顕微鏡
【課題】ポンプ光とイレース光との光学調整を簡単かつ正確に行うことができ、超解像効果を確実に発現できる顕微鏡を提供する。
【解決手段】ポンプ光を出射するポンプ光用光源21と、イレース光を出射するイレース光用光源22と、ポンプ光およびイレース光を同軸に合成する光合成手段(23〜26)と、合成光を集光する集光手段62と、合成光により試料を走査する走査手段(44,45)と、試料から発生する光応答信号を検出する検出手段50と、合成光の光路中に配置され、イレース光に対して高い波長選択特性を有するイレース光選択領域およびポンプ光に対して高い波長選択特性を有するポンプ光選択領域を備える波長選択素子42と、合成光の光路中に配置され、波長選択素子のイレース光選択領域に対応するイレース光を空間変調する空間変調素子43と、を有する。
【解決手段】ポンプ光を出射するポンプ光用光源21と、イレース光を出射するイレース光用光源22と、ポンプ光およびイレース光を同軸に合成する光合成手段(23〜26)と、合成光を集光する集光手段62と、合成光により試料を走査する走査手段(44,45)と、試料から発生する光応答信号を検出する検出手段50と、合成光の光路中に配置され、イレース光に対して高い波長選択特性を有するイレース光選択領域およびポンプ光に対して高い波長選択特性を有するポンプ光選択領域を備える波長選択素子42と、合成光の光路中に配置され、波長選択素子のイレース光選択領域に対応するイレース光を空間変調する空間変調素子43と、を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観察するものである。この原理について、図１０〜図１３を参照して説明する。図１０は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１０に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１１に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１２に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１３に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１２の吸収過程や図１３の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１１のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１２のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１２の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図１０に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１４は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図１４はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１４に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１５は、図１４と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１５において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１５の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光とも呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を超える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
例えばローダミン６Ｇ色素の場合、波長５３２ｎｍの光（ポンプ光）を照射すると、ローダミン６Ｇ分子は、Ｓ０状態からＳ１状態へ励起されて波長５６０ｎｍにピークを有する蛍光を発光する。この際、波長５９９ｎｍの光（イレース光）を照射すると、二重共鳴吸収過程が起こって、ローダミン６Ｇ分子は蛍光発光がしにくいＳ２状態に遷移する。すなわち、これらのポンプ光とイレース光とをローダミン６Ｇに同時に照射すると蛍光が抑制されることになる。
【００１８】
図１６は、従来提案されている超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット１１０、スキャンユニット１３０および顕微鏡ユニット１５０からなっている。
【００１９】
光源ユニット１１０では、ポンプ光用光源１１１から出射されるポンプ光をダイクロイックプリズム１１４に入射させ、イレース光用光源１１２から出射されるイレース光は、位相板１１３により位相変調してからダイクロイックプリズム１１４に入射させて、ダイクロイックプリズム１１４でポンプ光とイレース光とを合成して同軸で出射させている。
【００２０】
位相板１１３は、光軸の周りをイレース光の位相差が２π周回するように構成されるもので、例えば図１７に示すように、光軸の周りに独立した８領域を有し、イレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なるようにガラス基板をエッチングして形成される。図１７には、各領域のエッチング深さｄも示している。この位相板１１３を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺された中空状のイレース光が生成される。
【００２１】
ここで、ローダミン６Ｇ色素で染色された試料を観察する場合には、ポンプ光用光源１１１は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザを用い、その２倍高調波である波長５３２ｎｍの光をポンプ光として出射するように構成される。また、イレース光用光源１１２は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザとラマンシフタとを用い、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍高調波をラマンシフタで波長５９９ｎｍに変換した光をイレース光として出射するように構成される。
【００２２】
スキャンユニット１３０では、光源ユニット１１０から同軸で出射されるポンプ光およびイレース光を、ハーフプリズム１３１を通過させた後、２枚のガルバノミラー１３２および１３３により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット１５０に出射するようになっていると共に、顕微鏡ユニット１５０で検出された蛍光を、往路と逆の経路を辿ってハーフプリズム１３１で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ１３４、ピンホール１３５、ノッチフィルタ１３６および１３７を経て光電子増倍管１３８で受光するようになっている。
【００２３】
図１６では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー１３２，１３３を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ１３６および１３７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、ピンホール１３５は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００２４】
顕微鏡ユニット１５０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット１３０から入射するポンプ光およびイレース光をハーフプリズム１５１で反射させて、顕微鏡対物レンズ１５２により少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料１５３上に集光させると共に、観察試料１５３で発光した蛍光を、再び顕微鏡対物レンズ１５２でコリメートしてハーフプリズム１５１で反射させることにより、再び、スキャンユニット１３０に戻すと同時に、ハーフプリズム１５１を通過する蛍光の一部を接眼レンズ１５４に導いて、蛍光像として目視観察できるようになっている。
【００２５】
この超解像顕微鏡によると、観察試料１５３の集光点上においてイレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されて、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域に存在する蛍光ラベラー分子のみを計測できるので、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列すれば、回折限界の空間分解能を上回る解像度を有する顕微鏡画像を形成することが可能となる。
【００２６】
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
ところが、本発明者による実験検討によると、従来提案されている超解像顕微鏡にあっては、特に、結像性能や顕微鏡の組み立てにおいて、以下に説明するような改良すべき点があることが判明した。
【００２８】
すなわち、超解像顕微鏡においては、ポンプ光の光路とイレース光の光路とを完全に同軸に合わせて、焦点面においてポンプ光のピーク位置をイレース光の中央中空部に完全に一致させる必要がある。
【００２９】
しかしながら、図１５に示した超解像顕微鏡では、イレース光を位相板１１３で位相変調してからダイクロイックプリズム１１４に入射させて、ダイクロイックプリズム１１４において全く独立した光路から入射するポンプ光と合成するようにしているため、ポンプ光と位相変調されたイレース光とが完全に同軸となるように、ポンプ光用光源１１１、イレース光用光源１１２、位相板１１３およびダイクロイックプリズム１１４を光学的に位置調整するのが困難である。
【００３０】
このため、焦点面において、ポンプ光のピーク位置がイレース光の辺緑部にずれて、ポンプ光の集光領域全体が蛍光抑制され、解像度およびＳ／Ｎの劣化を招くことが懸念される。
【００３１】
したがって、かかる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、ポンプ光とイレース光との光学調整を簡単かつ正確に行うことができ、超解像効果を確実に発現できる顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
上記目的を達成する請求項１に係る顕微鏡の発明は、
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する顕微鏡であって、
上記物質を基底状態から第１励起状態に励起するポンプ光を出射するポンプ光用光源と、
上記物質を上記第１励起状態から他の励起状態に励起するイレース光を出射するイレース光用光源と、
上記ポンプ光と上記イレース光とを同軸に合成する光合成手段と、
上記光合成手段による合成光を上記試料に集光する集光手段と、
上記集光手段により集光される上記合成光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を上記合成光により走査する走査手段と、
上記合成光の照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段と、
上記合成光の光路中に配置され、上記イレース光に対して高い波長選択特性を有するイレース光選択領域および上記ポンプ光に対して高い波長選択特性を有するポンプ光選択領域を備える波長選択素子と、
上記合成光の光路中に配置され、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を空間変調する空間変調素子と、
を有することを特徴とするものである。
【００３３】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高透過率のイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高透過率のポンプ光選択領域とを有する分光透過フィルタからなることを特徴とするものである。
【００３４】
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高反射率の多層膜からなるイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高反射率の多層膜からなるポンプ光選択領域とを有する反射ミラーからなることを特徴とするものである。
【００３５】
