
また、（３）は
（３）´７９０ ＜（λ１*λ２）／（λ１＋λ２）＜ ８１０と
透過である。
【０１３４】
また、本発明の多光子励起測定装置では、顕著な多光子吸収を発生させることで、高精度な多光子励起を発生させることが可能となり、形態画像観察に用いる場合に解像度を向上させることが可能となる。このため、検体内の線形吸収による吸光エネルギーに対して、多光子吸収による吸光エネルギーがある程度大きいことが望ましい。
【０１３５】
少なくとも多光子吸収による吸光エネルギーが、線形吸収による吸光エネルギーの１０％以上であることがのぞましい。
【０１３６】
また、和光子吸収による総吸光エネルギーは、重なり合った複数の光パルスの光強度に比例し、各光パルスの吸光エネルギー比は、各光パルスの波長に逆比例する。
【０１３７】
このため、パルス幅が同程度で、光強度が大きな光パルスと光強度が小さな光パルスを重ねた場合、光強度が小さな光パルスのほうが多光子吸収による光吸収率が高くなる。つまり、試料から出た後の光強度が小さいほうの光パルス出力をモニターしながら、両光パルスの重なり具合を調整する（発振タイミングを調節する）ことで、より顕著に多光子吸収による吸光度を求めることが可能となり、高コントラストな機能性画像が得られるため望ましい。
【０１３８】
そのため、実施の形態１から４の成分濃度計において、波長の異なる二つの光パルスを試料に照射し、試料内で重なり合うようにそれぞれの光パルスの光路、発振のタイミングを調整する場合において、二つの光パルスの光強度に差があることが望ましい。
【０１３９】
より望ましくは、波長が短い方の光パルスの光強度が小さいことが望ましい。
【０１４０】
また、波長の異なる複数の光パルスを試料に照射する構成の場合も同様のことが言える。
【０１４１】
また、光強度が小さい方の光パルスをＳＣ（スーパーコンティニューム）光源やＳＬＤ、フェムト秒ＯＰＯなどの広帯域パルス光源を用いて発振させることが望ましく、より様々な波長の吸光度をより高精度に計測することが可能となるめ、望ましい。これにより、更に、高精度な機能性画像が得られる。
【０１４２】
また、実施の形態１から４において、少なくとも一つの光パルスが波長可変光源から生成されていることがより望ましく、より高感度でより高精度に複数の波長の光吸光度を計測することが可能となる。これにより、より光が届き難い、散乱体や透過率が低い試料の奥深い位置まで高精度に機能性画像を得ることが可能となる。
【０１４３】
また、実施の形態１から４では、シトクロムＣやヘモグロビンを含む生体を対象の試料とした多光子励起測定装置について示したが、本発明の多光子励起測定装置の応用範囲はこれらに限らず、様々な用途において同様の効果を発揮する。
【０１４４】
例えば、体内の血糖値などを計測する成分濃度計として用いることも可能となる。例えば、血糖値を計測する場合、波長３〜４μｍ帯の遠赤外光の光パルスを人体に照射することで、グルコースの分子振動による基準振動にあたる光吸収特性と、倍音などの光吸収特性の両方を観察することが可能となり、より高精度な成分濃度計測が可能となるため望ましい。
【０１４５】
また、２〜１μｍ帯の近赤外光の光パルスを用いることで、分子振動の倍音と、電子振動による光吸収特性の両方を応用した成分濃度計測が可能となるため、より高精度な血糖値計測が可能となるため望ましい。
【０１４６】
また、本発明の多光子励起測定装置は、半導体材料など他の試料を多光子励起（非線形励起）して計測する計測装置としても応用することが可能である。
【０１４７】
また、本発明の多光子励起測定装置は波長の異なる複数の光パルスを同時に発振させて、その和光子励起による物質の蛍光を利用した蛍光顕微鏡として用いる場合、多波長光源からの光パルス出力を可変にしておくことが望ましい。
【０１４８】
これにより、過飽和吸収や蛍光の非線形現象を利用した物質の同定が可能となり、より多くの物質の濃度（分布）を計測することが可能となる。
【０１４９】
なお、上記の実施形態では、多光子励起測定装置を、複数の物質の濃度分布を算出するために使用する例を説明した。しかしながら、物質の濃度を算出しない場合（すなわちスペクトルを観測するのみ）でも、測定できる観測点を従来の測定装置よりも増加させることができる。これにより測定精度をより向上させることができるという特有の効果を奏することができる。
【０１５０】
また、複数の物質を含む試料を測定する場合に、各物質の吸収スペクトルの重複が少ない２つの波長帯域を用いて測定を行うことで、その後の演算を行うことなく、各物質の濃度を求めることができる。例えば、物質Ａでラマン散乱が発生する波長λ１（また、物質Ｂではラマン散乱がおきにくい波長）と、物質Ｂでラマン散乱が発生する波長λ２（また、物質Ａではラマン散乱が起きにくい波長）を用いて測定を行うことで、一度の測定で２つの異なる物質の濃度を算出することができる。
【０１５１】
また、λ１とλ２の和周波が、物質Ａ及び物質Ｂの何れかのラマン散乱が発生する波長帯に存在する場合には、この和周派の波長領域で得られた測定結果を用いることで、物質Ａまたは物質Ｂの測定点を増加させることができる。したがって、測定精度をより向上させることができる。
【０１５２】
以上のように、本発明の多光子励起測定装置は、得られた測定スペクトルの使用方法が特定の目的に限定されるものではなく、また得られた測定スペクトルを用いた演算方法も、ある特定の方法に限られるものではない。
【０１５３】
以上、本発明の測定装置について示したが、本明細書にて示した構成は一例であって、本発明の主旨を逸脱しない範囲で様々な変更が可能であることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明に係る多光子励起測定装置は、上記実施の形態で説明した生細胞を計測する多光子励起レーザー走査型顕微鏡に限らず、半導体材料など他の試料を多光子励起（非線形励起）して計測する計測装置にも適用可能である。
【０１５５】
また、物質の構造を観察するだけでなく、化学物質の同定をも可能とする測定装置を提供することができる。
【符号の説明】
【０１５６】
１００ 多光子励起測定装置
１０１ 多波長光源
１０２ レーザー走査光学ユニット
１０３ シングルモード光ファイバ
１０４ 試料
１０５ 光ファイバコネクタ
１０６ 光ファイバコネクタ
１０７ 二次元走査ミラー
１０８ 瞳投影レンズ
１０９ 結像レンズ
１１０ ダイクロイックミラー
１１１ 対物レンズ
１１２ 集光レンズ
１１３ 検出器
２０１ パルスジェネレータ
２０２ パルスジェネレータ
２０３ 半導体レーザー
２０４ 半導体レーザー
２０５ ファイバ増幅器
２０６ ファイバ増幅器
２０７ パルス幅圧縮機
２０８ パルス幅圧縮機
２０９ 反射ミラー
２１０ ダイクロイックプリズム
３００ 多光子励起測定装置
３０１ 集光レンズ
３０２ レーザー走査光学ユニット
３０３ 検出器
４００ 多光子励起測定装置
４０１ 回折格子
４０２ レーザー走査光学ユニット
４０３ 集光レンズ
４０４ 対物レンズ
５００ 多光子励起測定装置
５０１ レーザー走査光学ユニット
７００ 多光子励起測定装置
７０２ レーザー走査光学ユニット
７０３ 光ファイバ
７０４ 円筒ビーム形成器
７０５ 光ファイバコネクタ
７０６ 光ファイバコネクタ
７０７ コリメートレンズ
７０８ コリメートレンズ
８０１ アキシコレンズ
８０２ アキシコレンズ
８０３ ガウシアンビーム
８０４ 円筒ビーム
１００１ １０６４ｎｍ帯の光パルスのプロファイル
１００２ １１００ｎｍ帯の光パルスのプロファイル
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピーク光強度の高い超短パルス光を試料に照射して、多光子吸収現象を用いて試料を測定する多光子励起測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡で蛍光観察を行う手段として、特許文献１に示すように特定のある波長の超短パルス光による多光子励起を利用した蛍光観察法が知られている。
【０００３】
多光子励起では、吸収波長のほぼ整数倍の波長を持つ光線を同時に蛍光体に照射することにより、本来の吸収波長と同等な励起現象が引き起こされる。多光子励起で用いられる励起光は一般に赤外光であり、紫外光や可視光の励起現象を計測する目的で用いられる。
【０００４】
一般に波長が長い光のほうが散乱しにくいという性質（レイリー散乱）を持つため、生体試料のような散乱性試料では、多光子励起を利用した方が試料のより深くまで光を入射させることが出来る。このことは、通常の可視光では観察することができなかった生体の深部まで観察することが可能になることを意味する。しかも、赤外光は紫外光や可視光よりも光毒性が低いので、生体試料をできる限り傷つけないで形態観察することができる。
【０００５】
