新規な抗老化ペプチド、並びにそれを含む化粧品及び／または製薬組成物
本発明は、一般式：Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２のペプチド化合物に関し、並びに老化の効果と皮膚及び皮膚付属物に対するＵＶ照射の有害な効果を予防及び修正するための化粧品及び／または製薬におけるそれらの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式：Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２のペプチド化合物に関し、並びに老化の効果と皮膚及び皮膚付属物に対するＵＶ照射の有害な効果を予防及び修正するための化粧品及び／または製薬におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮の第一の機能は、外的環境と内的媒体の間にバリアを形成することである。この役目を実施するのは、表皮の再外層である角質層である。それは、分化の最終段階ではケラチノサイト、すなわち可撓性で不透過性である厚い細胞間接合剤により互いに接合されているコルネオサイトから形成される。皮膚である物理的バリアは、ヒトが数多くのタイプの攻撃に対して自分自身を保護することを可能にする。これらの攻撃は、各種の固有の起源を有し、例えば年齢的な老化、または疲労状態の間で生じる生化学的変化、ストレスまたはホルモン変化、例えば妊娠中のもの等が存在する。他の攻撃は起源が外的なもの、例えば汚染、日光、疾患等である。これらの攻撃に応答して、皮膚の外観は変化し、シワ及び小じわの出現、色素過剰または脱色の領域、乾燥または皮膚の脱水、表皮の日焼け、弾力線維症、欠陥、加齢領域等が観察される。これらの変化は、細胞の再生、細胞の接着、並びにコラーゲン、エラスチン、及び他のタンパク質の合成の機能に対する改変によって引き起こされ、究極的には皮膚の保護的バリア機能の減少と、その魅力的でない外観を導く。全てのこれらの変化は皮膚のみに影響せず、爪及び毛髪のような皮膚付属物にも影響する。例えば毛髪は、生気がなくなりまたは灰色化し、あるいは早く抜けたりする。
【０００３】
これらの欠点を解消するために、数多くの化粧品組成物がここ数年で提案されている。これらの組成物は、水和剤、鎮静剤、抗炎症剤、抗フリーラジカル剤、抗脂漏剤、治癒剤、明色化剤、及び角質溶解剤等を単独でまたは組み合わせて使用することを含む。しかしながら、これらの組成物の全てが現在、皮膚の固有のまたは外的な起源の老化の兆候を予防または修正することが可能ではない。
【０００４】
驚くべきことに、本出願人は、以下の一般式：Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２のペプチド化合物が、各種の特徴的な老化の兆候に対するグローバルな作用の結果として、皮膚の抗老化効果を有することを発見した。更にこれらのペプチド化合物は、サーカディアンサイクルの調節に関与するClock(circadian locomotor output cycles kaput)タンパク質のアクチベーター剤であるという事実によって特徴づけされる。その結果本発明は、Clockアクチベーターであるペプチド化合物に関し、加齢によって引き起こされる兆候、並びに皮膚及び皮膚付属物に対するＵＶ照射の有害な効果を予防または修正するための、化粧品及び製薬組成物におけるそれらの使用に関する。
【０００５】
概日時計は、一連の遺伝子、特にPer-1（period）、Clock、及びBMAL-1（脳及び筋肉ARNt様タンパク質）遺伝子を含むネガティブ調節ループによって制御されている。
【０００６】
加齢は、振幅の減少と相のリードに向けた傾向と共に、生物学的リズムの変化を伴うことが示されている（Weinert D., Chronobiol. Int. 2000; 17: 261-83）。更に、概日時計はこの同じ老化プロセスによって改変されることも示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第6,291,429号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Weinert D., Chronobiol. Int. 2000; 17: 261-83
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当該技術分野では以前に、数多くの出願がClock、Per-1及びBMAL-1遺伝子によって生産されるヌクレオチド及び／またはタンパク質の使用に関して提案している。例えば、睡眠サイクルまたは生理学的若しくは内分泌プロセスを再同調するための、あるいは時差ぼけ等の後の身体の再同調のための、Clock遺伝子の産物の使用を記載する米国特許第6,291,429号を参照。しかしながら、老化の兆候、またはＵＶ照射の有害な効果の結果を予防または修正するための特異的なClockアクチベーターペプチドの使用を記載する当該技術分野の文献は存在しない
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第一に、本発明は、以下の式（Ｉ）のペプチド化合物に関する：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２
［式中、
Ｘ１はシステイン、メチオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ２はセリン、トレオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ３はアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリン、またはゼロに等しく；
Ｘ４はアスパラギン、グルタミン、またはゼロに等しく；
Ｒ１は遊離した、またはアセチル基、ベンゾイル基、トシル基、またはベンジルオキシカルボニル基から選択できる保護基によって置換された、Ｎ末端アミノ酸の第一級アミン官能基であり；
Ｒ２は遊離した、またはＣ１からＣ２０アルキル鎖またはＮＨ２、ＮＨＹまたはＮＹＹ（式中、ＹはＣ１からＣ４アルキル鎖である）から選択できる保護基によって置換された、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基のヒドロキシル基であり；
前記一般式（Ｉ）の配列は４から８アミノ酸残基から形成され；
前記一般式（Ｉ）の配列はアミノ酸Ｘ１からＸ４における他の化学的に同等なアミノ酸での置換を含んでも良い］。
【００１１】
第二に、本発明は、一般式（Ｉ）のペプチド化合物を含む化粧品または皮膚製薬組成物に関する。
【００１２】
第三に、本発明は、一般式（Ｉ）のペプチド化合物を含む化粧品または皮膚製薬組成物の使用に関する。
【００１３】
最後第四に、本発明は、一般式（Ｉ）のペプチド化合物を含む組成物の補助で実施される美容処理方法に関する。
【００１４】
本発明の第一の目的は、以下の一般式（Ｉ）のペプチド化合物に関する：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２
［式中、
Ｘ１はシステイン、メチオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ２はセリン、トレオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ３はアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリン、またはゼロに等しく；
Ｘ４はアスパラギン、グルタミン、またはゼロに等しく；
Ｒ１は遊離した、またはアセチル基、ベンゾイル基、トシル基、またはベンジルオキシカルボニル基から選択できる保護基によって置換された、Ｎ末端アミノ酸の第一級アミン官能基であり；
Ｒ２は遊離した、またはＣ１からＣ２０アルキル鎖またはＮＨ２、ＮＨＹまたはＮＹＹ（式中、ＹはＣ１からＣ４アルキル鎖である）から選択できる保護基によって置換された、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基のヒドロキシル基であり；
前記一般式（Ｉ）の配列は４から８アミノ酸残基から形成され；
前記一般式（Ｉ）の配列はアミノ酸Ｘ１からＸ４における他の化学的に同等なアミノ酸での置換を含んでも良い］。
【００１５】
変性に対する耐性を改良するために、本発明に係るペプチドの保護化形態を使用することが必要であっても良い。もちろん保護の形態は、生物学的に適合可能な形態でなければならず、化粧品または医薬の分野内での使用に適合しなければならない。ペプチド化合物は好ましくは、保護基によって保護された少なくとも一つの官能基を有し、前記保護基は、アミノ末端のアセチル化、またはカルボキシ末端のアミド化若しくはエステル化、またはその両者である。ＹがＣ１からＣ４アルキル鎖であるＮＹＹ基でのカルボキシル末端のヒドロキシル官能基のアミド化、またはアルキル基でのエステル化に基づく保護が好ましくは使用される。
