質量分析装置および質量分析方法
【課題】
検出可能なフラグメントイオンのピークの数を増やした、電子捕獲解離を用いる質量分析装置を提供する。
【解決手段】
本発明の質量分析装置は、試料からイオンの生成を行うイオン源２と、イオンの蓄積および選択を行うイオントラップ部３と、イオンを電子捕獲解離するイオン解離部４と、イオンの質量分析を行う飛行時間質量分析部７と、を備えた質量分析装置であって、質量分析を行ったイオンの価数に応じて電子捕獲解離の反応時間が可変である。
検出可能なフラグメントイオンのピークの数を増やした、電子捕獲解離を用いる質量分析装置を提供する。
【解決手段】
本発明の質量分析装置は、試料からイオンの生成を行うイオン源２と、イオンの蓄積および選択を行うイオントラップ部３と、イオンを電子捕獲解離するイオン解離部４と、イオンの質量分析を行う飛行時間質量分析部７と、を備えた質量分析装置であって、質量分析を行ったイオンの価数に応じて電子捕獲解離の反応時間が可変である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子捕獲解離（ＥＣＤ）を行う質量分析装置および質量分析装置を用いた質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝情報を用いて生成されるタンパク質あるいはタンパク質をもとに細胞内で翻訳後に修飾され機能する生体高分子ペプチドの機能・構造解析が注目されている。
【０００３】
このような機能・構造解析の手段として、質量分析法が注目されている。質量分析法を用いることにより、アミノ酸がペプチド結合によりつながった生体高分子成分のタンパク質、ペプチド成分の配列情報を得ることが可能である。特に高周波電場を使用したイオントラップを有する質量分析装置は、特許文献１に開示されるように、イオントラップ部においてＭＳｎ測定を行うことが可能である。
【０００４】
試料をイオン化部でイオン化した後、イオントラップ部に導入し、イオンを蓄積する。次に、ＦＮＦ（Filtered Noise Field）を用いて、親イオンを単離する。次に、衝突励起解離（Collision Induced Dissociation：ＣＩＤ）を起こさせ、解離したイオンをイオン検出部により検出し、ＭＳｎスペクトルを得る。このようなイオントラップや飛行時間型質量分析法（Time of Flight：ＴＯＦ）は高速分析が可能なため、液体クロマトグラフィーなどの試料分離を行う方法との結合性が高いため、試料の連続解析を行うことが重要とされているプロテオーム解析などで幅広く使用されている。
【０００５】
現在、タンパク質・ペプチド解析分野において、最も広く使用されている手法が前記のＣＩＤである。この手法を用いてアミノ酸で構成されるペプチドを解離した場合、ａ−ｘ，ｂ−ｙで帰属される部位で優先的に解離される。しかし、アミノ酸の配列によっては、解離しにくい部位がある。また、ＣＩＤでイオン解離を行った場合、翻訳後修飾を受けたペプチドなどは、翻訳後修飾による側鎖が切れやすい傾向があるため、検出されたイオンからは修飾分子種と修飾の有無の確認は可能であるが、修飾を受けたアミノ酸部位の判定は困難である。
【０００６】
一方、タンパク質・ペプチド解析分野において、他の解離手段として電子捕獲解離（Electron Capture Dissociation：ＥＣＤ）が注目されている。ＥＣＤはアミノ酸配列に依存せず（ただし例外として環状構造であるプロリン残基は切断しない）、アミノ酸配列の主鎖上のｃ−ｚ部位を１箇所を切断する。そのため、アミノ酸配列及び翻訳後修飾された分子種と修飾部位を質量分析法のみで完全解析することが可能となる。
【０００７】
近年、特許文献２に開示されるように、イオントラップ部においてＥＣＤを可能な質量分析装置が開発されている。このような装置では、１台の装置で、ＣＩＤ測定とＥＣＤ測定が行えるため、多くの生体高分子に関する解析情報を取得することが可能であり、注目されている。そのため、液体クロマトグラフィーとの結合性は良いため、高速度でＥＣＤでのタンパク質・ペプチド解析を行うことが重要となる。
【０００８】
タンパク質・ペプチド構造解析分野において、構造解析に有用なスペクトルを取得するためには、構造に起因する数多くのフラグメントイオンを効率良く高感度で検出することが重要である。
【０００９】
通常、一般的にペプチドの構造解析として用いられるＣＩＤでは親イオンだけを衝突励起解離しているため、フラグメントイオンの信号強度を増加させるには親イオンをできるだけ解離させることが重要である。そのため、ＣＩＤを行う時間やＣＩＤを行う電圧などをリアルタイムで調整する様々な方法が考案・実用されている。また、ＥＣＤにおいても親イオンをできるだけ解離させることが重要である。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４７３６１０１号
【特許文献２】特開２００６−２３４７８２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、ＥＣＤにおいて親イオンをできるだけ解離させた上でフラグメントイオンを検出した場合、検出可能なフラグメントイオンのピークの数が少なくなる場合がある、という問題があった（図６（ｂ）参照）。
【００１２】
本発明は、上記の問題を解決するものであり、その目的は、検出可能なフラグメントイオンのピークの数を増やすことである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の問題を解決するために、本発明の質量分析装置および質量分析方法は、質量分析を行ったイオンの価数の大きさに応じて前記電子捕獲解離の反応時間が可変である。ここでの質量分析は、電子捕獲解離を行う対象となる親イオンを選択するための、電子捕獲解離前の質量分析（ＭＳ１）である。
【００１４】
ＥＣＤ反応では、できるだけ多くの親イオンを解離させることが重要であるため、従来、ＥＣＤ反応時間としてできるだけ多くの親イオンの解離が可能なデフォルト値（固定値）を用いていた。その結果として、ＥＣＤ時間を長くしてしまっている場合があった。そのため、生成されたフラグメントイオンもＥＣＤ反応を起こし、フラグメントイオンが解離・中性化してしまい、フラグメントイオンの検出可能なピークが少なくなってしまっていた。
【００１５】
これに対して、本発明者らは、ＥＣＤ反応効率は、親イオンの価数に依存している、という点に着目した。そこで、本発明では、質量分析（ＭＳ１）を行ったイオンの価数に応じてＥＣＤ反応時間が可変になっている。これにより、電子捕獲解離の反応時間が質量分析（ＭＳ１）を行ったイオンの価数に応じて可変であるため、ＥＣＤの反応効率をイオンに合ったより適切なものにすることができ、結果として、フラグメントイオンの解離・中性化を防止することができ、ＥＣＤ反応後のフラグメントイオンの検出可能なピークを増やすことができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の質量分析装置および質量分析方法によれば、ＥＣＤ反応後に検出可能なフラグメントイオンのピークの数を増やすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の一実施の形態について図面を用いて説明する。
【００１８】
〔質量分析装置の構成〕
図１は、本発明の一実施形態の質量分析装置（本装置）を示す概略図である。
【００１９】
本装置は、イオン源（イオン源部）２，イオントラップ部３，偏向レンズ４，イオン解離部５，イオン輸送部６，飛行時間質量分析部（質量分析部）７、および制御部８を備えている。なお、この本装置への試料の導入は、例えば、液体クロマトグラフ１１により行われる。液体クロマトグラフ１１により分離された成分、例えばペプチド成分は、イオン源２へ導かれる。
【００２０】
イオン源２は、このペプチド成分をイオン化する。イオン源２としては、エレクトロスプレーイオン源（Electro Spray Ion Source：ＥＳＩ）を用いることができる。エレクトロスプレーイオン源は、タンパク質・ペプチドの有用な多価イオンを生成しやすい。
