精子運動性を阻害するための形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）インヒビターの使用
本発明は、避妊効果を達成するために精子運動性を阻害するための、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）インヒビターの使用に関する。本発明はさらに、１以上のＰＭＣＡインヒビターを含む避妊剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、避妊効果を達成するために精子運動性を阻害するための、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）インヒビターの使用に関する。本発明はさらに、１以上のＰＭＣＡインヒビターを含む避妊剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
社会的、地理的および宗教的／倫理的条件に依存して、以下の異なる避妊方法が、現在、様々な信頼度をもって用いられている：１）機械的または化学的作用因子を使用しない避妊（「自然方法」）；２）コンドーム、閉鎖性ペッサリーおよび膣用ペッサリーの使用を含む、障害式方法による避妊；３）殺精子剤のような局所的に作用する物質による避妊；４）所定の計画に従って摂取されるエストロゲンおよび／またはプロゲステロンを含む製剤の定期的な摂取による女性におけるホルモン避妊；５）子宮内ペッサリーの使用による子宮内避妊、ならびに６）男性および／または女性の外科的不妊化。
【０００３】
上記技術のうち、ホルモン避妊が最もよく用いられている方法である。この方法は確実に妊娠を防ぎ、ほとんどの場合、その避妊効果は可逆性である。すなわち、子どもを持つことを望む人々について、そのような避妊製剤の使用を中止した後は、大多数の場合において妊娠が起こる。しかしながら、残念なことに、ホルモン避妊の多数の絶対的および相対的禁忌症が知られている。ホルモン避妊の絶対的禁忌症としては、血栓症、塞栓症、血栓塞栓性疾患、急性および進行性肝疾患、ホルモン依存性悪性腫瘍、胆汁分泌疾患、鎌状赤血球貧血、血管損傷を含む真性糖尿病、治療困難な高血圧症、ならびに他の臨床症状が挙げられる。相対的禁忌症の例としては、腎臓損傷、心不全、レイノー症候群、末梢血循環疾患、浮腫、ニコチン摂取に関連する障害、および他の関連疾患が挙げられる。
【０００４】
ホルモン避妊と比較して、「自然避妊」方法には禁忌症はない。しかし、それはたいてい信頼できず、また、受け入れがたいほど高い失敗率を特徴とする。
【０００５】
ペッサリーおよび不妊化のような機械的方法もまた、より高い合併症発生率のため（ペッサリー）、またはほとんど不可逆性であるため（不妊化）、少なからぬ欠点を有する。
【０００６】
要約すれば、従来公知の避妊方法の多くは、少なからぬ欠点を被る。さらなる欠点は、一般社会の意見では避妊は両方のパートナーにより共有される中心的な責任であるのに、これまで最も信頼性がありかつ一般的に用いられている避妊方法であるホルモン避妊が女性によってのみ使用可能であるという事実である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それゆえに、本発明は、女性と男性のどちらによっても使用可能であり、経口的もしくは非経口的に投与される製剤としての、または殺精子物質としての新規な非ホルモン避妊剤を提供する課題に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、精子運動性を抑制するための形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）インヒビターの使用に関し、それにより避妊効果が達成される。
【０００９】
さらに、本発明は、１以上のＰＭＣＡインヒビターを含む避妊剤に向けられる。これらの避妊剤はまた、ＰＭＣＡインヒビターに加えてさらなる従来の避妊剤を含んでいてもよい。
【００１０】
本発明の他の実施形態は、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼインヒビターが哺乳動物に投与される避妊のための方法に関する。
【００１１】
本発明によれば、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼの１以上のインヒビターが、避妊効果を達成するために用いられる。ＡＴＰアーゼ酵素は、カルシウムをサイトゾルから出して、細胞外環境へ輸送する。さらに、ＡＴＰアーゼ酵素は、ＳＥＲＣＡ ＡＴＰアーゼおよびナトリウム／Ｋ+ポンプを含む他のＡＴＰアーゼとの相同性を示す。ＰＭＣＡは、４つの異なる遺伝子（ＰＭＣＡ１〜４）によりコードされている；一次遺伝子産物の選択的スプライシングによるＰＭＣＡのいくつかのアイソフォームの存在が、研究により実証されている。ＰＭＣＡ遺伝子産物１および４は、組織の大部分において転写されるが、ＰＭＣＡ遺伝子産物２および３は、より組織特異的な様式で発現される。これらの遺伝子産物についてのＰＭＣＡスプライスバリアントの転写もまた、組織特異的である。このように、例えば、膵臓のβ細胞は４ｂアイソフォームのみを発現しているが、αおよびγ細胞は、４ａおよび４ｂアイソフォームの両方を発現している。異なるスプライスバリアントがカルシウムおよびカルモジュリンへの異なる親和性を有することも、証明可能であった。
【００１２】
本発明は、マウスＰＭＣＡのアイソフォーム４を欠損している雄マウス（「ノックアウト」マウスとして知られている）が不妊になるという観察に基づいている。その動物は、他の点では、生存して正常に発育する。さらに、これらの動物の場合において、勃起障害は観察されない。しかしながら、驚くべきことに、これらのＰＭＣＡ４−「ノックアウト」マウスについての精子の運動性が卵細胞の受精が起こることができないほどまでに制限され、その結果、その動物は繁殖することができないことが、実証可能であった。それゆえ、これらの精細胞に限定された高度に特異的な効果がある。
【００１３】
ＰＭＣＡ４はまた、ヒト精子で発現している。ＰＭＣＡ４−「ノックアウト」マウスをもって得られた結果は、ヒト精子の運動性が、女性の卵細胞の受精がもはや起こり得ないほどまでに、ＰＭＣＡインヒビターを用いて制限されうることを示唆している。
【００１４】
精子機能に対するＰＭＣＡの特異的な生理学的重要性は、以前には知られていなかった。さらに、今まで、ＰＭＣＡインヒビターの使用が精子の運動性を抑制するという指摘はなかった。したがって、避妊効果を達成するために精子運動性を抑制するためのＰＭＣＡインヒビターの使用が、ここで初めて実証される。
【００１５】
避妊活性、すなわち、精子の卵細胞との融合の阻止は、ＰＭＣＡインヒビターによる精子運動性の抑制に基づいており、それにより精子がもはや卵子を受精させることができない状況へ導かれる。
【００１６】
