肥満治療効果及び抗酸化活性を有する酵母加水分解物を含む組成物及びその製造方法
【課題】肥満治療及び予防用組成物並びに抗酸化活性を有する組成物及びその製造方法を提供する。
【解決手段】酵母をＫＨ−１５等のタンパク質分解酵素で分解した酵母加水分解物を有効成分として含み、体重減少効果及び抗酸化活性を有する組成物。
【解決手段】酵母をＫＨ−１５等のタンパク質分解酵素で分解した酵母加水分解物を有効成分として含み、体重減少効果及び抗酸化活性を有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体内脂肪の蓄積阻害活性及び抗酸化活性を有する酵母加水分解物を含む組成物及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、摂取した熱量のうち消耗して残った部分が脂肪に転換され、体内の様々な部分、特に皮下組織と腹腔内に蓄積される現象である。中性脂肪（TG, triglyceride）はグリセリンと３分子の脂肪酸がエステル結合した化合物であり、炭水化物から合成される中性脂肪として動物の脂肪組織に貯蔵されるため酵素による加水分解により遊離脂肪酸を血液中に放出する。脂肪組織に貯蔵された中性脂肪は糖がエネルギー源として、不十分になると非エステル化脂肪酸（nonesterifide fatty acid, NEFA）とグリセロール（glycerol）に分解されて血中に放出される。エネルギー源として用いられて残った非エステル化脂肪酸は、肝で再び中性脂肪に変わる。これが再び血中に流入すれば、これを内因性中性脂肪という。中性脂肪の量が過多であると、粥状硬化症、冠状動脈疾患等と密接な関係がある。
【０００３】
肥満患者は脂肪組織の機能に必要な脂肪量より非常に多くの脂肪が体内に蓄積されている状態であり、これが原因となり人体内の正常な生化学的及び生理的機能に障害を有する者である。肥満は、様々な疾患、特に糖尿病、高脂血症、高血圧及び冠状動脈疾患、そして関節疾患等の多様な疾病の原因となるだけでなく、正常な社会生活を不可能にすることもある。
【０００４】
また、肥満は人間だけでなく動物、特にペットの健康にも致命的な危険を及ぼし、過多な飼料の摂取や偏重した栄養の摂取により、ペット、特に犬や猫、ハムスターが肥満になったり栄養不均衡が発生する場合が多い。
【０００５】
動物に必要な栄養成分は主に飼料に依存し、飼料の中に含まれている脂質は、加工、貯蔵中、酸敗による品質低下が起きて不快な味や臭いを有するようになる。また、酸化生成物によりＤＮＡが損傷したり体内の酵素を不活性化させて代謝異常を誘発又は様々な疾病の原因となっている。従って、脂質の酸化を抑制するために、ＢＨＴ, ＢＨＡ, ＴＢＨＱ等の酸化防止剤を添加するが、これらは抗酸化効果は優れるが、変異原性及び発癌性等が問題視され、消費者の拒否反応によりその使用が減少している傾向である。従って、抗酸化能が高くて安全性が確保された天然抗酸化剤に対する多くの研究が必要であるが、天然抗酸化剤の開発と産業化が難しいので、食品業界では合成抗酸化剤を主に用いている。
【０００６】
したがって、本発明者は食欲や身体代謝を調節して肥満を治療、予防できる方案を研究していたところ、酵母を特定酵素で加水分解する場合、得られた酵母加水分解物が脂肪の蓄積を妨げるだけでなく体内脂肪を分解することにより肥満治療及び予防に効果が大きいことを確認して本発明を完成した。
【０００７】
しかも本発明の酵母加水分解物は、組織及び細胞の酸化的損傷も予防及び緩和させることを見出した。すなわち、本発明の酵母加水分解物は肥満及び酸化的損傷を治療、予防する効果がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３９３０８０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、肥満を治療する肥満治療及び予防用組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の目的は、抗酸化活性を有する組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、酵母を特定酵素で加水分解した酵母加水分解物を提供する。
【００１２】
本発明は、酵母を酵素で分解した酵母加水分解物を有効成分として含み、体重減少効果及び抗酸化活性を有することを特徴とする組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、酵母を酵素で分解した酵母加水分解物を動物に投与する段階を含む動物の動脈硬化、内臓肥満、腹部肥満、高脂血症、脂肪肝、肥満の予防又は治療方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、酵母に酵素を加える段階を含む、体重減少効果及び抗酸化活性を有する組成物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の酵母加水分解物は、体内脂肪の蓄積の阻害及び脂肪分解を通じて体重を減少、肥満を治療及び予防できる。また、本発明の酵母加水分解物は抗酸化活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、多様な酵素で加水分解した酵母加水分解物のタンパク質回収率を示す。
【図２】図２は、酵母加水分解物が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のグリセロール及びレプティン分泌量に及ぼす影響を示す。
【図３】図３は、ＭＴＴ方法で測定した、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞株に対する酵母加水分解物の細胞毒性を示す。
【図４】図４は、酵母ＫＨ−１５加水分解物のラットのＤＰＰＨ及びＡＢＴＳラジカル消去能を示す。
【図５】図５は、酵母ＫＨ−１５加水分解物がＳＤラットの体重に及ぼす影響を示す。
【図６】図６は、酵母ＫＨ−１５加水分解物がＳＤラットの脂肪の蓄積を抑制する効果を示す。
【図７】図７は、酵母ＫＨ−１５加水分解物が犬の体重に及ぼす影響を示す。
【図８】図８は、酵母ＫＨ−１５加水分解物が犬の腹囲に及ぼす影響を示す。
【図９】図９は、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与時における、犬の血液内のＭＤＡ及びＧＳＨ含量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の酵母は、食品として用いられる酵母であれば良く、その種類は特に限定されない。例えば、本発明の酵母にはサッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス ファーメンティー（Ｓａｃｃｈ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、サッカロマイセス バヤナス（Ｓａｃｃｈ．ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス サケ（Ｓａｃｃｈ．ｓａｋｅ）、サッカロマイセス マンドシュリコス（Ｓａｃｃｈ．ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）、サッカロマイセス アナメンシス（Ｓａｃｃｈ．ａｎａｍｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス フォルモセンシス（Ｓａｃｃｈ．ｆｏｒｍｏｓｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス エリプソイデュウス（Ｓａｃｃｈ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロマイセス コレアヌス（Ｓａｃｃｈ．ｃｏｒｅａｎｕｓ）等が用いられ、望ましくはサッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００１９】
本発明の酵素は、タンパク質分解酵素であることが望ましい。より望ましくは上記タンパク質分解酵素は、プロタメックス（Protamex）（登録商標）、プロレザーＦＧ−Ｆ（Proleather FGF）（登録商標）、フレーバーザイム（Flavourzyme）（登録商標）、プロテアーゼＡ（Protease A）、アロアーゼＡＰ−１０（Aroase AP-10）（登録商標）、ペスカラーゼ（Pescalase）、パパイン（Papain）、配列番号１のアミノ酸配列を含むＫＨ−１５、ブロメライン（Bromelain）、フィシン（Ficin）及びニュートラーゼ（Neutrase）で構成される群から選択されるいずれかであり、さらに望ましくは上記タンパク質分解酵素は、プロタメックス、フレーバーザイム及びＫＨ−１５である。最も望ましくは上記タンパク質分解酵素はＫＨ−１５である。しかし、本発明の特徴は酵母を加水分解して食餌摂取量の減少なしに体重を減少させて抗酸化活性を有する酵母加水分解物を製造することにあるところ、このような特徴を有するように酵母を加水分解するタンパク質分解酵素であればいずれかの本発明の範囲に含まれるといえる。
【００２０】
上記組成物は、食品組成物、飼料組成物、薬学的組成物及び化粧料組成物から選択されるいずれか一つである。
【００２１】
本発明の食品組成物、飼料組成物、薬学的組成物及び化粧料組成物は、体内活性酸素を除去することにより、体内脂肪、コレステロールと活性酸素が反応して過酸化脂質を生成することを妨げ、これによって、過酸化脂質が血栓、塞栓を生成することを予防できる。また、本発明の食品組成物、飼料組成物、薬学的組成物は、活性酸素を除去することにより、活性酸素と関連する血栓、塞栓、過酸化脂質による血液循環障害、脳卒中、中風、脳血栓、心筋梗塞、動脈硬化を予防及び治療し、活性酸素によるＤＮＡ、細胞、組織の変性を妨げることにより、アトピー、アレルギー、腫瘍、関節炎、白内障、皮膚腫瘍を予防及び治療し、老化の進行を妨げる。
【００２２】
また、本発明の食品、飼料又は薬学的組成物は、動脈硬化、内臓肥満、腹部肥満、高脂血症、脂肪肝及び肥満で構成された群から選択される疾患を予防及び／又は治療し、糖尿を予防する。また、本発明の食品、飼料又は薬学的組成物は、上記疾患の他に血中脂質濃度の増加、中性脂肪の蓄積等と関連する疾患に複合的な効果を奏し、長期間投与時に体重管理、抗酸化を通じた老化遅延、健康改善効果を奏する。
【００２３】
また、本発明は、酵母加水分解物を有効成分として含む食品組成物を提供する。上記食品とは、健康補助食品、健康機能食品、機能性食品等であるがこれに制限されるものではなく、天然食品、加工食品、一般的な食資材等に本発明の酵母加水分解物を添加したものも含まれる。
【００２４】
本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む食品組成物は、上記組成物をそのまま添加したり他の食品又は食品組成物と共に用いられ、通常の方法により適宜用いられる。有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康又は治療的処置）により適切に決定される。一般に、本発明の健康機能食品を食品又は飲料の製造時に原料に対して０．０１〜７０．００質量％、望ましくは０．０１〜３０．００質量％の量で添加することができ、より望ましくは０．０１〜１０．００質量％の量で添加することができる。食品組成物の上記酵母加水分解物の有効容量は、上記薬学的組成物の有効容量に準じて用いることができるが、健康及び衛生を目的としたり又は健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、上記範囲以下であってもよく、有効成分は安全性面で何ら問題がないため、上記範囲以上の量で用いることもできる。
【００２５】
上記食品の種類には特別な制限はない。上記酵母加水分解物を有効成分として含む食品組成物は、錠剤、硬質又は軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤等のような経口投与用製剤の形態で用いられ、これら製剤は許容可能な通常の担体、例えば、経口投与用製剤の場合には、賦形剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤又は増量剤等を用いて調製することができる。
【００２６】
上記酵母加水分解物を添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤等を挙げることができるが、これら種類の食品に制限されるわけではない。
【００２７】
本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む飼料組成物は、通常の飼料と共に配食でき、本発明の飼料組成物を通常の飼料組成物に添加して機能性飼料組成物を製造して用いることもできる。また、本発明の飼料組成物は本発明の酵母加水分解物以外の機能性成分をさらに含むことができる。上記通常の飼料組成物と本発明の酵母加水分解物が混合された機能性飼料組成物の製造時に、本発明の酵母加水分解物は総飼料組成物に対して０．０１〜３０．００質量％、望ましくは０．０１〜２０．００質量％の量で添加することができる。飼料組成物の上記酵母加水分解物の有効容量は、上記食品組成物の有効容量に準じて用いることができるが、持続的な体重管理を目的としたり、又は健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、上記範囲以下であってもよく、有効成分は安全性面で何ら問題がないため、高度肥満等の場合には、上記範囲以上の量でも用いられる。