請求項４に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高回折効率のイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高回折効率のポンプ光選択領域とを有する回折格子からなることを特徴とするものである。
【００３６】
請求項５に係る発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、該波長選択素子を経た上記合成光が、光軸断面内において、上記イレース光のみの強度が存在するイレース光領域と、上記ポンプ光のみの強度が存在するポンプ光領域と、上記イレース光領域および上記ポンプ光領域の境界部分において、上記合成光の光軸断面の外形よりも小さく、かつ上記イレース光および上記ポンプ光の重複強度が小さい重複領域とを有するように形成することを特徴とするものである。
【００３７】
請求項６に係る発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、同心円状に分割された上記イレース光選択領域と上記ポンプ光選択領域とを有することを特徴とするものである。
【００３８】
請求項７に係る発明は、請求項６に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、上記ポンプ光選択領域が光軸近傍の円形領域を占め、上記イレース光選択領域が上記ポンプ光選択領域の外側の輪帯領域を占めることを特徴とするものである。
【００３９】
請求項８に係る発明は、請求項７に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、上記ポンプ光選択領域の直径が上記集光手段の入射口径よりも小さく、かつ、上記イレース光選択領域の外径が上記集光手段の入射口径よりも大きいことを特徴とするものである。
【００４０】
請求項９に係る発明は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記空間変調素子は、上記ポンプ光および上記イレース光に対して透明な基板を有し、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調するエッチング領域を有する位相板からなることを特徴とするものである。
【００４１】
請求項１０に係る発明は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記空間変調素子は、上記ポンプ光および上記イレース光に対して透明な基板を有し、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する光学薄膜をコートした位相板からなることを特徴とするものである。
【００４２】
請求項１１に係る発明は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記空間変調素子は、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する液晶型空間変調器からなることを特徴とするものである。
【００４３】
請求項１２に係る発明は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記空間変調素子は、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する形状可変ミラーからなることを特徴とするものである。
【００４４】
請求項１３に係る発明は、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を、上記集光手段の鏡筒内に設けたことを特徴とするものである。
【００４５】
請求項１４に係る発明は、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記走査手段は上記合成光の光路中に配置したガルバノミラーを有し、該ガルバノミラーと上記光合成手段との間の上記合成光の光路中に、上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を配置したことを特徴とするものである。
【００４６】
請求項１５に係る発明は、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記光合成手段は、上記ポンプ光および上記イレース光を導光する光ファイバを有することを特徴とするものである。
【００４７】
請求項１６に係る発明は、請求項１５に記載の顕微鏡において、
上記光ファイバは、シングルモードファイバからなることを特徴とするものである。
【００４８】
請求項１７に係る発明は、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質が、蛍光性分子、量子ドット、蛍光タンパクのいずれかであることを特徴とするものである。
【００４９】
請求項１８に係る発明は、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を、上記集光手段の瞳面または共役瞳面、あるいはその近傍に配置したことを特徴とするものである。
【００５０】
先ず、本発明の概要について説明する。上記の課題を解決する本発明の基本的な考え方は、超解像顕微鏡を組み立てる際の最大の難点であるポンプ光とイレース光の位置合わせを機械的な精度で実現し、個別ビームに対する光軸調整作業を省いた点にある。
【００５１】
そのため、ポンプ光とイレース光とを、例えば、ピンホールのような微小な射出口を通して同時に放射させて合成する。具体的には、シングルモードファイバ等にポンプ光とイレース光とを同時に入射させて、同一の射出口から同一の立体角で放出させる。このようにして合成されたポンプ光とイレース光とを色収差の無いアクロマートな光学系で結像すれば、完全に同軸でコリメートして集光することができる。特に、顕微鏡対物レンズで集光すれば、焦点面の全く同じポイントにポンプ光およびイレース光を集光することができる。
【００５２】
本発明の一実施の形態では、同軸・同径に揃ったポンプ光およびイレース光の合成光を、波長選択素子に入射させる。波長選択素子は、例えば図１に示すような輪帯フィルタ１をもって構成する。この輪帯フィルタ１は、同心円構造となっており、中央部の内径（半径）ｒinの円形領域は、ポンプ光の透過率が高く、イレース光の透過率が低い分光特性を有するポンプ光選択領域１ａとなっており、この内径ｒinと瞳径である外径（半径）ｒoutとの間の輪帯領域は、イレース光の透過率が高く、ポンプ光の透過率が低い分光特性を有するイレース光選択領域１ｂとなっている。
【００５３】
この輪帯フィルタ１に、同軸・同径に揃ったポンプ光およびイレース光を入射させると、輪帯フィルタ１の円形状のポンプ光選択領域１ａから主としてポンプ光が透過し、輪帯状のイレース光選択領域１ｂからは主としてイレース光が透過することになる。
【００５４】
さらに、中空状のイレース光を生成するための空間変調素子として、例えば図２に示すような輪帯位相板２を用いる。この輪帯位相板２は、ガラスを基板とし、中央部の内径ｒinの円形領域は、位相無変調領域２ａで、この位相無変調領域２ａに入射する光は位相を変調することなく透過させ、この内径ｒinと外径ｒoutとの間の輪帯領域は、位相変調領域２ｂで、イレース光の位相差が２π周回するように、光軸の周りにイレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なるようにエッチングが施されている。
【００５５】
図１に示した輪帯フィルタ１および図２に示した輪帯位相板２の内径ｒinおよび外径ｒoutをそれぞれ同じにして形状を完全に一致させ、これら輪帯フィルタ１および輪帯位相板２を同軸上に配置して、同軸に光学調整されたポンプ光およびイレース光の合成光を透過させると、図３にビーム断面を示すように、輪帯に強度分布をもつ位相変調されたイレース光領域５ａと、その内側を通過する位相変調を受けないポンプ光領域５ｂが得られる。なお、ポンプ光およびイレース光の合成光は、輪帯フィルタ１を経てから輪帯位相板２に入射させても良いし、逆に、輪帯位相板２を経てから輪帯フィルタ１に入射させても良い。
【００５６】
したがって、図３に示すビーム断面を有するポンプ光およびイレース光を、同じ顕微鏡対物レンズで集光すれば、結像面でイレース光は中空形状に集光し、ポンプ光は円形のレイリーの回折バターとなって集光することになる。この際、ポンプ光およびイレース光が完全に同軸であれば、図４に集光パターンを示すように、結像面で中空状のイレース光の中心と、ポンプ光のピーク位置とが完全に一致することになる。
【００５７】
例えば、同軸に調整されたポンプ光およびイレース光が、上述したように同じシングルモードファイバの射出口から導かれ、かつ何れの光もデリバリされることなく同一の光学系を通過したものであれば、ポンプ光およびイレース光は波面収差を持たず、同じダイバージェンス（ビーム広がり）で、全く同じ結像点に集光することになる。したがって、このように構成すれば、基本的にはシステムの光学調整は不要となる。
【００５８】
ここで、ポンプ光に着目すると、図１に示した輪帯フィルタ１を用いた場合には、瞳面の辺縁部が輪帯フィルタ１でカットされることになる。このため、遮光の面積比に応じて、実質上、顕微鏡対物レンズの開口数（ＮＡ）が減少することになる。例えば、図１に示した輪帯フィルタ１の場合は、イレース光選択領域１ｂの外径である瞳径（ｒout）とポンプ光が透過するイレース光遮光領域の径（ｒin）との比で、ポンプ光の集光スポットの直径である全幅（Ｒp）が決定される。具体的には、ポンプ光の波長をλpとすると、レイリーの式に従って、下記の（１）式によりＲpが決定される。
【００５９】
【数１】
【００６０】
上記（１）式から、例えば、ｒin／ｒoutを７０％とすると、全瞳径を使用した場合と比較して、集光スポットの全幅Ｒpは、３０％ほど太くなる。
【００６１】
しかしながら、図４に集光パターンを示したように、ポンプ光の直径がイレース光の外径よりも小さい場合には、超解像顕微鏡における結像性能、すなわち点像分布関数の半値幅は、イレース光の強度と集光パターンで決まる。ここで、イレース光の波長をλeとすると、イレース光の集光スポットにおける外輪の直径（Ｒe）は、２λe／ＮＡで表されるので、輪帯フィルタの内側を通ったポンプ光の集光スポットの直径Ｒpが、Ｒe よりも小さければ、結像面において光軸近傍を除いたポンプ光照射部がイレース光の照射領域に完全に覆われることになる。
【００６２】
具体的には、上記（１）式から、下記の（２）式で表される条件が得られる。ローダミン６Ｇ分子の場合、λpが５３２ｎｍ、λeが５９９ｎｍであるので、ｒin／ｒoutが７０％の場合には、この条件を満足することになる。なお、（２）式において、ｒpはポンプ光の集光スポットの半径（Ｒp／２）を示しており、ｒeはイレース光の集光スポットの半径（Ｒe／２）を示している。
【００６３】
【数２】
【００６４】
このような条件下では、ポンプ光の集光状態に拘らず、イレース光の強度と色素分子の光学物性により、超解像顕微鏡の結像性能が決定される。すなわち、点像分布関数の半値幅（Γ）は、下記の（３）式で表され、ポンプ光の回折限界サイズよりも小さくなる。なお、（３）式において、Ｉeはイレース光の集光面における最大フォトンフラックスを示しており、σdipおよびτは、それぞれ色素分子の蛍光抑制断面積および蛍光寿命を示している。
【００６５】
【数３】
【００６６】
ここで、蛍光抑制断面積σdipとは、文献：Y. Iketaki, T. Watanabe, M, Sakai, S Ishiuchi, M. Fujii and T. Watanabe, "Theoretical investigation of the point-spread function given by super-resolving fluorescence microscopy using two-color fluorescence dip spectroscopy," Opt. Eng.44, 033602(2005)で定義されている光学定数で、
σdip＝σf＋ασup
で表される。なお、σf は誘導放出断面積であり、σupはＳ１状態から他のＳｎ状態（ｎは２以上の正の整数）へ遷移するときの２重共鳴吸収断面積である。また、αはＳｎ状態からの非輻射で緩和する確率である。
【００６７】
したがって、シングルモードファイバによりポンプ光とイレース光とを同軸に調整した後、輪帯フィルタおよび輪帯位相板を透過させてイレース光を位相変調しても、従来と比較して全く結像性能を劣化させることはない。しかも、従来のように、ポンプ光およびイレース光に対して、個別の複雑な光学調整が不要となる。
【００６８】
