改変型芳香環ジオキシゲナーゼ及び水酸化フラボン類化合物の製造法
【課題】フラボン類化合物のフェニル基（ベンゼン環）に水酸基を導入して新規化合物を作製する方法を提供すること。
【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）、及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）；（ｂ）改変型ＢｐｈＡ及びＢｐｈＢを発現する微生物；並びに（ｃ）該微生物の培養物の少なくとも１つを、フラボン類化合物を含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から水酸化されたフラボン類化合物を得ることを特徴とする、水酸化フラボン類化合物の製造方法。
【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）、及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）；（ｂ）改変型ＢｐｈＡ及びＢｐｈＢを発現する微生物；並びに（ｃ）該微生物の培養物の少なくとも１つを、フラボン類化合物を含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から水酸化されたフラボン類化合物を得ることを特徴とする、水酸化フラボン類化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット、それをコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体に関する。また本発明は、上記改変型芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットを用いた水酸化フラボン類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）ＫＦ７０７株は、北九州で単離されたビフェニルやポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）の分解細菌である。この細菌から、芳香環（ビフェニル）の分解酵素遺伝子群が世界で始めて単離された（非特許文献１）。現在では、芳香環分解細菌由来の芳香環分解酵素遺伝子群を用いた研究は、環境浄化関連のニーズから数多くなされており、遺伝子や酵素の構造や機能に関して多くの知見が集積している（たとえば、非特許文献２参照)。最初の４反応の芳香環分解酵素の機能を以下に示す（非特許文献３）。
【０００３】
【化１】
【０００４】
上記の全遺伝子、すなわち、ｂｐｈＡ（ｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４）、ｂｐｈＢ、ｂｐｈＣ、及び、ｂｐｈＤ遺伝子を大腸菌に導入し発現させると、その大腸菌は、芳香環を代謝して安息香酸を作ることができる。
【０００５】
現在までに、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子として、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＡ）を分子進化工学的手法により改変したものを導入・発現させた大腸菌又は放線菌を用いて、種々のフェニル基等を含む芳香族化合物からジヒドロジオール体を作製出来ることが報告されている（下記の非特許文献１、２又は特許文献１参照）。すなわち芳香環やＰＣＢの分解細菌であるシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株から単離された芳香環ジオキシゲナーゼにおける大サブユニット（ＢｐｈＡ１）をコードするＤＮＡを、他の芳香環分解細菌であるブルクホルデリア（Burkholderia）属ＬＢ４００株由来の芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニット（ＢｐｈＡ１）をコードするＤＮＡとの間でＤＮＡシャフリング（DNA shuffling）を行い、変異株の中から基質特異性に優れた変異体として単離したＢｐｈＡ１（２０７２）と、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニット以外の３つの構成要素（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４）からなる改変芳香環ジオキシゲナーゼ（群）により、複素環基とフェニル基を分子内に含む有機低分子化合物の生物変換が可能であることが見い出された（非特許文献４及び５参照）。すなわち、ＤＮＡシャフリングした改変芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４；ｂｐｈＡ（２０７２）］を含む大腸菌が、上記有機低分子化合物を変換し、フェニル基の隣合った位置（置換基が入っている位置を１とすると、２と３の位置）に位置特異的に２つの水酸基と２つの水素が導入された芳香族−シス（ｃｉｓ）−ジヒドロジオール体を立体選択的に生成できることがわかった。この改変芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニット［ＢｐｈＡ１（２０７２）］のアミノ酸配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０８５７４８に示されている。また、ＫＦ７０７株の小サブユニット（ＢｐｈＡ２）、フェレドキシン（ＢｐｈＡ３）、及び、フェレドキシンレダクターゼ（ＢｐｈＡ４）のアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ８３６７３に示されている。さらに、上記のｂｐｈＡ（２０７２）を有する大腸菌により合成された芳香族−シス（ｃｉｓ）−ジヒドロジオール体が、シュードモナス・シュードアルカリゲノスＫＦ７０７株由来の芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）によりジオール体に変換されることも報告されている（特許文献２参照）。このＢｐｈＢのアミノ酸配列もＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ８３６７３に示されている。なお、その次の反応を触媒する芳香環ジオールジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ）及びヒドロラーゼ（ＢｐｈＤ）のアミノ酸配列もそれぞれＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ８３６７３及びＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ８５８５１に示されている。
【０００６】
また、上記ｂｐｈＡ遺伝子とｂｐｈＢ遺伝子及びｂｐｈＣ遺伝子を発現した大腸菌を、フェニル基（ベンゼン環）を分子内に有する有機低分子化合物を合成培地内で混合培養すると、メタ解裂化合物ではなく、ピコリン酸化合物が生成されることも報告されている（特許文献３参照）。
【０００７】
さらに、上記のｂｐｈＡ（２０７２）及びＫＦ７０７株由来の芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＢ）を有する大腸菌によりフラボン、フラバノンや６−ヒドロキシフラボン等の数種類のフラボノイドをジオール体に変換できることも報告されている（非特許文献６参照）。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２６９号公報
【特許文献２】ＷＯ２００４／０７８９８８号パンフレット
【特許文献３】ＷＯ２００５／０８５４３５号パンフレット
【非特許文献１】Furukawa,K., and Miyazaki,T., Cloning of gene cluster encoding biphenyl and chlorobiphenyl degradation in Pseudomonas pseudoalcaligenes. J. Bacteriol., 166, 392-398, 1986
【非特許文献２】Furukawa,K., Engineering dioxygenases for efficient degradation of environmental pollutants, Curr. Opinion Biotechnol.,11,244-249.2000
【非特許文献３】Suenaga,H.,Goto,M., and Furukawa,K., Emergence of multifunctional oxygenase activities by random priming recombination. J. Biol. Chem., 276, 22500-22506, 2001
【非特許文献４】Misawa, N., Shindo, K., Takahashi, H., Suenaga, H., Iguchi, K., Okazaki, H., Harayama, S., and Furukawa, K., Hydroxylation of various molecules including heterocyclic aromatics using recombinant Escherichia coli cells expressing modified biphenyl dioxygenase genes. “Tetrahedron" , 58, 9605-9612, 2002.
【非特許文献５】Shindo, K., Nakamura, R., Chinda, I., Ohnishi, Y. Horinouchi,S., Takahashi, H., Iguchi, K., Harayama, S., Furukawa, K., and Misawa, N., Hydroxylation of ionized aromatics including carboxylic acid or amine using recombinant Streptomyces lividanscells expressing modified biphenyl dioxygenase genes. “Tetrahedron" , 59, 1895-1900, 2003.
【非特許文献６】Shindo, K., Kagiyama, Y., Nakamura, R., Hara, A., Ikenaga, H., Furukawa, K., and Misawa, N., Enzymatic synthesis of novel antioxidant flavonoids by Escherichia coli cells expressing modified metabolic genes involved in biphenyl catabolism.“J. Mol. Catalysis B:Enzymatic”23, 9-16, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、フラボン類化合物のフェニル基（ベンゼン環）の２つの位置（例えば２位及び３位）に水酸基を導入して新規化合物を作製する一般的な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、遺伝子工学的に改変した芳香環（ビフェニル）ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４：ＢｐｈＡ）をコードする遺伝子をジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）をコードする遺伝子と共に導入し発現させた組換え大腸菌と、種々のフラボン類化合物を合成培地内で混合培養すると、フラボン類化合物のジオール体がそれぞれ生成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、３２４番目若しくは３２５番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ａ）と同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチド
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、又は
（ｂ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、３２４番目若しくは３２５番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ａ）と同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチドをコードする核酸
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸、又は
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【００１２】
（４）上記（２）又は（３）の核酸を含む組換えベクター。
（５）上記（４）の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（６）上記（５）の形質転換体を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ１）の製造方法。
【００１３】
（７）さらに芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）をコードする核酸、及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）をコードする核酸を含む、上記（４）の組換えベクター。
【００１４】
（８）上記（１）のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）を発現し、かつ芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）を発現することを特徴とする微生物。
（９）上記（４）又は（７）の組換えベクターで形質転換されたものである、上記（８）の微生物。
（１０）フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換できるものである、上記（８）又は（９）の微生物。
（１１）微生物が大腸菌であることを特徴とする上記（８）〜（１０）のいずれかの微生物。
【００１５】
（１２）上記（８）〜（１１）のいずれかの微生物を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換する活性を有する酵素群の製造方法。
【００１６】
（１３）以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）上記（１）のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）
（ｂ）上記（８）〜（１１）のいずれかの微生物
（ｃ）上記（８）〜（１１）のいずれかの微生物の培養物
の少なくとも１つを、フラボン類化合物を含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から水酸化されたフラボン類化合物を得ることを特徴とする、水酸化フラボン類化合物の製造方法。
（１４）フラボン類化合物が、フラボン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラボン、５，７−ジヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシフラバノン、カルコン、１−フェニルナフタレン、及び２−フェニルナフタレンからなる群より選択される、上記（１３）の方法。
（１５）水酸化フラボン類化合物が、フラボン類化合物のフェニル基の２位及び３位に２つの水酸基が導入されたジオール体である、上記（１３）又は（１４）の方法。
【００１７】
（１６）下記式ＩＩで表わされる化合物。
【００１８】
【化２】
【００１９】
（１７）以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）上記（１）のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）
（ｂ）上記（８）〜（１１）のいずれかの微生物
（ｃ）上記（８）〜（１１）のいずれかの微生物の培養物
の少なくとも１つを、カルコンを含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から上記式ＩＩで表わされる化合物を得ることを特徴とする、式ＩＩで表わされる化合物の製造方法。
（１８）下記式ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶで表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする抗酸化剤。
【００２０】
【化３】
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、既存のフラボン類化合物から水酸化フラボン類化合物（特に水酸基を２つの位置に有するジオール体）を製造する新規な方法が提供される。かかる変換産物は種々の医薬品や農薬等の工業製品を有機化学合成するための原料として提供することができる。また、本発明の方法はフラボン類化合物のフェニル基（ベンゼン環）の２つの位置（２位及び３位）に特異的に水酸基を導入することができ、有機化学合成において有用な反応である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る水酸化フラボン類化合物の製造方法は、フェニル基（ベンゼン環）を有するフラボン類化合物に、本発明に係る芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチドと公知の芳香環分解系酵素とを作用させることにより、そのフェニル基（ベンゼン環）を水酸化して、水酸化フラボン類化合物に変換することを特徴とするものである。
【００２３】
具体的には、本発明に係る芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチド（以下、「改変型ＢｐｈＡ１」ともいう）と芳香環ジオキシゲナーゼの他のサブユニット（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）からなる酵素［改変型ＢｐｈＡ］、及び芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）を、順次作用させて、フェニル基（ベンゼン環）が水酸化されたフラボン類を製造する。
【００２４】
１．芳香環分解系酵素及びそれをコードする遺伝子
本発明では、芳香環（ビフェニル）分解系の最初の酵素、すなわち、芳香環（ビフェニル）ジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ；本明細書中、単に「芳香環ジオキシゲナーゼ」とも記載する）を遺伝子工学的に改変した改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）、及び２番目の酵素ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）の活性を利用している。ＢｐｈＡは４つのサブユニット（ＢｐｈＡ１，ＢｐｈＡ２，ＢｐｈＡ３及びＢｐｈＡ４；又はＢｐｈＡ１，ＢｐｈＥ，ＢｐｈＦ及びＢｐｈＧ）から構成されており、本発明において「改変型芳香環ジオキシゲナーゼ」とは、そのうちの大サブユニット（ＢｐｈＡ１）を遺伝子工学的に改変したものである。
【００２５】
（１）改変型ＢｐｈＡ（芳香環ジオキシゲナーゼ）
本発明において、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）としては、限定されるものではないが、その大サブユニットがＢｐｈＡ１（１−２２）（配列番号２）及びＢｐｈＡ１（２−２）（配列番号４）のものを用いることができる。これらの改変型ＢｐｈＡ１は、限定されるものではないが、それぞれｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子（配列番号１）及びｂｐｈＡ１（２−２）遺伝子（配列番号３）によりコードされる。
【００２６】
ｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子及びｂｐｈＡ１（２−２）遺伝子は、シュードモナス・プチダＫＦ７１５株（Hayase,N.,Taira,K. and Furukawa, K., Pseudomonasputida KF715 bphABCD operon encoding biphenyl and polychlorinated biphenyl degradation: Cloning analysis, and expression in soil bacteria. J. Bacteriol., 172, 1990）から単離したｂｐｈＡ１配列を中央部分に持ち、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７由来のｂｐｈＡ１配列を両端に持つハイブリッドｂｐｈＡ１遺伝子であるｂｐｈＡ１（７１５−７０７）遺伝子を基に、一部のアミノ酸残基に置換を加えたものである。ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）遺伝子は、カセットＰＣＲ法（特開２０００−１２５８７１号公報）を用いてシュードモナス・プチダＫＦ７１５株からｂｐｈＡ１配列を単離し構築したものである（特許文献３）。
【００２７】
本発明者らは、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の３２４番目及び３２５番目の部位（それぞれアミノ酸残基チロシン及びイソロイシン）がＢｐｈＡの基質特異性決定に重要であると考え、この部位にランダムな変異を導入し、その中からフラボン類化合物の変換に優れた変異株として、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）のアミノ酸配列の３２４番目及び３２５番目のアミノ酸がアラニン及びロイシン残基に変化した［ｂｐｈＡ１（１−２２）］と、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸がロイシン及びイソロイシン残基に変化した［ｂｐｈＡ１（２−２）］を獲得し、またこれらの改変型ｂｐｈＡ１によりコードされる芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットを他のサブユニット（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４）及びＢｐｈＢと共に発現させたところ、フラボン類のフェニル基に水酸基を導入することができることを確認した。
