自己免疫疾患を治療する方法
自己免疫疾患を患う患者を処置する方法が開示される。本出願の方法は、初めに、たとえば抗‐胸腺細胞抗体を投与することにより、哺乳動物の循環するリンパ球を枯渇させること、次に再構築の経過中に、治療的有効量の潜在型ＴＧＦ‐βおよび／または制御性Ｔ細胞の増殖を促進する別の因子を哺乳動物に投与することを含む。ある側面では、開示されたプロセスが結果として腎臓機能および生存率を改善する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔0001〕本出願は２００６年４月１２日に出願された米国仮出願番号６０／７４４，７１３に対する優先権を主張し、それをそのまま参照として本明細書に援用する。
【０００２】
〔0002〕本発明は自己免疫疾患を治療する方法に関する。本発明の方法は、潜在型ＴＧＦ‐βまたは制御性Ｔ細胞を刺激する他の因子（agent、作用物質）の、単独の、または、たとえば抗‐胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）のようなリンパ球枯渇因子と組み合わせた使用を含む。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
〔0003〕自己抗原および／または自己反応性Ｔ細胞に対する抗体の産生は多くの自己免疫疾患の特徴である。自己抗体および自己反応性Ｔ細胞は（たとえば、ループス腎炎でのような）重篤な組織損傷または（たとえば、免疫性血小板減少紫斑病でのような）血液成分の損失を引き起こしうる。
【０００４】
〔0004〕典型的には、自己免疫疾患は、たとえばシクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、およびシクロスポリンのような非特異的免疫抑制剤により治療され、それらは免疫細胞が臓器および組織を冒すことを妨げる。しかし、免疫抑制剤はしばしば重大な副作用（たとえば、毒性、望まない免疫系の抑制など）を伴う。
【０００５】
〔0005〕腫瘍増殖因子（ＴＧＦ‐β）はその免疫抑制作用のために、多発性硬化症および移植片対宿主病を含む、ある種の自己免疫疾患にとっての可能性のある治療薬として提案されてきた。Ｆｌａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１：１３−２０（２００３）。それはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでサプレッサーＴ細胞の生成を誘発するために有用であると報告されている（米国特許第６，７５９，０３５号を参照されたい）。しかし、ＴＧＦ‐βは免疫抑制特性を有する以外に、多能性サイトカインであり、細胞外マトリックス生産および他の生物学的プロセスに関与する。ＴＧＦ‐βに関する総説としては、たとえばＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００１を参照されたい。ＴＧＦ‐βの過剰な、または持続的な発現は器官線維症において役割を果たす（Ｋａｐａｎｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１５２：２１６３−２１６９（１９９５）；Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６：２７１９−２７２４（１９９９）；Ｋｕｗａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０６：１３０−１３５（２００２））が、活性なＴＧＦ‐βの全身投与は容認できない毒性に関連している。とりわけ、慢性進行性多発性硬化症の第I/II相治験において、活性なＴＧＦ‐β２の全身投与は、糸球体濾過速度の減少によって立証されるように、結果として容認できない腎毒性を生じた。Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５１：２８９−２９２（１９９８）。この結果は活性なＴＧＦ‐βの全身投与を含む、治療のそれ以上の臨床的発展を妨げている。従って、付随する毒性を招くことなく、ＴＧＦ‐βの免疫抑制能力を選択的に利用する挑戦が依然として続けられている。その上、望ましくない副作用を起こさずに、自己反応性免疫の抑制を可能にする、自己免疫疾患の治療方法を開発する必要性が依然として残っている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
〔0006〕本発明は部分的に、活性なＴＧＦ‐βの全身毒性を回避するために潜在型ＴＧＦ‐βが使用され得るという発見および証明に基づく。潜在型ＴＧＦ‐βの活性化は、蛋白質分解、活性酸素種への暴露、ならびにトロンボスポンジンおよび他の蛋白質との相互作用を含む、いくつかの機序を通してｉｎ ｖｉｖｏで出現しうる潜在型結合ペプチド（ＬＡＰ）の除去を必要とする。Ｍｕｒｐｈｙ−Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．，１１：５９−６９（２０００）。ルーパス患者の腎臓でのように、自己免疫性炎症の部分においてそのような異常が起こる可能性があることは理論化されているが、本発明の目的のためには当てにされていない。炎症および組織傷害の部分において潜在型ＴＧＦ‐βの活性化が起こるため、潜在型ＴＧＦ‐βの使用が全身ＴＧＦ‐βに伴う毒性を回避する可能性がある。従って、ある態様では、本発明の方法は哺乳動物への不活性なＴＧＦ‐β（たとえば潜在型ＴＧＦ‐β）の全身投与を含み、その結果ＴＧＦ‐βの活性化および／または作用は炎症および組織傷害の部位に限定される。
【０００７】
〔0007〕本発明はさらに、部分的に、全身性エリテマトーデスのマウスモデルにおいて、抗‐胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）によるリンパ球の枯渇、続く潜在型ＴＧＦ‐βの投与が腎臓機能を改善すること、および生存率を高めることにおいて有効であるという発見および証明に基づく。従って、本発明のある態様では、宿主リンパ球は潜在型ＴＧＦ‐βの投与前に枯渇し、潜在型ＴＧＦ‐β投与の治療的に望ましい効果が得られる。
【０００８】
〔0008〕ＴＧＦ‐βの治療効果は、部分的に制御性Ｔ細胞の増殖に対するＴＧＦ‐βの刺激効果に起因することがさらに理論化されているが、本発明の目的のためには当てにされていない。従って、本発明のある態様では、制御性Ｔ細胞の増殖を促進する別の因子が、潜在型ＴＧＦ‐βのかわりに、またはそれに加えて投与されてもよい。
【０００９】
〔0009〕本発明は自己免疫疾患、たとえば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）を患う哺乳動物（たとえばヒト）を治療するための方法を提供する。ある態様では、治療は疾患の進行を遅らせるか、症状を改善させる。本発明はさらに、たとえば、ＳＬＥ、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー症候群、およびベルガー病のような、腎臓機能を損なう自己免疫疾患を患う哺乳動物において腎臓機能を保持するか、または改善する方法を提供する。
【００１０】
〔0010〕いっそう特定の態様では、本発明の方法は以下のステップを含む：
（ａ）哺乳動物において循環するリンパ球を枯渇させること、
（ｂ）リンパ球に再構築を開始させること（“再構築相”）、および
（ｃ）再構築相中に、治療的有効量の潜在型ＴＧＦ‐βおよび／または制御性Ｔ細胞の増殖を促進する別の因子を哺乳動物に投与すること。
【００１１】
〔0011〕ある態様では、リンパ球の枯渇は抗‐胸腺細胞抗体（たとえば、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）、Ａｔｇａｍ（登録商標）、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ（登録商標）、およびＴｅｃｅｌａｃ（登録商標））またはＴ細胞に発現された抗原に対して特異的な別の抗体を投与することによって成し遂げられる。
【００１２】
〔0012〕ひとたび循環するリンパ球が実質的に枯渇してしまえば、それらは再構築を開始する（“再構築相”）ことが可能になる。再構築中、完全な再構築が起こる前に、治療的有効量の１種以上の以下の因子が哺乳動物に投与される：（１）潜在型ＴＧＦ‐β（たとえば、ＴＧＦ‐β１〜ＴＧＦ‐β３のいずれか１種の潜在型）および／または（２）制御性Ｔ細胞の増殖を促進する１種以上の他の因子（たとえばＩＬ−１０、ＩＬ−１０とＩＬ−４、ＩＬ−１０とＩＦＮ−α、ビタミンＤ３とデキサメタゾン、ビタミンＤ３とミコフェノール酸モフェチル、およびラパマイシン）
〔0013〕ある態様では、腎臓機能が自己免疫疾患のために損なわれる場合、たとえば、全身血圧、蛋白尿、アルブミン尿、糸球体濾過速度、および／または腎血流量における変化によって示されるように、治療方法が結果として哺乳動物の腎臓機能を改善する（たとえばその損失の進行を遅らせる）。
【００１３】
〔0014〕前述の概要および以下の詳細な説明は、主張したように代表的で説明的なだけであって、本発明を制限するものではない。
発明の詳細な説明
〔0025〕本発明は自己免疫疾患を患う哺乳動物の治療の方法を提供する。特定の態様では、そのような方法は、腎臓機能を損なう自己免疫疾患を患う哺乳動物において腎臓機能を改善する方法を含む。ある態様では、本発明の方法は哺乳動物への潜在型ＴＧＦ‐βの全身投与を含み、ここでＴＧＦ‐βの活性化および／または作用は炎症および組織傷害の部位に限定される。
【００１４】
〔0026〕ある態様では、本発明の方法は以下のステップを含む：
（ａ）哺乳動物の循環するリンパ球を枯渇させること、
（ｂ）リンパ球に再構築を開始させること、および
（ｃ）（ｂ）の再構築相中に、治療的有効量の潜在型ＴＧＦ‐βおよび／または制御性Ｔ細胞の増殖を促進する別の因子を哺乳動物に投与すること。
【００１５】
リンパ球枯渇
〔0027〕循環するリンパ球の枯渇は哺乳動物にリンパ球枯渇剤を投与すること、さもなければ哺乳動物のリンパ様細胞（たとえば、リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、および／または樹状細胞など）の実質的な画分が消失することになる条件に哺乳動物を曝すことにより成し遂げることができる。枯渇されることになるリンパ球は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）および／またはＴおよびＢリンパ球であってもよい。枯渇相において、Ｔ細胞数は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上減らされ、そして場合によりＢリンパ球（Ｂ細胞）数は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上減らされる。好ましい態様では、枯渇したリンパ球は主にＴ細胞であり、このことは枯渇したＴ細胞の割合が枯渇したＢ細胞の割合より大きい（たとえば、１．２−、１．５−、２−、５−、１０倍またはそれ以上）ことを意味する。
【００１６】
〔0028〕リンパ球枯渇のレベルは、たとえば末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の量を測定することにより容易に評価することができる。リンパ球数は慣用の臨床研究所技術（たとえば、フローサイトメトリー）を使用して測定することができる。ヒトにおける正常なＰＢＬレベルの参照値は表１に示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】
〔0029〕ある態様では、リンパ球枯渇剤は、抗‐リンパ球抗体、たとえば抗‐Ｔ細胞抗体、たとえば、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）、Ａｔｇａｍ（登録商標）、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ（登録商標）、およびＴｅｃｅｌａｃ（登録商標）のような抗‐胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）である。ＡＴＧは胸腺細胞に対して産生されるポリクローナル抗体である。現在市場で取引されるＡＴＧ製品はある種（たとえばヒト）から別の種（たとえば、ウサギまたはウマ）に胸腺細胞を注射することによって産生される。ＡＴＧはリンパ球表面抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＨＬＡ ＤＲ、およびＨＬＡクラスＩのような細胞表面蛋白質に結合する（Ｂｏｕｒｄａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５９：１１９４−１２００（１９９５））。ＡＴＧは主にＴ細胞枯渇の結果として免疫抑制を誘発すると考えられていて（たとえば、Ｂｏｎｎｅｆｏｙ−Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５１：６６９−６７３（１９９１）を参照されたい）、以前は臓器移植の際に拒絶のリスクを軽減するために移植患者の前処理に使用されていた。
【００１９】
〔0030〕ＡＴＧの他に、リンパ球枯渇剤は、１種以上の特異的なリンパ球表面抗原に対して産生されるモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、たとえば、抗‐ＣＤ５２抗体（たとえば、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））抗‐ＣＤ３抗体（たとえば、ＯＫＴ３（登録商標））、抗−ＣＤ４抗体（ＯＫＴ（登録商標））、抗−ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）抗体（たとえば、ダクリズマブ）、抗−ＣＤ５抗体、抗−ＣＤ７抗体、抗−ＴＣＲ抗体、抗−ＣＤ２（たとえば、Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ（登録商標））、または先に特定した他のリンパ球表面抗原のいずれかに対する抗体などから構成されるか、またはそれを含む。
【００２０】
〔0031〕ある態様では、リンパ球枯渇剤はコルチコステロイドである。
〔0032〕ある態様では、リンパ球を枯渇させることになる条件はガンマ線放射への暴露である。
【００２１】
〔0033〕リンパ球を枯渇させるためのいずれか適切な因子および／または条件の組み合わせも使用することができる。
再構築相
〔0034〕枯渇相に続いて、哺乳動物のリンパ球は、リンパ球枯渇剤を取り除くか、またはリンパ球を消失させることになる条件を緩和することにより、再構築を開始することができる。
【００２２】
〔0035〕ある場合には、ステップ（ｃ）の因子（すなわち、ＴＧＦ‐βまたは特に制御性Ｔ細胞を刺激する別の因子）が補充相の開始時に速やかに哺乳動物に投与されうるが、別の場合には因子は再構築が一部始まった後で投与される。ステップ（ｃ）の因子が哺乳動物に投与される前に、リンパ球は枯渇前のレベルに比較して５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれより低いレベルまで再構築することを許されてもよい。
【００２３】
〔0036〕ヒトでは、リンパ球は枯渇剤に依存して、異なる速度で枯渇前のレベルに再構築する。たとえば、ＡＴＧでは完全な再構築に２〜４時間掛かってもよいが、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）による治療後は、再構築に数年間かかってもよい。従って、ある態様では、リンパ球枯渇相の終了時からステップ（ｃ）因子の投与までに掛かる時間は、たとえば０、１、２、３、４、５、６日；１、２、３、４または５週間、またはそれより長い。
【００２４】
ＴＧＦ‐β
〔0037〕ある態様では、本発明の方法は投与後に活性化される不活性なＴＧＦ‐βの投与を含む。ある態様では、不活性なＴＧＦ‐βは潜在型ＴＧＦ‐βの形状で投与される。別の態様では、不活性なＴＧＦ‐βはＴＧＦ‐βをコードするＤＮＡの形状で投与され、それが誘導によって活性なＴＧＦ‐β１を発現する。
【００２５】
〔0038〕ＴＧＦ‐βは生物学的に活性なＴＧＦ‐βがそのプロドメイン（“潜在型結合ペプチド”、ＬＡＰ）と非競合的に結合している、いわゆる“低分子潜在型複合体”（１００ｋＤａ）と、付加的に潜在型ＴＧＦ‐β結合蛋白質（ＬＴＢＰ）を含む、いわゆる“高分子潜在型複合体”（２２０ｋＤａ）のいずれかで自然に分泌される。潜在型は活性な、すなわち成熟したＴＧＦ‐βが複合体から遊離されるまでＴＧＦ‐β受容体に結合することは不可能である。潜在型および活性化プロセスについてのより詳細な総説としては、たとえばＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００１，ｐｐ．７２４−７２５を参照されたい。本明細書で使用する“潜在型ＴＧＦ‐β”という用語は、ＬＡＰと（競合的に、または非競合的に）、そして場合により、付加的にＬＴＢＰと（競合的に、または非競合的に）結合したＴＧＦ‐βを表す。従って、該用語は低分子および高分子潜在型ＴＧＦ‐β複合体を表す。所望する位置および期間で活性化されうる不活性なＴＧＦ‐βの他の形状もまた本発明の方法において有用であろう。ＴＧＦ‐βには３種の既知の哺乳動物イソ型（ＴＧＦ‐β１〜ＴＧＦ‐β３）があり、それらのすべてはお互いの間で相同（６０〜８０％同一性）である。３種の哺乳動物イソ型の蛋白質受託番号の部分的なリストは表２に提供し；ヒトＴＧＦ‐βのアラインメントは図１に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
ＴＧＦ‐βならびにＴＧＦ‐β受容体の構造的および機能的側面は公知である。たとえば、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００１を参照されたい。従って、１種以上のＴＧＦ‐β受容体（ＴＧＦ‐βＲＩ、ＴＧＦ‐βＲＩＩ、またはＴＧＦ‐βＲＩＩＩ）に結合する能力を保持する、工学的に操作されたＴＧＦ‐βの不活性化された形状は、本発明の方法にも有用であろう。そのような工学的に操作されたＴＧＦ‐βの不活性化された形状は自然に存在するＴＧＦ‐βの部分的な、または変異したアミノ酸配列だけを含んでいてもよい。たとえば、工学的に操作されたＴＧＦ‐βの不活性化された形状は、保存的置換が行われ、および／または非必須アミノ酸が欠失した生来の配列を含んでいてもよい。たとえば、それらはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ｎの１１２アミノ酸Ｃ末端部分の全長にわたる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ｎのこのＣ末端部分に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含んでいてもよく、ここでｎ＝１、２または３である。
