高分子量の立体的な基へ抱合された核酸アプタマー
本発明は、標的分子に対する及び、アプタマー抱合体に対して結合する場合に標的分子によって標的分子結合パートナーに対する結合又は標的分子結合パートナーとの相互作用の阻害を亢進又は容易にする可溶性高分子量の立体的な基に対する特異的な親和性を有する核酸配列を含む立体的に増強されたアンタゴニストアプタマー抱合体を作製及び使用するための組成物及び方法を提供する。本発明は、荷電分子を生物学的活性分子へ結合し、生物学的活性分子をイオン泳動によって送達することによる、生物学的活性分子の眼内送達のための方法及び製剤も提供する。高分子量中性部分へ共役される生物学的活性分子のイオン泳動は、高分子量中性部分を匹敵する大きさの荷電分子と置換することによって増強される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００４年４月１３日に出願した米国仮出願第６０／５６１，６０１号の、及び２００５年３月４日に出願した米国仮出願第６０／６５８，８１９号の利点を請求する。前述の出願の全体の教示は、本明細書に参照によって組み込まれる。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、アプタマー又は核酸リガンドに関する。特に、本発明は、タンパク質結合対、特に（血管新生又は血管形成と関連したタンパク質結合対などの）疾病又は疾患の治療において標的にされるかもしれないタンパク質結合対を標的にするアプタマーの１つ以上のアンタゴニスト特性を増強又は増大するための方法に関する。本発明は、荷電分子を生物学的活性分子へ結合し、生物学的活性分子をイオン泳動によって送達することによる、生物学的活性分子の眼内送達のための方法及び製剤にも関する。
【背景技術】
【０００３】
アプタマー又は核酸リガンドは、古典的なワトソン−クリック塩基対以外の相互作用を通じて、分子、特にタンパク質へ特異的に結合する核酸分子である。ファージディスプレイ又はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）によって生じるペプチドと同様、アプタマーは選択された標的へ特異的に結合でき、それにより、アプタマーの標的の機能する能力を遮断する。特定の標的をターゲットにするための適切なアプタマー配列は、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）と呼ばれるプロセスを使用する無作為配列オリゴヌクレオチドのプールから開始する試験管内選抜プロセスを使用して解明できる。ＳＥＬＥＸは、いずれかの標的に対する適切な結合親和性及び特異性を有する特異的な配列について迅速にオリゴヌクレオチドの莫大な数がスクリーニングされる組み合わせ化学方法論である。このプロセスを使用して、特定の標的に特異的な新規のアプタマー核酸リガンドが作製される。このようなアプタマーは、特定に選択された標的へ結合する特異的な３次元構造を採用する。典型的なアプタマーは１０ｋＤａないし１５ｋＤａの大きさ（３０ヌクレオチドないし４５ヌクレオチド）であり、ナノモルを下回る親和性でその標的を結合し、密接に関連した標的に対して識別する（例、同一遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質を典型的に結合しないであろう。）。一連の構造研究は、抗体／抗原複合体において親和性及び特異性を駆動する結合相互作用（水素結合、静電気的相補性、疎水性接触、立体的排除、等）の同一タイプをアプタマーが使用できることを示してきた。一度、特定の標的へ結合するための適切なアプタマー配列が解明されると、治療用アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスとは無関係に大量に直接化学的に合成されてもよい。
【０００４】
例えば、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）の作用を遮断する拮抗性ＶＥＧＦアプタマー阻害剤が開発されてきた。抗ＶＥＧＦアプタマーは、ヒトＧＶＥＧＦの１６５ｋＤａ分子種へ高い親和性で結合する小さな安定性のあるＲＮＡ様分子である。このようなＶＥＧＦアプタマーは、乾癬、眼の疾患、コラーゲン循環器疾患及び新生物性疾患を含む血管形成を包含する多様な疾病におけるＶＥＧＦリガンドの役割によって広範囲の臨床上の有用性を有する。一般にＳＥＬＥＸプロセス、特にＶＥＧＦアプタマー及び製剤は、例えば米国特許第５，２７０，１６３号、第５，４７５，０９６号、第５，６９６，２４９号、第５，６７０，６３７号、第５，８１１，５３３号、第５，８１７，７８５号、第５，８４９，４７９号、第５，８５９，２２８号、第５，９５８，６９１号、第６，０１１，０２０号、第６，０５１，６９８号、第６，１４７，２０４号、第６，１６８，７７８号、第６，４２６，３３５号、及び第６，６９６，２５２号に記載されており、それらの各々の内容は本明細書に参照によって明確に組み込まれる。
【０００５】
アプタマーの高分子量の非免疫原性及び親油性化合物との複合体が記載されてきた。例えば、米国特許第６，０１１，０２０号は、アプタマーの安定性などの薬物動態学的特性を改善するために（つまり、アプタマーの生体内循環半減期を亢進させるために）、高分子量の非免疫原性及び親油性化合物を有するアプタマー複合体を形成することを開示する。さらに、米国特許第６，０５１，６９８号は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する特異的親和性を有するアプタマーの高分子量の非免疫原性複合体を開示する。多様な生物学的標的へ結合する高親和性のアプタマーの選抜、及びこのようなアプタマーの生体内での安定性を増強する修飾は記載されてきたが、このようなアプタマーのアンタゴニスト特性を増強するための組成物及び方法は、アプタマー技術の実際の治療上の可能性を増大させる上で有用であろう。
【０００６】
眼には解剖学的、生理学的及び生化学的に、眼の組織を外来物質に対して不浸透性にさせるいくつもの防御遮蔽があるため、眼への薬物送達は興味深い。活性因子を眼へ投与するために使用される技術には、全身性経路、眼内注入、眼の周りへの注入、眼内インプラント、及び局所適用が含まれる。このような侵襲性眼内投与は、患者に不快感を与え、時には恐怖感を与え、一方で永久的な組織損傷の危険性があるため、好ましくない。
【０００７】
点眼剤などの処方における局所的に適用される薬物の眼の生物学的利用能は非常に乏しい。眼における薬物の吸収は、眼の適切な機能を確実にするいくつかの保護的なメカニズムによって、及び例えば浸み込ませた溶液の排水、流涙、涙の蒸発、結膜の吸収、角膜の浸透性の乏しさ、涙中のタンパク質による結合、及び代謝などの非保護的吸収／吸着といった他の付随した因子によって著しく制限されている。
【０００８】
送達のための代替的なアプローチには、原位での活性化されたゲルを形成する系、粘液接着製剤、眼内浸透増強剤及び眼内挿入物が含まれる。原位での活性化されたゲルを形成する系は、眼における設置に際して粘性増加を経験する液体担体であり、したがって角膜前保持に適する。粘性におけるこのような変化は、温度、ｐＨ又は電解質組成における変化によって惹起できる。粘液接着性剤は、結膜のムチンへの非共有結合を介して接着するポリマーを含有する担体であり、したがってムチンの代謝回転がポリマーの放出を生じるまで、製剤の角膜前組織との接触を確実にする。眼への浸透増強剤は主として、細胞膜を破壊し投与量依存的方法で細胞溶解を生じることによって上層の細胞の浸透性を増強させるために角膜へ適用される表面活性剤である。眼内挿入物は、結膜嚢に置かれ、比較的低速で薬物を送達するよう企図された固体デバイスである。あるこのようなデバイスは、Ａｌｚａ社製のＯｃｕｓｅｒｔ（Ｒ）であり、共重合体でできた２つの徐放性膜によって封鎖される薬物貯蔵体からなる拡散ユニットである。Ｍ．Ｆ．Ｓａｅｔｔｏｎｅは、眼の送達へ傾注した絶え間ない努力の概説を提供する。（「眼内薬物送達における進展及び問題」、Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｂｒｉｅｆｉｎｇ： Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２００２，１６７−１７１）。
【０００９】
イオン泳動は、イオン性分子を生物学的組織へと導入する局所的な電流を使用する薬物送達プロセスである。イオン泳動は、電気輸送、イオン性薬物投与、イオン療法（ｉｏｎｔｏｔｈｅｒａｐｙ）、及び起電性薬物投与（ＥＭＤＡ）とも呼ばれる。イオン泳動は、組織を通じての生物学的活性分子の「オンデマンド式」送達を提供する。
【００１０】
しかしながら、高分子量ＰＥＧの生物学的活性分子への結合は、生物学的活性分子のイオン泳動送達を妨害する可能性がある。ＰＥＧの分子量のサイズ制約及び複雑性がイオン泳動送達の実用性を制限することがありうる。それゆえ、結合した生物学的活性分子を送達し、永久的な組織損傷及び患者の不快感を生じることなく眼の保護的な遮蔽を回避する、簡便で患者に優しい方法が入手できていないままである。前述の問題に関して、生物学的活性分子のイオン泳動による送達を増強するための方法及び製剤についての必要性がある。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、可溶性高分子量の立体的な基のアプタマーへの付加がアプタマーの本質的なアンタゴニスト特性を増大させるという知見に一部基づいている。特に、本発明は、抗ＶＥＧＦのペグ化した形態が、ペグ化していないアプタマーの形態を上回るＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）のアンタゴニスト活性を拡大したという知見に関する。さらに、特定の理論又は作用のメカニズムに対して本発明を制限せずに、アプタマーの立体的な増強から生じる拡大したアンタゴニスト活性の原理は、タンパク質間の相互作用（リガンド及びその受容体などの結合パートナーとのあるタンパク質の相互作用を遮断する作用）の混乱に影響するアプタマーへ一般的に適用可能である。
【００１２】
したがってある態様において、本発明は、可溶性高分子量の立体的な基がアプタマーの少なくとも１つのアンタゴニスト特性を増大させる、アプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ、アプタマーに沿ったいずれかの位置で結合することによってリガンド又はその受容体へ指向するアプタマーのアンタゴニスト特性を増大させる方法を提供する。
【００１３】
より広い態様において、立体的に増強したアプタマーは、第二タンパク質と相互作用するタンパク質を標的にし、可溶性高分子量の立体的な基へのアプタマー配列の結合は結果的に、タンパク質の第二タンパク質（つまり、標的タンパク質の結合パートナー）との相互作用を妨害するアプタマーの能力における増大を生じる。立体的に増強されるアプタマーはそれゆえ、標的タンパク質へ指向するアプタマーのアンタゴニスト特性を増大させる。
【００１４】
別の態様において、リガンドが複数の受容体へ結合し、リガンド結合アプタマーが複数の受容体の少なくとも１つのリガンド依存性活性化を効果的に拮抗することに失敗する、リガンド結合アプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させる方法を提供する。この態様において、本発明の方法は、アプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合するために提供し、それにより、可溶性高分子量の立体的な基へ結合する場合、アプタマーはアプタマー核酸配列が単独では効果的には拮抗しない１つ以上の受容体のリガンド依存性活性化を効果的に拮抗する。
【００１５】
関連した態様において、本発明は、受容体が複数のリガンドへ結合し、受容体結合アプタマーが複数のリガンドの少なくとも１つのリガンド依存性活性化を効果的に拮抗するのに失敗する場合の受容体結合アプタマーのリガンドアンタゴニスト範囲を増大させる方法を提供する。この態様において、本発明の方法は、アプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合するために提供し、それにより、可溶性高分子量の立体的な基へ結合する場合、アプタマーは、アプタマー単独によってさもなくば効果的には拮抗しない１つ以上のリガンドのリガンド依存性活性化を効果的に拮抗する。
【００１６】
ある実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はデキストランである。 他の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリエチレングリコールである。さらに他の特に有用な実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基は、多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（Ｒ）などの）高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド、又はポリエーテルであってもよい。特定の実施態様において、ポリエステル基は、共ブロック重合体のポリエステル基であってもよい。他の実施態様において、アルギン酸基は、ナトリウム又はカルシウムなどの陽イオン性対イオンを有する塩として提供される陰イオン性アルギン酸基であってもよい。さらなる実施態様において、ポリアルデヒド基は、合成的に派生されるか又はオリゴ糖の酸化によって得られるかのいずれかであってもよい。特に有用な実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基は、約２０ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である。
【００１７】
本発明の前述の態様の特に有用な実施態様において、アプタマーはＶＥＧＦ−Ａへ指向される。他の特定の実施態様において、アプタマーはＦｌｋ／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、又はＦｌｔ−４（ＶＥＧＦＲ−３）などのＶＥＧＦ受容体へ指向される。さらなる実施態様において、アプタマーは、ニューロピリン（例、ニューロピリン−１又はニューロピリン−２）などのＶＥＧＦ共受容体へ指向される。さらに他の実施態様において、アプタマーによって標的にされるＶＥＧＦ共受容体は、Ｖ３インテグリン又はＶＥ−カドヘリンである。
【００１８】
さらなる実施態様において、アプタマーはいずれかの公知のリガンド又はその受容体へ指向される。本発明のさらに有用な実施態様において、アプタマーはＩＣＡＭ−１又はそれの結合するＬＦＡ−１などの接着分子へ指向される。本発明の立体的に増強されるアプタマー抱合体による標的化のためのリガンド及び／又はそれらの受容体の例には、それらに制限を加えるものではないが、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、及びＦＧＦが含まれる。標的化のためのさらなるリガンド及び／又はそれらの受容体には、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、又はＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどの他の造血因子、トロンボポエチン、幹細胞因子、及びエリスロポエチン、肝細胞成長因子／ＮＫ１又はアンジオポエチンＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙなどの血管新生を調節する因子、及び又はヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。本発明の組成物で標的化するための特定の他の因子には、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質−１などのＢＭＰ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ及びＩＢなどの骨形態形成タンパク質受容体、神経栄養因子、走化性因子、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０などのＣＤタンパク質、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γなどのインターフェロン、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１ないしＩＬ−１０などのＩＬ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊加速因子、例えばエイズ外被の一部などのウィルス抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭなどのインテグリン、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原、及び前述のポリペプチドのいずれかの断片、組み合わせ及び／又は変異体が含まれる。
【００１９】
本発明にはさらに、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎほかによって提供されるアプタマーデータベースに集積されるものなどの例えばリガンド又はその受容体を標的にする公知のアプタマー核酸配列のいずれかを含む組成物が含まれる（Ｌｅｅ ＪＦ，Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ ＪＲ，Ｍｅｙｅｒｓ ＬＡ，Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ「アプタマーデータベース」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，１月１日号；３２（データベース号）： Ｄ９５−Ｄ１００）。
【００２０】
本発明のある有用な実施態様において、高分子量の立体的な基は、アプタマー配列の５’末端で、又はアプタマー配列の３’末端で、又は５’末端以外の又は３’末端以外の位置でアプタマーへ結合されてもよい。高分子量の立体的な基へ結合するための適切な内部アプタマー配列位置（つまり、５’末端以外又は３’末端以外の位置）の例には、アプタマー核酸配列の１つ以上の塩基上の環外アミノ基、１つ以上のピリミジンヌクレオチドの５の位置、１つ以上のプリンヌクレオチドの８の位置、リン酸塩の１つ以上のヒドロキシル基、１つ以上のリボース基の１つ以上のヒドロキシル基が含まれる。
【００２１】
別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦアプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させる方法を提供する。この態様において、最初のＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦへ結合するが、少なくとも１つのＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ依存性活性化を効果的に拮抗するのに失敗する核酸配列である。本発明のこの態様によって、ＶＥＧＦアプタマーは可溶性高分子量の立体的な基へ結合し、それにより結果として生じるＶＥＧＦアプタマー抱合体はＶＥＧＦアプタマーが効果的に拮抗するのに最初に失敗する少なくとも１つのＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ依存性活性化を効果的に拮抗し、それによりＶＥＧＦアプタマーの受容体アンタゴニスト範囲は増大する。
【００２２】
関連した態様において、本発明は、ＶＥＧＦアプタマーのリガンドアンタゴニスト範囲を増大させる方法を提供する。この態様において、最初のＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦへ結合するが、少なくとも１つのＶＥＧＦリガンドによってＶＥＧＦ依存性活性化を効果的に拮抗するのに失敗する核酸配列である。本発明のこの態様によって、ＶＥＧＦＲアプタマーは可溶性高分子量の立体的な基へ結合し、それにより結果として生じるＶＥＧＦＲアプタマー抱合体はＶＥＧＦＲアプタマーが拮抗するのに最初に失敗する少なくとも１つのＶＥＧＦリガンドによってＶＥＧＦＲ依存性活性化を効果的に拮抗し、それによりＶＥＧＦＲアプタマーのリガンドアンタゴニスト範囲は増大する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、対応する結合していないアプタマーよりも標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有するアプタマー抱合体を同定する方法を提供する。本発明のこの態様において、標的は、リガンド又はリガンドの受容体であってもよい。方法には一般に、アプタマーの５’末端で、３’末端で、又は必要に応じて１つ以上の非５’末端位置又は１つ以上の非３’末端位置で可溶性高分子量の立体的な基へ独立して結合される複数のアプタマー抱合体を提供する段階が含まれる。次に、これらの異別に結合されるアプタマーの各々をリガンド及びリガンドの受容体と接触させ、各アプタマー抱合体の存在におけるリガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量を、アプタマー抱合体のない場合におけるリガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量と比較する。次に、リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化を阻害する最大の能力を有する特定のアプタマー抱合体を選抜する。それにより、方法は、リガンド／受容体標的に及ぼすアンタゴニスト効果の増強したアプタマー抱合体を同定する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、リガンド又は受容体上の結合部位から離れた部位の活性を阻害する方法を提供する。この態様において、本発明は、アプタマーの結合部位から離れた部位の活性を阻害する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、可溶性高分子量の立体的な基をアプタマーへ結合することによってリガンド上のアプタマーの結合部位に対して遠位のリガンド上の部位の活性を阻害する方法を提供する。アプタマーは、リガンドの活性部位近くの領域にあるリガンドへ結合してもよい。アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、隣接する活性部位を越えてアプタマーの到達が伸展し、それによりリガンドの活性を遮断する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、リガンド又は受容体上の結合部位から離れた部位のリガンド又は受容体の結合を阻害する方法を提供する。この態様において、本発明は、アプタマーの結合部位から離れた部位の結合を阻害する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、可溶性高分子量の立体的な基をアプタマーへ結合することによってリガンド上のアプタマーの結合部位に対して遠位のリガンド上の部位への標的タンパク質の結合を阻害する方法を提供する。アプタマーは、リガンドの受容体結合部位近くの領域にあるリガンドへ結合してもよい。アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、隣接する受容体結合部位を越えてアプタマーの到達が伸展し、それにより受容体へ結合するリガンドの能力を遮断する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、標的タンパク質が、生理学的ｐＨで全体的な正の電荷によって特徴付けられる塩基性ドメインと同様、生理学的ｐＨで全体的な負の電荷によって特徴付けられる酸性ドメインを有する場合の、結合パートナーへの標的タンパク質の結合を阻害する方法を提供する。本発明のこの態様において、結合パートナーは標的タンパク質の酸性ドメインを通じて結合し、結合パートナーへの標的タンパク質の結合は、標的タンパク質の酸性ドメインへの結合パートナーの結合を立体的に妨げる可溶性高分子量の立体的な基及び標的タンパク質の塩基性ドメインへ結合するアプタマー核酸配列を含む立体的に増強されたアプタマー抱合体と標的タンパク質を接触させることによって阻害される。
【００２７】
本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の大きさ及び中性電荷がペグ化された生物学的活性分子のイオン泳動送達を有意に制限するという発見に一部基づいてもいる。出願者は、中性ＰＥＧを荷電分子と置換することがイオン泳動送達を増強することも発見した。本発明は、荷電分子を生物学的活性分子へ結合することによって、生物学的活性分子のイオン泳動を増強する方法に関する。
【００２８】
したがって、別の態様において、本発明は、ａ）生物学的活性分子荷電抱合体を形成するよう生物学的活性分子へ荷電分子を結合する段階と、ｂ）生物アッセイのある分子荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、生物学的活性分子を眼へ送達する方法に関する。
【００２９】
ある実施態様において、荷電分子は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）又はキトサンなどの高電荷密度ポリマーを含み、生物学的活性分子はアプタマーなどの核酸である。
【００３０】
別の態様において、本発明は、生物学的活性分子を眼へイオン泳動で送達するのに有用な製剤に関する。製剤は、荷電分子へ結合した生物学的活性分子を含む。ある実施態様において、製剤は、ＣＭＣ、ＣＭＤ又はキトサンなどの高電荷密度ポリマーへ結合したアプタマーなどの核酸を含む。
【００３１】
本発明のイオン泳動送達方法及び製剤は、いくつもの利点を有する。ＣＭＣ又はキトサンなどの高度に荷電したポリマーは、生物学的活性分子の滞在時間延長剤及びイオン泳動促進剤の両者として作用する。それゆえ、荷電分子はそれらのＰＥＧ対応物の循環時間の延長を保存しながら、イオン泳動送達を促進する。ＣＭＣ及びキトサンなどの荷電分子は、多様な分子量において入手可能であり、結合化学特性の確立された広く受容される生体適合性分子である（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｍｅｔａｌｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ，Ｍ．Ｓｚｙｃｈｅｒ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，１９８３を参照してほしく、本明細書によってその全体が参照によって組み込まれる。）。本発明のイオン泳動送達方法及び組成物は、患者の快適性を考慮し、永久的な組織損傷を回避しながら、非侵襲的な眼の治療を提供する。
【００３２】
（本発明の詳細な記述）
本明細書に記載の特許及び科学的文献は、当業者にとって入手可能な知識を確立する。本明細書で引用されるすべての発行された特許、特許出願、刊行された外国出願、及びＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む刊行された参考資料は、それらの全体が参照によって組み込まれるよう各々が特異的に及び個々に示された場合と同程度まで参照によって組み込まれる。
【００３３】
一般
本発明は、アンタゴニスト活性を増大させたアプタマー及び、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する標的タンパク質を結合する部位特異的アプタマーのアンタゴニスト活性の範囲を増大させるための方法を提供する。本発明は、ＳＥＬＥＸ方法論の本来の制限、及び一般には、塩基性領域がタンパク質機能に決定的であるかどうかに関わらず、核酸アプタマーのホスホジエステル主鎖によって運搬される高い負の電荷が結果的に、標的となったタンパク質の正に荷電した領域（つまり、塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン及びヒスチジンにおいて豊富である標的タンパク質の領域）へ結合するアプタマー配列の優先的選抜を生じるアプタマーデザインを指向する（例、Ｐａｂｏｒｓｋｙほか（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８： ２０８０８−２０８１１を参照）。
【００３４】
アプタマーは、高い特異性及び親和性、生物学的有効性、及び優れた薬物動態学的特性を含む治療剤として使用するための望ましい特徴の多くを有する。さらに、アプタマーはしばしば、抗体及び他のタンパク質生物製剤にわたって特異的な競合性のある利点を提供する。これらには例えば次のものが含まれる。すなわち、
（１）速度及び調節： アプタマーは完全な試験管内プロセスにおいて作製される。試験管内選抜によって、アプタマーの特異性及び親和性は厳密に調節でき、毒性標的及び非免疫原性標的の両者に対するリードをなすことができる。
【００３５】
（２）毒性及び免疫原性： １クラスとしてのアプタマーはほとんど又は全く毒性も免疫原性も示さない。アプタマーの高レベルのラット又はマーモットの慢性的な投与（１日につき１０ｍｇ／ｋｇを９０日間）において、臨床的、細胞上の、又は生化学的測定のいずれによっても毒性は観察されない。多くのモノクローナル抗体の有効性が抗体自体に対する免疫反応によって重度に制限されるのに対し、アプタマーに対して抗体を誘発することは極めて困難である（最もありそうな理由は、アプタマーがＩ ＭＨＣを介してＴ細胞によって呈示できず、免疫反応は一般に核酸断片を認識しないよう訓練されているからである。）。
【００３６】
（３）投与： すべての現在認可されている抗体治療剤が静脈内注入によって（典型的には２時間ないし４時間かけて）投与されるのに対し、アプタマーは皮下注射によって投与できる。この差異は比較的低い可溶性に主としてよるものであり、したがってたいていの治療用ＭＡｂに多量の容積が必要であることによるものである。可溶性が良好であること（１５０ｍｇ／ｍｌ超）及び比較的低分子量（アプタマー：１０ｋＤａないし５０ｋＤａ； 抗体：１５０ｋＤａ）であることから、アプタマーの週ごとの投与量は、０．５ｍｌ未満の容積における注入によって送達される。皮下投与を介するアプタマーの生物学的利用能は、サルの研究において８０％超である（Ｔｕｃｋｅｒほか（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．７３２： ２０３−２１２）。
【００３７】
（４）拡張性及び経費： アプタマーは化学的に合成され、結果的に製造需要に見合うのに必要なだけ迅速に拡張できる。製造を拡張する上での困難はいくつかの生物製剤の有効性を現に制限しており（例、イブレル（Ｅｂｒｅｌ）、レミケード）、大規模タンパク質製造プラントの資本経費は膨大である（例、１，０００，０００ドル、Ｉｍｍｕｎｅｘ社）であるのに対し、単一の大規模合成装置は１年当たり１００ｋｇ以上のオリゴヌクレオチドを製造でき、要する初期投資は比較的大きくない（例、２０，０００ドル未満、Ａｖｅｃｉａ社）。キログラム規模でのアプタマー合成のための商品の最新の経費は、５００ドル／ｇと概算され、非常に最適化された抗体に対する経費に匹敵する。プロセス開発におけるたゆまぬ改善は、５年で１ｇ当たり１００ドル未満まで商品の経費を低下させると期待される。
【００３８】
（５）安定性： アプタマーは化学的に強い。アプタマーは、熱、変性剤等への暴露後の活性を回復するのに本質的に適しており、凍結乾燥した粉末として室温で長期間（１年超）保存できる。対照的に、抗体は冷蔵保存しなければならない。
【００３９】
定義
本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、以下に別段の定義がなければ、当業者によって共通して理解されるのと同一の意味を有するよう企図され、本明細書で採用される技術に対する参照は、本分野で共通して理解される技術を指すよう企図され、それには、技術又は当業者に明白であろう等価の若しくは後に開発された技術の置換に関する多様性が含まれる。本発明である対象事項をより明確かつ簡潔に記載するため、以下の定義が本明細書及び付加される請求項において使用される特定の用語について提供される。
【００４０】
本明細書で「約」という語は、大まかに又はおおよその領域にあるほぼを意味するよう示される。「約」という後が数字の範囲とともに使用される場合、示される数値を上回り及び下回る境界を拡大することによってその範囲を修正する。一般に、「約」という語は、２０％の分散によって記載される値を上回り及び下回って数値を修正するよう使用される。
【００４１】
「アルギン酸塩」という語は、褐色藻類（褐色の海草、例、カリフォルニアジャイアントケルプ（マクロシスティスプリフェラ））において生じる親水性の多糖類を指し、α１−４−結合したα−Ｌ−グロピラノシルロン酸残基の配列、β−４−結合したβ−Ｄ−マンオピラノシルロン酸残基の配列、及び両ウロン酸が交互になっている配列において生じる配列の断続性構造を有する。
【００４２】
「陰イオン」という語は、負の電荷を有する原子又は分子を指す。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「アンタゴニスト」という語は、アプタマーへ適用される場合、標的タンパク質の結合パートナーとの相互作用を混乱させる能力を指し、標的タンパク質の結合パートナーとの相互作用は、標的タンパク質の生物学的機能に関与する。したがって、アプタマーアゴニストは標的タンパク質の生物学的機能を阻害するよう典型的に機能するであろう。しかしながら、例えば標的タンパク質が阻害因子タンパク質結合パートナーと相互作用する場合、アプタマーアンタゴニストは標的タンパク質のその阻害剤との相互作用を混乱させるかもしれず、それにより阻害因子タンパク質によってさもなくば阻害される標的タンパク質の生物学的機能の活性化に影響を及ぼすかもしれない。それゆえ、本発明のアプタマーアンタゴニストは、標的タンパク質の生物学的機能を典型的に阻害するであろう一方で、アプタマーアンタゴニストは標的の生物学的機能を活性化するよう機能するかもしれない。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「拮抗範囲」という語は、生物学的活性分子の拮抗作用を増大又は付加することを指す。例えば、アンタゴニストがすでに拮抗できたであろう補充性の１つ以上のさらなるリガンド／受容体相互作用をアンタゴニストが拮抗できる場合、アンタゴニストの「拮抗範囲」は増大する。拮抗範囲は、立体的な抱合体の付加によって増大するかもしれない。ある実施態様において、範囲は結合した部分の直鎖状の及び／又はすい力学的体積によって決定される。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「アプタマー」という語は、非共有結合性の物理的相互作用を介して（タンパク質などの）非ポリヌクレオチド分子に対する選択的な結合親和性を有するいずれかのポリヌクレオチド又はその塩を意味する。アプタマーは、抗体のそのエピトープに対する結合に類似した方法でリガンドへ結合するポリヌクレオチドである。標的分子は興味の対象のいずれかの分子でありうる。非ポリヌクレオチド分子の例はタンパク質である。アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインへ結合するのに使用でき、それにより自然発生するリガンドのタンパク質との相互作用を防止する。本発明のアプタマーは、アプタマーを適切な高分子量の立体的な基へ結合することによって、本明細書に記載されるように必要に応じて修飾される。
【００４６】
「生物学的活性分子」、「生物学的活性部分」又は「生物学的活性因子」は、以下に制限を加えるものではないが、ウィルス、バクテリア、菌、植物、動物、及びヒトを含む生物学的生物体のいずれかの物理的特性又は生化学的特性に影響を及ぼしうるいずれかの物質でありうる。生物学的活性分子には、ヒト又は他の動物における疾病の診断、治療緩和、治療、又は予防のために、又はさもなくばヒト又は動物の身体的又は精神的健康を増強するよう企図されるいずれかの物質を含むことができる。生物学的活性分子の例には、以下に制限されるものではないが、核酸、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、抗体、ペプチド、タンパク質、酵素及びポルフィリン、小分子薬物が含まれる。他の生物学的活性分子には、以下に制限されるものではないが、染色剤、脂質、細胞、ウィルス、リポソーム、微粒子及びミセルが含まれる。抗体の例には、以下に制限されるものではないが、ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（Ｒ））及びラニズマブ（ｒａｎｉｚｕｍａｂ）（ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）（Ｒ））が含まれる。アプタマーの例には、以下に制限されるものではないが、ペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）（マクゲン（Ｍａｃｕｇｅｎ）（Ｒ））が含まれる。ポルフィリンの例には、以下に制限されるものではないが、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）（ビスジン（Ｖｉｓｕｄｉｎｅ）（Ｒ））が含まれる。ステロイドの例には、以下に制限されるものではないが、アネコルタブ（ａｎｅｃｏｒｔａｖｅ）（レターネ（Ｒｅｔａａｎｅ）（Ｒ））が含まれる。本発明とともに使用するのに適した生物学的活性分子のクラスには、以下に制限されるものではないが、抗生物質、殺菌剤、抗ウィルス剤、抗感染剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、抗チューブリン剤、心臓循環器系剤、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、及びそれらの類似物が含まれる。
【００４７】
「陽イオン」という語は、正の電荷を有する原子又は分子を指す。
【００４８】
本明細書で使用される「荷電分子」又は「荷電部分」という語は、形式電荷を有するいずれかの部分又は分子を指す。荷電分子は、その本質的な構造の性質によって、又は別の原子とのその共有結合の結果として、永久的に荷電されてもよい。荷電分子は、例えば薬物送達中に存在する環境などの周囲の環境の存在するｐＨ条件の性質による形式電荷を有してもよい。分子における電荷は、正（陽イオン性）又は負（陰イオン性）のいずれかであってもよい。荷電分子は、正の電荷又は負の電荷のみを含むことができる。荷電分子は、正の電荷及び負の電荷の両者の組み合わせも含むことができる。特定の実施態様において、荷電分子は正味の陰イオン性電荷を有する。正の電荷を荷電分子へ付与する化学基には、いかに制限されるものではないが、アミノ含有化合物などのイオン化可能な窒素原子が含まれる。負の電荷を荷電分子へ付与する化学基には、以下に制限されるものではないが、カルボン酸基、硫酸基、スルホン酸基又はリン酸基が含まれる。
【００４９】
荷電分子又は生物学的活性分子荷電抱合体は、必要に応じて１つ以上の「対イオン」によって付随される。荷電分子又は生物学的活性分子荷電抱合体に付随する対イオンは、荷電分子の一部であると考慮されてもよい。荷電した両分子及び結果として生じる生物学的活性分子荷電抱合体についての対イオンは、医薬的に許容可能な塩を生じてもよい。適切な陰イオン性対イオンには、以下に限定されるものではないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、コハク酸塩、及びそれらの類似物が含まれる。適切な陽イオン性対イオンには、以下に限定されるものではないが、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、ＮＨ４＋及び有機アミン陽イオンが含まれる。有機アミン陽イオンには、以下に限定されるものではないが、テトラアルキルアンモニウム陽イオン及び水素イオンとともに四級アンモニウム陽イオンを形成する有機アミンが含まれる。四級アンモニウム陽イオンを形成できる有機アミンの例には、以下に制限されるものではないが、一有機アミン及び二有機アミン、モノアミノ酸及びジアミノ酸、並びにモノアミノ酸エステル及びジアミノ酸エステル、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、２−（４−イミダゾリル）エチルアミン、グルコサミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ピペラジン、ピペリジン、トロメタミン、６’−メトキシ−シンコナン（ｃｉｎｃｈｏｎａｎ）−９−オール、シンコナン（ｃｉｎｃｈｏｎａｎ）−９−オール、ピラゾール、ピリジン、テトラサイクリン、イミダゾール、アデノシン、べラパミル及びモルフォリンが含まれる。
【００５０】
「共重合体」という語は、モノマーの２種類以上から生成されるポリマーを指す。
【００５１】
「共有結合」という語は、２つの原子が電子一対を共有する場合に生じる原子の結合を指す。
【００５２】
「電流」という語は、荷電した粒子の移動による電気のコンダクタンスを指す。「電流」及び「電気流」という語は、包括的であって排他的ではないよう企図される。ある実施態様において、電流は「直流電流」、「直流」又は「定常電流」である。別の実施態様において、電流は「交流」「交互になる電気流」「直流相殺を有する交流」「直流相殺を有する交流」「パルス化した交流」又は「パルス化した直流」である。
【００５３】
「デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）」という語は、デンドリマー構造の半分を表す分子を指す。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、デンドリマー中心の半分の上に、又はデンドリマーの構築後のデンドリマー中心の開裂によって典型的に構築される。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、単量体及び表面修飾のいずれかの組み合わせから構成されてもよい。有用な単量体の例には、以下に制限されるものではないが、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）が含まれる。有用な表面修飾の例には、以下に制限されるものではないが、陽イオン性アンモニウム修飾、Ｎ−アシル修飾及びＮ−カルボキシメチル修飾が含まれる。代替的な表面修飾によって、広く異別の特性が可能になる。例えば、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、多価陰イオン性、多価陽イオン性、疎水性又は親水性であってもよい。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、単量体の精確な数及び表面修飾基がデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）の発生によって決定されるよう合目的であってもよい（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、及びＧ６はそれぞれ４、８、１６、３２、６４、及び１２８の基を有する）。１：１の化学量論でのデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）−生物学的活性分子の抱合体の構築はシスタミン中心を含有するデンドリマーにおけるジスルフィドの還元によって達成されてもよい。この還元は、単一のチオール反応基を含有するよう修飾されたいずれかの生物学的活性分子へ結合されてもよい単一の直交するスルフィドリル機能性の形成を生じる。このことは、アミン含有の生物学的活性分子を、ある末端にあるアミン反応基及びその他の末端にあるチオール反応基を含有する二機能性リンカーと反応させることによって達成されてもよい。ジスルフィドを含有する樹状ポリマー及び樹状ポリマー抱合体の例は、米国特許第６，０２０，４５７号に見られ、それはその全体において本明細書に参照によって組み込まれる。
【００５４】
「イオン泳動」という語は、組織などの遮蔽へまたは遮蔽を通じてのイオン化可能な分子又は荷電分子の電流による輸送を指す。例えば、アース電極を身体のほかのどこかに設置して電流回路を完了しながら薬物と同一の電荷を運搬する電極を使用して薬物を組織へ適用することによるイオン泳動によって身体にある組織へと運搬されてもよい。イオン泳動電流は、組織内のイオンが適用される電位の結果として輸送される場合、組織内で確立される。荷電した化合物は、反対の極性の電極へ結合され、同様の極性の電極によってパルス化される。結果として、この方法による化合物輸送は、化合物の適用される電位及び電気泳動による移動度に直接関連する。イオン泳動は、イオン泳動送達、電気輸送、イオン水動態（ｉｏｎｔｏｈｙｄｒｏｋｉｎｅｓｉｓ）、イオン性薬物投与、イオン療法（ｉｏｎｔｏｔｈｅｒａｐｙ）、及び起電性薬物投与（ＥＭＤＡ）とも呼ばれてもよい。
【００５５】
「伸長」という語は、組成物（例、高分子量ポリマー組成物）が引っ張ることによって引き伸ばされる場合に達成される長さを指す。伸長は、元の長さによって除された引き伸ばしの後の長さとして典型的に表される。
【００５６】
「ゲル」という語は、溶媒の多量を吸収した架橋したポリマーを指す。架橋したポリマーは、それらが溶媒を吸収する場合、相当典型的に膨潤する。
【００５７】
「グリコサミノグリカン」という語は、アミノ単糖類残基（例、アミノヘキソースから派生した多様な多糖類のいずれか）の実質的な割合を含有するいずれかのグリカン（つまり、多糖類）を指す。
【００５８】
「水力学的体積」とは、ポリマーコイルが溶液中にある場合にポリマーコイルが占有する体積を指す。ポリマーの「水力学的体積」は、ポリマーの分子量及びポリマーが溶媒といかに十分に相互作用するかによって変動しうる。例えば、ＰＥＧのいずれの酸化エチレン繰り返し単位も、２ないし３の水分子を結合することが公知である。水力学的体積は分子半径の単位において測定されてもよい。
【００５９】
「水素結合」という語は、電気陰性原子へ結合した水素原子と、通常別の文市場にある電気陰性原子との非常に強力な引力を指す。例えば、１個の水分子上の水素原子は、別の水分子上の酸素原子へ非常に強くひきつけられる。
【００６０】
「イオン」という語は、正又は負の電荷を有する原子又は分子を指す。
【００６１】
本明細書において使用される「イオン泳動デバイス」という語は、生物学的活性分子の対象へのイオン泳動送達に適したデバイス又は装置を指す。このようなイオン泳動デバイスは本分野で周知であり、「イオン泳動デバイス」又は「電気輸送デバイス」とも呼ばれる。
【００６２】
本明細書で使用される「非ペプチドポリマー」という語は、アミノ酸残基の実質的に存在しないオリゴマーを指す。
【００６３】
本明細書で使用される「非核酸ポリマー」という語は、ヌクレオチド残基の実質的に存在しないオリゴマーを指す。
【００６４】
「眼の送達」及び「眼内送達」は、生物学的活性分子などの化合物の眼の組織又は流体への送達を指す。「眼のイオン泳動」は、眼の組織又は流体へのイオン泳動送達を指す。いずれの眼の組織又は流体もイオン泳動を使用して治療できる。眼の組織及び流体には、例えば硝子体、結膜、角膜、強膜、虹彩、水晶体、毛様体、脈絡膜、網膜及び視覚神経などの眼の周りにあるものが含まれる。
【００６５】
「加水分解的に安定な」又は「加水分解できない」結合又は連結という語は、水中で実質的に安定であり、水と実質的には反応しない結合又は連結を指すよう、本明細書で使用される。例えば、加水分解的に安定な連結は、延長した期間、生理学的条件の下で反応しない。
【００６６】
「生理学的に安定な」結合又は連結という語は、生体内開裂又は加水分解に対して実質液に安定であるが、他の試験管内因子の存在においても安定であるかもしれない結合又は連結を指すよう本明細書で使用される。生理学的に安定した結合又は連結は加水分解的に安定であり、患者の細胞、器官、皮膚、膜又は身体内のほかのどこかにおける生理学的プロセスに対して安定である。
【００６７】
「生理学的に開裂可能な」結合は、生体内で開裂又は加水分解されるが、試験管内の他のものによっても開裂されるかもしれない結合である。生理学的開裂は化学的又は酵素的であってもよい。生理学的開裂は、患者の細胞、器官、皮膚、膜又は身体内のほかのどこかにおける生理学的プロセスによって生じてもよい。
【００６８】
「エステラーゼ耐性」又は「エステラーゼに対して安定な」結合又は連結は、エステラーゼの存在において安定である。
【００６９】
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という語は、適切な条件（例、pＨ、温度、溶媒、イオン強度、電場強度）下で相補的な又は実質的に相補的な配列の自然発生する核酸に対する選択的な結合親和性を有する共有結合されたヌクレオシド又は修飾されたヌクレオシドの配列を含むいずれかの分子を包含するよう意図される。ポリヌクレオチドには、修飾されたヌクレオシド又はヌクレオシド間結合を有する核酸アナログと同様に自然発生する核酸、及び結合または検出を容易にするリンカーまたは検出可能な標識で修飾された分子が含まれる。
【００７０】
本明細書で使用されるように、「ヌクレオシド」という語は、自然発生するリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド、すなわちアデノシン、シトシン、グアノシン、チモシン又はウラシルのいずれかを意味する。
【００７１】
