１−ベンジルインドール誘導体、並びにそれらの用途
【課題】従来の血管内皮増殖因子抗体もしくは阻害剤よりも強い血管新生阻害活性を示す新規ＨＩＦ−１α活性阻害剤を提供する。
【解決手段】下記一般式（１）
（式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立していてもよく、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ｚは水素原子または低級アシル基を示し、Ａｒは置換基を１〜３個有していてもよいアリール基もしくはヘテロアリール基を示す。）で表される１−ベンジルインドール誘導体を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【解決手段】下記一般式（１）
（式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立していてもよく、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ｚは水素原子または低級アシル基を示し、Ａｒは置換基を１〜３個有していてもよいアリール基もしくはヘテロアリール基を示す。）で表される１−ベンジルインドール誘導体を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＦ−１α活性を阻害する１−ベンジルインドール誘導体、並びにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生阻害剤は、血管新生に起因する疾患、および血管の新生を必要とする疾患に対する治療薬として、近年注目されている。例えば、そのような疾患の一例として、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ：Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。ＡＭＤは、加齢に伴う黄斑の変化によって引き起こされる疾患で高齢者の失明原因の一つとなっている。特に、脈絡膜から発生する新生血管を伴う滲出型のＡＭＤにおいては急激な視力低下を伴うことが多く、病態の改善にはこの血管新生を抑制することが重要であることがわかっている（非特許文献１）。主な治療としては、光線力学的療法（ＰＤＴ：Ｐｈｏｔｏ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ）がある。すなわち、光感受性物質ベルテポルフィンを静脈注射し、薬剤が脈絡膜新生血管に集積させた後、レーザーでベルテポルフィンを光活性化して、脈絡膜新生血管を退縮させる治療が行われている。また近年、ＡＭＤの治療薬として血管新生因子の一つである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）に対する抗体（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）やアプタマー（Ｍａｃｕｇｅｎ）が認可され、臨床で効果を示すようになってきている。しかし、ＰＤＴは行える施設が限られることや、費用が高額であること、更には、抗ＶＥＧＦ抗体やアプタマーについてもいずれも高分子製剤であり高額な医療費を必要とすること、などの問題点を抱えており、効果的に血管新生を抑制できる低分子化合物が望まれている。その他、癌疾患領域においても、癌が成長するために必要な血管新生を抑制するという治療法は大きな期待を集めており、これまでのところ抗ＶＥＧＦ抗体（Ａｖａｓｔｉｎ）が認可され、治療薬として応用されている。
【０００３】
しかし最近になって、転写因子であるＨＩＦ−１α （Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ−１α）が、ＶＥＧＦを始めとする複数の血管新生因子の発現を誘導することが明らかになってきた（非特許文献２−５）。このＨＩＦ−１αは、通常の酸素濃度では、ＨＩＦプロリルハイドロキシラーゼによって酸化された後、速やかに分解されるため検出できないが、癌組織などの低酸素状態ではこの酸化が起きないため、ＶＥＧＦなどの血管新生因子を強力に転写活性化する。（非特許文献６、７）。このため、ＶＥＧＦを始めとする複数の血管新生因子の発現を誘導するＨＩＦ−１αの阻害剤は、新たな血管新生の阻害活性を有する薬剤として期待されるようになってきた。
【０００４】
ＨＩＦ−１α活性阻害剤としては非特許文献８に記載されているＹＣ−１が知られている。この化合物は部分構造として１−ベンジルインドール骨格を有するが、インドール環３位の置換基が本発明化合物とは異なるものである。
【０００５】
その他には、特許文献１、２に報告されている化合物が類似化合物として知られている。しかしながら、特許文献１の化合物群は、インドール環３位の置換基が異なり、ヒドロキシメチル基および低級アシルオキシメチル基に関する記載がなく、用途はＥＰ３受容体を介したプロスタグランジン関連の疾患の治療であり、ＨＩＦ−１α阻害作用に関する記載もない。
【０００６】
特許文献２の化合物群は、インドール環の１位、３位もしくは７位にベンゾイル基もしくはフェノキシ基を有する化合物であり、本発明の骨格とは異なるものである。また、これらの化合物群の薬理作用として、チューブリン重合阻害剤活性による血管新生に関する作用が開示されているが、ＨＩＦ−１αに対する作用については何ら記載されていない。
【０００７】
さらには、特許文献３には本特許の骨格でインドール環３位にカルボニル基およびヒドロキシメチル基を有する化合物群（下記一般式（３）においてＡｒ2がメチル基を１個有しているフェニル基である化合物、１−（２，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール及び１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールを含む）のＲａｓ阻害作用と、それに起因する細胞増殖抑制作用が示されているが、ＨＩＦ−１αに対する作用については何ら記載がない。
【０００８】
特許文献４には抗真菌及び抗寄生虫活性を有するインドール誘導体が記載されているが、ＨＩＦ−１αに対する作用については記載がない。
【０００９】
非特許文献９には、５−クロロ−１−（４−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール、５−フルオロ−１−（４−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール及び下記一般式（３）においてＡｒ2がハロゲン原子を１個有しているフェニル基である化合物であって抗リーシュマニア活性を有するものが記載されているが、ＨＩＦ−１αに対する作用については記載がない。非特許文献１０には１−（３−メトキシベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール、非特許文献１１には抗菌活性を有する１−（２，４−ジフルオロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールが記載されているが、ＨＩＦ−１αに対する作用については記載がない。
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｎ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．，４０，ｐ．３５２(２００５)．
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，ｐ．４６０４(１９９６)．
【非特許文献３】Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１４，ｐ．３４（２０００）．
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，ｐ．１０４２３（２００２）．
【非特許文献５】Ｂｌｏｏｄ，１０７，ｐ．２７０５（２００６）．
【非特許文献６】Ｎａｔｕｒｅ，３９９，ｐ．２７１（１９９９）．
【非特許文献７】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２，ｐ．４６８（２００１）．
【非特許文献８】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，９５，ｐ．４９８（２００３）．
【非特許文献９】Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９，ｐ．４５１（２００４）．
【非特許文献１０】Ｊ．Ｉｎｄｉａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６，ｐ．６０１（１９９９）．
【非特許文献１１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，ｐ．７５−８７（２００３）．
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００７９５２０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２６７１０８号明細書
【特許文献３】国際公開第２００７／０６２３９９号パンフレット
【特許文献４】特表２００４−５０９８８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、新規のＨＩＦ−１α活性阻害剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するため合成化合物について種々検索した結果、１−ベンジルインドール誘導体がＨＩＦ−１α阻害活性を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は
一般式（１）
【００１５】
【化１】
【００１６】
（式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立していてもよく、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ｚは水素原子または低級アシル基を示し、Ａｒは低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜３個有していてもよいアリール基もしくはヘテロアリール基を示す。）で表される１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（２）一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子である前記（１）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（３）一般式（１）において、Ｚが水素原子である前記（２）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（４）一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子、低級アルキル基またはハロゲン原子である前記（３）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（５）一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子、メチル基またはフッ素原子である前記（４）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（６）一般式（１）において、Ａｒが塩素原子、フッ素原子、メチル基、メトキシ基及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有していてもよいアリール基である前記（５）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、または薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（７）一般式（１）において、Ａｒが３，４−ジクロロフェニル基、３，４−ジフルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ビフェニル基である前記（６）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（８）一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらも水素原子である前記（７）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（９）一般式（１）において、Ｚが低級アシル基である前記（２）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（１０）一般式（１）において、Ｚがアセチル基である前記（９）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（１１）一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子またはメチル基である前記（１０）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（１２）一般式（１）において、ＸおよびＹがどちらも水素原子であり、Ａｒがハロゲン原子を１〜２個有していてもよいフェニル基であるである前記（１１）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（１３）一般式（２）
【００１７】
【化２】
【００１８】
（式中、Ｙ1は低級アルキル基、フッ素原子、塩素原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ａｒ1はヘテロアリール基、または低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子及び低級アルコキシ基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有していてもよいアリール基を示す。但し、Ａｒ1が４−クロロフェニル基であり、Ｙ1が５−塩素原子もしくは５−フッ素原子の組み合わせの化合物、およびＡｒ1がフェニル基であり、Ｙ1が５−メトキシ基の組み合わせの化合物は除く。）で表される１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１４）一般式（２）において、Ｙ1がメチル基、フッ素原子、メトキシ基もしくはベンジルオキシ基である前記（１３）に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１５）一般式（２）において、Ａｒ1がメチル基、フッ素原子、塩素原子またはメトキシ基を１〜２個有していてもよいアリール基、またはピリジル基である前記（１４）に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１６）一般式（２）において、Ｙ1が５−メチル基、４−メチル基、７−メチル基、５−フッ素原子、６−フッ素原子、５−メトキシ基もしくは６−メトキシ基であり、Ａｒ1が３，４−ジクロロフェニル基である前記（１５）に記載の１−ベンジル−３（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１７）一般式（３）
【００１９】
【化３】
【００２０】
（式中、Ａｒ2はヘテロアリール基、または低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有しているアリール基を示す。但し、Ａｒ2がハロゲン原子もしくはメチル基を１個有しているフェニル基、３−メトキシフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基、３，４−ジクロロフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、および３，５−ジフルオロフェニル基である化合物は除く。）で表される１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１８）一般式（３）において、Ａｒ2がピリジル基、またはメチル基、フッ素原子、及び塩素原子からなる群から選ばれる置換基を２個有するフェニル基、４−メトキシ基もしくは４−フェニル基を有するフェニル基である前記（１７）に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１９）一般式（３）において、Ａｒ2が２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、３，４−ジフルオロフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、２，３−ジクロロフェニル基、２，５−ジクロロフェニル基、４−メトキシフェニル基もしくは４−ビフェニル基である前記（１８）に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
（２０）一般式（４）
【００２１】
【化４】
【００２２】
（式中、Ｙ3は水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ｚ3は低級アシル基を示し、Ａｒ3は低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、フェニル基からなる組み合わせの置換基を１〜３個有していてもよいアリール基、またはヘテロアリール基を示す。）で表される１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
（２１）一般式（４）において、Ｚ3がアセチル基である前記（２０）に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（２２）一般式（４）において、Ｙ3が水素原子である前記（２１）に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（２３）一般式（４）において、Ａｒ3がピリジル基または塩素原子を１〜２個有していてもよいフェニル基である請求項２２に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（２４）前記（２０）に記載の３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジクロロベンジル）インドール、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
【００２３】
（２５）前記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の化合物またはその水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする血管新生阻害剤、
（２６）前記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の化合物またはその水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする加齢黄斑変性症治療剤、
に関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、１−ベンジルインドール誘導体がＨＩＦ−１α阻害活性を有することが明らかになり、抗血管新生阻害剤および新生血管型加齢性黄斑変性症治療剤としての臨床応用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明において、低級アルキル基とは炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基を示し、例えばメチル基、エチル基，ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ジメチルプロピル基、イソブチル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ-ヘキシル基等を挙げることができる。これらのうち、好ましい基としてはメチル基を挙げることができる。
【００２６】
