２型糖尿病の遺伝薬理学的診断のためのバイオマーカー
ＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１におけるＳＮＰと糖尿病との間の重要な関連性が観察された。加えてＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤおよびＡＣＡＣＢのハプロタイプと糖尿病との間の重要な関連性もまた観察された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般にインビトロでの組織試料の分析試験およびさらに特に２型真性糖尿病の指標である遺伝子多型の態様に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）はアメリカ人だけでおよそ１６００万人が罹患する糖尿病の一般的な形態である。Ｔ２ＤＭは患者集団の急激な増加ならびに多くの加齢性障害およびその合併症とのその関連性のために非常に大きな公衆衛生上の問題になりつつある。Amos AF et al., Diabet. Med. １４ Suppl ５：Ｓ１−８５（１９９７）。Ｔ２ＤＭはその発症に遺伝的および環境的な双方の因子が寄与し、起源的に多因子性である。しかしながら、疾患およびその処置の我々の理解は限定的で、そして満足のいくものではない。
【０００３】
２型真性糖尿病を含む疾患の診断および処置に対する従来の医学的研究法は臨床データだけに基づくか、または診断試験と組み合わせて行われる。かかる伝統的な実践はしばしば処方された薬物治療の効果に、または個体対象の副作用の可能性を最低にするのに最適ではない治療選択に至る。
【０００４】
治療特異的診断（治療的診断法とも称される）は新たな医療テクノロジー分野であり、これは疾患を診断し、正確な処置計画を選択し、そして対象の応答をモニタリングするのに有用な試験を提供する。換言すれば、治療的診断法は個体対象における薬物応答を予測および評価する、すなわち個別化医療に有用である。治療的診断試験はまた特に処置の恩恵を受ける可能性のある処置の対象を選択するか、または個体対象における処置の効果の早期のおよび客観的な指標を提供するのにも有用であり、そして遅延を最低限にして処置を変更することができる。
【０００５】
特定の薬物に対する応答と個体患者の遺伝的プロフィールとの間の相関性を確立する遺伝薬理学的の進歩は新しい治療的診断研究法の発達の基礎である。そのために当分野では遺伝子配列および遺伝子発現における患者間の変化を評定する必要がある。遺伝子プロファイリングの一般的な形態は一塩基多型（「ＳＮＰ」）と称されるＤＮＡ配列の変化の同定に依存し、これは疾患感受性、疾患の進行および個体の薬物応答における患者間の変化に至るか、またはそれに相関する遺伝子変異の一つの型である。当分野においてしたがって疾患感受性、進行、薬物応答性、副作用または最適用量に関連する対象の遺伝子型を同定するのに有用であるＳＮＰのような遺伝的多様性を同定および特徴づける必要があることになる。加えて、ＳＮＰおよびハプロタイプ（一つの染色体上に存在する密接に連関する遺伝子マーカーのセット、この局面ではＳＮＰ）を用いて患者の改善の階層化によりより良好な臨床試験を設計することができる。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は当分野における必要性に対応するものを提供する。ＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１における一塩基多型（ＳＮＰ）と糖尿病との間で重要な関連性が同定され、観察された。加えてＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤおよびＡＣＡＣＢのハプロタイプと糖尿病との間の重要な関連性もまた同定された。これらのＳＮＰおよびハプロタイプは２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の診断の改善およびより良好な患者の階層化による臨床試験の設計に有用である。
【０００７】
したがって本発明は個体の２型糖尿病を診断するための方法を提供する。個体の遺伝子型はＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１から選択される遺伝子において決定される。２型糖尿病に対する素因の指標であるＳＮＰが見いだされた場合、次いで個体は２型糖尿病に対する素因を有するとして診断される。
【０００８】
本発明はまたＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤまたはＡＣＡＣＢから選択される遺伝子における個体のハプロタイプを決定することにより、個体における２型糖尿病を診断するための方法をも提供する。２型糖尿病に対する素因の指標であるハプロタイプが見いだされた場合、次いで個体は２型糖尿病に対する素因を有するとして診断される。
【０００９】
本発明はさらに個体の２型糖尿病を処置するための治療的診断方法を提供する。２型糖尿病を有することが疑われる個体の遺伝子型またはハプロタイプを決定する。遺伝子型またはハプロタイプが、２型糖尿病を有することが疑われる個体が２型糖尿病を有するための素因を有することを示した場合、次いで個体は適当な抗糖尿病薬またはその他の治療で処置される。
【００１０】
本発明は、個体が抗糖尿病薬の研究に含まれるべきかどうかを決定するための方法を提供する。研究に含める候補の遺伝子型またはハプロタイプを決定する。遺伝子型またはハプロタイプが、候補が２型糖尿病を有するための素因を有することを示した場合、次いで個体は研究に含められる。遺伝子型またはハプロタイプが、候補が２型糖尿病を有するための素因を有さないことを示した場合、次いで個体は研究に含められないか、さもなければ対照として含められるかのいずれかである。
【００１１】
本発明はまた本発明の方法において使用するためのキットをも提供する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
Ｔ２ＤＭの種々の候補遺伝子の可能な役割を調べるために、民族的背景（白色人種）、性別、年齢（＋／−５歳）および肥満度指数（ＢＭＩ）（＋／−単位）が適合する１０００人を超える２型糖尿病の参加者および１０００人を超える対照に関して分析を実施した。ＳＮＰは公共データベースから選択されるか、または選択された遺伝子のゲノム領域の直接的なシークエンシングにより内部で開発された。ＳＮＰは各遺伝子（ＡＣＡＤＳＢ、ＡＣＡＣＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１）の全ゲノム領域にわたり少なくとも５ｋｂの平均間隔で空間があった。ＴＣＦ２に関しては、分析用に数個の候補ＳＮＰのみが文献から選択された。ＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１のＳＮＰと糖尿病との間に有意な関連性が観察された。加えて、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤおよびＡＣＡＣＢのハプロタイプと糖尿病との間にも有意な関連性が観察された。
【００１３】
本発明の実質的な理解を提供するために、本発明の特定の態様、様式、実施態様、変化および特徴を種々のレベルの詳細さで記載することは理解されよう。一般にかかる開示は、それを必要とする対象の診断および処置に有用なＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１のＳＮＰを含む遺伝的多様性を提供する。したがって、本発明の種々の態様は本発明の遺伝的多様性をコードするポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドをコードする発現ベクター、ならびに本発明の遺伝的多様性および／またはポリペプチドを発現する生物に関する。本発明の種々の態様はさらに疾患に対する素因を有する個体を同定するか、または薬物応答性、副作用もしくは最適な薬物用量に関して個体を分類するために本発明の遺伝的多様性を用いる診断／治療的診断方法およびキットに関する。その他の態様では、本発明は化合物バリデーションのための方法ならびに本発明の遺伝的多様性に関するデータを保存および分析するためのコンピューターシステムを提供する。したがってこれらの態様を説明する種々の特定の実施態様は以下のとおりである。
【００１４】
定義
本明細書で用いる特定の用語の定義を以下に提供する。その他の用語の定義はU.S. Department of Energy, Office of Science, Human Genome Project（http：／／www.ornl.gov／sci／techresources／Human_Genome／glossary／）により提供される用語集に見いだすことができる。２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）は異常に高い血糖レベルを特徴とする障害の臨床的および遺伝的に異種の群である。Ｔ２ＤＭは糖尿病症候群のおよそ９０％を構成する。恐らく前臨床段階で始まる筋肉、肝臓および脂肪組織におけるインスリン抵抗性を特徴とする。最終的にインスリン分泌の欠損がインスリン抵抗性を代償することができず、そして糖尿病の臨床的発症を誘起する高血糖症に至る。Harris MI, Chapter ３２：Definition and Classification of Diabetes Mellitus and the New Criteria for Diagnosis, pp. ３２６−３３４, in Diabetes Mellitus：a Fundamental and Clinical Text, ２nd Edition, editors：LeRoith D, Taylor SI, Olefsky JM；（Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania, ２０００）。
【００１５】
本明細書で用いる「アレル」なる用語は、特異的な染色体位置（遺伝子座）での遺伝子またはＤＮＡ配列の特定の形態を意味する。
【００１６】