【００２８】
従って、本発明に係る改変型ＢｐｈＡ１は、公知のＢｐｈＡ１のアミノ酸配列において、ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）のアミノ酸配列の３２４番目及び３２５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸を、それぞれアラニン及びイソロイシンに改変するか、又はそれぞれロイシン及びイソロイシンに改変することにより、作製することができる。
【００２９】
公知のＢｐｈＡ１としては、限定されるものではないが、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７由来のＢｐｈＡ１、ブルクホルデリア属ＬＢ４００株由来のＢｐｈＡ１、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１とブルクホルデリア属ＬＢ４００株のｂｐｈＡ１間でＤＮＡシャフリングを行って得られたｂｐｈＡ１遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）］によりコードされるＢｐｈＡ１によりコードされるＢｐｈＡ１（ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ０８５７４８）、シュードモナス・プチダＫＦ７１５株由来のｂｐｈＡ１遺伝子を中央部分に持ち、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１遺伝子を両端に持つハイブリッドｂｐｈＡ１遺伝子［ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）］によりコードされるＢｐｈＡ１（特許文献３）などが挙げられる。
【００３０】
また、本明細書において例示する配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有する限り、当該アミノ酸配列において、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸以外の複数個、好ましくは１若しくは２個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性とは、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが有する、芳香環ジオキシゲナーゼ酵素における主要構成タンパク質として、基質認識とその酸素添加反応を担う機能を有することを指す。この機能は、芳香環ジオキシゲナーゼの他のサブユニットをコードする遺伝子（ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４、又はｂｐｈＥＦＧ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｂｐｈＢ）と共に微生物内で共発現させ、基質の生変換実験を行うことによって確認することができる。
【００３１】
例えば、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列の１〜２個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列の１〜２個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するタンパク質に含まれる。ただし、配列番号２又は４における３２４番目及び３２５番目のアミノ酸は当該変異を含むものではない。
【００３２】
改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）を構成する改変型ＢｐｈＡ１以外の要素は、ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４あるいは微生物によってはＢｐｈＥＦＧであるが、これらは当技術分野で公知の任意のものを用いることができる。芳香環ジオキシゲナーゼのサブユニット（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４あるいはＢｐｈＥＦＧ）は、天然にこの酵素を産生する微生物、又は該酵素をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる。あるいは、該酵素の変異体又は分子進化工学的手法による改変体をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる（特許文献３等）。例えば、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株の小サブユニット（ＢｐｈＡ２）、フェレドキシン（ＢｐｈＡ３）、及びフェレドキシンレダクターゼ（ＢｐｈＡ４）のアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３に示されている。また、バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）ＬＢ４００株の小サブユニット（ＢｐｈＥ）、フェレドキシン（ＢｐｈＦ）、及びフェレドキシンレダクターゼ（ＢｐｈＧ）のアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８６３４８に示されている。
【００３３】
（２）ＢｐｈＢ（ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ）
ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）は、天然に該酵素を産生する微生物、又は該酵素をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる。あるいは、該酵素の変異体又は分子進化工学的手法による改変体をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる。例えば限定されるものではないが、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のＢｐｈＢのアミノ酸配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３に示されている。また、バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）ＬＢ４００株のシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のＢｐｈＢのアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８６３４８に示されている。
【００３４】
（３）改変型ＢｐｈＡ又はＢｐｈＢをコードする遺伝子
上述した改変型芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子（改変型ｂｐｈＡ）は、改変型ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、及びｂｐｈＡ４、又は改変型ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＥ、ｂｐｈＦ、及びｂｐｈＧからなり、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はｂｐｈＢからなる。
【００３５】
改変型ｂｐｈＡ遺伝子は、限定されるものではないが、その大サブユニット（ＢｐｈＡ１）をコードする遺伝子がｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子（配列番号１）及びｂｐｈＡ１（２−２）遺伝子（配列番号３）であることが好ましい。すなわち、改変型ｂｐｈＡ１遺伝子は、公知のＢｐｈＡ１のアミノ酸配列において３２４番目及び３２５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がそれぞれアラニン及びイソロイシンであるか又はそれぞれロイシン及びイソロイシンであるアミノ酸配列をコードするように改変されたものである。
【００３６】
その他の遺伝子（すなわちｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、ｂｐｈＡ４及びｂｐｈＢ、あるいはｂｐｈＥ、ｂｐｈＦ、及びｂｐｈＧ）は、これらの遺伝子を天然に有する微生物に由来するものだけでなく、例えば、それらの自然に若しくは人為的に生じた変異体をコードする遺伝子、又はそれらの遺伝子間でＤＮＡシャフリング等の分子進化工学的手法を施して得られる改変体をコードする遺伝子を含む。
【００３７】
使用可能な遺伝子としては、たとえばシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来のｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、ｂｐｈＡ４、及びｂｐｈＢ遺伝子、あるいはバークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）LB４００株由来のｂｐｈE、ｂｐｈＦ、ｂｐｈＧ及びｂｐｈＢ遺伝子が挙げられる。ＫＦ７０７株のｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、ｂｐｈＡ４、ｂｐｈＢ遺伝子の塩基配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３に示されている。また、バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）ＬＢ４００株由来のｂｐｈＥ、ｂｐｈＦ、ｂｐｈＧ及びｂｐｈＢ遺伝子の塩基配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６４８に示されている。
【００３８】
また、上述した芳香環ジオキシゲナーゼ又はジヒドロジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、部位特異的突然変異誘発法等によって変異が導入され、かつ上記機能又は活性を有する変異体であってもよい。なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A.L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A.,Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001、及び、Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene, 212, 221-228, 1998を参照されたい。
【００３９】
変異を有する核酸により作製される組換えタンパク質が目的の機能（すなわち芳香環分解系酵素活性）を有するか否かは、上述したように当技術分野で公知の方法により、変異核酸を形質転換体において発現させ、得られる組換えタンパク質を用いて基質の生変換実験を行うことによって確認することができる。なお、フラボン類を水酸化する活性を保持するために、改変型ＢｐｈＡ１をコードする改変型ｂｐｈＡ１遺伝子は、それによりコードされるアミノ酸配列における３２４番目及び３２５番目のアミノ酸がそれぞれアラニン及びイソロイシンとなるか又はそれぞれロイシン及びイソロイシンとなるアミノ酸配列をコードするように、上記変異を導入する。
【００４０】
さらに、上記塩基配列からなる核酸の全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット若しくは芳香環ジオキシゲナーゼサブユニットの活性、又はジヒドロジオールデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸も本発明において用いることができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。このようなハイブリダイゼーション条件は当技術分野で公知であり、例えばSambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989などに記載されている。
【００４１】
なお、上記の芳香環分解系酵素をコードする遺伝子群（ｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４遺伝子又はｂｐｈＡ１ＥＦＧ遺伝子、及びｂｐｈＢ遺伝子）は通常、ゲノムＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ内において、隣接するかごく近傍に存在しているので、いずれか一つの遺伝子の配列を含むクローン、たとえばコスミドクローン等をコロニーハイブリダイゼーション法等により単離すれば、簡単に他の遺伝子も一緒に単離することができる場合が多い。
【００４２】
しかしながら、同様の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は多数報告され、当業者には周知であるため、本発明はこれらの遺伝子配列を有する組換え微生物から産生される酵素を利用するものに限定されるものではない。
【００４３】
２．微生物における芳香環分解系酵素の発現
本発明では、改変型芳香環ジオキシゲナーセ遺伝子（改変型ｂｐｈＡ）とジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＢ）とを発現し、フラボン類化合物を水酸化することができる微生物を作製し、該微生物又は該微生物により産生される酵素をフラボン類化合物の水酸化に用いることができる。
【００４４】
具体的には、例えば、上述した改変型ｂｐｈＡ１遺伝子を、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３及びＢｐｈＡ４（又はＢｐｈＥ、ＢｐｈＦ及びＢｐｈＧ）の全部又は一部を発現する微生物、またさらにＢｐｈＢを発現する微生物に導入し、該微生物においてこれらのポリペプチドを発現させることができる。あるいは、上述した改変型ｂｐｈＡ１遺伝子を、ｂｐｈＡ２遺伝子、ｂｐｈＡ３遺伝子、ｂｐｈＡ４遺伝子、及びｂｐｈＢ遺伝子と共に、又はｂｐｈＥ遺伝子、ｂｐｈＦ遺伝子、ｂｐｈＧ遺伝子、及びｂｐｈＢ遺伝子と共に微生物に導入し、該微生物においてこれらのポリペプチドを発現させることができる。従って、改変型ＢｐｈＡ及びＢｐｈＢが発現される限り、微生物が天然に有するポリペプチドを利用してもよいし、微生物にこれらの遺伝子を導入してポリペプチドを発現させてもよい。
【００４５】
目的の遺伝子を微生物に導入し、発現させる方法は当技術分野で公知である。本発明の一実施形態においては、改変型ｂｐｈＡ１遺伝子を含む組換えベクターを用いて微生物を形質転換する。また別の実施形態においては、改変型ｂｐｈＡ１遺伝子と他の遺伝子（ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はｂｐｈＥＦＧ、さらにｂｐｈＢ遺伝子）を含む組換えベクターを用いて形質転換する。さらに別の実施形態においては、改変型ｂｐｈＡ１遺伝子を含む組換えベクターと他の遺伝子を含む組換えベクターを用いて微生物を共形質転換する。目的のポリペプチドを発現する微生物を作製する限り、組換えベクターに含まれる遺伝子の種類、形質転換の順序などは特に限定されるものではない。
【００４６】
本発明において使用する組換えベクターは、適当なベクターに上記遺伝子、例えば改変型ｂｐｈＡ１を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主微生物中で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、ファージミドなどが挙げられ、直鎖状であっても環状であってもよい。また、シャトルベクターを用いることもできる。
【００４７】
プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばｐＫ４、ｐＲＫ４０１、ｐＲＦ３１等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。
【００４８】
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製された遺伝子を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００４９】
遺伝子は、目的のポリペプチドが発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明において使用するベクターには、プロモーター、目的の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、選択マーカーなどを連結することができる。プロモーターは、大腸菌等の宿主微生物中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。
【００５０】
例えば、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４−ｂｐｈＢ−ｂｐｈＣ遺伝子群を発現するプラスミドｐＪＨＦ１８（Hirose, J., Auyama, A., Hayashida, S., Furukawa, K., Gene, 128, 27-33, 1994）、又はｂｐｈＡ１（７１５−７０７）とｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４、並びにｂｐｈＢ及びｂｐｈＣを発現するプラスミドｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ（特許文献３）におけるｂｐｈＡ１遺伝子を本発明の改変型ｂｐｈＡ１で置き換え、また任意によりｂｐｈＣ遺伝子を除去することにより作製することができる。また例えば、大腸菌ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫを用いて、ｂｐｈＡ（１−２２）ｂｐｈＢ遺伝子やｂｐｈＡ（２−２）ｂｐｈＢ遺伝子の発現にはｌａｃプロモーターを利用することができる。
【００５１】
微生物の形質転換は、上記組換えベクターを、目的とするポリペプチドが発現し得るように宿主微生物中に導入することにより行うことができる。ここで、宿主微生物としては、特に限定されるものではなく、例えば、エッシェリヒア属に属する微生物、好ましくは大腸菌（E. coli）、並びに天然に芳香環分解系酵素を発現することが知られているシュードモナス（Pseudomonas）属、コマモナス（Comamonas）属、ブルクホルデリア（Burkholderia）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、及びラルストニア（Ralstonia）属等に属する微生物を挙げることができる。具体的な微生物の例としては、大腸菌ＪＭ１０９株、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonaspseudoalcaligenes）、例えばシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株（非特許文献１）、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）、ブルクホルテリア（Burkholderia）属ＬＢ４００株（Erickson,B.D., Mondello,F.J.,Nucleotide sequencing and transcriptional mapping of the genes encoding biphenyl dioxgenase, a multicomponent polychlorinated-biphenyl-degrading enzyme in Pseudomonas strain LB400. J. Bacteriol., 174, 2903-2912, 1992）、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonasaromaticivorans）、ロドコッカス・グロベルラス（Rodococcus globerulus）、ラルストニア・オキサラティカ（Ralstoniaoxalatica）等を挙げることができる。また、放線菌であるストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌においても、上記遺伝子を導入・発現させることも可能であり、そのような形質転換した組換え微生物も用いることができる（Chun,H.K.,Ohnishi,Y.,Shindo,K.,Misawa,N.,Furukawa, K., Horinouchi, S., Biotransformation of flavone and flavanone by Streptomycelividans cells carrying shuffled biphenyl dioxygenase genes. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic, 21, 113-121, 2003）。これらの微生物は、ＡＴＣＣやＤＳＭＺ等のカルチャーコレクションから入手可能である。ただし、本発明で利用可能な微生物は上記のものに限定されず、目的のポリペプチドを発現させることができる微生物であればどのようなものでも利用することができる。
【００５２】
外来遺伝子を微生物に導入・発現する方法は常法により行うことができる（例えば、Sambrook,J.,Russell, D. W., "Molecular cloning -A laboratory manual", Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。例えば、微生物への組換えベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。形質転換体の選択もまた、当技術分野で公知の方法、例えば薬剤耐性遺伝子を利用した選択等を用いて行うことができる。
【００５３】
以上のようにして得られる微生物は、フラボン類化合物を水酸化する芳香環分解系酵素を生成するものであるため、かかる酵素の製造や、それ自体を水酸化フラボン類化合物の製造において使用することができる。