なお、波長選択素子は、例えば図５に示すような輪帯フィルタ１１を用いることができる。この輪帯フィルタ１１は、図１に示した輪帯フィルタ１におけるポンプ光選択領域１ａとイレース光選択領域１ｂとの配置を逆にして、中央部の内径ｒinの円形領域を、イレース光の透過率が高く、ポンプ光の透過率が低い分光特性を有するイレース光選択領域１１ｂとし、この内径ｒinと瞳径である外径（半径）ｒoutとの間の輪帯領域は、ポンプ光の透過率が高く、イレース光の透過率が低い分光特性を有するポンプ光選択領域１１ａとしたものである。
【００６９】
同様に、空間変調素子も、例えば図６に示すような輪帯位相板１２を用いることができる。この輪帯位相板１２は、図２に示した輪帯位相板２における位相無変調領域２ａと位相変調領域２ｂとの配置を逆にして、中央部の内径ｒinの円形領域を、イレース光の位相差が２π周回するように、光軸の周りにイレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なるようにエッチングを施した位相変調領域１２ｂとし、この内径ｒinと外径ｒoutとの間の輪帯領域は、位相無変調領域１２ａとして、この位相無変調領域１２ａに入射する光は位相を変調することなく透過させるようにしたものである。
【００７０】
図５および図６に示した輪帯フィルタ１１および輪帯位相板１２を用いた場合には、イレース光に対する顕微鏡対物レンズのＮＡが実効的に小さくなるため、イレース光の中央中空部の径が大きくなって、ポンプ光辺縁部における蛍光抑制効果の発現が弱くなるが、イレース光の強度を上げれば、上記（３）式に従って超解像効果が発現する。
【００７１】
本発明は、特に、一本のシングルモードファイバから多波長のレーザ光を同軸で出射させ、ガルバノミラーによりレーザビームの空間走査を行う構造の商用レーザ走査型顕微鏡に容易に搭載することができる。すなわち、イレース光およびポンプ光の波長に対応するレーザ光源を用意し、これらレーザ光源からシングルモードファイバを経て出射されるポンプ光およびイレース光をコリメートした後、上述した波長選択素子および空間変調素子に入射させるようにすることで、商用レーザ走査型顕微鏡に容易に超解像機能を付加することができる。
【００７２】
また、本発明において、ポンプ光とイレース光とを合成する光合成手段は、光ファイバを用いるのが好ましいが、通常のダイクロックミラー等を用いてポンプ光とイレース光とを同軸にする場合でも、光学調整の際の利便性が向上することができる。すなわち、この場合には、従来と同様に、ポンプ光とイレース光とを同軸に調整すると言う作業が加わるが、同軸に調整されたポンプ光およびイレース光を、上述したように波長選択素子および空間変調素子に入射させれば、それらの光学素子によってポンプ光およびイレース光は全く同じダイバージェンスおよび角度ずれの影響を受けることになる。
【００７３】
この場合、ポンプ光およびイレース光の空間内における集光点の絶対的な位置は、調整によって変化するが、集光点の相対的な位置関係は変化しない。言い換えると、ポンプ光およびイレース光は同じ位置に集光する。したがって、例えば波長選択素子および空間変調素子を経たポンプ光およびイレース光を、光走査手段であるガルバノミラーや顕微鏡試料ステージの位置調整により走査すれば、結像性能を復元させることができる。
【００７４】
また、波長選択素子は、透過型の輪帯フィルタに限らず、ポンプ光選択領域で主としてポンプ光を反射させ、イレース光選択領域で主としてイレース光を反射させる多層膜をコートした反射ミラーを用い、この反射ミラーで反射されたポンプ光およびイレース光を用いるようにしてもよいし、ポンプ光選択領域で主としてポンプ光を回折させ、イレース光選択領域で主としてイレース光を回折させる回折格子を用い、この回折格子で回折されたポンプ光およびイレース光を用いるようにしてもよい。
【００７５】
同様に、空間変調素子も、ポンプ光およびイレース光に対して透明な光学基板をエッチングして形成した位相板に限らず、該光学基板に光学薄膜をコートした位相板や液晶型の光空間変調器、あるいはミラー形状が可変のデフォーマラブルミラー等を用いて構成することもできる。
【００７６】
さらに、空間変調素子や波長選択素子は、顕微鏡対物レンズの鏡枠に設けることもできる。このようにすれば、市販のレーザ走査型顕微鏡システムの構成を変化させることなく、顕微鏡対物レンズの交換のみで超解像機能を付加することができ、利便性を向上することができる。
【００７７】
特に、空間変調素子や波長選択素子を顕微鏡対物レンズの瞳位置に配置すれば、ポンプ光およびイレース光を空間走査しても、波面収差が少ないので、特に超解像顕微鏡機能を左右するイレース光の集光形状を乱すことなく、広い視野で高い結像性能を保つことができる。
【００７８】
さらに、本発明に係る超解像顕微鏡は、蛍光抑制効果を示す発光性材料の観察に広く適用できるもので、例えば、２以上の励起量子状態をもつ蛍光抑制効果が発現できるローダミン６Ｇのような有機色素分子からなる蛍光性分子、ＣsｄやＺnＯのような半導体量子ドット、トリ（８−キノリノラト）アルミニウムのような蛍光錯体分子、フォトクロミック特性を示すＦＰ５９５ＧＦＰのような蛍光タンパク、などの観察にも応用することができる。
【発明の効果】
【００７９】
本発明によれば、ポンプ光とイレース光とを合成してから、波長選択素子および空間変調素子に入射させるようにしたので、面倒な光学調整を要することなく、ポンプ光およびイレース光を集光手段により観察試料の全く同じ結像点に集光させることができ、超解像効果を確実に発現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
以下、本発明に係る顕微鏡の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００８１】
（第１実施の形態）
図７は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット２０、スキャンユニット４０および顕微鏡ユニット６０を有しており、スキャンユニット４０および顕微鏡ユニット６０は、瞳投影レンズ系７０を介して光学的に結合されている。
【００８２】
光源ユニット２０は、ポンプ光用光源２１から出射されるポンプ光およびイレース光用光源２２から出射されるイレース光を、ダイクロイックプリズム２３で合成した後、ファイバ集光レンズ２４を経て同一のシングルモードファイバ２５に同軸に入射させ、これによりシングルモードファイバ２５の射出口から放射立体角を揃えて完全球面波として出射させ、その出射光をファイバコリメータレンズ２６で平面波に変換して、スキャンユニット４０に入射させる。ここで、ダイクロイックプリズム２３、ファイバ集光レンズ２４、シングルモードファイバ２５、ファイバコリメータレンズ２６は、光合成手段を構成している。
【００８３】
本実施の形態では、ローダミン６Ｇ色素で染色された試料を観察するため、ポンプ光用光源２１は、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザを用い、その２倍高調波である波長５３２ｎｍの光をポンプ光として出射させ、イレース光用光源２２は、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザとラマンシフタとを用い、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍高調波をラマンシフタで波長５９９ｎｍに変換した光をイレース光として出射させる。
【００８４】
スキャンユニット４０は、光源ユニット２０から出射されるポンプ光およびイレース光を、ハーフプリズム４１を通過させた後、波長選択素子４２および空間変調素子４３を経て走査手段である２枚のガルバノミラー４４および４５により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット６０に出射させる。また、顕微鏡ユニット６０で検出された蛍光を、往路とは逆の経路を辿ってハーフプリズム４１で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ４６、ピンホール４７を、ノッチフィルタ４８および４９を経て検出手段である光電子増倍管５０で受光する。
【００８５】
波長選択素子４２は、例えば図１に示した輪帯フィルタ１を用い、空間変調素子４３は、例えば図２に示した輪帯位相板２を用いる。なお、ピンホール３７は、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものであり、ノッチフィルタ４８および４９は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、図７では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー４４，４５を同一平面内で揺動可能に示している。
【００８６】
スキャンユニット４０から出射されるポンプ光およびイレース光は、瞳投影レンズ系７０を介して顕微鏡ユニット６０に入射させる。
【００８７】
顕微鏡ユニット６０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット４０から瞳投影レンズ系７０を介して入射するポンプ光およびイレース光をハーフプリズム６１で反射させて、集光手段である顕微鏡対物レンズ６２によりローダミン６Ｇ色素で染色された観察試料６３上に集光させる。また、観察試料６３で発光した蛍光は、顕微鏡対物レンズ６２でコリメートしてハーフプリズム６１で反射させることにより、瞳投影レンズ系７０を経てスキャンユニット４０に戻すと同時に、ハーフプリズム６１を通過する蛍光の一部は、蛍光像として目視観察できるように接眼レンズ６４に導く。なお、顕微鏡対物レンズ６２は、その鏡筒も含めて示している。
【００８８】
ここで、瞳投影レンズ系７０は、顕微鏡対物レンズ６２の瞳位置をスキャンユニット４０内に投影して共役瞳面を形成する。
【００８９】
本実施の形態では、この瞳投影レンズ系７０によってスキャンユニット４０内に投影される顕微鏡対物レンズ６２の共役瞳面またはその近傍に、波長選択素子４２および空間変調素子４３を配置して、光源ユニット２０から同軸の平行光で入射するポンプ光およびイレース光を、波長選択素子４２により中央部から主としてポンプ光を透過させ、その周辺の輪帯部から主としてイレース光を透過させ、さらに空間変調素子４３により中央部のポンプ光は位相変調することなく透過させ、輪帯部のイレース光は位相変調して透過させる。
【００９０】
このように、本実施の形態では、光源ユニット２０において、ポンプ光用光源２１から出射されるポンプ光およびイレース光用光源２２から出射されるイレース光を、ダイクロイックプリズム２３で合成した後は、いずれの光もデリバリすることなく、同一光学系、すなわちファイバ集光レンズ２４およびシングルモードファイバ２５を経て出射させている。しかも、シングルモードファイバ２５から出射される完全球面波のポンプ光およびイレース光を、ファイバコリメータレンズ２６により同じ条件でコリメートしている。したがって、面倒な光学調整を要することなく、ポンプ光およびイレース光を、波面収差を与えることなく、同じダイバージェンス（ビーム広がり）で顕微鏡対物レンズ６２により観察試料６３の全く同じ結像点に集光させることができる。
【００９１】
また、波長選択素子４２および空間変調素子４３を、瞳投影レンズ系７０によってスキャンユニット４０内に投影される顕微鏡対物レンズ６２の共役瞳面またはその近傍に配置したので、ガルバノミラー４４および４５の揺動走査による波面収差の発生を抑えることができる。したがって、超解像顕微鏡性能を左右するイレース光の集光形状を乱すことなく、広い視野で高い結像性能を保つことができるとともに、観察試料６３上では常に図４に示したような位置関係でポンプ光およびイレース光を集光でき、良好な状態で超解像機能を発現できる。
【００９２】
（第２実施の形態）
図８は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、図７に示した超解像顕微鏡と光源ユニット２０の構成が異なるものである。
【００９３】
すなわち、本実施の形態では、光ファイバを用いることなくポンプ光とイレース光とを同軸に合成してから、イレース光を位相変調する。このため、ポンプ光用光源２１から出射されるポンプ光は、角度調整ミラー３１ａ，３１ｂにより２次元方向の角度を調整し、さらにビーム発散角調整レンズ３２によりポンプ光の発散角を調整してから、ダイクロイックプリズム３３に入射させる。同様に、イレース光用光源２２から出射されるイレース光は、角度調整ミラー３４ａ，３４ｂにより２次元方向の角度を調整し、さらにビーム発散角調整レンズ３５によりイレース光の発散角を調整してから、ダイクロイックプリズム３３に入射させて、ポンプ光と同軸に調整して出射させる。
【００９４】
ダイクロイックプリズム３３から同軸に出射されるポンプ光およびイレース光は、角度調整ミラー３６ａ，３６ｂにより２次元方向の角度を調整し、さらにビーム発散角調整レンズ３７により発散角を調整した後、アイリス３８を経てスキャンユニット４０に入射させる。その他の構成は、第１実施の形態と同様である。