例えばセロトニンという脳内物質は、紫外線領域に吸収波長を持つ自家蛍光特性を有する。しかしながら、紫外光は脳内の深部にまで到達することができず、また光毒性も強い。このような状況下で多光子励起レーザー走査型顕微鏡は有効に働く。紫外光と赤外光は波長が３倍程度離れているので、３光子励起を行えば赤外光を使ってセロトニンを励起できる。
【０００６】
以上のように多光子励起を利用した蛍光観察は大きなメリットを持っており、現在の形態観察において非常に有効な手段となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−００８９８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡は、ある特定の波長の光のみを用いた単一波長による多光子励起を応用したものである。そのため、いくつかの分子の吸収帯の波長領域が重複してしまうと、試料の化学成分の同定（機能観察）までは不可能である。
【０００９】
そこで本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、より多くの化学成分の識別を可能とする多光子励起測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の多光子励起測定装置は、高輝度の光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、波長の異なる複数の光パルスを出射する多波長光源と、多波長光源にて発生した波長の異なる複数の光パルスの光路を試料内で重ねて、重なった位置を試料内で走査する走査光学系と、光パルスの照射により試料から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の顕微鏡によれば、複数の波長の光による分子の吸収像、あるいは蛍光像を観察することにより、より多くの分子の区別が可能となる効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の第１、及び、第２の実施形態に係る多光子励起測定装置の要部の構成を示す図
【図２】図１に示した多波長光源の一例の要部構成を示す図
【図３】本発明の第１、及び、第２の実施形態に係る別の多光子励起測定装置の要部の構成を示す図
【図４】本発明の第３の実施形態に係る多光子励起測定装置の要部の構成を示す図
【図５】本発明の第３の実施形態に係る多光子励起測定装置の要部の構成を示す図
【図６】多波長光源から発生する複数の光パルスのスペクトル分布を示す図
【図７】本発明の第４の実施形態に係る多光子励起測定装置の要部の構成を示す図
【図８】図７に示した円筒ビーム形成器の要部の構成を示す図
【図９】図７に示した多波長光源の一例の要部構成を示す図
【図１０】図７に示した多波長励起測定装置内の面Ｃにおける光プロファイルを示す図
【図１１】蒸留水の透過スペクトルを示す図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００１４】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における多光子励起測定装置の概略構成を示す図である。この多光子励起測定装置１００は複数の波長の光を出射する多波長光源１０１と、レーザー走査光学ユニット１０２と、光ファイバ１０３とを有する。多波長光源１０１から発振した光パルスは、光ファイバ１０３を通してレーザー走査光学ユニット１０２に入射され、、試料１０４に集光する。ここで、光ファイバ１０３は、光ファイバコネクタ１０５、１０６によって、それぞれ多波長光源１０１、レーザー走査光学ユニット１０２と接続される。
【００１５】
試料１０４は、例えばシトクロムＣ（タンパク質）が生細胞内に存在するミトコンドリアであり、試料１０４に集光された光パルスは、シトクロムＣでの多光子吸収により強い共鳴ラマン散乱を示す。
【００１６】
図２は、図１に示した多波長光源１０１の一例の部分構成を示す図である。この多波長光源１０１は、パルスジェネレータ２０１、２０２、半導体レーザー２０３、２０４、ファイバ増幅器２０５、２０６、パルス幅圧縮機２０７、２０８、反射ミラー２０９、ダイクロイックプリズム２１０、及び光ファイバコネクタ１０５を有する。パルスジェネレータ２０１、２０２は、共に数ｎｓ以下の電気パルスを発生し、この電気パルスにより、それぞれ半導体レーザー２０３、２０４に電流を注入する。
【００１７】
半導体レーザー２０３、２０４は、パルスジェネレータ２０１、２０２からの電気パルスにより注入される電流によって、利得が瞬間的に発生又は消滅する、いわゆるゲインスイッチ動作をする。これにより半導体レーザー２０３、２０５は、短波長から長波長へと時間的にチャープした数十ピコ秒幅の光パルスを発生する。半導体レーザー２０３、２０４は、例えば、面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）、量子井戸分布帰還型レーザーダイオード（ＱＷＤＦＢＬＤ）、量子ドット分布帰還型レーザーダイオード（ＱＤＤＦＢＬＤ）などが使用可能であるが、本実施の形態ではＶＣＳＥＬを使用する。また、光パルスの波長は、試料１０４の多光子吸収により共鳴ラマン散乱光が発生する波長であればよい。例えば、可視から近赤外光、赤外光が使用可能であるが、ここでは、半導体レーザー２０３から１０６４ｎｍ帯、半導体レーザー２０４から１１００ｎｍ帯の近赤外光が発振することとする。
【００１８】
半導体レーザー２０３，２０４から発生した光パルスは、ファイバ増幅器２０５，２０６にて増幅する。ファイバ増幅器２０５，２０６は、ファイバレーザーまたは、半導体レーザーで励起され、被励起媒質として、Ｎｄ，Ｙｂ，Ｔｍ，Ｅｒなどをドープしたシングルクラッド、または、ダブルクラッドの光ファイバ、あるいは、断面に空隙がある光ファイバを用いる。ここで、被励起媒質としてＹｂがドープされたシングルクラッド光ファイバを用いる。
【００１９】
ファイバ増幅器２０５，２０６によって、半導体レーザー２０３，２０４にて発振した光パルスは平均出力が数十ｍＷから数Ｗの光パルスに増幅する。
【００２０】
増幅後の１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯の二つの光パルスは、例えば、１１００ｎｍ帯の光パルスを反射ミラー２０９で、１０６４ｎｍ帯の光パルスに光路が直行する用に反射させる。そして、二つの光パルスの光路が直行する部分に設置した、１０６４ｎｍ帯の光を透過し、１１００ｎｍ帯の光を反射するダイクロイックプリズム２１０を用いて、２つの光パルスの光路を同一伝搬路に合成する。合成された光パルスは、光ファイバコネクタ１０５を経て多波長光源１０１から出射する。
【００２１】
光ファイバコネクタ１０５は、ＳＣ型、ＦＣ型、ＳＴ型、ＭＵ型、ＬＣ型の各種コネクタが使用可能であるが、本実施の形態では、ＦＣ型を用いる。
【００２２】
多波長光源１０１より出射した光パルスは、図１に示すように光ファイバ１０３を伝搬し、光ファイバコネクタ１０６を介して、レーザー走査光学ユニット１０２に入射する。ここで、光ファイバコネクタ１０６も光ファイバコネクタ１０５と同様にＦＣ型を用いる。
【００２３】
レーザー走査光学ユニット１０２内に入射した光パルスは、自由空間に出射され、二次元走査ミラー１０７に入射する。ここで、走査ミラーは、光パルスの走査方向を変化させ、光の伝播角度が操作される。二次元走査ミラー１０７は、例えば、互いに直行する２本の軸周りに揺動可能な２枚のガル場のミラーで構成される。
【００２４】
二次元走査ミラー１０７を経た光パルスは、瞳投影レンズ１０８により集光されて中間像として結像された後、結像レンズ１０９により平行光とされ、ダイクロイックミラー１１０と透過して、対物レンズ１１１により試料１０４に集光される。これにより、試料１０４に含まれるシトクロムＣが多光子励起されて、ラマン散乱光が発せられる。試料１０４から発せられた光は、対物レンズ１１１を経て、特定波長帯の光（波長帯は、試料１０４に集光される光パルスとの波長とは異なる）を反射するダイクロイックミラー１１０に入射する。この光は試料１０４に集光させる光パルスの波長と異なるため、ダイクロイックミラー１１０で反射され、集光レンズ１１２により検出器１１３に集光されて、電気信号に変換される。
【００２５】
また、検出器１１３は回折光学素子やプリズムなどの波長分離手段を備えた、いわゆる分光光度計であることがより望ましい。これにより、シトクロムＣの分布画像がより正確に得られる。
【００２６】
光パルスの集光位置は、二次元走査ミラー１０７によって、試料１０４内をＸＹ方向に走査される。ここで、光パルスの試料１０４上での集光位置の座標と、検出器１１３により検出された電気信号とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子励起ラマン散乱画像を得ることができる。例えば、二次元走査ミラーをMEMSで構成する場合は、MEMSに設けられたそれぞれの電極へ印加した電圧量から、二次元走査ミラーの角度や光の走査角度（もしくは試料１０４での集光位置の座標）を算出することができる。
