腫瘍成長に対するDNAワクチン及びその使用方法
癌細胞に対して免疫応答を誘導するのに適切なDNAワクチンは、癌関連アポトーシスファミリータンパク質阻害剤と、サイトカイン又はナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドなどの免疫活性遺伝子産物とを作用可能にコードするDNA構築体を、薬剤として許容されるキャリア中に含む。好ましいサイトカインはCCL21である。好ましいナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドとしては、ヒトMICA、ヒトMICB、ヒトULBP1、ヒトULBP2、ヒトULBP3などが挙げられる。アポトーシス(IAP)ファミリータンパク質の癌関連阻害剤は、好ましくは、サービビン(survivin)タンパク質又はリビン(livin)タンパク質である。本発明のワクチンを哺乳動物に投与することによって腫瘍成長を阻害する方法も記載されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍細胞に対して免疫応答を誘導するのに有効な適切な分子をコードするデオキシリボ核酸(DNA)ワクチンに関する。特に、本発明は、癌関連アポトーシスファミリータンパク質阻害剤(IAP)及び免疫活性遺伝子産物をコードするDNAワクチンに関する。本発明は、腫瘍成長を阻害するDNAワクチンを使用する方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
ワクチンは、病原体が増殖し病理作用を生じる前に病原体を破壊するために生物の免疫系を刺激する予防薬を極めて限定的に投与することによって、いくつかの疾患に対して長期的保護作用をもたらすのに利用されてきた。ワクチン及びワクチン接種の様々な手法は、Bernard R. Glick及びJack J. Pasternak、Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA、Second Edition、ASM Press pp.253〜276(1998)に記載されている。
【0003】
ワクチン接種は、体自体の免疫系を誘導して、感染病原体が病理学的応答を引き起こす前に感染病原体を探し出して破壊する手段である。
【0004】
一般に、ワクチンは、生の、ただし弱毒された病原体(ウイルス又は細菌)か、病原体の死菌ワクチンである。生きた細菌又はウイルスからなるワクチンは、非病原性でなければならない。一般に、細菌培養物又はウイルス培養物は、物理的又は化学的処理によって弱毒化される(弱められる)。この病原体は非病原性ではあるが、ワクチンによる治療を受けた被検者において依然として免疫応答を誘導することができる。
【0005】
免疫応答は、特定の巨大分子又は病原体であり得る抗原によって誘導される。これらの抗原は、一般に、タンパク質、多糖、脂質又は糖脂質であり、B細胞及びT細胞として知られるリンパ球によって「異質」と認識される。両方のタイプのリンパ球が抗原に曝されると、急速な細胞分裂及び分化応答を誘導し、暴露されたリンパ球のクローンが形成される。B細胞は形質細胞を産生し、形質細胞は、抗体(Ab)と呼ばれるタンパク質を産生する。抗体は、病原体上に提示される抗原に選択的に結合し、病原体を無力化又は不活化する(液性免疫)。B細胞応答は、CD4ヘルパーT細胞の補助を必要とすることもある。
【0006】
抗原暴露に応答して形成される専門のT細胞クローンは、細胞障害性リンパ球(CTL)であり、これは、抗原を提示する病原体及び組織に結合し、それらを除去することができる(細胞媒介性又は細胞性免疫)。樹状細胞などの抗原提示細胞(APC)は、病原体又は他の異質細胞をエンドサイトーシスによって包囲する場合もある。次いで、APCは、細胞からの抗原を加工し、これらの抗原を組織適合性分子:ペプチド複合体の形でCTL上のT細胞受容体(TCR)に提示し、それによって免疫応答を刺激する。
【0007】
特異抗体の形成によって特徴付けられる液性免疫は、一般に、急性の細菌感染及びウイルスからの反復感染に対して最も有効であるのに対して、細胞媒介性免疫は、ウイルス感染、慢性細胞内細菌感染及び真菌感染に対して最も有効である。細胞性免疫は、癌を防御することでも知られ、臓器移植拒絶の原因である。
【0008】
以前の感染に由来する抗原に対する抗体は、血液中で極めて長期間検出可能であり、したがって以前に病原体に暴露されたかどうかを判定する手段となる。同じ病原体に再び暴露されると、免疫系は、病原体が増殖し病原性応答を生じる前に病原体を除去することによって再感染を有効に防止する。
【0009】
ある病原によって誘発される同じ免疫応答が、病原として同じ抗原を提示する非病原体によっても生成されることがある。このようにして、被検者は、以前に感染を撃退していなくても、病原体に対するその後の暴露に対して防御され得る。
【0010】
しかし、ワクチン形成に必要なすべての病原体が容易に培養され、不活化されるわけではない。現代の組換えDNA技術によって、この制約を克服しようと努力する新しいワクチンの設計が可能になった。病原性遺伝子を欠く病原体を造り出すことができ、したがって生きた非病原性生物をワクチンとして使用することができる。E コリ(E. coli)などの比較的非病原性の生物を操作して病原性キャリアの細胞表面抗原を提示するようにすることもできる。かかる形質転換キャリアをワクチン接種された被検者の免疫系は、「だまされて」病原体に対する抗体を形成する。病原体の抗原性タンパク質は、非病原性種において操作して発現させることが可能であり、その抗原性タンパク質を単離し、精製して「サブユニットワクチン」を製造することができる。サブユニットワクチンは、安定であり、安全であり、化学的に明確に定義されている利点を有するが、その製造に法外な費用のかかることがある。
【0011】
新しいワクチン化手法が近年出現し、広く遺伝子免疫法と呼ばれている。この手法においては、病原体の抗原をコードする遺伝子は、免疫される被検者の細胞中に作用可能に挿入される。処理された細胞、好ましくは樹状細胞などの抗原提示細胞(APC)は、形質転換され、病原体の抗原タンパク質を産生する。次いで、これらのインビボで産生された抗原は、宿主において所望の免疫応答を引き起こす。かかる遺伝子ワクチンに利用される遺伝物質は、DNA構築体でもRNA構築体でもよい。抗原をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子の挿入、複製又は発現を促進する他のプロモーターポリヌクレオチド配列と組み合わせて導入されることが多い。
【0012】
抗原遺伝子をコードするDNAワクチンは、様々な送達システムによって被検者の宿主細胞に導入することができる。これらの送達システムとしては、原核生物、ウイルス送達システムなどが挙げられる。例えば、ひとつの手法は、新しい遺伝物質を組み込むワクシニアウイルスなどのウイルスベクターを利用して、宿主細胞を接種するものである。或いは、遺伝物質は、プラスミドベクターに組み込むことができ、又は「裸の」ポリヌクレオチドとして、すなわち、単なる精製DNAとして宿主細胞に直接送達させることができる。また、DNAは、サルモネラ チフィムリウム(Salmonella typhimurium)などの弱毒細菌に安定に形質移入することができる。形質転換されたサルモネラを患者に経口接種すると、細菌は、腸のパイエル板(すなわち、二次リンパ組織)に輸送され、次いで免疫応答を刺激する。
【0013】
DNAワクチンは、遺伝病、癌などの在来の病原体に起因しない病態に対して免疫化する機会を提供するものである。一般に、遺伝子癌ワクチンは、抗原をコードする遺伝子をAPCに導入する。そのように形質転換されたAPCは、特定のタイプの腫瘍細胞に対する抗原を産生する。したがって、いくつかの癌タイプに対して有効な総合ワクチンは、免疫化しようとする癌細胞の各タイプに対する個々のワクチンを多数含むことができる。
【0014】
アポトーシスタンパク質阻害剤(すなわち、IAPファミリータンパク質)は、多数の異なる腫瘍細胞において発現される自然抗原の1クラスである。名前が示唆するように、これらのタンパク質は、その自然の形で、アポトーシス(すなわち、プログラム細胞死)を阻害し、エトポシドなどのアポトーシスを誘導する化学療法剤に対する癌細胞の耐性をもたらし得る。IAPファミリータンパク質の例としては、X染色体関連IAP(XIAP)、NAIP、(BIRC2としても知られる)cIAP1、(BIRC3としても知られる)cIAP2、(BIRC6としても知られる)ブルス(bruce)、(BIRC5としても知られる)サービビン(survivin)及び(BIRC7、KIAP及びML−IAPとしても知られる)リビン(livin)が挙げられる。哺乳動物のIAPタンパク質ファミリーとしては、3種類のBIRドメインを有するタンパク質(例えば、XIAP、cIAP1、cIAP2及びNAIP)、単一BIRドメインを有するタンパク質(例えば、サービビン及びリビン)などが挙げられる。
【0015】
Tamm等、Cancer Res. 1998;58(23):5315〜20は、60種類のヒト腫瘍細胞系におけるヒトサービビンの発現について報告している。Tamm等は、サービビンとXIAPの両方が、Bax、Fas(CD95)などのアポトーシス誘発剤で腫瘍細胞を処理することによって誘発されるプログラム細胞死(アポトーシス)を阻害するのに有効であることも報告した。報告によれば、サービビン及び他のIAPファミリータンパク質は、効果細胞死プロテアーゼ、例えば、カスパーゼ−3及びカスパーゼ−7に結合することによってアポトーシスを阻害する。IAPファミリータンパク質の突然変異によって、野生型IAPファミリータンパク質の活性よりもアポトーシス阻害活性が低下する可能性があり、さらにはアポトーシス誘発活性がもたらされる可能性がある。IAPファミリータンパク質の抗アポトーシス活性は、BIRドメインと関連があると考えられる。
【0016】
報告によれば、サービビンは、肺癌、前立腺癌、乳癌及びすい臓癌を含めて、最も一般的なヒト癌細胞中に存在する。サービビンは、高度の非ホジキンリンパ腫においても認められるが、低度の非ホジキンリンパ腫では認められない。報告によれば、サービビンは、胎児の発育中の正常細胞中に存在するが、他のほとんどのIAPファミリータンパク質とは異なり、正常な成人組織中では実質的に検出不可能である。Ambrosini等 Nat. Med. 1997;3(8):917〜21を参照されたい。
【0017】
リビンは、一部の成体組織及び胚組織において検出される。リビン発現レベルは、黒色腫、結腸癌細胞、膀胱癌細胞及び肺癌細胞において増加することが報告された。リビンの2種類のスプライスバリアントが報告され、その両方が単一のBIRドメインを含む。完全長アルファ変異体は298アミノ酸残基を有するのに対して、ベータ変異体は280アミノ酸残基を有する。
【0018】
IAPファミリータンパク質は、ヒトに加えて、マウスなどの哺乳動物、ゼノプス種(アフリカツメガエル)などの両生類、ショウジョウバエ種などの昆虫及びバキュロウイルスを含めたいくつかの種においても確認された。
【0019】
サービビンは癌細胞において広範かつ極めて選択的に発現することから、癌の有用な診断マーカー候補となっている。例えば、Rohayem等、Cancer Res. 2000;60:1815〜17の報告によれば、ヒト肺及び結腸直腸癌患者においてサービビンに対する自己抗体が確認された。
【0020】
サービビンは、癌治療の標的としても認識されている。カスパーゼ−3及びカスパーゼ−7に対するサービビンの阻害効果は、様々なアポトーシス刺激化学療法に対する癌細胞の抵抗性と関係がある。サービビン発現を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、腺癌細胞系におけるサービビンの発現を減少させ、化学療法剤エトポシドに対する癌細胞の感受性を増加させることが報告されている。Olie等 Cancer Res. 2000;60:2805〜9及びMesri等 J. Clinical Res.、2001;108:981〜990を参照されたい。
【0021】
サイトカインは、細胞増殖、細胞分化、免疫応答の調節、血球新生、炎症反応などの他の細胞の挙動に影響を及ぼすことができる、細胞によって産生されるタンパク質及びポリペプチドである。サイトカインは、ケモカイン、ヘマトポイエチン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子及び様々な未配属の分子を含めて、いくつかのファミリーに分類される。一般には、Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology、Revised Edition、Oxford University Press、2000、並びにC.A. Janeway、P. Travers、M. Walport及びM. Schlomchik、Immunobiology、Fifth Edition、Garland Publishing、2001(以後、Janeway及びTravers)を参照されたい。サイトカインの簡潔な分類は、Janeway及びTravers、Appendix III、677〜679ページにあり、その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。
【0022】
ヘマトポイエチンとしては、例えば、エリスロポイエチン、インターロイキン−2(IL−2、T細胞によって産生され、T細胞増殖に関与する133アミノ酸タンパク質)、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−11、IL−13、IL−15(腸管上皮、T細胞及びNK細胞の増殖を刺激する114アミノ酸IL−2様タンパク質)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、オンコスタチンM(OSM)及び白血病抑制因子(LIF)が挙げられる。
【0023】
インターフェロンとしては、例えば、IFN−α、IFN−β及びIFN−γ(T細胞及びNK細胞によって産生され、マクロファージ活性化、MHC分子及び抗原プロセシング成分の発現増加、IGクラススイッチ、及びTH2の抑制に関与する143アミノ酸ホモ二量体タンパク質)が挙げられる。
【0024】
免疫グロブリンとしては、例えば、その両方がT細胞応答を同時刺激するB7.1(CD80)及びB7.2(CD86)が挙げられる。
【0025】
腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーとしては、例えば、TNF−α、TNF−β(リンフォトキシン)、リンフォトキシン−β(LT−β)、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4−1BBリガンド、Trail及びOPGリガンドが挙げられる。
【0026】
特定のファミリーに割り当てられない様々なサイトカインとしては、例えば、腫瘍成長因子−β(TGF−β)、IL−1α、IL−1β、IL−1 RA、IL−10、IL−12(ナチュラルキラー細胞刺激因子;197アミノ酸鎖と306アミノ酸鎖を含み、NK細胞活性化及びTH1様細胞へのT細胞分化の誘導に関与するヘテロ二量体)、マクロファージ抑制因子(MIF)、IL−16、IL−17(上皮、内皮及び繊維芽細胞におけるサイトカイン産生を誘導するサイトカイン産生誘導因子)及びIL−18が挙げられる。
【0027】
ケモカインは、比較的小さな化学誘引タンパク質及びポリペプチドであり、白血球遊走など様々な細胞(例えば、食細胞及びリンパ球)の遊走及び活性化を刺激するサイトカインファミリーである。ケモカインは、炎症及び他の免疫応答においてある役割を果たす。ケモカインは、Cケモカイン、CCケモカイン、CXCケモカイン及びCX3Cケモカインを含めて、いくつかのファミリーに分類される。これらの名称は、分子中のシステイン残基の数及び空間的配置を基準とし、Cケモカインは1個のシステインを含み、CCケモカインは2個の隣接システインを含み、CXCは単一のアミノ酸残基によって分離された2個のシステインを含み、CX3Cケモカインは3個のアミノ酸残基によって分離された2個のシステインを含む。ケモカインは、細胞表面にあるいくつかのケモカイン受容体と相互作用する。その関連する開示を参照により本明細書に組み込むJaneway及びTravers、Appendix IV、680ページを参照されたい。
【0028】
また、ケモカインは、免疫調節活性を有することができ、癌に対する免疫応答と関係がある。例えば、ヒト二次リンパ組織ケモカイン(SLC)(現在一般にCCL21と称される)のマウスアナログであるネズミ6Ckine/SLCは、C−26結腸癌腫瘍細胞系において抗腫瘍応答を誘導することが報告されている。Vicari等 J. Immunol. 2000;165(4):1992〜2000を参照されたい。ヒトCCL21及びそのネズミ対応物6Ckine/SLCは、CCケモカインに分類され、CCR7ケモカイン受容体と相互作用する。ネズミ6Ckine/SLC(muCCL21)は、Vicari等によって、CXCR3ケモカイン受容体リガンドであることも報告されている。ヒトCCL21、ネズミmuCCL21及び様々な他のケモカインは、樹状細胞、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞などの様々な免疫系細胞の調節に関係する。
【0029】
Mig及びIP−10は、活性化T細胞に付随するCXCR3受容体と相互作用するCXCケモカインである。リンホタクチンはCケモカインであり、T細胞及びNK細胞に付随するXCR1受容体と相互作用する。フラクタルカインはCX3Cケモカインであり、T細胞、単球及び好中球に付随するCX3CR1受容体と相互作用する。
【0030】
NK細胞は、ウイルスに感染された細胞を認識し破壊する大きな顆粒リンパ球である。NK細胞は、免疫調節性ポリペプチドリガンドとNK細胞表面受容体の相互作用によって調節することができる。例えば、NK細胞活性を調節することができるNKG2D受容体リガンドとしては、muCCL21などのケモカイン、MHCクラスI鎖関連抗原、UL16結合タンパク質などのストレス誘導性ポリペプチドリガンドが挙げられる。ネズミH60副組織適合抗原ペプチドも、NKG2D受容体に結合することが報告されている。例えば、Robertson等、Cell Immunol. 2000;199(1):8〜14;Choi等、Immunity 2002、17(5):593〜603及びFarag等、Blood、2002;100(6):1935〜1947を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0031】
本発明は、単一ベクター中で癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物をコードするDNAワクチンを提供することによって、癌細胞に対する全身免疫応答を刺激することができるワクチンに対する継続的な要望を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【0032】
癌細胞に対して免疫応答を誘導するのに有効なDNAワクチンは、癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含む。DNA構築体は、弱毒細菌(例えば、弱毒サルモネラ チフィムリウムベクター)などのベクターに作用可能に組み込まれていることが好ましい。DNAワクチンは、少なくとも1種類の癌関連IAPファミリータンパク質をコードするポリヌクレオチドと、免疫活性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。DNA構築体は、サービビンタンパク質(例えば、ヒトサービビン、ネズミサービビンなど)など成体組織には実質的に存在しないが癌組織では増加する癌関連IAPファミリータンパク質又はリビンタンパク質をコードすることが好ましい。DNA構築体によってコードされる免疫反応性遺伝子産物は、サイトカイン、ナチュラルキラー細胞表面受容体リガンド又は類似の免疫反応性分子であることが好ましい。
【0033】
一実施態様においては、DNAワクチンは、好ましくは、(a)配列番号2のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビン、(b)配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログ、(c)配列番号23のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、(d)配列番号24のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、及び(e)MHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるサービビンタンパク質の断片からなる群から選択されるサービビンタンパク質を作用可能にコードするDNAを含む。
【0034】
さらに別の実施態様においては、DNAワクチンは、好ましくは、(a)配列番号27のアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンアルファスプライスバリアント、(b)配列番号29のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンベータスプライスバリアント、(c)配列番号27と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログ、(d)配列番号29と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンベータスプライスバリアントの免疫原性ホモログ、及び(e)MHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるリビンタンパク質の断片からなる群から選択されるリビンタンパク質を作用可能にコードするDNA構築体を含む。
【0035】
好ましいサイトカインとしては、ヒトCCL21、ネズミCCL21、リンホタクチン、フラクタルカイン、IP−10などのケモカイン、IL−2、IL−15などのヘマトポイエチン;IFN−γなどのインターフェロン;IL−12、IL−17などのT細胞及びNK細胞遊走又は増殖に関連する他のサイトカインなどが挙げられる。
【0036】
好ましいナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドは、NKG2D細胞表面受容体に結合するヒトMICA、ヒトMICB、ヒトULBP1、ヒトULBP2、ヒトULBP3などのストレス誘導性タンパク質である。特に好ましいNKG2DリガンドはMICA及びMICBである。
【0037】
ミョウバン、水中油型乳剤、防腐剤などの従来のアジュバントもワクチンに入れることができる。本発明のDNAワクチンは、腫瘍細胞アポトーシスの刺激を含めて、腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激し、腫瘍成長及び転移を阻害する。
【0038】
本発明の方法側面においては、ワクチン接種患者における腫瘍成長を長期間阻害するためにDNAワクチンを利用する。IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするポリヌクレオチド構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含むDNAワクチンは、腫瘍成長を阻害する必要がある患者に、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で(好ましくは、経口)投与される。
【0039】
本発明のワクチンは、様々なタイプの癌を治療するのに有用である。例えば、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫などの患者は、本発明のワクチンによる免疫化による利点を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0040】
腫瘍細胞に対して免疫応答を誘導するのに有効なDNAワクチンは、IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を含む。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「DNA構築体」という用語は、標的細胞において転写され得る合成DNA構造体を意味する。この構築体は、精製DNA、プラスミドベクターに組み込まれたDNA、DNAを宿主細胞に導入するのに適切な任意の他のベクターに組み込まれたDNAなどの線状核酸を含むことができる。DNAは、好ましくは、ウイルス又は細菌ベクター、より好ましくは、非病原性である弱毒ウイルス又は細菌ベクター、最も好ましくは、弱毒細菌ベクターに組み込まれる。
【0041】
本明細書において使用される「免疫」という用語は、毒性病原体又は腫瘍抗原に対する長期の免疫保護作用を指す。「免疫化」という用語は、非病原性源に由来する病原体の抗原に予防的に曝し、その被検者において病原体に対する免疫が獲得されることを指す。
【0042】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合するグリコシル化タンパク質である分子、免疫グロブリンを指す。
【0043】
本明細書において使用される「抗原」という用語は、免疫適格性動物に導入されたときに、特異抗体、すなわちその抗原に結合することができる抗体の産生を刺激する実体を意味する。本明細書において使用される「免疫原」という用語は、単独で抗体産生を刺激することができるが、キャリアと結びついた場合でも抗体産生を刺激することができる実体を意味する。
【0044】
本明細書において使用される「保存的置換」という用語は、1個のアミノ酸残基が別の生物学的に類似した残基で置換されることを意味する。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどの1個の疎水性残基と別のものとの置換、又はアルギニンなどの1個の親水性残基とリジンの置換及びその逆、グルタミン酸とアスパラギン酸の置換及びその逆、グルタミンとアスパラギンの置換及びその逆などが挙げられる。
【0045】
ペプチド配列に関して本明細書において使用される、文法的に様々な形の「実質的に対応する」という用語は、アミノ末端とカルボキシ末端の一方又は両方において最高3個のアミノ酸残基が追加又は削除され、ポリペプチド配列に沿って保存的置換のみを含む記載のペプチド配列を意味する。
【0046】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「免疫活性遺伝子産物」という用語及びその文法的に変化した用語は、T細胞及びNK細胞と相互作用し、それらの活性を調整するタンパク質及びポリペプチドなどの免疫調節活性を有するタンパク質及びポリペプチドを含む。
【0047】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「IAPファミリータンパク質」という用語は、腫瘍細胞において発現され、その自然の形でアポトーシスを阻害する自然抗原クラスのすべてを含む。IAPファミリータンパク質としては、例えば、ヒトサービビン、ヒトX染色体連鎖IAP(XIAP)、ネズミTIAP(サービビンのネズミアナログ)、ヒトリビン、ヒトc−IAP−1、ヒトc−IAP−2、ヒトNAIP、少なくとも1個のバキュロウイルスアポトーシス反復阻害剤(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat)(BIR)ドメインを含む任意の他のタンパク質又はそのホモログが挙げられる。BIRドメインは、すべての野生型IAPファミリータンパク質中に存在する。BIRドメインは、4つの比較的短いアルファらせん及び3本鎖逆平行ベータシート構造領域を含む。このドメインは、IAPファミリータンパク質の全体にわたって保存されている3個のシステイン残基と1個のヒスチジン残基によってZnに結合する。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「IAPファミリータンパク質」という用語は、スプライスバリアント、置換変異体などの野生型IAPタンパク質の変異体、並びに主要組織適合性(MHC)クラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識される断片及びその免疫原性ホモログ(すなわち、サービビンタンパク質エピトープ)も含む。
【0048】
IAPファミリータンパク質に関連して、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「癌関連」という用語は、正常な非癌性細胞よりも癌細胞において高いレベルで発現されるIAPファミリータンパク質を意味する。癌関連IAPファミリータンパク質の例としては、ヒトサービビン及びヒトリビンが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【0049】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「サービビンタンパク質」という用語は、完全長ヒトサービビン分子(配列番号2)、その完全長ネズミアナログ(すなわち、本明細書に記載するTIAP)、スプライスバリアント、置換変異体などのヒトサービビン又はネズミサービビンの変異体、並びに主要組織適合性(MHC)クラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるヒトサービビンの断片(例えば、エピトープ)及びヒトサービビンの免疫原性ホモログを含む。ヒトサービビンの公知の置換変異体としては、配列番号2のアミノ酸残基配列中に置換T34Aを有するタンパク質、配列番号2のアミノ酸残基配列中に置換D53Aを有するタンパク質、配列番号2のアミノ酸残基配列中に置換C84Aを有するタンパク質などが挙げられる(Song等、Mol. Biol. Cell、2004;15(3):1287〜1296、E−publication December 29,2003)。これらの公知の変異体の各々は、抗アポトーシス活性を有する野生型サービビンとは対照的にアポトーシス活性を有する。
【0050】
好ましい実施態様においては、本発明のDNAワクチンは、配列番号2のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビン、配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログ、配列番号23のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、配列番号24のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、及びMHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるサービビンタンパク質の断片などのサービビンタンパク質を作用可能にコードするDNA構築体を含む。
【0051】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「リビンタンパク質」という用語は、完全長ヒトリビンアルファスプライスバリアント(配列番号27)、ヒトリビンのベータスプライスバリアント(配列番号29)、ヒトリビンアルファ及びベータスプライスバリアントの置換変異体、並びにMHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるその断片及び免疫原性ホモログを含む。