【００１６】
好ましくはペプチド化合物は、以下の配列の一つを有する：
（配列番号１）Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＨ２
（配列番号２）Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
（配列番号３）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＮＨ２
（配列番号４）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＮＨ２。
【００１７】
特定の実施態様では、ペプチド化合物の配列は、配列番号１の配列、即ちＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＨ２である。
【００１８】
本発明は更に、これらの配列の相同形態に関する。用語「相同な」は、本発明によれば、配列番号１から配列番号４の配列から選択される前記ペプチドオ配列と少なくとも５０％、または好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％同一であるいずれかのペプチド配列を意味する。「少なくともＸ％同一であるペプチド配列」は、二つの配列の最適なアライメントの後に得られる、比較される二つの配列のアミノ酸残基の間の同一性のパーセンテージを表すと解される。最適なアライメントは、ＮＣＢＩサイトで入手可能なＩＴソフトウェアＢＬＡＳＴ ＰまたはＴ ＢＬＡＳＴ Ｎによって使用されるもののような部分的相同性のアルゴリズムの補助で得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
用語「相同な」は、化学的に同等なアミノ酸の置換によって、即ち同じ特徴を有する別の残基での一つの残基の置換によって、配列番号１から配列番号４の配列のペプチドの配列とは異なるペプチドを表すこともできる。かくして従来の置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの間；Ｓｅｒ及びＴｈｒの間；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの間、Ａｓｎ及びＧｌｎの間；並びに塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの間；または芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒの間で実施される。
【００２０】
用語「ペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに結合した二つ以上のアミノ酸の配列を表す。
【００２１】
「ペプチド」は、タンパク質分解的にまたは合成的に得られた、上述の本発明の天然または合成ペプチドまたはその断片の少なくとも一つ、あるいは上述のペプチドの配列によって全部または一部が形成されている配列を有するいずれかの天然または合成ペプチドを意味すると解されなければならない。
【００２２】
本発明に係る一般式（Ｉ）のペプチドは、従来の化学合成（固相でまたは均一な液相で）によって、または酵素的合成（Kullman等, J. Biol. Chem. 1980, 225, 8234）によってのいずれかで、構成的アミノ酸またはその誘導体から得ることができる。
【００２３】
本発明に係るペプチドは、天然起源または合成起源を有することができる。本発明によれば、ペプチドは好ましくは化学合成によって得られる。
【００２４】
最後に、活性成分は、単一のペプチド、またはペプチド若しくはペプチドの誘導体及び/またはアミノ酸誘導体から形成された誘導体の混合物であることができる。
【００２５】
本発明に係るペプチド化合物は、医薬として使用できる。
【００２６】
本発明の第二の目的は、一般式（I）の前記ペプチド化合物を含む化粧品組成物に関する。本発明に係る組成物は好ましくは、化粧品または皮膚科学的に許容可能な媒体を含む局所適用に適合した形態で存在する。「化粧品的または皮膚科学的に許容可能」は、毒性、寛容性、不安定性、アレルギー反応等の危険がなく、皮膚またはヒトの皮膚付属物と接触する使用に適した媒体を意味する。前記ペプチド化合物は好ましくは、約０．０００５から５００ｐｐｍの間の濃度で、好ましくは０．０１から５ｐｐｍの間の濃度で組成物中に存在する。本発明に係る組成物では、水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化若しくはプロポキシル化ジグリコール、環状ポリオール、ワセリン、植物オイル、またはこれらの溶媒のいずれかの混合物といった一つ以上の化粧品的または皮膚科学的に許容可能な溶媒中に事前に溶解される。
【００２７】
また更なる有利な実施態様によれば、本発明に係る活性成分は、リポソームのような化粧品または製薬ベクターに事前に溶解され、あるいは紛体有機ポリマー、タルク及びベントナイトのような無機支持体に吸着され、より一般的にはいずれかの生理学的に許容可能なベクター内に溶解され、またはそこに固定化される。
【００２８】
皮膚に適用される組成物は、水性または親アルコール性溶液、水中油型または油注水型エマルション、ミクロエマルション、水性または無水ゲル、漿液、またはベシクルの分散物、パッチ、クリーム、スプレー、膏薬、軟膏、ローション、ゲル、溶液、懸濁物等の形態で存在できる。前記組成物はまた、特に睫、眉毛、若しくは毛髪にブラシ若しくはクシによって適用されるシャンプー、染料、またはマスカラの形態で、あるいはワニスのような爪のケア処置物の形態で皮膚付属物に適用できる。
【００２９】
特定の実施態様では、本発明に係る組成物は更に、前記ペプチド活性成分の作用を促進する少なくとも一つの更なる活性成分を含む。非制限的な例として以下のクラスの成分が含まれる：他のペプチド活性剤、植物抽出物、治癒剤、抗老化剤、抗シワ剤、鎮静剤、抗ラジカル剤、抗ＵＶ剤、皮膚巨大分子の合成若しくはエネルギー代謝の刺激剤、水和剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、麻酔剤、皮膚分化、色素沈着若しくは脱色の調節剤、爪または毛髪成長の刺激剤等。抗ラジカル剤、または抗酸化剤、または真皮巨大分子の合成の刺激剤、あるいはエネルギー代謝の刺激剤が好ましくは使用される。
【００３０】
更に、増粘剤、乳化剤、湿潤剤、及び皮膚軟化剤、香料、抗酸化剤、皮膜形成剤、キレート剤、金属イオン封鎖剤、コンディショニング剤等といった添加剤が、前記組成物に添加できる。
【００３１】
いずれの場合でも、これらの添加剤並びにその量が、本発明に係る組成物の所望される有利な特性に対して有害とならないように選択されることが、当業者により確認されるであろう。例えばこれらの添加剤は、組成物の全重量の０．０１から２０％に対応して良い。本発明の組成物がエマルションである場合、脂肪相は、前記組成物の全重量に基づいて５から８０重量％、好ましくは５から５０重量％であることができる。前記組成物で使用される乳化剤及び共乳化剤は、考慮される分野で従来使用されるものから選択されよう。例えばそれらは、前記組成物の全重量に基づいて０．３から３０重量％の割合で使用できる。
【００３２】
本発明の第三の目的は、Clockアクチベーター活性成分としての上述のペプチド化合物の使用に関する。「Clockアクチベーター」ペプチドは、Clockタンパク質合成を増大することによって（Clock遺伝子発現の直接的または間接的な調節によって）、またはClock タンパク質の安定化、若しくはＲＮＡメッセンジャージャー転写産物の安定化のような他の生物学的プロセスによってのいずれかで、Clock活性を増大することが可能ないずれかの生物学的に活性なペプチドまたは誘導体を意味する。
【００３３】
本発明の第四の目的は、皮膚の老化の兆候を予防または処理するための前記ペプチド化合物を含む組成物の使用からなる。「皮膚の老化の兆候」は、加齢によって引き起こされる皮膚上のいずれかの視覚的な発現を含むがこれらに制限されない。特にこれは、シワ、小じわ、皮膚のひび割れ、大きな穴、不完全性、張りの欠如、脱色、加齢領域、角化症、コラーゲンの欠如、及び真皮と表皮に対する他の変化等を意味する。
【００３４】
「皮膚の老化の兆候」は更に、加齢によって引き起こされる皮膚及び皮膚付属物の外的な外観に対するいずれかの変化、例えば角質層の表面の荒れを意味するが、更に変更された外的な外観内で全身的には影響しない皮膚に対するいずれかの内的な変化、例えば真皮の日焼けまたは皮膚のいずれかの他の内的な分解をも意味する。