【００９５】
本実施の形態によると、角度調整ミラー３１ａ，３１ｂ，３４ａ，３４ｂにより、ポンプ光およびイレース光を同軸に調整する作業を要するが、同軸に調整した後、波長選択素子４２および空間変調素子４３に入射させてイレース光を位相変調するので、ポンプ光およびイレース光は波長選択素子４２および空間変調素子４３により全く同じダイバージェンスおよび角度ずれの影響を受けることになる。したがって、本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の効果が得られる。
【００９６】
（第３実施の形態）
図９は、本発明の第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部断面図である。本実施の形態は、第１実施の形態または第２実施の形態において、顕微鏡対物レンズ６２の鏡筒６２ａ内に波長選択素子４２および空間変調素子４３を配置したものである。
【００９７】
すなわち、顕微鏡対物レンズ６２の鏡筒６２ａ内で、顕微鏡対物レンズ系６２ｂの像側（入射側）に波長選択素子４２および空間変調素子４３を配置する。また、図示しないがガルバノミラー４４，４５は、瞳投影レンズ系７０によって投影される顕微鏡対物レンズ６２の共役瞳面を挟むように配置する。
【００９８】
本実施の形態によれば、上述した実施の形態と同様、広い視野で高い結像性能を保つことができるとともに、観察試料６３上では常に図４に示したような位置関係でポンプ光およびイレース光を集光でき、良好な状態で超解像機能を発現できる他、顕微鏡対物レンズ６２の鏡筒６２ａ内で、顕微鏡対物レンズ系６２ｂの像側（入射側）に波長選択素子４２および空間変調素子４３を配置するので、より簡単に構成できる利点がある。
【００９９】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、ガルバノミラー４４，４５によりポンプ光およびイレース光を偏向して観察試料６３を二次元走査するようにしたが、顕微鏡対物レンズ６２および／または観察試料６３を載置する試料ステージを移動させて、ポンプ光およびイレース光により観察試料６３を二次元走査したり、一つのガルバノミラーによるポンプ光およびイレース光の一次元移動（主走査）と、その一次元移動と直交する方向への顕微鏡対物レンズ６２あるいは試料ステージの一次元移動（副走査）との組み合わせて、観察試料６３を二次元走査したりすることもできる。
【０１００】
また、波長選択素子４２および空間変調素子４３は、顕微鏡対物レンズ６２の鏡筒内で顕微鏡対物レンズ６２の瞳位置またはその近傍に配置することもできる。なお、観察試料６３を走査するために、ポンプ光およびイレース光を偏向する場合には、波長選択素子４２および空間変調素子４３は、顕微鏡対物レンズ６２の瞳位置またはその近傍、あるいは瞳位置と共役な位置またはその近傍に配置するのが好ましいが、通常の走査範囲での計測であれば、合成されたポンプ光およびイレース光の光路中、好ましくは平行光路中の任意の位置に接合あるいは離間して配置することにより、良好な状態で超解像機能を発現することができる。
【０１０１】
さらに、波長選択素子４２は、イレース光選択領域とポンプ光選択領域とを同心円状に形成する場合に限らず、光軸断面内で、イレース光のみの強度が存在するイレース光領域と、ポンプ光のみの強度が存在するポンプ光領域と、イレース光領域およびポンプ光領域の境界において、イレース光領域およびポンプ光領域よりも小さく、かつイレース光およびポンプ光の強度が小さい重複領域とを有するように形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】本発明の顕微鏡を構成する波長選択素子の一例を示す図である。
【図２】同じく、空間変調素子の一例を示す図である。
【図３】図１の輪帯フィルタおよび図２の輪帯位相板を透過した後の合成光のビーム断面を示す図である。
【図４】図３に示すビーム断面を有するポンプ光およびイレース光の結像面での集光パターンを示す図である。
【図５】本発明の顕微鏡を構成する波長選択素子の他の例を示す図である。
【図６】同じく、空間変調素子の他の例を示す図である。
【図７】本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図８】同じく、第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図９】同じく、第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部断面図である。
【図１０】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１１】図１６の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１２】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１３】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図１４】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１５】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１６】従来提案されている超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図１７】図１６に示す位相板の構成を示す図である。
【符号の説明】
【０１０３】
１，１１ 輪帯フィルタ
１ａ，１１ａ ポンプ光選択領域
１ｂ，１１ｂ イレース光選択領域
２，１２ 輪帯位相板
２ａ，１２ａ 位相無変調領域
２ｂ，１２ｂ 位相変調領域
５ａ イレース光領域
５ｂ ポンプ光領域
２０ 光源ユニット
２１ ポンプ光用光源
２２ イレース光用光源
２３ ダイクロイックプリズム
２４ ファイバ集光レンズ
２５ シングルモードファイバ
２６ ファイバコリメータレンズ
３１ａ，３１ｂ，３４ａ，３４ｂ，３６ａ，３６ｂ 角度調整ミラー
３２，３５，３７ ビーム発散角調整レンズ
３３ ダイクロイックプリズム
３８ アイリス
４０ スキャンユニット
４１ ハーフプリズム
４２ 波長選択素子
４３ 空間変調素子
４４，４５ ガルバノミラー
４６ 投影レンズ
４７ ピンホール
４８，４９ ノッチフィルタ
５０ 光電子増倍管
６０ 顕微鏡ユニット
６１ ハーフプリズム
６２ 顕微鏡対物レンズ
６２ａ 鏡筒
６２ｂ 顕微鏡対物レンズ系
６３ 観察試料
６４ 接眼レンズ
７０ 瞳投影レンズ系
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観察するものである。この原理について、図１０〜図１３を参照して説明する。図１０は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１０に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１１に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１２に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１３に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１２の吸収過程や図１３の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１１のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１２のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１２の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図１０に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１４は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図１４はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１４に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１５は、図１４と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１５において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１５の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光とも呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を超える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
例えばローダミン６Ｇ色素の場合、波長５３２ｎｍの光（ポンプ光）を照射すると、ローダミン６Ｇ分子は、Ｓ０状態からＳ１状態へ励起されて波長５６０ｎｍにピークを有する蛍光を発光する。この際、波長５９９ｎｍの光（イレース光）を照射すると、二重共鳴吸収過程が起こって、ローダミン６Ｇ分子は蛍光発光がしにくいＳ２状態に遷移する。すなわち、これらのポンプ光とイレース光とをローダミン６Ｇに同時に照射すると蛍光が抑制されることになる。
【００１８】
図１６は、従来提案されている超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット１１０、スキャンユニット１３０および顕微鏡ユニット１５０からなっている。
【００１９】
光源ユニット１１０では、ポンプ光用光源１１１から出射されるポンプ光をダイクロイックプリズム１１４に入射させ、イレース光用光源１１２から出射されるイレース光は、位相板１１３により位相変調してからダイクロイックプリズム１１４に入射させて、ダイクロイックプリズム１１４でポンプ光とイレース光とを合成して同軸で出射させている。
【００２０】
位相板１１３は、光軸の周りをイレース光の位相差が２π周回するように構成されるもので、例えば図１７に示すように、光軸の周りに独立した８領域を有し、イレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なるようにガラス基板をエッチングして形成される。図１７には、各領域のエッチング深さｄも示している。この位相板１１３を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺された中空状のイレース光が生成される。
【００２１】
ここで、ローダミン６Ｇ色素で染色された試料を観察する場合には、ポンプ光用光源１１１は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザを用い、その２倍高調波である波長５３２ｎｍの光をポンプ光として出射するように構成される。また、イレース光用光源１１２は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザとラマンシフタとを用い、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍高調波をラマンシフタで波長５９９ｎｍに変換した光をイレース光として出射するように構成される。
【００２２】
スキャンユニット１３０では、光源ユニット１１０から同軸で出射されるポンプ光およびイレース光を、ハーフプリズム１３１を通過させた後、２枚のガルバノミラー１３２および１３３により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット１５０に出射するようになっていると共に、顕微鏡ユニット１５０で検出された蛍光を、往路と逆の経路を辿ってハーフプリズム１３１で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ１３４、ピンホール１３５、ノッチフィルタ１３６および１３７を経て光電子増倍管１３８で受光するようになっている。
【００２３】
図１６では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー１３２，１３３を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ１３６および１３７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、ピンホール１３５は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００２４】