【００２８】
制御性Ｔ細胞増殖を促進する因子
〔0039〕ある態様では、本発明の方法は制御性Ｔ細胞増殖（expansion）を促進する因子の投与を含む。制御性Ｔ細胞（ＴｒｅｇまたはサプレッサーＴ細胞としても公知）は接触‐依存的または接触‐非依存的（たとえば、サイトカイン産生）機序を介して他のリンパ様細胞の増殖および／または機能を阻止することが可能な細胞である。γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびダブルネガティブＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞を含む、いくつかの型の制御性Ｔ細胞が記載されている。たとえば、Ｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：１８９−９８（２００３）を参照されたい。いわゆる“自然に存在する”制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｃ２５＋であり、フォークヘッドファミリー転写因子ＦＯＸＰ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐ３）を発現する。ＦＯＸＰ３‐発現ＣＤ４＋Ｃ２５＋に加え、少数集団のＣＤ８＋ＦＯＸＰ３‐発現細胞も制御性Ｔ細胞である。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇはさらに、Ｔｒ１細胞およびＴ−ヘルパー３（Ｔｈ３）細胞のような、インターロイキン‐１０（ＩＬ−１０）およびＴＧＦ‐βを分泌する、誘導型制御性Ｔ細胞に分割することができる。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の付加的な表面マーカーには、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、表面ＴＧＦ−β、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４およびＣＤ６２Ｌが挙げられる。種々の型の制御性Ｔ細胞についての詳細な総説としては、たとえば、Ｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６２（１）：１（２００５）；Ｊｏｎｕｌｅｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：６３２３−６３２７（２００３）；Ｈｏｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．，７４：４７１−４７８（２００３）を参照されたい。
【００２９】
〔0040〕従って、ある態様では、刺激されている制御性Ｔ細胞は１種以上の以下の群を含む：（１）ＩＬ−１０を発現する制御性Ｔ細胞；（２）ＴＧＦ‐βを発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞およびＴｈ３細胞を含む）；（３）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（付加的なマーカーＣＤ４５ＲＢ＋、ＣＤ３８＋、ＧＩＴＲ、表面ＴＧＦ−β、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４および／またはＣＤ６２Ｌを有する細胞を含む）；（４）ＦＯＸＰ３−発現Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞を含む）；（５）γδＴ細胞；（６）ＮＫＴ細胞；および（７）ダブルネガティブＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞。
【００３０】
〔0041〕直接免疫抑制活性に加えて、ＴＧＦ‐βはまた制御性Ｔ細胞を刺激することが可能であってもよい。Ｇｏｒｅｌｉｋ ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２：４６−５３（２００２）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８：１８７５−１８８６（２００３）；Ｍａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，７：１０６１−１０６７（２００５）；Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７３：６５２６−６５３１（２００４）。
【００３１】
〔0042〕制御性Ｔ細胞の増殖を促進するＴＧＦ‐β以外の因子の例としては以下のものが挙げられる：（１）ＩＬ−１０；（２）ＩＬ−１０およびＩＬ−４；（３）ＩＬ−１０およびＩＦＮ−a；（４）ビタミンＤ３およびデキサメタゾン；（５）ビタミンＤ３ ミコフェノール酸モフェチル；および（６）ラパマイシン（たとえば、Ｂａｒｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９５：６０３−６１６（２００２）；Ｊｏｎｕｌｅｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：６３２３−６３２７（２００３）；Ｇｒｅｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：１９４５−１９５３（２００１）；Ｂａｔｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：４７４３−４７４８（２００５）を参照されたい）。
【００３２】
〔0043〕ある態様では、因子の欠如とは反対に、その存在における、たとえば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、またはそれ以上の制御性Ｔ細胞増殖の増加は制御性Ｔ細胞増殖を促進する因子の能力を表すと見なされている。ＴＧＦ‐βおよび他の因子は、常法を使用して制御性Ｔ細胞増殖を促進する能力についてアッセイされうる。より頻繁に使用されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのいくつかの例としては以下のものが挙げられる：
〔0044〕（１）フローサイトメトリー解析、ここではＣＤ４、ＣＤ２５、および／またはＦＯＸＰ３、および／またはＣＤ６２Ｌ、および／またはＧＩＴＲ、および／またはＣＴＬＡ４、および／または表面ＴＧＦ−β、および／またはＤ１０３、および／またはＣＤ１３４の共発現が制御性Ｔ細胞表現型の指標として使用される（たとえば、上記のＪｏｎｕｌｅｉｔを参照されたい）；
〔0045〕（２）たとえば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８：１８７５−１８８６（２００３）に記載のような、共培養システムにおけるＴ細胞増殖の阻止。（このアッセイでは、制御性Ｔ細胞は反応性Ｔ細胞に添加され、共培養は抗‐ＣＤ３または同種異系リンパ球により刺激される。制御性Ｔ細胞の存在下では、反応性Ｔ細胞はこれらの刺激に反応して増殖することが不可能になる。増殖の程度は典型的にはトリチウム化されたチミジン取込によって測定される）；および
〔0046〕（３）たとえば、Ｂａｒｒａｔ，上記、およびＪｏｎｕｌｅｉｔ、上記、に記載のような、サイトカインプロファイリング。（このアッセイでは、培養した制御性Ｔ細胞由来の上清は、制御性Ｔ細胞によって生産されることが公知の、たとえばＩＬ−１０およびＴＧＦ‐βのような免疫抑制性サイトカインの存在について分析される。
【００３３】
用途
〔0047〕本発明の方法を使用して、たとえば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および自己免疫リウマチ性関節炎（ＲＡ）のような自己免疫疾患を有する哺乳動物を治療することができる。哺乳動物の例としてはヒトまたは他の霊長類（たとえば、チンパンジー）、齧歯類（たとえば、マウス、ラット、またはモルモット）、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、およびブタが挙げられる。疾患を患う対象によっては、治療により疾患の進行を阻止し、および／または症状を改善することが期待される。
【００３４】
〔0048〕付加的な自己免疫疾患の例としては、インスリン‐依存的糖尿病（ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、セリアック病、自己免疫甲状腺病、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、自己免疫性肝炎、皮膚自己免疫疾患、自己免疫性拡張型心筋症、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、血管炎（たとえば、高安動脈炎およびウェゲナー肉芽腫症）、筋肉の自己免疫疾患、精巣の自己免疫疾患、自己免疫性卵巣疾患、自己免疫性ブドウ膜炎、グラーブ病、乾癬、強直性脊椎炎、アジソン病、橋本甲状腺疾患、突発性血小板減少性紫斑病、および尋常性白斑が挙げられる。
【００３５】
〔0049〕本発明の方法は自己免疫の進行を遅らせ、少なくとも一部の症状を改善し、および／または生存率を高めることが期待されている。たとえば、本発明の方法が結果として自己抗体、自己抗体を産生するＢ細胞、および／または自己反応性Ｔ細胞のレベルを減少させてもよい。これらのパラメータのいずれかの減少は、たとえば、治療前のレベルに比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、７０％またはそれ以上でありうる。
【００３６】
〔0050〕本発明はさらに、腎臓機能を損なう自己免疫疾患を患う哺乳動物の腎臓機能を保持するか、または改善する方法を提供する。腎臓機能を損なう可能性がある自己免疫疾患の例としては、ＳＬＥ（たとえば、ループス腎炎）、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症（ウェゲナー症候群）、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、およびＩｇＭ腎症が挙げられる。そのような疾患に苦しむ患者によっては、たとえば全身血圧、蛋白尿、アルブミン尿、糸球体濾過速度、および／または腎血流量の変化によって示されるような、治療による腎臓機能の改善（たとえば、腎臓機能の損失の進行を遅らせる、機能を保持する、または改善する）が期待される。
【００３７】
〔0051〕“腎臓機能”という用語は、その生理的機能、たとえば圧濾過、選択的再吸収、尿細管分泌、および／または全身血圧調節を行う腎臓の能力を表す。腎臓機能を評価する方法は当該技術分野で公知であり、以下のものが挙げられるがそれらに限定されない：全身および糸球体毛細管血圧、蛋白尿、アルブミン尿、顕微鏡的および肉眼的血尿、血清クレアチニンレベル（たとえば、ヒトの腎臓機能を推定する１つの式は、２．０ｍｇ／ｄｌのクレアチニンレベルを５０％、そして４．０ｍｇ／ｄｌを２５％の正常腎臓機能とみなす）、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）の減少（たとえば、クレアチニンクリアランスの速度によって表される、またはイヌリンアッセイを使用）、および尿細管傷害の程度。
【００３８】
〔0052〕腎臓機能および関連する疾患状態の詳細な総説としては、Ｔｈｅ Ｋｉｄｎｅｙ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．編，３版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０００を参照されたい。通常、０．１５ｇ未満の蛋白質が２４時間で尿に排泄される。ほとんどすべての型の腎臓疾患は尿に軽度（１日に５００ｍｇまで）から中等度（１日４ｇまで）の蛋白質漏出を引き起こす。尿中の正常なアルブミン濃度は１．０ｍｇ／ｄｌ未満である。一般に、３０〜３００ｍｇ／ｄｌの尿中アルブミンはミクロアルブミン尿と見なされ、３００ｍｇ／ｄｌより多いものはマクロアルブミン尿と見なされる。血清クレアチニンの正常値は男性の場合０．６〜１．５ｍｇ／ｄｌ、女性の場合０．６〜１．１ｍｇ／ｄｌである。クレアチニンレベル、腎臓機能、および腎臓疾患のステージ間の関係は表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
〔0053〕従って、本発明の方法は低下した、または減少した腎臓の余力、腎機能不全、腎不全、または末期腎臓疾患を伴う自己免疫疾患を有する患者において有用であってもよい。たとえば、本発明の方法は、ミクロアルブミン尿、マクロアルブミン尿、および／または２４時間につき１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ｇまたはそれを越える蛋白尿レベル、および／または約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、７．０、８．０、９．０、１０ｍｇ／ｄｌまたはそれ以上の血清クレアチニンレベルを有する患者に使用されてもよい。
【００４１】
〔0054〕ある態様では、本発明の方法は対照被験者に比較して、尿中に分泌される蛋白質（蛋白尿）の量、尿中に分泌されるアルブミン（アルブミン尿）の量、および／または患者の血清クレアチニンレベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれより多く減少させる。別の態様では、本発明の方法は対照被験者に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれより多く腎臓機能の損失の進行を遅らせる。腎臓機能を評価するための限定的でない説明的な方法は本明細書、およびたとえばＷＯ０１／６６１４０に記載される。
【００４２】
投与方法
〔0055〕本発明の方法では、“投与”はいずれか特定の送達システムに限定されず、そして限定することなく、非経口的（皮下、静脈内、骨髄内、関節内、筋肉内、または腹腔内注射を含む）、直腸内、局所、経皮、または経口（たとえば、カプセル、懸濁液、または錠剤で）を含んでいてもよい。個体への投与は、単回用量または反復投与で、そして多様な生理学的に受容可能な塩型のいずれかで、および／または医薬組成物の一部としての受容可能な医薬キャリアおよび／または添加物と共に行われてもよい。生理的に受容可能な塩型および標準医薬製剤技術および賦形剤は当業者に公知である（たとえば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ（登録商標））２００５，５９版，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，２００４；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｄｏ ｅｔ ａｌ．編，２１版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５を参照されたい）。
【００４３】
〔0056〕潜在型ＴＧＦ‐βはまた、たとえばＫｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２（１）：４１−５２ （２０００）に記載のように、遺伝子治療によって（すなわち、適切なベクター中のＴＧＦ‐βをコードするＤＮＡを投与することによって）投与されうる。
【００４４】
〔0057〕Ｔｒｅｇを促進する因子で、リンパ球枯渇剤である潜在型ＴＧＦ‐βの適切な有効量は、治療する医師によって選択され、およそ０．０１μｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇまで、０．１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまで、１μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、１０μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇまで、１００μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、および５００μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまでに及ぶことになる。その上、実施例において、またはＰＤＲ（登録商標）２００５および後の版において示された特定の投与量を使用して、所望する投与量に到達してもよい。たとえば、米国において現在認可されているサイモグロブリン（登録商標）の使用としては、臓器移植（２〜１４日間で１ｍｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇまで）および再生不良性貧血（５日間で２．５ｍｇ／ｋｇから３．５ｍｇ／ｋｇまで）が挙げられる。
【００４５】
〔0058〕ある動物で達成された有効投与量は、当該技術分野で公知の変換因子を使用して、ヒトを含む別の動物における使用のために変換されてもよい。たとえば、等価な表面積投与量因子に関してはＦｒｅｉｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，５０（４）：２１９−２４４（１９６６）および表４を参照されたい。自己免疫疾患モデルおよび適切な方法は、たとえば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（編）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００５に見いだすことができる。
【００４６】
【表４】
【００４７】
〔0059〕以下の実施例は説明のために提供され、限定することを意図しない。
【実施例】
【００４８】
活性化されたＴＧＦ‐β１の効能評価
〔0060〕組換えヒト潜在型ＴＧＦ‐β１はＣＨＯ細胞（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）において生産された。潜在型ＴＧＦ‐β１からのＬＡＰの分裂は酸性化によって達成された。ＬＡＰ−ＴＧＦ−β１はアッセイ液（ＤＭＥＭプラス非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、および１０％ ＦＢＳ）で２００ｎｇ／ｍＬに希釈した。希釈した試料５００マイクロリットルは１Ｎ ＨＣｌを１００μＬ添加することにより活性化し、室温で２０分間インキュベーションした。その後、試料は１００μＬの１．２Ｎ ＮａＯＨ／０．５Ｍ ＨＥＰＥＳで中和した。
【００４９】