「修飾されたヌクレオチド」又は「修飾されたヌクレオシド」又は「修飾された塩基」という語は、リボ核酸（つまり、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵ）及びデオキシリボ核酸（つまり、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）において生じる標準的な塩基、糖及び／又はリン酸主鎖化学構造のバリエーションを指す。例えば、Ｇｍは２’−メトキシグアニル酸を表し、Ａｍは２’−メトキシアデニル酸を表し、Ｃｆは２’−フルオロシチジル酸を表し、Ｕｆは２’−フルオロウリジル酸を表し、Ａｒはリボアデニル酸を表す。アプタマーには、シトシン又は、５−メチルシトシン、４−アセチルシトシン、３−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、２−チオシトシン、５−ハロシトシン（例、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、及び５−ヨードシトシン）、５−プロピニルシトシン、６−アゾシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、Ｎ４−エタノシトシン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、カルバゾールシチジン又はピリドインドールシチジンを含む、いずれかのシトシン関連塩基が含まれる。アプタマーにはさらに、グアニン、又は６−メチルグアニン、１−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、６−プロピルグアニン、８−ハログアニン（例、８−フルオログアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、及び８−ヨードグアニン）、８−アミノグアニン、８−スルフヒドリルグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、７−メチルグアニン、８−アザグアニン、７−デアザグアニン又は３−デアザグアニンを含むいずれかのグアニン関連塩基が含まれる。アプタマーにはさらに、アデニン又は、６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、８−ハロアデニン（例、８−フルオロアデニン、８−ブロモアデニン、８−クロロアデニン、及び８−ヨードアデニン）、８−アミノアデニン、８−スルフヒドリルアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、７−メチルアデニン、２−ハロアデニン（例、２−フルオロアデニン、２−ブロモアデニン、２−クロロアデニン、及び２−ヨードアデニン）、２−アミノアデニン、８−アザアデニン、７−デアザアデニン又は３−デアザアデニンを含むいずれかのアデニン関連塩基が含まれる。又含まれるのはウラシル又は、５−ハロウラシル（例、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、１−メチル偽ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、偽ウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アゾウラシル、又は４−チオウラシルを含むいずれかのウラシル関連塩基である。本分野で公知の他の修飾された塩基変異体の例には、以下の制限されるものではないが、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ第１．８２２章１ページに列挙されるものが含まれ、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’−メトキシシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチル偽ウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチル偽ウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルクエノシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）、ｗｙブトキオシン、ｐｓｅｕｄｏウリジン、クエノシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ｗｙブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジンが含まれる。ヌクレオチドには、米国特許第３，６８７，８０８号、第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、及び第５，６８１，９４１号に記載の修飾された核酸塩基のいずれかも含まれる。本分野で公知の修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド糖主鎖変異体の例には、以下に制限されるものではないが、例えば、Ｆ、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ２ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、Ｏ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ２−１０アルケニル）、Ｏ（Ｃ２−１０アルキニル）、Ｓ（Ｃ１−１０アルキニル）、Ｓ（Ｃ２−１０アルケニル）、Ｓ（Ｃ２−１０アルキニル）、ＮＨ（Ｃ１−１０アルキル）、ＮＨ（Ｃ２−１０アルケニル）、ＮＨ（Ｃ２−１０アルキニル）、及びＯ−アルキル−Ｏ−アルキルなどの２’リボシル置換体を有するものが含まれる。望ましい２’リボシル置換体には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−置換体は、アラビノ（上）位置又はリボ（下）位置にあってもよい。
【００７２】
本明細書に示されるように、「５’−５’逆転したヌクレオチドキャップ」という語は、以下に示される第一ヌクレオチドの５’位置とオリゴヌクレオチドの５’末端との間のホスホジエステル結合を介したオリゴヌクレオチドの５’末端へ共有結合される第一ヌクレオチドを意味する。
【００７３】
【化１】
【００７４】
「３’−３’逆転したヌクレオチドキャップ」という語は、以下に示される第一ヌクレオチドの３’位置とオリゴヌクレオチドの３’末端との間のホスホジエステル結合を介したオリゴヌクレオチドの３’末端へ共有結合される最後のヌクレオチドを意味する。
【００７５】
【化２】
【００７６】
アプタマー組成物には、以下に制限されるものではないが、５’−５’逆転したヌクレオチドキャップ構造を有するもの、３’−３’逆転したヌクレオチドキャップ構造を有するもの、及びアプタマー末端で５’−５’逆転したヌクレオチドキャップ構造及び３’−３’逆転したヌクレオチドキャップ構造の両者を有するものが含まれてもよい。
【００７７】
「抗ＶＥＧＦアプタマー」は、ＶＥＧＦへ結合し、ＶＥＧＦの活性を阻害するポリヌクレオチドアプタマーを包含するよう意図される。このような抗ＶＤＧＦアプタマーは、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー又は混合した（つまり、ＲＮＡ及びＤＮＡの両者の）組成物を有するアプタマーであってもよい。このようなアプタマーは公知の方法を使用して同定できる。例えば、試験管内進化法又はＳＥＬＥＸ法は、全体において参考文献により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４７５，０９６号及び第５，２７０，１６３号に記載されるように使用できる。抗ＶＥＧＦアプタマーには、米国特許第６，１６８，７７８号、第６，０５１，６９８号、第５，８５９，２２８号、及び第６，４２６，３３５号に記載される配列が含まれ、それらの特許の各々は、その全体において本明細書に参照によって組み込まれる。配列は、５’−５’逆転したキャップ及び／又は３’−３’逆転したキャップを含むよう修飾できる（その全体において本明細書に参照によって組み込まれるＡｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．ほか、刊行された出願第ＷＯ２００５／０１４８１４号を参照。）。
【００７８】
本発明の適切な抗ＶＥＧＦアプタマーには、ヌクレオチド配列ＧＡＡＧＡＡＵＵＧＧ（配列番号４）、又はヌクレオチド配列ＵＵＧＧＡＣＧＣ（配列番号５）、又はヌクレオチド配列ＧＵＧＡＡＵＧＣ（配列番号６）が含まれる。
【００７９】
抗ＶＥＧＦアプタマーの例には、以下に制限されるものではないが、
（ｉ）配列ＣＧＧＡＡＵＣＡＧＵＧＡＡＵＧＣＵＵＡＵＡＣＡＵＣＣＧ（その全体において本明細書に参照によって組み込まれる米国特許第６，０５１，６９８号に記載される配列番号７）を有する抗ＶＥＧＦアプタマー。各Ｃ、Ｇ、Ａ、及びＵはそれぞれ、自然に発生するヌクレオチドであるシチジン、グアニジン、アデニン、及びウリジン、又はそれに対応する修飾されたヌクレオチドを表し、及び好ましくは、
（ｉｉ）配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を有する抗ＶＥＧＦアプタマーが含まれる。
【００８０】
キャッピングされた抗ＶＥＧＦアプタマーの例は、配列Ｘ−５’−５’−ＣＧＧＡＡＵＣＡＧＵＧＡＡＵＧＣＵＵＡＵＡＣＡＵＣＣＧ−３’−３’−Ｘ（配列番号９）を有し、各Ｃ、Ｇ、Ａ、及びＵはそれぞれ、自然に発生するヌクレオチドであるシチジン、グアニン、アデニン、及びウリジン、又はそれに対応する修飾されたヌクレオチドを表し、Ｘ−５’−５’−は、アプタマーの５’末端をキャッピングする逆転したヌクレオチドであり、３’−３’−Ｘは、アプタマーの３’末端をキャッピングする逆転したヌクレオチドであり、残余ヌクレオチド又は修飾されたヌクレオチドは５’−３’ホスホジエステル結合を介して連続して結合される。いくつかの実施態様において、キャピングされた抗ＶＥＧＦアプタマーの各ヌクレオチドは各々、（リボ核酸（ＲＮＡ）に対する標準である）−ＯＨ、又は（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対する標準である）−Ｈなどの２’リボシル置換を抱える。他の実施態様において、２’リボシル位置は、Ｏ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ１−１０アルケニル）、Ｆ、Ｎ３、又はＮＨ２置換体と置換される。
【００８１】
さらにより特定の制限のない例において、５’−５’キャッピングされた抗ＶＥＧＦアプタマーは構造
Ｔｄ−５’−５’−ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ３’−３’−Ｔｄ
（配列番号１）
を有してもよく、式中、「Ｇｍ」は２’−メトキシグアニル酸を表し、「Ａｍ」は２’−メトキシアデニル酸を表し、「Ｃｆ」は２’−フルオロシチジル酸を表し、「Ｕｆ」は２’−フルオロウリジル酸を表し、「Ａｒ」はリボアデニル酸を表し、「Ｔｄ」はデオキシリボチミジル酸を表す（本明細書にその全体において参照によって組み込まれるＡｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．ほか、刊行された出願第ＷＯ２００５／０１４８１４号を参照）。
【００８２】
「抗ＰＤＧＦアプタマー」は、ＰＤＧＦへ結合し、ＰＤＧＦの活性を阻害するポリヌクレオチドアプタマーを包含するよう意図される。このようなアプタマーは公知の方法を使用して同定できる。例えば、試験管内進化法又はＳＥＬＥＸ法は、前述のように使用できる。
【００８３】
抗ＰＤＧＦアプタマーには、米国特許第５，６６８，２６４号、第５，６７４，６８５号、第５，７２３，５９４号、第６，２２９，００２号、第６，５８２，９１８号、及び第６，６９９，８４３号に記載された配列が含まれ、本発明にしたがって、５’−５’逆転したキャップ及び／又は３’−３’逆転したキャップ及び／又は可溶性高分子量の立体的な基による修飾で修飾できる。
【００８４】
抗ＰＤＧＦアプタマーの例には、以下に制限されるものではないが、
（ｉ）位置６、２０及び３０で２’−フルオロ−２’−デオキシウリジンを有し、位置８、２１、２８、及び２９で２’−フルオロ−２’−デオキシシチジンを有し、位置９、１５、１７、及び３１で２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシンを有し、位置２２で２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシンを有し、位置１０及び２３にある「Ｎ」でヘキサエチレン−グリコールホスホラミダイトを有し、位置３２で逆転した向きＴ（つまり、３’−３’結合される。）を有する配列ＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵＧＴ（その全体において本明細書に参照によって組み込まれる米国特許第６，５８２，９１８号由来の配列番号１０）を有するペグ化した抗ＰＤＧＦアプタマーである、ＡＲＣ−１２７（Ａｒｃｈｅｍｉｘ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、及び、
（ｉｉ）位置８のＣでＯ−メチル−２−デオキシシチジンを、位置９、１７及び３１のＧで２−Ｏ−メチル−２−デオキシグアノシンを、位置２２のＡで２−Ｏ−メチル−２−デオキシアデノシンを、位置３０で２−Ｏ−メチル−２−デオキシウリジンを、位置６及び２０のＵで２−フルオロ−２−デオキシウリジンを、位置２１、２８及び２９のＣで２−フルオロ−２−デオキシシチジンを、位置１０及び２３のＮでペンタエチレングリコールホスホラミダイトスペーサーを、位置３２で逆転した向きＴ（つまり、３’−３’結合される。）を有するＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵＧＴ（その全体において本明細書に参照によって組み込まれる米国特許第５，７２３，５９４号由来の配列番号１１）が含まれる。
【００８５】
「抗ＩＣＡＭアプタマー」は、ＩＣＡＭへ結合し、ＩＣＡＭの活性を阻害するポリヌクレオチドアプタマーを包含するよう意図される。このようなアプタマーは公知の方法を使用して同定できる。例えば、試験管内進化法又はＳＥＬＥＸ法は、前述のように使用できる。
【００８６】
別段の記載がなければ、「又は」という語は本明細書において「及び／又は」の包括的な感覚で使用され、「いずれか／又は」の排他的な感覚では使用されない。
【００８７】
本明細書で使用されるように、「増大」及び「低下」という語はそれぞれ、統計的に有意な増大（つまり、ｐ＜０．１）及び統計的に有意な低下（つまり、ｐ＜０．１）を意味する。
【００８８】
本明細書で使用される変数についての数の範囲の詳説は、本明細書が範囲内の値のいずれかに等しい変数で実施されてもよいことを意味するよう企図される。したがって、本質的に離散した変数について、変数は、範囲の終点を含む数の範囲内のいずれかの整数値に等しくありうる。同様に、本質的に連続する変数について、変数は、範囲の終点を含む数の範囲内のいずれかの実際の値に等しくありうる。
【００８９】
「ＩＣＡＭ」又は「細胞間接着分子」という語は、免疫グロブリンスーパーファミリーのいくつものI型膜糖タンパク質のいずれかを指す。ＩＣＡＭは、ＬＦＡ−１とともに標的細胞への白血球接着のためのリガンドとして作用する。ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ相互作用は、多くの細胞タイプ間の接着を仲介する。ＩＣＡＭの３つのサブクラスがある。ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）は、９０ｋＤａないし１１５ｋＤａの分子量を有し（図４（Ａ）参照）、線維芽細胞、ケラチノサイト、及び軟骨細胞と同様、Ｂ細胞及びＴ細胞、内皮細胞、上皮細胞、及び樹状細胞において発現する。それらは、γインターフェロン、インターロイキン−１β、及び腫瘍壊死因子−αを含むサイトカインによって１２時間ないし２４時間で誘導可能である。ＩＣＡＭ−１の例には、５３２個のアミノ酸のＩＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ（５７．７６ｋＤａ）が含まれる。ＩＣＡＭ−２（ＣＤ１０２）は、約５５ｋＤａないし６５ｋＤａの分子量を有し、内皮細胞、いくつかのリンパ球、単球及び樹状細胞で構成的に発現する。ＩＣＡＭ−２の例には、２７５個のアミノ酸のＩＣＡ２＿ＨＵＭＡＮ（３０．６２ｋＤａ）が含まれる。ＩＣＡＭ−３（ＣＤ５０）は、１１６ｋＤａないし１４０ｋＤａの分子量を有し、単球、顆粒球及びリンパ球において構成的に発現する。生理学的刺激に際し、ＩＣＡＭ−３は迅速かつ一過性にセリン残基でリン酸化される。ＩＣＡＭ−３の例には、５４７個のアミノ酸のＩＣＡ３＿ＨＵＭＡＮ（５９．３２ｋＤａ）が含まれる。
【００９０】
本明細書で使用される「オリゴマー」という語は、その分子量がポリマーを考慮されるには小さすぎるポリマーを指す。オリゴマーは典型的に、数百の分子量を有するが、ポリマーは典型的に、数千以上の分子量を有する。
【００９１】
「オリゴヌクレオチド」という語は、自然発生する塩基、糖及び糖間（主鎖）結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシド単量体のオリゴマー又はポリマーを指す。語には、同様に機能する自然には発生しない単量体又はその一部を含む修飾された又は置換されたオリゴマーも含まれる。置換されたオリゴマーの組み込みは、細胞内取り込みの増強又はヌクレアーゼ抵抗性の亢進を含む因子に基づいており、本分野で周知のように選択される。全体的なオリゴヌクレオチド又はそのたったの一部は、置換されたオリゴマーを含有してもよい。
【００９２】
「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」という語は、ｎが３を超える一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨのいずれかのポリマーを指す。ある実施態様において、ｎは約４ないし約４０００である。別の実施態様において、ｎは約２０ないし約２０００である。ある実施態様において、ｎは約４５０である。ある実施態様において、ＰＥＧは約８００ダルトン（Ｄａ）ないし約１００，０００Ｄａの分子量を有する。さらなる実施態様において、ポリエチレングリコールは２０ｋＤａ ＰＥＧ、４０ｋＤａ ＰＥＧ、又は８０ｋＤａ ＰＥＧである。ポリエチレングリコールの平均的な相対分子量は時々、接尾数によって示される。例えば、４０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有するＰＥＧは、「ポリエチレングリコール４０００」と呼ばれてもよい。ＰＥＧにより結合した生成物は、ペグ化した生成物と呼ばれてもよい。
【００９３】
「ランダムコイル」という語は、それが溶液中にある場合のポリマー分子の形状を指し、それ自体一直線に伸ばされているよりもむしろ、それ自体後ろに折りたたまれる。このようなランダムコイルは、ポリマーと溶媒との分子間力が溶媒分子自体の間の力及びポリマー鎖セグメント間の力と等しい場合に形成する。
【００９４】
「立体障害」という語は、ある分子実体（例、タンパク質）の別の分子実体（例、相互作用するタンパク質）との結合又は相互作用の制限又は防止を指す。「立体障害」という語には、立体的な基における原子又は基のサイズ及び／又は空間的な配置によってアプタマーの標的タンパク質の標的タンパク質の結合パートナー（例、その受容体とのリガンド）との結合を制限又は防止する上で、可溶性高分子量の立体的な基を有する立体的に増強されたアプタマーの効果が含まれる。
【００９５】
「離れた部位」又は「アプタマー結合部位から離れている部位」は、アプタマー結合部位に対して近位又は遠位であってもよい。離れた部位は、アプタマー結合部位に近接するか、重なるか、結合部位のそばにあるか、又は離れていてもよい。
【００９６】
アプタマー核酸組成物
標的分子の多様性へ結合するアプタマー核酸配列は簡単に作製される。本発明のアプタマー核酸配列は、ＲＮＡの完全に又はＲＮＡの部分的に、ＤＮＡの完全に又は部分的に、及び／又は他のヌクレオチドアナログから構成できる。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）として公知の生体内又は試験管内（最も典型的には試験管内）選抜技術を採用することによって、特定のリガンドを結合するよう典型的に開発されている。アプタマーを作製する方法は、例えばＥｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６： ８１８、Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ５０５、米国特許第５，５８２，９８１号、ＰＣＴ出願第ＷＯ００／２００４０号、米国特許第５，２７０，１６３号、Ｌｏｒｓｃｈ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３： ９７３、Ｍａｎｎｉｒｏｎｉほか（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６： ９７２６、Ｂｌｉｎｄ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６： ３６０６−３６１０、Ｈｕｉｚｅｎｇａ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４： ６５６−６６５、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／５４５０６号、第ＷＯ９９／２７１３３号、及び第ＷＯ９７／４２３１７号、及び米国特許第５，７５６，２９１号に記載される。
【００９７】
一般に、それらの最も基本的な形態において、ＲＮＡアプタマーを同定するための試験管内選抜技術は、無作為化されるか又は変異誘発される少なくともある領域を含有する望ましい長さのＤＮＡ分子の大きなプールをまず調製することを包含する。例えば、アプタマー選抜のための共通のオリゴヌクレオチドプールは、ＰＣＲプライマーの結合に有用な定義された配列の約１５ヌクレオチド長ないし２５ヌクレオチド長の領域によって両端で隣接した２０ないし１００の無作為化したヌクレオチドの領域を含有してもよいであろう。オリゴヌクレオチドプールは、標準的なＰＣＲ技術を使用して増幅される。次に、ＤＮＡプールは試験管内で転写される。次に、ＲＮＡ転写産物は、アフィニティクロマトグラフィーへ供される。転写産物は、標的リガンドが固定されたカラムを通じて最も典型的に通過するか又は磁気ビーズ又はその類似物と接触する。リガンドへ結合するプールにあるＲＮＡ分子はカラム又はビーズへ保持され、その間、結合していない配列は洗い流される。次に、リガンドを結合するＲＮＡ分子は逆転写され、（通常溶出後）ＰＣＲによって再度増幅される。次に、選択されたプールの配列は、選抜の同一タイプの別の回を通じて置かれる。典型的に、選択されたプールの配列は、選抜手段の総計約３回ないし１０回の繰り返しを通じて置かれる。次に、ｃＤＮＡは、標的リガンドのためのアプタマーとして作用できるＲＮＡ分子の配列を同定するため、標準的な手段を使用して増幅され、クローン化され、配列決定される。
【００９８】
本発明における使用のために、アプタマーは、正常な生理学的条件を模擬する塩濃度及び温度の存在下でリガンド結合のために選抜されてもよい。一度アプタマー配列がうまく同定されると、アプタマーはさらに、変異誘発したアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドのプールから開始する選抜のさらなる回を実施することによって最適化されてもよい。
【００９９】
アプタマーがまだ入手可能かどうかに関係なく、当業者は適切なリガンドを一般に選択できる。たいていの場合において、当業者による選択の小さな有機分子を結合するアプタマーが得られうる。試験管内選抜プロセスの独特の性質によって、構造のどんなタイプが望ましいリガンドを結合するかもしれないかに関する先行知識の完全な不足にもかかわらず望ましいリガンドを結合する適切なアプタマーを単離できる。
【０１００】
アプタマー及び会合したリガンドについての結合定数は、例えば、リガンドが銭アプタマーへ結合するよう機能し、リガンドの投与の際に得られるリガンドの濃度で望ましい効果を有するようである。生体内での使用のために、例えば結合定数は、血清又は（眼の硝子体流体などの）他の組織において達成できるリガンドの濃度を下回って結合が生じるようであるべきである。例えば、生体内での使用に必要なリガンド濃度は、生物体に及ぼす望ましくない効果を有することができるであろう濃度も下回る。
【０１０１】
アプタマー核酸配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び混合した組成物を含むことに加えて修飾されてもよい。例えば、特定の修飾されたヌクレオチドは、改善された生体内安定性又は改善された送達特徴など、ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド上での改善された特徴を付与できる。このような修飾の例には、リボース及び／又はリン酸塩及び／又は塩基の位置にある化学的な置換が含まれる。修飾されたヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸにより同定される核酸リガンドは、ピリミジンの５’位置及び２’位置で化学的に修飾されるヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する「修飾されたヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド」という表題の米国特許第５，６６０，９８５号に記載される。前述の米国特許第５，６３７，４５９号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する非常に特異的な核酸リガンドを記載する。「分子内核親和性求核性置換による公知の及び新規の２’修飾されたヌクレオシドの調製の新規の方法」という表題の１９９４年６月２２に出願された米国出願シリアル番号第０８／２６４，０２９号は、多様な２’−修飾されたピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載する。
【０１０２】
本発明のアプタマー核酸配列はさらに、「指数関数的な濃縮によるリガンドの系統的な進化：キメラＳＥＬＥＸ」という表題の米国特許第５，６３７，４５９号、及び「指数関数的な濃縮によるリガンドの系統的な進化：配合されたＳＥＬＥＸ」という表題の米国特許第５，６８３，８６７号にそれぞれ記載される他の選択されたオリゴヌクレオチド及び／又は非オリゴヌクレオチド機能的単位と組み合わされてもよい。
【０１０３】
アンタゴニストアプタマー標的
本発明は、アプタマー、特に１つ以上の結合パートナーへの多様な生物標的のいずれかの結合を阻害するよう機能する１つ以上の可溶性高分子量の立体的な基へ結合する特に立体的に増強したアプタマーを提供する。アプタマーはそれにより生物標的のアンタゴニストとして機能する。たいていの場合において、標的／結合パートナーの相互作用の混乱は、標的タンパク質の１つ以上の生物機能を阻害するよう機能するであろう。しかしながら、特定の場合において、結合パートナーが標的の生物機能を阻害するよう機能する場合、立体的に増強したアプタマーアンタゴニストは標的タンパク質の生物機能を活性化してもよい。したがって、本発明の「アンタゴニスト」アプタマー抱合体は、例えば（シグナル伝達リガンドポリペプチドなどの）標的タンパク質と、その結合パートナー（細胞表面受容体タンパク質など）の１つ以上との結合の機能的な「アンタゴニスト」である。
【０１０４】
例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、乾癬、眼の疾患、コラーゲン循環器疾患及び新生物性疾患を含む血管形成を包含する多様な疾病におけるＶＥＧＦの役割によって広範囲の臨床上の有用性を有する。
【０１０５】
ＶＥＧＦリガンドは、ＶＥＧＦ遺伝子の代替的なスプライシングの結果として４つの形態（ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６）において生じる（Ｈｏｕｃｋほか（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．５： １８０６−１８１４； Ｔｉｓｃｈｅｒほか（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６： １１９４７−１１９５４）。２つのより小さな形態は拡散可能であるのに対し、より大きな２つの形態はヘパリンに対するその高い親和性の結果として、細胞膜へ主として局在したままである。ＶＥＧＦ−１６５もヘパリンへ結合し、最も豊富な形態である。ヘパリンへ結合しない唯一の形態であるＶＥＧＦ−１２１は、より低い分裂能（Ｋｅｙｔほか（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１： ７７８８−７７９５）と同様、ＶＥＧＦ受容体に対するより低い親和性を有するようである（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎほか（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１： ５５１９−５５２３）。ＶＥＧＦの生物効果は、発現が内皮由来の細胞に非常に制限される２つのチロシンキナーゼ受容体（それぞれＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２としても公知のＦｌｔ−１及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ）によって仲介される（ｄｅ Ｖｒｉｅｓほか（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ９８９−９９１； Ｍｉｌｌａｕｅｒほか（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２： ８３５−８４６； Ｔｅｒｍａｎほか（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６： ５１９−５２４）。両機能的状態の発現が高い親和性結合に必要である一方で、内皮細胞における走化性及び分裂促進的シグナル伝達は主としてＫＤＲ受容体を通じて生じるようである（Ｐａｒｋほか（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９： ２５６４６−２５６５４； Ｓｅｅｔｈａｒａｍほか（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０： １３５−１４７； Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒほか（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９８８−２６９９５）。血管の発達のためのＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体の重要性は、ＶＥＧＦ遺伝子に対する単一の対立遺伝子（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔほか（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０： ４３５−４３９； Ｆｅｒｒａｒａほか（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０： ４３９−４４２）又はＦｌｔ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）遺伝子（Ｆｏｎｇほか（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６： ６６−７０）若しくはＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦ−Ｒ２）遺伝子（Ｓｈａｌａｂｙほか（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６： ６２−６６）の両対立遺伝子を欠失するマウスにおいて最近示されている。各場合において、血管形成における明確な異常性は胚死亡率を生じることが観察された。
【０１０６】
ＶＥＧＦは、事実上すべての腫瘍細胞によって変動する量で産生及び分泌される（Ｂｒｏｗｎほか（１９９７）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ及びＲｏｓｅｎ編）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂａｓｅｌ、ｐｐ．２３３−２６９）。ＶＥＧＦ及びその受容体が腫瘍成長に関与するという直接的な証拠は、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍ｘｅｎｏｇｒａｆｔの成長がＶＥＧＦに対する抗体を中和すること（Ｋｉｍほか（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２： ８４１−８４４）によって、優位抑制型ＶＥＧＦ受容体ｆｌｋ−１の発現（Ｍｉｌｌａｕｅｒほか（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６： １６１５−１６２０； Ｍｉｌｌａｕｅｒほか（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６７： ５７６−５７９）によって、Ｆｌｋ−１チロシンキナーゼ活性の低分子量阻害剤（Ｓｔｒａｗｎほか（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６： ３５４０−３５４５）によって、又はＶＥＧＦｍＲＮＡに対するアンチセンス配列の発現（Ｓａｌｅｈほか（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６： ３９３−４０１）によって阻害できることを示すことによって最近得られた。重要なことに、腫瘍の転移の発症は、VEGFアンタゴニストによって劇的に低下することも発見された（Ｃｌａｆｆｅｙほか（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６： １７２−１８１）。
【０１０７】
したがって、ＶＥＧＦのアプタマーアンタゴニストは、血管新生を包含する疾病の治療において有用である。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、老年者集団におけるその他の疾病よりもより重度の展望を生じる脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の存在によって特徴付けられる進行性疾患である新生血管の加齢関連黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療するために使用されてきた（Ｃｓａｋｙほか（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１０： ８８０−８８１）。
【０１０８】
ＶＥＧＦ阻害剤の１つのタイプは、核酸ベースのＶＥＧＦリガンドｔｅｒｍｅｄアプタマーである。アプタマーは、特異的な３時限構造を採用する核酸の化学的に合成された短鎖であり、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる試験管内選抜のプロセスを通じて特定の標的に対する親和性について選抜される。ＳＥＬＥＸは、いずれかの標的に対する適切な結合親和性及び特異性を有する特異的な配列について迅速にオリゴヌクレオチドの莫大な数がスクリーニングされる組み合わせ化学方法論である。このプロセスを使用して、特定の標的に特異的な新規のアプタマー核酸リガンドが作製されてもよい。
【０１０９】
ＶＥＧＦの作用を遮断するＶＥＧＦアプタマー阻害剤が開発されてきた。これらの抗ＶＥＧＦアプタマーは、ヒトＧＶＥＧＦの１６５ｋＤａ分子種へ高い親和性で結合する小さな安定性のあるＲＮＡ様分子である。このようなＶＥＧＦアプタマーは、乾癬、眼の疾患、コラーゲン循環器疾患及び新生物性疾患を含む血管形成を包含する多様な疾病におけるＶＥＧＦリガンドの役割によって広範囲の臨床上の有用性を有する。一般にＳＥＬＥＸプロセス、特にＶＥＧＦアプタマー及び製剤は、例えば米国特許第５，２７０，１６３号、第５，４７５，０９６号、第５，６９６，２４９号、第５，６７０，６３７号、第５，８１１，５３３号、第５，８１７，７８５号、第５，８４９，４７９号、第５，８５９，２２８号、第５，９５８，６９１号、第６，０１１，０２０号、第６，０６１，６９８号、第６，１４７，２０４号、第６，１６８，７７８号、第６，４２６，３３５号、及び第６，６９６，２５２号に記載されており、それらの各々の内容は本明細書に参照によって特に組み込まれる。
【０１１０】
多様な他の生物標的を標的とする多くの他のアプタマー配列が開発されてきた。例えば、サイトカイン（米国特許第６，０２８，１８６号参照）、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体（米国特許第６，６８２，８８６号参照）、ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，６９３，５０２号、第５，７６３，１７３号、第５，８７４，５５７号、及び第６，０２０，１３０号参照）、補体系タンパク質（米国特許第６，３９５，８８８号及び第６，５６６，３４３号参照）、レクチン（米国特許第５，７８０，２２８号、第６，００１，９８８号、第６，２８０，９３２号、及び第６，５４４，９５９号参照）、インテグリン（米国特許第６，３３１，３９４号参照）、及び肝細胞成長因子／散乱係数（ＨＧＦ／ＳＰ）又はその受容体（ｃ−ｍｅｔ）（米国特許第６，３４４，３２１号参照）と同様、ＰＤＧＦ（米国特許第５，６６８，２６４号、第５，６７４，６８５号、第５，７２３，５９４号、第６，２２９，００２号、第６，５８２，９１８号、及び第６，６９９，８４３号参照）、塩基性ＦＧＦ（米国特許第５，４５９，０１５号及び第５，６３９，８６８号参照）、ＣＤ４０（米国特許第６，１７１，７９５号参照）、ＴＧＦβ（米国特許第６，１２４，４４９号、第６，３４６，６１１号、及び第６，７１３，６１６号参照）、ＣＤ４（米国特許第５，８６９，６４１号）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン（米国特許第５，８３７，４５６号及び第５，８４９，８９０号参照）、ＨＫＧＦ（米国特許第５，７３１，４２４号、第５，７３１，１４４号、第５，８３７，８３４号、及び第５，８４６，７１３号参照）、ＩＣＰ４（米国特許第５，７９５，７２１号）、ＨＩＶ逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号参照）、ＨＩＶインテグラーゼ（米国特許第５，５８７，４６８号及び第５，７５６，２８７号参照）、ＨＩＶ−ｇａｇ（米国特許第５，７２６，０１７号参照）、ＨＩＶ−ｔａｔ（米国特許第５，６３７，４６１号参照）、ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−ｒｅｖ（米国特許第５，４９６，９３８号及び５，５０３，９７８号）、ＨＩＶヌクレオカプシド（米国特許第５，６３５，６１５号及び第５，６５４，１５１号）、好中球エラスターゼ（米国特許第５，４７２，８４１号及び第５，７３４，０３４号）、ＩｇＥ（米国特許第５，６２９，１５５号及び第５，６８６，５９２号）、タキキニンＰ物質（米国特許第５，６３７，６８２号及び第５，６４８，２１４号）、分泌性ホスホリパーゼＡ２（米国特許第５，６２２，８２８号参照）、トロンビン（米国特許第５，４７６，７６６号参照）、腸ホスファターゼ（米国特許第６，２８０，９４３号、第６，３８７，６３５号、及び第６，６７３，５５３号参照）、テネイシン−Ｃ（米国特許第６，２３２，０７１号及び第６，５９６，４９１号参照）を標的にするアプタマー配列が開発されてきた。これらの配列及び他のアプタマーの配列は本発明において組み込まれうる。望ましい生物標的を標的にするなおより多くのアプタマーは、ＳＥＬＥＸベースの方法論の適応性をおそらく付与される。
【０１１１】
他の有用なアプタマー標的には、以下に制限されるものではないが、ＮＦ−κＢ、ＲＲＥ、ＴＡＲ、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０、ＨＩＶ−１、ＭＡＰキナーゼ、アミロイド原線維、オノスタチンＭ（Ｏｎｏｓｔａｔｉｎ Ｍ）（ＯＳＭ）、Ｅ２Ｆ、アンジオポエチン−２、凝固因子ＩＸａ、Ｒａｓ誘導性Ｒａｆ活性化タンパク質、ヌクレオカプシド、チューブリン、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、及びスパイゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）（鏡像ヌクレオチド）が含まれる。
【０１１２】
本発明の特に有用なアプタマー標的には接着分子及びそれらのリガンドが含まれ、その多くは細胞連絡を容易にし、本発明の方法及び組成物に特に従う大きな多領域の細胞外領域を有する。接着分子には、セレクチン（例、Ｌ−セレクチン（硫酸化ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４、及びＭＡｄＣＡＭ−１へ結合するＣＤ６２Ｌ））、Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）及びＰ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）、インテグリン（例、ＩＣＡＭであるＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３へ結合するＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）及びＩＣＡＭ−１、Ｘ因子、ｉＣ３ｂ及びフィブリノーゲンへ結合するＣＤ１１ｂ）、ＭＡＧ（ミエリン結合糖タンパク質）、ＭＯＧ（ミエリン−オリゴデンドロサイト糖タンパク質）、及びＮＣＡＭ−１（ＣＤ５６）などの神経特異的ＩｇＣＡＭを含むタンパク質の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、（ＬＦＡ−１へ結合する）ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）（前述参照）、ＩＣＡＭ−２（ＣＤ１０２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＤ５０）、及び（ヒアルロニン、アンキリン、フィブロネクチンＭＩＰ１β及びオステオポンチンへ結合する）ＣＤ４４、並びに（カドヘリンＥ（１）、Ｎ（２）、ＢＲ（１２）、Ｐ（３）、Ｒ（４）等及びデスモコリン１などのデスモコリンなどの）カドヘリンが含まれる。
【０１１３】
アプタマーは、診断上の使用（例、ヒト赤血球細胞ゴーストの認識、癌細胞診断における親細胞から分化した細胞の識別）のために開発されてもよい。例えば、アプタマーはタンパク質、代謝産物、アミノ酸、及びヌクレオチドなど（例、コレラ毒素及びブドウ球菌性エンテロトキシン）の分子を特異的に標的にしてもよい。
【０１１４】
立体的な基
本発明は、可溶性で、標的特異的アプタマー核酸配列と共役してもよい高分子量の立体的な基を提供する。立体的な基の共役は、アプタマー核酸の５’末端及びアプタマー核酸の３’末端を通じてであってもよく、又は５’末端ないし３’末端のアプタマー核酸配列に沿ったいずれかの位置を通じてであってもよい。例えば、高分子量の立体的な基は、アプタマー核酸配列の塩基の環外アミノ基にあるアプタマー、ピリミジンヌクレオチドの５の位置、プリンヌクレオチドの８の位置、リン酸塩のヒドロキシル基、又はリボース基のヒドロキシル基と共役してもよい。高分子量の立体的な基をこれらの多様な位置にあるアプタマー核酸配列へ化学的に結合するための手段は本分野で公知であり、及び／又は以下に例証される。
【０１１５】
適切な高分子量の立体的な基には一般に、アプタマー結合標的とその結合パートナーとの相互作用に立体的に干渉するのに十分な水力学的体積を有するいずれかの可溶性高分子量化合物が含まれる。例には、ポリマー、ゲル形成化合物、及びそれらに類似物が含まれるが、それらには限定されない。適切な高分子量の立体的な基には、ポリマーネットワーク間に浸透すること及びポリマーネットワーク内に浸透することが含まれうる。
【０１１６】
特定の可溶性高分子量の立体的な基の最適な特徴は、本明細書に教示された手段並びに本明細書に教示された方法及び組成物を使用して決定されてもよい。最適な立体的ポリマーを決定するための方法には、実施例８ないし実施例１２として本明細書に記載の阻害アッセイが含まれる。
【０１１７】
あるいは、可溶性高分子量の立体的な基の流体力学的半径を測定するために動的光散乱を使用できる。流体力学的半径と有効性との相関は、間接的な有効性の測定結果を提供するかもしれない。
【０１１８】
本発明の特に有用な立体的な基の例には、以下に制限されるものではないが、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、及びアルギン酸塩などの多糖類、ポリエステル、（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（Ｒ）などの）高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、カルボキシメチルセルロース、他のセルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド又はポリエーテルが含まれる。
【０１１９】
有用な立体的な基は、水又は生理学的溶液中で可溶性であろう。ある実施態様において、立体的な基は少なくとも１ｍｇ／ｍｌの水溶解性を有する。別の実施態様において、立体的な基は少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの水溶解性を有する。別の実施態様において、立体的な基は少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの水溶解性を有する。
【０１２０】
有用な立体的な基は、約８００Ｄａないし約３，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有し、及び／又は立体的な障害を提供するために（例えば、リガンドとその受容体などの、アンタゴニストアプタマー標的と標的結合パートナーとの結合を遮断するために）十分なサイズの水力学的体積を有するであろう。ある実施態様において、立体的な基は、約２０キロダルトン（ｋＤａ）ないし約１０００ｋＤａの分子量を有する。別の実施態様において、立体的な基は、約５ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する。ある特定の実施態様において、立体的な基は約２０ｋＤａの分子量を有する。別の特定の実施態様において、立体的な基は約４０ｋＤａの分子量を有する。別の特定の実施態様において、立体的な基は約８０ｋＤａの分子量を有する。
【０１２１】
ある実施態様において、立体的な基は、約０．５ナノメーター（ｎｍ）ないし約１０００ｎｍの範囲の水力学的体積を有する。別の実施態様において、立体的な基は、約１ナノメーター（ｎｍ）ないし約１０ｎｍの範囲の水力学的体積を有する。ある特定の実施態様において、立体的な基は約２ｎｍの水力学的体積を有する。別の特定の実施態様において、立体的な基は約４ｎｍの水力学的体積を有する。別の特定の実施態様において、立体的な基は約８ｎｍの水力学的体積を有する。
【０１２２】
ある実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリエーテルポリオールである。好ましい実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、遊離ヒドロキシル基を有してもよいか、又はアルキル化されてもよい。好ましい実施態様において、アプタマーへ結合していないＰＥＧの末端はメトキシ基を有する（ｍＰＥＧ）。
【０１２３】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基は多糖類である。ある実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はデキストランである。デキストランは、直鎖又は分岐鎖であってもよい。ある実施態様において、デキストランはカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤｅｘ）である。
【０１２４】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はセルロース誘導体である。別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）である。デキストランのアナログであるＣＭＣ及びその還元末端は、共役におけるシッフ塩基化学による生物学的活性化合物のアミン基への共役のために入手可能である。別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリグリコサミンである。別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はキトサンである。
【０１２５】
多糖類は、還元的アミノ化によってアプタマーの末端でアミンへ結合されてもよい。アルデヒド又はヘミアセタール機能性などの還元性末端を含有する多糖類は、二次アミン結合を生じるために還元的アミノ化によって一次アミン含有アプタマーへ共役されてもよい。あるいは、アプタマーは、アプタマーとヒドラジン又はヒドラジン機能性との間に共有結合が存在するよう修飾されてもよい。イミンの、これらのアミン当量のいずれかによる形成は、従来のイミンに相対的な加水分解に対して安定化する抱合体を提供する。ヒドラジン又はヒドラジン共役は、還元的アミノ化がリンカーの長さによって制限される場合に有用である。例えば、ヒドラジン又はヒドラジン共役は、かさ高い部分及び高電子密度巨大分子部分の各々の反応基が互いに引き付けられることができながら、リンカーがかさ高い部分及び高電子密度巨大分子部分を分離するのに必要とされる場合、特に有用である。オリゴヌクレオチドアミンとヒドラジン又はヒドラジドとの間のリンカーは、立体的な自由度の余分を測定してもよい。ヒドラジン又はヒドラジドから生じるイミンは、さらなる還元又はアミン様結合を生じるために還元されることなく使用されてもよい。
【０１２６】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリアルデヒドである。さらなる実施態様において、ポリアルデヒド基は、合成的に派生されるか又はオリゴ糖の酸化によって得られるかのいずれかであってもよい。