【００２８】
本発明の飼料組成物は、家畜又は家禽を対象とする。上記家畜又は家禽は、牛、豚、鶏、馬、羊、ロバ、ラバ、猪、うさぎ、ウズラ、アヒル、雄鳥、闘鶏用鶏、鳩、七面鳥、犬、猫、猿、ハムスター、マウス、ラット、九官鳥、オウム、インコ、カナリア等であるが、これらに制限されるわけではなく、家庭内で飼育可能な人間以外の哺乳動物又は鳥類であれば本発明の飼料組成物の対象といえる。
【００２９】
本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む薬学的組成物は、血栓、塞栓、過酸化脂質による血液循環障害、脳卒中、中風、脳血栓、心筋梗塞、動脈硬化を予防及び治療し、活性酸素によるＤＮＡ、細胞、組織の変性を妨げることにより、アトピー、アレルギー、腫瘍、関節炎、白内障、皮膚腫瘍を予防及び治療し、老化進行を妨げる。また、本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む薬学的組成物は、高脂血症、脂肪肝、内臓肥満、腹部肥満等、部分的肥満及び肥満（即ち、一般的な肥満）を予防及び治療する。
【００３０】
本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む薬学的組成物は、経口又は非経口投与が可能で、一般的な医薬品製剤の形態で用いられる。望ましい薬剤学的製剤は、錠剤、硬質又は軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤等のような経口投与用製剤があり、これら薬剤学的製剤は薬剤学的に許容可能な通常の担体、例えば経口投与用製剤の場合には、賦形剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤又は増量剤等を用いて調製することができる。
【００３１】
本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む薬学的組成物の投与容量は、患者の状態、年齢、性別及び合併症等の多様な要因によって専門家により決定され得るが、一般には、成人１ｋｇ当り０．１ｍｇ〜１０ｇ、望ましくは１０ｍｇ〜１ｇの容量で投与され得る。また、単位剤形当り上記薬学的組成物の１日用量又はこの１／２, １／３又は１／４の用量が含まれるようにし、一日に１〜６回投与され得る。しかし、健康及び衛生を目的としたり、又は健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、上記量は上記範囲以下であってもよく、有効成分は安全性面で何ら問題がないため、上記範囲以上の量でも用いられる。
【００３２】
また、本発明は、上記製造方法により製造された酵母加水分解物を有効成分として含む化粧料組成物を提供し、上記酵母加水分解物の製造段階を含む上記化粧料組成物の生産方法を提供する。上記化粧料組成物の製造方法において、化粧品製造に許容される担体は本発明の化粧料組成物の剤形により異なり得る。本発明の化粧料組成物の剤形としては、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、石鹸、シャンプー、界面活性剤-含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、リキッドファウンデーション、クリームファウンデーション及びスプレイ等に剤形化されることができ、本発明の抗酸化用化粧料組成物は、より詳細には柔軟化粧水（スキン、トナー）、収れん化粧水、栄養化粧水、乳液（ローション）、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、ゲル、皮膚接着用パッチ、パウダー、皮膚外用軟膏、貼布剤、懸濁液、エマルジョンスプレイ、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、ヘアーエッセンス又は美容液等の通常の化粧料形態で製造され得る。
【００３３】
上記本発明の製造方法により製造された化粧料組成物の剤形がペースト、クリーム又はゲルの場合、担体成分としては、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛等が望ましい。
【００３４】
上記本発明の製造方法により製造された酵母加水分解物を有効成分として含む化粧料組成物の剤形が溶液又は乳濁液の場合、担体成分としては、溶媒、溶媒化剤又は乳濁化剤が用いられ得、その例としては、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1, 3-ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステル等が望ましい。
【００３５】
上記本発明の製造方法により製造された酵母加水分解物の剤形が懸濁液の場合、担体成分としては、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー又はトラカント等が望ましい。
【００３６】
上記本発明の製造方法により製造された化粧料組成物の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分としては、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホ琥珀酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレイト、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体エトキシル化グリセロール、又は脂肪酸エステル等が望ましい。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を次の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明の内容を例示するもので、発明の範囲が実施例により限定されるわけではない。以下の各例において、％、部及び比率はとくにことわらない限り質量基準である。
【００３８】
実施例１：材料
タンパク質分解酵素
タンパク質分解酵素ＫＨ−１５は、高麗大学食品栄養学科で味噌から分離して保存中のバチルス属菌（Bacillus sp.）ＫＨ−１５をタンパク質分解酵素の生産菌株に用いて得た。即ち、タンパク質分解酵素の生産のためにＬＢ培地（tryptone１０ ｇ／Ｌ、酵母エキス５ ｇ/Ｌ、NaCl １０ ｇ／Ｌ）にスキムミルク １％を添加した液体培地をタンパク質分解酵素生産用培地として用いた。タンパク質分解酵素生産用培地はｐＨ ６．５に調整後、１２１℃、１５分間加圧殺菌し、３０℃で２４時間培養し、上澄液を遠心分離して回収し、粗酵素液として用いた。このように得たタンパク質分解酵素ＫＨ−１５のアミノ酸配列は配列番号１の通りである。
【００３９】
<配列番号１>
MNQKAMIVIA AGSMLFGGAG VYAGINLLEM DKPQTAAVPA TAQADSERDK AMDKIEKAYE
LISNEYVEKV DREKLLEGAI QGMLSTLNDP YSVYMDKQTA KGGSDSLDSS FEGIGAEVGM
EDGKIIIVSP FKKSPAEKAG LKPLSTIISI NGESMAGKDL NHAVLKIRGK KGSSVSMKIQ
RPGTKKQLSF RIKRAEIPLE TVFASEKKVQ GHSVGYIAIS TFSEHTAEDF AKALRELEKK
EIEGLVIDVR GNPGGYLQSV EEILKHFVTK DQPYIQIAER NGDKKRYFST LTHKKAYPVN
VITDKGSASA SEILAGALKE AGHYDVVGDT SFGKGTVQQA VPMGDGSNIK LTLYKWLTPN
GNWIHKKGIE PTIAIKQPDY FSAGPLQLKE PLKVDMNNED VKHAQVLLKG LSFDPGREDG
YFSKDMKKAV MAFQDQNKLN KTGVIDTRTA ETLNQQIEKK KSDEKNDLQL QTALKASFVN
【００４０】
プロタメックス（Protamex）とフレーバーザイム（Flavourzyme）はNovo Korea（Seoul, South Korea）、プロレザーＦＧ−Ｆ（Proleather FG-F）とプロテアーゼＡ（Protease A）はAmano Enzyme USA Co.（Lombard, IL, USA）、アロアーゼＡＰ−１０（Aroase AP-10）とペスカラーゼ（Pescalase）はYakult（Yakult Pharmaceutical Ind. Co., Tokyo, Japan）とDSM Gist（Netherlands）でそれぞれ購入して用い、その特性は表１の通りである。
【００４１】
【表１】
【００４２】
統計分析
実験結果はSPSS programを用いて平均と誤差を提示し、各処理別有意性はDuncans multiple range testでp<0.05水準で検定した。
【００４３】
実施例２：酵母加水分解物の活性
【００４４】
<実験例１>酵母加水分解物の製造
Saccharomyces cerevisiae （ATCC4126）を２％モラセス（廃糖蜜）、０．６％(NH4)2SO4、０．１％MgSO4・7H2O、０．２％KH2PO4、０．０３％K2HPO4と０．１％NaClを含有した液体培地を用いて３０℃で３日間培養した。培養後、３，０００ ｒｐｍで２０分間遠心分離して菌体を回収し、２０ ｍＭリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ ７．０）を用いて１０％懸濁液を作った。懸濁液にプロタメックス（Protamex）、フレーバーザイム（Flavourzyme）、プロテアーゼＡ（Protease A）、アロアーゼＡＰ−１０（Aroase AP-10）、ペスカラーゼ（Pescalase）、パパイン（Papain）及びＫＨ−１５をそれぞれ０．５％ずつ添加し、３５℃で６時間加水分解後、９５℃で１０分間加熱処理し、遠心分離して上澄液を回収した。酵母加水分解物は１０ｋＤａ分離膜（Satocon cassette, Sartorius, Germany）を用いて処理し凍結乾燥して製造した。
【００４５】
<実験例２>酵母加水分解物のタンパク質回収率
商業用酵素とバチルス属菌ＫＨ−１５が生産したタンパク質分解酵素ＫＨ−１５を用いて酵母加水分解物を製造してタンパク質回収率を測定した（図１、式１）。
【００４６】
<式１>
タンパク質回収率（％）=（加水分解後のタンパク質/加水分解前のタンパク質）×100
【００４７】
プロタメックス、フレーバーザイムによる加水分解物は、それぞれ５２．３％と５４．５％の回収率を示し、endo-typeタンパク質分解酵素であるプロレザー、プロテアーゼＡとペスカラーゼによる酵母加水分解物のタンパク質回収率は、それぞれ４６．７％、４４．５％と５０．４％で多少低くなった一方、ＫＨ−１５は５３．９％でendoとexo-typeの混合であるcomplex-typeと類似のタンパク質回収率を示した（表２）。
【００４８】
【表２】
【００４９】
<実験例３>酵母加水分解物の脂肪の蓄積阻害の効果
脂肪細胞での脂肪分解効果
３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞（preadipocytes）（ATCC#F8979, Manassas, VA）を１０％ウシ胎児血清、１００ ｕｎｉｔ／ｍＬ ペニシリン、１００mｇ／ｍＬ ストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培養液を用いて５％ＣＯ２下にインキュベーターで培養した。３, ４日後に細胞が融合するようになると、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで処理して細胞を分離した後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ, ５分）して細胞を集め、細胞密度が３．３×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２になるように懸濁溶液を作って１２ウェルプレートに１ ｍｌずつ分注して２次培養した。３, ４日後に細胞を増殖させた後、分化培地（ＤＭＥＭ培養液に５μｇ／ｍｌインスリン、０．２５ μＭデキサメタゾン及び０．５ ｍＭ ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）が添加された培地）を添加して分化を誘導した。
【００５０】
２日間隔で処理培地（ＤＭＥＭ培養液に５μｇ／ｍｌのインスリンのみ含まれた培地）に培地を取り替えながら脂肪細胞に分化させた。分化培地処理後、約１０日が経過すると９０％以上が脂肪細胞に分化するようになる。酵母加水分解物は０．１％の濃度になるように処理培地に溶かした後、０．２μｍフィルターで濾過して完全に分化された脂肪細胞に処理した。
【００５１】
グリセロール濃度は酵素反応法で測定した。３７℃に予め加温しておいた遊離グリセロール試薬１ ｍＬに収集された培養液１０μＬを添加して３７℃の水浴槽で５分間培養した。グリセロール定量のためには、グリセロール標準溶液（Sigma）１２．５μgと２５μgを試料と同一の方法で反応させた後、９６ウェルプレートに２００μＬを採り５４０ ｎｍで吸光度を測定した。
【００５２】