【００５４】
３．芳香環分解系酵素の単離及び精製
本発明においては、後述する変換反応のために、芳香環分解系酵素（改変型ＢｐｈＡ及びＢｐｈＢ）を生成する微生物から当該酵素群を単離及び精製し、それを使用することができる。
【００５５】
芳香環分解系酵素は、それをコードする遺伝子を保有する前記微生物を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の微生物を培地で培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００５６】
細菌等の微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５７】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類、そしてジベンゾフラン、ゲンチジン酸、サリチル酸等の芳香族炭化水素が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、又はその他の含窒素化合物が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００５８】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２０〜４０℃で行う。培養期間中、ｐＨは約５〜９に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５９】
培養後、目的の芳香環分解系酵素群のタンパク質（改変型ＢｐｈＡ及びＢｐｈＢ）が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより当該タンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。
【００６０】
目的のタンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。さらに、目的タンパク質の理化学的性質又は機能を調べるため、種々の試験を行うことができる。試験項目としては、Ｘ線結晶解析、ＣＤスペクトル解析、ＮＭＲ解析等が挙げられる。
【００６１】
４．フラボン類化合物の変換
本発明においては、上記改変型芳香環ジヒドロゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）を用いて、フラボン類化合物を水酸化することができる。
【００６２】
さらに、上述の組換え微生物から、必要な酵素を産生させて、それらを用いてフラボン類化合物の変換を行うことも容易である。すなわち、本発明は、組換え微生物と変換対象のフラボン類基質との混合培養により水酸化フラボン類化合物を製造するだけでなく、該組み換え微生物又は相当遺伝子を有する非組換え微生物が産生する酵素を抽出し、その抽出酵素を用いて水酸化フラボン類化合物を製造することもできる。
【００６３】
従って、本発明においては、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）、これらの酵素を生成する微生物、又は該微生物の培養物の少なくとも１つを、フラボン類化合物を含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から水酸化されたフラボン類化合物を得るものである。
【００６４】
ここで変換反応の基質として用いられる「フラボン類化合物」とは、フラボン骨格を有する化合物及びそれから誘導される化合物群であり、具体的にはフラボン、イソフラボン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラボン、５，７−ジヒドロキシフラボン（クリシン）；フラバノン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシフラバノン；環化炭化水素基とフェニル環がビフェニル結合した化合物（１−フェニルナフタレン、２−フェニルナフタレン）；芳香環とフェニル基の間に置換若しくは非置換アルケニレン基（好ましくは炭素数３の置換アルケニレン基）を有する化合物（（トランス−）カルコン、カルコン、ジヒドロカルコン）などが挙げられる。本発明において基質として使用可能なフラボン類化合物は、窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群から選択される１以上の異種原子を環原子として含んでなる単環式又は二環式の環状基を有していてもよく、置換基により置換されていてもよい。また、アルケニレン基としては、例えば、ビニレン基、１−プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基等が挙げられる。
【００６５】
本発明において特に好適に用いられるフラボン類化合物（基質）としては、限定されるものではないが、フラボン、カルコン、７−ヒドロキシフラボン、クリシン、フラバノン、６−ヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシフラバノン、１−フェニルナフタレン、２−フェニルナフタレンが挙げられる。
【００６６】
本発明においては、基質として上記フラボン類化合物と、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）とを反応させるか、又はこれらの酵素を産生する微生物と培養するか若しくはその培養物と反応させることにより、フラボン類化合物が有するフェニル基（ベンゼン環）に水酸基が導入された化合物に変換することができる。特に本発明により、フラボン類化合物が有するフェニル基（ベンゼン環）の２つの位置、好ましくは２位及び３位に水酸基が導入されたジオール体に変換することができる。
【００６７】
具体的には、図１に示されるように、本発明の方法により、フラボン類化合物であるカルコン、７−ヒドロキシフラボン及びクリシンより、それぞれ式Ｉ〜ＶＩにより表わされる化合物１〜４を得ることができる。このうち化合物２は新規物質である。また、式ＩＩ〜ＶＩにより表わされる化合物２〜４は、実施例３に示されるように抗酸化活性を有するものである。従って、これらの化合物２〜４を含む組成物は、抗酸化剤として使用することができる。
【００６８】
フラボン類化合物と、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）（又は、これらの酵素を含む破砕微生物、微生物培養液、粗酵素、精製酵素等）との反応、あるいは上記３つの酵素を産生する微生物とともに培養する方法は、通常の酵素反応又は培養方法と同様にして常法により行うことができる。
【００６９】
例えば、上記フラボン類化合物と、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）との反応は、フラボン類化合物を含む溶液に、改変型ＢｐｈＡ及びＢｐｈＢを混合し、酵素反応に適切な温度にて一定時間にわたってインキュベートすることにより、フラボン類化合物を変換することができる。
また例えば、上記フラボン類化合物とともに、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）を産生する微生物を培養する方法は以下のようにして行うことができる。
【００７０】
微生物を培養する培地としては通常、該微生物が生育し得る培地であれば良く、具体的には、ＬＢ培地、Ｍ９培地、ＫＢ培地、ＹＭ培地、ＫＹ培地、Ｆ１０１培地、等が例示される。
【００７１】
炭素源としては菌体が資化し生育できる炭素化合物であればいずれでも使用可能である。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
【００７２】
培養は、通常、温度２０〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃であり、ｐＨは５〜９が好ましい。また、適宜、振盤培養や回転培養としてもよい。培養終了後、培養液を遠心分離機にかけ、上清を回収し、上清液を酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出する。
【００７３】
上記混合物又は培養物から水酸化フラボン類化合物を精製するには、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００７４】
本発明の方法により、フラボン類化合物、特にこれまで変換が困難であった７−ヒドロキシフラボン、５，７−ジヒドロキシフラボン（クリシン）、１−フェニルナフタレン等のフラボン類化合物を、効率よく水酸化フラボン類化合物に変換することができる。また、本発明の方法では、フラボン類化合物のフェニル基（ベンゼン環）における２位及び３位に特異的に水酸基を導入することができる。このようにして製造される水酸化フラボン類化合物（ジオール体）は、医薬品、農薬を始めとする種々の工業製品の原料として用いることができる。
【００７５】
またさらに、以上のように変換された水酸化フラボン類化合物（ジオール体）は、芳香環分解系酵素であるＢｐｈＣによりピコリン酸化合物へ、また芳香環分解系酵素であるＢｐｈＣ及びＢｐｈＤによりカルボン酸化合物にまで変換することができる。
【００７６】
以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００７７】
ここで用いられた通常の遺伝子組換え実験は、特に言及されていない場合は、標準的な方法（Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., "Molecular cloning -A laboratory manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に基づいている。
【実施例１】
【００７８】
本実施例においては、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ［ｂｐｈＡ（１−２２）］／芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ同時発現用プラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ、及び改変型芳香環ジオキシゲナーゼ［ｂｐｈＡ（２−２）］／芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ同時発現用プラスミドｐＢＰＡ（２−２）Ｂを作製した。
【００７９】
本発明者らは以前にシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）とシュードモナス・プチダＫＦ７１５株由来のＢｐｈＡ１とのハイブリッドＢｐｈＡ１であるＢｐｈＡ１（７１５−７０７）を、カセットＰＣＲと呼ばれる手法（特開２０００−１２５８７１号公報）を用いて作製した。本発明者らはこのＢｐｈＡ１（７１５−７０７）及びＫＦ７０７株由来ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４−ｂｐｈＢ−ｂｐｈＣ遺伝子群［ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子］を発現するプラスミドｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣを作製し、このプラスミドが導入された大腸菌ＪＭ１０９株を用いて種々のバイオコンバージョン実験を行なっており、その結果は、特許文献３に開示しているようにピコリン酸の生成が確認された。
【００８０】
ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）はＫＦ７０７株由来ＢｐｈＡ１と比して幅広い基質特異性を有する。ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）はＫＦ７０７株由来ＢｐｈＡ１とは３２４−３２５番目の２つのアミノ酸残基が異なっており、ＫＦ７０７株由来のものがセリン残基−バリン残基であるところがスレオニン残基−イソロイシン残基となっている。
【００８１】
そこで、本実施例においては、ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）を基に、より広い基質特異性の獲得を目指し、３２４−３２５番目の２つのアミノ酸残基をランダムに置換した変異株を作製した。ランダムな変異の導入はＢｐｈＡ１（７１５−７０７）をコードする遺伝子を鋳型に用い、３２４−３２５番目のアミノ酸残基をコードするコドン部分をランダムに置換した遺伝子ライブラリをＰＣＲにより作製した。まず、プライマーとして７１５ＴＩＮＮＫ−Ｆ（配列番号７）及びＢｐｈＡ１ＢｇｌＩＩＲ（配列番号６）を用いたＰＣＲ、及び、プライマーとしてＢｐｈＡ１ＳａｃＩＦ（配列番号５）及び７１５ＴＩＮＮＫ−Ｒ（配列番号８）を用いたＰＣＲをそれぞれ行い、増幅産物（それぞれのＰＣＲについて約１０ｋｂ、約５ｋｂ）をアガロースゲル電気泳動で分離、精製した。
【００８２】
使用したプライマーの配列は以下の通りである：
BphA1SacIF: 5'- CCGAATTCAAGGAGACGTTGAATCATGAGCTCAGC -3'（配列番号５）
BphA1BglIIR: 5'- TTGAATTCTTCCGGTTGACAGATCT-3'（配列番号６）
715TINNK-F： 5'-GCATGTTCGGCCAGCACATGNNKNNKTTCCCGACCTGTTC -3'（配列番号７）
715TINNK-R： 5'-CATGTGCTGGCCGAACATGC -3'（配列番号８）
【００８３】
ＢｐｈＡ１ＳａｃＩＦ（配列番号５）及びＢｐｈＡ１ＢｇｌＩＩＲ（配列番号６）はそれぞれＢｐｈＡ１（７１５−７０７）のＮ末端付近、Ｃ末端付近及びその外側の部位を含む配列をコードしている。ＢｐｈＡ１ＳａｃＩＦ（配列番号５）にはＳａｃＩ部位が、ＢｐｈＡ１ＢｇｌＩＩＲ（配列番号６）にはＢｇｌＩＩ部位があり、両側にさらにＥｃｏＲＩ部位が付与されている（いずれも、アンダーラインで示されている）。
【００８４】
７１５ＴＩＮＮＫ−Ｆ（配列番号７）の配列における下線部はＢｐｈＡ１（７１５−７０７）の３２４−３２５番目のアミノ酸残基の位置にあたり、ランダムコドンの混合（ＮＮＫ；ＮはＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの等量混合、ＫはＧ，Ｔの等量混合を示す）を２つ連結したものになっている。
【００８５】
ＰＣＲの条件は約１０ｋｂ、約５ｋｂの増幅ともに同じで、９４℃１分、６１℃１分、７２℃１分３０秒で、３０サイクル行い、ＫＯＤ Ｄａｓｈポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、それぞれ約１０ｋｂ、約５ｋｂのバンドを切り出して精製した。次にこれら２種の遺伝子断片を混合し、さらにプライマーＢｐｈＡ１ＳａｃＩＦ（配列番号５）及びＢｐｈＡ１ＢｇｌＩＩＲ（配列番号６）を加えてＰＣＲを行い、ｂｐｈＡ１全長約１．５ｋｂにあたる増幅産物を得た。ＰＣＲの反応条件は約１０ｋｂ、約５ｋｂの増幅の場合と同じである。増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、約１．５ｋｂのバンドを切り出して精製し、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）変異株ライブラリとした。
【００８６】
Ｐ．プソイドアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４−ｂｐｈＢ−ｂｐｈＣ遺伝子群（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８３６７３に登録されている）を含む発現プラスミドｐＪＨＦ１８（Hirose, J., Auyama, A., Hayashida, S., Furukawa, K., Gene, 128, 27-33, 1994）を有する大腸菌は、メタ開裂まで反応が進むので、ビフェニルを基質とした場合はメタ開裂産物として、２−ヒドロキシ−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸（2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid）を生成すると考えられている。一般に、メタ開裂産物は黄色を呈するので、４３４ｍｍ付近の波長でモニターすることが可能である。
【００８７】
プラスミドｐＪＨＦ１８において、１ヵ所のＭｌｕＩ部位がｂｐｈＡ１内にあるので、ＭｌｕＩで消化、平滑末端処理後、再度ライゲーションを行うことにより、ｂｐｈＡ１のみを破壊したプラスミドｐＪＨＦ１８ΔＭ１ｕＩを作製した（T.Kumamaru,H.Suenaga,M.Mitsuoka, T. Watanabe, K. Furukawa, Nature Biotechnology, 16, 663-666, 1998）。
【００８８】
次に、ＰＪＨＦ１８ΔＭ１ｕＩをＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩで二重消化により、ΔｂｐｈＡ１遺伝子をのみを含む１．３９ｋｂ断片を除き、代わりに、上記で作製したｂｐｈＡ１（７１５−７０７）変異株ライブラリ（ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩで二重消化後のもの）を挿入し、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子ライブラリ（ｂｐｈＡ１変異ライブラリ：：ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子）とｂｐｈＢｂｐｈＣ遺伝子を含むプラスミドを得た。
【００８９】
このプラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９にビフェニル蒸気を充て、メタ開裂により黄色を呈することができるコロニーを選抜した。メタ開裂により黄色を呈することができるコロニーにおいては、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）変異株遺伝子が正常に機能できることを意味している。
【００９０】
ビフェニル蒸気により黄色を呈することができた大腸菌形質転換体２００個を用い、２次スクリーニングを実施した。２次スクリーニングは基質として１−フェニルナフタレン及び２−フェニルナフタレンのいずれかを混合した寒天培地上に変異体コロニーを生育させ、メタ開裂産物の呈色の確認により行った。１−フェニルナフタレン及び２−フェニルナフタレンに対するメタ開裂の分解効率が共に高いことを指標に選択した結果、５個の変異体が見いだされた。それらの内２種類（この大腸菌に含まれるプラスミドをそれぞれｐＳＨＦ１−２２ＡＢＣ及びｐＳＨＦ２−２ＡＢＣと命名）はＫＦ７０７由来のｂｐｈＡ１遺伝子やｂｐｈＡ１（７１５−７０７）を持つものが分解できない７−ヒドロキシフラボンや５，７−ジヒドロキシフラボンをもメタ開裂により分解することができた。
【００９１】
このプラスミドｐＳＨＦ１−２２ＡＢＣ及びｐＳＨＦ２−２ＡＢＣ由来のｂｐｈＡ１（７１５−７０７）変異株遺伝子を以後、それぞれｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子及びｂｐｈＡ１（２−２）と呼ぶ。
【００９２】
ｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子の配列を解析したところ、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）を基に変異を加えた３２４−３２５番目の２つのアミノ酸残基が、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）のものがスレオニン残基−イソロイシン残基であるところがアラニン残基−ロイシン残基となっていた。また、ｂｐｈＡ１（２−２）遺伝子の配列を解析したところ、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）を基に変異を加えた３２４−３２５番目の２つのアミノ酸残基が、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）のものがスレオニン残基−イソロイシン残基であるところがロイシン残基−イソロイシン残基となっていた。ｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子及びｂｐｈＡ１（２−２）遺伝子の配列をそれぞれ配列番号１及び３に示す。
【００９３】
また、このｐＳＨＦ１−２２ＡＢＣ及びｐＳＨＦ２−２ＡＢＣからｂｐｈＣのみを除いて、ｂｐｈＡ１（１−２２）ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４ｂｐｈＢ遺伝子を発現するプラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ及びｂｐｈＡ１（２−２）ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４ｂｐｈＢ遺伝子を発現するプラスミドｐＢＰＡ（２−２）Ｂを作製した。
【実施例２】
【００９４】
本実施例においては、実施例１において作製した改変遺伝子を用いて変換実験を行い、また得られた変換産物の同定及び精製を行った。
【００９５】
（１）変換実験
実施例１において作製したプラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ又はｐＢＰＡ（２−２）Ｂを有する大腸菌ＪＭ１０９と、実施例１で変換が確認された基質の混合培養液７００ｍｌ〜１４００ｍｌに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを７，０００ｒｐｍにて１０分遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下３００ｍｌ〜５００ｍｌまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキスを得た。エキスをシリカゲル［０．２５ｎｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）］を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけ、変換産物の確認を行った後、シリカゲルカラム［２０×２５０ｍｍ，Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）］を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、純品を得た。