【００３５】
さらに本発明は、ＵＶ照射によって引き起こされる有害な効果に対して皮膚を保護するための本発明に係る組成物の使用に関する。
【００３６】
本発明の更なる目的は、酸化プロセスと関連する病理を予防または打ち消すための製薬組成物の調製のための、有効量の本発明に係るペプチド活性成分の使用に関する。
【００３７】
本発明の最後の目的は、有効量のペプチド活性成分を含む組成物を、皮膚の老化の兆候を予防または処理するために、あるいはＵＶ照射によって引き起こされる有害な効果に対して皮膚を保護するために、皮膚または皮膚付属物に局所適用することを特徴とする美容処理方法に関する。更にこの美容処理方法は、皮膚の抗老化効果を有するために、皮膚のサーカディアンリズムを念頭に置くように睡眠に至る前に前記組成物を適用することを特徴とする。実際夜間で皮膚は、再生機能、並びに代謝合成プロセスを促進する。従って、皮膚の生物学的リズムを念頭に置くことによって、上述の組成物の適用は、細胞の再生を刺激する抗老化効果、及びかくして老化の兆候を減少する再生効果を得ることが可能である。
【００３８】
以下の実施例は、本発明によって記載されたペプチド化合物の効力を記載して説明する。言及される美容製剤は本発明の代表物であるが、単に例示としてのみ記載されるものであり、本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１：培養線維芽細胞におけるClockタンパク質の発現に対する配列番号１のペプチドの活性化効果の説明
配列番号１のペプチドの活性化効果の研究を、培養線維芽細胞におけるウエスタンブロットによりClockタンパク質の発現を評価することによって、及びイムノラベリングによるClockタンパク質のラベリングによる免疫組織化学によって実施した。ウエスタンブロッティングの方法は、真皮細胞内のClockタンパク質のレベルを評価することが可能な半定量的な方法である。
【００４０】
プロトコール
ａ）ウエスタンブロットによる研究
１％に希釈した（１０−４Ｍ溶液から）配列番号１のペプチドの存在下または不存在下で、５％ＣＯ２を含む湿潤環境中で３７℃で１６時間１００ｍｍの直径を有する容器中で培養線維芽細胞を培養する。細胞をすすぎ、プロテアーゼインヒビターのカクテル（Sigma）の存在下で抽出バッファー（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％トリトン×１０）の補助で支持体から細胞を取り出す。かくして抽出されたタンパク質を１００００ｒｐｍで４℃で遠心分離し、その後ＢＣＡタンパク質定量キット（Pierce）によって定量する。細胞溶解物を変性バッファーと混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供する。使用されたゲルは４−１２％Nupage（Invitrogen）である。次いでタンパク質をニトロセルロース膜（Pal corporation）に移す。膜を環境温度で２時間５％PBS-ミルク及び０．１％Tween 20で飽和し、次いで１／１０００に希釈した抗Clock一次抗体（ABcan）で４℃で一晩インキュベートし、その後１／５０００に希釈した抗ウサギ二次抗体Ｉｇｇｙ-ペルオキシダーゼでインキュベートする。視覚化を化学発光基質によって実施した。細胞中に存在するタンパク質の定量評価を、ケミイメージャーソフトウェア（Alpha innotech Corporation USA）を使用して実施した。処理を受けていないコントロール条件と比較したタンパク質の量を、発光強度のパーセンテージとして表す。
【００４１】
ｂ）免疫組織化学による研究
培養線維芽細胞を、１％に希釈した（１０−４Ｍ溶液から）配列番号１のペプチドの存在下または不存在下で、５％ＣＯ２を含む湿潤環境中で３７℃で１８時間８穴チェンバー（ラブテック）で培養する。非処理細胞を同じ時間で培養し、コントロールとして機能する。ラベリングの実施日に、細胞をすすぎ、混合物（２％グルタルアルデヒド−２％ホルムアルデヒド）中で３分間固定化し、細胞をすすぐ。１／２５０に希釈した一次抗体（ABcan）を１時間適用し、１／５０に希釈し蛍光色素に接合した二次抗体を１時間適用する。次いで細胞を、適切な搭載媒体中でスライドとカバーガラスの間に配置し、蛍光顕微鏡下で観察する。
【００４２】
結果
ウエスタンブロットによって得られた結果は、１％に希釈した配列番号１のペプチドによる処理が、培養線維芽細胞中に存在するClockタンパク質の量を増大することを示す。この結果は以下の表に要約されている。
【００４３】
【表１】
【００４４】
これらの結果は、線維芽細胞中のClockタンパク質のラベリングにより確認される。
実際、Clockタンパク質の発現の増大は、処理された繊維が細胞で示される。
【００４５】
結論：
配列番号１のペプチドの投与は、培養真皮細胞におけるClockタンパク質の量を増大することが可能である。
【００４６】
実施例２：皮膚生検におけるClock及びPerタンパク質の発現に対する配列番号１のペプチドの活性化効果の説明
配列番号１のペプチドの活性化効果の研究を、ex vivoで皮膚生検におけるClock及びPer-1タンパク質の発現を評価することによって実施した。
【００４７】
プロトコール
イムノブロッティングによるex vivoでの研究は、皮膚サンプル中のClock及びPer-1タンパク質の発現を評価することが可能である。ヒト皮膚のサンプルを気相／液相界面で培養する。１％に希釈した（１０−４Ｍ溶液から）配列番号１のペプチドをこれらのサンプルに４８時間に亘り、２４時間当たり二度の速度で局所適用する。
【００４８】
配列番号１のペプチドで処理していない皮膚サンプルは、コントロールとして機能する。皮膚サンプルを１０％ホルムアルデヒドで固定化し、パラフィンに埋没させる。次いで３μｍの切片をミクロトームで作製する。パラフィンの除去と抗原性部位の脱マスキングの後、イムノラベリングを実施する。
【００４９】
Clockタンパク質についてのイムノラベリングを、１／２５０に希釈した抗体（ABcan）と１／５０に希釈し蛍光色素に接合した二次抗体によって実施する。
【００５０】
Per-1タンパク質についてのイムノラベリングを、１／１００に希釈したポリクローナル抗体（Cosmobio）と１／５０に希釈し蛍光色素に接合した二次抗体によって実施する。
【００５１】
次いでスライドを適切な媒体に載せ、蛍光顕微鏡下で観察する（Nikon Eclipse E600）。
【００５２】
結果：
得られた結果により、配列番号１のペプチドで処理された皮膚は、非処理皮膚のものよりも大きい、Clockタンパク質の量を発現することが示された配列番号１のペプチドで処理された皮膚は、非処理皮膚のものより大きいPer-1タンパク質の量を発現することも同様に示された。
【００５３】
ラベリングの半定量的評価を顕微鏡観察により実施し、以下の表に要約されている。
【００５４】
【表２】
【００５５】
結論：
配列番号１のペプチドは、皮膚生検においてClock及びPER-1タンパク質の量を増大することが可能である。
【００５６】
実施例３：老化の間の皮膚生検におけるClock及びPer-1タンパク質の発現に対する配列番号１のペプチドの活性化効果の説明
配列番号１のペプチドの活性化効果の研究を、培養の間で人工的に老化させた皮膚モデルにおけるClock及びPer-1タンパク質の発現を評価することによって実施した。分析を６２時間及び１３４時間の培養の後に実施した。
【００５７】
プロトコール
イムノラベリングによるex vivoでの研究は、培養の間で老化した皮膚サンプルにおけるClock及びPer-1タンパク質の発現を評価することが可能である。ヒト皮膚のサンプルを、気相／液相界面で６２時間及び１３４時間に亘り培養する。１％に希釈した（１０−４Ｍ溶液から）配列番号１のペプチドを、実験に期間の間の一日当たり二度の速度でこれらのサンプルに局所適用する。
【００５８】
配列番号１のペプチドで処理していない皮膚サンプルは、コントロールとして機能する。皮膚サンプルを１０％ホルムアルデヒドで固定化し、パラフィンに埋没させる。次いで３μｍの切片をミクロトームで作製する。パラフィンの除去と抗原性部位の脱マスキングの後、イムノラベリングを実施する。Clockタンパク質についてのイムノラベリングを、１／２５０に希釈した抗ウサギ抗体（ABcan）と１／５０に希釈し蛍光色素に接合した二次抗体によって実施する。
【００５９】
Per-1タンパク質についてのイムノラベリングを、１／１００に希釈したポリクローナル抗体（Cosmobio）と１／５０に希釈し蛍光色素に接合した二次抗体によって実施する。
【００６０】