【００２１】
イオントラップ部３は、親イオンの純度を向上するために、イオンを蓄積するという機能、およびイオンを単離および蓄積するという機能等を有する。イオントラップ部３としては、例えばリニアトラップを用いることができる。また、イオンの単離・蓄積における、単離と蓄積は、同時に行ってもよいし、蓄積した後に単離してもよい。
【００２２】
偏向レンズ４は、ＥＣＤ測定を行うのか否かにより動作が切り替えられる。イオン解離部５においてＥＣＤ測定を行う場合には、後述する親イオン決定部５２が決定し、かつ、イオントラップ部３にて単離および蓄積した親イオンをイオン解離部５へ導入する。イオン解離部５においてＥＣＤ測定を行わない場合には、イオントラップ部３が蓄積したイオンを質量分析部１７へ導入する。
【００２３】
イオン解離部５は、親イオン決定部５２が決定した親イオンを解離して（電子捕獲解離して）、フラグメントイオンとする。イオン解離部５は、電子源を備えている。また、イオン解離部５としては、ＥＣＤ（Electron Capture Dissociation）反応可能なリニアトラップを用いることができる。
【００２４】
イオン輸送路６は、ＥＣＤ反応後にイオン解離部５から排出されたフラグメントイオンの質量分析部７への輸送、および、質量分析（ＭＳ１）前にイオントラップ部３が蓄積したイオンの質量分析部７への輸送を行う。
【００２５】
質量分析部７は、飛行時間型（Time of Flight：ＴＯＦ）の質量分析部７であり、イオントラップ部３において蓄積されたイオンの中から親イオンを選択するための質量分析（ＭＳ１）と、イオン解離部５においてＥＣＤ反応されたフラグメントイオンを用いた高分解能測定（質量分析；ＭＳ２）と、を行う。なお、質量分析部７は、ＴＯＦ型質量分析部に限らず、ＦＴ−ＩＣＲでもよい。制御部８は、イオントラップ部３等の各部材の動作を制御する。
【００２６】
制御部８は、価数判定部４０，ピーク判定部４１，反応時間切替部４２、および親イオン決定部５２を備えている。
【００２７】
価数判定部４０は、質量分析（ＭＳ１）のスペクトルデータのピーク情報（ｍ／ｚ，強度，価数，同位体）からピークの価数が標準試料のピークの価数より大きいかどうかを判定する。ピーク判定部４１は、質量分析（ＭＳ１）のスペクトルデータのピークが所定のしきい値より大きいかどうかを判定する。親イオン決定部５２は、価数判定部４０およびピーク判定部４１の判定結果に基づき、親イオンを決定する。反応時間切替部４２は、決定された親イオンの価数に基づき反応時間を決定する。親イオン決定部５２は、質量分析（ＭＳ１）のスペクトルデータに基づき親イオンを決定する。この決定は、スペクトルデータのピークの信号強度が所定のしきい値を超えているかどうかにより判定する。信号強度が所定のしきい値を超えているものを親イオンとし、信号強度が所定のしきい値を超えていないものは親イオンでないとする。このような親イオンが複数存在する場合には、信号強度が高い順番に測定することができる。決定の仕方については、以下の（１）〜（３）において詳細に述べる。
【００２８】
さらに、制御部８は、フラグメントイオン強度総和測定部（強度総和測定部）５１および最適フラグメントイオン判定部５３を備えていてもよい。強度総和測定部５１は、フラグメントイオンの強度の総和を測定する。ＥＣＤの反応時間を変更して、強度総和測定部５１がそれぞれの反応時間におけるフラグメントイオンの強度の総和を求める。その結果、上記の最適フラグメントイオン判定部５３がフラグメントイオンの強度の総和が最も高くなるフラグメントイオンを選択する。選択後、反応時間切替部４２が選択されたフラグメントイオンに対応する反応時間をＥＣＤ反応時間とする。
【００２９】
この強度総和測定部５１および最適フラグメントイオン判定部５３は必須の構成要素ではなく、反応時間切替部４２は、強度総和測定部５１および最適フラグメントイオン判定部５３が設けられていない場合には、親イオンの価数に基づき反応時間を決定し、強度総和測定部５１および最適フラグメントイオン判定部５３が設けられている場合には、最適フラグメントイオン判定部５３による判定結果および親イオンの価数に基づき反応時間を決定する。
【００３０】
〔質量分析装置の一般的な動作〕
図２は、一般的な質量分析装置の動作の流れを示すフローチャートである。
【００３１】
図２に示すように、本装置は、次の順序で動作を行う。
（ｉ） イオン化・・・イオン源２が液体クロマトグラフ１１から得た成分をイオン化する。
（ii） イオン蓄積・・・イオン源２がイオン化したイオンをイオントラップ部３が蓄積する。
（iii） 質量分析（ＭＳ１）・・・質量分析部７がイオントラップ部３において蓄積されたイオンの中から親イオンを選択するための質量分析（ＭＳ１）を行う。
（iv） 親イオン決定・・・親イオン決定部５２は、価数判定およびピーク判定に基づき親イオンを決定する。ここでの親イオンの決定は、複数のものを選択して決定してもよい。その場合には、例えば信号強度の順にＭＳ２を行う。
（ｖ） 親イオンの単離・蓄積・・・決定された親イオンをイオントラップ部３が単離・蓄積する。つまり、イオントラップ部３が決定された親イオンを選択する。
（vi） ＥＣＤ（電子捕獲解離）実行・・・決定された親イオンに対してイオン解離部５が親イオンを解離してフラグメントイオンとする。
（vii） 質量分析（ＭＳ２）・・・ＥＣＤ反応されたフラグメントイオンに対して質量分析（ＭＳ２）を行う。
（viii） データ取得・・・質量分析（ＭＳ２）後のデータを取得する。
【００３２】
〔質量分析装置の特徴的動作〕
図３，図４は、本装置の特徴的な動作の流れを説明する、フローチャートである。特に図４は、本実施の形態の最重要部分を説明するためのフローチャートであり、ＥＣＤ反応時間をいかにして決定するかを説明するためのフローチャートである。
【００３３】
まず、質量分析（ＭＳ１）を行う（Ｓ１）。次に、価数判定部４０が価数を判定する（Ｓ２）。ここで、図示していないが、２価以上の価数のイオンが無い場合には、Ｓ１へ戻る。その後、ピーク判定部４１がイオンのピークを判定する（Ｓ３）。具体的には、ピーク判定部４１は、イオンのピークが所定のしきい値を超えているかどうかを判定する。なお、ここでは、価数判定→ピークの判定の順に記載しているが、判定の順序は逆でも良く、同時でもよい。
【００３４】
次に、親イオン決定部５２は、価数判定（Ｓ２）およびピーク判定（Ｓ３）の結果を用いて親イオンを決定する。これにより、この親イオンの価数が分かるため、この価数が３以上であるかどうかを判定する（Ｓ４）。ここで親イオンの決定手法について補足説明する。
（１）価数が２価以上のイオンが一つしか無く、そのイオンの信号強度が所定のしきい値より大きい場合には、そのイオンを親イオンとする。
（２）価数が２価以上のイオンが複数有る場合で、かつ、信号強度が所定のしきい値より大きいイオンが一つしか無い場合には、そのイオンを親イオンとする。
（３）価数が２価以上のイオンが複数有る場合で、かつ、信号強度が所定のしきい値より大きいイオンが複数有る場合には、最も信号強度の大きいイオンを親イオンとするか、または、信号強度の高い順に基づき複数のイオンを親イオンとする。
【００３５】
なお、以下のルーチンは、決定された親イオンは一つであると仮定して説明する。もし複数の親イオンを決定した場合には、質量分析（ＭＳ２）後に再びＳ４に戻って分析動作を行えばよく、この場合のそれ以上の説明は省略する。
【００３６】
親イオンの価数が３以上のものは、図４に示すルーチンへ進む。一方、イオンの価数が２のものは、Ｓ５へ進む。
【００３７】
Ｓ５において、制御部８は、使用者がフラグメントイオンの強度の総和確認機能を使うかどうかを判定する。具体的には、例えば使用者に対して該機能を使用するかどうかを問いかけ、使用者からの指示に基づき、使用するかどうかを判定する。
【００３８】
