皮膚外用剤
【課題】皮膚内に存在する幹細胞の優れた増殖効果や線維芽細胞や角化細胞への分化誘導促進効果を持つ素材を含有することを特徴とし、肌荒れやシワを改善し、加齢などに伴う皮膚の損傷を総合的に改善できる皮膚外用剤を提供する。
【解決手段】セイヨウミザクラ種子の抽出物、紫麦種子の抽出物及びハンタイカイ種子の抽出物に、それぞれ優れた幹細胞の増殖促進効果、線維芽細胞への分化誘導促進効果及び角化細胞への分化誘導促進効果を見出し、これらを含有することを特徴とする皮膚外用剤は肌荒れやシワに対する優れた改善効果を示した。
【解決手段】セイヨウミザクラ種子の抽出物、紫麦種子の抽出物及びハンタイカイ種子の抽出物に、それぞれ優れた幹細胞の増殖促進効果、線維芽細胞への分化誘導促進効果及び角化細胞への分化誘導促進効果を見出し、これらを含有することを特徴とする皮膚外用剤は肌荒れやシワに対する優れた改善効果を示した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バラ科サクラ属に属するセイヨウミザクラ（学名：Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ Ｌ．）の種子の抽出物を含有することを特徴とする皮膚内に存在する幹細胞の増殖促進用外用剤、イネ科オオムギ属に属する紫麦（学名：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）の種子の抽出物を含有することを特徴とする皮膚内に存在する幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進用外用剤、アオギリ科に属するハンタイカイ（学名：Ｓｔｅｒｃｕｌｉａ ｓｃａｐｈｉｇｅｒａ ＷＡＬＬ）の種子の抽出物を含有することを特徴とする皮膚内に存在する幹細胞の角化細胞への分化誘導促進用外用剤及びこれらを含有することを特徴とする皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞・臓器に分化する多能性を有しており、この性質により細胞・組織の損傷部を補うことで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した、次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。
【０００３】
哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、すべての血液細胞再生の源であることが明らかにされた。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、その他の臓器（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪など）へ分化可能な幹細胞が包含されていることが報告されている（非特許文献１参照）。
さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪、皮膚など、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生および恒常性維持を司っていることがわかってきた（非特許文献２〜５参照）。
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｌｌ Ｍ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， １９９７，３，１３３７−１３４５
【非特許文献３】Ｚｕｌｅｗｓｋｉ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ２００１，５０，５２１−５３３
【非特許文献４】Ｓｕｚｕｋｉ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２０００，３２，１２３０−１２３９
【非特許文献５】Ｚｕｋ Ｐ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２００１，７，２１１−２２８
【０００４】
幹細胞の存在する器官の中でも、皮膚は、紫外線などの刺激に日常的にさらされており、損傷が顕著に見られる器官である。
【０００５】
皮膚内における幹細胞は、表皮及び真皮に存在していると考えられており（非特許文献６，７参照）、それらは多分化能を示し、皮膚の細胞にも分化可能であると考えられる（非特許文献８参照）。
【非特許文献６】Ｂｉｃｋｅｎｂａｃｈ Ｊｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， １９８７，８８，４２−４６
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ ＦＧ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，２００７，１２０，２８７５−２８８３
【非特許文献８】Ｆｕｃｈｓ Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｃｅｌｌ， ２００１， Ｊｕｌ．１（１），１３−２５， Ｒｅｖｉｅｗ．
【０００６】
しかしながら、現状では、幹細胞の有用性及び、皮膚への局在は示されているものの、幹細胞を増殖させ、表皮や真皮の細胞へと分化誘導することによって皮膚の損傷を回復させる素材についての検討はなされていない。
【０００７】
また、本発明に用いるセイヨウミザクラ種子、紫麦種子及びハンタイカイ種子は、それぞれ単独で用いた皮膚外用剤は知られているが（特許文献１〜３参照）、組み合わせて用いることにより、効果を高めたものは検討されていない。
【特許文献１】特開平１１−３１５０１０
【特許文献２】特開２００８−１４３８２７
【特許文献３】特開２００５−１９４２３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
かかる状況に鑑み、本発明は、皮膚における幹細胞を増殖させ、表皮や真皮の細胞に分化させる効果を持つ素材を提供し、それらを含有し、肌荒れやシワを改善し、皮膚の受ける損傷を総合的に改善することのできる皮膚外用剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、バラ科サクラ属に属するセイヨウミザクラ種子の抽出物の皮膚内に存在する幹細胞の優れた増殖促進効果、紫麦種子の抽出物の皮膚内に存在する幹細胞の優れた線維芽細胞への分化誘導促進効果及びハンタイカイ種子の抽出物の皮膚内に存在する幹細胞の角化細胞への優れた分化誘導促進効果を見出し、さらに、それらを含有した皮膚外用剤に、肌荒れやシワを改善する効果を確認し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、即ち、以下の通りである。
（１）セイヨウミザクラ種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の増殖促進用外用剤。
（２）紫麦種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進用外用剤。
（３）ハンタイカイ種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の角化細胞への分化誘導促進用外用剤。