本発明において、アリール基とは炭素数６〜１４の芳香族炭化水素基を示し、例えばフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基等を挙げることができる。これらのうち、好ましい基としてはフェニル基、ナフチル基を挙げることができる。また、更に好ましい基としてフェニル基を挙げることができる。
【００２７】
本発明において、ヘテロアリール基とはヘテロ原子として窒素原子、酸素原子または硫黄原子を同一または異なるヘテロ原子として１〜４個含む複素芳香族を示し、例えばフリル基、チエニル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、ピリジル基、インドリル基、チアゾリル基、フラザニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、キノキサリル基等を挙げることができる。これらのうち、好ましい基としてピリジル基を挙げることができる。
【００２８】
本発明において、低級アルコキシ基とは低級アルキルオキシ基のことで低級アルキル基は前述の通り、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基を示し、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等を挙げることができる。これらのうち、好ましい基としてはメトキシ基を挙げることができる。
【００２９】
本発明において、ハロゲン原子とはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を示す。これらのうち、好ましい原子としてはフッ素原子、塩素原子を挙げることができる。
【００３０】
本発明化合物の薬理学的に許容し得る水和物としては、水分子１分子以上と会合又は結合した状態のものが挙げられる。また、本発明化合物の水和物には、上記本発明化合物の薬理学的に許容しうる塩の水和物も含まれる。
【００３１】
本発明化合物の薬理学的に許容し得る溶媒和物としては、例えば、エタノールもしくはプロパノール等のアルコール系溶媒、酢酸等の有機酸、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフランもしくはジエチルエーテル等のエーテル類、ジメチルスルホキシド等の溶媒和物が挙げられる。溶媒和物は非毒性かつ水溶性であることが好ましい。また、本発明化合物の溶媒和物には、上記本発明化合物の薬理学的に許容しうる塩の溶媒和物も含まれる。
【００３２】
本発明化合物の薬理学的に許容し得る塩としては、塩酸、硫酸等の鉱酸との塩、酢酸、安息香酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩などが挙げられる。これらの塩は常法に従って製造することができる。
【００３３】
一般式（１）で表される化合物としては、以下のような化合物が挙げられる。
（１）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２）１−（２−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（３）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−５−メチルインドール
（４）１−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（５）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−４−メチルインドール
（６）１−（３，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（７）１−（２−ナフチルメチル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（８）１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（９）１−（４−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（１０）１−（３−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
【００３４】
（１１）３−（ヒドロキシメチル）−１−（２−ピリジルメチル）インドール
（１２）１−（３，４−ジメチルベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（１３）３−ヒドロキシメチル−１−（４−メトキシベンジル）インドール
（１４）１−（４−ビフェニルメチル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（１５）１−（３，４−ジクロロベンジル）−５−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（１６）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−７−メチルインドール
（１７）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−６−メトキシインドール
（１８）３−ヒドロキシメチル−１−（３−ピリジルメチル）インドール
（１９）１−（２，３−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２０）３−ヒドロキシメチル−１−（４−ピリジルメチル）インドール
【００３５】
（２１）１−（２，５−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２２）６−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２３）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−５−メトキシインドール
（２４）５−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２５）４−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２６）７−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２７）１−（２，６−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２８）５−ベンジルオキシ−１−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
【００３６】
（２９）３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジクロロベンジル）インドール
（３０）３−アセトキシメチル−１−ベンジルインドール
（３１）３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジクロロベンジル）−５−メチルインドール
（３２）３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジフルオロベンジル）インドール
【００３７】
本発明の１−ベンジルインドール誘導体は特許文献４の方法に従って、下記一般式（５）の化合物から合成することができる。なお、一般式（５）で表される化合物は、市場から容易に入手できる。すなわち、下記一般式（５）
【００３８】
【化５】
（式中、ＸおよびＹは前記に記載の通りである。）で表される化合物に、Ａｒ−ＣＨ2−Ｑ（ＱはＣｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ2ＣＨ3、ＯＳＯ2Ｐｈなどの脱離基を示す）を１〜５当量、好ましくは１〜２当量を加えて、塩基性条件化で反応させることにより、
【００３９】
【化６】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ａｒは前記に記載の通りである。）で表される化合物を得ることができる。続いて、この化合物を水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤によってアルデヒド基を水酸基へ還元することにより、下記一般式（１）
【００４０】
【化７】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ａｒは前記に記載の通りであり、Ｚは水素原子を示す。）で表される本発明の１−ベンジルインドール誘導体を得ることができる。更には一般式（１）のＺが低級アシル基である化合物群は、Ｚが水酸基である化合物群を塩基性条件下、対応する酸無水物もしくは酸塩化物等の低級アシル化剤で処理することにより、所望の誘導体へ導くことができる。
【００４１】
なお、５−メトキシ−１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール及び１−（３，５−ジフルオロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールは化合物ライブラリーより入手可能である。
【００４２】
上記の各合成法により得た反応混合物から目的物を単離および精製するには、常法による溶媒抽出、濃縮、結晶化、蒸留、懸濁精製、各種クロマトグラフィーなどを、必要に応じて用いることができる。
【００４３】
本発明の１−ベンジルインドール誘導体は、例えば、血管新生阻害剤、加齢黄斑変性症治療剤等の医薬品として使用する場合の製剤化および投与方法は従来公知の種々の方法が適用できる。すなわち、投与方法としては例えば注射（皮下注、静注、動注等）、経口又は直腸投与等が可能である。
【００４４】
製剤化の際に本発明の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩に悪影響を与えない限り、医薬用に用いられる種々の医薬用添加剤、すなわち、担体やその他の助剤、例えば安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等を使用してもよい。製剤において、１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、または薬理学的に許容される塩の含量は製剤形態等により広範囲に変えることが可能であり、一般には０．０１〜１００％（重量）、好ましくは０．１〜７０％（重量）含有する。経口剤の場合には添加剤と共に錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤等の形態で用いられる。カプセル剤、錠剤、顆粒、散剤は一般に５〜１００％（重量）、好ましくは２５〜９８％（重量）の有効成分を含む。
【００４５】
本発明の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩の投与量は適応症、症状、投与方法等により異なるが、成人１人１日あたり０．０１〜８００ｍｇ程度である。
【実施例】
【００４６】
次に実施例として本発明化合物の合成例及び薬理実験例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、以下で室温とは１０〜３０℃を示す。また、ＬＣＭＳは島津製作所製ＬＣＭＳ２０１０Ａにて分析し、ＬＣはカラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（φ２．１×１００ｍｍ）を用い、溶出液Ａに０．１％ギ酸水溶液、溶出液Ｂにアセトニトリルをそれぞれ用い、ＬＣＭＳ（Ａ）では溶出液Ｂの濃度が２０（０ｍｉｎ）−９０％（５．５ｍｉｎ）−９０％（６．５ｍｉｎ）−２０％（６．５１ｍｉｎ）−２０％（１０ｍｉｎ）のグラジエントで流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで溶出、ＬＣＭＳ（Ｂ）では溶出液Ｂの濃度が６０（０ｍｉｎ）−９０％（５．５ｍｉｎ）−９０％（６．５ｍｉｎ）−６０％（６．５１ｍｉｎ）−６０％（１０ｍｉｎ）のグラジエントで流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで溶出、ＬＣＭＳ（Ｃ）では溶出液Ｂの濃度が５（０ｍｉｎ）−９０％（５．５ｍｉｎ）−９０％（６．５ｍｉｎ）−５％（６．５１ｍｉｎ）−５％（１０ｍｉｎ）のグラジエントで流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで溶出した。保持時間（Ｒｔ）はＵＶ検出器までの時間とし、ＭＳはＥＳＩ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）モードで測定した。
【００４７】
実施例１
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールの合成
１−（３，４−ジクロロベンジル）インドール−３−アルデヒドの合成（第１工程）
インドール−３−アルデヒド（７．２６ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）に炭酸セシウム（３２．５８ｇ、１００ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（１００ｍＬ）を加え、２時間加熱還流した。この溶液に３，４−ジクロロベンジルクロリド（１０．７７ｇ、５５．０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、１時間加熱還流した。
反応終了後、反応液の溶媒を減圧下溜去し、水（２００ｍＬ）を加えた後、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）で３回抽出した。抽出した有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下溜去することにより、結晶を得た。この結晶をジクロロメタン−ｎ−ヘキサン（１：３）混合液で洗浄することにより、淡褐色の目的物（１３．００ｇ）を収率８５．５％で得た。
【００４８】
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールの合成（第２工程）
第１工程で得られた１−（３，４−ジクロロベンジル）インドール−３−アルデヒド（６．０８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）−メタノール（１０ｍＬ）混合液に溶解した溶液に、室温下、水素化ホウ素ナトリウム（０．８３ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）を加え、同温にて１時間攪拌した。
反応終了後、アセトン（５ｍＬ）を加え、１０分間攪拌した後、溶媒を減圧下溜去することにより無色結晶（６．４０ｇ）を得た。この結晶をジクロロメタン（８０ｍＬ）に溶解した後、ｎ−ヘキサン（１６０ｍＬ）を加えて再結晶することにより、無色結晶の目的物（３．９２ｇ）を収率６４．０％で得た。
【００４９】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ｐｐｍ）：７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）、７．１７−７．２５（４Ｈ，ｍ）、７．１０（１Ｈ，ｓ）、６．９０(１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ)、５．２３（２Ｈ，ｓ）、４．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ）、１．５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ）．
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．６９０ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２８８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５０】
実施例２
１−（２−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールの合成
１−（２−クロロベンジル）インドール−３−アルデヒドの合成（第１工程）
インドール−３−アルデヒド（１．４５ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）に炭酸セシウム（６．５２ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（２０ｍＬ）を加え、２時間加熱還流した。この溶液に２−クロロベンジルクロリド（１．７８ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）を加え、１時間加熱還流した。
反応終了後、反応液の溶媒を減圧下溜去し、水を加えた後、ジクロロメタンで３回抽出した。抽出した有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下溜去することにより、結晶を得た。この結晶をアセトニトリルで洗浄後、ジクロロメタン−ｎ−ヘキサンで再結晶することにより、淡褐色の目的物（１．７７ｇ）を収率６６％で得た。
【００５１】
１−（２−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールの合成（第２工程）
第１工程で得られた１−（２−クロロベンジル）インドール−３−アルデヒド（１．５０ｇ、５．５６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８ｍＬ）−メタノール（２ｍＬ）混合液に溶解した溶液に、室温下、水素化ホウ素ナトリウム（０．２３ｇ、６．０８ｍｍｏｌ）を加え、同温にて１．５時間攪拌した。
反応終了後、アセトン（１ｍＬ）を加え、１０分間攪拌した。溶媒を減圧下溜去した後、することによりオイルを得た。このオイルに水を加えた後、ジクロロメタンで３回抽出した。抽出した有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下溜去することにより、結晶（１．５５ｇ）を得た。この結晶をジエチルエーテル−ｎ−ヘキサン（１：２）で洗浄することにより、無色結晶の目的物（１．３５ｇ）を収率８９％で得た。
【００５２】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ｐｐｍ）：７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．９，１．０Ｈｚ）、７．１７−７．２５（６Ｈ，ｍ）、６．６６(１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．７，０．６Ｈｚ)、５．３８（２Ｈ，ｓ）、４．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）、１．５２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）．
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．３８４ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２５４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５３】
以下に示す実施例３〜２８の化合物の合成は、実施例１の化合物の合成法に準じて行い、第１工程のインドール−３−アルデヒドの代わりに対応する置換基を有する化合物に、さらに３，４−ジクロロベンジルクロリドの代わりに対応するベンジルクロリドを用いて実施した。実施例３〜２８について得られた各々の化合物の理化学的性質を以下に示す。
【００５４】
実施例３
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−５−メチルインドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．２２９ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３０２（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５５】
実施例４