Ｓ５において上記の機能を使わない場合には、反応時間切替部４２は、ＥＣＤ反応の反応時間を切り替えずにデフォルト（予め規定した反応時間）とし、イオン解離部５は、決定された親イオンに対してＥＣＤ反応を行う（Ｓ６）。次に、質量分析部７が、ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ７）。ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）の後、制御部８がデータ取得を行う（Ｓ１３）。
【００３９】
一方、Ｓ５において上記の機能を使う場合には、反応時間切替部４２は、ＥＣＤ反応の反応時間を切り替えずにデフォルトとし、イオン解離部５は、親イオンに対してＥＣＤ反応を行う（Ｓ８）。次に、質量分析部７が、ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ９）。その後、ＥＣＤの反応時間を少なくとも２回変更して、それぞれの反応時間で質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ１０）。次に、最適フラグメントイオン判定部５３が上記の少なくとも３つの反応時間のうち、最適なフラグメントイオン強度総和となるものがあるかどうかを判定する（Ｓ１１）。Ｓ１１において、ＹＥＳの場合には、その場合の反応時間を選択して、データ取得する（Ｓ１３）。Ｓ１１において、ＮＯの場合には、もう一回、反応時間を変更して（Ｓ１２）、Ｓ１１へ戻る。
【００４０】
次に、図４を用いて、上記のＳ４がＹＥＳの場合（Ｓ２０）について説明する。Ｓ４がＹＥＳの場合、つまり、決定された親イオンの価数が３以上である場合、制御部８は、使用者がフラグメントイオンの強度の総和確認機能を使うかどうかを判定する（Ｓ２１）。
【００４１】
Ｓ２１において上記の機能を使わない場合には、反応時間切替部４２は、デフォルトの反応時間よりも小さく価数の大きさに応じた反応時間となるようにＥＣＤ反応の反応時間を切り替え、イオン解離部５は、決定された親イオンに対してＥＣＤ反応を行う（Ｓ２２）。次に、質量分析部７が、ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ２３）。ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）の後、制御部８がデータ取得を行う（Ｓ２９）。
【００４２】
一方、Ｓ２１において上記の機能を使う場合には、反応時間切替部４２は、デフォルトの反応時間よりも小さく価数の大きさに応じた反応時間をＥＣＤ反応の反応時間となるように切り替え、イオン解離部５は、親イオンに対してＥＣＤ反応を行う（Ｓ２４）。次に、質量分析部７が、ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ２５）。その後、ＥＣＤの反応時間を少なくとも２回変更して、それぞれの反応時間で質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ２６）。次に、最適フラグメントイオン判定部５３が上記の少なくとも３つの反応時間のうち、最適なフラグメントイオン強度総和となるものがあるかどうかを判定する（Ｓ２７）。Ｓ２７において、ＹＥＳの場合には、その場合の反応時間を選択して、データ取得する（Ｓ２９）。Ｓ２７において、ＮＯの場合には、もう一回、反応時間を変更して（Ｓ１２）、Ｓ１１へ戻る。
【００４３】
〔実験データ〕
次に図５〜図８を用いて、本実施の形態の効果を実際のデータを用いて説明する。本実施の形態の効果を示す図は、図７，図８であり、図５，図６はこの効果を導くための図である。図５（ａ）はＥＣＤ調整用サンプル（特許請求の範囲に記載の「既知の標準試料」）として用いるSubstance−Ｐ（アミノ酸配列：RPKPQQFFGLM）を測定したＭＳ１スペクトルを示しており、図５（ｂ）は同じくＥＣＤ調整用サンプルとして用いるSubstance−Ｐ（アミノ酸配列：RPKPQQFFGLM）を測定したＭＳ２によるＥＣＤフラグメントイオンのスペクトル（ＭＳ２スペクトル）を示している。
【００４４】
図５（ａ）（ｂ）において、横軸はｍ／ｚを示しており、縦軸は信号強度を示している。ＭＳ１で検出されている親イオンは２価イオンであり、この２価のイオンのピークを用いてフラグメントイオンの信号強度の総和が最大になる反応時間は１０ｍｓである。Substance−Ｐにより決定したＥＣＤ反応時間１０ｍｓをデフォルト値（特許請求の範囲に記載の「予め規定した反応時間」）として、他のペプチド成分の測定を行う。ここでは、ペプチド成分として例えばGhrelin（アミノ酸配列：ＧＳＳ（−ｎ−Octanoyl）FLSPEHGRVQQRKESKKPPAKLQPR）を用いる。
【００４５】
図６（ａ）は、Ghrelinを測定した際のＭＳ１スペクトルを示しており、図６（ｂ）は同じくGhrelinを測定した際のＭＳ２におけるＥＣＤ反応時間による１０ｍｓによるＥＣＤのフラグメントイオンのスペクトル（ＭＳ２スペクトル）を示している。図６（ａ）におけるGhrelinに由来する親イオンの中で一番信号強度の高いピークはｍ／ｚ４８２の７価イオンである。この７価のイオンを親イオンとして選択し、ＥＣＤ反応時間１０ｍｓでＥＣＤ反応を行った結果のフラグメントイオンでは、図６（ｂ）に示すように、アミノ酸残基数に対して生成したフラグメントイオンのスペクトルの数は少ない。そのため、本発明者らは、最適なＥＣＤ反応時間はSubstance−Ｐの親イオンの価数の２価に対し、Ghrelinの親イオン価数は７価であることから低く設定する必要があると判断した。
【００４６】
図７（ａ）（ｂ）は、図６（ｂ）において１０ｍｓとしたGhrelinのＥＣＤ測定時のＥＣＤ反応時間をそれぞれ５ｍｓ，３ｍｓに変更した場合の、ＥＣＤのフラグメントイオンのＥＣＤスペクトルを示す図である。図６（ｂ）に示すＥＣＤ反応時間１０ｍｓに対し、図７（ｂ）に示す５ｍｓではフラグメントイオンのスペクトルの数（フラグメントイオンのピークの数）が増加していることが確認できる。また、ＥＣＤ反応時間３ｍｓでは、図７（ａ）に示すように、親イオンのピーク強度比が増加している。このことから、選択した親イオンピークのＥＣＤ反応効率が減少している、ことが判断できる。このことからも、アミノ酸配列の構造解析を行うには、ＥＣＤ反応時間５ｍｓで取得したＥＣＤのフラグメントイオンが有用である。
【００４７】
図８は、ＥＣＤ反応で生成したフラグメントイオンの総和を反応時間毎に計算した結果である。ＥＣＤ反応により切断されるＣ−Ｚ系列のＣ及びＺ系列の各々の各価数後とのフラグメントイオンの信号強度の総和をグラフにしたものである。各反応時間におけるフラグメントイオンの総和から最大強度値は、５ｍｓであり、図７（ｂ）に示すフラグメントイオンのスペクトルにおけるフラグメントイオンの検出数の最大値及び親イオンの反応効率の結果と同等である。
【００４８】
ＥＣＤ反応時間１０ｍｓについては、ＥＣＤ時間（電子照射時間）が長いために生成されたフラグメントイオンもＥＣＤ反応を起こし、解離・中性化していることから、フラグメントイオンの信号強度の総和及びピーク本数も少ない結果である。このことから、親イオンの価数の増大に応じて、ＥＣＤ反応時間の減少、ＥＣＤで生成される反応時間の総和を確認することにより、液体クロマトグラフィーで分離されイオン化される様々な親イオンに対するＥＣＤの反応時間の最適化を行うことが可能となり、タンパク質・ペプチドのアミノ酸配列解析に有用な情報を多く取得することができる。
【００４９】
〔付記事項〕
イオンラップ部を具備したＥＣＤを可能な質量分析装置において、ＥＣＤ実行時にまず、マススペクトルの中からＥＣＤ反応を行う親イオンを判定する際の親イオンの価数を判定し、異なる親イオンの価数に応じてＥＣＤ実行時のＥＣＤ反応時間を変化させる。また、価数のみではなく、ＥＣＤ実行後の生成したフラグメントイオンの信号強度の総和を判定し、フラグメントイオンの信号強度の総和が最大になるＥＣＤ反応時間を設定することにより、課題を解決する。
【００５０】