〔0061〕活性化したＴＧＦ‐β１試料は、Ａ５４９ Ｃｅｌｌ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙを使用して分析し、活性はヒト組換えＴＧＦ‐β２（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）対照に比較して評価した。Ａ５４９ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙはヒト肺上皮細胞系統、Ａ５４９によるＴＧＦ‐β１‐誘発ＩＬ−１１遊離に基づき、そしてＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７６：Ｌ１７５−Ｌ１８５（１９９９）に記載される。ＴＧＦ‐β１に反応したＡ５４９からのＩＬ−１１遊離は、ＥＬＩＳＡ手順（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して測定した。
【００５０】
マウスルーパスモデル
〔0062〕動物および試薬− 雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得て、５〜６週齢で受け入れた。ＡＴＧはＢａｌｂ／ｃマウス胸腺細胞でウサギを免疫化することにより生成された。ウサギは０日目に５ｘ１０７の新鮮な胸腺細胞の皮下注射により免疫され、１４日目に５ｘ１０７の新鮮な胸腺細胞を静脈内にブースター注射された。２０、２２、および２５日目に集めた血清をプールし、ＩｇＧ画分はクロマトグラフィーおよび、硫酸ナトリウム沈殿により分離した。投薬をうけていない（ｎａｉｖｅ）ウサギ由来のＩｇＧの市販調製物（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を陰性対照として使用した。組換えヒト潜在型ＴＧＦ‐β１はＣＨＯ細胞（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）中で生産された。シクロホスファミドはＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から購入した。
【００５１】
〔0063〕治療（treatment、処置）− 動物は蛋白尿、アルブミン尿、および２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対するＩｇＧ抗体の力価について３週間毎にモニターした（以下を参照されたい）。治療的処置は動物がｄｓＤＮＡに対する抗体を産生し始めた、および／または１２〜１３週齢で蛋白尿が高まった時に開始した。５００μｇ（〜２５ｍｇ／ｋｇ）の２回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射からなるＡＴＧまたは対照ウサギＩｇＧによる処置は、３日間離して（０日目と３日目）行われた。潜在型ＴＧＦ‐β１はマウス毎に４μｇのｉ．ｐ．注射を毎日、１２日間として１４日目から２５日目まで与えられた。潜在型ＴＧＦ‐β１の４μｇの用量は、分子の活性な（成熟、非ＬＡＰ‐結合）部分の１μｇ（〜０．０５ｍｇ／ｋｇ）に相当する。シクロホスファミドは陽性対照として使用され、１２〜１３週齢から２４〜２５週齢における試験の終了まで、１００ｍｇ／ｋｇの用量で毎週、ｉ．ｐ．送達された。処置群は対照ウサギＩｇＧ、対照ウサギＩｇＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１、ＡＴＧ、ＡＴＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１、またはシクロホスファミドからなり、１群につき、動物は１０匹であった。
【００５２】
〔0064〕蛋白尿およびアルブミン尿− 個々のマウスの尿中の蛋白質レベルは、総蛋白質濃度を測定するためにデザインされた比色法を使用して測定した。尿中のアルブミンレベルは定量的ＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。
【００５３】
〔0065〕２４時間尿回収は、マウスを別個の代謝ケージに入れることによって３週間毎に実施した。蛋白尿は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のＭｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ−ＰＲ（登録商標）キットを使用して測定した。手短に述べると、尿はピロガロールレッド‐モリブデン酸塩複合体を含む試験溶液に添加した。混合物は３７℃で１０分間、インキュベーションし、蛋白質の塩基性アミノ基に試薬を結合させ、６００ｎＭに吸光度をシフトさせた。６００ｎＭでの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）の増加は蛋白質濃度に直接比例し、参照標準を使用して、以下の式に従って試験試料の蛋白質濃度が測定された：
【００５４】
【化１】
【００５５】
〔0066〕尿中アルブミンレベルは取扱説明書に従って、間接的競合的ＥＬＩＳＡキット（Ｅｘｏｃｅｌｌ Ｉｎｃ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡのＡｌｂｕｗｅｌｌ Ｍ）を使用して評価した。手短に述べると、尿試料の系列２倍希釈物はマウスアルブミンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートのデュプリケートウェルに添加された。次にウサギ抗‐マウスアルブミン抗体がウェルに添加され、試料中のアルブミンとウェルに結合したアルブミンへの抗体の結合を競合させた。この後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）‐結合抗‐ウサギイムノグロブリンとＨＲＰ基質を添加し、ウェルに結合したウサギ‐抗‐マウスアルブミン抗体の量を検出した。４５０ｎｍでのＯ．Ｄ．は尿試料中のアルブミン量の対数に逆比例した。尿試料中のアルブミン濃度は、既知のマウスアルブミン濃度で得られた標準曲線から導かれた。
【００５６】
〔0067〕抗‐ｄｓＤＮＡ ＥＬＩＳＡ− 個々のマウスから得られた血清試料中のｄｓＤＮＡに対するＩｇＧ抗体の力価はＥＬＩＳＡによって測定した。
〔0068〕個々のマウスから得られた血清試料は３週間毎に回収した。ｄｓＤＮＡに対する抗体の力価はＥＬＩＳＡにより評価した。マウス２本鎖ＤＮＡ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により消化して１本鎖ＤＮＡをすべて除去し、その後それを使用して９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを一晩、４℃でコーティング（１μｇ／ｍｌ ｄｓＤＮＡをウェルにつき１００μｌ）した。プレートは水中０．０１％の硫酸プロタミンで前処理（１５０μｌ／ウェル、室温で９０分間）し、ＤＮＡの接着を促進させた。コーティング後、プレートは２．５％ＢＳＡブロッキングバッファーで１時間、３７℃でインキュベーションした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ‐結合ヤギ抗‐マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を添加し、ｄｓＤＮＡに結合した抗体を検出した（３７℃、１時間）。洗浄後、ＨＲＰ基質を３０分間、室温で添加し、２波長プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で、参照波長６５０ｎＭを使用して、比色法で測定した生成物のＯ．Ｄ．を４９０ｎＭで読み取った。抗体力価は、０．１より大きいか、またはそれに等しいＯ．Ｄ．を与える血清の希釈の逆数として定義した。正常マウス血清は陰性対照（力価＜２００、試験された最も低い希釈）として使用し、老齢のＭＲＬ／ｌｐｒルーパスマウスの血清は陽性対照（力価６４００〜２５６００）として使用した。
【００５７】
〔0069〕組織構造− 腎臓は予定した致死時に、または安楽死を必要とする瀕死の動物由来の試験の経過中に、組織学的解析のために回収した。腎臓は縦方向に薄く切り、バッファーで中和したホルマリンで固定した。約５μｍの切片はヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）および過ヨウ素酸‐Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）染色により染色した。スライドは、表５Ａおよび５Ｂに記載のスコアリングシステムに従って、糸球体形態、間質の炎症、および蛋白円柱に対して病理学者によりスコアが付けられた。
【００５８】
【表５Ａ】
【００５９】
【表５Ｂ】
【００６０】
〔0070〕統計− 統計学的解析はＴｕｒｋｅｙの多重比較検定を使用して行い、処置群間に有意差が存在するかどうかを確認した。０．０５以下に等しいか、それ未満のＰ値は統計的に有意であると見なされた。
【００６１】
〔0071〕蛋白尿およびアルブミン尿− ＡＴＧまたは潜在型ＴＧＦ‐β１だけ（対照Ｉｇ＋ＴＧＦβ１）による処置は大部分蛋白尿の発症を阻止することができなかった（図２）が、試験の終わりまでには、これらの単一因子処置群では対照Ｉｇにより処置したマウスに比較して、重篤な蛋白尿（＞５００ｍｇ／ｄｌ／日）の発生率はわずかに低下した（それぞれ、６０〜６７％対９０％）（図３）。対照的に、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせによる処置は蛋白尿の発生率（３０％対９０％）と重症度を著しく阻止し、これらの２種の因子間の相乗作用を示唆した（図２および３）。
【００６２】
〔0072〕ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせにより処置されたマウス尿中の総蛋白質レベルにおいて観察された減少は、また尿アルブミンレベルの測定値に反映された（図４および５）。ＥＬＩＳＡ定量は、アルブミン尿の発生率および重症度が、陰性対照Ｉｇ群または単一因子処置群（ＡＴＧ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦβ１）のいずれかと比較して、組み合わせ処置により処置したマウスにおいてかなり低下することを示した。
【００６３】
〔0073〕ｄｓＤＮＡに対する抗体‐陰性対照群（正常ウサギＩｇ）ならびに潜在型ＴＧＦ‐β１＋対照ＩｇおよびＡＴＧ処置群のマウスの大部分は、同じような反応速度で、次第にＩｇＧ抗体力価を上昇させ始めた。対照的に、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせにより処置された群の抗‐ｄｓＤＮＡ力価の上昇はかなり遅延した（図６）。糸球体における免疫複合体（ＤＮＡ‐抗−ＤＮＡ複合体）の沈着はルーパスに特有の炎症および腎臓病理において重要な役割を果たすと考えられている。しかし、試験終了時の抗体力価と蛋白尿の程度間の相関関係が低かったため、組み合わせ処置群のｄｓＤＮＡに対する抗体産生における明白な阻止は、腎臓機能の保存を十分に説明することができなかった。
【００６４】
〔0074〕生存率− ＡＴＧおよび／または潜在型ＴＧＦ‐β１を使用した投与は十分に耐容され、明白な有害事象は全く生じなかった。潜在型ＴＧＦ‐β１＋対照Ｉｇ群の１匹の動物以外は、すべての死亡は非常に高レベルの蛋白尿に関連し、おそらく腎不全に起因した。処置群のすべては、陰性対照ウサギＩｇ‐処置群に比較した場合、生存率の全体的な改善を示した（図７）。最も高度な生存率（１００％）はシクロホスファミドおよびＡＴＧ／潜在型ＴＧＦ‐β１組み合わせ処置群に見られ、次にＡＴＧ（９０％）そして潜在型ＴＧＦ‐β１＋対照Ｉｇ（７０％）処置群の順であった。陰性対照群は試験の終わりまでには生存率は４０％にすぎなかった。
【００６５】
〔0075〕組織構造− 組織学的解析の結果は表６に提示される。ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１で処置されたマウスは、対照マウス、またはＡＴＧだけもしくは潜在型ＴＧＦ‐β１と対照Ｉｇのいずれかを投与されたマウスに比較して、糸球体腎炎の程度が低かった。これらの組織学的所見は、組み合わせ‐処置動物における蛋白尿／アルブミン尿の減少および生存率改善という臨床所見と相関した。
【００６６】
〔0076〕対照ウサギＩｇＧだけで処置した群に比較して、ＡＴＧ、潜在型ＴＧＦ‐β１＋対照ＩｇおよびＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせで処置した群では、炎症スコアのごくわずかの減少が認められた。
【００６７】
【表６】
【００６８】
〔0077〕ＭＲＬ／ＭＰＪ−Ｔｎｆｒｓ６ｌｐｒマウスを用いて、先に記載の同じ治療計画に続いて反復試験が実施された。この場合、試験は（初めの試験の２４週と対比して）４０週齢まで延長され、ＡＴＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１による一過性処置の効果の持続性が評価された。結果は長期生存の利点を示した。対照ウサギＩｇを投与されたマウスにおける３０％生存率、およびＡＴＧで処置された群における１０％生存率に比較して、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１で処置されたマウスでは９０％生存率が観察された。これは、１００％生存率を提供したシクロホスファミドにひけをとらないが、ＡＴＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１による処置は、長期の週毎の注射を必要とするシクロホスファミドとは対照的に、１回の一時的コースであった（図８）。
【００６９】
〔0078〕同様の試験が、自然発症ルーパスの別のモデルである、ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて行われた。同じ治療計画が使用され、これらの条件下では、疾患の経過または重症度に対して、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１、またはいずれかの因子単独による処置に統計的に有意な効果は見られなかった。２つのモデル間の疾患の特徴および反応速度論における差のために、治療計画はＮＺＢ／ＮＺＷＦ１系統に対して最適化される必要があると考えられる。
【００７０】
〔0079〕ＡＴＧ＋ＴＧＦ‐β１の活性の基礎をなす作用機序を検討するために、ＭＲＬ／ｌｐｒルーパスマウスの脾細胞はＡＴＧ＋／−ＴＧＦ‐β１と共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、回収した細胞はＦＡＣＳによりＴｒｅｇの存在について分析した。活性な疾患を有する１０匹のＭＲＬ／ｌｐｒルーパスマウス（〜２５週齢）のプールされた脾細胞は１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを補足した、血清フリーＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に再懸濁した。細胞は以下の６種の異なる条件下で２ｍｌ細胞／ウェルを含む２４ウェルプレートで培養した：１）細胞だけ、２）ＡＴＧ（１００μｇ／ｍｌ）＋活性なＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｇｅｎｚｙｍｅ）、３）ＡＴＧだけ（１００μｇ／ｍｌ）、４）対照ウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）＋活性なＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）、５）対照ウサギＩｇＧだけ（１００μｇ／ｍｌ）、および６）活性なＴＧＦ−β１だけ（１０ｎｇ／ｍｌ）。活性なＴＧＦ‐β１を使用して、通常はｉｎ ｖｉｖｏで起こることになる活性化プロセスを模倣した。細胞は５日間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。それぞれの培養条件に由来する細胞をプールし、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、計数し、そしてＦＡＣＳ解析のために染色した。試料毎に全部で５ｘ１０５細胞をラット抗‐マウスＣＤ４−Ａｌｅｘａ ４８８（Ｃａｔ．Ｎｏ．５５７６６７；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびラット抗‐マウスＣＤ２５−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（Ｃａｔ．Ｎｏ．５５１０７１；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。ＦＯＸＰ３の細胞内検出の場合、表面ＣＤ４／ＣＤ２５について染色された細胞は、一晩透過化処理し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ＦＯＸＰ３染色キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．７２−５７７５）を使用して、取り扱い説明書に従って染色した。処置毎に取得した６，０００個のリンパ球はＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により染色を分析した。結果は、それぞれの培養条件下で回収したそれぞれの表現型の細胞の絶対数（ＦＡＣＳによる陽性細胞の割合ｘ培養物から回収した細胞の総数）として表される。
【００７１】
〔0080〕図９に示すように、回収したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数は、ＡＴＧ＋ＴＧＦ‐β１を含む培養物中で最も多かった。制御性Ｔ細胞は典型的には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋表現型を発現するが、活性化されたＴ細胞もこの表現型を示すことができる。付加的なＦＯＸＰ３染色はＴｒｅｇ表現型の別の証拠を提供し、得られた結果は、ＡＴＧ＋ＴＧＦ‐β１による処置が最も多い数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇを生産したことを確証した。ＡＴＧだけによる処置はまた、この集団（細胞だけに比較して）におけるわずかな増加を導くように見え、そしてその増加はＴＧＦ‐β１の添加により高められた。これらの結果は、ＡＴＧ＋／−ＴＧＦ‐β１による処置がＴｒｅｇの増殖を促進し、そしてそのような細胞が自己免疫の条件下で治療的利点を提供してもよいという仮説を支持する。
【００７２】
関節炎のマウスモデル