【００２７】
また、集光位置をＺ方向に変化させる手段を備えることが、より望ましく、例えば、対物レンズ１１１をＰＺＴやＫＴＮを用いた可変焦点レンズとすることで３次元的な多光子励起ラマン散乱画像を高速に取得することが可能となる。
【００２８】
本発明では、既述のように、１０６４ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の光パルスを試料１０４入射させる。これにより、それぞれ２光子励起によって、５３２ｎｍ帯と５５０ｎｍ帯の可視光による励起と同様の効果を与えることとなる。
【００２９】
ここで、酸化型タンパク質と還元型タンパク質は、ラマン散乱の波長依存特性が異なっている。例えば、酸化型タンパク質は入射波長が増大するにつれて増加する特性を示し、還元型タンパク質は入射波長が増大するにつれて減少する特性を示す。増加、及び減少の特性は上述のものに限られず、逆になっていても良いが、いずれにせよ酸化型タンパク質と還元型タンパク質は、５３２ｎｍ帯の光励起によるラマン散乱と、５５０ｎｍ帯の光励起によるラマン散乱スペクトルが異なり、また、ラマン散乱量と波長の関係式は異なる式で表される。なお、物質のスペクトル特性を示す式は物質に応じて予め決定されている。
【００３０】
ここで、５３２nm帯のラマン散乱量と、５５０ｎｍ帯のラマン散乱量には、それぞれ酸化型タンパク質のラマン散乱と還元型タンパク質のラマン散乱量が含まれている。この５３２nm帯のラマン散乱量と５５０ｎｍ帯のラマン散乱量の値、及び酸化型タンパク質と還元型タンパク質のラマン散乱特性の波長依存性（ラマン散乱スペクトルの関係式）を用いて、酸化型タンパク質及び還元型タンパク質の、５３２ｎｍ帯及び５５０ｎｍ帯のラマン散乱量をそれぞれ算出することができる。これにより、異なる物質のラマン散乱スペクトルの波長領域が重複している場合にも、各波長帯における特定物質のラマン散乱量を算出することができる。
【００３１】
以上のように、複数波長のラマン散乱光の光量比較により多変量解析による成分分析が可能になる。
【００３２】
また、上述のように試料１０４上での光パルスの集光位置の座標が検出器１１３により検出された電気信号を対応づけて記憶されおり、画像化を行うことで各物質の濃度分布を画像化することができる。
【００３３】
上記構成により、酸化型タンパク質と還元型タンパク質を識別し、それぞれの濃度分布を画像化すること（機能観察）が可能となる。
【００３４】
また、本発明の多光子励起測定装置では、試料の観察部分（光パルス集光位置）以外の部分に対して低侵襲であり、安価に（共焦点光学系を必要とせず）、光伝搬方向（光軸方向）の解像度を高めることが可能となる。
【００３５】
また、本実施の形態において、１０６４ｎｍ帯の光パルスと１１００ｎｍ帯の光パルスの発振を同期させて、且つ、集光位置を一致させて、試料１０４に照射することで、二つの光の相互作用による多光子吸収現象が引き起こされる。すなわち、和周波である５４１ｎｍ帯の可視光励起によるラマン散乱画像を得ることも可能となる。
【００３６】
ここで、和周波は２波長の光パルスの集光点を含むごく限られた領域にのみ発生する。そのため、和周波と同じ周波数を有する単一波長の光パルスを試料１０４に入射した場合と比較すると、和周派が発生する場合の方が、ラマン散乱が発生する領域が限定される。そのため、複数波長の光パルスを入射させて和周波を発生させることで、測定の分解能をより向上させることができる。
【００３７】
このように、波長の異なる二つの光パルスが重なり合うことで引き起こされる２光子吸収、言い換えると、エネルギーが異なる二つの光子が出合って引き起こす２光子吸収を、以降、本明細書では『和光子吸収』とし、それによる励起を『和光子励起』とする。
【００３８】
また、試料内で発生するラマン散乱光は、試料内で偏光方向が回転し、試料入射前の光パルスと異なる偏光成分を含むため、ダイクロイックミラー１１０の代わりに偏光分離ミラーを用いてもよい。ダイクロイックミラーを用いることで、全ての偏光成分のラマン散乱光の出力を求めることが可能となる。その結果、より高精度な機能画像観察が可能となる。一方、偏光分離ミラーを用いる場合は、ミラーの固定角度尤度がより広くなり、対振動性や耐熱性に優れた顕微鏡となる。本発明では、複数の波長の光パルスを試料に照射し、それらのラマン散乱光を計測する必要があり、偏光分離ミラーを用いることによる耐振動性や耐熱性の向上の効果が大きい。
【００３９】
なお、本実施の形態は２光子吸収をベースに説明したが、３光子吸収以上の多光子吸収であってもよい。また、本実施の形態は２つの異なる波長の光を用いて説明したが、多波長光源１０１は３つ以上の波長の光を使用するものであってもよい。
【００４０】
（実施の形態２）
本実施の形態１では、１０３０ｎｍ帯、１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯などの赤外光（光パルス）をミトコンドリア（試料）に照射し、試料内のシトクロムＣによって発生したラマン散乱光を計測する例について示した。しかし、本発明の多光子励起測定装置は、任意の試料（材料）に対して、その試料が異なる光学特性を示す複数の異なる波長の光を照射することで同様の効果を得ることが可能となる。
【００４１】
例えば、本実施の形態では、１４００ｎｍ帯と１８６７ｎｍ帯の波長の光パルスを発振する図２と同様の構成の多波長光源を用い、人体を試料とする図１と同様の構成の多光子励起測定装置について説明する。本実施の形態では、人体内部のヘモグロビン濃度分布（形態画像）と、ヘモグロビンの酸素化の割合（機能画像）の両方を取得することが可能となる。
【００４２】
より詳細には下記に示す。
【００４３】
本実施の形態により、１４００ｎｍ帯と１８６７ｎｍ帯の二つの光の２光子吸収を利用して７００ｎｍ帯と９３３ｎｍ帯の二つの波長の吸光度を求めることが可能となる。また更に、１４００ｎｍ帯と１８６７ｎｍ帯の和光子吸収を利用して８００ｎｍ帯の吸光度を求めることが可能となる。また、波長８００ｎｍ帯の酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の吸光度は等しく、７００ｎｍ帯の吸光度は脱酸素化ヘモグロビンの方が高く、９３３ｎｍ帯の吸光度は酸素化ヘモグロビンの方が高い。このため、少なくとも８００ｎｍ帯の波長の吸光度を求めることで、酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の総和であるヘモグロビンの濃度が求められる。
【００４４】
更に、７００ｎｍ帯、９３３ｎｍ帯のうち、何れかの吸光度を計測し、８００ｎｍ帯の吸光度と比較することで、酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）それぞれの濃度を算出することができる。これにより、ヘモグロビンの酸素化の割合を求めることが可能となる。
【００４５】
例えば、酸素化ヘモグロビンの濃度をｘ、脱酸素化ヘモグロビンの濃度をｙとするとし、酸素化ヘモグロビン、脱酸素化ヘモグロビンの濃度に対する８００ｎｍの光の吸光度の関数をｆとし、脱酸素化ヘモグロビンの濃度に対する７００ｎｍの光の吸光度の関数をｇとし、脱酸素化ヘモグロビンの濃度に対する７００ｎｍの光の吸光度の関数をｈとすると、
ｆ（ｘ+ｙ）＝（８００ｎｍの吸光度）
ｇ（ｘ）+ｈ（ｙ）＝（７００ｎｍの吸光度）
として連立方程式を解くことで、ヘモグロビンの酸素化の割合を求めることが可能になる。
【００４６】
なお、上述の例では８００ｎｍ帯の吸光度を利用したが、７００ｎｍ帯、９３３ｎｍ帯で得られた吸光度量を使用して、酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の各濃度を算出してもよい。また、ヘモグロビン濃度の総和を求める差異に８００ｎｍ帯の吸光度を利用したが、７００ｎｍ帯、９３３ｎｍ帯の吸光度量を利用して得られた酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）のそれぞれの濃度からヘモグロビンの総和を算出しても良い。
【００４７】
本発明では直接７００ｎｍ帯、８００ｎｍ帯、９３３ｎｍ帯の光を生体に照射する場合に比べて、多光子励起現象を用いることで、より生体の透過率が高い長波長の赤外光を用いることが可能であり、生体のより深い部分のヘモグロビン濃度や酸素化の割合を調べることが可能となるため望ましい。
【００４８】
また、本実施の形態では、実施の形態１と同様に、試料に光パルスを照射し、返ってきた光の出力を計測する構成をとってもよいが、試料に入射させる光パルスと試料から返ってきた光の波長は同じであり、ダイクロイックミラー１１０の変わりに偏光分離ミラーを用いることが望ましい。これによって、試料から返ってきた光を検出器１１３に導き、試料内での減衰量（吸光度）が求められる。
【００４９】