本発明によれば、価数の異なる親イオンに応じてＥＣＤ反応時間を変化させることより、過剰なＥＣＤ反応時間によるＥＣＤのフラグメントイオンの解離・中性化を抑え、ＥＣＤのフラグメントイオンの信号強度を増加させることが出来る。また、ＥＣＤにより生成したフラグメントイオンの信号高度の総和を確認させながらＥＣＤ反応時間を最適化することが出来、高速度で有用なＥＣＤスペクトルを得ることが可能な質量分析方法及び装置を実現することができる。
【００５１】
本発明は、電子捕獲解離を具備した質量分析法を用いた制御方法であり、生体高分子の配列構造解析技術に関する。
【００５２】
一方、ＥＣＤにおいても親イオンをできるだけ解離させることが重要であるが、より多くの親イオンを解離させるためにＥＣＤ時間（電子照射時間）を長くすると、生成されたフラグメントイオンもＥＣＤ反応を起こし、解離・中性化してしまう。そのため、ＥＣＤ時間コントロールを行うことが重要となる。また、ＥＣＤの反応効率は、親イオンの価数、アミノ酸配列などに依存するところも多いことから、親イオンの情報によってＥＣＤの反応時間を調整することが、高速度ＥＣＤスペクトルを得ることが液体クロマトグラフィーとの結合において重要となる。
【００５３】
本発明は、上記課題を解決し、液体クロマトグラフィーとの結合において、ＥＣＤフラグメントイオンの反応効率の最適化、フラグメントイオンの信号強度を増加を行い、高速度で液体クロマトグラフィーとの結合において有用なＥＣＤスペクトルを得ることが可能な質量分析方法及び装置を実現することを目的としたものである。
【００５４】
また、本発明を次のように表現してもよい。
【００５５】
試料のイオン生成を行うイオン源部と、前記イオン生成部で生成されたイオンを２次元高周波電場と静電場とからなる２次元高周波イオントラップで蓄積，単離，解離，排出するイオントラップ部と、前記イオントラップ部から排出されたイオンを磁場を印加する２次元結合型イオントラップ及び電子線を発生する電子源を具備した反応セル内で電子線を照射し電子捕獲解離するイオン解離部と、前記イオン解離部から排出されたイオンの質量分析を行う質量分析部を具備する質量分析装置において、電子捕獲解離を行う目的イオンをイオントラップ部での単離制御と電子捕獲解離制御を行う制御部を有する質量分析装置の制御方法であり、前記イオントラップ部において電子捕獲解離を行った目的イオンに対応して、前記イオン解離部で前記目的イオンの解離効率を向上させることを特徴とする質量分析装置の制御方法。
【００５６】
前記イオントラップ部で目的イオンの単離を行う際に、前記制御部により価数の異なる目的イオンを判定し、選択を行い、単離された目的イオンの価数が高くなるに従い、電子捕獲解離を行うイオン解離部での解離反応時間を短くすることを特徴とする質量分析装置の制御方法。
【００５７】
前記イオントラップ部で目的イオンの単離を行い、前記制御部により価数の異なる目的イオンを判定し、選択を行った際に、単離された目的イオンの価数に応じて、電子捕獲解離を行うイオン解離部での解離反応時間の変化を制御部内で自動で解離反応時間を変化させることを特徴とする質量分析装置の制御方法。
【００５８】
前記イオントラップ部で目的イオンの単離を行う際に、前記制御部により価数の異なる目的イオンを判定し、選択を行い、単離された目的イオンを電子捕獲解離を行う解離部でイオン解離を行う際に、解離イオンの信号強度の総和を前記制御部で判定を行い、解離イオンの信号強度の総和が高くなるように解離反応時間を自動的に制御することを特徴とする質量分析装置の制御方法。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の質量分析装置は、液体クロマトグラフと共に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の質量分析装置の概略構成を示す図である。
【図２】一般的な質量分析装置の概略フローを示すフローチャートである。
【図３】本発明の質量分析装置の分析の流れを示すフローチャートである。
【図４】本発明の質量分析装置の分析の流れを示すフローチャートである。
【図５】（ａ）は標準サンプルを用いて質量分析（ＭＳ１）を行った場合のＭＳスペクトルを示す図であり、（ｂ）はこの標準サンプルを用いて質量分析（ＭＳ２）を行ったＥＣＤのフラグメントイオンのスペクトルを示す図である。
【図６】（ａ）はGhrelinを測定した際のＭＳ１スペクトルを示しており、（ｂ）はＥＣＤ反応時間を１０ｍｓとした場合のＥＣＤのフラグメントイオンのスペクトルを示す図である。
【図７】（ａ）は図６に対応しており、ＥＣＤ反応時間を３ｍｓにした場合のＥＣＤのフラグメントイオンを示す図であり、（ｂ）は、同じくＥＣＤ反応時間を５ｍｓにした場合のＥＣＤのフラグメントイオンのスペクトルを示す図である。
【図８】ＥＣＤ反応で生成したフラグメントイオンの総和を反応時間毎に計算した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００６１】
２ イオン源（イオン源部）
３ イオントラップ部
５ イオン解離部
７ 飛行時間質量分析部（質量分析部）
４０ 価数判定部
４１ ピーク判定部
４２ 反応時間切替部
５１ フラグメントイオン強度総和測定部（強度総和測定部）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子捕獲解離（ＥＣＤ）を行う質量分析装置および質量分析装置を用いた質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝情報を用いて生成されるタンパク質あるいはタンパク質をもとに細胞内で翻訳後に修飾され機能する生体高分子ペプチドの機能・構造解析が注目されている。
【０００３】
このような機能・構造解析の手段として、質量分析法が注目されている。質量分析法を用いることにより、アミノ酸がペプチド結合によりつながった生体高分子成分のタンパク質、ペプチド成分の配列情報を得ることが可能である。特に高周波電場を使用したイオントラップを有する質量分析装置は、特許文献１に開示されるように、イオントラップ部においてＭＳｎ測定を行うことが可能である。
【０００４】
試料をイオン化部でイオン化した後、イオントラップ部に導入し、イオンを蓄積する。次に、ＦＮＦ（Filtered Noise Field）を用いて、親イオンを単離する。次に、衝突励起解離（Collision Induced Dissociation：ＣＩＤ）を起こさせ、解離したイオンをイオン検出部により検出し、ＭＳｎスペクトルを得る。このようなイオントラップや飛行時間型質量分析法（Time of Flight：ＴＯＦ）は高速分析が可能なため、液体クロマトグラフィーなどの試料分離を行う方法との結合性が高いため、試料の連続解析を行うことが重要とされているプロテオーム解析などで幅広く使用されている。
【０００５】
現在、タンパク質・ペプチド解析分野において、最も広く使用されている手法が前記のＣＩＤである。この手法を用いてアミノ酸で構成されるペプチドを解離した場合、ａ−ｘ，ｂ−ｙで帰属される部位で優先的に解離される。しかし、アミノ酸の配列によっては、解離しにくい部位がある。また、ＣＩＤでイオン解離を行った場合、翻訳後修飾を受けたペプチドなどは、翻訳後修飾による側鎖が切れやすい傾向があるため、検出されたイオンからは修飾分子種と修飾の有無の確認は可能であるが、修飾を受けたアミノ酸部位の判定は困難である。
【０００６】
一方、タンパク質・ペプチド解析分野において、他の解離手段として電子捕獲解離（Electron Capture Dissociation：ＥＣＤ）が注目されている。ＥＣＤはアミノ酸配列に依存せず（ただし例外として環状構造であるプロリン残基は切断しない）、アミノ酸配列の主鎖上のｃ−ｚ部位を１箇所を切断する。そのため、アミノ酸配列及び翻訳後修飾された分子種と修飾部位を質量分析法のみで完全解析することが可能となる。
【０００７】
近年、特許文献２に開示されるように、イオントラップ部においてＥＣＤを可能な質量分析装置が開発されている。このような装置では、１台の装置で、ＣＩＤ測定とＥＣＤ測定が行えるため、多くの生体高分子に関する解析情報を取得することが可能であり、注目されている。そのため、液体クロマトグラフィーとの結合性は良いため、高速度でＥＣＤでのタンパク質・ペプチド解析を行うことが重要となる。
