蛍光検出方法および蛍光検出装置
【課題】装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象から発生する蛍光を高いＳＮ比で検出できる蛍光検出装置を提供する。
【解決手段】励起光源102から射出される励起光を観察対象115に照射し、該観察対象115から発生する蛍光を光増幅器110により光増幅して検出する蛍光検出装置１において、励起光源102から射出される励起光を光増幅器110に入射させて、観察対象115から発生する蛍光を光増幅する。
【解決手段】励起光源102から射出される励起光を観察対象115に照射し、該観察対象115から発生する蛍光を光増幅器110により光増幅して検出する蛍光検出装置１において、励起光源102から射出される励起光を光増幅器110に入射させて、観察対象115から発生する蛍光を光増幅する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体等の観察対象が発する蛍光を検出する蛍光検出方法およびその方法を実施する蛍光検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体または非生体物質からの蛍光現象を観察する蛍光顕微鏡や、生体組織内の蛍光物質が発する蛍光を観察する蛍光内視鏡等の蛍光検出装置が知られている。ところが、物質が発する蛍光は、その蛍光を発生させるために照射された励起光に比較してはるかに弱い。このため、蛍光顕微鏡や蛍光内視鏡で得られる像は、他の照明方法による像、例えば顕微鏡におけるケーラー照明の透過像や、内視鏡における白色光照明の反射像と比較すると、極めて暗く、その観察はより困難であるのが一般的である。
【０００３】
その解決策の一つとして、観察対象に照射する励起光を強めて、明るい蛍光像を得ることが考えられる。また、他の解決策として、蛍光を光電変換する光検出器からの電気信号を、高利得増幅器で増幅することが考えられる。
【０００４】
しかし、前者のように、観察対象に強い励起光を照射する場合は、観察対象すなわち顕微鏡における標本や、内視鏡における患者の体にダメージを与えることになる。また、後者のように、蛍光を光電変換する光検出器からの電気信号を高利得増幅器で増幅する場合は、光電変換された段階で不可避的に一定量の雑音が生じて信号に加わるために、後段の高利得増幅器で増幅しても、光電変換で加わった雑音に埋もれるほどに小さな信号は取り出すことができない。
【０００５】
一方、従来の顕微鏡として、例えば、観察対象が発した散乱光を光増幅器で増幅して検出するようにしたものが提案されている（例えば、特許文献１参照）。かかる顕微鏡によれば、たとえ散乱光が光電変換で生じる雑音よりも小さくても、その散乱光を雑音よりも高いレベルにまで光増幅器により光増幅してから光電変換するので、光電変換信号のＳＮ比を改善し、より小さな散乱光を取り出すことが可能となる。
【０００６】
したがって、このような光増幅器を蛍光検出装置に応用して、観察対象から発生する微弱な蛍光を、光増幅器で増幅してから検出するようにすれば、観察対象に照射する励起光の強度を、観察対象にダメージを与えない程度に抑えながら、それによって生じた弱い蛍光を雑音に埋もれさせることなく、ＳＮ比の高い電気信号として取り出すことができ、より明るく良好な蛍光像を得ることが可能になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６３５１３２５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、光増幅器により蛍光を増幅するには、光増幅の主体である利得媒質を励起する光源が必要となる。その代表的な光源として、レーザ発振器の使用が想定される。また、蛍光検出装置は、例えば、レーザ走査型蛍光顕微鏡に代表されるように、観察対象の励起光源としてレーザ発振器を備えるものが多い。
【０００９】
このため、従来の蛍光検出装置に、上記の特許文献１に開示の技術を単に応用して、蛍光を光増幅するようにすると、観察対象を励起するレーザ発振器と、光増幅器の利得媒質を励起するレーザ発振器との二つの励起光源を要し、装置全体の大型化、複雑化およびコストアップを招くことになる。
【００１０】
本発明は、かかる課題を解決し、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象から発生する蛍光を高いＳＮ比で検出できる蛍光検出方法および蛍光検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明に係る蛍光検出方法は、励起光源から射出される励起光を観察対象に照射し、該観察対象から発生する蛍光を光増幅器により光増幅して検出するにあたり、
前記励起光源から射出される励起光を前記光増幅器に入射させて、前記観察対象から発生する蛍光を光増幅する、ことを特徴とするものである。
【００１２】
本発明によると、一つの励起光源から射出される励起光の一部が観察対象の励起に寄与し、残りの一部が光増幅に寄与することになる。したがって、一つの励起光源を、観察対象の照明用と光増幅用とに共用することができるので、それらを別々の励起光源とする場合と比較して、装置の小型化、構成の簡略化、コストダウンを図りながら、観察対象から発生する蛍光を高いＳＮ比で検出することが可能となる。
【００１３】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出方法においては、前記励起光源から射出される励起光を、前記光増幅器を経て前記観察対象に照射する。
【００１４】
本発明によると、励起光源から射出される励起光の一部が光増幅器で吸収されて、該光増幅器を構成する利得媒質が励起され、該利得媒質で吸収されなかった残りの励起光により観察対象が励起される。そして、観察対象から発生する蛍光が光増幅器に入射して光増幅される。
【００１５】
このように、光増幅器を経て観察対象に励起光を照射することは、観察対象に対する励起光の光路中に光増幅器を配置して用いることを意味する。そしてこの方法は、観察対象の励起光路と利得媒質の励起光路を共通とするために、光路径の増大を避け得る長所を有し、例えば内視鏡等に好適に採用することが可能となる。
【００１６】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出方法においては、前記励起光源から射出される励起光を、少なくとも二つの励起光に分離し、該分離された一方の励起光を前記観察対象に照射し、前記分離された他方の励起光を前記光増幅器に入射させる。
【００１７】
本発明によると、分離された一方の励起光により観察対象が励起され、他方の励起光により光増幅器を構成する利得媒質が励起されて、観察対象から発生する蛍光が光増幅器に入射して光増幅される。
【００１８】
このように、励起光源から射出される励起光を観察対象用と光増幅用とに分離することにより、これらの分離された励起光を、例えば強度や光束径や照射方向等について、個別に制御することが可能となり、照明条件を設定する上での自由度を向上させることが可能となる。
【００１９】
さらに、上記課題を解決するため、本発明に係る蛍光検出装置は、励起光源から射出される励起光を観察対象に照射し、該観察対象から発生する蛍光を光増幅器により光増幅して検出する蛍光検出装置において、
前記励起光源から射出される励起光を前記光増幅器に入射させて、前記観察対象から発生する蛍光を光増幅するように構成した、ことを特徴とするものである。
【００２０】
本発明によると、励起光源は、観察対象の照明用と、観察対象から発生する蛍光の光増幅用との共通の光源として機能し、この励起光源から射出された励起光の一部が観察対象の励起に寄与し、残りの一部が光増幅に寄与することになる。
【００２１】
このように、一つの励起光源を、観察対象の照明用と光増幅用とに共用することで、それらを別々の励起光源とする場合と比較して、装置の小型化、構成の簡略化、コストダウンを図りながら、観察対象から発生する蛍光を高いＳＮ比で検出することが可能となる。
【００２２】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出装置においては、前記観察対象に照射する励起光と、前記光増幅器により前記蛍光を光増幅するための励起光との光量比を調整する光量調整部を備える。
【００２３】
本発明によると、光量調整部により、観察対象に照射する励起光と、光増幅器により蛍光を光増幅するための励起光との光量比を最適化することが可能となる。これにより、例えば、観察対象に対してはダメージを与えないように比較的弱い励起照明とし、光増幅器に対しては十分な利得およびＳＮ比が得られるように比較的強い励起照明とすることができる。また、観察の目的や観察対象の種類等に応じて、光量比を最適に設定することが可能となる。
【００２４】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出装置においては、前記光増幅器を、利得媒質が添加された光ファイバを有して構成する。
【００２５】
このように構成すると、例えば、観察対象の近くに位置する対物レンズと、観察対象から離れて位置する励起光源を有する装置本体部との間を、利得媒質が添加された光ファイバにより光学的に接続することにより、該光ファイバを、装置本体部から対物レンズへの励起光の伝送と、対物レンズから装置本体部への蛍光の伝達と、該蛍光の光増幅との３つの機能を担わせることが可能となる。