本発明により、開示されたＰＭＣＡインヒビターの使用を通して避妊効果が達成される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、前記インヒビターは、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼすなわちＰＭＣＡの４つのアイソフォームの１つに対するものである。この点において、ＰＭＣＡ４アイソフォームに関するインヒビターが、特に好ましい。
【００１８】
従来から知られているＰＭＣＡインヒビターは、２つの主なカテゴリー、すなわち、細胞内で作用するインヒビター、および細胞外で作用するインヒビター、に分類されうる。本発明では、単独または組み合わせでの、細胞外または細胞内のインヒビターのどちらの使用も記載されている。この点において、細胞内インヒビターまたは細胞外インヒビターのいずれかを別々に含む組み合わせ、および細胞外インヒビターと共に細胞内インヒビターを含む組み合わせ、を用いることができる
【００１９】
本発明における使用に適した公知のＰＭＣＡインヒビターとしては、５−（および−６）−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステル（5-(and-6)-carboxyeosindiacetate succinimidyl ester）（ＰＭＣＡの細胞膜インヒビター）、細胞外でＰＭＣＡに作用するペプチドであるカロキシン−２Ａ１（Caloxin-2A1）、およびポリカチオンであるスペルミン（spermin）が挙げられる。
【００２０】
本発明の１つの実施形態においては、５−（および−６）−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステル(１５０３４７−６０−７／２,５−ピロリジンジオン，１−［［［３’，６’−ビス(アセチルオキシ)−２’，４’，５’，７’−テトラブロモスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−５（または６)−イル］カルボニル］オキシ］（2,5-pyrrolidinedione, 1-[[[3',6'-bis(acetyloxy)-2',4',5',7'-tetrabromospiro [isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthene]-5(or 6)-yl]carbonyl]oxy]））、またはその誘導体が、精子におけるＰＭＣＡのインヒビターとして用いられる。
【００２１】
対応するエオシン(eosin)誘導体およびフルオレセイン（fluorescein）誘導体（Gatto, C.およびMilanik, M.A. (1993)、American Journal of Physiology 264、C1577-1586）は、このインヒビターの特に好ましい誘導体である。
【００２２】
例えば、５−(および−６)−カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル（5-(and-6)-carboxyfluorescein succinimidyl ester）（５（６）−ＦＡＭ）のような５−（および−６）−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステルに対応するエステル化合物だけでなく、細胞膜通過インヒビターである５−（および−６）−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステルの広範囲のエオシン、フルオレセインおよびフルオレシン誘導体、ならびにそれらの塩もすでに存在している。これらの誘導体の使用もまた、本発明の好ましい実施形態である。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、ＰＭＣＡインヒビターであるカロキシン２ａ１（Holmes, M.E. et al.、(2003)、Cell Calcium 33、241-245；Chaudary, J. et al.、(2001)、Am. J. Physiol. Cell Physiol. 280、C1027-1030）の使用に関する。
【００２４】
カロキシン２ａ１はアミノ酸配列ＶＳＮＳＮＷＰＳＦＰＳＳＧＧＧをもつポリペプチドであり、ＰＭＣＡに関して細胞外様式で作用する。このオリゴペプチドがＰＭＣＡに細胞外で結合し、ＰＭＣＡの機能に阻害性の影響を及ぼすことをインビトロで示すことが可能であった。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態においては、カロキシン２ａ１の誘導体が、精子運動性を阻害するために用いられる。この点において、「カロキシン２ａ１の変異体」という表現は、該ペプチドの化学修飾された変異体を表し、すなわち、環状およびすべての他の誘導体を含む。カロキシン２ａ１を構成するアミノ酸は、化学修飾の様々な機会を提供する。例えば、多数のセリン（Ｓ）のＯＨ基または２個のアスパラギン残基（Ｎ）のアミド基は、該ペプチドの親和性を調節するための適切な起始点を示し、それを通して、ＰＭＣＡ４への結合親和性もまた調節される。これにより、精細胞におけるＰＭＣＡ４への阻害特性に影響を与え、かつ増強することができる。
【００２６】
カロキシン２ａ１の変異体には、そのポリペプチドのアミノ酸配列の挿入、欠失および置換変異体も含まれる。この点において、挿入変異体は、配列内の単一または複数のアミノ酸残基の挿入に加えて、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合を含む。典型的には、挿入変異体は、カロキシン２ａ１のアミノ酸配列への１個〜１４個、好ましくは１個〜７個のアミノ酸の付加を含む。欠失変異体は、カロキシン２ａ１オリゴペプチドからの１個以上のアミノ酸残基の除去により特徴づけられる。典型的には、２個〜６個より多くない残基が除去される。置換変異体は、カロキシン２ａ１配列の少なくとも１個のアミノ酸が除去されて、異なるアミノ酸と交換された変異体を特徴づける。一般的に、アミノ酸は、疎水性、電気陰性度、側鎖などに関して類似した性質をもつアミノ酸と交換される。典型的には、該変異体は、修飾されていないカロキシン２ａ１と同じ性質を示す。
【００２７】
他の実施形態において、本発明は、精子運動性を阻害するための、ＰＭＣＡインヒビターであるスペルミン（Palacios, J. et al.、(2003)、Biochem. Biophys. Acta 1611、197-203）の使用に向けられる。好ましい実施形態において、本発明は、スペルミン二水和物およびスペルミン四塩酸塩を含むスペルミン誘導体の使用に向けられる。
【００２８】
すべての３つの起始点物質は、ＰＭＣＡの結合親和性に関係する阻害特性を調節および増強するために化学修飾の様々な可能性を提供する。
【００２９】
インヒビター誘導体の精子の運動性への阻害効果がなお維持されるとの条件で、開示されたインヒビターのすべての化学修飾が考えられうる。精子の運動性の測定については実施例３に記載されている。