（４）これらを含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【００１１】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明に用いるセイヨウミザクラは、オウトウとも呼ばれ、学名はＰｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ Ｌ．である。主要品種として、アメリカンチェリー、佐藤錦、ナポレオンなどの食用品種が挙げられる。紫麦は、頴、頴果、茎又は葉が紫色の大麦のことを指し、学名はＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．である。例えば、大麦の品種ではＯＵＣ３２１、ＣＩ１５８、ＣＩ２４４等が挙げられる。ハンタイカイとは、アオギリ科に属する落葉高木で、学名はＳｔｅｒｃｕｌｉａ ｓｃａｐｈｉｇｅｒａ ＷＡＬＬである。
【００１３】
上記植物からの抽出物の調製に際し、種子を含む植物体そのままを用いることも可能であり、花、葉、茎、根、樹皮又は果実などより選択した部位を混合して用いても良い。より好ましくは、種子のみを用いるのが良い。また、抽出には、植物体をそのまま使用しても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってから抽出を行っても良い。
【００１４】
抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコールが良く、特に好ましくは、水が良い。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いても良い。また、抽出法は特に限定されないが、加熱による抽出が好ましい。さらに上記抽出溶媒に酸やアルカリを添加してｐＨ調整して用いてもよい。
【００１５】
それぞれの種子の抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、稀釈、濾過等の処理及び活性炭等による脱色、脱臭処理をして用いても良い。特に、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いることが好ましい。
【００１６】
それぞれの種子の抽出物を溶液の状態で用いる場合の成分含有量は特に限定されないが、乾燥物として０．００００１〜１０重量％であることが好ましく、０．０００１〜１重量％含まれる濃度で使用することが最も好ましい。０．００００１重量％未満であると本発明の効果が十分に発揮されにくい場合がある。
【００１７】
また、本発明の皮膚外用剤は、効果を損なわない範囲内で、必要に応じ、通常の医薬品、医薬部外品、化粧品などに使用される成分を適宜配合することができる。例えば、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、酸化防止剤、美白剤、キレート剤等の成分を配合することができる。
【００１８】
本発明の皮膚外用剤の用途は、特に限定されるものではないが、軟膏、乳剤、ゲル剤、ローション剤、クリーム剤、パップ剤、エアゾール剤、ペースト剤、プラスター剤、洗浄剤等に用いることができる。また、本発明の皮膚外用剤は医薬品、医薬部外品及び化粧品を含むものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明を詳細に説明するため、実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２０】
以下に、セイヨウミザクラ（ナポレオン）種子、紫麦種子、ハンタイカイ種子を用いた溶媒抽出物の製造例を示す。
【実施例１】
【００２１】
製造例１ セイヨウミザクラ（ナポレオン）種子の熱水抽出物
セイヨウミザクラ種子の粉砕物２５ｇに精製水５００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してセイヨウミザクラ種子の熱水抽出物を２．０ｇ得た。
【００２２】
製造例２ セイヨウミザクラ（ナポレオン）種子の５０％エタノール抽出物
セイヨウミザクラ種子の粉砕物２５ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール５００ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、セイヨウミザクラ種子の５０％エタノール抽出物を１．０ｇ得た。
【００２３】
製造例３ セイヨウミザクラ（ナポレオン）種子のエタノール抽出物
セイヨウミザクラ種子の粉砕物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、セイヨウミザクラ種子のエタノール抽出物を３．３ｇ得た。
【００２４】
製造例４ 紫麦種子の熱水抽出物
紫麦種子の粉砕物５０ｇに精製水５００ｍＬを加え、９５〜１００℃で１時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、紫麦種子の熱水抽出物を９．２ｇ得た。
【００２５】
製造例５ 紫麦種子の５０％エタノール抽出物
紫麦種子の粉砕物５０ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール５００ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、紫麦種子の５０％エタノール抽出物を３．８ｇ得た。
【００２６】
製造例６ 紫麦種子のエタノール抽出物
紫麦種子の粉砕物５０ｇにエタノール５００ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、紫麦種子のエタノール抽出物を１．２ｇ得た。
【００２７】
製造例７ ハンタイカイ種子の熱水抽出物
ハンタイカイ種子の乾燥物２０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してハンタイカイの熱水抽出物を３．４ｇ得た。
【００２８】
製造例８ ハンタイカイ種子の５０％エタノール抽出物
ハンタイカイ種子の乾燥物２０ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ハンタイカイの５０％エタノール抽出物を３．７ｇ得た。
【００２９】
製造例９ ハンタイカイ種子のエタノール抽出物
ハンタイカイ種子の乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ハンタイカイのエタノール抽出物を６．７ｇ得た。
【００３０】
次に、本発明に用いる種子の抽出物を用いた皮膚外用剤の処方例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例２】
【００３１】
処方例１ 軟膏
処方 配合量
１．セイヨウミザクラ種子の
５０％エタノール抽出物（製造例２） ０．５部
２．紫麦種子の５０％エタノール抽出物（製造例５） ０．５
３．ハンタイカイ種子の５０％エタノール抽出物（製造例８）０．５
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．モノステアリン酸グリセリン １０．０
６．流動パラフィン ５．０
７．セタノール ６．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．プロピレングリコール １０．０
１０．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分４〜７を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１〜３及び８〜１０を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３２】
比較例１〜４ 従来の軟膏
処方例１において、セイヨウミザクラ種子の５０％エタノール抽出物のみを含有したものを比較例１、紫麦種子の５０％エタノール抽出物のみを含有したものを比較例２、ハンタイカイ種子の５０％エタノール抽出物のみを含有したものを比較例３、すべて除いたものを比較例４とした。
【００３３】
処方例２ 乳剤
処方 配合量
１．セイヨウミザクラ種子の熱水抽出物（製造例１） ０．００１部
２．紫麦種子の熱水抽出物（製造例４） ０．００１