【0052】
別の好ましい実施態様においては、本発明のDNAワクチンは、配列番号27のアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンアルファスプライスバリアント、配列番号29のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンベータスプライスバリアント、配列番号27と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログ、配列番号29と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンベータスプライスバリアントの免疫原性ホモログ、及びMHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるリビンタンパク質の断片などのリビンタンパク質を作用可能にコードするDNA構築体を含む。
【0053】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「免疫原性ホモログ」という用語及びその文法的に変化した用語は、サービビン、リビンなどの癌関連IAPファミリータンパク質に関して使用されるときには、野生型癌関連IAPファミリータンパク質に対して高度の相同性を有するタンパク質であって、MHCクラスI分子に結合することができ、対応する野生型IAPファミリータンパク質に対して活性である細胞障害性T細胞によって認識され得るタンパク質を意味する。免疫原性ホモログは、好ましくは、野生型癌関連IAPファミリータンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、最も好ましくは少なくとも約95%同一であるアミノ酸残基配列を有する。
【0054】
理論に拘泥するわけではないが、ヒト患者などの患者への本発明のワクチンの接種によって、抗原提示細胞などの免疫細胞表面で癌関連IAPファミリータンパク質に由来する抗原が選択的に提示され、さらにこれらの細胞において免疫活性遺伝子産物が選択的に発現されると考えられる。抗原提示細胞の細胞表面でサービビンタンパク質、リビンタンパク質などの癌関連IAPファミリータンパク質の提示が増加し、さらにサイトカイン、NK細胞表面受容体に対するリガンドなどの免疫活性遺伝子産物が発現することによって、サービビンタンパク質、リビンタンパク質などの癌関連IAPファミリータンパク質を発現する癌細胞に対する免疫応答が増強される。成人においては、サービビンはほぼすべて癌細胞において発現される。同様に、リビン発現は、報告によれば、一部の癌細胞系、特にメラノーマ細胞系において増加する。
【0055】
好ましい実施態様においては、DNAワクチンは、サービビンタンパク質及びサイトカインを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。サービビンタンパク質は、ヒトサービビン、ネズミサービビン又はそのエピトープであることが好ましい。サイトカインは、T細胞又はNK細胞活性を調整することが好ましい。好ましいサイトカインとしては、ケモカイン、ヘマトポイエチン、インターフェロンが挙げられる。他の好ましいサイトカインとしては、IL−12などのNK細胞活性化サイトカイン及びIL−17などのサイトカイン産生刺激因子が挙げられる。
【0056】
別の好ましい実施態様においては、DNAワクチンは、リビンタンパク質及びサイトカインを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。リビンタンパク質は、野生型ヒトリビン又はそのエピトープであることが好ましい。サイトカインは、T細胞又はNK細胞活性を調整することが好ましい。好ましいサイトカインとしては、ケモカイン、ヘマトポイエチン、インターフェロンが挙げられる。他の好ましいサイトカインとしては、IL−12などのNK細胞活性化サイトカイン及びIL−17などのサイトカイン産生刺激因子が挙げられる。
【0057】
好ましいケモカインとしては、CCケモカイン、特にCCL21(SLC)などのCCR7ケモカイン受容体リガンドであるCCケモカイン;リンホタクチンなどのCR1受容体リガンドであるCケモカイン;フラクタルカインなどのCX3CR1受容体リガンドであるCX3Cケモカイン;CXCケモカイン、特にIP−10などのCXCR3受容体リガンドであるCXCケモカインが挙げられる。ケモカインは、ヒトCCL21又はそのネズミアナログ(ネズミCCL21)であることが最も好ましい。
【0058】
好ましいヘマトポイエチンとしては、IL−2、IL−15などのT細胞増殖因子が挙げられる。好ましいインターフェロンとしては、IFN−γなどのT細胞及びNK細胞によって産生されるインターフェロンなどが挙げられる。他の好ましいサイトカインとしては、IL−12などのNK細胞活性化サイトカイン、IL−17などを含めて、上皮、内皮及び線維芽細胞などの細胞においてサイトカイン産生を誘導するサイトカインなどが挙げられる。
【0059】
別の好ましい実施態様においては、DNAワクチンは、サービビンタンパク質及びナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。サービビンタンパク質は、ヒトサービビン、ネズミサービビン又はヒトサービビンのエピトープであることが好ましい。ナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドは、NKG2D細胞表面受容体リガンドであることが好ましい。NKG2D細胞表面受容体リガンドは、MICA、MICBなどのMHCクラスI鎖関連(MIC)抗原、ULBP1、ULBP2、ULBP3などのUL16結合タンパク質(ULBP)などであることが好ましい。ネズミNKG2Dリガンドとしては、例えば、Rael及び副組織適合抗原ペプチドH60が挙げられる。NKG2D細胞表面受容体リガンドはMICA又はMICBであることが最も好ましい。
【0060】
さらに別の好ましい実施態様においては、DNAワクチンは、リビンタンパク質及びNK細胞受容体リガンドを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。リビンタンパク質は、野生型ヒトリビン、ヒトリビンのエピトープ又はリビン変異体とすることができる。
【0061】
癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードする本発明のDNA構築体は、遺伝子発現に必要な当分野で周知の調節性要素に作用可能に結合されていることも好ましい。
【0062】
DNA構築体は、Invitrogen,Inc.、Carlsbad、CAから入手可能なBUDCE4.1発現ベクターなどの発現ベクターに作用可能に組み込まれていることが好ましい。他の適切な発現ベクターは、例えば、BD Biosciences Clonetech、Palo Alto、CAから市販されている。DNA構築体は、発現ベクターに組み込まれると、宿主細胞に発現ベクターを形質移入することによって、生きた弱毒細菌ベクターなどの宿主ベクターに導入することができ、本発明のワクチンが提供される。
【0063】
DNA構築体は、好ましくは、ヌクレオチドの発現に必要な調節性要素を含む。かかる要素としては、例えば、プロモーター、開始コドン、終止コドン及びポリアデニレーションシグナルが挙げられる。また、エンハンサーは、免疫原性標的タンパク質をコードする配列の発現に必要なことが多い。当分野で知られているように、これらの要素は、好ましくは、所望のタンパク質をコードする配列に作用可能に結合されている。それらが投与される種に適合する調節性要素が好ましくは選択される。
【0064】
開始コドン及び終止コドンは、好ましくは、サービビンタンパク質及び免疫調節性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部として本発明の遺伝子ワクチンに含まれる。開始コドン及び終止コドンは、サービビンタンパク質及び免疫調節性ポリペプチドのコード配列とインフレームになければならないのは言うまでもない。
【0065】
本発明のワクチンに含まれるプロモーター及びポリアデニレーションシグナルは、好ましくは、免疫される被検者の細胞内で機能するように選択される。
【0066】
本発明のワクチン、特にヒト用遺伝子ワクチンの製造に有用なプロモーターの例としては、シミアンウイルス40(SV40)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、HIV長末端反復(LTR)プロモーターなどのヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、モロニーウイルス、CMV即時型プロモーターなどのサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタインバーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)に由来するプロモーター、及びヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子に由来するプロモーターが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【0067】
本発明のワクチン、特にヒト用遺伝子ワクチンの製造に有用なポリアデニレーションシグナルとしては、SV40ポリアデニレーションシグナル、LTRポリアデニレーションシグナルなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【0068】
DNA発現に必要な調節性要素に加えて、他の要素もDNA分子中に入れることができる。かかる追加の要素としてはエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン並びにCMV、RSV及びEBV由来のエンハンサーなどのウイルスエンハンサーとすることができる。
【0069】
制御配列及びコドンは一般に種に依存する。タンパク質産生を最大にするために、制御配列及びコドンは、免疫される種に有効なように選択される。当業者は、所与の対象種において機能するDNA構築体を容易に製造することができる。
【0070】
本ワクチンのDNA構築体は、その該当する開示を参照により援用するRestifo等 Gene Therapy 2000;7:89〜92に定義された「裸の」DNAとすることができる。DNAは、ベクターに作用可能に組み込まれていることが好ましい。有用な送達ベクターとしては、生分解性マイクロカプセル、免疫刺激複合体(ISCOM)又はリポソーム、ウイルス、細菌などの生きた遺伝子改変弱毒ベクターなどが挙げられる。
【0071】
生きた適切な弱毒細菌ベクターの例としては、サルモネラ チフィムリウム、サルモネラ チフィ(Salmonella typhi)、シゲラ(Shigella)種、バチルス(Bacillus)種、ラクトバチルス(Lactobacillus)種、バチルス カルメット ゲラン(Bacille Calmette−Guerin)(BCG)、エシェリキア コリ(Escherichia coli)、ビブリオ コレレ(Vibrio cholerae)、カンピロバクター(Campylobacter)種、リステリア(Listeria)種、又は当分野で既知の任意の他の適切な細菌ベクターが挙げられる。ベクターは、生きた弱毒サルモネラ チフィムリウムベクターであることが好ましい。好ましい生きた弱毒サルモネラ チフィムリウムとしては、SL7207などのAroA−系統、又はRE88などの二重弱毒(doubly attenuated)AroA−,dam−系統が挙げられる。二重弱毒AroA−,dam−サルモネラ チフィムリウムは特に好ましいベクターである。
【0072】
生きた細菌ベクターを外来性DNA構築体で形質転換する方法は、当分野では十分に述べられている。例えば、Joseph Sambrook及びDavid W. Russell、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、3rd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(2001)(Sambrook及びRussell)を参照されたい。
【0073】
好ましいウイルスベクターとしては、バクテリオファージ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス及びアビポックスが挙げられる。ウイルスベクターを外来性DNA構築体で形質転換する方法も当分野では十分に述べられている。上記Sambrook及びRussellを参照されたい。
【0074】
有用なリポソームベクターは、親油性材料と内部水性部分で形成された膜部を有する単層又は多層の小胞である。水性部分は、本発明では、標的細胞に送達されるポリヌクレオチド材料を含むのに使用される。リポソーム形成材料は、第4級アンモニウムなどの陽イオン性基、及び約6個から約30個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アリル基などの1個以上の親油性基を有することが一般に好ましい。適切な材料の一群は、欧州特許第0187702号に記載されており、Wolff等の米国特許第6,228,844号でさらに考察されている。これらの該当する開示を参照により援用する。多数の他の適切なリポソーム形成陽イオン性脂質化合物が文献に記載されている。例えば、L. Stamatatos等、Biochemistry 1988;27:3917〜3925及びH. Eibl等、Biophysical Chemistry 1979;10:261〜271を参照されたい。或いは、ポリ乳酸−コグリコリド生分解性ミクロスフェアなどのミクロスフェアを利用することができる。核酸構築体は、当分野で知られているとおり、内部に封入されており、又は組織に核酸を送達するリポソーム若しくはミクロスフェアと複合化されている。
【0075】
他の有用なベクターとしては、Wang等、Nat.Mater.、2004;3(3):190〜6.Epub 2004 Feb.15に記載の生分解性ポリ(オルトエステル)材料を含む重合体ミクロスフェアが挙げられる。その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。
【0076】
本発明の方法側面は、癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫反応性遺伝子産物を作用可能にコードするDNAワクチンをヒトなどの哺乳動物の組織に投与することを含む。一部の好ましい実施態様においては、DNAワクチンは、経口、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内又は局所に投与される。DNAワクチンは、経口投与されることが好ましい。
【0077】
好ましい方法においては、本発明のDNAワクチンは、ワクチンによる治療を受けた患者において腫瘍成長を長期的に阻害するために利用することができる。DNAワクチンは、サービビンタンパク質などの癌関連IAPファミリータンパク質、サイトカイン、NK細胞表面受容体リガンドなどの免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNAポリヌクレオチド構築体、及び薬剤として許容されるその担体を含む。ワクチンは、腫瘍成長を阻害する必要がある哺乳動物に、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で投与される。
【0078】
本発明のワクチンによる治療を受ける哺乳動物はヒトであることが好ましい。肺癌又は結腸癌、乳房腫瘍、前立腺腫瘍などの癌患者は、本発明のワクチンによる免疫化の利点を得ることができる。
【0079】
本発明のワクチンは、好ましくは、水、食塩水、デキストロース、グリセリンなど、並びにそれらの組み合わせなどの薬剤として許容される担体又は賦形剤とともに処方される。ワクチンは、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、アジュバントなどの補助物質を含むこともできる。
【0080】
本発明のワクチンは、好ましくは、薬剤として許容される担体の溶液又は懸濁液としてヒトなどの哺乳動物に、約1から約10マイクログラム/ミリリットルのDNA濃度で経口投与される。適切な投与量は、ワクチン接種される被検者によって決まり、ワクチンを投与する又は投与を要求する開業医の判断にある程度依存する。
【0081】
本発明のワクチンは、アンプル、ビン、バイアルなどの適切に滅菌された容器に複数回投与又は単位剤形として入れられる。容器は、好ましくは、ワクチン調製物を充填した後で機密密封される。ワクチンは、ワクチンを識別するラベルが貼られた容器に入れられ、適切な法の下にワクチンが承認されたことを示す米国食品医薬品局などの政府機関によって規定された形式の表示、投与情報などを有することが好ましい。ラベルは、好ましくは、ワクチンを患者に投与する医療関係者に有用なワクチンについての情報を含む。包装は、好ましくは、ワクチン投与に関する印刷された情報資料、説明書、指示書及びあらゆる必要な所定の警告を含む。
【0082】
ヒトサービビンDNA配列及びその対応するタンパク質配列は、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UK、DNA受託番号BC034148のEMBLデータベースにStrausbergによって報告された。その開示を参照により本明細書に組み込む。ネズミTIAPのDNA配列及び対応するタンパク質配列は、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに、Kobayashi等 Proc. Natl. Acad. Sci. 1999;96:1457〜62;DNA受託番号AB01389によって報告された。その開示を参照により本明細書に組み込む。
【0083】
ヒトサービビンをコードする核酸配列を図1(配列番号1)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号2)を図2に示す。ネズミサービビン(すなわち、TIAP)をコードする核酸配列を図3(配列番号3)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号4)を図4に示す。
【0084】
ヒトサービビンとそのネズミ対応物TIAPのタンパク質相同性を図5に示す。図5に示すように、ヒトサービビン(配列番号2)とネズミTIAP(配列番号4)には約83%の同一アミノ酸残基配列がある。
【0085】
Mahotka等は、サービビン−ΔEx3及びサービビン−2Bと称するヒトサービビンの2種類のスプライスバリアントを特定した。これらも本発明に使用するのに適切である。Mahotka等 Cancer Res.、1999;59:6097〜6102。その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。サービビン−2B(配列番号23)及びサービビン−ΔEx3(配列番号24)のアミノ酸残基配列を図37に示す。Hirohashi等は、サービビン−2Bに対して細胞障害性リンパ球応答を誘導するサービビン−2B80−88と称される、アミノ酸残基配列AYACNTSTL(配列番号25)を有するサービビン−2B由来の強力なT細胞エピトープを特定した。Hirohashi等 Clinical Cancer Res.、2002;8:1731〜39。その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。このエピトープは、MHCクラスI分子と結合することができ、細胞障害性T細胞によって認識されるサービビンの断片であり、本発明のワクチンのIAPファミリータンパク質成分として使用するのに適切である。
【0086】
ヒトサービビンの別のスプライスバリアントは、Badran等、Biochem. Biophys. Res. Commun.、2004;314(3):902〜907によって記述されたサービビン−3B変異体である。サービビン−3B及びその対応するアミノ酸残基配列をコードするポリヌクレオチド配列は、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UK、DNA受託番号AB 154416のEMBLデータベースに報告されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【0087】
(アルファ変異体として知られる)完全長ヒトリビンは、単一BIRドメインを有し、298アミノ酸残基からなるIAPファミリータンパク質である。ヒトリビンアルファ変異体のDNA配列及び対応するタンパク質配列は、Clark等によってEuropean Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UK、DNA受託番号NM 139317のEMBLデータベースに報告されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトリビンのベータ変異体のDNA配列及び対応するタンパク質配列は、受託番号NM 022161としてEuropean Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【0088】
完全長ヒトリビン(アルファ変異体)をコードする核酸配列を図39(配列番号26)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号27)を図40に示す。ヒトリビンのベータ変異体をコードする核酸配列を図41(配列番号28)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号29)を図42に示す。ヒトリビンのベータ変異体は、完全長ヒトリビンアルファスプライスバリアント(配列番号27)のアミノ酸残基216から233までを欠いている。ベータ変異体は、他のすべての点でヒトリビンのアルファ変異体と同一である。ヒトリビンのアルファとベータ変異体の両方のBIRドメインは、配列番号27及び配列番号29のアミノ酸残基R90からアミノ酸残基L155の領域にある)。
【0089】
好ましい実施態様においては、本発明のワクチンは、ヒトサービビン、TIAP(ネズミサービビン)、その免疫原性ホモログなどの1種類以上のサービビンタンパク質をコードするDNA構築体を含む。免疫原性ホモログは、好ましくは、ヒトサービビンと少なくとも約80%のアミノ酸残基配列が同一であり、より好ましくは、配列番号2と少なくとも約90%のアミノ酸残基配列が同一であり、最も好ましくは少なくとも約95%のアミノ酸残基配列が同一である。或いは、ワクチンはヒトサービビンタンパク質の1種類以上のT細胞エピトープをコードするDNA構築体を含むことができる。
【0090】
別の好ましい実施態様においては、本発明のワクチンは、ヒトリビンアルファ及びベータスプライスバリアント(それぞれ配列番号27及び29)、その免疫原性ホモログなどの1種類以上のリビンタンパク質をコードするDNA構築体を含む。免疫原性ホモログは、好ましくは、ヒトリビンのアルファ又はベータスプライスバリアントと少なくとも約80%のアミノ酸残基配列が同一であり、より好ましくは、配列番号27又は配列番号29と少なくとも約90%のアミノ酸残基配列が同一であり、最も好ましくは、少なくとも約95%のアミノ酸残基配列が同一である。或いは、ワクチンはヒトリビンタンパク質の1種類以上のT細胞エピトープをコードするDNA構築体を含むことができる。
【0091】
遺伝コード固有の縮重のために、ヒトサービビン、ネズミサービビン、ヒトリビンスプライスバリアントなどの生来の(すなわち、天然)癌関連IAPファミリータンパク質と実質的に同じ又は機能的に等価なアミノ酸残基配列をコードするDNA配列を本発明のワクチンに使用することができる。かかるDNA配列としては、生来のサービビン又はリビン DNA配列とハイブリッド形成可能なDNA配列、対立遺伝子変異体などが挙げられる。機能的に等価なホモログのDNAは、前記未変性サービビン又はリビンタンパク質をコードするDNAと少なくとも約70%のヌクレオチド配列が同一であり、より好ましくは少なくとも約80%のヌクレオチド配列が同一であることが好ましい。
【0092】
本ワクチンのDNA構築体によってコードされる免疫活性遺伝子産物は、好ましくは、サイトカイン又はナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドである。特に好ましいサイトカインはCCケモカインである。特に有用なCCケモカインは、CCR7ケモカイン受容体のリガンドである。選択的CCR7リガンドとしては、(exodus−3、ELC、MIP−3β及びCKβ11としても知られる)CCL19、(exodus−2、SLC、6Ckine、TCA4及びCKβ9としても知られる)CCL21などが挙げられる。特に好ましいケモカインは、ヒトCCL21及びそのネズミ対応物6Ckine/SLC(muCCL21)、及びそれに実質的に対応するケモカインである。
【0093】
ヒトSLCのDNA及びタンパク質配列は、Nishimura等によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UK、DNA受託番号AB002409のEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。6Ckine/SLC DNA及びタンパク質配列のネズミCCL21a変異体は、Hromas等 J ImmunoL 1997;159(6):2554〜2558、DNA受託番号NM011335によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。6Ckine/SLC DNA及びタンパク質配列のネズミCCL21b変異体は、Hedrick等、J. Immunol. 1997;159(4):1589〜1593、DNA受託番号NM011124によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベース報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。
【0094】
ヒトCCL21(SLC)をコードする核酸配列を図6(配列番号5)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号6)を図7に示す。ネズミCCL21(CCL21b変異体)をコードする核酸配列を図8(配列番号7)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号8)を図9に示す。
【0095】
ヒトCCL21(SLC)とそのネズミ対応物(ネズミ6Ckine/SLC、CCL21b)のタンパク質相同性を図10に示す。図10に示すように、ヒトCCL21(配列番号6)とネズミCCL21(配列番号8)には約73%の同一アミノ酸残基配列がある。
【0096】
ネズミSLCのCCL21a変異体をコードする核酸配列を図25(配列番号11)に示す。その対応するアミノ配列(配列番号12)を図26に示す。
【0097】
ナチュラルキラー細胞表面受容体の好ましいリガンドは、ネズミNKG2D表面受容体リガンドである。NKG2D表面受容体の好ましいリガンドは、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3などである。最も好ましくは、MICA及びMICB。NKG2D表面受容体の他の公知のリガンドとしては、ネズミRea−1β、ネズミ副組織適合抗原ペプチドH60などが挙げられる。
【0098】
ネズミH60副組織適合抗原ペプチドDNA及びタンパク質配列は、Malarkannan等、J. Immuraol. 1998;161(7):3501〜3509、DNA受託番号AF084643によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ネズミH60副組織適合抗原ペプチドをコードする部分核酸配列を図11(配列番号9)に示す。その対応する部分アミノ酸残基配列(配列番号10)を図12に示す。
【0099】
ヒトMICAのDNA及びタンパク質配列は、Zwirner等、DNA受託番号AY204547によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトMICAをコードする核酸配列を図27(配列番号13)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号14)を図28に示す。
【0100】
ヒトMICBのDNA及びタンパク質配列は、Bahram等 Immunogenetics 1996;45(2):161〜162、DNA受託番号U65416によってEuropean Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトMICBをコードする核酸配列を図29(配列番号15)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号16)を図30に示す。MICBの対立遺伝子変異体は、参照により本明細書に組み込むGENBANK受託番号NP 005922に記載されている。図38は、受託番号NP 005922のGENBANK登録の複製である。
【0101】
ヒトULBPIのDNA及びタンパク質配列は、Cosman等、Immunity 2001;14(2):123〜133、DNA受託番号AF304377によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトULBP1をコードする核酸配列を図31(配列番号17)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号18)を図32に示す。
【0102】
ヒトULBP2のDNA及びタンパク質配列は、Cosman等、Immunity 2001;14(2):123〜133、DNA受託番号AF304378によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトULBP2をコードする核酸配列を図33(配列番号19)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号20)を図34に示す。
【0103】
ヒトULBP3のDNA及びタンパク質配列は、Cosman等、Immunity 2001;14(2):123〜133、DNA受託番号AF304379によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトULBP3をコードする核酸配列を図35(配列番号21)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号22)を図36に示す。
【0104】
特に好ましいナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドとしては、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3などのNKG2D受容体リガンド及びその機能等価物が挙げられる。機能等価物は、好ましくは、前記免疫調節性ポリペプチドと少なくとも約80%のアミノ酸残基配列が同一であり、より好ましくは、少なくとも約90%のアミノ酸残基配列が同一であり、最も好ましくは、少なくとも約95%のアミノ酸残基配列が同一である。
【0105】