【００２６】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出装置においては、前記利得媒質が添加された光ファイバを、内視鏡の挿入部に延在して配置する。
【００２７】
このように構成すれば、例えば、内視鏡型蛍光顕微鏡、蛍光内視鏡、ファイバスコープ型の蛍光内視鏡等を容易に構成することが可能となる。
【００２８】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出装置においては、前記光増幅器を、利得媒質が添加されたバルク状光学素子を有して構成する。
【００２９】
このように構成すれば、バルク状光学素子が容易に製造可能であることから、さらなるコストダウンが図れる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象から発生する蛍光を高いＳＮ比で検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の第１実施の形態に係る内視鏡型蛍光顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図２】図１に示す励起光強度バランスフィルタの光学特性を説明するための図である。
【図３】本発明の第２実施の形態に係る蛍光内視鏡の概略構成を示す図である。
【図４】本発明の第３実施の形態に係るファイバスコープ型の蛍光内視鏡の概略構成を示す図である。
【図５】本発明の第４実施の形態に係る蛍光顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図６】図５に示すダイクロイックミラーの光学特性を説明するための図である。
【図７】本発明の第５実施の形態に係る全反射蛍光顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図８】本発明の第６実施の形態に係るニポウディスク型共焦点蛍光顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図９】本発明の第７実施の形態に係る実験小動物用蛍光マクロ観察装置の概略構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００３３】
（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、内視鏡型蛍光顕微鏡１として構成されたもので、本体部１００と挿入部であるプローブ部１０１とを備える。本体部１００には、励起光源１０２、コリメートレンズ１０３、ダイクロイックミラー１０４、第１のリレーレンズ１０５、励起光カットフィルタ１０６、結像レンズ１０７および光検出器１０８が配置されている。また、プローブ部１０１は、可撓部１０１ａおよび先端部１０１ｂからなり、可撓部１０１ａには、光増幅器を構成する光ファイバ１１０が延在して配置されており、先端部１０１ｂには、第２のリレーレンズ１１１、光量調整部を構成する励起光強度バランスフィルタ１１２、スキャナ１１３および顕微鏡対物レンズ１１４が配置されている。
【００３４】
図１において、本体部１００の励起光源１０２から射出された励起光は、コリメートレンズ１０３でコリメートされてダイクロイックミラー１０４で反射された後、第１のリレーレンズ１０５を経てプローブ部１０１の光ファイバ１１０に入射する。光ファイバ１１０には、蛍光を増幅するための利得媒質が添加されており、該光ファイバ１１０に入射した励起光は、その一部が、該光ファイバ１１０に吸収されて利得媒質を励起し、吸収されなかった残りの励起光が、該光ファイバ１１０から射出されて、第２のリレーレンズ１１１を経て励起光強度バランスフィルタ１１２に入射する。
【００３５】
励起光強度バランスフィルタ１１２は、入射した励起光を所定の割合で透過させる。そして、励起光強度バランスフィルタ１１２を透過した励起光は、スキャナ１１３を経て顕微鏡対物レンズ１１４により観察対象１１５に集光される。これにより、観察対象１１５の集光部位を構成する分子または集光部位に含まれる蛍光色素が励起されて、蛍光が発生する。
【００３６】
観察対象１１５から発生した蛍光は、顕微鏡対物レンズ１１４、スキャナ１１３、励起光強度バランスフィルタ１１２および第２のリレーレンズ１１１を経て光ファイバ１１０に入射する。ここで、光ファイバ１１０は、往路において既に利得媒質が励起されているので、蛍光が入射すると誘導放出を起こして、入射した蛍光を光増幅して射出する。
【００３７】
光ファイバ１１０で光増幅されて射出される蛍光は、第１のリレーレンズ１０５を経てダイクロイックミラー１０４に入射する。ダイクロイックミラー１０４を透過した蛍光は、励起光カットフィルタ１０６に入射し、ここで入射光に含まれる不要な励起光がカットされて、結像レンズ１０７により光検出器１０８に集光されて光電変換される。そして、プローブ部１０１側において、励起光がスキャナ１１３の作用により観察対象１１５をスキャンするのに伴って、観察対象１１５の蛍光強度分布を反映した信号が得られる。
【００３８】
上記構成において、光ファイバ１１０に添加される利得媒質は、種々の元素、例えば、プラセオジム(Pr)、ネオジム (Nd)、ホルミウム(Ho)、エルビウム(Er)、ツリウム(Tm)、イッテルビウム(Yb)、テルビウム(Tb)等が利用可能であるが、特に可視域の蛍光を増幅する場合は、プラセオジム、ホルミウム、エルビウム、ツリウムやテルビウムが有効である。また、スキャナ１１３は、光学的走査が可能であれば良く、例えばMEMS(micro electro mechanical systems)型ガルバノミラーを用いて構成することもできるし、光ファイバ１１０の対物レンズ側端部を、アクチュエータにより光軸と直交する方向に駆動するように構成することもできる。なお、図１では、スキャナ１１３によりスキャンされる光路のうち、軸上光路を符号１１６CTで示し、軸外光路を符号１１６PRで示している。
【００３９】
図２は、励起光強度バランスフィルタ１１２の光学特性を説明するための図で、図２（ａ）は励起光強度バランスフィルタ１１２に入射する励起光および蛍光のスペクトル分布を示し、図２（ｂ）は励起光強度バランスフィルタ１１２の分光透過率特性を示す。なお、図２（ａ）において、蛍光のスペクトル強度は、図面を明瞭とするため強調して示している。図２に示すように、励起光強度バランスフィルタ１１２は、励起光の波長λEX（例えば、４８８ｎｍ）における透過率TEXを比較的低く、逆に、蛍光の波長帯域λFL1〜λFL2（例えば、５００ｎｍ〜６００ｎｍ）における透過率TFLは、比較的高くなるように構成する。このような励起光強度バランスフィルタ１１２は、例えば、ダイクロイックフィルタ等の誘電体多層膜フィルタ、チューナブルフィルタ、ファブリペロ干渉計等により構成することができる。
【００４０】
このように、励起光強度バランスフィルタ１１２を構成して、該励起光強度バランスフィルタ１１２を光ファイバ１１０と観察対象１１５との間に配置することにより、励起光源１０２から射出される励起光のうち比較的高い割合を光ファイバ１１０に入射させて励起させながら、観察対象１１５に対しては、光ファイバ１１０を透過した励起光のうち透過率TEXによって制限された比較的低い割合の励起光を照射することができる。また、観察対象１１５から発した蛍光を、励起光強度バランスフィルタ１１８における透過率TFLによって、その大部分を光ファイバ１１０に入射させることができる。
【００４１】
これにより、光ファイバ１１０の励起および蛍光増幅作用をほとんど妨げることなく、観察対象１１５を照射する励起光を適度に弱めて、観察対象１１５が励起光によって受けるダメージ（例えば、蛍光色素の退色）を低減することができる。すなわち、観察対象１１５に照射する励起光と、光ファイバ１１０に入射させて蛍光を光増幅する励起光との光量比を最適化することができる。
【００４２】
以上のように、本実施の形態に係る内視鏡型蛍光顕微鏡１によれば、一つの励起光源１０２から射出される励起光を、観察対象１１５の照明用と、光ファイバ１１０による光増幅用とに最適化して用いるようにしたので、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象１１５から発生する蛍光が弱い場合でも、光ファイバ１１０により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。また、可撓部１０１ａの撓み作用により、本体部１００を移動させることなく、先端部１０１ｂの位置や方向を任意に変えることができ、さらにプローブ部１０１を生体の狭まった部位や管腔・内腔部に入れることができるので、例えば、実験動物や実験小動物の体内に挿入して蛍光観察を容易に行うことができる。したがって、本実施の形態によれば、生体内の組織や細胞の蛍光顕微鏡画像を高感度に観察できる内視鏡型蛍光顕微鏡１を提供することができ、特に、医学・生物学の研究に供することができる。
【００４３】
（第２実施の形態）
図３は、本発明の第２実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、蛍光内視鏡２として構成されたものである。この蛍光内視鏡２は、被検部位の自家蛍光や、病変部に特異的に結合する蛍光色素が発する蛍光を観察することによって診断を行う医療機器であり、対物レンズとして内視鏡対物レンズ２０１を用いることを除き、全体の構成および各部の作用は、図１に示した内視鏡型蛍光顕微鏡１と基本的に同じである。したがって、図１に示した構成要素と、同一作用を成す構成要素には、同一参照符号を付して説明を省略する。
【００４４】