３．ハンタイカイ種子の熱水抽出物（製造例７） ０．００１
４．スクワラン ５．０
５．オリーブ油 ５．０
６．ホホバ油 ５．０
７．セタノール １．５
８．モノステアリン酸グリセリン ２．０
９．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
１０．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
１１．香料 ０．１
１２．プロピレングリコール １．０
１３．グリセリン ２．０
１４．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１５．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分４〜１０を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１〜３及び１２〜１５を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１１を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００３４】
処方例３ ゲル剤
処方 配合量
１．セイヨウミザクラ種子のエタノール抽出物（製造例３） １．０部
２．紫麦種子のエタノール抽出物（製造例６） １．０
３．ハンタイカイ種子エキスのエタノール抽出物（製造例９）１．０
４．エタノール ５．０
５．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
６．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
７．香料 適量
８．１，３−ブチレングリコール ５．０
９．グリセリン ５．０
１０．キサンタンガム ０．１
１１．カルボキシビニルポリマー ０．２
１２．水酸化カリウム ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分４〜７と、成分１〜３及び８〜１３をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
【００３５】
処方例４ ローション剤
処方 配合量
１．セイヨウミザクラ種子の熱水抽出物（製造例１） ０．１部
２．紫麦種子の熱水抽出物（製造例４） ０．１
３．ハンタイカイ種子の熱水抽出物（製造例７） ０．１
４．１，３−ブチレングリコール ８．０
５．グリセリン ２．０
６．キサンタンガム ０．０２
７．クエン酸 ０．０１
８．クエン酸ナトリウム ０．１
９．エタノール ５．０
１０．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
１１．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１２．香料 適量
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜８及び１３と、成分９〜１２をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
【００３６】
処方例５ クリーム剤
処方 配合量
１．セイヨウミザクラ種子の
５０％エタノール抽出物（製造例２） ０．０５部
２．紫麦種子の５０％エタノール抽出物（製造例５） ０．０５
３．ハンタイカイ種子の５０％エタノール抽出物（製造例８）０．０５
４．スクワラン ５．５
５．オリーブ油 ３．０
６．ステアリン酸 ２．０
７．ミツロウ ２．０
８．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
９．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
１０．ベヘニルアルコール １．５
１１．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１２．香料 ０．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１５．１，３−ブチレングリコール ８．５
１６．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分４〜１１を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１〜３及び１３〜１６を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１２を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【実施例３】
【００３７】
以下に、実施例１で示した製造例１〜３のセイヨウミザクラ種子の抽出物を用いた、幹細胞の増殖促進効果の実験例とその結果を示す。
【００３８】
実験例１ 幹細胞の増殖促進効果の評価
ヒト幹細胞培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ヒト体性幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を６ｃｍディッシュに１ｘ１０５個播種し、セイヨウミザクラ種子の抽出物（製造例１〜３）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、それぞれの細胞数をカウントした。
抽出物未添加時の総細胞数をコントロールとし、コントロールを１００（％）とした場合の、セイヨウミザクラ種子の抽出物（製造例１〜３）添加時の細胞数の増減（％）を算出し、幹細胞の細胞増殖促進効果の評価を行った。
なお、本実験例では、一般的に幹細胞の増殖促進因子として使用されているＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ：幹細胞成長因子）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）を陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。
【００３９】
これらの試験結果を表１に示した。その結果、セイヨウミザクラ種子の抽出物（製造例１〜３）全てに、顕著な幹細胞の細胞増殖促進効果が認められた。以上より、セイヨウミザクラ種子の抽出物の極めて優れた幹細胞の細胞増殖促進効果を明らかとし、セイヨウミザクラ種子の抽出物の増殖促進効果を確認した。これらセイヨウミザクラ種子の増殖効果は、現在、幹細胞の増殖促進因子として一般的に用いられているＳＣＦに比べても、顕著に高い効果を示した。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞の細胞増殖促進効果が認められた。
【００４０】
【表１】
【００４１】
以下に、実施例１で示した製造例４〜６の紫麦種子の抽出物を用いた、幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進効果を評価し、該抽出物の幹細胞から線維芽細胞への分化誘導促進剤としての性能を確認する実験例とその結果を示す。
【００４２】
実験例２ 幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進効果の評価