顕微鏡ユニット１５０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット１３０から入射するポンプ光およびイレース光をハーフプリズム１５１で反射させて、顕微鏡対物レンズ１５２により少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料１５３上に集光させると共に、観察試料１５３で発光した蛍光を、再び顕微鏡対物レンズ１５２でコリメートしてハーフプリズム１５１で反射させることにより、再び、スキャンユニット１３０に戻すと同時に、ハーフプリズム１５１を通過する蛍光の一部を接眼レンズ１５４に導いて、蛍光像として目視観察できるようになっている。
【００２５】
この超解像顕微鏡によると、観察試料１５３の集光点上においてイレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されて、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域に存在する蛍光ラベラー分子のみを計測できるので、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列すれば、回折限界の空間分解能を上回る解像度を有する顕微鏡画像を形成することが可能となる。
【００２６】
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
ところが、本発明者による実験検討によると、従来提案されている超解像顕微鏡にあっては、特に、結像性能や顕微鏡の組み立てにおいて、以下に説明するような改良すべき点があることが判明した。
【００２８】
すなわち、超解像顕微鏡においては、ポンプ光の光路とイレース光の光路とを完全に同軸に合わせて、焦点面においてポンプ光のピーク位置をイレース光の中央中空部に完全に一致させる必要がある。
【００２９】
しかしながら、図１５に示した超解像顕微鏡では、イレース光を位相板１１３で位相変調してからダイクロイックプリズム１１４に入射させて、ダイクロイックプリズム１１４において全く独立した光路から入射するポンプ光と合成するようにしているため、ポンプ光と位相変調されたイレース光とが完全に同軸となるように、ポンプ光用光源１１１、イレース光用光源１１２、位相板１１３およびダイクロイックプリズム１１４を光学的に位置調整するのが困難である。
【００３０】
このため、焦点面において、ポンプ光のピーク位置がイレース光の辺緑部にずれて、ポンプ光の集光領域全体が蛍光抑制され、解像度およびＳ／Ｎの劣化を招くことが懸念される。
【００３１】
したがって、かかる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、ポンプ光とイレース光との光学調整を簡単かつ正確に行うことができ、超解像効果を確実に発現できる顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
上記目的を達成する請求項１に係る顕微鏡の発明は、
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する顕微鏡であって、
上記物質を基底状態から第１励起状態に励起するポンプ光を出射するポンプ光用光源と、
上記物質を上記第１励起状態から他の励起状態に励起するイレース光を出射するイレース光用光源と、
上記ポンプ光と上記イレース光とを同軸に合成する光合成手段と、
上記光合成手段による合成光を上記試料に集光する集光手段と、
上記集光手段により集光される上記合成光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を上記合成光により走査する走査手段と、
上記合成光の照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段と、
上記合成光の光路中に配置され、上記イレース光に対して高い波長選択特性を有するイレース光選択領域および上記ポンプ光に対して高い波長選択特性を有するポンプ光選択領域を備える波長選択素子と、
上記合成光の光路中に配置され、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を空間変調する空間変調素子と、
を有することを特徴とするものである。
【００３３】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高透過率のイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高透過率のポンプ光選択領域とを有する分光透過フィルタからなることを特徴とするものである。
【００３４】
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高反射率の多層膜からなるイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高反射率の多層膜からなるポンプ光選択領域とを有する反射ミラーからなることを特徴とするものである。
【００３５】
請求項４に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高回折効率のイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高回折効率のポンプ光選択領域とを有する回折格子からなることを特徴とするものである。
【００３６】
請求項５に係る発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、該波長選択素子を経た上記合成光が、光軸断面内において、上記イレース光のみの強度が存在するイレース光領域と、上記ポンプ光のみの強度が存在するポンプ光領域と、上記イレース光領域および上記ポンプ光領域の境界部分において、上記合成光の光軸断面の外形よりも小さく、かつ上記イレース光および上記ポンプ光の重複強度が小さい重複領域とを有するように形成することを特徴とするものである。
【００３７】
請求項６に係る発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、同心円状に分割された上記イレース光選択領域と上記ポンプ光選択領域とを有することを特徴とするものである。
【００３８】
請求項７に係る発明は、請求項６に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、上記ポンプ光選択領域が光軸近傍の円形領域を占め、上記イレース光選択領域が上記ポンプ光選択領域の外側の輪帯領域を占めることを特徴とするものである。
【００３９】
請求項８に係る発明は、請求項７に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子は、上記ポンプ光選択領域の直径が上記集光手段の入射口径よりも小さく、かつ、上記イレース光選択領域の外径が上記集光手段の入射口径よりも大きいことを特徴とするものである。
【００４０】
請求項９に係る発明は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記空間変調素子は、上記ポンプ光および上記イレース光に対して透明な基板を有し、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調するエッチング領域を有する位相板からなることを特徴とするものである。
【００４１】
請求項１０に係る発明は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記空間変調素子は、上記ポンプ光および上記イレース光に対して透明な基板を有し、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する光学薄膜をコートした位相板からなることを特徴とするものである。
【００４２】
請求項１１に係る発明は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記空間変調素子は、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する液晶型空間変調器からなることを特徴とするものである。
【００４３】
請求項１２に係る発明は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記空間変調素子は、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する形状可変ミラーからなることを特徴とするものである。
【００４４】
請求項１３に係る発明は、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を、上記集光手段の鏡筒内に設けたことを特徴とするものである。
【００４５】
請求項１４に係る発明は、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記走査手段は上記合成光の光路中に配置したガルバノミラーを有し、該ガルバノミラーと上記光合成手段との間の上記合成光の光路中に、上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を配置したことを特徴とするものである。
【００４６】
請求項１５に係る発明は、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記光合成手段は、上記ポンプ光および上記イレース光を導光する光ファイバを有することを特徴とするものである。
【００４７】
請求項１６に係る発明は、請求項１５に記載の顕微鏡において、
上記光ファイバは、シングルモードファイバからなることを特徴とするものである。
【００４８】
請求項１７に係る発明は、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質が、蛍光性分子、量子ドット、蛍光タンパクのいずれかであることを特徴とするものである。
【００４９】
請求項１８に係る発明は、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を、上記集光手段の瞳面または共役瞳面、あるいはその近傍に配置したことを特徴とするものである。
【００５０】
先ず、本発明の概要について説明する。上記の課題を解決する本発明の基本的な考え方は、超解像顕微鏡を組み立てる際の最大の難点であるポンプ光とイレース光の位置合わせを機械的な精度で実現し、個別ビームに対する光軸調整作業を省いた点にある。
【００５１】
そのため、ポンプ光とイレース光とを、例えば、ピンホールのような微小な射出口を通して同時に放射させて合成する。具体的には、シングルモードファイバ等にポンプ光とイレース光とを同時に入射させて、同一の射出口から同一の立体角で放出させる。このようにして合成されたポンプ光とイレース光とを色収差の無いアクロマートな光学系で結像すれば、完全に同軸でコリメートして集光することができる。特に、顕微鏡対物レンズで集光すれば、焦点面の全く同じポイントにポンプ光およびイレース光を集光することができる。
【００５２】
本発明の一実施の形態では、同軸・同径に揃ったポンプ光およびイレース光の合成光を、波長選択素子に入射させる。波長選択素子は、例えば図１に示すような輪帯フィルタ１をもって構成する。この輪帯フィルタ１は、同心円構造となっており、中央部の内径（半径）ｒinの円形領域は、ポンプ光の透過率が高く、イレース光の透過率が低い分光特性を有するポンプ光選択領域１ａとなっており、この内径ｒinと瞳径である外径（半径）ｒoutとの間の輪帯領域は、イレース光の透過率が高く、ポンプ光の透過率が低い分光特性を有するイレース光選択領域１ｂとなっている。
【００５３】
この輪帯フィルタ１に、同軸・同径に揃ったポンプ光およびイレース光を入射させると、輪帯フィルタ１の円形状のポンプ光選択領域１ａから主としてポンプ光が透過し、輪帯状のイレース光選択領域１ｂからは主としてイレース光が透過することになる。
【００５４】
さらに、中空状のイレース光を生成するための空間変調素子として、例えば図２に示すような輪帯位相板２を用いる。この輪帯位相板２は、ガラスを基板とし、中央部の内径ｒinの円形領域は、位相無変調領域２ａで、この位相無変調領域２ａに入射する光は位相を変調することなく透過させ、この内径ｒinと外径ｒoutとの間の輪帯領域は、位相変調領域２ｂで、イレース光の位相差が２π周回するように、光軸の周りにイレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なるようにエッチングが施されている。
【００５５】