本明細書で用いる「抗体」なる用語には、限定するものではないがポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体および抗体フラグメントがタンパク質に結合するのに十分な生物学的に機能的な抗体フラグメントを含む。
【００１７】
本明細書で用いる「臨床応答」なる用語は、以下の：応答、応答なし、および逆応答（すなわち副作用）の定量的手段；のいずれかまたは全てを意味する。
【００１８】
本明細書で用いる「臨床試験」なる用語は、特定の処置に対する応答に関する臨床データを収集するために設計された任意の調査研究を意味し、そして限定するものではないが第Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ相臨床試験を含む。標準的な方法を用いて患者集団を定義し、そして対象を登録する。
【００１９】
本明細書で用いる化合物の「有効量」なる用語は、望ましい治療的および／または予防的効果を達成するのに十分な量であり、例えば処置される疾患、例えば本明細書で同定される遺伝的多様性およびポリペプチドに関連する疾患に関連する病徴の防御または低減を招く量である。対象に投与される化合物の量は疾患の型および重篤度ならびに一般健康状態、年齢、性別、体重および薬物に対する耐容性のような個体の特性に依存する。それはまた疾患の程度、重篤度および型にも依存する。当業者はこれらおよびその他の因子に依存して適当な用量を決定することができる。典型的には、治療的または予防的効果を達成するのに十分な本発明の化合物の有効量は１日あたり体重ｋｇあたり約０.０００００１ｍｇから１日あたり体重ｋｇあたり約１００００ｍｇの範囲である。好ましくは、用量範囲は１日あたり体重ｋｇあたり約０.０００１ｍｇから１日あたり体重ｋｇあたり約１００ｍｇである。本発明の化合物を互いに、または一つもしくはそれより多いさらなる治療用化合物と組み合わせて投与することもできる。
【００２０】
本明細書で用いる「発現」は、限定するものではないが一つもしくはそれより多い以下の：遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写；成熟ｍＲＮＡを生成するための前駆体ｍＲＮＡのスプライシングおよびその他のプロセシング；ｍＲＮＡ安定性；成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドン使用およびｔＲＮＡ利用性を含む）；ならびに適当な発現および機能に必要な場合、翻訳生成物のグリコシル化および／またはその他の修飾；を含む。
【００２１】
本明細書で用いる「遺伝子」なる用語は、プロモーター、エクソン、イントロンおよび発現を制御するその他の非翻訳領域を含むＲＮＡ生成物の調節された生合成のための全ての情報を含有するＤＮＡのセグメントを意味する。
【００２２】
本明細書で用いる「遺伝子型」なる用語は、個体の相同染色体の一対の遺伝子座において一つもしくはそれより多い多型部位で見出されるヌクレオチド対の非位相５’から３’配列を意味する。本明細書で用いる遺伝子型は全遺伝子型および／またはサブ遺伝子型を含む。
【００２３】
本明細書で用いる「遺伝子座」なる用語は、遺伝子または身体的もしくは表現型的特徴に対応する染色体またはＤＮＡ分子上の位置を意味する。
【００２４】
本明細書で用いる「調整剤」なる用語は、調整剤が不在のときのポリペプチドの発現レベルまたは生物学的活性レベルに比較して、ポリペプチドの発現レベルまたは生物学的活性レベルを変更させる（例えば増加または減少させる）任意の化合物である。調整剤は小型分子、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ヌクレオチドまたはその組み合わせでよい。調整剤は有機化合物または無機化合物でよい。
【００２５】
本明細書で用いる「変異体」なる用語は、野生型からの任意の遺伝的な変化を意味し、すなわち変異、例えば一塩基多型の結果である。「変異体」なる用語は本明細書全体にわたって「マーカー」、「バイオマーカー」および「標的」なる用語と互換的に用いられる。
【００２６】
本明細書で用いる「医学的状態」なる用語には限定するものではないが、処置が望ましい一つもしくはそれより多い身体的および／または心理学的病徴として明示される任意の状態または疾患を含み、そして以前におよび新たに同定された疾患およびその他の障害を含む。
【００２７】
本明細書で用いる「ヌクレオチド対」なる用語は、個体からの染色体の２つのコピー上の多型部位で見出されるヌクレオチドを意味する。
【００２８】
本明細書で用いる「多型部位」なる用語は、集団において少なくとも２つの選択的配列が見出される遺伝子座内の位置を意味し、その最も高い頻度はせいぜい９９％である。
【００２９】
本明細書で用いる「相になる」なる用語は、遺伝子座の２つまたはそれより多い多型部位に関するヌクレオチド対の配列に適用する場合、公知である遺伝子座の単一のコピー上のこれらの多型部位に存在するヌクレオチドの組み合わせを意味する。
【００３０】
本明細書で用いる「多型」なる用語は、集団において＞１％の頻度で存在する任意の配列バリアントを意味する。配列バリアントは５％または１０％またはそれより多いような１％より有意に大きい頻度で存在し得る。また多型部位で個体において観察された配列変化を意味するために用語を用いることもできる。多型にはヌクレオチド置換、挿入、欠失およびマイクロサテライトを含み、そして必ずしもではないが、遺伝子発現またはタンパク質機能における検出可能な差異を招き得る。
【００３１】
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は任意のＲＮＡまたはＤＮＡを意味し、それは未修飾または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでよい。ポリヌクレオチドには限定するものではないが、一本および二本鎖ＤＮＡ、一本および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本および二本鎖ＲＮＡ、一本および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ならびに一本鎖またはさらに典型的には二本鎖または一本および二本鎖領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。加えてポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む三本鎖領域を意味する。ポリヌクレオチドなる用語はまた一つもしくはそれより多い修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性またはその他の理由のために修飾されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡをも含む。
【００３２】
本明細書で用いる「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわちペプチドイソスターにより互いに連結された２つまたはそれより多いアミノ酸を含む任意のポリペプチドを意味する。ポリペプチドは一般にペプチド、糖ペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖、および一般的にタンパク質と称される長鎖の双方を意味する。ポリペプチドは２０個の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは翻訳後プロセシングのような天然のプロセシングか、または当分野において周知である科学的修飾技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含む。かかる修飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な研究論文、ならびに膨大な研究文献において十分に記載されている。
【００３３】
本明細書で用いる「ＳＮＰ核酸」なる用語は、個体または個体群の間でそれ以外は同一のヌクレオチド配列内で可変であるヌクレオチドを含み、したがってアレルとして存在する核酸を意味する。かかるＳＮＰ核酸は好ましくは約１５から約５００ヌクレオチド長である。ＳＮＰ核酸は染色体の一部でよいか、またはそれらは例えばＰＣＲもしくはクローニングによる染色体のそのような部分の増幅による染色体の一部の正確なコピーでよい。本明細書では以後ＳＮＰ核酸を簡単に「ＳＮＰ」と称する。ＳＮＰはゲノムの単一の位置でのヌクレオチド可変性の発生であり、そこで２つの選択的塩基はヒト集団においてかなりの頻度で（すなわち＞１％）発生する。ＳＮＰは遺伝子内またはゲノムの遺伝子間領域内で発生し得る。本発明によるＳＮＰプローブはＳＮＰ核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
「ハプロタイプ」は一緒に遺伝される傾向がある一つの染色体上に存在する密接に連関する遺伝子マーカーのセット、この局面ではＳＮＰである。
【００３５】
本明細書で用いる「対象」なる用語は、好ましくは対象がヒトのような哺乳動物であるが、動物、例えば家庭用動物（例えばイヌ、ネコ等）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）および実験動物（例えばサル（例えばカニクイザル）、ラット、マウス、モルモット等）でもよいことを意味する。
【００３６】
本明細書で用いるように、薬剤または薬物の対象または患者への投与には自己投与および他人による投与が含まれる。記載されるような医学的状態の処置または防御の種々の様式は「実質的である」ことを意味し、それは完全な処置または防御を含むが、完全に満たない処置または防御もまた含み、そしてそこでいくらかの生物学的または医学的に関係する結果が達成されることが意図されることもまた理解されよう。
【００３７】
遺伝子配列変化の同定および特徴付け
その保持率および蔓延する特性のために、ＳＮＰはヒト疾患状態に関与する遺伝子を位置決定するための重要な道具である可能性を有する。例えばWang et al., Science ２８０：１０７７−１０８２（１９９８）参照。いずれか一つのバリアントの影響は小さいかもしれないが、多くの共通する障害を発達させる危険性およびこれらの症状を処置するために用いられる医薬品の代謝は根本的なゲノム変化により実質的に影響を受けることがますます解明されてきている。