【０００８】
タンパク質・ペプチド構造解析分野において、構造解析に有用なスペクトルを取得するためには、構造に起因する数多くのフラグメントイオンを効率良く高感度で検出することが重要である。
【０００９】
通常、一般的にペプチドの構造解析として用いられるＣＩＤでは親イオンだけを衝突励起解離しているため、フラグメントイオンの信号強度を増加させるには親イオンをできるだけ解離させることが重要である。そのため、ＣＩＤを行う時間やＣＩＤを行う電圧などをリアルタイムで調整する様々な方法が考案・実用されている。また、ＥＣＤにおいても親イオンをできるだけ解離させることが重要である。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４７３６１０１号
【特許文献２】特開２００６−２３４７８２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、ＥＣＤにおいて親イオンをできるだけ解離させた上でフラグメントイオンを検出した場合、検出可能なフラグメントイオンのピークの数が少なくなる場合がある、という問題があった（図６（ｂ）参照）。
【００１２】
本発明は、上記の問題を解決するものであり、その目的は、検出可能なフラグメントイオンのピークの数を増やすことである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の問題を解決するために、本発明の質量分析装置および質量分析方法は、質量分析を行ったイオンの価数の大きさに応じて前記電子捕獲解離の反応時間が可変である。ここでの質量分析は、電子捕獲解離を行う対象となる親イオンを選択するための、電子捕獲解離前の質量分析（ＭＳ１）である。
【００１４】
ＥＣＤ反応では、できるだけ多くの親イオンを解離させることが重要であるため、従来、ＥＣＤ反応時間としてできるだけ多くの親イオンの解離が可能なデフォルト値（固定値）を用いていた。その結果として、ＥＣＤ時間を長くしてしまっている場合があった。そのため、生成されたフラグメントイオンもＥＣＤ反応を起こし、フラグメントイオンが解離・中性化してしまい、フラグメントイオンの検出可能なピークが少なくなってしまっていた。
【００１５】
これに対して、本発明者らは、ＥＣＤ反応効率は、親イオンの価数に依存している、という点に着目した。そこで、本発明では、質量分析（ＭＳ１）を行ったイオンの価数に応じてＥＣＤ反応時間が可変になっている。これにより、電子捕獲解離の反応時間が質量分析（ＭＳ１）を行ったイオンの価数に応じて可変であるため、ＥＣＤの反応効率をイオンに合ったより適切なものにすることができ、結果として、フラグメントイオンの解離・中性化を防止することができ、ＥＣＤ反応後のフラグメントイオンの検出可能なピークを増やすことができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の質量分析装置および質量分析方法によれば、ＥＣＤ反応後に検出可能なフラグメントイオンのピークの数を増やすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の一実施の形態について図面を用いて説明する。
【００１８】
〔質量分析装置の構成〕
図１は、本発明の一実施形態の質量分析装置（本装置）を示す概略図である。
【００１９】
本装置は、イオン源（イオン源部）２，イオントラップ部３，偏向レンズ４，イオン解離部５，イオン輸送部６，飛行時間質量分析部（質量分析部）７、および制御部８を備えている。なお、この本装置への試料の導入は、例えば、液体クロマトグラフ１１により行われる。液体クロマトグラフ１１により分離された成分、例えばペプチド成分は、イオン源２へ導かれる。
【００２０】
イオン源２は、このペプチド成分をイオン化する。イオン源２としては、エレクトロスプレーイオン源（Electro Spray Ion Source：ＥＳＩ）を用いることができる。エレクトロスプレーイオン源は、タンパク質・ペプチドの有用な多価イオンを生成しやすい。
【００２１】
イオントラップ部３は、親イオンの純度を向上するために、イオンを蓄積するという機能、およびイオンを単離および蓄積するという機能等を有する。イオントラップ部３としては、例えばリニアトラップを用いることができる。また、イオンの単離・蓄積における、単離と蓄積は、同時に行ってもよいし、蓄積した後に単離してもよい。
【００２２】
偏向レンズ４は、ＥＣＤ測定を行うのか否かにより動作が切り替えられる。イオン解離部５においてＥＣＤ測定を行う場合には、後述する親イオン決定部５２が決定し、かつ、イオントラップ部３にて単離および蓄積した親イオンをイオン解離部５へ導入する。イオン解離部５においてＥＣＤ測定を行わない場合には、イオントラップ部３が蓄積したイオンを質量分析部１７へ導入する。
【００２３】
イオン解離部５は、親イオン決定部５２が決定した親イオンを解離して（電子捕獲解離して）、フラグメントイオンとする。イオン解離部５は、電子源を備えている。また、イオン解離部５としては、ＥＣＤ（Electron Capture Dissociation）反応可能なリニアトラップを用いることができる。
【００２４】
イオン輸送路６は、ＥＣＤ反応後にイオン解離部５から排出されたフラグメントイオンの質量分析部７への輸送、および、質量分析（ＭＳ１）前にイオントラップ部３が蓄積したイオンの質量分析部７への輸送を行う。
【００２５】
質量分析部７は、飛行時間型（Time of Flight：ＴＯＦ）の質量分析部７であり、イオントラップ部３において蓄積されたイオンの中から親イオンを選択するための質量分析（ＭＳ１）と、イオン解離部５においてＥＣＤ反応されたフラグメントイオンを用いた高分解能測定（質量分析；ＭＳ２）と、を行う。なお、質量分析部７は、ＴＯＦ型質量分析部に限らず、ＦＴ−ＩＣＲでもよい。制御部８は、イオントラップ部３等の各部材の動作を制御する。
【００２６】
制御部８は、価数判定部４０，ピーク判定部４１，反応時間切替部４２、および親イオン決定部５２を備えている。
【００２７】
価数判定部４０は、質量分析（ＭＳ１）のスペクトルデータのピーク情報（ｍ／ｚ，強度，価数，同位体）からピークの価数が標準試料のピークの価数より大きいかどうかを判定する。ピーク判定部４１は、質量分析（ＭＳ１）のスペクトルデータのピークが所定のしきい値より大きいかどうかを判定する。親イオン決定部５２は、価数判定部４０およびピーク判定部４１の判定結果に基づき、親イオンを決定する。反応時間切替部４２は、決定された親イオンの価数に基づき反応時間を決定する。親イオン決定部５２は、質量分析（ＭＳ１）のスペクトルデータに基づき親イオンを決定する。この決定は、スペクトルデータのピークの信号強度が所定のしきい値を超えているかどうかにより判定する。信号強度が所定のしきい値を超えているものを親イオンとし、信号強度が所定のしきい値を超えていないものは親イオンでないとする。このような親イオンが複数存在する場合には、信号強度が高い順番に測定することができる。決定の仕方については、以下の（１）〜（３）において詳細に述べる。
【００２８】
さらに、制御部８は、フラグメントイオン強度総和測定部（強度総和測定部）５１および最適フラグメントイオン判定部５３を備えていてもよい。強度総和測定部５１は、フラグメントイオンの強度の総和を測定する。ＥＣＤの反応時間を変更して、強度総和測定部５１がそれぞれの反応時間におけるフラグメントイオンの強度の総和を求める。その結果、上記の最適フラグメントイオン判定部５３がフラグメントイオンの強度の総和が最も高くなるフラグメントイオンを選択する。選択後、反応時間切替部４２が選択されたフラグメントイオンに対応する反応時間をＥＣＤ反応時間とする。
【００２９】