その結果、脂肪分解時に生成されるグリセロール濃度は、対照群（酵母加水分解物未添加群）と比較時にプロタメックス、フレーバーザイム及びＫＨ−１５による各酵母加水分解物添加群でそれぞれ１０９．３％、１１４．５％及び１１６．８％と、他の酵母加水分解物に比べて増加した。一方、プロレザー、プロテアーゼＡ、アロアーゼ、ペスカラーゼ及びパパインによる各酵母加水分解物投与群の場合、対照群と大きな差はなかった（図２）。
【００５３】
脂肪細胞での脂肪の蓄積阻害効果
レプティンは、脂肪細胞の肥満遺伝子により生成されるホルモンで、視床下部に作用して飲食物の摂取を抑制させてエネルギー消費を増加させ、肥満を調節するタンパク質で（Caro et al., 1996）、レプティンは体脂肪量と密接な関連関係があり（Considine et al., 1996）、血中レプティン濃度は体脂肪量を示す指標として知られ、最近の肥満研究で多く適用されている。レプティンは脂肪細胞内の脂肪の蓄積量が増加するほどレプティンの分泌量が増加すると知られている（Considine et al., 1996）。従って、レプティン量の減少は脂肪蓄積が少ないということを意味する。
【００５４】
脂肪細胞から分泌されたレプティンの量はEnzyme Linked Immunosorbent Assay（ELISA）方法を用いて測定した。ラット抗マウスレプティン ＩｇＧ ２μg／ｍＬをMaxiSorp（登録商標） ELISAプレート（Nunc）に入れて一夜培養した後、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のTween 20（登録商標）を含むＰＢＳ）緩衝液で３回洗浄したプレートに脂肪細胞から収集した培養上清１００μＬを培地に添加して１時間培養した。再びＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ビオチン化ウサギ抗マウスレプティン ＩｇＧ ２００μg／ｍＬを入れて１時間常温に置いた後、再度ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。その後、ExtrAvidinホースラディッシュペルオキシダーゼを常温で１時間培養した後、３回洗浄した。免疫活性を測定するために各ウェルに１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン二塩酸塩基質（ＴＭＢ）を入れて３０分間反応させた後、５０μＬの２Ｍ H2SO4を添加して反応を終了させて吸光度を４５０ｎｍで測定した。酵母加水分解物のレプティン分泌量は対照群と比較して相対的な値で示した。
【００５５】
酵母加水分解物による脂肪細胞でのレプティン含量を測定した結果（図２）、ＫＨ−１５による酵母加水分解物処理時に２３．５％として最も低いレプティン含量を示し、プロタメックスとフレーバーザイム加水分解物は５８．７％と３５．７％の含量を示した。
【００５６】
ＫＨ−１５による酵母加水分解物添加によるグリセロール濃度が有意的に増加し、レプティンの分泌量が大幅に減少したことから見て、ＫＨ−１５、プロタメックス及びフレーバーザイム酵母加水分解物は、脂肪分解効果とは別途に脂肪の蓄積を抑制する効果があり、両者は互いに異なる機作によりなされるものと確認された。また、他の酵母加水分解物に比べて、特にＫＨ−１５酵母加水分解物の肥満抑制効果が優れると判断される。
【００５７】
【表３】
【００５８】
<実験例４>酵母加水分解物の細胞毒性
試料に対する細胞生存率は、ＭＴＴ〔3-（4,5-メチルチアゾ-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド〕比色法で実験した（Camichael et al., 1978）。細胞は１×１０５ ｃｅｌｌ／２００μＬの濃度で９６ウェル プレートに分注して２４時間培養後に培地を除去した。ここで新たなＤＭＥＭ培地２００μＬに濃度別に希釈した試料をそれぞれ添加して２４時間培養した後、２．５ｍｇ／ｍＬで製造したＭＴＴ溶液２０μＬを各ウェルに加えて４時間培養した。培養終了後、上澄液を除去して各ウェルに１００μＬのDMSOを添加して生成されたformazan結晶を溶解させてマイクロプレートリーダーを用いて５５０ｎｍで吸光度を測定した。この時、細胞生存率は次の通り計算して示した。
【００５９】
<式２>
細胞生存率（％）＝{100−（対照群の吸光度−試料処理群の吸光度）/対照群の吸光度}×100
【００６０】
脂肪に分化された３Ｔ３−Ｌ１細胞株（adipocyte）に対して異なる濃度（５０，１００μｇ／ｍＬ）の酵母加水分解物で２４時間処理して細胞毒性を観察した結果、処理濃度区間内では毒性が観察されず、１００μｇ／ｍＬの処理時に５５０ｎｍでの吸光度の増加は試料自体が有する色によるもので、細胞の増殖促進効果はないことが確認された。従って、以後肥満細胞の処理濃度は１００μｇ／ｍＬに設定した（図３）。酵母加水分解物間の若干の差はあったが、この結果から酵母加水分解物は１００μｇ／ｍＬの濃度で脂肪細胞に対する細胞毒性がなく、脂肪細胞を増殖させたり肥満を誘導しないということを確認することができた。
【００６１】
【表４】
【００６２】
実施例３：酵母ＫＨ−１５加水分解物の活性
【００６３】
<実験例１>材料
酵母ＫＨ−１５加水分解物
実施例２で抗肥満効果が最も優れていたBacillus sp. ＫＨ−１５が生産したタンパク質分解酵素であるＫＨ−１５を用いて製造した酵母加水分解物（以下、Eatlessということがある）をもって生理活性を測定した。
【００６４】
実験動物及び実験食餌
実験動物は体重１８０−１８５ｇ程度のＳ／Ｄ雄ラットを大韓実験動物センター（忠清北道陰城）から購入して用いた。食餌（表５）と水は自由に摂取するようにし、飼育場温度は２２℃、そして湿度は４０−６０％に維持し、照明は１２時間明暗周期とした。
【００６５】
ラットは２つの群に分けて、実験群１は高脂肪食餌群（対照群）、実験群２は高脂肪食餌及び酵母ＫＨ−１５加水分解物の経口投与群（１００ｍｇ／ｋｇ）に分けて各群ごとに８匹ずつ分けて実験を進めた。経口投与は２４日間実施した。
【００６６】
【表５】
【００６７】
<実験例２>酵母ＫＨ−１５加水分解物がラットの血中脂質に及ぼす影響
血清中の総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、中性脂質濃度は酵素法による測定キット試薬で分析した。
【００６８】
酵母ＫＨ−１５加水分解物を２４日間経口投与した後、血清中の脂質の変化を測定した結果（表６）、体脂肪蓄積の原因物質である中性脂質は対照群である高脂肪食餌群が９６．２８ｍｇ／ｄｌであるのに対し、酵母ＫＨ−１５加水分解物を投与した場合、８０．０７ ｍｇ／ｄｌと差を示したが、統計的に有意差を示さなかった。
【００６９】
しかし、総コレステロールの場合、対照群が酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群に比べて高い数値を示し、ＨＤＬ−コレステロールの場合には、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群が高脂肪食餌群に比べて３４％程度高い数値を示した。従って、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群は総コレステロールの数値が低く、ＨＤＬ−コレステロールの数値が高いことにより動脈硬化発病率を低くすることができる。
【００７０】
以上の実験結果によると、酵母ＫＨ−１５加水分解物は体重減少、体脂肪減少効果を奏することにより肥満抑制又は治療効果を奏していることを確認した。
【００７１】
【表６】
【００７２】
スチューデントt-検定（Students t-test）によると、対照群に対して有意な差を示す（*p<0.05, **p<0.01）。
（※）ＨＴＲ ＝ ＨＤＬコレステロール／総コレステロール
【００７３】
<実験例３>酵母ＫＨ−１５加水分解物の抗酸化活性
酵母ＫＨ−１５加水分解物のＤＰＰＨラジカルとＡＢＴＳラジカル消去能
ＤＰＰＨラジカル消去能の測定は、Cheung等（2003）の方法を用いた。1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジルをエタノールに溶解させた０．２ｍＭ ＤＰＰＨ溶液０．４ｍＬと試料０．１ｍＬを暗所で１０分間反応させた後、５２０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７４】
ＡＢＴＳラジカル消去能の測定は、Re等（1999）の方法を用いた。７ｍＭ 2,2’-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）二アンモニウムに２．４５ｍＭ過硫酸カリウムを添加して暗所で室温で１２−１６時間放置した後、４１４ ｎｍで吸光度が１．４−１．５になるように蒸留水で希釈させた。肝組織試料１２．５μＬに希釈されたＡＢＴＳラジカル溶液２５０μＬを入れて暗所で６０分間反応させて４１４ｎｍで吸光度を測定した。ＤＰＰＨ及びＡＢＴＳラジカル消去能（％）は次の通り計算した。
【００７５】
<式３>
ラジカル消去活性（％）=（1-Asample/A対照群）×100
Asample:試料添加時の吸光度、 A対照群:試料未添加時の吸光度
【００７６】
酵母ＫＨ−１５加水分解物のＤＰＰＨラジカルとＡＢＴＳラジカル消去能は、図４のように濃度依存的に増加する傾向を示し、ラジカルの５０％消去に必要なＩＣ５０値は１９．１ ｍｇ／ｍｌと９．０ ｍｇ／ｍｌであり、比較的高い水準のラジカル消去能を有していることを確認した。従って、酵母ＫＨ−１５加水分解物を飼料に添加時に抗酸化活性を期待することができる。
【００７７】
酵母ＫＨ−１５加水分解物が還元型グルタチオン及び過酸化脂質に及ぼす影響
酸素遊離基（酸素フリーラジカル、活性酸素）は酸素を用いて生存する細胞内で生成される毒性が強い物質で、細胞のＤＮＡや細胞膜脂質及びタンパク質等を損傷させるので、細胞内ではスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等の抗酸化酵素とグルタチオン、尿酸等の様々な非酵素的抗酸化物質があり、酸素遊離基による酸化的損傷から各種細胞構造物を保護する。ＳＯＤは遊離酸素をＨ２Ｏ２とＯ２に転換し、生成されたＨ２Ｏ２はカタラーゼとグルタチオンペルオキシダーゼにより消去されるが、グルタチオンペルオキシダーゼは還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）に酸化させながらＨ２Ｏ２を除去し、ＧＳＳＧはグルタチオンリダクターゼにより再びＧＳＨに還元され、人体内でグルタチオンはＧＳＨとＧＳＳＧの２つの形態で均衡をなしながら存在するようになる。もし、細胞内に毒性又は酸化的損傷が生じた場合には、ＧＳＳＧが徐々に増加するようになって、ＧＳＨ／ＧＳＳＧの不均衡をもたらすようになり防御機作としての役割が消失する。ＧＳＨは酸素遊離基による細胞の損傷を防止し、細胞内解毒作用を担当する重要な物質とみなされている。従って、健康な個体の細胞は酸化的細胞損傷を引き起こし得る酸素遊離基を消去する防御機作により十分に保護を受けることができる（De Haan et al., 1995）。
【００７８】
Tietz（1969）の方法を用いて血液中の還元型グルタチオン含量を測定した。血漿に同量の５％スルホサリチル酸を添加し、４℃、２，０００×gで１０分間遠心分離をした。上澄液１００μＬに０．３ｍＭ Na2HPO4 ８００μＬと０．１％クエン酸ナトリウムに０．０４％になるように5,5’-ジチオビス2-ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を混ぜた溶液１００μＬを添加して５分後４１２ｎｍで吸光度を測定し、還元型グルタチオンを標準物質にして定量した。
【００７９】
Quintanilha等（1982）の方法を用いて血液中の過酸化脂質レベルを測定した。血漿１００μＬに１０％トリクロロ酢酸 ２００μＬを入れて１５分間室温で放置した後、４℃、２，２００×gで１５分間遠心分離をした。上澄液２００μＬに０．６７％チオバルビツール酸 ２００μＬを添加して混合した後、１００℃の恒温水槽で１０分間反応させて冷却し、５３２ｎｍで吸光度を測定し、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を標準物質にして定量した。
【００８０】
酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与させたＳＤラットの肝と血液中のＧＳＨ量を測定した結果は表７の通りである。血液中に存在する脂質が酸化して生成される酸化生成物であるＭＤＡ（マロンジアルデヒド）の含量が高いほど酸化ストレスが大きいが、対照群と酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群でのＭＤＡ含量を測定した結果、１２．０と９．０μｍｏｌ／ｇであり、酵母ＫＨ−１５加水分解物の経口投与時に酸化生成物であるＭＤＡが少なく生成されることを確認した。また、血液と肝での抗酸化活性に関与する還元型ＧＳＨ（グルタチオンサルフェート）含量は、対照群に比べて酵母ＫＨ−１５加水分解物経口投与群が４３７．４μｍｏｌ／Ｌと６．７ｍｍｏｌ／Ｌとして高い含量を示した。酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与することにより抗酸化に関与するＧＳＨの含量の増加と共に酸化生成物であるＭＤＡの減少を確認した。これは酵母ＫＨ−１５加水分解物が抗肥満効果だけでなく、様々な疾病の原因物質であるラジカル消去能があるということを意味する。