【００３０】
ＰＭＣＡインヒビターは、様々な方法で投与されうる。本発明の１つの実施形態において、インヒビターは、経口的に、非経口的に、もしくは機械的避妊手段上のコーティングとして、または、クリーム、ゲル、もしくは油の形状をもって投与される。この点において、例えば、コンドームまたは他の機械的避妊手段のＰＭＣＡインヒビターでのコーティングが特に好ましい。
【００３１】
ＰＭＣＡインヒビターの投与期間は調整可能である。本発明の１つの実施形態は、単回使用の避妊のためにインヒビターを用いることに向けられる。しかしながら、インヒビターはまた、反復的または常用的に投与されうる。ＰＭＣＡインヒビターの用量は、従来から知られている方法を用いることにより、当業者により容易に決定されうる。
【００３２】
インヒビターは、哺乳動物、好ましくはヒトに投与されうる。好ましい実施形態において、ＰＭＣＡインヒビターはヒト男性に投与される。それゆえに、避妊のためのＰＭＣＡインヒビターのヒト男性への投与は、ここに記載されているように、全く新規な原理に基づいている。生理学的効果は、精子の発生に介入せず、それゆえに、それはまた、永久的不妊性、身体の「女性化」および他の望ましくない副作用のような男性用の公知ホルモン製剤の副作用をもたない。
【００３３】
他の好ましい実施形態において、ＰＭＣＡインヒビターは女性に投与される。ＰＭＣＡインヒビターが子宮頚部の粘液にまたは子宮に蓄積している場合、精子が膣領域に入るとすぐにその運動性が阻害され、その結果、避妊効果が達成される。
【００３４】
好ましくは、ＰＭＣＡインヒビターは、最大限可能な阻害効果を達成するために、男性と女性の両方へ投与される。
【００３５】
さらに、本発明はまた、薬学的に許容される担体と組み合わせてＰＭＣＡインヒビターを含む避妊剤に向けられる。１つの好ましい実施形態において、該避妊剤は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、１つのＰＭＣＡインヒビターだけでなく、少なくとも２つのＰＭＣＡインヒビターの組み合わせを含む。
【００３６】
公知の固体もしくは液体の担体または希釈剤、および慣習的である薬学的−技術的補助物質が、必要とされる使用の類型に適した用量での薬学的に許容される担体として適している。
【００３７】
本発明の避妊剤は、また、従来の避妊手段と組み合わせて用いることができ、別の避妊用組成物を得ることができる。この点において、前記従来の避妊手段は、コンドーム、ペッサリー、避妊用発泡剤などからなる群より選択されうる。
【００３８】
このように、例えば、本発明の避妊剤は、改善された避妊効果を有する改善された従来の避妊手段を得るために、コンドームをコーティングするのに用いることができる。精子が、このような様式でコーティングされた避妊剤と接触した場合には、精子運動性が明確に阻害され、避妊効果が達成される。
【００３９】
さらに、本発明はまた、ＰＭＣＡの分子研究、特にＰＭＣＡをコードする遺伝子に向けられる。これはまた、男性において不妊症を診断することを目的として、様々なＰＭＣＡアイソフォームおよびスプライスバリアントの特徴付け、加えて、突然変異および他の修飾、例えば翻訳後変化、を含む。
【００４０】
不妊症（すなわち、子どもを望む気持ちおよび正常な性交にもかかわらず子どものいないこと）は、すべての夫婦の約１５％に存在している。これらの場合の約４０％において、不妊症の原因は男性パートナーに存在する。この疾患の診断はまだ難しく、特に、根底にある可能性のある遺伝的欠陥は、最小限の細部しか知られていない。
【００４１】
ＰＭＣＡ４アイソフォームはヒト精細胞においても発現しているので、マウスモデルとの類推により、ヒトの器官においても同様に、ＰＭＣＡ４に影響を及ぼす遺伝子欠陥が男性の受精能力に影響をもたらすと考えるのが妥当である。それゆえに、本発明の実施形態は、男性不妊症がＰＭＣＡ ｍＲＮＡの発現の欠陥によるのか、それともＰＭＣＡ４遺伝子における欠陥によるのかを調べることを含む診断方法に向けられる。
【００４２】
ＰＭＣＡ４遺伝子および他のＰＭＣＡアイソフォームをコードする遺伝子における、発現レベルならびに可能性のある突然変異または多型は、ＰＣＲおよび場合によりそれに続くシーケンシング、ＥＬＩＳＡ、免疫組織学的検出、ウェスタンブロット、ならびにＰＭＣＡ活性測定を用いて、射精液試料中の精細胞において測定されうる。この点において、ＰＭＣＡ活性の測定は、公知の方法を用いて遂行される。これらの研究からの結果は、男性不妊症を治療するための適切な治療法を開発する最初の基盤を形成しうる。
【００４３】
以下の実施例は、単に本発明を例証することのみを意図するものであり、本発明の保護の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００４４】
ＰＭＣＡ４欠損マウス系統の確立
【００４５】
ＰＭＣＡ４遺伝子が相同組換えにより欠失したマウス系統を、２つの異なる（ヘテロ接合的ＰＭＣＡ４欠損性の）胚幹細胞クローンを用いて調製した。エキソン３の部分と共に、エキソン２を含む遺伝子の領域を除去した（図２）。さらに、ネオマイシン耐性カセットを挿入することにより、複数の終止コドンをすべての３つの読み枠へ挿入し、異常なタンパク質（「リードスルー産物」または「スプライシング」変異体）の可能性のある発現を排除した。合計１４匹の雄および６匹の雌のキメラを作製した。雄の動物をＣ５７Ｂ１／６動物と交配した。いくつかのキメラマウスの場合において、破壊されたＰＭＣＡ４対立遺伝子の生殖系列への組み込みを実証することができた。作製された雄ＰＭＣＡ欠損動物は不妊であり、作製された雌マウスは正常な受精能力を示した。
【００４６】
マウスおよびヒト精子におけるＰＭＣＡ４の発現分析
【００４７】
マウスおよびヒト精子におけるＰＭＣＡ４の発現を、免疫組織化学的技術を用いて示した。結果を図１に示す。図１のパートＡは、マウス精細胞が、アクロソームおよび尾部においてＰＭＣＡ４の強い発現を表していることを示している（赤色、第二画像）。単離された精子の位相差画像が、比較を目的として提供されている。２つの右側の画像は、２つの精細胞の位相差写真と比較される二次抗体のみの陰性対照を示す。図１のパートＢは、ヒト精細胞が、マウス精細胞と同様に、アクロソームおよび尾部の両方においてＰＭＣＡ４を発現していることを示す。ただし、ＰＭＣＡ４を表す色付きの図のみが、例としてここに示されている。
【００４８】
ＰＭＣＡインヒビターによる精子運動性の抑制
【００４９】
精子機能の阻害、すなわち精子運動性の阻害を、以下のようにして測定した：
【００５０】