【００９６】
なお、各基質におけるＴＬＣの展開溶媒は以下の通りである：
カルコン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）；７−ヒドロキシフラボン，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１０：１）；クリシン，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）
また、各基質におけるカラムクロマトグラフィーの展開溶媒は以下の通りである：
カルコン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３：１）；７−ヒドロキシフラボン，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１５：１）；クリシン，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）
【００９７】
（２）カルコン（chalcon）の変換産物の同定
プラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ又はｐＢＰＡ（２−２）Ｂを有する大腸菌ＪＭ１０９によりそれぞれ［（トランス−）カルコン］の変換実験を行った粗抽出物（１０５．８ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、両方についてＲｆ値０．２及びＲｆ値０．１の産物が生成していることが判明した。両産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１（２７．６ｍｇ）及び化合物２（５．２ｍｇ）の純品を得た。
【００９８】
化合物１は標準品とのＴＬＣ及びＨＰＬＣによる直接比較により、３−（２，３）ジヒドロキシフェニル）−１−フェニルプロパン−１−オン（3-(2,3-dihydroxyphenyl)-1-phenylpropan-1-one）（図１）と同定した。
【００９９】
化合物２の分子式は、ＡＰＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ２５８（Ｍ＋）），１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲよりＣ１５Ｈ１４Ｏ４と決定された。得られた分子式及び化合物２の１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲより、化合物２はカルコンのＡ環及びＢ環に２個ずつ、計４個のフェノール性水酸基が導入された化合物であることが示唆された。また化合物のＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいて３つの連続したｓｐ２ビシナルスピン結合が２組（δ７．０２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）−δ６．７４（δ，Ｊ＝７．９，８．０Ｈｚ）−δ７．３６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）及びδ６．５６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）−δ６．５２（δ，Ｊ＝７．０，７．３Ｈｚ）−δ６．６３（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ））が観測されたことから、化合物２はＡ環の５，６位、及びＢ環の１’，２’’位に４つのフェノール性水酸基が導入された物質であると決定された。
【０１００】
以上の結果より、化合物２は１，３−ビス−（２，３−ジヒドロキシ−フェニル）−プロパン−１−オン（1,3-bis-(2,3-dihydroxy-phenyl)-propan-1-one）（図１）と同定した。化合物２は新規化合物であった。化合物２のＮＭＲデータを以下に記す。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
（３）７−ヒドロキシフラボン（7-hydroxyflavone）の変換産物の同定
プラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ又はｐＢＰＡ（２−２）Ｂを有する大腸菌ＪＭ１０９によりそれぞれ７−ヒドロキシフラボンの変換実験を行った粗抽出物（９３．２ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、両方についてＲｆ値０．５の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物３（４．５ｍｇ）の純品を得た。
【０１０３】
化合物３の分子式は、ＡＰＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ２７０（Ｍ＋）），１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲよりＣ１５Ｈ１０Ｏ５と決定された。得られた分子式及び化合物３の１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲより、化合物３は７−ヒドロキシフラボンに２個のフェノール性水酸基が導入された化合物であることが示唆された。また化合物のＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいて３つの連続したｓｐ２ビシナルスピン結合（δ７．２９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）−δ８．８０（δ，Ｊ＝７．４，８．５Ｈｚ）−δ６．９５（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）が観測されることから、２つのフェノール性水酸基はＢ環の１’，２’’位に導入されたことが明らかとなった。
【０１０４】
以上の結果より、化合物３は２−（２，３−ジヒドロキシ−フェニル）−７−ヒドロキシ−クロメン−４−オン（2-(2,3-dihydroxy-phenyl)-7-hydroxy-chromen-4-one）（図１）と同定した。
【０１０５】
化合物３はＣＡＳに構造登録のある既知物質であるが、これを芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応により製造できるという報告はない。従って、本発明による化合物３の製造方法は新規かつ有効である。化合物３のＮＭＲデータを以下に記す。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
（４）クリシン（chrysin）の変換産物の同定
プラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ又はｐＢＰＡ（２−２）Ｂを有する大腸菌ＪＭ１０９によりクリシンの変換実験を行った粗抽出物（１２６．３ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、両方についてＲｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。両産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物４（４．２ｍｇ）の純品を得た。
【０１０８】
化合物４の分子式は、ＡＰＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ２８６（Ｍ＋）），１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲよりＣ１５Ｈ１０Ｏ６と決定された。得られた分子式及び化合物４の１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲより、化合物４はｃｈｒｙｓｉｎに２個のフェノール性水酸基が導入された化合物であることが示唆された。また化合物のＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいて３つの連続したｓｐ２ビシナルスピン結合（δ７．３０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）−δ６．８１（δ，Ｊ＝７．６，８．０Ｈｚ）−δ６．９８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）が観測されることから、２つのフェノール性水酸基はＢ環の１’，２’’位に導入されたことが明らかとなった。
【０１０９】
以上の結果より、化合物４は２−（２，３−ジヒドロキシ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−クロメン−４−オン（2-(2,3-dihydroxy-phenyl)-5,7-dihydroxy-chromen-4-one）（図１）と同定した。
【０１１０】
化合物４はＣＡＳに構造登録のある既知物質であるが、これを芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、本発明による化合物４の製造方法は新規かつ有効である。化合物４のＮＭＲデータを以下に記す。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
（５）その他の変換物（２０７２ＡＢ変換と同一化合物）
（５−１）フラバノン（Flavanone）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）Ｒｆ０．６
酢酸エチル抽出物重量 ２１２．１ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）６８．６ｍｇ
【０１１３】
（５−２）６−ＯＨフラボン（6-OH Flavone）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１０：１）Ｒｆ０．３
酢酸エチル抽出物重量 ７７．０ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１０：１）２０．３ｍｇ
【０１１４】
（５−３）６−ＯＨフラバノン（6-OH Flavanone）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）Ｒｆ０．３
酢酸エチル抽出物重量 １５５．９ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）６０．３ｍｇ
【０１１５】
（５−４）７−ＯＨフラバノン（7-OH Flavanone）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）Ｒｆ０．５
酢酸エチル抽出物重量 １４９．３ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）３１．５ｍｇ
【０１１６】
（５−５）１−フェニルナフタレン（1-phenylnaphthalene）（ｂｐｈＡでの変換、２０７２Ａと同一変換物）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（５０：１）Ｒｆ０．３
酢酸エチル抽出物重量 １１４．９ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（５０：１）６０．９ｍｇ
【０１１７】
（５−６）２−フェニルナフタレン（2-phenylnaphthalene）（ｂｐｈＡでの変換、２０７２Ａと同一変換物）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（５０：１）Ｒｆ０．２
酢酸エチル抽出物重量 １１４．９ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（５０：１）６５．５ｍｇ
【０１１８】
（５−７）ナリンゲニン（Naringenin）
変換反応進行せず。
【実施例３】
【０１１９】
抗酸化活性
活性酸素により最も傷害を受ける生体成分は脂質（特に極性脂質）である。ラット脳組織は極性脂質に富み、また活性酸素の反応に関与する酸化還元酵素系も含むため、活性酸素の生体脂質への傷害（動脈硬化の原因）を検討するのに優れた材料である。
【０１２０】
そこで変換化合物である化合物２〜４の脳脂質過酸化抑制作用をＴＢＡ（チオバルビツール酸）法にて検討した。本法は、K. Shindo, Y. Kagiyama, R. Nakamura, A. Hara, H. Ikenaga, K. Furukawa, N. Misawa, J. Mol. Catal. B: Enzym., 23, 9 (2003)に記載されている。化合物２〜４の抗酸化活性を測定した（ラット脳脂質過酸化抑制ＩＣ５０）。簡単に説明すると、ラット脳のホモジネートを用いて、各化合物を加えた際の脂質過酸化抑制作用を測定するものである。
【０１２１】
結果を以下に示す：
化合物２ ０．７μＭ
化合物３ ２．９μＭ
化合物４ ４．８μＭ
上記結果から、化合物２〜４が、抗酸化活性、特に脂質に対する抗酸化活性を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明によれば、既存のフラボン類化合物から水酸化フラボン類化合物（特に水酸基を２つの位置に有するジオール体）を製造する新規な方法が提供される。かかる変換産物は種々の医薬品や農薬等の工業製品を有機化学合成するための原料として提供することができる。また、本発明の方法はフラボン類化合物のフェニル基（ベンゼン環）の２つの位置（２位及び３位）に特異的に水酸基を導入することができ、有機化学合成において有用な反応である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】改変型芳香環ジオキシゲナーゼを用いた変換実験により得られた化合物１〜４の構造（式Ｉ〜ＩＶ）を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号１及び３：合成ポリヌクレオチド
配列番号２及び４：合成ポリペプチド
配列番号５〜８：合成オリゴヌクレオチド
配列番号７におけるＮは任意のヌクレオチドを表わす。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット、それをコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体に関する。また本発明は、上記改変型芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットを用いた水酸化フラボン類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）ＫＦ７０７株は、北九州で単離されたビフェニルやポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）の分解細菌である。この細菌から、芳香環（ビフェニル）の分解酵素遺伝子群が世界で始めて単離された（非特許文献１）。現在では、芳香環分解細菌由来の芳香環分解酵素遺伝子群を用いた研究は、環境浄化関連のニーズから数多くなされており、遺伝子や酵素の構造や機能に関して多くの知見が集積している（たとえば、非特許文献２参照)。最初の４反応の芳香環分解酵素の機能を以下に示す（非特許文献３）。
【０００３】
【化１】
【０００４】
上記の全遺伝子、すなわち、ｂｐｈＡ（ｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４）、ｂｐｈＢ、ｂｐｈＣ、及び、ｂｐｈＤ遺伝子を大腸菌に導入し発現させると、その大腸菌は、芳香環を代謝して安息香酸を作ることができる。
【０００５】
現在までに、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子として、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＡ）を分子進化工学的手法により改変したものを導入・発現させた大腸菌又は放線菌を用いて、種々のフェニル基等を含む芳香族化合物からジヒドロジオール体を作製出来ることが報告されている（下記の非特許文献１、２又は特許文献１参照）。すなわち芳香環やＰＣＢの分解細菌であるシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株から単離された芳香環ジオキシゲナーゼにおける大サブユニット（ＢｐｈＡ１）をコードするＤＮＡを、他の芳香環分解細菌であるブルクホルデリア（Burkholderia）属ＬＢ４００株由来の芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニット（ＢｐｈＡ１）をコードするＤＮＡとの間でＤＮＡシャフリング（DNA shuffling）を行い、変異株の中から基質特異性に優れた変異体として単離したＢｐｈＡ１（２０７２）と、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニット以外の３つの構成要素（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４）からなる改変芳香環ジオキシゲナーゼ（群）により、複素環基とフェニル基を分子内に含む有機低分子化合物の生物変換が可能であることが見い出された（非特許文献４及び５参照）。すなわち、ＤＮＡシャフリングした改変芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４；ｂｐｈＡ（２０７２）］を含む大腸菌が、上記有機低分子化合物を変換し、フェニル基の隣合った位置（置換基が入っている位置を１とすると、２と３の位置）に位置特異的に２つの水酸基と２つの水素が導入された芳香族−シス（ｃｉｓ）−ジヒドロジオール体を立体選択的に生成できることがわかった。この改変芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニット［ＢｐｈＡ１（２０７２）］のアミノ酸配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０８５７４８に示されている。また、ＫＦ７０７株の小サブユニット（ＢｐｈＡ２）、フェレドキシン（ＢｐｈＡ３）、及び、フェレドキシンレダクターゼ（ＢｐｈＡ４）のアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ８３６７３に示されている。さらに、上記のｂｐｈＡ（２０７２）を有する大腸菌により合成された芳香族−シス（ｃｉｓ）−ジヒドロジオール体が、シュードモナス・シュードアルカリゲノスＫＦ７０７株由来の芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）によりジオール体に変換されることも報告されている（特許文献２参照）。このＢｐｈＢのアミノ酸配列もＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ８３６７３に示されている。なお、その次の反応を触媒する芳香環ジオールジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ）及びヒドロラーゼ（ＢｐｈＤ）のアミノ酸配列もそれぞれＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ８３６７３及びＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ８５８５１に示されている。
【０００６】
また、上記ｂｐｈＡ遺伝子とｂｐｈＢ遺伝子及びｂｐｈＣ遺伝子を発現した大腸菌を、フェニル基（ベンゼン環）を分子内に有する有機低分子化合物を合成培地内で混合培養すると、メタ解裂化合物ではなく、ピコリン酸化合物が生成されることも報告されている（特許文献３参照）。
【０００７】
さらに、上記のｂｐｈＡ（２０７２）及びＫＦ７０７株由来の芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＢ）を有する大腸菌によりフラボン、フラバノンや６−ヒドロキシフラボン等の数種類のフラボノイドをジオール体に変換できることも報告されている（非特許文献６参照）。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２６９号公報
【特許文献２】ＷＯ２００４／０７８９８８号パンフレット
【特許文献３】ＷＯ２００５／０８５４３５号パンフレット
【非特許文献１】Furukawa,K., and Miyazaki,T., Cloning of gene cluster encoding biphenyl and chlorobiphenyl degradation in Pseudomonas pseudoalcaligenes. J. Bacteriol., 166, 392-398, 1986
【非特許文献２】Furukawa,K., Engineering dioxygenases for efficient degradation of environmental pollutants, Curr. Opinion Biotechnol.,11,244-249.2000
【非特許文献３】Suenaga,H.,Goto,M., and Furukawa,K., Emergence of multifunctional oxygenase activities by random priming recombination. J. Biol. Chem., 276, 22500-22506, 2001
【非特許文献４】Misawa, N., Shindo, K., Takahashi, H., Suenaga, H., Iguchi, K., Okazaki, H., Harayama, S., and Furukawa, K., Hydroxylation of various molecules including heterocyclic aromatics using recombinant Escherichia coli cells expressing modified biphenyl dioxygenase genes. “Tetrahedron" , 58, 9605-9612, 2002.