〔0081〕ＡＴＧ＋／−ＴＧＦ‐β１の効果はコラーゲン誘発関節炎マウスモデルにおいて試験された。疾患を誘発するために、ＤＢＡ／１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は、０日目に、尾の基部を全容量１００μｌの完全フロイントアジュバント中のウシＩＩ型コラーゲン（Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２−２，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）で免疫化した。不完全フロイントアジュバント中のコラーゲンによるブースター免疫化は２２日目に行われた。２回の５００μｇ（〜２５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射から構成される、ＡＴＧまたは対照ウサギＩｇＧによる処置は、３日間離して（２３日目と２６日目）送達された。潜在型ＴＧＦ‐β１は、マウスごとに１０日間毎日４μｇのｉ．ｐ．注射として２８から３７日目まで投与された。潜在型ＴＧＦ‐β１の４μｇの用量は、分子の活性な（成熟、非ＬＡＰ結合）部分の１μｇ（〜０．０５ｍｇ／ｋｇ）用量に相当した。処置群は、（１）対照ウサギＩｇＧ、（２）対照ウサギＩｇＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１、（３）ＡＴＧ、および（４）ＡＴＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１を含み、１群の動物は１０匹であった。２１日目から始めて、１週間に２〜３回個々のマウスが検査され、疾患の臨床徴候が採点された。関節炎スコアは表７に定義する。
【００７３】
【表７】
【００７４】
〔0082〕ＡＴＧだけの処置は結果として疾患スコアを減少させ、潜在型ＴＧＦ‐β１の添加は試験した条件下では付加的な利点を提供するようには見えなかった。結果は表８に示す。
【００７５】
【表８】
【００７６】
〔0083〕コラーゲン誘発関節炎は短期間動物モデルであり、処置はルーパスモデルの月単位に対して、週単位のタイムスケールで行われる。この短いタイムスケールは、ルーパスモデルで観察された、ＡＴＧと一緒にＴＧＦ‐β１を投与することによって添加される利点を観察するには十分でない可能性がある。したがって、異なる投与計画、または付加的な動物モデルの別の試験がＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐βの組み合わせ投与の利点を示すであろう。
【００７７】
ぶどう膜炎のマウスモデル
〔0084〕ＡＴＧ＋／−ＴＧＦ‐β１の効果はぶどう膜炎のマウスモデルにおいて試験した。疾患を誘発するために、Ｂ１０．ＲＩＩＩマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（カスタム合成，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ）は０日目に、完全フロイントアジュバント中のヒト光受容体間レチノイド結合蛋白質の１６１〜１８０アミノ酸（ＩＲＢＰ１６１−１８０）１００μｇを２カ所（肩甲骨の間と骨盤領域）に皮下注射することにより、免疫化した。個々のマウスに対して１０日目から始める眼底検査が行われ、疾患スコアが割り当てられた。試験を行うために、Ｍｙｄｒｉａｃｙｌ（登録商標）１％（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１２０，ＪＡ Ｗｅｂｓｔｅｒ）を１〜２滴使用することによりマウスの瞳孔を開き、約５分間、暗室で休ませた。マウスは手で押さえ、両眼の網膜は７８ジオプトリーレンズを持つ間接検眼鏡を使用して観察した。表９に記載のように、０〜５までの連続スコアリングシステムを使用して、眼の炎症を採点した。
【００７８】
【表９】
【００７９】
〔0085〕ＡＴＧまたは対照ウサギＩｇＧによる処置は、疾患開始（スコア１）時に始められ、４日間離して（１０日目と１４日目）送達される２回の５００μｇ（〜２５ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射からなる。潜在型ＴＧＦ‐β１はマウス毎に１３日間毎日の、４μｇのｉ．ｐ．注射として１５〜２７日目まで投与された。潜在型ＴＧＦ‐β１の４μｇの用量は、分子の活性な（成熟、非ＬＡＰ結合）部分の１μｇ（〜０．０５ｍｇ／ｋｇ）の用量に相当する。処置群は、（１）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）対照（２）対照ウサギＩｇＧ、（３）対照ウサギＩｇＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１、（４）ＡＴＧ、および（５）ＡＴＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１を含み、１群の動物は６匹であった。
【００８０】
ＡＴＧだけの処置は結果として疾患スコアを減少させ、潜在型ＴＧＦ‐β１の添加は試験した条件下では付加的な利点を提供するようには見えなかった。結果は表１０に示す。
【００８１】
【表１０】
【００８２】
〔0086〕ぶどう膜モデルは短期間動物モデルであり、処置はルーパスモデルの月単位に対して、週単位のタイムスケールで行われる。この短いタイムスケールは、ルーパスモデルで観察された、ＡＴＧと一緒にＴＧＦ‐β１を投与することによって添加される利点を観察するには十分でない可能性がある。したがって、異なる投与計画、または付加的な動物モデルの試験がＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐βの組み合わせ投与の利点を示してもよい。
【００８３】
〔0087〕すべての刊行物、特許、特許出願、および本開示に引用された生物学的結果はそのまま参照として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】〔0015〕ヒトＴＧＦ‐β１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＴＧＦ‐β２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびＴＧＦ‐β３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の前駆体のアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＴＧＦ‐β２は‘長い’オルタナティブにスプライシングされた形状で示され、そこでは２８アミノ酸の挿入が残基１１９で始まるプレ‐プロドメインに見いだされる。矢印は蛋白質分解によるプロセッシング部位を示し、シグナルペプチドおよび成熟Ｃ−末端ＴＧＦ‐β１フラグメントが解裂される。＊はＴＧＦ‐β１およびＴＧＦ‐β３の潜在型結合ペプチド（ＬＡＰ）蛋白質に見いだされるＲＧＤインテグリン認識部位を表す。＋は２つのモノマーＬＡＰ蛋白質間のジスルフィド結合に含まれるシステイン残基を表す。＃は単独ジスルフィド結合ＴＧＦ‐βモノマーの形成に関与するシステイン残基を表す。
【図２】〔0016〕腎臓機能に対するＡＴＧ／潜在型ＴＧＦ‐β１組み合わせ処置の効果を示す。ＭＲＬ／ＭＰＪ−Ｔｎｆｒｓ６ｌｐｒマウス（ＳＬＥのマウスモデル）は、ＡＴＧ５００μｇを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌ中の潜在型ＴＧＦ‐β１ ４μｇと共に、またはＴＧＦ‐β１なしに、３日間離して２回腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。潜在型ＴＧＦ‐β１の４μｇは分子の活性（成熟、非ＬＡＰ結合）部分の１μｇ（〜０．０５ｍｇ／ｋｇ）用量に相当する。処置に含まれる場合、潜在型ＴＧＦ‐β１は２回目のＡＴＧ注射後、１１日目から始めて、１２日間毎日投与された。陰性対照として、ＳＬＥマウスは、５００μｇの正常ウサギイムノグロブリン（Ｉｇ）ｉ．ｐ．を２回、３日間放して処置された。付加的な処置群は、正常ウサギイムノグロブリンと先に投与された潜在型ＴＧＦ‐β１を投与された。陽性対照として、ＳＬＥマウスは毎週２００μｌ生理食塩水中のシクロホスファミド１００ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．で処置された。蛋白尿はＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかで処置されたＳＬＥマウスに比較して、潜在型ＴＧＦ‐β１とＡＴＧで処置されたＳＬＥマウスにおいて有意に低下していた。組み合わせ処置群の平均総尿中蛋白質は、ルーパスの現行の治療薬であるシクロホスファミドによって達成されたレベルに匹敵した。
【図３】〔0017〕重篤な腎臓疾患の発症に対する組み合わせ処置の効果を示す。マウスは先の図２に記載のように処置された。ＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかで処置されたＳＬＥマウスに比較して、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１を一緒に処置されたＳＬＥマウスは、重篤な蛋白尿（＞５００ｍｇ／ｄｌ／日）発生の減少を示した。
【図４】〔0018〕腎臓機能に対する組み合わせ処置の効果を示す。マウスは先の図２に記載のように処置された。ＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかで処置されたＳＬＥマウスに比較して、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせで処置されたＳＬＥマウスでは平均尿中アルブミンレベルが減少した。ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせ処置によりシクロホスファミド処置によって成し遂げられたものに近い平均尿中アルブミンレベルになった。
【図５】〔0019〕重篤な腎臓疾患の発症に対する組み合わせ処置の効果を示す。マウスは先の図２に記載のように処置された。重篤なアルブミン尿（＞１０ｍｇ／ｄｌ／日）を有するＳＬＥマウスの割合は、ＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかと比較して、組み合わせ処置群において減少した。
【図６】〔0020〕図６Ａ〜６Ｅは、自己抗体の発生に対する組み合わせ処置の効果を示す。矢印は処置の開始を示す。マウスは先の図２に記載のように、そして図６Ａ〜６Ｅに従って処置された。全体的に見て、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１で処置されたＳＬＥマウスはＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかで処置されたＳＬＥマウスに比較して、ＩｇＧ抗‐ｄｓＤＮＡ抗体力価上昇の顕著な遅延を示した。
【図７】〔0021〕ＳＬＥマウスの生存に対する組み合わせ処置の効果を示す。マウスは先の図２に記載のように処置された。ＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかで処置されたＳＬＥマウスより、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１で処置されたＳＬＥマウスは有意に長く生き延びた。
【図８】〔0022〕先の図２に記載のように処置されたＭＲＬ／ＭＰＪ−Ｔｎｆｒｓ６ｌｐｒマウスによる反復試験で得られた生存率データを示す。この例では、試験は４０週齢まで延長（初めの試験の２４週に対して）され、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１による一過性処置の効果の持続性を評価した。実際、生存の利点は持続し、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１で処置されたマウスの生存率は、陽性対照であるシクロホスファミドで得られたものに匹敵した（それぞれ、９０％対１００％）
【図９】〔0023〕図９Ａは、種々の処置に曝された脾細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の絶対数を示す。脾細胞は活性な疾患を有する１０匹のＭＲＬ／ｌｐｒマウスからプールした。６種の異なる条件（８ウェル／条件）がアッセイされた：１）細胞だけ、２）ＡＴＧ（１００μｇ／ｍｌ）＋活性なＴＧＦ‐β１（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｇｅｎｚｙｍｅ）、３）ＡＴＧだけ（１００μｇ／ｍｌ）、４）対照ウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）＋活性なＴＧＦ‐β１（１０ｎｇ／ｍｌ）、５）対照ウサギＩｇＧだけ（１００μｇ／ｍｌ）、および６）活性なＴＧＦ‐β１だけ（１０ｎｇ／ｍｌ）。５日後、それぞれの培養条件の複製物をプールし、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し，計数し、ＦＡＣＳ解析のために染色した。処置毎に５ｘ１０５細胞の試料をラット抗‐マウスＣＤ４−Ａｌｅｘａ４８８およびラット抗‐マウスＣＤ２５−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５で染色し、フローメトリーにより解析した。処置毎に取得した６，０００のリンパ球は、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色を解析した。結果は、それぞれの培養条件下で回収されたそれぞれの表現型の細胞の絶対数として表される（ＦＡＣＳによる陽性細胞の割合ｘ培養物から回収した細胞の総数）。〔0024〕図９Ｂは、図９Ａに記載のように処置された脾細胞の培養物中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞の絶対数を示す。さらに、ＦＯＸＰ３の細胞内検出の場合、表面ＣＤ４／ＣＤ２５について染色された細胞は一晩透過化処理し、ＦＯＸＰ３について染色された。
【技術分野】
【０００１】
〔0001〕本出願は２００６年４月１２日に出願された米国仮出願番号６０／７４４，７１３に対する優先権を主張し、それをそのまま参照として本明細書に援用する。
【０００２】
〔0002〕本発明は自己免疫疾患を治療する方法に関する。本発明の方法は、潜在型ＴＧＦ‐βまたは制御性Ｔ細胞を刺激する他の因子（agent、作用物質）の、単独の、または、たとえば抗‐胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）のようなリンパ球枯渇因子と組み合わせた使用を含む。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
〔0003〕自己抗原および／または自己反応性Ｔ細胞に対する抗体の産生は多くの自己免疫疾患の特徴である。自己抗体および自己反応性Ｔ細胞は（たとえば、ループス腎炎でのような）重篤な組織損傷または（たとえば、免疫性血小板減少紫斑病でのような）血液成分の損失を引き起こしうる。
【０００４】
〔0004〕典型的には、自己免疫疾患は、たとえばシクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、およびシクロスポリンのような非特異的免疫抑制剤により治療され、それらは免疫細胞が臓器および組織を冒すことを妨げる。しかし、免疫抑制剤はしばしば重大な副作用（たとえば、毒性、望まない免疫系の抑制など）を伴う。
【０００５】
〔0005〕腫瘍増殖因子（ＴＧＦ‐β）はその免疫抑制作用のために、多発性硬化症および移植片対宿主病を含む、ある種の自己免疫疾患にとっての可能性のある治療薬として提案されてきた。Ｆｌａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１：１３−２０（２００３）。それはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでサプレッサーＴ細胞の生成を誘発するために有用であると報告されている（米国特許第６，７５９，０３５号を参照されたい）。しかし、ＴＧＦ‐βは免疫抑制特性を有する以外に、多能性サイトカインであり、細胞外マトリックス生産および他の生物学的プロセスに関与する。ＴＧＦ‐βに関する総説としては、たとえばＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００１を参照されたい。ＴＧＦ‐βの過剰な、または持続的な発現は器官線維症において役割を果たす（Ｋａｐａｎｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１５２：２１６３−２１６９（１９９５）；Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６：２７１９−２７２４（１９９９）；Ｋｕｗａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０６：１３０−１３５（２００２））が、活性なＴＧＦ‐βの全身投与は容認できない毒性に関連している。とりわけ、慢性進行性多発性硬化症の第I/II相治験において、活性なＴＧＦ‐β２の全身投与は、糸球体濾過速度の減少によって立証されるように、結果として容認できない腎毒性を生じた。Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５１：２８９−２９２（１９９８）。この結果は活性なＴＧＦ‐βの全身投与を含む、治療のそれ以上の臨床的発展を妨げている。従って、付随する毒性を招くことなく、ＴＧＦ‐βの免疫抑制能力を選択的に利用する挑戦が依然として続けられている。その上、望ましくない副作用を起こさずに、自己反応性免疫の抑制を可能にする、自己免疫疾患の治療方法を開発する必要性が依然として残っている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
〔0006〕本発明は部分的に、活性なＴＧＦ‐βの全身毒性を回避するために潜在型ＴＧＦ‐βが使用され得るという発見および証明に基づく。潜在型ＴＧＦ‐βの活性化は、蛋白質分解、活性酸素種への暴露、ならびにトロンボスポンジンおよび他の蛋白質との相互作用を含む、いくつかの機序を通してｉｎ ｖｉｖｏで出現しうる潜在型結合ペプチド（ＬＡＰ）の除去を必要とする。Ｍｕｒｐｈｙ−Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．，１１：５９−６９（２０００）。ルーパス患者の腎臓でのように、自己免疫性炎症の部分においてそのような異常が起こる可能性があることは理論化されているが、本発明の目的のためには当てにされていない。炎症および組織傷害の部分において潜在型ＴＧＦ‐βの活性化が起こるため、潜在型ＴＧＦ‐βの使用が全身ＴＧＦ‐βに伴う毒性を回避する可能性がある。従って、ある態様では、本発明の方法は哺乳動物への不活性なＴＧＦ‐β（たとえば潜在型ＴＧＦ‐β）の全身投与を含み、その結果ＴＧＦ‐βの活性化および／または作用は炎症および組織傷害の部位に限定される。
【０００７】