ＰＭＣＡ４欠損雄マウスを屠殺し、それぞれの副睾丸を調製した。これらの組織を、２ｍｌの精子調製培地（MediCult社（Mollehaven 12, 4040 Jyllinge, Denmark）の「精子調製培地」で、以下のものを含む：アールの平衡塩類溶液、ピルビン酸ナトリウム、合成代用血清、ＨＥＰＥＳ［エタンスルホン酸ヒドロキシ−エチル−ピペラジン］、重炭酸ナトリウム、ヒト血清アルブミン、ペニシリン ５０，０００ＩＵ／リットルおよびストレプトマイシン ５０ｍｇ／リットル；Kahn, J.A.、Human Reproduction 8/9、p1414-1419、1993；Lahteenmaki, A.、Human Reproduction 10/1、p142-147、1995）へ置き、その後、滅菌した解剖用メスを用いて切開した。すべての機能している精子を、１５分間、副睾丸から泳ぎ出るようにさせておいた。これらの精子を含む上清を取り出し、各濃度の５−および６−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステル（ＣＥ）５００μｌと混合した。この段階後、精子を３７℃で１時間インキュベートした。ＣＥは、この時間中、精子へと拡散する；該エステルは、細胞内レベルにおいて加水分解される。その後、残った運動性精子を、非運動性精子と関連させて数えた。以下の結果が得られた：
【表１】
【００５１】
精子運動性の阻害について、medeaLAB社（Erlangen、Germany）のＣＡＳＡシステム４．２を用いて自動的に評価した。この点において、精子の調製およびインヒビターの添加は、上記のように行った。以下の３つの群について、ＣＡＳＡシステムを用いて検討した：
【００５２】
Ａ群（未処理、正常な精子、調製後４５分間、３７℃）；Ｂ群（ＰＭＣＡ欠損精子、調製後４５分間、３７℃）；Ｃ群（正常な精子、調製後４５分間、３７℃、そのうちの３０分間は細胞内インヒビターである５−および６−ＣＥの２０μＭと接触させた）。
【００５３】
以下の結果が得られた：
Ａ群：前進運動性７３％、局所的運動性または非運動性２７％、ｎ＝２５４精子；Ｂ群：前進運動性１４％、局所的運動性または非運動性８６％、ｎ＝１９８、およびＣ群：前進運動性２２％、局所的運動性または非運動性７８％、ｎ＝２１７。
【００５４】
上記の自動化実験プロトコールについて、（手作業の計数と比較して）インキュベーション時間は短縮され（１時間に代わって３０分間のみ）、ソフトウェアはまた、試料に存在する意味のない物体を記録したが、そのような物体は手作業の計数で容易に除外することができた。
【００５５】
本発明は、ここに含まれる図により例示される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】精子におけるＰＭＣＡ４の発現。Ａ．マウス精細胞は、アクロソームおよび尾部においてＰＭＣＡ４の強い発現を示している（赤色、第二画像）。単離された精子の位相差画像は、比較を目的として提供されている。２つの右側の画像は、２つの精細胞の位相差写真と比較される二次抗体のみの陰性対照を示す。Ｂ．マウス精細胞と同様に、ヒト精細胞もまた、アクロソームおよび尾部においてＰＭＣＡ４を発現している。ＰＭＣＡ４の染色は、例としてここに示されている。
【図２】ＰＭＣＡ４欠損マウスにおける不妊性。Ａ．適切な戦略により、マウスにおいてＰＭＣＡ４遺伝子を除去することができた。１つの完全なエキソンおよびもう１つのエキソンの部分を、「ターゲティングベクター」として知られているものの助けを借りて、相同組換えを用いることにより除去した。Ｂ．正常なマウス（「ｗｔ」）では精子においてＰＭＣＡ４を強く発現するのに対して、遺伝子操作によって作製されたＰＭＣＡ４欠損マウス（「ｋｏ」）では遺伝子発現が完全に損失していた。ＭはＲＴ−ＰＣＲ産物のサイズを決定するためのマーカー。Ｃ．遺伝子操作後に得られた雄ＰＭＣＡ４欠損動物（ｋｏ）は、正常な雌と交配されようが、同じくＰＭＣＡ４欠損である雌と交配されようが、にかかわらず、不妊であることが見出された。
【図３】ＰＭＣＡインヒビターの作用様式の概略図。細胞外様式でＰＭＣＡ（白色で表示）に結合するインヒビター（灰色で表示）は直接的に作用するが、細胞内で作用する他の物質（黒色で表示）は、それらの生物学的活性を効果的に発揮することができるように細胞膜を通過しなければならない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、避妊効果を達成するために精子運動性を阻害するための、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）インヒビターの使用に関する。本発明はさらに、１以上のＰＭＣＡインヒビターを含む避妊剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
社会的、地理的および宗教的／倫理的条件に依存して、以下の異なる避妊方法が、現在、様々な信頼度をもって用いられている：１）機械的または化学的作用因子を使用しない避妊（「自然方法」）；２）コンドーム、閉鎖性ペッサリーおよび膣用ペッサリーの使用を含む、障害式方法による避妊；３）殺精子剤のような局所的に作用する物質による避妊；４）所定の計画に従って摂取されるエストロゲンおよび／またはプロゲステロンを含む製剤の定期的な摂取による女性におけるホルモン避妊；５）子宮内ペッサリーの使用による子宮内避妊、ならびに６）男性および／または女性の外科的不妊化。
【０００３】
上記技術のうち、ホルモン避妊が最もよく用いられている方法である。この方法は確実に妊娠を防ぎ、ほとんどの場合、その避妊効果は可逆性である。すなわち、子どもを持つことを望む人々について、そのような避妊製剤の使用を中止した後は、大多数の場合において妊娠が起こる。しかしながら、残念なことに、ホルモン避妊の多数の絶対的および相対的禁忌症が知られている。ホルモン避妊の絶対的禁忌症としては、血栓症、塞栓症、血栓塞栓性疾患、急性および進行性肝疾患、ホルモン依存性悪性腫瘍、胆汁分泌疾患、鎌状赤血球貧血、血管損傷を含む真性糖尿病、治療困難な高血圧症、ならびに他の臨床症状が挙げられる。相対的禁忌症の例としては、腎臓損傷、心不全、レイノー症候群、末梢血循環疾患、浮腫、ニコチン摂取に関連する障害、および他の関連疾患が挙げられる。
【０００４】
ホルモン避妊と比較して、「自然避妊」方法には禁忌症はない。しかし、それはたいてい信頼できず、また、受け入れがたいほど高い失敗率を特徴とする。
【０００５】
ペッサリーおよび不妊化のような機械的方法もまた、より高い合併症発生率のため（ペッサリー）、またはほとんど不可逆性であるため（不妊化）、少なからぬ欠点を有する。
【０００６】
要約すれば、従来公知の避妊方法の多くは、少なからぬ欠点を被る。さらなる欠点は、一般社会の意見では避妊は両方のパートナーにより共有される中心的な責任であるのに、これまで最も信頼性がありかつ一般的に用いられている避妊方法であるホルモン避妊が女性によってのみ使用可能であるという事実である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それゆえに、本発明は、女性と男性のどちらによっても使用可能であり、経口的もしくは非経口的に投与される製剤としての、または殺精子物質としての新規な非ホルモン避妊剤を提供する課題に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、精子運動性を抑制するための形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）インヒビターの使用に関し、それにより避妊効果が達成される。