次いでスライドを適切な媒体に載せ、蛍光顕微鏡下で観察する（Nikon Eclipse E600）。
【００６１】
結果：
得られた結果により、Clockタンパク質のラベリング（必須に表皮）は、非処理コントロールスライドと比較して６２時間の培養の後増加することが示された。同様に、PER-1タンパク質の発現は、６２時間の培養後に増大する。１３４時間後にClockタンパク質のラベリングは、非処理コントロール皮膚と比較して大きく増加しているため、このラベリングは経時的に継続する。以下の表はラベリングの視覚的評価を与える。
【００６２】
【表３】
【００６３】
結論：
配列番号１のペプチドは、培養の間で人工的に老化した処理済皮膚生検におけるClock及びPER-1タンパク質の量を増大することが可能である。
【００６４】
実施例４：老化の間の皮膚生検に対する配列番号１のペプチドの保護効果の説明
配列番号１のペプチドの保護効果の研究を、皮膚の切片の発色による免疫組織化学によって６２時間と１３４時間での老化により引き起こされた損傷を評価することにより平行に実施した。
【００６５】
プロトコール
ヒトの皮膚のサンプルを、気相／液相界面で培養に配置する。１％に希釈した（１０−４Ｍ溶液から）配列番号１のペプチドを、６２時間及び１３４時間に亘りこれらのサンプルに局所適用する。適用を実験の期間の間一日当たり二度新しくする。非処理皮膚サンプルは、この実験の間でコントロールとして機能する。皮膚サンプルを４％ホルムアルデヒドで固定化し、パラフィンに埋没する。次いで３μｍの切片をミクロトームで作製する。組織をヘマトキシリン（細胞核を青黒色に発色する）と、細胞膜の発色に特異的であるエオシンを使用して発色する。次いで、生検の形態学的構造を透過型顕微鏡下で評価する。
【００６６】
結果：
得られた結果により、配列番号１のペプチドで処理されなかった皮膚は損傷し、細胞は空胞を生じ、核が非常に凝集した（アポトーシスの兆候）細胞の損傷が出現することが示された。対照的に、配列番号１のペプチドで処理された皮膚は、十分に保存された形態学的構造を有し、老化によって引き起こされる損傷はあまり見えなかった。６２時間と１３４時間での二つの実験について、配列番号１のペプチドは生検を皮膚の老化から保護した。
【００６７】
結論：
配列番号１のペプチドは、培養の間で人工的な老化に供された皮膚生検の構造的形態に対する保護効果を示すことができる。
【００６８】
実施例７：組成物の調製
日光保護クリーム
【表４】
【００６９】
方法：
Ａ相とＢ相の組成を７０から７５℃の間に別個に加熱する。Ｂ相を攪拌しながらＡ相に乳化する。Ｃ相を４５℃で攪拌を増しながら添加する。次いで温度が４０℃未満になってからＤ相を添加する。迅速に攪拌しながら２５℃への冷却を実施する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式：Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２のペプチド化合物に関し、並びに老化の効果と皮膚及び皮膚付属物に対するＵＶ照射の有害な効果を予防及び修正するための化粧品及び／または製薬におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮の第一の機能は、外的環境と内的媒体の間にバリアを形成することである。この役目を実施するのは、表皮の再外層である角質層である。それは、分化の最終段階ではケラチノサイト、すなわち可撓性で不透過性である厚い細胞間接合剤により互いに接合されているコルネオサイトから形成される。皮膚である物理的バリアは、ヒトが数多くのタイプの攻撃に対して自分自身を保護することを可能にする。これらの攻撃は、各種の固有の起源を有し、例えば年齢的な老化、または疲労状態の間で生じる生化学的変化、ストレスまたはホルモン変化、例えば妊娠中のもの等が存在する。他の攻撃は起源が外的なもの、例えば汚染、日光、疾患等である。これらの攻撃に応答して、皮膚の外観は変化し、シワ及び小じわの出現、色素過剰または脱色の領域、乾燥または皮膚の脱水、表皮の日焼け、弾力線維症、欠陥、加齢領域等が観察される。これらの変化は、細胞の再生、細胞の接着、並びにコラーゲン、エラスチン、及び他のタンパク質の合成の機能に対する改変によって引き起こされ、究極的には皮膚の保護的バリア機能の減少と、その魅力的でない外観を導く。全てのこれらの変化は皮膚のみに影響せず、爪及び毛髪のような皮膚付属物にも影響する。例えば毛髪は、生気がなくなりまたは灰色化し、あるいは早く抜けたりする。
【０００３】
これらの欠点を解消するために、数多くの化粧品組成物がここ数年で提案されている。これらの組成物は、水和剤、鎮静剤、抗炎症剤、抗フリーラジカル剤、抗脂漏剤、治癒剤、明色化剤、及び角質溶解剤等を単独でまたは組み合わせて使用することを含む。しかしながら、これらの組成物の全てが現在、皮膚の固有のまたは外的な起源の老化の兆候を予防または修正することが可能ではない。
【０００４】
驚くべきことに、本出願人は、以下の一般式：Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２のペプチド化合物が、各種の特徴的な老化の兆候に対するグローバルな作用の結果として、皮膚の抗老化効果を有することを発見した。更にこれらのペプチド化合物は、サーカディアンサイクルの調節に関与するClock(circadian locomotor output cycles kaput)タンパク質のアクチベーター剤であるという事実によって特徴づけされる。その結果本発明は、Clockアクチベーターであるペプチド化合物に関し、加齢によって引き起こされる兆候、並びに皮膚及び皮膚付属物に対するＵＶ照射の有害な効果を予防または修正するための、化粧品及び製薬組成物におけるそれらの使用に関する。
【０００５】
概日時計は、一連の遺伝子、特にPer-1（period）、Clock、及びBMAL-1（脳及び筋肉ARNt様タンパク質）遺伝子を含むネガティブ調節ループによって制御されている。
【０００６】
加齢は、振幅の減少と相のリードに向けた傾向と共に、生物学的リズムの変化を伴うことが示されている（Weinert D., Chronobiol. Int. 2000; 17: 261-83）。更に、概日時計はこの同じ老化プロセスによって改変されることも示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第6,291,429号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Weinert D., Chronobiol. Int. 2000; 17: 261-83
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当該技術分野では以前に、数多くの出願がClock、Per-1及びBMAL-1遺伝子によって生産されるヌクレオチド及び／またはタンパク質の使用に関して提案している。例えば、睡眠サイクルまたは生理学的若しくは内分泌プロセスを再同調するための、あるいは時差ぼけ等の後の身体の再同調のための、Clock遺伝子の産物の使用を記載する米国特許第6,291,429号を参照。しかしながら、老化の兆候、またはＵＶ照射の有害な効果の結果を予防または修正するための特異的なClockアクチベーターペプチドの使用を記載する当該技術分野の文献は存在しない
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第一に、本発明は、以下の式（Ｉ）のペプチド化合物に関する：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２
［式中、
Ｘ１はシステイン、メチオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ２はセリン、トレオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ３はアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリン、またはゼロに等しく；
Ｘ４はアスパラギン、グルタミン、またはゼロに等しく；
Ｒ１は遊離した、またはアセチル基、ベンゾイル基、トシル基、またはベンジルオキシカルボニル基から選択できる保護基によって置換された、Ｎ末端アミノ酸の第一級アミン官能基であり；
Ｒ２は遊離した、またはＣ１からＣ２０アルキル鎖またはＮＨ２、ＮＨＹまたはＮＹＹ（式中、ＹはＣ１からＣ４アルキル鎖である）から選択できる保護基によって置換された、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基のヒドロキシル基であり；
前記一般式（Ｉ）の配列は４から８アミノ酸残基から形成され；