また、図３に示すように、レーザー走査光学ユニット１０２からダイクロイックミラー１１０を省いたレーザー走査光学ユニット３０２を用いて、試料１０４に光パルスを照射し、レーザー走査光学ユニット３０２と反対側に検出器３０３を備える多光子励起測定装置３００としてもよい。この構成により、より正確に吸光度を調べることが可能となり、より正確なヘモグロビン濃度分布や酸素化割合を求めることが可能となる（より高精度な機能画像観察が可能となる）ため望ましい。
【００５０】
また、試料１０４と検出器の間には集光レンズ３０１を設置することで、更に測定の精度が向上するため望ましい。
【００５１】
なお、図１の構成では、光の透過率が低い試料や散乱が多い試料においても機能画像観察が可能となる。そのため、観察可能な資料の種類は図３の構成より多くすることができるというメリットを有している。
【００５２】
（実施の形態３）
図４は、本発明の実施の形態３における多光子励起測定装置の概略構成を示す図である。この多光子励起測定装置４００は、図１に示す多光子励起測定装置１００と同様に、多波長光源１０１にて発振した波長の異なる二つの光パルスを、光ファイバ１０３を通してレーザー走査光学ユニットに入射させて、試料１０４（シトクロムＣを生細胞内に含んだミトコンドリア）に照射する構成となる。
【００５３】
ただし、本実施形態に示すレーザー走査光学ユニット４０２では、入射した光パルスは自由空間に出射され、回折格子４０１に入射する。ここで、回折格子４０１は二つの波長の異なる光パルスを、その波長に応じて反射角が異なるように回折するため、例えば、図４の点線と破線で示すように光路が分離される。波長によって光路が分離された二つの波長の光パルスは共に、対物レンズ４０４により試料１０４内に入射する。対物レンズ４０４は、光路が分離された２つの光パルスを試料内で再び重ねあわせるように設計されており、光パルスは試料１０４内で同じ位置に集光される。この対物レンズは、例えば、回折格子から対物レンズまでの距離をａとし、対物レンズと資料内の集光位置までの距離をｂとし、対物レンズの焦点距離をｆとすると、
1／ｆ ＝ 1／ａ + １／ｂ
の関係になるようなｆの対物レンズを選択すればよい。
【００５４】
これにより、試料１０４に含まれるシトクロムＣが多光子励起されて、ラマン散乱光が発せられる。
【００５５】
二つの光パルスが重なる（交わる）位置では、実施の形態１と同様に、それぞれの光パルスの２光子吸収（励起）と共に、二つの波長の異なる光パルスの和光子吸収（励起）現象が発生し、そこで発生するラマン散乱光を検出器１１３にて電気信号に変換する。
【００５６】
本実施の形態では、対物レンズ４０４がＸＹ方向に並進運動することで、二つの波長の異なる光パルスの重なる位置は、試料１０４内をＸＹ方向に走査する。
【００５７】
また、検出器１１３も回折光学素子やプリズムなどの波長分離手段を備えた、いわゆる分光光度計であることがより望ましい。これにより、シトクロムＣの分布画像がより正確に得られる。
【００５８】
光パルスの試料１０４上での交わる位置の座標と、検出器１１３により検出されたラマン散乱光のスペクトルとを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子励起ラマン散乱画像を得ることができる。これにより、ミトコンドリア中におけるシトクロムCの濃度分布を観測することができる。
【００５９】
また、本実施の形態では、回折格子４０１の格子面上に二つの光パルスの焦点が位置するように集光レンズ４０３を備えることが望ましい。
【００６０】
これによって、試料１０４内で二つの光パルスが交わる位置とそれぞれの光パルスの焦点の位置が一致するため、より強い多光子励起現象が発生し、よりノイズの少ないシトクロムＣの濃度分布画像を取得することが可能となる。
【００６１】
本実施の形態では、波長の異なる二つの光パルスの光路が異なるため、交わる部分のみで和光子励起現象が発生する。このため、和光子励起によるラマン散乱スペクトルを計測することによって、散乱スペクトルの観測点を増加させることが出来る。また、和周派の発生領域が集光点付近に限定されるため、和周派を発生させて散乱スペクトルを計測することで、より高分解能のシトクロムＣ濃度分布画像が得られる。
【００６２】
本実施の形態では、実施の形態１と同様に、１０６４ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の光パルスを試料１０４入射させることで、５３２ｎｍ帯、５４１ｎｍ帯、５５０ｎｍ帯の可視光による励起と同様の効果を与えることとなる。１０６４ｎｍ帯の光パルスで励起した場合と、１１００ｎｍ帯の光パルスで励起した場合の、ラマン散乱画像を比較することで、酸化型タンパク質と還元型タンパク質を識別し、それぞれの濃度分布を画像化すること（機能観察）が可能となる。
【００６３】
また、本実施の形態の多光子励起測定装置も、試料の観察部分（光パルス集光位置）以外の部分に対して低侵襲であり、安価に（共焦点光学系を必要とせず）、光伝搬方向（光軸方向）の解像度を高めることが可能となる。
【００６４】
また、本実施の形態では、光ファイバ１０３を通してレーザー走査光学ユニット４０２に入射した光パルスを集光レンズ４０３に通して、２次元走査回折格子４０１の反射面で集光させることが望ましい。
【００６５】
これによって、２次元走査回折格子４０１の反射面をより小さくすることが可能となり、より低コストで、より低消費電力の２次元走査が可能となる。
【００６６】
また、試料１０４内における二つの光パルスがそれぞれの集光位置で重なるため、より高コントラストな機能画像が得られる。
【００６７】
また、対物レンズ４０４の手前の光パルス光路に略垂直な二面（Ａ面、Ｂ面）において、Ａ面とＢ面での二つの光パルスのビーム径の拡大率と、二つの光パルス光路の間隔の拡大率がほぼ一致することが望ましい。なお、ビーム径の拡大率とは、Ｂ面でのビーム径÷Ａ面でのビーム径を意味する。これによって、試料１０４内において、二つの光パルスはそれぞれの集光位置で重なる。つまり、最も光強度が高い位置で和光子吸収（和光子励起）を行うことが可能となり、得られるラマン散乱スペクトルも強くなる。その結果、より高コントラストな機能画像が得られる。
【００６８】
また、本実施の形態は、図５に示す構成を採用しても良い。すなわち、試料１０４内にて発生したラマン散乱光を、試料１０４に入射させた光パルス光路を逆走させて、対物レンズ４０４からレーザー走査光学ユニット内に再び取り込み、回折格子４０１で反射させる。多光子励起測定装置５００は、その後ダイクロイックミラー１１０を用いて試料１０４に入射する前の光パルスと試料１０４で反射した光の光路を分離し、検出器１１３に入射させるレーザー走査光学ユニット５０１を備えたとしてもよい。
【００６９】
図４の構成のほうが、より多くの試料からの光を受光することが可能となり、電気ノイズが少なく、より正確（再現性が高い）シトクロムＣの濃度分布、酸化／還元の割合の画像が得られるため望ましい。しかし、図５の構成では、より正確に分光光度を計測することが可能となり、成分分析の正確性が増すため望ましい。
【００７０】
また、言うまでもなく、本実施の形態の光学構成を実施の形態２と同様に、生体内のヘモグロビンの濃度や酸素化の割合を調べる多光子励起測定装置として用いてもよく、更に、別の試料の機能画像観察や形態画像観察に用いてもよい。
【００７１】
本実施の形態の多光子励起測定装置では、実施の形態１、２に示すように二つの波長の光パルスが同光路の構成に比べて、Ｚ方向の解像度が高くなるため望ましい。また、実施の形態１，２の構成の多光子励起測定装置は、より光学系が単純で安価な構成とすることが可能となるため望ましい。
【００７２】
（実施の形態４）
図７は、本発明の実施の形態４における多光子励起測定装置の概略構成を示す図である。この多光子励起測定装置７００は、多波長光源７０１にて発振した波長の異なる二つの光パルスを、それぞれ別の光ファイバ１０３、７０３を通してレーザー走査光学ユニット７０２に入射させて、試料１０４（シトクロムＣを生細胞内に含んだミトコンドリア）に照射する構成となる。
【００７３】
ここで、光ファイバ１０３は、光ファイバコネクタ１０５、１０６によって、それぞれ多波長光源１０１、レーザー走査光学ユニット７０２と接続される。
【００７４】
試料１０４は、シトクロムＣ（タンパク質）が生細胞内に存在するミトコンドリアであり、試料１０４に集光された光パルスは、シトクロムＣでの多光子吸収により強い共鳴ラマン散乱を示す。
【００７５】
図９は、図７に示した多波長光源７０１の一例の部分構成を示す図である。この多波長光源７０１は、パルスジェネレータ２０１、２０２、半導体レーザー２０３、２０４、ファイバ増幅器２０５、２０６、パルス幅圧縮機２０７、２０８、及び、光ファイバコネクタ１０５、７０５を有する。
【００７６】
パルスジェネレータ２０１、２０２は、共に数ｎｓ以下の電気パルスを発生し、この電気パルスにより、それぞれ半導体レーザー２０３、２０４に電流を注入する。