【００３８】
多型の存在のために、種のいくつかのメンバーが変異していない配列（すなわち元来のアレル）を有し得るが、一方その他のメンバーは変異した配列を有し得る（すなわちバリアントまたは変異アレル）という点でＳＮＰはアレルであると言われている。
【００３９】
ＳＮＰと特定の表現型との間の関連性は、ＳＮＰが表現型の原因であることを示すまたは要求する必要はない。それよりむしろ単にＳＮＰと、所定の表現型に実際に寄与するこれらの遺伝的因子との間のゲノム近接のためであり得て、そのためにＳＮＰおよび該遺伝的因子は密接に連関する。換言すれば、ＳＮＰは「真の」機能的バリアントとの連鎖不均衡（「ＬＤ」）であり得る。ゲノムの２つの異なる位置のアレルが予測よりもさらに高度に関連する場合、ＬＤ（アレル関連性とも称される）が存在する。したがって、特定の表現型を引き起こす変異に近接するので、ＳＮＰを価値のあるマーカーとして提供することができる。
【００４０】
本発明の多型部位の記載において便宜上遺伝子のセンス鎖を参照する。しかしながら、当業者には認識されるように、遺伝子を含有する核酸分子は相補的二本鎖分子でよく、そしてしたがってセンス鎖の特定の部位への参照は同様に相補的アンチセンス鎖の対応する部位への参照を意味する。換言すると、いずれかの鎖の同一の多型部位を参照することができ、そしてオリゴヌクレオチドは多型部位を含有する標的領域でいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。したがって本発明はまた本明細書で記載するゲノムバリアントのセンス鎖に相補的である一本鎖ポリヌクレオチドをも含む。
【００４１】
ＳＮＰの同定および特徴付け
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、変成高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）によるヘテロ二本鎖分析ならびに直接ＤＮＡシークエンシングおよびコンピューターによる方法を含む多くの異なる技術を用いてＳＮＰを同定および特徴付けすることができる。Shi et al., Clin. Chem. ４７：１６４−１７２（２００１）。公共データベースには豊富な配列情報がある。
【００４２】
最も一般的なＳＮＰ分類方法には現在ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、および切断法が含まれる。これらの方法の各々には適切な検出系が接続されていなければならない。検出テクノロジーには蛍光偏光法（Chan et al., Genome Res. ９：４９２−４９９（１９９９））、ピロリン酸放出の発光検出（ピロシークエンシング）（Ahmadiian et al., Anal. Biochem. ２８０：１０３−１０（２０００））、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）基盤の切断アッセイ、ＤＨＰＬＣ、および質量分析（Shi, Clin. Chem. ４７：１６４−１７２（２００１）；方法は米国特許第６２９７０１８号および第６３０００６３号に開示されるものである。
【００４３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【００４４】
INVADER（商標）テクノロジー（Third Wave Technologies Inc. Madison, Wisconsin, USAから入手可能）のような市販により入手可能である生成物を用いて多型を検出することもできる。このアッセイでは特異的な上流の「インベーダー」オリゴヌクレオチドおよび部分重複する下流プローブが相補的ＤＮＡ鋳型に結合した場合、一緒に特異的構造を形成する。この構造はCleavase酵素により認識され、そして特異的部位で切断され、結果的にプローブオリゴヌクレオチドの５’フラップが遊離される。次いでこのフラグメントを反応混合物に含有される合成２次標的および２次蛍光標識シグナルプローブに関して「インベーダー」オリゴヌクレオチドとして供する。Ryan D et al., Molecular Diagnosis ４（２）：１３５−１４４（１９９９）およびLyamichev V et al., Nature Biotechnology １７：２９２−２９６（１９９９）、米国特許第５８４６７１７号および第６００１５６７号もまた参照されたい。
【００４５】
限定するものではないがリボプローブ（Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８２：７５７５（１９８５）； Meyers et al., Science ２３０：１２４２（１９８５））および大腸菌ｍｕｔＳタンパク質（Modrich P. Ann Rev Genet ２５：２２９−２５３（１９９１））のようなヌクレオチド誤対合を認識するタンパク質を用いるＲＮアーゼ保護法を含む誤対合検出技術を用いて多型の同一性を決定することもできる。これに代えて、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（Orita et al., Genomics ５：８７４−８７９（１９８９）； Humphries et al., in Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, R. Elles, ed.,（１９９６）pp. ３２１−３４０）または変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Wartell et al., Nucl. Acids. Res. １８：２６９９−２７０６（１９９０）； Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：２３２−２３６（１９８９））によりバリアントアレルを同定することができる。ポリメラーゼ媒介プライマー伸長法を用いて多型を同定することもできる。いくつかのかかる方法は特許および科学文献に記載されており、そして「Genetic Bit Analysis」法（第ＷＯ９２／１５７１２号）およびリガーゼ／ポリメラーゼ媒介genetic bit analysis（米国特許第５６７９５２４号）を含む。関連する方法は第ＷＯ９１／０２０８７号、第ＷＯ９０／０９４５５号、第ＷＯ９５／１７６７６号ならびに米国特許第５３０２５０９号および第５９４５２８３号に開示されている。米国特許第５６０５７９８号に記載されるように多型を含有する伸長プライマーを質量分析により検出することができる。別のプライマー伸長法はアレル特異的ＰＣＲ（Ruafio et al., Nucl. Acids. Res. １７：８３９２（１９８９）； Ruafio et al., Nucl. Acids. Res. １９：６８７７−６８８２（１９９１）；第ＷＯ９３／２２４５６号； Turki et al., J. Clin. Invest. ９５：１６３５−１６４１（１９９５））である。加えて、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ８９／１０４１４号に記載されるようにアレル特異的プライマーのセットを用いて核酸の複数の領域を同時に増幅することにより複数の多型部位を調査することができる。
【００４６】
オリゴヌクレオチドのハプロタイプ分類および遺伝子型分類
本発明は個体において遺伝子をハプロタイプ分類および／または遺伝子型分類するための方法および組成物を提供する。本明細書で用いる「遺伝子型」および「ハプロタイプ」なる用語は各々本明細書で記載する一つもしくはそれより多い多型部位に存在するヌクレオチド対またはヌクレオチドを含有する遺伝子型またはハプロタイプを意味し、そして場合によっては遺伝子の一つもしくはそれより多いさらなる多型部位に存在するヌクレオチド対またはヌクレオチドをも含み得る。さらなる多型部位は現在公知の多型部位または後に見出される部位でよい。
【００４７】
本発明の組成物は、多型部位を含有するか、またはそれに隣接する一つもしくはそれより多い標的領域に特異的にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを含有する。本発明のオリゴヌクレオチド組成物は個体において遺伝子を遺伝子型分類および／またはハプロタイプ分類するための方法において有用である。本明細書で記載する多型部位で個体の遺伝子型またはハプロタイプを確立するための方法および組成物は、タンパク質の発現および機能により影響を受ける疾患の原因論において多型の影響を研究するのに、薬物ターゲティングの効率を研究するのに、タンパク質の発現および機能により影響を受ける疾患に対する個体の感受性を予測するのに、そして遺伝子生成物をターゲティングする薬物に対する個体の応答性を予測するのに有用である。
【００４８】
本発明の遺伝子型分類オリゴヌクレオチドをマイクロチップ、ビーズまたはガラススライドのような固体表面上に固定または合成することができる。例えば第ＷＯ９８／２００２０号および第ＷＯ９８／２００１９号参照。
【００４９】
遺伝子型分類オリゴヌクレオチドは本明細書で同定された多型部位の一つの下流１から数個のヌクレオチドに位置する標的領域にハイブリダイズすることができる。かかるオリゴヌクレオチドは本明細書で記載する多型の一つを検出するためのポリメラーゼ媒介プライマー伸長法で有用であり、そしてしたがってかかる遺伝子型分類オリゴヌクレオチドは本明細書では「プライマー伸長オリゴヌクレオチド」と称される。
【００５０】
本発明の直接的遺伝子型分類方法
本発明の遺伝子型分類方法は目的の遺伝子またはそのフラグメントの２個のコピーを含む核酸混合物を個体から単離し、そして２個のコピーの一つもしくはそれより多い多型部位でヌクレオチド対の同一性を決定することを含み得る。当業者には容易に理解されるように、個体の遺伝子の２個の「コピー」は同一のアレルでよいか、または異なるアレルでよい。特に好ましい実施態様では、遺伝子型分類方法は各多型部位でヌクレオチド対の同一性を決定することを含む。典型的には、血液試料または組織試料のような個体から採取した生物学的試料から核酸混合物を単離する。適当な組織試料には全血、精液、唾液、涙液、尿、糞便材料、汗、口腔塗抹、皮膚および毛髪が含まれる。