１−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｂ）：Ｒｔ＝２．４９１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２５６（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５６】
実施例５
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−４−メチルインドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．１３５ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３０２（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５７】
実施例６
１−（３，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．９５４ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３０６（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５８】
実施例７
１−（２−ナフチルメチル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．６２２ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２７０（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５９】
実施例８
１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝５．９９０ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２２０（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６０】
実施例９
１−（４−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．３６８ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２５４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６１】
実施例１０
１−（３−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．３１１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２５４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６２】
実施例１１
３−（ヒドロキシメチル）−１−（２−ピリジルメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｃ）：Ｒｔ＝４．８１５ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２３９（Ｍ＋Ｈ）+．
【００６３】
実施例１２
１−（３，４−ジメチルベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｂ）：Ｒｔ＝３．２７５ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２４８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６４】
実施例１３
３−ヒドロキシメチル−１−（４−メトキシベンジル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｂ）：Ｒｔ＝２．２４０ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２５０（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６５】
実施例１４
１−（４−ビフェニルメチル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝３．８６４ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２９６（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６６】
実施例１５
１−（３，４−ジクロロベンジル）−５−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．９１７ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３０６（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６７】
実施例１６
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−７−メチルインドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．１４８ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３０２（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６８】
実施例１７
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−６−メトキシインドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．７３８ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３１８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６９】
実施例１８
３−ヒドロキシメチル−１−（３−ピリジルメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｃ）：Ｒｔ＝３．９３３ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２３９（Ｍ＋Ｈ）+．
【００７０】
実施例１９
１−（２，３−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．８５４ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２８８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７１】
実施例２０
３−ヒドロキシメチル−１−（４−ピリジルメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｃ）：Ｒｔ＝３．７２４ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２３９（Ｍ＋Ｈ）+．
【００７２】
実施例２１
１−（２，５−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．７５７ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２８８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７３】
実施例２２
６−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．５８１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３９４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７４】
実施例２３
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−５−メトキシインドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．７３２ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３１８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７５】
実施例２４
５−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．６７１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３９４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７６】
実施例２５
４−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．８４１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３９４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７７】
実施例２６
７−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．８１５ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３９４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７８】
実施例２７
１−（２，６−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．６４７ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２８８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７９】
実施例２８
５−ベンジルオキシ−１−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｂ）：Ｒｔ＝４．３７１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２７６（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００８０】
実施例２９
３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジクロロベンジル）インドールの合成
実施例1で得られた１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール（１５３ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）をピリジン（０．５ｍＬ）に溶解した溶液に、無水酢酸（１．０ｍＬ、１０．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜攪拌した。
反応終了後、反応液にトルエンを加え、減圧下で溶媒および無水酢酸を溜去した。残渣に水を加えた後、酢酸エチルで抽出した。抽出した有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下溜去し、オイルを得た。このオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製することにより、無色の目的物（７１．３ｍｇ）を収率４１％で得た。
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝５．３３７ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２８８（Ｍ−ＣＨ3ＣＯＯＨ＋Ｈ）+．
【００８１】
試験例１
ＨＩＦ−１α依存的転写活性阻害作用
（１−１）ＨＩＦ−１α依存的転写を測定するためのレポーターベクターの作成
ＨＩＦ−１α依存的転写を測定するために、ＨＩＦ−１α応答配列として知られるＶＥＧＦ−Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ａ）遺伝子上流に存在する４７ｂｐのＨＲＥ（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）配列を用いることとした。
【００８２】
配列表の配列番号１、２に示されるＨＲＥオリゴヌクレオチド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，1６（９），ｐ．４６０４−４６１３（１９９６））を合成（オペロンバイオテクノロジーズ社に依頼）し、１００μＭとなるように蒸留水で希釈した。
【００８３】
これらを各１μＬずつ混合し、９５℃で５分間加熱した後、室温に戻しアニーリングさせた。導入するベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクター（東洋紡績社製）を用いた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶ（東洋紡績社製）で切断後、エタノール沈殿した。次に、このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、ＴＥ溶液（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。このＤＮＡとアニーリングさせたＨＲＥオリゴヌクレオチドとをモル比が１：１００となるように混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて接続した。以下このプラスミドをｐＢＳＫＳ（＋）／ＨＲＥベクターと表記する。
【００８４】
続いて、ｐＢＳＫＳ（＋）／ＨＲＥベクターを制限酵素ＳａｃＩ（東洋紡績社製）及びＸｈｏＩ（東洋紡績社製）で切断した後、０．８％アガロース電気泳動により分画した。ＨＲＥ配列を含む断片を抽出し、精製した（以下ＨＲＥ／ＳａｃＩ，ＸｈｏＩと表記する）。精製には、ＥＡＳＹＴＲＡＰ（宝酒造社製）を用いた。導入するベクターとしては、ルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター（プロメガ社製）のＢａｍＨＩサイトに選択用マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を導入したｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒベクターを用いた。ｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒベクターをＳａｃＩ及びＸｈｏＩで切断した後、１μＬのエビアルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を加え、３７℃、３０分間保温することにより末端を脱リン酸化した。続いて、６５℃、１５分間保温し、酵素を失活させた後、２０μｇのグリコーゲンを加え、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。次に、このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄したのち、ＴＥ溶液に溶解した。このＤＮＡ溶液を、０．８％アガロース電気泳動により分画し、抽出、精製した（以下ｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＳａｃＩ，ＸｈｏＩ（ＳＡＰ）と表記する）。精製にはＥＡＳＹＴＲＡＰを用いた。続いて、ＨＲＥ／ＳａｃＩ，ＸｈｏＩとｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＳａｃＩ，ＸｈｏＩ（ＳＡＰ）とをＤＮＡライゲーションキットを用いて接続した。以下、このベクターをｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＨＲＥと表記する。
【００８５】
（１−２）レポーターベクターを保持する細胞株の取得
次に、上記レポーターベクターを保持する細胞の取得ならびに機能評価を以下の方法に従って行った。
１００万個のＨＣＴ−１１６細胞を直径６０ｍｍの培養ディッシュに散布した。メディウムは１０％牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（イワキ社製）（以下ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳと表記する）を用いた。これらを、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて２４時間培養した後、メディウムをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ギブコ社製）に置換した。続いて、ｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＨＲＥベクター２μｇを導入した。プラスミドの導入はリポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社製）を用いて行った。すなわち、プラスミド溶液に１２５μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ギブコ社製）と１２μＬのリポフェクトアミン試薬を加え、良く攪拌した後、室温にて１５分間保温した。これを上記の手順で培養したＨＣＴ−１１６細胞株に投与し、穏やかに混和後、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて、３時間培養し、プラスミドを取り込ませた。続いてメディウムをＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳに置換し、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて、２１時間培養した。引き続いて、この細胞をトリプシン処理によりディッシュからはがし、直径１００ｍｍの培養ディッシュに散布した。３７℃にて、２日間培養した後、選択用薬剤として、１．２ｍｇ／ｍＬのジェネティシン（インビトロジェン社製）を添加した。培地を３日おきに交換しつつ、上記条件にてさらに２週間培養することによって、プラスミド中の遺伝子が細胞内遺伝子中に導入され、ジェネティシン耐性となった細胞を選択した。この細胞株中にはｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＨＲＥが導入されていると考えられる。
【００８６】
ディッシュ上でコロニーを形成した細胞群を複数単離し、２４穴の培養ディッシュに散布し、培養を継続した。これらクローンは、低酸素刺激及び低酸素ミミック刺激（The EMBO Journal １７（２２） ｐｐ．６５７３−６５８６、１９９８）に対してルシフェラーゼ活性の増大を示すことが期待できる。次にこれらクローンの２，２’−ｄｉｐｙｒｉｄｙｌに対する反応性を以下の手順により検討した。１ウエルあたり各クローン化細胞１万個を９６ウエルプレートに散布した。メディウムはＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳを用いた。これらを５％二酸化炭素存在下、３７℃にて２日間培養した後、１００μＭの２，２’−ｄｉｐｙｒｉｄｙｌを処理して、３７℃にて８時間培養した。続いて、これらの細胞について、そのルシフェラーゼ活性を測定することによって、低酸素ミミック刺激によるルシフェラーゼの活性化が認められるかどうか検討した。すなわち、各ウエルのメディウムを除去後、５０μＬの溶解液（２５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．８）、２ｍＭ ジチオトレイトール、２ｍＭ ＣＤＴＡ、１０％ グリセロール、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した後、室温にて１５分間保温した。この細胞溶解液を２０μＬ分取し、基質液（２０ｍＭ トリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．８）、１．０７ｍＭ 塩基性炭酸マグネシウム、２．６７ｍＭ 硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ジチオトレイトール、２７０μＭ コエンザイムＡ、４７０μＭ ルシフェリン、５３０μＭ アデノシン三リン酸）５０μＬを添加した後、ルミノメーター（パーキンエルマー社製）にてその化学発光強度を測定した。２，２’−ｄｉｐｙｒｉｄｙｌ刺激によって有意にルシフェラーゼ活性の上昇を示すクローンを選択し、以下の評価に用いた。以下、ＨＣＴ−１１６／ＨＲＥ ｃｌ．９と表記する。