【０１２７】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はアルギン酸塩である。好ましい実施態様において、アルギン酸基は、ナトリウム又はカルシウムなどの陽イオン性対イオンを有する塩として提供される陰イオン性アルギン酸基であってもよい。
【０１２８】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリエステルである。特定の実施態様において、ポリエステル基は、共ブロック重合体のポリエステル基であってもよい。
【０１２９】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又はポリ乳酸共グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）（ＰＬＧＡ）である。適切なＰＬＧＡ基及びＰＬＧＡ基を共役するための方法は、Ｊ．Ｈ．Ｊｅｏｎｇほか、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，１２，９１７−９２３； Ｊ．Ｅ．Ｏｈほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９９，５７，２６９−２８０及びＪ．Ｅ．Ｏｈほか、米国特許第６，５８９，５４８号に見られ、各々の内容はその全体において本明細書で参照によって組み込まれる。
【０１３０】
別の実施態様において、高分子量の立体的な基はデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）である。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、モノマー及び表面修飾のいずれかの組み合わせから構成されてもよい。有用な単量体の例には、以下に制限されるものではないが、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）が含まれる。有用な表面修飾の例には、以下に制限されるものではないが、陽イオン性アンモニウム、Ｎ−アシル及びＮ−カルボキシメチル基が含まれる。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、多価陰イオン性、多価陽イオン性、疎水性又は親水性であってもよい。ある特定の実施態様において、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は約１個ないし約２５６個の表面修飾基を有する。別の特定の実施態様において、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、約４、８、１６、３２、６４又は１２８個の表面修飾基を有する。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）及びデンドリマー共役技術の例は米国特許第５，７１４，１６６号に見られ、それはその全体において本明細書に参照によって組み込まれる。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）をアプタマーへ共役するための一般的な合成スキームは図１５に示される。
【０１３１】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。ＢＳＡ上の遊離チオールの存在は、ある末端にチオール反応基を、その他の末端にアミン反応基を含有する二機能性リンカーを採用することによって、アミン含有アプタマーの共役を可能にする。ＢＳＡをアプタマーへ共役するための一般的な合成スキームは図１４に示される。二機能性リンカーをアプタマーへ共役するための一般的な合成スキームは図１６に示される。
【０１３２】
他の特に有用な実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基は、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸塩、（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（Ｒ）などの）高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリエーテル又はポリカプロラクトンであってもよい。
【０１３３】
荷電された分子
本発明は、標的特異的アプタマー核酸配列などの生物学的活性分子へ共役されてもよい大きく荷電分子を提供する。荷電分子は、本分野で周知のいずれかの適切な電荷分子でありうる。好ましくは荷電分子は陰イオン荷電した又は陽イオン荷電したポリマー又は多価電解質である。荷電分子を生物学的活性分子へ化学的に結合させるための手段は、本分野で公知であるか及び／又は以下に例証される。
【０１３４】
陰イオンポリマーの例には、以下に制限されるものではないが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリアクリルアミド、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カラゲナン、硫酸セルロース、硫酸デキストラン／デキストリン、ポリ（スルホン酸ナフタレン）、ポリ（スチレン−４−スルホン酸）及びポリ（４−スチレンスルホン酸共マレイン酸）が含まれる。
【０１３５】
陽イオンポリマーの例には、以下に制限されるものではないが、キトサン、ポリグルコサミン、ポリリジン、ポリグルタミン酸塩、ポリビニルアミン、２−（ジエチルアミノ）エタノール（ＤＥＡＥ）、スペルミン及びプトレシンなどのアミンを含むポリマー、及び他のポリアミンが含まれる。
【０１３６】
「多価電解質」という語は、荷電された（負に荷電された、正に荷電された、または双性イオン性の）、又は荷電させられることのできるいずれかの分子、イオン又は粒子、有機物又は無機物を記載するよう使用される。多価電解質は、少なくとも１つの、好ましくは２つ以上の荷電した基を有する。「多価電解質」という語には、異別の多価電解質又は異別の分子量分布を有する同様の多価電解質の混合物も含まれる。「電解質」は、単一の分子又は分子の凝集体であってもよい。多価電解質が粒子状である場合、つまり、複数の分子凝集体からなる場合、粒子は多孔性又は非多孔性であることができ、例えばミセル（陽イオン性又は陰イオン性）又はリポソーム（陽イオン性又は陰イオン性）などの巨大分子構造であってもよい。多か電解質は、陽イオン性多価電解質、陰イオン性多価電解質、両性多価電解質及びそれらの混合物からなる群から選択できる。
【０１３７】
多価電解質は、四級アンモニウム、スルホニウム、ホスホニウム、カルボン酸塩、スルホン酸塩及びリン酸塩からなる群から選択される１つ以上のイオン基を含むポリマー主鎖を典型的に含むことができる。
【０１３８】
このような多価電解質化合物に適した主鎖構造の例には、以下に制限されるものではないが、アクリルアミド、付加ポリマー（例、ポリスチレン）、オリゴ糖及び多糖類（例、アガロース、デキストラン、セルロース）、ポリアミン及びポリカルボン酸塩、ポリエチレン、ポリイミン、ポリスチレン、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１３９】
陽イオン性多価電解質は、四級アンモニウムなどの１つ以上のイオン基、貯蔵溶液ｐＨで荷電した一次、二次、又は三次アミン、貯蔵溶液ｐＨで荷電した複素環式化合物、スルホニウム基、又はホスホニウム基を典型的に含有する。
【０１４０】
陰イオン性多価電解質は、カルボン酸基、スルホン酸基及びリン酸基などの１つ以上のイオン基を典型的に含有する。
【０１４１】
さらに、これらのカテゴリーのうちの２つ以上の特徴を有する多価電解質も本発明の方法において使用されてもよい。例えば、ポリアクリルアミドなどの化合物の部分的な加水分解は、アミド基（非イオン性）及びカルボン酸基（陰イオン性）の両者を有する両性多価電解質を生じる。
【０１４２】
陽イオン性多価電解質の例には、以下に制限されるものではないが、ポリビニルアルコールなどの付加ポリマー及び、ポリ（ビニル４−アルキルピリジニウム）、ポリ（ビニルベンジルトリメチル−１アンモニウム）及びポリビニルイミンなどの他のポリビニル化合物、アミノ化スチレン、コレスチラミン、ポリエチレンイミンなどのポリイミン、アミノ化多糖類、特にデキストラン（例、炭酸デキストラン及びＤＥＡＥデキストラン）などの架橋された多糖類、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１４３】
陰イオン性多価電解質の例には、以下に制限されるものではないが、メタンプロパンスルホン酸アクリルアミド（ポリ−ＡＭＰＳ）、ポリ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルメタクリルアミド）及びアクリルアミドの他の陰イオン共重合体などのアクリルアミド、アルキン酸塩及びアルギン酸、アクリル酸塩及びメタクリル酸塩の誘導体のホモポリマー及び共重合体などの付加ポリマー（例、エチルメタクリル酸ヒドロキシル（ポリ−ＨＥＭＡ）、ポリ（２−メタクリル酸ＤＥＡＥ）リン酸）、及びポリ（ポリアクリル酸ナトリウムなどの塩を含むアクリル酸エチル共マレイン酸無水物共酢酸ビニル）ナトリウム、ポリスチレン（例、スルホン酸ポリスチレン、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、ポリスチレンナトリウムスルホン酸ナトリウム（「ＮａＰＳＳ」）、ポリ（無水マレイン酸共スチレン）２−ブトキシエチルエステル、アンモニウム塩）、並びに、遊離ヒドロキシル機能性を有するそれらのエステル及びアミド、ヒアルロン酸塩、陰イオン的に荷電したシクロデキストランなどのオリゴ糖（例、スルホブチルエーテル、β−シクロデキストラン）、ペクチン酸、ポリアクリル酸（例、ポリ（アクリル酸ｄｏエチレン）ナトリウム）、多糖類、デキストラン（例、スルホン酸デキストラン及びヘパリン）などの特に架橋した多糖類、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルホスホン酸、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１４４】
多価電解質として使用するのに適した他の材料には、以下に制限されるものではないが、ヘパリン及びヘパリン誘導体、陰イオン性及び陽イオン性の両者のリポソーム、陰イオン性及び陽イオン性の両者のミセル、ポリビニルピリジンなどのポリアミン、クロロスルホン酸化ポリエチレン、ポリ（４−ｔ−ブチルフェノール共酸化エチレン共ホルムアルデヒド）リン酸、エチル硫酸ポリエチレンアミノステアラミド、ポリ（エチレン共アクリル酸イソブチル共メタクリル酸）カリウム、ポリ（エチレン共アクリル酸イソブチル共メタクリル酸）ナトリウム、ポリ（エチレン共アクリル酸イソブチル共メタクリル酸）ナトリウム亜鉛、ポリ（エチレン共アクリル酸イソブチル共メタクリル酸）亜鉛、ポリ（エチレン共メタクリル酸共酢酸ビニル）カリウム、ポリエチレンイミン、及びポリ（酸化エチレン共ホルムアルデヒド共４−ノニルフェノール）リン酸、アガロース、セルロース（例、ベンゾイル化ナフトイル化ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース、ベンジルＤＥＡＥセルロース、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）セルロース、カルボキシメチルセルロース、リン酸セルロース、ＤＥＡＥセルロース、エピクロロヒドリントリエタノールアミンセルロース、オキシセルロース、スルホキシエチルセルロース及びＱＡＥセルロース）、デンプン、及びそれらの類似物などの架橋された多糖類を含む多糖類、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１４５】
当業者は、「高電荷密度ポリマー」という語の意味を理解するであろう。本明細書で使用される「高電荷密度ポリマー」は、実質的に高い電荷密度を有するよう本分野で典型的に認識されるポリマーを指す。ある実施態様において、高電荷密度ポリマーは、約１ミリ当量／グラム（ｍｅｑ／ｇ）ないし約２０ｍｅｑ／ｇの範囲の電荷密度を有してもよい。別の実施態様において、高電荷密度ポリマーは、少なくとも５ｍｅｑ／ｇの電荷密度を有する。別の実施態様において、高電荷密度ポリマーは、少なくとも１０ｍｅｑ／ｇの電荷密度を有する。
【０１４６】
高分子量の立体的な基は、アプタマー上のいずれかの位置でアプタマーへ結合されてもよい。本発明のある有用な実施態様において、高分子量の立体的な基は、アプタマー配列の５’末端で、又はアプタマー配列の３’末端で、又は５’末端又は３’末端以外の位置でアプタマーへ結合されてもよい。高分子量の立体的な基へ結合するための適切な内部アプタマー配列位置（つまり、５’末端以外又は３’末端以外の位置）の例には、アプタマー核酸配列の１つ以上の塩基上の環外アミノ基、１つ以上のピリミジンヌクレオチドの５の位置、１つ以上のプリンヌクレオチドの８の位置、リン酸塩の１つ以上のヒドロキシル基、又は１つ以上のリボース基の１つ以上のヒドロキシル基が含まれる。
【０１４７】
本発明は、対応する結合していないアプタマーよりも標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有するアプタマー抱合体を同定する方法を提供する。本発明には一般に次の段階が含まれる。すなわち、
ａ）可溶性高分子量の立体的な基へ独立して結合した複数のアプタマー抱合体を提供する段階、
ｂ）これら異別に共役されるアプタマーの各々を独立してリガンド及びリガンドの受容体と接触させる段階、
ｃ）各アプタマー抱合体の存在下でのリガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量を、アプタマー抱合体の不在下でのリガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量と比較する段階
である。
【０１４８】
次に、リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化を阻害する最大の能力を有する特定のアプタマー抱合体を選抜する。それにより、方法は、リガンド／受容体標的に及ぼすアンタゴニスト効果の増強したアプタマー抱合体を同定する。
【０１４９】
ある実施態様において、標的がリガンド又はリガンドの受容体である、標的に及ぼすアンタゴニスト効果の増強したアプタマー抱合体を同定する方法は、アプタマーの５’末端で、３’末端で、及び１つ以上の５’末端以外又は３’末端以外の位置で、約２０ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有し、多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、カルボキシメチルセルロース、セルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド、及びポリエーテルからなる群から選択される可溶性高分子量の立体的な基へ独立して結合された複数のアプタマー抱合体を提供する段階、アプタマー抱合体の各々をリガンド又はリガンドの受容体と接触させる段階、リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量を検出する段階、リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化を阻害する最大の能力を有し、対応する共役していないアプタマーよりもリガンド／受容体標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有するアプタマー抱合体を選抜する段階を含む。
【０１５０】
特定の理論又は作用のメカニズムに対して本発明を制限せずに、アプタマーの立体的な増強から生じるアンタゴニスト活性の拡大の原理は、タンパク質−タンパク質間の相互作用（例、リガンド及びその受容体などの結合パートナーとのあるタンパク質の相互作用を遮断する作用）の混乱に影響するアプタマーへ一般的に適用可能である。
【０１５１】
作用の第一メカニズムにおいて、アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、個別の受容体結合部位を越えてアプタマーの到達が伸展でき、それにより受容体へ結合するリガンドの能力を遮断する。
【０１５２】
アプタマーは、リガンドの受容体結合部位に対して近くの、隣接した、近位の又は遠位の領域にあるリガンドへ結合してもよい。アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、隣接する受容体結合部位を越えてアプタマーの到達が伸展し、それにより受容体へ結合するリガンドの能力を遮断する。アプタマーのこのような立体的な増強の例は図９に示されている。図９は、可溶性高分子量の立体的な基（５）が受容体結合部位（４）を越えて伸展する場合の受容体結合部位（４）に隣接する部位（３）でリガンド（２）へ結合する可溶性高分子量の立体的な基（５）へ抱合されたアプタマー（１）を示す。高分子量の立体的な基（５）は、受容体（７）のリガンド結合部位（６）へ結合するリガンド（２）の受容体結合部位（４）の能力を妨害する。
【０１５３】
類似した方法で、アプタマーは、リガンド結合受容体のリガンド結合部位に対して近くの、隣接した、近位の又は遠位の領域にあるリガンド結合受容体へ結合してもよい。アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、隣接するリガンド結合部位を越えてアプタマーの到達を伸展させ、それによりリガンドへ結合する受容体の能力を遮断する。アプタマーのこのような立体的な増強の例は図１０に示されている。図１０は、可溶性高分子量の立体的な基（５）がリガンド結合部位（６）を越えて伸展する場合のリガンド結合部位（６）に隣接する部位（３）で受容体（7）へ結合する可溶性高分子量の立体的な基（５）へ抱合されたアプタマー（１）を示す。高分子量の立体的な基（５）は、受容体（７）のリガンド結合部位（６）へ結合するリガンド（２）の受容体結合部位（４）の能力を妨害する。
【０１５４】
本発明のある態様において、標的タンパク質が、生理学的ｐＨで全体的な正の電荷によって特徴付けられる塩基性ドメインと同様、生理学的ｐＨで全体的な負の電荷によって特徴付けられる酸性ドメインを有する場合の、結合パートナーへの標的タンパク質の結合を阻害する。本発明のこの態様において、結合パートナーは標的タンパク質の酸性ドメインを通じて結合し、結合パートナーへの標的タンパク質の結合は、標的タンパク質の酸性ドメインへの結合パートナーの結合を立体的に妨げる可溶性高分子量の立体的な基及び標的タンパク質の塩基性ドメインへ結合するアプタマー核酸配列を含む立体的に増強されたアプタマー抱合体と標的タンパク質を接触させることによって阻害され、それにより結合パートナーへの標的タンパク質の結合は阻害される。図１１は、リガンド（左）の塩基性領域へ結合するアプタマーがリガンド受容体（右）へのリガンド結合を効果的に遮断するよう立体的に増強される、立体的に増強されるリガンドアプタマーアンタゴニストのデザインの模式的な表示である。
【０１５５】
作用の第二メカニズムにおいて、アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、リガンドにおけるアロステリック効果を誘発できる。可溶性高分子量の立体的な基はリガンドの高次構造を変化させてもよく、それによりリガンドのその受容体への結合活性を変化してもよい。複数の結合部位を有するリガンドの場合において、アロステリック効果は協調した挙動を生じうる。
【０１５６】
可溶性高分子量の立体的な基へ抱合されたＶＥＧＦアプタマーの活性を、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイによって決定した。アッセイの結果を図４ないし図８に示す。結果は、ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）（図１にその構造が示されるＥＹＥ−００１、ＭａｃＩ）などの立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体が、ＥＹＥ−００２（図２にその構造が示されるＭａｃＩＩ）などの増強されていないＶＥＧＦアプタマーよりもＶＥＧＦ結合を阻害する上で非常により効果的であることを示す。
【０１５７】
５’ペグ化したアプタマーの化学構造の例を図１に示す。多様な５’ペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するアッセイの結果のグラフ呈示を図４に示す。立体的に増強したＶＥＧＦアプタマーの有効性は、添加された可溶性高分子量の立体的な基の分子量と相関した。図４に示されるアッセイは多様な分子量の分岐鎖ＰＥＧを比較した。例えば、２つの２０ｋＤａＰＥＧユニット（２０Ｋ／２０Ｋ分岐鎖）を有する抱合体を、５ｋＤａＰＥＧ（５Ｋ／５Ｋ分岐鎖）を有する抱合体と比較した。図４に示されるアッセイは多様な分子量の直鎖ＰＥＧを比較した。例えば、３０ｋＤａのＰＥＧ（３０Ｋ直鎖）を有する抱合体を１０ｋＤａのＰＥＧ（１０Ｋ直鎖）を有する抱合体と比較した。有意に、抱合していないＰＥＧ単独（コントロール）は、これらの可溶性高分子量の立体的な基がＶＥＧＦ−Ｆｌｔ−１結合に直接的には影響しないが、立体的な基が抱合されたＶＥＧＦアプタマーを通じて作用することを示す、Ｆｌｔ−１へのＶＥＧＦの結合を阻害しなかった。
【０１５８】
デキストランにより共役されたアプタマーの化学構造の例を図１２に示す。デキストラン−ＶＥＧＦアプタマー抱合体の活性を、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイにより決定した。アッセイ結果のグラフ呈示を図５に示す。図４に示されるアッセイは多様な分子量のデキストランも比較した。例えば、７０ｋＤａのデキストラン（７０Ｋデキストラン）を有する抱合体を１０ｋＤａのデキストラン（１０Ｋデキストラン）を有する抱合体と比較した。有意なことに、共役していないデキストラン単独（コントロール）は、これらの可溶性高分子量の立体的な基がＶＥＧＦ／Ｆｌｔ−１結合に直接的には影響しないが、立体的な基が共役されたＶＥＧＦアプタマーを通じて作用することを示す、Ｆｌｔ−１へのＶＥＧＦの結合を阻害しなかった。
【０１５９】
ＣＭＣにより共役されたアプタマーの化学構造の例を図１３に示す。ＣＭＣ−ＶＥＧＦアプタマー抱合体の活性を、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイにより決定した。アッセイの結果を図６に図示する。顕著に、共役していないＣＭＣ単独（コントロール）は、これらの可溶性高分子量の立体的な基がＶＥＧＦ／Ｆｌｔ−１結合に直接的には影響しないが、立体的な基が共役されたＶＥＧＦアプタマーを通じて作用することを示す、Ｆｌｔ−１へのＶＥＧＦの結合を阻害しなかった。
【０１６０】
図７は、多様な分子量及び分子半径（水力学的体積）のＰＥＧ部分を有する多様なペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果を示す。立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体の有効性は、付加された可溶性高分子量の立体的な基の分子量とも相関した。立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体の有効性は、付加された可溶性高分子量の立体的な基の分子半径（水力学的体積）とも相関した。
【０１６１】
図８は、多様な３’ペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果を示す。ＶＥＧＦアプタマーの３’末端へＰＥＧを抱合することは、増強されていないＶＥＧＦアプタマーよりもＶＥＧＦ結合を阻害する上でより効果的であることを示した。結果は、可溶性高分子量の立体的な基がアプタマーの多様な位置に置かれてもよいことも示した。
【０１６２】
本発明は、ａ）荷電分子を生物学的活性分子荷電抱合体を形成する生物学的活性分子へ結合させる段階と、ｂ）生物学的活性分子荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、生物学的活性分子を眼へ送達する方法も提供する。
【０１６３】
本発明は、生物学的活性分子を眼へイオン泳動で送達するのに有用な製剤にも関する。製剤は、荷電分子へ結合した生物学的活性分子を含む。ある実施態様において、製剤は、荷電分子へ抱合された生物学的活性分子と、イオン泳動送達に適した担体とを含む。
【０１６４】
イオン泳動送達に適したいずれかの担体は、本発明において使用できる。適切な担体の例には、以下に制限されるものではないが、米国特許第６，１５４，６７１号、第６，３１９，２４０号、第６，５３９，２５１号、第６，５７９，２７６号、第６，６９７，６６８号、第６，７２８，５７３号、第６，８０１，８０４号及び第６，５５３，２５５号、米国特許出願第２００４／０１６７４５９号、第２００４／００７１７６１号及び第２００３／００６５３０５号及び刊行された出願第ＷＯ２００４／１０５８６４号及び第ＷＯ２００４／０５２２５２号に見られうるものが含まれ、それらの各々の内容はそれらの全体において本明細書に参照によって組み込まれる。
【０１６５】
ある態様において、荷電分子は加水分解的に安定した結合によって生物学的活性分子へ結合される。
【０１６６】
別の態様において、荷電分子は荷電したポリマーを含む。ある実施態様において、荷電したポリマーは多価電解質である。ある実施態様において、荷電したポリマーは高電荷密度ポリマーである。別の実施態様において、電荷したポリマーは、約１ミリ当量／グラム（ｍｅｑ／ｇ）ないし約２０ｍｅｑ／ｇの範囲の電荷密度を含む高電荷密度ポリマーである。別の実施態様において、荷電したポリマーは少なくとも１０ｍｅｑ／ｇの電荷を含む高電荷密度ポリマーである。
【０１６７】
ある実施態様において、荷電したポリマーは陽イオンポリマーである。特定の実施態様において、陽イオンポリマーはキトサンである。
【０１６８】
ある実施態様において、荷電したポリマーは陰イオンポリマーである。特定の実施態様において、陰イオンポリマーはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）である。
【０１６９】
別の態様において、生物学的活性分子は核酸である。ある実施態様において、核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、アプタマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドの概説は、Ａ．Ｍｅｓｍａｅｋｅｒほか（本明細書によってその全体において参考文献により組み込まれる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、３６６−３７４）によって提供される。
【０１７０】
ある特定の実施態様において、生物学的活性分子はアプタマーである。別の実施態様において、生物学的活性分子は抗ＶＥＧＦアプタマーである。別の実施態様において、生物学的活性分子は抗ＶＥＧＦアプタマーであるＥＹＥ−００２であり、構造
Ｔｄ−５’−５’−ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ３’−３’−Ｔｄ
（配列番号１）
を有し、式中、「Ｇｍ」は２’−メトキシグアニル酸を表し、「Ａｍ」は２’−メトキシアデニル酸を表し、「Ｃｆ」は２’−フルオロシチジル酸を表し、「Ｕｆ」は２’−フルオロウリジル酸を表し、「Ａｒ」はリボアデニル酸を表し、「Ｔｄ」はデオキシリボチミジル酸を表す（その全体において本明細書に参照によって組み込まれるＡｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．ほか、刊行された出願第ＷＯ２００５／０１４８１４号を参照。）。
【０１７１】
第一の例において、本発明は、ａ）生物学的活性分子荷電抱合体を形成するよう生物学的活性分子へ荷電分子を加水分解的に安定した結合によって結合する段階と、ｂ）生物学的活性分子荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、生物学的活性分子を眼へ送達する方法に関する。
【０１７２】
第二の例において、本発明は、ａ）核酸荷電抱合体を形成する核酸へ非核酸ポリマーを結合する段階と、ｂ）核酸荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、核酸を眼へ送達する方法に関する。
【０１７３】
第三の例において、本発明は、ａ）陰イオン性高電荷密度ポリマーを加水分解的に安定した結合によってアプタマーへ結合する段階と、ｂ）アプタマーによって荷電された抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、アプタマーを眼へ送達する方法に関する。
【０１７４】
第四の例において、本発明は、ａ）カルボキシメチルセルロース部分又はキトサン部分を抗ＶＥＧＦアプタマーへ結合して、抗ＶＥＧＦアプタマー荷電抱合体を形成する段階と、ｂ）抗ＶＥＧＦアプタマーによって荷電された抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、抗ＶＥＧＦアプタマーを眼へ送達する方法に関する。
【０１７５】
あるいは、本発明は、眼のイオン泳動を増強させる方法に関する。高分子量中性部分へ共役される生物学的活性分子のイオン泳動送達は、高分子量中性部分を匹敵する大きさの荷電分子と置換することによって増強される。例えば、５ｋＤａないし１００ｋＤａのペグ化したアプタマーのイオン泳動を増強する方法は、カルボキシメチルセルロース又はキトサンなどの５ｋＤａないし１００ｋＤａの高電荷密度ポリマーの替わりにポリエチレングリコールを使用することを含む。
【０１７６】
生物学的活性因子荷電部分の抱合体間の結合は、延長した時間、試験管内及び生体内で安定であるべきである。さらに、結合は、イオン泳動送達中などの電流の適用に際して安定であるべきである。イオン泳動において使用するための抱合体は、電流の適用に際して安定である生理学的に安定な結合を有するべきである。例えば、イオン泳動投与のために企図される生物活性因子荷電部分の抱合体について、抱合体は、適切な送達担体における溶解、イオン送達デバイスにおける設置、及び電流の適用に関する整合性を維持すべきである。
【０１７７】
いずれかの適切な電流密度は、本発明の方法において使用されてもよい。ある実施態様において、電流密度は約０．０１ｍＡ／ｃｍ２ないし約５ｍＡ／ｃｍ２で調整可能である。別の実施態様において、電流密度は約０．１ｍＡ／ｃｍ２ないし約５ｍＡ／ｃｍ２で調整可能である。別の実施態様において、電流密度は約０．８ｍＡ／ｃｍ２ないし約５ｍＡ／ｃｍ２で調整可能である。ある実施態様において、電流は約１μＡないし約１０００μＡの範囲で適用される。好ましい実施態様において、電流は約４分間適用される約４００μＡ（１．２ｍＡ／ｃｍ２の密度での０．１２クーロンの電荷）である。
【０１７８】
いずれかの適切な電位は、本発明の方法において使用されてもよい。ある実施態様において、電流は約１Ｖないし約７５Ｖの範囲の電位で送達される。ある実施態様において、電流は約１．５Ｖないし約９Ｖの範囲の、好ましくは約２Ｖないし約８Ｖの範囲の電位で送達される。
【０１７９】
いずれかの適切なイオン泳動デバイスは本発明において使用されてもよい。生物学的活性分子の治療レベルを送達できるいくつもの眼のイオン泳動デバイスは公知である。典型的なクーロンにより調節される眼のイオン泳動デバイスは、１）患者の眼へ適用できる活性製剤、例えば生物学的活性分子の貯蔵器、２）貯蔵器に配置される少なくとも１つの能動電極、３）受動電極及び４）電流発生装置を含む。典型的に、ある能動電極は、角膜周辺にある眼の組織に面するよう配置される表面電極である。このようなイオン泳動デバイスによって、外来治療を実施できる。
【０１８０】
眼と接触した貯蔵器の表面積の範囲によって、イオン泳動デバイスは、局在化した電荷密度システム又は拡散電荷密度システムを使用して必要に応じて作動される。
【０１８１】
本発明において有用なイオン泳動デバイス及び技術の例は本明細書に提供される。
【０１８２】
Ｏｐｔｉｓ Ｆｒａｎｃｅ，Ｓ．Ａ．によって開発されるアイゲート（Ｒ）は２つの部分、すなわち再利用可能なマイクロ発生装置及び使い捨て可能な眼用アプリケーターを含む。使い捨て可能な眼用アプリケーターは、薬物を保持する内側リング、及び、電流が薬物を眼、特に脈絡膜及び網膜へ送達するよう通される伝導性リングを含有する。再利用可能なマイクロ発生装置は、自動調節特性とともに動力を電池で付与され、戻り電極として使用される前頭パッチへ接続される。アプリケーターはそのチューブ、（薬物をアプリケーターへ注入する）シリンジ及び（マイクロ発生装置へ接続されるリード）を有し、滅菌され、ブリスターへと密閉され、その全体は使い捨て可能である。イオン泳動デバイス及びアイゲート（Ｒ）と関連する技術は例えば、米国特許第６，１５４，６７１号及び公開された出願第ＷＯ２００４／１０５８６４号、及び第ＷＯ２００４／０５２２５２号において記載され、各々の内容はそれらの全体において本明細書に参照によって組み込まれる。
【０１８３】
Ｉｏｍｅｄ社によって開発されたオキュフォア（Ｒ）は薬物アプリケーター、散発性電極、及び電子イオン泳動投与量調節器を含む。薬物アプリケーターは、銀−塩化銀インク伝導部品、薬物製剤を吸収するヒドロゲルパッド、投与量調節器へ伝導性部品を接続するための小さな柔軟性のあるワイヤを含有する小さなシリコーンシェルである。薬物パッドは、使用直前に薬物溶液で水和され、アプリケーターは下まぶたの下で眼の強膜上に設置される（「オキュフォア（Ｒ）」： その内容が本明細書にその全体において参考文献により組み込まれる「眼内薬物送達の未来」Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｇ．Ａ．ほか、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，２（５），５０−５２を参照。）。オキュフォア（Ｒ）と関連するイオン泳動デバイスは、例えば米国特許第６，３１９，２４０号、第６，５３９，２５１号、第６，５７９，２７６号、第６，６９７，６６８号、及び第６，７２８，５７３号に記載される。各々の内容は本明細書にその全体において参照によって組み込まれる。
【０１８４】
Ａｃｉｏｎｔ社によって開発されたビジレックス（Ｒ）は、ユーザーに優しいアプリケーター、投与量調節器、及び接続ワイヤからなる。デバイスは、眼の適用のためにデザインされ、ソフトウェア及びアルゴリズム調節部品及び互いに安全性を最適化する多重電極モニターシステムを含有する。アプリケーターは、眼の湾曲へ適合させながら、下部窩へと快適に滑り込む。細く柔軟なワイヤは、アプリケーターを電流調節器へ接続する。戻り電極は、選択的な薬物輸送及び流量増強によって従来のイオン泳動システムを越えて薬物輸送有効性を亢進する膜も含む電気回路ビジュレックス（Ｒ）システムを完成させるため、身体のほかのどこかに位置どられる。外来性の非薬物イオンの輸送を排除することは、薬物イオンを、強膜組織を流れる電流の一次担体にする（その内容が、本明細書にその全体において参照によって組み込まれる「ビジュレックス（Ｒ）：効果的な眼の後部の非侵襲的治療剤のための応用イオン泳動」、Ｈａｓｔｉｎｇｓ，Ｍ．Ｓ．ほか、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，４（３），５３−５７を参照。）。ビジュレックス（Ｒ）に関するイオン流動装置及び技術は例えば、米国特許第６，８０１，８０４号及び６，５５３，２５５号並びに米国特許出願第２００４／０１６７４５９号、２００４／００７１７６１号及び２００３／００６５３０５号に記載されており、各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
他の眼のイオン泳動システムは、Ｊ．Ａｓｈｏｏｋほか（Ｃｅｒａｍａｔｅｃ社）による刊行された出願第ＷＯ０３／０３３９６２２号、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｅｒｔｓほか（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）による米国特許第６，００１，０８８号、及びＤｏｍｂほかによる米国特許第６，４４２，４２３号に記載される。（Ｈａｄａｓｉｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ及びＹｉｓｓｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）各々の内容はその全部において本明細書に参考文献により組み込まれる。
【０１８６】
眼のイオン泳動の文献概説には、「眼のイオン泳動」、Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｍ．ほか、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９９３），５８，３３１−３５４、及び「眼の薬物送達におけるイオン泳動の役割」、Ｓａｒｒａｆ，Ｄほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ （１９９４），１０（１），６９−８１が含まれる。各内容はその全体において本明細書に参照によって組み込まれる。
【０１８７】
生物学的活性分子は、本分野で公知のいずれかの適切な手段によって荷電分子へ結合されてもよい。電荷分子は、活性機能基によって生物学的活性分子へ結合できる。生物学的活性分子と反応するのに適した活性機能基には、以下に制限されるものではないが、カルボキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、硫酸基、リン酸基、ケト基及びアルデヒド基が含まれる。
【０１８８】
別の態様において、本発明は、イオン泳動送達に有用な生物学的活性分子荷電抱合体組成物に関する。
【０１８９】
ある実施態様において、生物学的活性分子荷電抱合体は、式
ＣＭＣ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号１２）
を有する。
【０１９０】
別の実施態様において、生物学的活性分子荷電抱合体は、式
キトサン−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号１３）
を有する。
【０１９１】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の特定の有用な実施態様及び態様を説明するよう機能し、その範囲を制限するとして解釈されるべきではない。代替的な材料及び方法は同様の結果を得るために利用できる。
【実施例１】
【０１９２】
ＶＥＧＦアプタマーの５’−ＰＥＧ抱合体の調製
手段は、４０ｋＤａＰＥＧ／アプタマー抱合体の調製によって説明される。５’アミノアプタマー（５７吸光度）の溶液をエッペンドルフチューブへ転移し、固体へと凍結乾燥させた。残りを３０μｌのホウ酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）へと再度溶解した。ＰＥＧ ＮＨＳエステルの溶液（１．１当量、３０μｌアセトニトリル中の１１ｍｇ）を前述のアプタマー溶液へ添加した。結果として生じる混合物を十分にボルテックスし、室温で一晩インキュベートした。反応を、２．５ｍｌ容積まで水を添加することによって停止させた。ＳＥＣ ＨＰＬＣによる材料の分析は、アプタマー（１０．２３分）が、抱合体に属するより長い保持時間（７．２分、７５％）を有する別の種に変換されたことを示す。
【０１９３】
混合物を標準的な脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ−１０カラム）で脱塩した。脱塩した材料（３．５ｍｌ）を紫外線（９．５吸光度／ｍｌ）により定量し、粗生成物としての乾燥粉末へと濃縮した。固体を水（０．５ｍｌ）中に再懸濁し、結果として生じるストックを精製するまで−２０℃の冷凍庫に保存した。抱合体の単離を、ＳＥＣ ＨＰＬＣを使用してこの溶液（典型的に約５吸光度）の一定分量を注入することによって達成した。精製した抱合体を生じるため、抱合体に対応する溶出された材料を回収し、回転真空機で濃縮し、脱塩した。生成物の同一性を認証するため、生成物を最終的にＨＰＬＣ及びＭＳにより分析した。
【実施例２】
【０１９４】
ＶＥＧＦアプタマーの５’−デキストラン抱合体の調製
手段を、４０ｋＤａデキストラン／アプタマー抱合体を作製することによって説明する。アミノアプタマー（２８．６吸光度）の一定分量を乾燥粉末になるよう凍結乾燥し、１００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に再度溶解した。この溶液へ添加したのは４０ｋＤａデキストラン（４当量、２０ｍｇ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１０当量超、８ｍｇ）であった。材料すべてが溶解するまで溶液をボルテックスした後、６０℃で一晩インキュベートした。次に、溶液を０．５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に取り込んだ。ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）分析は、材料がアプタマー（１０．８分）及び抱合体（９．６分、幅広のピーク、３５％）の混合物であることを示した。幅広のピークは、デキストラン抱合体が異別の大きさの抱合体の幅広い分布を有することを示す。材料をＰＤ−１０カラムによって脱塩し、脱塩した材料を冷凍庫（−２０℃）で精製するまで保存した。
【０１９５】
前述に調製した試料の一定分量を注入することによって、精製をＳＥＣカラム（Ｓｈｏｗｄｅｘ ＫＷ ８０３）上で実施した。抱合体に対応する画分（大気温、９．６分）を回収した。プールした画分を濃縮した後、ＮＡＰ−１０カラムで脱塩し、最終的な精製された材料を生じた。抱合体の同一性を、紫外線検出及び放射線同位体検出の両者でＳＥＣ ＨＰＬＣ（室温、９．６分）によって認証した。
【実施例３】
【０１９６】
ＶＥＧＦアプタマーの５’−ＣＭＣ抱合体の調製
ＶＥＧＦアプタマーの５’−ＣＭＣ抱合体を作製するため、デキストラン抱合体（実施例２参照）を作成するのに使用されるものと同様の手段を使用した。５’−アミノＶＥＧＦアプタマー（２８吸光度）をエッペンドルフチューブ中で固体残渣になるまで凍結乾燥し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１００μｌ）中に溶解した。このため、添加したのは２０ｍｇ（３．２当量）のＣＭＣであった。ＣＭＣの分子量は約５０ｋＤａであった。次に、水のさらなる一定分量（１００μｌ）を添加してＣＭＣポリマーを可溶化し、濃厚な粘性のある溶液を生じた。最終的に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（８ｍｇ）を添加した。６０℃で一晩撹拌した後、反応を、水（約２ｍｌ）で希釈し水中で（３回）透析することによって停止させ、粗抱合材料を生じた。ＳＥＣ ＨＰＬＣは、抱合された生成物の存在を示した（５．８分ないし８．３分）。抱合体に対応する画分を回収して脱遠視、機能検査のための試料を生じた。抱合体は、ＩＥ ＨＰＬＣ上の非常に幅広のピークとして現れ、材料が多価陰イオン性ポリマーであるという事実を反映する。
【実施例４】
【０１９７】
ＶＥＧＦアプタマーの３’−ＰＥＧ抱合体の調製
３’アミノアプタマー（５７吸光度）の溶液をエッペンドルフチューブへ転移し、固体へと凍結乾燥させた。残基を９０μｌのホウ酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）へと再度溶解した。ポリエチレングリコール−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＰＥＧ−ＮＨＳ）エステルの溶液（１．１当量、３０μｌアセトニトリル）を前述のアプタマー溶液へ添加した。結果として生じる混合物を十分にボルテックスし、室温で一晩インキュベートした。反応を、２．５ｍｌ容積まで水を添加することによって停止させた。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣによる材料の分析は、アプタマーが、抱合体に属するより非常に長い保持時間を有する別の種に変換されたことを示す。
【０１９８】
混合物を標準的な脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ−１０カラム）で脱塩した。脱塩した材料（３．５ｍｌ）を紫外線により定量し、粗生成物としての乾燥粉末へと濃縮した。固体を水（０．５ｍｌ）中に再懸濁し、結果として生じるストックを精製するまで−２０℃の冷凍庫に保存した。抱合体の単離を、ＳＥＣ ＨＰＬＣを使用してこの溶液（典型的に約５吸光度）の一定分量を注入することによって実施した。精製した抱合体を生じるため、抱合体に対応する溶出された材料を回収し、回転真空機で濃縮し、脱塩した。生成物の同一性を認証するため、生成物を最終的にＨＰＬＣ及びＭＳにより分析した。
【実施例５】
【０１９９】
アミン含有アプタマーの二機能性リンカーへの共役
ホスホジエステル結合によって５’末端へ結合されるヘキシルアミンリンカーを含有する２８マーのオリゴヌクレオチド（配列番号８）の１．３０μモルをホウ酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）の２００μｌに溶解し、アセトニトリルの２００ｌ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル含有二機能性リンカー（８．０μモル）の溶液を室温で添加した。結果として生じる反応混合物を室温で１８時間振盪させた後、脱イオン水で３ｍｌへ希釈し、１ｋＤａ膜に対して３５２０×ｇで４時間撹拌しながら透析した。結果として生じる濃縮物を３ｍｌまで再度希釈し、２回目の撹拌しながらの透析を実施した。次に、結果として生じる濃縮物を凍結乾燥し、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ−１、Ｃ１８）及びＭＡＬＤＩ−ＭＳによって修飾を査定した。二機能性リンカー（６−マレイミドカプロン酸；スクシンイミジル−２−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）酢酸；Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ； Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯから購入した。アプタマーへの二機能性リンカーの共役を表す一般的な合成スキームを図１６に示す。
【実施例６】
【０２００】
ＢＳＡへのアプタマーの共役
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の、チオール反応性二機能リンカーで修飾しておいたアプタマー（配列番号８）への共役を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＰＯ３、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．７）中で実施した。ＢＳＡ溶液（６９２μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ）をアプタマー抱合体（３００μｌ中の３００ｎＭ）の溶液へ添加し、大気温で４時間室温にて振盪した。反応混合物を分析し、さらなる処理なしで逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａｐａｋ，Ｃ１８）上での精製へ供した。ＢＳＡをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【実施例７】
【０２０１】
デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）へのアプタマーの共役
デンドリマーの溶液（Ｇ６、シスタミン中心、ＮＨＡｃ表面；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）をメタノールに溶解した（５０μｌ中２．１ｍｇ）後、リン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＰＯ３、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．７）の５０μｌ中のトリスカルボキシエチルホスフィン（５０ｍｇ）で処理し、大気温で３０分振盪した。アプタマー（チオール反応性二機能リンカー（３．０ｍｇ）で修飾された配列番号８）の溶液を、アプタマーをリン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＰＯ３、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．７）の１００μｌへ添加することによって調製した。次に、アプタマー溶液をデンドリマー溶液へ添加し、生じた溶液を室温で１時間撹拌した。溶液を凍結乾燥し、生成物を特徴づけ、サイズ排除クロマトグラフィー（順にＳｈｏｄｅｘ ＫＷ−８０３及びＫＷ−８０４）によって精製した。
【実施例８】
【０２０２】
立体的に増強したＩＣＡＭ、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストアプタマー
ＫＤＲ／ＦＬＫ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ２）、ＦＬＴ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）及びＶＥＧＦ共受容体ニューロピリンへのＶＥＧＦの結合を阻害する立体的に増強したＶＥＧＦアプタマーの能力を次に様に査定する。立体的に増強されたアプタマーによる結合の阻害を、増強されていないアプタマーによる阻害と比較する。
【０２０３】
ＬＦＡ−１への結合を阻害する立体的に増強したＩＣＡＭ−１アプタマーの能力も同様の手段を使用して検討する。ＰＤＧＦ受容体−β（ＰＤＧＦＲ−β）に対するＰＤＧＦの結合を阻害する立体的に増強したＰＤＧＦアプタマーの能力も同様の手段を使用して検討する。
【実施例９】
【０２０４】
受容体プレートコーティング