【００７７】
半導体レーザー２０３、２０４は、パルスジェネレータ２０１、２０２からの電気パルスにより注入される電流によって利得が瞬間的に発生消滅する、いわゆるゲインスイッチ動作し、これにより短波長から長波長へと時間的にチャープした数十ピコ秒幅の光パルスを発生する。半導体レーザー２０３、２０４は、例えば、面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）、量子井戸分布帰還型レーザーダイオード（ＱＷＤＦＢＬＤ）、量子ドット分布帰還型レーザーダイオード（ＱＤＤＦＢＬＤ）などが使用可能であるが、本実施の形態ではＶＣＳＥＬを使用する。また、光パルスの波長は、試料１０４の多光子吸収により共鳴ラマン散乱する波長であればよく、可視から近赤外光、赤外光が使用可能である。ここでは、半導体レーザー２０３から１０６４ｎｍ帯、半導体レーザー２０４から１１００ｎｍ帯の近赤外光が発振することとする。
【００７８】
半導体レーザー２０３，２０４から発生した光パルスは、ファイバ増幅器２０５，２０６にて増幅する。ファイバ増幅器２０５、２０６は、ファイバレーザーまたは、半導体レーザーで励起される。ファイバレーザー中の被励起媒質として、Ｎｄ，Ｙｂ，Ｔｍ，Ｅｒなどをドープしたシングルクラッド、または、ダブルクラッドの光ファイバ、あるいは、断面に空隙がある光ファイバを用いる。ここで、被励起媒質としてＹｂがドープされたシングルクラッド光ファイバを用い、波長９４０ｎｍの半導体レーザーを用いて励起する。
【００７９】
ここで、ファイバ増幅器２０５，２０６によって、半導体レーザー２０３，２０４にて発振した光パルスは平均出力が数十ｍＷから数Ｗの光パルスに増幅する。
【００８０】
増幅後の１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯の二つの光パルスは、それぞれ、光ファイバコネクタ１０５、７０５を経て多波長光源７０１から出射する。
【００８１】
光ファイバコネクタ７０５も、本実施の形態では、ＦＣ型とする。
【００８２】
多波長光源７０１より出射した光パルスは、図７に示すように光ファイバ１０３、７０３を伝搬し、光ファイバコネクタ１０６、７０６を介して、レーザー走査光学ユニット７０２に入射する。ここで、光ファイバコネクタ７０６も光ファイバコネクタ７０５と同様にＦＣ型を用いる。
【００８３】
本実施形態に示すレーザー走査光学ユニット７０２では、入射した２つの光パルスはともに自由空間に放出され、コリメートレンズ７０７，７０８を通して平行光となる。
【００８４】
その後、多波長光源７０１にて発振した波長の異なる二つの光パルスのうち、片方（ここでは１１００ｎｍ帯の光パルスとする）を円筒ビーム形成器７０４に入射する。ここで、円筒ビーム形成器７０４は図８に示すように、向かい合った一対のアキシコレンズ（円錐レンズ）８０１、８０２で構成され、アキシコレンズ８０１の平面側から入射したガウシアンビーム８０３を円筒ビーム８０４に変換する構成となる。
【００８５】
円筒ビーム形成器７０４から出射した１１００ｎｍ帯の光パルスは図７に示すように、反射ミラー２０９とダイクロイックプリズム２１０で反射させて、円筒ビーム形成器７０４に入射させなかった、もう一方の光パルス（１０６４ｎｍ帯の光パルス）と同一伝搬路に重ねあわされる。
【００８６】
光路が一致した二つの波長の異なる光パルスは、二次元走査ミラー１０７に入射する。ここで、伝播角度が走査される。
【００８７】
二次元走査ミラー１０７を経た光パルスは、瞳投影レンズ１０８により集光されて中間像として結像された後、結像レンズ１０９により平行光とされ、対物レンズ１１１により試料１０４に集光される。これにより、試料１０４に含まれるシトクロムＣが多光子励起されて、ラマン散乱光が発せられる。
【００８８】
ここで、対物レンズ１１１直後の面Ｃにおける、光パルスのプロファイル（光強度分布）を図１０に示す。１０６４ｎｍ帯の光パルスのプロファイル１００１は光軸を中心としてガウシアン分布を示す。また、１１００ｎｍ帯の光パルスのプロファイル１００２も同様に光軸を中心とするが、円環状の光強度分布を示す。また、図１０では、１１００ｎｍ帯の光強度のうち、１１００ｎｍ帯の光の最高強度のe＾-2以上の光強度の部分を斜線部で示している。また、１０６４ｎｍ帯の光強度のうち、１０６４ｎｍ帯の光の最高強度のe＾-2以上の光強度の部分を斜線部で示している。
【００８９】
１１００ｎｍ帯の光パルスのプロファイル１００２において、内径ａ、外径ｂは、円筒ビーム形成器７０４におけるアキシコレンズ８０１とアキシコレンズ８０２の間隔を広げることで拡大することが可能である。１１００ｎｍ帯の光パルスのプロファイル１００２における内径ａが１０６４ｎｍ帯の光パルスのビーム径（光強度が最も高い位置の光強度のｅ-２倍の部分と光軸との距離）より大きくなるように二つのアキシコレンズを配置することで、二つの光パルスのプロファイルの重なりを抑制することが可能となる。このように、対物レンズ直後の面Ｃにおける二つの光パルスのプロファイルの重なりを無くすと、１１００ｎｍ帯の光パルスの集光位置以外で、二つの光パルスのプロファイルの重なりが無くなる。ただし、１１００ｎｍ帯の光パルスのプロファイルも集光位置では光軸中真付近にピーク光強度を持つ１ピークのプロファイルとなる。つまり、１１００ｎｍ帯の光パルスと１０６４ｎｍ帯の光パルスは、１１００ｎｍ帯の光パルスの集光位置でのみ重なり合うこととなる。
【００９０】
このため、１１００ｎｍ帯の光パルスの集光位置でのみ、和光子励起によるラマン散乱光が発生する。そのため、測定の分解能を向上させることが可能になる。
【００９１】
この和光子励起によるラマン散乱光は、試料１０４後方の集光レンズ３０１により検出器３０３に集光されて、電気信号に変換される。二次元走査ミラー１０７によって、光パルスの集光位置は試料１０４内をＸＹ方向に走査され、光パルスの試料１０４上での集光位置の座標と、検出器１１３により検出された電気信号とを対応づけて記憶することにより、２次元的な和光子励起ラマン散乱画像を得ることができる。
【００９２】
本発明では、既述のように、１０６４ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の光パルスを試料１０４入射させる。これにより、それぞれ２光子励起によって、５３２ｎｍ帯と５５０ｎｍ帯の可視光による励起と同様の効果を与えることとなる。
【００９３】
酸化型タンパク質と還元型タンパク質は、５３２ｎｍ帯の光励起によるラマン散乱と、５５０ｎｍ帯の光励起によるラマン散乱スペクトルが異なるため、上記構成により、酸化型タンパク質と還元型タンパク質を識別し、それぞれの濃度分布を画像化すること（機能観察）が可能となる。
【００９４】
また、本発明の多光子励起測定装置では、試料の観察部分（光パルス集光位置）以外の部分に対して低侵襲であり、安価に（共焦点光学系を必要とせず）、光伝搬方向（光軸方向）の解像度を高めることが可能となる。
【００９５】
また、実施の形態１と同様に、二つの異なる波長の光が重なり合う集光位置においては、５４１ｎｍ帯の光励起によるラマン散乱スペクトル画像を得ることも可能となる。
【００９６】
また、本実施の形態では、検出器３０３にピンホールを備え、共焦点光学系を採用することにより、１０６４ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の光パルスの集光位置で発生したラマン散乱光のみを計測することが可能となる。
【００９７】
これにより、同位置における、５３２ｎｍ，５４１ｎｍ，５５０ｎｍの三つの波長の光の吸光度を比較することが可能となるため望ましい。
【００９８】
以上、実施の形態１から４では、波長の異なる光を発振する複数のパルス光源を備えた多波長光源の例を示したが、波長可変の一つのパルス光源を備えた多波長光源を用いた場合であっても、複数の波長の多光子吸収率を計測することが可能となる。つまり、形態画像観察だけでなく機能画像観察が可能な多光子励起測定装置となる。
【００９９】
しかし、実施の形態１から４に示したように、本発明の多光子励起測定装置では、複数のパルス光源を備えた多波長光源を用い、波長の異なる複数の光を同時に発振することで、それぞれの２光子吸収、３光子吸収…現象だけでなく、和光子吸収現象を利用することが可能となるためより多くの波長の多光子吸収率を計測することが可能となるため望ましい。
【０１００】
更に、実施の形態３、４に示すように波長の異なる複数の光の光路を変えて、ある一部分でのみ重ならせる構成とすることによって、解像度を高めることも可能となる。
【０１０１】
また、本発明の実施の形態１から４について、Ｚ方向の解像度は実施の形態１、２ ＜ 実施の形態４ ＜ 実施の形態３ であり、光学系部分の価格についても、実施の形態１、２ ＜ 実施の形態４ ＜ 実施の形態３ となるため、用途に応じて適した実施の形態を用いることが望ましい。
【０１０２】