本実施の形態に係る蛍光内視鏡２においても、第１実施の形態と同様に、一つの励起光源１０２から射出される励起光を用いることで、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象２０２から発生する蛍光が弱い場合でも、光ファイバ１１０により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００４５】
（第３実施の形態）
図４は、本発明の第３実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、ファイバスコープ型の蛍光内視鏡３として構成されたもので、内視鏡本体部３００と挿入部であるプローブ部３０１とを備える。内視鏡本体部３００には、励起光源３０２、励起光集光レンズ３０３、ダイクロイックミラー３０４、リレーレンズ３０５、励起光カットフィルタ３０６、結像レンズ３０７および撮像素子３０８が配置されている。また、プローブ部３０１は、可撓部３０１ａおよび先端部３０１ｂからなり、可撓部３０１ａには、多数の光ファイバを束ねてなる光ファイババンドル３１０が延在して配置され、先端部３０１ｂには、励起光強度バランスフィルタ３１２および内視鏡対物レンズ３１４が配置されている。
【００４６】
図４において、内視鏡本体部３００の励起光源３０２から射出された励起光は、励起光集光レンズ３０３で集光されてダイクロイックミラー３０４で反射された後、リレーレンズ３０５を経てプローブ部３０１の光ファイババンドル３１０の後端部３１０ａの端面全体に入射する。光ファイババンドル３１０は、各々の光ファイバが光増幅器を構成するもので、各光ファイバには、第１実施の形態における光ファイバ１１０と同様の蛍光を増幅するための利得媒質が添加されている。そして、光ファイババンドル３１０に入射した励起光は、その一部が、各光ファイバに吸収されて利得媒質を励起し、吸収されなかった残りの励起光が、光ファイババンドル３１０の先端部３１０ｂの端面から射出されて、励起光強度バランスフィルタ３１２に入射する。
【００４７】
励起光強度バランスフィルタ３１２は、光量調整部を構成するもので、第１実施の形態における励起光強度バランスフィルタ１１２と同様に構成され、入射した励起光を所定の割合で透過させる。そして、励起光強度バランスフィルタ３１２を透過した励起光は、内視鏡対物レンズ３１４により観察対象３１５の画像観察領域に対応する照明領域（視野）３１６を照明する。これにより、観察対象３１５の照明領域３１６内の分子または照明領域に含まれる蛍光色素が励起されて、蛍光が発生する。
【００４８】
観察対象３１５の照明領域３１６から発生した蛍光は、内視鏡対物レンズ３１４により励起光強度バランスフィルタ３１２を経て光ファイババンドル３１０の先端部３１０ｂの端面に集光されて、該先端面に照明領域３１６の蛍光像が結像される。そして、この先端面に結像された蛍光像は、光ファイババンドル３１０を経て光増幅されて伝送され、これにより後端部３１０ａの端面に光増幅された蛍光像が形成される。
【００４９】
この後端部３１０ａの端面に形成される光増幅された蛍光像は、リレーレンズ３０５およびダイクロイックミラー３０４を経て励起光カットフィルタ３０６に入射され、ここで蛍光像に含まれる不要な励起光がカットされて、結像レンズ３０７により撮像素子３０８上に結像されて光電変換される。
【００５０】
したがって、本実施の形態においても、上記実施の形態と同様に、一つの励起光源３０２から射出される励起光を用いることで、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象３１５の蛍光像が弱い場合でも、光ファイババンドル３１０により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００５１】
（第４実施の形態）
図５は、本発明の第４実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、蛍光顕微鏡４として構成されたもので、上述した実施の形態と同様に、一つの励起光源４０１を有する。図５において、励起光源４０１から射出された励起光は、第１のコリメートレンズ４０２でコリメートされてダイクロイックミラー４０３に入射し、該ダイクロイックミラー４０３を透過および反射して二つの励起光に分離される。
【００５２】
ダイクロイックミラー４０３を透過した一方の励起光は、反射ミラー４０４で反射されて再びダイクロイックミラー４０３に入射し、ここで反射される励起光が、スキャナ４０５および瞳リレーレンズ４０６を経て顕微鏡対物レンズ４０７により観察対象４０８に集光される。これにより、観察対象４０８の集光部位を構成する分子または集光部位に含まれる蛍光色素が励起されて、蛍光が発生する。
【００５３】
この観察対象４０８から発生した蛍光は、顕微鏡対物レンズ４０７により捕集されて、瞳リレーレンズ４０６およびスキャナ４０５を経てダイクロイックミラー４０３に入射する。そして、ダイクロイックミラー４０３に入射した蛍光は、該ダイクロイックミラー４０３を透過して、第１の結像レンズ４１０、第１の共焦点ピンホール４１１および第２のコリメートレンズ４１２を経て、利得媒質が添加されたバルク状光学素子４１３に入射する。なお、第１の共焦点ピンホール４１１は、顕微鏡対物レンズ４０７の焦点以外からの光を遮光して、観察対象４０８の三次元計測を行うためのピンホールである。
【００５４】
一方、励起光源４０１から射出されてダイクロイックミラー４０３で反射される他方の励起光は、第１の結像レンズ４１０、第１の共焦点ピンホール４１１および第２のコリメートレンズ４１２を経てバルク状光学素子４１３に入射し、該バルク状光学素子４１３の利得媒質を励起する。これにより、バルク状光学素子４１３に入射した観察対象４０８からの蛍光は、光増幅されて該バルク状光学素子４１３から射出される。
【００５５】
バルク状光学素子４１３から射出された蛍光は、励起光カットフィルタ４１４により不要な励起光がカットされた後、第２の結像レンズ４１５により第２の共焦点ピンホール４１６に集光されて、バルク状光学素子４１３から発生する不所望な自然放出光が遮光され、この第２の共焦点ピンホール４１６を透過した蛍光が第３の結像レンズ４１７により光検出器４１８に集光されて光電変換される。そして、観察対象４０８に照射される励起光が、スキャナ４０５によりスキャンされるのに伴って、観察対象４０８の蛍光強度分布を反映した信号が得られる。なお、図５では、スキャナ４０５によりスキャンされる光路のうち、軸上光路を符号４１９CTで示し、軸外光路を符号４１９PRで示している。
【００５６】
ここで、ダイクロイックミラー４０３は、観察対象４０８に照射する励起光と、バルク状光学素子４１３により蛍光を光増幅する励起光との光量比を最適化する光量調整部を構成する。図６は、このダイクロイックミラー４０３の光学特性を説明するための図で、図６（ａ）はダイクロイックミラー４０３に入射する励起光および蛍光のスペクトル分布を示し、図６（ｂ）および（ｃ）はそれぞれダイクロイックミラー４０３の分光反射率特性および分光透過率特性を示す。なお、図６（ａ）において、蛍光のスペクトル強度は、図面を明瞭とするため強調して示している。
【００５７】
図６から明らかなように、ダイクロイックミラー４０３は、励起光の波長λEXにおける反射率REXを比較的高く、逆に、蛍光の波長帯域λFL1〜λFL2における反射率RFLは、極力低くなるように構成する。そしてその結果、励起光の波長λEXにおける透過率TEXは、比較的低く、逆に、蛍光の波長帯域λFL1〜λFL2における透過率TFLは、高いものになる。
【００５８】
このように構成することにより、一つの励起光源４０１から射出される励起光のうち、ダイクロイックミラー４０３で一回反射したもの、すなわち割合にしてREX相当分を光増幅用として用い、またダイクロイックミラー４０３で一回透過し一回反射したもの、すなわち割合にしてTEX×REX相当分を観察対象４０８の照明用として用いることができる。これにより、観察対象に照射する励起光と、光増幅器により蛍光を光増幅するための励起光との光量比を最適化することが可能となる。したがって、上述した実施の形態と同様に、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象４０８からの蛍光が弱い場合でも、バルク状光学素子４１３により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００５９】
（第５実施の形態）
図７は、本発明の第５実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、全反射蛍光顕微鏡５として構成されたもので、上述した実施の形態と同様に、一つの励起光源５０１を有する。図７において、励起光源５０１から射出された励起光は、第１のコリメートレンズ５０２でコリメートされてビームスプリッター５０３に入射し、該ビームスプリッター５０３を透過および反射して二つの励起光に分離される。
【００６０】
ビームスプリッター５０３を透過した一方の励起光は、反射ミラー５０４、コンデンサレンズ系５０５および反射ミラー５０６を経て、顕微鏡対物レンズ５０７の瞳の周縁部から観察対象５０８を収容するサンプル容器５０９に照射される。このとき、照明光がサンプル容器５０９と観察対象５０８との間で全反射を生じる条件を満たすようにする。この照明光の全反射により発生するエバネッセント光により観察対象５０８が照明されて蛍光が励起される。そして、この観察対象５０８から発生した蛍光は、顕微鏡対物レンズ５０７により捕集されて、集光レンズ５１０により、利得媒質が添加されたバルク状光学素子５１１内に集光される。