ヒト幹細胞培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて培養したヒト体性幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を９６ｗｅｌｌプレートに５ｘ１０３個播種し、紫麦の種子抽出物（製造例４〜６）を最終濃度が０．００１％になるように添加して７日間培養を続けた。７日後、幹細胞から線維芽細胞への分化誘導効率について評価した。線維芽細胞への分化誘導効果の指標としては、１型コラーゲンの遺伝子発現（発現が高いほど線維芽細胞へ分化が促進した）を測定した。具体的には、細胞からＴａｑＭａｎ ＧＥＮＥ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｔＴＭｋｉｔ（アプライドバイオシステム社）を用いてｍＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにより１型コラーゲンの遺伝子発現を測定した。
抽出物未添加時のコラーゲン遺伝子の発現をコントロール（１００％）とした場合の、紫麦種子の抽出物（製造例４〜６）添加時のコラーゲン発現の増減（％）を算出し、幹細胞から線維芽細胞への分化誘導促進効果の評価を行った。
なお、本実験例では、一般的に線維芽細胞の分化誘導因子として使用されているｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ：線維芽細胞成長因子）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）を陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。
【００４３】
これらの試験結果を表２に示した。その結果、紫麦種子の抽出物（製造例４〜６）全てに、顕著な線維芽細胞への分化誘導促進効果が認められた。以上より、紫麦種子の抽出物に極めて優れた線維芽細胞への分化誘導促進効果を明らかとし、紫麦種子の抽出物の分化誘導促進剤としての効果を確認した。これら紫麦種子の抽出物の分化誘導促進効果は、現在、線維芽細胞の分化誘導因子として一般的に用いられているｂＦＧＦに比べても、顕著に高い効果を示した。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、その他、未分化な状態の細胞（体性幹細胞）についても試験を行ったところ、同様な効果が確認できた。
【００４４】
【表２】
【００４５】
以下に、実施例１で示した製造例７〜９のハンタイカイの種子抽出物を用いた、幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果を評価し、該抽出物の角化細胞への分化誘導促進剤としての効果について確認した。
【００４６】
実験例３ 幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果の評価
ＭＣＤＢ１５３培養液（Ｓｉｇｍａ社製）に、ＩＴＳ−Ｘサプリメント（１００倍希釈、ＧＩＢＣＯ社製）、ハイドロコルチゾン（０．４ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて調製した培地を用いて、マウス表皮組織から分離した幹細胞を、６ｃｍディッシュに１ｘ１０６個播種し、各抽出物（製造例７〜９）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、血球計数板にて細胞数をカウントした後、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（Ｓｉｇｍａ社製）にてタンパク質を抽出し、角化細胞への分化状態の測定を豊岡らの報告に従って行った（非特許文献９参照）。
すなわち、角化細胞への分化状態を示しているインボルクリンタンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法にて定量解析し、これを指標に、幹細胞から角化細胞への分化誘導促進効果を評価した。この場合、ハンタイカイの種子抽出物を添加せずに培養した細胞が発現したインボルクリンタンパク質の量をコントロール（１００％）とし、各抽出物（製造例７〜９）を添加して培養した時のインボルクリンタンパク質の発現量を相対値（％）として算出し、コントロールと比較することで、角化細胞への分化誘導促進効果（％）について評価した。なお、本実験例では、一般的に角化細胞の分化誘導因子として使用されているＥｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ：角化細胞成長因子、非特許文献１０参照）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）を陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。
【非特許文献９】豊岡 やよい，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｒ臨時増刊号 再生医学，２００３，１０６−１１５
【非特許文献１０】Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ．ＪＤ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，１９７７，２６５，４２１−４２４
【００４７】
これらの試験結果を表３に示した。その結果、ハンタイカイ種子の抽出物（製造例７〜９）全てに、顕著な幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果が認められた。以上より、ハンタイカイ種子の抽出物の極めて優れた幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果を明らかとし、ハンタイカイ種子の抽出物の分化誘導促進剤としての効果を確認した。これらハンタイカイの種子抽出物の分化誘導促進効果は、現在、角化細胞の分化誘導因子として一般的に用いられているＥＧＦに比べても、顕著に高い効果を示した。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、その他、未分化な状態の細胞（体性幹細胞）についても試験を行ったところ、同様な効果が確認できた。
【００４８】
【表３】
【００４９】
実験例４ 臨床試験
処方例１の軟膏を用いて肌荒れやシワが確認される女性２５人（４０〜６０才）を対象に２ヶ月間の臨床試験を行った。２５人をランダムに５人ずつ五群に分け、各群において、それぞれ、処方例１又は比較例１〜４の軟膏を使用してもらった。２ヶ月間の使用後、目視にて評価を行い、５（著効）〜０（効果なし）の６段階にスコア化し、各群の比較により評価した。
【００５０】
臨床試験の結果を表４に示した。処方例１の軟膏は比較例と比較して、有意に肌荒れやシワに対する改善効果を示した。なお、試験期間中、皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。
【００５１】
【表４】
【００５２】
処方例２〜５についても同様に臨床試験を行ったところ、いずれも安全で優れた肌荒れやシワに対する改善効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のセイヨウミザクラ種子の抽出物、紫麦種子の抽出物及びハンタイカイ種子の抽出物は、それぞれ皮膚内に存在する幹細胞の優れた増殖促進効果、線維芽細胞への分化誘導促進効果及び角化細胞への分化誘導促進効果を持ち、それらを含有した皮膚外用剤は、肌荒れやシワを改善する効果に優れており、医薬品や医薬部外品、化粧品として利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バラ科サクラ属に属するセイヨウミザクラ（学名：Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ Ｌ．）の種子の抽出物を含有することを特徴とする皮膚内に存在する幹細胞の増殖促進用外用剤、イネ科オオムギ属に属する紫麦（学名：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）の種子の抽出物を含有することを特徴とする皮膚内に存在する幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進用外用剤、アオギリ科に属するハンタイカイ（学名：Ｓｔｅｒｃｕｌｉａ ｓｃａｐｈｉｇｅｒａ ＷＡＬＬ）の種子の抽出物を含有することを特徴とする皮膚内に存在する幹細胞の角化細胞への分化誘導促進用外用剤及びこれらを含有することを特徴とする皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞・臓器に分化する多能性を有しており、この性質により細胞・組織の損傷部を補うことで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した、次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。