また、実施の形態１から４について、共通して下記のことが言える。
【０１０３】
まず、言うまでもなく多波長光源１０１の代わりに、任意の波長の光パルスを発振する多波長光源を用いることにより、任意の波長励起の光学特性画像を得ることが可能となる。
【０１０４】
例えば、試料がミトコンドリア内のシトクロムＣであって、試料のラマン散乱スペクトルを観察する場合は、図２における半導体レーザー２０１の代わりに１０３０ｎｍ帯の光パルスを発振する半導体レーザーを用いてもよい。試料に１０３０ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の光パルスを照射することが可能となり、１０３０ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯のそれぞれの光パルスの２光子励起と１０３０ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の和光子励起により、５１５ｎｍ帯、５３２ｎｍ帯、５５０ｎｍ帯の三つの波長の可視光励起によるラマン散乱画像を得ることが可能となる。
【０１０５】
シトクロムＣは５１５ｎｍ帯の光パルス励起によるラマン散乱による強いラマンピーク（７５３，１１２７，１３１４，１５８３ｃｍ−１）が観察されるため望ましい。上述の１０６４ｎｍ帯と１１００ｎｍ帯の二つの波長の光パルスを照射する構成に比べて、より正確にシトクロムＣの分布画像観察（形態画像観察）が可能となる。この特徴は、１０４５ｎｍ未満の波長の光パルスと１０４５ｎｍより長波長の光パルスをシトクロムＣに照射するすべての本発明の構成に適用可能となる。
【０１０６】
また、１０８０ｎｍ未満の波長の光パルスと１０８０ｎｍより長波長の光パルスを照射する構成では、シトクロムＣの酸化／還元の比率をより正確に求めることが可能となるため望ましい。
【０１０７】
また、実施の形態１から４では、半導体レーザーとファイバーアンプからなる多波長光源を用いたが、一般的に多光子励起測定装置に用いられるチタンサファイアレーザー光源などを用いてもよい。
【０１０８】
また、ＹｂやＮｄなどの希土類を添加したＹＡＧ、ＹＶＯ４などのレーザー媒質を用いたＱスイッチ短パルス固体レーザーを用いてもよい。
【０１０９】
ただし、半導体レーザーとファイバーアンプからなるパルス光源を用いることによって、より安価に様々な波長の光パルス発振が可能となるため望ましく、より多種類の化学物質の同定が可能となる。
【０１１０】
また、チタンサファイアレーザー光源や、Ｑスイッチ短パルス固体レーザーを用いることによって、より高ピークの光パルスを試料に照射することが可能となるため、化学物質の濃度計測精度が向上するため望ましい。
【０１１１】
また、試料が生体の場合には、生体への光透過特性に優れているクロム・フォルステライトレーザー光源などのファイバレーザーを用いることで、より生体の深部まで高精度に形態画像観察や機能画像観察が可能となるため望ましい。
【０１１２】
また、実施の形態１から４に示す多光子励起測定装置において、３つ以上の波長が異なる光パルスを試料に照射することが望ましく、更に、形態画像の正確性と機能画像のコントラストが向上する。
【０１１３】
ただし、試料に照射する光パルスのスペクトルは、図６に示すように、最も短波長のものから、それぞれ、中心波長をλ１、λ２…λｎ、λｎ+１とし、波長の半値全幅をΔλ１、Δλ２…Δλｎ、Δλｎ+１とすると、少なくとも一つのｎ（ｎは自然数）に対して下記の数式１を満たすことが望ましい。
【０１１４】
【数１】
【０１１５】
これにより、隣り合う波長の光のｍ光子励起（ｍは２以上の自然数）による光学特性の切り分けの精度が大きく向上するため、得られる機能画像の高コントラスト化が可能となる。
【０１１６】
また、より望ましくは、少なくとも一つの波長に対して数式２を満たすことが望ましい。
【０１１７】
【数２】
【０１１８】
これにより、隣り合う波長の光の和光子励起による光学特性の切り分け精度も大きく向上するため、得られる機能画像の更なる高コントラスト化が可能となる。
【０１１９】
また、試料がシトクロムＣを含む場合には、
（１）１０４５ｎｍより短波長
（２）１０４５ｎｍより長波長で１０８０ｎｍより短波長
（３）１０８０ｎｍより長波長
の三つの波長領域の光パルスを少なくとも一つづつ含むことで、形態画像の正確性と機能画像のコントラストが共に最も高くなるため望ましい。
【０１２０】
多波長光源からの波長に関係なく、複数波長の光短パルスを試料に照射する多光子励起測定装置において、波長が異なる複数の光パルスを同時に試料に照射する場合と、別々に試料に照射する場合に、試料から出射する光（実施の形態１ではラマン散乱光。蛍光などの場合も同様。）を計測し、比較することが望ましい。これにより、更に高コントラストな機能画像観察が可能となる。
【０１２１】
例えば、実施の形態１を例にとると、まず、１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯の光パルスをそれぞれ別々（のタイミングで）に試料１０４に照射し、５３２ｎｍ帯、５５０ｎｍ帯の可視光励起によるラマン散乱画像を取得する。次に、１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯の光パルスを同時に試料１０４に照射し、５４１ｎｍ帯の可視光励起によるラマン散乱画像を取得する。
【０１２２】
これにより、より正確に、５３２ｎｍ帯、５４１ｎｍ帯、５５０ｎｍ帯、それぞれの波長によるラマン散乱光の切り分けができる。つまり、より正確なそれぞれの波長のラマン散乱画像を取得することが可能となり、機能画像観察の正確性（再現性）を高めることが可能となる。図示しないが、各光パルスの発振タイミングを制御するタイミング制御手段を備えていてもよい。
【０１２３】
また、更に望ましくは、複数波長の光パルスの光強度をそれぞれ独立に変えて試料に照射し、試料から出射する光を計測して比較することが望ましく、これによって、２光子励起による光学特性と３光子励起による光学特性（ラマン散乱、吸光特性、蛍光特性）、さらに多光子励起による光学特性を切り分けることが可能となる。
【０１２４】
例えば、ラマン散乱光を計測する場合は、２光子励起によるラマン散乱、３光子励起によるラマン散乱、更に、高次のラマン散乱の切り分けが可能となるため、より高コントラストの機能画像観察が可能となる。また、同様に、蛍光とラマン散乱の切り分けも可能となるため、更に、機能画像のコントラスト向上に繋がる。
【０１２５】
また、同様に、二つの波長の光パルスのパルス波形を変形させる手段を備えることが望ましい。パルス波形を変形させ、且つ、二つの光パルス発振のタイミングを調節することにより、二つの光パルス光路が重なり合う位置におけるそれぞれの光パルスの２光子吸収、３光子吸収、和光子吸収の吸収率を任意に調節することが可能となり、機能画像のコントラスト向上が可能となる。
【０１２６】
また、増幅後の二つの波長の光パルス（実施の形態１の一つ目の例では、１０６４ｎｍ帯、１１００ｎｍ帯の二つの光パルス）光路に、それぞれ、図２に示すようなパルス幅圧縮機２０７、２０８を設置し、より短パルス化してもよい。試料１０５内の対抗し励起現象が、より顕著に起こるため、より高精度な機能画像観察が可能となる。パルス幅圧縮機２０７、２０８について、詳細を図示しないが、波長分散特性を示す光ファイバや、回折格子とミラーを組み合わせて、波長によって光路長が異なる分散補償手段などを用いることが可能となる。半導体レーザーをゲインスイッチ動作させて発生させる光パルスは、短波長から長波長へと時間的にチャープした波長特性を示すため、上述のように、波長によって光学距離が異なる構成のパルス幅圧縮機を用いて、パルス幅の圧縮が可能となるため望ましい。より安価な多波長光源が可能となる。
【０１２７】
また、ファイバ増幅器２０５、２０６は、複数のファイバ増幅器を直列に繋いだ多段増幅器であってもよい。ファイバ増幅器１段ごとの増幅率は１０００倍以下が望ましく、これによって、ノイズが少なく、高効率な光パルス増幅が可能となるため、より正確な形態画像が得られる。
【０１２８】
また、一段ごとの増幅率は５０倍以上が望ましく、より安価に、検体の多光子励起が可能となる。
【０１２９】
また、生体内のヘモグロビン濃度や酸素化割合を求める応用の場合は、水に吸収が少ない波長の光を用いることが望ましい。図１１には、セル長１ｃｍの蒸留水の透過スペクトルを示す。図１１に示すように、波長１４４０ｎｍ以下の光パルスと波長１６２５ｎｍ以上の光パルスを用いて、生体に照射することが望ましい。これにより生体内のより深い位置のヘモグロビン濃度や酸素化割合を求めることが可能となる。
【０１３０】