遺伝コード固有の縮重のために、ヒトCCL21、ネズミCCL21、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、それに実質的に対応する類似の材料など有用な生来の免疫活性遺伝子産物と実質的に同じ又は機能的に等価なアミノ酸残基配列をコードするDNA配列を本発明のワクチンに使用することができる。かかるDNA配列としては、免疫調節性ポリペプチドDNA配列とハイブリッド形成可能なDNA配列、対立遺伝子変異体などが挙げられる。機能的に等価なホモログのDNAは、前記生来の免疫調節性ポリペプチドをコードするDNAと少なくとも約70%のヌクレオチド配列が同一であることが好ましい。
【0106】
本発明によって使用することができる改変DNA配列は、野生型癌関連LAPファミリータンパク質をコードする生来のポリヌクレオチド配列中の異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含み、野生型タンパク質又はその免疫原性ホモログをコードする配列が得られる。本発明によって使用することができる改変DNA配列は、野生型免疫原性遺伝子産物をコードする生来のポリヌクレオチド配列中の異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換も含み、野生型免疫活性遺伝子産物又はその機能等価物をコードする配列が得られる。機能的に等価な免疫活性遺伝子産物は、サイレントな変化をもたらす野生型サイトカイン又はNK細胞表面受容体リガンド内のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含むことができ、それによって機能的に等価な分子が産生される。かかるアミノ酸置換(例えば、保存的置換)は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び/又は両親媒性の類似度に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあり、正に帯電したアミノ酸としては、リジン、アルギニンなどがあり、類似した親水性値を有する非帯電極性頭部基を含むアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン;グリシン、アラニン;アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。
【0107】
本明細書において使用される、サイトカイン、NK細胞表面受容体リガンドなどの機能的に等価な免疫活性遺伝子産物とは、その対応物の天然の免疫活性遺伝子産物と実質的に同じ免疫調節活性を有するポリペプチドを意味する。
【0108】
本発明のワクチンに有用なIAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA配列は、遺伝子産物のプロセシング及び発現を改変する変更を含めて、ただしこれらだけに限定されない様々な目的のためにコード配列を変更するように操作することができる。例えば、当分野で周知の技術、例えば、部位特異的突然変異誘発によって突然変異を導入して、新しい制限酵素切断部位を挿入し、グリコシル化パターン、リン酸化などを変更することができる。
【0109】
本発明の別の態様は、癌の免疫になるように哺乳動物にワクチン接種する方法である。この方法は、本明細書に記載するように、本発明のワクチンを哺乳動物に癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で投与することを含む。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【0110】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載するアポトーシスファミリータンパク質阻害剤及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を含むベクターが形質移入された形質転換宿主細胞も包含する。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。
【0111】
本発明は、アポトーシスファミリータンパク質阻害剤及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を含む単離プラスミドベクターも提供する。このベクターは、本発明のワクチンを調製するために弱毒細菌細胞などの宿主細胞に形質移入するのに有用である。
【0112】
以下の例は、本発明の特徴及び実施態様をさらに説明するために提供するものであって、限定するものではない。
材料、方法及び実施例
材料。C57/BL/6J及びBalb/cマウスをScripps Research Institute育種施設から得た。TIAP(サービビンのネズミ型)をコードするDNAをPCRによってMC3PcDNAからクローン化した。ネズミ6Ckine(ネズミCCL21)をコードするDNAをひ臓細胞からクローン化した。H60副組織適合抗原ペプチド(MICA及びMICBのネズミ型)をコードするDNAは、University of California(Berkley)のDr. David H. Ranletの厚意によって提供された。ネズミCCL21(muCCL21、6Ckine/SLCとしても知られる)及びネズミサービビン(muサービビン、TIAPとしても知られる)をコードするワクチン用DNAを、Invitrogen,Inc.から入手したpBudCE4.1真核発現ベクターに、MuCCL21に対しては制限酵素切断部位HindIII及びBamHI、muサービビンの両末端に対してはXhoIを使用してクローン化した。H60及びTIAPをコードするワクチン用DNAを、Invitrogen,Inc.から入手したpBudCE4.1真核発現ベクターに、H60に対しては制限酵素切断部位HindIII及びXbaI、muサービビンに対しては制限酵素切断部位KpnI及びXhoIを使用してクローン化した。サルモネラ チフィムリウムのAroA−弱毒系統(SL2707)及びサルモネラ チフィムリウムの二重弱毒AroA−,dam−系統(RE88)をRemedyne、Santa Barbara、CAから得た。抗体は、BD Biosciences、Bedford、MAから得られた。フルオレッセインイソチオシアネート(FITC)及びR−フィコエリトリン(PE)をMolecular Probes、Eugene、ORから得た。FITC標識及びPE標識抗体は、製造者の推奨プロトコルに従って調製された。
パートA. 形質転換AroA−弱毒サルモネラ チフィムリウムからのワクチン
【実施例1】
【0113】
muサービビン及びmuCCL21をコードするDNAワクチンの調製
muサービビン及びmuCCL21 DNA(pDNA約1〜10μg)を含むpBudCE4.1ベクターを、Bio−Rad Pulserを用いて2.5kV、25μF及び200オームで製造者の推奨手順に従って、新しく調製された弱毒サルモネラ チフィムリウム(SL2707)に電気穿孔して入れた。このベクターを含むサルモネラを、ゼオシンを含むプレート上で選択した。コロニーを翌日に選択し、ゼオシンが添加されたLBブロス(EM Science、Gibbstown、NJ)中で終夜培養した。細菌を単離し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。次いで、洗浄された細菌をPBS培養液に約1x109組換えサルモネラ/ミリリットルPBSの濃度で懸濁して、後で使用するワクチン溶液を生成した。
【0114】
ベクターのみで形質転換されたサルモネラからなる対照ワクチン、muサービビンDNAのみを組み込んだベクター、及びmuCCL21 DNAのみを組み込んだベクターも同じ手順に従って調製した。図13は発現構築体の略図である。
【0115】
ワクチンを使用するまで密封アンプルに保存した。プラスミドDNAは、サルモネラを形質転換するまで約−80℃で保存された。
【実施例2】
【0116】
実施例1のDNAワクチンのマウスへの接種
Balb/cマウス(約8匹のマウス/投与群)に実施例1のDNAワクチン(約100μlのPBS中に約1x108個の組換えサルモネラ)を経口胃管栄養法によって2週間間隔で3回接種した。
【実施例3】
【0117】
ワクチン接種マウスの腫瘍抵抗性の評価
最後のワクチン接種から約1週間後に、実施例2のBalb/cマウス(約8匹のマウス/投与群)に約1x105個のD121ルイス肺癌細胞を(皮下)投与した。約2週間成長させて肺に自然に播種させた後に皮下ルイス肺腫瘍を外科的に除去した。皮下腫瘍成長を二次元で一日おきに測定し、各腫瘍の腫瘍体積を次式によって計算した。
【0118】
体積=(幅2)(長さ÷2)
肺へのD121の自然転移量を、皮下原発腫瘍の除去後約24から約28日評価した。マウスを屠殺し、解剖し、腫瘍によって覆われた肺表面の割合によって肺の腫瘍量を評価し、腫瘍がないのを「0」、約20%未満の腫瘍被覆を「1」、約20から約30%の腫瘍被覆を「2」、約50%を超える腫瘍被覆を「3」とした。
【0119】
実施例1のワクチンを接種されたマウスの腫瘍量スコアを表1に示す。図14に、実施例1のワクチンを接種されたマウスから得られた肺の写真を示す。腫瘍体積を表1及び図14に示す。図14において、棒Aは、本発明のmuサービビン/muCCL21ワクチンを接種されたマウスの平均肺腫瘍体積(立法ミリメータ)であり、棒Bは、muサービビンDNAのみを組み込まれたワクチンを接種されたマウスの平均腫瘍体積であり、棒Cは、muCCL21 DNAのみを組み込まれたワクチンを接種されたマウスの平均腫瘍体積であり、棒Dは、空のベクターのみを組み込まれたワクチンを接種されたマウスの平均腫瘍体積であり、棒Eは、PBS緩衝剤を接種されたマウスの平均腫瘍体積である。図14は、図14のそれぞれの棒の各々の下に示された各投与群から切除された代表的な肺の写真も含む。
【0120】
【表1】
【0121】
表1及び図14(図A及びB)の結果によれば、IAPファミリータンパク質(すなわち、muサービビン)及び免疫活性遺伝子産物(すなわち、muCCL21)をコードするDNA構築体を含むDNAワクチンは、肺腫瘍転移に対してマウスを有効に免疫することができ、肺腫瘍の成長を阻害した。
【実施例4】
【0122】
本発明の本発明のDNAワクチンによって誘導されるD121肺癌細胞に対するT細胞媒介細胞障害性
実施例2に記載したように、C5/7BL/6Jマウス(約8匹のマウス/投与群)に実施例1のDNAワクチンを接種した。脾細胞をワクチン接種から約4日後に単離し、Current Protocols in Immunology at 3.11.4, Coligan, et al. Eds., John Wiley & Sons, Inc.(1994)に記載されたように、4時間の51Cr放出アッセイによってその溶菌活性を分析した。D121細胞を脾細胞の標的細胞として使用した。
【0123】
図15は、本発明のDNAワクチンによって誘導されるD121肺癌細胞に対するT細胞媒介細胞障害性を示すグラフである。白抜きの円で示されるデータポイントは、細胞がH−2Kb/H−2Db MHCクラスI抗原に対する抗体(クローンSF1−1.1;34−2−12 IgG2a,κ)50μg/mlで処理される阻害アッセイのデータであり、黒塗りの四角は阻害抗体の非存在下におけるデータである。腫瘍細胞の溶解百分率(Y軸)は、各ワクチン接種群に対して効果細胞と標的細胞(E/T)の3つの異なる比(すなわち、第1のデータポイントは100:1のE/Tであり、第2のデータポイントは50:1であり、第3のデータポイントは25:1である)に対してプロットされている。その結果、(SLC/TIAPと標識された)本発明のmuサービビン/muCCL21ワクチンは、100:1 E/T比において、PBS、空のベクター及びmuCCL21 DNAを含む各対照ワクチンと比較してほぼ5倍、muサービビンDNAのみを含む対照ワクチンの約2倍の溶解を誘導した。
【実施例5】
【0124】
ワクチン接種マウスから得られた脾細胞におけるCD25、CD69及びCD28活性化マーカー(CD8+T細胞)の増加
実施例2に記載したように、C5/7BL/6Jマウス(約4匹のマウス/投与群)に実施例1のDNAワクチンを接種した。脾細胞を最後のワクチン接種から約1週間後に免疫マウス及び対照マウスから単離した。次いで、細胞をFITC複合CD8+抗体、並びにCD25、CD69及びCD28のPE複合抗体で染色した。細胞懸濁液を、2色フローサイトメトリーBecton Dickenson FACスキャンを用いて評価して、各脾細胞についてCD25、CD28及びCD69に陽性なCD8+T細胞の割合を求めた。結果を図16に示す。各FACSプロットの上部右手四半分の数値は、場合によってはCD8+抗原とCD25、CD28又はCD69の両方を提示する細胞の割合である。数値結果を表2に示す。これらの結果は、本発明のワクチンによるT細胞マーカー発現の増加を示しており、T細胞活性化が増大したことを示している。
【0125】
【表2】
【0126】
表2及び図16のデータは、muサービビン及びmuCCL21をコードするDNA構築体を含む実施例1の本発明のワクチンが、T細胞活性化分子の発現を増加させることを示している。
【実施例6】
【0127】
ワクチン接種マウスにおける樹状細胞上での同時刺激分子の発現増加
実施例2に記載したように、C5/7BL/6Jマウス(約4匹のマウス/投与群)に実施例1のDNAワクチンを接種した。脾細胞を最後のワクチン接種から約1週間後に免疫マウス及び対照マウスから単離した。次いで、細胞を、同時刺激分子B7(CD80)、ICAM−1及びDEC205のPE複合抗体と組み合わせたFITC複合CD11c抗体で染色した。細胞懸濁液を2色フローサイトメトリーBecton Dickenson FACスキャンを用いて評価した。図17は、細胞の平均蛍光値を示すグラフであり、対照ワクチンと比較して、本発明のmuサービビン/muCCL21ワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞のICAM−1(上)、CD80(中間)及びDEC205(下)の発現が増加していることを示している。
【実施例7】
【0128】
細胞内サイトカイン放出の誘導
実施例2と同様に免疫されたマウス(8匹のマウス/群)に実施例3と同様にD121肺癌細胞を投与した。腫瘍細胞投与から約1週間後に各マウスから脾細胞を採取した。脾細胞をFITC−抗CD3抗体で染色し、次いで固定し、透過化処理し、引き続いてPE複合抗IFN−γ抗体で染色した。2色染色された細胞をFACSフローサイトメトリーによって分析した。結果を図18に示す。細胞をBD Pharmingen、La Jolla、CAの細胞内染色スターターキットによって固定した。
【0129】
図18にプロットされた結果によれば、サイトカインIFN−γを放出する細胞の割合は、PBS対照ワクチンを投与されたマウスの場合のわずか0.41%、空のベクター対照ワクチンを投与されたマウスの場合の約0.38%、SLC対照ワクチンを投与されたマウスの場合の約0.96%、及びmuサービビン対照ワクチンを投与されたマウスの場合の約1.53%と比較して、本発明のワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞では約3.17%に増加した。
【実施例8】
【0130】
ワクチン接種マウスにおける肺癌細胞のアポトーシスの増加
実施例2と同様に免疫されたマウス(8匹のマウス/群)に実施例3と同様にD121肺癌細胞を投与した。腫瘍細胞投与から約1週間後に各マウスから脾細胞を採取した。脾細胞をD121腫瘍細胞とともに温度約37℃で約3時間インキュベートした。次いで、腫瘍細胞を単離し、FACSによって分析した。Annexin V−FITCを使用して、集団内の活発にアポトーシスを起こす細胞の割合を定量した。ヨウ化プロピジウム(PI)を使用して、BD Pharmingen、La Jolla、CAから入手可能なApoptosis Detection Kitによって、生育不能な細胞から生細胞を区別した。
【0131】
図19は、約3時間(上のプロットセット)及び約24時間(下のプロットセット)後に評価されたFACS分析結果のグラフである。各プロットの下右四半分の数値は、各投与群においてアポトーシスを起こす細胞の割合である。3時間後、無処置の(すなわち、脾細胞に曝されていない)D121細胞の約5.39%がアポトーシスを起こした。PBS緩衝剤のみを含有する対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたD121細胞の約2.28%がアポトーシスを起こした。空のベクターDNAを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたD121細胞のわずか約5.19%しかアポトーシスを起こさなかった。同様に、muCCL21 DNAのみを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときにはD121細胞の約5.15%がアポトーシスを起こしたのに対して、muサービビンDNAのみを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときにはD121細胞の約11.46%がアポトーシスを起こした。驚くべきことに、3時間後、muCCL21とmuサービビンDNAの両方を含む本発明のワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときには、D121細胞の約18.44%がアポトーシスを起こした。
【0132】
同様に、24時間後、(アポトーシス細胞を排除する)ゲート付きFACS分析においては、無処置の(すなわち、脾細胞に曝されていない)D121細胞のいずれもアポトーシスを起こさなかった。PBS緩衝剤のみを含有する対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたD121細胞の約8.46%がアポトーシスを起こした。空のベクターDNAを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたD121細胞のわずか約4.78%しかアポトーシスを起こさなかった。驚くべきことに、24時間後、muCCL21とmuサービビンDNAの両方を含む本発明のワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときには、D121細胞の約59.2%がアポトーシスを起こした。
【実施例9】
【0133】
TIAP及びネズミH60副組織適合抗原ペプチドをコードするDNAワクチンの調製
TIAP及びネズミH60副組織適合抗原DNA(pDNA約1μg)を含有するpBudCE4.1ベクターを、Bio−Rad Pulserを利用して2.0kV、25μF及び100オームで製造者の推奨手順に従って、新しく調製された弱毒サルモネラ チフィムリウム(SL2707)に電気穿孔して入れた。図20は、H60の発現ベクター、及びベクターに組み込まれたmuサービビンの略図である。
【0134】
このベクターを含むサルモネラを、ゼオシンを含むプレート上で選択した。翌日、コロニーを選択し、ゼオシンが添加されたLBブロス(EM Science、Gibbstown、NJ)中で終夜培養した。細菌を単離し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。次いで、洗浄された細菌をPBS培養液に約5x109組換えサルモネラ/ミリリットルPBSの濃度で懸濁して、後で使用するワクチン溶液を生成した。
【0135】
ベクターのみで形質転換されたサルモネラからなる対照ワクチン、muサービビンDNAのみを組み込んだベクター、及びH60副組織適合性抗原(H60)DNAのみを組み込んだベクターも同じ手順に従って調製した。
【0136】
ワクチンを使用するまで密封アンプルに保存した。プラスミドDNAは、サルモネラを形質転換するまで約−20℃で保存された。
【実施例10】
【0137】
実施例9のDNAワクチンのマウスへの接種
Balb/cマウス(約8匹のマウス/投与群)に実施例9のDNAワクチン(約100μlのPBS中に約5x108個の組換えサルモネラ)を経口胃管栄養法によって2週間間隔で3回接種した。
【実施例11】
【0138】
実施例10のDNAワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞の細胞障害性アッセイ
脾細胞を実施例10のワクチン接種マウスから単離し、照射を受けたCT−26細胞で刺激した。5日後、脾細胞を収集し、CT−26細胞及びYac−1細胞(NK感受性T細胞)を標的に細胞障害性アッセイを実施した。Current Protocols in Immunology at 3.11.4、Coligan, et al. Eds.、John Wiley & Sons, Inc.(1994)に記載されたように、4時間51Cr放出アッセイによって、細胞特異的溶解度をE/T比25:1、50:1及び100:1において求めた。結果を図21に図示する。
【0139】
その結果、muサービビン及びH60 DNAを含む本発明のワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞は、CT−26結腸直腸癌細胞の溶解が、100:1のE/T比において、空のベクター、H60及びmuサービビン対照ワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞の2倍以上増加した。すべてのE/T比においてすべてのワクチンでYac−1の溶解は極めて少なく、観察された死滅はT細胞によって媒介された可能性が高いことが示された。
【実施例12】
【0140】
ワクチン接種マウスの腫瘍抵抗性の評価
第3のワクチン接種から約2週間後に、実施例10のBalb/cマウス(約8匹のマウス/投与群)に、約1x105個のネズミCT−26結腸直腸癌細胞を(静脈内;i.v.)投与した。
【0141】
肺へのCT−26細胞の自然転移量を、CT−26細胞をi.v.投与してから約25日後に評価した。マウスを屠殺し、解剖し、各群の肺の平均重量を記録することによって肺の腫瘍量を評価した。正常肺重量は約0.2グラムである。図22に、ワクチン接種されたCT−26投与マウスから取り出された典型的な肺(上)を示す。図22は、各投与群の平均肺重量のグラフ(下)も含む。本発明のH60/muサービビンワクチンを接種されたマウスでは、対照ワクチンと比較して、劇的な腫瘍量減少が認められた。
【0142】
図23は、各投与群において26日後に生存していたマウスの割合を示すグラフである。本発明のH60/muサービビンワクチンを接種されたマウスでは、対照ワクチンと比較して、生存のかなりの増加が認められた。
【実施例13】
【0143】
293T細胞におけるH60及びmuサービビンの発現の評価
図24AにH60の発現を示す。293T細胞に、空のベクター(V)又はpH60(H)を24時間形質移入し、収集し、NKG2D四量体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。形質移入効率は、pGFP(緑色蛍光タンパク質)形質移入によって評価して約45%であった。図24Aにmuサービビンの発現を示す。293T細胞に、空のベクター又はpmuサービビンを24時間形質移入し、収集し、溶解し、ウエスタンブロットによって分析した。ウエスタンブロットによれば、muサービビンは、形質移入細胞では検出可能であるが、未変性細胞では検出不可能である。
パートB. 形質転換されたAroA−,dam−二重弱毒サルモネラ チフィムリウムからのワクチン
【実施例14】
【0144】
muサービビン及びmuCCL21をコードするDNAワクチンの調製
ネズミサービビン(muサービビン)及びネズミCCL21(muCCL21)の完全長コード領域を、それぞれD121マウスルイス肺癌細胞及び活性化マウス脾細胞から抽出された全RNA 1μgを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅した。全RNAはRNEASY(登録商標)Miniキット(Qiagen、Valencia、CA)を用いて抽出され、RT−PCRはplatinum quantitative RT−PCR thermoscript one−step system(Gibco/BRL)を用いて製造者の指示に従って実施された。いくつかの構築体が、哺乳動物発現ベクターにおいて、単一プラスミドから2種類の遺伝子が独立に発現するようになされたPCR産物を用いてpBudCE4.1ベクター(Invitrogen)に基づいて作製された。第1の構築体である完全長ネズミサービビン及びネズミCCL21を含むmuサービビン/muCCL21は、制限酵素切断部位HindIIIとBamHIの間のマルチクローニング部位Aに挿入された。ケモカインmuCCL21は、制限酵素切断部位XhoIとNotIの間のマルチクローニング部位Bに遺伝子を挿入することによってそれぞれ産生された。DNAワクチン接種に使用されるもう一方のベクターは、muCCL21又はmuサービビンのどちらかが存在しないのではなく、第1の構築に基づいた。空のベクターが対照として作製された。
【0145】
muサービビン及びmuCCL21のタンパク質発現は、プラスミドをCOS−7細胞へ形質移入した後に、それぞれ抗サービビン及び抗CCL21抗体を用いた細胞可溶化物のウエスタンブロット法によって示された。C57BL/6Jマウスのパイエル板におけるEGFP活性の発現が、pEGFPで形質転換された108個のサルモネラ チフィムリウム(AroA−,dam−系統RE88)を経口投与した後のマウスにおいて検出された。マウスを8、16及び36時間で屠殺し、新しい小腸試料を取り出し、PBSで十分洗浄した後に分析した。EGFPの蛍光発現が共焦点顕微鏡法によって検出された。
【0146】
弱毒細菌によって宿主中で引き起こされ得る毒性を、二重弱毒AroA−,dam−系統RE88を単一弱毒AroA−系統SL2707と比較することによって評価した。RE88系統を使用すると、全16匹のマウスが明らかな毒性副作用を起こさずに生存したのに対して、SL2707系統で免疫された16匹のマウスのうち2匹が毒性及び感染によって死亡した。したがって、細菌毒性を制御するRE88系統のdam−突然変異によって、この系統がDNAワクチンキャリアとして特に有用になったことが明らかである。
【実施例15】
【0147】
実施例14のワクチンを用いたマウスの経口ワクチン接種及び腫瘍暴露
C57BL/6Jマウスを5つの群に分け、すなわち、空のベクターpBUd;pBud−muサービビン/muCCL21、pBud−muサービビン又はpBud−muCCL21の個々の発現ベクター、並びにPBS投与群、いずれかを含む約1x108個の二重弱毒S.チフィムリウム(RE88)を含有するPBS約100μlを用いた胃管栄養法によって2週間間隔で3回免疫した。予防処置をした全マウスに、約1x105個のD121ネズミルイス肺癌細胞を、最後の免疫化から約1週間後にi.v.注射して投与した。治療設定においては、マウスに約1x105個のD121ネズミルイス肺癌をまずi.v.注射し、1週間後に、形質転換されたS.チフィムリウムを用いて3種類のワクチン接種を行った。マウスを毎日検査し、屠殺し、予防設定では腫瘍細胞投与から約28日後に、又は治療モデルにおいては最初の腫瘍細胞接種から63日後に肺転移を調べた。
【0148】
ワクチンによる予防処置の場合のPBS、空のベクター、CCL21、サービビン又はCCL21/サービビンワクチンそれぞれによる免疫化後の腫瘍転移スコアを表3に示す。表3の結果は、融合転移病巣で覆われた%肺表面で表される転移スコア、すなわち、0=なし;1=5%未満;2=5から50%;及び3=>50%として示されている。CCL21/サービビンワクチンによる治療を受けたマウス群と全対照群の転移スコアの差は統計的に有意(P=<0.001)であった。この治療モデルにおいても腫瘍成長の阻害が認められた。
【0149】
【表3】
【0150】
この予防設定においては、本発明者らは、2週間間隔で3回ワクチンを接種され、次いで1週間後に腫瘍細胞のi.v.注射によって暴露されたマウスにおいて、D121ネズミルイス肺癌の播種性の肺転移が明確に抑制されることを認めた。実際、8匹のマウスのうち6匹ですべての肺腫瘍転移が完全に阻止され、残りのマウスでは腫瘍転移が著しく抑制された(表3参照)。これに対して、muCCL21を欠くサービビン系DNAワクチンは、8匹のマウスのうちわずか1匹においてしか完全な転移抑制を誘導せず、2匹は5%未満の転移性腫瘍成長を示し、残りのマウスはすべて広範な転移性腫瘍成長を示した。PBS又は空のベクターの対照ワクチン接種のみによる治療を受けた別のマウスは、腫瘍保護作用をまったく示さず、腫瘍細胞投与後4週間以内に広範な転移のために死亡した。分泌性muCCL21プラスミドのみを含む二重弱毒サルモネラによる免疫化は、腫瘍転移を劇的には抑制しなかったが、それでも対照と比較すると転移が統計的に有意に遅延された。
【0151】
重要なことに、muサービビン/muCCL21系DNAワクチンは、治療設定においてはすべての実験動物においてすでに十分定着した肺転移の成長を顕著に抑制するのにも有効であった。これに対して、muサービビン若しくはmuCCL21系ワクチン自体、又は空のベクター及びPBS対照を投与されたマウスは、この実験設定においてD121非小細胞肺癌の大きな播種性肺転移が明らかになった。治療モデルからの様々な実験群の肺重量を表4に示す。正常肺重量は約0.3gであった。
【0152】
【表4】
【実施例16】
【0153】
実施例15のワクチン接種マウスにおける抗血管形成効果の測定
最後のワクチン接種から2週間後に、ネズミFGF−2(PeproTech、Rocky Hill、NJ)約400ng/ml及び1000Gyで照射されたD121腫瘍細胞(1x104/ml)を含むgrowth factor−reduced matrigel(BD Biosciences)約500mlをマウスの胸骨領域に皮下(s.c.)注射した。2匹の対照マウス以外すべてのマウスにおいて、6日後に内皮組織を0.1mg/ml蛍光性Bandeiraea simplicifolia lectin I、Isolectin B4(Vector Laboratories、Burlingame、CA.)200mlを外側尾静脈に注射して染色し、約30分後、マウスを屠殺し、Matrigelプラグを切除し、巨視的に評価した。次いで、レクチン−FITCを各プラグ100mlからRIPA溶解500mlで抽出し、蛍光定量法によって490nmで定量した。各例においては、注射されなかった2匹の対照マウスで認められたバックグラウンド蛍光が減算された。
【0154】
muサービビン/muCCL21系ワクチンは、腫瘍脈管構造における血管形成を明確に抑制した。Matrigelアッセイ、及びFITC複合レクチンによるマウス内皮のインビボ染色後に測定された相対蛍光による定量によって示されるとおり、腫瘍新血管新生のかなりの減少が観察された。FITC複合レクチンのs.c.注射から6日後に取り出された代表的なMatrigelプラグを検査すると、腫瘍血管新生における巨視的に明白な差が、muサービビン/muCCL212ワクチンで処置された群とマウス対照群の間で認められた。本発明のワクチンを接種されたマウスは、腫瘍血管新生が対照群よりもかなり少なかった。
【実施例17】
【0155】
細胞障害性アッセイ
脾細胞が、腫瘍細胞投与から5日後にワクチン接種マウスから首尾よく単離された。細胞障害性は、D121腫瘍細胞又はサービビンを過剰発現するネズミ内皮細胞のどちらかの標的に対する標準51Cr放出アッセイによって評価された。細胞障害性の特異的MHCクラスI拘束を明らかにするために、抗マウスMHCクラスI H−2Kb/Db抗体(PharMingen、San Diego、CA)10μg/mlを用いて阻害評価を実施した。