【０００３】
哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、すべての血液細胞再生の源であることが明らかにされた。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、その他の臓器（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪など）へ分化可能な幹細胞が包含されていることが報告されている（非特許文献１参照）。
さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪、皮膚など、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生および恒常性維持を司っていることがわかってきた（非特許文献２〜５参照）。
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｌｌ Ｍ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， １９９７，３，１３３７−１３４５
【非特許文献３】Ｚｕｌｅｗｓｋｉ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ２００１，５０，５２１−５３３
【非特許文献４】Ｓｕｚｕｋｉ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２０００，３２，１２３０−１２３９
【非特許文献５】Ｚｕｋ Ｐ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２００１，７，２１１−２２８
【０００４】
幹細胞の存在する器官の中でも、皮膚は、紫外線などの刺激に日常的にさらされており、損傷が顕著に見られる器官である。
【０００５】
皮膚内における幹細胞は、表皮及び真皮に存在していると考えられており（非特許文献６，７参照）、それらは多分化能を示し、皮膚の細胞にも分化可能であると考えられる（非特許文献８参照）。
【非特許文献６】Ｂｉｃｋｅｎｂａｃｈ Ｊｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， １９８７，８８，４２−４６
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ ＦＧ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，２００７，１２０，２８７５−２８８３
【非特許文献８】Ｆｕｃｈｓ Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｃｅｌｌ， ２００１， Ｊｕｌ．１（１），１３−２５， Ｒｅｖｉｅｗ．
【０００６】
しかしながら、現状では、幹細胞の有用性及び、皮膚への局在は示されているものの、幹細胞を増殖させ、表皮や真皮の細胞へと分化誘導することによって皮膚の損傷を回復させる素材についての検討はなされていない。
【０００７】
また、本発明に用いるセイヨウミザクラ種子、紫麦種子及びハンタイカイ種子は、それぞれ単独で用いた皮膚外用剤は知られているが（特許文献１〜３参照）、組み合わせて用いることにより、効果を高めたものは検討されていない。
【特許文献１】特開平１１−３１５０１０
【特許文献２】特開２００８−１４３８２７
【特許文献３】特開２００５−１９４２３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
かかる状況に鑑み、本発明は、皮膚における幹細胞を増殖させ、表皮や真皮の細胞に分化させる効果を持つ素材を提供し、それらを含有し、肌荒れやシワを改善し、皮膚の受ける損傷を総合的に改善することのできる皮膚外用剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、バラ科サクラ属に属するセイヨウミザクラ種子の抽出物の皮膚内に存在する幹細胞の優れた増殖促進効果、紫麦種子の抽出物の皮膚内に存在する幹細胞の優れた線維芽細胞への分化誘導促進効果及びハンタイカイ種子の抽出物の皮膚内に存在する幹細胞の角化細胞への優れた分化誘導促進効果を見出し、さらに、それらを含有した皮膚外用剤に、肌荒れやシワを改善する効果を確認し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、即ち、以下の通りである。
（１）セイヨウミザクラ種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の増殖促進用外用剤。
（２）紫麦種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進用外用剤。
（３）ハンタイカイ種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の角化細胞への分化誘導促進用外用剤。
（４）これらを含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【００１１】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明に用いるセイヨウミザクラは、オウトウとも呼ばれ、学名はＰｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ Ｌ．である。主要品種として、アメリカンチェリー、佐藤錦、ナポレオンなどの食用品種が挙げられる。紫麦は、頴、頴果、茎又は葉が紫色の大麦のことを指し、学名はＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．である。例えば、大麦の品種ではＯＵＣ３２１、ＣＩ１５８、ＣＩ２４４等が挙げられる。ハンタイカイとは、アオギリ科に属する落葉高木で、学名はＳｔｅｒｃｕｌｉａ ｓｃａｐｈｉｇｅｒａ ＷＡＬＬである。
【００１３】
上記植物からの抽出物の調製に際し、種子を含む植物体そのままを用いることも可能であり、花、葉、茎、根、樹皮又は果実などより選択した部位を混合して用いても良い。より好ましくは、種子のみを用いるのが良い。また、抽出には、植物体をそのまま使用しても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってから抽出を行っても良い。
【００１４】
抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコールが良く、特に好ましくは、水が良い。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いても良い。また、抽出法は特に限定されないが、加熱による抽出が好ましい。さらに上記抽出溶媒に酸やアルカリを添加してｐＨ調整して用いてもよい。
【００１５】