この強度総和測定部５１および最適フラグメントイオン判定部５３は必須の構成要素ではなく、反応時間切替部４２は、強度総和測定部５１および最適フラグメントイオン判定部５３が設けられていない場合には、親イオンの価数に基づき反応時間を決定し、強度総和測定部５１および最適フラグメントイオン判定部５３が設けられている場合には、最適フラグメントイオン判定部５３による判定結果および親イオンの価数に基づき反応時間を決定する。
【００３０】
〔質量分析装置の一般的な動作〕
図２は、一般的な質量分析装置の動作の流れを示すフローチャートである。
【００３１】
図２に示すように、本装置は、次の順序で動作を行う。
（ｉ） イオン化・・・イオン源２が液体クロマトグラフ１１から得た成分をイオン化する。
（ii） イオン蓄積・・・イオン源２がイオン化したイオンをイオントラップ部３が蓄積する。
（iii） 質量分析（ＭＳ１）・・・質量分析部７がイオントラップ部３において蓄積されたイオンの中から親イオンを選択するための質量分析（ＭＳ１）を行う。
（iv） 親イオン決定・・・親イオン決定部５２は、価数判定およびピーク判定に基づき親イオンを決定する。ここでの親イオンの決定は、複数のものを選択して決定してもよい。その場合には、例えば信号強度の順にＭＳ２を行う。
（ｖ） 親イオンの単離・蓄積・・・決定された親イオンをイオントラップ部３が単離・蓄積する。つまり、イオントラップ部３が決定された親イオンを選択する。
（vi） ＥＣＤ（電子捕獲解離）実行・・・決定された親イオンに対してイオン解離部５が親イオンを解離してフラグメントイオンとする。
（vii） 質量分析（ＭＳ２）・・・ＥＣＤ反応されたフラグメントイオンに対して質量分析（ＭＳ２）を行う。
（viii） データ取得・・・質量分析（ＭＳ２）後のデータを取得する。
【００３２】
〔質量分析装置の特徴的動作〕
図３，図４は、本装置の特徴的な動作の流れを説明する、フローチャートである。特に図４は、本実施の形態の最重要部分を説明するためのフローチャートであり、ＥＣＤ反応時間をいかにして決定するかを説明するためのフローチャートである。
【００３３】
まず、質量分析（ＭＳ１）を行う（Ｓ１）。次に、価数判定部４０が価数を判定する（Ｓ２）。ここで、図示していないが、２価以上の価数のイオンが無い場合には、Ｓ１へ戻る。その後、ピーク判定部４１がイオンのピークを判定する（Ｓ３）。具体的には、ピーク判定部４１は、イオンのピークが所定のしきい値を超えているかどうかを判定する。なお、ここでは、価数判定→ピークの判定の順に記載しているが、判定の順序は逆でも良く、同時でもよい。
【００３４】
次に、親イオン決定部５２は、価数判定（Ｓ２）およびピーク判定（Ｓ３）の結果を用いて親イオンを決定する。これにより、この親イオンの価数が分かるため、この価数が３以上であるかどうかを判定する（Ｓ４）。ここで親イオンの決定手法について補足説明する。
（１）価数が２価以上のイオンが一つしか無く、そのイオンの信号強度が所定のしきい値より大きい場合には、そのイオンを親イオンとする。
（２）価数が２価以上のイオンが複数有る場合で、かつ、信号強度が所定のしきい値より大きいイオンが一つしか無い場合には、そのイオンを親イオンとする。
（３）価数が２価以上のイオンが複数有る場合で、かつ、信号強度が所定のしきい値より大きいイオンが複数有る場合には、最も信号強度の大きいイオンを親イオンとするか、または、信号強度の高い順に基づき複数のイオンを親イオンとする。
【００３５】
なお、以下のルーチンは、決定された親イオンは一つであると仮定して説明する。もし複数の親イオンを決定した場合には、質量分析（ＭＳ２）後に再びＳ４に戻って分析動作を行えばよく、この場合のそれ以上の説明は省略する。
【００３６】
親イオンの価数が３以上のものは、図４に示すルーチンへ進む。一方、イオンの価数が２のものは、Ｓ５へ進む。
【００３７】
Ｓ５において、制御部８は、使用者がフラグメントイオンの強度の総和確認機能を使うかどうかを判定する。具体的には、例えば使用者に対して該機能を使用するかどうかを問いかけ、使用者からの指示に基づき、使用するかどうかを判定する。
【００３８】
Ｓ５において上記の機能を使わない場合には、反応時間切替部４２は、ＥＣＤ反応の反応時間を切り替えずにデフォルト（予め規定した反応時間）とし、イオン解離部５は、決定された親イオンに対してＥＣＤ反応を行う（Ｓ６）。次に、質量分析部７が、ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ７）。ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）の後、制御部８がデータ取得を行う（Ｓ１３）。
【００３９】
一方、Ｓ５において上記の機能を使う場合には、反応時間切替部４２は、ＥＣＤ反応の反応時間を切り替えずにデフォルトとし、イオン解離部５は、親イオンに対してＥＣＤ反応を行う（Ｓ８）。次に、質量分析部７が、ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ９）。その後、ＥＣＤの反応時間を少なくとも２回変更して、それぞれの反応時間で質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ１０）。次に、最適フラグメントイオン判定部５３が上記の少なくとも３つの反応時間のうち、最適なフラグメントイオン強度総和となるものがあるかどうかを判定する（Ｓ１１）。Ｓ１１において、ＹＥＳの場合には、その場合の反応時間を選択して、データ取得する（Ｓ１３）。Ｓ１１において、ＮＯの場合には、もう一回、反応時間を変更して（Ｓ１２）、Ｓ１１へ戻る。
【００４０】
次に、図４を用いて、上記のＳ４がＹＥＳの場合（Ｓ２０）について説明する。Ｓ４がＹＥＳの場合、つまり、決定された親イオンの価数が３以上である場合、制御部８は、使用者がフラグメントイオンの強度の総和確認機能を使うかどうかを判定する（Ｓ２１）。
【００４１】
Ｓ２１において上記の機能を使わない場合には、反応時間切替部４２は、デフォルトの反応時間よりも小さく価数の大きさに応じた反応時間となるようにＥＣＤ反応の反応時間を切り替え、イオン解離部５は、決定された親イオンに対してＥＣＤ反応を行う（Ｓ２２）。次に、質量分析部７が、ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ２３）。ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）の後、制御部８がデータ取得を行う（Ｓ２９）。
【００４２】
一方、Ｓ２１において上記の機能を使う場合には、反応時間切替部４２は、デフォルトの反応時間よりも小さく価数の大きさに応じた反応時間をＥＣＤ反応の反応時間となるように切り替え、イオン解離部５は、親イオンに対してＥＣＤ反応を行う（Ｓ２４）。次に、質量分析部７が、ＴＯＦ質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ２５）。その後、ＥＣＤの反応時間を少なくとも２回変更して、それぞれの反応時間で質量分析（ＭＳ２）を行う（Ｓ２６）。次に、最適フラグメントイオン判定部５３が上記の少なくとも３つの反応時間のうち、最適なフラグメントイオン強度総和となるものがあるかどうかを判定する（Ｓ２７）。Ｓ２７において、ＹＥＳの場合には、その場合の反応時間を選択して、データ取得する（Ｓ２９）。Ｓ２７において、ＮＯの場合には、もう一回、反応時間を変更して（Ｓ１２）、Ｓ１１へ戻る。
【００４３】
〔実験データ〕
次に図５〜図８を用いて、本実施の形態の効果を実際のデータを用いて説明する。本実施の形態の効果を示す図は、図７，図８であり、図５，図６はこの効果を導くための図である。図５（ａ）はＥＣＤ調整用サンプル（特許請求の範囲に記載の「既知の標準試料」）として用いるSubstance−Ｐ（アミノ酸配列：RPKPQQFFGLM）を測定したＭＳ１スペクトルを示しており、図５（ｂ）は同じくＥＣＤ調整用サンプルとして用いるSubstance−Ｐ（アミノ酸配列：RPKPQQFFGLM）を測定したＭＳ２によるＥＣＤフラグメントイオンのスペクトル（ＭＳ２スペクトル）を示している。
【００４４】