〔0007〕本発明はさらに、部分的に、全身性エリテマトーデスのマウスモデルにおいて、抗‐胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）によるリンパ球の枯渇、続く潜在型ＴＧＦ‐βの投与が腎臓機能を改善すること、および生存率を高めることにおいて有効であるという発見および証明に基づく。従って、本発明のある態様では、宿主リンパ球は潜在型ＴＧＦ‐βの投与前に枯渇し、潜在型ＴＧＦ‐β投与の治療的に望ましい効果が得られる。
【０００８】
〔0008〕ＴＧＦ‐βの治療効果は、部分的に制御性Ｔ細胞の増殖に対するＴＧＦ‐βの刺激効果に起因することがさらに理論化されているが、本発明の目的のためには当てにされていない。従って、本発明のある態様では、制御性Ｔ細胞の増殖を促進する別の因子が、潜在型ＴＧＦ‐βのかわりに、またはそれに加えて投与されてもよい。
【０００９】
〔0009〕本発明は自己免疫疾患、たとえば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）を患う哺乳動物（たとえばヒト）を治療するための方法を提供する。ある態様では、治療は疾患の進行を遅らせるか、症状を改善させる。本発明はさらに、たとえば、ＳＬＥ、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー症候群、およびベルガー病のような、腎臓機能を損なう自己免疫疾患を患う哺乳動物において腎臓機能を保持するか、または改善する方法を提供する。
【００１０】
〔0010〕いっそう特定の態様では、本発明の方法は以下のステップを含む：
（ａ）哺乳動物において循環するリンパ球を枯渇させること、
（ｂ）リンパ球に再構築を開始させること（“再構築相”）、および
（ｃ）再構築相中に、治療的有効量の潜在型ＴＧＦ‐βおよび／または制御性Ｔ細胞の増殖を促進する別の因子を哺乳動物に投与すること。
【００１１】
〔0011〕ある態様では、リンパ球の枯渇は抗‐胸腺細胞抗体（たとえば、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）、Ａｔｇａｍ（登録商標）、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ（登録商標）、およびＴｅｃｅｌａｃ（登録商標））またはＴ細胞に発現された抗原に対して特異的な別の抗体を投与することによって成し遂げられる。
【００１２】
〔0012〕ひとたび循環するリンパ球が実質的に枯渇してしまえば、それらは再構築を開始する（“再構築相”）ことが可能になる。再構築中、完全な再構築が起こる前に、治療的有効量の１種以上の以下の因子が哺乳動物に投与される：（１）潜在型ＴＧＦ‐β（たとえば、ＴＧＦ‐β１〜ＴＧＦ‐β３のいずれか１種の潜在型）および／または（２）制御性Ｔ細胞の増殖を促進する１種以上の他の因子（たとえばＩＬ−１０、ＩＬ−１０とＩＬ−４、ＩＬ−１０とＩＦＮ−α、ビタミンＤ３とデキサメタゾン、ビタミンＤ３とミコフェノール酸モフェチル、およびラパマイシン）
〔0013〕ある態様では、腎臓機能が自己免疫疾患のために損なわれる場合、たとえば、全身血圧、蛋白尿、アルブミン尿、糸球体濾過速度、および／または腎血流量における変化によって示されるように、治療方法が結果として哺乳動物の腎臓機能を改善する（たとえばその損失の進行を遅らせる）。
【００１３】
〔0014〕前述の概要および以下の詳細な説明は、主張したように代表的で説明的なだけであって、本発明を制限するものではない。
発明の詳細な説明
〔0025〕本発明は自己免疫疾患を患う哺乳動物の治療の方法を提供する。特定の態様では、そのような方法は、腎臓機能を損なう自己免疫疾患を患う哺乳動物において腎臓機能を改善する方法を含む。ある態様では、本発明の方法は哺乳動物への潜在型ＴＧＦ‐βの全身投与を含み、ここでＴＧＦ‐βの活性化および／または作用は炎症および組織傷害の部位に限定される。
【００１４】
〔0026〕ある態様では、本発明の方法は以下のステップを含む：
（ａ）哺乳動物の循環するリンパ球を枯渇させること、
（ｂ）リンパ球に再構築を開始させること、および
（ｃ）（ｂ）の再構築相中に、治療的有効量の潜在型ＴＧＦ‐βおよび／または制御性Ｔ細胞の増殖を促進する別の因子を哺乳動物に投与すること。
【００１５】
リンパ球枯渇
〔0027〕循環するリンパ球の枯渇は哺乳動物にリンパ球枯渇剤を投与すること、さもなければ哺乳動物のリンパ様細胞（たとえば、リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、および／または樹状細胞など）の実質的な画分が消失することになる条件に哺乳動物を曝すことにより成し遂げることができる。枯渇されることになるリンパ球は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）および／またはＴおよびＢリンパ球であってもよい。枯渇相において、Ｔ細胞数は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上減らされ、そして場合によりＢリンパ球（Ｂ細胞）数は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上減らされる。好ましい態様では、枯渇したリンパ球は主にＴ細胞であり、このことは枯渇したＴ細胞の割合が枯渇したＢ細胞の割合より大きい（たとえば、１．２−、１．５−、２−、５−、１０倍またはそれ以上）ことを意味する。
【００１６】
〔0028〕リンパ球枯渇のレベルは、たとえば末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の量を測定することにより容易に評価することができる。リンパ球数は慣用の臨床研究所技術（たとえば、フローサイトメトリー）を使用して測定することができる。ヒトにおける正常なＰＢＬレベルの参照値は表１に示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】
〔0029〕ある態様では、リンパ球枯渇剤は、抗‐リンパ球抗体、たとえば抗‐Ｔ細胞抗体、たとえば、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）、Ａｔｇａｍ（登録商標）、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ（登録商標）、およびＴｅｃｅｌａｃ（登録商標）のような抗‐胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）である。ＡＴＧは胸腺細胞に対して産生されるポリクローナル抗体である。現在市場で取引されるＡＴＧ製品はある種（たとえばヒト）から別の種（たとえば、ウサギまたはウマ）に胸腺細胞を注射することによって産生される。ＡＴＧはリンパ球表面抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＨＬＡ ＤＲ、およびＨＬＡクラスＩのような細胞表面蛋白質に結合する（Ｂｏｕｒｄａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５９：１１９４−１２００（１９９５））。ＡＴＧは主にＴ細胞枯渇の結果として免疫抑制を誘発すると考えられていて（たとえば、Ｂｏｎｎｅｆｏｙ−Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５１：６６９−６７３（１９９１）を参照されたい）、以前は臓器移植の際に拒絶のリスクを軽減するために移植患者の前処理に使用されていた。
【００１９】
〔0030〕ＡＴＧの他に、リンパ球枯渇剤は、１種以上の特異的なリンパ球表面抗原に対して産生されるモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、たとえば、抗‐ＣＤ５２抗体（たとえば、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））抗‐ＣＤ３抗体（たとえば、ＯＫＴ３（登録商標））、抗−ＣＤ４抗体（ＯＫＴ（登録商標））、抗−ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）抗体（たとえば、ダクリズマブ）、抗−ＣＤ５抗体、抗−ＣＤ７抗体、抗−ＴＣＲ抗体、抗−ＣＤ２（たとえば、Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ（登録商標））、または先に特定した他のリンパ球表面抗原のいずれかに対する抗体などから構成されるか、またはそれを含む。
【００２０】
〔0031〕ある態様では、リンパ球枯渇剤はコルチコステロイドである。
〔0032〕ある態様では、リンパ球を枯渇させることになる条件はガンマ線放射への暴露である。
【００２１】
〔0033〕リンパ球を枯渇させるためのいずれか適切な因子および／または条件の組み合わせも使用することができる。
再構築相
〔0034〕枯渇相に続いて、哺乳動物のリンパ球は、リンパ球枯渇剤を取り除くか、またはリンパ球を消失させることになる条件を緩和することにより、再構築を開始することができる。
【００２２】
〔0035〕ある場合には、ステップ（ｃ）の因子（すなわち、ＴＧＦ‐βまたは特に制御性Ｔ細胞を刺激する別の因子）が補充相の開始時に速やかに哺乳動物に投与されうるが、別の場合には因子は再構築が一部始まった後で投与される。ステップ（ｃ）の因子が哺乳動物に投与される前に、リンパ球は枯渇前のレベルに比較して５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれより低いレベルまで再構築することを許されてもよい。
【００２３】
〔0036〕ヒトでは、リンパ球は枯渇剤に依存して、異なる速度で枯渇前のレベルに再構築する。たとえば、ＡＴＧでは完全な再構築に２〜４時間掛かってもよいが、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）による治療後は、再構築に数年間かかってもよい。従って、ある態様では、リンパ球枯渇相の終了時からステップ（ｃ）因子の投与までに掛かる時間は、たとえば０、１、２、３、４、５、６日；１、２、３、４または５週間、またはそれより長い。
【００２４】
ＴＧＦ‐β
〔0037〕ある態様では、本発明の方法は投与後に活性化される不活性なＴＧＦ‐βの投与を含む。ある態様では、不活性なＴＧＦ‐βは潜在型ＴＧＦ‐βの形状で投与される。別の態様では、不活性なＴＧＦ‐βはＴＧＦ‐βをコードするＤＮＡの形状で投与され、それが誘導によって活性なＴＧＦ‐β１を発現する。
【００２５】
〔0038〕ＴＧＦ‐βは生物学的に活性なＴＧＦ‐βがそのプロドメイン（“潜在型結合ペプチド”、ＬＡＰ）と非競合的に結合している、いわゆる“低分子潜在型複合体”（１００ｋＤａ）と、付加的に潜在型ＴＧＦ‐β結合蛋白質（ＬＴＢＰ）を含む、いわゆる“高分子潜在型複合体”（２２０ｋＤａ）のいずれかで自然に分泌される。潜在型は活性な、すなわち成熟したＴＧＦ‐βが複合体から遊離されるまでＴＧＦ‐β受容体に結合することは不可能である。潜在型および活性化プロセスについてのより詳細な総説としては、たとえばＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００１，ｐｐ．７２４−７２５を参照されたい。本明細書で使用する“潜在型ＴＧＦ‐β”という用語は、ＬＡＰと（競合的に、または非競合的に）、そして場合により、付加的にＬＴＢＰと（競合的に、または非競合的に）結合したＴＧＦ‐βを表す。従って、該用語は低分子および高分子潜在型ＴＧＦ‐β複合体を表す。所望する位置および期間で活性化されうる不活性なＴＧＦ‐βの他の形状もまた本発明の方法において有用であろう。ＴＧＦ‐βには３種の既知の哺乳動物イソ型（ＴＧＦ‐β１〜ＴＧＦ‐β３）があり、それらのすべてはお互いの間で相同（６０〜８０％同一性）である。３種の哺乳動物イソ型の蛋白質受託番号の部分的なリストは表２に提供し；ヒトＴＧＦ‐βのアラインメントは図１に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
ＴＧＦ‐βならびにＴＧＦ‐β受容体の構造的および機能的側面は公知である。たとえば、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００１を参照されたい。従って、１種以上のＴＧＦ‐β受容体（ＴＧＦ‐βＲＩ、ＴＧＦ‐βＲＩＩ、またはＴＧＦ‐βＲＩＩＩ）に結合する能力を保持する、工学的に操作されたＴＧＦ‐βの不活性化された形状は、本発明の方法にも有用であろう。そのような工学的に操作されたＴＧＦ‐βの不活性化された形状は自然に存在するＴＧＦ‐βの部分的な、または変異したアミノ酸配列だけを含んでいてもよい。たとえば、工学的に操作されたＴＧＦ‐βの不活性化された形状は、保存的置換が行われ、および／または非必須アミノ酸が欠失した生来の配列を含んでいてもよい。たとえば、それらはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ｎの１１２アミノ酸Ｃ末端部分の全長にわたる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ｎのこのＣ末端部分に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含んでいてもよく、ここでｎ＝１、２または３である。
【００２８】
制御性Ｔ細胞増殖を促進する因子
〔0039〕ある態様では、本発明の方法は制御性Ｔ細胞増殖（expansion）を促進する因子の投与を含む。制御性Ｔ細胞（ＴｒｅｇまたはサプレッサーＴ細胞としても公知）は接触‐依存的または接触‐非依存的（たとえば、サイトカイン産生）機序を介して他のリンパ様細胞の増殖および／または機能を阻止することが可能な細胞である。γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびダブルネガティブＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞を含む、いくつかの型の制御性Ｔ細胞が記載されている。たとえば、Ｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：１８９−９８（２００３）を参照されたい。いわゆる“自然に存在する”制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｃ２５＋であり、フォークヘッドファミリー転写因子ＦＯＸＰ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐ３）を発現する。ＦＯＸＰ３‐発現ＣＤ４＋Ｃ２５＋に加え、少数集団のＣＤ８＋ＦＯＸＰ３‐発現細胞も制御性Ｔ細胞である。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇはさらに、Ｔｒ１細胞およびＴ−ヘルパー３（Ｔｈ３）細胞のような、インターロイキン‐１０（ＩＬ−１０）およびＴＧＦ‐βを分泌する、誘導型制御性Ｔ細胞に分割することができる。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の付加的な表面マーカーには、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、表面ＴＧＦ−β、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４およびＣＤ６２Ｌが挙げられる。種々の型の制御性Ｔ細胞についての詳細な総説としては、たとえば、Ｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６２（１）：１（２００５）；Ｊｏｎｕｌｅｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：６３２３−６３２７（２００３）；Ｈｏｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．，７４：４７１−４７８（２００３）を参照されたい。
【００２９】
〔0040〕従って、ある態様では、刺激されている制御性Ｔ細胞は１種以上の以下の群を含む：（１）ＩＬ−１０を発現する制御性Ｔ細胞；（２）ＴＧＦ‐βを発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞およびＴｈ３細胞を含む）；（３）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（付加的なマーカーＣＤ４５ＲＢ＋、ＣＤ３８＋、ＧＩＴＲ、表面ＴＧＦ−β、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４および／またはＣＤ６２Ｌを有する細胞を含む）；（４）ＦＯＸＰ３−発現Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞を含む）；（５）γδＴ細胞；（６）ＮＫＴ細胞；および（７）ダブルネガティブＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞。
【００３０】
〔0041〕直接免疫抑制活性に加えて、ＴＧＦ‐βはまた制御性Ｔ細胞を刺激することが可能であってもよい。Ｇｏｒｅｌｉｋ ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２：４６−５３（２００２）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８：１８７５−１８８６（２００３）；Ｍａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，７：１０６１−１０６７（２００５）；Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７３：６５２６−６５３１（２００４）。
【００３１】
〔0042〕制御性Ｔ細胞の増殖を促進するＴＧＦ‐β以外の因子の例としては以下のものが挙げられる：（１）ＩＬ−１０；（２）ＩＬ−１０およびＩＬ−４；（３）ＩＬ−１０およびＩＦＮ−a；（４）ビタミンＤ３およびデキサメタゾン；（５）ビタミンＤ３ ミコフェノール酸モフェチル；および（６）ラパマイシン（たとえば、Ｂａｒｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９５：６０３−６１６（２００２）；Ｊｏｎｕｌｅｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：６３２３−６３２７（２００３）；Ｇｒｅｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：１９４５−１９５３（２００１）；Ｂａｔｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：４７４３−４７４８（２００５）を参照されたい）。