【００６１】
一方、励起光源５０１から射出されてビームスプリッター５０３で反射される他方の励起光は、バルク状光学素子５１１に入射して、該バルク状光学素子５１１の利得媒質を励起する。これにより、バルク状光学素子５１１に入射した観察対象５０８からの蛍光は、光増幅されて該バルク状光学素子５１１から射出される。そして、このバルク状光学素子５１１から射出される蛍光は、第２のコリメートレンズ５１２および励起光カットフィルタ５１３を経て結像レンズ５１４により撮像素子５１５に結像される。
【００６２】
ここで、ビームスプリッター５０３は、観察対象５０８を全反射照明する励起光と、バルク状光学素子５１１により蛍光を光増幅するための励起光との光量比を最適化する光量調整部を構成する。これにより、本実施の形態においても、上記実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００６３】
（第６実施の形態）
図８は、本発明の第６実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、ニポウディスク型共焦点蛍光顕微鏡６として構成されたもので、上述した実施の形態と同様に、一つの励起光源６０１を有する。図８において、励起光源６０１から射出された励起光は、第１のコリメートレンズ６０２でコリメートされて、マイクロレンズアレイディスク６０３、ダイクロイックミラー６０４およびピンホールアレイディスク６０５を経て、利得媒質が添加されたバルク状光学素子６０６に入射される。
【００６４】
マイクロレンズアレイディスク６０３には、多数のマイクロレンズが渦巻き状に配列されている。また、ピンホールアレイディスク６０５は、いわゆるニポウディスクと同様のものであり、これにはマイクロレンズアレイディスク６０３の多数のマイクロレンズと対を成す多数のピンホールが、同様に渦巻き状に配列されている。これらマイクロレンズアレイディスク６０３およびピンホールアレイディスク６０５は、モータ６０７により一体に回転される。
【００６５】
バルク状光学素子６０６に入射した励起光は、その一部が、該バルク状光学素子６０６に吸収されて利得媒質を励起し、吸収されなかった残りの励起光が、該バルク状光学素子６０６から射出されて、第２のコリメートレンズ６０８を経て励起光強度バランスフィルタ６０９に入射する。励起光強度バランスフィルタ６０９は、光量調整部を構成するもので、上記第１〜３実施の形態の励起光強度バランスフィルタと同様に、入射した励起光を所定の割合で透過させる。そして、励起光強度バランスフィルタ６０９を透過した励起光は、顕微鏡対物レンズ６１０により観察対象６１１に集光される。これにより、観察対象６１１の集光部位を構成する分子または集光部位に含まれる蛍光色素が励起されて、蛍光が発生する。
【００６６】
また、観察対象６１１から発生した蛍光は、顕微鏡対物レンズ６１０、励起光強度バランスフィルタ６０９および第２のコリメートレンズ６０８を経てバルク状光学素子６０６に入射して光増幅される。この光増幅された蛍光は、ピンホールアレイディスク６０５を経てダイクロイックミラー６０４で反射されて、第３のコリメートレンズ６１２を経て励起光カットフィルタ６１３に入射し、ここで不要な励起光がカットされて、結像レンズ６１４により撮像素子６１５に結像される。そして、モータ６０７によるマイクロレンズアレイディスク６０３およびピンホールアレイディスク６０５の回転により、観察対象６１１がスキャンされるのに伴って、観察対象６１１の蛍光強度分布を反映した蛍光画像が得られる。
【００６７】
したがって、本実施の形態においても、上記実施の形態と同様に、一つの励起光源６０１から射出された励起光を、観察対象６１１の照明用と、観察対象６１１から発生した蛍光の光増幅用とに用いることで、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象６１１からの蛍光が弱い場合でも、バルク状光学素子６０６により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００６８】
（第７実施の形態）
図９は、本発明の第７実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、実験小動物用蛍光マクロ観察装置７として構成されたもので、上述した実施の形態と同様に、一つの励起光源７０１を有する。図９において、励起光源７０１から射出された励起光は、励起光集光レンズ７０２で集光されてダイクロイックミラー７０３で反射された後、利得媒質が添加されたバルク状光学素子７０４に入射される。
【００６９】
バルク状光学素子７０４に入射した励起光は、その一部が、該バルク状光学素子７０４に吸収されて利得媒質を励起し、吸収されなかった残りの励起光が、該バルク状光学素子７０４から射出されて、励起光強度バランスフィルタ７０５に入射する。励起光強度バランスフィルタ７０５は、光量調整部を構成するもので、上記第６実施の形態の励起光強度バランスフィルタ６０９と同様に、入射した励起光を所定の割合で透過させる。そして、励起光強度バランスフィルタ７０５を透過した励起光は、対物レンズ７０６により実験小動物である観察対象７０７の画像観察領域を照明する。これにより、観察対象７０７が励起されて、蛍光が発生する。
【００７０】
観察対象７０７から発生した蛍光は、対物レンズ７０６および励起光強度バランスフィルタ７０５を経てバルク状光学素子７０４に入射して光増幅され、その光増幅された蛍光が、ダイクロイックミラー７０３を透過し、さらに励起光カットフィルタ７０８で不要な励起光がカットされた後、結像レンズ７０９により撮像素子７１０上に結像されて光電変換される。
【００７１】
このように、本実施の形態においても、上記実施の形態と同様に、一つの励起光源７０１から射出された励起光を、観察対象７０７の照明用と、観察対象７０７から発生した蛍光の光増幅用とに用いることで、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象７０７からの蛍光が弱い場合でも、バルク状光学素子７０４により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００７２】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、光量調整部を構成する励起光強度バランスフィルタやダイクロイックミラーは、観察の目的や観察対象の種類等、あるいは、使用する励起光の波長や検出する蛍光の波長等に応じて、交換あるいは切り替え可能に構成することができる。
【符号の説明】
【００７３】
１ 内視鏡型蛍光顕微鏡
２，３ 蛍光内視鏡
４ 蛍光顕微鏡
５ 全反射蛍光顕微鏡
６ ニポウディスク型共焦点蛍光顕微鏡
７ 実験小動物用蛍光マクロ観察装置
１００，３００ 本体部
１０１，３０１ プローブ部
１０２，３０２，４０１，５０１，６０１，７０１ 励起光源
１０８，４１８ 光検出器
１１０ 光ファイバ
１１２，３１２，６０９，７０５ 励起光強度バランスフィルタ
１１５，２０２，３１５，４０８，５０８，６１１，７０７ 観察対象
３０８，５１５，６１５，７１０ 撮像素子
３１０ 光ファイババンドル
１０４，３０４，４０３，６０４，７０３ ダイクロイックミラー
５０３ ビームスプリッター
４１３，５１１，６０６，７０４ バルク状光学素子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体等の観察対象が発する蛍光を検出する蛍光検出方法およびその方法を実施する蛍光検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体または非生体物質からの蛍光現象を観察する蛍光顕微鏡や、生体組織内の蛍光物質が発する蛍光を観察する蛍光内視鏡等の蛍光検出装置が知られている。ところが、物質が発する蛍光は、その蛍光を発生させるために照射された励起光に比較してはるかに弱い。このため、蛍光顕微鏡や蛍光内視鏡で得られる像は、他の照明方法による像、例えば顕微鏡におけるケーラー照明の透過像や、内視鏡における白色光照明の反射像と比較すると、極めて暗く、その観察はより困難であるのが一般的である。
【０００３】
その解決策の一つとして、観察対象に照射する励起光を強めて、明るい蛍光像を得ることが考えられる。また、他の解決策として、蛍光を光電変換する光検出器からの電気信号を、高利得増幅器で増幅することが考えられる。
【０００４】
しかし、前者のように、観察対象に強い励起光を照射する場合は、観察対象すなわち顕微鏡における標本や、内視鏡における患者の体にダメージを与えることになる。また、後者のように、蛍光を光電変換する光検出器からの電気信号を高利得増幅器で増幅する場合は、光電変換された段階で不可避的に一定量の雑音が生じて信号に加わるために、後段の高利得増幅器で増幅しても、光電変換で加わった雑音に埋もれるほどに小さな信号は取り出すことができない。
【０００５】
一方、従来の顕微鏡として、例えば、観察対象が発した散乱光を光増幅器で増幅して検出するようにしたものが提案されている（例えば、特許文献１参照）。かかる顕微鏡によれば、たとえ散乱光が光電変換で生じる雑音よりも小さくても、その散乱光を雑音よりも高いレベルにまで光増幅器により光増幅してから光電変換するので、光電変換信号のＳＮ比を改善し、より小さな散乱光を取り出すことが可能となる。
【０００６】