図５（ａ）（ｂ）において、横軸はｍ／ｚを示しており、縦軸は信号強度を示している。ＭＳ１で検出されている親イオンは２価イオンであり、この２価のイオンのピークを用いてフラグメントイオンの信号強度の総和が最大になる反応時間は１０ｍｓである。Substance−Ｐにより決定したＥＣＤ反応時間１０ｍｓをデフォルト値（特許請求の範囲に記載の「予め規定した反応時間」）として、他のペプチド成分の測定を行う。ここでは、ペプチド成分として例えばGhrelin（アミノ酸配列：ＧＳＳ（−ｎ−Octanoyl）FLSPEHGRVQQRKESKKPPAKLQPR）を用いる。
【００４５】
図６（ａ）は、Ghrelinを測定した際のＭＳ１スペクトルを示しており、図６（ｂ）は同じくGhrelinを測定した際のＭＳ２におけるＥＣＤ反応時間による１０ｍｓによるＥＣＤのフラグメントイオンのスペクトル（ＭＳ２スペクトル）を示している。図６（ａ）におけるGhrelinに由来する親イオンの中で一番信号強度の高いピークはｍ／ｚ４８２の７価イオンである。この７価のイオンを親イオンとして選択し、ＥＣＤ反応時間１０ｍｓでＥＣＤ反応を行った結果のフラグメントイオンでは、図６（ｂ）に示すように、アミノ酸残基数に対して生成したフラグメントイオンのスペクトルの数は少ない。そのため、本発明者らは、最適なＥＣＤ反応時間はSubstance−Ｐの親イオンの価数の２価に対し、Ghrelinの親イオン価数は７価であることから低く設定する必要があると判断した。
【００４６】
図７（ａ）（ｂ）は、図６（ｂ）において１０ｍｓとしたGhrelinのＥＣＤ測定時のＥＣＤ反応時間をそれぞれ５ｍｓ，３ｍｓに変更した場合の、ＥＣＤのフラグメントイオンのＥＣＤスペクトルを示す図である。図６（ｂ）に示すＥＣＤ反応時間１０ｍｓに対し、図７（ｂ）に示す５ｍｓではフラグメントイオンのスペクトルの数（フラグメントイオンのピークの数）が増加していることが確認できる。また、ＥＣＤ反応時間３ｍｓでは、図７（ａ）に示すように、親イオンのピーク強度比が増加している。このことから、選択した親イオンピークのＥＣＤ反応効率が減少している、ことが判断できる。このことからも、アミノ酸配列の構造解析を行うには、ＥＣＤ反応時間５ｍｓで取得したＥＣＤのフラグメントイオンが有用である。
【００４７】
図８は、ＥＣＤ反応で生成したフラグメントイオンの総和を反応時間毎に計算した結果である。ＥＣＤ反応により切断されるＣ−Ｚ系列のＣ及びＺ系列の各々の各価数後とのフラグメントイオンの信号強度の総和をグラフにしたものである。各反応時間におけるフラグメントイオンの総和から最大強度値は、５ｍｓであり、図７（ｂ）に示すフラグメントイオンのスペクトルにおけるフラグメントイオンの検出数の最大値及び親イオンの反応効率の結果と同等である。
【００４８】
ＥＣＤ反応時間１０ｍｓについては、ＥＣＤ時間（電子照射時間）が長いために生成されたフラグメントイオンもＥＣＤ反応を起こし、解離・中性化していることから、フラグメントイオンの信号強度の総和及びピーク本数も少ない結果である。このことから、親イオンの価数の増大に応じて、ＥＣＤ反応時間の減少、ＥＣＤで生成される反応時間の総和を確認することにより、液体クロマトグラフィーで分離されイオン化される様々な親イオンに対するＥＣＤの反応時間の最適化を行うことが可能となり、タンパク質・ペプチドのアミノ酸配列解析に有用な情報を多く取得することができる。
【００４９】
〔付記事項〕
イオンラップ部を具備したＥＣＤを可能な質量分析装置において、ＥＣＤ実行時にまず、マススペクトルの中からＥＣＤ反応を行う親イオンを判定する際の親イオンの価数を判定し、異なる親イオンの価数に応じてＥＣＤ実行時のＥＣＤ反応時間を変化させる。また、価数のみではなく、ＥＣＤ実行後の生成したフラグメントイオンの信号強度の総和を判定し、フラグメントイオンの信号強度の総和が最大になるＥＣＤ反応時間を設定することにより、課題を解決する。
【００５０】
本発明によれば、価数の異なる親イオンに応じてＥＣＤ反応時間を変化させることより、過剰なＥＣＤ反応時間によるＥＣＤのフラグメントイオンの解離・中性化を抑え、ＥＣＤのフラグメントイオンの信号強度を増加させることが出来る。また、ＥＣＤにより生成したフラグメントイオンの信号高度の総和を確認させながらＥＣＤ反応時間を最適化することが出来、高速度で有用なＥＣＤスペクトルを得ることが可能な質量分析方法及び装置を実現することができる。
【００５１】
本発明は、電子捕獲解離を具備した質量分析法を用いた制御方法であり、生体高分子の配列構造解析技術に関する。
【００５２】
一方、ＥＣＤにおいても親イオンをできるだけ解離させることが重要であるが、より多くの親イオンを解離させるためにＥＣＤ時間（電子照射時間）を長くすると、生成されたフラグメントイオンもＥＣＤ反応を起こし、解離・中性化してしまう。そのため、ＥＣＤ時間コントロールを行うことが重要となる。また、ＥＣＤの反応効率は、親イオンの価数、アミノ酸配列などに依存するところも多いことから、親イオンの情報によってＥＣＤの反応時間を調整することが、高速度ＥＣＤスペクトルを得ることが液体クロマトグラフィーとの結合において重要となる。
【００５３】
本発明は、上記課題を解決し、液体クロマトグラフィーとの結合において、ＥＣＤフラグメントイオンの反応効率の最適化、フラグメントイオンの信号強度を増加を行い、高速度で液体クロマトグラフィーとの結合において有用なＥＣＤスペクトルを得ることが可能な質量分析方法及び装置を実現することを目的としたものである。
【００５４】
また、本発明を次のように表現してもよい。
【００５５】
試料のイオン生成を行うイオン源部と、前記イオン生成部で生成されたイオンを２次元高周波電場と静電場とからなる２次元高周波イオントラップで蓄積，単離，解離，排出するイオントラップ部と、前記イオントラップ部から排出されたイオンを磁場を印加する２次元結合型イオントラップ及び電子線を発生する電子源を具備した反応セル内で電子線を照射し電子捕獲解離するイオン解離部と、前記イオン解離部から排出されたイオンの質量分析を行う質量分析部を具備する質量分析装置において、電子捕獲解離を行う目的イオンをイオントラップ部での単離制御と電子捕獲解離制御を行う制御部を有する質量分析装置の制御方法であり、前記イオントラップ部において電子捕獲解離を行った目的イオンに対応して、前記イオン解離部で前記目的イオンの解離効率を向上させることを特徴とする質量分析装置の制御方法。
【００５６】
前記イオントラップ部で目的イオンの単離を行う際に、前記制御部により価数の異なる目的イオンを判定し、選択を行い、単離された目的イオンの価数が高くなるに従い、電子捕獲解離を行うイオン解離部での解離反応時間を短くすることを特徴とする質量分析装置の制御方法。
【００５７】
前記イオントラップ部で目的イオンの単離を行い、前記制御部により価数の異なる目的イオンを判定し、選択を行った際に、単離された目的イオンの価数に応じて、電子捕獲解離を行うイオン解離部での解離反応時間の変化を制御部内で自動で解離反応時間を変化させることを特徴とする質量分析装置の制御方法。
【００５８】
前記イオントラップ部で目的イオンの単離を行う際に、前記制御部により価数の異なる目的イオンを判定し、選択を行い、単離された目的イオンを電子捕獲解離を行う解離部でイオン解離を行う際に、解離イオンの信号強度の総和を前記制御部で判定を行い、解離イオンの信号強度の総和が高くなるように解離反応時間を自動的に制御することを特徴とする質量分析装置の制御方法。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の質量分析装置は、液体クロマトグラフと共に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の質量分析装置の概略構成を示す図である。
【図２】一般的な質量分析装置の概略フローを示すフローチャートである。
【図３】本発明の質量分析装置の分析の流れを示すフローチャートである。
【図４】本発明の質量分析装置の分析の流れを示すフローチャートである。