【００５１】
以下の実施例で用いる遺伝子型分類の方法は以下のとおりである：全てのＳＮＰの遺伝子型分類は一塩基伸長により実施し、Sequenom’s MassArray（商標）テクノロジーを用いる質量分析を続ける。Ross et al., Nat. Biotechnol. １６：１３４７−１３５１（１９９８）。この系の遺伝子型の確認は均一な質量増加（homogenous Mass Extension）（ｈＭＥ）反応生成物のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析に基づく。
【００５２】
本発明の直接的ハプロタイプ分類方法
本発明のハプロタイプ分類方法は目的の遺伝子またはそのフラグメントの２個のコピーのうちの１個のみを含有する核酸分子を個体から単離し、そしてそのコピーの一つもしくはそれより多い多型部位でヌクレオチドの同一性を決定することを含み得る。直接的ハプロタイプ分類方法には、例えばCLASPER System（商標）テクノロジー（米国特許第５８６６４０４号）またはアレル特異的ロングレンジＰＣＲ（Michalotos−Beloin et al., Nucl. Acids. Res. ２４：４８４１−４８４３（１９９６））が含まれる。遺伝子またはフラグメントの２個のコピーを分離することができる任意の方法を用いて核酸を単離することができる。当業者には容易に理解されるように、任意の個々のクローンは個体に存在する２個の遺伝子コピーのうちの１個のハプロタイプ情報のみを提供する。一つの実施態様では、個体に存在する遺伝子の各コピーの一つもしくはそれより多い多型部位でヌクレオチドの相になった配列を同定することによりハプロタイプ対を決定する。好ましい実施態様では、ハプロタイプ分類方法は遺伝子の各コピーの各多型部位の相になった配列を同定することを含む。
【００５３】
以下の実施例では、ハプロタイプ分類方法は以下のとおりであった：全てのハプロタイプ関連解析をバイナリ形質（binary trait）に関する推奨されるパラメーターを用いてＲのhaplo.statsパッケージのhaplo.scoreプログラムを用いて実施した。Becker R, Chambers J & Willks A, The new S language： a programming environment for data analysis and graphics（Wadsworth & Brooks／Cole Advanced Books, Pacific Grove, １９８８）p. ７０２； Schaid DJ et al., Am. J. Hum. Genet. ７０（２）：４２５−３４（２００２）参照。Haplo.score はＥＭアルゴリズムを用いて遺伝子型データからハプロタイプを推測し、そして遺伝子座での個体のハプロタイプおよびハプロタイプの全セットの双方に関して形質との関連性を検定する。
【００５４】
遺伝子型分類方法およびハプロタイプ分類方法の双方で、遺伝子またはそのフラグメントの一つまたは双方のコピーから直接的に多型部位を含有する標的領域を増幅し、そして従来の方法により増幅された領域をシークエンシングすることにより、多型部位でのヌクレオチド（またはヌクレオチド対）の同一性を決定することができる。第ＷＯ９５／１１９９５号に記載されるように遺伝子の一つまたは双方のコピーを含有する核酸試料を核酸アレイおよびサブアレイにハイブリダイズさせることにより個体の遺伝子に関する遺伝子型またはハプロタイプを決定することもできる。
【００５５】
標的多型と連鎖不均衡にある多型部位を用いる間接的遺伝子型分類方法
加えて、本発明のいずれかの多型部位に存在するアレルの同一性を、目的のこれらの部位と連鎖不均衡にあるその他の多型部位を遺伝子型分類することにより間接的に決定することができる。前記したように、一つの部位での特定のバリアントの存在が第２の部位での別のバリアントの存在の指標である場合、二つの部位は連鎖不均衡にあるといわれている。Stevens JC, Mol. Diag. ４：３０９−３１７（１９９９）。本発明の多型部位と連鎖不均衡にある多型部位は同一の遺伝子の領域またはその他のゲノム領域に位置し得る。
【００５６】
標的遺伝子領域の増幅
限定するものではないがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４９６５１８８号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：１８９−１９３（１９９１）； 公開ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９０／０１０６９号）およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Landegren et al., Science ２４１：１０７７−１０８０（１９８８））を含む任意のオリゴヌクレオチド指向性増幅方法を用いて標的領域を増幅することができる。かかる方法においてプライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドは多型部位を含有するかまたはそれに隣接する核酸の領域に特異的にハイブリダイズすべきである。典型的には、オリゴヌクレオチドは１０ヌクレオチド長と３５ヌクレオチド長の間であり、そして好ましくは１５ヌクレオチド長と３０ヌクレオチド長との間である。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは２０ヌクレオチド長と２５ヌクレオチド長の間である。オリゴヌクレオチドの正確な長さは当業者により日常的に考えられそして実行される多くの因子に依存する。
【００５７】
転写基盤の増幅系（米国特許第５１３０２３８号；欧州特許第３２９８２２号；米国特許第５１６９７６６号、公開ＰＣＴ特許出願第ＷＯ８９／０６７００号）および等温法（Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：３９２−３９６（１９９２））を含むその他の公知の核酸増幅手順を用いて標的領域を増幅することができる。
【００５８】
アレル特異的オリゴヌクレオチドの標的遺伝子へのハイブリダイズ
当分野において公知のいくつかのハイブリダイゼーション基盤の方法の一つを用いて増幅の前または後に標的領域における多型を検定することができる。典型的には、アレル特異的オリゴヌクレオチドをかかる方法の実施に利用する。アレル特異的オリゴヌクレオチドを、異なって標識されたプローブ対として用いることができ、対の一方のメンバーは標的配列の一つのバリアントと完全な対合を示し、他方のメンバーは異なるバリアントと完全な対合を示す。いくつかの実施態様ではアレル特異的オリゴヌクレオチドのセットまたはオリゴヌクレオチド対を用いて一を超える多型部位を一度に検出することができる。好ましくは、セットのメンバーは多型部位の各々へのハイブリダイゼーションが検出される場合、お互いの５℃以内、およびさらに好ましくは２℃以内の融点を有する。
【００５９】
アレル特異的オリゴヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを双方の実体と共に溶液中で実施することができるか、またはオリゴヌクレオチドもしくは標的ポリヌクレオチドのいずれかが共有結合的にもしくは非共有結合的に固体支持体に取り付けられている場合にかかるハイブリダイゼーションを実施することができる。付着は例えば抗体−抗原相互作用、ポリ−Ｌ−Ｌｙｓ、ストレプトアビジンまたはアビジン−ビオチン、塩橋、疎水性相互作用、化学的連結、ＵＶ架橋、焼き付け等により媒介され得る。アレル特異的オリゴヌクレオチドを固体支持体上で直接的に、または合成した後に固体支持体に付着させることができる。本発明の検出方法で用いるのに適当な固体支持体にはシリコン製の基質、ガラス、プラスチック、紙等が含まれ、これを例えばウェル（９６ウェルプレートのような）スライド、シート、膜、繊維、チップ、皿およびビーズに形成することができる。固体支持体を処理、コーティングまたは誘導してアレル特異的オリゴヌクレオチドまたは標的核酸の固定を促すことができる。
【００６０】
集団遺伝子型およびハプロタイプの決定ならびにそれらと形質との相関性
本発明は集団における遺伝子型またはハプロタイプの頻度を決定するための方法を提供する。方法は、集団の各メンバーに存在する遺伝子に関して遺伝子の一つもしくはそれより多い多型部位で検出されたヌクレオチド対またはヌクレオチドを含む遺伝子型またはハプロタイプを決定すること、および集団において遺伝子型またはハプロタイプが見出された頻度を計算することを含む。集団は参照集団、家族集団、同一性別集団、集団群、または形質集団（例えば医学的状態または治療的処置に対する応答のような目的の形質を呈する個体の群）でよい。
【００６１】
本発明の別の態様では、参照集団において見出された遺伝子型および／またはハプロタイプに関する頻度データを形質と遺伝子型またはハプロタイプとの間の関連性を同定するための方法において用いる。形質は限定するものではないが疾患に対する感受性または処置に対する応答性を含む任意の検出可能な表現型でよい。方法を参照集団における目的の遺伝子型またはハプロタイプの頻度に関する情報を得ること、および形質を呈する集団における遺伝子型またはハプロタイプの頻度とデータを比較することを伴う。前記で記載した方法の一つを用いて集団の各個体を遺伝子型分類またはハプロタイプ分類することにより、参照および形質集団の一つまたは双方に関する頻度データを得ることができる。形質集団に関するハプロタイプを直接的に、またはこれに代えて前記で記載した予測的な遺伝子型からハプロタイプへの研究法により決定することができる。
【００６２】
書面または電子形式でよい予め決定された頻度データを評価することにより、参照および／または形質集団に関する頻度データが得られる。例えば頻度データはコンピューターによりアクセス可能であるデータベースに存在し得る。一度頻度データが得られると、参照および形質集団の目的の遺伝子型またはハプロタイプの頻度を比較する。