【0156】
51Cr放出アッセイは、ワクチン接種及びその後のD121ルイス肺癌細胞投与後にマウスから得られた特異的CD8+T細胞によって誘導された顕著な細胞障害性を示した。muサービビン/muCCL21又はmuサービビンワクチン自体で免疫されたマウスの脾細胞から単離されたCD8+T細胞は、D121腫瘍細胞のそれぞれ50%及び30%を有効に溶解した。これに対して、対照マウスから単離されたCD8+T細胞は、腫瘍細胞の注目すべき死滅を惹起せず、バックグラウンドの細胞障害活性を示すに過ぎなかった。特徴的なことに、抗H2Kb/H2Db抗体を添加すると細胞障害性は完全に消失したので、観察されたCD8+T細胞媒介性細胞障害性は、MHCクラス1抗原拘束性であった。
【実施例18】
【0157】
フローサイトメトリー分析及びサイトカイン放出アッセイ
T細胞の活性化マーカー、並びにCD11c及びMHCクラスII抗原陽性DC上の同時刺激分子の発現を、BD Biosciences FACScanを用いた2色又は3色フローサイトメトリー分析によって測定した。T細胞活性化は、首尾よくワクチン接種されたマウスから新たに単離された脾細胞をPE複合抗CD25、CD28又はCD69抗体と組み合わせたFITC標識抗CD3e抗体で染色することによって判定された。APC上の同時刺激分子の活性化は、FITC標識抗CD11c抗体及びビオチン化抗IAb抗体、続いてストレプトアビジン−アロフィコシアニン、及びPE複合抗ICAM−1、CD80又はDEC205抗体と組み合わせて測定された。すべての細胞数測定流通実験は、死細胞を除外するために0.1μg/mlヨウ化プロピジウムの存在下で実施された。これらのアッセイのすべての試薬は、BD Pharmingen(La Jolla、CA)から得られた。
【0158】
フローサイトメトリーは、細胞内サイトカインの検出に使用された。このために、脾細胞は、D121腫瘍細胞投与から約2週間後にB57BL/6Jマウスから収集され、照射された前記D121細胞とともに完全T細胞培地中で約24時間培養された。プレインキュベートされた細胞は、非特異的染色を阻止するために精製2.4G2抗体(BD Pharmingen)約1mgとともに懸濁された。細胞は洗浄され、次いで、FITC複合抗CD3+抗体0.5mgで染色された。細胞は、2回洗浄後、固定され、フローサイトメトリー分析のために、抗IL2又は抗IFN−g抗体と複合された1mg/ml PEで染色された。すべての抗体はBD Pharmingen(La Jolla、CA.)から得られた。
【0159】
muサービビン/muCCL21ワクチン自体のみが、CD25、CD28及びCD69 T細胞活性化マーカーの発現を顕著に増加させるのに最も有効であった。DC上のB7同時刺激分子とCD28の相互作用は、ナイーブT細胞と抗原提示DCの重要な複数の相互作用を実現するのに必須であることが知られているので、CD28の増加は特に重要である。これに対して、muサービビン又はmuCCL21自体のみをコードするDNAワクチンは、T細胞活性化マーカーの発現をわずか1倍増加させただけであった。muサービビン/muCCL21ワクチンによるCD4+とCD8+の両方のT細胞の活性化は、細胞内炎症誘発性サイトカインIFN−g及びIL−2の明確な増加によっても示された。これに対して、PBS及び空のベクター対照、並びにmuサービビン又はmuCCL21のみをコードするDNAワクチンは、これらのサイトカインを誘導するのに有効性がかなり低いことが判明した。
【0160】
T細胞受容体との最適な連結を得るために、T細胞の活性化が、DC上で発現されるこれらの同時刺激分子との強い細胞−細胞相互作用に決定的に依存することはよく知られているので、muサービビン/muCCL21系DNAワクチンによって得られるDC上のICAM−1、CD80及びDEC205の発現増大は特に重要である。今回も、muサービビン/muCCL21をコードする真核生物プラスミドを含む二重弱毒サルモネラ チフィムリウムによる免疫化によって、これらの活性化マーカーが最も有効に増加し、対照のそれの最高2から3倍になった。
【実施例19】
【0161】
腫瘍細胞アポトーシスの分析
ワクチン接種によって誘導されるD121腫瘍細胞のアポトーシスは、それぞれワクチン接種から約3時間及び約24時間後に測定された。対照と実験動物の両方に、3回の免疫化の最後から1週間後に約1x105個のD121細胞をi.v.投与した。腫瘍細胞投与から1週間後に各個々のマウスから脾細胞を収集し、その後、約2.5x107個の脾細胞を約5x105個のD121細胞と6ウェルプレート中で4時間同時培養した。ANNEXIN(登録商標)V−FITCアポトーシス検出キットII(BD Biosciences Pharmingen、San Diego、CA)を使用してアポトーシスの初期段階を確認した。後期段階の腫瘍細胞アポトーシスを確認するために、約5x105個のD121細胞と約2.5x107個の脾細胞を約24時間同時培養し、次いで、アポトーシスをFACSによって、APO−DIRECT(商標)キット(BD Biosciences Phramingen、San Diego、CA)を用いたTUNELアッセイによって製造者の指示に従って分析した。
【0162】
アポトーシスは早くも3時間には観察され、24時間後にはさらにかなりの増加がAnnexin V又はTUNELアッセイによって得られるデータのフローサイトメトリー分析によって示された。すなわち、かかるマウスから収集された脾細胞を腫瘍細胞と同時インキュベートした後の初期アポトーシスは、muサービビン/muCCL21ワクチンで免疫されたマウス群が対照よりも最高3から4倍高かった。muサービビンのみをコードするワクチンは、アポトーシスをある程度惹起したが、対照よりもわずか1倍高いだけであった。しかし、muサービビン/muCCL21ワクチンで免疫されたマウスにおいてのみ24時間でアポトーシスの劇的な85%の増加が認められ、CTLによって誘導された強い腫瘍細胞免疫がこの現象を引き起こしたことが示唆される。
【実施例20】
【0163】
muサービビン及びH60をコードするDNAワクチンの調製
完全長ネズミNKG2Dリガンド−H60を含むプラスミドは、Dr.A. Diefenbach及びDr.D. H. Raulet(University of California、Berkeley、CA)の厚意によるものであった。発現ベクターは、上述したpBudCE4.1(Invitrogen)骨格上で構築された。
【0164】
二重弱毒S.チフィムリウム(AroA−,dam−)は、上述したエレクトロポレーションによってDNAワクチンプラスミドで形質転換された。手短に述べると、中間成長期(midlog growth phase)の新しく調製された細菌(約1x108)をプラスミドDNA(1から2μg)と氷上で0.1cmキュベット中で混合し、約2.0KV、25μF及び100Ωで電気穿孔した。DNAワクチンベクターを含む耐性コロニーを培養し、コード配列を確認した後に−80℃で保存した。
【実施例21】
【0165】
実施例20のワクチンを用いたマウスの経口ワクチン接種及び腫瘍暴露
BALB/c A2Kbマウス群(n=4から12)を、発現ベクターを含む約5x108個の二重弱毒S.チフィムリウムを含有するPBS 100μlを用いた胃管栄養法によって2週間間隔で2回免疫した。予防モデルにおいては、BALB/cマウスに約1x105個のCT−26細胞を最後のワクチン接種から2週間後にi.v.投与し、治療設定においては、第1のワクチン接種の5日前に投与した。腫瘍投与後25日又は28日後にマウスを屠殺し、それぞれ肺転移又は腫瘍重量を測定し、対照のそれらと比較した。実験群と対照の鑑別所見の統計的有意性をスチューデントのt検定によって判定した。所見は、両側のP値が<0.05であった場合に有意とみなされた。
【0166】
H60及びmuサービビンの発現は、293T細胞を形質移入し、フローサイトメトリー又はウエスタンブロット分析によって調べることによって確認された。H60の発現は、NKG2D四量体の陽性染色によって確認された。サービビンを形質移入された細胞は、約16.5KDaの予想分子量における単一バンドによって陽性と判定された。CT−26によって発現されるNKG2Dリガンドレベルは、正の対照のYak−1細胞と比較して比較的低い。NKG2Dリガンド発現が低レベルである腫瘍細胞は、腫瘍阻止を誘導できないことが以前に報告されている。予防設定においては、腫瘍投与から25日後にマウスを屠殺した後に、肺重量及び(上述した)転移スコアを評価した。結果を表5及び表6に示す。このデータによれば、H60及びmuサービビンワクチンは、個々にマウスをある程度保護したが、H60とmuサービビンの組み合わせ(muサービビン/H60ワクチン)は、転移スコアのかなりの低下及び肺における腫瘍量の減少によって示されるように腫瘍投与に対する保護作用を大きく増大させた。これらの所見は、PBS、pBud、pH60及びpmuサービビン対照群と比較して統計的に有意であった(それぞれ、p<0.0001、0.002、0.01及び0.005)。
【0167】
治療設定においては、すなわち、定着した結腸癌転移に対しては、28日に屠殺した後に肺腫瘍量を評価した。重要なことには、H60/muサービビンワクチンで処置された12匹のマウスのうち8匹が生存し、より重要なことには、これらの生存マウスのうち2匹は完全に転移がなく、他の2匹は融合腫瘍転移によって覆われた肺表面は5%未満であった。これに対して、空のpBudベクターで処置された対照群においてはわずか2匹のマウスしか生存せず、全生存マウスの肺表面の50%以上が融合腫瘍転移で覆われた。muサービビンワクチンのみの接種は、治療モデルにおいて有意な保護作用が得られず、H60ワクチンのみの処置は、十分とはいえない治療効果しか示さなかった。後者は、生存率がわずかに改善され、生存マウスのうちの1匹は融合腫瘍転移によって覆われた肺表面がわずか<5%であったことによって示唆された。
【0168】
【表5】
【0169】
【表6】
【実施例22】
【0170】
細胞障害性アッセイ
上述した標準51Cr放出アッセイによって細胞障害性を測定した。手短に述べると、脾細胞を最後の免疫化から2週間後に収集し、照射を受けた(1,000Gy)CT−26細胞によって37℃で5日間、10%FBS、L−グルタミン、15mM HEPES、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、2−ME及び20U/mlの組換えIL−2が補充されたRPMI 1640(PeproTech、Rocky Hill、NJ)中において、インビトロで刺激した。脾細胞を収集し、Lympholyte−M細胞分離培地(Cedarlane Laboratories Limited、Hornby、Ontario、Canada)を用いて分離した。標的細胞を約1.5時間、室温で51Crで標識し、効果細胞とともに様々な効果細胞/標的細胞比で約37℃で約4時間インキュベートした。特異的標的細胞溶解割合を式[(E−S)/(T−S)]x100によって計算した。ここで、Eは平均実験放出であり、Sは平均自然放出であり、Tは平均全放出である。
【0171】
NK活性は、H60ワクチンで免疫されたマウスにおいてかなり増大することが判明し、さらに大きなNK死滅がmuサービビン/H60ワクチンで免疫されたマウスにおいて認められた。muサービビン/H60ワクチンで免疫されたマウスから得られた脾細胞は、CT−26標的細胞に対して最も高い細胞障害性を示した。これに対して、pBudで免疫された対照から単離されたかかる脾細胞は最小の細胞障害性死滅を示し、H60ワクチン又はmuサービビンワクチン接種マウスからの脾細胞自体はいくらか高い細胞障害性死滅を示した。細胞培養5日後、NK細胞は、Yac−1 NK標的細胞が使用されたときと有意差が見られず、この細胞障害性アッセイにおいて主要な役割を果たしていないと考えられ、検出された細胞障害性は主にCTLによって媒介されたことが示唆された。
【0172】
本発明の新規な特徴の精神及び範囲から逸脱することなく、上記実施態様の多数の変更及び改変を実施することができる。本明細書に記載される具体的な実施態様は限定的なものではなく、又は限定的なものと考えるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0173】
【図1】ヒトサービビンをコードする核酸配列、配列番号1を示す図である。
【図2】ヒトサービビンのアミノ酸残基配列、配列番号2を示す図である。
【図3】ネズミTIAPをコードする核酸配列、配列番号3を示す図である。
【図4】ネズミTIAPのアミノ酸残基配列、配列番号4を示す図である。
【図5】ヒトサービビンとネズミTIAPのタンパク質相同性を示す図である。
【図6】ヒトSLC(CCL21)をコードする核酸配列、配列番号5を示す図である。
【図7】ヒトSLC(CCL21)のアミノ酸残基配列、配列番号6を示す図である。
【図8】ネズミ6Ckine/SLC(muCCL21)をコードする核酸配列、配列番号7を示す図である。
【図9】ネズミ6Ckine/SLC(muCCL21)のアミノ酸残基配列、配列番号8を示す図である。
【図10】ヒトSLC(CCL21)とネズミ6Ckine/SLC(muCCL21)のタンパク質相同性を示す図である。
【図11】ネズミ副組織適合抗原ペプチドH60をコードする部分核酸配列、配列番号9を示す図である。
【図12】副組織適合抗原ペプチドH60の部分アミノ酸残基配列、配列番号10を示す図である。
【図13】pBudCE4.1ベクター中でサービビンタンパク質(TIAPとしても知られるネズミサービビン)及び免疫調節性ケモカイン(SLCとしても知られるCCL21)をコードするDNA構築体を示す略図である。
【図14】図14Aは、対照緩衝剤(E)、空のベクターを含む対照ワクチン(D)、ケモカインを含むDNAワクチン(C)、サービビンタンパク質を含むワクチン(B)及び本発明のワクチン(A)による治療を受けたマウスにおけるルイス肺癌の肺転移の平均腫瘍体積を示すグラフである。図14Bは、図14Aに示されたワクチン接種マウスから切除された典型的な肺腫瘍転移の写真である。
【図15】図14Aに示されたDNAワクチンによって誘導されるD121肺癌細胞に対するT細胞媒介細胞障害性を示すグラフである。溶解百分率(Y軸)は、各ワクチン接種に対して効果細胞と標的細胞(E/T)の3つの異なる比(すなわち、100:1、第1のデータポイント;50:1、第2のデータポイント;及び25:1、第3のデータポイント)に対してプロットされている。
【図16】フローサイトメトリー分析によって測定された、本発明のワクチンを接種されたマウスにおけるT細胞活性化分子の発現増加を示すグラフである。
【図17】本発明のワクチン及び様々な対照ワクチンをマウスに接種した後の樹状細胞による同時刺激分子の発現促進を示すグラフである。
【図18】フローサイトメトリー分析によって測定された、本発明のワクチン及び様々な対照ワクチンをマウスに接種した後の細胞内サイトカイン放出の誘導を示すグラフである。
【図19】本発明のワクチン及び様々な対照ワクチンをマウスに接種した後のD121肺腫瘍細胞におけるアポトーシスの増加を示すFACSプロットである。(A)ワクチン接種後3時間及び(B)ワクチン接種後24時間。
【図20】TIAP及び副組織適合抗原ペプチドH60を組み込んだ発現構築体を示す略図である。
【図21】本発明のワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞の細胞障害性アッセイデータを示すグラフである。
【図22】実施例10に記載のワクチン接種マウスから切除された肺の写真(上)及び投与群のマウスの平均肺重量の棒グラフ(下)である。
【図23】ワクチン接種され、CT−26腫瘍細胞を投与されたマウスの生存割合を示すグラフである。
【図24】H60ペプチド(A)及びmuサービビン(B)の発現を示す図である。
【図25】6CKine/SLCのCCL21b変異体をコードする核酸配列、配列番号11を示す図である。
【図26】6CKine/SLCのCCL21b変異体のアミノ酸残基配列、配列番号12を示す図である。
【図27】ヒトMICAをコードする核酸配列、配列番号13を示す図である。
【図28】ヒトMICAのアミノ酸残基配列、配列番号14を示す図である。
【図29】ヒトMICBをコードする核酸配列、配列番号15を示す図である。
【図29−A】ヒトMICBをコードする核酸配列、配列番号15を示す図である。
【図30】ヒトMICBのアミノ酸残基配列、配列番号16を示す図である。
【図31】ヒトULBP1をコードする核酸配列、配列番号17を示す図である。
【図32】ヒトULBP1のアミノ酸残基配列、配列番号18を示す図である。
【図33】ヒトULBP2をコードする核酸配列、配列番号19を示す図である。
【図34】ヒトULBP2のアミノ酸残基配列、配列番号20を示す図である。
【図35】ヒトULBP3をコードする核酸配列、配列番号21を示す図である。
【図36】ヒトULBP3のアミノ酸残基配列、配列番号22を示す図である。
【図37】ヒトサービビンスプライスバリアントサービビン−2B(配列番号23)及びスプライスバリアントサービビン−ΔEx3(配列番号24)のアミノ酸残基配列を示す図である。
【図38】MICBの対立遺伝子変異体を記載した受託番号NP 005922のGENBANK記録の複製である。
【図38−A】MICBの対立遺伝子変異体を記載した受託番号NP 005922のGENBANK記録の複製である。
【図38−B】MICBの対立遺伝子変異体を記載した受託番号NP 005922のGENBANK記録の複製である。
【図39】完全長ヒトリビンアルファスプライスバリアントをコードする核酸配列、配列番号26を示す図である。
【図40】ヒトリビンアルファスプライスバリアントのアミノ酸残基配列、配列番号27を示す図である。
【図41】ヒトリビンベータスプライスバリアントをコードする核酸配列、配列番号28を示す図である。
【図42】ヒトリビンベータスプライスバリアントのアミノ酸残基配列、配列番号29を示す図である。
【配列表】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍細胞に対して免疫応答を誘導するのに有効な適切な分子をコードするデオキシリボ核酸(DNA)ワクチンに関する。特に、本発明は、癌関連アポトーシスファミリータンパク質阻害剤(IAP)及び免疫活性遺伝子産物をコードするDNAワクチンに関する。本発明は、腫瘍成長を阻害するDNAワクチンを使用する方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
ワクチンは、病原体が増殖し病理作用を生じる前に病原体を破壊するために生物の免疫系を刺激する予防薬を極めて限定的に投与することによって、いくつかの疾患に対して長期的保護作用をもたらすのに利用されてきた。ワクチン及びワクチン接種の様々な手法は、Bernard R. Glick及びJack J. Pasternak、Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA、Second Edition、ASM Press pp.253〜276(1998)に記載されている。
【0003】
ワクチン接種は、体自体の免疫系を誘導して、感染病原体が病理学的応答を引き起こす前に感染病原体を探し出して破壊する手段である。
【0004】
一般に、ワクチンは、生の、ただし弱毒された病原体(ウイルス又は細菌)か、病原体の死菌ワクチンである。生きた細菌又はウイルスからなるワクチンは、非病原性でなければならない。一般に、細菌培養物又はウイルス培養物は、物理的又は化学的処理によって弱毒化される(弱められる)。この病原体は非病原性ではあるが、ワクチンによる治療を受けた被検者において依然として免疫応答を誘導することができる。
【0005】
免疫応答は、特定の巨大分子又は病原体であり得る抗原によって誘導される。これらの抗原は、一般に、タンパク質、多糖、脂質又は糖脂質であり、B細胞及びT細胞として知られるリンパ球によって「異質」と認識される。両方のタイプのリンパ球が抗原に曝されると、急速な細胞分裂及び分化応答を誘導し、暴露されたリンパ球のクローンが形成される。B細胞は形質細胞を産生し、形質細胞は、抗体(Ab)と呼ばれるタンパク質を産生する。抗体は、病原体上に提示される抗原に選択的に結合し、病原体を無力化又は不活化する(液性免疫)。B細胞応答は、CD4ヘルパーT細胞の補助を必要とすることもある。
【0006】
抗原暴露に応答して形成される専門のT細胞クローンは、細胞障害性リンパ球(CTL)であり、これは、抗原を提示する病原体及び組織に結合し、それらを除去することができる(細胞媒介性又は細胞性免疫)。樹状細胞などの抗原提示細胞(APC)は、病原体又は他の異質細胞をエンドサイトーシスによって包囲する場合もある。次いで、APCは、細胞からの抗原を加工し、これらの抗原を組織適合性分子:ペプチド複合体の形でCTL上のT細胞受容体(TCR)に提示し、それによって免疫応答を刺激する。
【0007】
特異抗体の形成によって特徴付けられる液性免疫は、一般に、急性の細菌感染及びウイルスからの反復感染に対して最も有効であるのに対して、細胞媒介性免疫は、ウイルス感染、慢性細胞内細菌感染及び真菌感染に対して最も有効である。細胞性免疫は、癌を防御することでも知られ、臓器移植拒絶の原因である。
【0008】
以前の感染に由来する抗原に対する抗体は、血液中で極めて長期間検出可能であり、したがって以前に病原体に暴露されたかどうかを判定する手段となる。同じ病原体に再び暴露されると、免疫系は、病原体が増殖し病原性応答を生じる前に病原体を除去することによって再感染を有効に防止する。
【0009】
ある病原によって誘発される同じ免疫応答が、病原として同じ抗原を提示する非病原体によっても生成されることがある。このようにして、被検者は、以前に感染を撃退していなくても、病原体に対するその後の暴露に対して防御され得る。
【0010】
しかし、ワクチン形成に必要なすべての病原体が容易に培養され、不活化されるわけではない。現代の組換えDNA技術によって、この制約を克服しようと努力する新しいワクチンの設計が可能になった。病原性遺伝子を欠く病原体を造り出すことができ、したがって生きた非病原性生物をワクチンとして使用することができる。E コリ(E. coli)などの比較的非病原性の生物を操作して病原性キャリアの細胞表面抗原を提示するようにすることもできる。かかる形質転換キャリアをワクチン接種された被検者の免疫系は、「だまされて」病原体に対する抗体を形成する。病原体の抗原性タンパク質は、非病原性種において操作して発現させることが可能であり、その抗原性タンパク質を単離し、精製して「サブユニットワクチン」を製造することができる。サブユニットワクチンは、安定であり、安全であり、化学的に明確に定義されている利点を有するが、その製造に法外な費用のかかることがある。
【0011】
新しいワクチン化手法が近年出現し、広く遺伝子免疫法と呼ばれている。この手法においては、病原体の抗原をコードする遺伝子は、免疫される被検者の細胞中に作用可能に挿入される。処理された細胞、好ましくは樹状細胞などの抗原提示細胞(APC)は、形質転換され、病原体の抗原タンパク質を産生する。次いで、これらのインビボで産生された抗原は、宿主において所望の免疫応答を引き起こす。かかる遺伝子ワクチンに利用される遺伝物質は、DNA構築体でもRNA構築体でもよい。抗原をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子の挿入、複製又は発現を促進する他のプロモーターポリヌクレオチド配列と組み合わせて導入されることが多い。
【0012】
抗原遺伝子をコードするDNAワクチンは、様々な送達システムによって被検者の宿主細胞に導入することができる。これらの送達システムとしては、原核生物、ウイルス送達システムなどが挙げられる。例えば、ひとつの手法は、新しい遺伝物質を組み込むワクシニアウイルスなどのウイルスベクターを利用して、宿主細胞を接種するものである。或いは、遺伝物質は、プラスミドベクターに組み込むことができ、又は「裸の」ポリヌクレオチドとして、すなわち、単なる精製DNAとして宿主細胞に直接送達させることができる。また、DNAは、サルモネラ チフィムリウム(Salmonella typhimurium)などの弱毒細菌に安定に形質移入することができる。形質転換されたサルモネラを患者に経口接種すると、細菌は、腸のパイエル板(すなわち、二次リンパ組織)に輸送され、次いで免疫応答を刺激する。
【0013】
DNAワクチンは、遺伝病、癌などの在来の病原体に起因しない病態に対して免疫化する機会を提供するものである。一般に、遺伝子癌ワクチンは、抗原をコードする遺伝子をAPCに導入する。そのように形質転換されたAPCは、特定のタイプの腫瘍細胞に対する抗原を産生する。したがって、いくつかの癌タイプに対して有効な総合ワクチンは、免疫化しようとする癌細胞の各タイプに対する個々のワクチンを多数含むことができる。
【0014】
アポトーシスタンパク質阻害剤(すなわち、IAPファミリータンパク質)は、多数の異なる腫瘍細胞において発現される自然抗原の1クラスである。名前が示唆するように、これらのタンパク質は、その自然の形で、アポトーシス(すなわち、プログラム細胞死)を阻害し、エトポシドなどのアポトーシスを誘導する化学療法剤に対する癌細胞の耐性をもたらし得る。IAPファミリータンパク質の例としては、X染色体関連IAP(XIAP)、NAIP、(BIRC2としても知られる)cIAP1、(BIRC3としても知られる)cIAP2、(BIRC6としても知られる)ブルス(bruce)、(BIRC5としても知られる)サービビン(survivin)及び(BIRC7、KIAP及びML−IAPとしても知られる)リビン(livin)が挙げられる。哺乳動物のIAPタンパク質ファミリーとしては、3種類のBIRドメインを有するタンパク質(例えば、XIAP、cIAP1、cIAP2及びNAIP)、単一BIRドメインを有するタンパク質(例えば、サービビン及びリビン)などが挙げられる。
【0015】
Tamm等、Cancer Res. 1998;58(23):5315〜20は、60種類のヒト腫瘍細胞系におけるヒトサービビンの発現について報告している。Tamm等は、サービビンとXIAPの両方が、Bax、Fas(CD95)などのアポトーシス誘発剤で腫瘍細胞を処理することによって誘発されるプログラム細胞死(アポトーシス)を阻害するのに有効であることも報告した。報告によれば、サービビン及び他のIAPファミリータンパク質は、効果細胞死プロテアーゼ、例えば、カスパーゼ−3及びカスパーゼ−7に結合することによってアポトーシスを阻害する。IAPファミリータンパク質の突然変異によって、野生型IAPファミリータンパク質の活性よりもアポトーシス阻害活性が低下する可能性があり、さらにはアポトーシス誘発活性がもたらされる可能性がある。IAPファミリータンパク質の抗アポトーシス活性は、BIRドメインと関連があると考えられる。
【0016】
報告によれば、サービビンは、肺癌、前立腺癌、乳癌及びすい臓癌を含めて、最も一般的なヒト癌細胞中に存在する。サービビンは、高度の非ホジキンリンパ腫においても認められるが、低度の非ホジキンリンパ腫では認められない。報告によれば、サービビンは、胎児の発育中の正常細胞中に存在するが、他のほとんどのIAPファミリータンパク質とは異なり、正常な成人組織中では実質的に検出不可能である。Ambrosini等 Nat. Med. 1997;3(8):917〜21を参照されたい。
【0017】
リビンは、一部の成体組織及び胚組織において検出される。リビン発現レベルは、黒色腫、結腸癌細胞、膀胱癌細胞及び肺癌細胞において増加することが報告された。リビンの2種類のスプライスバリアントが報告され、その両方が単一のBIRドメインを含む。完全長アルファ変異体は298アミノ酸残基を有するのに対して、ベータ変異体は280アミノ酸残基を有する。
【0018】
IAPファミリータンパク質は、ヒトに加えて、マウスなどの哺乳動物、ゼノプス種(アフリカツメガエル)などの両生類、ショウジョウバエ種などの昆虫及びバキュロウイルスを含めたいくつかの種においても確認された。
【0019】
サービビンは癌細胞において広範かつ極めて選択的に発現することから、癌の有用な診断マーカー候補となっている。例えば、Rohayem等、Cancer Res. 2000;60:1815〜17の報告によれば、ヒト肺及び結腸直腸癌患者においてサービビンに対する自己抗体が確認された。
【0020】
サービビンは、癌治療の標的としても認識されている。カスパーゼ−3及びカスパーゼ−7に対するサービビンの阻害効果は、様々なアポトーシス刺激化学療法に対する癌細胞の抵抗性と関係がある。サービビン発現を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、腺癌細胞系におけるサービビンの発現を減少させ、化学療法剤エトポシドに対する癌細胞の感受性を増加させることが報告されている。Olie等 Cancer Res. 2000;60:2805〜9及びMesri等 J. Clinical Res.、2001;108:981〜990を参照されたい。
【0021】
サイトカインは、細胞増殖、細胞分化、免疫応答の調節、血球新生、炎症反応などの他の細胞の挙動に影響を及ぼすことができる、細胞によって産生されるタンパク質及びポリペプチドである。サイトカインは、ケモカイン、ヘマトポイエチン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子及び様々な未配属の分子を含めて、いくつかのファミリーに分類される。一般には、Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology、Revised Edition、Oxford University Press、2000、並びにC.A. Janeway、P. Travers、M. Walport及びM. Schlomchik、Immunobiology、Fifth Edition、Garland Publishing、2001(以後、Janeway及びTravers)を参照されたい。サイトカインの簡潔な分類は、Janeway及びTravers、Appendix III、677〜679ページにあり、その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。
【0022】
ヘマトポイエチンとしては、例えば、エリスロポイエチン、インターロイキン−2(IL−2、T細胞によって産生され、T細胞増殖に関与する133アミノ酸タンパク質)、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−11、IL−13、IL−15(腸管上皮、T細胞及びNK細胞の増殖を刺激する114アミノ酸IL−2様タンパク質)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、オンコスタチンM(OSM)及び白血病抑制因子(LIF)が挙げられる。
【0023】
インターフェロンとしては、例えば、IFN−α、IFN−β及びIFN−γ(T細胞及びNK細胞によって産生され、マクロファージ活性化、MHC分子及び抗原プロセシング成分の発現増加、IGクラススイッチ、及びTH2の抑制に関与する143アミノ酸ホモ二量体タンパク質)が挙げられる。
【0024】
免疫グロブリンとしては、例えば、その両方がT細胞応答を同時刺激するB7.1(CD80)及びB7.2(CD86)が挙げられる。
【0025】
腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーとしては、例えば、TNF−α、TNF−β(リンフォトキシン)、リンフォトキシン−β(LT−β)、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4−1BBリガンド、Trail及びOPGリガンドが挙げられる。