それぞれの種子の抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、稀釈、濾過等の処理及び活性炭等による脱色、脱臭処理をして用いても良い。特に、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いることが好ましい。
【００１６】
それぞれの種子の抽出物を溶液の状態で用いる場合の成分含有量は特に限定されないが、乾燥物として０．００００１〜１０重量％であることが好ましく、０．０００１〜１重量％含まれる濃度で使用することが最も好ましい。０．００００１重量％未満であると本発明の効果が十分に発揮されにくい場合がある。
【００１７】
また、本発明の皮膚外用剤は、効果を損なわない範囲内で、必要に応じ、通常の医薬品、医薬部外品、化粧品などに使用される成分を適宜配合することができる。例えば、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、酸化防止剤、美白剤、キレート剤等の成分を配合することができる。
【００１８】
本発明の皮膚外用剤の用途は、特に限定されるものではないが、軟膏、乳剤、ゲル剤、ローション剤、クリーム剤、パップ剤、エアゾール剤、ペースト剤、プラスター剤、洗浄剤等に用いることができる。また、本発明の皮膚外用剤は医薬品、医薬部外品及び化粧品を含むものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明を詳細に説明するため、実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２０】
以下に、セイヨウミザクラ（ナポレオン）種子、紫麦種子、ハンタイカイ種子を用いた溶媒抽出物の製造例を示す。
【実施例１】
【００２１】
製造例１ セイヨウミザクラ（ナポレオン）種子の熱水抽出物
セイヨウミザクラ種子の粉砕物２５ｇに精製水５００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してセイヨウミザクラ種子の熱水抽出物を２．０ｇ得た。
【００２２】
製造例２ セイヨウミザクラ（ナポレオン）種子の５０％エタノール抽出物
セイヨウミザクラ種子の粉砕物２５ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール５００ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、セイヨウミザクラ種子の５０％エタノール抽出物を１．０ｇ得た。
【００２３】
製造例３ セイヨウミザクラ（ナポレオン）種子のエタノール抽出物
セイヨウミザクラ種子の粉砕物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、セイヨウミザクラ種子のエタノール抽出物を３．３ｇ得た。
【００２４】
製造例４ 紫麦種子の熱水抽出物
紫麦種子の粉砕物５０ｇに精製水５００ｍＬを加え、９５〜１００℃で１時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、紫麦種子の熱水抽出物を９．２ｇ得た。
【００２５】
製造例５ 紫麦種子の５０％エタノール抽出物
紫麦種子の粉砕物５０ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール５００ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、紫麦種子の５０％エタノール抽出物を３．８ｇ得た。
【００２６】
製造例６ 紫麦種子のエタノール抽出物
紫麦種子の粉砕物５０ｇにエタノール５００ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、紫麦種子のエタノール抽出物を１．２ｇ得た。
【００２７】
製造例７ ハンタイカイ種子の熱水抽出物
ハンタイカイ種子の乾燥物２０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してハンタイカイの熱水抽出物を３．４ｇ得た。
【００２８】
製造例８ ハンタイカイ種子の５０％エタノール抽出物
ハンタイカイ種子の乾燥物２０ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ハンタイカイの５０％エタノール抽出物を３．７ｇ得た。
【００２９】
製造例９ ハンタイカイ種子のエタノール抽出物
ハンタイカイ種子の乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ハンタイカイのエタノール抽出物を６．７ｇ得た。
【００３０】
次に、本発明に用いる種子の抽出物を用いた皮膚外用剤の処方例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例２】
【００３１】
処方例１ 軟膏
処方 配合量
１．セイヨウミザクラ種子の
５０％エタノール抽出物（製造例２） ０．５部
２．紫麦種子の５０％エタノール抽出物（製造例５） ０．５
３．ハンタイカイ種子の５０％エタノール抽出物（製造例８）０．５
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．モノステアリン酸グリセリン １０．０
６．流動パラフィン ５．０
７．セタノール ６．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．プロピレングリコール １０．０
１０．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分４〜７を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１〜３及び８〜１０を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３２】
比較例１〜４ 従来の軟膏
処方例１において、セイヨウミザクラ種子の５０％エタノール抽出物のみを含有したものを比較例１、紫麦種子の５０％エタノール抽出物のみを含有したものを比較例２、ハンタイカイ種子の５０％エタノール抽出物のみを含有したものを比較例３、すべて除いたものを比較例４とした。
【００３３】
処方例２ 乳剤
処方 配合量
１．セイヨウミザクラ種子の熱水抽出物（製造例１） ０．００１部
２．紫麦種子の熱水抽出物（製造例４） ０．００１
３．ハンタイカイ種子の熱水抽出物（製造例７） ０．００１
４．スクワラン ５．０
５．オリーブ油 ５．０
６．ホホバ油 ５．０
７．セタノール １．５
８．モノステアリン酸グリセリン ２．０
９．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
１０．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
１１．香料 ０．１
１２．プロピレングリコール １．０
１３．グリセリン ２．０
１４．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１５．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分４〜１０を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１〜３及び１２〜１５を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１１を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００３４】
処方例３ ゲル剤
処方 配合量
１．セイヨウミザクラ種子のエタノール抽出物（製造例３） １．０部
２．紫麦種子のエタノール抽出物（製造例６） １．０
３．ハンタイカイ種子エキスのエタノール抽出物（製造例９）１．０