【００６３】
多型を分析している場合、計算を実施して、偶然に見出され得る有意な関連性を補正することができる。本発明の方法で有用な統計方法に関しては、Statistical Methods in Biology, ３rd edition, Bailey NTJ,（Cambridge Univ. Press, １９９７）； Waterman MS, Introduction to Computational Biology（CRC Press, ２０００）およびBioinformatics, Baxevanis AD & Ouellette BFF editors（John Wiley & Sons, Inc., ２００１）を参照されたい。
【００６４】
別の実施態様では、異なる群に関するハプロタイプ頻度データを試験して、それらがハーディワインベルグ平衡 D.L. Hartl et al., Principles of Population Genomics, ３rd Ed.（Sinauer Associates, Sunderland, MA, １９９７）と合致するすかどうかを決定する。
【００６５】
別の実施態様では、ボンフェロニ補正した標準的なＡＮＯＶＡ検定、または何回も遺伝子型表現型相関性をシミュレートし、そして有意な値を計算するブートストラップ法を用いて統計分析を実施する。ＡＮＯＶＡを用いて、応答可変性が一つもしくはそれより多い形質または測定できる可変性により引き起こされるかまたはそれと相関するかどうかについての仮説を検定する。L.D. Fisher & G. vanBelle, Biostatistics：A Methodology for the Health Sciences（Wiley−lnterscience, New York, １９９３）Ch. １０。
【００６６】
ハプロタイプ対の予測のための一つの実施態様では、分析には以下のような割り当ての工程が含まれる：最初に可能なハプロタイプ対の各々を参照集団のハプロタイプ対と比較する。一般に参照集団のハプロタイプ対の一つのみが可能なハプロタイプ対と対合し、そしてその対を個体に割り当てる。時には参照ハプロタイプ対で示された一つのハプロタイプのみが個体の可能なハプロタイプ対と合致し、そしてそのような場合には個体はこの公知のハプロタイプおよび、可能なハプロタイプ対から公知のハプロタイプを除くことにより誘導される新しいハプロタイプを含有するハプロタイプ対に割り当てられる。
【００６７】
別の実施態様では、目的の遺伝子型またはハプロタイプと連鎖不均衡にある検出可能な遺伝子型またはハプロタイプを代理マーカーとして使用することができる。所定の遺伝子の特定の遺伝子型またはハプロタイプが参照集団におけるよりも可能性のある代理マーカー遺伝子型を実証する集団においてより高頻度である場合に、遺伝子型が別の遺伝子型と連鎖不均衡にあることが示される。頻度が統計的に有意であれば、次いでマーカー遺伝子型はその遺伝子型またはハプロタイプを予測し、そして代理マーカーとして使用され得る。
【００６８】
ハプロタイプの内容と臨床応答との間の相関性を見出すための別の方法は誤差最小化最適化アルゴリズムに基づく予測モデルであり、その一つは遺伝的アルゴリズムである。R. Judson, 「Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry」 in Reviews in Computational Chemistry １０：１−７３, K.B. Lipkowitz & D.B. Boyd, eds.（VCH Publishers, New York, １９９７）を参照されたい。シュミレーテッドアニーリング（Press et al., Numerical Recipes in C：The Art of Scientific Computing, Ch. １０（Cambridge University Press, Cambridge）１９９２）、ニューラルネットワーク（E. Rich & K. Knight, Artificial Intelligence, ２nd Edition, Ch. １０（McGraw−Hill, New York, １９９１）、標準的勾配下降法（Press et al., supra Ch. １０）またはその他の大域的もしくは局所的最適化研究法（see discussion in Judson, supra）を用いることもできる。
【００６９】
対象遺伝子型またはハプロタイプの処置応答性に対する相関性
好ましい実施態様では、形質は疾患に対する感受性、疾患の重篤度、疾患の段階化または薬物に対する応答である。かかる方法は遺伝子型と有効性測定、薬物動態測定および副作用測定を含む処置結果との間の関連性に関して可能性がある全ての遺伝薬理学的適用のための診断試験および治療的処置の開発において適用可能性を有している。
【００７０】
別の好ましい実施態様では、目的の形質は患者が呈するいくつかの治療的処置に対する臨床応答、例えば薬物ターゲティングまたは医学的症状のための治療的処置に対する応答である。
【００７１】
処置に対する臨床応答と遺伝子型またはハプロタイプとの間の相関性を推測するために、処置を受けた個体の集団（以後「臨床集団」と称する）が呈する臨床応答に関して遺伝子型またはハプロタイプデータを得る。すでに行われている臨床試験の結果を分析することにより、ならびに／または一つもしくはそれより多い新しい臨床試験を設計および実行することによりこの臨床データを得ることができる。
【００７２】
臨床集団に含まれる個体は通常目的の医学的症状の存在に関して等級分けされる。潜在的患者のこの等級分けには標準的な身体的試験または一つもしくはそれより多い実験室試験を用いることができる。これに代えて、患者の等級分けにはハプロタイプ対と疾患感受性または重篤度との間に強力な相関性がある状況に関してハプロタイプ分類を用いることができる。
【００７３】
目的の治療的処置は試験集団の各個体に投与され、そして各個体の処置に対する応答は一つもしくはそれより多い予め決定された診断基準を用いて測定される。多くの場合で試験集団は応答の範囲を提示し、そして研究者は種々の応答により作られた応答群の数（例えば、低、中、高）を選択することが意図される。加えて試験集団の各個体の遺伝子を遺伝子型分類および／またはハプロタイプ分類し、処置を施す前または後にそれを行うことができる。
【００７４】
次いでこれらの結果を分析して、多型群間で臨床応答における任意の観測された変化が統計的に有意であるかどうかを決定する。用いることができる統計分析方法はL.D. Fisher & G. vanBelle, Biostatistics：A Methodology for the Health Sciences（Wiley−lnterscience, New York, １９９３）に記載されている。この分析はまた遺伝子のどの多型部位が表現型における差異に最も有意に寄与するかの回帰計算をも含み得る。
【００７５】
臨床および多型の双方のデータが得られた後、個体応答と遺伝子型またはハプロタイプの内容との間の相関が創られる。いくつかの方式で相関を生むことができる。一つの方法では、その遺伝子型またはハプロタイプ（またはハプロタイプ対）により個体を群分けし（多型群とも称する）、そして次に各多型群のメンバーが呈した臨床応答の平均（average）および標準偏差を計算する。
【００７６】
前記で記載した分析から、遺伝子型またはハプロタイプ内容の関数として臨床応答を予測する当業者は数学的モデルを容易に構築することができる。臨床応答と遺伝子に関する遺伝子型またはハプロタイプ（またはハプロタイプ対）との間の関連性の同定は、処置に応答するもしくは応答しないか、またはこれに代えて低レベルで応答し、そしてしたがってさらなる処置、すなわちより高用量の薬物を必要とし得るこれらの個体を決定するための診断方法を設計するための基礎になり得る。診断方法はいくつかの形態の一つ：例えば直接ＤＮＡ試験（すなわち遺伝子の一つもしくはそれより多い多型部位を遺伝子型分類またはハプロタイプ分類する）血清学的試験または身体試験測定を取り得る。唯一の要件は診断検定結果と基礎となる遺伝子型またはハプロタイプとの間に良好な相関性があるということである。好ましい実施態様では、この診断方法は前記で記載した予測的ハプロタイプ分類方法を用いる。
【００７７】
対象の遺伝子型群への割り当て
当業者には理解されるように、この決定を行うにはある程度の不確実性が存在する。したがって、対照群レベルの標準偏差を用いて確率的決定を行い、そして遺伝子型群決定に基づく確率の広い範囲にわたって本発明の方法が適用される。したがって例えば、そして限定するものではないが、一つの実施態様では遺伝子発現生成物の測定レベルがいずれかの対照群の平均（mean）の標準偏差２.５以内に入る場合、次いでその個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。別の実施態様では、遺伝子発現生成物の測定レベルがいずれかの対照群の平均（mean）の標準偏差２.０以内に入る場合、次いでその個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。さらに別の実施態様では、遺伝子発現生成物の測定レベルがいずれかの対照群の平均（mean）の標準偏差１.５以内に入る場合、次いでその個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。なおさらに別の実施態様では、遺伝子発現生成物の測定レベルがいずれかの対照群レベルの平均（mean）の標準偏差１.０であるかまたはそれより小さい場合、次いでその個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。
【００７８】
この過程により種々の確率の程度でどの群に特異的対象をおくべきかの決定が可能になり、そして次に遺伝子型群へのかかる割り当てにより個体をおくべき危険性カテゴリーが決定される。
【００７９】
臨床応答と遺伝子型またはハプロタイプとの間の相関性