【0026】
特定のファミリーに割り当てられない様々なサイトカインとしては、例えば、腫瘍成長因子−β(TGF−β)、IL−1α、IL−1β、IL−1 RA、IL−10、IL−12(ナチュラルキラー細胞刺激因子;197アミノ酸鎖と306アミノ酸鎖を含み、NK細胞活性化及びTH1様細胞へのT細胞分化の誘導に関与するヘテロ二量体)、マクロファージ抑制因子(MIF)、IL−16、IL−17(上皮、内皮及び繊維芽細胞におけるサイトカイン産生を誘導するサイトカイン産生誘導因子)及びIL−18が挙げられる。
【0027】
ケモカインは、比較的小さな化学誘引タンパク質及びポリペプチドであり、白血球遊走など様々な細胞(例えば、食細胞及びリンパ球)の遊走及び活性化を刺激するサイトカインファミリーである。ケモカインは、炎症及び他の免疫応答においてある役割を果たす。ケモカインは、Cケモカイン、CCケモカイン、CXCケモカイン及びCX3Cケモカインを含めて、いくつかのファミリーに分類される。これらの名称は、分子中のシステイン残基の数及び空間的配置を基準とし、Cケモカインは1個のシステインを含み、CCケモカインは2個の隣接システインを含み、CXCは単一のアミノ酸残基によって分離された2個のシステインを含み、CX3Cケモカインは3個のアミノ酸残基によって分離された2個のシステインを含む。ケモカインは、細胞表面にあるいくつかのケモカイン受容体と相互作用する。その関連する開示を参照により本明細書に組み込むJaneway及びTravers、Appendix IV、680ページを参照されたい。
【0028】
また、ケモカインは、免疫調節活性を有することができ、癌に対する免疫応答と関係がある。例えば、ヒト二次リンパ組織ケモカイン(SLC)(現在一般にCCL21と称される)のマウスアナログであるネズミ6Ckine/SLCは、C−26結腸癌腫瘍細胞系において抗腫瘍応答を誘導することが報告されている。Vicari等 J. Immunol. 2000;165(4):1992〜2000を参照されたい。ヒトCCL21及びそのネズミ対応物6Ckine/SLCは、CCケモカインに分類され、CCR7ケモカイン受容体と相互作用する。ネズミ6Ckine/SLC(muCCL21)は、Vicari等によって、CXCR3ケモカイン受容体リガンドであることも報告されている。ヒトCCL21、ネズミmuCCL21及び様々な他のケモカインは、樹状細胞、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞などの様々な免疫系細胞の調節に関係する。
【0029】
Mig及びIP−10は、活性化T細胞に付随するCXCR3受容体と相互作用するCXCケモカインである。リンホタクチンはCケモカインであり、T細胞及びNK細胞に付随するXCR1受容体と相互作用する。フラクタルカインはCX3Cケモカインであり、T細胞、単球及び好中球に付随するCX3CR1受容体と相互作用する。
【0030】
NK細胞は、ウイルスに感染された細胞を認識し破壊する大きな顆粒リンパ球である。NK細胞は、免疫調節性ポリペプチドリガンドとNK細胞表面受容体の相互作用によって調節することができる。例えば、NK細胞活性を調節することができるNKG2D受容体リガンドとしては、muCCL21などのケモカイン、MHCクラスI鎖関連抗原、UL16結合タンパク質などのストレス誘導性ポリペプチドリガンドが挙げられる。ネズミH60副組織適合抗原ペプチドも、NKG2D受容体に結合することが報告されている。例えば、Robertson等、Cell Immunol. 2000;199(1):8〜14;Choi等、Immunity 2002、17(5):593〜603及びFarag等、Blood、2002;100(6):1935〜1947を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0031】
本発明は、単一ベクター中で癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物をコードするDNAワクチンを提供することによって、癌細胞に対する全身免疫応答を刺激することができるワクチンに対する継続的な要望を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【0032】
癌細胞に対して免疫応答を誘導するのに有効なDNAワクチンは、癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含む。DNA構築体は、弱毒細菌(例えば、弱毒サルモネラ チフィムリウムベクター)などのベクターに作用可能に組み込まれていることが好ましい。DNAワクチンは、少なくとも1種類の癌関連IAPファミリータンパク質をコードするポリヌクレオチドと、免疫活性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。DNA構築体は、サービビンタンパク質(例えば、ヒトサービビン、ネズミサービビンなど)など成体組織には実質的に存在しないが癌組織では増加する癌関連IAPファミリータンパク質又はリビンタンパク質をコードすることが好ましい。DNA構築体によってコードされる免疫反応性遺伝子産物は、サイトカイン、ナチュラルキラー細胞表面受容体リガンド又は類似の免疫反応性分子であることが好ましい。
【0033】
一実施態様においては、DNAワクチンは、好ましくは、(a)配列番号2のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビン、(b)配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログ、(c)配列番号23のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、(d)配列番号24のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、及び(e)MHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるサービビンタンパク質の断片からなる群から選択されるサービビンタンパク質を作用可能にコードするDNAを含む。
【0034】
さらに別の実施態様においては、DNAワクチンは、好ましくは、(a)配列番号27のアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンアルファスプライスバリアント、(b)配列番号29のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンベータスプライスバリアント、(c)配列番号27と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログ、(d)配列番号29と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンベータスプライスバリアントの免疫原性ホモログ、及び(e)MHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるリビンタンパク質の断片からなる群から選択されるリビンタンパク質を作用可能にコードするDNA構築体を含む。
【0035】
好ましいサイトカインとしては、ヒトCCL21、ネズミCCL21、リンホタクチン、フラクタルカイン、IP−10などのケモカイン、IL−2、IL−15などのヘマトポイエチン;IFN−γなどのインターフェロン;IL−12、IL−17などのT細胞及びNK細胞遊走又は増殖に関連する他のサイトカインなどが挙げられる。
【0036】
好ましいナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドは、NKG2D細胞表面受容体に結合するヒトMICA、ヒトMICB、ヒトULBP1、ヒトULBP2、ヒトULBP3などのストレス誘導性タンパク質である。特に好ましいNKG2DリガンドはMICA及びMICBである。
【0037】
ミョウバン、水中油型乳剤、防腐剤などの従来のアジュバントもワクチンに入れることができる。本発明のDNAワクチンは、腫瘍細胞アポトーシスの刺激を含めて、腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激し、腫瘍成長及び転移を阻害する。
【0038】
本発明の方法側面においては、ワクチン接種患者における腫瘍成長を長期間阻害するためにDNAワクチンを利用する。IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするポリヌクレオチド構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含むDNAワクチンは、腫瘍成長を阻害する必要がある患者に、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で(好ましくは、経口)投与される。
【0039】
本発明のワクチンは、様々なタイプの癌を治療するのに有用である。例えば、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫などの患者は、本発明のワクチンによる免疫化による利点を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0040】
腫瘍細胞に対して免疫応答を誘導するのに有効なDNAワクチンは、IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を含む。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「DNA構築体」という用語は、標的細胞において転写され得る合成DNA構造体を意味する。この構築体は、精製DNA、プラスミドベクターに組み込まれたDNA、DNAを宿主細胞に導入するのに適切な任意の他のベクターに組み込まれたDNAなどの線状核酸を含むことができる。DNAは、好ましくは、ウイルス又は細菌ベクター、より好ましくは、非病原性である弱毒ウイルス又は細菌ベクター、最も好ましくは、弱毒細菌ベクターに組み込まれる。
【0041】
本明細書において使用される「免疫」という用語は、毒性病原体又は腫瘍抗原に対する長期の免疫保護作用を指す。「免疫化」という用語は、非病原性源に由来する病原体の抗原に予防的に曝し、その被検者において病原体に対する免疫が獲得されることを指す。
【0042】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合するグリコシル化タンパク質である分子、免疫グロブリンを指す。
【0043】
本明細書において使用される「抗原」という用語は、免疫適格性動物に導入されたときに、特異抗体、すなわちその抗原に結合することができる抗体の産生を刺激する実体を意味する。本明細書において使用される「免疫原」という用語は、単独で抗体産生を刺激することができるが、キャリアと結びついた場合でも抗体産生を刺激することができる実体を意味する。
【0044】
本明細書において使用される「保存的置換」という用語は、1個のアミノ酸残基が別の生物学的に類似した残基で置換されることを意味する。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどの1個の疎水性残基と別のものとの置換、又はアルギニンなどの1個の親水性残基とリジンの置換及びその逆、グルタミン酸とアスパラギン酸の置換及びその逆、グルタミンとアスパラギンの置換及びその逆などが挙げられる。
【0045】
ペプチド配列に関して本明細書において使用される、文法的に様々な形の「実質的に対応する」という用語は、アミノ末端とカルボキシ末端の一方又は両方において最高3個のアミノ酸残基が追加又は削除され、ポリペプチド配列に沿って保存的置換のみを含む記載のペプチド配列を意味する。
【0046】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「免疫活性遺伝子産物」という用語及びその文法的に変化した用語は、T細胞及びNK細胞と相互作用し、それらの活性を調整するタンパク質及びポリペプチドなどの免疫調節活性を有するタンパク質及びポリペプチドを含む。
【0047】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「IAPファミリータンパク質」という用語は、腫瘍細胞において発現され、その自然の形でアポトーシスを阻害する自然抗原クラスのすべてを含む。IAPファミリータンパク質としては、例えば、ヒトサービビン、ヒトX染色体連鎖IAP(XIAP)、ネズミTIAP(サービビンのネズミアナログ)、ヒトリビン、ヒトc−IAP−1、ヒトc−IAP−2、ヒトNAIP、少なくとも1個のバキュロウイルスアポトーシス反復阻害剤(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat)(BIR)ドメインを含む任意の他のタンパク質又はそのホモログが挙げられる。BIRドメインは、すべての野生型IAPファミリータンパク質中に存在する。BIRドメインは、4つの比較的短いアルファらせん及び3本鎖逆平行ベータシート構造領域を含む。このドメインは、IAPファミリータンパク質の全体にわたって保存されている3個のシステイン残基と1個のヒスチジン残基によってZnに結合する。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「IAPファミリータンパク質」という用語は、スプライスバリアント、置換変異体などの野生型IAPタンパク質の変異体、並びに主要組織適合性(MHC)クラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識される断片及びその免疫原性ホモログ(すなわち、サービビンタンパク質エピトープ)も含む。
【0048】
IAPファミリータンパク質に関連して、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「癌関連」という用語は、正常な非癌性細胞よりも癌細胞において高いレベルで発現されるIAPファミリータンパク質を意味する。癌関連IAPファミリータンパク質の例としては、ヒトサービビン及びヒトリビンが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【0049】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「サービビンタンパク質」という用語は、完全長ヒトサービビン分子(配列番号2)、その完全長ネズミアナログ(すなわち、本明細書に記載するTIAP)、スプライスバリアント、置換変異体などのヒトサービビン又はネズミサービビンの変異体、並びに主要組織適合性(MHC)クラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるヒトサービビンの断片(例えば、エピトープ)及びヒトサービビンの免疫原性ホモログを含む。ヒトサービビンの公知の置換変異体としては、配列番号2のアミノ酸残基配列中に置換T34Aを有するタンパク質、配列番号2のアミノ酸残基配列中に置換D53Aを有するタンパク質、配列番号2のアミノ酸残基配列中に置換C84Aを有するタンパク質などが挙げられる(Song等、Mol. Biol. Cell、2004;15(3):1287〜1296、E−publication December 29,2003)。これらの公知の変異体の各々は、抗アポトーシス活性を有する野生型サービビンとは対照的にアポトーシス活性を有する。
【0050】
好ましい実施態様においては、本発明のDNAワクチンは、配列番号2のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビン、配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログ、配列番号23のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、配列番号24のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、及びMHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるサービビンタンパク質の断片などのサービビンタンパク質を作用可能にコードするDNA構築体を含む。
【0051】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「リビンタンパク質」という用語は、完全長ヒトリビンアルファスプライスバリアント(配列番号27)、ヒトリビンのベータスプライスバリアント(配列番号29)、ヒトリビンアルファ及びベータスプライスバリアントの置換変異体、並びにMHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるその断片及び免疫原性ホモログを含む。
【0052】
別の好ましい実施態様においては、本発明のDNAワクチンは、配列番号27のアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンアルファスプライスバリアント、配列番号29のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンベータスプライスバリアント、配列番号27と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログ、配列番号29と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンベータスプライスバリアントの免疫原性ホモログ、及びMHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるリビンタンパク質の断片などのリビンタンパク質を作用可能にコードするDNA構築体を含む。
【0053】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「免疫原性ホモログ」という用語及びその文法的に変化した用語は、サービビン、リビンなどの癌関連IAPファミリータンパク質に関して使用されるときには、野生型癌関連IAPファミリータンパク質に対して高度の相同性を有するタンパク質であって、MHCクラスI分子に結合することができ、対応する野生型IAPファミリータンパク質に対して活性である細胞障害性T細胞によって認識され得るタンパク質を意味する。免疫原性ホモログは、好ましくは、野生型癌関連IAPファミリータンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、最も好ましくは少なくとも約95%同一であるアミノ酸残基配列を有する。
【0054】
理論に拘泥するわけではないが、ヒト患者などの患者への本発明のワクチンの接種によって、抗原提示細胞などの免疫細胞表面で癌関連IAPファミリータンパク質に由来する抗原が選択的に提示され、さらにこれらの細胞において免疫活性遺伝子産物が選択的に発現されると考えられる。抗原提示細胞の細胞表面でサービビンタンパク質、リビンタンパク質などの癌関連IAPファミリータンパク質の提示が増加し、さらにサイトカイン、NK細胞表面受容体に対するリガンドなどの免疫活性遺伝子産物が発現することによって、サービビンタンパク質、リビンタンパク質などの癌関連IAPファミリータンパク質を発現する癌細胞に対する免疫応答が増強される。成人においては、サービビンはほぼすべて癌細胞において発現される。同様に、リビン発現は、報告によれば、一部の癌細胞系、特にメラノーマ細胞系において増加する。
【0055】
好ましい実施態様においては、DNAワクチンは、サービビンタンパク質及びサイトカインを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。サービビンタンパク質は、ヒトサービビン、ネズミサービビン又はそのエピトープであることが好ましい。サイトカインは、T細胞又はNK細胞活性を調整することが好ましい。好ましいサイトカインとしては、ケモカイン、ヘマトポイエチン、インターフェロンが挙げられる。他の好ましいサイトカインとしては、IL−12などのNK細胞活性化サイトカイン及びIL−17などのサイトカイン産生刺激因子が挙げられる。
【0056】
別の好ましい実施態様においては、DNAワクチンは、リビンタンパク質及びサイトカインを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。リビンタンパク質は、野生型ヒトリビン又はそのエピトープであることが好ましい。サイトカインは、T細胞又はNK細胞活性を調整することが好ましい。好ましいサイトカインとしては、ケモカイン、ヘマトポイエチン、インターフェロンが挙げられる。他の好ましいサイトカインとしては、IL−12などのNK細胞活性化サイトカイン及びIL−17などのサイトカイン産生刺激因子が挙げられる。
【0057】
好ましいケモカインとしては、CCケモカイン、特にCCL21(SLC)などのCCR7ケモカイン受容体リガンドであるCCケモカイン;リンホタクチンなどのCR1受容体リガンドであるCケモカイン;フラクタルカインなどのCX3CR1受容体リガンドであるCX3Cケモカイン;CXCケモカイン、特にIP−10などのCXCR3受容体リガンドであるCXCケモカインが挙げられる。ケモカインは、ヒトCCL21又はそのネズミアナログ(ネズミCCL21)であることが最も好ましい。
【0058】
好ましいヘマトポイエチンとしては、IL−2、IL−15などのT細胞増殖因子が挙げられる。好ましいインターフェロンとしては、IFN−γなどのT細胞及びNK細胞によって産生されるインターフェロンなどが挙げられる。他の好ましいサイトカインとしては、IL−12などのNK細胞活性化サイトカイン、IL−17などを含めて、上皮、内皮及び線維芽細胞などの細胞においてサイトカイン産生を誘導するサイトカインなどが挙げられる。
【0059】
別の好ましい実施態様においては、DNAワクチンは、サービビンタンパク質及びナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。サービビンタンパク質は、ヒトサービビン、ネズミサービビン又はヒトサービビンのエピトープであることが好ましい。ナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドは、NKG2D細胞表面受容体リガンドであることが好ましい。NKG2D細胞表面受容体リガンドは、MICA、MICBなどのMHCクラスI鎖関連(MIC)抗原、ULBP1、ULBP2、ULBP3などのUL16結合タンパク質(ULBP)などであることが好ましい。ネズミNKG2Dリガンドとしては、例えば、Rael及び副組織適合抗原ペプチドH60が挙げられる。NKG2D細胞表面受容体リガンドはMICA又はMICBであることが最も好ましい。
【0060】
さらに別の好ましい実施態様においては、DNAワクチンは、リビンタンパク質及びNK細胞受容体リガンドを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。リビンタンパク質は、野生型ヒトリビン、ヒトリビンのエピトープ又はリビン変異体とすることができる。
【0061】
癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードする本発明のDNA構築体は、遺伝子発現に必要な当分野で周知の調節性要素に作用可能に結合されていることも好ましい。
【0062】
DNA構築体は、Invitrogen,Inc.、Carlsbad、CAから入手可能なBUDCE4.1発現ベクターなどの発現ベクターに作用可能に組み込まれていることが好ましい。他の適切な発現ベクターは、例えば、BD Biosciences Clonetech、Palo Alto、CAから市販されている。DNA構築体は、発現ベクターに組み込まれると、宿主細胞に発現ベクターを形質移入することによって、生きた弱毒細菌ベクターなどの宿主ベクターに導入することができ、本発明のワクチンが提供される。
【0063】
DNA構築体は、好ましくは、ヌクレオチドの発現に必要な調節性要素を含む。かかる要素としては、例えば、プロモーター、開始コドン、終止コドン及びポリアデニレーションシグナルが挙げられる。また、エンハンサーは、免疫原性標的タンパク質をコードする配列の発現に必要なことが多い。当分野で知られているように、これらの要素は、好ましくは、所望のタンパク質をコードする配列に作用可能に結合されている。それらが投与される種に適合する調節性要素が好ましくは選択される。
【0064】
開始コドン及び終止コドンは、好ましくは、サービビンタンパク質及び免疫調節性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部として本発明の遺伝子ワクチンに含まれる。開始コドン及び終止コドンは、サービビンタンパク質及び免疫調節性ポリペプチドのコード配列とインフレームになければならないのは言うまでもない。
【0065】
本発明のワクチンに含まれるプロモーター及びポリアデニレーションシグナルは、好ましくは、免疫される被検者の細胞内で機能するように選択される。
【0066】
本発明のワクチン、特にヒト用遺伝子ワクチンの製造に有用なプロモーターの例としては、シミアンウイルス40(SV40)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、HIV長末端反復(LTR)プロモーターなどのヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、モロニーウイルス、CMV即時型プロモーターなどのサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタインバーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)に由来するプロモーター、及びヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子に由来するプロモーターが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【0067】
本発明のワクチン、特にヒト用遺伝子ワクチンの製造に有用なポリアデニレーションシグナルとしては、SV40ポリアデニレーションシグナル、LTRポリアデニレーションシグナルなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【0068】
DNA発現に必要な調節性要素に加えて、他の要素もDNA分子中に入れることができる。かかる追加の要素としてはエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン並びにCMV、RSV及びEBV由来のエンハンサーなどのウイルスエンハンサーとすることができる。
【0069】
制御配列及びコドンは一般に種に依存する。タンパク質産生を最大にするために、制御配列及びコドンは、免疫される種に有効なように選択される。当業者は、所与の対象種において機能するDNA構築体を容易に製造することができる。
【0070】
本ワクチンのDNA構築体は、その該当する開示を参照により援用するRestifo等 Gene Therapy 2000;7:89〜92に定義された「裸の」DNAとすることができる。DNAは、ベクターに作用可能に組み込まれていることが好ましい。有用な送達ベクターとしては、生分解性マイクロカプセル、免疫刺激複合体(ISCOM)又はリポソーム、ウイルス、細菌などの生きた遺伝子改変弱毒ベクターなどが挙げられる。
【0071】
生きた適切な弱毒細菌ベクターの例としては、サルモネラ チフィムリウム、サルモネラ チフィ(Salmonella typhi)、シゲラ(Shigella)種、バチルス(Bacillus)種、ラクトバチルス(Lactobacillus)種、バチルス カルメット ゲラン(Bacille Calmette−Guerin)(BCG)、エシェリキア コリ(Escherichia coli)、ビブリオ コレレ(Vibrio cholerae)、カンピロバクター(Campylobacter)種、リステリア(Listeria)種、又は当分野で既知の任意の他の適切な細菌ベクターが挙げられる。ベクターは、生きた弱毒サルモネラ チフィムリウムベクターであることが好ましい。好ましい生きた弱毒サルモネラ チフィムリウムとしては、SL7207などのAroA−系統、又はRE88などの二重弱毒(doubly attenuated)AroA−,dam−系統が挙げられる。二重弱毒AroA−,dam−サルモネラ チフィムリウムは特に好ましいベクターである。
【0072】
生きた細菌ベクターを外来性DNA構築体で形質転換する方法は、当分野では十分に述べられている。例えば、Joseph Sambrook及びDavid W. Russell、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、3rd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(2001)(Sambrook及びRussell)を参照されたい。
【0073】
好ましいウイルスベクターとしては、バクテリオファージ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス及びアビポックスが挙げられる。ウイルスベクターを外来性DNA構築体で形質転換する方法も当分野では十分に述べられている。上記Sambrook及びRussellを参照されたい。
【0074】
有用なリポソームベクターは、親油性材料と内部水性部分で形成された膜部を有する単層又は多層の小胞である。水性部分は、本発明では、標的細胞に送達されるポリヌクレオチド材料を含むのに使用される。リポソーム形成材料は、第4級アンモニウムなどの陽イオン性基、及び約6個から約30個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アリル基などの1個以上の親油性基を有することが一般に好ましい。適切な材料の一群は、欧州特許第0187702号に記載されており、Wolff等の米国特許第6,228,844号でさらに考察されている。これらの該当する開示を参照により援用する。多数の他の適切なリポソーム形成陽イオン性脂質化合物が文献に記載されている。例えば、L. Stamatatos等、Biochemistry 1988;27:3917〜3925及びH. Eibl等、Biophysical Chemistry 1979;10:261〜271を参照されたい。或いは、ポリ乳酸−コグリコリド生分解性ミクロスフェアなどのミクロスフェアを利用することができる。核酸構築体は、当分野で知られているとおり、内部に封入されており、又は組織に核酸を送達するリポソーム若しくはミクロスフェアと複合化されている。
【0075】
他の有用なベクターとしては、Wang等、Nat.Mater.、2004;3(3):190〜6.Epub 2004 Feb.15に記載の生分解性ポリ(オルトエステル)材料を含む重合体ミクロスフェアが挙げられる。その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。
【0076】
本発明の方法側面は、癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫反応性遺伝子産物を作用可能にコードするDNAワクチンをヒトなどの哺乳動物の組織に投与することを含む。一部の好ましい実施態様においては、DNAワクチンは、経口、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内又は局所に投与される。DNAワクチンは、経口投与されることが好ましい。