前記一般式（Ｉ）の配列はアミノ酸Ｘ１からＸ４における他の化学的に同等なアミノ酸での置換を含んでも良い］。
【００１１】
第二に、本発明は、一般式（Ｉ）のペプチド化合物を含む化粧品または皮膚製薬組成物に関する。
【００１２】
第三に、本発明は、一般式（Ｉ）のペプチド化合物を含む化粧品または皮膚製薬組成物の使用に関する。
【００１３】
最後第四に、本発明は、一般式（Ｉ）のペプチド化合物を含む組成物の補助で実施される美容処理方法に関する。
【００１４】
本発明の第一の目的は、以下の一般式（Ｉ）のペプチド化合物に関する：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２
［式中、
Ｘ１はシステイン、メチオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ２はセリン、トレオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ３はアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリン、またはゼロに等しく；
Ｘ４はアスパラギン、グルタミン、またはゼロに等しく；
Ｒ１は遊離した、またはアセチル基、ベンゾイル基、トシル基、またはベンジルオキシカルボニル基から選択できる保護基によって置換された、Ｎ末端アミノ酸の第一級アミン官能基であり；
Ｒ２は遊離した、またはＣ１からＣ２０アルキル鎖またはＮＨ２、ＮＨＹまたはＮＹＹ（式中、ＹはＣ１からＣ４アルキル鎖である）から選択できる保護基によって置換された、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基のヒドロキシル基であり；
前記一般式（Ｉ）の配列は４から８アミノ酸残基から形成され；
前記一般式（Ｉ）の配列はアミノ酸Ｘ１からＸ４における他の化学的に同等なアミノ酸での置換を含んでも良い］。
【００１５】
変性に対する耐性を改良するために、本発明に係るペプチドの保護化形態を使用することが必要であっても良い。もちろん保護の形態は、生物学的に適合可能な形態でなければならず、化粧品または医薬の分野内での使用に適合しなければならない。ペプチド化合物は好ましくは、保護基によって保護された少なくとも一つの官能基を有し、前記保護基は、アミノ末端のアセチル化、またはカルボキシ末端のアミド化若しくはエステル化、またはその両者である。ＹがＣ１からＣ４アルキル鎖であるＮＹＹ基でのカルボキシル末端のヒドロキシル官能基のアミド化、またはアルキル基でのエステル化に基づく保護が好ましくは使用される。
【００１６】
好ましくはペプチド化合物は、以下の配列の一つを有する：
（配列番号１）Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＨ２
（配列番号２）Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
（配列番号３）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＮＨ２
（配列番号４）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＮＨ２。
【００１７】
特定の実施態様では、ペプチド化合物の配列は、配列番号１の配列、即ちＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＨ２である。
【００１８】
本発明は更に、これらの配列の相同形態に関する。用語「相同な」は、本発明によれば、配列番号１から配列番号４の配列から選択される前記ペプチドオ配列と少なくとも５０％、または好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％同一であるいずれかのペプチド配列を意味する。「少なくともＸ％同一であるペプチド配列」は、二つの配列の最適なアライメントの後に得られる、比較される二つの配列のアミノ酸残基の間の同一性のパーセンテージを表すと解される。最適なアライメントは、ＮＣＢＩサイトで入手可能なＩＴソフトウェアＢＬＡＳＴ ＰまたはＴ ＢＬＡＳＴ Ｎによって使用されるもののような部分的相同性のアルゴリズムの補助で得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
用語「相同な」は、化学的に同等なアミノ酸の置換によって、即ち同じ特徴を有する別の残基での一つの残基の置換によって、配列番号１から配列番号４の配列のペプチドの配列とは異なるペプチドを表すこともできる。かくして従来の置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの間；Ｓｅｒ及びＴｈｒの間；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの間、Ａｓｎ及びＧｌｎの間；並びに塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの間；または芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒの間で実施される。
【００２０】
用語「ペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに結合した二つ以上のアミノ酸の配列を表す。
【００２１】
「ペプチド」は、タンパク質分解的にまたは合成的に得られた、上述の本発明の天然または合成ペプチドまたはその断片の少なくとも一つ、あるいは上述のペプチドの配列によって全部または一部が形成されている配列を有するいずれかの天然または合成ペプチドを意味すると解されなければならない。
【００２２】
本発明に係る一般式（Ｉ）のペプチドは、従来の化学合成（固相でまたは均一な液相で）によって、または酵素的合成（Kullman等, J. Biol. Chem. 1980, 225, 8234）によってのいずれかで、構成的アミノ酸またはその誘導体から得ることができる。
【００２３】
本発明に係るペプチドは、天然起源または合成起源を有することができる。本発明によれば、ペプチドは好ましくは化学合成によって得られる。
【００２４】
最後に、活性成分は、単一のペプチド、またはペプチド若しくはペプチドの誘導体及び/またはアミノ酸誘導体から形成された誘導体の混合物であることができる。
【００２５】
本発明に係るペプチド化合物は、医薬として使用できる。
【００２６】
本発明の第二の目的は、一般式（I）の前記ペプチド化合物を含む化粧品組成物に関する。本発明に係る組成物は好ましくは、化粧品または皮膚科学的に許容可能な媒体を含む局所適用に適合した形態で存在する。「化粧品的または皮膚科学的に許容可能」は、毒性、寛容性、不安定性、アレルギー反応等の危険がなく、皮膚またはヒトの皮膚付属物と接触する使用に適した媒体を意味する。前記ペプチド化合物は好ましくは、約０．０００５から５００ｐｐｍの間の濃度で、好ましくは０．０１から５ｐｐｍの間の濃度で組成物中に存在する。本発明に係る組成物では、水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化若しくはプロポキシル化ジグリコール、環状ポリオール、ワセリン、植物オイル、またはこれらの溶媒のいずれかの混合物といった一つ以上の化粧品的または皮膚科学的に許容可能な溶媒中に事前に溶解される。
【００２７】
また更なる有利な実施態様によれば、本発明に係る活性成分は、リポソームのような化粧品または製薬ベクターに事前に溶解され、あるいは紛体有機ポリマー、タルク及びベントナイトのような無機支持体に吸着され、より一般的にはいずれかの生理学的に許容可能なベクター内に溶解され、またはそこに固定化される。
【００２８】
皮膚に適用される組成物は、水性または親アルコール性溶液、水中油型または油注水型エマルション、ミクロエマルション、水性または無水ゲル、漿液、またはベシクルの分散物、パッチ、クリーム、スプレー、膏薬、軟膏、ローション、ゲル、溶液、懸濁物等の形態で存在できる。前記組成物はまた、特に睫、眉毛、若しくは毛髪にブラシ若しくはクシによって適用されるシャンプー、染料、またはマスカラの形態で、あるいはワニスのような爪のケア処置物の形態で皮膚付属物に適用できる。
【００２９】
特定の実施態様では、本発明に係る組成物は更に、前記ペプチド活性成分の作用を促進する少なくとも一つの更なる活性成分を含む。非制限的な例として以下のクラスの成分が含まれる：他のペプチド活性剤、植物抽出物、治癒剤、抗老化剤、抗シワ剤、鎮静剤、抗ラジカル剤、抗ＵＶ剤、皮膚巨大分子の合成若しくはエネルギー代謝の刺激剤、水和剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、麻酔剤、皮膚分化、色素沈着若しくは脱色の調節剤、爪または毛髪成長の刺激剤等。抗ラジカル剤、または抗酸化剤、または真皮巨大分子の合成の刺激剤、あるいはエネルギー代謝の刺激剤が好ましくは使用される。