したがって、このような光増幅器を蛍光検出装置に応用して、観察対象から発生する微弱な蛍光を、光増幅器で増幅してから検出するようにすれば、観察対象に照射する励起光の強度を、観察対象にダメージを与えない程度に抑えながら、それによって生じた弱い蛍光を雑音に埋もれさせることなく、ＳＮ比の高い電気信号として取り出すことができ、より明るく良好な蛍光像を得ることが可能になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６３５１３２５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、光増幅器により蛍光を増幅するには、光増幅の主体である利得媒質を励起する光源が必要となる。その代表的な光源として、レーザ発振器の使用が想定される。また、蛍光検出装置は、例えば、レーザ走査型蛍光顕微鏡に代表されるように、観察対象の励起光源としてレーザ発振器を備えるものが多い。
【０００９】
このため、従来の蛍光検出装置に、上記の特許文献１に開示の技術を単に応用して、蛍光を光増幅するようにすると、観察対象を励起するレーザ発振器と、光増幅器の利得媒質を励起するレーザ発振器との二つの励起光源を要し、装置全体の大型化、複雑化およびコストアップを招くことになる。
【００１０】
本発明は、かかる課題を解決し、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象から発生する蛍光を高いＳＮ比で検出できる蛍光検出方法および蛍光検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明に係る蛍光検出方法は、励起光源から射出される励起光を観察対象に照射し、該観察対象から発生する蛍光を光増幅器により光増幅して検出するにあたり、
前記励起光源から射出される励起光を前記光増幅器に入射させて、前記観察対象から発生する蛍光を光増幅する、ことを特徴とするものである。
【００１２】
本発明によると、一つの励起光源から射出される励起光の一部が観察対象の励起に寄与し、残りの一部が光増幅に寄与することになる。したがって、一つの励起光源を、観察対象の照明用と光増幅用とに共用することができるので、それらを別々の励起光源とする場合と比較して、装置の小型化、構成の簡略化、コストダウンを図りながら、観察対象から発生する蛍光を高いＳＮ比で検出することが可能となる。
【００１３】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出方法においては、前記励起光源から射出される励起光を、前記光増幅器を経て前記観察対象に照射する。
【００１４】
本発明によると、励起光源から射出される励起光の一部が光増幅器で吸収されて、該光増幅器を構成する利得媒質が励起され、該利得媒質で吸収されなかった残りの励起光により観察対象が励起される。そして、観察対象から発生する蛍光が光増幅器に入射して光増幅される。
【００１５】
このように、光増幅器を経て観察対象に励起光を照射することは、観察対象に対する励起光の光路中に光増幅器を配置して用いることを意味する。そしてこの方法は、観察対象の励起光路と利得媒質の励起光路を共通とするために、光路径の増大を避け得る長所を有し、例えば内視鏡等に好適に採用することが可能となる。
【００１６】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出方法においては、前記励起光源から射出される励起光を、少なくとも二つの励起光に分離し、該分離された一方の励起光を前記観察対象に照射し、前記分離された他方の励起光を前記光増幅器に入射させる。
【００１７】
本発明によると、分離された一方の励起光により観察対象が励起され、他方の励起光により光増幅器を構成する利得媒質が励起されて、観察対象から発生する蛍光が光増幅器に入射して光増幅される。
【００１８】
このように、励起光源から射出される励起光を観察対象用と光増幅用とに分離することにより、これらの分離された励起光を、例えば強度や光束径や照射方向等について、個別に制御することが可能となり、照明条件を設定する上での自由度を向上させることが可能となる。
【００１９】
さらに、上記課題を解決するため、本発明に係る蛍光検出装置は、励起光源から射出される励起光を観察対象に照射し、該観察対象から発生する蛍光を光増幅器により光増幅して検出する蛍光検出装置において、
前記励起光源から射出される励起光を前記光増幅器に入射させて、前記観察対象から発生する蛍光を光増幅するように構成した、ことを特徴とするものである。
【００２０】
本発明によると、励起光源は、観察対象の照明用と、観察対象から発生する蛍光の光増幅用との共通の光源として機能し、この励起光源から射出された励起光の一部が観察対象の励起に寄与し、残りの一部が光増幅に寄与することになる。
【００２１】
このように、一つの励起光源を、観察対象の照明用と光増幅用とに共用することで、それらを別々の励起光源とする場合と比較して、装置の小型化、構成の簡略化、コストダウンを図りながら、観察対象から発生する蛍光を高いＳＮ比で検出することが可能となる。
【００２２】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出装置においては、前記観察対象に照射する励起光と、前記光増幅器により前記蛍光を光増幅するための励起光との光量比を調整する光量調整部を備える。
【００２３】
本発明によると、光量調整部により、観察対象に照射する励起光と、光増幅器により蛍光を光増幅するための励起光との光量比を最適化することが可能となる。これにより、例えば、観察対象に対してはダメージを与えないように比較的弱い励起照明とし、光増幅器に対しては十分な利得およびＳＮ比が得られるように比較的強い励起照明とすることができる。また、観察の目的や観察対象の種類等に応じて、光量比を最適に設定することが可能となる。
【００２４】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出装置においては、前記光増幅器を、利得媒質が添加された光ファイバを有して構成する。
【００２５】
このように構成すると、例えば、観察対象の近くに位置する対物レンズと、観察対象から離れて位置する励起光源を有する装置本体部との間を、利得媒質が添加された光ファイバにより光学的に接続することにより、該光ファイバを、装置本体部から対物レンズへの励起光の伝送と、対物レンズから装置本体部への蛍光の伝達と、該蛍光の光増幅との３つの機能を担わせることが可能となる。
【００２６】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出装置においては、前記利得媒質が添加された光ファイバを、内視鏡の挿入部に延在して配置する。
【００２７】
このように構成すれば、例えば、内視鏡型蛍光顕微鏡、蛍光内視鏡、ファイバスコープ型の蛍光内視鏡等を容易に構成することが可能となる。
【００２８】
本発明の一実施の形態に係る蛍光検出装置においては、前記光増幅器を、利得媒質が添加されたバルク状光学素子を有して構成する。
【００２９】
このように構成すれば、バルク状光学素子が容易に製造可能であることから、さらなるコストダウンが図れる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象から発生する蛍光を高いＳＮ比で検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の第１実施の形態に係る内視鏡型蛍光顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図２】図１に示す励起光強度バランスフィルタの光学特性を説明するための図である。
【図３】本発明の第２実施の形態に係る蛍光内視鏡の概略構成を示す図である。
【図４】本発明の第３実施の形態に係るファイバスコープ型の蛍光内視鏡の概略構成を示す図である。
【図５】本発明の第４実施の形態に係る蛍光顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図６】図５に示すダイクロイックミラーの光学特性を説明するための図である。
【図７】本発明の第５実施の形態に係る全反射蛍光顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図８】本発明の第６実施の形態に係るニポウディスク型共焦点蛍光顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図９】本発明の第７実施の形態に係る実験小動物用蛍光マクロ観察装置の概略構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００３３】
（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、内視鏡型蛍光顕微鏡１として構成されたもので、本体部１００と挿入部であるプローブ部１０１とを備える。本体部１００には、励起光源１０２、コリメートレンズ１０３、ダイクロイックミラー１０４、第１のリレーレンズ１０５、励起光カットフィルタ１０６、結像レンズ１０７および光検出器１０８が配置されている。また、プローブ部１０１は、可撓部１０１ａおよび先端部１０１ｂからなり、可撓部１０１ａには、光増幅器を構成する光ファイバ１１０が延在して配置されており、先端部１０１ｂには、第２のリレーレンズ１１１、光量調整部を構成する励起光強度バランスフィルタ１１２、スキャナ１１３および顕微鏡対物レンズ１１４が配置されている。