【０００９】
さらに、本発明は、１以上のＰＭＣＡインヒビターを含む避妊剤に向けられる。これらの避妊剤はまた、ＰＭＣＡインヒビターに加えてさらなる従来の避妊剤を含んでいてもよい。
【００１０】
本発明の他の実施形態は、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼインヒビターが哺乳動物に投与される避妊のための方法に関する。
【００１１】
本発明によれば、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼの１以上のインヒビターが、避妊効果を達成するために用いられる。ＡＴＰアーゼ酵素は、カルシウムをサイトゾルから出して、細胞外環境へ輸送する。さらに、ＡＴＰアーゼ酵素は、ＳＥＲＣＡ ＡＴＰアーゼおよびナトリウム／Ｋ+ポンプを含む他のＡＴＰアーゼとの相同性を示す。ＰＭＣＡは、４つの異なる遺伝子（ＰＭＣＡ１〜４）によりコードされている；一次遺伝子産物の選択的スプライシングによるＰＭＣＡのいくつかのアイソフォームの存在が、研究により実証されている。ＰＭＣＡ遺伝子産物１および４は、組織の大部分において転写されるが、ＰＭＣＡ遺伝子産物２および３は、より組織特異的な様式で発現される。これらの遺伝子産物についてのＰＭＣＡスプライスバリアントの転写もまた、組織特異的である。このように、例えば、膵臓のβ細胞は４ｂアイソフォームのみを発現しているが、αおよびγ細胞は、４ａおよび４ｂアイソフォームの両方を発現している。異なるスプライスバリアントがカルシウムおよびカルモジュリンへの異なる親和性を有することも、証明可能であった。
【００１２】
本発明は、マウスＰＭＣＡのアイソフォーム４を欠損している雄マウス（「ノックアウト」マウスとして知られている）が不妊になるという観察に基づいている。その動物は、他の点では、生存して正常に発育する。さらに、これらの動物の場合において、勃起障害は観察されない。しかしながら、驚くべきことに、これらのＰＭＣＡ４−「ノックアウト」マウスについての精子の運動性が卵細胞の受精が起こることができないほどまでに制限され、その結果、その動物は繁殖することができないことが、実証可能であった。それゆえ、これらの精細胞に限定された高度に特異的な効果がある。
【００１３】
ＰＭＣＡ４はまた、ヒト精子で発現している。ＰＭＣＡ４−「ノックアウト」マウスをもって得られた結果は、ヒト精子の運動性が、女性の卵細胞の受精がもはや起こり得ないほどまでに、ＰＭＣＡインヒビターを用いて制限されうることを示唆している。
【００１４】
精子機能に対するＰＭＣＡの特異的な生理学的重要性は、以前には知られていなかった。さらに、今まで、ＰＭＣＡインヒビターの使用が精子の運動性を抑制するという指摘はなかった。したがって、避妊効果を達成するために精子運動性を抑制するためのＰＭＣＡインヒビターの使用が、ここで初めて実証される。
【００１５】
避妊活性、すなわち、精子の卵細胞との融合の阻止は、ＰＭＣＡインヒビターによる精子運動性の抑制に基づいており、それにより精子がもはや卵子を受精させることができない状況へ導かれる。
【００１６】
本発明により、開示されたＰＭＣＡインヒビターの使用を通して避妊効果が達成される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、前記インヒビターは、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼすなわちＰＭＣＡの４つのアイソフォームの１つに対するものである。この点において、ＰＭＣＡ４アイソフォームに関するインヒビターが、特に好ましい。
【００１８】
従来から知られているＰＭＣＡインヒビターは、２つの主なカテゴリー、すなわち、細胞内で作用するインヒビター、および細胞外で作用するインヒビター、に分類されうる。本発明では、単独または組み合わせでの、細胞外または細胞内のインヒビターのどちらの使用も記載されている。この点において、細胞内インヒビターまたは細胞外インヒビターのいずれかを別々に含む組み合わせ、および細胞外インヒビターと共に細胞内インヒビターを含む組み合わせ、を用いることができる
【００１９】
本発明における使用に適した公知のＰＭＣＡインヒビターとしては、５−（および−６）−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステル（5-(and-6)-carboxyeosindiacetate succinimidyl ester）（ＰＭＣＡの細胞膜インヒビター）、細胞外でＰＭＣＡに作用するペプチドであるカロキシン−２Ａ１（Caloxin-2A1）、およびポリカチオンであるスペルミン（spermin）が挙げられる。
【００２０】
本発明の１つの実施形態においては、５−（および−６）−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステル(１５０３４７−６０−７／２,５−ピロリジンジオン，１−［［［３’，６’−ビス(アセチルオキシ)−２’，４’，５’，７’−テトラブロモスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−５（または６)−イル］カルボニル］オキシ］（2,5-pyrrolidinedione, 1-[[[3',6'-bis(acetyloxy)-2',4',5',7'-tetrabromospiro [isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthene]-5(or 6)-yl]carbonyl]oxy]））、またはその誘導体が、精子におけるＰＭＣＡのインヒビターとして用いられる。
【００２１】
対応するエオシン(eosin)誘導体およびフルオレセイン（fluorescein）誘導体（Gatto, C.およびMilanik, M.A. (1993)、American Journal of Physiology 264、C1577-1586）は、このインヒビターの特に好ましい誘導体である。
【００２２】