【0077】
好ましい方法においては、本発明のDNAワクチンは、ワクチンによる治療を受けた患者において腫瘍成長を長期的に阻害するために利用することができる。DNAワクチンは、サービビンタンパク質などの癌関連IAPファミリータンパク質、サイトカイン、NK細胞表面受容体リガンドなどの免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNAポリヌクレオチド構築体、及び薬剤として許容されるその担体を含む。ワクチンは、腫瘍成長を阻害する必要がある哺乳動物に、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で投与される。
【0078】
本発明のワクチンによる治療を受ける哺乳動物はヒトであることが好ましい。肺癌又は結腸癌、乳房腫瘍、前立腺腫瘍などの癌患者は、本発明のワクチンによる免疫化の利点を得ることができる。
【0079】
本発明のワクチンは、好ましくは、水、食塩水、デキストロース、グリセリンなど、並びにそれらの組み合わせなどの薬剤として許容される担体又は賦形剤とともに処方される。ワクチンは、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、アジュバントなどの補助物質を含むこともできる。
【0080】
本発明のワクチンは、好ましくは、薬剤として許容される担体の溶液又は懸濁液としてヒトなどの哺乳動物に、約1から約10マイクログラム/ミリリットルのDNA濃度で経口投与される。適切な投与量は、ワクチン接種される被検者によって決まり、ワクチンを投与する又は投与を要求する開業医の判断にある程度依存する。
【0081】
本発明のワクチンは、アンプル、ビン、バイアルなどの適切に滅菌された容器に複数回投与又は単位剤形として入れられる。容器は、好ましくは、ワクチン調製物を充填した後で機密密封される。ワクチンは、ワクチンを識別するラベルが貼られた容器に入れられ、適切な法の下にワクチンが承認されたことを示す米国食品医薬品局などの政府機関によって規定された形式の表示、投与情報などを有することが好ましい。ラベルは、好ましくは、ワクチンを患者に投与する医療関係者に有用なワクチンについての情報を含む。包装は、好ましくは、ワクチン投与に関する印刷された情報資料、説明書、指示書及びあらゆる必要な所定の警告を含む。
【0082】
ヒトサービビンDNA配列及びその対応するタンパク質配列は、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UK、DNA受託番号BC034148のEMBLデータベースにStrausbergによって報告された。その開示を参照により本明細書に組み込む。ネズミTIAPのDNA配列及び対応するタンパク質配列は、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに、Kobayashi等 Proc. Natl. Acad. Sci. 1999;96:1457〜62;DNA受託番号AB01389によって報告された。その開示を参照により本明細書に組み込む。
【0083】
ヒトサービビンをコードする核酸配列を図1(配列番号1)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号2)を図2に示す。ネズミサービビン(すなわち、TIAP)をコードする核酸配列を図3(配列番号3)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号4)を図4に示す。
【0084】
ヒトサービビンとそのネズミ対応物TIAPのタンパク質相同性を図5に示す。図5に示すように、ヒトサービビン(配列番号2)とネズミTIAP(配列番号4)には約83%の同一アミノ酸残基配列がある。
【0085】
Mahotka等は、サービビン−ΔEx3及びサービビン−2Bと称するヒトサービビンの2種類のスプライスバリアントを特定した。これらも本発明に使用するのに適切である。Mahotka等 Cancer Res.、1999;59:6097〜6102。その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。サービビン−2B(配列番号23)及びサービビン−ΔEx3(配列番号24)のアミノ酸残基配列を図37に示す。Hirohashi等は、サービビン−2Bに対して細胞障害性リンパ球応答を誘導するサービビン−2B80−88と称される、アミノ酸残基配列AYACNTSTL(配列番号25)を有するサービビン−2B由来の強力なT細胞エピトープを特定した。Hirohashi等 Clinical Cancer Res.、2002;8:1731〜39。その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。このエピトープは、MHCクラスI分子と結合することができ、細胞障害性T細胞によって認識されるサービビンの断片であり、本発明のワクチンのIAPファミリータンパク質成分として使用するのに適切である。
【0086】
ヒトサービビンの別のスプライスバリアントは、Badran等、Biochem. Biophys. Res. Commun.、2004;314(3):902〜907によって記述されたサービビン−3B変異体である。サービビン−3B及びその対応するアミノ酸残基配列をコードするポリヌクレオチド配列は、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UK、DNA受託番号AB 154416のEMBLデータベースに報告されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【0087】
(アルファ変異体として知られる)完全長ヒトリビンは、単一BIRドメインを有し、298アミノ酸残基からなるIAPファミリータンパク質である。ヒトリビンアルファ変異体のDNA配列及び対応するタンパク質配列は、Clark等によってEuropean Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UK、DNA受託番号NM 139317のEMBLデータベースに報告されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトリビンのベータ変異体のDNA配列及び対応するタンパク質配列は、受託番号NM 022161としてEuropean Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【0088】
完全長ヒトリビン(アルファ変異体)をコードする核酸配列を図39(配列番号26)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号27)を図40に示す。ヒトリビンのベータ変異体をコードする核酸配列を図41(配列番号28)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号29)を図42に示す。ヒトリビンのベータ変異体は、完全長ヒトリビンアルファスプライスバリアント(配列番号27)のアミノ酸残基216から233までを欠いている。ベータ変異体は、他のすべての点でヒトリビンのアルファ変異体と同一である。ヒトリビンのアルファとベータ変異体の両方のBIRドメインは、配列番号27及び配列番号29のアミノ酸残基R90からアミノ酸残基L155の領域にある)。
【0089】
好ましい実施態様においては、本発明のワクチンは、ヒトサービビン、TIAP(ネズミサービビン)、その免疫原性ホモログなどの1種類以上のサービビンタンパク質をコードするDNA構築体を含む。免疫原性ホモログは、好ましくは、ヒトサービビンと少なくとも約80%のアミノ酸残基配列が同一であり、より好ましくは、配列番号2と少なくとも約90%のアミノ酸残基配列が同一であり、最も好ましくは少なくとも約95%のアミノ酸残基配列が同一である。或いは、ワクチンはヒトサービビンタンパク質の1種類以上のT細胞エピトープをコードするDNA構築体を含むことができる。
【0090】
別の好ましい実施態様においては、本発明のワクチンは、ヒトリビンアルファ及びベータスプライスバリアント(それぞれ配列番号27及び29)、その免疫原性ホモログなどの1種類以上のリビンタンパク質をコードするDNA構築体を含む。免疫原性ホモログは、好ましくは、ヒトリビンのアルファ又はベータスプライスバリアントと少なくとも約80%のアミノ酸残基配列が同一であり、より好ましくは、配列番号27又は配列番号29と少なくとも約90%のアミノ酸残基配列が同一であり、最も好ましくは、少なくとも約95%のアミノ酸残基配列が同一である。或いは、ワクチンはヒトリビンタンパク質の1種類以上のT細胞エピトープをコードするDNA構築体を含むことができる。
【0091】
遺伝コード固有の縮重のために、ヒトサービビン、ネズミサービビン、ヒトリビンスプライスバリアントなどの生来の(すなわち、天然)癌関連IAPファミリータンパク質と実質的に同じ又は機能的に等価なアミノ酸残基配列をコードするDNA配列を本発明のワクチンに使用することができる。かかるDNA配列としては、生来のサービビン又はリビン DNA配列とハイブリッド形成可能なDNA配列、対立遺伝子変異体などが挙げられる。機能的に等価なホモログのDNAは、前記未変性サービビン又はリビンタンパク質をコードするDNAと少なくとも約70%のヌクレオチド配列が同一であり、より好ましくは少なくとも約80%のヌクレオチド配列が同一であることが好ましい。
【0092】
本ワクチンのDNA構築体によってコードされる免疫活性遺伝子産物は、好ましくは、サイトカイン又はナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドである。特に好ましいサイトカインはCCケモカインである。特に有用なCCケモカインは、CCR7ケモカイン受容体のリガンドである。選択的CCR7リガンドとしては、(exodus−3、ELC、MIP−3β及びCKβ11としても知られる)CCL19、(exodus−2、SLC、6Ckine、TCA4及びCKβ9としても知られる)CCL21などが挙げられる。特に好ましいケモカインは、ヒトCCL21及びそのネズミ対応物6Ckine/SLC(muCCL21)、及びそれに実質的に対応するケモカインである。
【0093】
ヒトSLCのDNA及びタンパク質配列は、Nishimura等によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UK、DNA受託番号AB002409のEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。6Ckine/SLC DNA及びタンパク質配列のネズミCCL21a変異体は、Hromas等 J ImmunoL 1997;159(6):2554〜2558、DNA受託番号NM011335によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。6Ckine/SLC DNA及びタンパク質配列のネズミCCL21b変異体は、Hedrick等、J. Immunol. 1997;159(4):1589〜1593、DNA受託番号NM011124によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベース報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。
【0094】
ヒトCCL21(SLC)をコードする核酸配列を図6(配列番号5)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号6)を図7に示す。ネズミCCL21(CCL21b変異体)をコードする核酸配列を図8(配列番号7)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号8)を図9に示す。
【0095】
ヒトCCL21(SLC)とそのネズミ対応物(ネズミ6Ckine/SLC、CCL21b)のタンパク質相同性を図10に示す。図10に示すように、ヒトCCL21(配列番号6)とネズミCCL21(配列番号8)には約73%の同一アミノ酸残基配列がある。
【0096】
ネズミSLCのCCL21a変異体をコードする核酸配列を図25(配列番号11)に示す。その対応するアミノ配列(配列番号12)を図26に示す。
【0097】
ナチュラルキラー細胞表面受容体の好ましいリガンドは、ネズミNKG2D表面受容体リガンドである。NKG2D表面受容体の好ましいリガンドは、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3などである。最も好ましくは、MICA及びMICB。NKG2D表面受容体の他の公知のリガンドとしては、ネズミRea−1β、ネズミ副組織適合抗原ペプチドH60などが挙げられる。
【0098】
ネズミH60副組織適合抗原ペプチドDNA及びタンパク質配列は、Malarkannan等、J. Immuraol. 1998;161(7):3501〜3509、DNA受託番号AF084643によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ネズミH60副組織適合抗原ペプチドをコードする部分核酸配列を図11(配列番号9)に示す。その対応する部分アミノ酸残基配列(配列番号10)を図12に示す。
【0099】
ヒトMICAのDNA及びタンパク質配列は、Zwirner等、DNA受託番号AY204547によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトMICAをコードする核酸配列を図27(配列番号13)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号14)を図28に示す。
【0100】
ヒトMICBのDNA及びタンパク質配列は、Bahram等 Immunogenetics 1996;45(2):161〜162、DNA受託番号U65416によってEuropean Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトMICBをコードする核酸配列を図29(配列番号15)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号16)を図30に示す。MICBの対立遺伝子変異体は、参照により本明細書に組み込むGENBANK受託番号NP 005922に記載されている。図38は、受託番号NP 005922のGENBANK登録の複製である。
【0101】
ヒトULBPIのDNA及びタンパク質配列は、Cosman等、Immunity 2001;14(2):123〜133、DNA受託番号AF304377によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトULBP1をコードする核酸配列を図31(配列番号17)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号18)を図32に示す。
【0102】
ヒトULBP2のDNA及びタンパク質配列は、Cosman等、Immunity 2001;14(2):123〜133、DNA受託番号AF304378によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトULBP2をコードする核酸配列を図33(配列番号19)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号20)を図34に示す。
【0103】
ヒトULBP3のDNA及びタンパク質配列は、Cosman等、Immunity 2001;14(2):123〜133、DNA受託番号AF304379によって、European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UKのEMBLデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトULBP3をコードする核酸配列を図35(配列番号21)に示す。その対応するアミノ酸残基配列(配列番号22)を図36に示す。
【0104】
特に好ましいナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドとしては、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3などのNKG2D受容体リガンド及びその機能等価物が挙げられる。機能等価物は、好ましくは、前記免疫調節性ポリペプチドと少なくとも約80%のアミノ酸残基配列が同一であり、より好ましくは、少なくとも約90%のアミノ酸残基配列が同一であり、最も好ましくは、少なくとも約95%のアミノ酸残基配列が同一である。
【0105】
遺伝コード固有の縮重のために、ヒトCCL21、ネズミCCL21、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、それに実質的に対応する類似の材料など有用な生来の免疫活性遺伝子産物と実質的に同じ又は機能的に等価なアミノ酸残基配列をコードするDNA配列を本発明のワクチンに使用することができる。かかるDNA配列としては、免疫調節性ポリペプチドDNA配列とハイブリッド形成可能なDNA配列、対立遺伝子変異体などが挙げられる。機能的に等価なホモログのDNAは、前記生来の免疫調節性ポリペプチドをコードするDNAと少なくとも約70%のヌクレオチド配列が同一であることが好ましい。
【0106】
本発明によって使用することができる改変DNA配列は、野生型癌関連LAPファミリータンパク質をコードする生来のポリヌクレオチド配列中の異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含み、野生型タンパク質又はその免疫原性ホモログをコードする配列が得られる。本発明によって使用することができる改変DNA配列は、野生型免疫原性遺伝子産物をコードする生来のポリヌクレオチド配列中の異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換も含み、野生型免疫活性遺伝子産物又はその機能等価物をコードする配列が得られる。機能的に等価な免疫活性遺伝子産物は、サイレントな変化をもたらす野生型サイトカイン又はNK細胞表面受容体リガンド内のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含むことができ、それによって機能的に等価な分子が産生される。かかるアミノ酸置換(例えば、保存的置換)は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び/又は両親媒性の類似度に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあり、正に帯電したアミノ酸としては、リジン、アルギニンなどがあり、類似した親水性値を有する非帯電極性頭部基を含むアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン;グリシン、アラニン;アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。
【0107】
本明細書において使用される、サイトカイン、NK細胞表面受容体リガンドなどの機能的に等価な免疫活性遺伝子産物とは、その対応物の天然の免疫活性遺伝子産物と実質的に同じ免疫調節活性を有するポリペプチドを意味する。
【0108】
本発明のワクチンに有用なIAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA配列は、遺伝子産物のプロセシング及び発現を改変する変更を含めて、ただしこれらだけに限定されない様々な目的のためにコード配列を変更するように操作することができる。例えば、当分野で周知の技術、例えば、部位特異的突然変異誘発によって突然変異を導入して、新しい制限酵素切断部位を挿入し、グリコシル化パターン、リン酸化などを変更することができる。
【0109】
本発明の別の態様は、癌の免疫になるように哺乳動物にワクチン接種する方法である。この方法は、本明細書に記載するように、本発明のワクチンを哺乳動物に癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で投与することを含む。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【0110】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載するアポトーシスファミリータンパク質阻害剤及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を含むベクターが形質移入された形質転換宿主細胞も包含する。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。
【0111】
本発明は、アポトーシスファミリータンパク質阻害剤及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を含む単離プラスミドベクターも提供する。このベクターは、本発明のワクチンを調製するために弱毒細菌細胞などの宿主細胞に形質移入するのに有用である。
【0112】
以下の例は、本発明の特徴及び実施態様をさらに説明するために提供するものであって、限定するものではない。
材料、方法及び実施例
材料。C57/BL/6J及びBalb/cマウスをScripps Research Institute育種施設から得た。TIAP(サービビンのネズミ型)をコードするDNAをPCRによってMC3PcDNAからクローン化した。ネズミ6Ckine(ネズミCCL21)をコードするDNAをひ臓細胞からクローン化した。H60副組織適合抗原ペプチド(MICA及びMICBのネズミ型)をコードするDNAは、University of California(Berkley)のDr. David H. Ranletの厚意によって提供された。ネズミCCL21(muCCL21、6Ckine/SLCとしても知られる)及びネズミサービビン(muサービビン、TIAPとしても知られる)をコードするワクチン用DNAを、Invitrogen,Inc.から入手したpBudCE4.1真核発現ベクターに、MuCCL21に対しては制限酵素切断部位HindIII及びBamHI、muサービビンの両末端に対してはXhoIを使用してクローン化した。H60及びTIAPをコードするワクチン用DNAを、Invitrogen,Inc.から入手したpBudCE4.1真核発現ベクターに、H60に対しては制限酵素切断部位HindIII及びXbaI、muサービビンに対しては制限酵素切断部位KpnI及びXhoIを使用してクローン化した。サルモネラ チフィムリウムのAroA−弱毒系統(SL2707)及びサルモネラ チフィムリウムの二重弱毒AroA−,dam−系統(RE88)をRemedyne、Santa Barbara、CAから得た。抗体は、BD Biosciences、Bedford、MAから得られた。フルオレッセインイソチオシアネート(FITC)及びR−フィコエリトリン(PE)をMolecular Probes、Eugene、ORから得た。FITC標識及びPE標識抗体は、製造者の推奨プロトコルに従って調製された。
パートA. 形質転換AroA−弱毒サルモネラ チフィムリウムからのワクチン
【実施例1】
【0113】
muサービビン及びmuCCL21をコードするDNAワクチンの調製
muサービビン及びmuCCL21 DNA(pDNA約1〜10μg)を含むpBudCE4.1ベクターを、Bio−Rad Pulserを用いて2.5kV、25μF及び200オームで製造者の推奨手順に従って、新しく調製された弱毒サルモネラ チフィムリウム(SL2707)に電気穿孔して入れた。このベクターを含むサルモネラを、ゼオシンを含むプレート上で選択した。コロニーを翌日に選択し、ゼオシンが添加されたLBブロス(EM Science、Gibbstown、NJ)中で終夜培養した。細菌を単離し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。次いで、洗浄された細菌をPBS培養液に約1x109組換えサルモネラ/ミリリットルPBSの濃度で懸濁して、後で使用するワクチン溶液を生成した。
【0114】
ベクターのみで形質転換されたサルモネラからなる対照ワクチン、muサービビンDNAのみを組み込んだベクター、及びmuCCL21 DNAのみを組み込んだベクターも同じ手順に従って調製した。図13は発現構築体の略図である。
【0115】
ワクチンを使用するまで密封アンプルに保存した。プラスミドDNAは、サルモネラを形質転換するまで約−80℃で保存された。
【実施例2】
【0116】
実施例1のDNAワクチンのマウスへの接種
Balb/cマウス(約8匹のマウス/投与群)に実施例1のDNAワクチン(約100μlのPBS中に約1x108個の組換えサルモネラ)を経口胃管栄養法によって2週間間隔で3回接種した。
【実施例3】
【0117】
ワクチン接種マウスの腫瘍抵抗性の評価
最後のワクチン接種から約1週間後に、実施例2のBalb/cマウス(約8匹のマウス/投与群)に約1x105個のD121ルイス肺癌細胞を(皮下)投与した。約2週間成長させて肺に自然に播種させた後に皮下ルイス肺腫瘍を外科的に除去した。皮下腫瘍成長を二次元で一日おきに測定し、各腫瘍の腫瘍体積を次式によって計算した。
【0118】
体積=(幅2)(長さ÷2)
肺へのD121の自然転移量を、皮下原発腫瘍の除去後約24から約28日評価した。マウスを屠殺し、解剖し、腫瘍によって覆われた肺表面の割合によって肺の腫瘍量を評価し、腫瘍がないのを「0」、約20%未満の腫瘍被覆を「1」、約20から約30%の腫瘍被覆を「2」、約50%を超える腫瘍被覆を「3」とした。
【0119】
実施例1のワクチンを接種されたマウスの腫瘍量スコアを表1に示す。図14に、実施例1のワクチンを接種されたマウスから得られた肺の写真を示す。腫瘍体積を表1及び図14に示す。図14において、棒Aは、本発明のmuサービビン/muCCL21ワクチンを接種されたマウスの平均肺腫瘍体積(立法ミリメータ)であり、棒Bは、muサービビンDNAのみを組み込まれたワクチンを接種されたマウスの平均腫瘍体積であり、棒Cは、muCCL21 DNAのみを組み込まれたワクチンを接種されたマウスの平均腫瘍体積であり、棒Dは、空のベクターのみを組み込まれたワクチンを接種されたマウスの平均腫瘍体積であり、棒Eは、PBS緩衝剤を接種されたマウスの平均腫瘍体積である。図14は、図14のそれぞれの棒の各々の下に示された各投与群から切除された代表的な肺の写真も含む。
【0120】
【表1】
【0121】
表1及び図14(図A及びB)の結果によれば、IAPファミリータンパク質(すなわち、muサービビン)及び免疫活性遺伝子産物(すなわち、muCCL21)をコードするDNA構築体を含むDNAワクチンは、肺腫瘍転移に対してマウスを有効に免疫することができ、肺腫瘍の成長を阻害した。
【実施例4】
【0122】
本発明の本発明のDNAワクチンによって誘導されるD121肺癌細胞に対するT細胞媒介細胞障害性
実施例2に記載したように、C5/7BL/6Jマウス(約8匹のマウス/投与群)に実施例1のDNAワクチンを接種した。脾細胞をワクチン接種から約4日後に単離し、Current Protocols in Immunology at 3.11.4, Coligan, et al. Eds., John Wiley & Sons, Inc.(1994)に記載されたように、4時間の51Cr放出アッセイによってその溶菌活性を分析した。D121細胞を脾細胞の標的細胞として使用した。
【0123】
図15は、本発明のDNAワクチンによって誘導されるD121肺癌細胞に対するT細胞媒介細胞障害性を示すグラフである。白抜きの円で示されるデータポイントは、細胞がH−2Kb/H−2Db MHCクラスI抗原に対する抗体(クローンSF1−1.1;34−2−12 IgG2a,κ)50μg/mlで処理される阻害アッセイのデータであり、黒塗りの四角は阻害抗体の非存在下におけるデータである。腫瘍細胞の溶解百分率(Y軸)は、各ワクチン接種群に対して効果細胞と標的細胞(E/T)の3つの異なる比(すなわち、第1のデータポイントは100:1のE/Tであり、第2のデータポイントは50:1であり、第3のデータポイントは25:1である)に対してプロットされている。その結果、(SLC/TIAPと標識された)本発明のmuサービビン/muCCL21ワクチンは、100:1 E/T比において、PBS、空のベクター及びmuCCL21 DNAを含む各対照ワクチンと比較してほぼ5倍、muサービビンDNAのみを含む対照ワクチンの約2倍の溶解を誘導した。
【実施例5】
【0124】
ワクチン接種マウスから得られた脾細胞におけるCD25、CD69及びCD28活性化マーカー(CD8+T細胞)の増加
実施例2に記載したように、C5/7BL/6Jマウス(約4匹のマウス/投与群)に実施例1のDNAワクチンを接種した。脾細胞を最後のワクチン接種から約1週間後に免疫マウス及び対照マウスから単離した。次いで、細胞をFITC複合CD8+抗体、並びにCD25、CD69及びCD28のPE複合抗体で染色した。細胞懸濁液を、2色フローサイトメトリーBecton Dickenson FACスキャンを用いて評価して、各脾細胞についてCD25、CD28及びCD69に陽性なCD8+T細胞の割合を求めた。結果を図16に示す。各FACSプロットの上部右手四半分の数値は、場合によってはCD8+抗原とCD25、CD28又はCD69の両方を提示する細胞の割合である。数値結果を表2に示す。これらの結果は、本発明のワクチンによるT細胞マーカー発現の増加を示しており、T細胞活性化が増大したことを示している。
【0125】
【表2】
【0126】
表2及び図16のデータは、muサービビン及びmuCCL21をコードするDNA構築体を含む実施例1の本発明のワクチンが、T細胞活性化分子の発現を増加させることを示している。
【実施例6】
【0127】
ワクチン接種マウスにおける樹状細胞上での同時刺激分子の発現増加
実施例2に記載したように、C5/7BL/6Jマウス(約4匹のマウス/投与群)に実施例1のDNAワクチンを接種した。脾細胞を最後のワクチン接種から約1週間後に免疫マウス及び対照マウスから単離した。次いで、細胞を、同時刺激分子B7(CD80)、ICAM−1及びDEC205のPE複合抗体と組み合わせたFITC複合CD11c抗体で染色した。細胞懸濁液を2色フローサイトメトリーBecton Dickenson FACスキャンを用いて評価した。図17は、細胞の平均蛍光値を示すグラフであり、対照ワクチンと比較して、本発明のmuサービビン/muCCL21ワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞のICAM−1(上)、CD80(中間)及びDEC205(下)の発現が増加していることを示している。
【実施例7】
【0128】
細胞内サイトカイン放出の誘導
実施例2と同様に免疫されたマウス(8匹のマウス/群)に実施例3と同様にD121肺癌細胞を投与した。腫瘍細胞投与から約1週間後に各マウスから脾細胞を採取した。脾細胞をFITC−抗CD3抗体で染色し、次いで固定し、透過化処理し、引き続いてPE複合抗IFN−γ抗体で染色した。2色染色された細胞をFACSフローサイトメトリーによって分析した。結果を図18に示す。細胞をBD Pharmingen、La Jolla、CAの細胞内染色スターターキットによって固定した。