【００８１】
【表７】
【００８２】
<実験例３>酵母ＫＨ−１５加水分解物が脂肪の蓄積及び肥満に及ぼす影響
体重増加量及び食餌摂取率
高脂肪食餌をしたラットと酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与（１００ｍｇ／ｋｇ， ２４日投与）したラット間の体重増加量を測定した結果、経口投与１２日以後から高脂肪食餌群と酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群との間に体重増加量が有意的差を示し、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群の体重増加量が少ないことが確認された（図５）。
【００８３】
一方、一日平均体重増加量を測定した結果（表８）、酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与した場合、対照群に比べて体重増加量が５．６３ ｇと少なく増加した。また、酵母ＫＨ−１５加水分解物経口投与群が対照群に比べて食餌摂取量が多少少ないと確認されたが、有意的なレベルではなかった。従って、酵母ＫＨ−１５加水分解物摂取群の体重増加量が少なく、飼料摂取効率が減少することが確認された。
【００８４】
酵母ＫＨ−１５加水分解物を２４日間経口投与した結果、対照群に比べて体重増加量が明確に少なく、一日平均体重増加量でも明確な差を示すことにより肥満予防効果が非常に優れていると予想された。
【００８５】
【表８】
【００８６】
体脂肪減少の効果
各実験群の臓器の重さの変化を測定した結果、肝、脾臓と腎臓の臓器間の重量変化は有意的差がなかったが、副睾丸周辺の脂肪（epididymal fat pad）と腎臓周辺の脂肪（perirenal fat pad）は対照群の場合、５．３８ gと３．７８ gである一方、酵母ＫＨ−１５加水分解物経口投与群の場合、４．３８ gと３．０５ gの脂肪含量を示した。
【００８７】
また、体重で脂肪が占める比率を測定した結果（図６）、副睾丸周辺の脂肪（epididymal fat pad）と腎臓周辺の脂肪（perirenal fat pad）は高脂肪食餌をした群の場合、１．４６％と１．０３％の脂肪含量を示したのに対し、酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与した群の場合、１．２１％と０．８５％の脂肪含量を示すことにより酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与した場合、対照群に比べて副睾丸周辺の脂肪と腎臓周辺の脂肪含量が１７．１％と１７．５％減少した。
【００８８】
従って、肥満の最も大きな原因物質である脂肪の蓄積が酵母ＫＨ−１５加水分解物を投与した場合、相当多くの量が減少することを確認した。
【００８９】
実施例４：酵母ＫＨ−１５加水分解物の活性
【００９０】
<実験例1>材料
酵母ＫＨ−１５加水分解物
以上の結果により、抗肥満効果が最も優れたバチルス属菌ＫＨ−１５が生産したタンパク質分解酵素ＫＨ−１５を用いて製造した酵母ＫＨ−１５加水分解物（Eatless）を用いて生理活性を測定した。
【００９１】
実験動物及び実験食餌
犬（ビーグル（beagle））（２〜５年）を標準飼料（ピュリナ（登録商標））と水は自由に摂取するようにし、飼育場温度は２４℃、そして湿度は４０−６０％に維持し、照明は１２時間明暗周期とした。酵母加水分解物が入っているカプセルを１００ｍｇ／ｋｇに該当する量を経口投与した。ビーグルを３群（対照群、実験群１、実験群２）に分類し、群当り５匹を用いた。対照群は標準飼料を給餌、実験群１は３０日間標準試料及び酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与し（１００ ｍｇ／ｋｇ）、実験群２は初期１０日間は標準飼料、１１−２０日の間には、標準飼料及び酵母ＫＨ−１５加水分解物を（１００ ｍｇ／ｋｇ）、２１−３０日の間には、標準飼料をそれぞれ給餌した。各群間の飼料摂取は次の通りであり（表９）、酵母ＫＨ−１５加水分解物に対して犬の最初の食いつき（嗜好性）が相当良かったことから、飼料添加物に適するものと見られる。
【００９２】
【表９】
【００９３】
<実験例２>酵母ＫＨ−１５加水分解物が脂肪の蓄積及び肥満に及ぼす影響
体重増加
３０日間標準飼料、酵母ＫＨ−１５加水分解物をそれぞれ経口投与し、実験前、実験開始１０，２０，３０日後に体重増加量を測定した結果（図７）、対照群は実験期間が経過するほど体重が増加する傾向を示し、１０，２０，３０日での体重増加量はそれぞれ０．８８， １．４６， ３．０６ ｋｇの増加量を示した。一方、実験群１（Eatless-A）では３０日経過後に０．２ ｋｇの体重増加量を示し、実験群２（Eatless-B）ではむしろ１．６４ ｋｇの体重減少量を示した。
【００９４】
腹囲
腹囲を測定した結果（図８）、標準飼料のみ摂取した対照群では体重の増加量と共に腹囲も１０日目は２．２ ｃｍ、２０日と３０日目は２．８６と３．４３ ｃｍの増加を示した一方、実験群１では３０日目１．８ ｃｍ減少し、実験群２では３０日目に腹囲の変化がなかった。
【００９５】
以上の結果によると、投与方法により若干の差はあるが、酵母ＫＨ−１５加水分解物の経口投与時に体重の増加を防止して体重減少を誘導できる機能を有していることを確認した。
【００９６】
<実験例３>酵母ＫＨ−１５加水分解物投与後の血中指標測定
前述した通り、酵母ＫＨ−１５加水分解物の経口投与は体重増加を抑制又はむしろ減少させる効果があることを確認したが、これは酵母ＫＨ−１５加水分解物が有する毒性による可能性があるので、血液を採取してペットの健康点検時に測定するいくつかの血液中の成分を測定した（表１０, １１）。
【００９７】
酵素法によりキット試薬で血清中の総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、中性脂質濃度を分析した。血液中での赤血球、白血球及びヘモグロビンの数値を測定した結果（表１０）、対照群と酵母ＫＨ−１５加水分解物経口投与群である実験群１, ２で指標は正常な数値を示していることを確認した。
【００９８】
【表１０】
【００９９】
また、血漿でのコレステロール、アルブミン、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）等を測定した（表１１）。血漿中の指標成分等を測定した結果、コレステロール、アルブミン、タンパク質の含量は各群いずれも正常数値を示した。特に肝損傷の指標であるＡＬＴ数値も各群とも正常水準であることを確認した。これは酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与時に体重減少を示した実験群２の場合、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群の毒性による効果ではないとのことを間接的に確認できる結果で、表７, ８で測定された他の数値と比較時、複数の指標が正常範囲内に属するので、このような体重減少は酵母ＫＨ−１５加水分解物の抗肥満活性よるものと見られる。
【０１００】
【表１１】
【０１０１】
<実験例４>酵母ＫＨ−１５加水分解物の抗酸化活性
血液内で抗酸化活性の指標であるＭＤＡとＧＳＨ含量をそれぞれ測定した結果、酸化生成物であるＭＤＡ（マロンジアルデヒド）の含量は、対照群が２７８．４μmol/Lと高い数値を示した一方、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群である実験群１, ２は、それぞれ２１３．６と２２４．４ μmol/Lと低い数値を示した。また、抗酸化活性物質であるＧＳＨ含量は、対照群が２．０ mmol/Lである一方、実験群１, ２はそれぞれ２．７と２．６ mmol/Lとして多少高い含量を示した（図９）。なお、図９において、各群間で記号ｂの値は記号ａの値に対して有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【０１０２】
試作例１：カプセル剤
本発明の酵母ＫＨ−１５ 加水分解物（Ｅａｔｌｅｓｓ）１７０部、ミツロウ３０部及びコーン油５０部を約５０℃に加熱混合して均質にした後、カプセル充填機に供して、常法により１粒当り内容量が２５０ｍｇのゼラチン被覆ソフトカプセル製剤を試作した。このカプセル製剤は、経口摂取が可能な栄養補助食品、飼料又は医薬品として利用できる。
【０１０３】
試作例２：錠剤
本発明の酵母ＫＨ−１５ 加水分解物（Ｅａｔｌｅｓｓ）１００部、化工デンプン（松谷化学工業社製、商品名：「パインフロー」（登録商標））８０部、リン酸三カルシウム８５部及びセルロース３５部を混合機に仕込み、１０分間攪拌混合した。この混合物を直打式打錠機に供して直径７ｍｍ、高さ４ｍｍ、質量１５０ｍｇ／個の素錠を作成し、次いでコーティング機でシェラック被膜を形成させて錠剤形状の経口摂取用組成物を試作した。
【０１０４】
試作例３：飲料
市販の緑茶飲料水１０００部に本発明の酵母ＫＨ−１５ 加水分解物（Ｅａｔｌｅｓｓ）１０部を加えて十分に混合し均質な飲料水を試作した。これは冷蔵庫で１週間保存しても外観及び風味に異状や違和感は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明の酵母加水分解物は、体内脂肪蓄積を妨げることにより体重を調節し、肥満を予防及び治療する。また、本発明の酵母加水分解物は抗酸化活性を有する。従って、本発明の酵母加水分解物は肥満、酸化的損傷等と関連する様々な疾患を予防及び治療するのに効果的であり、これは食品、医薬、飼料等に用いられることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体内脂肪の蓄積阻害活性及び抗酸化活性を有する酵母加水分解物を含む組成物及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、摂取した熱量のうち消耗して残った部分が脂肪に転換され、体内の様々な部分、特に皮下組織と腹腔内に蓄積される現象である。中性脂肪（TG, triglyceride）はグリセリンと３分子の脂肪酸がエステル結合した化合物であり、炭水化物から合成される中性脂肪として動物の脂肪組織に貯蔵されるため酵素による加水分解により遊離脂肪酸を血液中に放出する。脂肪組織に貯蔵された中性脂肪は糖がエネルギー源として、不十分になると非エステル化脂肪酸（nonesterifide fatty acid, NEFA）とグリセロール（glycerol）に分解されて血中に放出される。エネルギー源として用いられて残った非エステル化脂肪酸は、肝で再び中性脂肪に変わる。これが再び血中に流入すれば、これを内因性中性脂肪という。中性脂肪の量が過多であると、粥状硬化症、冠状動脈疾患等と密接な関係がある。
【０００３】
肥満患者は脂肪組織の機能に必要な脂肪量より非常に多くの脂肪が体内に蓄積されている状態であり、これが原因となり人体内の正常な生化学的及び生理的機能に障害を有する者である。肥満は、様々な疾患、特に糖尿病、高脂血症、高血圧及び冠状動脈疾患、そして関節疾患等の多様な疾病の原因となるだけでなく、正常な社会生活を不可能にすることもある。
【０００４】
また、肥満は人間だけでなく動物、特にペットの健康にも致命的な危険を及ぼし、過多な飼料の摂取や偏重した栄養の摂取により、ペット、特に犬や猫、ハムスターが肥満になったり栄養不均衡が発生する場合が多い。
【０００５】
動物に必要な栄養成分は主に飼料に依存し、飼料の中に含まれている脂質は、加工、貯蔵中、酸敗による品質低下が起きて不快な味や臭いを有するようになる。また、酸化生成物によりＤＮＡが損傷したり体内の酵素を不活性化させて代謝異常を誘発又は様々な疾病の原因となっている。従って、脂質の酸化を抑制するために、ＢＨＴ, ＢＨＡ, ＴＢＨＱ等の酸化防止剤を添加するが、これらは抗酸化効果は優れるが、変異原性及び発癌性等が問題視され、消費者の拒否反応によりその使用が減少している傾向である。従って、抗酸化能が高くて安全性が確保された天然抗酸化剤に対する多くの研究が必要であるが、天然抗酸化剤の開発と産業化が難しいので、食品業界では合成抗酸化剤を主に用いている。
【０００６】
したがって、本発明者は食欲や身体代謝を調節して肥満を治療、予防できる方案を研究していたところ、酵母を特定酵素で加水分解する場合、得られた酵母加水分解物が脂肪の蓄積を妨げるだけでなく体内脂肪を分解することにより肥満治療及び予防に効果が大きいことを確認して本発明を完成した。
【０００７】
しかも本発明の酵母加水分解物は、組織及び細胞の酸化的損傷も予防及び緩和させることを見出した。すなわち、本発明の酵母加水分解物は肥満及び酸化的損傷を治療、予防する効果がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３９３０８０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、肥満を治療する肥満治療及び予防用組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の目的は、抗酸化活性を有する組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、酵母を特定酵素で加水分解した酵母加水分解物を提供する。
【００１２】