【非特許文献５】Shindo, K., Nakamura, R., Chinda, I., Ohnishi, Y. Horinouchi,S., Takahashi, H., Iguchi, K., Harayama, S., Furukawa, K., and Misawa, N., Hydroxylation of ionized aromatics including carboxylic acid or amine using recombinant Streptomyces lividanscells expressing modified biphenyl dioxygenase genes. “Tetrahedron" , 59, 1895-1900, 2003.
【非特許文献６】Shindo, K., Kagiyama, Y., Nakamura, R., Hara, A., Ikenaga, H., Furukawa, K., and Misawa, N., Enzymatic synthesis of novel antioxidant flavonoids by Escherichia coli cells expressing modified metabolic genes involved in biphenyl catabolism.“J. Mol. Catalysis B:Enzymatic”23, 9-16, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、フラボン類化合物のフェニル基（ベンゼン環）の２つの位置（例えば２位及び３位）に水酸基を導入して新規化合物を作製する一般的な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、遺伝子工学的に改変した芳香環（ビフェニル）ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４：ＢｐｈＡ）をコードする遺伝子をジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）をコードする遺伝子と共に導入し発現させた組換え大腸菌と、種々のフラボン類化合物を合成培地内で混合培養すると、フラボン類化合物のジオール体がそれぞれ生成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、３２４番目若しくは３２５番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ａ）と同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチド
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、又は
（ｂ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、３２４番目若しくは３２５番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ａ）と同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチドをコードする核酸
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸、又は
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【００１２】
（４）上記（２）又は（３）の核酸を含む組換えベクター。
（５）上記（４）の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（６）上記（５）の形質転換体を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ１）の製造方法。
【００１３】
（７）さらに芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）をコードする核酸、及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）をコードする核酸を含む、上記（４）の組換えベクター。
【００１４】
（８）上記（１）のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）を発現し、かつ芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）を発現することを特徴とする微生物。
（９）上記（４）又は（７）の組換えベクターで形質転換されたものである、上記（８）の微生物。
（１０）フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換できるものである、上記（８）又は（９）の微生物。
（１１）微生物が大腸菌であることを特徴とする上記（８）〜（１０）のいずれかの微生物。
【００１５】
（１２）上記（８）〜（１１）のいずれかの微生物を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換する活性を有する酵素群の製造方法。
【００１６】
（１３）以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）上記（１）のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）
（ｂ）上記（８）〜（１１）のいずれかの微生物
（ｃ）上記（８）〜（１１）のいずれかの微生物の培養物
の少なくとも１つを、フラボン類化合物を含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から水酸化されたフラボン類化合物を得ることを特徴とする、水酸化フラボン類化合物の製造方法。
（１４）フラボン類化合物が、フラボン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラボン、５，７−ジヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシフラバノン、カルコン、１−フェニルナフタレン、及び２−フェニルナフタレンからなる群より選択される、上記（１３）の方法。
（１５）水酸化フラボン類化合物が、フラボン類化合物のフェニル基の２位及び３位に２つの水酸基が導入されたジオール体である、上記（１３）又は（１４）の方法。
【００１７】
（１６）下記式ＩＩで表わされる化合物。
【００１８】
【化２】
【００１９】
（１７）以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）上記（１）のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）
（ｂ）上記（８）〜（１１）のいずれかの微生物
（ｃ）上記（８）〜（１１）のいずれかの微生物の培養物
の少なくとも１つを、カルコンを含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から上記式ＩＩで表わされる化合物を得ることを特徴とする、式ＩＩで表わされる化合物の製造方法。
（１８）下記式ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶで表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする抗酸化剤。
【００２０】
【化３】
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、既存のフラボン類化合物から水酸化フラボン類化合物（特に水酸基を２つの位置に有するジオール体）を製造する新規な方法が提供される。かかる変換産物は種々の医薬品や農薬等の工業製品を有機化学合成するための原料として提供することができる。また、本発明の方法はフラボン類化合物のフェニル基（ベンゼン環）の２つの位置（２位及び３位）に特異的に水酸基を導入することができ、有機化学合成において有用な反応である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る水酸化フラボン類化合物の製造方法は、フェニル基（ベンゼン環）を有するフラボン類化合物に、本発明に係る芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチドと公知の芳香環分解系酵素とを作用させることにより、そのフェニル基（ベンゼン環）を水酸化して、水酸化フラボン類化合物に変換することを特徴とするものである。
【００２３】
具体的には、本発明に係る芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチド（以下、「改変型ＢｐｈＡ１」ともいう）と芳香環ジオキシゲナーゼの他のサブユニット（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）からなる酵素［改変型ＢｐｈＡ］、及び芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）を、順次作用させて、フェニル基（ベンゼン環）が水酸化されたフラボン類を製造する。
【００２４】
１．芳香環分解系酵素及びそれをコードする遺伝子
本発明では、芳香環（ビフェニル）分解系の最初の酵素、すなわち、芳香環（ビフェニル）ジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ；本明細書中、単に「芳香環ジオキシゲナーゼ」とも記載する）を遺伝子工学的に改変した改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）、及び２番目の酵素ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）の活性を利用している。ＢｐｈＡは４つのサブユニット（ＢｐｈＡ１，ＢｐｈＡ２，ＢｐｈＡ３及びＢｐｈＡ４；又はＢｐｈＡ１，ＢｐｈＥ，ＢｐｈＦ及びＢｐｈＧ）から構成されており、本発明において「改変型芳香環ジオキシゲナーゼ」とは、そのうちの大サブユニット（ＢｐｈＡ１）を遺伝子工学的に改変したものである。
【００２５】
（１）改変型ＢｐｈＡ（芳香環ジオキシゲナーゼ）
本発明において、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）としては、限定されるものではないが、その大サブユニットがＢｐｈＡ１（１−２２）（配列番号２）及びＢｐｈＡ１（２−２）（配列番号４）のものを用いることができる。これらの改変型ＢｐｈＡ１は、限定されるものではないが、それぞれｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子（配列番号１）及びｂｐｈＡ１（２−２）遺伝子（配列番号３）によりコードされる。
【００２６】
ｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子及びｂｐｈＡ１（２−２）遺伝子は、シュードモナス・プチダＫＦ７１５株（Hayase,N.,Taira,K. and Furukawa, K., Pseudomonasputida KF715 bphABCD operon encoding biphenyl and polychlorinated biphenyl degradation: Cloning analysis, and expression in soil bacteria. J. Bacteriol., 172, 1990）から単離したｂｐｈＡ１配列を中央部分に持ち、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７由来のｂｐｈＡ１配列を両端に持つハイブリッドｂｐｈＡ１遺伝子であるｂｐｈＡ１（７１５−７０７）遺伝子を基に、一部のアミノ酸残基に置換を加えたものである。ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）遺伝子は、カセットＰＣＲ法（特開２０００−１２５８７１号公報）を用いてシュードモナス・プチダＫＦ７１５株からｂｐｈＡ１配列を単離し構築したものである（特許文献３）。
【００２７】
本発明者らは、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の３２４番目及び３２５番目の部位（それぞれアミノ酸残基チロシン及びイソロイシン）がＢｐｈＡの基質特異性決定に重要であると考え、この部位にランダムな変異を導入し、その中からフラボン類化合物の変換に優れた変異株として、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）のアミノ酸配列の３２４番目及び３２５番目のアミノ酸がアラニン及びロイシン残基に変化した［ｂｐｈＡ１（１−２２）］と、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸がロイシン及びイソロイシン残基に変化した［ｂｐｈＡ１（２−２）］を獲得し、またこれらの改変型ｂｐｈＡ１によりコードされる芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットを他のサブユニット（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４）及びＢｐｈＢと共に発現させたところ、フラボン類のフェニル基に水酸基を導入することができることを確認した。
【００２８】
従って、本発明に係る改変型ＢｐｈＡ１は、公知のＢｐｈＡ１のアミノ酸配列において、ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）のアミノ酸配列の３２４番目及び３２５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸を、それぞれアラニン及びイソロイシンに改変するか、又はそれぞれロイシン及びイソロイシンに改変することにより、作製することができる。
【００２９】
公知のＢｐｈＡ１としては、限定されるものではないが、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７由来のＢｐｈＡ１、ブルクホルデリア属ＬＢ４００株由来のＢｐｈＡ１、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１とブルクホルデリア属ＬＢ４００株のｂｐｈＡ１間でＤＮＡシャフリングを行って得られたｂｐｈＡ１遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）］によりコードされるＢｐｈＡ１によりコードされるＢｐｈＡ１（ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ０８５７４８）、シュードモナス・プチダＫＦ７１５株由来のｂｐｈＡ１遺伝子を中央部分に持ち、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１遺伝子を両端に持つハイブリッドｂｐｈＡ１遺伝子［ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）］によりコードされるＢｐｈＡ１（特許文献３）などが挙げられる。
【００３０】
また、本明細書において例示する配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有する限り、当該アミノ酸配列において、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸以外の複数個、好ましくは１若しくは２個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性とは、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが有する、芳香環ジオキシゲナーゼ酵素における主要構成タンパク質として、基質認識とその酸素添加反応を担う機能を有することを指す。この機能は、芳香環ジオキシゲナーゼの他のサブユニットをコードする遺伝子（ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４、又はｂｐｈＥＦＧ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｂｐｈＢ）と共に微生物内で共発現させ、基質の生変換実験を行うことによって確認することができる。
【００３１】
例えば、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列の１〜２個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列の１〜２個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するタンパク質に含まれる。ただし、配列番号２又は４における３２４番目及び３２５番目のアミノ酸は当該変異を含むものではない。
【００３２】
改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）を構成する改変型ＢｐｈＡ１以外の要素は、ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４あるいは微生物によってはＢｐｈＥＦＧであるが、これらは当技術分野で公知の任意のものを用いることができる。芳香環ジオキシゲナーゼのサブユニット（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４あるいはＢｐｈＥＦＧ）は、天然にこの酵素を産生する微生物、又は該酵素をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる。あるいは、該酵素の変異体又は分子進化工学的手法による改変体をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる（特許文献３等）。例えば、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株の小サブユニット（ＢｐｈＡ２）、フェレドキシン（ＢｐｈＡ３）、及びフェレドキシンレダクターゼ（ＢｐｈＡ４）のアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３に示されている。また、バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）ＬＢ４００株の小サブユニット（ＢｐｈＥ）、フェレドキシン（ＢｐｈＦ）、及びフェレドキシンレダクターゼ（ＢｐｈＧ）のアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８６３４８に示されている。
【００３３】
（２）ＢｐｈＢ（ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ）
ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）は、天然に該酵素を産生する微生物、又は該酵素をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる。あるいは、該酵素の変異体又は分子進化工学的手法による改変体をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる。例えば限定されるものではないが、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のＢｐｈＢのアミノ酸配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３に示されている。また、バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）ＬＢ４００株のシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のＢｐｈＢのアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８６３４８に示されている。
【００３４】
（３）改変型ＢｐｈＡ又はＢｐｈＢをコードする遺伝子
上述した改変型芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子（改変型ｂｐｈＡ）は、改変型ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、及びｂｐｈＡ４、又は改変型ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＥ、ｂｐｈＦ、及びｂｐｈＧからなり、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はｂｐｈＢからなる。
【００３５】