結合実験の各セットについて、９６穴アイソプレートの１行（１２穴）を使用する。１２穴の各々をまず、ＰＢＳの１００マイクロリットル（μｌ）中の抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片特異的抗体の２ピコモル（３００ナノグラム（ｎｇ））で、４℃で一晩コーティングする。翌日、各ウェルに結合するタンパク質を、Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液の３００μｌを使用して室温で各回５分で３回洗浄することによってブロックする。次に、各ウェルを室温で２回、結合緩衝液（１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ＨＳＡ、ｐＨ７．４を有するＰＢＳ）の３００μｌで洗浄する。ＫＤＲ／Ｆｃについて、結合緩衝液の１００μｌ中のキメラ受容体の０．２５ピコモル（８５ｎｇ）を最初の１１穴へと添加するのに対し、１２番目のウェルは背景コントロールウェルとしてヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃキメラタンパク質の０．５ピコモル（１１８ｎｇ）を受容する。Ｆｌｔ−１／Ｆｃについて、各結合緩衝液の１００μｌ中のキメラ受容体の０．１２５ピコモル（３０．８ｎｇ）を最初の１１穴へと添加するのに対し、背景コントロールウェル（１２番）はヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃキメラタンパク質の０．５ピコモル（１１８ｎｇ）を受容する。ニューロピリン−１／Ｆｃについて、結合緩衝液の１００μｌ中のキメラ受容体の０．２ピコモル（４８ｎｇ）を１２穴すべてへ添加する。キメラ受容体及びヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質を、各ウェル中の固定した抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片特異的抗体へ室温で２時間ないし３時間結合することによってウェルへと捕捉する。遊離キメラ受容体及びヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質を除去するため、各ウェルを結合緩衝液の３００μｌを使用して室温で洗浄する。
【実施例１０】
【０２０５】
１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５−ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）結合混合物の調製
１μＭ（又は２μＭ）ないし０．５１２ピコモラー（ｐＭ）（又は１．０２４ｐＭ）の範囲のペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）（チューブ１番ないし１０番）の１０個の５倍希釈物の１セットを各々、総計各１００μｌ終容積における穿孔していない１．５ｍｌμ微量遠心チューブ中の結合緩衝液（１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ＨＡＳ、ｐＨ７．４を有するＰＢＳ）中の１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５の約０．０１μＣｉと混合する。チューブ１１番及び１２番について、１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５のたったの０．０１μＣｉをいずれのペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）もなしで添加し、それらはそれぞれポジティブコントロール及び背景コントロールである。１２本のチューブすべてを（ＫＤＲ及びＦｌｔ−１について）３７℃又は（ニューロピリン−１について）室温で１５分ないし２０分インキュベートし、平衡に達するまでペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）をＶＥＧＦへ結合させる。次に、各チューブからの１００μｌの結合混合物を、受容体によりコーティングしたアイソプレート上の対応するウェルへ適用する。プレートを結合平衡が生じるまで３７℃で（ＫＤＲ用及びＦｌｔ−１用）又は室温で（ニューロピリン−１用）２時間ないし３時間インキュベートする。プレートを室温で、０．０５％トゥイーン２０入り（ＫＤＲ用及びニューロピリン−１用）またはなし（Ｆｌｔ−１用）の結合緩衝液の３００μｌ／ウェルで４回洗浄する。プレートを約１０分間空気乾燥し、シンチレーション液の約２００μｌを各ウェルへ添加する。各ウェルの放射能活性をシンチレーション計数により決定する。
【０２０６】
実験のネガティブコントロールについて、ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）について前述の段階すべての後、結合アッセイにおいてペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）を置換するためにポリエチレングリコール分子量４０，０００（４０ｋＤａＰＥＧ）を同一モル濃度で使用する。
【実施例１１】
【０２０７】
ＶＥＧＦ受容体結合の５０％阻害（ＩＣ５０）についての効果的な濃度の決定
ウェルにおける１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５：受容体結合比を、ウェル（１番ないし１１番）上に保持される計数の数から背景（ウェル１２番）を差し引いたものを、最大結合（ポジティブコントロール、ウェル１１番）から背景（ウェル１２番）を差し引いたものによって除するものとして計算する。異別のペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）濃度での結果として生じる結合比を、グラフパッドＰＲＩＳＭプログラム（１部位競合）による非線形回帰を使用することによって分析し、結果として生じる曲線を使用して、ＶＥＧＦ１６５への受容体結合を阻害する上でのペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）の最大半量阻害（ＩＣ５０）を決定する。ＰＥＧを使用する実験のネガティブコントロールからのデータを同一方法によって分析する。
【実施例１２】
【０２０８】
ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）の比較阻害
ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦ結合を阻害する立体的に増強されたＶＥＧＦアプタマー抱合体の能力を、立体的に増強されていないＶＥＧＦアプタマー抱合体の能力と比較した。結果を図４、図５、図６、図７及び図８に示す。結果は、ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）（図１にその構造が示されるＥＹＥ−００１、ＭａｃＩ）などの立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体が、ＥＹＥ−００２（図２にその構造が示されるＭａｃＩＩ）などの増強されていないＶＥＧＦアプタマーよりもＶＥＧＦ結合を阻害する上で非常により効果的であることを示す。さらに、立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体の有効性は、添加した可溶性高分子量の立体的な基の分子量と相関した（２０Ｋ／２０Ｋ分岐を５Ｋ／５Ｋ分岐と、及び３０Ｋ直鎖を１０Ｋ直鎖と比較する。）。立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体の有効性は、付加された可溶性高分子量の立体的な基の分子半径（水力学的体積）とも相関した。有意なことに、抱合していないＰＥＧ、デキストラン又はＣＭＣ単独も、これらの可溶性高分子量の立体的な基はＶＥＧＦ／Ｆｌｔ−１結合に直接的には影響しないが、立体的な基が抱合されたＶＥＧＦアプタマーを通じて作用することを示す。
【０２０９】
ＶＥＧＦアプタマーの３’末端へＰＥＧを共役することが、増強されていないＶＥＧＦアプタマーよりもＶＥＧＦ結合を阻害する上でより効果的であったことを示す結果は、可溶性高分子量の立体的な基がアプタマー上の多様な位置に存在するかもしれないことを示した。
【実施例１３】
【０２１０】
ＩＣＡＭ−１の立体的に増強したアプタマーアンタゴニストのデザイン
ＩＣＡＭ−１は細胞間接着分子である。ＩＣＡＭ−１は単回膜貫通タンパク質であり、内皮細胞及び特定の血球細胞タイプに主として存在する５個のＩｇ様細胞外ドメインを有する。ＩＣＡＭ−１は、接着受容体のインテグリンファミリーに属する２つの十分に認識された受容体ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１を有する。ＩＣＡＭ−１のドメイン１は、ＬＦＡ−１相互作用ドメインであり、たいていの薬物開発アプローチの焦点である。しかしながら、ＩＣＡＭ−１のこのドメインは非常に酸性であり（４．５ないし５のｐＩ）、したがってＩＣＡＭ−１へ直接結合することによってＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を直接遮断できるアプタマー配列について選抜すること又はさもなくばアプタマー配列をデザインすることは困難である。対照的に、ＩＣＡＭ−１の隣接するドメイン２は非常に塩基性であり（ｐＩ８ないしｐＩ９．５）、したがってより影響を受けやすいアプタマー結合領域である（図３（Ａ）及び図１１の左を参照。）。
【０２１１】
したがって、ＩＣＡＭ−１の塩基性ドメイン２を、ＩＣＡＭ−１のこの領域に対する高い親和性で結合するアプタマー配列を選抜するのに使用する。次に、高分子量の可溶性の立体的な基をアプタマーへ添加して、ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１の隣接するドメイン１との相互作用の立体的な阻害に影響を及ぼす（図１１、右）。アプタマーは、高分子量の立体的な基が、ＩＣＡＭ−１の酸性ＬＦＡ−１結合ドメインを遮断させるであろうアプタマーの端へ結合する一方、足場又はアンカーとして機能する。
【実施例１４】
【０２１２】
カルボキシメチルセルロースへ抱合された抗ＶＥＧＦアプタマーのイオン泳動
クーロンにより調節されるイオン泳動（ＣＣＩ）システムであるイオン泳動は、ＯＰＴＩＳ Ｆｒａｎｃｅによってデザインされる薬物送達デバイスを使用して実施できる（その全体において本明細書に参照によって各々組み込まれる米国特許第６，１５４，６７１号、及びＯｐｔｉｓによる第ＷＯ０２／０８３１８４号を参照。）。眼のカップの形態の容器を、経角質強膜（ｔｒａｎｓｃｏｒｎｅｏｓｃｌｅｒａｌ）イオン泳動を可能にするようデザインする。白金電極を容器の底へ置き、２つのシリコーンチューブを側部に設置する。カルボキシメチルセルロースへ抱合された抗ＶＥＧＦアプタマーを含むイオン泳動製剤を容器へ添加する。塩類溶液を注入するため１本のチューブを使用し、その他は気泡を吸引するのに使用する。ＣＣＩ電子ユニットは２，５００マイクロアンペア（μＡ）まで６００秒間送達できる。聴覚視覚警報は、生成物の較正され調節された送達を確実にする電子回路における各混乱を示す。イオン泳動処理を使用して進行するため、カルボキシメチルセルロースへ抱合された抗ＶＥＧＦアプタマーを含むイオン泳動製剤を含有するＣＣＩ眼用カップを眼に設置し、もう片方の電極を対象と接触して維持する。
【実施例１５】
【０２１３】
カルボキシメチルセルロースへ抱合された抗ＶＥＧＦアプタマーのイオン泳動
カルボキシメチルセルロースへ抱合された抗ＶＥＧＦアプタマーのイオン泳動送達を、塩化銀コーティングした銀ホイル電流分配部品で裏打ちされた１８０μｌのシリコーン受容器シェル、接続器リード線、及び抗ＶＥＧＦアプタマー抱合体が投与される、ヒドロゲルにより浸漬されるポリビニルアセタルマトリクスの単一層からなる眼用ウサギ眼アプリケーター（ＩＯＭＥＤ社、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）を使用して実施する。アプリケーターの接触表面積は０．５４ｃｍ２である。アプリケーターを、角膜強膜接合部から１ｍｍないし２ｍｍ遠位の前側縁を有する角膜縁のところの上位窩におけるニュージーランドシロウサギ（３ｋｇないし３．５ｋｇ）の右眼における強膜上に置く。直流陽極イオン泳動を、ＰｈｏｒｅｓｏｒII（Ｒ）ＰＭ７００（ＩＯＭＥＤ社、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）電源を使用して２ｍＡ、３ｍＡ、及び４ｍＡで２０分間、各アプリケーターを使用して実施する。受動的イオン泳動（０ｍＡで２０分間）をコントロールとして使用する。
【０２１４】
本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、及び刊行された参考文献は、それらの全体において本明細書に参照によって組み込まれる。
【０２１５】
均等物
当業者は、定型的な実験操作に過ぎない操作を用いて、本明細書に具体的に記載されている具体的な実施形態に対して多数の均等物を認識し、又は想到することが可能であろう。このような均等物は、以下に記載されている請求項の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】図１は、ペグ化したＶＥＧＦアンタゴニストアプタマーＥＹＥ００１（Ｍａｃｕｇｅｎ（Ｒ）、ペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ））の化学構造の模式的な表示である。
【図２】図２は、５’−５’キャップしたＶＥＧＦアンタゴニストアプタマーＥＹＥ００２（つまり、ＭａｃＩＩ、配列番号１）の化学構造の模式的な表示である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５２７０９（配列番号２）に対応するヒト細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）前駆体のポリペプチド配列の模式的な表示である。２７のアミノ酸（ａ．ａ．）のＮ末端シグナルペプチドの配列は陰影を付され、成熟ペプチド（ａ．ａ．２８ないし５３２）における塩基性アミノ酸残基は太字で示され、成熟ペプチドにおける酸性アミノ酸残基は下線を付されて示されている。
【図３Ｂ−１】図３Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０３１３２（配列番号３）に対応するヒトＩＣＡＭ−１をコード化する核酸配列のヌクレオチド配列の模式的な表示である。ＩＣＡＭ−１前駆体タンパク質の開いた読み枠の開始コドン及び終止コドンは下線を付されている。
【図３Ｂ−２】図３Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０３１３２（配列番号３）に対応するヒトＩＣＡＭ−１をコード化する核酸配列のヌクレオチド配列の模式的な表示である。ＩＣＡＭ−１前駆体タンパク質の開いた読み枠の開始コドン及び終止コドンは下線を付されている。
【図４】図４は、多様な５’ペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果のグラフ表示である。
【図５】図５は、多様なデキストラン−ＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果のグラフ表示である。
【図６】図６は、多様なカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）−ＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果のグラフ表示である。
【図７】図７は、多様な分子量及び分子半径（水力学的体積）のＰＥＧ分子を有する多様なペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果のグラフ表示である。
【図８】図８は、多様な３’ペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果のグラフ表示である。
【図９】図９は、リガンドへ結合し、それによりリガンド及び受容体の相互作用を阻害する、立体的に増強されたアプタマーの模式的な表示である。
【図１０】図１０は、受容体へ結合し、それによりリガンド及び受容体の相互作用を阻害する、立体的に増強されたアプタマーの模式的な表示である。
【図１１】図１１は、ＩＣＡＭ（左）の塩基性領域へ結合するアプタマーがＩＣＡＭ受容体ＬＦＡ−１（右）へのＩＣＡＭ結合を効果的に遮断するよう立体的に増強される、立体的に増強されるＩＣＡＭアプタマーアンタゴニストのデザインの模式的な表示である。
【図１２】図１２は、デキストランにより結合されたアプタマーの一般的な化学構造の模式的な表示である。
【図１３】図１３は、カルボキシメチルセルロースにより結合されたアプタマーの一般的な化学構造の模式的な表示である。
【図１４】図１４は、ＢＳＡをアプタマーへ結合するための一般的な合成方法の模式的な表示である。
【図１５】図１５は、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）をアプタマーへ結合するための一般的な合成方法の模式的な表示である。
【図１６】図１６は、二機能性リンカーをアプタマーへ結合するための一般的な合成方法の模式的な表示である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００４年４月１３日に出願した米国仮出願第６０／５６１，６０１号の、及び２００５年３月４日に出願した米国仮出願第６０／６５８，８１９号の利点を請求する。前述の出願の全体の教示は、本明細書に参照によって組み込まれる。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、アプタマー又は核酸リガンドに関する。特に、本発明は、タンパク質結合対、特に（血管新生又は血管形成と関連したタンパク質結合対などの）疾病又は疾患の治療において標的にされるかもしれないタンパク質結合対を標的にするアプタマーの１つ以上のアンタゴニスト特性を増強又は増大するための方法に関する。本発明は、荷電分子を生物学的活性分子へ結合し、生物学的活性分子をイオン泳動によって送達することによる、生物学的活性分子の眼内送達のための方法及び製剤にも関する。
【背景技術】
【０００３】
アプタマー又は核酸リガンドは、古典的なワトソン−クリック塩基対以外の相互作用を通じて、分子、特にタンパク質へ特異的に結合する核酸分子である。ファージディスプレイ又はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）によって生じるペプチドと同様、アプタマーは選択された標的へ特異的に結合でき、それにより、アプタマーの標的の機能する能力を遮断する。特定の標的をターゲットにするための適切なアプタマー配列は、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）と呼ばれるプロセスを使用する無作為配列オリゴヌクレオチドのプールから開始する試験管内選抜プロセスを使用して解明できる。ＳＥＬＥＸは、いずれかの標的に対する適切な結合親和性及び特異性を有する特異的な配列について迅速にオリゴヌクレオチドの莫大な数がスクリーニングされる組み合わせ化学方法論である。このプロセスを使用して、特定の標的に特異的な新規のアプタマー核酸リガンドが作製される。このようなアプタマーは、特定に選択された標的へ結合する特異的な３次元構造を採用する。典型的なアプタマーは１０ｋＤａないし１５ｋＤａの大きさ（３０ヌクレオチドないし４５ヌクレオチド）であり、ナノモルを下回る親和性でその標的を結合し、密接に関連した標的に対して識別する（例、同一遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質を典型的に結合しないであろう。）。一連の構造研究は、抗体／抗原複合体において親和性及び特異性を駆動する結合相互作用（水素結合、静電気的相補性、疎水性接触、立体的排除、等）の同一タイプをアプタマーが使用できることを示してきた。一度、特定の標的へ結合するための適切なアプタマー配列が解明されると、治療用アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスとは無関係に大量に直接化学的に合成されてもよい。
【０００４】
例えば、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）の作用を遮断する拮抗性ＶＥＧＦアプタマー阻害剤が開発されてきた。抗ＶＥＧＦアプタマーは、ヒトＧＶＥＧＦの１６５ｋＤａ分子種へ高い親和性で結合する小さな安定性のあるＲＮＡ様分子である。このようなＶＥＧＦアプタマーは、乾癬、眼の疾患、コラーゲン循環器疾患及び新生物性疾患を含む血管形成を包含する多様な疾病におけるＶＥＧＦリガンドの役割によって広範囲の臨床上の有用性を有する。一般にＳＥＬＥＸプロセス、特にＶＥＧＦアプタマー及び製剤は、例えば米国特許第５，２７０，１６３号、第５，４７５，０９６号、第５，６９６，２４９号、第５，６７０，６３７号、第５，８１１，５３３号、第５，８１７，７８５号、第５，８４９，４７９号、第５，８５９，２２８号、第５，９５８，６９１号、第６，０１１，０２０号、第６，０５１，６９８号、第６，１４７，２０４号、第６，１６８，７７８号、第６，４２６，３３５号、及び第６，６９６，２５２号に記載されており、それらの各々の内容は本明細書に参照によって明確に組み込まれる。
【０００５】
アプタマーの高分子量の非免疫原性及び親油性化合物との複合体が記載されてきた。例えば、米国特許第６，０１１，０２０号は、アプタマーの安定性などの薬物動態学的特性を改善するために（つまり、アプタマーの生体内循環半減期を亢進させるために）、高分子量の非免疫原性及び親油性化合物を有するアプタマー複合体を形成することを開示する。さらに、米国特許第６，０５１，６９８号は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する特異的親和性を有するアプタマーの高分子量の非免疫原性複合体を開示する。多様な生物学的標的へ結合する高親和性のアプタマーの選抜、及びこのようなアプタマーの生体内での安定性を増強する修飾は記載されてきたが、このようなアプタマーのアンタゴニスト特性を増強するための組成物及び方法は、アプタマー技術の実際の治療上の可能性を増大させる上で有用であろう。
【０００６】
眼には解剖学的、生理学的及び生化学的に、眼の組織を外来物質に対して不浸透性にさせるいくつもの防御遮蔽があるため、眼への薬物送達は興味深い。活性因子を眼へ投与するために使用される技術には、全身性経路、眼内注入、眼の周りへの注入、眼内インプラント、及び局所適用が含まれる。このような侵襲性眼内投与は、患者に不快感を与え、時には恐怖感を与え、一方で永久的な組織損傷の危険性があるため、好ましくない。
【０００７】
点眼剤などの処方における局所的に適用される薬物の眼の生物学的利用能は非常に乏しい。眼における薬物の吸収は、眼の適切な機能を確実にするいくつかの保護的なメカニズムによって、及び例えば浸み込ませた溶液の排水、流涙、涙の蒸発、結膜の吸収、角膜の浸透性の乏しさ、涙中のタンパク質による結合、及び代謝などの非保護的吸収／吸着といった他の付随した因子によって著しく制限されている。
【０００８】
送達のための代替的なアプローチには、原位での活性化されたゲルを形成する系、粘液接着製剤、眼内浸透増強剤及び眼内挿入物が含まれる。原位での活性化されたゲルを形成する系は、眼における設置に際して粘性増加を経験する液体担体であり、したがって角膜前保持に適する。粘性におけるこのような変化は、温度、ｐＨ又は電解質組成における変化によって惹起できる。粘液接着性剤は、結膜のムチンへの非共有結合を介して接着するポリマーを含有する担体であり、したがってムチンの代謝回転がポリマーの放出を生じるまで、製剤の角膜前組織との接触を確実にする。眼への浸透増強剤は主として、細胞膜を破壊し投与量依存的方法で細胞溶解を生じることによって上層の細胞の浸透性を増強させるために角膜へ適用される表面活性剤である。眼内挿入物は、結膜嚢に置かれ、比較的低速で薬物を送達するよう企図された固体デバイスである。あるこのようなデバイスは、Ａｌｚａ社製のＯｃｕｓｅｒｔ（Ｒ）であり、共重合体でできた２つの徐放性膜によって封鎖される薬物貯蔵体からなる拡散ユニットである。Ｍ．Ｆ．Ｓａｅｔｔｏｎｅは、眼の送達へ傾注した絶え間ない努力の概説を提供する。（「眼内薬物送達における進展及び問題」、Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｂｒｉｅｆｉｎｇ： Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２００２，１６７−１７１）。
【０００９】
イオン泳動は、イオン性分子を生物学的組織へと導入する局所的な電流を使用する薬物送達プロセスである。イオン泳動は、電気輸送、イオン性薬物投与、イオン療法（ｉｏｎｔｏｔｈｅｒａｐｙ）、及び起電性薬物投与（ＥＭＤＡ）とも呼ばれる。イオン泳動は、組織を通じての生物学的活性分子の「オンデマンド式」送達を提供する。
【００１０】
しかしながら、高分子量ＰＥＧの生物学的活性分子への結合は、生物学的活性分子のイオン泳動送達を妨害する可能性がある。ＰＥＧの分子量のサイズ制約及び複雑性がイオン泳動送達の実用性を制限することがありうる。それゆえ、結合した生物学的活性分子を送達し、永久的な組織損傷及び患者の不快感を生じることなく眼の保護的な遮蔽を回避する、簡便で患者に優しい方法が入手できていないままである。前述の問題に関して、生物学的活性分子のイオン泳動による送達を増強するための方法及び製剤についての必要性がある。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、可溶性高分子量の立体的な基のアプタマーへの付加がアプタマーの本質的なアンタゴニスト特性を増大させるという知見に一部基づいている。特に、本発明は、抗ＶＥＧＦのペグ化した形態が、ペグ化していないアプタマーの形態を上回るＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）のアンタゴニスト活性を拡大したという知見に関する。さらに、特定の理論又は作用のメカニズムに対して本発明を制限せずに、アプタマーの立体的な増強から生じる拡大したアンタゴニスト活性の原理は、タンパク質間の相互作用（リガンド及びその受容体などの結合パートナーとのあるタンパク質の相互作用を遮断する作用）の混乱に影響するアプタマーへ一般的に適用可能である。
【００１２】
したがってある態様において、本発明は、可溶性高分子量の立体的な基がアプタマーの少なくとも１つのアンタゴニスト特性を増大させる、アプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ、アプタマーに沿ったいずれかの位置で結合することによってリガンド又はその受容体へ指向するアプタマーのアンタゴニスト特性を増大させる方法を提供する。
【００１３】
より広い態様において、立体的に増強したアプタマーは、第二タンパク質と相互作用するタンパク質を標的にし、可溶性高分子量の立体的な基へのアプタマー配列の結合は結果的に、タンパク質の第二タンパク質（つまり、標的タンパク質の結合パートナー）との相互作用を妨害するアプタマーの能力における増大を生じる。立体的に増強されるアプタマーはそれゆえ、標的タンパク質へ指向するアプタマーのアンタゴニスト特性を増大させる。
【００１４】
別の態様において、リガンドが複数の受容体へ結合し、リガンド結合アプタマーが複数の受容体の少なくとも１つのリガンド依存性活性化を効果的に拮抗することに失敗する、リガンド結合アプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させる方法を提供する。この態様において、本発明の方法は、アプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合するために提供し、それにより、可溶性高分子量の立体的な基へ結合する場合、アプタマーはアプタマー核酸配列が単独では効果的には拮抗しない１つ以上の受容体のリガンド依存性活性化を効果的に拮抗する。
【００１５】
関連した態様において、本発明は、受容体が複数のリガンドへ結合し、受容体結合アプタマーが複数のリガンドの少なくとも１つのリガンド依存性活性化を効果的に拮抗するのに失敗する場合の受容体結合アプタマーのリガンドアンタゴニスト範囲を増大させる方法を提供する。この態様において、本発明の方法は、アプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合するために提供し、それにより、可溶性高分子量の立体的な基へ結合する場合、アプタマーは、アプタマー単独によってさもなくば効果的には拮抗しない１つ以上のリガンドのリガンド依存性活性化を効果的に拮抗する。
【００１６】
ある実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はデキストランである。 他の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリエチレングリコールである。さらに他の特に有用な実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基は、多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（Ｒ）などの）高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド、又はポリエーテルであってもよい。特定の実施態様において、ポリエステル基は、共ブロック重合体のポリエステル基であってもよい。他の実施態様において、アルギン酸基は、ナトリウム又はカルシウムなどの陽イオン性対イオンを有する塩として提供される陰イオン性アルギン酸基であってもよい。さらなる実施態様において、ポリアルデヒド基は、合成的に派生されるか又はオリゴ糖の酸化によって得られるかのいずれかであってもよい。特に有用な実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基は、約２０ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である。
【００１７】
本発明の前述の態様の特に有用な実施態様において、アプタマーはＶＥＧＦ−Ａへ指向される。他の特定の実施態様において、アプタマーはＦｌｋ／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、又はＦｌｔ−４（ＶＥＧＦＲ−３）などのＶＥＧＦ受容体へ指向される。さらなる実施態様において、アプタマーは、ニューロピリン（例、ニューロピリン−１又はニューロピリン−２）などのＶＥＧＦ共受容体へ指向される。さらに他の実施態様において、アプタマーによって標的にされるＶＥＧＦ共受容体は、Ｖ３インテグリン又はＶＥ−カドヘリンである。
【００１８】
さらなる実施態様において、アプタマーはいずれかの公知のリガンド又はその受容体へ指向される。本発明のさらに有用な実施態様において、アプタマーはＩＣＡＭ−１又はそれの結合するＬＦＡ−１などの接着分子へ指向される。本発明の立体的に増強されるアプタマー抱合体による標的化のためのリガンド及び／又はそれらの受容体の例には、それらに制限を加えるものではないが、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、及びＦＧＦが含まれる。標的化のためのさらなるリガンド及び／又はそれらの受容体には、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、又はＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどの他の造血因子、トロンボポエチン、幹細胞因子、及びエリスロポエチン、肝細胞成長因子／ＮＫ１又はアンジオポエチンＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙなどの血管新生を調節する因子、及び又はヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。本発明の組成物で標的化するための特定の他の因子には、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質−１などのＢＭＰ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ及びＩＢなどの骨形態形成タンパク質受容体、神経栄養因子、走化性因子、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０などのＣＤタンパク質、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γなどのインターフェロン、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１ないしＩＬ−１０などのＩＬ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊加速因子、例えばエイズ外被の一部などのウィルス抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭなどのインテグリン、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原、及び前述のポリペプチドのいずれかの断片、組み合わせ及び／又は変異体が含まれる。
【００１９】
本発明にはさらに、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎほかによって提供されるアプタマーデータベースに集積されるものなどの例えばリガンド又はその受容体を標的にする公知のアプタマー核酸配列のいずれかを含む組成物が含まれる（Ｌｅｅ ＪＦ，Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ ＪＲ，Ｍｅｙｅｒｓ ＬＡ，Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ「アプタマーデータベース」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，１月１日号；３２（データベース号）： Ｄ９５−Ｄ１００）。
【００２０】
本発明のある有用な実施態様において、高分子量の立体的な基は、アプタマー配列の５’末端で、又はアプタマー配列の３’末端で、又は５’末端以外の又は３’末端以外の位置でアプタマーへ結合されてもよい。高分子量の立体的な基へ結合するための適切な内部アプタマー配列位置（つまり、５’末端以外又は３’末端以外の位置）の例には、アプタマー核酸配列の１つ以上の塩基上の環外アミノ基、１つ以上のピリミジンヌクレオチドの５の位置、１つ以上のプリンヌクレオチドの８の位置、リン酸塩の１つ以上のヒドロキシル基、１つ以上のリボース基の１つ以上のヒドロキシル基が含まれる。
【００２１】
別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦアプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させる方法を提供する。この態様において、最初のＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦへ結合するが、少なくとも１つのＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ依存性活性化を効果的に拮抗するのに失敗する核酸配列である。本発明のこの態様によって、ＶＥＧＦアプタマーは可溶性高分子量の立体的な基へ結合し、それにより結果として生じるＶＥＧＦアプタマー抱合体はＶＥＧＦアプタマーが効果的に拮抗するのに最初に失敗する少なくとも１つのＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ依存性活性化を効果的に拮抗し、それによりＶＥＧＦアプタマーの受容体アンタゴニスト範囲は増大する。
【００２２】
関連した態様において、本発明は、ＶＥＧＦアプタマーのリガンドアンタゴニスト範囲を増大させる方法を提供する。この態様において、最初のＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦへ結合するが、少なくとも１つのＶＥＧＦリガンドによってＶＥＧＦ依存性活性化を効果的に拮抗するのに失敗する核酸配列である。本発明のこの態様によって、ＶＥＧＦＲアプタマーは可溶性高分子量の立体的な基へ結合し、それにより結果として生じるＶＥＧＦＲアプタマー抱合体はＶＥＧＦＲアプタマーが拮抗するのに最初に失敗する少なくとも１つのＶＥＧＦリガンドによってＶＥＧＦＲ依存性活性化を効果的に拮抗し、それによりＶＥＧＦＲアプタマーのリガンドアンタゴニスト範囲は増大する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、対応する結合していないアプタマーよりも標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有するアプタマー抱合体を同定する方法を提供する。本発明のこの態様において、標的は、リガンド又はリガンドの受容体であってもよい。方法には一般に、アプタマーの５’末端で、３’末端で、又は必要に応じて１つ以上の非５’末端位置又は１つ以上の非３’末端位置で可溶性高分子量の立体的な基へ独立して結合される複数のアプタマー抱合体を提供する段階が含まれる。次に、これらの異別に結合されるアプタマーの各々をリガンド及びリガンドの受容体と接触させ、各アプタマー抱合体の存在におけるリガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量を、アプタマー抱合体のない場合におけるリガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量と比較する。次に、リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化を阻害する最大の能力を有する特定のアプタマー抱合体を選抜する。それにより、方法は、リガンド／受容体標的に及ぼすアンタゴニスト効果の増強したアプタマー抱合体を同定する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、リガンド又は受容体上の結合部位から離れた部位の活性を阻害する方法を提供する。この態様において、本発明は、アプタマーの結合部位から離れた部位の活性を阻害する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、可溶性高分子量の立体的な基をアプタマーへ結合することによってリガンド上のアプタマーの結合部位に対して遠位のリガンド上の部位の活性を阻害する方法を提供する。アプタマーは、リガンドの活性部位近くの領域にあるリガンドへ結合してもよい。アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、隣接する活性部位を越えてアプタマーの到達が伸展し、それによりリガンドの活性を遮断する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、リガンド又は受容体上の結合部位から離れた部位のリガンド又は受容体の結合を阻害する方法を提供する。この態様において、本発明は、アプタマーの結合部位から離れた部位の結合を阻害する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、可溶性高分子量の立体的な基をアプタマーへ結合することによってリガンド上のアプタマーの結合部位に対して遠位のリガンド上の部位への標的タンパク質の結合を阻害する方法を提供する。アプタマーは、リガンドの受容体結合部位近くの領域にあるリガンドへ結合してもよい。アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、隣接する受容体結合部位を越えてアプタマーの到達が伸展し、それにより受容体へ結合するリガンドの能力を遮断する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、標的タンパク質が、生理学的ｐＨで全体的な正の電荷によって特徴付けられる塩基性ドメインと同様、生理学的ｐＨで全体的な負の電荷によって特徴付けられる酸性ドメインを有する場合の、結合パートナーへの標的タンパク質の結合を阻害する方法を提供する。本発明のこの態様において、結合パートナーは標的タンパク質の酸性ドメインを通じて結合し、結合パートナーへの標的タンパク質の結合は、標的タンパク質の酸性ドメインへの結合パートナーの結合を立体的に妨げる可溶性高分子量の立体的な基及び標的タンパク質の塩基性ドメインへ結合するアプタマー核酸配列を含む立体的に増強されたアプタマー抱合体と標的タンパク質を接触させることによって阻害される。
【００２７】
本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の大きさ及び中性電荷がペグ化された生物学的活性分子のイオン泳動送達を有意に制限するという発見に一部基づいてもいる。出願者は、中性ＰＥＧを荷電分子と置換することがイオン泳動送達を増強することも発見した。本発明は、荷電分子を生物学的活性分子へ結合することによって、生物学的活性分子のイオン泳動を増強する方法に関する。
【００２８】
したがって、別の態様において、本発明は、ａ）生物学的活性分子荷電抱合体を形成するよう生物学的活性分子へ荷電分子を結合する段階と、ｂ）生物アッセイのある分子荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、生物学的活性分子を眼へ送達する方法に関する。
【００２９】
ある実施態様において、荷電分子は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）又はキトサンなどの高電荷密度ポリマーを含み、生物学的活性分子はアプタマーなどの核酸である。
【００３０】
別の態様において、本発明は、生物学的活性分子を眼へイオン泳動で送達するのに有用な製剤に関する。製剤は、荷電分子へ結合した生物学的活性分子を含む。ある実施態様において、製剤は、ＣＭＣ、ＣＭＤ又はキトサンなどの高電荷密度ポリマーへ結合したアプタマーなどの核酸を含む。
【００３１】
本発明のイオン泳動送達方法及び製剤は、いくつもの利点を有する。ＣＭＣ又はキトサンなどの高度に荷電したポリマーは、生物学的活性分子の滞在時間延長剤及びイオン泳動促進剤の両者として作用する。それゆえ、荷電分子はそれらのＰＥＧ対応物の循環時間の延長を保存しながら、イオン泳動送達を促進する。ＣＭＣ及びキトサンなどの荷電分子は、多様な分子量において入手可能であり、結合化学特性の確立された広く受容される生体適合性分子である（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｍｅｔａｌｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ，Ｍ．Ｓｚｙｃｈｅｒ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，１９８３を参照してほしく、本明細書によってその全体が参照によって組み込まれる。）。本発明のイオン泳動送達方法及び組成物は、患者の快適性を考慮し、永久的な組織損傷を回避しながら、非侵襲的な眼の治療を提供する。
【００３２】
（本発明の詳細な記述）
本明細書に記載の特許及び科学的文献は、当業者にとって入手可能な知識を確立する。本明細書で引用されるすべての発行された特許、特許出願、刊行された外国出願、及びＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む刊行された参考資料は、それらの全体が参照によって組み込まれるよう各々が特異的に及び個々に示された場合と同程度まで参照によって組み込まれる。
【００３３】
一般
本発明は、アンタゴニスト活性を増大させたアプタマー及び、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する標的タンパク質を結合する部位特異的アプタマーのアンタゴニスト活性の範囲を増大させるための方法を提供する。本発明は、ＳＥＬＥＸ方法論の本来の制限、及び一般には、塩基性領域がタンパク質機能に決定的であるかどうかに関わらず、核酸アプタマーのホスホジエステル主鎖によって運搬される高い負の電荷が結果的に、標的となったタンパク質の正に荷電した領域（つまり、塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン及びヒスチジンにおいて豊富である標的タンパク質の領域）へ結合するアプタマー配列の優先的選抜を生じるアプタマーデザインを指向する（例、Ｐａｂｏｒｓｋｙほか（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８： ２０８０８−２０８１１を参照）。
【００３４】
アプタマーは、高い特異性及び親和性、生物学的有効性、及び優れた薬物動態学的特性を含む治療剤として使用するための望ましい特徴の多くを有する。さらに、アプタマーはしばしば、抗体及び他のタンパク質生物製剤にわたって特異的な競合性のある利点を提供する。これらには例えば次のものが含まれる。すなわち、
（１）速度及び調節： アプタマーは完全な試験管内プロセスにおいて作製される。試験管内選抜によって、アプタマーの特異性及び親和性は厳密に調節でき、毒性標的及び非免疫原性標的の両者に対するリードをなすことができる。
【００３５】
（２）毒性及び免疫原性： １クラスとしてのアプタマーはほとんど又は全く毒性も免疫原性も示さない。アプタマーの高レベルのラット又はマーモットの慢性的な投与（１日につき１０ｍｇ／ｋｇを９０日間）において、臨床的、細胞上の、又は生化学的測定のいずれによっても毒性は観察されない。多くのモノクローナル抗体の有効性が抗体自体に対する免疫反応によって重度に制限されるのに対し、アプタマーに対して抗体を誘発することは極めて困難である（最もありそうな理由は、アプタマーがＩ ＭＨＣを介してＴ細胞によって呈示できず、免疫反応は一般に核酸断片を認識しないよう訓練されているからである。）。
【００３６】
（３）投与： すべての現在認可されている抗体治療剤が静脈内注入によって（典型的には２時間ないし４時間かけて）投与されるのに対し、アプタマーは皮下注射によって投与できる。この差異は比較的低い可溶性に主としてよるものであり、したがってたいていの治療用ＭＡｂに多量の容積が必要であることによるものである。可溶性が良好であること（１５０ｍｇ／ｍｌ超）及び比較的低分子量（アプタマー：１０ｋＤａないし５０ｋＤａ； 抗体：１５０ｋＤａ）であることから、アプタマーの週ごとの投与量は、０．５ｍｌ未満の容積における注入によって送達される。皮下投与を介するアプタマーの生物学的利用能は、サルの研究において８０％超である（Ｔｕｃｋｅｒほか（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．７３２： ２０３−２１２）。
【００３７】
（４）拡張性及び経費： アプタマーは化学的に合成され、結果的に製造需要に見合うのに必要なだけ迅速に拡張できる。製造を拡張する上での困難はいくつかの生物製剤の有効性を現に制限しており（例、イブレル（Ｅｂｒｅｌ）、レミケード）、大規模タンパク質製造プラントの資本経費は膨大である（例、１，０００，０００ドル、Ｉｍｍｕｎｅｘ社）であるのに対し、単一の大規模合成装置は１年当たり１００ｋｇ以上のオリゴヌクレオチドを製造でき、要する初期投資は比較的大きくない（例、２０，０００ドル未満、Ａｖｅｃｉａ社）。キログラム規模でのアプタマー合成のための商品の最新の経費は、５００ドル／ｇと概算され、非常に最適化された抗体に対する経費に匹敵する。プロセス開発におけるたゆまぬ改善は、５年で１ｇ当たり１００ドル未満まで商品の経費を低下させると期待される。
【００３８】
（５）安定性： アプタマーは化学的に強い。アプタマーは、熱、変性剤等への暴露後の活性を回復するのに本質的に適しており、凍結乾燥した粉末として室温で長期間（１年超）保存できる。対照的に、抗体は冷蔵保存しなければならない。
【００３９】
定義
本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、以下に別段の定義がなければ、当業者によって共通して理解されるのと同一の意味を有するよう企図され、本明細書で採用される技術に対する参照は、本分野で共通して理解される技術を指すよう企図され、それには、技術又は当業者に明白であろう等価の若しくは後に開発された技術の置換に関する多様性が含まれる。本発明である対象事項をより明確かつ簡潔に記載するため、以下の定義が本明細書及び付加される請求項において使用される特定の用語について提供される。
【００４０】
本明細書で「約」という語は、大まかに又はおおよその領域にあるほぼを意味するよう示される。「約」という後が数字の範囲とともに使用される場合、示される数値を上回り及び下回る境界を拡大することによってその範囲を修正する。一般に、「約」という語は、２０％の分散によって記載される値を上回り及び下回って数値を修正するよう使用される。
【００４１】
「アルギン酸塩」という語は、褐色藻類（褐色の海草、例、カリフォルニアジャイアントケルプ（マクロシスティスプリフェラ））において生じる親水性の多糖類を指し、α１−４−結合したα−Ｌ−グロピラノシルロン酸残基の配列、β−４−結合したβ−Ｄ−マンオピラノシルロン酸残基の配列、及び両ウロン酸が交互になっている配列において生じる配列の断続性構造を有する。
【００４２】