処置に対する臨床応答と遺伝子型またはハプロタイプとの間の相関性を推測するために、処置を受けた個体の集団（以後「臨床集団」と称する）が呈する臨床応答に関するデータを得ることが必要である。すでに行われている臨床試験の結果を分析することによりこの臨床データを得ることができ、そして／または一つもしくはそれより多い新しい臨床試験を設計および実行することによりこの臨床データを得ることができる。
【００８０】
したがって異なる対照群で決定される遺伝子発現生成物の標準的な対照レベルを、次いで所定の患者の遺伝子発現生成物の測定レベルと比較する。この遺伝子発現生成物はその特定の遺伝子型群またはその遺伝子型群のポリペプチド遺伝子発現生成物に関連する特徴的なｍＲＮＡでよい。次いで患者を所定の群に関する対照レベルと比較して測定レベルがどれほど類似していたかに基づいて特定の遺伝子型群に分類または割り当てることができる。
【００８１】
多型データを保存または表示するためのコンピューターシステム
本発明はまた遺伝子に関して決定された多型データを保存および表示するためのコンピューターシステムを提供する。コンピューターシステムはプロセシングユニット、ディスプレイおよび多型データを含有するデータベースを含む。多型データには参照集団の所定の遺伝子に関して同定された多型、遺伝子型およびハプロタイプが含まれる。好ましい実施態様では、コンピューターシステムはその進化的関係に従って体系化されたハプロタイプを示すディスプレイを作ることができる。コンピューターは本発明の方法の実施に関与する任意のまたは全ての分析的および数学的操作を遂行することができる。加えてコンピューターはディスプレイ装置に表示されたビュー（またはスクリーン）を作るプログラムを実行することができ、そしてそれを用いて使用者はビューと双方向作用し、そして染色体位置、遺伝子構造および遺伝子ファミリー、遺伝子発現データ、多型データ、遺伝子配列データならびに臨床集団データ（例えば一つもしくはそれより多い集団に関する民族地理学的起源、臨床応答、遺伝子型およびハプロタイプ）を含む遺伝子およびそのゲノム変化に関係する多量の情報を分析することができる。本明細書に記載した多型データをリレーショナルデータベース（例えばオラクルデータベースの一例またはＡＳＣＩＩフラットファイル）の部分として保存することができる。これらの多型データをコンピューターハード装置に保存することができるか、または例えばＣＤ−ＲＯＭまたはコンピューターによりアクセス可能な一つもしくはそれより多いその他の保存装置に保存することができる。例えばネットワークを介してコンピューターに接続されている一つもしくはそれより多いデータベースにデータを保存することができる。
【００８２】
核酸基盤の診断
別の態様では、本発明はその遺伝的多様性の型に従って対象を分類するのに有用であるＳＮＰプローブを提供する。本発明によるＳＮＰプローブは従来のアレル識別アッセイでＳＮＰ間を識別するオリゴヌクレオチドである。特定の好ましい実施態様では、本発明のこの態様によるオリゴヌクレオチドはＳＮＰ核酸の一つのアレルに相補的であるが、ＳＮＰ核酸の任意のその他のアレルには相補的でない。本発明のこの実施態様によるオリゴヌクレオチドは種々の方式でＳＮＰ間を識別することができる。例えばストリンジェントハイブリダイゼーション条件下では、適切な長さのオリゴヌクレオチドは一つのＳＮＰにハイブリダイズするが、任意のその他のものにはハイブリダイズしない。放射性標識または蛍光分子タグを用いてオリゴヌクレオチドを標識することができる。これに代えて適切な長さのオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして使用することができ、ここで３’末端ヌクレオチドはＳＮＰを含有する一つのアレルに相補的であるが、任意のその他のアレルには相補的でない。この実施態様ではＰＣＲによる増幅の存在または不在によりＳＮＰのハプロタイプが決定される。
【００８３】
本発明のゲノムおよびｃＤＮＡフラグメントは本明細書で同定した少なくとも一つの多型部位を含み、少なくとも１０ヌクレオチド長を有し、そして遺伝子の全長までにわたり得る。好ましくは本発明によるフラグメントは１００ヌクレオチド長と３０００ヌクレオチド長の間であり、さらに好ましくは２００ヌクレオチド長と２０００ヌクレオチド長の間であり、そして最も好ましくは５００ヌクレオチド長と１０００ヌクレオチド長の間である。
【００８４】
本発明のキット
本発明は個体の遺伝子をハプロタイプ分類および／または遺伝子型分類するのに有用な核酸およびポリペプチド検出キットを提供する。かかるキットは個体を分類する目的のために個体を分類するのに有用である。具体的には、本発明は生物学的試料、例えば限定するものではないが血清、血漿、リンパ液、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水または血液を含む任意の体液、および身体組織の生検試料を含む生物学的試料中の本発明のマーカーに相当するポリペプチドまたは核酸の存在を検出するためのキットを包含する。例えばキットは生物学的試料中の本発明のマーカーに相当するポリペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる標識化合物または薬剤および試料中のポリペプチドまたはｍＲＮＡの量を決定するための手段、例えばポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合するポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドプローブに結合する抗体を含むことができる。キットはまたキットを用いて得られた結果を解釈するための指示書を含むこともできる。
【００８５】
別の実施態様では、本発明は別個の容器に包装された少なくとも二つの遺伝子型分類オリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。キットはまた別個の容器に包装されたハイブリダイゼーションバッファー（ここでオリゴヌクレオチドはプローブとして用いられる）のようなその他の構成成分をも含有できる。これに代えて、オリゴヌクレオチドを用いて標的領域を増幅しようとする場合、ＰＣＲの場合のように、キットは別個の容器に包装されたポリメラーゼおよびポリメラーゼにより媒介されるプライマー伸長に最適化された反応バッファーを含有できる。好ましい実施態様では、かかるキットはさらにＤＮＡ試料収集手段を含むことができる。
【００８６】
抗体基盤のキットに関しては、キットは例えば（１）本発明のマーカーに相当するポリペプチドに結合する、例えば固体支持体に付着させた第一抗体；および場合によっては（２）ポリペプチドまたは第一抗体のいずれかに結合し、そして検出可能な標識に抱合させた第二の異なる抗体を含むことができる。
【００８７】
オリゴヌクレオチド基盤のキットに関しては、キットは例えば（１）本発明のマーカーに相当するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド；または（２）本発明のマーカーに相当する核酸分子を増幅するのに有用なプライマーの対を含むことができる。
【００８８】
キットはまた例えば緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定剤をも含むことができる。キットはさらに検出可能な標識、例えば酵素または基質を検出するのに必要な構成成分を含むことができる。キットはまた検定しそして被験試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料を含有することもできる。キットの各々の構成成分を個々の容器内に封入し、そして種々の容器の全てを、キットを用いて実施されたアッセイの結果を解釈するための指示書と一緒に単一の包装にすることができる。
【００８９】
本発明の核酸配列
一つの態様では、本発明は一つもしくはそれより多い単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明はまた同一物のアレルバリアント、すなわちポリヌクレオチドによりコードされるものと同一、相同または関連する変異ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドの天然発生の代替え形態をも包含する。これに代えて当分野において周知の変異誘発技術または直接合成技術により非天然発生バリアントを生成することができる。
【００９０】
したがって低ストリンジェントで本発明の変異ポリペプチドをコードする任意の核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列は本発明の範囲内であると考えられる。標準的なストリンジェント条件は標準的な分子生物学クローニングテキストにおいて十分に特徴付けされている。例えばMolecular Cloning A Laboratory Manual, ２nd Ed., ed., Sambrook, Fritsch, & Maniatis（Cold Spring Harbor Laboratory Press, １９８９）；DNA Cloning, Volumes I and II, D.N. Glover, ed.（１９８５）； Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait, ed.（１９８４）； Nucleic Acid Hybridization, B.D. Hames & S.J. Higgins, eds（１９８４）参照。
【００９１】
組換え発現ベクター