改変型ｂｐｈＡ遺伝子は、限定されるものではないが、その大サブユニット（ＢｐｈＡ１）をコードする遺伝子がｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子（配列番号１）及びｂｐｈＡ１（２−２）遺伝子（配列番号３）であることが好ましい。すなわち、改変型ｂｐｈＡ１遺伝子は、公知のＢｐｈＡ１のアミノ酸配列において３２４番目及び３２５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がそれぞれアラニン及びイソロイシンであるか又はそれぞれロイシン及びイソロイシンであるアミノ酸配列をコードするように改変されたものである。
【００３６】
その他の遺伝子（すなわちｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、ｂｐｈＡ４及びｂｐｈＢ、あるいはｂｐｈＥ、ｂｐｈＦ、及びｂｐｈＧ）は、これらの遺伝子を天然に有する微生物に由来するものだけでなく、例えば、それらの自然に若しくは人為的に生じた変異体をコードする遺伝子、又はそれらの遺伝子間でＤＮＡシャフリング等の分子進化工学的手法を施して得られる改変体をコードする遺伝子を含む。
【００３７】
使用可能な遺伝子としては、たとえばシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来のｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、ｂｐｈＡ４、及びｂｐｈＢ遺伝子、あるいはバークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）LB４００株由来のｂｐｈE、ｂｐｈＦ、ｂｐｈＧ及びｂｐｈＢ遺伝子が挙げられる。ＫＦ７０７株のｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、ｂｐｈＡ４、ｂｐｈＢ遺伝子の塩基配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３に示されている。また、バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）ＬＢ４００株由来のｂｐｈＥ、ｂｐｈＦ、ｂｐｈＧ及びｂｐｈＢ遺伝子の塩基配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６４８に示されている。
【００３８】
また、上述した芳香環ジオキシゲナーゼ又はジヒドロジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、部位特異的突然変異誘発法等によって変異が導入され、かつ上記機能又は活性を有する変異体であってもよい。なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A.L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A.,Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001、及び、Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene, 212, 221-228, 1998を参照されたい。
【００３９】
変異を有する核酸により作製される組換えタンパク質が目的の機能（すなわち芳香環分解系酵素活性）を有するか否かは、上述したように当技術分野で公知の方法により、変異核酸を形質転換体において発現させ、得られる組換えタンパク質を用いて基質の生変換実験を行うことによって確認することができる。なお、フラボン類を水酸化する活性を保持するために、改変型ＢｐｈＡ１をコードする改変型ｂｐｈＡ１遺伝子は、それによりコードされるアミノ酸配列における３２４番目及び３２５番目のアミノ酸がそれぞれアラニン及びイソロイシンとなるか又はそれぞれロイシン及びイソロイシンとなるアミノ酸配列をコードするように、上記変異を導入する。
【００４０】
さらに、上記塩基配列からなる核酸の全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット若しくは芳香環ジオキシゲナーゼサブユニットの活性、又はジヒドロジオールデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸も本発明において用いることができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。このようなハイブリダイゼーション条件は当技術分野で公知であり、例えばSambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989などに記載されている。
【００４１】
なお、上記の芳香環分解系酵素をコードする遺伝子群（ｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４遺伝子又はｂｐｈＡ１ＥＦＧ遺伝子、及びｂｐｈＢ遺伝子）は通常、ゲノムＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ内において、隣接するかごく近傍に存在しているので、いずれか一つの遺伝子の配列を含むクローン、たとえばコスミドクローン等をコロニーハイブリダイゼーション法等により単離すれば、簡単に他の遺伝子も一緒に単離することができる場合が多い。
【００４２】
しかしながら、同様の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は多数報告され、当業者には周知であるため、本発明はこれらの遺伝子配列を有する組換え微生物から産生される酵素を利用するものに限定されるものではない。
【００４３】
２．微生物における芳香環分解系酵素の発現
本発明では、改変型芳香環ジオキシゲナーセ遺伝子（改変型ｂｐｈＡ）とジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＢ）とを発現し、フラボン類化合物を水酸化することができる微生物を作製し、該微生物又は該微生物により産生される酵素をフラボン類化合物の水酸化に用いることができる。
【００４４】
具体的には、例えば、上述した改変型ｂｐｈＡ１遺伝子を、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３及びＢｐｈＡ４（又はＢｐｈＥ、ＢｐｈＦ及びＢｐｈＧ）の全部又は一部を発現する微生物、またさらにＢｐｈＢを発現する微生物に導入し、該微生物においてこれらのポリペプチドを発現させることができる。あるいは、上述した改変型ｂｐｈＡ１遺伝子を、ｂｐｈＡ２遺伝子、ｂｐｈＡ３遺伝子、ｂｐｈＡ４遺伝子、及びｂｐｈＢ遺伝子と共に、又はｂｐｈＥ遺伝子、ｂｐｈＦ遺伝子、ｂｐｈＧ遺伝子、及びｂｐｈＢ遺伝子と共に微生物に導入し、該微生物においてこれらのポリペプチドを発現させることができる。従って、改変型ＢｐｈＡ及びＢｐｈＢが発現される限り、微生物が天然に有するポリペプチドを利用してもよいし、微生物にこれらの遺伝子を導入してポリペプチドを発現させてもよい。
【００４５】
目的の遺伝子を微生物に導入し、発現させる方法は当技術分野で公知である。本発明の一実施形態においては、改変型ｂｐｈＡ１遺伝子を含む組換えベクターを用いて微生物を形質転換する。また別の実施形態においては、改変型ｂｐｈＡ１遺伝子と他の遺伝子（ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はｂｐｈＥＦＧ、さらにｂｐｈＢ遺伝子）を含む組換えベクターを用いて形質転換する。さらに別の実施形態においては、改変型ｂｐｈＡ１遺伝子を含む組換えベクターと他の遺伝子を含む組換えベクターを用いて微生物を共形質転換する。目的のポリペプチドを発現する微生物を作製する限り、組換えベクターに含まれる遺伝子の種類、形質転換の順序などは特に限定されるものではない。
【００４６】
本発明において使用する組換えベクターは、適当なベクターに上記遺伝子、例えば改変型ｂｐｈＡ１を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主微生物中で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、ファージミドなどが挙げられ、直鎖状であっても環状であってもよい。また、シャトルベクターを用いることもできる。
【００４７】
プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばｐＫ４、ｐＲＫ４０１、ｐＲＦ３１等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。
【００４８】
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製された遺伝子を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００４９】
遺伝子は、目的のポリペプチドが発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明において使用するベクターには、プロモーター、目的の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、選択マーカーなどを連結することができる。プロモーターは、大腸菌等の宿主微生物中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。
【００５０】
例えば、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４−ｂｐｈＢ−ｂｐｈＣ遺伝子群を発現するプラスミドｐＪＨＦ１８（Hirose, J., Auyama, A., Hayashida, S., Furukawa, K., Gene, 128, 27-33, 1994）、又はｂｐｈＡ１（７１５−７０７）とｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４、並びにｂｐｈＢ及びｂｐｈＣを発現するプラスミドｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ（特許文献３）におけるｂｐｈＡ１遺伝子を本発明の改変型ｂｐｈＡ１で置き換え、また任意によりｂｐｈＣ遺伝子を除去することにより作製することができる。また例えば、大腸菌ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫを用いて、ｂｐｈＡ（１−２２）ｂｐｈＢ遺伝子やｂｐｈＡ（２−２）ｂｐｈＢ遺伝子の発現にはｌａｃプロモーターを利用することができる。
【００５１】
微生物の形質転換は、上記組換えベクターを、目的とするポリペプチドが発現し得るように宿主微生物中に導入することにより行うことができる。ここで、宿主微生物としては、特に限定されるものではなく、例えば、エッシェリヒア属に属する微生物、好ましくは大腸菌（E. coli）、並びに天然に芳香環分解系酵素を発現することが知られているシュードモナス（Pseudomonas）属、コマモナス（Comamonas）属、ブルクホルデリア（Burkholderia）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、及びラルストニア（Ralstonia）属等に属する微生物を挙げることができる。具体的な微生物の例としては、大腸菌ＪＭ１０９株、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonaspseudoalcaligenes）、例えばシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株（非特許文献１）、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）、ブルクホルテリア（Burkholderia）属ＬＢ４００株（Erickson,B.D., Mondello,F.J.,Nucleotide sequencing and transcriptional mapping of the genes encoding biphenyl dioxgenase, a multicomponent polychlorinated-biphenyl-degrading enzyme in Pseudomonas strain LB400. J. Bacteriol., 174, 2903-2912, 1992）、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonasaromaticivorans）、ロドコッカス・グロベルラス（Rodococcus globerulus）、ラルストニア・オキサラティカ（Ralstoniaoxalatica）等を挙げることができる。また、放線菌であるストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌においても、上記遺伝子を導入・発現させることも可能であり、そのような形質転換した組換え微生物も用いることができる（Chun,H.K.,Ohnishi,Y.,Shindo,K.,Misawa,N.,Furukawa, K., Horinouchi, S., Biotransformation of flavone and flavanone by Streptomycelividans cells carrying shuffled biphenyl dioxygenase genes. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic, 21, 113-121, 2003）。これらの微生物は、ＡＴＣＣやＤＳＭＺ等のカルチャーコレクションから入手可能である。ただし、本発明で利用可能な微生物は上記のものに限定されず、目的のポリペプチドを発現させることができる微生物であればどのようなものでも利用することができる。
【００５２】
外来遺伝子を微生物に導入・発現する方法は常法により行うことができる（例えば、Sambrook,J.,Russell, D. W., "Molecular cloning -A laboratory manual", Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。例えば、微生物への組換えベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。形質転換体の選択もまた、当技術分野で公知の方法、例えば薬剤耐性遺伝子を利用した選択等を用いて行うことができる。
【００５３】
以上のようにして得られる微生物は、フラボン類化合物を水酸化する芳香環分解系酵素を生成するものであるため、かかる酵素の製造や、それ自体を水酸化フラボン類化合物の製造において使用することができる。
【００５４】
３．芳香環分解系酵素の単離及び精製
本発明においては、後述する変換反応のために、芳香環分解系酵素（改変型ＢｐｈＡ及びＢｐｈＢ）を生成する微生物から当該酵素群を単離及び精製し、それを使用することができる。
【００５５】
芳香環分解系酵素は、それをコードする遺伝子を保有する前記微生物を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の微生物を培地で培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００５６】
細菌等の微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５７】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類、そしてジベンゾフラン、ゲンチジン酸、サリチル酸等の芳香族炭化水素が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、又はその他の含窒素化合物が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００５８】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２０〜４０℃で行う。培養期間中、ｐＨは約５〜９に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５９】
培養後、目的の芳香環分解系酵素群のタンパク質（改変型ＢｐｈＡ及びＢｐｈＢ）が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより当該タンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。
【００６０】
目的のタンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。さらに、目的タンパク質の理化学的性質又は機能を調べるため、種々の試験を行うことができる。試験項目としては、Ｘ線結晶解析、ＣＤスペクトル解析、ＮＭＲ解析等が挙げられる。
【００６１】
４．フラボン類化合物の変換
本発明においては、上記改変型芳香環ジヒドロゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）を用いて、フラボン類化合物を水酸化することができる。
【００６２】
さらに、上述の組換え微生物から、必要な酵素を産生させて、それらを用いてフラボン類化合物の変換を行うことも容易である。すなわち、本発明は、組換え微生物と変換対象のフラボン類基質との混合培養により水酸化フラボン類化合物を製造するだけでなく、該組み換え微生物又は相当遺伝子を有する非組換え微生物が産生する酵素を抽出し、その抽出酵素を用いて水酸化フラボン類化合物を製造することもできる。
【００６３】
従って、本発明においては、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）、これらの酵素を生成する微生物、又は該微生物の培養物の少なくとも１つを、フラボン類化合物を含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から水酸化されたフラボン類化合物を得るものである。
【００６４】
ここで変換反応の基質として用いられる「フラボン類化合物」とは、フラボン骨格を有する化合物及びそれから誘導される化合物群であり、具体的にはフラボン、イソフラボン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラボン、５，７−ジヒドロキシフラボン（クリシン）；フラバノン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシフラバノン；環化炭化水素基とフェニル環がビフェニル結合した化合物（１−フェニルナフタレン、２−フェニルナフタレン）；芳香環とフェニル基の間に置換若しくは非置換アルケニレン基（好ましくは炭素数３の置換アルケニレン基）を有する化合物（（トランス−）カルコン、カルコン、ジヒドロカルコン）などが挙げられる。本発明において基質として使用可能なフラボン類化合物は、窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群から選択される１以上の異種原子を環原子として含んでなる単環式又は二環式の環状基を有していてもよく、置換基により置換されていてもよい。また、アルケニレン基としては、例えば、ビニレン基、１−プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基等が挙げられる。
【００６５】
本発明において特に好適に用いられるフラボン類化合物（基質）としては、限定されるものではないが、フラボン、カルコン、７−ヒドロキシフラボン、クリシン、フラバノン、６−ヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシフラバノン、１−フェニルナフタレン、２−フェニルナフタレンが挙げられる。
【００６６】
本発明においては、基質として上記フラボン類化合物と、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）とを反応させるか、又はこれらの酵素を産生する微生物と培養するか若しくはその培養物と反応させることにより、フラボン類化合物が有するフェニル基（ベンゼン環）に水酸基が導入された化合物に変換することができる。特に本発明により、フラボン類化合物が有するフェニル基（ベンゼン環）の２つの位置、好ましくは２位及び３位に水酸基が導入されたジオール体に変換することができる。
【００６７】
具体的には、図１に示されるように、本発明の方法により、フラボン類化合物であるカルコン、７−ヒドロキシフラボン及びクリシンより、それぞれ式Ｉ〜ＶＩにより表わされる化合物１〜４を得ることができる。このうち化合物２は新規物質である。また、式ＩＩ〜ＶＩにより表わされる化合物２〜４は、実施例３に示されるように抗酸化活性を有するものである。従って、これらの化合物２〜４を含む組成物は、抗酸化剤として使用することができる。
【００６８】
フラボン類化合物と、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）（又は、これらの酵素を含む破砕微生物、微生物培養液、粗酵素、精製酵素等）との反応、あるいは上記３つの酵素を産生する微生物とともに培養する方法は、通常の酵素反応又は培養方法と同様にして常法により行うことができる。