【００８７】
（１−３）ＨＩＦ−１α依存的転写活性阻害作用の検討
１万個のＨＣＴ１１６／ＨＲＥ ｃｌ．９細胞を５０μＬの培地とともに９６穴 プレートに散布した。メディウムはＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳを用いた。これらを５％二酸化炭素存在下、３７℃にて４日間培養した後、各ウエルに１５０μＬのメディウムを添加し、さらに１０μＬの化合物を処理した。続いて、これら細胞を酸素濃度調節機能付のインキュベーター（池本理化工業社製）へ入れ、酸素濃度を１％に低下させ、５％二酸化炭素存在下、３７℃にて８時間培養した。各ウエルのメディウムを除去後、上記と同様の方法で、細胞中のルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＨＩＦ−１α依存的な転写活性に対する阻害作用を見た。本発明の化合物によるＨＩＦ−１α依存的な転写活性に対する阻害作用を表１に示す。
【００８８】
表１ ベンジルインドール誘導体のＨＩＦ−１α依存的転写活性阻害作用
化合物 ＩＣ５０（μＭ）
実施例１ ０．０１５
実施例２ ０．０９７
実施例３ ０．０３５
実施例４ ０．００９
実施例５ ０．０１０
実施例５ ０．０１０
実施例７ ０．０１４
実施例８ ０．０１７
実施例９ ０．０１３
実施例１０ ０．０１３
実施例１１ ０．０２４
実施例１２ ０．０２５
実施例１３ ０．０３３
実施例１４ ０．０３７
実施例１５ ０．０６７
実施例１６ ０．０７７
実施例１７ ０．１１
実施例１８ ０．１１
実施例１９ ０．１４
実施例２０ ０．１４
実施例２１ ０．３３
実施例２２ ０．３１
実施例２３ １．２
実施例２９ ０．０１７
【００８９】
以上のように、本発明の１−ベンジルインドール誘導体は、ＨＩＦ−１α依存的な転写活性を強く阻害することが明らかになった。
【００９０】
試験例２
ＨＩＦ−１α安定化阻害作用の検討
（２−１）ＨＩＦ−１α蛋白質画分の調製
５０万個のＨｅｐ３Ｂ細胞を直径６０ｍｍの培養ディッシュに散布した。メディウムはＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳを用いた。５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて終夜培養した後、実施例１及び実施例２の化合物をそれぞれ０．３２μＭ〜１０μＭまでを処理し、さらに１６時間培養した。続いて、酸素濃度調節機能付のインキュベーターに移し、酸素濃度を１％に低下させ、２時間培養することによってＨＩＦ−１αを安定化させた。その後、細胞を取り出してメディウムを吸引除去し、さらに１ｍＬの氷冷したＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ（−））を加え、細胞を洗浄した。続いて、１ｍＬの氷冷ＰＢＳ（−）を加えた後、スクレイパーで細胞をエッペンドルフチューブに回収した。小型遠心機を用い、７０００ｒｐｍで１分間、４℃にて遠心することで、細胞を沈殿させた。上清を吸引除去後、１００μＬの細胞溶解液（０．５Ｍ ショ糖、１５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、６０ｍＭ 塩化カリウム、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１２５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ジチオトレイトール、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド、０．４％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）を加え、氷上に５分間静置することで細胞を溶解させた。その後、小型遠心機を用い、３０００ｒｐｍで１０分間、４℃にて遠心することで、粗核画分を沈殿させ、上清を除去した。沈殿した粗核画分に３０μＬの核蛋白質抽出用溶液（５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．５）、２％ 硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ））を加え、プローブ式のソニケーターを用いて、超音波破砕を行った。続いて、小型遠心機を用い、１５０００ｒｐｍで３０分間、４℃にて遠心することで、核抽出液を上清に回収した。蛋白質濃度をＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアス社製）を用いて測定した。
【００９１】
（２−２）ウエスタンブロッティングを用いたＨＩＦ−１α蛋白質量の定量
各１５μｇの蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分画した。アクリルアミドの濃度は１０％とした。泳動したゲルはミニトランスブロットセルブロッティング装置（バイオラッド社製）を用いて、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて蛋白質が転写されたＰＶＤＦ膜を、５％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ溶液（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で室温にて３０分間穏やかに振とうすることでブロッキングを行った。
【００９２】
引き続いて、１次抗体との反応を行った。５％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ溶液で１０００倍希釈した抗ＨＩＦ−１α抗体（ＮＢ１００−１２３：Ｎｏｖｕｓ社製）とＰＶＤＦ膜を４℃にて終夜、穏やかに振とうしながら反応した。抗体液を除去した後、５％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ溶液で３回の洗浄を行い（室温にて１０分間、１０分間、５分間）、非特異的な抗体を除去した。続いて２次抗体との反応を行った。５％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ溶液で２０００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＮＡ９３１Ｖ ＧＥヘルスケア社製）を加え、室温で２時間穏やかに振とうしながら反応した。抗体液を除去した後、５％のスキムミルクを含むＴＢＳ溶液で３回の洗浄を行い（室温にて１０分間、１０分間、５分間）、非特異的な抗体を除去した。引き続いて、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用い、抗ＨＩＦ−１α抗体と反応した蛋白質のバンドを検出した。薬剤処理による細胞内ＨＩＦ−１α蛋白質量の変化を見積もることによって、低酸素依存的なＨＩＦ−１α安定化阻害作用を評価した。
【００９３】
図１に示すように、通常の酸素濃度下（ＮＯＲＭＯＸＩＡ）では検出されないＨＩＦ−１αの蛋白質量は酸素濃度１％、２時間培養（ＨＹＰＯＸＩＡ）により増加した。これは、低酸素において、ＨＩＦ−１αの分解が抑制されたためと考えられる。一方、実施例１及び実施例２の化合物のいずれもＨＹＰＯＸＩＡにおいて濃度依存的にＨＩＦ−１αの蛋白質量を減少させた。従って、実施例１及び実施例２の化合物は低酸素によるＨＩＦ−１αの分解を抑制し、ＨＩＦ−１αの安定化を阻害していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のＨＩＦ−１α活性阻害剤はＨＩＦ−１α依存的転写活性阻害作用を有し、低酸素下におけるＨＩＦ−１αの安定化を阻害することから、ＨＩＦ−１αが発現を制御するＶＥＧＦ等の血管新生因子の発現を抑制することが可能である。従って、本発明のＨＩＦ−１α活性阻害剤は血管新生に起因する疾患の治療に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明のＨＩＦ−１α活性阻害剤によるＨＩＦ−１αの安定化阻害作用を示す図である。
【符号の説明】
【００９６】
１レーン：通常の酸素濃度下（ＮＯＲＭＯＸＩＡ）におけるＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
２レーン：酸素濃度１％、２時間培養（ＨＹＰＯＸＩＡ）におけるＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
３レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例１の化合物を０．３２μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
４レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例１の化合物を１μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
５レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例１の化合物を３．１６μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
６レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例１の化合物を１０μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
７レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例２の化合物を０．３２μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
８レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例２の化合物を１μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
９レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例２の化合物を３．１６μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
１０レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例２の化合物を１０μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
配列表の配列番号：１はＨＲＥ（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）配列を含むオリゴヌクレオチドを表す
配列表の配列番号：２は配列番号：１に相補的なオリゴヌクレオチドを表す
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＦ−１α活性を阻害する１−ベンジルインドール誘導体、並びにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生阻害剤は、血管新生に起因する疾患、および血管の新生を必要とする疾患に対する治療薬として、近年注目されている。例えば、そのような疾患の一例として、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ：Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。ＡＭＤは、加齢に伴う黄斑の変化によって引き起こされる疾患で高齢者の失明原因の一つとなっている。特に、脈絡膜から発生する新生血管を伴う滲出型のＡＭＤにおいては急激な視力低下を伴うことが多く、病態の改善にはこの血管新生を抑制することが重要であることがわかっている（非特許文献１）。主な治療としては、光線力学的療法（ＰＤＴ：Ｐｈｏｔｏ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ）がある。すなわち、光感受性物質ベルテポルフィンを静脈注射し、薬剤が脈絡膜新生血管に集積させた後、レーザーでベルテポルフィンを光活性化して、脈絡膜新生血管を退縮させる治療が行われている。また近年、ＡＭＤの治療薬として血管新生因子の一つである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）に対する抗体（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）やアプタマー（Ｍａｃｕｇｅｎ）が認可され、臨床で効果を示すようになってきている。しかし、ＰＤＴは行える施設が限られることや、費用が高額であること、更には、抗ＶＥＧＦ抗体やアプタマーについてもいずれも高分子製剤であり高額な医療費を必要とすること、などの問題点を抱えており、効果的に血管新生を抑制できる低分子化合物が望まれている。その他、癌疾患領域においても、癌が成長するために必要な血管新生を抑制するという治療法は大きな期待を集めており、これまでのところ抗ＶＥＧＦ抗体（Ａｖａｓｔｉｎ）が認可され、治療薬として応用されている。
【０００３】
しかし最近になって、転写因子であるＨＩＦ−１α （Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ−１α）が、ＶＥＧＦを始めとする複数の血管新生因子の発現を誘導することが明らかになってきた（非特許文献２−５）。このＨＩＦ−１αは、通常の酸素濃度では、ＨＩＦプロリルハイドロキシラーゼによって酸化された後、速やかに分解されるため検出できないが、癌組織などの低酸素状態ではこの酸化が起きないため、ＶＥＧＦなどの血管新生因子を強力に転写活性化する。（非特許文献６、７）。このため、ＶＥＧＦを始めとする複数の血管新生因子の発現を誘導するＨＩＦ−１αの阻害剤は、新たな血管新生の阻害活性を有する薬剤として期待されるようになってきた。
【０００４】
ＨＩＦ−１α活性阻害剤としては非特許文献８に記載されているＹＣ−１が知られている。この化合物は部分構造として１−ベンジルインドール骨格を有するが、インドール環３位の置換基が本発明化合物とは異なるものである。
【０００５】
その他には、特許文献１、２に報告されている化合物が類似化合物として知られている。しかしながら、特許文献１の化合物群は、インドール環３位の置換基が異なり、ヒドロキシメチル基および低級アシルオキシメチル基に関する記載がなく、用途はＥＰ３受容体を介したプロスタグランジン関連の疾患の治療であり、ＨＩＦ−１α阻害作用に関する記載もない。
【０００６】
特許文献２の化合物群は、インドール環の１位、３位もしくは７位にベンゾイル基もしくはフェノキシ基を有する化合物であり、本発明の骨格とは異なるものである。また、これらの化合物群の薬理作用として、チューブリン重合阻害剤活性による血管新生に関する作用が開示されているが、ＨＩＦ−１αに対する作用については何ら記載されていない。
【０００７】
さらには、特許文献３には本特許の骨格でインドール環３位にカルボニル基およびヒドロキシメチル基を有する化合物群（下記一般式（３）においてＡｒ2がメチル基を１個有しているフェニル基である化合物、１−（２，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール及び１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールを含む）のＲａｓ阻害作用と、それに起因する細胞増殖抑制作用が示されているが、ＨＩＦ−１αに対する作用については何ら記載がない。
【０００８】
特許文献４には抗真菌及び抗寄生虫活性を有するインドール誘導体が記載されているが、ＨＩＦ−１αに対する作用については記載がない。
【０００９】
非特許文献９には、５−クロロ−１−（４−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール、５−フルオロ−１−（４−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール及び下記一般式（３）においてＡｒ2がハロゲン原子を１個有しているフェニル基である化合物であって抗リーシュマニア活性を有するものが記載されているが、ＨＩＦ−１αに対する作用については記載がない。非特許文献１０には１−（３−メトキシベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール、非特許文献１１には抗菌活性を有する１−（２，４−ジフルオロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールが記載されているが、ＨＩＦ−１αに対する作用については記載がない。
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｎ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．，４０，ｐ．３５２(２００５)．
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，ｐ．４６０４(１９９６)．
【非特許文献３】Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１４，ｐ．３４（２０００）．
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，ｐ．１０４２３（２００２）．
【非特許文献５】Ｂｌｏｏｄ，１０７，ｐ．２７０５（２００６）．
【非特許文献６】Ｎａｔｕｒｅ，３９９，ｐ．２７１（１９９９）．
【非特許文献７】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２，ｐ．４６８（２００１）．
【非特許文献８】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，９５，ｐ．４９８（２００３）．
【非特許文献９】Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９，ｐ．４５１（２００４）．
【非特許文献１０】Ｊ．Ｉｎｄｉａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６，ｐ．６０１（１９９９）．
【非特許文献１１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，ｐ．７５−８７（２００３）．
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００７９５２０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２６７１０８号明細書
【特許文献３】国際公開第２００７／０６２３９９号パンフレット
【特許文献４】特表２００４−５０９８８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、新規のＨＩＦ−１α活性阻害剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するため合成化合物について種々検索した結果、１−ベンジルインドール誘導体がＨＩＦ−１α阻害活性を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は
一般式（１）
【００１５】
【化１】
【００１６】