本発明は、酵母を酵素で分解した酵母加水分解物を有効成分として含み、体重減少効果及び抗酸化活性を有することを特徴とする組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、酵母を酵素で分解した酵母加水分解物を動物に投与する段階を含む動物の動脈硬化、内臓肥満、腹部肥満、高脂血症、脂肪肝、肥満の予防又は治療方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、酵母に酵素を加える段階を含む、体重減少効果及び抗酸化活性を有する組成物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の酵母加水分解物は、体内脂肪の蓄積の阻害及び脂肪分解を通じて体重を減少、肥満を治療及び予防できる。また、本発明の酵母加水分解物は抗酸化活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、多様な酵素で加水分解した酵母加水分解物のタンパク質回収率を示す。
【図２】図２は、酵母加水分解物が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のグリセロール及びレプティン分泌量に及ぼす影響を示す。
【図３】図３は、ＭＴＴ方法で測定した、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞株に対する酵母加水分解物の細胞毒性を示す。
【図４】図４は、酵母ＫＨ−１５加水分解物のラットのＤＰＰＨ及びＡＢＴＳラジカル消去能を示す。
【図５】図５は、酵母ＫＨ−１５加水分解物がＳＤラットの体重に及ぼす影響を示す。
【図６】図６は、酵母ＫＨ−１５加水分解物がＳＤラットの脂肪の蓄積を抑制する効果を示す。
【図７】図７は、酵母ＫＨ−１５加水分解物が犬の体重に及ぼす影響を示す。
【図８】図８は、酵母ＫＨ−１５加水分解物が犬の腹囲に及ぼす影響を示す。
【図９】図９は、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与時における、犬の血液内のＭＤＡ及びＧＳＨ含量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の酵母は、食品として用いられる酵母であれば良く、その種類は特に限定されない。例えば、本発明の酵母にはサッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス ファーメンティー（Ｓａｃｃｈ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、サッカロマイセス バヤナス（Ｓａｃｃｈ．ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス サケ（Ｓａｃｃｈ．ｓａｋｅ）、サッカロマイセス マンドシュリコス（Ｓａｃｃｈ．ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）、サッカロマイセス アナメンシス（Ｓａｃｃｈ．ａｎａｍｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス フォルモセンシス（Ｓａｃｃｈ．ｆｏｒｍｏｓｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス エリプソイデュウス（Ｓａｃｃｈ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロマイセス コレアヌス（Ｓａｃｃｈ．ｃｏｒｅａｎｕｓ）等が用いられ、望ましくはサッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００１９】
本発明の酵素は、タンパク質分解酵素であることが望ましい。より望ましくは上記タンパク質分解酵素は、プロタメックス（Protamex）（登録商標）、プロレザーＦＧ−Ｆ（Proleather FGF）（登録商標）、フレーバーザイム（Flavourzyme）（登録商標）、プロテアーゼＡ（Protease A）、アロアーゼＡＰ−１０（Aroase AP-10）（登録商標）、ペスカラーゼ（Pescalase）、パパイン（Papain）、配列番号１のアミノ酸配列を含むＫＨ−１５、ブロメライン（Bromelain）、フィシン（Ficin）及びニュートラーゼ（Neutrase）で構成される群から選択されるいずれかであり、さらに望ましくは上記タンパク質分解酵素は、プロタメックス、フレーバーザイム及びＫＨ−１５である。最も望ましくは上記タンパク質分解酵素はＫＨ−１５である。しかし、本発明の特徴は酵母を加水分解して食餌摂取量の減少なしに体重を減少させて抗酸化活性を有する酵母加水分解物を製造することにあるところ、このような特徴を有するように酵母を加水分解するタンパク質分解酵素であればいずれかの本発明の範囲に含まれるといえる。
【００２０】
上記組成物は、食品組成物、飼料組成物、薬学的組成物及び化粧料組成物から選択されるいずれか一つである。
【００２１】
本発明の食品組成物、飼料組成物、薬学的組成物及び化粧料組成物は、体内活性酸素を除去することにより、体内脂肪、コレステロールと活性酸素が反応して過酸化脂質を生成することを妨げ、これによって、過酸化脂質が血栓、塞栓を生成することを予防できる。また、本発明の食品組成物、飼料組成物、薬学的組成物は、活性酸素を除去することにより、活性酸素と関連する血栓、塞栓、過酸化脂質による血液循環障害、脳卒中、中風、脳血栓、心筋梗塞、動脈硬化を予防及び治療し、活性酸素によるＤＮＡ、細胞、組織の変性を妨げることにより、アトピー、アレルギー、腫瘍、関節炎、白内障、皮膚腫瘍を予防及び治療し、老化の進行を妨げる。
【００２２】
また、本発明の食品、飼料又は薬学的組成物は、動脈硬化、内臓肥満、腹部肥満、高脂血症、脂肪肝及び肥満で構成された群から選択される疾患を予防及び／又は治療し、糖尿を予防する。また、本発明の食品、飼料又は薬学的組成物は、上記疾患の他に血中脂質濃度の増加、中性脂肪の蓄積等と関連する疾患に複合的な効果を奏し、長期間投与時に体重管理、抗酸化を通じた老化遅延、健康改善効果を奏する。
【００２３】
また、本発明は、酵母加水分解物を有効成分として含む食品組成物を提供する。上記食品とは、健康補助食品、健康機能食品、機能性食品等であるがこれに制限されるものではなく、天然食品、加工食品、一般的な食資材等に本発明の酵母加水分解物を添加したものも含まれる。
【００２４】
本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む食品組成物は、上記組成物をそのまま添加したり他の食品又は食品組成物と共に用いられ、通常の方法により適宜用いられる。有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康又は治療的処置）により適切に決定される。一般に、本発明の健康機能食品を食品又は飲料の製造時に原料に対して０．０１〜７０．００質量％、望ましくは０．０１〜３０．００質量％の量で添加することができ、より望ましくは０．０１〜１０．００質量％の量で添加することができる。食品組成物の上記酵母加水分解物の有効容量は、上記薬学的組成物の有効容量に準じて用いることができるが、健康及び衛生を目的としたり又は健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、上記範囲以下であってもよく、有効成分は安全性面で何ら問題がないため、上記範囲以上の量で用いることもできる。
【００２５】
上記食品の種類には特別な制限はない。上記酵母加水分解物を有効成分として含む食品組成物は、錠剤、硬質又は軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤等のような経口投与用製剤の形態で用いられ、これら製剤は許容可能な通常の担体、例えば、経口投与用製剤の場合には、賦形剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤又は増量剤等を用いて調製することができる。
【００２６】
上記酵母加水分解物を添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤等を挙げることができるが、これら種類の食品に制限されるわけではない。
【００２７】
本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む飼料組成物は、通常の飼料と共に配食でき、本発明の飼料組成物を通常の飼料組成物に添加して機能性飼料組成物を製造して用いることもできる。また、本発明の飼料組成物は本発明の酵母加水分解物以外の機能性成分をさらに含むことができる。上記通常の飼料組成物と本発明の酵母加水分解物が混合された機能性飼料組成物の製造時に、本発明の酵母加水分解物は総飼料組成物に対して０．０１〜３０．００質量％、望ましくは０．０１〜２０．００質量％の量で添加することができる。飼料組成物の上記酵母加水分解物の有効容量は、上記食品組成物の有効容量に準じて用いることができるが、持続的な体重管理を目的としたり、又は健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、上記範囲以下であってもよく、有効成分は安全性面で何ら問題がないため、高度肥満等の場合には、上記範囲以上の量でも用いられる。
【００２８】
本発明の飼料組成物は、家畜又は家禽を対象とする。上記家畜又は家禽は、牛、豚、鶏、馬、羊、ロバ、ラバ、猪、うさぎ、ウズラ、アヒル、雄鳥、闘鶏用鶏、鳩、七面鳥、犬、猫、猿、ハムスター、マウス、ラット、九官鳥、オウム、インコ、カナリア等であるが、これらに制限されるわけではなく、家庭内で飼育可能な人間以外の哺乳動物又は鳥類であれば本発明の飼料組成物の対象といえる。
【００２９】
本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む薬学的組成物は、血栓、塞栓、過酸化脂質による血液循環障害、脳卒中、中風、脳血栓、心筋梗塞、動脈硬化を予防及び治療し、活性酸素によるＤＮＡ、細胞、組織の変性を妨げることにより、アトピー、アレルギー、腫瘍、関節炎、白内障、皮膚腫瘍を予防及び治療し、老化進行を妨げる。また、本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む薬学的組成物は、高脂血症、脂肪肝、内臓肥満、腹部肥満等、部分的肥満及び肥満（即ち、一般的な肥満）を予防及び治療する。
【００３０】
本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む薬学的組成物は、経口又は非経口投与が可能で、一般的な医薬品製剤の形態で用いられる。望ましい薬剤学的製剤は、錠剤、硬質又は軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤等のような経口投与用製剤があり、これら薬剤学的製剤は薬剤学的に許容可能な通常の担体、例えば経口投与用製剤の場合には、賦形剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤又は増量剤等を用いて調製することができる。
【００３１】
本発明の酵母加水分解物を有効成分として含む薬学的組成物の投与容量は、患者の状態、年齢、性別及び合併症等の多様な要因によって専門家により決定され得るが、一般には、成人１ｋｇ当り０．１ｍｇ〜１０ｇ、望ましくは１０ｍｇ〜１ｇの容量で投与され得る。また、単位剤形当り上記薬学的組成物の１日用量又はこの１／２, １／３又は１／４の用量が含まれるようにし、一日に１〜６回投与され得る。しかし、健康及び衛生を目的としたり、又は健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、上記量は上記範囲以下であってもよく、有効成分は安全性面で何ら問題がないため、上記範囲以上の量でも用いられる。
【００３２】
また、本発明は、上記製造方法により製造された酵母加水分解物を有効成分として含む化粧料組成物を提供し、上記酵母加水分解物の製造段階を含む上記化粧料組成物の生産方法を提供する。上記化粧料組成物の製造方法において、化粧品製造に許容される担体は本発明の化粧料組成物の剤形により異なり得る。本発明の化粧料組成物の剤形としては、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、石鹸、シャンプー、界面活性剤-含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、リキッドファウンデーション、クリームファウンデーション及びスプレイ等に剤形化されることができ、本発明の抗酸化用化粧料組成物は、より詳細には柔軟化粧水（スキン、トナー）、収れん化粧水、栄養化粧水、乳液（ローション）、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、ゲル、皮膚接着用パッチ、パウダー、皮膚外用軟膏、貼布剤、懸濁液、エマルジョンスプレイ、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、ヘアーエッセンス又は美容液等の通常の化粧料形態で製造され得る。
【００３３】
上記本発明の製造方法により製造された化粧料組成物の剤形がペースト、クリーム又はゲルの場合、担体成分としては、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛等が望ましい。
【００３４】