【００６９】
例えば、上記フラボン類化合物と、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）との反応は、フラボン類化合物を含む溶液に、改変型ＢｐｈＡ及びＢｐｈＢを混合し、酵素反応に適切な温度にて一定時間にわたってインキュベートすることにより、フラボン類化合物を変換することができる。
また例えば、上記フラボン類化合物とともに、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ（改変型ＢｐｈＡ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）を産生する微生物を培養する方法は以下のようにして行うことができる。
【００７０】
微生物を培養する培地としては通常、該微生物が生育し得る培地であれば良く、具体的には、ＬＢ培地、Ｍ９培地、ＫＢ培地、ＹＭ培地、ＫＹ培地、Ｆ１０１培地、等が例示される。
【００７１】
炭素源としては菌体が資化し生育できる炭素化合物であればいずれでも使用可能である。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
【００７２】
培養は、通常、温度２０〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃であり、ｐＨは５〜９が好ましい。また、適宜、振盤培養や回転培養としてもよい。培養終了後、培養液を遠心分離機にかけ、上清を回収し、上清液を酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出する。
【００７３】
上記混合物又は培養物から水酸化フラボン類化合物を精製するには、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００７４】
本発明の方法により、フラボン類化合物、特にこれまで変換が困難であった７−ヒドロキシフラボン、５，７−ジヒドロキシフラボン（クリシン）、１−フェニルナフタレン等のフラボン類化合物を、効率よく水酸化フラボン類化合物に変換することができる。また、本発明の方法では、フラボン類化合物のフェニル基（ベンゼン環）における２位及び３位に特異的に水酸基を導入することができる。このようにして製造される水酸化フラボン類化合物（ジオール体）は、医薬品、農薬を始めとする種々の工業製品の原料として用いることができる。
【００７５】
またさらに、以上のように変換された水酸化フラボン類化合物（ジオール体）は、芳香環分解系酵素であるＢｐｈＣによりピコリン酸化合物へ、また芳香環分解系酵素であるＢｐｈＣ及びＢｐｈＤによりカルボン酸化合物にまで変換することができる。
【００７６】
以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００７７】
ここで用いられた通常の遺伝子組換え実験は、特に言及されていない場合は、標準的な方法（Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., "Molecular cloning -A laboratory manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に基づいている。
【実施例１】
【００７８】
本実施例においては、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ［ｂｐｈＡ（１−２２）］／芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ同時発現用プラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ、及び改変型芳香環ジオキシゲナーゼ［ｂｐｈＡ（２−２）］／芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ同時発現用プラスミドｐＢＰＡ（２−２）Ｂを作製した。
【００７９】
本発明者らは以前にシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）とシュードモナス・プチダＫＦ７１５株由来のＢｐｈＡ１とのハイブリッドＢｐｈＡ１であるＢｐｈＡ１（７１５−７０７）を、カセットＰＣＲと呼ばれる手法（特開２０００−１２５８７１号公報）を用いて作製した。本発明者らはこのＢｐｈＡ１（７１５−７０７）及びＫＦ７０７株由来ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４−ｂｐｈＢ−ｂｐｈＣ遺伝子群［ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子］を発現するプラスミドｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣを作製し、このプラスミドが導入された大腸菌ＪＭ１０９株を用いて種々のバイオコンバージョン実験を行なっており、その結果は、特許文献３に開示しているようにピコリン酸の生成が確認された。
【００８０】
ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）はＫＦ７０７株由来ＢｐｈＡ１と比して幅広い基質特異性を有する。ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）はＫＦ７０７株由来ＢｐｈＡ１とは３２４−３２５番目の２つのアミノ酸残基が異なっており、ＫＦ７０７株由来のものがセリン残基−バリン残基であるところがスレオニン残基−イソロイシン残基となっている。
【００８１】
そこで、本実施例においては、ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）を基に、より広い基質特異性の獲得を目指し、３２４−３２５番目の２つのアミノ酸残基をランダムに置換した変異株を作製した。ランダムな変異の導入はＢｐｈＡ１（７１５−７０７）をコードする遺伝子を鋳型に用い、３２４−３２５番目のアミノ酸残基をコードするコドン部分をランダムに置換した遺伝子ライブラリをＰＣＲにより作製した。まず、プライマーとして７１５ＴＩＮＮＫ−Ｆ（配列番号７）及びＢｐｈＡ１ＢｇｌＩＩＲ（配列番号６）を用いたＰＣＲ、及び、プライマーとしてＢｐｈＡ１ＳａｃＩＦ（配列番号５）及び７１５ＴＩＮＮＫ−Ｒ（配列番号８）を用いたＰＣＲをそれぞれ行い、増幅産物（それぞれのＰＣＲについて約１０ｋｂ、約５ｋｂ）をアガロースゲル電気泳動で分離、精製した。
【００８２】
使用したプライマーの配列は以下の通りである：
BphA1SacIF: 5'- CCGAATTCAAGGAGACGTTGAATCATGAGCTCAGC -3'（配列番号５）
BphA1BglIIR: 5'- TTGAATTCTTCCGGTTGACAGATCT-3'（配列番号６）
715TINNK-F： 5'-GCATGTTCGGCCAGCACATGNNKNNKTTCCCGACCTGTTC -3'（配列番号７）
715TINNK-R： 5'-CATGTGCTGGCCGAACATGC -3'（配列番号８）
【００８３】
ＢｐｈＡ１ＳａｃＩＦ（配列番号５）及びＢｐｈＡ１ＢｇｌＩＩＲ（配列番号６）はそれぞれＢｐｈＡ１（７１５−７０７）のＮ末端付近、Ｃ末端付近及びその外側の部位を含む配列をコードしている。ＢｐｈＡ１ＳａｃＩＦ（配列番号５）にはＳａｃＩ部位が、ＢｐｈＡ１ＢｇｌＩＩＲ（配列番号６）にはＢｇｌＩＩ部位があり、両側にさらにＥｃｏＲＩ部位が付与されている（いずれも、アンダーラインで示されている）。
【００８４】
７１５ＴＩＮＮＫ−Ｆ（配列番号７）の配列における下線部はＢｐｈＡ１（７１５−７０７）の３２４−３２５番目のアミノ酸残基の位置にあたり、ランダムコドンの混合（ＮＮＫ；ＮはＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの等量混合、ＫはＧ，Ｔの等量混合を示す）を２つ連結したものになっている。
【００８５】
ＰＣＲの条件は約１０ｋｂ、約５ｋｂの増幅ともに同じで、９４℃１分、６１℃１分、７２℃１分３０秒で、３０サイクル行い、ＫＯＤ Ｄａｓｈポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、それぞれ約１０ｋｂ、約５ｋｂのバンドを切り出して精製した。次にこれら２種の遺伝子断片を混合し、さらにプライマーＢｐｈＡ１ＳａｃＩＦ（配列番号５）及びＢｐｈＡ１ＢｇｌＩＩＲ（配列番号６）を加えてＰＣＲを行い、ｂｐｈＡ１全長約１．５ｋｂにあたる増幅産物を得た。ＰＣＲの反応条件は約１０ｋｂ、約５ｋｂの増幅の場合と同じである。増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、約１．５ｋｂのバンドを切り出して精製し、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）変異株ライブラリとした。
【００８６】
Ｐ．プソイドアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４−ｂｐｈＢ−ｂｐｈＣ遺伝子群（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８３６７３に登録されている）を含む発現プラスミドｐＪＨＦ１８（Hirose, J., Auyama, A., Hayashida, S., Furukawa, K., Gene, 128, 27-33, 1994）を有する大腸菌は、メタ開裂まで反応が進むので、ビフェニルを基質とした場合はメタ開裂産物として、２−ヒドロキシ−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸（2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid）を生成すると考えられている。一般に、メタ開裂産物は黄色を呈するので、４３４ｍｍ付近の波長でモニターすることが可能である。
【００８７】
プラスミドｐＪＨＦ１８において、１ヵ所のＭｌｕＩ部位がｂｐｈＡ１内にあるので、ＭｌｕＩで消化、平滑末端処理後、再度ライゲーションを行うことにより、ｂｐｈＡ１のみを破壊したプラスミドｐＪＨＦ１８ΔＭ１ｕＩを作製した（T.Kumamaru,H.Suenaga,M.Mitsuoka, T. Watanabe, K. Furukawa, Nature Biotechnology, 16, 663-666, 1998）。
【００８８】
次に、ＰＪＨＦ１８ΔＭ１ｕＩをＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩで二重消化により、ΔｂｐｈＡ１遺伝子をのみを含む１．３９ｋｂ断片を除き、代わりに、上記で作製したｂｐｈＡ１（７１５−７０７）変異株ライブラリ（ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩで二重消化後のもの）を挿入し、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子ライブラリ（ｂｐｈＡ１変異ライブラリ：：ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子）とｂｐｈＢｂｐｈＣ遺伝子を含むプラスミドを得た。
【００８９】
このプラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９にビフェニル蒸気を充て、メタ開裂により黄色を呈することができるコロニーを選抜した。メタ開裂により黄色を呈することができるコロニーにおいては、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）変異株遺伝子が正常に機能できることを意味している。
【００９０】
ビフェニル蒸気により黄色を呈することができた大腸菌形質転換体２００個を用い、２次スクリーニングを実施した。２次スクリーニングは基質として１−フェニルナフタレン及び２−フェニルナフタレンのいずれかを混合した寒天培地上に変異体コロニーを生育させ、メタ開裂産物の呈色の確認により行った。１−フェニルナフタレン及び２−フェニルナフタレンに対するメタ開裂の分解効率が共に高いことを指標に選択した結果、５個の変異体が見いだされた。それらの内２種類（この大腸菌に含まれるプラスミドをそれぞれｐＳＨＦ１−２２ＡＢＣ及びｐＳＨＦ２−２ＡＢＣと命名）はＫＦ７０７由来のｂｐｈＡ１遺伝子やｂｐｈＡ１（７１５−７０７）を持つものが分解できない７−ヒドロキシフラボンや５，７−ジヒドロキシフラボンをもメタ開裂により分解することができた。
【００９１】
このプラスミドｐＳＨＦ１−２２ＡＢＣ及びｐＳＨＦ２−２ＡＢＣ由来のｂｐｈＡ１（７１５−７０７）変異株遺伝子を以後、それぞれｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子及びｂｐｈＡ１（２−２）と呼ぶ。
【００９２】
ｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子の配列を解析したところ、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）を基に変異を加えた３２４−３２５番目の２つのアミノ酸残基が、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）のものがスレオニン残基−イソロイシン残基であるところがアラニン残基−ロイシン残基となっていた。また、ｂｐｈＡ１（２−２）遺伝子の配列を解析したところ、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）を基に変異を加えた３２４−３２５番目の２つのアミノ酸残基が、ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）のものがスレオニン残基−イソロイシン残基であるところがロイシン残基−イソロイシン残基となっていた。ｂｐｈＡ１（１−２２）遺伝子及びｂｐｈＡ１（２−２）遺伝子の配列をそれぞれ配列番号１及び３に示す。
【００９３】
また、このｐＳＨＦ１−２２ＡＢＣ及びｐＳＨＦ２−２ＡＢＣからｂｐｈＣのみを除いて、ｂｐｈＡ１（１−２２）ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４ｂｐｈＢ遺伝子を発現するプラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ及びｂｐｈＡ１（２−２）ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４ｂｐｈＢ遺伝子を発現するプラスミドｐＢＰＡ（２−２）Ｂを作製した。
【実施例２】
【００９４】
本実施例においては、実施例１において作製した改変遺伝子を用いて変換実験を行い、また得られた変換産物の同定及び精製を行った。
【００９５】
（１）変換実験
実施例１において作製したプラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ又はｐＢＰＡ（２−２）Ｂを有する大腸菌ＪＭ１０９と、実施例１で変換が確認された基質の混合培養液７００ｍｌ〜１４００ｍｌに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを７，０００ｒｐｍにて１０分遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下３００ｍｌ〜５００ｍｌまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキスを得た。エキスをシリカゲル［０．２５ｎｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）］を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけ、変換産物の確認を行った後、シリカゲルカラム［２０×２５０ｍｍ，Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）］を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、純品を得た。
【００９６】
なお、各基質におけるＴＬＣの展開溶媒は以下の通りである：
カルコン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）；７−ヒドロキシフラボン，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１０：１）；クリシン，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）
また、各基質におけるカラムクロマトグラフィーの展開溶媒は以下の通りである：
カルコン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３：１）；７−ヒドロキシフラボン，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１５：１）；クリシン，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）
【００９７】
（２）カルコン（chalcon）の変換産物の同定
プラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ又はｐＢＰＡ（２−２）Ｂを有する大腸菌ＪＭ１０９によりそれぞれ［（トランス−）カルコン］の変換実験を行った粗抽出物（１０５．８ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、両方についてＲｆ値０．２及びＲｆ値０．１の産物が生成していることが判明した。両産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１（２７．６ｍｇ）及び化合物２（５．２ｍｇ）の純品を得た。
【００９８】
化合物１は標準品とのＴＬＣ及びＨＰＬＣによる直接比較により、３−（２，３）ジヒドロキシフェニル）−１−フェニルプロパン−１−オン（3-(2,3-dihydroxyphenyl)-1-phenylpropan-1-one）（図１）と同定した。
【００９９】
化合物２の分子式は、ＡＰＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ２５８（Ｍ＋）），１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲよりＣ１５Ｈ１４Ｏ４と決定された。得られた分子式及び化合物２の１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲより、化合物２はカルコンのＡ環及びＢ環に２個ずつ、計４個のフェノール性水酸基が導入された化合物であることが示唆された。また化合物のＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいて３つの連続したｓｐ２ビシナルスピン結合が２組（δ７．０２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）−δ６．７４（δ，Ｊ＝７．９，８．０Ｈｚ）−δ７．３６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）及びδ６．５６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）−δ６．５２（δ，Ｊ＝７．０，７．３Ｈｚ）−δ６．６３（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ））が観測されたことから、化合物２はＡ環の５，６位、及びＢ環の１’，２’’位に４つのフェノール性水酸基が導入された物質であると決定された。
【０１００】
以上の結果より、化合物２は１，３−ビス−（２，３−ジヒドロキシ−フェニル）−プロパン−１−オン（1,3-bis-(2,3-dihydroxy-phenyl)-propan-1-one）（図１）と同定した。化合物２は新規化合物であった。化合物２のＮＭＲデータを以下に記す。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
（３）７−ヒドロキシフラボン（7-hydroxyflavone）の変換産物の同定
プラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ又はｐＢＰＡ（２−２）Ｂを有する大腸菌ＪＭ１０９によりそれぞれ７−ヒドロキシフラボンの変換実験を行った粗抽出物（９３．２ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、両方についてＲｆ値０．５の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物３（４．５ｍｇ）の純品を得た。
【０１０３】