「陰イオン」という語は、負の電荷を有する原子又は分子を指す。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「アンタゴニスト」という語は、アプタマーへ適用される場合、標的タンパク質の結合パートナーとの相互作用を混乱させる能力を指し、標的タンパク質の結合パートナーとの相互作用は、標的タンパク質の生物学的機能に関与する。したがって、アプタマーアゴニストは標的タンパク質の生物学的機能を阻害するよう典型的に機能するであろう。しかしながら、例えば標的タンパク質が阻害因子タンパク質結合パートナーと相互作用する場合、アプタマーアンタゴニストは標的タンパク質のその阻害剤との相互作用を混乱させるかもしれず、それにより阻害因子タンパク質によってさもなくば阻害される標的タンパク質の生物学的機能の活性化に影響を及ぼすかもしれない。それゆえ、本発明のアプタマーアンタゴニストは、標的タンパク質の生物学的機能を典型的に阻害するであろう一方で、アプタマーアンタゴニストは標的の生物学的機能を活性化するよう機能するかもしれない。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「拮抗範囲」という語は、生物学的活性分子の拮抗作用を増大又は付加することを指す。例えば、アンタゴニストがすでに拮抗できたであろう補充性の１つ以上のさらなるリガンド／受容体相互作用をアンタゴニストが拮抗できる場合、アンタゴニストの「拮抗範囲」は増大する。拮抗範囲は、立体的な抱合体の付加によって増大するかもしれない。ある実施態様において、範囲は結合した部分の直鎖状の及び／又はすい力学的体積によって決定される。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「アプタマー」という語は、非共有結合性の物理的相互作用を介して（タンパク質などの）非ポリヌクレオチド分子に対する選択的な結合親和性を有するいずれかのポリヌクレオチド又はその塩を意味する。アプタマーは、抗体のそのエピトープに対する結合に類似した方法でリガンドへ結合するポリヌクレオチドである。標的分子は興味の対象のいずれかの分子でありうる。非ポリヌクレオチド分子の例はタンパク質である。アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインへ結合するのに使用でき、それにより自然発生するリガンドのタンパク質との相互作用を防止する。本発明のアプタマーは、アプタマーを適切な高分子量の立体的な基へ結合することによって、本明細書に記載されるように必要に応じて修飾される。
【００４６】
「生物学的活性分子」、「生物学的活性部分」又は「生物学的活性因子」は、以下に制限を加えるものではないが、ウィルス、バクテリア、菌、植物、動物、及びヒトを含む生物学的生物体のいずれかの物理的特性又は生化学的特性に影響を及ぼしうるいずれかの物質でありうる。生物学的活性分子には、ヒト又は他の動物における疾病の診断、治療緩和、治療、又は予防のために、又はさもなくばヒト又は動物の身体的又は精神的健康を増強するよう企図されるいずれかの物質を含むことができる。生物学的活性分子の例には、以下に制限されるものではないが、核酸、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、抗体、ペプチド、タンパク質、酵素及びポルフィリン、小分子薬物が含まれる。他の生物学的活性分子には、以下に制限されるものではないが、染色剤、脂質、細胞、ウィルス、リポソーム、微粒子及びミセルが含まれる。抗体の例には、以下に制限されるものではないが、ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（Ｒ））及びラニズマブ（ｒａｎｉｚｕｍａｂ）（ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）（Ｒ））が含まれる。アプタマーの例には、以下に制限されるものではないが、ペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）（マクゲン（Ｍａｃｕｇｅｎ）（Ｒ））が含まれる。ポルフィリンの例には、以下に制限されるものではないが、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）（ビスジン（Ｖｉｓｕｄｉｎｅ）（Ｒ））が含まれる。ステロイドの例には、以下に制限されるものではないが、アネコルタブ（ａｎｅｃｏｒｔａｖｅ）（レターネ（Ｒｅｔａａｎｅ）（Ｒ））が含まれる。本発明とともに使用するのに適した生物学的活性分子のクラスには、以下に制限されるものではないが、抗生物質、殺菌剤、抗ウィルス剤、抗感染剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、抗チューブリン剤、心臓循環器系剤、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、及びそれらの類似物が含まれる。
【００４７】
「陽イオン」という語は、正の電荷を有する原子又は分子を指す。
【００４８】
本明細書で使用される「荷電分子」又は「荷電部分」という語は、形式電荷を有するいずれかの部分又は分子を指す。荷電分子は、その本質的な構造の性質によって、又は別の原子とのその共有結合の結果として、永久的に荷電されてもよい。荷電分子は、例えば薬物送達中に存在する環境などの周囲の環境の存在するｐＨ条件の性質による形式電荷を有してもよい。分子における電荷は、正（陽イオン性）又は負（陰イオン性）のいずれかであってもよい。荷電分子は、正の電荷又は負の電荷のみを含むことができる。荷電分子は、正の電荷及び負の電荷の両者の組み合わせも含むことができる。特定の実施態様において、荷電分子は正味の陰イオン性電荷を有する。正の電荷を荷電分子へ付与する化学基には、いかに制限されるものではないが、アミノ含有化合物などのイオン化可能な窒素原子が含まれる。負の電荷を荷電分子へ付与する化学基には、以下に制限されるものではないが、カルボン酸基、硫酸基、スルホン酸基又はリン酸基が含まれる。
【００４９】
荷電分子又は生物学的活性分子荷電抱合体は、必要に応じて１つ以上の「対イオン」によって付随される。荷電分子又は生物学的活性分子荷電抱合体に付随する対イオンは、荷電分子の一部であると考慮されてもよい。荷電した両分子及び結果として生じる生物学的活性分子荷電抱合体についての対イオンは、医薬的に許容可能な塩を生じてもよい。適切な陰イオン性対イオンには、以下に限定されるものではないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、コハク酸塩、及びそれらの類似物が含まれる。適切な陽イオン性対イオンには、以下に限定されるものではないが、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、ＮＨ４＋及び有機アミン陽イオンが含まれる。有機アミン陽イオンには、以下に限定されるものではないが、テトラアルキルアンモニウム陽イオン及び水素イオンとともに四級アンモニウム陽イオンを形成する有機アミンが含まれる。四級アンモニウム陽イオンを形成できる有機アミンの例には、以下に制限されるものではないが、一有機アミン及び二有機アミン、モノアミノ酸及びジアミノ酸、並びにモノアミノ酸エステル及びジアミノ酸エステル、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、２−（４−イミダゾリル）エチルアミン、グルコサミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ピペラジン、ピペリジン、トロメタミン、６’−メトキシ−シンコナン（ｃｉｎｃｈｏｎａｎ）−９−オール、シンコナン（ｃｉｎｃｈｏｎａｎ）−９−オール、ピラゾール、ピリジン、テトラサイクリン、イミダゾール、アデノシン、べラパミル及びモルフォリンが含まれる。
【００５０】
「共重合体」という語は、モノマーの２種類以上から生成されるポリマーを指す。
【００５１】
「共有結合」という語は、２つの原子が電子一対を共有する場合に生じる原子の結合を指す。
【００５２】
「電流」という語は、荷電した粒子の移動による電気のコンダクタンスを指す。「電流」及び「電気流」という語は、包括的であって排他的ではないよう企図される。ある実施態様において、電流は「直流電流」、「直流」又は「定常電流」である。別の実施態様において、電流は「交流」「交互になる電気流」「直流相殺を有する交流」「直流相殺を有する交流」「パルス化した交流」又は「パルス化した直流」である。
【００５３】
「デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）」という語は、デンドリマー構造の半分を表す分子を指す。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、デンドリマー中心の半分の上に、又はデンドリマーの構築後のデンドリマー中心の開裂によって典型的に構築される。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、単量体及び表面修飾のいずれかの組み合わせから構成されてもよい。有用な単量体の例には、以下に制限されるものではないが、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）が含まれる。有用な表面修飾の例には、以下に制限されるものではないが、陽イオン性アンモニウム修飾、Ｎ−アシル修飾及びＮ−カルボキシメチル修飾が含まれる。代替的な表面修飾によって、広く異別の特性が可能になる。例えば、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、多価陰イオン性、多価陽イオン性、疎水性又は親水性であってもよい。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、単量体の精確な数及び表面修飾基がデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）の発生によって決定されるよう合目的であってもよい（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、及びＧ６はそれぞれ４、８、１６、３２、６４、及び１２８の基を有する）。１：１の化学量論でのデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）−生物学的活性分子の抱合体の構築はシスタミン中心を含有するデンドリマーにおけるジスルフィドの還元によって達成されてもよい。この還元は、単一のチオール反応基を含有するよう修飾されたいずれかの生物学的活性分子へ結合されてもよい単一の直交するスルフィドリル機能性の形成を生じる。このことは、アミン含有の生物学的活性分子を、ある末端にあるアミン反応基及びその他の末端にあるチオール反応基を含有する二機能性リンカーと反応させることによって達成されてもよい。ジスルフィドを含有する樹状ポリマー及び樹状ポリマー抱合体の例は、米国特許第６，０２０，４５７号に見られ、それはその全体において本明細書に参照によって組み込まれる。
【００５４】
「イオン泳動」という語は、組織などの遮蔽へまたは遮蔽を通じてのイオン化可能な分子又は荷電分子の電流による輸送を指す。例えば、アース電極を身体のほかのどこかに設置して電流回路を完了しながら薬物と同一の電荷を運搬する電極を使用して薬物を組織へ適用することによるイオン泳動によって身体にある組織へと運搬されてもよい。イオン泳動電流は、組織内のイオンが適用される電位の結果として輸送される場合、組織内で確立される。荷電した化合物は、反対の極性の電極へ結合され、同様の極性の電極によってパルス化される。結果として、この方法による化合物輸送は、化合物の適用される電位及び電気泳動による移動度に直接関連する。イオン泳動は、イオン泳動送達、電気輸送、イオン水動態（ｉｏｎｔｏｈｙｄｒｏｋｉｎｅｓｉｓ）、イオン性薬物投与、イオン療法（ｉｏｎｔｏｔｈｅｒａｐｙ）、及び起電性薬物投与（ＥＭＤＡ）とも呼ばれてもよい。
【００５５】
「伸長」という語は、組成物（例、高分子量ポリマー組成物）が引っ張ることによって引き伸ばされる場合に達成される長さを指す。伸長は、元の長さによって除された引き伸ばしの後の長さとして典型的に表される。
【００５６】
「ゲル」という語は、溶媒の多量を吸収した架橋したポリマーを指す。架橋したポリマーは、それらが溶媒を吸収する場合、相当典型的に膨潤する。
【００５７】
「グリコサミノグリカン」という語は、アミノ単糖類残基（例、アミノヘキソースから派生した多様な多糖類のいずれか）の実質的な割合を含有するいずれかのグリカン（つまり、多糖類）を指す。
【００５８】
「水力学的体積」とは、ポリマーコイルが溶液中にある場合にポリマーコイルが占有する体積を指す。ポリマーの「水力学的体積」は、ポリマーの分子量及びポリマーが溶媒といかに十分に相互作用するかによって変動しうる。例えば、ＰＥＧのいずれの酸化エチレン繰り返し単位も、２ないし３の水分子を結合することが公知である。水力学的体積は分子半径の単位において測定されてもよい。
【００５９】
「水素結合」という語は、電気陰性原子へ結合した水素原子と、通常別の文市場にある電気陰性原子との非常に強力な引力を指す。例えば、１個の水分子上の水素原子は、別の水分子上の酸素原子へ非常に強くひきつけられる。
【００６０】
「イオン」という語は、正又は負の電荷を有する原子又は分子を指す。
【００６１】
本明細書において使用される「イオン泳動デバイス」という語は、生物学的活性分子の対象へのイオン泳動送達に適したデバイス又は装置を指す。このようなイオン泳動デバイスは本分野で周知であり、「イオン泳動デバイス」又は「電気輸送デバイス」とも呼ばれる。
【００６２】
本明細書で使用される「非ペプチドポリマー」という語は、アミノ酸残基の実質的に存在しないオリゴマーを指す。
【００６３】
本明細書で使用される「非核酸ポリマー」という語は、ヌクレオチド残基の実質的に存在しないオリゴマーを指す。
【００６４】
「眼の送達」及び「眼内送達」は、生物学的活性分子などの化合物の眼の組織又は流体への送達を指す。「眼のイオン泳動」は、眼の組織又は流体へのイオン泳動送達を指す。いずれの眼の組織又は流体もイオン泳動を使用して治療できる。眼の組織及び流体には、例えば硝子体、結膜、角膜、強膜、虹彩、水晶体、毛様体、脈絡膜、網膜及び視覚神経などの眼の周りにあるものが含まれる。
【００６５】
「加水分解的に安定な」又は「加水分解できない」結合又は連結という語は、水中で実質的に安定であり、水と実質的には反応しない結合又は連結を指すよう、本明細書で使用される。例えば、加水分解的に安定な連結は、延長した期間、生理学的条件の下で反応しない。
【００６６】
「生理学的に安定な」結合又は連結という語は、生体内開裂又は加水分解に対して実質液に安定であるが、他の試験管内因子の存在においても安定であるかもしれない結合又は連結を指すよう本明細書で使用される。生理学的に安定した結合又は連結は加水分解的に安定であり、患者の細胞、器官、皮膚、膜又は身体内のほかのどこかにおける生理学的プロセスに対して安定である。
【００６７】
「生理学的に開裂可能な」結合は、生体内で開裂又は加水分解されるが、試験管内の他のものによっても開裂されるかもしれない結合である。生理学的開裂は化学的又は酵素的であってもよい。生理学的開裂は、患者の細胞、器官、皮膚、膜又は身体内のほかのどこかにおける生理学的プロセスによって生じてもよい。
【００６８】
「エステラーゼ耐性」又は「エステラーゼに対して安定な」結合又は連結は、エステラーゼの存在において安定である。
【００６９】
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という語は、適切な条件（例、pＨ、温度、溶媒、イオン強度、電場強度）下で相補的な又は実質的に相補的な配列の自然発生する核酸に対する選択的な結合親和性を有する共有結合されたヌクレオシド又は修飾されたヌクレオシドの配列を含むいずれかの分子を包含するよう意図される。ポリヌクレオチドには、修飾されたヌクレオシド又はヌクレオシド間結合を有する核酸アナログと同様に自然発生する核酸、及び結合または検出を容易にするリンカーまたは検出可能な標識で修飾された分子が含まれる。
【００７０】
本明細書で使用されるように、「ヌクレオシド」という語は、自然発生するリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド、すなわちアデノシン、シトシン、グアノシン、チモシン又はウラシルのいずれかを意味する。
【００７１】
「修飾されたヌクレオチド」又は「修飾されたヌクレオシド」又は「修飾された塩基」という語は、リボ核酸（つまり、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵ）及びデオキシリボ核酸（つまり、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）において生じる標準的な塩基、糖及び／又はリン酸主鎖化学構造のバリエーションを指す。例えば、Ｇｍは２’−メトキシグアニル酸を表し、Ａｍは２’−メトキシアデニル酸を表し、Ｃｆは２’−フルオロシチジル酸を表し、Ｕｆは２’−フルオロウリジル酸を表し、Ａｒはリボアデニル酸を表す。アプタマーには、シトシン又は、５−メチルシトシン、４−アセチルシトシン、３−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、２−チオシトシン、５−ハロシトシン（例、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、及び５−ヨードシトシン）、５−プロピニルシトシン、６−アゾシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、Ｎ４−エタノシトシン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、カルバゾールシチジン又はピリドインドールシチジンを含む、いずれかのシトシン関連塩基が含まれる。アプタマーにはさらに、グアニン、又は６−メチルグアニン、１−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、６−プロピルグアニン、８−ハログアニン（例、８−フルオログアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、及び８−ヨードグアニン）、８−アミノグアニン、８−スルフヒドリルグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、７−メチルグアニン、８−アザグアニン、７−デアザグアニン又は３−デアザグアニンを含むいずれかのグアニン関連塩基が含まれる。アプタマーにはさらに、アデニン又は、６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、８−ハロアデニン（例、８−フルオロアデニン、８−ブロモアデニン、８−クロロアデニン、及び８−ヨードアデニン）、８−アミノアデニン、８−スルフヒドリルアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、７−メチルアデニン、２−ハロアデニン（例、２−フルオロアデニン、２−ブロモアデニン、２−クロロアデニン、及び２−ヨードアデニン）、２−アミノアデニン、８−アザアデニン、７−デアザアデニン又は３−デアザアデニンを含むいずれかのアデニン関連塩基が含まれる。又含まれるのはウラシル又は、５−ハロウラシル（例、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、１−メチル偽ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、偽ウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アゾウラシル、又は４−チオウラシルを含むいずれかのウラシル関連塩基である。本分野で公知の他の修飾された塩基変異体の例には、以下の制限されるものではないが、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ第１．８２２章１ページに列挙されるものが含まれ、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’−メトキシシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチル偽ウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチル偽ウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルクエノシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）、ｗｙブトキオシン、ｐｓｅｕｄｏウリジン、クエノシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ｗｙブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジンが含まれる。ヌクレオチドには、米国特許第３，６８７，８０８号、第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、及び第５，６８１，９４１号に記載の修飾された核酸塩基のいずれかも含まれる。本分野で公知の修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド糖主鎖変異体の例には、以下に制限されるものではないが、例えば、Ｆ、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ２ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、Ｏ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ２−１０アルケニル）、Ｏ（Ｃ２−１０アルキニル）、Ｓ（Ｃ１−１０アルキニル）、Ｓ（Ｃ２−１０アルケニル）、Ｓ（Ｃ２−１０アルキニル）、ＮＨ（Ｃ１−１０アルキル）、ＮＨ（Ｃ２−１０アルケニル）、ＮＨ（Ｃ２−１０アルキニル）、及びＯ−アルキル−Ｏ−アルキルなどの２’リボシル置換体を有するものが含まれる。望ましい２’リボシル置換体には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−置換体は、アラビノ（上）位置又はリボ（下）位置にあってもよい。
【００７２】
本明細書に示されるように、「５’−５’逆転したヌクレオチドキャップ」という語は、以下に示される第一ヌクレオチドの５’位置とオリゴヌクレオチドの５’末端との間のホスホジエステル結合を介したオリゴヌクレオチドの５’末端へ共有結合される第一ヌクレオチドを意味する。
【００７３】
【化１】
【００７４】
「３’−３’逆転したヌクレオチドキャップ」という語は、以下に示される第一ヌクレオチドの３’位置とオリゴヌクレオチドの３’末端との間のホスホジエステル結合を介したオリゴヌクレオチドの３’末端へ共有結合される最後のヌクレオチドを意味する。
【００７５】
【化２】
【００７６】
アプタマー組成物には、以下に制限されるものではないが、５’−５’逆転したヌクレオチドキャップ構造を有するもの、３’−３’逆転したヌクレオチドキャップ構造を有するもの、及びアプタマー末端で５’−５’逆転したヌクレオチドキャップ構造及び３’−３’逆転したヌクレオチドキャップ構造の両者を有するものが含まれてもよい。
【００７７】
「抗ＶＥＧＦアプタマー」は、ＶＥＧＦへ結合し、ＶＥＧＦの活性を阻害するポリヌクレオチドアプタマーを包含するよう意図される。このような抗ＶＤＧＦアプタマーは、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー又は混合した（つまり、ＲＮＡ及びＤＮＡの両者の）組成物を有するアプタマーであってもよい。このようなアプタマーは公知の方法を使用して同定できる。例えば、試験管内進化法又はＳＥＬＥＸ法は、全体において参考文献により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４７５，０９６号及び第５，２７０，１６３号に記載されるように使用できる。抗ＶＥＧＦアプタマーには、米国特許第６，１６８，７７８号、第６，０５１，６９８号、第５，８５９，２２８号、及び第６，４２６，３３５号に記載される配列が含まれ、それらの特許の各々は、その全体において本明細書に参照によって組み込まれる。配列は、５’−５’逆転したキャップ及び／又は３’−３’逆転したキャップを含むよう修飾できる（その全体において本明細書に参照によって組み込まれるＡｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．ほか、刊行された出願第ＷＯ２００５／０１４８１４号を参照。）。
【００７８】
本発明の適切な抗ＶＥＧＦアプタマーには、ヌクレオチド配列ＧＡＡＧＡＡＵＵＧＧ（配列番号４）、又はヌクレオチド配列ＵＵＧＧＡＣＧＣ（配列番号５）、又はヌクレオチド配列ＧＵＧＡＡＵＧＣ（配列番号６）が含まれる。
【００７９】
抗ＶＥＧＦアプタマーの例には、以下に制限されるものではないが、
（ｉ）配列ＣＧＧＡＡＵＣＡＧＵＧＡＡＵＧＣＵＵＡＵＡＣＡＵＣＣＧ（その全体において本明細書に参照によって組み込まれる米国特許第６，０５１，６９８号に記載される配列番号７）を有する抗ＶＥＧＦアプタマー。各Ｃ、Ｇ、Ａ、及びＵはそれぞれ、自然に発生するヌクレオチドであるシチジン、グアニジン、アデニン、及びウリジン、又はそれに対応する修飾されたヌクレオチドを表し、及び好ましくは、
（ｉｉ）配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を有する抗ＶＥＧＦアプタマーが含まれる。
【００８０】
キャッピングされた抗ＶＥＧＦアプタマーの例は、配列Ｘ−５’−５’−ＣＧＧＡＡＵＣＡＧＵＧＡＡＵＧＣＵＵＡＵＡＣＡＵＣＣＧ−３’−３’−Ｘ（配列番号９）を有し、各Ｃ、Ｇ、Ａ、及びＵはそれぞれ、自然に発生するヌクレオチドであるシチジン、グアニン、アデニン、及びウリジン、又はそれに対応する修飾されたヌクレオチドを表し、Ｘ−５’−５’−は、アプタマーの５’末端をキャッピングする逆転したヌクレオチドであり、３’−３’−Ｘは、アプタマーの３’末端をキャッピングする逆転したヌクレオチドであり、残余ヌクレオチド又は修飾されたヌクレオチドは５’−３’ホスホジエステル結合を介して連続して結合される。いくつかの実施態様において、キャピングされた抗ＶＥＧＦアプタマーの各ヌクレオチドは各々、（リボ核酸（ＲＮＡ）に対する標準である）−ＯＨ、又は（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対する標準である）−Ｈなどの２’リボシル置換を抱える。他の実施態様において、２’リボシル位置は、Ｏ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ１−１０アルケニル）、Ｆ、Ｎ３、又はＮＨ２置換体と置換される。
【００８１】
さらにより特定の制限のない例において、５’−５’キャッピングされた抗ＶＥＧＦアプタマーは構造
Ｔｄ−５’−５’−ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ３’−３’−Ｔｄ
（配列番号１）
を有してもよく、式中、「Ｇｍ」は２’−メトキシグアニル酸を表し、「Ａｍ」は２’−メトキシアデニル酸を表し、「Ｃｆ」は２’−フルオロシチジル酸を表し、「Ｕｆ」は２’−フルオロウリジル酸を表し、「Ａｒ」はリボアデニル酸を表し、「Ｔｄ」はデオキシリボチミジル酸を表す（本明細書にその全体において参照によって組み込まれるＡｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．ほか、刊行された出願第ＷＯ２００５／０１４８１４号を参照）。
【００８２】
「抗ＰＤＧＦアプタマー」は、ＰＤＧＦへ結合し、ＰＤＧＦの活性を阻害するポリヌクレオチドアプタマーを包含するよう意図される。このようなアプタマーは公知の方法を使用して同定できる。例えば、試験管内進化法又はＳＥＬＥＸ法は、前述のように使用できる。
【００８３】
抗ＰＤＧＦアプタマーには、米国特許第５，６６８，２６４号、第５，６７４，６８５号、第５，７２３，５９４号、第６，２２９，００２号、第６，５８２，９１８号、及び第６，６９９，８４３号に記載された配列が含まれ、本発明にしたがって、５’−５’逆転したキャップ及び／又は３’−３’逆転したキャップ及び／又は可溶性高分子量の立体的な基による修飾で修飾できる。
【００８４】
抗ＰＤＧＦアプタマーの例には、以下に制限されるものではないが、
（ｉ）位置６、２０及び３０で２’−フルオロ−２’−デオキシウリジンを有し、位置８、２１、２８、及び２９で２’−フルオロ−２’−デオキシシチジンを有し、位置９、１５、１７、及び３１で２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシンを有し、位置２２で２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシンを有し、位置１０及び２３にある「Ｎ」でヘキサエチレン−グリコールホスホラミダイトを有し、位置３２で逆転した向きＴ（つまり、３’−３’結合される。）を有する配列ＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵＧＴ（その全体において本明細書に参照によって組み込まれる米国特許第６，５８２，９１８号由来の配列番号１０）を有するペグ化した抗ＰＤＧＦアプタマーである、ＡＲＣ−１２７（Ａｒｃｈｅｍｉｘ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、及び、
（ｉｉ）位置８のＣでＯ−メチル−２−デオキシシチジンを、位置９、１７及び３１のＧで２−Ｏ−メチル−２−デオキシグアノシンを、位置２２のＡで２−Ｏ−メチル−２−デオキシアデノシンを、位置３０で２−Ｏ−メチル−２−デオキシウリジンを、位置６及び２０のＵで２−フルオロ−２−デオキシウリジンを、位置２１、２８及び２９のＣで２−フルオロ−２−デオキシシチジンを、位置１０及び２３のＮでペンタエチレングリコールホスホラミダイトスペーサーを、位置３２で逆転した向きＴ（つまり、３’−３’結合される。）を有するＣＡＧＧＣＵＡＣＧＮＣＧＴＡＧＡＧＣＡＵＣＡＮＴＧＡＴＣＣＵＧＴ（その全体において本明細書に参照によって組み込まれる米国特許第５，７２３，５９４号由来の配列番号１１）が含まれる。
【００８５】
「抗ＩＣＡＭアプタマー」は、ＩＣＡＭへ結合し、ＩＣＡＭの活性を阻害するポリヌクレオチドアプタマーを包含するよう意図される。このようなアプタマーは公知の方法を使用して同定できる。例えば、試験管内進化法又はＳＥＬＥＸ法は、前述のように使用できる。
【００８６】
別段の記載がなければ、「又は」という語は本明細書において「及び／又は」の包括的な感覚で使用され、「いずれか／又は」の排他的な感覚では使用されない。
【００８７】
本明細書で使用されるように、「増大」及び「低下」という語はそれぞれ、統計的に有意な増大（つまり、ｐ＜０．１）及び統計的に有意な低下（つまり、ｐ＜０．１）を意味する。
【００８８】
本明細書で使用される変数についての数の範囲の詳説は、本明細書が範囲内の値のいずれかに等しい変数で実施されてもよいことを意味するよう企図される。したがって、本質的に離散した変数について、変数は、範囲の終点を含む数の範囲内のいずれかの整数値に等しくありうる。同様に、本質的に連続する変数について、変数は、範囲の終点を含む数の範囲内のいずれかの実際の値に等しくありうる。
【００８９】
「ＩＣＡＭ」又は「細胞間接着分子」という語は、免疫グロブリンスーパーファミリーのいくつものI型膜糖タンパク質のいずれかを指す。ＩＣＡＭは、ＬＦＡ−１とともに標的細胞への白血球接着のためのリガンドとして作用する。ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ相互作用は、多くの細胞タイプ間の接着を仲介する。ＩＣＡＭの３つのサブクラスがある。ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）は、９０ｋＤａないし１１５ｋＤａの分子量を有し（図４（Ａ）参照）、線維芽細胞、ケラチノサイト、及び軟骨細胞と同様、Ｂ細胞及びＴ細胞、内皮細胞、上皮細胞、及び樹状細胞において発現する。それらは、γインターフェロン、インターロイキン−１β、及び腫瘍壊死因子−αを含むサイトカインによって１２時間ないし２４時間で誘導可能である。ＩＣＡＭ−１の例には、５３２個のアミノ酸のＩＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ（５７．７６ｋＤａ）が含まれる。ＩＣＡＭ−２（ＣＤ１０２）は、約５５ｋＤａないし６５ｋＤａの分子量を有し、内皮細胞、いくつかのリンパ球、単球及び樹状細胞で構成的に発現する。ＩＣＡＭ−２の例には、２７５個のアミノ酸のＩＣＡ２＿ＨＵＭＡＮ（３０．６２ｋＤａ）が含まれる。ＩＣＡＭ−３（ＣＤ５０）は、１１６ｋＤａないし１４０ｋＤａの分子量を有し、単球、顆粒球及びリンパ球において構成的に発現する。生理学的刺激に際し、ＩＣＡＭ−３は迅速かつ一過性にセリン残基でリン酸化される。ＩＣＡＭ−３の例には、５４７個のアミノ酸のＩＣＡ３＿ＨＵＭＡＮ（５９．３２ｋＤａ）が含まれる。
【００９０】
本明細書で使用される「オリゴマー」という語は、その分子量がポリマーを考慮されるには小さすぎるポリマーを指す。オリゴマーは典型的に、数百の分子量を有するが、ポリマーは典型的に、数千以上の分子量を有する。
【００９１】
「オリゴヌクレオチド」という語は、自然発生する塩基、糖及び糖間（主鎖）結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシド単量体のオリゴマー又はポリマーを指す。語には、同様に機能する自然には発生しない単量体又はその一部を含む修飾された又は置換されたオリゴマーも含まれる。置換されたオリゴマーの組み込みは、細胞内取り込みの増強又はヌクレアーゼ抵抗性の亢進を含む因子に基づいており、本分野で周知のように選択される。全体的なオリゴヌクレオチド又はそのたったの一部は、置換されたオリゴマーを含有してもよい。
【００９２】
「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」という語は、ｎが３を超える一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨのいずれかのポリマーを指す。ある実施態様において、ｎは約４ないし約４０００である。別の実施態様において、ｎは約２０ないし約２０００である。ある実施態様において、ｎは約４５０である。ある実施態様において、ＰＥＧは約８００ダルトン（Ｄａ）ないし約１００，０００Ｄａの分子量を有する。さらなる実施態様において、ポリエチレングリコールは２０ｋＤａ ＰＥＧ、４０ｋＤａ ＰＥＧ、又は８０ｋＤａ ＰＥＧである。ポリエチレングリコールの平均的な相対分子量は時々、接尾数によって示される。例えば、４０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有するＰＥＧは、「ポリエチレングリコール４０００」と呼ばれてもよい。ＰＥＧにより結合した生成物は、ペグ化した生成物と呼ばれてもよい。
【００９３】
「ランダムコイル」という語は、それが溶液中にある場合のポリマー分子の形状を指し、それ自体一直線に伸ばされているよりもむしろ、それ自体後ろに折りたたまれる。このようなランダムコイルは、ポリマーと溶媒との分子間力が溶媒分子自体の間の力及びポリマー鎖セグメント間の力と等しい場合に形成する。
【００９４】
「立体障害」という語は、ある分子実体（例、タンパク質）の別の分子実体（例、相互作用するタンパク質）との結合又は相互作用の制限又は防止を指す。「立体障害」という語には、立体的な基における原子又は基のサイズ及び／又は空間的な配置によってアプタマーの標的タンパク質の標的タンパク質の結合パートナー（例、その受容体とのリガンド）との結合を制限又は防止する上で、可溶性高分子量の立体的な基を有する立体的に増強されたアプタマーの効果が含まれる。
【００９５】
「離れた部位」又は「アプタマー結合部位から離れている部位」は、アプタマー結合部位に対して近位又は遠位であってもよい。離れた部位は、アプタマー結合部位に近接するか、重なるか、結合部位のそばにあるか、又は離れていてもよい。
【００９６】
アプタマー核酸組成物
標的分子の多様性へ結合するアプタマー核酸配列は簡単に作製される。本発明のアプタマー核酸配列は、ＲＮＡの完全に又はＲＮＡの部分的に、ＤＮＡの完全に又は部分的に、及び／又は他のヌクレオチドアナログから構成できる。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）として公知の生体内又は試験管内（最も典型的には試験管内）選抜技術を採用することによって、特定のリガンドを結合するよう典型的に開発されている。アプタマーを作製する方法は、例えばＥｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６： ８１８、Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ５０５、米国特許第５，５８２，９８１号、ＰＣＴ出願第ＷＯ００／２００４０号、米国特許第５，２７０，１６３号、Ｌｏｒｓｃｈ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３： ９７３、Ｍａｎｎｉｒｏｎｉほか（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６： ９７２６、Ｂｌｉｎｄ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６： ３６０６−３６１０、Ｈｕｉｚｅｎｇａ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４： ６５６−６６５、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／５４５０６号、第ＷＯ９９／２７１３３号、及び第ＷＯ９７／４２３１７号、及び米国特許第５，７５６，２９１号に記載される。
【００９７】
一般に、それらの最も基本的な形態において、ＲＮＡアプタマーを同定するための試験管内選抜技術は、無作為化されるか又は変異誘発される少なくともある領域を含有する望ましい長さのＤＮＡ分子の大きなプールをまず調製することを包含する。例えば、アプタマー選抜のための共通のオリゴヌクレオチドプールは、ＰＣＲプライマーの結合に有用な定義された配列の約１５ヌクレオチド長ないし２５ヌクレオチド長の領域によって両端で隣接した２０ないし１００の無作為化したヌクレオチドの領域を含有してもよいであろう。オリゴヌクレオチドプールは、標準的なＰＣＲ技術を使用して増幅される。次に、ＤＮＡプールは試験管内で転写される。次に、ＲＮＡ転写産物は、アフィニティクロマトグラフィーへ供される。転写産物は、標的リガンドが固定されたカラムを通じて最も典型的に通過するか又は磁気ビーズ又はその類似物と接触する。リガンドへ結合するプールにあるＲＮＡ分子はカラム又はビーズへ保持され、その間、結合していない配列は洗い流される。次に、リガンドを結合するＲＮＡ分子は逆転写され、（通常溶出後）ＰＣＲによって再度増幅される。次に、選択されたプールの配列は、選抜の同一タイプの別の回を通じて置かれる。典型的に、選択されたプールの配列は、選抜手段の総計約３回ないし１０回の繰り返しを通じて置かれる。次に、ｃＤＮＡは、標的リガンドのためのアプタマーとして作用できるＲＮＡ分子の配列を同定するため、標準的な手段を使用して増幅され、クローン化され、配列決定される。
【００９８】
本発明における使用のために、アプタマーは、正常な生理学的条件を模擬する塩濃度及び温度の存在下でリガンド結合のために選抜されてもよい。一度アプタマー配列がうまく同定されると、アプタマーはさらに、変異誘発したアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドのプールから開始する選抜のさらなる回を実施することによって最適化されてもよい。
【００９９】
アプタマーがまだ入手可能かどうかに関係なく、当業者は適切なリガンドを一般に選択できる。たいていの場合において、当業者による選択の小さな有機分子を結合するアプタマーが得られうる。試験管内選抜プロセスの独特の性質によって、構造のどんなタイプが望ましいリガンドを結合するかもしれないかに関する先行知識の完全な不足にもかかわらず望ましいリガンドを結合する適切なアプタマーを単離できる。
【０１００】
アプタマー及び会合したリガンドについての結合定数は、例えば、リガンドが銭アプタマーへ結合するよう機能し、リガンドの投与の際に得られるリガンドの濃度で望ましい効果を有するようである。生体内での使用のために、例えば結合定数は、血清又は（眼の硝子体流体などの）他の組織において達成できるリガンドの濃度を下回って結合が生じるようであるべきである。例えば、生体内での使用に必要なリガンド濃度は、生物体に及ぼす望ましくない効果を有することができるであろう濃度も下回る。
【０１０１】
アプタマー核酸配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び混合した組成物を含むことに加えて修飾されてもよい。例えば、特定の修飾されたヌクレオチドは、改善された生体内安定性又は改善された送達特徴など、ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド上での改善された特徴を付与できる。このような修飾の例には、リボース及び／又はリン酸塩及び／又は塩基の位置にある化学的な置換が含まれる。修飾されたヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸにより同定される核酸リガンドは、ピリミジンの５’位置及び２’位置で化学的に修飾されるヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する「修飾されたヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド」という表題の米国特許第５，６６０，９８５号に記載される。前述の米国特許第５，６３７，４５９号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する非常に特異的な核酸リガンドを記載する。「分子内核親和性求核性置換による公知の及び新規の２’修飾されたヌクレオシドの調製の新規の方法」という表題の１９９４年６月２２に出願された米国出願シリアル番号第０８／２６４，０２９号は、多様な２’−修飾されたピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載する。
【０１０２】
本発明のアプタマー核酸配列はさらに、「指数関数的な濃縮によるリガンドの系統的な進化：キメラＳＥＬＥＸ」という表題の米国特許第５，６３７，４５９号、及び「指数関数的な濃縮によるリガンドの系統的な進化：配合されたＳＥＬＥＸ」という表題の米国特許第５，６８３，８６７号にそれぞれ記載される他の選択されたオリゴヌクレオチド及び／又は非オリゴヌクレオチド機能的単位と組み合わされてもよい。
【０１０３】
アンタゴニストアプタマー標的
本発明は、アプタマー、特に１つ以上の結合パートナーへの多様な生物標的のいずれかの結合を阻害するよう機能する１つ以上の可溶性高分子量の立体的な基へ結合する特に立体的に増強したアプタマーを提供する。アプタマーはそれにより生物標的のアンタゴニストとして機能する。たいていの場合において、標的／結合パートナーの相互作用の混乱は、標的タンパク質の１つ以上の生物機能を阻害するよう機能するであろう。しかしながら、特定の場合において、結合パートナーが標的の生物機能を阻害するよう機能する場合、立体的に増強したアプタマーアンタゴニストは標的タンパク質の生物機能を活性化してもよい。したがって、本発明の「アンタゴニスト」アプタマー抱合体は、例えば（シグナル伝達リガンドポリペプチドなどの）標的タンパク質と、その結合パートナー（細胞表面受容体タンパク質など）の１つ以上との結合の機能的な「アンタゴニスト」である。
【０１０４】
例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、乾癬、眼の疾患、コラーゲン循環器疾患及び新生物性疾患を含む血管形成を包含する多様な疾病におけるＶＥＧＦの役割によって広範囲の臨床上の有用性を有する。
【０１０５】
ＶＥＧＦリガンドは、ＶＥＧＦ遺伝子の代替的なスプライシングの結果として４つの形態（ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６）において生じる（Ｈｏｕｃｋほか（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．５： １８０６−１８１４； Ｔｉｓｃｈｅｒほか（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６： １１９４７−１１９５４）。２つのより小さな形態は拡散可能であるのに対し、より大きな２つの形態はヘパリンに対するその高い親和性の結果として、細胞膜へ主として局在したままである。ＶＥＧＦ−１６５もヘパリンへ結合し、最も豊富な形態である。ヘパリンへ結合しない唯一の形態であるＶＥＧＦ−１２１は、より低い分裂能（Ｋｅｙｔほか（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１： ７７８８−７７９５）と同様、ＶＥＧＦ受容体に対するより低い親和性を有するようである（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎほか（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１： ５５１９−５５２３）。ＶＥＧＦの生物効果は、発現が内皮由来の細胞に非常に制限される２つのチロシンキナーゼ受容体（それぞれＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２としても公知のＦｌｔ−１及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ）によって仲介される（ｄｅ Ｖｒｉｅｓほか（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ９８９−９９１； Ｍｉｌｌａｕｅｒほか（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２： ８３５−８４６； Ｔｅｒｍａｎほか（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６： ５１９−５２４）。両機能的状態の発現が高い親和性結合に必要である一方で、内皮細胞における走化性及び分裂促進的シグナル伝達は主としてＫＤＲ受容体を通じて生じるようである（Ｐａｒｋほか（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９： ２５６４６−２５６５４； Ｓｅｅｔｈａｒａｍほか（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０： １３５−１４７； Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒほか（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９８８−２６９９５）。血管の発達のためのＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体の重要性は、ＶＥＧＦ遺伝子に対する単一の対立遺伝子（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔほか（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０： ４３５−４３９； Ｆｅｒｒａｒａほか（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０： ４３９−４４２）又はＦｌｔ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）遺伝子（Ｆｏｎｇほか（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６： ６６−７０）若しくはＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦ−Ｒ２）遺伝子（Ｓｈａｌａｂｙほか（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６： ６２−６６）の両対立遺伝子を欠失するマウスにおいて最近示されている。各場合において、血管形成における明確な異常性は胚死亡率を生じることが観察された。
【０１０６】
ＶＥＧＦは、事実上すべての腫瘍細胞によって変動する量で産生及び分泌される（Ｂｒｏｗｎほか（１９９７）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ及びＲｏｓｅｎ編）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂａｓｅｌ、ｐｐ．２３３−２６９）。ＶＥＧＦ及びその受容体が腫瘍成長に関与するという直接的な証拠は、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍ｘｅｎｏｇｒａｆｔの成長がＶＥＧＦに対する抗体を中和すること（Ｋｉｍほか（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２： ８４１−８４４）によって、優位抑制型ＶＥＧＦ受容体ｆｌｋ−１の発現（Ｍｉｌｌａｕｅｒほか（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６： １６１５−１６２０； Ｍｉｌｌａｕｅｒほか（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６７： ５７６−５７９）によって、Ｆｌｋ−１チロシンキナーゼ活性の低分子量阻害剤（Ｓｔｒａｗｎほか（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６： ３５４０−３５４５）によって、又はＶＥＧＦｍＲＮＡに対するアンチセンス配列の発現（Ｓａｌｅｈほか（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６： ３９３−４０１）によって阻害できることを示すことによって最近得られた。重要なことに、腫瘍の転移の発症は、VEGFアンタゴニストによって劇的に低下することも発見された（Ｃｌａｆｆｅｙほか（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６： １７２−１８１）。
【０１０７】