【図５】（ａ）は標準サンプルを用いて質量分析（ＭＳ１）を行った場合のＭＳスペクトルを示す図であり、（ｂ）はこの標準サンプルを用いて質量分析（ＭＳ２）を行ったＥＣＤのフラグメントイオンのスペクトルを示す図である。
【図６】（ａ）はGhrelinを測定した際のＭＳ１スペクトルを示しており、（ｂ）はＥＣＤ反応時間を１０ｍｓとした場合のＥＣＤのフラグメントイオンのスペクトルを示す図である。
【図７】（ａ）は図６に対応しており、ＥＣＤ反応時間を３ｍｓにした場合のＥＣＤのフラグメントイオンを示す図であり、（ｂ）は、同じくＥＣＤ反応時間を５ｍｓにした場合のＥＣＤのフラグメントイオンのスペクトルを示す図である。
【図８】ＥＣＤ反応で生成したフラグメントイオンの総和を反応時間毎に計算した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００６１】
２ イオン源（イオン源部）
３ イオントラップ部
５ イオン解離部
７ 飛行時間質量分析部（質量分析部）
４０ 価数判定部
４１ ピーク判定部
４２ 反応時間切替部
５１ フラグメントイオン強度総和測定部（強度総和測定部）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料からイオンの生成を行うイオン源部と、
イオンの蓄積および選択を行うイオントラップ部と、
イオンを電子捕獲解離するイオン解離部と、
イオンの質量分析を行う質量分析部と、を備えた質量分析装置であって、
質量分析を行ったイオンの価数の大きさに応じて前記電子捕獲解離の反応時間が可変であることを特徴とする質量分析装置。
【請求項２】
質量分析を行ったイオンのピークが所定のしきい値よりも大きく、かつ、価数が２価よりも大きいイオンの電子捕獲解離の反応時間が、既知の標準試料を用いて予め規定した反応時間よりも短いことを特徴とする請求項１に記載の質量分析装置。
【請求項３】
異なる反応時間毎に、電子捕獲解離後に質量分析されたフラグメントイオンの強度の総和を求めることを特徴とする請求項１に記載の質量分析装置。
【請求項４】
試料からイオンの生成を行うイオン源部と、
イオンの蓄積および選択を行うイオントラップ部と、
イオンを電子捕獲解離するイオン解離部と、
イオンの質量分析を行う質量分析部と、
質量分析を行ったイオンの価数が所定の価数よりも大きいかどうかを判定する価数判定部と、
質量分析を行ったイオンのピークが所定のしきい値よりも大きいかどうかを判定するピーク判定部と、
価数が所定の価数よりも大きいイオンに対して、前記価数判定部の判定結果に基づき、前記電子捕獲解離の反応時間を切り替える反応時間切替部と、を備えていることを特徴とする質量分析装置。
【請求項５】
前記反応時間切替部は、
前記しきい値よりも大きく、かつ、価数が２価よりも大きい、イオンの電子捕獲解離の反応時間を、既知の標準試料を用いて予め規定した反応時間よりも短くすることを特徴とする請求項４に記載の質量分析装置。
【請求項６】
異なる反応時間毎に電子捕獲解離後に質量分析されたフラグメントイオンの強度の総和を測定する強度総和測定部をさらに備えていることを特徴とする請求項４に記載の質量分析装置。
【請求項７】
試料からイオンの生成を行うイオン源部と、イオンの蓄積を行うイオントラップ部と、イオンを電子捕獲解離するイオン解離部と、イオンの質量分析を行う質量分析部とを備えてなる質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
質量分析を行ったイオンの価数に応じて前記電子捕獲解離の反応時間が可変であることを特徴とする質量分析方法。
【請求項８】
試料からイオンの生成を行うイオン源部と、イオンの蓄積を行うイオントラップ部と、イオンを電子捕獲解離するイオン解離部と、イオンの質量分析を行う質量分析部とを備えてなる質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
質量分析を行ったイオンの価数が所定の価数よりも大きいかどうかを判定する価数判定工程と、
質量分析を行ったイオンのピークが所定のしきい値よりも大きいかどうかを判定するピーク判定工程と、
価数が所定の価数よりも大きいイオンに対して、前記価数判定工程の判定結果に基づき、前記電子捕獲解離の反応時間を切り替える工程と、を有することを特徴とする質量分析方法。
【請求項１】
試料からイオンの生成を行うイオン源部と、
イオンの蓄積および選択を行うイオントラップ部と、
イオンを電子捕獲解離するイオン解離部と、
イオンの質量分析を行う質量分析部と、を備えた質量分析装置であって、
質量分析を行ったイオンの価数の大きさに応じて前記電子捕獲解離の反応時間が可変であることを特徴とする質量分析装置。
【請求項２】
質量分析を行ったイオンのピークが所定のしきい値よりも大きく、かつ、価数が２価よりも大きいイオンの電子捕獲解離の反応時間が、既知の標準試料を用いて予め規定した反応時間よりも短いことを特徴とする請求項１に記載の質量分析装置。
【請求項３】
異なる反応時間毎に、電子捕獲解離後に質量分析されたフラグメントイオンの強度の総和を求めることを特徴とする請求項１に記載の質量分析装置。
【請求項４】
試料からイオンの生成を行うイオン源部と、
イオンの蓄積および選択を行うイオントラップ部と、
イオンを電子捕獲解離するイオン解離部と、
イオンの質量分析を行う質量分析部と、
質量分析を行ったイオンの価数が所定の価数よりも大きいかどうかを判定する価数判定部と、
質量分析を行ったイオンのピークが所定のしきい値よりも大きいかどうかを判定するピーク判定部と、
価数が所定の価数よりも大きいイオンに対して、前記価数判定部の判定結果に基づき、前記電子捕獲解離の反応時間を切り替える反応時間切替部と、を備えていることを特徴とする質量分析装置。
【請求項５】
前記反応時間切替部は、
前記しきい値よりも大きく、かつ、価数が２価よりも大きい、イオンの電子捕獲解離の反応時間を、既知の標準試料を用いて予め規定した反応時間よりも短くすることを特徴とする請求項４に記載の質量分析装置。
【請求項６】
異なる反応時間毎に電子捕獲解離後に質量分析されたフラグメントイオンの強度の総和を測定する強度総和測定部をさらに備えていることを特徴とする請求項４に記載の質量分析装置。
【請求項７】
試料からイオンの生成を行うイオン源部と、イオンの蓄積を行うイオントラップ部と、イオンを電子捕獲解離するイオン解離部と、イオンの質量分析を行う質量分析部とを備えてなる質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
質量分析を行ったイオンの価数に応じて前記電子捕獲解離の反応時間が可変であることを特徴とする質量分析方法。
【請求項８】
試料からイオンの生成を行うイオン源部と、イオンの蓄積を行うイオントラップ部と、イオンを電子捕獲解離するイオン解離部と、イオンの質量分析を行う質量分析部とを備えてなる質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
質量分析を行ったイオンの価数が所定の価数よりも大きいかどうかを判定する価数判定工程と、
質量分析を行ったイオンのピークが所定のしきい値よりも大きいかどうかを判定するピーク判定工程と、
価数が所定の価数よりも大きいイオンに対して、前記価数判定工程の判定結果に基づき、前記電子捕獲解離の反応時間を切り替える工程と、を有することを特徴とする質量分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−３２２２７（Ｐ２０１０−３２２２７Ａ）
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９１５８０（Ｐ２００８−１９１５８０）
【出願日】平成２０年７月２５日（２００８．７．２５）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２５日（２００８．７．２５）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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