【００３０】
更に、増粘剤、乳化剤、湿潤剤、及び皮膚軟化剤、香料、抗酸化剤、皮膜形成剤、キレート剤、金属イオン封鎖剤、コンディショニング剤等といった添加剤が、前記組成物に添加できる。
【００３１】
いずれの場合でも、これらの添加剤並びにその量が、本発明に係る組成物の所望される有利な特性に対して有害とならないように選択されることが、当業者により確認されるであろう。例えばこれらの添加剤は、組成物の全重量の０．０１から２０％に対応して良い。本発明の組成物がエマルションである場合、脂肪相は、前記組成物の全重量に基づいて５から８０重量％、好ましくは５から５０重量％であることができる。前記組成物で使用される乳化剤及び共乳化剤は、考慮される分野で従来使用されるものから選択されよう。例えばそれらは、前記組成物の全重量に基づいて０．３から３０重量％の割合で使用できる。
【００３２】
本発明の第三の目的は、Clockアクチベーター活性成分としての上述のペプチド化合物の使用に関する。「Clockアクチベーター」ペプチドは、Clockタンパク質合成を増大することによって（Clock遺伝子発現の直接的または間接的な調節によって）、またはClock タンパク質の安定化、若しくはＲＮＡメッセンジャージャー転写産物の安定化のような他の生物学的プロセスによってのいずれかで、Clock活性を増大することが可能ないずれかの生物学的に活性なペプチドまたは誘導体を意味する。
【００３３】
本発明の第四の目的は、皮膚の老化の兆候を予防または処理するための前記ペプチド化合物を含む組成物の使用からなる。「皮膚の老化の兆候」は、加齢によって引き起こされる皮膚上のいずれかの視覚的な発現を含むがこれらに制限されない。特にこれは、シワ、小じわ、皮膚のひび割れ、大きな穴、不完全性、張りの欠如、脱色、加齢領域、角化症、コラーゲンの欠如、及び真皮と表皮に対する他の変化等を意味する。
【００３４】
「皮膚の老化の兆候」は更に、加齢によって引き起こされる皮膚及び皮膚付属物の外的な外観に対するいずれかの変化、例えば角質層の表面の荒れを意味するが、更に変更された外的な外観内で全身的には影響しない皮膚に対するいずれかの内的な変化、例えば真皮の日焼けまたは皮膚のいずれかの他の内的な分解をも意味する。
【００３５】
さらに本発明は、ＵＶ照射によって引き起こされる有害な効果に対して皮膚を保護するための本発明に係る組成物の使用に関する。
【００３６】
本発明の更なる目的は、酸化プロセスと関連する病理を予防または打ち消すための製薬組成物の調製のための、有効量の本発明に係るペプチド活性成分の使用に関する。
【００３７】
本発明の最後の目的は、有効量のペプチド活性成分を含む組成物を、皮膚の老化の兆候を予防または処理するために、あるいはＵＶ照射によって引き起こされる有害な効果に対して皮膚を保護するために、皮膚または皮膚付属物に局所適用することを特徴とする美容処理方法に関する。更にこの美容処理方法は、皮膚の抗老化効果を有するために、皮膚のサーカディアンリズムを念頭に置くように睡眠に至る前に前記組成物を適用することを特徴とする。実際夜間で皮膚は、再生機能、並びに代謝合成プロセスを促進する。従って、皮膚の生物学的リズムを念頭に置くことによって、上述の組成物の適用は、細胞の再生を刺激する抗老化効果、及びかくして老化の兆候を減少する再生効果を得ることが可能である。
【００３８】
以下の実施例は、本発明によって記載されたペプチド化合物の効力を記載して説明する。言及される美容製剤は本発明の代表物であるが、単に例示としてのみ記載されるものであり、本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１：培養線維芽細胞におけるClockタンパク質の発現に対する配列番号１のペプチドの活性化効果の説明
配列番号１のペプチドの活性化効果の研究を、培養線維芽細胞におけるウエスタンブロットによりClockタンパク質の発現を評価することによって、及びイムノラベリングによるClockタンパク質のラベリングによる免疫組織化学によって実施した。ウエスタンブロッティングの方法は、真皮細胞内のClockタンパク質のレベルを評価することが可能な半定量的な方法である。
【００４０】
プロトコール
ａ）ウエスタンブロットによる研究
１％に希釈した（１０−４Ｍ溶液から）配列番号１のペプチドの存在下または不存在下で、５％ＣＯ２を含む湿潤環境中で３７℃で１６時間１００ｍｍの直径を有する容器中で培養線維芽細胞を培養する。細胞をすすぎ、プロテアーゼインヒビターのカクテル（Sigma）の存在下で抽出バッファー（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％トリトン×１０）の補助で支持体から細胞を取り出す。かくして抽出されたタンパク質を１００００ｒｐｍで４℃で遠心分離し、その後ＢＣＡタンパク質定量キット（Pierce）によって定量する。細胞溶解物を変性バッファーと混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供する。使用されたゲルは４−１２％Nupage（Invitrogen）である。次いでタンパク質をニトロセルロース膜（Pal corporation）に移す。膜を環境温度で２時間５％PBS-ミルク及び０．１％Tween 20で飽和し、次いで１／１０００に希釈した抗Clock一次抗体（ABcan）で４℃で一晩インキュベートし、その後１／５０００に希釈した抗ウサギ二次抗体Ｉｇｇｙ-ペルオキシダーゼでインキュベートする。視覚化を化学発光基質によって実施した。細胞中に存在するタンパク質の定量評価を、ケミイメージャーソフトウェア（Alpha innotech Corporation USA）を使用して実施した。処理を受けていないコントロール条件と比較したタンパク質の量を、発光強度のパーセンテージとして表す。
【００４１】
ｂ）免疫組織化学による研究
培養線維芽細胞を、１％に希釈した（１０−４Ｍ溶液から）配列番号１のペプチドの存在下または不存在下で、５％ＣＯ２を含む湿潤環境中で３７℃で１８時間８穴チェンバー（ラブテック）で培養する。非処理細胞を同じ時間で培養し、コントロールとして機能する。ラベリングの実施日に、細胞をすすぎ、混合物（２％グルタルアルデヒド−２％ホルムアルデヒド）中で３分間固定化し、細胞をすすぐ。１／２５０に希釈した一次抗体（ABcan）を１時間適用し、１／５０に希釈し蛍光色素に接合した二次抗体を１時間適用する。次いで細胞を、適切な搭載媒体中でスライドとカバーガラスの間に配置し、蛍光顕微鏡下で観察する。
【００４２】
結果
ウエスタンブロットによって得られた結果は、１％に希釈した配列番号１のペプチドによる処理が、培養線維芽細胞中に存在するClockタンパク質の量を増大することを示す。この結果は以下の表に要約されている。
【００４３】
【表１】
【００４４】
これらの結果は、線維芽細胞中のClockタンパク質のラベリングにより確認される。
実際、Clockタンパク質の発現の増大は、処理された繊維が細胞で示される。
【００４５】
結論：
配列番号１のペプチドの投与は、培養真皮細胞におけるClockタンパク質の量を増大することが可能である。
【００４６】
実施例２：皮膚生検におけるClock及びPerタンパク質の発現に対する配列番号１のペプチドの活性化効果の説明
配列番号１のペプチドの活性化効果の研究を、ex vivoで皮膚生検におけるClock及びPer-1タンパク質の発現を評価することによって実施した。
【００４７】
プロトコール
イムノブロッティングによるex vivoでの研究は、皮膚サンプル中のClock及びPer-1タンパク質の発現を評価することが可能である。ヒト皮膚のサンプルを気相／液相界面で培養する。１％に希釈した（１０−４Ｍ溶液から）配列番号１のペプチドをこれらのサンプルに４８時間に亘り、２４時間当たり二度の速度で局所適用する。
【００４８】
配列番号１のペプチドで処理していない皮膚サンプルは、コントロールとして機能する。皮膚サンプルを１０％ホルムアルデヒドで固定化し、パラフィンに埋没させる。次いで３μｍの切片をミクロトームで作製する。パラフィンの除去と抗原性部位の脱マスキングの後、イムノラベリングを実施する。
【００４９】
Clockタンパク質についてのイムノラベリングを、１／２５０に希釈した抗体（ABcan）と１／５０に希釈し蛍光色素に接合した二次抗体によって実施する。
【００５０】
Per-1タンパク質についてのイムノラベリングを、１／１００に希釈したポリクローナル抗体（Cosmobio）と１／５０に希釈し蛍光色素に接合した二次抗体によって実施する。
【００５１】