図１に示した輪帯フィルタ１および図２に示した輪帯位相板２の内径ｒinおよび外径ｒoutをそれぞれ同じにして形状を完全に一致させ、これら輪帯フィルタ１および輪帯位相板２を同軸上に配置して、同軸に光学調整されたポンプ光およびイレース光の合成光を透過させると、図３にビーム断面を示すように、輪帯に強度分布をもつ位相変調されたイレース光領域５ａと、その内側を通過する位相変調を受けないポンプ光領域５ｂが得られる。なお、ポンプ光およびイレース光の合成光は、輪帯フィルタ１を経てから輪帯位相板２に入射させても良いし、逆に、輪帯位相板２を経てから輪帯フィルタ１に入射させても良い。
【００５６】
したがって、図３に示すビーム断面を有するポンプ光およびイレース光を、同じ顕微鏡対物レンズで集光すれば、結像面でイレース光は中空形状に集光し、ポンプ光は円形のレイリーの回折バターとなって集光することになる。この際、ポンプ光およびイレース光が完全に同軸であれば、図４に集光パターンを示すように、結像面で中空状のイレース光の中心と、ポンプ光のピーク位置とが完全に一致することになる。
【００５７】
例えば、同軸に調整されたポンプ光およびイレース光が、上述したように同じシングルモードファイバの射出口から導かれ、かつ何れの光もデリバリされることなく同一の光学系を通過したものであれば、ポンプ光およびイレース光は波面収差を持たず、同じダイバージェンス（ビーム広がり）で、全く同じ結像点に集光することになる。したがって、このように構成すれば、基本的にはシステムの光学調整は不要となる。
【００５８】
ここで、ポンプ光に着目すると、図１に示した輪帯フィルタ１を用いた場合には、瞳面の辺縁部が輪帯フィルタ１でカットされることになる。このため、遮光の面積比に応じて、実質上、顕微鏡対物レンズの開口数（ＮＡ）が減少することになる。例えば、図１に示した輪帯フィルタ１の場合は、イレース光選択領域１ｂの外径である瞳径（ｒout）とポンプ光が透過するイレース光遮光領域の径（ｒin）との比で、ポンプ光の集光スポットの直径である全幅（Ｒp）が決定される。具体的には、ポンプ光の波長をλpとすると、レイリーの式に従って、下記の（１）式によりＲpが決定される。
【００５９】
【数１】
【００６０】
上記（１）式から、例えば、ｒin／ｒoutを７０％とすると、全瞳径を使用した場合と比較して、集光スポットの全幅Ｒpは、３０％ほど太くなる。
【００６１】
しかしながら、図４に集光パターンを示したように、ポンプ光の直径がイレース光の外径よりも小さい場合には、超解像顕微鏡における結像性能、すなわち点像分布関数の半値幅は、イレース光の強度と集光パターンで決まる。ここで、イレース光の波長をλeとすると、イレース光の集光スポットにおける外輪の直径（Ｒe）は、２λe／ＮＡで表されるので、輪帯フィルタの内側を通ったポンプ光の集光スポットの直径Ｒpが、Ｒe よりも小さければ、結像面において光軸近傍を除いたポンプ光照射部がイレース光の照射領域に完全に覆われることになる。
【００６２】
具体的には、上記（１）式から、下記の（２）式で表される条件が得られる。ローダミン６Ｇ分子の場合、λpが５３２ｎｍ、λeが５９９ｎｍであるので、ｒin／ｒoutが７０％の場合には、この条件を満足することになる。なお、（２）式において、ｒpはポンプ光の集光スポットの半径（Ｒp／２）を示しており、ｒeはイレース光の集光スポットの半径（Ｒe／２）を示している。
【００６３】
【数２】
【００６４】
このような条件下では、ポンプ光の集光状態に拘らず、イレース光の強度と色素分子の光学物性により、超解像顕微鏡の結像性能が決定される。すなわち、点像分布関数の半値幅（Γ）は、下記の（３）式で表され、ポンプ光の回折限界サイズよりも小さくなる。なお、（３）式において、Ｉeはイレース光の集光面における最大フォトンフラックスを示しており、σdipおよびτは、それぞれ色素分子の蛍光抑制断面積および蛍光寿命を示している。
【００６５】
【数３】
【００６６】
ここで、蛍光抑制断面積σdipとは、文献：Y. Iketaki, T. Watanabe, M, Sakai, S Ishiuchi, M. Fujii and T. Watanabe, "Theoretical investigation of the point-spread function given by super-resolving fluorescence microscopy using two-color fluorescence dip spectroscopy," Opt. Eng.44, 033602(2005)で定義されている光学定数で、
σdip＝σf＋ασup
で表される。なお、σf は誘導放出断面積であり、σupはＳ１状態から他のＳｎ状態（ｎは２以上の正の整数）へ遷移するときの２重共鳴吸収断面積である。また、αはＳｎ状態からの非輻射で緩和する確率である。
【００６７】
したがって、シングルモードファイバによりポンプ光とイレース光とを同軸に調整した後、輪帯フィルタおよび輪帯位相板を透過させてイレース光を位相変調しても、従来と比較して全く結像性能を劣化させることはない。しかも、従来のように、ポンプ光およびイレース光に対して、個別の複雑な光学調整が不要となる。
【００６８】
なお、波長選択素子は、例えば図５に示すような輪帯フィルタ１１を用いることができる。この輪帯フィルタ１１は、図１に示した輪帯フィルタ１におけるポンプ光選択領域１ａとイレース光選択領域１ｂとの配置を逆にして、中央部の内径ｒinの円形領域を、イレース光の透過率が高く、ポンプ光の透過率が低い分光特性を有するイレース光選択領域１１ｂとし、この内径ｒinと瞳径である外径（半径）ｒoutとの間の輪帯領域は、ポンプ光の透過率が高く、イレース光の透過率が低い分光特性を有するポンプ光選択領域１１ａとしたものである。
【００６９】
同様に、空間変調素子も、例えば図６に示すような輪帯位相板１２を用いることができる。この輪帯位相板１２は、図２に示した輪帯位相板２における位相無変調領域２ａと位相変調領域２ｂとの配置を逆にして、中央部の内径ｒinの円形領域を、イレース光の位相差が２π周回するように、光軸の周りにイレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なるようにエッチングを施した位相変調領域１２ｂとし、この内径ｒinと外径ｒoutとの間の輪帯領域は、位相無変調領域１２ａとして、この位相無変調領域１２ａに入射する光は位相を変調することなく透過させるようにしたものである。
【００７０】
図５および図６に示した輪帯フィルタ１１および輪帯位相板１２を用いた場合には、イレース光に対する顕微鏡対物レンズのＮＡが実効的に小さくなるため、イレース光の中央中空部の径が大きくなって、ポンプ光辺縁部における蛍光抑制効果の発現が弱くなるが、イレース光の強度を上げれば、上記（３）式に従って超解像効果が発現する。
【００７１】
本発明は、特に、一本のシングルモードファイバから多波長のレーザ光を同軸で出射させ、ガルバノミラーによりレーザビームの空間走査を行う構造の商用レーザ走査型顕微鏡に容易に搭載することができる。すなわち、イレース光およびポンプ光の波長に対応するレーザ光源を用意し、これらレーザ光源からシングルモードファイバを経て出射されるポンプ光およびイレース光をコリメートした後、上述した波長選択素子および空間変調素子に入射させるようにすることで、商用レーザ走査型顕微鏡に容易に超解像機能を付加することができる。
【００７２】
また、本発明において、ポンプ光とイレース光とを合成する光合成手段は、光ファイバを用いるのが好ましいが、通常のダイクロックミラー等を用いてポンプ光とイレース光とを同軸にする場合でも、光学調整の際の利便性が向上することができる。すなわち、この場合には、従来と同様に、ポンプ光とイレース光とを同軸に調整すると言う作業が加わるが、同軸に調整されたポンプ光およびイレース光を、上述したように波長選択素子および空間変調素子に入射させれば、それらの光学素子によってポンプ光およびイレース光は全く同じダイバージェンスおよび角度ずれの影響を受けることになる。
【００７３】
この場合、ポンプ光およびイレース光の空間内における集光点の絶対的な位置は、調整によって変化するが、集光点の相対的な位置関係は変化しない。言い換えると、ポンプ光およびイレース光は同じ位置に集光する。したがって、例えば波長選択素子および空間変調素子を経たポンプ光およびイレース光を、光走査手段であるガルバノミラーや顕微鏡試料ステージの位置調整により走査すれば、結像性能を復元させることができる。
【００７４】
また、波長選択素子は、透過型の輪帯フィルタに限らず、ポンプ光選択領域で主としてポンプ光を反射させ、イレース光選択領域で主としてイレース光を反射させる多層膜をコートした反射ミラーを用い、この反射ミラーで反射されたポンプ光およびイレース光を用いるようにしてもよいし、ポンプ光選択領域で主としてポンプ光を回折させ、イレース光選択領域で主としてイレース光を回折させる回折格子を用い、この回折格子で回折されたポンプ光およびイレース光を用いるようにしてもよい。
【００７５】
同様に、空間変調素子も、ポンプ光およびイレース光に対して透明な光学基板をエッチングして形成した位相板に限らず、該光学基板に光学薄膜をコートした位相板や液晶型の光空間変調器、あるいはミラー形状が可変のデフォーマラブルミラー等を用いて構成することもできる。
【００７６】
さらに、空間変調素子や波長選択素子は、顕微鏡対物レンズの鏡枠に設けることもできる。このようにすれば、市販のレーザ走査型顕微鏡システムの構成を変化させることなく、顕微鏡対物レンズの交換のみで超解像機能を付加することができ、利便性を向上することができる。
【００７７】
特に、空間変調素子や波長選択素子を顕微鏡対物レンズの瞳位置に配置すれば、ポンプ光およびイレース光を空間走査しても、波面収差が少ないので、特に超解像顕微鏡機能を左右するイレース光の集光形状を乱すことなく、広い視野で高い結像性能を保つことができる。
【００７８】
さらに、本発明に係る超解像顕微鏡は、蛍光抑制効果を示す発光性材料の観察に広く適用できるもので、例えば、２以上の励起量子状態をもつ蛍光抑制効果が発現できるローダミン６Ｇのような有機色素分子からなる蛍光性分子、ＣsｄやＺnＯのような半導体量子ドット、トリ（８−キノリノラト）アルミニウムのような蛍光錯体分子、フォトクロミック特性を示すＦＰ５９５ＧＦＰのような蛍光タンパク、などの観察にも応用することができる。
【発明の効果】
【００７９】
本発明によれば、ポンプ光とイレース光とを合成してから、波長選択素子および空間変調素子に入射させるようにしたので、面倒な光学調整を要することなく、ポンプ光およびイレース光を集光手段により観察試料の全く同じ結像点に集光させることができ、超解像効果を確実に発現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
以下、本発明に係る顕微鏡の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００８１】
（第１実施の形態）
図７は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット２０、スキャンユニット４０および顕微鏡ユニット６０を有しており、スキャンユニット４０および顕微鏡ユニット６０は、瞳投影レンズ系７０を介して光学的に結合されている。
【００８２】
光源ユニット２０は、ポンプ光用光源２１から出射されるポンプ光およびイレース光用光源２２から出射されるイレース光を、ダイクロイックプリズム２３で合成した後、ファイバ集光レンズ２４を経て同一のシングルモードファイバ２５に同軸に入射させ、これによりシングルモードファイバ２５の射出口から放射立体角を揃えて完全球面波として出射させ、その出射光をファイバコリメータレンズ２６で平面波に変換して、スキャンユニット４０に入射させる。ここで、ダイクロイックプリズム２３、ファイバ集光レンズ２４、シングルモードファイバ２５、ファイバコリメータレンズ２６は、光合成手段を構成している。
【００８３】
本実施の形態では、ローダミン６Ｇ色素で染色された試料を観察するため、ポンプ光用光源２１は、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザを用い、その２倍高調波である波長５３２ｎｍの光をポンプ光として出射させ、イレース光用光源２２は、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザとラマンシフタとを用い、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍高調波をラマンシフタで波長５９９ｎｍに変換した光をイレース光として出射させる。
【００８４】
スキャンユニット４０は、光源ユニット２０から出射されるポンプ光およびイレース光を、ハーフプリズム４１を通過させた後、波長選択素子４２および空間変調素子４３を経て走査手段である２枚のガルバノミラー４４および４５により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット６０に出射させる。また、顕微鏡ユニット６０で検出された蛍光を、往路とは逆の経路を辿ってハーフプリズム４１で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ４６、ピンホール４７を、ノッチフィルタ４８および４９を経て検出手段である光電子増倍管５０で受光する。