したがって、ＶＥＧＦのアプタマーアンタゴニストは、血管新生を包含する疾病の治療において有用である。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、老年者集団におけるその他の疾病よりもより重度の展望を生じる脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の存在によって特徴付けられる進行性疾患である新生血管の加齢関連黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療するために使用されてきた（Ｃｓａｋｙほか（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１０： ８８０−８８１）。
【０１０８】
ＶＥＧＦ阻害剤の１つのタイプは、核酸ベースのＶＥＧＦリガンドｔｅｒｍｅｄアプタマーである。アプタマーは、特異的な３時限構造を採用する核酸の化学的に合成された短鎖であり、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる試験管内選抜のプロセスを通じて特定の標的に対する親和性について選抜される。ＳＥＬＥＸは、いずれかの標的に対する適切な結合親和性及び特異性を有する特異的な配列について迅速にオリゴヌクレオチドの莫大な数がスクリーニングされる組み合わせ化学方法論である。このプロセスを使用して、特定の標的に特異的な新規のアプタマー核酸リガンドが作製されてもよい。
【０１０９】
ＶＥＧＦの作用を遮断するＶＥＧＦアプタマー阻害剤が開発されてきた。これらの抗ＶＥＧＦアプタマーは、ヒトＧＶＥＧＦの１６５ｋＤａ分子種へ高い親和性で結合する小さな安定性のあるＲＮＡ様分子である。このようなＶＥＧＦアプタマーは、乾癬、眼の疾患、コラーゲン循環器疾患及び新生物性疾患を含む血管形成を包含する多様な疾病におけるＶＥＧＦリガンドの役割によって広範囲の臨床上の有用性を有する。一般にＳＥＬＥＸプロセス、特にＶＥＧＦアプタマー及び製剤は、例えば米国特許第５，２７０，１６３号、第５，４７５，０９６号、第５，６９６，２４９号、第５，６７０，６３７号、第５，８１１，５３３号、第５，８１７，７８５号、第５，８４９，４７９号、第５，８５９，２２８号、第５，９５８，６９１号、第６，０１１，０２０号、第６，０６１，６９８号、第６，１４７，２０４号、第６，１６８，７７８号、第６，４２６，３３５号、及び第６，６９６，２５２号に記載されており、それらの各々の内容は本明細書に参照によって特に組み込まれる。
【０１１０】
多様な他の生物標的を標的とする多くの他のアプタマー配列が開発されてきた。例えば、サイトカイン（米国特許第６，０２８，１８６号参照）、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体（米国特許第６，６８２，８８６号参照）、ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，６９３，５０２号、第５，７６３，１７３号、第５，８７４，５５７号、及び第６，０２０，１３０号参照）、補体系タンパク質（米国特許第６，３９５，８８８号及び第６，５６６，３４３号参照）、レクチン（米国特許第５，７８０，２２８号、第６，００１，９８８号、第６，２８０，９３２号、及び第６，５４４，９５９号参照）、インテグリン（米国特許第６，３３１，３９４号参照）、及び肝細胞成長因子／散乱係数（ＨＧＦ／ＳＰ）又はその受容体（ｃ−ｍｅｔ）（米国特許第６，３４４，３２１号参照）と同様、ＰＤＧＦ（米国特許第５，６６８，２６４号、第５，６７４，６８５号、第５，７２３，５９４号、第６，２２９，００２号、第６，５８２，９１８号、及び第６，６９９，８４３号参照）、塩基性ＦＧＦ（米国特許第５，４５９，０１５号及び第５，６３９，８６８号参照）、ＣＤ４０（米国特許第６，１７１，７９５号参照）、ＴＧＦβ（米国特許第６，１２４，４４９号、第６，３４６，６１１号、及び第６，７１３，６１６号参照）、ＣＤ４（米国特許第５，８６９，６４１号）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン（米国特許第５，８３７，４５６号及び第５，８４９，８９０号参照）、ＨＫＧＦ（米国特許第５，７３１，４２４号、第５，７３１，１４４号、第５，８３７，８３４号、及び第５，８４６，７１３号参照）、ＩＣＰ４（米国特許第５，７９５，７２１号）、ＨＩＶ逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号参照）、ＨＩＶインテグラーゼ（米国特許第５，５８７，４６８号及び第５，７５６，２８７号参照）、ＨＩＶ−ｇａｇ（米国特許第５，７２６，０１７号参照）、ＨＩＶ−ｔａｔ（米国特許第５，６３７，４６１号参照）、ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−ｒｅｖ（米国特許第５，４９６，９３８号及び５，５０３，９７８号）、ＨＩＶヌクレオカプシド（米国特許第５，６３５，６１５号及び第５，６５４，１５１号）、好中球エラスターゼ（米国特許第５，４７２，８４１号及び第５，７３４，０３４号）、ＩｇＥ（米国特許第５，６２９，１５５号及び第５，６８６，５９２号）、タキキニンＰ物質（米国特許第５，６３７，６８２号及び第５，６４８，２１４号）、分泌性ホスホリパーゼＡ２（米国特許第５，６２２，８２８号参照）、トロンビン（米国特許第５，４７６，７６６号参照）、腸ホスファターゼ（米国特許第６，２８０，９４３号、第６，３８７，６３５号、及び第６，６７３，５５３号参照）、テネイシン−Ｃ（米国特許第６，２３２，０７１号及び第６，５９６，４９１号参照）を標的にするアプタマー配列が開発されてきた。これらの配列及び他のアプタマーの配列は本発明において組み込まれうる。望ましい生物標的を標的にするなおより多くのアプタマーは、ＳＥＬＥＸベースの方法論の適応性をおそらく付与される。
【０１１１】
他の有用なアプタマー標的には、以下に制限されるものではないが、ＮＦ−κＢ、ＲＲＥ、ＴＡＲ、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０、ＨＩＶ−１、ＭＡＰキナーゼ、アミロイド原線維、オノスタチンＭ（Ｏｎｏｓｔａｔｉｎ Ｍ）（ＯＳＭ）、Ｅ２Ｆ、アンジオポエチン−２、凝固因子ＩＸａ、Ｒａｓ誘導性Ｒａｆ活性化タンパク質、ヌクレオカプシド、チューブリン、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、及びスパイゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）（鏡像ヌクレオチド）が含まれる。
【０１１２】
本発明の特に有用なアプタマー標的には接着分子及びそれらのリガンドが含まれ、その多くは細胞連絡を容易にし、本発明の方法及び組成物に特に従う大きな多領域の細胞外領域を有する。接着分子には、セレクチン（例、Ｌ−セレクチン（硫酸化ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４、及びＭＡｄＣＡＭ−１へ結合するＣＤ６２Ｌ））、Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）及びＰ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）、インテグリン（例、ＩＣＡＭであるＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３へ結合するＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）及びＩＣＡＭ−１、Ｘ因子、ｉＣ３ｂ及びフィブリノーゲンへ結合するＣＤ１１ｂ）、ＭＡＧ（ミエリン結合糖タンパク質）、ＭＯＧ（ミエリン−オリゴデンドロサイト糖タンパク質）、及びＮＣＡＭ−１（ＣＤ５６）などの神経特異的ＩｇＣＡＭを含むタンパク質の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、（ＬＦＡ−１へ結合する）ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）（前述参照）、ＩＣＡＭ−２（ＣＤ１０２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＤ５０）、及び（ヒアルロニン、アンキリン、フィブロネクチンＭＩＰ１β及びオステオポンチンへ結合する）ＣＤ４４、並びに（カドヘリンＥ（１）、Ｎ（２）、ＢＲ（１２）、Ｐ（３）、Ｒ（４）等及びデスモコリン１などのデスモコリンなどの）カドヘリンが含まれる。
【０１１３】
アプタマーは、診断上の使用（例、ヒト赤血球細胞ゴーストの認識、癌細胞診断における親細胞から分化した細胞の識別）のために開発されてもよい。例えば、アプタマーはタンパク質、代謝産物、アミノ酸、及びヌクレオチドなど（例、コレラ毒素及びブドウ球菌性エンテロトキシン）の分子を特異的に標的にしてもよい。
【０１１４】
立体的な基
本発明は、可溶性で、標的特異的アプタマー核酸配列と共役してもよい高分子量の立体的な基を提供する。立体的な基の共役は、アプタマー核酸の５’末端及びアプタマー核酸の３’末端を通じてであってもよく、又は５’末端ないし３’末端のアプタマー核酸配列に沿ったいずれかの位置を通じてであってもよい。例えば、高分子量の立体的な基は、アプタマー核酸配列の塩基の環外アミノ基にあるアプタマー、ピリミジンヌクレオチドの５の位置、プリンヌクレオチドの８の位置、リン酸塩のヒドロキシル基、又はリボース基のヒドロキシル基と共役してもよい。高分子量の立体的な基をこれらの多様な位置にあるアプタマー核酸配列へ化学的に結合するための手段は本分野で公知であり、及び／又は以下に例証される。
【０１１５】
適切な高分子量の立体的な基には一般に、アプタマー結合標的とその結合パートナーとの相互作用に立体的に干渉するのに十分な水力学的体積を有するいずれかの可溶性高分子量化合物が含まれる。例には、ポリマー、ゲル形成化合物、及びそれらに類似物が含まれるが、それらには限定されない。適切な高分子量の立体的な基には、ポリマーネットワーク間に浸透すること及びポリマーネットワーク内に浸透することが含まれうる。
【０１１６】
特定の可溶性高分子量の立体的な基の最適な特徴は、本明細書に教示された手段並びに本明細書に教示された方法及び組成物を使用して決定されてもよい。最適な立体的ポリマーを決定するための方法には、実施例８ないし実施例１２として本明細書に記載の阻害アッセイが含まれる。
【０１１７】
あるいは、可溶性高分子量の立体的な基の流体力学的半径を測定するために動的光散乱を使用できる。流体力学的半径と有効性との相関は、間接的な有効性の測定結果を提供するかもしれない。
【０１１８】
本発明の特に有用な立体的な基の例には、以下に制限されるものではないが、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、及びアルギン酸塩などの多糖類、ポリエステル、（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（Ｒ）などの）高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、カルボキシメチルセルロース、他のセルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド又はポリエーテルが含まれる。
【０１１９】
有用な立体的な基は、水又は生理学的溶液中で可溶性であろう。ある実施態様において、立体的な基は少なくとも１ｍｇ／ｍｌの水溶解性を有する。別の実施態様において、立体的な基は少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの水溶解性を有する。別の実施態様において、立体的な基は少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの水溶解性を有する。
【０１２０】
有用な立体的な基は、約８００Ｄａないし約３，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有し、及び／又は立体的な障害を提供するために（例えば、リガンドとその受容体などの、アンタゴニストアプタマー標的と標的結合パートナーとの結合を遮断するために）十分なサイズの水力学的体積を有するであろう。ある実施態様において、立体的な基は、約２０キロダルトン（ｋＤａ）ないし約１０００ｋＤａの分子量を有する。別の実施態様において、立体的な基は、約５ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する。ある特定の実施態様において、立体的な基は約２０ｋＤａの分子量を有する。別の特定の実施態様において、立体的な基は約４０ｋＤａの分子量を有する。別の特定の実施態様において、立体的な基は約８０ｋＤａの分子量を有する。
【０１２１】
ある実施態様において、立体的な基は、約０．５ナノメーター（ｎｍ）ないし約１０００ｎｍの範囲の水力学的体積を有する。別の実施態様において、立体的な基は、約１ナノメーター（ｎｍ）ないし約１０ｎｍの範囲の水力学的体積を有する。ある特定の実施態様において、立体的な基は約２ｎｍの水力学的体積を有する。別の特定の実施態様において、立体的な基は約４ｎｍの水力学的体積を有する。別の特定の実施態様において、立体的な基は約８ｎｍの水力学的体積を有する。
【０１２２】
ある実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリエーテルポリオールである。好ましい実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、遊離ヒドロキシル基を有してもよいか、又はアルキル化されてもよい。好ましい実施態様において、アプタマーへ結合していないＰＥＧの末端はメトキシ基を有する（ｍＰＥＧ）。
【０１２３】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基は多糖類である。ある実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はデキストランである。デキストランは、直鎖又は分岐鎖であってもよい。ある実施態様において、デキストランはカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤｅｘ）である。
【０１２４】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はセルロース誘導体である。別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）である。デキストランのアナログであるＣＭＣ及びその還元末端は、共役におけるシッフ塩基化学による生物学的活性化合物のアミン基への共役のために入手可能である。別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリグリコサミンである。別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はキトサンである。
【０１２５】
多糖類は、還元的アミノ化によってアプタマーの末端でアミンへ結合されてもよい。アルデヒド又はヘミアセタール機能性などの還元性末端を含有する多糖類は、二次アミン結合を生じるために還元的アミノ化によって一次アミン含有アプタマーへ共役されてもよい。あるいは、アプタマーは、アプタマーとヒドラジン又はヒドラジン機能性との間に共有結合が存在するよう修飾されてもよい。イミンの、これらのアミン当量のいずれかによる形成は、従来のイミンに相対的な加水分解に対して安定化する抱合体を提供する。ヒドラジン又はヒドラジン共役は、還元的アミノ化がリンカーの長さによって制限される場合に有用である。例えば、ヒドラジン又はヒドラジン共役は、かさ高い部分及び高電子密度巨大分子部分の各々の反応基が互いに引き付けられることができながら、リンカーがかさ高い部分及び高電子密度巨大分子部分を分離するのに必要とされる場合、特に有用である。オリゴヌクレオチドアミンとヒドラジン又はヒドラジドとの間のリンカーは、立体的な自由度の余分を測定してもよい。ヒドラジン又はヒドラジドから生じるイミンは、さらなる還元又はアミン様結合を生じるために還元されることなく使用されてもよい。
【０１２６】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリアルデヒドである。さらなる実施態様において、ポリアルデヒド基は、合成的に派生されるか又はオリゴ糖の酸化によって得られるかのいずれかであってもよい。
【０１２７】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はアルギン酸塩である。好ましい実施態様において、アルギン酸基は、ナトリウム又はカルシウムなどの陽イオン性対イオンを有する塩として提供される陰イオン性アルギン酸基であってもよい。
【０１２８】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はポリエステルである。特定の実施態様において、ポリエステル基は、共ブロック重合体のポリエステル基であってもよい。
【０１２９】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又はポリ乳酸共グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）（ＰＬＧＡ）である。適切なＰＬＧＡ基及びＰＬＧＡ基を共役するための方法は、Ｊ．Ｈ．Ｊｅｏｎｇほか、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，１２，９１７−９２３； Ｊ．Ｅ．Ｏｈほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９９，５７，２６９−２８０及びＪ．Ｅ．Ｏｈほか、米国特許第６，５８９，５４８号に見られ、各々の内容はその全体において本明細書で参照によって組み込まれる。
【０１３０】
別の実施態様において、高分子量の立体的な基はデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）である。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、モノマー及び表面修飾のいずれかの組み合わせから構成されてもよい。有用な単量体の例には、以下に制限されるものではないが、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）が含まれる。有用な表面修飾の例には、以下に制限されるものではないが、陽イオン性アンモニウム、Ｎ−アシル及びＮ−カルボキシメチル基が含まれる。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、多価陰イオン性、多価陽イオン性、疎水性又は親水性であってもよい。ある特定の実施態様において、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は約１個ないし約２５６個の表面修飾基を有する。別の特定の実施態様において、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）は、約４、８、１６、３２、６４又は１２８個の表面修飾基を有する。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）及びデンドリマー共役技術の例は米国特許第５，７１４，１６６号に見られ、それはその全体において本明細書に参照によって組み込まれる。デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）をアプタマーへ共役するための一般的な合成スキームは図１５に示される。
【０１３１】
別の実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。ＢＳＡ上の遊離チオールの存在は、ある末端にチオール反応基を、その他の末端にアミン反応基を含有する二機能性リンカーを採用することによって、アミン含有アプタマーの共役を可能にする。ＢＳＡをアプタマーへ共役するための一般的な合成スキームは図１４に示される。二機能性リンカーをアプタマーへ共役するための一般的な合成スキームは図１６に示される。
【０１３２】
他の特に有用な実施態様において、可溶性高分子量の立体的な基は、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸塩、（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（Ｒ）などの）高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリエーテル又はポリカプロラクトンであってもよい。
【０１３３】
荷電された分子
本発明は、標的特異的アプタマー核酸配列などの生物学的活性分子へ共役されてもよい大きく荷電分子を提供する。荷電分子は、本分野で周知のいずれかの適切な電荷分子でありうる。好ましくは荷電分子は陰イオン荷電した又は陽イオン荷電したポリマー又は多価電解質である。荷電分子を生物学的活性分子へ化学的に結合させるための手段は、本分野で公知であるか及び／又は以下に例証される。
【０１３４】
陰イオンポリマーの例には、以下に制限されるものではないが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリアクリルアミド、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カラゲナン、硫酸セルロース、硫酸デキストラン／デキストリン、ポリ（スルホン酸ナフタレン）、ポリ（スチレン−４−スルホン酸）及びポリ（４−スチレンスルホン酸共マレイン酸）が含まれる。
【０１３５】
陽イオンポリマーの例には、以下に制限されるものではないが、キトサン、ポリグルコサミン、ポリリジン、ポリグルタミン酸塩、ポリビニルアミン、２−（ジエチルアミノ）エタノール（ＤＥＡＥ）、スペルミン及びプトレシンなどのアミンを含むポリマー、及び他のポリアミンが含まれる。
【０１３６】
「多価電解質」という語は、荷電された（負に荷電された、正に荷電された、または双性イオン性の）、又は荷電させられることのできるいずれかの分子、イオン又は粒子、有機物又は無機物を記載するよう使用される。多価電解質は、少なくとも１つの、好ましくは２つ以上の荷電した基を有する。「多価電解質」という語には、異別の多価電解質又は異別の分子量分布を有する同様の多価電解質の混合物も含まれる。「電解質」は、単一の分子又は分子の凝集体であってもよい。多価電解質が粒子状である場合、つまり、複数の分子凝集体からなる場合、粒子は多孔性又は非多孔性であることができ、例えばミセル（陽イオン性又は陰イオン性）又はリポソーム（陽イオン性又は陰イオン性）などの巨大分子構造であってもよい。多か電解質は、陽イオン性多価電解質、陰イオン性多価電解質、両性多価電解質及びそれらの混合物からなる群から選択できる。
【０１３７】
多価電解質は、四級アンモニウム、スルホニウム、ホスホニウム、カルボン酸塩、スルホン酸塩及びリン酸塩からなる群から選択される１つ以上のイオン基を含むポリマー主鎖を典型的に含むことができる。
【０１３８】
このような多価電解質化合物に適した主鎖構造の例には、以下に制限されるものではないが、アクリルアミド、付加ポリマー（例、ポリスチレン）、オリゴ糖及び多糖類（例、アガロース、デキストラン、セルロース）、ポリアミン及びポリカルボン酸塩、ポリエチレン、ポリイミン、ポリスチレン、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１３９】
陽イオン性多価電解質は、四級アンモニウムなどの１つ以上のイオン基、貯蔵溶液ｐＨで荷電した一次、二次、又は三次アミン、貯蔵溶液ｐＨで荷電した複素環式化合物、スルホニウム基、又はホスホニウム基を典型的に含有する。
【０１４０】
陰イオン性多価電解質は、カルボン酸基、スルホン酸基及びリン酸基などの１つ以上のイオン基を典型的に含有する。
【０１４１】
さらに、これらのカテゴリーのうちの２つ以上の特徴を有する多価電解質も本発明の方法において使用されてもよい。例えば、ポリアクリルアミドなどの化合物の部分的な加水分解は、アミド基（非イオン性）及びカルボン酸基（陰イオン性）の両者を有する両性多価電解質を生じる。
【０１４２】
陽イオン性多価電解質の例には、以下に制限されるものではないが、ポリビニルアルコールなどの付加ポリマー及び、ポリ（ビニル４−アルキルピリジニウム）、ポリ（ビニルベンジルトリメチル−１アンモニウム）及びポリビニルイミンなどの他のポリビニル化合物、アミノ化スチレン、コレスチラミン、ポリエチレンイミンなどのポリイミン、アミノ化多糖類、特にデキストラン（例、炭酸デキストラン及びＤＥＡＥデキストラン）などの架橋された多糖類、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１４３】
陰イオン性多価電解質の例には、以下に制限されるものではないが、メタンプロパンスルホン酸アクリルアミド（ポリ−ＡＭＰＳ）、ポリ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルメタクリルアミド）及びアクリルアミドの他の陰イオン共重合体などのアクリルアミド、アルキン酸塩及びアルギン酸、アクリル酸塩及びメタクリル酸塩の誘導体のホモポリマー及び共重合体などの付加ポリマー（例、エチルメタクリル酸ヒドロキシル（ポリ−ＨＥＭＡ）、ポリ（２−メタクリル酸ＤＥＡＥ）リン酸）、及びポリ（ポリアクリル酸ナトリウムなどの塩を含むアクリル酸エチル共マレイン酸無水物共酢酸ビニル）ナトリウム、ポリスチレン（例、スルホン酸ポリスチレン、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、ポリスチレンナトリウムスルホン酸ナトリウム（「ＮａＰＳＳ」）、ポリ（無水マレイン酸共スチレン）２−ブトキシエチルエステル、アンモニウム塩）、並びに、遊離ヒドロキシル機能性を有するそれらのエステル及びアミド、ヒアルロン酸塩、陰イオン的に荷電したシクロデキストランなどのオリゴ糖（例、スルホブチルエーテル、β−シクロデキストラン）、ペクチン酸、ポリアクリル酸（例、ポリ（アクリル酸ｄｏエチレン）ナトリウム）、多糖類、デキストラン（例、スルホン酸デキストラン及びヘパリン）などの特に架橋した多糖類、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルホスホン酸、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１４４】
多価電解質として使用するのに適した他の材料には、以下に制限されるものではないが、ヘパリン及びヘパリン誘導体、陰イオン性及び陽イオン性の両者のリポソーム、陰イオン性及び陽イオン性の両者のミセル、ポリビニルピリジンなどのポリアミン、クロロスルホン酸化ポリエチレン、ポリ（４−ｔ−ブチルフェノール共酸化エチレン共ホルムアルデヒド）リン酸、エチル硫酸ポリエチレンアミノステアラミド、ポリ（エチレン共アクリル酸イソブチル共メタクリル酸）カリウム、ポリ（エチレン共アクリル酸イソブチル共メタクリル酸）ナトリウム、ポリ（エチレン共アクリル酸イソブチル共メタクリル酸）ナトリウム亜鉛、ポリ（エチレン共アクリル酸イソブチル共メタクリル酸）亜鉛、ポリ（エチレン共メタクリル酸共酢酸ビニル）カリウム、ポリエチレンイミン、及びポリ（酸化エチレン共ホルムアルデヒド共４−ノニルフェノール）リン酸、アガロース、セルロース（例、ベンゾイル化ナフトイル化ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース、ベンジルＤＥＡＥセルロース、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）セルロース、カルボキシメチルセルロース、リン酸セルロース、ＤＥＡＥセルロース、エピクロロヒドリントリエタノールアミンセルロース、オキシセルロース、スルホキシエチルセルロース及びＱＡＥセルロース）、デンプン、及びそれらの類似物などの架橋された多糖類を含む多糖類、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１４５】
当業者は、「高電荷密度ポリマー」という語の意味を理解するであろう。本明細書で使用される「高電荷密度ポリマー」は、実質的に高い電荷密度を有するよう本分野で典型的に認識されるポリマーを指す。ある実施態様において、高電荷密度ポリマーは、約１ミリ当量／グラム（ｍｅｑ／ｇ）ないし約２０ｍｅｑ／ｇの範囲の電荷密度を有してもよい。別の実施態様において、高電荷密度ポリマーは、少なくとも５ｍｅｑ／ｇの電荷密度を有する。別の実施態様において、高電荷密度ポリマーは、少なくとも１０ｍｅｑ／ｇの電荷密度を有する。
【０１４６】
高分子量の立体的な基は、アプタマー上のいずれかの位置でアプタマーへ結合されてもよい。本発明のある有用な実施態様において、高分子量の立体的な基は、アプタマー配列の５’末端で、又はアプタマー配列の３’末端で、又は５’末端又は３’末端以外の位置でアプタマーへ結合されてもよい。高分子量の立体的な基へ結合するための適切な内部アプタマー配列位置（つまり、５’末端以外又は３’末端以外の位置）の例には、アプタマー核酸配列の１つ以上の塩基上の環外アミノ基、１つ以上のピリミジンヌクレオチドの５の位置、１つ以上のプリンヌクレオチドの８の位置、リン酸塩の１つ以上のヒドロキシル基、又は１つ以上のリボース基の１つ以上のヒドロキシル基が含まれる。
【０１４７】
本発明は、対応する結合していないアプタマーよりも標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有するアプタマー抱合体を同定する方法を提供する。本発明には一般に次の段階が含まれる。すなわち、
ａ）可溶性高分子量の立体的な基へ独立して結合した複数のアプタマー抱合体を提供する段階、
ｂ）これら異別に共役されるアプタマーの各々を独立してリガンド及びリガンドの受容体と接触させる段階、
ｃ）各アプタマー抱合体の存在下でのリガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量を、アプタマー抱合体の不在下でのリガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量と比較する段階
である。
【０１４８】
次に、リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化を阻害する最大の能力を有する特定のアプタマー抱合体を選抜する。それにより、方法は、リガンド／受容体標的に及ぼすアンタゴニスト効果の増強したアプタマー抱合体を同定する。
【０１４９】
ある実施態様において、標的がリガンド又はリガンドの受容体である、標的に及ぼすアンタゴニスト効果の増強したアプタマー抱合体を同定する方法は、アプタマーの５’末端で、３’末端で、及び１つ以上の５’末端以外又は３’末端以外の位置で、約２０ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有し、多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、カルボキシメチルセルロース、セルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド、及びポリエーテルからなる群から選択される可溶性高分子量の立体的な基へ独立して結合された複数のアプタマー抱合体を提供する段階、アプタマー抱合体の各々をリガンド又はリガンドの受容体と接触させる段階、リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量を検出する段階、リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化を阻害する最大の能力を有し、対応する共役していないアプタマーよりもリガンド／受容体標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有するアプタマー抱合体を選抜する段階を含む。
【０１５０】
特定の理論又は作用のメカニズムに対して本発明を制限せずに、アプタマーの立体的な増強から生じるアンタゴニスト活性の拡大の原理は、タンパク質−タンパク質間の相互作用（例、リガンド及びその受容体などの結合パートナーとのあるタンパク質の相互作用を遮断する作用）の混乱に影響するアプタマーへ一般的に適用可能である。
【０１５１】
作用の第一メカニズムにおいて、アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、個別の受容体結合部位を越えてアプタマーの到達が伸展でき、それにより受容体へ結合するリガンドの能力を遮断する。
【０１５２】
アプタマーは、リガンドの受容体結合部位に対して近くの、隣接した、近位の又は遠位の領域にあるリガンドへ結合してもよい。アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、隣接する受容体結合部位を越えてアプタマーの到達が伸展し、それにより受容体へ結合するリガンドの能力を遮断する。アプタマーのこのような立体的な増強の例は図９に示されている。図９は、可溶性高分子量の立体的な基（５）が受容体結合部位（４）を越えて伸展する場合の受容体結合部位（４）に隣接する部位（３）でリガンド（２）へ結合する可溶性高分子量の立体的な基（５）へ抱合されたアプタマー（１）を示す。高分子量の立体的な基（５）は、受容体（７）のリガンド結合部位（６）へ結合するリガンド（２）の受容体結合部位（４）の能力を妨害する。
【０１５３】
類似した方法で、アプタマーは、リガンド結合受容体のリガンド結合部位に対して近くの、隣接した、近位の又は遠位の領域にあるリガンド結合受容体へ結合してもよい。アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、隣接するリガンド結合部位を越えてアプタマーの到達を伸展させ、それによりリガンドへ結合する受容体の能力を遮断する。アプタマーのこのような立体的な増強の例は図１０に示されている。図１０は、可溶性高分子量の立体的な基（５）がリガンド結合部位（６）を越えて伸展する場合のリガンド結合部位（６）に隣接する部位（３）で受容体（7）へ結合する可溶性高分子量の立体的な基（５）へ抱合されたアプタマー（１）を示す。高分子量の立体的な基（５）は、受容体（７）のリガンド結合部位（６）へ結合するリガンド（２）の受容体結合部位（４）の能力を妨害する。
【０１５４】
本発明のある態様において、標的タンパク質が、生理学的ｐＨで全体的な正の電荷によって特徴付けられる塩基性ドメインと同様、生理学的ｐＨで全体的な負の電荷によって特徴付けられる酸性ドメインを有する場合の、結合パートナーへの標的タンパク質の結合を阻害する。本発明のこの態様において、結合パートナーは標的タンパク質の酸性ドメインを通じて結合し、結合パートナーへの標的タンパク質の結合は、標的タンパク質の酸性ドメインへの結合パートナーの結合を立体的に妨げる可溶性高分子量の立体的な基及び標的タンパク質の塩基性ドメインへ結合するアプタマー核酸配列を含む立体的に増強されたアプタマー抱合体と標的タンパク質を接触させることによって阻害され、それにより結合パートナーへの標的タンパク質の結合は阻害される。図１１は、リガンド（左）の塩基性領域へ結合するアプタマーがリガンド受容体（右）へのリガンド結合を効果的に遮断するよう立体的に増強される、立体的に増強されるリガンドアプタマーアンタゴニストのデザインの模式的な表示である。
【０１５５】
作用の第二メカニズムにおいて、アプタマーへの可溶性高分子量の立体的な基の付加は、リガンドにおけるアロステリック効果を誘発できる。可溶性高分子量の立体的な基はリガンドの高次構造を変化させてもよく、それによりリガンドのその受容体への結合活性を変化してもよい。複数の結合部位を有するリガンドの場合において、アロステリック効果は協調した挙動を生じうる。
【０１５６】
可溶性高分子量の立体的な基へ抱合されたＶＥＧＦアプタマーの活性を、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイによって決定した。アッセイの結果を図４ないし図８に示す。結果は、ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）（図１にその構造が示されるＥＹＥ−００１、ＭａｃＩ）などの立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体が、ＥＹＥ−００２（図２にその構造が示されるＭａｃＩＩ）などの増強されていないＶＥＧＦアプタマーよりもＶＥＧＦ結合を阻害する上で非常により効果的であることを示す。
【０１５７】
５’ペグ化したアプタマーの化学構造の例を図１に示す。多様な５’ペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するアッセイの結果のグラフ呈示を図４に示す。立体的に増強したＶＥＧＦアプタマーの有効性は、添加された可溶性高分子量の立体的な基の分子量と相関した。図４に示されるアッセイは多様な分子量の分岐鎖ＰＥＧを比較した。例えば、２つの２０ｋＤａＰＥＧユニット（２０Ｋ／２０Ｋ分岐鎖）を有する抱合体を、５ｋＤａＰＥＧ（５Ｋ／５Ｋ分岐鎖）を有する抱合体と比較した。図４に示されるアッセイは多様な分子量の直鎖ＰＥＧを比較した。例えば、３０ｋＤａのＰＥＧ（３０Ｋ直鎖）を有する抱合体を１０ｋＤａのＰＥＧ（１０Ｋ直鎖）を有する抱合体と比較した。有意に、抱合していないＰＥＧ単独（コントロール）は、これらの可溶性高分子量の立体的な基がＶＥＧＦ−Ｆｌｔ−１結合に直接的には影響しないが、立体的な基が抱合されたＶＥＧＦアプタマーを通じて作用することを示す、Ｆｌｔ−１へのＶＥＧＦの結合を阻害しなかった。
【０１５８】
デキストランにより共役されたアプタマーの化学構造の例を図１２に示す。デキストラン−ＶＥＧＦアプタマー抱合体の活性を、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイにより決定した。アッセイ結果のグラフ呈示を図５に示す。図４に示されるアッセイは多様な分子量のデキストランも比較した。例えば、７０ｋＤａのデキストラン（７０Ｋデキストラン）を有する抱合体を１０ｋＤａのデキストラン（１０Ｋデキストラン）を有する抱合体と比較した。有意なことに、共役していないデキストラン単独（コントロール）は、これらの可溶性高分子量の立体的な基がＶＥＧＦ／Ｆｌｔ−１結合に直接的には影響しないが、立体的な基が共役されたＶＥＧＦアプタマーを通じて作用することを示す、Ｆｌｔ−１へのＶＥＧＦの結合を阻害しなかった。
【０１５９】
ＣＭＣにより共役されたアプタマーの化学構造の例を図１３に示す。ＣＭＣ−ＶＥＧＦアプタマー抱合体の活性を、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイにより決定した。アッセイの結果を図６に図示する。顕著に、共役していないＣＭＣ単独（コントロール）は、これらの可溶性高分子量の立体的な基がＶＥＧＦ／Ｆｌｔ−１結合に直接的には影響しないが、立体的な基が共役されたＶＥＧＦアプタマーを通じて作用することを示す、Ｆｌｔ−１へのＶＥＧＦの結合を阻害しなかった。
【０１６０】
図７は、多様な分子量及び分子半径（水力学的体積）のＰＥＧ部分を有する多様なペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果を示す。立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体の有効性は、付加された可溶性高分子量の立体的な基の分子量とも相関した。立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体の有効性は、付加された可溶性高分子量の立体的な基の分子半径（水力学的体積）とも相関した。
【０１６１】
図８は、多様な３’ペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果を示す。ＶＥＧＦアプタマーの３’末端へＰＥＧを抱合することは、増強されていないＶＥＧＦアプタマーよりもＶＥＧＦ結合を阻害する上でより効果的であることを示した。結果は、可溶性高分子量の立体的な基がアプタマーの多様な位置に置かれてもよいことも示した。
【０１６２】
本発明は、ａ）荷電分子を生物学的活性分子荷電抱合体を形成する生物学的活性分子へ結合させる段階と、ｂ）生物学的活性分子荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、生物学的活性分子を眼へ送達する方法も提供する。
【０１６３】
本発明は、生物学的活性分子を眼へイオン泳動で送達するのに有用な製剤にも関する。製剤は、荷電分子へ結合した生物学的活性分子を含む。ある実施態様において、製剤は、荷電分子へ抱合された生物学的活性分子と、イオン泳動送達に適した担体とを含む。
【０１６４】
イオン泳動送達に適したいずれかの担体は、本発明において使用できる。適切な担体の例には、以下に制限されるものではないが、米国特許第６，１５４，６７１号、第６，３１９，２４０号、第６，５３９，２５１号、第６，５７９，２７６号、第６，６９７，６６８号、第６，７２８，５７３号、第６，８０１，８０４号及び第６，５５３，２５５号、米国特許出願第２００４／０１６７４５９号、第２００４／００７１７６１号及び第２００３／００６５３０５号及び刊行された出願第ＷＯ２００４／１０５８６４号及び第ＷＯ２００４／０５２２５２号に見られうるものが含まれ、それらの各々の内容はそれらの全体において本明細書に参照によって組み込まれる。
【０１６５】
ある態様において、荷電分子は加水分解的に安定した結合によって生物学的活性分子へ結合される。
【０１６６】
別の態様において、荷電分子は荷電したポリマーを含む。ある実施態様において、荷電したポリマーは多価電解質である。ある実施態様において、荷電したポリマーは高電荷密度ポリマーである。別の実施態様において、電荷したポリマーは、約１ミリ当量／グラム（ｍｅｑ／ｇ）ないし約２０ｍｅｑ／ｇの範囲の電荷密度を含む高電荷密度ポリマーである。別の実施態様において、荷電したポリマーは少なくとも１０ｍｅｑ／ｇの電荷を含む高電荷密度ポリマーである。
【０１６７】
ある実施態様において、荷電したポリマーは陽イオンポリマーである。特定の実施態様において、陽イオンポリマーはキトサンである。
【０１６８】
ある実施態様において、荷電したポリマーは陰イオンポリマーである。特定の実施態様において、陰イオンポリマーはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）である。
【０１６９】
別の態様において、生物学的活性分子は核酸である。ある実施態様において、核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、アプタマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドの概説は、Ａ．Ｍｅｓｍａｅｋｅｒほか（本明細書によってその全体において参考文献により組み込まれる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、３６６−３７４）によって提供される。
【０１７０】
ある特定の実施態様において、生物学的活性分子はアプタマーである。別の実施態様において、生物学的活性分子は抗ＶＥＧＦアプタマーである。別の実施態様において、生物学的活性分子は抗ＶＥＧＦアプタマーであるＥＹＥ−００２であり、構造
Ｔｄ−５’−５’−ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ３’−３’−Ｔｄ
（配列番号１）
を有し、式中、「Ｇｍ」は２’−メトキシグアニル酸を表し、「Ａｍ」は２’−メトキシアデニル酸を表し、「Ｃｆ」は２’−フルオロシチジル酸を表し、「Ｕｆ」は２’−フルオロウリジル酸を表し、「Ａｒ」はリボアデニル酸を表し、「Ｔｄ」はデオキシリボチミジル酸を表す（その全体において本明細書に参照によって組み込まれるＡｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．ほか、刊行された出願第ＷＯ２００５／０１４８１４号を参照。）。
【０１７１】
第一の例において、本発明は、ａ）生物学的活性分子荷電抱合体を形成するよう生物学的活性分子へ荷電分子を加水分解的に安定した結合によって結合する段階と、ｂ）生物学的活性分子荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、生物学的活性分子を眼へ送達する方法に関する。
【０１７２】
第二の例において、本発明は、ａ）核酸荷電抱合体を形成する核酸へ非核酸ポリマーを結合する段階と、ｂ）核酸荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、核酸を眼へ送達する方法に関する。
【０１７３】
第三の例において、本発明は、ａ）陰イオン性高電荷密度ポリマーを加水分解的に安定した結合によってアプタマーへ結合する段階と、ｂ）アプタマーによって荷電された抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、アプタマーを眼へ送達する方法に関する。
【０１７４】
第四の例において、本発明は、ａ）カルボキシメチルセルロース部分又はキトサン部分を抗ＶＥＧＦアプタマーへ結合して、抗ＶＥＧＦアプタマー荷電抱合体を形成する段階と、ｂ）抗ＶＥＧＦアプタマーによって荷電された抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階とを含む、抗ＶＥＧＦアプタマーを眼へ送達する方法に関する。
【０１７５】
あるいは、本発明は、眼のイオン泳動を増強させる方法に関する。高分子量中性部分へ共役される生物学的活性分子のイオン泳動送達は、高分子量中性部分を匹敵する大きさの荷電分子と置換することによって増強される。例えば、５ｋＤａないし１００ｋＤａのペグ化したアプタマーのイオン泳動を増強する方法は、カルボキシメチルセルロース又はキトサンなどの５ｋＤａないし１００ｋＤａの高電荷密度ポリマーの替わりにポリエチレングリコールを使用することを含む。
【０１７６】
生物学的活性因子荷電部分の抱合体間の結合は、延長した時間、試験管内及び生体内で安定であるべきである。さらに、結合は、イオン泳動送達中などの電流の適用に際して安定であるべきである。イオン泳動において使用するための抱合体は、電流の適用に際して安定である生理学的に安定な結合を有するべきである。例えば、イオン泳動投与のために企図される生物活性因子荷電部分の抱合体について、抱合体は、適切な送達担体における溶解、イオン送達デバイスにおける設置、及び電流の適用に関する整合性を維持すべきである。
【０１７７】
いずれかの適切な電流密度は、本発明の方法において使用されてもよい。ある実施態様において、電流密度は約０．０１ｍＡ／ｃｍ２ないし約５ｍＡ／ｃｍ２で調整可能である。別の実施態様において、電流密度は約０．１ｍＡ／ｃｍ２ないし約５ｍＡ／ｃｍ２で調整可能である。別の実施態様において、電流密度は約０．８ｍＡ／ｃｍ２ないし約５ｍＡ／ｃｍ２で調整可能である。ある実施態様において、電流は約１μＡないし約１０００μＡの範囲で適用される。好ましい実施態様において、電流は約４分間適用される約４００μＡ（１．２ｍＡ／ｃｍ２の密度での０．１２クーロンの電荷）である。
【０１７８】
いずれかの適切な電位は、本発明の方法において使用されてもよい。ある実施態様において、電流は約１Ｖないし約７５Ｖの範囲の電位で送達される。ある実施態様において、電流は約１．５Ｖないし約９Ｖの範囲の、好ましくは約２Ｖないし約８Ｖの範囲の電位で送達される。
【０１７９】
いずれかの適切なイオン泳動デバイスは本発明において使用されてもよい。生物学的活性分子の治療レベルを送達できるいくつもの眼のイオン泳動デバイスは公知である。典型的なクーロンにより調節される眼のイオン泳動デバイスは、１）患者の眼へ適用できる活性製剤、例えば生物学的活性分子の貯蔵器、２）貯蔵器に配置される少なくとも１つの能動電極、３）受動電極及び４）電流発生装置を含む。典型的に、ある能動電極は、角膜周辺にある眼の組織に面するよう配置される表面電極である。このようなイオン泳動デバイスによって、外来治療を実施できる。
【０１８０】
眼と接触した貯蔵器の表面積の範囲によって、イオン泳動デバイスは、局在化した電荷密度システム又は拡散電荷密度システムを使用して必要に応じて作動される。
【０１８１】
本発明において有用なイオン泳動デバイス及び技術の例は本明細書に提供される。
【０１８２】
Ｏｐｔｉｓ Ｆｒａｎｃｅ，Ｓ．Ａ．によって開発されるアイゲート（Ｒ）は２つの部分、すなわち再利用可能なマイクロ発生装置及び使い捨て可能な眼用アプリケーターを含む。使い捨て可能な眼用アプリケーターは、薬物を保持する内側リング、及び、電流が薬物を眼、特に脈絡膜及び網膜へ送達するよう通される伝導性リングを含有する。再利用可能なマイクロ発生装置は、自動調節特性とともに動力を電池で付与され、戻り電極として使用される前頭パッチへ接続される。アプリケーターはそのチューブ、（薬物をアプリケーターへ注入する）シリンジ及び（マイクロ発生装置へ接続されるリード）を有し、滅菌され、ブリスターへと密閉され、その全体は使い捨て可能である。イオン泳動デバイス及びアイゲート（Ｒ）と関連する技術は例えば、米国特許第６，１５４，６７１号及び公開された出願第ＷＯ２００４／１０５８６４号、及び第ＷＯ２００４／０５２２５２号において記載され、各々の内容はそれらの全体において本明細書に参照によって組み込まれる。
【０１８３】
Ｉｏｍｅｄ社によって開発されたオキュフォア（Ｒ）は薬物アプリケーター、散発性電極、及び電子イオン泳動投与量調節器を含む。薬物アプリケーターは、銀−塩化銀インク伝導部品、薬物製剤を吸収するヒドロゲルパッド、投与量調節器へ伝導性部品を接続するための小さな柔軟性のあるワイヤを含有する小さなシリコーンシェルである。薬物パッドは、使用直前に薬物溶液で水和され、アプリケーターは下まぶたの下で眼の強膜上に設置される（「オキュフォア（Ｒ）」： その内容が本明細書にその全体において参考文献により組み込まれる「眼内薬物送達の未来」Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｇ．Ａ．ほか、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，２（５），５０−５２を参照。）。オキュフォア（Ｒ）と関連するイオン泳動デバイスは、例えば米国特許第６，３１９，２４０号、第６，５３９，２５１号、第６，５７９，２７６号、第６，６９７，６６８号、及び第６，７２８，５７３号に記載される。各々の内容は本明細書にその全体において参照によって組み込まれる。
【０１８４】