例えば、５−(および−６)−カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル（5-(and-6)-carboxyfluorescein succinimidyl ester）（５（６）−ＦＡＭ）のような５−（および−６）−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステルに対応するエステル化合物だけでなく、細胞膜通過インヒビターである５−（および−６）−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステルの広範囲のエオシン、フルオレセインおよびフルオレシン誘導体、ならびにそれらの塩もすでに存在している。これらの誘導体の使用もまた、本発明の好ましい実施形態である。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、ＰＭＣＡインヒビターであるカロキシン２ａ１（Holmes, M.E. et al.、(2003)、Cell Calcium 33、241-245；Chaudary, J. et al.、(2001)、Am. J. Physiol. Cell Physiol. 280、C1027-1030）の使用に関する。
【００２４】
カロキシン２ａ１はアミノ酸配列ＶＳＮＳＮＷＰＳＦＰＳＳＧＧＧをもつポリペプチドであり、ＰＭＣＡに関して細胞外様式で作用する。このオリゴペプチドがＰＭＣＡに細胞外で結合し、ＰＭＣＡの機能に阻害性の影響を及ぼすことをインビトロで示すことが可能であった。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態においては、カロキシン２ａ１の誘導体が、精子運動性を阻害するために用いられる。この点において、「カロキシン２ａ１の変異体」という表現は、該ペプチドの化学修飾された変異体を表し、すなわち、環状およびすべての他の誘導体を含む。カロキシン２ａ１を構成するアミノ酸は、化学修飾の様々な機会を提供する。例えば、多数のセリン（Ｓ）のＯＨ基または２個のアスパラギン残基（Ｎ）のアミド基は、該ペプチドの親和性を調節するための適切な起始点を示し、それを通して、ＰＭＣＡ４への結合親和性もまた調節される。これにより、精細胞におけるＰＭＣＡ４への阻害特性に影響を与え、かつ増強することができる。
【００２６】
カロキシン２ａ１の変異体には、そのポリペプチドのアミノ酸配列の挿入、欠失および置換変異体も含まれる。この点において、挿入変異体は、配列内の単一または複数のアミノ酸残基の挿入に加えて、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合を含む。典型的には、挿入変異体は、カロキシン２ａ１のアミノ酸配列への１個〜１４個、好ましくは１個〜７個のアミノ酸の付加を含む。欠失変異体は、カロキシン２ａ１オリゴペプチドからの１個以上のアミノ酸残基の除去により特徴づけられる。典型的には、２個〜６個より多くない残基が除去される。置換変異体は、カロキシン２ａ１配列の少なくとも１個のアミノ酸が除去されて、異なるアミノ酸と交換された変異体を特徴づける。一般的に、アミノ酸は、疎水性、電気陰性度、側鎖などに関して類似した性質をもつアミノ酸と交換される。典型的には、該変異体は、修飾されていないカロキシン２ａ１と同じ性質を示す。
【００２７】
他の実施形態において、本発明は、精子運動性を阻害するための、ＰＭＣＡインヒビターであるスペルミン（Palacios, J. et al.、(2003)、Biochem. Biophys. Acta 1611、197-203）の使用に向けられる。好ましい実施形態において、本発明は、スペルミン二水和物およびスペルミン四塩酸塩を含むスペルミン誘導体の使用に向けられる。
【００２８】
すべての３つの起始点物質は、ＰＭＣＡの結合親和性に関係する阻害特性を調節および増強するために化学修飾の様々な可能性を提供する。
【００２９】
インヒビター誘導体の精子の運動性への阻害効果がなお維持されるとの条件で、開示されたインヒビターのすべての化学修飾が考えられうる。精子の運動性の測定については実施例３に記載されている。
【００３０】
ＰＭＣＡインヒビターは、様々な方法で投与されうる。本発明の１つの実施形態において、インヒビターは、経口的に、非経口的に、もしくは機械的避妊手段上のコーティングとして、または、クリーム、ゲル、もしくは油の形状をもって投与される。この点において、例えば、コンドームまたは他の機械的避妊手段のＰＭＣＡインヒビターでのコーティングが特に好ましい。
【００３１】
ＰＭＣＡインヒビターの投与期間は調整可能である。本発明の１つの実施形態は、単回使用の避妊のためにインヒビターを用いることに向けられる。しかしながら、インヒビターはまた、反復的または常用的に投与されうる。ＰＭＣＡインヒビターの用量は、従来から知られている方法を用いることにより、当業者により容易に決定されうる。
【００３２】
インヒビターは、哺乳動物、好ましくはヒトに投与されうる。好ましい実施形態において、ＰＭＣＡインヒビターはヒト男性に投与される。それゆえに、避妊のためのＰＭＣＡインヒビターのヒト男性への投与は、ここに記載されているように、全く新規な原理に基づいている。生理学的効果は、精子の発生に介入せず、それゆえに、それはまた、永久的不妊性、身体の「女性化」および他の望ましくない副作用のような男性用の公知ホルモン製剤の副作用をもたない。
【００３３】
他の好ましい実施形態において、ＰＭＣＡインヒビターは女性に投与される。ＰＭＣＡインヒビターが子宮頚部の粘液にまたは子宮に蓄積している場合、精子が膣領域に入るとすぐにその運動性が阻害され、その結果、避妊効果が達成される。
【００３４】
好ましくは、ＰＭＣＡインヒビターは、最大限可能な阻害効果を達成するために、男性と女性の両方へ投与される。
【００３５】
さらに、本発明はまた、薬学的に許容される担体と組み合わせてＰＭＣＡインヒビターを含む避妊剤に向けられる。１つの好ましい実施形態において、該避妊剤は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、１つのＰＭＣＡインヒビターだけでなく、少なくとも２つのＰＭＣＡインヒビターの組み合わせを含む。
【００３６】
公知の固体もしくは液体の担体または希釈剤、および慣習的である薬学的−技術的補助物質が、必要とされる使用の類型に適した用量での薬学的に許容される担体として適している。
【００３７】
本発明の避妊剤は、また、従来の避妊手段と組み合わせて用いることができ、別の避妊用組成物を得ることができる。この点において、前記従来の避妊手段は、コンドーム、ペッサリー、避妊用発泡剤などからなる群より選択されうる。
【００３８】
このように、例えば、本発明の避妊剤は、改善された避妊効果を有する改善された従来の避妊手段を得るために、コンドームをコーティングするのに用いることができる。精子が、このような様式でコーティングされた避妊剤と接触した場合には、精子運動性が明確に阻害され、避妊効果が達成される。
【００３９】
さらに、本発明はまた、ＰＭＣＡの分子研究、特にＰＭＣＡをコードする遺伝子に向けられる。これはまた、男性において不妊症を診断することを目的として、様々なＰＭＣＡアイソフォームおよびスプライスバリアントの特徴付け、加えて、突然変異および他の修飾、例えば翻訳後変化、を含む。
【００４０】
不妊症（すなわち、子どもを望む気持ちおよび正常な性交にもかかわらず子どものいないこと）は、すべての夫婦の約１５％に存在している。これらの場合の約４０％において、不妊症の原因は男性パートナーに存在する。この疾患の診断はまだ難しく、特に、根底にある可能性のある遺伝的欠陥は、最小限の細部しか知られていない。