【００８５】
波長選択素子４２は、例えば図１に示した輪帯フィルタ１を用い、空間変調素子４３は、例えば図２に示した輪帯位相板２を用いる。なお、ピンホール３７は、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものであり、ノッチフィルタ４８および４９は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、図７では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー４４，４５を同一平面内で揺動可能に示している。
【００８６】
スキャンユニット４０から出射されるポンプ光およびイレース光は、瞳投影レンズ系７０を介して顕微鏡ユニット６０に入射させる。
【００８７】
顕微鏡ユニット６０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット４０から瞳投影レンズ系７０を介して入射するポンプ光およびイレース光をハーフプリズム６１で反射させて、集光手段である顕微鏡対物レンズ６２によりローダミン６Ｇ色素で染色された観察試料６３上に集光させる。また、観察試料６３で発光した蛍光は、顕微鏡対物レンズ６２でコリメートしてハーフプリズム６１で反射させることにより、瞳投影レンズ系７０を経てスキャンユニット４０に戻すと同時に、ハーフプリズム６１を通過する蛍光の一部は、蛍光像として目視観察できるように接眼レンズ６４に導く。なお、顕微鏡対物レンズ６２は、その鏡筒も含めて示している。
【００８８】
ここで、瞳投影レンズ系７０は、顕微鏡対物レンズ６２の瞳位置をスキャンユニット４０内に投影して共役瞳面を形成する。
【００８９】
本実施の形態では、この瞳投影レンズ系７０によってスキャンユニット４０内に投影される顕微鏡対物レンズ６２の共役瞳面またはその近傍に、波長選択素子４２および空間変調素子４３を配置して、光源ユニット２０から同軸の平行光で入射するポンプ光およびイレース光を、波長選択素子４２により中央部から主としてポンプ光を透過させ、その周辺の輪帯部から主としてイレース光を透過させ、さらに空間変調素子４３により中央部のポンプ光は位相変調することなく透過させ、輪帯部のイレース光は位相変調して透過させる。
【００９０】
このように、本実施の形態では、光源ユニット２０において、ポンプ光用光源２１から出射されるポンプ光およびイレース光用光源２２から出射されるイレース光を、ダイクロイックプリズム２３で合成した後は、いずれの光もデリバリすることなく、同一光学系、すなわちファイバ集光レンズ２４およびシングルモードファイバ２５を経て出射させている。しかも、シングルモードファイバ２５から出射される完全球面波のポンプ光およびイレース光を、ファイバコリメータレンズ２６により同じ条件でコリメートしている。したがって、面倒な光学調整を要することなく、ポンプ光およびイレース光を、波面収差を与えることなく、同じダイバージェンス（ビーム広がり）で顕微鏡対物レンズ６２により観察試料６３の全く同じ結像点に集光させることができる。
【００９１】
また、波長選択素子４２および空間変調素子４３を、瞳投影レンズ系７０によってスキャンユニット４０内に投影される顕微鏡対物レンズ６２の共役瞳面またはその近傍に配置したので、ガルバノミラー４４および４５の揺動走査による波面収差の発生を抑えることができる。したがって、超解像顕微鏡性能を左右するイレース光の集光形状を乱すことなく、広い視野で高い結像性能を保つことができるとともに、観察試料６３上では常に図４に示したような位置関係でポンプ光およびイレース光を集光でき、良好な状態で超解像機能を発現できる。
【００９２】
（第２実施の形態）
図８は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、図７に示した超解像顕微鏡と光源ユニット２０の構成が異なるものである。
【００９３】
すなわち、本実施の形態では、光ファイバを用いることなくポンプ光とイレース光とを同軸に合成してから、イレース光を位相変調する。このため、ポンプ光用光源２１から出射されるポンプ光は、角度調整ミラー３１ａ，３１ｂにより２次元方向の角度を調整し、さらにビーム発散角調整レンズ３２によりポンプ光の発散角を調整してから、ダイクロイックプリズム３３に入射させる。同様に、イレース光用光源２２から出射されるイレース光は、角度調整ミラー３４ａ，３４ｂにより２次元方向の角度を調整し、さらにビーム発散角調整レンズ３５によりイレース光の発散角を調整してから、ダイクロイックプリズム３３に入射させて、ポンプ光と同軸に調整して出射させる。
【００９４】
ダイクロイックプリズム３３から同軸に出射されるポンプ光およびイレース光は、角度調整ミラー３６ａ，３６ｂにより２次元方向の角度を調整し、さらにビーム発散角調整レンズ３７により発散角を調整した後、アイリス３８を経てスキャンユニット４０に入射させる。その他の構成は、第１実施の形態と同様である。
【００９５】
本実施の形態によると、角度調整ミラー３１ａ，３１ｂ，３４ａ，３４ｂにより、ポンプ光およびイレース光を同軸に調整する作業を要するが、同軸に調整した後、波長選択素子４２および空間変調素子４３に入射させてイレース光を位相変調するので、ポンプ光およびイレース光は波長選択素子４２および空間変調素子４３により全く同じダイバージェンスおよび角度ずれの影響を受けることになる。したがって、本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の効果が得られる。
【００９６】
（第３実施の形態）
図９は、本発明の第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部断面図である。本実施の形態は、第１実施の形態または第２実施の形態において、顕微鏡対物レンズ６２の鏡筒６２ａ内に波長選択素子４２および空間変調素子４３を配置したものである。
【００９７】
すなわち、顕微鏡対物レンズ６２の鏡筒６２ａ内で、顕微鏡対物レンズ系６２ｂの像側（入射側）に波長選択素子４２および空間変調素子４３を配置する。また、図示しないがガルバノミラー４４，４５は、瞳投影レンズ系７０によって投影される顕微鏡対物レンズ６２の共役瞳面を挟むように配置する。
【００９８】
本実施の形態によれば、上述した実施の形態と同様、広い視野で高い結像性能を保つことができるとともに、観察試料６３上では常に図４に示したような位置関係でポンプ光およびイレース光を集光でき、良好な状態で超解像機能を発現できる他、顕微鏡対物レンズ６２の鏡筒６２ａ内で、顕微鏡対物レンズ系６２ｂの像側（入射側）に波長選択素子４２および空間変調素子４３を配置するので、より簡単に構成できる利点がある。
【００９９】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、ガルバノミラー４４，４５によりポンプ光およびイレース光を偏向して観察試料６３を二次元走査するようにしたが、顕微鏡対物レンズ６２および／または観察試料６３を載置する試料ステージを移動させて、ポンプ光およびイレース光により観察試料６３を二次元走査したり、一つのガルバノミラーによるポンプ光およびイレース光の一次元移動（主走査）と、その一次元移動と直交する方向への顕微鏡対物レンズ６２あるいは試料ステージの一次元移動（副走査）との組み合わせて、観察試料６３を二次元走査したりすることもできる。
【０１００】
また、波長選択素子４２および空間変調素子４３は、顕微鏡対物レンズ６２の鏡筒内で顕微鏡対物レンズ６２の瞳位置またはその近傍に配置することもできる。なお、観察試料６３を走査するために、ポンプ光およびイレース光を偏向する場合には、波長選択素子４２および空間変調素子４３は、顕微鏡対物レンズ６２の瞳位置またはその近傍、あるいは瞳位置と共役な位置またはその近傍に配置するのが好ましいが、通常の走査範囲での計測であれば、合成されたポンプ光およびイレース光の光路中、好ましくは平行光路中の任意の位置に接合あるいは離間して配置することにより、良好な状態で超解像機能を発現することができる。
【０１０１】
さらに、波長選択素子４２は、イレース光選択領域とポンプ光選択領域とを同心円状に形成する場合に限らず、光軸断面内で、イレース光のみの強度が存在するイレース光領域と、ポンプ光のみの強度が存在するポンプ光領域と、イレース光領域およびポンプ光領域の境界において、イレース光領域およびポンプ光領域よりも小さく、かつイレース光およびポンプ光の強度が小さい重複領域とを有するように形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】本発明の顕微鏡を構成する波長選択素子の一例を示す図である。
【図２】同じく、空間変調素子の一例を示す図である。
【図３】図１の輪帯フィルタおよび図２の輪帯位相板を透過した後の合成光のビーム断面を示す図である。
【図４】図３に示すビーム断面を有するポンプ光およびイレース光の結像面での集光パターンを示す図である。
【図５】本発明の顕微鏡を構成する波長選択素子の他の例を示す図である。
【図６】同じく、空間変調素子の他の例を示す図である。
【図７】本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図８】同じく、第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図９】同じく、第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部断面図である。
【図１０】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１１】図１６の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１２】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１３】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図１４】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１５】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１６】従来提案されている超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図１７】図１６に示す位相板の構成を示す図である。
【符号の説明】
【０１０３】
１，１１ 輪帯フィルタ
１ａ，１１ａ ポンプ光選択領域
１ｂ，１１ｂ イレース光選択領域
２，１２ 輪帯位相板
２ａ，１２ａ 位相無変調領域
２ｂ，１２ｂ 位相変調領域
５ａ イレース光領域
５ｂ ポンプ光領域
２０ 光源ユニット
２１ ポンプ光用光源
２２ イレース光用光源
２３ ダイクロイックプリズム
２４ ファイバ集光レンズ
２５ シングルモードファイバ
２６ ファイバコリメータレンズ
３１ａ，３１ｂ，３４ａ，３４ｂ，３６ａ，３６ｂ 角度調整ミラー
３２，３５，３７ ビーム発散角調整レンズ
３３ ダイクロイックプリズム
３８ アイリス
４０ スキャンユニット
４１ ハーフプリズム
４２ 波長選択素子
４３ 空間変調素子
４４，４５ ガルバノミラー
４６ 投影レンズ
４７ ピンホール
４８，４９ ノッチフィルタ
５０ 光電子増倍管
６０ 顕微鏡ユニット
６１ ハーフプリズム
６２ 顕微鏡対物レンズ
６２ａ 鏡筒
６２ｂ 顕微鏡対物レンズ系
６３ 観察試料
６４ 接眼レンズ
７０ 瞳投影レンズ系
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する顕微鏡であって、
上記物質を基底状態から第１励起状態に励起するポンプ光を出射するポンプ光用光源と、
上記物質を上記第１励起状態から他の励起状態に励起するイレース光を出射するイレース光用光源と、
上記ポンプ光と上記イレース光とを同軸に合成する光合成手段と、
上記光合成手段による合成光を上記試料に集光する集光手段と、
上記集光手段により集光される上記合成光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を上記合成光により走査する走査手段と、
上記合成光の照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段と、
上記合成光の光路中に配置され、上記イレース光に対して高い波長選択特性を有するイレース光選択領域および上記ポンプ光に対して高い波長選択特性を有するポンプ光選択領域を備える波長選択素子と、
上記合成光の光路中に配置され、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を空間変調する空間変調素子と、