上記本発明の製造方法により製造された酵母加水分解物を有効成分として含む化粧料組成物の剤形が溶液又は乳濁液の場合、担体成分としては、溶媒、溶媒化剤又は乳濁化剤が用いられ得、その例としては、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1, 3-ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステル等が望ましい。
【００３５】
上記本発明の製造方法により製造された酵母加水分解物の剤形が懸濁液の場合、担体成分としては、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー又はトラカント等が望ましい。
【００３６】
上記本発明の製造方法により製造された化粧料組成物の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分としては、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホ琥珀酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレイト、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体エトキシル化グリセロール、又は脂肪酸エステル等が望ましい。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を次の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明の内容を例示するもので、発明の範囲が実施例により限定されるわけではない。以下の各例において、％、部及び比率はとくにことわらない限り質量基準である。
【００３８】
実施例１：材料
タンパク質分解酵素
タンパク質分解酵素ＫＨ−１５は、高麗大学食品栄養学科で味噌から分離して保存中のバチルス属菌（Bacillus sp.）ＫＨ−１５をタンパク質分解酵素の生産菌株に用いて得た。即ち、タンパク質分解酵素の生産のためにＬＢ培地（tryptone１０ ｇ／Ｌ、酵母エキス５ ｇ/Ｌ、NaCl １０ ｇ／Ｌ）にスキムミルク １％を添加した液体培地をタンパク質分解酵素生産用培地として用いた。タンパク質分解酵素生産用培地はｐＨ ６．５に調整後、１２１℃、１５分間加圧殺菌し、３０℃で２４時間培養し、上澄液を遠心分離して回収し、粗酵素液として用いた。このように得たタンパク質分解酵素ＫＨ−１５のアミノ酸配列は配列番号１の通りである。
【００３９】
<配列番号１>
MNQKAMIVIA AGSMLFGGAG VYAGINLLEM DKPQTAAVPA TAQADSERDK AMDKIEKAYE
LISNEYVEKV DREKLLEGAI QGMLSTLNDP YSVYMDKQTA KGGSDSLDSS FEGIGAEVGM
EDGKIIIVSP FKKSPAEKAG LKPLSTIISI NGESMAGKDL NHAVLKIRGK KGSSVSMKIQ
RPGTKKQLSF RIKRAEIPLE TVFASEKKVQ GHSVGYIAIS TFSEHTAEDF AKALRELEKK
EIEGLVIDVR GNPGGYLQSV EEILKHFVTK DQPYIQIAER NGDKKRYFST LTHKKAYPVN
VITDKGSASA SEILAGALKE AGHYDVVGDT SFGKGTVQQA VPMGDGSNIK LTLYKWLTPN
GNWIHKKGIE PTIAIKQPDY FSAGPLQLKE PLKVDMNNED VKHAQVLLKG LSFDPGREDG
YFSKDMKKAV MAFQDQNKLN KTGVIDTRTA ETLNQQIEKK KSDEKNDLQL QTALKASFVN
【００４０】
プロタメックス（Protamex）とフレーバーザイム（Flavourzyme）はNovo Korea（Seoul, South Korea）、プロレザーＦＧ−Ｆ（Proleather FG-F）とプロテアーゼＡ（Protease A）はAmano Enzyme USA Co.（Lombard, IL, USA）、アロアーゼＡＰ−１０（Aroase AP-10）とペスカラーゼ（Pescalase）はYakult（Yakult Pharmaceutical Ind. Co., Tokyo, Japan）とDSM Gist（Netherlands）でそれぞれ購入して用い、その特性は表１の通りである。
【００４１】
【表１】
【００４２】
統計分析
実験結果はSPSS programを用いて平均と誤差を提示し、各処理別有意性はDuncans multiple range testでp<0.05水準で検定した。
【００４３】
実施例２：酵母加水分解物の活性
【００４４】
<実験例１>酵母加水分解物の製造
Saccharomyces cerevisiae （ATCC4126）を２％モラセス（廃糖蜜）、０．６％(NH4)2SO4、０．１％MgSO4・7H2O、０．２％KH2PO4、０．０３％K2HPO4と０．１％NaClを含有した液体培地を用いて３０℃で３日間培養した。培養後、３，０００ ｒｐｍで２０分間遠心分離して菌体を回収し、２０ ｍＭリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ ７．０）を用いて１０％懸濁液を作った。懸濁液にプロタメックス（Protamex）、フレーバーザイム（Flavourzyme）、プロテアーゼＡ（Protease A）、アロアーゼＡＰ−１０（Aroase AP-10）、ペスカラーゼ（Pescalase）、パパイン（Papain）及びＫＨ−１５をそれぞれ０．５％ずつ添加し、３５℃で６時間加水分解後、９５℃で１０分間加熱処理し、遠心分離して上澄液を回収した。酵母加水分解物は１０ｋＤａ分離膜（Satocon cassette, Sartorius, Germany）を用いて処理し凍結乾燥して製造した。
【００４５】
<実験例２>酵母加水分解物のタンパク質回収率
商業用酵素とバチルス属菌ＫＨ−１５が生産したタンパク質分解酵素ＫＨ−１５を用いて酵母加水分解物を製造してタンパク質回収率を測定した（図１、式１）。
【００４６】
<式１>
タンパク質回収率（％）=（加水分解後のタンパク質/加水分解前のタンパク質）×100
【００４７】
プロタメックス、フレーバーザイムによる加水分解物は、それぞれ５２．３％と５４．５％の回収率を示し、endo-typeタンパク質分解酵素であるプロレザー、プロテアーゼＡとペスカラーゼによる酵母加水分解物のタンパク質回収率は、それぞれ４６．７％、４４．５％と５０．４％で多少低くなった一方、ＫＨ−１５は５３．９％でendoとexo-typeの混合であるcomplex-typeと類似のタンパク質回収率を示した（表２）。
【００４８】
【表２】
【００４９】
<実験例３>酵母加水分解物の脂肪の蓄積阻害の効果
脂肪細胞での脂肪分解効果
３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞（preadipocytes）（ATCC#F8979, Manassas, VA）を１０％ウシ胎児血清、１００ ｕｎｉｔ／ｍＬ ペニシリン、１００mｇ／ｍＬ ストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培養液を用いて５％ＣＯ２下にインキュベーターで培養した。３, ４日後に細胞が融合するようになると、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで処理して細胞を分離した後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ, ５分）して細胞を集め、細胞密度が３．３×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２になるように懸濁溶液を作って１２ウェルプレートに１ ｍｌずつ分注して２次培養した。３, ４日後に細胞を増殖させた後、分化培地（ＤＭＥＭ培養液に５μｇ／ｍｌインスリン、０．２５ μＭデキサメタゾン及び０．５ ｍＭ ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）が添加された培地）を添加して分化を誘導した。
【００５０】
２日間隔で処理培地（ＤＭＥＭ培養液に５μｇ／ｍｌのインスリンのみ含まれた培地）に培地を取り替えながら脂肪細胞に分化させた。分化培地処理後、約１０日が経過すると９０％以上が脂肪細胞に分化するようになる。酵母加水分解物は０．１％の濃度になるように処理培地に溶かした後、０．２μｍフィルターで濾過して完全に分化された脂肪細胞に処理した。
【００５１】
グリセロール濃度は酵素反応法で測定した。３７℃に予め加温しておいた遊離グリセロール試薬１ ｍＬに収集された培養液１０μＬを添加して３７℃の水浴槽で５分間培養した。グリセロール定量のためには、グリセロール標準溶液（Sigma）１２．５μgと２５μgを試料と同一の方法で反応させた後、９６ウェルプレートに２００μＬを採り５４０ ｎｍで吸光度を測定した。
【００５２】
その結果、脂肪分解時に生成されるグリセロール濃度は、対照群（酵母加水分解物未添加群）と比較時にプロタメックス、フレーバーザイム及びＫＨ−１５による各酵母加水分解物添加群でそれぞれ１０９．３％、１１４．５％及び１１６．８％と、他の酵母加水分解物に比べて増加した。一方、プロレザー、プロテアーゼＡ、アロアーゼ、ペスカラーゼ及びパパインによる各酵母加水分解物投与群の場合、対照群と大きな差はなかった（図２）。
【００５３】
脂肪細胞での脂肪の蓄積阻害効果
レプティンは、脂肪細胞の肥満遺伝子により生成されるホルモンで、視床下部に作用して飲食物の摂取を抑制させてエネルギー消費を増加させ、肥満を調節するタンパク質で（Caro et al., 1996）、レプティンは体脂肪量と密接な関連関係があり（Considine et al., 1996）、血中レプティン濃度は体脂肪量を示す指標として知られ、最近の肥満研究で多く適用されている。レプティンは脂肪細胞内の脂肪の蓄積量が増加するほどレプティンの分泌量が増加すると知られている（Considine et al., 1996）。従って、レプティン量の減少は脂肪蓄積が少ないということを意味する。
【００５４】
脂肪細胞から分泌されたレプティンの量はEnzyme Linked Immunosorbent Assay（ELISA）方法を用いて測定した。ラット抗マウスレプティン ＩｇＧ ２μg／ｍＬをMaxiSorp（登録商標） ELISAプレート（Nunc）に入れて一夜培養した後、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のTween 20（登録商標）を含むＰＢＳ）緩衝液で３回洗浄したプレートに脂肪細胞から収集した培養上清１００μＬを培地に添加して１時間培養した。再びＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ビオチン化ウサギ抗マウスレプティン ＩｇＧ ２００μg／ｍＬを入れて１時間常温に置いた後、再度ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。その後、ExtrAvidinホースラディッシュペルオキシダーゼを常温で１時間培養した後、３回洗浄した。免疫活性を測定するために各ウェルに１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン二塩酸塩基質（ＴＭＢ）を入れて３０分間反応させた後、５０μＬの２Ｍ H2SO4を添加して反応を終了させて吸光度を４５０ｎｍで測定した。酵母加水分解物のレプティン分泌量は対照群と比較して相対的な値で示した。
【００５５】
酵母加水分解物による脂肪細胞でのレプティン含量を測定した結果（図２）、ＫＨ−１５による酵母加水分解物処理時に２３．５％として最も低いレプティン含量を示し、プロタメックスとフレーバーザイム加水分解物は５８．７％と３５．７％の含量を示した。
【００５６】
ＫＨ−１５による酵母加水分解物添加によるグリセロール濃度が有意的に増加し、レプティンの分泌量が大幅に減少したことから見て、ＫＨ−１５、プロタメックス及びフレーバーザイム酵母加水分解物は、脂肪分解効果とは別途に脂肪の蓄積を抑制する効果があり、両者は互いに異なる機作によりなされるものと確認された。また、他の酵母加水分解物に比べて、特にＫＨ−１５酵母加水分解物の肥満抑制効果が優れると判断される。
【００５７】
【表３】
【００５８】
<実験例４>酵母加水分解物の細胞毒性
試料に対する細胞生存率は、ＭＴＴ〔3-（4,5-メチルチアゾ-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド〕比色法で実験した（Camichael et al., 1978）。細胞は１×１０５ ｃｅｌｌ／２００μＬの濃度で９６ウェル プレートに分注して２４時間培養後に培地を除去した。ここで新たなＤＭＥＭ培地２００μＬに濃度別に希釈した試料をそれぞれ添加して２４時間培養した後、２．５ｍｇ／ｍＬで製造したＭＴＴ溶液２０μＬを各ウェルに加えて４時間培養した。培養終了後、上澄液を除去して各ウェルに１００μＬのDMSOを添加して生成されたformazan結晶を溶解させてマイクロプレートリーダーを用いて５５０ｎｍで吸光度を測定した。この時、細胞生存率は次の通り計算して示した。
【００５９】
<式２>
細胞生存率（％）＝{100−（対照群の吸光度−試料処理群の吸光度）/対照群の吸光度}×100
【００６０】