【００４１】
ＰＭＣＡ４アイソフォームはヒト精細胞においても発現しているので、マウスモデルとの類推により、ヒトの器官においても同様に、ＰＭＣＡ４に影響を及ぼす遺伝子欠陥が男性の受精能力に影響をもたらすと考えるのが妥当である。それゆえに、本発明の実施形態は、男性不妊症がＰＭＣＡ ｍＲＮＡの発現の欠陥によるのか、それともＰＭＣＡ４遺伝子における欠陥によるのかを調べることを含む診断方法に向けられる。
【００４２】
ＰＭＣＡ４遺伝子および他のＰＭＣＡアイソフォームをコードする遺伝子における、発現レベルならびに可能性のある突然変異または多型は、ＰＣＲおよび場合によりそれに続くシーケンシング、ＥＬＩＳＡ、免疫組織学的検出、ウェスタンブロット、ならびにＰＭＣＡ活性測定を用いて、射精液試料中の精細胞において測定されうる。この点において、ＰＭＣＡ活性の測定は、公知の方法を用いて遂行される。これらの研究からの結果は、男性不妊症を治療するための適切な治療法を開発する最初の基盤を形成しうる。
【００４３】
以下の実施例は、単に本発明を例証することのみを意図するものであり、本発明の保護の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００４４】
ＰＭＣＡ４欠損マウス系統の確立
【００４５】
ＰＭＣＡ４遺伝子が相同組換えにより欠失したマウス系統を、２つの異なる（ヘテロ接合的ＰＭＣＡ４欠損性の）胚幹細胞クローンを用いて調製した。エキソン３の部分と共に、エキソン２を含む遺伝子の領域を除去した（図２）。さらに、ネオマイシン耐性カセットを挿入することにより、複数の終止コドンをすべての３つの読み枠へ挿入し、異常なタンパク質（「リードスルー産物」または「スプライシング」変異体）の可能性のある発現を排除した。合計１４匹の雄および６匹の雌のキメラを作製した。雄の動物をＣ５７Ｂ１／６動物と交配した。いくつかのキメラマウスの場合において、破壊されたＰＭＣＡ４対立遺伝子の生殖系列への組み込みを実証することができた。作製された雄ＰＭＣＡ欠損動物は不妊であり、作製された雌マウスは正常な受精能力を示した。
【００４６】
マウスおよびヒト精子におけるＰＭＣＡ４の発現分析
【００４７】
マウスおよびヒト精子におけるＰＭＣＡ４の発現を、免疫組織化学的技術を用いて示した。結果を図１に示す。図１のパートＡは、マウス精細胞が、アクロソームおよび尾部においてＰＭＣＡ４の強い発現を表していることを示している（赤色、第二画像）。単離された精子の位相差画像が、比較を目的として提供されている。２つの右側の画像は、２つの精細胞の位相差写真と比較される二次抗体のみの陰性対照を示す。図１のパートＢは、ヒト精細胞が、マウス精細胞と同様に、アクロソームおよび尾部の両方においてＰＭＣＡ４を発現していることを示す。ただし、ＰＭＣＡ４を表す色付きの図のみが、例としてここに示されている。
【００４８】
ＰＭＣＡインヒビターによる精子運動性の抑制
【００４９】
精子機能の阻害、すなわち精子運動性の阻害を、以下のようにして測定した：
【００５０】
ＰＭＣＡ４欠損雄マウスを屠殺し、それぞれの副睾丸を調製した。これらの組織を、２ｍｌの精子調製培地（MediCult社（Mollehaven 12, 4040 Jyllinge, Denmark）の「精子調製培地」で、以下のものを含む：アールの平衡塩類溶液、ピルビン酸ナトリウム、合成代用血清、ＨＥＰＥＳ［エタンスルホン酸ヒドロキシ−エチル−ピペラジン］、重炭酸ナトリウム、ヒト血清アルブミン、ペニシリン ５０，０００ＩＵ／リットルおよびストレプトマイシン ５０ｍｇ／リットル；Kahn, J.A.、Human Reproduction 8/9、p1414-1419、1993；Lahteenmaki, A.、Human Reproduction 10/1、p142-147、1995）へ置き、その後、滅菌した解剖用メスを用いて切開した。すべての機能している精子を、１５分間、副睾丸から泳ぎ出るようにさせておいた。これらの精子を含む上清を取り出し、各濃度の５−および６−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステル（ＣＥ）５００μｌと混合した。この段階後、精子を３７℃で１時間インキュベートした。ＣＥは、この時間中、精子へと拡散する；該エステルは、細胞内レベルにおいて加水分解される。その後、残った運動性精子を、非運動性精子と関連させて数えた。以下の結果が得られた：
【表１】
【００５１】
精子運動性の阻害について、medeaLAB社（Erlangen、Germany）のＣＡＳＡシステム４．２を用いて自動的に評価した。この点において、精子の調製およびインヒビターの添加は、上記のように行った。以下の３つの群について、ＣＡＳＡシステムを用いて検討した：
【００５２】
Ａ群（未処理、正常な精子、調製後４５分間、３７℃）；Ｂ群（ＰＭＣＡ欠損精子、調製後４５分間、３７℃）；Ｃ群（正常な精子、調製後４５分間、３７℃、そのうちの３０分間は細胞内インヒビターである５−および６−ＣＥの２０μＭと接触させた）。
【００５３】
以下の結果が得られた：
Ａ群：前進運動性７３％、局所的運動性または非運動性２７％、ｎ＝２５４精子；Ｂ群：前進運動性１４％、局所的運動性または非運動性８６％、ｎ＝１９８、およびＣ群：前進運動性２２％、局所的運動性または非運動性７８％、ｎ＝２１７。
【００５４】
上記の自動化実験プロトコールについて、（手作業の計数と比較して）インキュベーション時間は短縮され（１時間に代わって３０分間のみ）、ソフトウェアはまた、試料に存在する意味のない物体を記録したが、そのような物体は手作業の計数で容易に除外することができた。
【００５５】
本発明は、ここに含まれる図により例示される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】精子におけるＰＭＣＡ４の発現。Ａ．マウス精細胞は、アクロソームおよび尾部においてＰＭＣＡ４の強い発現を示している（赤色、第二画像）。単離された精子の位相差画像は、比較を目的として提供されている。２つの右側の画像は、２つの精細胞の位相差写真と比較される二次抗体のみの陰性対照を示す。Ｂ．マウス精細胞と同様に、ヒト精細胞もまた、アクロソームおよび尾部においてＰＭＣＡ４を発現している。ＰＭＣＡ４の染色は、例としてここに示されている。
【図２】ＰＭＣＡ４欠損マウスにおける不妊性。Ａ．適切な戦略により、マウスにおいてＰＭＣＡ４遺伝子を除去することができた。１つの完全なエキソンおよびもう１つのエキソンの部分を、「ターゲティングベクター」として知られているものの助けを借りて、相同組換えを用いることにより除去した。Ｂ．正常なマウス（「ｗｔ」）では精子においてＰＭＣＡ４を強く発現するのに対して、遺伝子操作によって作製されたＰＭＣＡ４欠損マウス（「ｋｏ」）では遺伝子発現が完全に損失していた。ＭはＲＴ−ＰＣＲ産物のサイズを決定するためのマーカー。Ｃ．遺伝子操作後に得られた雄ＰＭＣＡ４欠損動物（ｋｏ）は、正常な雌と交配されようが、同じくＰＭＣＡ４欠損である雌と交配されようが、にかかわらず、不妊であることが見出された。