本発明の別の態様は変異ポリペプチドをコードする一つもしくはそれより多い核酸配列を含有するベクターを含む。本発明の実施において、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの多くの従来技術を用いる。これらの技術は周知であり、そして例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Vols. I−III, Ausubel, ed.（１９９７）； Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ２nd Ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, １９８９）；DNA Cloning：A Practical Approach, Vols. I and II, Glover, Ed.（１９８５）； Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed.（１９８４）； Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds.（１９８５）； Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds.（１９８４）； Animal Cell Culture, Freshney, ed.（１９８６）； Immobilized Cells and Enzymes（IRL Press, １９８６）； Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning； the series Methods in Enzymology,（Academic Press, Inc., １９８４）； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds.（Cold Spring Harbor Laboratory, New York, １９８７）；およびMethods in Enzymology, Vols. １５４ and １５５, Wu & Grossman, and Wu, Eds.の各々において説明されている。
【００９２】
本発明の一つもしくはそれより多いポリペプチドの組換え発現に関しては、当分野において周知組換えＤＮＡ技術により、ポリペプチドをコードする核酸配列の全てまたは一部を含有する核酸を適切なクローニングベクターまたは発現ベクター（すなわち挿入されたポリペプチドコード化配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクター）に挿入する。
【００９３】
プラスミドは最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、本明細書では「プラスミド」および「ベクター」を互換的に用いることができる。しかしながら、本発明はウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、等価な機能を提供する技術的にはプラスミドではない発現ベクターのかかるその他の形態を含むことが意図される。かかるウイルスベクターにより対象の感染およびその対象における化合物の発現が可能になる（Becker et al., Meth. Cell Biol. ４３：１６１ ８９（１９９４））。組換え発現ベクター内で「作動可能なように連結された」とは目的のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えばインビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）調節配列に連結されていることを意味すると意図される。「調節配列」なる用語はプロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むと意図される。かかる調節配列は例えばGoeddel, Gene Expression Technology：Methods In Enzymology １８５（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）に記載されている。調節配列には、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は形質転換される宿主細胞の選択、望ましいポリペプチドの発現のレベル等のような因子に依存し得ることは当業者には理解されよう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより本明細書に記載するような核酸によりコードされる融合ポリペプチドを含むポリペプチドまたはペプチド（例えば変異ポリペプチドおよび変異誘導融合ポリペプチド等）を生成することができる。
【００９４】
ポリペプチド発現宿主細胞
本発明の別の態様は本発明の一つもしくはそれより多い変異ポリペプチドをコードする核酸を含有するポリペプチド発現宿主細胞に関係する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」なる用語は本明細書では互換的に用いられる。かかる用語が特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫または潜在的子孫をも意味することは理解される。変異または環境の影響のいずれかのために後の世代で特定の修飾が生じ得るので、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で用いる用語の範囲内に依然含まれる。宿主細胞は任意の原核または真核細胞でよい。Sambrook et al. Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ２nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８９）。
【００９５】
従来の形質転換またはトランスフェクション技術によりベクターＤＮＡを原核または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」なる用語は外来の核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当分野で認識されている種々の技術を意味し、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが含まれると意図される。宿主を形質転換またはトランスフェクションするための適当な方法をSambrook et al. Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ２nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８９）、およびその他の実験室マニュアルに見出すことができる。細胞へのＤＮＡの導入に関しては、エレクトロポレーション、粒子ボンバードメント、リン酸カルシウム共沈およびウイルス形質導入が当分野において公知である；したがって方法の選択は当業者の能力および嗜好を伴い得る。
【００９６】
本発明の組換え細胞を調製するために、イソ遺伝子が染色体外に留まるように、望ましいイソ遺伝子をベクター中で宿主細胞に導入することができる。かかる状況では、遺伝子は染色体外位置から細胞により発現される。好ましい実施態様では、イソ遺伝子を細胞に存在する内因性遺伝子と組換えされるように細胞に導入する。組換えおよび染色体外維持の双方のための遺伝子の導入のためのベクターが当分野において公知であり、そして任意の適当なベクターまたはベクター構築物を本発明で用いることができる。
【００９７】
原核または真核細胞において変異ポリペプチドを発現するために本発明の組換え発現ベクターを設計することができる。例えば変異ポリペプチドを大腸菌（E. coli）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、真菌細胞、例えば酵母、または哺乳動物細胞において発現させることができる。適当な宿主細胞はさらにGoeddel, Gene Expression Technology：Methods In Enzymology １８５（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）において論じられている。
【００９８】
原核細胞におけるポリペプチドの発現は、融合または非融合ポリペプチドのいずれかの発現を指示する構成的または誘導プロモーターを含有するベクターを伴う大腸菌において最も頻繁に実施される。典型的な融合発現ベクターにはｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc； Smith and Johnson, １９８８. Gene ６７：３１ ４０）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, Mass., USA）およびグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合ポリペプチドまたはポリペプチドＡを各々標的組換えポリペプチドの融合させるｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, N.J., USA）が含まれる。適当な誘導非融合大腸菌発現ベクターの実例にはｐＴｒｃ（Amrann et al., Gene ６９：３０１ ３１５（１９８８））およびｐＥＴ１１ｄ（Studier et al., Gene Expression Technology：Methods In Enzymology（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）pp. ６０−８９）が含まれる。その他の試験計画はGottesman, Gene Expression Technology：Methods In Enzymology（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）pp. １１９−１２８ およびWada, et al., Nucl. Acids Res. ２０：２１１１−２１１８（１９９２））に記載されている。
【００９９】