化合物３の分子式は、ＡＰＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ２７０（Ｍ＋）），１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲよりＣ１５Ｈ１０Ｏ５と決定された。得られた分子式及び化合物３の１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲより、化合物３は７−ヒドロキシフラボンに２個のフェノール性水酸基が導入された化合物であることが示唆された。また化合物のＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいて３つの連続したｓｐ２ビシナルスピン結合（δ７．２９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）−δ８．８０（δ，Ｊ＝７．４，８．５Ｈｚ）−δ６．９５（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）が観測されることから、２つのフェノール性水酸基はＢ環の１’，２’’位に導入されたことが明らかとなった。
【０１０４】
以上の結果より、化合物３は２−（２，３−ジヒドロキシ−フェニル）−７−ヒドロキシ−クロメン−４−オン（2-(2,3-dihydroxy-phenyl)-7-hydroxy-chromen-4-one）（図１）と同定した。
【０１０５】
化合物３はＣＡＳに構造登録のある既知物質であるが、これを芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応により製造できるという報告はない。従って、本発明による化合物３の製造方法は新規かつ有効である。化合物３のＮＭＲデータを以下に記す。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
（４）クリシン（chrysin）の変換産物の同定
プラスミドｐＢＰＡ（１−２２）Ｂ又はｐＢＰＡ（２−２）Ｂを有する大腸菌ＪＭ１０９によりクリシンの変換実験を行った粗抽出物（１２６．３ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、両方についてＲｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。両産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物４（４．２ｍｇ）の純品を得た。
【０１０８】
化合物４の分子式は、ＡＰＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ２８６（Ｍ＋）），１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲよりＣ１５Ｈ１０Ｏ６と決定された。得られた分子式及び化合物４の１Ｈ，１３Ｃ ＮＭＲより、化合物４はｃｈｒｙｓｉｎに２個のフェノール性水酸基が導入された化合物であることが示唆された。また化合物のＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいて３つの連続したｓｐ２ビシナルスピン結合（δ７．３０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）−δ６．８１（δ，Ｊ＝７．６，８．０Ｈｚ）−δ６．９８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）が観測されることから、２つのフェノール性水酸基はＢ環の１’，２’’位に導入されたことが明らかとなった。
【０１０９】
以上の結果より、化合物４は２−（２，３−ジヒドロキシ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−クロメン−４−オン（2-(2,3-dihydroxy-phenyl)-5,7-dihydroxy-chromen-4-one）（図１）と同定した。
【０１１０】
化合物４はＣＡＳに構造登録のある既知物質であるが、これを芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、本発明による化合物４の製造方法は新規かつ有効である。化合物４のＮＭＲデータを以下に記す。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
（５）その他の変換物（２０７２ＡＢ変換と同一化合物）
（５−１）フラバノン（Flavanone）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）Ｒｆ０．６
酢酸エチル抽出物重量 ２１２．１ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）６８．６ｍｇ
【０１１３】
（５−２）６−ＯＨフラボン（6-OH Flavone）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１０：１）Ｒｆ０．３
酢酸エチル抽出物重量 ７７．０ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１０：１）２０．３ｍｇ
【０１１４】
（５−３）６−ＯＨフラバノン（6-OH Flavanone）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）Ｒｆ０．３
酢酸エチル抽出物重量 １５５．９ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）６０．３ｍｇ
【０１１５】
（５−４）７−ＯＨフラバノン（7-OH Flavanone）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）Ｒｆ０．５
酢酸エチル抽出物重量 １４９．３ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（２０：１）３１．５ｍｇ
【０１１６】
（５−５）１−フェニルナフタレン（1-phenylnaphthalene）（ｂｐｈＡでの変換、２０７２Ａと同一変換物）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（５０：１）Ｒｆ０．３
酢酸エチル抽出物重量 １１４．９ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（５０：１）６０．９ｍｇ
【０１１７】
（５−６）２−フェニルナフタレン（2-phenylnaphthalene）（ｂｐｈＡでの変換、２０７２Ａと同一変換物）
ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（５０：１）Ｒｆ０．２
酢酸エチル抽出物重量 １１４．９ｍｇ
シリカカラムＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（５０：１）６５．５ｍｇ
【０１１８】
（５−７）ナリンゲニン（Naringenin）
変換反応進行せず。
【実施例３】
【０１１９】
抗酸化活性
活性酸素により最も傷害を受ける生体成分は脂質（特に極性脂質）である。ラット脳組織は極性脂質に富み、また活性酸素の反応に関与する酸化還元酵素系も含むため、活性酸素の生体脂質への傷害（動脈硬化の原因）を検討するのに優れた材料である。
【０１２０】
そこで変換化合物である化合物２〜４の脳脂質過酸化抑制作用をＴＢＡ（チオバルビツール酸）法にて検討した。本法は、K. Shindo, Y. Kagiyama, R. Nakamura, A. Hara, H. Ikenaga, K. Furukawa, N. Misawa, J. Mol. Catal. B: Enzym., 23, 9 (2003)に記載されている。化合物２〜４の抗酸化活性を測定した（ラット脳脂質過酸化抑制ＩＣ５０）。簡単に説明すると、ラット脳のホモジネートを用いて、各化合物を加えた際の脂質過酸化抑制作用を測定するものである。
【０１２１】
結果を以下に示す：
化合物２ ０．７μＭ
化合物３ ２．９μＭ
化合物４ ４．８μＭ
上記結果から、化合物２〜４が、抗酸化活性、特に脂質に対する抗酸化活性を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明によれば、既存のフラボン類化合物から水酸化フラボン類化合物（特に水酸基を２つの位置に有するジオール体）を製造する新規な方法が提供される。かかる変換産物は種々の医薬品や農薬等の工業製品を有機化学合成するための原料として提供することができる。また、本発明の方法はフラボン類化合物のフェニル基（ベンゼン環）の２つの位置（２位及び３位）に特異的に水酸基を導入することができ、有機化学合成において有用な反応である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】改変型芳香環ジオキシゲナーゼを用いた変換実験により得られた化合物１〜４の構造（式Ｉ〜ＩＶ）を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号１及び３：合成ポリヌクレオチド
配列番号２及び４：合成ポリペプチド
配列番号５〜８：合成オリゴヌクレオチド
配列番号７におけるＮは任意のヌクレオチドを表わす。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、３２４番目若しくは３２５番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ａ）と同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチド
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、又は
（ｂ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、３２４番目若しくは３２５番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ａ）と同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸、又は
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【請求項４】
請求項２又は３記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ１）の製造方法。
【請求項７】
さらに芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）をコードする核酸、及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）をコードする核酸を含む、請求項４記載の組換えベクター。
【請求項８】
請求項１記載のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）を発現し、かつ芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）を発現することを特徴とする微生物。
【請求項９】
請求項４又は７記載の組換えベクターで形質転換されたものである、請求項８記載の微生物。
【請求項１０】
フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換できるものである、請求項８又は９記載の微生物。
【請求項１１】
微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換する活性を有する酵素群の製造方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）請求項１記載のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）
（ｂ）請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物
（ｃ）請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物の培養物
の少なくとも１つを、フラボン類化合物を含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から水酸化されたフラボン類化合物を得ることを特徴とする、水酸化フラボン類化合物の製造方法。
【請求項１４】
フラボン類化合物が、フラボン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラボン、５，７−ジヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシフラバノン、カルコン、１−フェニルナフタレン、及び２−フェニルナフタレンからなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
水酸化フラボン類化合物が、フラボン類化合物のフェニル基の２位及び３位に２つの水酸基が導入されたジオール体である、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
下記式ＩＩ：
【化１】
で表わされる化合物。
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）請求項１記載のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）
（ｂ）請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物
（ｃ）請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物の培養物
の少なくとも１つを、カルコンを含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から下記式ＩＩ：
【化２】
で表わされる化合物を得ることを特徴とする、式ＩＩで表わされる化合物の製造方法。
【請求項１８】
下記式ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ：
【化３】
で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする抗酸化剤。
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、３２４番目若しくは３２５番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ａ）と同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチド
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、又は
（ｂ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、３２４番目若しくは３２５番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ａ）と同等の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸、又は
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【請求項４】
請求項２又は３記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ１）の製造方法。
【請求項７】
さらに芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）をコードする核酸、及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）をコードする核酸を含む、請求項４記載の組換えベクター。
【請求項８】
請求項１記載のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）を発現し、かつ芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）を発現することを特徴とする微生物。
【請求項９】
請求項４又は７記載の組換えベクターで形質転換されたものである、請求項８記載の微生物。
【請求項１０】
フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換できるものである、請求項８又は９記載の微生物。
【請求項１１】
微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換する活性を有する酵素群の製造方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）請求項１記載のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）
（ｂ）請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物
（ｃ）請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物の培養物
の少なくとも１つを、フラボン類化合物を含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から水酸化されたフラボン類化合物を得ることを特徴とする、水酸化フラボン類化合物の製造方法。
【請求項１４】
フラボン類化合物が、フラボン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラボン、５，７−ジヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシフラバノン、カルコン、１−フェニルナフタレン、及び２−フェニルナフタレンからなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
水酸化フラボン類化合物が、フラボン類化合物のフェニル基の２位及び３位に２つの水酸基が導入されたジオール体である、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
下記式ＩＩ：
【化１】
で表わされる化合物。
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）請求項１記載のポリペプチド（ＢｐｈＡ１）及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＡ２Ａ３Ａ４又はＢｐｈＥＦＧ）、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（ＢｐｈＢ）
（ｂ）請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物
（ｃ）請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微生物の培養物
の少なくとも１つを、カルコンを含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から下記式ＩＩ：
【化２】
で表わされる化合物を得ることを特徴とする、式ＩＩで表わされる化合物の製造方法。
【請求項１８】
下記式ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ：
【化３】
で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする抗酸化剤。
【図１】
【公開番号】特開２００７−１１６９７５（Ｐ２００７−１１６９７５Ａ）
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３１３１７７（Ｐ２００５−３１３１７７）
【出願日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、生物機能活用型循環産業システム創造プログラム／ゲノム情報に基づいた未知微生物遺伝資源ライブラリーの構築 委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１００１９４９）株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 (33)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、生物機能活用型循環産業システム創造プログラム／ゲノム情報に基づいた未知微生物遺伝資源ライブラリーの構築 委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１００１９４９）株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 (33)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]