Ａｃｉｏｎｔ社によって開発されたビジレックス（Ｒ）は、ユーザーに優しいアプリケーター、投与量調節器、及び接続ワイヤからなる。デバイスは、眼の適用のためにデザインされ、ソフトウェア及びアルゴリズム調節部品及び互いに安全性を最適化する多重電極モニターシステムを含有する。アプリケーターは、眼の湾曲へ適合させながら、下部窩へと快適に滑り込む。細く柔軟なワイヤは、アプリケーターを電流調節器へ接続する。戻り電極は、選択的な薬物輸送及び流量増強によって従来のイオン泳動システムを越えて薬物輸送有効性を亢進する膜も含む電気回路ビジュレックス（Ｒ）システムを完成させるため、身体のほかのどこかに位置どられる。外来性の非薬物イオンの輸送を排除することは、薬物イオンを、強膜組織を流れる電流の一次担体にする（その内容が、本明細書にその全体において参照によって組み込まれる「ビジュレックス（Ｒ）：効果的な眼の後部の非侵襲的治療剤のための応用イオン泳動」、Ｈａｓｔｉｎｇｓ，Ｍ．Ｓ．ほか、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，４（３），５３−５７を参照。）。ビジュレックス（Ｒ）に関するイオン流動装置及び技術は例えば、米国特許第６，８０１，８０４号及び６，５５３，２５５号並びに米国特許出願第２００４／０１６７４５９号、２００４／００７１７６１号及び２００３／００６５３０５号に記載されており、各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
他の眼のイオン泳動システムは、Ｊ．Ａｓｈｏｏｋほか（Ｃｅｒａｍａｔｅｃ社）による刊行された出願第ＷＯ０３／０３３９６２２号、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｅｒｔｓほか（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）による米国特許第６，００１，０８８号、及びＤｏｍｂほかによる米国特許第６，４４２，４２３号に記載される。（Ｈａｄａｓｉｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ及びＹｉｓｓｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）各々の内容はその全部において本明細書に参考文献により組み込まれる。
【０１８６】
眼のイオン泳動の文献概説には、「眼のイオン泳動」、Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｍ．ほか、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９９３），５８，３３１−３５４、及び「眼の薬物送達におけるイオン泳動の役割」、Ｓａｒｒａｆ，Ｄほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ （１９９４），１０（１），６９−８１が含まれる。各内容はその全体において本明細書に参照によって組み込まれる。
【０１８７】
生物学的活性分子は、本分野で公知のいずれかの適切な手段によって荷電分子へ結合されてもよい。電荷分子は、活性機能基によって生物学的活性分子へ結合できる。生物学的活性分子と反応するのに適した活性機能基には、以下に制限されるものではないが、カルボキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、硫酸基、リン酸基、ケト基及びアルデヒド基が含まれる。
【０１８８】
別の態様において、本発明は、イオン泳動送達に有用な生物学的活性分子荷電抱合体組成物に関する。
【０１８９】
ある実施態様において、生物学的活性分子荷電抱合体は、式
ＣＭＣ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号１２）
を有する。
【０１９０】
別の実施態様において、生物学的活性分子荷電抱合体は、式
キトサン−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号１３）
を有する。
【０１９１】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の特定の有用な実施態様及び態様を説明するよう機能し、その範囲を制限するとして解釈されるべきではない。代替的な材料及び方法は同様の結果を得るために利用できる。
【実施例１】
【０１９２】
ＶＥＧＦアプタマーの５’−ＰＥＧ抱合体の調製
手段は、４０ｋＤａＰＥＧ／アプタマー抱合体の調製によって説明される。５’アミノアプタマー（５７吸光度）の溶液をエッペンドルフチューブへ転移し、固体へと凍結乾燥させた。残りを３０μｌのホウ酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）へと再度溶解した。ＰＥＧ ＮＨＳエステルの溶液（１．１当量、３０μｌアセトニトリル中の１１ｍｇ）を前述のアプタマー溶液へ添加した。結果として生じる混合物を十分にボルテックスし、室温で一晩インキュベートした。反応を、２．５ｍｌ容積まで水を添加することによって停止させた。ＳＥＣ ＨＰＬＣによる材料の分析は、アプタマー（１０．２３分）が、抱合体に属するより長い保持時間（７．２分、７５％）を有する別の種に変換されたことを示す。
【０１９３】
混合物を標準的な脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ−１０カラム）で脱塩した。脱塩した材料（３．５ｍｌ）を紫外線（９．５吸光度／ｍｌ）により定量し、粗生成物としての乾燥粉末へと濃縮した。固体を水（０．５ｍｌ）中に再懸濁し、結果として生じるストックを精製するまで−２０℃の冷凍庫に保存した。抱合体の単離を、ＳＥＣ ＨＰＬＣを使用してこの溶液（典型的に約５吸光度）の一定分量を注入することによって達成した。精製した抱合体を生じるため、抱合体に対応する溶出された材料を回収し、回転真空機で濃縮し、脱塩した。生成物の同一性を認証するため、生成物を最終的にＨＰＬＣ及びＭＳにより分析した。
【実施例２】
【０１９４】
ＶＥＧＦアプタマーの５’−デキストラン抱合体の調製
手段を、４０ｋＤａデキストラン／アプタマー抱合体を作製することによって説明する。アミノアプタマー（２８．６吸光度）の一定分量を乾燥粉末になるよう凍結乾燥し、１００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に再度溶解した。この溶液へ添加したのは４０ｋＤａデキストラン（４当量、２０ｍｇ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１０当量超、８ｍｇ）であった。材料すべてが溶解するまで溶液をボルテックスした後、６０℃で一晩インキュベートした。次に、溶液を０．５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に取り込んだ。ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）分析は、材料がアプタマー（１０．８分）及び抱合体（９．６分、幅広のピーク、３５％）の混合物であることを示した。幅広のピークは、デキストラン抱合体が異別の大きさの抱合体の幅広い分布を有することを示す。材料をＰＤ−１０カラムによって脱塩し、脱塩した材料を冷凍庫（−２０℃）で精製するまで保存した。
【０１９５】
前述に調製した試料の一定分量を注入することによって、精製をＳＥＣカラム（Ｓｈｏｗｄｅｘ ＫＷ ８０３）上で実施した。抱合体に対応する画分（大気温、９．６分）を回収した。プールした画分を濃縮した後、ＮＡＰ−１０カラムで脱塩し、最終的な精製された材料を生じた。抱合体の同一性を、紫外線検出及び放射線同位体検出の両者でＳＥＣ ＨＰＬＣ（室温、９．６分）によって認証した。
【実施例３】
【０１９６】
ＶＥＧＦアプタマーの５’−ＣＭＣ抱合体の調製
ＶＥＧＦアプタマーの５’−ＣＭＣ抱合体を作製するため、デキストラン抱合体（実施例２参照）を作成するのに使用されるものと同様の手段を使用した。５’−アミノＶＥＧＦアプタマー（２８吸光度）をエッペンドルフチューブ中で固体残渣になるまで凍結乾燥し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１００μｌ）中に溶解した。このため、添加したのは２０ｍｇ（３．２当量）のＣＭＣであった。ＣＭＣの分子量は約５０ｋＤａであった。次に、水のさらなる一定分量（１００μｌ）を添加してＣＭＣポリマーを可溶化し、濃厚な粘性のある溶液を生じた。最終的に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（８ｍｇ）を添加した。６０℃で一晩撹拌した後、反応を、水（約２ｍｌ）で希釈し水中で（３回）透析することによって停止させ、粗抱合材料を生じた。ＳＥＣ ＨＰＬＣは、抱合された生成物の存在を示した（５．８分ないし８．３分）。抱合体に対応する画分を回収して脱遠視、機能検査のための試料を生じた。抱合体は、ＩＥ ＨＰＬＣ上の非常に幅広のピークとして現れ、材料が多価陰イオン性ポリマーであるという事実を反映する。
【実施例４】
【０１９７】
ＶＥＧＦアプタマーの３’−ＰＥＧ抱合体の調製
３’アミノアプタマー（５７吸光度）の溶液をエッペンドルフチューブへ転移し、固体へと凍結乾燥させた。残基を９０μｌのホウ酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）へと再度溶解した。ポリエチレングリコール−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＰＥＧ−ＮＨＳ）エステルの溶液（１．１当量、３０μｌアセトニトリル）を前述のアプタマー溶液へ添加した。結果として生じる混合物を十分にボルテックスし、室温で一晩インキュベートした。反応を、２．５ｍｌ容積まで水を添加することによって停止させた。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣによる材料の分析は、アプタマーが、抱合体に属するより非常に長い保持時間を有する別の種に変換されたことを示す。
【０１９８】
混合物を標準的な脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ−１０カラム）で脱塩した。脱塩した材料（３．５ｍｌ）を紫外線により定量し、粗生成物としての乾燥粉末へと濃縮した。固体を水（０．５ｍｌ）中に再懸濁し、結果として生じるストックを精製するまで−２０℃の冷凍庫に保存した。抱合体の単離を、ＳＥＣ ＨＰＬＣを使用してこの溶液（典型的に約５吸光度）の一定分量を注入することによって実施した。精製した抱合体を生じるため、抱合体に対応する溶出された材料を回収し、回転真空機で濃縮し、脱塩した。生成物の同一性を認証するため、生成物を最終的にＨＰＬＣ及びＭＳにより分析した。
【実施例５】
【０１９９】
アミン含有アプタマーの二機能性リンカーへの共役
ホスホジエステル結合によって５’末端へ結合されるヘキシルアミンリンカーを含有する２８マーのオリゴヌクレオチド（配列番号８）の１．３０μモルをホウ酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）の２００μｌに溶解し、アセトニトリルの２００ｌ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル含有二機能性リンカー（８．０μモル）の溶液を室温で添加した。結果として生じる反応混合物を室温で１８時間振盪させた後、脱イオン水で３ｍｌへ希釈し、１ｋＤａ膜に対して３５２０×ｇで４時間撹拌しながら透析した。結果として生じる濃縮物を３ｍｌまで再度希釈し、２回目の撹拌しながらの透析を実施した。次に、結果として生じる濃縮物を凍結乾燥し、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ−１、Ｃ１８）及びＭＡＬＤＩ−ＭＳによって修飾を査定した。二機能性リンカー（６−マレイミドカプロン酸；スクシンイミジル−２−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）酢酸；Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ； Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯから購入した。アプタマーへの二機能性リンカーの共役を表す一般的な合成スキームを図１６に示す。
【実施例６】
【０２００】
ＢＳＡへのアプタマーの共役
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の、チオール反応性二機能リンカーで修飾しておいたアプタマー（配列番号８）への共役を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＰＯ３、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．７）中で実施した。ＢＳＡ溶液（６９２μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ）をアプタマー抱合体（３００μｌ中の３００ｎＭ）の溶液へ添加し、大気温で４時間室温にて振盪した。反応混合物を分析し、さらなる処理なしで逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａｐａｋ，Ｃ１８）上での精製へ供した。ＢＳＡをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【実施例７】
【０２０１】
デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）へのアプタマーの共役
デンドリマーの溶液（Ｇ６、シスタミン中心、ＮＨＡｃ表面；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）をメタノールに溶解した（５０μｌ中２．１ｍｇ）後、リン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＰＯ３、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．７）の５０μｌ中のトリスカルボキシエチルホスフィン（５０ｍｇ）で処理し、大気温で３０分振盪した。アプタマー（チオール反応性二機能リンカー（３．０ｍｇ）で修飾された配列番号８）の溶液を、アプタマーをリン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＰＯ３、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．７）の１００μｌへ添加することによって調製した。次に、アプタマー溶液をデンドリマー溶液へ添加し、生じた溶液を室温で１時間撹拌した。溶液を凍結乾燥し、生成物を特徴づけ、サイズ排除クロマトグラフィー（順にＳｈｏｄｅｘ ＫＷ−８０３及びＫＷ−８０４）によって精製した。
【実施例８】
【０２０２】
立体的に増強したＩＣＡＭ、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦアンタゴニストアプタマー
ＫＤＲ／ＦＬＫ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ２）、ＦＬＴ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）及びＶＥＧＦ共受容体ニューロピリンへのＶＥＧＦの結合を阻害する立体的に増強したＶＥＧＦアプタマーの能力を次に様に査定する。立体的に増強されたアプタマーによる結合の阻害を、増強されていないアプタマーによる阻害と比較する。
【０２０３】
ＬＦＡ−１への結合を阻害する立体的に増強したＩＣＡＭ−１アプタマーの能力も同様の手段を使用して検討する。ＰＤＧＦ受容体−β（ＰＤＧＦＲ−β）に対するＰＤＧＦの結合を阻害する立体的に増強したＰＤＧＦアプタマーの能力も同様の手段を使用して検討する。
【実施例９】
【０２０４】
受容体プレートコーティング
結合実験の各セットについて、９６穴アイソプレートの１行（１２穴）を使用する。１２穴の各々をまず、ＰＢＳの１００マイクロリットル（μｌ）中の抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片特異的抗体の２ピコモル（３００ナノグラム（ｎｇ））で、４℃で一晩コーティングする。翌日、各ウェルに結合するタンパク質を、Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液の３００μｌを使用して室温で各回５分で３回洗浄することによってブロックする。次に、各ウェルを室温で２回、結合緩衝液（１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ＨＳＡ、ｐＨ７．４を有するＰＢＳ）の３００μｌで洗浄する。ＫＤＲ／Ｆｃについて、結合緩衝液の１００μｌ中のキメラ受容体の０．２５ピコモル（８５ｎｇ）を最初の１１穴へと添加するのに対し、１２番目のウェルは背景コントロールウェルとしてヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃキメラタンパク質の０．５ピコモル（１１８ｎｇ）を受容する。Ｆｌｔ−１／Ｆｃについて、各結合緩衝液の１００μｌ中のキメラ受容体の０．１２５ピコモル（３０．８ｎｇ）を最初の１１穴へと添加するのに対し、背景コントロールウェル（１２番）はヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃキメラタンパク質の０．５ピコモル（１１８ｎｇ）を受容する。ニューロピリン−１／Ｆｃについて、結合緩衝液の１００μｌ中のキメラ受容体の０．２ピコモル（４８ｎｇ）を１２穴すべてへ添加する。キメラ受容体及びヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質を、各ウェル中の固定した抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片特異的抗体へ室温で２時間ないし３時間結合することによってウェルへと捕捉する。遊離キメラ受容体及びヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質を除去するため、各ウェルを結合緩衝液の３００μｌを使用して室温で洗浄する。
【実施例１０】
【０２０５】
１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５−ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）結合混合物の調製
１μＭ（又は２μＭ）ないし０．５１２ピコモラー（ｐＭ）（又は１．０２４ｐＭ）の範囲のペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）（チューブ１番ないし１０番）の１０個の５倍希釈物の１セットを各々、総計各１００μｌ終容積における穿孔していない１．５ｍｌμ微量遠心チューブ中の結合緩衝液（１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ＨＡＳ、ｐＨ７．４を有するＰＢＳ）中の１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５の約０．０１μＣｉと混合する。チューブ１１番及び１２番について、１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５のたったの０．０１μＣｉをいずれのペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）もなしで添加し、それらはそれぞれポジティブコントロール及び背景コントロールである。１２本のチューブすべてを（ＫＤＲ及びＦｌｔ−１について）３７℃又は（ニューロピリン−１について）室温で１５分ないし２０分インキュベートし、平衡に達するまでペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）をＶＥＧＦへ結合させる。次に、各チューブからの１００μｌの結合混合物を、受容体によりコーティングしたアイソプレート上の対応するウェルへ適用する。プレートを結合平衡が生じるまで３７℃で（ＫＤＲ用及びＦｌｔ−１用）又は室温で（ニューロピリン−１用）２時間ないし３時間インキュベートする。プレートを室温で、０．０５％トゥイーン２０入り（ＫＤＲ用及びニューロピリン−１用）またはなし（Ｆｌｔ−１用）の結合緩衝液の３００μｌ／ウェルで４回洗浄する。プレートを約１０分間空気乾燥し、シンチレーション液の約２００μｌを各ウェルへ添加する。各ウェルの放射能活性をシンチレーション計数により決定する。
【０２０６】
実験のネガティブコントロールについて、ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）について前述の段階すべての後、結合アッセイにおいてペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）を置換するためにポリエチレングリコール分子量４０，０００（４０ｋＤａＰＥＧ）を同一モル濃度で使用する。
【実施例１１】
【０２０７】
ＶＥＧＦ受容体結合の５０％阻害（ＩＣ５０）についての効果的な濃度の決定
ウェルにおける１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５：受容体結合比を、ウェル（１番ないし１１番）上に保持される計数の数から背景（ウェル１２番）を差し引いたものを、最大結合（ポジティブコントロール、ウェル１１番）から背景（ウェル１２番）を差し引いたものによって除するものとして計算する。異別のペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）濃度での結果として生じる結合比を、グラフパッドＰＲＩＳＭプログラム（１部位競合）による非線形回帰を使用することによって分析し、結果として生じる曲線を使用して、ＶＥＧＦ１６５への受容体結合を阻害する上でのペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）の最大半量阻害（ＩＣ５０）を決定する。ＰＥＧを使用する実験のネガティブコントロールからのデータを同一方法によって分析する。
【実施例１２】
【０２０８】
ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）の比較阻害
ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦ結合を阻害する立体的に増強されたＶＥＧＦアプタマー抱合体の能力を、立体的に増強されていないＶＥＧＦアプタマー抱合体の能力と比較した。結果を図４、図５、図６、図７及び図８に示す。結果は、ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）（図１にその構造が示されるＥＹＥ−００１、ＭａｃＩ）などの立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体が、ＥＹＥ−００２（図２にその構造が示されるＭａｃＩＩ）などの増強されていないＶＥＧＦアプタマーよりもＶＥＧＦ結合を阻害する上で非常により効果的であることを示す。さらに、立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体の有効性は、添加した可溶性高分子量の立体的な基の分子量と相関した（２０Ｋ／２０Ｋ分岐を５Ｋ／５Ｋ分岐と、及び３０Ｋ直鎖を１０Ｋ直鎖と比較する。）。立体的に増強したＶＥＧＦアプタマー抱合体の有効性は、付加された可溶性高分子量の立体的な基の分子半径（水力学的体積）とも相関した。有意なことに、抱合していないＰＥＧ、デキストラン又はＣＭＣ単独も、これらの可溶性高分子量の立体的な基はＶＥＧＦ／Ｆｌｔ−１結合に直接的には影響しないが、立体的な基が抱合されたＶＥＧＦアプタマーを通じて作用することを示す。
【０２０９】
ＶＥＧＦアプタマーの３’末端へＰＥＧを共役することが、増強されていないＶＥＧＦアプタマーよりもＶＥＧＦ結合を阻害する上でより効果的であったことを示す結果は、可溶性高分子量の立体的な基がアプタマー上の多様な位置に存在するかもしれないことを示した。
【実施例１３】
【０２１０】
ＩＣＡＭ−１の立体的に増強したアプタマーアンタゴニストのデザイン
ＩＣＡＭ−１は細胞間接着分子である。ＩＣＡＭ−１は単回膜貫通タンパク質であり、内皮細胞及び特定の血球細胞タイプに主として存在する５個のＩｇ様細胞外ドメインを有する。ＩＣＡＭ−１は、接着受容体のインテグリンファミリーに属する２つの十分に認識された受容体ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１を有する。ＩＣＡＭ−１のドメイン１は、ＬＦＡ−１相互作用ドメインであり、たいていの薬物開発アプローチの焦点である。しかしながら、ＩＣＡＭ−１のこのドメインは非常に酸性であり（４．５ないし５のｐＩ）、したがってＩＣＡＭ−１へ直接結合することによってＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を直接遮断できるアプタマー配列について選抜すること又はさもなくばアプタマー配列をデザインすることは困難である。対照的に、ＩＣＡＭ−１の隣接するドメイン２は非常に塩基性であり（ｐＩ８ないしｐＩ９．５）、したがってより影響を受けやすいアプタマー結合領域である（図３（Ａ）及び図１１の左を参照。）。
【０２１１】
したがって、ＩＣＡＭ−１の塩基性ドメイン２を、ＩＣＡＭ−１のこの領域に対する高い親和性で結合するアプタマー配列を選抜するのに使用する。次に、高分子量の可溶性の立体的な基をアプタマーへ添加して、ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１の隣接するドメイン１との相互作用の立体的な阻害に影響を及ぼす（図１１、右）。アプタマーは、高分子量の立体的な基が、ＩＣＡＭ−１の酸性ＬＦＡ−１結合ドメインを遮断させるであろうアプタマーの端へ結合する一方、足場又はアンカーとして機能する。
【実施例１４】
【０２１２】
カルボキシメチルセルロースへ抱合された抗ＶＥＧＦアプタマーのイオン泳動
クーロンにより調節されるイオン泳動（ＣＣＩ）システムであるイオン泳動は、ＯＰＴＩＳ Ｆｒａｎｃｅによってデザインされる薬物送達デバイスを使用して実施できる（その全体において本明細書に参照によって各々組み込まれる米国特許第６，１５４，６７１号、及びＯｐｔｉｓによる第ＷＯ０２／０８３１８４号を参照。）。眼のカップの形態の容器を、経角質強膜（ｔｒａｎｓｃｏｒｎｅｏｓｃｌｅｒａｌ）イオン泳動を可能にするようデザインする。白金電極を容器の底へ置き、２つのシリコーンチューブを側部に設置する。カルボキシメチルセルロースへ抱合された抗ＶＥＧＦアプタマーを含むイオン泳動製剤を容器へ添加する。塩類溶液を注入するため１本のチューブを使用し、その他は気泡を吸引するのに使用する。ＣＣＩ電子ユニットは２，５００マイクロアンペア（μＡ）まで６００秒間送達できる。聴覚視覚警報は、生成物の較正され調節された送達を確実にする電子回路における各混乱を示す。イオン泳動処理を使用して進行するため、カルボキシメチルセルロースへ抱合された抗ＶＥＧＦアプタマーを含むイオン泳動製剤を含有するＣＣＩ眼用カップを眼に設置し、もう片方の電極を対象と接触して維持する。
【実施例１５】
【０２１３】
カルボキシメチルセルロースへ抱合された抗ＶＥＧＦアプタマーのイオン泳動
カルボキシメチルセルロースへ抱合された抗ＶＥＧＦアプタマーのイオン泳動送達を、塩化銀コーティングした銀ホイル電流分配部品で裏打ちされた１８０μｌのシリコーン受容器シェル、接続器リード線、及び抗ＶＥＧＦアプタマー抱合体が投与される、ヒドロゲルにより浸漬されるポリビニルアセタルマトリクスの単一層からなる眼用ウサギ眼アプリケーター（ＩＯＭＥＤ社、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）を使用して実施する。アプリケーターの接触表面積は０．５４ｃｍ２である。アプリケーターを、角膜強膜接合部から１ｍｍないし２ｍｍ遠位の前側縁を有する角膜縁のところの上位窩におけるニュージーランドシロウサギ（３ｋｇないし３．５ｋｇ）の右眼における強膜上に置く。直流陽極イオン泳動を、ＰｈｏｒｅｓｏｒII（Ｒ）ＰＭ７００（ＩＯＭＥＤ社、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）電源を使用して２ｍＡ、３ｍＡ、及び４ｍＡで２０分間、各アプリケーターを使用して実施する。受動的イオン泳動（０ｍＡで２０分間）をコントロールとして使用する。
【０２１４】
本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、及び刊行された参考文献は、それらの全体において本明細書に参照によって組み込まれる。
【０２１５】
均等物
当業者は、定型的な実験操作に過ぎない操作を用いて、本明細書に具体的に記載されている具体的な実施形態に対して多数の均等物を認識し、又は想到することが可能であろう。このような均等物は、以下に記載されている請求項の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】図１は、ペグ化したＶＥＧＦアンタゴニストアプタマーＥＹＥ００１（Ｍａｃｕｇｅｎ（Ｒ）、ペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ））の化学構造の模式的な表示である。
【図２】図２は、５’−５’キャップしたＶＥＧＦアンタゴニストアプタマーＥＹＥ００２（つまり、ＭａｃＩＩ、配列番号１）の化学構造の模式的な表示である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５２７０９（配列番号２）に対応するヒト細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）前駆体のポリペプチド配列の模式的な表示である。２７のアミノ酸（ａ．ａ．）のＮ末端シグナルペプチドの配列は陰影を付され、成熟ペプチド（ａ．ａ．２８ないし５３２）における塩基性アミノ酸残基は太字で示され、成熟ペプチドにおける酸性アミノ酸残基は下線を付されて示されている。
【図３Ｂ−１】図３Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０３１３２（配列番号３）に対応するヒトＩＣＡＭ−１をコード化する核酸配列のヌクレオチド配列の模式的な表示である。ＩＣＡＭ−１前駆体タンパク質の開いた読み枠の開始コドン及び終止コドンは下線を付されている。
【図３Ｂ−２】図３Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０３１３２（配列番号３）に対応するヒトＩＣＡＭ−１をコード化する核酸配列のヌクレオチド配列の模式的な表示である。ＩＣＡＭ−１前駆体タンパク質の開いた読み枠の開始コドン及び終止コドンは下線を付されている。
【図４】図４は、多様な５’ペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果のグラフ表示である。
【図５】図５は、多様なデキストラン−ＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果のグラフ表示である。
【図６】図６は、多様なカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）−ＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果のグラフ表示である。
【図７】図７は、多様な分子量及び分子半径（水力学的体積）のＰＥＧ分子を有する多様なペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果のグラフ表示である。
【図８】図８は、多様な３’ペグ化したＶＥＧＦアプタマー抱合体を使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイの結果のグラフ表示である。
【図９】図９は、リガンドへ結合し、それによりリガンド及び受容体の相互作用を阻害する、立体的に増強されたアプタマーの模式的な表示である。
【図１０】図１０は、受容体へ結合し、それによりリガンド及び受容体の相互作用を阻害する、立体的に増強されたアプタマーの模式的な表示である。
【図１１】図１１は、ＩＣＡＭ（左）の塩基性領域へ結合するアプタマーがＩＣＡＭ受容体ＬＦＡ−１（右）へのＩＣＡＭ結合を効果的に遮断するよう立体的に増強される、立体的に増強されるＩＣＡＭアプタマーアンタゴニストのデザインの模式的な表示である。
【図１２】図１２は、デキストランにより結合されたアプタマーの一般的な化学構造の模式的な表示である。
【図１３】図１３は、カルボキシメチルセルロースにより結合されたアプタマーの一般的な化学構造の模式的な表示である。
【図１４】図１４は、ＢＳＡをアプタマーへ結合するための一般的な合成方法の模式的な表示である。
【図１５】図１５は、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）をアプタマーへ結合するための一般的な合成方法の模式的な表示である。
【図１６】図１６は、二機能性リンカーをアプタマーへ結合するための一般的な合成方法の模式的な表示である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド上のアプタマー結合部位から離れた部位の活性を阻害する方法であって、
アプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合することを含み、前記可溶性高分子量の立体的な基が、前記リガンド上の前記アプタマー結合部位から離れた部位の活性を阻害する、前記方法。
【請求項２】
可溶性高分子分子量の立体的な基が多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアルキレングリコール、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、キトサン、ポリアルデヒド、ポリ乳酸共グリコリド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、及びポリエーテルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可溶性高分子量の立体的な基がデキストラン又はその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
可溶性高分子量の立体的な基がポリエチレングリコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
可溶性高分子量の立体的な基が、８００Ｄａないし３，０００，０００Ｄａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
可溶性高分子量の立体的な基が、２０ｋＤａないし１，０００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
可溶性高分子量の立体的な基が、２０ｋＤａないし１００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
可溶性高分子量の立体的な基が、約２０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
可溶性高分子量の立体的な基が、約４０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
可溶性高分子量の立体的な基が、約８０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
可溶性高分子量の立体的な基が、１ｎｍないし１０ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
可溶性高分子量の立体的な基が、約４ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
可溶性高分子量の立体的な基が、約６ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
アプタマーが、成長因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、サイトカイン、リンホカイン、造血因子、Ｍ−ＣＳＲ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、エリスロポエチン、肝細胞成長因子／ＮＫ１、血管新生因子、アンジオポエチン、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンギオポエチン様ポリペプチド、アンジオゲニン、形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質受容体、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、神経栄養因子、走化性因子、ＣＤタンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊加速因子、ウィルス抗原、エイズ外被の一部、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ、腫瘍関連抗原、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４受容体、又はそれらの断片若しくは変異体からなる群から選択されるリガンド又はその受容体へと指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
アプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＶＥＧＦ−Ｅからなる群から選択されるＶＥＧＦリガンドへ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
アプタマーがＶＥＧＦ受容体へ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｔ−４／（ＶＥＧＦＲ−３）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
アプタマーがＶＥＧＦ共受容体へ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＶＥＧＦ共受容体がニューロピリン−１又はニューロピリン−２である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＶＥＧＦ共受容体がαＶＢ３インテグリン又はＶＥ−カドヘリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
アプタマーがＩＣＡＭ−１へ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
アプタマーがＬＦＡ−１へ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
アプタマー結合部位から離れた部位が前記アプタマー結合部位に対して遠位の部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
アプタマー結合部位から離れた部位が前記アプタマー結合部位に対して近位の部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
アプタマー結合部位から離れた部位が負に荷電するか又は中性であり、前記アプタマー結合部位が正に荷電する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
リガンド結合アプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させる方法（前記リガンドは複数の受容体へ結合し、リガンド結合アプタマーは前記複数の受容体の少なくとも１つのリガンド依存性活性化を効果的に拮抗することができない。）であって、
アダプタマーを可溶性高分子量の立体的な基に結合することを含む（前記アダプタマーは、前記可溶性高分子量の立体的な基へ結合された場合に、アダプタマー単独によっては効果的に拮抗されない少なくとも１つの受容体のリガンド依存性活性化を効果的に拮抗する。）、前記方法。
【請求項３２】
可溶性高分子分子量の立体的な基が多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアルキレングリコール、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、キトサン、ポリアルデヒド及びポリエーテルからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
可溶性高分子量の立体的な基がデキストラン又はその誘導体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
可溶性高分子量の立体的な基がポリエチレングリコールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
可溶性高分子量の立体的な基が、８００Ｄａないし３，０００，０００Ｄａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
可溶性高分子量の立体的な基が、２０ｋＤａないし１，０００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
可溶性高分子量の立体的な基が、２０ｋＤａないし１００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
可溶性高分子量の立体的な基が、約２０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
可溶性高分子量の立体的な基が、約４０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
可溶性高分子量の立体的な基が、約８０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
可溶性高分子量の立体的な基が、１ｎｍないし１０ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
可溶性高分子量の立体的な基が、約４ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
可溶性高分子量の立体的な基が、約６ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
アプタマーが、成長因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、サイトカイン、リンホカイン、造血因子、Ｍ−ＣＳＲ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、エリスロポエチン、肝細胞成長因子／ＮＫ１、血管新生因子、アンジオポエチン、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンギオポエチン様ポリペプチド、アンジオゲニン、形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質受容体、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、神経栄養因子、走化性因子、ＣＤタンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊加速因子、ウィルス抗原、エイズ外被の一部、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ、腫瘍関連抗原、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４受容体、又はそれらの断片若しくは変異体からなる群から選択されるリガンド又はその受容体へと指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
アプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４７】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＶＥＧＦ−Ｅからなる群から選択されるＶＥＧＦリガンドへ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
アプタマーがＶＥＧＦ受容体へ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４９】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｔ−４／（ＶＥＧＦＲ−３）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
アプタマーがＶＥＧＦ共受容体へ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項５３】
ＶＥＧＦ共受容体がニューロピリン−１又はニューロピリン−２である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＶＥＧＦ共受容体がαＶＢ３インテグリン又はＶＥ−カドヘリンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
アプタマーがＩＣＡＭ−１へ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項５６】
アプタマーがＬＦＡ−１へ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項５７】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５８】
受容体結合アプタマーのリガンドアンタゴニスト範囲を増大させる方法（前記受容体は複数のリガンドへ結合し、受容体結合アプタマーは前記複数のリガンドの少なくとも１つのリガンド依存性活性化を効果的に拮抗できない。）であって、
アプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合することを含む（前記アダプタマーは、前記可溶性高分子量の立体的な基へ結合された場合に、アプタマー単独によっては効果的に拮抗されない少なくとも１つの受容体のリガンド依存性活性化を効果的に拮抗する。）、前記方法。
【請求項５９】
ＶＥＧＦアプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させる方法であって、
ＶＥＧＦへ結合するが、少なくとも１つのＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ依存的活性化を効果的に拮抗できないＶＥＧＦアプタマーを提供し、結果として生じるＶＥＧＦアプタマー抱合体が少なくとも１つのＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ依存性活性化を効果的に拮抗するように、前記ＶＥＧＦアプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合することにより前記ＶＥＧＦアプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させることを含む、前記方法。
【請求項６０】
ＶＥＧＦＲアプタマーのリガンドアンタゴニスト範囲を増大させる方法であって、
ＶＥＧＦＲへ結合するが、少なくとも１つのＶＥＧＦリガンドによるリガンド依存的活性化を効果的に拮抗できないＶＥＧＦＲアプタマーを提供し、結果として生じるＶＥＧＦＲアプタマー抱合体が少なくとも１つのＶＥＧＦリガンドによってＶＥＧＦＲ依存性活性化を効果的に拮抗するように、前記ＶＥＧＦＲアプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合することにより前記ＶＥＧＦＲアプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させることを含む、前記方法。
【請求項６１】
第二のタンパク質と相互作用するタンパク質を標的にするアプタマーのアンタゴニスト特性を増大させる方法であって、
可溶性高分子量の立体的な基にアプタマーを結合することを含む（前記可溶性高分子量の立体的な基はタンパク質の第二タンパク質との相互作用を崩壊させるアプタマーの能力を増大させる。）、前記方法。
【請求項６２】
リガンドの受容体に対する結合を阻害するための方法（前記リガンドの受容体結合部位は負に荷電し、前記リガンド上のアプタマー結合部位は正に荷電する。）であって、
アプタマー抱合体を形成するように可溶性高分子量の立体的な基へアプタマーを結合する段階を含み、前記アプタマーがリガンド上の正に荷電したアプタマー結合部位へ結合し、前記可溶性高分子量の立体的な基がリガンドの負に荷電した受容体結合部位への受容体の結合を阻害する、前記方法。
【請求項６３】
受容体が細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
受容体がＩＣＡＭ−１である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
対応する抱合していないアプタマーよりも標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有するアプタマー抱合体を同定する方法（標的はリガンド又はリガンドの受容体である。）であって、
アプタマーの５’末端及び３’末端で、場合により、１つ以上の非５’末端位置又は非３’末端位置で可溶性高分子量の立体的な基へ独立して結合される複数のアプタマー抱合体を提供し、
アプタマー抱合体をそれぞれ独立して前記リガンド及びリガンドの受容体と接触させ、リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量を検出し、
リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化を阻害する最も大きな能力を有するアプタマー抱合体を選抜することにより、対応する抱合していないアプタマーよりもリガンド／受容体標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有するアプタマー抱合体を同定することを含む、前記方法。
【請求項６６】
標的に及ぼすアンタゴニスト効果の増大したアプタマー抱合体を同定する方法（標的はリガンド又はリガンドの受容体である。）であって、
アプタマーの５’末端、３’末端及び１つ以上の非５’末端又は非３’末端の位置で可溶性高分子量の立体的な基（前記可溶性高分子量の立体的な基は２０ｋＤａないし１００ｋＤａの分子量を有し、多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、カルボキシメチルセルロース、セルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド、及びポリエーテルからなる群から選択される。）へ独立して結合される、複数のアプタマー抱合体を提供し、
各アプタマー抱合体を独立して前記リガンド及び前記リガンドの受容体と接触させ、
リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量を検出し、
リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化を阻害する最大の能力を有するアプタマー抱合体を選抜することを含み、前記アプタマー抱合体が対応する結合していないアプタマーよりもリガンド／受容体標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有する、前記方法。
【請求項６７】
アプタマーが抗ＶＥＧＦアプタマーであり、高分子量の立体的な基がデキストラン、ＣＭＣ、ＢＳＡ、ＰＬＧＡ又はデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）である、高分子量の立体的な基へ結合したアプタマーを含む化合物。
【請求項６８】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項６７の化合物。
【請求項６９】
ａ）荷電分子を、加水分解的に安定な結合によって、生物活性分子に結合して、生物活性分子荷電抱合体を形成する段階、及び
ｂ）前記生物活性分子荷電抱合体を、イオン泳動を使用して眼に送達する段階
を含む、生物学的活性分子を眼へ送達する方法。
【請求項７０】
荷電分子が陰イオン性である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
荷電分子が陽イオン性である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
荷電分子が多価電解質である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
荷電分子がデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
荷電分子が陰イオン性に荷電したポリマーである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
荷電分子が、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリアクリルアミド、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カラゲナン、硫酸セルロース、硫酸デキストラン／デキストリン、ポリ（スルホン酸ナフタレン）、ポリ（スチレン−４−スルホン酸）及びポリ（４−スチレンスルホン酸共マレイン酸）からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
荷電分子が陽イオン性に荷電したポリマーである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
荷電分子がポリアミン、キトサン、ポリグルコサミン、ポリリジン、ポリグルタミン酸塩、ポリビニルアミン、２-（ジエチルアミノ）エタノール（ＤＥＡＥ）、スペルミン及びプトレシンなどのアミンを含むポリマーからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】
荷電分子が、８００Ｄａないし３，０００，０００Ｄａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７９】
荷電分子が、２０ｋＤａないし１０００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８０】
荷電分子が、２０ｋＤａないし１００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８１】
荷電分子が、約２０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８２】
荷電分子が、約４０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８３】
荷電分子が、約８０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８４】
生物学的活性分子が核酸、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、抗体、ペプチド、タンパク質、酵素ポルフィリン、及び小分子薬物からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項８５】
生物学的活性分子がアプタマーである、請求項６９に記載の方法。
【請求項８６】
アプタマーが成長因子、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ及びＩＣＡＭ、又はそれらの断片若しくは変異体からなる群から選択されるリガンド又はその受容体へ指向される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
アプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
ａ）非核酸ポリマーを、核酸荷電抱合体を形成する核酸へ結合する段階、及び
ｂ）前記核酸荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階
を含む、核酸を眼へ送達する方法。
【請求項９１】
非核酸ポリマーが多価電解質である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
荷電分子がデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
非核酸ポリマーが陰イオン荷電ポリマーである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
非核酸ポリマーが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリアクリルアミド、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カラゲナン、硫酸セルロース、硫酸デキストラン／デキストリン、ポリ（スルホン酸ナフタレン）、ポリ（スチレン−４−スルホン酸）及びポリ（４−スチレンスルホン酸共マレイン酸）からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
非核酸ポリマーが陽イオン荷電ポリマーである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
荷電分子がポリアミン、キトサン、ポリグルコサミン、ポリリジン、ポリグルタミン酸塩、ポリビニルアミン、２-（ジエチルアミノ）エタノール（ＤＥＡＥ）、スペルミン及びプトレシンなどのアミンを含むポリマーからなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９７】
陽イオン荷電ポリマーが、８００Ｄａないし３，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９８】
陽イオン荷電ポリマーが、２０Ｄａないし１０００Ｄａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９９】
陽イオン荷電ポリマーが、２０Ｄａないし１００Ｄａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１００】
陽イオン荷電ポリマーが、約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０１】
陽イオン荷電ポリマーが、約４０ｋＤａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０２】
陽イオン荷電ポリマーが、約８０ｋＤａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０３】
核酸がアプタマーである、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０４】
アプタマーが成長因子、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ及びＩＣＡＭ、又はそれらの断片若しくは変異体からなる群から選択されるリガンド又はその受容体へ指向される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
アプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０８】
ａ）陰イオン性高電荷密度ポリマーをアプタマーへ、加水分解的に安定な結合によって結合し、アプタマー荷電抱合体を形成する段階、及び
ｂ）前記アプタマー荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階
を含む、アプタマーを眼へ送達する方法。
【請求項１０９】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）、ポリアクリルアミド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カラゲナン、硫酸セルロース、硫酸デキストラン／デキストリン、ポリ（スルホン酸ナフタレン）、ポリ（スチレン−４−スルホン酸）及びポリ（４−スチレンスルホン酸共マレイン酸）からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが少なくとも５ｍｅｑ／ｇの電荷密度の電荷密度を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが少なくとも１０ｍｅｑ／ｇの電荷密度を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが少なくとも１ｍｅｑ／ｇないし２０ｍｅｑ／ｇの電荷密度を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、８００Ｄａないし３，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１４】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、２０ｋＤａないし１０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１５】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、２０ｋＤａないし１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１６】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１７】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、約４０ｋＤａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１８】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、約８０ｋＤａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１９】
アプタマーが成長因子、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ及びＩＣＡＭ、又はそれらの断片若しくは変異体から選択されるリガンド又はその受容体へ指向される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２０】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２１】
アプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２２】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２３】
ａ）カルボキシメチルセルロース部分又はカルボキシメチルデキストラン部分を抗ＶＥＧＦアプタマーへ結合し、抗ＶＥＧＦアプタマー荷電抱合体を形成する段階、及び
ｂ）抗ＶＥＧＦアプタマー荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階
を含む、抗ＶＥＧＦアプタマーを眼へ送達する方法。
【請求項１２４】
抗ＶＥＧＦアプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
抗ＶＥＧＦアプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
抗ＶＥＧＦアプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
荷電分子へ結合したアプタマーを含む化合物。
【請求項１２８】
アプタマーが抗ＶＥＧＦアプタマーである、請求項１２７の化合物。
【請求項１２９】
抗ＶＥＧＦアプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
抗ＶＥＧＦアプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
抗ＶＥＧＦアプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
荷電分子が、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリアクリルアミド、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カラゲナン、硫酸セルロース、硫酸デキストラン／デキストリン、ポリ（スルホン酸ナフタレン）、ポリ（スチレン−４−スルホン酸）及びポリ（４−スチレンスルホン酸共マレイン酸）からなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３３】
荷電分子がＣＭＣである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３４】
荷電分子がＣＭＤである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３５】
荷電分子が加水分解的に安定した結合によって生物学的活性分子へ結合される生物学的活性分子荷電抱合体と、イオン泳動送達に適した担体とを含む、生物学的活性分子を眼へ送達するための組成物。
【請求項１】
リガンド上のアプタマー結合部位から離れた部位の活性を阻害する方法であって、
アプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合することを含み、前記可溶性高分子量の立体的な基が、前記リガンド上の前記アプタマー結合部位から離れた部位の活性を阻害する、前記方法。
【請求項２】
可溶性高分子分子量の立体的な基が多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアルキレングリコール、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、キトサン、ポリアルデヒド、ポリ乳酸共グリコリド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、及びポリエーテルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可溶性高分子量の立体的な基がデキストラン又はその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
可溶性高分子量の立体的な基がポリエチレングリコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
可溶性高分子量の立体的な基が、８００Ｄａないし３，０００，０００Ｄａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
可溶性高分子量の立体的な基が、２０ｋＤａないし１，０００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
可溶性高分子量の立体的な基が、２０ｋＤａないし１００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
可溶性高分子量の立体的な基が、約２０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
可溶性高分子量の立体的な基が、約４０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
可溶性高分子量の立体的な基が、約８０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
可溶性高分子量の立体的な基が、１ｎｍないし１０ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
可溶性高分子量の立体的な基が、約４ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
可溶性高分子量の立体的な基が、約６ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
アプタマーが、成長因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、サイトカイン、リンホカイン、造血因子、Ｍ−ＣＳＲ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、エリスロポエチン、肝細胞成長因子／ＮＫ１、血管新生因子、アンジオポエチン、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンギオポエチン様ポリペプチド、アンジオゲニン、形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質受容体、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、神経栄養因子、走化性因子、ＣＤタンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊加速因子、ウィルス抗原、エイズ外被の一部、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ、腫瘍関連抗原、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４受容体、又はそれらの断片若しくは変異体からなる群から選択されるリガンド又はその受容体へと指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
アプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＶＥＧＦ−Ｅからなる群から選択されるＶＥＧＦリガンドへ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
アプタマーがＶＥＧＦ受容体へ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｔ−４／（ＶＥＧＦＲ−３）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
アプタマーがＶＥＧＦ共受容体へ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＶＥＧＦ共受容体がニューロピリン−１又はニューロピリン−２である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＶＥＧＦ共受容体がαＶＢ３インテグリン又はＶＥ−カドヘリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
アプタマーがＩＣＡＭ−１へ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
アプタマーがＬＦＡ−１へ指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
アプタマー結合部位から離れた部位が前記アプタマー結合部位に対して遠位の部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
アプタマー結合部位から離れた部位が前記アプタマー結合部位に対して近位の部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
アプタマー結合部位から離れた部位が負に荷電するか又は中性であり、前記アプタマー結合部位が正に荷電する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
リガンド結合アプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させる方法（前記リガンドは複数の受容体へ結合し、リガンド結合アプタマーは前記複数の受容体の少なくとも１つのリガンド依存性活性化を効果的に拮抗することができない。）であって、
アダプタマーを可溶性高分子量の立体的な基に結合することを含む（前記アダプタマーは、前記可溶性高分子量の立体的な基へ結合された場合に、アダプタマー単独によっては効果的に拮抗されない少なくとも１つの受容体のリガンド依存性活性化を効果的に拮抗する。）、前記方法。
【請求項３２】
可溶性高分子分子量の立体的な基が多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアルキレングリコール、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、キトサン、ポリアルデヒド及びポリエーテルからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
可溶性高分子量の立体的な基がデキストラン又はその誘導体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
可溶性高分子量の立体的な基がポリエチレングリコールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
可溶性高分子量の立体的な基が、８００Ｄａないし３，０００，０００Ｄａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
可溶性高分子量の立体的な基が、２０ｋＤａないし１，０００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
可溶性高分子量の立体的な基が、２０ｋＤａないし１００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
可溶性高分子量の立体的な基が、約２０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
可溶性高分子量の立体的な基が、約４０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
可溶性高分子量の立体的な基が、約８０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
可溶性高分子量の立体的な基が、１ｎｍないし１０ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
可溶性高分子量の立体的な基が、約４ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
可溶性高分子量の立体的な基が、約６ｎｍの流体力学的半径を有するポリマー組成物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
アプタマーが、成長因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、サイトカイン、リンホカイン、造血因子、Ｍ−ＣＳＲ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、エリスロポエチン、肝細胞成長因子／ＮＫ１、血管新生因子、アンジオポエチン、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンギオポエチン様ポリペプチド、アンジオゲニン、形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質受容体、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、神経栄養因子、走化性因子、ＣＤタンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊加速因子、ウィルス抗原、エイズ外被の一部、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ、腫瘍関連抗原、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４受容体、又はそれらの断片若しくは変異体からなる群から選択されるリガンド又はその受容体へと指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
アプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４７】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＶＥＧＦ−Ｅからなる群から選択されるＶＥＧＦリガンドへ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
アプタマーがＶＥＧＦ受容体へ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４９】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
ＶＥＧＦ受容体がＦｌｔ−４／（ＶＥＧＦＲ−３）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
アプタマーがＶＥＧＦ共受容体へ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項５３】
ＶＥＧＦ共受容体がニューロピリン−１又はニューロピリン−２である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＶＥＧＦ共受容体がαＶＢ３インテグリン又はＶＥ−カドヘリンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
アプタマーがＩＣＡＭ−１へ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項５６】
アプタマーがＬＦＡ−１へ指向される、請求項３１に記載の方法。
【請求項５７】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５８】
受容体結合アプタマーのリガンドアンタゴニスト範囲を増大させる方法（前記受容体は複数のリガンドへ結合し、受容体結合アプタマーは前記複数のリガンドの少なくとも１つのリガンド依存性活性化を効果的に拮抗できない。）であって、
アプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合することを含む（前記アダプタマーは、前記可溶性高分子量の立体的な基へ結合された場合に、アプタマー単独によっては効果的に拮抗されない少なくとも１つの受容体のリガンド依存性活性化を効果的に拮抗する。）、前記方法。
【請求項５９】
ＶＥＧＦアプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させる方法であって、
ＶＥＧＦへ結合するが、少なくとも１つのＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ依存的活性化を効果的に拮抗できないＶＥＧＦアプタマーを提供し、結果として生じるＶＥＧＦアプタマー抱合体が少なくとも１つのＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ依存性活性化を効果的に拮抗するように、前記ＶＥＧＦアプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合することにより前記ＶＥＧＦアプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させることを含む、前記方法。
【請求項６０】
ＶＥＧＦＲアプタマーのリガンドアンタゴニスト範囲を増大させる方法であって、
ＶＥＧＦＲへ結合するが、少なくとも１つのＶＥＧＦリガンドによるリガンド依存的活性化を効果的に拮抗できないＶＥＧＦＲアプタマーを提供し、結果として生じるＶＥＧＦＲアプタマー抱合体が少なくとも１つのＶＥＧＦリガンドによってＶＥＧＦＲ依存性活性化を効果的に拮抗するように、前記ＶＥＧＦＲアプタマーを可溶性高分子量の立体的な基へ結合することにより前記ＶＥＧＦＲアプタマーの受容体アンタゴニスト範囲を増大させることを含む、前記方法。
【請求項６１】
第二のタンパク質と相互作用するタンパク質を標的にするアプタマーのアンタゴニスト特性を増大させる方法であって、
可溶性高分子量の立体的な基にアプタマーを結合することを含む（前記可溶性高分子量の立体的な基はタンパク質の第二タンパク質との相互作用を崩壊させるアプタマーの能力を増大させる。）、前記方法。
【請求項６２】
リガンドの受容体に対する結合を阻害するための方法（前記リガンドの受容体結合部位は負に荷電し、前記リガンド上のアプタマー結合部位は正に荷電する。）であって、
アプタマー抱合体を形成するように可溶性高分子量の立体的な基へアプタマーを結合する段階を含み、前記アプタマーがリガンド上の正に荷電したアプタマー結合部位へ結合し、前記可溶性高分子量の立体的な基がリガンドの負に荷電した受容体結合部位への受容体の結合を阻害する、前記方法。
【請求項６３】
受容体が細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
受容体がＩＣＡＭ−１である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
対応する抱合していないアプタマーよりも標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有するアプタマー抱合体を同定する方法（標的はリガンド又はリガンドの受容体である。）であって、
アプタマーの５’末端及び３’末端で、場合により、１つ以上の非５’末端位置又は非３’末端位置で可溶性高分子量の立体的な基へ独立して結合される複数のアプタマー抱合体を提供し、
アプタマー抱合体をそれぞれ独立して前記リガンド及びリガンドの受容体と接触させ、リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量を検出し、
リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化を阻害する最も大きな能力を有するアプタマー抱合体を選抜することにより、対応する抱合していないアプタマーよりもリガンド／受容体標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有するアプタマー抱合体を同定することを含む、前記方法。
【請求項６６】
標的に及ぼすアンタゴニスト効果の増大したアプタマー抱合体を同定する方法（標的はリガンド又はリガンドの受容体である。）であって、
アプタマーの５’末端、３’末端及び１つ以上の非５’末端又は非３’末端の位置で可溶性高分子量の立体的な基（前記可溶性高分子量の立体的な基は２０ｋＤａないし１００ｋＤａの分子量を有し、多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリル酸塩、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、カルボキシメチルセルロース、セルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド、及びポリエーテルからなる群から選択される。）へ独立して結合される、複数のアプタマー抱合体を提供し、
各アプタマー抱合体を独立して前記リガンド及び前記リガンドの受容体と接触させ、
リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化の量を検出し、
リガンド／受容体結合又はリガンド依存性受容体活性化を阻害する最大の能力を有するアプタマー抱合体を選抜することを含み、前記アプタマー抱合体が対応する結合していないアプタマーよりもリガンド／受容体標的に及ぼす強いアンタゴニスト効果を有する、前記方法。
【請求項６７】
アプタマーが抗ＶＥＧＦアプタマーであり、高分子量の立体的な基がデキストラン、ＣＭＣ、ＢＳＡ、ＰＬＧＡ又はデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）である、高分子量の立体的な基へ結合したアプタマーを含む化合物。
【請求項６８】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項６７の化合物。
【請求項６９】
ａ）荷電分子を、加水分解的に安定な結合によって、生物活性分子に結合して、生物活性分子荷電抱合体を形成する段階、及び
ｂ）前記生物活性分子荷電抱合体を、イオン泳動を使用して眼に送達する段階
を含む、生物学的活性分子を眼へ送達する方法。
【請求項７０】
荷電分子が陰イオン性である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
荷電分子が陽イオン性である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
荷電分子が多価電解質である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
荷電分子がデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
荷電分子が陰イオン性に荷電したポリマーである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
荷電分子が、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリアクリルアミド、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カラゲナン、硫酸セルロース、硫酸デキストラン／デキストリン、ポリ（スルホン酸ナフタレン）、ポリ（スチレン−４−スルホン酸）及びポリ（４−スチレンスルホン酸共マレイン酸）からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
荷電分子が陽イオン性に荷電したポリマーである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
荷電分子がポリアミン、キトサン、ポリグルコサミン、ポリリジン、ポリグルタミン酸塩、ポリビニルアミン、２-（ジエチルアミノ）エタノール（ＤＥＡＥ）、スペルミン及びプトレシンなどのアミンを含むポリマーからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】
荷電分子が、８００Ｄａないし３，０００，０００Ｄａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７９】
荷電分子が、２０ｋＤａないし１０００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８０】
荷電分子が、２０ｋＤａないし１００ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８１】
荷電分子が、約２０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８２】
荷電分子が、約４０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８３】
荷電分子が、約８０ｋＤａの分子量を有するポリマー組成物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８４】
生物学的活性分子が核酸、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、抗体、ペプチド、タンパク質、酵素ポルフィリン、及び小分子薬物からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項８５】
生物学的活性分子がアプタマーである、請求項６９に記載の方法。
【請求項８６】
アプタマーが成長因子、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ及びＩＣＡＭ、又はそれらの断片若しくは変異体からなる群から選択されるリガンド又はその受容体へ指向される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
アプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
ａ）非核酸ポリマーを、核酸荷電抱合体を形成する核酸へ結合する段階、及び
ｂ）前記核酸荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階
を含む、核酸を眼へ送達する方法。
【請求項９１】
非核酸ポリマーが多価電解質である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
荷電分子がデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
非核酸ポリマーが陰イオン荷電ポリマーである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
非核酸ポリマーが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリアクリルアミド、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カラゲナン、硫酸セルロース、硫酸デキストラン／デキストリン、ポリ（スルホン酸ナフタレン）、ポリ（スチレン−４−スルホン酸）及びポリ（４−スチレンスルホン酸共マレイン酸）からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
非核酸ポリマーが陽イオン荷電ポリマーである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
荷電分子がポリアミン、キトサン、ポリグルコサミン、ポリリジン、ポリグルタミン酸塩、ポリビニルアミン、２-（ジエチルアミノ）エタノール（ＤＥＡＥ）、スペルミン及びプトレシンなどのアミンを含むポリマーからなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９７】
陽イオン荷電ポリマーが、８００Ｄａないし３，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９８】
陽イオン荷電ポリマーが、２０Ｄａないし１０００Ｄａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９９】
陽イオン荷電ポリマーが、２０Ｄａないし１００Ｄａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１００】
陽イオン荷電ポリマーが、約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０１】
陽イオン荷電ポリマーが、約４０ｋＤａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０２】
陽イオン荷電ポリマーが、約８０ｋＤａの分子量を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０３】
核酸がアプタマーである、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０４】
アプタマーが成長因子、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ及びＩＣＡＭ、又はそれらの断片若しくは変異体からなる群から選択されるリガンド又はその受容体へ指向される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
アプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０８】
ａ）陰イオン性高電荷密度ポリマーをアプタマーへ、加水分解的に安定な結合によって結合し、アプタマー荷電抱合体を形成する段階、及び
ｂ）前記アプタマー荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階
を含む、アプタマーを眼へ送達する方法。
【請求項１０９】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）、ポリアクリルアミド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カラゲナン、硫酸セルロース、硫酸デキストラン／デキストリン、ポリ（スルホン酸ナフタレン）、ポリ（スチレン−４−スルホン酸）及びポリ（４−スチレンスルホン酸共マレイン酸）からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが少なくとも５ｍｅｑ／ｇの電荷密度の電荷密度を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが少なくとも１０ｍｅｑ／ｇの電荷密度を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが少なくとも１ｍｅｑ／ｇないし２０ｍｅｑ／ｇの電荷密度を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、８００Ｄａないし３，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１４】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、２０ｋＤａないし１０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１５】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、２０ｋＤａないし１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１６】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１７】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、約４０ｋＤａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１８】
陰イオン性高電荷密度ポリマーが、約８０ｋＤａの分子量を有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１９】
アプタマーが成長因子、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ及びＩＣＡＭ、又はそれらの断片若しくは変異体から選択されるリガンド又はその受容体へ指向される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２０】
アプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２１】
アプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２２】
アプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２３】
ａ）カルボキシメチルセルロース部分又はカルボキシメチルデキストラン部分を抗ＶＥＧＦアプタマーへ結合し、抗ＶＥＧＦアプタマー荷電抱合体を形成する段階、及び
ｂ）抗ＶＥＧＦアプタマー荷電抱合体を眼へ、イオン泳動を使用して送達する段階
を含む、抗ＶＥＧＦアプタマーを眼へ送達する方法。
【請求項１２４】
抗ＶＥＧＦアプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
抗ＶＥＧＦアプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
抗ＶＥＧＦアプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
荷電分子へ結合したアプタマーを含む化合物。
【請求項１２８】
アプタマーが抗ＶＥＧＦアプタマーである、請求項１２７の化合物。
【請求項１２９】
抗ＶＥＧＦアプタマーがＶＥＧＦ−Ａへ指向される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
抗ＶＥＧＦアプタマーがＶＥＧＦ−１６５へ指向される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
抗ＶＥＧＦアプタマーが配列
ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ（配列番号８）
を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
荷電分子が、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリアクリルアミド、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カラゲナン、硫酸セルロース、硫酸デキストラン／デキストリン、ポリ（スルホン酸ナフタレン）、ポリ（スチレン−４−スルホン酸）及びポリ（４−スチレンスルホン酸共マレイン酸）からなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３３】
荷電分子がＣＭＣである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３４】
荷電分子がＣＭＤである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３５】
荷電分子が加水分解的に安定した結合によって生物学的活性分子へ結合される生物学的活性分子荷電抱合体と、イオン泳動送達に適した担体とを含む、生物学的活性分子を眼へ送達するための組成物。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ−１】
【図３Ｂ−２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ−１】
【図３Ｂ−２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００７−５３２６６２（Ｐ２００７−５３２６６２Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０８４８７（Ｐ２００７−５０８４８７）
【出願日】平成１７年４月１３日（２００５．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１２４６９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１０４８９
【国際公開日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【出願人】（５０６０６４９１３）（オーエスアイ）アイテツク・インコーポレーテツド (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月１３日（２００５．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１２４６９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１０４８９
【国際公開日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【出願人】（５０６０６４９１３）（オーエスアイ）アイテツク・インコーポレーテツド (10)
【Ｆターム（参考）】
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