次いでスライドを適切な媒体に載せ、蛍光顕微鏡下で観察する（Nikon Eclipse E600）。
【００５２】
結果：
得られた結果により、配列番号１のペプチドで処理された皮膚は、非処理皮膚のものよりも大きい、Clockタンパク質の量を発現することが示された配列番号１のペプチドで処理された皮膚は、非処理皮膚のものより大きいPer-1タンパク質の量を発現することも同様に示された。
【００５３】
ラベリングの半定量的評価を顕微鏡観察により実施し、以下の表に要約されている。
【００５４】
【表２】
【００５５】
結論：
配列番号１のペプチドは、皮膚生検においてClock及びPER-1タンパク質の量を増大することが可能である。
【００５６】
実施例３：老化の間の皮膚生検におけるClock及びPer-1タンパク質の発現に対する配列番号１のペプチドの活性化効果の説明
配列番号１のペプチドの活性化効果の研究を、培養の間で人工的に老化させた皮膚モデルにおけるClock及びPer-1タンパク質の発現を評価することによって実施した。分析を６２時間及び１３４時間の培養の後に実施した。
【００５７】
プロトコール
イムノラベリングによるex vivoでの研究は、培養の間で老化した皮膚サンプルにおけるClock及びPer-1タンパク質の発現を評価することが可能である。ヒト皮膚のサンプルを、気相／液相界面で６２時間及び１３４時間に亘り培養する。１％に希釈した（１０−４Ｍ溶液から）配列番号１のペプチドを、実験に期間の間の一日当たり二度の速度でこれらのサンプルに局所適用する。
【００５８】
配列番号１のペプチドで処理していない皮膚サンプルは、コントロールとして機能する。皮膚サンプルを１０％ホルムアルデヒドで固定化し、パラフィンに埋没させる。次いで３μｍの切片をミクロトームで作製する。パラフィンの除去と抗原性部位の脱マスキングの後、イムノラベリングを実施する。Clockタンパク質についてのイムノラベリングを、１／２５０に希釈した抗ウサギ抗体（ABcan）と１／５０に希釈し蛍光色素に接合した二次抗体によって実施する。
【００５９】
Per-1タンパク質についてのイムノラベリングを、１／１００に希釈したポリクローナル抗体（Cosmobio）と１／５０に希釈し蛍光色素に接合した二次抗体によって実施する。
【００６０】
次いでスライドを適切な媒体に載せ、蛍光顕微鏡下で観察する（Nikon Eclipse E600）。
【００６１】
結果：
得られた結果により、Clockタンパク質のラベリング（必須に表皮）は、非処理コントロールスライドと比較して６２時間の培養の後増加することが示された。同様に、PER-1タンパク質の発現は、６２時間の培養後に増大する。１３４時間後にClockタンパク質のラベリングは、非処理コントロール皮膚と比較して大きく増加しているため、このラベリングは経時的に継続する。以下の表はラベリングの視覚的評価を与える。
【００６２】
【表３】
【００６３】
結論：
配列番号１のペプチドは、培養の間で人工的に老化した処理済皮膚生検におけるClock及びPER-1タンパク質の量を増大することが可能である。
【００６４】
実施例４：老化の間の皮膚生検に対する配列番号１のペプチドの保護効果の説明
配列番号１のペプチドの保護効果の研究を、皮膚の切片の発色による免疫組織化学によって６２時間と１３４時間での老化により引き起こされた損傷を評価することにより平行に実施した。
【００６５】
プロトコール
ヒトの皮膚のサンプルを、気相／液相界面で培養に配置する。１％に希釈した（１０−４Ｍ溶液から）配列番号１のペプチドを、６２時間及び１３４時間に亘りこれらのサンプルに局所適用する。適用を実験の期間の間一日当たり二度新しくする。非処理皮膚サンプルは、この実験の間でコントロールとして機能する。皮膚サンプルを４％ホルムアルデヒドで固定化し、パラフィンに埋没する。次いで３μｍの切片をミクロトームで作製する。組織をヘマトキシリン（細胞核を青黒色に発色する）と、細胞膜の発色に特異的であるエオシンを使用して発色する。次いで、生検の形態学的構造を透過型顕微鏡下で評価する。
【００６６】
結果：
得られた結果により、配列番号１のペプチドで処理されなかった皮膚は損傷し、細胞は空胞を生じ、核が非常に凝集した（アポトーシスの兆候）細胞の損傷が出現することが示された。対照的に、配列番号１のペプチドで処理された皮膚は、十分に保存された形態学的構造を有し、老化によって引き起こされる損傷はあまり見えなかった。６２時間と１３４時間での二つの実験について、配列番号１のペプチドは生検を皮膚の老化から保護した。
【００６７】
結論：
配列番号１のペプチドは、培養の間で人工的な老化に供された皮膚生検の構造的形態に対する保護効果を示すことができる。
【００６８】
実施例７：組成物の調製
日光保護クリーム
【表４】
【００６９】
方法：
Ａ相とＢ相の組成を７０から７５℃の間に別個に加熱する。Ｂ相を攪拌しながらＡ相に乳化する。Ｃ相を４５℃で攪拌を増しながら添加する。次いで温度が４０℃未満になってからＤ相を添加する。迅速に攪拌しながら２５℃への冷却を実施する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）のペプチド化合物：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２
［式中、
Ｘ１はシステイン、メチオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ２はセリン、トレオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ３はアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリン、またはゼロに等しく；
Ｘ４はアスパラギン、グルタミン、またはゼロに等しく；
Ｒ１は遊離した、またはアセチル基、ベンゾイル基、トシル基、またはベンジルオキシカルボニル基から選択できる保護基によって置換された、Ｎ末端アミノ酸の第一級アミン官能基であり；
Ｒ２は遊離した、またはＣ１からＣ２０アルキル鎖またはＮＨ２、ＮＨＹまたはＮＹＹ（式中、ＹはＣ１からＣ４アルキル鎖である）から選択できる保護基によって置換された、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基のヒドロキシル基であり；
前記一般式（Ｉ）の配列は４から８アミノ酸残基から形成され；
前記一般式（Ｉ）の配列はアミノ酸Ｘ１からＸ４における他の化学的に同等なアミノ酸での置換を含んでも良い］。
【請求項２】
一般式（Ｉ）のペプチドが、アミノ末端のアセチル化、またはカルボキシ末端のアミド化若しくはエステル化、または両者である保護基によって保護された少なくとも一つの官能基を有することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド化合物。
【請求項３】
以下の式：
（配列番号１）Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＨ２
（配列番号２）Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
（配列番号３）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＮＨ２
（配列番号４）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＮＨ２。
の一つに対応することを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド化合物。
【請求項４】
医薬として使用することを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド化合物を活性成分として含む化粧品組成物。
【請求項６】
化粧品的に許容可能な媒体を含む局所適用に適合した形態で存在することを特徴とする、請求項５に記載の化粧品組成物。
【請求項７】
前記ペプチド化合物が、約０．０００５から５００ｐｐｍの間の濃度、好ましくは０．０１から５ｐｐｍの間の濃度で組成物中に存在することを特徴とする、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ペプチド活性成分が、水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化若しくはプロポキシル化ジグリコール、環状ポリオール、ワセリン、植物オイル、またはこれらの溶媒のいずれかの混合物といった一つ以上の溶媒中に溶解されていることを特徴とする、請求項５から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ペプチド活性成分の作用を促進する少なくとも一つの活性成分を更に含むことを特徴とする、請求項５から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記活性成分が、抗ラジカル剤、または抗酸化剤、または真皮巨大分子の合成の刺激剤、あるいはエネルギー代謝の刺激剤であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