【００３２】
〔0043〕ある態様では、因子の欠如とは反対に、その存在における、たとえば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、またはそれ以上の制御性Ｔ細胞増殖の増加は制御性Ｔ細胞増殖を促進する因子の能力を表すと見なされている。ＴＧＦ‐βおよび他の因子は、常法を使用して制御性Ｔ細胞増殖を促進する能力についてアッセイされうる。より頻繁に使用されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのいくつかの例としては以下のものが挙げられる：
〔0044〕（１）フローサイトメトリー解析、ここではＣＤ４、ＣＤ２５、および／またはＦＯＸＰ３、および／またはＣＤ６２Ｌ、および／またはＧＩＴＲ、および／またはＣＴＬＡ４、および／または表面ＴＧＦ−β、および／またはＤ１０３、および／またはＣＤ１３４の共発現が制御性Ｔ細胞表現型の指標として使用される（たとえば、上記のＪｏｎｕｌｅｉｔを参照されたい）；
〔0045〕（２）たとえば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８：１８７５−１８８６（２００３）に記載のような、共培養システムにおけるＴ細胞増殖の阻止。（このアッセイでは、制御性Ｔ細胞は反応性Ｔ細胞に添加され、共培養は抗‐ＣＤ３または同種異系リンパ球により刺激される。制御性Ｔ細胞の存在下では、反応性Ｔ細胞はこれらの刺激に反応して増殖することが不可能になる。増殖の程度は典型的にはトリチウム化されたチミジン取込によって測定される）；および
〔0046〕（３）たとえば、Ｂａｒｒａｔ，上記、およびＪｏｎｕｌｅｉｔ、上記、に記載のような、サイトカインプロファイリング。（このアッセイでは、培養した制御性Ｔ細胞由来の上清は、制御性Ｔ細胞によって生産されることが公知の、たとえばＩＬ−１０およびＴＧＦ‐βのような免疫抑制性サイトカインの存在について分析される。
【００３３】
用途
〔0047〕本発明の方法を使用して、たとえば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および自己免疫リウマチ性関節炎（ＲＡ）のような自己免疫疾患を有する哺乳動物を治療することができる。哺乳動物の例としてはヒトまたは他の霊長類（たとえば、チンパンジー）、齧歯類（たとえば、マウス、ラット、またはモルモット）、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、およびブタが挙げられる。疾患を患う対象によっては、治療により疾患の進行を阻止し、および／または症状を改善することが期待される。
【００３４】
〔0048〕付加的な自己免疫疾患の例としては、インスリン‐依存的糖尿病（ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、セリアック病、自己免疫甲状腺病、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、自己免疫性肝炎、皮膚自己免疫疾患、自己免疫性拡張型心筋症、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、血管炎（たとえば、高安動脈炎およびウェゲナー肉芽腫症）、筋肉の自己免疫疾患、精巣の自己免疫疾患、自己免疫性卵巣疾患、自己免疫性ブドウ膜炎、グラーブ病、乾癬、強直性脊椎炎、アジソン病、橋本甲状腺疾患、突発性血小板減少性紫斑病、および尋常性白斑が挙げられる。
【００３５】
〔0049〕本発明の方法は自己免疫の進行を遅らせ、少なくとも一部の症状を改善し、および／または生存率を高めることが期待されている。たとえば、本発明の方法が結果として自己抗体、自己抗体を産生するＢ細胞、および／または自己反応性Ｔ細胞のレベルを減少させてもよい。これらのパラメータのいずれかの減少は、たとえば、治療前のレベルに比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、７０％またはそれ以上でありうる。
【００３６】
〔0050〕本発明はさらに、腎臓機能を損なう自己免疫疾患を患う哺乳動物の腎臓機能を保持するか、または改善する方法を提供する。腎臓機能を損なう可能性がある自己免疫疾患の例としては、ＳＬＥ（たとえば、ループス腎炎）、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症（ウェゲナー症候群）、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、およびＩｇＭ腎症が挙げられる。そのような疾患に苦しむ患者によっては、たとえば全身血圧、蛋白尿、アルブミン尿、糸球体濾過速度、および／または腎血流量の変化によって示されるような、治療による腎臓機能の改善（たとえば、腎臓機能の損失の進行を遅らせる、機能を保持する、または改善する）が期待される。
【００３７】
〔0051〕“腎臓機能”という用語は、その生理的機能、たとえば圧濾過、選択的再吸収、尿細管分泌、および／または全身血圧調節を行う腎臓の能力を表す。腎臓機能を評価する方法は当該技術分野で公知であり、以下のものが挙げられるがそれらに限定されない：全身および糸球体毛細管血圧、蛋白尿、アルブミン尿、顕微鏡的および肉眼的血尿、血清クレアチニンレベル（たとえば、ヒトの腎臓機能を推定する１つの式は、２．０ｍｇ／ｄｌのクレアチニンレベルを５０％、そして４．０ｍｇ／ｄｌを２５％の正常腎臓機能とみなす）、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）の減少（たとえば、クレアチニンクリアランスの速度によって表される、またはイヌリンアッセイを使用）、および尿細管傷害の程度。
【００３８】
〔0052〕腎臓機能および関連する疾患状態の詳細な総説としては、Ｔｈｅ Ｋｉｄｎｅｙ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．編，３版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０００を参照されたい。通常、０．１５ｇ未満の蛋白質が２４時間で尿に排泄される。ほとんどすべての型の腎臓疾患は尿に軽度（１日に５００ｍｇまで）から中等度（１日４ｇまで）の蛋白質漏出を引き起こす。尿中の正常なアルブミン濃度は１．０ｍｇ／ｄｌ未満である。一般に、３０〜３００ｍｇ／ｄｌの尿中アルブミンはミクロアルブミン尿と見なされ、３００ｍｇ／ｄｌより多いものはマクロアルブミン尿と見なされる。血清クレアチニンの正常値は男性の場合０．６〜１．５ｍｇ／ｄｌ、女性の場合０．６〜１．１ｍｇ／ｄｌである。クレアチニンレベル、腎臓機能、および腎臓疾患のステージ間の関係は表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
〔0053〕従って、本発明の方法は低下した、または減少した腎臓の余力、腎機能不全、腎不全、または末期腎臓疾患を伴う自己免疫疾患を有する患者において有用であってもよい。たとえば、本発明の方法は、ミクロアルブミン尿、マクロアルブミン尿、および／または２４時間につき１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ｇまたはそれを越える蛋白尿レベル、および／または約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、７．０、８．０、９．０、１０ｍｇ／ｄｌまたはそれ以上の血清クレアチニンレベルを有する患者に使用されてもよい。
【００４１】
〔0054〕ある態様では、本発明の方法は対照被験者に比較して、尿中に分泌される蛋白質（蛋白尿）の量、尿中に分泌されるアルブミン（アルブミン尿）の量、および／または患者の血清クレアチニンレベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれより多く減少させる。別の態様では、本発明の方法は対照被験者に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれより多く腎臓機能の損失の進行を遅らせる。腎臓機能を評価するための限定的でない説明的な方法は本明細書、およびたとえばＷＯ０１／６６１４０に記載される。
【００４２】
投与方法
〔0055〕本発明の方法では、“投与”はいずれか特定の送達システムに限定されず、そして限定することなく、非経口的（皮下、静脈内、骨髄内、関節内、筋肉内、または腹腔内注射を含む）、直腸内、局所、経皮、または経口（たとえば、カプセル、懸濁液、または錠剤で）を含んでいてもよい。個体への投与は、単回用量または反復投与で、そして多様な生理学的に受容可能な塩型のいずれかで、および／または医薬組成物の一部としての受容可能な医薬キャリアおよび／または添加物と共に行われてもよい。生理的に受容可能な塩型および標準医薬製剤技術および賦形剤は当業者に公知である（たとえば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ（登録商標））２００５，５９版，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，２００４；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｄｏ ｅｔ ａｌ．編，２１版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５を参照されたい）。
【００４３】
〔0056〕潜在型ＴＧＦ‐βはまた、たとえばＫｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２（１）：４１−５２ （２０００）に記載のように、遺伝子治療によって（すなわち、適切なベクター中のＴＧＦ‐βをコードするＤＮＡを投与することによって）投与されうる。
【００４４】
〔0057〕Ｔｒｅｇを促進する因子で、リンパ球枯渇剤である潜在型ＴＧＦ‐βの適切な有効量は、治療する医師によって選択され、およそ０．０１μｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇまで、０．１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまで、１μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、１０μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇまで、１００μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、および５００μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまでに及ぶことになる。その上、実施例において、またはＰＤＲ（登録商標）２００５および後の版において示された特定の投与量を使用して、所望する投与量に到達してもよい。たとえば、米国において現在認可されているサイモグロブリン（登録商標）の使用としては、臓器移植（２〜１４日間で１ｍｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇまで）および再生不良性貧血（５日間で２．５ｍｇ／ｋｇから３．５ｍｇ／ｋｇまで）が挙げられる。
【００４５】
〔0058〕ある動物で達成された有効投与量は、当該技術分野で公知の変換因子を使用して、ヒトを含む別の動物における使用のために変換されてもよい。たとえば、等価な表面積投与量因子に関してはＦｒｅｉｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，５０（４）：２１９−２４４（１９６６）および表４を参照されたい。自己免疫疾患モデルおよび適切な方法は、たとえば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（編）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００５に見いだすことができる。
【００４６】
【表４】
【００４７】
〔0059〕以下の実施例は説明のために提供され、限定することを意図しない。
【実施例】
【００４８】
活性化されたＴＧＦ‐β１の効能評価
〔0060〕組換えヒト潜在型ＴＧＦ‐β１はＣＨＯ細胞（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）において生産された。潜在型ＴＧＦ‐β１からのＬＡＰの分裂は酸性化によって達成された。ＬＡＰ−ＴＧＦ−β１はアッセイ液（ＤＭＥＭプラス非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、および１０％ ＦＢＳ）で２００ｎｇ／ｍＬに希釈した。希釈した試料５００マイクロリットルは１Ｎ ＨＣｌを１００μＬ添加することにより活性化し、室温で２０分間インキュベーションした。その後、試料は１００μＬの１．２Ｎ ＮａＯＨ／０．５Ｍ ＨＥＰＥＳで中和した。
【００４９】
〔0061〕活性化したＴＧＦ‐β１試料は、Ａ５４９ Ｃｅｌｌ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙを使用して分析し、活性はヒト組換えＴＧＦ‐β２（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）対照に比較して評価した。Ａ５４９ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙはヒト肺上皮細胞系統、Ａ５４９によるＴＧＦ‐β１‐誘発ＩＬ−１１遊離に基づき、そしてＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７６：Ｌ１７５−Ｌ１８５（１９９９）に記載される。ＴＧＦ‐β１に反応したＡ５４９からのＩＬ−１１遊離は、ＥＬＩＳＡ手順（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して測定した。
【００５０】
マウスルーパスモデル
〔0062〕動物および試薬− 雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得て、５〜６週齢で受け入れた。ＡＴＧはＢａｌｂ／ｃマウス胸腺細胞でウサギを免疫化することにより生成された。ウサギは０日目に５ｘ１０７の新鮮な胸腺細胞の皮下注射により免疫され、１４日目に５ｘ１０７の新鮮な胸腺細胞を静脈内にブースター注射された。２０、２２、および２５日目に集めた血清をプールし、ＩｇＧ画分はクロマトグラフィーおよび、硫酸ナトリウム沈殿により分離した。投薬をうけていない（ｎａｉｖｅ）ウサギ由来のＩｇＧの市販調製物（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を陰性対照として使用した。組換えヒト潜在型ＴＧＦ‐β１はＣＨＯ細胞（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）中で生産された。シクロホスファミドはＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から購入した。
【００５１】
〔0063〕治療（treatment、処置）− 動物は蛋白尿、アルブミン尿、および２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対するＩｇＧ抗体の力価について３週間毎にモニターした（以下を参照されたい）。治療的処置は動物がｄｓＤＮＡに対する抗体を産生し始めた、および／または１２〜１３週齢で蛋白尿が高まった時に開始した。５００μｇ（〜２５ｍｇ／ｋｇ）の２回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射からなるＡＴＧまたは対照ウサギＩｇＧによる処置は、３日間離して（０日目と３日目）行われた。潜在型ＴＧＦ‐β１はマウス毎に４μｇのｉ．ｐ．注射を毎日、１２日間として１４日目から２５日目まで与えられた。潜在型ＴＧＦ‐β１の４μｇの用量は、分子の活性な（成熟、非ＬＡＰ‐結合）部分の１μｇ（〜０．０５ｍｇ／ｋｇ）に相当する。シクロホスファミドは陽性対照として使用され、１２〜１３週齢から２４〜２５週齢における試験の終了まで、１００ｍｇ／ｋｇの用量で毎週、ｉ．ｐ．送達された。処置群は対照ウサギＩｇＧ、対照ウサギＩｇＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１、ＡＴＧ、ＡＴＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１、またはシクロホスファミドからなり、１群につき、動物は１０匹であった。
【００５２】
〔0064〕蛋白尿およびアルブミン尿− 個々のマウスの尿中の蛋白質レベルは、総蛋白質濃度を測定するためにデザインされた比色法を使用して測定した。尿中のアルブミンレベルは定量的ＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。
【００５３】
〔0065〕２４時間尿回収は、マウスを別個の代謝ケージに入れることによって３週間毎に実施した。蛋白尿は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のＭｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ−ＰＲ（登録商標）キットを使用して測定した。手短に述べると、尿はピロガロールレッド‐モリブデン酸塩複合体を含む試験溶液に添加した。混合物は３７℃で１０分間、インキュベーションし、蛋白質の塩基性アミノ基に試薬を結合させ、６００ｎＭに吸光度をシフトさせた。６００ｎＭでの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）の増加は蛋白質濃度に直接比例し、参照標準を使用して、以下の式に従って試験試料の蛋白質濃度が測定された：
【００５４】
【化１】
【００５５】
〔0066〕尿中アルブミンレベルは取扱説明書に従って、間接的競合的ＥＬＩＳＡキット（Ｅｘｏｃｅｌｌ Ｉｎｃ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡのＡｌｂｕｗｅｌｌ Ｍ）を使用して評価した。手短に述べると、尿試料の系列２倍希釈物はマウスアルブミンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートのデュプリケートウェルに添加された。次にウサギ抗‐マウスアルブミン抗体がウェルに添加され、試料中のアルブミンとウェルに結合したアルブミンへの抗体の結合を競合させた。この後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）‐結合抗‐ウサギイムノグロブリンとＨＲＰ基質を添加し、ウェルに結合したウサギ‐抗‐マウスアルブミン抗体の量を検出した。４５０ｎｍでのＯ．Ｄ．は尿試料中のアルブミン量の対数に逆比例した。尿試料中のアルブミン濃度は、既知のマウスアルブミン濃度で得られた標準曲線から導かれた。