脂肪に分化された３Ｔ３−Ｌ１細胞株（adipocyte）に対して異なる濃度（５０，１００μｇ／ｍＬ）の酵母加水分解物で２４時間処理して細胞毒性を観察した結果、処理濃度区間内では毒性が観察されず、１００μｇ／ｍＬの処理時に５５０ｎｍでの吸光度の増加は試料自体が有する色によるもので、細胞の増殖促進効果はないことが確認された。従って、以後肥満細胞の処理濃度は１００μｇ／ｍＬに設定した（図３）。酵母加水分解物間の若干の差はあったが、この結果から酵母加水分解物は１００μｇ／ｍＬの濃度で脂肪細胞に対する細胞毒性がなく、脂肪細胞を増殖させたり肥満を誘導しないということを確認することができた。
【００６１】
【表４】
【００６２】
実施例３：酵母ＫＨ−１５加水分解物の活性
【００６３】
<実験例１>材料
酵母ＫＨ−１５加水分解物
実施例２で抗肥満効果が最も優れていたBacillus sp. ＫＨ−１５が生産したタンパク質分解酵素であるＫＨ−１５を用いて製造した酵母加水分解物（以下、Eatlessということがある）をもって生理活性を測定した。
【００６４】
実験動物及び実験食餌
実験動物は体重１８０−１８５ｇ程度のＳ／Ｄ雄ラットを大韓実験動物センター（忠清北道陰城）から購入して用いた。食餌（表５）と水は自由に摂取するようにし、飼育場温度は２２℃、そして湿度は４０−６０％に維持し、照明は１２時間明暗周期とした。
【００６５】
ラットは２つの群に分けて、実験群１は高脂肪食餌群（対照群）、実験群２は高脂肪食餌及び酵母ＫＨ−１５加水分解物の経口投与群（１００ｍｇ／ｋｇ）に分けて各群ごとに８匹ずつ分けて実験を進めた。経口投与は２４日間実施した。
【００６６】
【表５】
【００６７】
<実験例２>酵母ＫＨ−１５加水分解物がラットの血中脂質に及ぼす影響
血清中の総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、中性脂質濃度は酵素法による測定キット試薬で分析した。
【００６８】
酵母ＫＨ−１５加水分解物を２４日間経口投与した後、血清中の脂質の変化を測定した結果（表６）、体脂肪蓄積の原因物質である中性脂質は対照群である高脂肪食餌群が９６．２８ｍｇ／ｄｌであるのに対し、酵母ＫＨ−１５加水分解物を投与した場合、８０．０７ ｍｇ／ｄｌと差を示したが、統計的に有意差を示さなかった。
【００６９】
しかし、総コレステロールの場合、対照群が酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群に比べて高い数値を示し、ＨＤＬ−コレステロールの場合には、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群が高脂肪食餌群に比べて３４％程度高い数値を示した。従って、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群は総コレステロールの数値が低く、ＨＤＬ−コレステロールの数値が高いことにより動脈硬化発病率を低くすることができる。
【００７０】
以上の実験結果によると、酵母ＫＨ−１５加水分解物は体重減少、体脂肪減少効果を奏することにより肥満抑制又は治療効果を奏していることを確認した。
【００７１】
【表６】
【００７２】
スチューデントt-検定（Students t-test）によると、対照群に対して有意な差を示す（*p<0.05, **p<0.01）。
（※）ＨＴＲ ＝ ＨＤＬコレステロール／総コレステロール
【００７３】
<実験例３>酵母ＫＨ−１５加水分解物の抗酸化活性
酵母ＫＨ−１５加水分解物のＤＰＰＨラジカルとＡＢＴＳラジカル消去能
ＤＰＰＨラジカル消去能の測定は、Cheung等（2003）の方法を用いた。1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジルをエタノールに溶解させた０．２ｍＭ ＤＰＰＨ溶液０．４ｍＬと試料０．１ｍＬを暗所で１０分間反応させた後、５２０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７４】
ＡＢＴＳラジカル消去能の測定は、Re等（1999）の方法を用いた。７ｍＭ 2,2’-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）二アンモニウムに２．４５ｍＭ過硫酸カリウムを添加して暗所で室温で１２−１６時間放置した後、４１４ ｎｍで吸光度が１．４−１．５になるように蒸留水で希釈させた。肝組織試料１２．５μＬに希釈されたＡＢＴＳラジカル溶液２５０μＬを入れて暗所で６０分間反応させて４１４ｎｍで吸光度を測定した。ＤＰＰＨ及びＡＢＴＳラジカル消去能（％）は次の通り計算した。
【００７５】
<式３>
ラジカル消去活性（％）=（1-Asample/A対照群）×100
Asample:試料添加時の吸光度、 A対照群:試料未添加時の吸光度
【００７６】
酵母ＫＨ−１５加水分解物のＤＰＰＨラジカルとＡＢＴＳラジカル消去能は、図４のように濃度依存的に増加する傾向を示し、ラジカルの５０％消去に必要なＩＣ５０値は１９．１ ｍｇ／ｍｌと９．０ ｍｇ／ｍｌであり、比較的高い水準のラジカル消去能を有していることを確認した。従って、酵母ＫＨ−１５加水分解物を飼料に添加時に抗酸化活性を期待することができる。
【００７７】
酵母ＫＨ−１５加水分解物が還元型グルタチオン及び過酸化脂質に及ぼす影響
酸素遊離基（酸素フリーラジカル、活性酸素）は酸素を用いて生存する細胞内で生成される毒性が強い物質で、細胞のＤＮＡや細胞膜脂質及びタンパク質等を損傷させるので、細胞内ではスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等の抗酸化酵素とグルタチオン、尿酸等の様々な非酵素的抗酸化物質があり、酸素遊離基による酸化的損傷から各種細胞構造物を保護する。ＳＯＤは遊離酸素をＨ２Ｏ２とＯ２に転換し、生成されたＨ２Ｏ２はカタラーゼとグルタチオンペルオキシダーゼにより消去されるが、グルタチオンペルオキシダーゼは還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）に酸化させながらＨ２Ｏ２を除去し、ＧＳＳＧはグルタチオンリダクターゼにより再びＧＳＨに還元され、人体内でグルタチオンはＧＳＨとＧＳＳＧの２つの形態で均衡をなしながら存在するようになる。もし、細胞内に毒性又は酸化的損傷が生じた場合には、ＧＳＳＧが徐々に増加するようになって、ＧＳＨ／ＧＳＳＧの不均衡をもたらすようになり防御機作としての役割が消失する。ＧＳＨは酸素遊離基による細胞の損傷を防止し、細胞内解毒作用を担当する重要な物質とみなされている。従って、健康な個体の細胞は酸化的細胞損傷を引き起こし得る酸素遊離基を消去する防御機作により十分に保護を受けることができる（De Haan et al., 1995）。
【００７８】
Tietz（1969）の方法を用いて血液中の還元型グルタチオン含量を測定した。血漿に同量の５％スルホサリチル酸を添加し、４℃、２，０００×gで１０分間遠心分離をした。上澄液１００μＬに０．３ｍＭ Na2HPO4 ８００μＬと０．１％クエン酸ナトリウムに０．０４％になるように5,5’-ジチオビス2-ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を混ぜた溶液１００μＬを添加して５分後４１２ｎｍで吸光度を測定し、還元型グルタチオンを標準物質にして定量した。
【００７９】
Quintanilha等（1982）の方法を用いて血液中の過酸化脂質レベルを測定した。血漿１００μＬに１０％トリクロロ酢酸 ２００μＬを入れて１５分間室温で放置した後、４℃、２，２００×gで１５分間遠心分離をした。上澄液２００μＬに０．６７％チオバルビツール酸 ２００μＬを添加して混合した後、１００℃の恒温水槽で１０分間反応させて冷却し、５３２ｎｍで吸光度を測定し、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を標準物質にして定量した。
【００８０】
酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与させたＳＤラットの肝と血液中のＧＳＨ量を測定した結果は表７の通りである。血液中に存在する脂質が酸化して生成される酸化生成物であるＭＤＡ（マロンジアルデヒド）の含量が高いほど酸化ストレスが大きいが、対照群と酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群でのＭＤＡ含量を測定した結果、１２．０と９．０μｍｏｌ／ｇであり、酵母ＫＨ−１５加水分解物の経口投与時に酸化生成物であるＭＤＡが少なく生成されることを確認した。また、血液と肝での抗酸化活性に関与する還元型ＧＳＨ（グルタチオンサルフェート）含量は、対照群に比べて酵母ＫＨ−１５加水分解物経口投与群が４３７．４μｍｏｌ／Ｌと６．７ｍｍｏｌ／Ｌとして高い含量を示した。酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与することにより抗酸化に関与するＧＳＨの含量の増加と共に酸化生成物であるＭＤＡの減少を確認した。これは酵母ＫＨ−１５加水分解物が抗肥満効果だけでなく、様々な疾病の原因物質であるラジカル消去能があるということを意味する。
【００８１】
【表７】
【００８２】
<実験例３>酵母ＫＨ−１５加水分解物が脂肪の蓄積及び肥満に及ぼす影響
体重増加量及び食餌摂取率
高脂肪食餌をしたラットと酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与（１００ｍｇ／ｋｇ， ２４日投与）したラット間の体重増加量を測定した結果、経口投与１２日以後から高脂肪食餌群と酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群との間に体重増加量が有意的差を示し、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群の体重増加量が少ないことが確認された（図５）。
【００８３】
一方、一日平均体重増加量を測定した結果（表８）、酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与した場合、対照群に比べて体重増加量が５．６３ ｇと少なく増加した。また、酵母ＫＨ−１５加水分解物経口投与群が対照群に比べて食餌摂取量が多少少ないと確認されたが、有意的なレベルではなかった。従って、酵母ＫＨ−１５加水分解物摂取群の体重増加量が少なく、飼料摂取効率が減少することが確認された。
【００８４】
酵母ＫＨ−１５加水分解物を２４日間経口投与した結果、対照群に比べて体重増加量が明確に少なく、一日平均体重増加量でも明確な差を示すことにより肥満予防効果が非常に優れていると予想された。
【００８５】
【表８】
【００８６】
体脂肪減少の効果
各実験群の臓器の重さの変化を測定した結果、肝、脾臓と腎臓の臓器間の重量変化は有意的差がなかったが、副睾丸周辺の脂肪（epididymal fat pad）と腎臓周辺の脂肪（perirenal fat pad）は対照群の場合、５．３８ gと３．７８ gである一方、酵母ＫＨ−１５加水分解物経口投与群の場合、４．３８ gと３．０５ gの脂肪含量を示した。
【００８７】
また、体重で脂肪が占める比率を測定した結果（図６）、副睾丸周辺の脂肪（epididymal fat pad）と腎臓周辺の脂肪（perirenal fat pad）は高脂肪食餌をした群の場合、１．４６％と１．０３％の脂肪含量を示したのに対し、酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与した群の場合、１．２１％と０．８５％の脂肪含量を示すことにより酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与した場合、対照群に比べて副睾丸周辺の脂肪と腎臓周辺の脂肪含量が１７．１％と１７．５％減少した。
【００８８】
従って、肥満の最も大きな原因物質である脂肪の蓄積が酵母ＫＨ−１５加水分解物を投与した場合、相当多くの量が減少することを確認した。
【００８９】
実施例４：酵母ＫＨ−１５加水分解物の活性
【００９０】
<実験例1>材料
酵母ＫＨ−１５加水分解物
以上の結果により、抗肥満効果が最も優れたバチルス属菌ＫＨ−１５が生産したタンパク質分解酵素ＫＨ−１５を用いて製造した酵母ＫＨ−１５加水分解物（Eatless）を用いて生理活性を測定した。
【００９１】
実験動物及び実験食餌
犬（ビーグル（beagle））（２〜５年）を標準飼料（ピュリナ（登録商標））と水は自由に摂取するようにし、飼育場温度は２４℃、そして湿度は４０−６０％に維持し、照明は１２時間明暗周期とした。酵母加水分解物が入っているカプセルを１００ｍｇ／ｋｇに該当する量を経口投与した。ビーグルを３群（対照群、実験群１、実験群２）に分類し、群当り５匹を用いた。対照群は標準飼料を給餌、実験群１は３０日間標準試料及び酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与し（１００ ｍｇ／ｋｇ）、実験群２は初期１０日間は標準飼料、１１−２０日の間には、標準飼料及び酵母ＫＨ−１５加水分解物を（１００ ｍｇ／ｋｇ）、２１−３０日の間には、標準飼料をそれぞれ給餌した。各群間の飼料摂取は次の通りであり（表９）、酵母ＫＨ−１５加水分解物に対して犬の最初の食いつき（嗜好性）が相当良かったことから、飼料添加物に適するものと見られる。
【００９２】
【表９】
【００９３】
<実験例２>酵母ＫＨ−１５加水分解物が脂肪の蓄積及び肥満に及ぼす影響
体重増加