【００３４】
図１において、本体部１００の励起光源１０２から射出された励起光は、コリメートレンズ１０３でコリメートされてダイクロイックミラー１０４で反射された後、第１のリレーレンズ１０５を経てプローブ部１０１の光ファイバ１１０に入射する。光ファイバ１１０には、蛍光を増幅するための利得媒質が添加されており、該光ファイバ１１０に入射した励起光は、その一部が、該光ファイバ１１０に吸収されて利得媒質を励起し、吸収されなかった残りの励起光が、該光ファイバ１１０から射出されて、第２のリレーレンズ１１１を経て励起光強度バランスフィルタ１１２に入射する。
【００３５】
励起光強度バランスフィルタ１１２は、入射した励起光を所定の割合で透過させる。そして、励起光強度バランスフィルタ１１２を透過した励起光は、スキャナ１１３を経て顕微鏡対物レンズ１１４により観察対象１１５に集光される。これにより、観察対象１１５の集光部位を構成する分子または集光部位に含まれる蛍光色素が励起されて、蛍光が発生する。
【００３６】
観察対象１１５から発生した蛍光は、顕微鏡対物レンズ１１４、スキャナ１１３、励起光強度バランスフィルタ１１２および第２のリレーレンズ１１１を経て光ファイバ１１０に入射する。ここで、光ファイバ１１０は、往路において既に利得媒質が励起されているので、蛍光が入射すると誘導放出を起こして、入射した蛍光を光増幅して射出する。
【００３７】
光ファイバ１１０で光増幅されて射出される蛍光は、第１のリレーレンズ１０５を経てダイクロイックミラー１０４に入射する。ダイクロイックミラー１０４を透過した蛍光は、励起光カットフィルタ１０６に入射し、ここで入射光に含まれる不要な励起光がカットされて、結像レンズ１０７により光検出器１０８に集光されて光電変換される。そして、プローブ部１０１側において、励起光がスキャナ１１３の作用により観察対象１１５をスキャンするのに伴って、観察対象１１５の蛍光強度分布を反映した信号が得られる。
【００３８】
上記構成において、光ファイバ１１０に添加される利得媒質は、種々の元素、例えば、プラセオジム(Pr)、ネオジム (Nd)、ホルミウム(Ho)、エルビウム(Er)、ツリウム(Tm)、イッテルビウム(Yb)、テルビウム(Tb)等が利用可能であるが、特に可視域の蛍光を増幅する場合は、プラセオジム、ホルミウム、エルビウム、ツリウムやテルビウムが有効である。また、スキャナ１１３は、光学的走査が可能であれば良く、例えばMEMS(micro electro mechanical systems)型ガルバノミラーを用いて構成することもできるし、光ファイバ１１０の対物レンズ側端部を、アクチュエータにより光軸と直交する方向に駆動するように構成することもできる。なお、図１では、スキャナ１１３によりスキャンされる光路のうち、軸上光路を符号１１６CTで示し、軸外光路を符号１１６PRで示している。
【００３９】
図２は、励起光強度バランスフィルタ１１２の光学特性を説明するための図で、図２（ａ）は励起光強度バランスフィルタ１１２に入射する励起光および蛍光のスペクトル分布を示し、図２（ｂ）は励起光強度バランスフィルタ１１２の分光透過率特性を示す。なお、図２（ａ）において、蛍光のスペクトル強度は、図面を明瞭とするため強調して示している。図２に示すように、励起光強度バランスフィルタ１１２は、励起光の波長λEX（例えば、４８８ｎｍ）における透過率TEXを比較的低く、逆に、蛍光の波長帯域λFL1〜λFL2（例えば、５００ｎｍ〜６００ｎｍ）における透過率TFLは、比較的高くなるように構成する。このような励起光強度バランスフィルタ１１２は、例えば、ダイクロイックフィルタ等の誘電体多層膜フィルタ、チューナブルフィルタ、ファブリペロ干渉計等により構成することができる。
【００４０】
このように、励起光強度バランスフィルタ１１２を構成して、該励起光強度バランスフィルタ１１２を光ファイバ１１０と観察対象１１５との間に配置することにより、励起光源１０２から射出される励起光のうち比較的高い割合を光ファイバ１１０に入射させて励起させながら、観察対象１１５に対しては、光ファイバ１１０を透過した励起光のうち透過率TEXによって制限された比較的低い割合の励起光を照射することができる。また、観察対象１１５から発した蛍光を、励起光強度バランスフィルタ１１８における透過率TFLによって、その大部分を光ファイバ１１０に入射させることができる。
【００４１】
これにより、光ファイバ１１０の励起および蛍光増幅作用をほとんど妨げることなく、観察対象１１５を照射する励起光を適度に弱めて、観察対象１１５が励起光によって受けるダメージ（例えば、蛍光色素の退色）を低減することができる。すなわち、観察対象１１５に照射する励起光と、光ファイバ１１０に入射させて蛍光を光増幅する励起光との光量比を最適化することができる。
【００４２】
以上のように、本実施の形態に係る内視鏡型蛍光顕微鏡１によれば、一つの励起光源１０２から射出される励起光を、観察対象１１５の照明用と、光ファイバ１１０による光増幅用とに最適化して用いるようにしたので、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象１１５から発生する蛍光が弱い場合でも、光ファイバ１１０により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。また、可撓部１０１ａの撓み作用により、本体部１００を移動させることなく、先端部１０１ｂの位置や方向を任意に変えることができ、さらにプローブ部１０１を生体の狭まった部位や管腔・内腔部に入れることができるので、例えば、実験動物や実験小動物の体内に挿入して蛍光観察を容易に行うことができる。したがって、本実施の形態によれば、生体内の組織や細胞の蛍光顕微鏡画像を高感度に観察できる内視鏡型蛍光顕微鏡１を提供することができ、特に、医学・生物学の研究に供することができる。
【００４３】
（第２実施の形態）
図３は、本発明の第２実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、蛍光内視鏡２として構成されたものである。この蛍光内視鏡２は、被検部位の自家蛍光や、病変部に特異的に結合する蛍光色素が発する蛍光を観察することによって診断を行う医療機器であり、対物レンズとして内視鏡対物レンズ２０１を用いることを除き、全体の構成および各部の作用は、図１に示した内視鏡型蛍光顕微鏡１と基本的に同じである。したがって、図１に示した構成要素と、同一作用を成す構成要素には、同一参照符号を付して説明を省略する。
【００４４】
本実施の形態に係る蛍光内視鏡２においても、第１実施の形態と同様に、一つの励起光源１０２から射出される励起光を用いることで、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象２０２から発生する蛍光が弱い場合でも、光ファイバ１１０により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００４５】
（第３実施の形態）
図４は、本発明の第３実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、ファイバスコープ型の蛍光内視鏡３として構成されたもので、内視鏡本体部３００と挿入部であるプローブ部３０１とを備える。内視鏡本体部３００には、励起光源３０２、励起光集光レンズ３０３、ダイクロイックミラー３０４、リレーレンズ３０５、励起光カットフィルタ３０６、結像レンズ３０７および撮像素子３０８が配置されている。また、プローブ部３０１は、可撓部３０１ａおよび先端部３０１ｂからなり、可撓部３０１ａには、多数の光ファイバを束ねてなる光ファイババンドル３１０が延在して配置され、先端部３０１ｂには、励起光強度バランスフィルタ３１２および内視鏡対物レンズ３１４が配置されている。
【００４６】
図４において、内視鏡本体部３００の励起光源３０２から射出された励起光は、励起光集光レンズ３０３で集光されてダイクロイックミラー３０４で反射された後、リレーレンズ３０５を経てプローブ部３０１の光ファイババンドル３１０の後端部３１０ａの端面全体に入射する。光ファイババンドル３１０は、各々の光ファイバが光増幅器を構成するもので、各光ファイバには、第１実施の形態における光ファイバ１１０と同様の蛍光を増幅するための利得媒質が添加されている。そして、光ファイババンドル３１０に入射した励起光は、その一部が、各光ファイバに吸収されて利得媒質を励起し、吸収されなかった残りの励起光が、光ファイババンドル３１０の先端部３１０ｂの端面から射出されて、励起光強度バランスフィルタ３１２に入射する。
【００４７】
励起光強度バランスフィルタ３１２は、光量調整部を構成するもので、第１実施の形態における励起光強度バランスフィルタ１１２と同様に構成され、入射した励起光を所定の割合で透過させる。そして、励起光強度バランスフィルタ３１２を透過した励起光は、内視鏡対物レンズ３１４により観察対象３１５の画像観察領域に対応する照明領域（視野）３１６を照明する。これにより、観察対象３１５の照明領域３１６内の分子または照明領域に含まれる蛍光色素が励起されて、蛍光が発生する。
【００４８】
観察対象３１５の照明領域３１６から発生した蛍光は、内視鏡対物レンズ３１４により励起光強度バランスフィルタ３１２を経て光ファイババンドル３１０の先端部３１０ｂの端面に集光されて、該先端面に照明領域３１６の蛍光像が結像される。そして、この先端面に結像された蛍光像は、光ファイババンドル３１０を経て光増幅されて伝送され、これにより後端部３１０ａの端面に光増幅された蛍光像が形成される。