【0129】
図18にプロットされた結果によれば、サイトカインIFN−γを放出する細胞の割合は、PBS対照ワクチンを投与されたマウスの場合のわずか0.41%、空のベクター対照ワクチンを投与されたマウスの場合の約0.38%、SLC対照ワクチンを投与されたマウスの場合の約0.96%、及びmuサービビン対照ワクチンを投与されたマウスの場合の約1.53%と比較して、本発明のワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞では約3.17%に増加した。
【実施例8】
【0130】
ワクチン接種マウスにおける肺癌細胞のアポトーシスの増加
実施例2と同様に免疫されたマウス(8匹のマウス/群)に実施例3と同様にD121肺癌細胞を投与した。腫瘍細胞投与から約1週間後に各マウスから脾細胞を採取した。脾細胞をD121腫瘍細胞とともに温度約37℃で約3時間インキュベートした。次いで、腫瘍細胞を単離し、FACSによって分析した。Annexin V−FITCを使用して、集団内の活発にアポトーシスを起こす細胞の割合を定量した。ヨウ化プロピジウム(PI)を使用して、BD Pharmingen、La Jolla、CAから入手可能なApoptosis Detection Kitによって、生育不能な細胞から生細胞を区別した。
【0131】
図19は、約3時間(上のプロットセット)及び約24時間(下のプロットセット)後に評価されたFACS分析結果のグラフである。各プロットの下右四半分の数値は、各投与群においてアポトーシスを起こす細胞の割合である。3時間後、無処置の(すなわち、脾細胞に曝されていない)D121細胞の約5.39%がアポトーシスを起こした。PBS緩衝剤のみを含有する対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたD121細胞の約2.28%がアポトーシスを起こした。空のベクターDNAを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたD121細胞のわずか約5.19%しかアポトーシスを起こさなかった。同様に、muCCL21 DNAのみを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときにはD121細胞の約5.15%がアポトーシスを起こしたのに対して、muサービビンDNAのみを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときにはD121細胞の約11.46%がアポトーシスを起こした。驚くべきことに、3時間後、muCCL21とmuサービビンDNAの両方を含む本発明のワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときには、D121細胞の約18.44%がアポトーシスを起こした。
【0132】
同様に、24時間後、(アポトーシス細胞を排除する)ゲート付きFACS分析においては、無処置の(すなわち、脾細胞に曝されていない)D121細胞のいずれもアポトーシスを起こさなかった。PBS緩衝剤のみを含有する対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたD121細胞の約8.46%がアポトーシスを起こした。空のベクターDNAを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたD121細胞のわずか約4.78%しかアポトーシスを起こさなかった。驚くべきことに、24時間後、muCCL21とmuサービビンDNAの両方を含む本発明のワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときには、D121細胞の約59.2%がアポトーシスを起こした。
【実施例9】
【0133】
TIAP及びネズミH60副組織適合抗原ペプチドをコードするDNAワクチンの調製
TIAP及びネズミH60副組織適合抗原DNA(pDNA約1μg)を含有するpBudCE4.1ベクターを、Bio−Rad Pulserを利用して2.0kV、25μF及び100オームで製造者の推奨手順に従って、新しく調製された弱毒サルモネラ チフィムリウム(SL2707)に電気穿孔して入れた。図20は、H60の発現ベクター、及びベクターに組み込まれたmuサービビンの略図である。
【0134】
このベクターを含むサルモネラを、ゼオシンを含むプレート上で選択した。翌日、コロニーを選択し、ゼオシンが添加されたLBブロス(EM Science、Gibbstown、NJ)中で終夜培養した。細菌を単離し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。次いで、洗浄された細菌をPBS培養液に約5x109組換えサルモネラ/ミリリットルPBSの濃度で懸濁して、後で使用するワクチン溶液を生成した。
【0135】
ベクターのみで形質転換されたサルモネラからなる対照ワクチン、muサービビンDNAのみを組み込んだベクター、及びH60副組織適合性抗原(H60)DNAのみを組み込んだベクターも同じ手順に従って調製した。
【0136】
ワクチンを使用するまで密封アンプルに保存した。プラスミドDNAは、サルモネラを形質転換するまで約−20℃で保存された。
【実施例10】
【0137】
実施例9のDNAワクチンのマウスへの接種
Balb/cマウス(約8匹のマウス/投与群)に実施例9のDNAワクチン(約100μlのPBS中に約5x108個の組換えサルモネラ)を経口胃管栄養法によって2週間間隔で3回接種した。
【実施例11】
【0138】
実施例10のDNAワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞の細胞障害性アッセイ
脾細胞を実施例10のワクチン接種マウスから単離し、照射を受けたCT−26細胞で刺激した。5日後、脾細胞を収集し、CT−26細胞及びYac−1細胞(NK感受性T細胞)を標的に細胞障害性アッセイを実施した。Current Protocols in Immunology at 3.11.4、Coligan, et al. Eds.、John Wiley & Sons, Inc.(1994)に記載されたように、4時間51Cr放出アッセイによって、細胞特異的溶解度をE/T比25:1、50:1及び100:1において求めた。結果を図21に図示する。
【0139】
その結果、muサービビン及びH60 DNAを含む本発明のワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞は、CT−26結腸直腸癌細胞の溶解が、100:1のE/T比において、空のベクター、H60及びmuサービビン対照ワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞の2倍以上増加した。すべてのE/T比においてすべてのワクチンでYac−1の溶解は極めて少なく、観察された死滅はT細胞によって媒介された可能性が高いことが示された。
【実施例12】
【0140】
ワクチン接種マウスの腫瘍抵抗性の評価
第3のワクチン接種から約2週間後に、実施例10のBalb/cマウス(約8匹のマウス/投与群)に、約1x105個のネズミCT−26結腸直腸癌細胞を(静脈内;i.v.)投与した。
【0141】
肺へのCT−26細胞の自然転移量を、CT−26細胞をi.v.投与してから約25日後に評価した。マウスを屠殺し、解剖し、各群の肺の平均重量を記録することによって肺の腫瘍量を評価した。正常肺重量は約0.2グラムである。図22に、ワクチン接種されたCT−26投与マウスから取り出された典型的な肺(上)を示す。図22は、各投与群の平均肺重量のグラフ(下)も含む。本発明のH60/muサービビンワクチンを接種されたマウスでは、対照ワクチンと比較して、劇的な腫瘍量減少が認められた。
【0142】
図23は、各投与群において26日後に生存していたマウスの割合を示すグラフである。本発明のH60/muサービビンワクチンを接種されたマウスでは、対照ワクチンと比較して、生存のかなりの増加が認められた。
【実施例13】
【0143】
293T細胞におけるH60及びmuサービビンの発現の評価
図24AにH60の発現を示す。293T細胞に、空のベクター(V)又はpH60(H)を24時間形質移入し、収集し、NKG2D四量体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。形質移入効率は、pGFP(緑色蛍光タンパク質)形質移入によって評価して約45%であった。図24Aにmuサービビンの発現を示す。293T細胞に、空のベクター又はpmuサービビンを24時間形質移入し、収集し、溶解し、ウエスタンブロットによって分析した。ウエスタンブロットによれば、muサービビンは、形質移入細胞では検出可能であるが、未変性細胞では検出不可能である。
パートB. 形質転換されたAroA−,dam−二重弱毒サルモネラ チフィムリウムからのワクチン
【実施例14】
【0144】
muサービビン及びmuCCL21をコードするDNAワクチンの調製
ネズミサービビン(muサービビン)及びネズミCCL21(muCCL21)の完全長コード領域を、それぞれD121マウスルイス肺癌細胞及び活性化マウス脾細胞から抽出された全RNA 1μgを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅した。全RNAはRNEASY(登録商標)Miniキット(Qiagen、Valencia、CA)を用いて抽出され、RT−PCRはplatinum quantitative RT−PCR thermoscript one−step system(Gibco/BRL)を用いて製造者の指示に従って実施された。いくつかの構築体が、哺乳動物発現ベクターにおいて、単一プラスミドから2種類の遺伝子が独立に発現するようになされたPCR産物を用いてpBudCE4.1ベクター(Invitrogen)に基づいて作製された。第1の構築体である完全長ネズミサービビン及びネズミCCL21を含むmuサービビン/muCCL21は、制限酵素切断部位HindIIIとBamHIの間のマルチクローニング部位Aに挿入された。ケモカインmuCCL21は、制限酵素切断部位XhoIとNotIの間のマルチクローニング部位Bに遺伝子を挿入することによってそれぞれ産生された。DNAワクチン接種に使用されるもう一方のベクターは、muCCL21又はmuサービビンのどちらかが存在しないのではなく、第1の構築に基づいた。空のベクターが対照として作製された。
【0145】
muサービビン及びmuCCL21のタンパク質発現は、プラスミドをCOS−7細胞へ形質移入した後に、それぞれ抗サービビン及び抗CCL21抗体を用いた細胞可溶化物のウエスタンブロット法によって示された。C57BL/6Jマウスのパイエル板におけるEGFP活性の発現が、pEGFPで形質転換された108個のサルモネラ チフィムリウム(AroA−,dam−系統RE88)を経口投与した後のマウスにおいて検出された。マウスを8、16及び36時間で屠殺し、新しい小腸試料を取り出し、PBSで十分洗浄した後に分析した。EGFPの蛍光発現が共焦点顕微鏡法によって検出された。
【0146】
弱毒細菌によって宿主中で引き起こされ得る毒性を、二重弱毒AroA−,dam−系統RE88を単一弱毒AroA−系統SL2707と比較することによって評価した。RE88系統を使用すると、全16匹のマウスが明らかな毒性副作用を起こさずに生存したのに対して、SL2707系統で免疫された16匹のマウスのうち2匹が毒性及び感染によって死亡した。したがって、細菌毒性を制御するRE88系統のdam−突然変異によって、この系統がDNAワクチンキャリアとして特に有用になったことが明らかである。
【実施例15】
【0147】
実施例14のワクチンを用いたマウスの経口ワクチン接種及び腫瘍暴露
C57BL/6Jマウスを5つの群に分け、すなわち、空のベクターpBUd;pBud−muサービビン/muCCL21、pBud−muサービビン又はpBud−muCCL21の個々の発現ベクター、並びにPBS投与群、いずれかを含む約1x108個の二重弱毒S.チフィムリウム(RE88)を含有するPBS約100μlを用いた胃管栄養法によって2週間間隔で3回免疫した。予防処置をした全マウスに、約1x105個のD121ネズミルイス肺癌細胞を、最後の免疫化から約1週間後にi.v.注射して投与した。治療設定においては、マウスに約1x105個のD121ネズミルイス肺癌をまずi.v.注射し、1週間後に、形質転換されたS.チフィムリウムを用いて3種類のワクチン接種を行った。マウスを毎日検査し、屠殺し、予防設定では腫瘍細胞投与から約28日後に、又は治療モデルにおいては最初の腫瘍細胞接種から63日後に肺転移を調べた。
【0148】
ワクチンによる予防処置の場合のPBS、空のベクター、CCL21、サービビン又はCCL21/サービビンワクチンそれぞれによる免疫化後の腫瘍転移スコアを表3に示す。表3の結果は、融合転移病巣で覆われた%肺表面で表される転移スコア、すなわち、0=なし;1=5%未満;2=5から50%;及び3=>50%として示されている。CCL21/サービビンワクチンによる治療を受けたマウス群と全対照群の転移スコアの差は統計的に有意(P=<0.001)であった。この治療モデルにおいても腫瘍成長の阻害が認められた。
【0149】
【表3】
【0150】
この予防設定においては、本発明者らは、2週間間隔で3回ワクチンを接種され、次いで1週間後に腫瘍細胞のi.v.注射によって暴露されたマウスにおいて、D121ネズミルイス肺癌の播種性の肺転移が明確に抑制されることを認めた。実際、8匹のマウスのうち6匹ですべての肺腫瘍転移が完全に阻止され、残りのマウスでは腫瘍転移が著しく抑制された(表3参照)。これに対して、muCCL21を欠くサービビン系DNAワクチンは、8匹のマウスのうちわずか1匹においてしか完全な転移抑制を誘導せず、2匹は5%未満の転移性腫瘍成長を示し、残りのマウスはすべて広範な転移性腫瘍成長を示した。PBS又は空のベクターの対照ワクチン接種のみによる治療を受けた別のマウスは、腫瘍保護作用をまったく示さず、腫瘍細胞投与後4週間以内に広範な転移のために死亡した。分泌性muCCL21プラスミドのみを含む二重弱毒サルモネラによる免疫化は、腫瘍転移を劇的には抑制しなかったが、それでも対照と比較すると転移が統計的に有意に遅延された。
【0151】
重要なことに、muサービビン/muCCL21系DNAワクチンは、治療設定においてはすべての実験動物においてすでに十分定着した肺転移の成長を顕著に抑制するのにも有効であった。これに対して、muサービビン若しくはmuCCL21系ワクチン自体、又は空のベクター及びPBS対照を投与されたマウスは、この実験設定においてD121非小細胞肺癌の大きな播種性肺転移が明らかになった。治療モデルからの様々な実験群の肺重量を表4に示す。正常肺重量は約0.3gであった。
【0152】
【表4】
【実施例16】
【0153】
実施例15のワクチン接種マウスにおける抗血管形成効果の測定
最後のワクチン接種から2週間後に、ネズミFGF−2(PeproTech、Rocky Hill、NJ)約400ng/ml及び1000Gyで照射されたD121腫瘍細胞(1x104/ml)を含むgrowth factor−reduced matrigel(BD Biosciences)約500mlをマウスの胸骨領域に皮下(s.c.)注射した。2匹の対照マウス以外すべてのマウスにおいて、6日後に内皮組織を0.1mg/ml蛍光性Bandeiraea simplicifolia lectin I、Isolectin B4(Vector Laboratories、Burlingame、CA.)200mlを外側尾静脈に注射して染色し、約30分後、マウスを屠殺し、Matrigelプラグを切除し、巨視的に評価した。次いで、レクチン−FITCを各プラグ100mlからRIPA溶解500mlで抽出し、蛍光定量法によって490nmで定量した。各例においては、注射されなかった2匹の対照マウスで認められたバックグラウンド蛍光が減算された。
【0154】
muサービビン/muCCL21系ワクチンは、腫瘍脈管構造における血管形成を明確に抑制した。Matrigelアッセイ、及びFITC複合レクチンによるマウス内皮のインビボ染色後に測定された相対蛍光による定量によって示されるとおり、腫瘍新血管新生のかなりの減少が観察された。FITC複合レクチンのs.c.注射から6日後に取り出された代表的なMatrigelプラグを検査すると、腫瘍血管新生における巨視的に明白な差が、muサービビン/muCCL212ワクチンで処置された群とマウス対照群の間で認められた。本発明のワクチンを接種されたマウスは、腫瘍血管新生が対照群よりもかなり少なかった。
【実施例17】
【0155】
細胞障害性アッセイ
脾細胞が、腫瘍細胞投与から5日後にワクチン接種マウスから首尾よく単離された。細胞障害性は、D121腫瘍細胞又はサービビンを過剰発現するネズミ内皮細胞のどちらかの標的に対する標準51Cr放出アッセイによって評価された。細胞障害性の特異的MHCクラスI拘束を明らかにするために、抗マウスMHCクラスI H−2Kb/Db抗体(PharMingen、San Diego、CA)10μg/mlを用いて阻害評価を実施した。
【0156】
51Cr放出アッセイは、ワクチン接種及びその後のD121ルイス肺癌細胞投与後にマウスから得られた特異的CD8+T細胞によって誘導された顕著な細胞障害性を示した。muサービビン/muCCL21又はmuサービビンワクチン自体で免疫されたマウスの脾細胞から単離されたCD8+T細胞は、D121腫瘍細胞のそれぞれ50%及び30%を有効に溶解した。これに対して、対照マウスから単離されたCD8+T細胞は、腫瘍細胞の注目すべき死滅を惹起せず、バックグラウンドの細胞障害活性を示すに過ぎなかった。特徴的なことに、抗H2Kb/H2Db抗体を添加すると細胞障害性は完全に消失したので、観察されたCD8+T細胞媒介性細胞障害性は、MHCクラス1抗原拘束性であった。
【実施例18】
【0157】
フローサイトメトリー分析及びサイトカイン放出アッセイ
T細胞の活性化マーカー、並びにCD11c及びMHCクラスII抗原陽性DC上の同時刺激分子の発現を、BD Biosciences FACScanを用いた2色又は3色フローサイトメトリー分析によって測定した。T細胞活性化は、首尾よくワクチン接種されたマウスから新たに単離された脾細胞をPE複合抗CD25、CD28又はCD69抗体と組み合わせたFITC標識抗CD3e抗体で染色することによって判定された。APC上の同時刺激分子の活性化は、FITC標識抗CD11c抗体及びビオチン化抗IAb抗体、続いてストレプトアビジン−アロフィコシアニン、及びPE複合抗ICAM−1、CD80又はDEC205抗体と組み合わせて測定された。すべての細胞数測定流通実験は、死細胞を除外するために0.1μg/mlヨウ化プロピジウムの存在下で実施された。これらのアッセイのすべての試薬は、BD Pharmingen(La Jolla、CA)から得られた。
【0158】
フローサイトメトリーは、細胞内サイトカインの検出に使用された。このために、脾細胞は、D121腫瘍細胞投与から約2週間後にB57BL/6Jマウスから収集され、照射された前記D121細胞とともに完全T細胞培地中で約24時間培養された。プレインキュベートされた細胞は、非特異的染色を阻止するために精製2.4G2抗体(BD Pharmingen)約1mgとともに懸濁された。細胞は洗浄され、次いで、FITC複合抗CD3+抗体0.5mgで染色された。細胞は、2回洗浄後、固定され、フローサイトメトリー分析のために、抗IL2又は抗IFN−g抗体と複合された1mg/ml PEで染色された。すべての抗体はBD Pharmingen(La Jolla、CA.)から得られた。
【0159】
muサービビン/muCCL21ワクチン自体のみが、CD25、CD28及びCD69 T細胞活性化マーカーの発現を顕著に増加させるのに最も有効であった。DC上のB7同時刺激分子とCD28の相互作用は、ナイーブT細胞と抗原提示DCの重要な複数の相互作用を実現するのに必須であることが知られているので、CD28の増加は特に重要である。これに対して、muサービビン又はmuCCL21自体のみをコードするDNAワクチンは、T細胞活性化マーカーの発現をわずか1倍増加させただけであった。muサービビン/muCCL21ワクチンによるCD4+とCD8+の両方のT細胞の活性化は、細胞内炎症誘発性サイトカインIFN−g及びIL−2の明確な増加によっても示された。これに対して、PBS及び空のベクター対照、並びにmuサービビン又はmuCCL21のみをコードするDNAワクチンは、これらのサイトカインを誘導するのに有効性がかなり低いことが判明した。
【0160】
T細胞受容体との最適な連結を得るために、T細胞の活性化が、DC上で発現されるこれらの同時刺激分子との強い細胞−細胞相互作用に決定的に依存することはよく知られているので、muサービビン/muCCL21系DNAワクチンによって得られるDC上のICAM−1、CD80及びDEC205の発現増大は特に重要である。今回も、muサービビン/muCCL21をコードする真核生物プラスミドを含む二重弱毒サルモネラ チフィムリウムによる免疫化によって、これらの活性化マーカーが最も有効に増加し、対照のそれの最高2から3倍になった。
【実施例19】
【0161】
腫瘍細胞アポトーシスの分析
ワクチン接種によって誘導されるD121腫瘍細胞のアポトーシスは、それぞれワクチン接種から約3時間及び約24時間後に測定された。対照と実験動物の両方に、3回の免疫化の最後から1週間後に約1x105個のD121細胞をi.v.投与した。腫瘍細胞投与から1週間後に各個々のマウスから脾細胞を収集し、その後、約2.5x107個の脾細胞を約5x105個のD121細胞と6ウェルプレート中で4時間同時培養した。ANNEXIN(登録商標)V−FITCアポトーシス検出キットII(BD Biosciences Pharmingen、San Diego、CA)を使用してアポトーシスの初期段階を確認した。後期段階の腫瘍細胞アポトーシスを確認するために、約5x105個のD121細胞と約2.5x107個の脾細胞を約24時間同時培養し、次いで、アポトーシスをFACSによって、APO−DIRECT(商標)キット(BD Biosciences Phramingen、San Diego、CA)を用いたTUNELアッセイによって製造者の指示に従って分析した。
【0162】
アポトーシスは早くも3時間には観察され、24時間後にはさらにかなりの増加がAnnexin V又はTUNELアッセイによって得られるデータのフローサイトメトリー分析によって示された。すなわち、かかるマウスから収集された脾細胞を腫瘍細胞と同時インキュベートした後の初期アポトーシスは、muサービビン/muCCL21ワクチンで免疫されたマウス群が対照よりも最高3から4倍高かった。muサービビンのみをコードするワクチンは、アポトーシスをある程度惹起したが、対照よりもわずか1倍高いだけであった。しかし、muサービビン/muCCL21ワクチンで免疫されたマウスにおいてのみ24時間でアポトーシスの劇的な85%の増加が認められ、CTLによって誘導された強い腫瘍細胞免疫がこの現象を引き起こしたことが示唆される。
【実施例20】
【0163】
muサービビン及びH60をコードするDNAワクチンの調製
完全長ネズミNKG2Dリガンド−H60を含むプラスミドは、Dr.A. Diefenbach及びDr.D. H. Raulet(University of California、Berkeley、CA)の厚意によるものであった。発現ベクターは、上述したpBudCE4.1(Invitrogen)骨格上で構築された。
【0164】
二重弱毒S.チフィムリウム(AroA−,dam−)は、上述したエレクトロポレーションによってDNAワクチンプラスミドで形質転換された。手短に述べると、中間成長期(midlog growth phase)の新しく調製された細菌(約1x108)をプラスミドDNA(1から2μg)と氷上で0.1cmキュベット中で混合し、約2.0KV、25μF及び100Ωで電気穿孔した。DNAワクチンベクターを含む耐性コロニーを培養し、コード配列を確認した後に−80℃で保存した。
【実施例21】
【0165】
実施例20のワクチンを用いたマウスの経口ワクチン接種及び腫瘍暴露
BALB/c A2Kbマウス群(n=4から12)を、発現ベクターを含む約5x108個の二重弱毒S.チフィムリウムを含有するPBS 100μlを用いた胃管栄養法によって2週間間隔で2回免疫した。予防モデルにおいては、BALB/cマウスに約1x105個のCT−26細胞を最後のワクチン接種から2週間後にi.v.投与し、治療設定においては、第1のワクチン接種の5日前に投与した。腫瘍投与後25日又は28日後にマウスを屠殺し、それぞれ肺転移又は腫瘍重量を測定し、対照のそれらと比較した。実験群と対照の鑑別所見の統計的有意性をスチューデントのt検定によって判定した。所見は、両側のP値が<0.05であった場合に有意とみなされた。
【0166】
H60及びmuサービビンの発現は、293T細胞を形質移入し、フローサイトメトリー又はウエスタンブロット分析によって調べることによって確認された。H60の発現は、NKG2D四量体の陽性染色によって確認された。サービビンを形質移入された細胞は、約16.5KDaの予想分子量における単一バンドによって陽性と判定された。CT−26によって発現されるNKG2Dリガンドレベルは、正の対照のYak−1細胞と比較して比較的低い。NKG2Dリガンド発現が低レベルである腫瘍細胞は、腫瘍阻止を誘導できないことが以前に報告されている。予防設定においては、腫瘍投与から25日後にマウスを屠殺した後に、肺重量及び(上述した)転移スコアを評価した。結果を表5及び表6に示す。このデータによれば、H60及びmuサービビンワクチンは、個々にマウスをある程度保護したが、H60とmuサービビンの組み合わせ(muサービビン/H60ワクチン)は、転移スコアのかなりの低下及び肺における腫瘍量の減少によって示されるように腫瘍投与に対する保護作用を大きく増大させた。これらの所見は、PBS、pBud、pH60及びpmuサービビン対照群と比較して統計的に有意であった(それぞれ、p<0.0001、0.002、0.01及び0.005)。
【0167】
治療設定においては、すなわち、定着した結腸癌転移に対しては、28日に屠殺した後に肺腫瘍量を評価した。重要なことには、H60/muサービビンワクチンで処置された12匹のマウスのうち8匹が生存し、より重要なことには、これらの生存マウスのうち2匹は完全に転移がなく、他の2匹は融合腫瘍転移によって覆われた肺表面は5%未満であった。これに対して、空のpBudベクターで処置された対照群においてはわずか2匹のマウスしか生存せず、全生存マウスの肺表面の50%以上が融合腫瘍転移で覆われた。muサービビンワクチンのみの接種は、治療モデルにおいて有意な保護作用が得られず、H60ワクチンのみの処置は、十分とはいえない治療効果しか示さなかった。後者は、生存率がわずかに改善され、生存マウスのうちの1匹は融合腫瘍転移によって覆われた肺表面がわずか<5%であったことによって示唆された。
【0168】
【表5】
【0169】
【表6】
【実施例22】
【0170】
細胞障害性アッセイ
上述した標準51Cr放出アッセイによって細胞障害性を測定した。手短に述べると、脾細胞を最後の免疫化から2週間後に収集し、照射を受けた(1,000Gy)CT−26細胞によって37℃で5日間、10%FBS、L−グルタミン、15mM HEPES、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、2−ME及び20U/mlの組換えIL−2が補充されたRPMI 1640(PeproTech、Rocky Hill、NJ)中において、インビトロで刺激した。脾細胞を収集し、Lympholyte−M細胞分離培地(Cedarlane Laboratories Limited、Hornby、Ontario、Canada)を用いて分離した。標的細胞を約1.5時間、室温で51Crで標識し、効果細胞とともに様々な効果細胞/標的細胞比で約37℃で約4時間インキュベートした。特異的標的細胞溶解割合を式[(E−S)/(T−S)]x100によって計算した。ここで、Eは平均実験放出であり、Sは平均自然放出であり、Tは平均全放出である。
【0171】
NK活性は、H60ワクチンで免疫されたマウスにおいてかなり増大することが判明し、さらに大きなNK死滅がmuサービビン/H60ワクチンで免疫されたマウスにおいて認められた。muサービビン/H60ワクチンで免疫されたマウスから得られた脾細胞は、CT−26標的細胞に対して最も高い細胞障害性を示した。これに対して、pBudで免疫された対照から単離されたかかる脾細胞は最小の細胞障害性死滅を示し、H60ワクチン又はmuサービビンワクチン接種マウスからの脾細胞自体はいくらか高い細胞障害性死滅を示した。細胞培養5日後、NK細胞は、Yac−1 NK標的細胞が使用されたときと有意差が見られず、この細胞障害性アッセイにおいて主要な役割を果たしていないと考えられ、検出された細胞障害性は主にCTLによって媒介されたことが示唆された。
【0172】
本発明の新規な特徴の精神及び範囲から逸脱することなく、上記実施態様の多数の変更及び改変を実施することができる。本明細書に記載される具体的な実施態様は限定的なものではなく、又は限定的なものと考えるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0173】
【図1】ヒトサービビンをコードする核酸配列、配列番号1を示す図である。
【図2】ヒトサービビンのアミノ酸残基配列、配列番号2を示す図である。
【図3】ネズミTIAPをコードする核酸配列、配列番号3を示す図である。
【図4】ネズミTIAPのアミノ酸残基配列、配列番号4を示す図である。
【図5】ヒトサービビンとネズミTIAPのタンパク質相同性を示す図である。
【図6】ヒトSLC(CCL21)をコードする核酸配列、配列番号5を示す図である。
【図7】ヒトSLC(CCL21)のアミノ酸残基配列、配列番号6を示す図である。
【図8】ネズミ6Ckine/SLC(muCCL21)をコードする核酸配列、配列番号7を示す図である。
【図9】ネズミ6Ckine/SLC(muCCL21)のアミノ酸残基配列、配列番号8を示す図である。
【図10】ヒトSLC(CCL21)とネズミ6Ckine/SLC(muCCL21)のタンパク質相同性を示す図である。
【図11】ネズミ副組織適合抗原ペプチドH60をコードする部分核酸配列、配列番号9を示す図である。
【図12】副組織適合抗原ペプチドH60の部分アミノ酸残基配列、配列番号10を示す図である。
【図13】pBudCE4.1ベクター中でサービビンタンパク質(TIAPとしても知られるネズミサービビン)及び免疫調節性ケモカイン(SLCとしても知られるCCL21)をコードするDNA構築体を示す略図である。
【図14】図14Aは、対照緩衝剤(E)、空のベクターを含む対照ワクチン(D)、ケモカインを含むDNAワクチン(C)、サービビンタンパク質を含むワクチン(B)及び本発明のワクチン(A)による治療を受けたマウスにおけるルイス肺癌の肺転移の平均腫瘍体積を示すグラフである。図14Bは、図14Aに示されたワクチン接種マウスから切除された典型的な肺腫瘍転移の写真である。
【図15】図14Aに示されたDNAワクチンによって誘導されるD121肺癌細胞に対するT細胞媒介細胞障害性を示すグラフである。溶解百分率(Y軸)は、各ワクチン接種に対して効果細胞と標的細胞(E/T)の3つの異なる比(すなわち、100:1、第1のデータポイント;50:1、第2のデータポイント;及び25:1、第3のデータポイント)に対してプロットされている。
【図16】フローサイトメトリー分析によって測定された、本発明のワクチンを接種されたマウスにおけるT細胞活性化分子の発現増加を示すグラフである。