また、酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンは、８００ｎｍ付近の光に対して吸光度が等しい。このため、８００ｎｍ付近の光の吸光度と８００ｎｍ帯より短波の吸光度、８００ｎｍ帯より長波の吸光度を求めることが望ましい。つまり、二つの波長の異なる光パルスによる和光子励起によって８００ｎｍの波長の光の吸光度を求める構成とすることが望ましく、多波長光源にて生成する二つの光パルスの波長をλ１[ｎｍ]、λ２[ｎｍ]とすると、下記条件（１）〜（３）をすべて満たすことが望ましく、それによって、ヘモグロビンの酸素化割合をより正確に計測することが可能となる。
【０１３１】
（１）λ１ ＜ １４４０
（２）１６２５ ＜ λ２ ＜ １９２５
（３）λ１ ＝ （λ３*λ２）／（λ２−λ３）
ここで、λ３は８００ｎｍに略同一であって、７９０ｎｍから８１０ｎｍの範囲において、略同一とみなし、同様の効果を得る。
【０１３２】
また、（２）と（３）の条件を満たすために、
（４）１３４０ ＜ λ１
も満たすことが必要となる。
【０１３３】
また、（３）は
（３）´７９０ ＜（λ１*λ２）／（λ１＋λ２）＜ ８１０と
透過である。
【０１３４】
また、本発明の多光子励起測定装置では、顕著な多光子吸収を発生させることで、高精度な多光子励起を発生させることが可能となり、形態画像観察に用いる場合に解像度を向上させることが可能となる。このため、検体内の線形吸収による吸光エネルギーに対して、多光子吸収による吸光エネルギーがある程度大きいことが望ましい。
【０１３５】
少なくとも多光子吸収による吸光エネルギーが、線形吸収による吸光エネルギーの１０％以上であることがのぞましい。
【０１３６】
また、和光子吸収による総吸光エネルギーは、重なり合った複数の光パルスの光強度に比例し、各光パルスの吸光エネルギー比は、各光パルスの波長に逆比例する。
【０１３７】
このため、パルス幅が同程度で、光強度が大きな光パルスと光強度が小さな光パルスを重ねた場合、光強度が小さな光パルスのほうが多光子吸収による光吸収率が高くなる。つまり、試料から出た後の光強度が小さいほうの光パルス出力をモニターしながら、両光パルスの重なり具合を調整する（発振タイミングを調節する）ことで、より顕著に多光子吸収による吸光度を求めることが可能となり、高コントラストな機能性画像が得られるため望ましい。
【０１３８】
そのため、実施の形態１から４の成分濃度計において、波長の異なる二つの光パルスを試料に照射し、試料内で重なり合うようにそれぞれの光パルスの光路、発振のタイミングを調整する場合において、二つの光パルスの光強度に差があることが望ましい。
【０１３９】
より望ましくは、波長が短い方の光パルスの光強度が小さいことが望ましい。
【０１４０】
また、波長の異なる複数の光パルスを試料に照射する構成の場合も同様のことが言える。
【０１４１】
また、光強度が小さい方の光パルスをＳＣ（スーパーコンティニューム）光源やＳＬＤ、フェムト秒ＯＰＯなどの広帯域パルス光源を用いて発振させることが望ましく、より様々な波長の吸光度をより高精度に計測することが可能となるめ、望ましい。これにより、更に、高精度な機能性画像が得られる。
【０１４２】
また、実施の形態１から４において、少なくとも一つの光パルスが波長可変光源から生成されていることがより望ましく、より高感度でより高精度に複数の波長の光吸光度を計測することが可能となる。これにより、より光が届き難い、散乱体や透過率が低い試料の奥深い位置まで高精度に機能性画像を得ることが可能となる。
【０１４３】
また、実施の形態１から４では、シトクロムＣやヘモグロビンを含む生体を対象の試料とした多光子励起測定装置について示したが、本発明の多光子励起測定装置の応用範囲はこれらに限らず、様々な用途において同様の効果を発揮する。
【０１４４】
例えば、体内の血糖値などを計測する成分濃度計として用いることも可能となる。例えば、血糖値を計測する場合、波長３〜４μｍ帯の遠赤外光の光パルスを人体に照射することで、グルコースの分子振動による基準振動にあたる光吸収特性と、倍音などの光吸収特性の両方を観察することが可能となり、より高精度な成分濃度計測が可能となるため望ましい。
【０１４５】
また、２〜１μｍ帯の近赤外光の光パルスを用いることで、分子振動の倍音と、電子振動による光吸収特性の両方を応用した成分濃度計測が可能となるため、より高精度な血糖値計測が可能となるため望ましい。
【０１４６】
また、本発明の多光子励起測定装置は、半導体材料など他の試料を多光子励起（非線形励起）して計測する計測装置としても応用することが可能である。
【０１４７】
また、本発明の多光子励起測定装置は波長の異なる複数の光パルスを同時に発振させて、その和光子励起による物質の蛍光を利用した蛍光顕微鏡として用いる場合、多波長光源からの光パルス出力を可変にしておくことが望ましい。
【０１４８】
これにより、過飽和吸収や蛍光の非線形現象を利用した物質の同定が可能となり、より多くの物質の濃度（分布）を計測することが可能となる。
【０１４９】
なお、上記の実施形態では、多光子励起測定装置を、複数の物質の濃度分布を算出するために使用する例を説明した。しかしながら、物質の濃度を算出しない場合（すなわちスペクトルを観測するのみ）でも、測定できる観測点を従来の測定装置よりも増加させることができる。これにより測定精度をより向上させることができるという特有の効果を奏することができる。
【０１５０】
また、複数の物質を含む試料を測定する場合に、各物質の吸収スペクトルの重複が少ない２つの波長帯域を用いて測定を行うことで、その後の演算を行うことなく、各物質の濃度を求めることができる。例えば、物質Ａでラマン散乱が発生する波長λ１（また、物質Ｂではラマン散乱がおきにくい波長）と、物質Ｂでラマン散乱が発生する波長λ２（また、物質Ａではラマン散乱が起きにくい波長）を用いて測定を行うことで、一度の測定で２つの異なる物質の濃度を算出することができる。
【０１５１】
また、λ１とλ２の和周波が、物質Ａ及び物質Ｂの何れかのラマン散乱が発生する波長帯に存在する場合には、この和周派の波長領域で得られた測定結果を用いることで、物質Ａまたは物質Ｂの測定点を増加させることができる。したがって、測定精度をより向上させることができる。
【０１５２】
以上のように、本発明の多光子励起測定装置は、得られた測定スペクトルの使用方法が特定の目的に限定されるものではなく、また得られた測定スペクトルを用いた演算方法も、ある特定の方法に限られるものではない。
【０１５３】
以上、本発明の測定装置について示したが、本明細書にて示した構成は一例であって、本発明の主旨を逸脱しない範囲で様々な変更が可能であることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明に係る多光子励起測定装置は、上記実施の形態で説明した生細胞を計測する多光子励起レーザー走査型顕微鏡に限らず、半導体材料など他の試料を多光子励起（非線形励起）して計測する計測装置にも適用可能である。
【０１５５】
また、物質の構造を観察するだけでなく、化学物質の同定をも可能とする測定装置を提供することができる。
【符号の説明】
【０１５６】
１００ 多光子励起測定装置
１０１ 多波長光源
１０２ レーザー走査光学ユニット
１０３ シングルモード光ファイバ
１０４ 試料
１０５ 光ファイバコネクタ
１０６ 光ファイバコネクタ
１０７ 二次元走査ミラー
１０８ 瞳投影レンズ
１０９ 結像レンズ
１１０ ダイクロイックミラー
１１１ 対物レンズ
１１２ 集光レンズ
１１３ 検出器
２０１ パルスジェネレータ
２０２ パルスジェネレータ
２０３ 半導体レーザー
２０４ 半導体レーザー
２０５ ファイバ増幅器
２０６ ファイバ増幅器
２０７ パルス幅圧縮機
２０８ パルス幅圧縮機
２０９ 反射ミラー
２１０ ダイクロイックプリズム
３００ 多光子励起測定装置
３０１ 集光レンズ
３０２ レーザー走査光学ユニット
３０３ 検出器
４００ 多光子励起測定装置
４０１ 回折格子
４０２ レーザー走査光学ユニット
４０３ 集光レンズ
４０４ 対物レンズ
５００ 多光子励起測定装置
５０１ レーザー走査光学ユニット
７００ 多光子励起測定装置
７０２ レーザー走査光学ユニット
７０３ 光ファイバ
７０４ 円筒ビーム形成器
７０５ 光ファイバコネクタ
７０６ 光ファイバコネクタ
７０７ コリメートレンズ
７０８ コリメートレンズ
８０１ アキシコレンズ
８０２ アキシコレンズ
８０３ ガウシアンビーム
８０４ 円筒ビーム
１００１ １０６４ｎｍ帯の光パルスのプロファイル
１００２ １１００ｎｍ帯の光パルスのプロファイル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、
波長の異なる複数の光パルスを出射する多波長光源と、
前記多波長光源にて発生した前記波長の異なる複数の光パルスの光路を前記試料内で重ねて、重なった位置を試料内で走査する走査光学系と、
前記光パルスの照射により前記試料から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器と、
を有することを特徴とする多光子励起測定装置。
【請求項２】