【００４９】
この後端部３１０ａの端面に形成される光増幅された蛍光像は、リレーレンズ３０５およびダイクロイックミラー３０４を経て励起光カットフィルタ３０６に入射され、ここで蛍光像に含まれる不要な励起光がカットされて、結像レンズ３０７により撮像素子３０８上に結像されて光電変換される。
【００５０】
したがって、本実施の形態においても、上記実施の形態と同様に、一つの励起光源３０２から射出される励起光を用いることで、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象３１５の蛍光像が弱い場合でも、光ファイババンドル３１０により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００５１】
（第４実施の形態）
図５は、本発明の第４実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、蛍光顕微鏡４として構成されたもので、上述した実施の形態と同様に、一つの励起光源４０１を有する。図５において、励起光源４０１から射出された励起光は、第１のコリメートレンズ４０２でコリメートされてダイクロイックミラー４０３に入射し、該ダイクロイックミラー４０３を透過および反射して二つの励起光に分離される。
【００５２】
ダイクロイックミラー４０３を透過した一方の励起光は、反射ミラー４０４で反射されて再びダイクロイックミラー４０３に入射し、ここで反射される励起光が、スキャナ４０５および瞳リレーレンズ４０６を経て顕微鏡対物レンズ４０７により観察対象４０８に集光される。これにより、観察対象４０８の集光部位を構成する分子または集光部位に含まれる蛍光色素が励起されて、蛍光が発生する。
【００５３】
この観察対象４０８から発生した蛍光は、顕微鏡対物レンズ４０７により捕集されて、瞳リレーレンズ４０６およびスキャナ４０５を経てダイクロイックミラー４０３に入射する。そして、ダイクロイックミラー４０３に入射した蛍光は、該ダイクロイックミラー４０３を透過して、第１の結像レンズ４１０、第１の共焦点ピンホール４１１および第２のコリメートレンズ４１２を経て、利得媒質が添加されたバルク状光学素子４１３に入射する。なお、第１の共焦点ピンホール４１１は、顕微鏡対物レンズ４０７の焦点以外からの光を遮光して、観察対象４０８の三次元計測を行うためのピンホールである。
【００５４】
一方、励起光源４０１から射出されてダイクロイックミラー４０３で反射される他方の励起光は、第１の結像レンズ４１０、第１の共焦点ピンホール４１１および第２のコリメートレンズ４１２を経てバルク状光学素子４１３に入射し、該バルク状光学素子４１３の利得媒質を励起する。これにより、バルク状光学素子４１３に入射した観察対象４０８からの蛍光は、光増幅されて該バルク状光学素子４１３から射出される。
【００５５】
バルク状光学素子４１３から射出された蛍光は、励起光カットフィルタ４１４により不要な励起光がカットされた後、第２の結像レンズ４１５により第２の共焦点ピンホール４１６に集光されて、バルク状光学素子４１３から発生する不所望な自然放出光が遮光され、この第２の共焦点ピンホール４１６を透過した蛍光が第３の結像レンズ４１７により光検出器４１８に集光されて光電変換される。そして、観察対象４０８に照射される励起光が、スキャナ４０５によりスキャンされるのに伴って、観察対象４０８の蛍光強度分布を反映した信号が得られる。なお、図５では、スキャナ４０５によりスキャンされる光路のうち、軸上光路を符号４１９CTで示し、軸外光路を符号４１９PRで示している。
【００５６】
ここで、ダイクロイックミラー４０３は、観察対象４０８に照射する励起光と、バルク状光学素子４１３により蛍光を光増幅する励起光との光量比を最適化する光量調整部を構成する。図６は、このダイクロイックミラー４０３の光学特性を説明するための図で、図６（ａ）はダイクロイックミラー４０３に入射する励起光および蛍光のスペクトル分布を示し、図６（ｂ）および（ｃ）はそれぞれダイクロイックミラー４０３の分光反射率特性および分光透過率特性を示す。なお、図６（ａ）において、蛍光のスペクトル強度は、図面を明瞭とするため強調して示している。
【００５７】
図６から明らかなように、ダイクロイックミラー４０３は、励起光の波長λEXにおける反射率REXを比較的高く、逆に、蛍光の波長帯域λFL1〜λFL2における反射率RFLは、極力低くなるように構成する。そしてその結果、励起光の波長λEXにおける透過率TEXは、比較的低く、逆に、蛍光の波長帯域λFL1〜λFL2における透過率TFLは、高いものになる。
【００５８】
このように構成することにより、一つの励起光源４０１から射出される励起光のうち、ダイクロイックミラー４０３で一回反射したもの、すなわち割合にしてREX相当分を光増幅用として用い、またダイクロイックミラー４０３で一回透過し一回反射したもの、すなわち割合にしてTEX×REX相当分を観察対象４０８の照明用として用いることができる。これにより、観察対象に照射する励起光と、光増幅器により蛍光を光増幅するための励起光との光量比を最適化することが可能となる。したがって、上述した実施の形態と同様に、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象４０８からの蛍光が弱い場合でも、バルク状光学素子４１３により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００５９】
（第５実施の形態）
図７は、本発明の第５実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、全反射蛍光顕微鏡５として構成されたもので、上述した実施の形態と同様に、一つの励起光源５０１を有する。図７において、励起光源５０１から射出された励起光は、第１のコリメートレンズ５０２でコリメートされてビームスプリッター５０３に入射し、該ビームスプリッター５０３を透過および反射して二つの励起光に分離される。
【００６０】
ビームスプリッター５０３を透過した一方の励起光は、反射ミラー５０４、コンデンサレンズ系５０５および反射ミラー５０６を経て、顕微鏡対物レンズ５０７の瞳の周縁部から観察対象５０８を収容するサンプル容器５０９に照射される。このとき、照明光がサンプル容器５０９と観察対象５０８との間で全反射を生じる条件を満たすようにする。この照明光の全反射により発生するエバネッセント光により観察対象５０８が照明されて蛍光が励起される。そして、この観察対象５０８から発生した蛍光は、顕微鏡対物レンズ５０７により捕集されて、集光レンズ５１０により、利得媒質が添加されたバルク状光学素子５１１内に集光される。
【００６１】
一方、励起光源５０１から射出されてビームスプリッター５０３で反射される他方の励起光は、バルク状光学素子５１１に入射して、該バルク状光学素子５１１の利得媒質を励起する。これにより、バルク状光学素子５１１に入射した観察対象５０８からの蛍光は、光増幅されて該バルク状光学素子５１１から射出される。そして、このバルク状光学素子５１１から射出される蛍光は、第２のコリメートレンズ５１２および励起光カットフィルタ５１３を経て結像レンズ５１４により撮像素子５１５に結像される。
【００６２】
ここで、ビームスプリッター５０３は、観察対象５０８を全反射照明する励起光と、バルク状光学素子５１１により蛍光を光増幅するための励起光との光量比を最適化する光量調整部を構成する。これにより、本実施の形態においても、上記実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００６３】
（第６実施の形態）
図８は、本発明の第６実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、ニポウディスク型共焦点蛍光顕微鏡６として構成されたもので、上述した実施の形態と同様に、一つの励起光源６０１を有する。図８において、励起光源６０１から射出された励起光は、第１のコリメートレンズ６０２でコリメートされて、マイクロレンズアレイディスク６０３、ダイクロイックミラー６０４およびピンホールアレイディスク６０５を経て、利得媒質が添加されたバルク状光学素子６０６に入射される。
【００６４】
マイクロレンズアレイディスク６０３には、多数のマイクロレンズが渦巻き状に配列されている。また、ピンホールアレイディスク６０５は、いわゆるニポウディスクと同様のものであり、これにはマイクロレンズアレイディスク６０３の多数のマイクロレンズと対を成す多数のピンホールが、同様に渦巻き状に配列されている。これらマイクロレンズアレイディスク６０３およびピンホールアレイディスク６０５は、モータ６０７により一体に回転される。
【００６５】
バルク状光学素子６０６に入射した励起光は、その一部が、該バルク状光学素子６０６に吸収されて利得媒質を励起し、吸収されなかった残りの励起光が、該バルク状光学素子６０６から射出されて、第２のコリメートレンズ６０８を経て励起光強度バランスフィルタ６０９に入射する。励起光強度バランスフィルタ６０９は、光量調整部を構成するもので、上記第１〜３実施の形態の励起光強度バランスフィルタと同様に、入射した励起光を所定の割合で透過させる。そして、励起光強度バランスフィルタ６０９を透過した励起光は、顕微鏡対物レンズ６１０により観察対象６１１に集光される。これにより、観察対象６１１の集光部位を構成する分子または集光部位に含まれる蛍光色素が励起されて、蛍光が発生する。
【００６６】