３０日間標準飼料、酵母ＫＨ−１５加水分解物をそれぞれ経口投与し、実験前、実験開始１０，２０，３０日後に体重増加量を測定した結果（図７）、対照群は実験期間が経過するほど体重が増加する傾向を示し、１０，２０，３０日での体重増加量はそれぞれ０．８８， １．４６， ３．０６ ｋｇの増加量を示した。一方、実験群１（Eatless-A）では３０日経過後に０．２ ｋｇの体重増加量を示し、実験群２（Eatless-B）ではむしろ１．６４ ｋｇの体重減少量を示した。
【００９４】
腹囲
腹囲を測定した結果（図８）、標準飼料のみ摂取した対照群では体重の増加量と共に腹囲も１０日目は２．２ ｃｍ、２０日と３０日目は２．８６と３．４３ ｃｍの増加を示した一方、実験群１では３０日目１．８ ｃｍ減少し、実験群２では３０日目に腹囲の変化がなかった。
【００９５】
以上の結果によると、投与方法により若干の差はあるが、酵母ＫＨ−１５加水分解物の経口投与時に体重の増加を防止して体重減少を誘導できる機能を有していることを確認した。
【００９６】
<実験例３>酵母ＫＨ−１５加水分解物投与後の血中指標測定
前述した通り、酵母ＫＨ−１５加水分解物の経口投与は体重増加を抑制又はむしろ減少させる効果があることを確認したが、これは酵母ＫＨ−１５加水分解物が有する毒性による可能性があるので、血液を採取してペットの健康点検時に測定するいくつかの血液中の成分を測定した（表１０, １１）。
【００９７】
酵素法によりキット試薬で血清中の総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、中性脂質濃度を分析した。血液中での赤血球、白血球及びヘモグロビンの数値を測定した結果（表１０）、対照群と酵母ＫＨ−１５加水分解物経口投与群である実験群１, ２で指標は正常な数値を示していることを確認した。
【００９８】
【表１０】
【００９９】
また、血漿でのコレステロール、アルブミン、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）等を測定した（表１１）。血漿中の指標成分等を測定した結果、コレステロール、アルブミン、タンパク質の含量は各群いずれも正常数値を示した。特に肝損傷の指標であるＡＬＴ数値も各群とも正常水準であることを確認した。これは酵母ＫＨ−１５加水分解物を経口投与時に体重減少を示した実験群２の場合、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群の毒性による効果ではないとのことを間接的に確認できる結果で、表７, ８で測定された他の数値と比較時、複数の指標が正常範囲内に属するので、このような体重減少は酵母ＫＨ−１５加水分解物の抗肥満活性よるものと見られる。
【０１００】
【表１１】
【０１０１】
<実験例４>酵母ＫＨ−１５加水分解物の抗酸化活性
血液内で抗酸化活性の指標であるＭＤＡとＧＳＨ含量をそれぞれ測定した結果、酸化生成物であるＭＤＡ（マロンジアルデヒド）の含量は、対照群が２７８．４μmol/Lと高い数値を示した一方、酵母ＫＨ−１５加水分解物投与群である実験群１, ２は、それぞれ２１３．６と２２４．４ μmol/Lと低い数値を示した。また、抗酸化活性物質であるＧＳＨ含量は、対照群が２．０ mmol/Lである一方、実験群１, ２はそれぞれ２．７と２．６ mmol/Lとして多少高い含量を示した（図９）。なお、図９において、各群間で記号ｂの値は記号ａの値に対して有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【０１０２】
試作例１：カプセル剤
本発明の酵母ＫＨ−１５ 加水分解物（Ｅａｔｌｅｓｓ）１７０部、ミツロウ３０部及びコーン油５０部を約５０℃に加熱混合して均質にした後、カプセル充填機に供して、常法により１粒当り内容量が２５０ｍｇのゼラチン被覆ソフトカプセル製剤を試作した。このカプセル製剤は、経口摂取が可能な栄養補助食品、飼料又は医薬品として利用できる。
【０１０３】
試作例２：錠剤
本発明の酵母ＫＨ−１５ 加水分解物（Ｅａｔｌｅｓｓ）１００部、化工デンプン（松谷化学工業社製、商品名：「パインフロー」（登録商標））８０部、リン酸三カルシウム８５部及びセルロース３５部を混合機に仕込み、１０分間攪拌混合した。この混合物を直打式打錠機に供して直径７ｍｍ、高さ４ｍｍ、質量１５０ｍｇ／個の素錠を作成し、次いでコーティング機でシェラック被膜を形成させて錠剤形状の経口摂取用組成物を試作した。
【０１０４】
試作例３：飲料
市販の緑茶飲料水１０００部に本発明の酵母ＫＨ−１５ 加水分解物（Ｅａｔｌｅｓｓ）１０部を加えて十分に混合し均質な飲料水を試作した。これは冷蔵庫で１週間保存しても外観及び風味に異状や違和感は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明の酵母加水分解物は、体内脂肪蓄積を妨げることにより体重を調節し、肥満を予防及び治療する。また、本発明の酵母加水分解物は抗酸化活性を有する。従って、本発明の酵母加水分解物は肥満、酸化的損傷等と関連する様々な疾患を予防及び治療するのに効果的であり、これは食品、医薬、飼料等に用いられることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母（Saccharomyces cerevisiae）をタンパク質分解酵素で分解した酵母加水分解物を有効成分として含み、体重減少効果及び抗酸化活性を有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
上記タンパク質分解酵素は、プロタメックス（Protamex）、フレーバーザイム（Flavourzyme）、プロテアーゼＡ（Protease A）、アロアーゼＡＰ−１０（Aroase AP-10）、ペスカラーゼ（Pescalase）、パパイン（Papain）及び配列番号１のアミノ酸配列を含むＫＨ−１５で構成される群から選択される1つ又はそれ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記タンパク質分解酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＫＨ−１５であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
上記組成物は、食品組成物、飼料組成物、薬学的組成物及び化粧料組成物から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記薬学的組成物は、動脈硬化、内臓肥満、腹部肥満、高脂血症、脂肪肝及び肥満で構成された群から選択されるいずれか１つを予防又は治療することを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項の組成物を動物に投与する段階を含む、動物の動脈硬化、内臓肥満、腹部肥満、高脂血症、脂肪肝及び肥満で構成された群から選択されるいずれか１つを予防又は治療する方法。
【請求項７】
酵母（Saccharomyces cerevisiae）にタンパク質分解酵素を加える段階を含む、体重減少効果及び抗酸化活性を有する組成物の製造方法。
【請求項８】
上記タンパク質分解酵素は、プロタメックス（Protamex）、フレーバーザイム（Flavourzyme）、プロテアーゼＡ（Protease A）、アロアーゼＡＰ−１０（Aroase AP-10）、ペスカラーゼ（Pescalase）、パパイン（Papain）及び配列番号１のアミノ酸配列を含むＫＨ−１５で構成される群から選択される１つ又はそれ以上であることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
上記タンパク質分解酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＫＨ−１５であることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
上記組成物は、食品組成物、飼料組成物、薬学的組成物及び化粧料組成物から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１１】
上記薬学的組成物は、動脈硬化、内臓肥満、腹部肥満、高脂血症、脂肪肝及び肥満で構成された群から選択されるいずれか１つを予防又は治療することを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１】
酵母（Saccharomyces cerevisiae）をタンパク質分解酵素で分解した酵母加水分解物を有効成分として含み、体重減少効果及び抗酸化活性を有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
上記タンパク質分解酵素は、プロタメックス（Protamex）、フレーバーザイム（Flavourzyme）、プロテアーゼＡ（Protease A）、アロアーゼＡＰ−１０（Aroase AP-10）、ペスカラーゼ（Pescalase）、パパイン（Papain）及び配列番号１のアミノ酸配列を含むＫＨ−１５で構成される群から選択される1つ又はそれ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記タンパク質分解酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＫＨ−１５であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
上記組成物は、食品組成物、飼料組成物、薬学的組成物及び化粧料組成物から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記薬学的組成物は、動脈硬化、内臓肥満、腹部肥満、高脂血症、脂肪肝及び肥満で構成された群から選択されるいずれか１つを予防又は治療することを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項の組成物を動物に投与する段階を含む、動物の動脈硬化、内臓肥満、腹部肥満、高脂血症、脂肪肝及び肥満で構成された群から選択されるいずれか１つを予防又は治療する方法。
【請求項７】
酵母（Saccharomyces cerevisiae）にタンパク質分解酵素を加える段階を含む、体重減少効果及び抗酸化活性を有する組成物の製造方法。
【請求項８】
上記タンパク質分解酵素は、プロタメックス（Protamex）、フレーバーザイム（Flavourzyme）、プロテアーゼＡ（Protease A）、アロアーゼＡＰ−１０（Aroase AP-10）、ペスカラーゼ（Pescalase）、パパイン（Papain）及び配列番号１のアミノ酸配列を含むＫＨ−１５で構成される群から選択される１つ又はそれ以上であることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
上記タンパク質分解酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＫＨ−１５であることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
上記組成物は、食品組成物、飼料組成物、薬学的組成物及び化粧料組成物から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１１】
上記薬学的組成物は、動脈硬化、内臓肥満、腹部肥満、高脂血症、脂肪肝及び肥満で構成された群から選択されるいずれか１つを予防又は治療することを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−２３１０９７（Ｐ２０１１−２３１０９７Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２３３１２７（Ｐ２０１０−２３３１２７）
【出願日】平成２２年１０月１５日（２０１０．１０．１５）
【出願人】（５１０２７５６３３）ネオクレマー株式会社 (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｎｅｏ Ｃｒｅｍａｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｍ １１８ ＳＩＣＯＸ ｔｏｗｅｒ， ５１３−１４ Ｓａｎｇｄａｅｗｏｎ−ｄｏｎｇ， Ｊｕｎｇｗｏｎ−ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ−ｃｉｔｙ，Ｋｙｏｕｎｇｇｉ−ｄｏ， Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１５日（２０１０．１０．１５）
【出願人】（５１０２７５６３３）ネオクレマー株式会社 (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｎｅｏ Ｃｒｅｍａｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｍ １１８ ＳＩＣＯＸ ｔｏｗｅｒ， ５１３−１４ Ｓａｎｇｄａｅｗｏｎ−ｄｏｎｇ， Ｊｕｎｇｗｏｎ−ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ−ｃｉｔｙ，Ｋｙｏｕｎｇｇｉ−ｄｏ， Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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