（式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立していてもよく、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ｚは水素原子または低級アシル基を示し、Ａｒは低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜３個有していてもよいアリール基もしくはヘテロアリール基を示す。）で表される１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（２）一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子である前記（１）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（３）一般式（１）において、Ｚが水素原子である前記（２）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（４）一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子、低級アルキル基またはハロゲン原子である前記（３）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（５）一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子、メチル基またはフッ素原子である前記（４）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（６）一般式（１）において、Ａｒが塩素原子、フッ素原子、メチル基、メトキシ基及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有していてもよいアリール基である前記（５）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、または薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（７）一般式（１）において、Ａｒが３，４−ジクロロフェニル基、３，４−ジフルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ビフェニル基である前記（６）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（８）一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらも水素原子である前記（７）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（９）一般式（１）において、Ｚが低級アシル基である前記（２）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（１０）一般式（１）において、Ｚがアセチル基である前記（９）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（１１）一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子またはメチル基である前記（１０）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（１２）一般式（１）において、ＸおよびＹがどちらも水素原子であり、Ａｒがハロゲン原子を１〜２個有していてもよいフェニル基であるである前記（１１）に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤、
（１３）一般式（２）
【００１７】
【化２】
【００１８】
（式中、Ｙ1は低級アルキル基、フッ素原子、塩素原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ａｒ1はヘテロアリール基、または低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子及び低級アルコキシ基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有していてもよいアリール基を示す。但し、Ａｒ1が４−クロロフェニル基であり、Ｙ1が５−塩素原子もしくは５−フッ素原子の組み合わせの化合物、およびＡｒ1がフェニル基であり、Ｙ1が５−メトキシ基の組み合わせの化合物は除く。）で表される１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１４）一般式（２）において、Ｙ1がメチル基、フッ素原子、メトキシ基もしくはベンジルオキシ基である前記（１３）に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１５）一般式（２）において、Ａｒ1がメチル基、フッ素原子、塩素原子またはメトキシ基を１〜２個有していてもよいアリール基、またはピリジル基である前記（１４）に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１６）一般式（２）において、Ｙ1が５−メチル基、４−メチル基、７−メチル基、５−フッ素原子、６−フッ素原子、５−メトキシ基もしくは６−メトキシ基であり、Ａｒ1が３，４−ジクロロフェニル基である前記（１５）に記載の１−ベンジル−３（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１７）一般式（３）
【００１９】
【化３】
【００２０】
（式中、Ａｒ2はヘテロアリール基、または低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有しているアリール基を示す。但し、Ａｒ2がハロゲン原子もしくはメチル基を１個有しているフェニル基、３−メトキシフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基、３，４−ジクロロフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、および３，５−ジフルオロフェニル基である化合物は除く。）で表される１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１８）一般式（３）において、Ａｒ2がピリジル基、またはメチル基、フッ素原子、及び塩素原子からなる群から選ばれる置換基を２個有するフェニル基、４−メトキシ基もしくは４−フェニル基を有するフェニル基である前記（１７）に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（１９）一般式（３）において、Ａｒ2が２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、３，４−ジフルオロフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、２，３−ジクロロフェニル基、２，５−ジクロロフェニル基、４−メトキシフェニル基もしくは４−ビフェニル基である前記（１８）に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
（２０）一般式（４）
【００２１】
【化４】
【００２２】
（式中、Ｙ3は水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ｚ3は低級アシル基を示し、Ａｒ3は低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、フェニル基からなる組み合わせの置換基を１〜３個有していてもよいアリール基、またはヘテロアリール基を示す。）で表される１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
（２１）一般式（４）において、Ｚ3がアセチル基である前記（２０）に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（２２）一般式（４）において、Ｙ3が水素原子である前記（２１）に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（２３）一般式（４）において、Ａｒ3がピリジル基または塩素原子を１〜２個有していてもよいフェニル基である請求項２２に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
（２４）前記（２０）に記載の３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジクロロベンジル）インドール、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩、
【００２３】
（２５）前記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の化合物またはその水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする血管新生阻害剤、
（２６）前記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の化合物またはその水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする加齢黄斑変性症治療剤、
に関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、１−ベンジルインドール誘導体がＨＩＦ−１α阻害活性を有することが明らかになり、抗血管新生阻害剤および新生血管型加齢性黄斑変性症治療剤としての臨床応用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明において、低級アルキル基とは炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基を示し、例えばメチル基、エチル基，ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ジメチルプロピル基、イソブチル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ-ヘキシル基等を挙げることができる。これらのうち、好ましい基としてはメチル基を挙げることができる。
【００２６】
本発明において、アリール基とは炭素数６〜１４の芳香族炭化水素基を示し、例えばフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基等を挙げることができる。これらのうち、好ましい基としてはフェニル基、ナフチル基を挙げることができる。また、更に好ましい基としてフェニル基を挙げることができる。
【００２７】
本発明において、ヘテロアリール基とはヘテロ原子として窒素原子、酸素原子または硫黄原子を同一または異なるヘテロ原子として１〜４個含む複素芳香族を示し、例えばフリル基、チエニル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、ピリジル基、インドリル基、チアゾリル基、フラザニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、キノキサリル基等を挙げることができる。これらのうち、好ましい基としてピリジル基を挙げることができる。
【００２８】
本発明において、低級アルコキシ基とは低級アルキルオキシ基のことで低級アルキル基は前述の通り、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基を示し、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等を挙げることができる。これらのうち、好ましい基としてはメトキシ基を挙げることができる。
【００２９】
本発明において、ハロゲン原子とはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を示す。これらのうち、好ましい原子としてはフッ素原子、塩素原子を挙げることができる。
【００３０】
本発明化合物の薬理学的に許容し得る水和物としては、水分子１分子以上と会合又は結合した状態のものが挙げられる。また、本発明化合物の水和物には、上記本発明化合物の薬理学的に許容しうる塩の水和物も含まれる。
【００３１】
本発明化合物の薬理学的に許容し得る溶媒和物としては、例えば、エタノールもしくはプロパノール等のアルコール系溶媒、酢酸等の有機酸、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフランもしくはジエチルエーテル等のエーテル類、ジメチルスルホキシド等の溶媒和物が挙げられる。溶媒和物は非毒性かつ水溶性であることが好ましい。また、本発明化合物の溶媒和物には、上記本発明化合物の薬理学的に許容しうる塩の溶媒和物も含まれる。
【００３２】
本発明化合物の薬理学的に許容し得る塩としては、塩酸、硫酸等の鉱酸との塩、酢酸、安息香酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩などが挙げられる。これらの塩は常法に従って製造することができる。
【００３３】
一般式（１）で表される化合物としては、以下のような化合物が挙げられる。
（１）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２）１−（２−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（３）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−５−メチルインドール
（４）１−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（５）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−４−メチルインドール
（６）１−（３，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（７）１−（２−ナフチルメチル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（８）１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（９）１−（４−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（１０）１−（３−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
【００３４】
（１１）３−（ヒドロキシメチル）−１−（２−ピリジルメチル）インドール
（１２）１−（３，４−ジメチルベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（１３）３−ヒドロキシメチル−１−（４−メトキシベンジル）インドール
（１４）１−（４−ビフェニルメチル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（１５）１−（３，４−ジクロロベンジル）−５−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（１６）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−７−メチルインドール
（１７）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−６−メトキシインドール
（１８）３−ヒドロキシメチル−１−（３−ピリジルメチル）インドール
（１９）１−（２，３−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２０）３−ヒドロキシメチル−１−（４−ピリジルメチル）インドール
【００３５】
（２１）１−（２，５−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２２）６−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２３）１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−５−メトキシインドール
（２４）５−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２５）４−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２６）７−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２７）１−（２，６−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
（２８）５−ベンジルオキシ−１−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
【００３６】
（２９）３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジクロロベンジル）インドール
（３０）３−アセトキシメチル−１−ベンジルインドール
（３１）３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジクロロベンジル）−５−メチルインドール
（３２）３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジフルオロベンジル）インドール
【００３７】
本発明の１−ベンジルインドール誘導体は特許文献４の方法に従って、下記一般式（５）の化合物から合成することができる。なお、一般式（５）で表される化合物は、市場から容易に入手できる。すなわち、下記一般式（５）
【００３８】
【化５】
（式中、ＸおよびＹは前記に記載の通りである。）で表される化合物に、Ａｒ−ＣＨ2−Ｑ（ＱはＣｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ2ＣＨ3、ＯＳＯ2Ｐｈなどの脱離基を示す）を１〜５当量、好ましくは１〜２当量を加えて、塩基性条件化で反応させることにより、
【００３９】
【化６】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ａｒは前記に記載の通りである。）で表される化合物を得ることができる。続いて、この化合物を水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤によってアルデヒド基を水酸基へ還元することにより、下記一般式（１）
【００４０】
【化７】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ａｒは前記に記載の通りであり、Ｚは水素原子を示す。）で表される本発明の１−ベンジルインドール誘導体を得ることができる。更には一般式（１）のＺが低級アシル基である化合物群は、Ｚが水酸基である化合物群を塩基性条件下、対応する酸無水物もしくは酸塩化物等の低級アシル化剤で処理することにより、所望の誘導体へ導くことができる。
【００４１】
なお、５−メトキシ−１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール及び１−（３，５−ジフルオロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールは化合物ライブラリーより入手可能である。
【００４２】
上記の各合成法により得た反応混合物から目的物を単離および精製するには、常法による溶媒抽出、濃縮、結晶化、蒸留、懸濁精製、各種クロマトグラフィーなどを、必要に応じて用いることができる。
【００４３】
本発明の１−ベンジルインドール誘導体は、例えば、血管新生阻害剤、加齢黄斑変性症治療剤等の医薬品として使用する場合の製剤化および投与方法は従来公知の種々の方法が適用できる。すなわち、投与方法としては例えば注射（皮下注、静注、動注等）、経口又は直腸投与等が可能である。
【００４４】
製剤化の際に本発明の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩に悪影響を与えない限り、医薬用に用いられる種々の医薬用添加剤、すなわち、担体やその他の助剤、例えば安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等を使用してもよい。製剤において、１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、または薬理学的に許容される塩の含量は製剤形態等により広範囲に変えることが可能であり、一般には０．０１〜１００％（重量）、好ましくは０．１〜７０％（重量）含有する。経口剤の場合には添加剤と共に錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤等の形態で用いられる。カプセル剤、錠剤、顆粒、散剤は一般に５〜１００％（重量）、好ましくは２５〜９８％（重量）の有効成分を含む。