また、観察対象６１１から発生した蛍光は、顕微鏡対物レンズ６１０、励起光強度バランスフィルタ６０９および第２のコリメートレンズ６０８を経てバルク状光学素子６０６に入射して光増幅される。この光増幅された蛍光は、ピンホールアレイディスク６０５を経てダイクロイックミラー６０４で反射されて、第３のコリメートレンズ６１２を経て励起光カットフィルタ６１３に入射し、ここで不要な励起光がカットされて、結像レンズ６１４により撮像素子６１５に結像される。そして、モータ６０７によるマイクロレンズアレイディスク６０３およびピンホールアレイディスク６０５の回転により、観察対象６１１がスキャンされるのに伴って、観察対象６１１の蛍光強度分布を反映した蛍光画像が得られる。
【００６７】
したがって、本実施の形態においても、上記実施の形態と同様に、一つの励起光源６０１から射出された励起光を、観察対象６１１の照明用と、観察対象６１１から発生した蛍光の光増幅用とに用いることで、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象６１１からの蛍光が弱い場合でも、バルク状光学素子６０６により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００６８】
（第７実施の形態）
図９は、本発明の第７実施の形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。この蛍光検出装置は、実験小動物用蛍光マクロ観察装置７として構成されたもので、上述した実施の形態と同様に、一つの励起光源７０１を有する。図９において、励起光源７０１から射出された励起光は、励起光集光レンズ７０２で集光されてダイクロイックミラー７０３で反射された後、利得媒質が添加されたバルク状光学素子７０４に入射される。
【００６９】
バルク状光学素子７０４に入射した励起光は、その一部が、該バルク状光学素子７０４に吸収されて利得媒質を励起し、吸収されなかった残りの励起光が、該バルク状光学素子７０４から射出されて、励起光強度バランスフィルタ７０５に入射する。励起光強度バランスフィルタ７０５は、光量調整部を構成するもので、上記第６実施の形態の励起光強度バランスフィルタ６０９と同様に、入射した励起光を所定の割合で透過させる。そして、励起光強度バランスフィルタ７０５を透過した励起光は、対物レンズ７０６により実験小動物である観察対象７０７の画像観察領域を照明する。これにより、観察対象７０７が励起されて、蛍光が発生する。
【００７０】
観察対象７０７から発生した蛍光は、対物レンズ７０６および励起光強度バランスフィルタ７０５を経てバルク状光学素子７０４に入射して光増幅され、その光増幅された蛍光が、ダイクロイックミラー７０３を透過し、さらに励起光カットフィルタ７０８で不要な励起光がカットされた後、結像レンズ７０９により撮像素子７１０上に結像されて光電変換される。
【００７１】
このように、本実施の形態においても、上記実施の形態と同様に、一つの励起光源７０１から射出された励起光を、観察対象７０７の照明用と、観察対象７０７から発生した蛍光の光増幅用とに用いることで、装置の大型化、複雑化およびコストアップを招くことなく、観察対象７０７からの蛍光が弱い場合でも、バルク状光学素子７０４により光増幅して、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００７２】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、光量調整部を構成する励起光強度バランスフィルタやダイクロイックミラーは、観察の目的や観察対象の種類等、あるいは、使用する励起光の波長や検出する蛍光の波長等に応じて、交換あるいは切り替え可能に構成することができる。
【符号の説明】
【００７３】
１ 内視鏡型蛍光顕微鏡
２，３ 蛍光内視鏡
４ 蛍光顕微鏡
５ 全反射蛍光顕微鏡
６ ニポウディスク型共焦点蛍光顕微鏡
７ 実験小動物用蛍光マクロ観察装置
１００，３００ 本体部
１０１，３０１ プローブ部
１０２，３０２，４０１，５０１，６０１，７０１ 励起光源
１０８，４１８ 光検出器
１１０ 光ファイバ
１１２，３１２，６０９，７０５ 励起光強度バランスフィルタ
１１５，２０２，３１５，４０８，５０８，６１１，７０７ 観察対象
３０８，５１５，６１５，７１０ 撮像素子
３１０ 光ファイババンドル
１０４，３０４，４０３，６０４，７０３ ダイクロイックミラー
５０３ ビームスプリッター
４１３，５１１，６０６，７０４ バルク状光学素子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光源から射出される励起光を観察対象に照射し、該観察対象から発生する蛍光を光増幅器により光増幅して検出するにあたり、
前記励起光源から射出される励起光を前記光増幅器に入射させて、前記観察対象から発生する蛍光を光増幅する、ことを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
前記励起光源から射出される励起光を、前記光増幅器を経て前記観察対象に照射する、ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記励起光源から射出される励起光を、少なくとも二つの励起光に分離し、該分離された一方の励起光を前記観察対象に照射し、前記分離された他方の励起光を前記光増幅器に入射させる、ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
励起光源から射出される励起光を観察対象に照射し、該観察対象から発生する蛍光を光増幅器により光増幅して検出する蛍光検出装置において、
前記励起光源から射出される励起光を前記光増幅器に入射させて、前記観察対象から発生する蛍光を光増幅するように構成した、ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項５】
前記観察対象に照射する励起光と、前記光増幅器により前記蛍光を光増幅するための励起光との光量比を調整する光量調整部を備える、ことを特徴とする請求項４に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記光増幅器は、利得媒質が添加された光ファイバを有する、ことを特徴とする請求項４または５に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記光ファイバは、内視鏡の挿入部に延在して配置されている、ことを特徴とする請求項６に記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
前記光増幅器は、利得媒質が添加されたバルク状光学素子を有する、ことを特徴とする請求項４または５に記載の蛍光検出装置。
【請求項１】
励起光源から射出される励起光を観察対象に照射し、該観察対象から発生する蛍光を光増幅器により光増幅して検出するにあたり、
前記励起光源から射出される励起光を前記光増幅器に入射させて、前記観察対象から発生する蛍光を光増幅する、ことを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
前記励起光源から射出される励起光を、前記光増幅器を経て前記観察対象に照射する、ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記励起光源から射出される励起光を、少なくとも二つの励起光に分離し、該分離された一方の励起光を前記観察対象に照射し、前記分離された他方の励起光を前記光増幅器に入射させる、ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
励起光源から射出される励起光を観察対象に照射し、該観察対象から発生する蛍光を光増幅器により光増幅して検出する蛍光検出装置において、
前記励起光源から射出される励起光を前記光増幅器に入射させて、前記観察対象から発生する蛍光を光増幅するように構成した、ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項５】
前記観察対象に照射する励起光と、前記光増幅器により前記蛍光を光増幅するための励起光との光量比を調整する光量調整部を備える、ことを特徴とする請求項４に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記光増幅器は、利得媒質が添加された光ファイバを有する、ことを特徴とする請求項４または５に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記光ファイバは、内視鏡の挿入部に延在して配置されている、ことを特徴とする請求項６に記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
前記光増幅器は、利得媒質が添加されたバルク状光学素子を有する、ことを特徴とする請求項４または５に記載の蛍光検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−１９６８７３（Ｐ２０１１−１９６８７３Ａ）
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６５１６８（Ｐ２０１０−６５１６８）
【出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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