【図17】本発明のワクチン及び様々な対照ワクチンをマウスに接種した後の樹状細胞による同時刺激分子の発現促進を示すグラフである。
【図18】フローサイトメトリー分析によって測定された、本発明のワクチン及び様々な対照ワクチンをマウスに接種した後の細胞内サイトカイン放出の誘導を示すグラフである。
【図19】本発明のワクチン及び様々な対照ワクチンをマウスに接種した後のD121肺腫瘍細胞におけるアポトーシスの増加を示すFACSプロットである。(A)ワクチン接種後3時間及び(B)ワクチン接種後24時間。
【図20】TIAP及び副組織適合抗原ペプチドH60を組み込んだ発現構築体を示す略図である。
【図21】本発明のワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞の細胞障害性アッセイデータを示すグラフである。
【図22】実施例10に記載のワクチン接種マウスから切除された肺の写真(上)及び投与群のマウスの平均肺重量の棒グラフ(下)である。
【図23】ワクチン接種され、CT−26腫瘍細胞を投与されたマウスの生存割合を示すグラフである。
【図24】H60ペプチド(A)及びmuサービビン(B)の発現を示す図である。
【図25】6CKine/SLCのCCL21b変異体をコードする核酸配列、配列番号11を示す図である。
【図26】6CKine/SLCのCCL21b変異体のアミノ酸残基配列、配列番号12を示す図である。
【図27】ヒトMICAをコードする核酸配列、配列番号13を示す図である。
【図28】ヒトMICAのアミノ酸残基配列、配列番号14を示す図である。
【図29】ヒトMICBをコードする核酸配列、配列番号15を示す図である。
【図29−A】ヒトMICBをコードする核酸配列、配列番号15を示す図である。
【図30】ヒトMICBのアミノ酸残基配列、配列番号16を示す図である。
【図31】ヒトULBP1をコードする核酸配列、配列番号17を示す図である。
【図32】ヒトULBP1のアミノ酸残基配列、配列番号18を示す図である。
【図33】ヒトULBP2をコードする核酸配列、配列番号19を示す図である。
【図34】ヒトULBP2のアミノ酸残基配列、配列番号20を示す図である。
【図35】ヒトULBP3をコードする核酸配列、配列番号21を示す図である。
【図36】ヒトULBP3のアミノ酸残基配列、配列番号22を示す図である。
【図37】ヒトサービビンスプライスバリアントサービビン−2B(配列番号23)及びスプライスバリアントサービビン−ΔEx3(配列番号24)のアミノ酸残基配列を示す図である。
【図38】MICBの対立遺伝子変異体を記載した受託番号NP 005922のGENBANK記録の複製である。
【図38−A】MICBの対立遺伝子変異体を記載した受託番号NP 005922のGENBANK記録の複製である。
【図38−B】MICBの対立遺伝子変異体を記載した受託番号NP 005922のGENBANK記録の複製である。
【図39】完全長ヒトリビンアルファスプライスバリアントをコードする核酸配列、配列番号26を示す図である。
【図40】ヒトリビンアルファスプライスバリアントのアミノ酸残基配列、配列番号27を示す図である。
【図41】ヒトリビンベータスプライスバリアントをコードする核酸配列、配列番号28を示す図である。
【図42】ヒトリビンベータスプライスバリアントのアミノ酸残基配列、配列番号29を示す図である。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも1種類の癌関連アポトーシスファミリータンパク質阻害剤(IAPファミリータンパク質)及び少なくとも1種類の免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含む、癌細胞に対して免疫応答を誘導するのに適切なDNAワクチン。
【請求項2】
前記癌関連IAPファミリータンパク質がサービビン(survivin)タンパク質及びリビン(livin)タンパク質からなる群から選択される、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項3】
前記DNAが、(a)配列番号2のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビン、(b)配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログ、(c)配列番号23のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、(d)配列番号24のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、及び(e)MHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるサービビンタンパク質の断片からなる群から選択されるサービビンタンパク質を作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項4】
前記DNA構築体が、配列番号2のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項5】
前記DNA構築体が、配列番号23のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンスプライスバリアントを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項6】
前記DNA構築体が、配列番号24のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンスプライスバリアントを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項7】
前記DNA構築体が、配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項8】
前記DNA構築体が、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項9】
前記DNA構築体が、配列番号2と少なくとも95%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項10】
前記DNA構築体が、(a)配列番号27のアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンアルファスプライスバリアント、(b)配列番号29のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンベータスプライスバリアント、(c)配列番号27と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログ、(d)配列番号29と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンベータスプライスバリアントの免疫原性ホモログ、及び(e)MHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるリビンタンパク質の断片からなる群から選択されるリビンタンパク質を作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項11】
前記DNA構築体が、配列番号27のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンスプライスバリアントを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項12】
前記DNA構築体が、配列番号29のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンスプライスバリアントを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項13】
前記DNA構築体が、配列番号27又は配列番号29と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項14】
前記DNA構築体が、配列番号27又は配列番号29と少なくとも90%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項15】
前記DNA構築体が、配列番号27又は配列番号29と少なくとも95%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項16】
前記DNA構築体によって作用可能にコードされる前記免疫活性遺伝子産物が、サイトカインであり、又はナチュラルキラー細胞表面受容体に対するリガンドである、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項17】
前記サイトカインが、ケモカイン、ヘマトポイエチン、インターフェロン、ナチュラルキラー細胞刺激因子及びサイトカイン産生誘導因子からなる群から選択される、請求項16に記載のDNAワクチン。
【請求項18】
前記サイトカインがヒトCCL21である、請求項17に記載のDNAワクチン。
【請求項19】
前記DNA構築体によって作用可能にコードされる前記ナチュラルキラー細胞表面受容体に対するリガンドが、ヒトMICA、ヒトMICB、ヒトULBP1、ヒトULBP2及びヒトULBP3からなる群から選択されるストレス誘導性タンパク質である、請求項16に記載のDNAワクチン。
【請求項20】
前記DNA構築体が、プラスミドベクターに作用可能に組み込まれている、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項21】
前記DNA構築体が、弱毒細菌ベクターに作用可能に組み込まれている、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項22】
前記弱毒細菌ベクターが、弱毒サルモネラ チフィムリウム、サルモネラ チフィ、シゲラ種、バチルス種、ラクトバチルス種、BCG、エシェリキア コリ、ビブリオ コレレ、カンピロバクター種及びリステリア種からなる群から選択される、請求項21に記載のDNAワクチン。
【請求項23】
前記弱毒細菌ベクターが弱毒サルモネラ チフィムリウムである、請求項21に記載のDNAワクチン。
【請求項24】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムがサルモネラ チフィムリウムのAroA−系統である、請求項23に記載のDNAワクチン。
【請求項25】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムがサルモネラ チフィムリウムのAroA−,dam−系統である、請求項23に記載のDNAワクチン。
【請求項26】
前記癌関連IAPファミリータンパク質を作用可能にコードする前記DNA構築体が、配列番号1、配列番号3、配列番号26及び配列番号28からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項27】
前記DNA構築体が弱毒サルモネラ チフィムリウムベクターに作用可能に組み込まれている、請求項26に記載のDNAワクチン。
【請求項28】
前記免疫反応性遺伝子産物を作用可能にコードする前記DNA構築体が、配列番号5、配列番号7、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19及び配列番号21からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項29】
前記DNA構築体が弱毒サルモネラ チフィムリウムベクターに作用可能に組み込まれている、請求項28に記載のDNAワクチン。
【請求項30】
癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含むDNAワクチンの有効な免疫応答を誘導する量を哺乳動物に投与する段階を含み、それによって前記哺乳動物が、ワクチンによって誘導され腫瘍細胞に特異的な免疫応答を示す、哺乳動物における腫瘍成長を阻害する方法。
【請求項31】
前記DNA構築体によってコードされる前記癌関連IAPファミリータンパク質が、サービビン(survivin)タンパク質及びリビン(livin)タンパク質からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項32】
前記DNA構築体によってコードされる前記免疫活性遺伝子産物が、サイトカインであり、又はナチュラルキラー細胞表面受容体に対するリガンドである、請求項30に記載の方法。
【請求項33】
前記哺乳動物がヒトである、請求項30に記載の方法。
【請求項34】
前記DNA構築体が弱毒細菌ベクターに作用可能に組み込まれている、請求項30に記載の方法。
【請求項35】
前記弱毒細菌ベクターが、弱毒サルモネラ チフィムリウム、サルモネラ チフィ、シゲラ種、バチルス種、ラクトバチルス種、BCG、エシェリキア コリ、ビブリオ コレレ、カンピロバクター種及びリステリア種からなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
【請求項36】
前記弱毒細菌ベクターが弱毒サルモネラ チフィムリウムである、請求項34に記載の方法。
【請求項37】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムが、サルモネラ チフィムリウムのAroA−系統である、請求項36に記載の方法。
【請求項38】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムがサルモネラ チフィムリウムのAroA−,dam−系統である、請求項36に記載のDNAワクチン。
【請求項39】
機密密封された無菌容器に梱包された請求項1に記載のワクチンを含み、前記容器が該容器に貼付されたラベルを有し、前記ラベルが前記ワクチンを識別し、前記ワクチンを患者に投与する個人に有用な情報を提供する印刷物を有する、製品。
【請求項40】
癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を含む単離されたプラスミドベクター。
【請求項41】
癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を含むベクターが形質移入された形質転換宿主細胞。
【請求項42】
癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含むDNAワクチンの有効な免疫応答を誘導する量を哺乳動物に投与する段階を含み、それによって前記哺乳動物が、ワクチンによって誘導され腫瘍細胞に特異的な免疫応答を示す、癌に対して哺乳動物にワクチン接種する方法。
【請求項43】
前記DNA構築体によってコードされる前記癌関連IAPファミリータンパク質が、サービビン(survivin)タンパク質及びリビン(livin)タンパク質からなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
【請求項44】
前記DNA構築体によってコードされる前記免疫活性遺伝子産物が、サイトカインであり、又はナチュラルキラー細胞表面受容体に対するリガンドである、請求項42に記載の方法。
【請求項45】
前記哺乳動物がヒトである、請求項42に記載の方法。
【請求項46】
前記DNA構築体が弱毒細菌ベクターに作用可能に組み込まれている、請求項42に記載の方法。
【請求項47】
前記弱毒細菌ベクターが、弱毒サルモネラ チフィムリウム、サルモネラ チフィ、シゲラ種、バチルス種、ラクトバチルス種、BCG、エシェリキア コリ、ビブリオ コレレ、カンピロバクター種及びリステリア種からなる群から選択される、請求項46に記載の方法。
【請求項48】
前記弱毒細菌ベクターが弱毒サルモネラ チフィムリウムである、請求項46に記載の方法。
【請求項49】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムがサルモネラ チフィムリウムのAroA−系統である、請求項48に記載の方法。
【請求項50】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムがサルモネラ チフィムリウムのAroA−,dam−系統である、請求項49に記載のDNAワクチン。
【請求項1】
少なくとも1種類の癌関連アポトーシスファミリータンパク質阻害剤(IAPファミリータンパク質)及び少なくとも1種類の免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含む、癌細胞に対して免疫応答を誘導するのに適切なDNAワクチン。
【請求項2】
前記癌関連IAPファミリータンパク質がサービビン(survivin)タンパク質及びリビン(livin)タンパク質からなる群から選択される、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項3】
前記DNAが、(a)配列番号2のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビン、(b)配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログ、(c)配列番号23のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、(d)配列番号24のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、及び(e)MHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるサービビンタンパク質の断片からなる群から選択されるサービビンタンパク質を作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項4】
前記DNA構築体が、配列番号2のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項5】
前記DNA構築体が、配列番号23のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンスプライスバリアントを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項6】
前記DNA構築体が、配列番号24のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンスプライスバリアントを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項7】
前記DNA構築体が、配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項8】
前記DNA構築体が、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項9】
前記DNA構築体が、配列番号2と少なくとも95%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項10】
前記DNA構築体が、(a)配列番号27のアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンアルファスプライスバリアント、(b)配列番号29のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンベータスプライスバリアント、(c)配列番号27と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログ、(d)配列番号29と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンベータスプライスバリアントの免疫原性ホモログ、及び(e)MHCクラスI分子に結合し、細胞障害性T細胞によって認識されるリビンタンパク質の断片からなる群から選択されるリビンタンパク質を作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項11】
前記DNA構築体が、配列番号27のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンスプライスバリアントを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項12】
前記DNA構築体が、配列番号29のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンスプライスバリアントを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項13】
前記DNA構築体が、配列番号27又は配列番号29と少なくとも80%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項14】
前記DNA構築体が、配列番号27又は配列番号29と少なくとも90%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項15】
前記DNA構築体が、配列番号27又は配列番号29と少なくとも95%同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログを作用可能にコードする、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項16】
前記DNA構築体によって作用可能にコードされる前記免疫活性遺伝子産物が、サイトカインであり、又はナチュラルキラー細胞表面受容体に対するリガンドである、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項17】
前記サイトカインが、ケモカイン、ヘマトポイエチン、インターフェロン、ナチュラルキラー細胞刺激因子及びサイトカイン産生誘導因子からなる群から選択される、請求項16に記載のDNAワクチン。
【請求項18】
前記サイトカインがヒトCCL21である、請求項17に記載のDNAワクチン。
【請求項19】
前記DNA構築体によって作用可能にコードされる前記ナチュラルキラー細胞表面受容体に対するリガンドが、ヒトMICA、ヒトMICB、ヒトULBP1、ヒトULBP2及びヒトULBP3からなる群から選択されるストレス誘導性タンパク質である、請求項16に記載のDNAワクチン。
【請求項20】
前記DNA構築体が、プラスミドベクターに作用可能に組み込まれている、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項21】
前記DNA構築体が、弱毒細菌ベクターに作用可能に組み込まれている、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項22】
前記弱毒細菌ベクターが、弱毒サルモネラ チフィムリウム、サルモネラ チフィ、シゲラ種、バチルス種、ラクトバチルス種、BCG、エシェリキア コリ、ビブリオ コレレ、カンピロバクター種及びリステリア種からなる群から選択される、請求項21に記載のDNAワクチン。
【請求項23】
前記弱毒細菌ベクターが弱毒サルモネラ チフィムリウムである、請求項21に記載のDNAワクチン。
【請求項24】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムがサルモネラ チフィムリウムのAroA−系統である、請求項23に記載のDNAワクチン。
【請求項25】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムがサルモネラ チフィムリウムのAroA−,dam−系統である、請求項23に記載のDNAワクチン。
【請求項26】
前記癌関連IAPファミリータンパク質を作用可能にコードする前記DNA構築体が、配列番号1、配列番号3、配列番号26及び配列番号28からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項27】
前記DNA構築体が弱毒サルモネラ チフィムリウムベクターに作用可能に組み込まれている、請求項26に記載のDNAワクチン。
【請求項28】
前記免疫反応性遺伝子産物を作用可能にコードする前記DNA構築体が、配列番号5、配列番号7、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19及び配列番号21からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のDNAワクチン。
【請求項29】
前記DNA構築体が弱毒サルモネラ チフィムリウムベクターに作用可能に組み込まれている、請求項28に記載のDNAワクチン。
【請求項30】
癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含むDNAワクチンの有効な免疫応答を誘導する量を哺乳動物に投与する段階を含み、それによって前記哺乳動物が、ワクチンによって誘導され腫瘍細胞に特異的な免疫応答を示す、哺乳動物における腫瘍成長を阻害する方法。
【請求項31】
前記DNA構築体によってコードされる前記癌関連IAPファミリータンパク質が、サービビン(survivin)タンパク質及びリビン(livin)タンパク質からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項32】
前記DNA構築体によってコードされる前記免疫活性遺伝子産物が、サイトカインであり、又はナチュラルキラー細胞表面受容体に対するリガンドである、請求項30に記載の方法。
【請求項33】
前記哺乳動物がヒトである、請求項30に記載の方法。
【請求項34】
前記DNA構築体が弱毒細菌ベクターに作用可能に組み込まれている、請求項30に記載の方法。
【請求項35】
前記弱毒細菌ベクターが、弱毒サルモネラ チフィムリウム、サルモネラ チフィ、シゲラ種、バチルス種、ラクトバチルス種、BCG、エシェリキア コリ、ビブリオ コレレ、カンピロバクター種及びリステリア種からなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
【請求項36】
前記弱毒細菌ベクターが弱毒サルモネラ チフィムリウムである、請求項34に記載の方法。
【請求項37】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムが、サルモネラ チフィムリウムのAroA−系統である、請求項36に記載の方法。
【請求項38】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムがサルモネラ チフィムリウムのAroA−,dam−系統である、請求項36に記載のDNAワクチン。
【請求項39】
機密密封された無菌容器に梱包された請求項1に記載のワクチンを含み、前記容器が該容器に貼付されたラベルを有し、前記ラベルが前記ワクチンを識別し、前記ワクチンを患者に投与する個人に有用な情報を提供する印刷物を有する、製品。
【請求項40】
癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を含む単離されたプラスミドベクター。
【請求項41】
癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を含むベクターが形質移入された形質転換宿主細胞。
【請求項42】
癌関連IAPファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするDNA構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含むDNAワクチンの有効な免疫応答を誘導する量を哺乳動物に投与する段階を含み、それによって前記哺乳動物が、ワクチンによって誘導され腫瘍細胞に特異的な免疫応答を示す、癌に対して哺乳動物にワクチン接種する方法。
【請求項43】
前記DNA構築体によってコードされる前記癌関連IAPファミリータンパク質が、サービビン(survivin)タンパク質及びリビン(livin)タンパク質からなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
【請求項44】
前記DNA構築体によってコードされる前記免疫活性遺伝子産物が、サイトカインであり、又はナチュラルキラー細胞表面受容体に対するリガンドである、請求項42に記載の方法。
【請求項45】
前記哺乳動物がヒトである、請求項42に記載の方法。
【請求項46】
前記DNA構築体が弱毒細菌ベクターに作用可能に組み込まれている、請求項42に記載の方法。
【請求項47】
前記弱毒細菌ベクターが、弱毒サルモネラ チフィムリウム、サルモネラ チフィ、シゲラ種、バチルス種、ラクトバチルス種、BCG、エシェリキア コリ、ビブリオ コレレ、カンピロバクター種及びリステリア種からなる群から選択される、請求項46に記載の方法。
【請求項48】
前記弱毒細菌ベクターが弱毒サルモネラ チフィムリウムである、請求項46に記載の方法。
【請求項49】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムがサルモネラ チフィムリウムのAroA−系統である、請求項48に記載の方法。
【請求項50】
前記弱毒サルモネラ チフィムリウムがサルモネラ チフィムリウムのAroA−,dam−系統である、請求項49に記載のDNAワクチン。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図29−A】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図38−A】
【図38−B】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図29−A】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図38−A】
【図38−B】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【公表番号】特表2006−523217(P2006−523217A)
【公表日】平成18年10月12日(2006.10.12)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−507511(P2006−507511)
【出願日】平成16年3月24日(2004.3.24)
【国際出願番号】PCT/US2004/008932
【国際公開番号】WO2004/099389
【国際公開日】平成16年11月18日(2004.11.18)
【出願人】(501318914)ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート (23)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成18年10月12日(2006.10.12)
【国際特許分類】
【出願日】平成16年3月24日(2004.3.24)
【国際出願番号】PCT/US2004/008932
【国際公開番号】WO2004/099389
【国際公開日】平成16年11月18日(2004.11.18)
【出願人】(501318914)ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート (23)
【Fターム(参考)】
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