Clockアクチベーター活性成分としての、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド化合物の使用。
【請求項１２】
前記組成物が、皮膚の老化の兆候を予防または処理することが可能であることを特徴とする、請求項５から１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
前記組成物が、ＵＶ照射によって引き起こされる有害な効果に対して皮膚を保護することを特徴とする、請求項１２に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
酸化プロセスと関連する病理を予防または打ち消すための製薬組成物を調製するための、請求項１から４のいずれか一項に規定された有効量のペプチド活性成分の使用。
【請求項１５】
請求項１から３のいずれか一項に規定された有効量のペプチド活性成分を含む組成物を、皮膚の老化の兆候を予防または処理するため、あるいはＵＶ照射によって引き起こされる有害な効果に対して皮膚を保護するために、処理される皮膚または皮膚付属物に局所適用することを特徴とする美容処理方法。
【請求項１６】
前記組成物が、皮膚に対する抗老化効果を有するように、皮膚のサーカディアンリズムを念頭に置くように、睡眠に至る前に適用されることを特徴とする、請求項１５に記載の美容処理方法。
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）のペプチド化合物：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｒ２
［式中、
Ｘ１はシステイン、メチオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ２はセリン、トレオニン、またはゼロに等しく；
Ｘ３はアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリン、またはゼロに等しく；
Ｘ４はアスパラギン、グルタミン、またはゼロに等しく；
Ｒ１は遊離した、またはアセチル基、ベンゾイル基、トシル基、またはベンジルオキシカルボニル基から選択できる保護基によって置換された、Ｎ末端アミノ酸の第一級アミン官能基であり；
Ｒ２は遊離した、またはＣ１からＣ２０アルキル鎖またはＮＨ２、ＮＨＹまたはＮＹＹ（式中、ＹはＣ１からＣ４アルキル鎖である）から選択できる保護基によって置換された、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基のヒドロキシル基であり；
前記一般式（Ｉ）の配列は４から８アミノ酸残基から形成され；
前記一般式（Ｉ）の配列はアミノ酸Ｘ１からＸ４における他の化学的に同等なアミノ酸での置換を含んでも良い］。
【請求項２】
一般式（Ｉ）のペプチドが、アミノ末端のアセチル化、またはカルボキシ末端のアミド化若しくはエステル化、または両者である保護基によって保護された少なくとも一つの官能基を有することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド化合物。
【請求項３】
以下の式：
（配列番号１）Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＨ２
（配列番号２）Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
（配列番号３）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＮＨ２
（配列番号４）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＮＨ２。
の一つに対応することを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド化合物。
【請求項４】
医薬として使用することを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド化合物を活性成分として含む化粧品組成物。
【請求項６】
化粧品的に許容可能な媒体を含む局所適用に適合した形態で存在することを特徴とする、請求項５に記載の化粧品組成物。
【請求項７】
前記ペプチド化合物が、約０．０００５から５００ｐｐｍの間の濃度、好ましくは０．０１から５ｐｐｍの間の濃度で組成物中に存在することを特徴とする、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ペプチド活性成分が、水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化若しくはプロポキシル化ジグリコール、環状ポリオール、ワセリン、植物オイル、またはこれらの溶媒のいずれかの混合物といった一つ以上の溶媒中に溶解されていることを特徴とする、請求項５から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ペプチド活性成分の作用を促進する少なくとも一つの活性成分を更に含むことを特徴とする、請求項５から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記活性成分が、抗ラジカル剤、または抗酸化剤、または真皮巨大分子の合成の刺激剤、あるいはエネルギー代謝の刺激剤であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
Clockアクチベーター活性成分としての、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド化合物の使用。
【請求項１２】
前記組成物が、皮膚の老化の兆候を予防または処理することが可能であることを特徴とする、請求項５から１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
前記組成物が、ＵＶ照射によって引き起こされる有害な効果に対して皮膚を保護することを特徴とする、請求項１２に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
酸化プロセスと関連する病理を予防または打ち消すための製薬組成物を調製するための、請求項１から４のいずれか一項に規定された有効量のペプチド活性成分の使用。
【請求項１５】
請求項１から３のいずれか一項に規定された有効量のペプチド活性成分を含む組成物を、皮膚の老化の兆候を予防または処理するため、あるいはＵＶ照射によって引き起こされる有害な効果に対して皮膚を保護するために、処理される皮膚または皮膚付属物に局所適用することを特徴とする美容処理方法。
【請求項１６】
前記組成物が、皮膚に対する抗老化効果を有するように、皮膚のサーカディアンリズムを念頭に置くように、睡眠に至る前に適用されることを特徴とする、請求項１５に記載の美容処理方法。
【公表番号】特表２０１２−５１４６２６（Ｐ２０１２−５１４６２６Ａ）
【公表日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４８９９（Ｐ２０１１−５４４８９９）
【出願日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０００００７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９２８５
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５１１１５２４８５）アイエスピー・インヴェストメンツ・インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０００００７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９２８５
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５１１１５２４８５）アイエスピー・インヴェストメンツ・インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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