【図３】ＰＭＣＡインヒビターの作用様式の概略図。細胞外様式でＰＭＣＡ（白色で表示）に結合するインヒビター（灰色で表示）は直接的に作用するが、細胞内で作用する他の物質（黒色で表示）は、それらの生物学的活性を効果的に発揮することができるように細胞膜を通過しなければならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
避妊を達成するために精子運動性を阻害するための、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）インヒビターの使用。
【請求項２】
前記インヒビターは、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）の４つのアイソフォームのいずれか１つに対するものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記インヒビターは、ＰＭＣＡ４アイソフォームに対するものである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記インヒビターは、５−もしくは６−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステル、エオシン、フルオレセイン、またはこれらの誘導体である、請求項１〜３に記載の使用。
【請求項５】
前記インヒビターは、カロキシン２ａ１またはその誘導体である、請求項１〜３に記載の使用。
【請求項６】
前記インヒビターは、スペルミンまたはその誘導体である、請求項１〜３に記載の使用。
【請求項７】
前記インヒビターは、経口的に、非経口的に、またはコーティングされた機械的避妊手段として投与される、請求項１〜６に記載の使用。
【請求項８】
前記インヒビターは、単回使用の避妊のためまたは常用的に、避妊剤として投与される、請求項１〜７に記載の使用。
【請求項９】
前記インヒビターは、哺乳類に、好ましくはヒトに投与される、請求項１〜８に記載の使用。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体と組み合わせてＰＣＭＡインヒビターを含む避妊剤。
【請求項１１】
前記避妊剤は、従来の避妊手段と組み合わせて存在する、請求項１０に記載の避妊剤。
【請求項１２】
前記従来の避妊手段は、コンドームである、請求項１１に記載の避妊剤。
【請求項１３】
ＰＣＭＡをコードする遺伝子の突然変異または翻訳後修飾の検出に基づいて診断する、ヒト男性において不妊診断をするための方法。
【請求項１】
避妊を達成するために精子運動性を阻害するための、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）インヒビターの使用。
【請求項２】
前記インヒビターは、形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）の４つのアイソフォームのいずれか１つに対するものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記インヒビターは、ＰＭＣＡ４アイソフォームに対するものである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記インヒビターは、５−もしくは６−カルボキシエオシンジアセテートスクシニミジルエステル、エオシン、フルオレセイン、またはこれらの誘導体である、請求項１〜３に記載の使用。
【請求項５】
前記インヒビターは、カロキシン２ａ１またはその誘導体である、請求項１〜３に記載の使用。
【請求項６】
前記インヒビターは、スペルミンまたはその誘導体である、請求項１〜３に記載の使用。
【請求項７】
前記インヒビターは、経口的に、非経口的に、またはコーティングされた機械的避妊手段として投与される、請求項１〜６に記載の使用。
【請求項８】
前記インヒビターは、単回使用の避妊のためまたは常用的に、避妊剤として投与される、請求項１〜７に記載の使用。
【請求項９】
前記インヒビターは、哺乳類に、好ましくはヒトに投与される、請求項１〜８に記載の使用。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体と組み合わせてＰＣＭＡインヒビターを含む避妊剤。
【請求項１１】
前記避妊剤は、従来の避妊手段と組み合わせて存在する、請求項１０に記載の避妊剤。
【請求項１２】
前記従来の避妊手段は、コンドームである、請求項１１に記載の避妊剤。
【請求項１３】
ＰＣＭＡをコードする遺伝子の突然変異または翻訳後修飾の検出に基づいて診断する、ヒト男性において不妊診断をするための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５１３５０８（Ｐ２００９−５１３５０８Ａ）
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８０８５（Ｐ２００６−５１８０８５）
【出願日】平成１６年７月１日（２００４．７．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７１６８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００２４９５
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０６００２８６７）
【氏名又は名称原語表記】Ｌｕｄｗｉｇ Ｎｅｙｓｅｓ
【住所又は居所原語表記】１０ Ｈｅｒｉｔａｇｅ Ｇａｒｄｅｎ，Ｗｉｌｍｓｌｏｗ Ｒｏａｄ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ Ｍ２０ ５ｈｊ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月１日（２００４．７．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７１６８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００２４９５
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０６００２８６７）
【氏名又は名称原語表記】Ｌｕｄｗｉｇ Ｎｅｙｓｅｓ
【住所又は居所原語表記】１０ Ｈｅｒｉｔａｇｅ Ｇａｒｄｅｎ，Ｗｉｌｍｓｌｏｗ Ｒｏａｄ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ Ｍ２０ ５ｈｊ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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