【００４５】
本発明の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩の投与量は適応症、症状、投与方法等により異なるが、成人１人１日あたり０．０１〜８００ｍｇ程度である。
【実施例】
【００４６】
次に実施例として本発明化合物の合成例及び薬理実験例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、以下で室温とは１０〜３０℃を示す。また、ＬＣＭＳは島津製作所製ＬＣＭＳ２０１０Ａにて分析し、ＬＣはカラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（φ２．１×１００ｍｍ）を用い、溶出液Ａに０．１％ギ酸水溶液、溶出液Ｂにアセトニトリルをそれぞれ用い、ＬＣＭＳ（Ａ）では溶出液Ｂの濃度が２０（０ｍｉｎ）−９０％（５．５ｍｉｎ）−９０％（６．５ｍｉｎ）−２０％（６．５１ｍｉｎ）−２０％（１０ｍｉｎ）のグラジエントで流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで溶出、ＬＣＭＳ（Ｂ）では溶出液Ｂの濃度が６０（０ｍｉｎ）−９０％（５．５ｍｉｎ）−９０％（６．５ｍｉｎ）−６０％（６．５１ｍｉｎ）−６０％（１０ｍｉｎ）のグラジエントで流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで溶出、ＬＣＭＳ（Ｃ）では溶出液Ｂの濃度が５（０ｍｉｎ）−９０％（５．５ｍｉｎ）−９０％（６．５ｍｉｎ）−５％（６．５１ｍｉｎ）−５％（１０ｍｉｎ）のグラジエントで流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで溶出した。保持時間（Ｒｔ）はＵＶ検出器までの時間とし、ＭＳはＥＳＩ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）モードで測定した。
【００４７】
実施例１
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールの合成
１−（３，４−ジクロロベンジル）インドール−３−アルデヒドの合成（第１工程）
インドール−３−アルデヒド（７．２６ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）に炭酸セシウム（３２．５８ｇ、１００ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（１００ｍＬ）を加え、２時間加熱還流した。この溶液に３，４−ジクロロベンジルクロリド（１０．７７ｇ、５５．０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、１時間加熱還流した。
反応終了後、反応液の溶媒を減圧下溜去し、水（２００ｍＬ）を加えた後、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）で３回抽出した。抽出した有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下溜去することにより、結晶を得た。この結晶をジクロロメタン−ｎ−ヘキサン（１：３）混合液で洗浄することにより、淡褐色の目的物（１３．００ｇ）を収率８５．５％で得た。
【００４８】
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールの合成（第２工程）
第１工程で得られた１−（３，４−ジクロロベンジル）インドール−３−アルデヒド（６．０８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）−メタノール（１０ｍＬ）混合液に溶解した溶液に、室温下、水素化ホウ素ナトリウム（０．８３ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）を加え、同温にて１時間攪拌した。
反応終了後、アセトン（５ｍＬ）を加え、１０分間攪拌した後、溶媒を減圧下溜去することにより無色結晶（６．４０ｇ）を得た。この結晶をジクロロメタン（８０ｍＬ）に溶解した後、ｎ−ヘキサン（１６０ｍＬ）を加えて再結晶することにより、無色結晶の目的物（３．９２ｇ）を収率６４．０％で得た。
【００４９】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ｐｐｍ）：７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）、７．１７−７．２５（４Ｈ，ｍ）、７．１０（１Ｈ，ｓ）、６．９０(１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ)、５．２３（２Ｈ，ｓ）、４．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ）、１．５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ）．
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．６９０ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２８８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５０】
実施例２
１−（２−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールの合成
１−（２−クロロベンジル）インドール−３−アルデヒドの合成（第１工程）
インドール−３−アルデヒド（１．４５ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）に炭酸セシウム（６．５２ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（２０ｍＬ）を加え、２時間加熱還流した。この溶液に２−クロロベンジルクロリド（１．７８ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）を加え、１時間加熱還流した。
反応終了後、反応液の溶媒を減圧下溜去し、水を加えた後、ジクロロメタンで３回抽出した。抽出した有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下溜去することにより、結晶を得た。この結晶をアセトニトリルで洗浄後、ジクロロメタン−ｎ−ヘキサンで再結晶することにより、淡褐色の目的物（１．７７ｇ）を収率６６％で得た。
【００５１】
１−（２−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドールの合成（第２工程）
第１工程で得られた１−（２−クロロベンジル）インドール−３−アルデヒド（１．５０ｇ、５．５６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８ｍＬ）−メタノール（２ｍＬ）混合液に溶解した溶液に、室温下、水素化ホウ素ナトリウム（０．２３ｇ、６．０８ｍｍｏｌ）を加え、同温にて１．５時間攪拌した。
反応終了後、アセトン（１ｍＬ）を加え、１０分間攪拌した。溶媒を減圧下溜去した後、することによりオイルを得た。このオイルに水を加えた後、ジクロロメタンで３回抽出した。抽出した有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下溜去することにより、結晶（１．５５ｇ）を得た。この結晶をジエチルエーテル−ｎ−ヘキサン（１：２）で洗浄することにより、無色結晶の目的物（１．３５ｇ）を収率８９％で得た。
【００５２】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ｐｐｍ）：７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．９，１．０Ｈｚ）、７．１７−７．２５（６Ｈ，ｍ）、６．６６(１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．７，０．６Ｈｚ)、５．３８（２Ｈ，ｓ）、４．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）、１．５２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）．
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．３８４ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２５４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５３】
以下に示す実施例３〜２８の化合物の合成は、実施例１の化合物の合成法に準じて行い、第１工程のインドール−３−アルデヒドの代わりに対応する置換基を有する化合物に、さらに３，４−ジクロロベンジルクロリドの代わりに対応するベンジルクロリドを用いて実施した。実施例３〜２８について得られた各々の化合物の理化学的性質を以下に示す。
【００５４】
実施例３
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−５−メチルインドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．２２９ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３０２（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５５】
実施例４
１−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｂ）：Ｒｔ＝２．４９１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２５６（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５６】
実施例５
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−４−メチルインドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．１３５ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３０２（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５７】
実施例６
１−（３，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．９５４ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３０６（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５８】
実施例７
１−（２−ナフチルメチル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．６２２ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２７０（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００５９】
実施例８
１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝５．９９０ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２２０（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６０】
実施例９
１−（４−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．３６８ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２５４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６１】
実施例１０
１−（３−クロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．３１１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２５４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６２】
実施例１１
３−（ヒドロキシメチル）−１−（２−ピリジルメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｃ）：Ｒｔ＝４．８１５ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２３９（Ｍ＋Ｈ）+．
【００６３】
実施例１２
１−（３，４−ジメチルベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｂ）：Ｒｔ＝３．２７５ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２４８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６４】
実施例１３
３−ヒドロキシメチル−１−（４−メトキシベンジル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｂ）：Ｒｔ＝２．２４０ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２５０（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６５】
実施例１４
１−（４−ビフェニルメチル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝３．８６４ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２９６（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６６】
実施例１５
１−（３，４−ジクロロベンジル）−５−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．９１７ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３０６（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６７】
実施例１６
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−７−メチルインドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．１４８ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３０２（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６８】
実施例１７
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−６−メトキシインドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．７３８ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３１８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００６９】
実施例１８
３−ヒドロキシメチル−１−（３−ピリジルメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｃ）：Ｒｔ＝３．９３３ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２３９（Ｍ＋Ｈ）+．
【００７０】
実施例１９
１−（２，３−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．８５４ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２８８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７１】
実施例２０
３−ヒドロキシメチル−１−（４−ピリジルメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｃ）：Ｒｔ＝３．７２４ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２３９（Ｍ＋Ｈ）+．
【００７２】
実施例２１
１−（２，５−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．７５７ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２８８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７３】
実施例２２
６−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．５８１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３９４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７４】
実施例２３
１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−ヒドロキシメチル−５−メトキシインドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．７３２ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３１８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７５】
実施例２４
５−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．６７１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３９４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７６】
実施例２５
４−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．８４１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３９４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７７】
実施例２６
７−ベンジルオキシ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝７．８１５ｍｉｎ，ｍ／ｚ：３９４（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７８】
実施例２７
１−（２，６−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝６．６４７ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２８８（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００７９】
実施例２８
５−ベンジルオキシ−１−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール
ＬＣＭＳ（Ｂ）：Ｒｔ＝４．３７１ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２７６（Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｈ）+．
【００８０】
実施例２９
３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジクロロベンジル）インドールの合成
実施例1で得られた１−（３，４−ジクロロベンジル）−３−（ヒドロキシメチル）インドール（１５３ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）をピリジン（０．５ｍＬ）に溶解した溶液に、無水酢酸（１．０ｍＬ、１０．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜攪拌した。
反応終了後、反応液にトルエンを加え、減圧下で溶媒および無水酢酸を溜去した。残渣に水を加えた後、酢酸エチルで抽出した。抽出した有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下溜去し、オイルを得た。このオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製することにより、無色の目的物（７１．３ｍｇ）を収率４１％で得た。
ＬＣＭＳ（Ａ）：Ｒｔ＝５．３３７ｍｉｎ，ｍ／ｚ：２８８（Ｍ−ＣＨ3ＣＯＯＨ＋Ｈ）+．
【００８１】
試験例１
ＨＩＦ−１α依存的転写活性阻害作用
（１−１）ＨＩＦ−１α依存的転写を測定するためのレポーターベクターの作成
ＨＩＦ−１α依存的転写を測定するために、ＨＩＦ−１α応答配列として知られるＶＥＧＦ−Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ａ）遺伝子上流に存在する４７ｂｐのＨＲＥ（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）配列を用いることとした。
【００８２】
配列表の配列番号１、２に示されるＨＲＥオリゴヌクレオチド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，1６（９），ｐ．４６０４−４６１３（１９９６））を合成（オペロンバイオテクノロジーズ社に依頼）し、１００μＭとなるように蒸留水で希釈した。
【００８３】
これらを各１μＬずつ混合し、９５℃で５分間加熱した後、室温に戻しアニーリングさせた。導入するベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクター（東洋紡績社製）を用いた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶ（東洋紡績社製）で切断後、エタノール沈殿した。次に、このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、ＴＥ溶液（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。このＤＮＡとアニーリングさせたＨＲＥオリゴヌクレオチドとをモル比が１：１００となるように混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて接続した。以下このプラスミドをｐＢＳＫＳ（＋）／ＨＲＥベクターと表記する。
【００８４】
続いて、ｐＢＳＫＳ（＋）／ＨＲＥベクターを制限酵素ＳａｃＩ（東洋紡績社製）及びＸｈｏＩ（東洋紡績社製）で切断した後、０．８％アガロース電気泳動により分画した。ＨＲＥ配列を含む断片を抽出し、精製した（以下ＨＲＥ／ＳａｃＩ，ＸｈｏＩと表記する）。精製には、ＥＡＳＹＴＲＡＰ（宝酒造社製）を用いた。導入するベクターとしては、ルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター（プロメガ社製）のＢａｍＨＩサイトに選択用マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を導入したｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒベクターを用いた。ｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒベクターをＳａｃＩ及びＸｈｏＩで切断した後、１μＬのエビアルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を加え、３７℃、３０分間保温することにより末端を脱リン酸化した。続いて、６５℃、１５分間保温し、酵素を失活させた後、２０μｇのグリコーゲンを加え、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。次に、このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄したのち、ＴＥ溶液に溶解した。このＤＮＡ溶液を、０．８％アガロース電気泳動により分画し、抽出、精製した（以下ｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＳａｃＩ，ＸｈｏＩ（ＳＡＰ）と表記する）。精製にはＥＡＳＹＴＲＡＰを用いた。続いて、ＨＲＥ／ＳａｃＩ，ＸｈｏＩとｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＳａｃＩ，ＸｈｏＩ（ＳＡＰ）とをＤＮＡライゲーションキットを用いて接続した。以下、このベクターをｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＨＲＥと表記する。
【００８５】
（１−２）レポーターベクターを保持する細胞株の取得
次に、上記レポーターベクターを保持する細胞の取得ならびに機能評価を以下の方法に従って行った。
１００万個のＨＣＴ−１１６細胞を直径６０ｍｍの培養ディッシュに散布した。メディウムは１０％牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（イワキ社製）（以下ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳと表記する）を用いた。これらを、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて２４時間培養した後、メディウムをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ギブコ社製）に置換した。続いて、ｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＨＲＥベクター２μｇを導入した。プラスミドの導入はリポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社製）を用いて行った。すなわち、プラスミド溶液に１２５μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ギブコ社製）と１２μＬのリポフェクトアミン試薬を加え、良く攪拌した後、室温にて１５分間保温した。これを上記の手順で培養したＨＣＴ−１１６細胞株に投与し、穏やかに混和後、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて、３時間培養し、プラスミドを取り込ませた。続いてメディウムをＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳに置換し、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて、２１時間培養した。引き続いて、この細胞をトリプシン処理によりディッシュからはがし、直径１００ｍｍの培養ディッシュに散布した。３７℃にて、２日間培養した後、選択用薬剤として、１．２ｍｇ／ｍＬのジェネティシン（インビトロジェン社製）を添加した。培地を３日おきに交換しつつ、上記条件にてさらに２週間培養することによって、プラスミド中の遺伝子が細胞内遺伝子中に導入され、ジェネティシン耐性となった細胞を選択した。この細胞株中にはｐＧＬ３−ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＨＲＥが導入されていると考えられる。
【００８６】
ディッシュ上でコロニーを形成した細胞群を複数単離し、２４穴の培養ディッシュに散布し、培養を継続した。これらクローンは、低酸素刺激及び低酸素ミミック刺激（The EMBO Journal １７（２２） ｐｐ．６５７３−６５８６、１９９８）に対してルシフェラーゼ活性の増大を示すことが期待できる。次にこれらクローンの２，２’−ｄｉｐｙｒｉｄｙｌに対する反応性を以下の手順により検討した。１ウエルあたり各クローン化細胞１万個を９６ウエルプレートに散布した。メディウムはＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳを用いた。これらを５％二酸化炭素存在下、３７℃にて２日間培養した後、１００μＭの２，２’−ｄｉｐｙｒｉｄｙｌを処理して、３７℃にて８時間培養した。続いて、これらの細胞について、そのルシフェラーゼ活性を測定することによって、低酸素ミミック刺激によるルシフェラーゼの活性化が認められるかどうか検討した。すなわち、各ウエルのメディウムを除去後、５０μＬの溶解液（２５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．８）、２ｍＭ ジチオトレイトール、２ｍＭ ＣＤＴＡ、１０％ グリセロール、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した後、室温にて１５分間保温した。この細胞溶解液を２０μＬ分取し、基質液（２０ｍＭ トリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．８）、１．０７ｍＭ 塩基性炭酸マグネシウム、２．６７ｍＭ 硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ジチオトレイトール、２７０μＭ コエンザイムＡ、４７０μＭ ルシフェリン、５３０μＭ アデノシン三リン酸）５０μＬを添加した後、ルミノメーター（パーキンエルマー社製）にてその化学発光強度を測定した。２，２’−ｄｉｐｙｒｉｄｙｌ刺激によって有意にルシフェラーゼ活性の上昇を示すクローンを選択し、以下の評価に用いた。以下、ＨＣＴ−１１６／ＨＲＥ ｃｌ．９と表記する。
【００８７】
（１−３）ＨＩＦ−１α依存的転写活性阻害作用の検討
１万個のＨＣＴ１１６／ＨＲＥ ｃｌ．９細胞を５０μＬの培地とともに９６穴 プレートに散布した。メディウムはＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳを用いた。これらを５％二酸化炭素存在下、３７℃にて４日間培養した後、各ウエルに１５０μＬのメディウムを添加し、さらに１０μＬの化合物を処理した。続いて、これら細胞を酸素濃度調節機能付のインキュベーター（池本理化工業社製）へ入れ、酸素濃度を１％に低下させ、５％二酸化炭素存在下、３７℃にて８時間培養した。各ウエルのメディウムを除去後、上記と同様の方法で、細胞中のルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＨＩＦ−１α依存的な転写活性に対する阻害作用を見た。本発明の化合物によるＨＩＦ−１α依存的な転写活性に対する阻害作用を表１に示す。
【００８８】
表１ ベンジルインドール誘導体のＨＩＦ−１α依存的転写活性阻害作用
化合物 ＩＣ５０（μＭ）
実施例１ ０．０１５
実施例２ ０．０９７
実施例３ ０．０３５
実施例４ ０．００９
実施例５ ０．０１０
実施例５ ０．０１０
実施例７ ０．０１４
実施例８ ０．０１７
実施例９ ０．０１３
実施例１０ ０．０１３
実施例１１ ０．０２４
実施例１２ ０．０２５
実施例１３ ０．０３３
実施例１４ ０．０３７
実施例１５ ０．０６７
実施例１６ ０．０７７
実施例１７ ０．１１
実施例１８ ０．１１
実施例１９ ０．１４
実施例２０ ０．１４
実施例２１ ０．３３
実施例２２ ０．３１
実施例２３ １．２
実施例２９ ０．０１７
【００８９】
以上のように、本発明の１−ベンジルインドール誘導体は、ＨＩＦ−１α依存的な転写活性を強く阻害することが明らかになった。
【００９０】
試験例２
ＨＩＦ−１α安定化阻害作用の検討
（２−１）ＨＩＦ−１α蛋白質画分の調製
５０万個のＨｅｐ３Ｂ細胞を直径６０ｍｍの培養ディッシュに散布した。メディウムはＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳを用いた。５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて終夜培養した後、実施例１及び実施例２の化合物をそれぞれ０．３２μＭ〜１０μＭまでを処理し、さらに１６時間培養した。続いて、酸素濃度調節機能付のインキュベーターに移し、酸素濃度を１％に低下させ、２時間培養することによってＨＩＦ−１αを安定化させた。その後、細胞を取り出してメディウムを吸引除去し、さらに１ｍＬの氷冷したＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ（−））を加え、細胞を洗浄した。続いて、１ｍＬの氷冷ＰＢＳ（−）を加えた後、スクレイパーで細胞をエッペンドルフチューブに回収した。小型遠心機を用い、７０００ｒｐｍで１分間、４℃にて遠心することで、細胞を沈殿させた。上清を吸引除去後、１００μＬの細胞溶解液（０．５Ｍ ショ糖、１５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、６０ｍＭ 塩化カリウム、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１２５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ジチオトレイトール、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド、０．４％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）を加え、氷上に５分間静置することで細胞を溶解させた。その後、小型遠心機を用い、３０００ｒｐｍで１０分間、４℃にて遠心することで、粗核画分を沈殿させ、上清を除去した。沈殿した粗核画分に３０μＬの核蛋白質抽出用溶液（５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．５）、２％ 硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ））を加え、プローブ式のソニケーターを用いて、超音波破砕を行った。続いて、小型遠心機を用い、１５０００ｒｐｍで３０分間、４℃にて遠心することで、核抽出液を上清に回収した。蛋白質濃度をＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアス社製）を用いて測定した。
【００９１】
（２−２）ウエスタンブロッティングを用いたＨＩＦ−１α蛋白質量の定量
各１５μｇの蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分画した。アクリルアミドの濃度は１０％とした。泳動したゲルはミニトランスブロットセルブロッティング装置（バイオラッド社製）を用いて、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて蛋白質が転写されたＰＶＤＦ膜を、５％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ溶液（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で室温にて３０分間穏やかに振とうすることでブロッキングを行った。
【００９２】
引き続いて、１次抗体との反応を行った。５％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ溶液で１０００倍希釈した抗ＨＩＦ−１α抗体（ＮＢ１００−１２３：Ｎｏｖｕｓ社製）とＰＶＤＦ膜を４℃にて終夜、穏やかに振とうしながら反応した。抗体液を除去した後、５％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ溶液で３回の洗浄を行い（室温にて１０分間、１０分間、５分間）、非特異的な抗体を除去した。続いて２次抗体との反応を行った。５％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ溶液で２０００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＮＡ９３１Ｖ ＧＥヘルスケア社製）を加え、室温で２時間穏やかに振とうしながら反応した。抗体液を除去した後、５％のスキムミルクを含むＴＢＳ溶液で３回の洗浄を行い（室温にて１０分間、１０分間、５分間）、非特異的な抗体を除去した。引き続いて、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用い、抗ＨＩＦ−１α抗体と反応した蛋白質のバンドを検出した。薬剤処理による細胞内ＨＩＦ−１α蛋白質量の変化を見積もることによって、低酸素依存的なＨＩＦ−１α安定化阻害作用を評価した。
【００９３】
図１に示すように、通常の酸素濃度下（ＮＯＲＭＯＸＩＡ）では検出されないＨＩＦ−１αの蛋白質量は酸素濃度１％、２時間培養（ＨＹＰＯＸＩＡ）により増加した。これは、低酸素において、ＨＩＦ−１αの分解が抑制されたためと考えられる。一方、実施例１及び実施例２の化合物のいずれもＨＹＰＯＸＩＡにおいて濃度依存的にＨＩＦ−１αの蛋白質量を減少させた。従って、実施例１及び実施例２の化合物は低酸素によるＨＩＦ−１αの分解を抑制し、ＨＩＦ−１αの安定化を阻害していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のＨＩＦ−１α活性阻害剤はＨＩＦ−１α依存的転写活性阻害作用を有し、低酸素下におけるＨＩＦ−１αの安定化を阻害することから、ＨＩＦ−１αが発現を制御するＶＥＧＦ等の血管新生因子の発現を抑制することが可能である。従って、本発明のＨＩＦ−１α活性阻害剤は血管新生に起因する疾患の治療に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明のＨＩＦ−１α活性阻害剤によるＨＩＦ−１αの安定化阻害作用を示す図である。
【符号の説明】
【００９６】
１レーン：通常の酸素濃度下（ＮＯＲＭＯＸＩＡ）におけるＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
２レーン：酸素濃度１％、２時間培養（ＨＹＰＯＸＩＡ）におけるＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
３レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例１の化合物を０．３２μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
４レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例１の化合物を１μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
５レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例１の化合物を３．１６μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
６レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例１の化合物を１０μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
７レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例２の化合物を０．３２μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
８レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例２の化合物を１μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
９レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例２の化合物を３．１６μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す。
１０レーン：ＨＹＰＯＸＩＡ処理後、実施例２の化合物を１０μＭ処理したＨｅｐ３Ｂ細胞のＨＩＦ−１αの発現を示す
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
配列表の配列番号：１はＨＲＥ（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）配列を含むオリゴヌクレオチドを表す
配列表の配列番号：２は配列番号：１に相補的なオリゴヌクレオチドを表す
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
（式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立していてもよく、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ｚは水素原子または低級アシル基を示し、Ａｒは低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜３個有していてもよいアリール基もしくはヘテロアリール基を示す。）で表される１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項２】
一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子である請求項１に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項３】
一般式（１）において、Ｚが水素原子である請求項２に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項４】
一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子、低級アルキル基またはハロゲン原子である請求項３に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項５】
一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子、メチル基またはフッ素原子である請求項４に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項６】
一般式（１）において、Ａｒが塩素原子、フッ素原子、メチル基、メトキシ基及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有していてもよいアリール基である請求項５に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、または薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項７】
一般式（１）において、Ａｒが３，４−ジクロロフェニル基、３，４−ジフルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ビフェニル基である請求項６に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項８】
一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらも水素原子である請求項７に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項９】
一般式（１）において、Ｚが低級アシル基である請求項２に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項１０】
一般式（１）において、Ｚがアセチル基である請求項９に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項１１】
一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子またはメチル基である請求項１０に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項１２】
一般式（１）において、ＸおよびＹがどちらも水素原子であり、Ａｒがハロゲン原子を１〜２個有していてもよいフェニル基であるである請求項１１に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項１３】
一般式（２）
【化２】
（式中、Ｙ1は低級アルキル基、フッ素原子、塩素原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ａｒ1はヘテロアリール基、または低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子及び低級アルコキシ基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有していてもよいアリール基を示す。但し、Ａｒ1が４−クロロフェニル基であり、Ｙ1が５−塩素原子もしくは５−フッ素原子の組み合わせの化合物、およびＡｒ1がフェニル基であり、Ｙ1が５−メトキシ基の組み合わせの化合物は除く。）で表される１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１４】
一般式（２）において、Ｙ1がメチル基、フッ素原子、メトキシ基もしくはベンジルオキシ基である請求項１３に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１５】
一般式（２）において、Ａｒ1がメチル基、フッ素原子、塩素原子またはメトキシ基を１〜２個有していてもよいアリール基、またはピリジル基である請求項１４に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１６】
一般式（２）において、Ｙ1が５−メチル基、４−メチル基、７−メチル基、５−フッ素原子、６−フッ素原子、５−メトキシ基もしくは６−メトキシ基であり、Ａｒ1が３，４−ジクロロフェニル基である請求項１５に記載の１−ベンジル−３（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１７】
一般式（３）
【化３】
（式中、Ａｒ2はヘテロアリール基、または低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有しているアリール基を示す。但し、Ａｒ2がハロゲン原子もしくはメチル基を１個有しているフェニル基、３−メトキシフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基、３，４−ジクロロフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、および３，５−ジフルオロフェニル基である化合物は除く。）で表される１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１８】
一般式（３）において、Ａｒ2がピリジル基、またはメチル基、フッ素原子、及び塩素原子からなる群から選ばれる置換基を２個有するフェニル基、４−メトキシ基もしくは４−フェニル基を有するフェニル基である請求項１７に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１９】
一般式（３）において、Ａｒ2が２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、３，４−ジフルオロフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、２，３−ジクロロフェニル基、２，５−ジクロロフェニル基、４−メトキシフェニル基もしくは４−ビフェニル基である請求項１８に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２０】
一般式（４）
【化４】
（式中、Ｙ3は水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ｚ3は低級アシル基を示し、Ａｒ3は低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、フェニル基からなる組み合わせの置換基を１〜３個有していてもよいアリール基、またはヘテロアリール基を示す。）で表される１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２１】
一般式（４）において、Ｚ3がアセチル基である請求項２０に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２２】
一般式（４）において、Ｙ3が水素原子である請求項２１に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２３】
一般式（４）において、Ａｒ3がピリジル基または塩素原子を１〜２個有していてもよいフェニル基である請求項２２に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２４】
請求項２０に記載の３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジクロロベンジル）インドール、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物またはその水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする血管新生阻害剤。
【請求項２６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物またはその水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする加齢黄斑変性症治療剤。
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
（式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立していてもよく、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ｚは水素原子または低級アシル基を示し、Ａｒは低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜３個有していてもよいアリール基もしくはヘテロアリール基を示す。）で表される１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項２】
一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子である請求項１に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項３】
一般式（１）において、Ｚが水素原子である請求項２に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項４】
一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子、低級アルキル基またはハロゲン原子である請求項３に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項５】
一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子、メチル基またはフッ素原子である請求項４に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項６】
一般式（１）において、Ａｒが塩素原子、フッ素原子、メチル基、メトキシ基及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有していてもよいアリール基である請求項５に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、または薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項７】
一般式（１）において、Ａｒが３，４−ジクロロフェニル基、３，４−ジフルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ビフェニル基である請求項６に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項８】
一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらも水素原子である請求項７に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項９】
一般式（１）において、Ｚが低級アシル基である請求項２に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項１０】
一般式（１）において、Ｚがアセチル基である請求項９に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項１１】
一般式（１）において、ＸおよびＹのどちらか一方が水素原子であり、他方が水素原子またはメチル基である請求項１０に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項１２】
一般式（１）において、ＸおよびＹがどちらも水素原子であり、Ａｒがハロゲン原子を１〜２個有していてもよいフェニル基であるである請求項１１に記載の１−ベンジルインドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＩＦ−１α活性阻害剤。
【請求項１３】
一般式（２）
【化２】
（式中、Ｙ1は低級アルキル基、フッ素原子、塩素原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ａｒ1はヘテロアリール基、または低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子及び低級アルコキシ基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有していてもよいアリール基を示す。但し、Ａｒ1が４−クロロフェニル基であり、Ｙ1が５−塩素原子もしくは５−フッ素原子の組み合わせの化合物、およびＡｒ1がフェニル基であり、Ｙ1が５−メトキシ基の組み合わせの化合物は除く。）で表される１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１４】
一般式（２）において、Ｙ1がメチル基、フッ素原子、メトキシ基もしくはベンジルオキシ基である請求項１３に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１５】
一般式（２）において、Ａｒ1がメチル基、フッ素原子、塩素原子またはメトキシ基を１〜２個有していてもよいアリール基、またはピリジル基である請求項１４に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１６】
一般式（２）において、Ｙ1が５−メチル基、４−メチル基、７−メチル基、５−フッ素原子、６−フッ素原子、５−メトキシ基もしくは６−メトキシ基であり、Ａｒ1が３，４−ジクロロフェニル基である請求項１５に記載の１−ベンジル−３（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１７】
一般式（３）
【化３】
（式中、Ａｒ2はヘテロアリール基、または低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基及びフェニル基からなる群から選ばれる置換基を１〜２個有しているアリール基を示す。但し、Ａｒ2がハロゲン原子もしくはメチル基を１個有しているフェニル基、３−メトキシフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基、３，４−ジクロロフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、および３，５−ジフルオロフェニル基である化合物は除く。）で表される１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１８】
一般式（３）において、Ａｒ2がピリジル基、またはメチル基、フッ素原子、及び塩素原子からなる群から選ばれる置換基を２個有するフェニル基、４−メトキシ基もしくは４−フェニル基を有するフェニル基である請求項１７に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１９】
一般式（３）において、Ａｒ2が２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、３，４−ジフルオロフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、２，３−ジクロロフェニル基、２，５−ジクロロフェニル基、４−メトキシフェニル基もしくは４−ビフェニル基である請求項１８に記載の１−ベンジル−３−（ヒドロキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２０】
一般式（４）
【化４】
（式中、Ｙ3は水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、またはベンジルオキシ基を示し、Ｚ3は低級アシル基を示し、Ａｒ3は低級アルキル基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、フェニル基からなる組み合わせの置換基を１〜３個有していてもよいアリール基、またはヘテロアリール基を示す。）で表される１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２１】
一般式（４）において、Ｚ3がアセチル基である請求項２０に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２２】
一般式（４）において、Ｙ3が水素原子である請求項２１に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２３】
一般式（４）において、Ａｒ3がピリジル基または塩素原子を１〜２個有していてもよいフェニル基である請求項２２に記載の１−ベンジル−３−（低級アシルオキシメチル）インドール誘導体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２４】
請求項２０に記載の３−アセトキシメチル−１−（３，４−ジクロロベンジル）インドール、その水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物またはその水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする血管新生阻害剤。
【請求項２６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物またはその水和物、その溶媒和物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする加齢黄斑変性症治療剤。
【図１】
【公開番号】特開２００９−９１３２６（Ｐ２００９−９１３２６Ａ）
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６５５２６（Ｐ２００７−２６５５２６）
【出願日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【出願人】（０００００４０８６）日本化薬株式会社 (921)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【出願人】（０００００４０８６）日本化薬株式会社 (921)
【Ｆターム（参考）】
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