【００５６】
〔0067〕抗‐ｄｓＤＮＡ ＥＬＩＳＡ− 個々のマウスから得られた血清試料中のｄｓＤＮＡに対するＩｇＧ抗体の力価はＥＬＩＳＡによって測定した。
〔0068〕個々のマウスから得られた血清試料は３週間毎に回収した。ｄｓＤＮＡに対する抗体の力価はＥＬＩＳＡにより評価した。マウス２本鎖ＤＮＡ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により消化して１本鎖ＤＮＡをすべて除去し、その後それを使用して９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを一晩、４℃でコーティング（１μｇ／ｍｌ ｄｓＤＮＡをウェルにつき１００μｌ）した。プレートは水中０．０１％の硫酸プロタミンで前処理（１５０μｌ／ウェル、室温で９０分間）し、ＤＮＡの接着を促進させた。コーティング後、プレートは２．５％ＢＳＡブロッキングバッファーで１時間、３７℃でインキュベーションした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ‐結合ヤギ抗‐マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を添加し、ｄｓＤＮＡに結合した抗体を検出した（３７℃、１時間）。洗浄後、ＨＲＰ基質を３０分間、室温で添加し、２波長プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で、参照波長６５０ｎＭを使用して、比色法で測定した生成物のＯ．Ｄ．を４９０ｎＭで読み取った。抗体力価は、０．１より大きいか、またはそれに等しいＯ．Ｄ．を与える血清の希釈の逆数として定義した。正常マウス血清は陰性対照（力価＜２００、試験された最も低い希釈）として使用し、老齢のＭＲＬ／ｌｐｒルーパスマウスの血清は陽性対照（力価６４００〜２５６００）として使用した。
【００５７】
〔0069〕組織構造− 腎臓は予定した致死時に、または安楽死を必要とする瀕死の動物由来の試験の経過中に、組織学的解析のために回収した。腎臓は縦方向に薄く切り、バッファーで中和したホルマリンで固定した。約５μｍの切片はヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）および過ヨウ素酸‐Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）染色により染色した。スライドは、表５Ａおよび５Ｂに記載のスコアリングシステムに従って、糸球体形態、間質の炎症、および蛋白円柱に対して病理学者によりスコアが付けられた。
【００５８】
【表５Ａ】
【００５９】
【表５Ｂ】
【００６０】
〔0070〕統計− 統計学的解析はＴｕｒｋｅｙの多重比較検定を使用して行い、処置群間に有意差が存在するかどうかを確認した。０．０５以下に等しいか、それ未満のＰ値は統計的に有意であると見なされた。
【００６１】
〔0071〕蛋白尿およびアルブミン尿− ＡＴＧまたは潜在型ＴＧＦ‐β１だけ（対照Ｉｇ＋ＴＧＦβ１）による処置は大部分蛋白尿の発症を阻止することができなかった（図２）が、試験の終わりまでには、これらの単一因子処置群では対照Ｉｇにより処置したマウスに比較して、重篤な蛋白尿（＞５００ｍｇ／ｄｌ／日）の発生率はわずかに低下した（それぞれ、６０〜６７％対９０％）（図３）。対照的に、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせによる処置は蛋白尿の発生率（３０％対９０％）と重症度を著しく阻止し、これらの２種の因子間の相乗作用を示唆した（図２および３）。
【００６２】
〔0072〕ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせにより処置されたマウス尿中の総蛋白質レベルにおいて観察された減少は、また尿アルブミンレベルの測定値に反映された（図４および５）。ＥＬＩＳＡ定量は、アルブミン尿の発生率および重症度が、陰性対照Ｉｇ群または単一因子処置群（ＡＴＧ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦβ１）のいずれかと比較して、組み合わせ処置により処置したマウスにおいてかなり低下することを示した。
【００６３】
〔0073〕ｄｓＤＮＡに対する抗体‐陰性対照群（正常ウサギＩｇ）ならびに潜在型ＴＧＦ‐β１＋対照ＩｇおよびＡＴＧ処置群のマウスの大部分は、同じような反応速度で、次第にＩｇＧ抗体力価を上昇させ始めた。対照的に、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせにより処置された群の抗‐ｄｓＤＮＡ力価の上昇はかなり遅延した（図６）。糸球体における免疫複合体（ＤＮＡ‐抗−ＤＮＡ複合体）の沈着はルーパスに特有の炎症および腎臓病理において重要な役割を果たすと考えられている。しかし、試験終了時の抗体力価と蛋白尿の程度間の相関関係が低かったため、組み合わせ処置群のｄｓＤＮＡに対する抗体産生における明白な阻止は、腎臓機能の保存を十分に説明することができなかった。
【００６４】
〔0074〕生存率− ＡＴＧおよび／または潜在型ＴＧＦ‐β１を使用した投与は十分に耐容され、明白な有害事象は全く生じなかった。潜在型ＴＧＦ‐β１＋対照Ｉｇ群の１匹の動物以外は、すべての死亡は非常に高レベルの蛋白尿に関連し、おそらく腎不全に起因した。処置群のすべては、陰性対照ウサギＩｇ‐処置群に比較した場合、生存率の全体的な改善を示した（図７）。最も高度な生存率（１００％）はシクロホスファミドおよびＡＴＧ／潜在型ＴＧＦ‐β１組み合わせ処置群に見られ、次にＡＴＧ（９０％）そして潜在型ＴＧＦ‐β１＋対照Ｉｇ（７０％）処置群の順であった。陰性対照群は試験の終わりまでには生存率は４０％にすぎなかった。
【００６５】
〔0075〕組織構造− 組織学的解析の結果は表６に提示される。ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１で処置されたマウスは、対照マウス、またはＡＴＧだけもしくは潜在型ＴＧＦ‐β１と対照Ｉｇのいずれかを投与されたマウスに比較して、糸球体腎炎の程度が低かった。これらの組織学的所見は、組み合わせ‐処置動物における蛋白尿／アルブミン尿の減少および生存率改善という臨床所見と相関した。
【００６６】
〔0076〕対照ウサギＩｇＧだけで処置した群に比較して、ＡＴＧ、潜在型ＴＧＦ‐β１＋対照ＩｇおよびＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせで処置した群では、炎症スコアのごくわずかの減少が認められた。
【００６７】
【表６】
【００６８】
〔0077〕ＭＲＬ／ＭＰＪ−Ｔｎｆｒｓ６ｌｐｒマウスを用いて、先に記載の同じ治療計画に続いて反復試験が実施された。この場合、試験は（初めの試験の２４週と対比して）４０週齢まで延長され、ＡＴＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１による一過性処置の効果の持続性が評価された。結果は長期生存の利点を示した。対照ウサギＩｇを投与されたマウスにおける３０％生存率、およびＡＴＧで処置された群における１０％生存率に比較して、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１で処置されたマウスでは９０％生存率が観察された。これは、１００％生存率を提供したシクロホスファミドにひけをとらないが、ＡＴＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１による処置は、長期の週毎の注射を必要とするシクロホスファミドとは対照的に、１回の一時的コースであった（図８）。
【００６９】
〔0078〕同様の試験が、自然発症ルーパスの別のモデルである、ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて行われた。同じ治療計画が使用され、これらの条件下では、疾患の経過または重症度に対して、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１、またはいずれかの因子単独による処置に統計的に有意な効果は見られなかった。２つのモデル間の疾患の特徴および反応速度論における差のために、治療計画はＮＺＢ／ＮＺＷＦ１系統に対して最適化される必要があると考えられる。
【００７０】
〔0079〕ＡＴＧ＋ＴＧＦ‐β１の活性の基礎をなす作用機序を検討するために、ＭＲＬ／ｌｐｒルーパスマウスの脾細胞はＡＴＧ＋／−ＴＧＦ‐β１と共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、回収した細胞はＦＡＣＳによりＴｒｅｇの存在について分析した。活性な疾患を有する１０匹のＭＲＬ／ｌｐｒルーパスマウス（〜２５週齢）のプールされた脾細胞は１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを補足した、血清フリーＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に再懸濁した。細胞は以下の６種の異なる条件下で２ｍｌ細胞／ウェルを含む２４ウェルプレートで培養した：１）細胞だけ、２）ＡＴＧ（１００μｇ／ｍｌ）＋活性なＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｇｅｎｚｙｍｅ）、３）ＡＴＧだけ（１００μｇ／ｍｌ）、４）対照ウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）＋活性なＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）、５）対照ウサギＩｇＧだけ（１００μｇ／ｍｌ）、および６）活性なＴＧＦ−β１だけ（１０ｎｇ／ｍｌ）。活性なＴＧＦ‐β１を使用して、通常はｉｎ ｖｉｖｏで起こることになる活性化プロセスを模倣した。細胞は５日間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。それぞれの培養条件に由来する細胞をプールし、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、計数し、そしてＦＡＣＳ解析のために染色した。試料毎に全部で５ｘ１０５細胞をラット抗‐マウスＣＤ４−Ａｌｅｘａ ４８８（Ｃａｔ．Ｎｏ．５５７６６７；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびラット抗‐マウスＣＤ２５−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（Ｃａｔ．Ｎｏ．５５１０７１；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。ＦＯＸＰ３の細胞内検出の場合、表面ＣＤ４／ＣＤ２５について染色された細胞は、一晩透過化処理し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ＦＯＸＰ３染色キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．７２−５７７５）を使用して、取り扱い説明書に従って染色した。処置毎に取得した６，０００個のリンパ球はＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により染色を分析した。結果は、それぞれの培養条件下で回収したそれぞれの表現型の細胞の絶対数（ＦＡＣＳによる陽性細胞の割合ｘ培養物から回収した細胞の総数）として表される。
【００７１】
〔0080〕図９に示すように、回収したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数は、ＡＴＧ＋ＴＧＦ‐β１を含む培養物中で最も多かった。制御性Ｔ細胞は典型的には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋表現型を発現するが、活性化されたＴ細胞もこの表現型を示すことができる。付加的なＦＯＸＰ３染色はＴｒｅｇ表現型の別の証拠を提供し、得られた結果は、ＡＴＧ＋ＴＧＦ‐β１による処置が最も多い数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇを生産したことを確証した。ＡＴＧだけによる処置はまた、この集団（細胞だけに比較して）におけるわずかな増加を導くように見え、そしてその増加はＴＧＦ‐β１の添加により高められた。これらの結果は、ＡＴＧ＋／−ＴＧＦ‐β１による処置がＴｒｅｇの増殖を促進し、そしてそのような細胞が自己免疫の条件下で治療的利点を提供してもよいという仮説を支持する。
【００７２】
関節炎のマウスモデル
〔0081〕ＡＴＧ＋／−ＴＧＦ‐β１の効果はコラーゲン誘発関節炎マウスモデルにおいて試験された。疾患を誘発するために、ＤＢＡ／１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は、０日目に、尾の基部を全容量１００μｌの完全フロイントアジュバント中のウシＩＩ型コラーゲン（Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２−２，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）で免疫化した。不完全フロイントアジュバント中のコラーゲンによるブースター免疫化は２２日目に行われた。２回の５００μｇ（〜２５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射から構成される、ＡＴＧまたは対照ウサギＩｇＧによる処置は、３日間離して（２３日目と２６日目）送達された。潜在型ＴＧＦ‐β１は、マウスごとに１０日間毎日４μｇのｉ．ｐ．注射として２８から３７日目まで投与された。潜在型ＴＧＦ‐β１の４μｇの用量は、分子の活性な（成熟、非ＬＡＰ結合）部分の１μｇ（〜０．０５ｍｇ／ｋｇ）用量に相当した。処置群は、（１）対照ウサギＩｇＧ、（２）対照ウサギＩｇＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１、（３）ＡＴＧ、および（４）ＡＴＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１を含み、１群の動物は１０匹であった。２１日目から始めて、１週間に２〜３回個々のマウスが検査され、疾患の臨床徴候が採点された。関節炎スコアは表７に定義する。
【００７３】
【表７】
【００７４】
〔0082〕ＡＴＧだけの処置は結果として疾患スコアを減少させ、潜在型ＴＧＦ‐β１の添加は試験した条件下では付加的な利点を提供するようには見えなかった。結果は表８に示す。
【００７５】
【表８】
【００７６】
〔0083〕コラーゲン誘発関節炎は短期間動物モデルであり、処置はルーパスモデルの月単位に対して、週単位のタイムスケールで行われる。この短いタイムスケールは、ルーパスモデルで観察された、ＡＴＧと一緒にＴＧＦ‐β１を投与することによって添加される利点を観察するには十分でない可能性がある。したがって、異なる投与計画、または付加的な動物モデルの別の試験がＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐βの組み合わせ投与の利点を示すであろう。
【００７７】
ぶどう膜炎のマウスモデル
〔0084〕ＡＴＧ＋／−ＴＧＦ‐β１の効果はぶどう膜炎のマウスモデルにおいて試験した。疾患を誘発するために、Ｂ１０．ＲＩＩＩマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（カスタム合成，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ）は０日目に、完全フロイントアジュバント中のヒト光受容体間レチノイド結合蛋白質の１６１〜１８０アミノ酸（ＩＲＢＰ１６１−１８０）１００μｇを２カ所（肩甲骨の間と骨盤領域）に皮下注射することにより、免疫化した。個々のマウスに対して１０日目から始める眼底検査が行われ、疾患スコアが割り当てられた。試験を行うために、Ｍｙｄｒｉａｃｙｌ（登録商標）１％（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１２０，ＪＡ Ｗｅｂｓｔｅｒ）を１〜２滴使用することによりマウスの瞳孔を開き、約５分間、暗室で休ませた。マウスは手で押さえ、両眼の網膜は７８ジオプトリーレンズを持つ間接検眼鏡を使用して観察した。表９に記載のように、０〜５までの連続スコアリングシステムを使用して、眼の炎症を採点した。
【００７８】
【表９】
【００７９】
〔0085〕ＡＴＧまたは対照ウサギＩｇＧによる処置は、疾患開始（スコア１）時に始められ、４日間離して（１０日目と１４日目）送達される２回の５００μｇ（〜２５ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射からなる。潜在型ＴＧＦ‐β１はマウス毎に１３日間毎日の、４μｇのｉ．ｐ．注射として１５〜２７日目まで投与された。潜在型ＴＧＦ‐β１の４μｇの用量は、分子の活性な（成熟、非ＬＡＰ結合）部分の１μｇ（〜０．０５ｍｇ／ｋｇ）の用量に相当する。処置群は、（１）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）対照（２）対照ウサギＩｇＧ、（３）対照ウサギＩｇＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１、（４）ＡＴＧ、および（５）ＡＴＧ＋潜在型ＴＧＦ‐β１を含み、１群の動物は６匹であった。
【００８０】
ＡＴＧだけの処置は結果として疾患スコアを減少させ、潜在型ＴＧＦ‐β１の添加は試験した条件下では付加的な利点を提供するようには見えなかった。結果は表１０に示す。
【００８１】
【表１０】
【００８２】
〔0086〕ぶどう膜モデルは短期間動物モデルであり、処置はルーパスモデルの月単位に対して、週単位のタイムスケールで行われる。この短いタイムスケールは、ルーパスモデルで観察された、ＡＴＧと一緒にＴＧＦ‐β１を投与することによって添加される利点を観察するには十分でない可能性がある。したがって、異なる投与計画、または付加的な動物モデルの試験がＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐βの組み合わせ投与の利点を示してもよい。
【００８３】