４．エタノール ５．０
５．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
６．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
７．香料 適量
８．１，３−ブチレングリコール ５．０
９．グリセリン ５．０
１０．キサンタンガム ０．１
１１．カルボキシビニルポリマー ０．２
１２．水酸化カリウム ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分４〜７と、成分１〜３及び８〜１３をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
【００３５】
処方例４ ローション剤
処方 配合量
１．セイヨウミザクラ種子の熱水抽出物（製造例１） ０．１部
２．紫麦種子の熱水抽出物（製造例４） ０．１
３．ハンタイカイ種子の熱水抽出物（製造例７） ０．１
４．１，３−ブチレングリコール ８．０
５．グリセリン ２．０
６．キサンタンガム ０．０２
７．クエン酸 ０．０１
８．クエン酸ナトリウム ０．１
９．エタノール ５．０
１０．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
１１．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１２．香料 適量
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜８及び１３と、成分９〜１２をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
【００３６】
処方例５ クリーム剤
処方 配合量
１．セイヨウミザクラ種子の
５０％エタノール抽出物（製造例２） ０．０５部
２．紫麦種子の５０％エタノール抽出物（製造例５） ０．０５
３．ハンタイカイ種子の５０％エタノール抽出物（製造例８）０．０５
４．スクワラン ５．５
５．オリーブ油 ３．０
６．ステアリン酸 ２．０
７．ミツロウ ２．０
８．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
９．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
１０．ベヘニルアルコール １．５
１１．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１２．香料 ０．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１５．１，３−ブチレングリコール ８．５
１６．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分４〜１１を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１〜３及び１３〜１６を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１２を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【実施例３】
【００３７】
以下に、実施例１で示した製造例１〜３のセイヨウミザクラ種子の抽出物を用いた、幹細胞の増殖促進効果の実験例とその結果を示す。
【００３８】
実験例１ 幹細胞の増殖促進効果の評価
ヒト幹細胞培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ヒト体性幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を６ｃｍディッシュに１ｘ１０５個播種し、セイヨウミザクラ種子の抽出物（製造例１〜３）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、それぞれの細胞数をカウントした。
抽出物未添加時の総細胞数をコントロールとし、コントロールを１００（％）とした場合の、セイヨウミザクラ種子の抽出物（製造例１〜３）添加時の細胞数の増減（％）を算出し、幹細胞の細胞増殖促進効果の評価を行った。
なお、本実験例では、一般的に幹細胞の増殖促進因子として使用されているＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ：幹細胞成長因子）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）を陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。
【００３９】
これらの試験結果を表１に示した。その結果、セイヨウミザクラ種子の抽出物（製造例１〜３）全てに、顕著な幹細胞の細胞増殖促進効果が認められた。以上より、セイヨウミザクラ種子の抽出物の極めて優れた幹細胞の細胞増殖促進効果を明らかとし、セイヨウミザクラ種子の抽出物の増殖促進効果を確認した。これらセイヨウミザクラ種子の増殖効果は、現在、幹細胞の増殖促進因子として一般的に用いられているＳＣＦに比べても、顕著に高い効果を示した。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞の細胞増殖促進効果が認められた。
【００４０】
【表１】
【００４１】
以下に、実施例１で示した製造例４〜６の紫麦種子の抽出物を用いた、幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進効果を評価し、該抽出物の幹細胞から線維芽細胞への分化誘導促進剤としての性能を確認する実験例とその結果を示す。
【００４２】
実験例２ 幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進効果の評価
ヒト幹細胞培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて培養したヒト体性幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を９６ｗｅｌｌプレートに５ｘ１０３個播種し、紫麦の種子抽出物（製造例４〜６）を最終濃度が０．００１％になるように添加して７日間培養を続けた。７日後、幹細胞から線維芽細胞への分化誘導効率について評価した。線維芽細胞への分化誘導効果の指標としては、１型コラーゲンの遺伝子発現（発現が高いほど線維芽細胞へ分化が促進した）を測定した。具体的には、細胞からＴａｑＭａｎ ＧＥＮＥ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｔＴＭｋｉｔ（アプライドバイオシステム社）を用いてｍＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにより１型コラーゲンの遺伝子発現を測定した。
抽出物未添加時のコラーゲン遺伝子の発現をコントロール（１００％）とした場合の、紫麦種子の抽出物（製造例４〜６）添加時のコラーゲン発現の増減（％）を算出し、幹細胞から線維芽細胞への分化誘導促進効果の評価を行った。
なお、本実験例では、一般的に線維芽細胞の分化誘導因子として使用されているｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ：線維芽細胞成長因子）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）を陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。
【００４３】