前記波長の異なる複数の光パルスのうち少なくとも一つの光パルスの光路を、前記多波長光源から前記光パルスが出射された後に別の少なくとも一つの光パルスの光路と分離し、
前記試料内で再び重なり合わせることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項３】
前記波長の異なる複数の光パルスのうち少なくとも一つの光パルスを円筒ビームに変換する手段と、
前記試料内において前記円筒ビームを集光する集光光学系と、
を有することを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項４】
前記波長の異なる複数の光パルスのうち少なくとも二つの光パルスが重なり合う位置において、前記少なくとも二つの光パルスが集光するように光学系が設計されていることを特徴とする請求項２または請求項３記載の多光子励起測定装置。
【請求項５】
前記波長の異なる複数の光パルスを発振するタイミングを変化させるタイミング制御手段をそなえ、
前記タイミング制御手段は
前記波長の異なる複数の光パルスの光路が、前記試料内で同時に重なり合う位置に集光するように少なくとも複数の波長の異なる光パルスを発振し、前記複数の波長の光が集光するタイミングとは異なるタイミングで、前記複数の波長の異なる光パルスのうち少なくとも一部の光パルスが前記試料内で集光するように前記光パルスを発振させることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項６】
前記複数の波長の光が前記試料内に同時に重なり合うように集光した場合に得られた信号光と、前記少なくとも一部の光パルスが前記試料内に集光した場合に得られた信号光を比較することを特徴とする請求項６に記載の多光子励起測定装置。
【請求項７】
前記光パルスを円筒ビームに変換する手段は、一組の円錐レンズを含み、前記円筒ビームを集光する集光光学系から出射する光の強度分布を、それぞれの光パルスで異ならせることを特徴とする請求項３に記載の多光子励起測定装置。
【請求項８】
前記多波長光源は、１０４５ｎｍより短波長の光パルスと、１０４５ｎｍより長波長の光パルスを少なくとも発振し、前記１０４５ｎｍより短波長の光パルスを前記試料に照射して得られた信号と、前記１０４５ｎｍより長波長の光パルスを前記試料に照射して得られた信号と、前記１０４５ｎｍより短波長の光パルスと前記１０４５ｎｍより長波長の光パルスの和周波波長で得られた信号と、を用いて、前記試料内の酸化型タンパク質と還元型タンパク質の濃度分布を求めることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項９】
前記多波長光源から、
波長λ１、λ２の光パルスであって
７９０ｎｍ ＜（λ１*λ２）／（λ１＋λ２）＜ ８１０ｎｍ
を満たす光パルスを発振し、
前記試料内の酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの濃度分布を求めることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項１０】
前記λ１、λ２は、それぞれ
１３４０ｎｍ ＜ λ１ ＜ １４４０ｎｍ
１６２５ｎｍ ＜ λ２ ＜ １９２５ｎｍ
を満たすことを特徴とする請求項７に記載の多光子励起測定装置。
【請求項１１】
前記多波長光源にて発生させる前記波長の異なる複数の光パルスのスペクトルについて、最も短波長のものから、それぞれ、中心波長をλ１、λ２…λｎ、λｎ+１とし、波長の半値全幅をΔλ１、Δλ２…Δλｎ、Δλｎ+１とし、
少なくとも一つのｎ（ｎは自然数）に対して
λｎ+１−λｎ ＞ Δλｎ+１ ＋ Δλｎ
を満たすことを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項１】
光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、
波長の異なる複数の光パルスを出射する多波長光源と、
前記多波長光源にて発生した前記波長の異なる複数の光パルスの光路を前記試料内で重ねて、重なった位置を試料内で走査する走査光学系と、
前記光パルスの照射により前記試料から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器と、
を有することを特徴とする多光子励起測定装置。
【請求項２】
前記波長の異なる複数の光パルスのうち少なくとも一つの光パルスの光路を、前記多波長光源から前記光パルスが出射された後に別の少なくとも一つの光パルスの光路と分離し、
前記試料内で再び重なり合わせることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項３】
前記波長の異なる複数の光パルスのうち少なくとも一つの光パルスを円筒ビームに変換する手段と、
前記試料内において前記円筒ビームを集光する集光光学系と、
を有することを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項４】
前記波長の異なる複数の光パルスのうち少なくとも二つの光パルスが重なり合う位置において、前記少なくとも二つの光パルスが集光するように光学系が設計されていることを特徴とする請求項２または請求項３記載の多光子励起測定装置。
【請求項５】
前記波長の異なる複数の光パルスを発振するタイミングを変化させるタイミング制御手段をそなえ、
前記タイミング制御手段は
前記波長の異なる複数の光パルスの光路が、前記試料内で同時に重なり合う位置に集光するように少なくとも複数の波長の異なる光パルスを発振し、前記複数の波長の光が集光するタイミングとは異なるタイミングで、前記複数の波長の異なる光パルスのうち少なくとも一部の光パルスが前記試料内で集光するように前記光パルスを発振させることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項６】
前記複数の波長の光が前記試料内に同時に重なり合うように集光した場合に得られた信号光と、前記少なくとも一部の光パルスが前記試料内に集光した場合に得られた信号光を比較することを特徴とする請求項６に記載の多光子励起測定装置。
【請求項７】
前記光パルスを円筒ビームに変換する手段は、一組の円錐レンズを含み、前記円筒ビームを集光する集光光学系から出射する光の強度分布を、それぞれの光パルスで異ならせることを特徴とする請求項３に記載の多光子励起測定装置。
【請求項８】
前記多波長光源は、１０４５ｎｍより短波長の光パルスと、１０４５ｎｍより長波長の光パルスを少なくとも発振し、前記１０４５ｎｍより短波長の光パルスを前記試料に照射して得られた信号と、前記１０４５ｎｍより長波長の光パルスを前記試料に照射して得られた信号と、前記１０４５ｎｍより短波長の光パルスと前記１０４５ｎｍより長波長の光パルスの和周波波長で得られた信号と、を用いて、前記試料内の酸化型タンパク質と還元型タンパク質の濃度分布を求めることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項９】
前記多波長光源から、
波長λ１、λ２の光パルスであって
７９０ｎｍ ＜（λ１*λ２）／（λ１＋λ２）＜ ８１０ｎｍ
を満たす光パルスを発振し、
前記試料内の酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの濃度分布を求めることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【請求項１０】
前記λ１、λ２は、それぞれ
１３４０ｎｍ ＜ λ１ ＜ １４４０ｎｍ
１６２５ｎｍ ＜ λ２ ＜ １９２５ｎｍ
を満たすことを特徴とする請求項７に記載の多光子励起測定装置。
【請求項１１】
前記多波長光源にて発生させる前記波長の異なる複数の光パルスのスペクトルについて、最も短波長のものから、それぞれ、中心波長をλ１、λ２…λｎ、λｎ+１とし、波長の半値全幅をΔλ１、Δλ２…Δλｎ、Δλｎ+１とし、
少なくとも一つのｎ（ｎは自然数）に対して
λｎ+１−λｎ ＞ Δλｎ+１ ＋ Δλｎ
を満たすことを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−１１２８６３（Ｐ２０１２−１１２８６３Ａ）
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６３３６７（Ｐ２０１０−２６３３６７）
【出願日】平成２２年１１月２６日（２０１０．１１．２６）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月２６日（２０１０．１１．２６）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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