〔0087〕すべての刊行物、特許、特許出願、および本開示に引用された生物学的結果はそのまま参照として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】〔0015〕ヒトＴＧＦ‐β１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＴＧＦ‐β２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびＴＧＦ‐β３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の前駆体のアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＴＧＦ‐β２は‘長い’オルタナティブにスプライシングされた形状で示され、そこでは２８アミノ酸の挿入が残基１１９で始まるプレ‐プロドメインに見いだされる。矢印は蛋白質分解によるプロセッシング部位を示し、シグナルペプチドおよび成熟Ｃ−末端ＴＧＦ‐β１フラグメントが解裂される。＊はＴＧＦ‐β１およびＴＧＦ‐β３の潜在型結合ペプチド（ＬＡＰ）蛋白質に見いだされるＲＧＤインテグリン認識部位を表す。＋は２つのモノマーＬＡＰ蛋白質間のジスルフィド結合に含まれるシステイン残基を表す。＃は単独ジスルフィド結合ＴＧＦ‐βモノマーの形成に関与するシステイン残基を表す。
【図２】〔0016〕腎臓機能に対するＡＴＧ／潜在型ＴＧＦ‐β１組み合わせ処置の効果を示す。ＭＲＬ／ＭＰＪ−Ｔｎｆｒｓ６ｌｐｒマウス（ＳＬＥのマウスモデル）は、ＡＴＧ５００μｇを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌ中の潜在型ＴＧＦ‐β１ ４μｇと共に、またはＴＧＦ‐β１なしに、３日間離して２回腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。潜在型ＴＧＦ‐β１の４μｇは分子の活性（成熟、非ＬＡＰ結合）部分の１μｇ（〜０．０５ｍｇ／ｋｇ）用量に相当する。処置に含まれる場合、潜在型ＴＧＦ‐β１は２回目のＡＴＧ注射後、１１日目から始めて、１２日間毎日投与された。陰性対照として、ＳＬＥマウスは、５００μｇの正常ウサギイムノグロブリン（Ｉｇ）ｉ．ｐ．を２回、３日間放して処置された。付加的な処置群は、正常ウサギイムノグロブリンと先に投与された潜在型ＴＧＦ‐β１を投与された。陽性対照として、ＳＬＥマウスは毎週２００μｌ生理食塩水中のシクロホスファミド１００ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．で処置された。蛋白尿はＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかで処置されたＳＬＥマウスに比較して、潜在型ＴＧＦ‐β１とＡＴＧで処置されたＳＬＥマウスにおいて有意に低下していた。組み合わせ処置群の平均総尿中蛋白質は、ルーパスの現行の治療薬であるシクロホスファミドによって達成されたレベルに匹敵した。
【図３】〔0017〕重篤な腎臓疾患の発症に対する組み合わせ処置の効果を示す。マウスは先の図２に記載のように処置された。ＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかで処置されたＳＬＥマウスに比較して、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１を一緒に処置されたＳＬＥマウスは、重篤な蛋白尿（＞５００ｍｇ／ｄｌ／日）発生の減少を示した。
【図４】〔0018〕腎臓機能に対する組み合わせ処置の効果を示す。マウスは先の図２に記載のように処置された。ＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかで処置されたＳＬＥマウスに比較して、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせで処置されたＳＬＥマウスでは平均尿中アルブミンレベルが減少した。ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１の組み合わせ処置によりシクロホスファミド処置によって成し遂げられたものに近い平均尿中アルブミンレベルになった。
【図５】〔0019〕重篤な腎臓疾患の発症に対する組み合わせ処置の効果を示す。マウスは先の図２に記載のように処置された。重篤なアルブミン尿（＞１０ｍｇ／ｄｌ／日）を有するＳＬＥマウスの割合は、ＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかと比較して、組み合わせ処置群において減少した。
【図６】〔0020〕図６Ａ〜６Ｅは、自己抗体の発生に対する組み合わせ処置の効果を示す。矢印は処置の開始を示す。マウスは先の図２に記載のように、そして図６Ａ〜６Ｅに従って処置された。全体的に見て、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１で処置されたＳＬＥマウスはＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかで処置されたＳＬＥマウスに比較して、ＩｇＧ抗‐ｄｓＤＮＡ抗体力価上昇の顕著な遅延を示した。
【図７】〔0021〕ＳＬＥマウスの生存に対する組み合わせ処置の効果を示す。マウスは先の図２に記載のように処置された。ＡＴＧだけ、対照Ｉｇ＋ＴＧＦ‐β１、または対照Ｉｇだけのいずれかで処置されたＳＬＥマウスより、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１で処置されたＳＬＥマウスは有意に長く生き延びた。
【図８】〔0022〕先の図２に記載のように処置されたＭＲＬ／ＭＰＪ−Ｔｎｆｒｓ６ｌｐｒマウスによる反復試験で得られた生存率データを示す。この例では、試験は４０週齢まで延長（初めの試験の２４週に対して）され、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１による一過性処置の効果の持続性を評価した。実際、生存の利点は持続し、ＡＴＧと潜在型ＴＧＦ‐β１で処置されたマウスの生存率は、陽性対照であるシクロホスファミドで得られたものに匹敵した（それぞれ、９０％対１００％）
【図９】〔0023〕図９Ａは、種々の処置に曝された脾細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の絶対数を示す。脾細胞は活性な疾患を有する１０匹のＭＲＬ／ｌｐｒマウスからプールした。６種の異なる条件（８ウェル／条件）がアッセイされた：１）細胞だけ、２）ＡＴＧ（１００μｇ／ｍｌ）＋活性なＴＧＦ‐β１（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｇｅｎｚｙｍｅ）、３）ＡＴＧだけ（１００μｇ／ｍｌ）、４）対照ウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）＋活性なＴＧＦ‐β１（１０ｎｇ／ｍｌ）、５）対照ウサギＩｇＧだけ（１００μｇ／ｍｌ）、および６）活性なＴＧＦ‐β１だけ（１０ｎｇ／ｍｌ）。５日後、それぞれの培養条件の複製物をプールし、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し，計数し、ＦＡＣＳ解析のために染色した。処置毎に５ｘ１０５細胞の試料をラット抗‐マウスＣＤ４−Ａｌｅｘａ４８８およびラット抗‐マウスＣＤ２５−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５で染色し、フローメトリーにより解析した。処置毎に取得した６，０００のリンパ球は、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色を解析した。結果は、それぞれの培養条件下で回収されたそれぞれの表現型の細胞の絶対数として表される（ＦＡＣＳによる陽性細胞の割合ｘ培養物から回収した細胞の総数）。〔0024〕図９Ｂは、図９Ａに記載のように処置された脾細胞の培養物中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞の絶対数を示す。さらに、ＦＯＸＰ３の細胞内検出の場合、表面ＣＤ４／ＣＤ２５について染色された細胞は一晩透過化処理し、ＦＯＸＰ３について染色された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患を患う哺乳動物を治療する方法であって、
（ａ）哺乳動物の循環するリンパ球を枯渇させること、
（ｂ）リンパ球に再構築を開始させること、および
（ｃ）（ｂ）の再構築相中に、治療的有効量の潜在型ＴＧＦ‐βおよび／または制御性Ｔ細胞の増殖を促進する別の因子を哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
枯渇したリンパ球が主にＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
リンパ球が抗‐胸腺細胞抗体、抗‐ＣＤ５２抗体、および抗‐ＣＤ３抗体からなる群から選択される因子を投与することによって枯渇する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗‐胸腺細胞抗体がＴｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）、Ａｔｇａｍ（登録商標）、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ（登録商標）、およびＴｅｃｅｌａｃ（登録商標）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
制御性Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
潜在型ＴＧＦ‐βが成熟ＴＧＦ‐βならびに：
（ａ）潜在型結合ペプチド（ＬＡＰ）；および
（ｂ）潜在型ＴＧＦ‐β結合蛋白質（ＬＴＢＰ）の１種または両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
潜在型ＴＧＦ‐βがＴＧＦ‐β１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
潜在型ＴＧＦ‐βが全身的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
制御性Ｔ細胞の増殖を促進する因子が：
（１）ＩＬ−１０、
（２）ＩＬ−４、
（３）ＩＦＮ−α、
（４）ビタミンＤ３、
（５）デキサメタゾン、および
（６）ミコフェノール酸モフェチルからなる群から選択される１種以上の因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
制御性Ｔ細胞の増殖を促進する因子がラパマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
自己免疫疾患が哺乳動物の腎臓機能損失に関連し、治療の結果として腎臓機能損失の進行が低下するか、または機能が改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
腎臓機能損失の進行低下、または機能の改善が全身血圧、蛋白尿、アルブミン尿、糸球体濾過速度、および／または腎血流量における変化によって示される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー症候群、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ腎症、または腎臓機能を損なう別の自己免疫疾患である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
以下のことを含む、自己免疫疾患を患う哺乳動物を治療する方法：
（ａ）哺乳動物に抗‐リンパ球抗体を投与し、それによって末梢血Ｔ細胞の集団を減少させること；および
（ｂ）疾患の進行を遅らせるおよび／または症状を改善するための有効量において潜在型ＴＧＦ‐βを哺乳動物に投与すること。
【請求項１８】
自己免疫疾患の治療のための医薬品の製造における潜在型ＴＧＦ‐βの使用。
【請求項１９】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー症候群、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ腎症、または腎臓機能を損なう別の自己免疫疾患である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前期治療が抗‐リンパ球抗体の投与を含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
自己免疫疾患の治療のための医薬品の製造における抗‐リンパ球抗体の使用であって、治療が潜在型ＴＧＦ‐βおよび／または制御性Ｔ細胞を刺激する別の因子の投与を含む、使用。
【請求項１】
自己免疫疾患を患う哺乳動物を治療する方法であって、
（ａ）哺乳動物の循環するリンパ球を枯渇させること、
（ｂ）リンパ球に再構築を開始させること、および
（ｃ）（ｂ）の再構築相中に、治療的有効量の潜在型ＴＧＦ‐βおよび／または制御性Ｔ細胞の増殖を促進する別の因子を哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
枯渇したリンパ球が主にＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
リンパ球が抗‐胸腺細胞抗体、抗‐ＣＤ５２抗体、および抗‐ＣＤ３抗体からなる群から選択される因子を投与することによって枯渇する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗‐胸腺細胞抗体がＴｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標）、Ａｔｇａｍ（登録商標）、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ（登録商標）、およびＴｅｃｅｌａｃ（登録商標）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
制御性Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
潜在型ＴＧＦ‐βが成熟ＴＧＦ‐βならびに：
（ａ）潜在型結合ペプチド（ＬＡＰ）；および
（ｂ）潜在型ＴＧＦ‐β結合蛋白質（ＬＴＢＰ）の１種または両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
潜在型ＴＧＦ‐βがＴＧＦ‐β１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
潜在型ＴＧＦ‐βが全身的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
制御性Ｔ細胞の増殖を促進する因子が：
（１）ＩＬ−１０、
（２）ＩＬ−４、
（３）ＩＦＮ−α、
（４）ビタミンＤ３、
（５）デキサメタゾン、および
（６）ミコフェノール酸モフェチルからなる群から選択される１種以上の因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
制御性Ｔ細胞の増殖を促進する因子がラパマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
自己免疫疾患が哺乳動物の腎臓機能損失に関連し、治療の結果として腎臓機能損失の進行が低下するか、または機能が改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
腎臓機能損失の進行低下、または機能の改善が全身血圧、蛋白尿、アルブミン尿、糸球体濾過速度、および／または腎血流量における変化によって示される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー症候群、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ腎症、または腎臓機能を損なう別の自己免疫疾患である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
以下のことを含む、自己免疫疾患を患う哺乳動物を治療する方法：
（ａ）哺乳動物に抗‐リンパ球抗体を投与し、それによって末梢血Ｔ細胞の集団を減少させること；および
（ｂ）疾患の進行を遅らせるおよび／または症状を改善するための有効量において潜在型ＴＧＦ‐βを哺乳動物に投与すること。
【請求項１８】
自己免疫疾患の治療のための医薬品の製造における潜在型ＴＧＦ‐βの使用。
【請求項１９】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー症候群、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ腎症、または腎臓機能を損なう別の自己免疫疾患である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前期治療が抗‐リンパ球抗体の投与を含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
自己免疫疾患の治療のための医薬品の製造における抗‐リンパ球抗体の使用であって、治療が潜在型ＴＧＦ‐βおよび／または制御性Ｔ細胞を刺激する別の因子の投与を含む、使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５３３４７０（Ｐ２００９−５３３４７０Ａ）
【公表日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０５５９３（Ｐ２００９−５０５５９３）
【出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６６４１６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２１２３３
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（３９１０１８５３６）ジェンザイム・コーポレーション (13)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＺＹＭＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６６４１６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２１２３３
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（３９１０１８５３６）ジェンザイム・コーポレーション (13)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＺＹＭＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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