を有することを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高透過率のイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高透過率のポンプ光選択領域とを有する分光透過フィルタからなることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高反射率の多層膜からなるイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高反射率の多層膜からなるポンプ光選択領域とを有する反射ミラーからなることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項４】
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高回折効率のイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高回折効率のポンプ光選択領域とを有する回折格子からなることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項５】
上記波長選択素子は、該波長選択素子を経た上記合成光が、光軸断面内において、上記イレース光のみの強度が存在するイレース光領域と、上記ポンプ光のみの強度が存在するポンプ光領域と、上記イレース光領域および上記ポンプ光領域の境界部分において、上記合成光の光軸断面の外形よりも小さく、かつ上記イレース光および上記ポンプ光の重複強度が小さい重複領域とを有するように形成することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項６】
上記波長選択素子は、同心円状に分割された上記イレース光選択領域と上記ポンプ光選択領域とを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項７】
上記波長選択素子は、上記ポンプ光選択領域が光軸近傍の円形領域を占め、上記イレース光選択領域が上記ポンプ光選択領域の外側の輪帯領域を占めることを特徴とする請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項８】
上記波長選択素子は、上記ポンプ光選択領域の直径が上記集光手段の入射口径よりも小さく、かつ、上記イレース光選択領域の外径が上記集光手段の入射口径よりも大きいことを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。
【請求項９】
上記空間変調素子は、上記ポンプ光および上記イレース光に対して透明な基板を有し、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調するエッチング領域を有する位相板からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
上記空間変調素子は、上記ポンプ光および上記イレース光に対して透明な基板を有し、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する光学薄膜をコートした位相板からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
上記空間変調素子は、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する液晶型空間変調器からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
上記空間変調素子は、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する形状可変ミラーからなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を、上記集光手段の鏡筒内に設けたことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１４】
上記走査手段は上記合成光の光路中に配置したガルバノミラーを有し、該ガルバノミラーと上記光合成手段との間の上記合成光の光路中に、上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を配置したことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１５】
上記光合成手段は、上記ポンプ光および上記イレース光を導光する光ファイバを有することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１６】
上記光ファイバは、シングルモードファイバからなることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡。
【請求項１７】
上記少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質が、蛍光性分子、量子ドット、蛍光タンパクのいずれかであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１８】
上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を、上記集光手段の瞳面または共役瞳面、あるいはその近傍に配置したことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１】
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する顕微鏡であって、
上記物質を基底状態から第１励起状態に励起するポンプ光を出射するポンプ光用光源と、
上記物質を上記第１励起状態から他の励起状態に励起するイレース光を出射するイレース光用光源と、
上記ポンプ光と上記イレース光とを同軸に合成する光合成手段と、
上記光合成手段による合成光を上記試料に集光する集光手段と、
上記集光手段により集光される上記合成光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を上記合成光により走査する走査手段と、
上記合成光の照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段と、
上記合成光の光路中に配置され、上記イレース光に対して高い波長選択特性を有するイレース光選択領域および上記ポンプ光に対して高い波長選択特性を有するポンプ光選択領域を備える波長選択素子と、
上記合成光の光路中に配置され、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を空間変調する空間変調素子と、
を有することを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高透過率のイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高透過率のポンプ光選択領域とを有する分光透過フィルタからなることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高反射率の多層膜からなるイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高反射率の多層膜からなるポンプ光選択領域とを有する反射ミラーからなることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項４】
上記波長選択素子は、上記イレース光に対して高回折効率のイレース光選択領域と、上記ポンプ光に対して高回折効率のポンプ光選択領域とを有する回折格子からなることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項５】
上記波長選択素子は、該波長選択素子を経た上記合成光が、光軸断面内において、上記イレース光のみの強度が存在するイレース光領域と、上記ポンプ光のみの強度が存在するポンプ光領域と、上記イレース光領域および上記ポンプ光領域の境界部分において、上記合成光の光軸断面の外形よりも小さく、かつ上記イレース光および上記ポンプ光の重複強度が小さい重複領域とを有するように形成することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項６】
上記波長選択素子は、同心円状に分割された上記イレース光選択領域と上記ポンプ光選択領域とを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項７】
上記波長選択素子は、上記ポンプ光選択領域が光軸近傍の円形領域を占め、上記イレース光選択領域が上記ポンプ光選択領域の外側の輪帯領域を占めることを特徴とする請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項８】
上記波長選択素子は、上記ポンプ光選択領域の直径が上記集光手段の入射口径よりも小さく、かつ、上記イレース光選択領域の外径が上記集光手段の入射口径よりも大きいことを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。
【請求項９】
上記空間変調素子は、上記ポンプ光および上記イレース光に対して透明な基板を有し、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調するエッチング領域を有する位相板からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
上記空間変調素子は、上記ポンプ光および上記イレース光に対して透明な基板を有し、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する光学薄膜をコートした位相板からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
上記空間変調素子は、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する液晶型空間変調器からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
上記空間変調素子は、上記波長選択素子の上記イレース光選択領域に対応するイレース光を位相変調する形状可変ミラーからなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を、上記集光手段の鏡筒内に設けたことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１４】
上記走査手段は上記合成光の光路中に配置したガルバノミラーを有し、該ガルバノミラーと上記光合成手段との間の上記合成光の光路中に、上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を配置したことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１５】
上記光合成手段は、上記ポンプ光および上記イレース光を導光する光ファイバを有することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１６】
上記光ファイバは、シングルモードファイバからなることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡。
【請求項１７】
上記少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質が、蛍光性分子、量子ドット、蛍光タンパクのいずれかであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１８】
上記波長選択素子および／または上記空間変調素子を、上記集光手段の瞳面または共役瞳面、あるいはその近傍に配置したことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−５８００３（Ｐ２００８−５８００３Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３２１１５（Ｐ２００６−２３２１１５）
【出願日】平成１８年８月２９日（２００６．８．２９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２９日（２００６．８．２９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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