これらの試験結果を表２に示した。その結果、紫麦種子の抽出物（製造例４〜６）全てに、顕著な線維芽細胞への分化誘導促進効果が認められた。以上より、紫麦種子の抽出物に極めて優れた線維芽細胞への分化誘導促進効果を明らかとし、紫麦種子の抽出物の分化誘導促進剤としての効果を確認した。これら紫麦種子の抽出物の分化誘導促進効果は、現在、線維芽細胞の分化誘導因子として一般的に用いられているｂＦＧＦに比べても、顕著に高い効果を示した。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、その他、未分化な状態の細胞（体性幹細胞）についても試験を行ったところ、同様な効果が確認できた。
【００４４】
【表２】
【００４５】
以下に、実施例１で示した製造例７〜９のハンタイカイの種子抽出物を用いた、幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果を評価し、該抽出物の角化細胞への分化誘導促進剤としての効果について確認した。
【００４６】
実験例３ 幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果の評価
ＭＣＤＢ１５３培養液（Ｓｉｇｍａ社製）に、ＩＴＳ−Ｘサプリメント（１００倍希釈、ＧＩＢＣＯ社製）、ハイドロコルチゾン（０．４ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて調製した培地を用いて、マウス表皮組織から分離した幹細胞を、６ｃｍディッシュに１ｘ１０６個播種し、各抽出物（製造例７〜９）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、血球計数板にて細胞数をカウントした後、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（Ｓｉｇｍａ社製）にてタンパク質を抽出し、角化細胞への分化状態の測定を豊岡らの報告に従って行った（非特許文献９参照）。
すなわち、角化細胞への分化状態を示しているインボルクリンタンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法にて定量解析し、これを指標に、幹細胞から角化細胞への分化誘導促進効果を評価した。この場合、ハンタイカイの種子抽出物を添加せずに培養した細胞が発現したインボルクリンタンパク質の量をコントロール（１００％）とし、各抽出物（製造例７〜９）を添加して培養した時のインボルクリンタンパク質の発現量を相対値（％）として算出し、コントロールと比較することで、角化細胞への分化誘導促進効果（％）について評価した。なお、本実験例では、一般的に角化細胞の分化誘導因子として使用されているＥｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ：角化細胞成長因子、非特許文献１０参照）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）を陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。
【非特許文献９】豊岡 やよい，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｒ臨時増刊号 再生医学，２００３，１０６−１１５
【非特許文献１０】Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ．ＪＤ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，１９７７，２６５，４２１−４２４
【００４７】
これらの試験結果を表３に示した。その結果、ハンタイカイ種子の抽出物（製造例７〜９）全てに、顕著な幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果が認められた。以上より、ハンタイカイ種子の抽出物の極めて優れた幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果を明らかとし、ハンタイカイ種子の抽出物の分化誘導促進剤としての効果を確認した。これらハンタイカイの種子抽出物の分化誘導促進効果は、現在、角化細胞の分化誘導因子として一般的に用いられているＥＧＦに比べても、顕著に高い効果を示した。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、その他、未分化な状態の細胞（体性幹細胞）についても試験を行ったところ、同様な効果が確認できた。
【００４８】
【表３】
【００４９】
実験例４ 臨床試験
処方例１の軟膏を用いて肌荒れやシワが確認される女性２５人（４０〜６０才）を対象に２ヶ月間の臨床試験を行った。２５人をランダムに５人ずつ五群に分け、各群において、それぞれ、処方例１又は比較例１〜４の軟膏を使用してもらった。２ヶ月間の使用後、目視にて評価を行い、５（著効）〜０（効果なし）の６段階にスコア化し、各群の比較により評価した。
【００５０】
臨床試験の結果を表４に示した。処方例１の軟膏は比較例と比較して、有意に肌荒れやシワに対する改善効果を示した。なお、試験期間中、皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。
【００５１】
【表４】
【００５２】
処方例２〜５についても同様に臨床試験を行ったところ、いずれも安全で優れた肌荒れやシワに対する改善効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のセイヨウミザクラ種子の抽出物、紫麦種子の抽出物及びハンタイカイ種子の抽出物は、それぞれ皮膚内に存在する幹細胞の優れた増殖促進効果、線維芽細胞への分化誘導促進効果及び角化細胞への分化誘導促進効果を持ち、それらを含有した皮膚外用剤は、肌荒れやシワを改善する効果に優れており、医薬品や医薬部外品、化粧品として利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セイヨウミザクラ種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の増殖促進用外用剤。
【請求項２】
紫麦種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進用外用剤。
【請求項３】
ハンタイカイ種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の角化細胞への分化誘導促進用外用剤。
【請求項４】
セイヨウミザクラ種子の抽出物、紫麦種子の抽出物及びハンタイカイ種子の抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項１】
セイヨウミザクラ種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の増殖促進用外用剤。
【請求項２】
紫麦種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進用外用剤。
【請求項３】
ハンタイカイ種子の抽出物を含有することを特徴とする、皮膚内に存在する幹細胞の角化細胞への分化誘導促進用外用剤。
【請求項４】
セイヨウミザクラ種子の抽出物、紫麦種子の抽出物及びハンタイカイ種子の抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【公開番号】特開２０１０−２４２０９（Ｐ２０１０−２４２０９Ａ）
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９０３６２（Ｐ２００８−１９０３６２）
【出願日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【Ｆターム（参考）】
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