ポリペプチド発現ベクターは酵母発現ベクターでよい。出芽酵母における発現のためのベクターの実例にはｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari et al., EMBO J. ６：２２９ ２３４（１９８７））、ｐＭＦａ（Kurjan & Herskowitz, Cell ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., Gene ５４：１１３ １２３（１９８７））、ｐＹＥＳ２（InVitrogen Corporation, San Diego, Calif. USA）およびｐｉｃＺ（InVitrogen Corp, San Diego, Calif., USA）が挙げられる。これに代えてバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において変異ポリペプチドを発現させることができる。培養された昆虫細胞（例えばＳＦ９細胞）におけるポリペプチドの発現に利用可能なバキュロウイルスベクターにはｐＡｃシリーズ（Smith et al., Mol. Cell. Biol. ３：２１５６ ２１６５（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（Lucklow & Summers, Virology １７０：３１ ３９（１９８９））が含まれる。ｐＣＤＭ８（Seed, Nature ３２９：８４２ ８４６（１９８７））またはｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al., EMBO J. ６：１８７ １９５（１９８７））のような哺乳動物発現ベクターを用いて本発明の核酸を哺乳動物細胞において発現させることができる。原核および真核細胞の双方のための発現系に適当なその他のものに関しては、例えばSambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ２nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８９）１６および１７章を参照されたい。組織特異的および発生学的に調節される調節エレメントは当分野において公知である。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節についての議論は例えばWeintraub et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Trends in Genetics １（１）（１９８６）を参照されたい。
【０１００】
培養下の原核または真核宿主細胞のような本発明の化合物を含む宿主細胞を用いて組換え変異ポリペプチドを生成（すなわち発現）することができる。組換えポリペプチドの精製は当分野において周知であり、そしてイオン交換精製技術または、例えば化合物に対する抗体を伴うアフィニティー精製技術が含まれる。
【０１０１】
トランスジェニック動物
当分野において公知の標準的な手順を用いて本発明のバリアント遺伝子を発現する組換え生物、すなわちトランスジェニック動物を調製する。当業者に公知のいくつかの方法により本発明の構築物を担持するトランスジェニック動物を作ることができる。例えば米国特許第５６１００５３号およびRecombinant DNA, Eds. J.D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski & M. Zoller（W.H. Freeman and Company, New York）pp. ２５４−２７２の「The Introduction of Foreign Genes into Mice」およびその引用文献を参照されたい。発現および／または活性異常に関係する疾患を研究するための、ならびにこれらの疾患の病徴または影響を低減させるための種々の候補薬物、化合物および処置計画をスクリーニングおよび検定するための生物学的モデルとしてヒトイソ遺伝子を安定して発現し、そしてヒトタンパク質を生成するトランスジェニック動物を用いることができる。
【０１０２】
遺伝子発現レベルの特徴付け
ｍＲＮＡレベル（すなわち遺伝子転写レベル）およびポリペプチド遺伝子発現生成物のレベル（すなわち遺伝子翻訳レベル）を検出および測定するための方法は当分野において周知であり、そしてヌクレオチドマイクロアレイの使用ならびに質量分析器および／または抗体検出および定量技術を伴うポリペプチド検出方法を含む。またTom Strachan & Andrew Read, Human Molecular Genetics, ２nd Edition.（John Wiley and Sons, Inc. Publication, New York, １９９９）も参照されたい。
【０１０３】
標的遺伝子転写の決定
生物学的試料、例えば個体の組織または体液中の遺伝子の発現生成物のレベルの決定を種々の方式で実施することができる。「生物学的試料」なる用語は対象から単離された組織、細胞、生物学的液体およびその単離体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および液体が含まれると意図される。多くの発現検出方法は単離されたＲＮＡを用いる。インビトロ法に関しては、ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技術を細胞からのＲＮＡの精製に利用することができる。例えばAusubel et al., Ed., Curr. Prot. Mol. Biol.（John Wiley & Sons, New York, １９８７−１９９９）参照。
【０１０４】
一つの実施態様では、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現生成物のレベルを決定する。特異的ｍＲＮＡのレベルを測定するための方法は当分野において周知であり、そしてノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＰＣＲまたはオリゴヌクレオチドアレイもしくはマイクロアレイへのハイブリダイゼーションによるものを含む。その他のさらに好ましい実施態様では、限定するものではないが血液または血清を含む体液または組織試料中のタンパク質または遺伝子のポリペプチド発現生成物のレベルを決定することにより発現のレベルの決定を実施することができる。例えば米国特許第４８４３１５５の一工程ＲＮＡ単離方法のような当業者に周知の技術を用いて多数の組織試料を容易に加工することができる。
【０１０５】
限定するものではないがサザンまたはノーザン分析、ＰＣＲ分析およびプローブアレイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて単離されたｍＲＮＡを用いることができる。ｍＲＮＡレベルを検出するための一つの好ましい診断方法は、検出されている遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と単離されたｍＲＮＡを接触させることを伴う。核酸プローブは例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのような、そしてストリンジェント条件下で本発明のマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分である全長ｃＤＮＡまたはその一部でよい。本発明の診断アッセイにおいて使用するためのその他の適当なプローブを本明細書で記載する。ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは問題のマーカーが発現されていることを示す。
【０１０６】
一つの形式では、プローブを固体表面に固定し、そしてｍＲＮＡを例えばAffymetrix 遺伝子チップアレイ（Affymetrix, Calif. USA）中プローブと接触させる。当業者は本発明のマーカーによりコードされるｍＲＮＡのレベルを検出するのに使用するために公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適合させることができる。
【０１０７】
試料中の本発明のマーカーに相当するｍＲＮＡのレベルを決定するための代替えの方法は例えばＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４６８３２０２号に示す実験的実施態様）；リガーゼ連鎖反応（Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：１８９−１９３（１９９１））、自律的配列複製（Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７：１８７４−１８７８（１９９０））；転写増幅系（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：１１７３−１１７７（１９８９））；Ｑベータレプリカーゼ（Lizardi et al., Biol. Technology ６：１１９７（１９８８））；ローリングサークル複製（U.S. Pat. No. ５,８５４,０３３）；または任意のその他の核酸増幅方法による核酸増幅の過程を伴い、続いて当業者に周知の技術を用いて増幅した分子を検出する。核酸分子が非常に低数で存在する場合、これらの検出スキームはかかる分子の検出に特に有用である。本明細書で用いるように、「増幅プライマー」は遺伝子の５’または３’領域にアニーリングし（各々プラスおよびマイナス鎖、またはその逆）、そしてその間に短い領域を含有することができる核酸分子の対であると定義される。一般に増幅プライマーは約１０−３０ヌクレオチド長であり、そして約５０−２００ヌクレオチド長の領域をフランキングする。
【０１０８】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は例えば本発明の遺伝子、例えば目的のＳＮＰおよび多型を含有する遺伝子の遺伝子発現レベルを評価するための一つの方式である。ＲＴ−ＰＣＲアッセイはｍＲＮＡ鎖を含むＲＮＡ鎖からのＤＮＡ鎖の合成を触媒するＲＮＡ逆転写酵素を利用する。得られたＤＮＡを特異的に検出および定量することができ、そしてこの方法を用いて特定の種類のｍＲＮＡのレベルを決定することができる。これを行うための一つの方法はTAQMAN（登録商標）（PE Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA）であり、そしてＰＣＲ反応中にAMPLITAQ GOLD（商標）ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を活用してプローブの特異的形態を切断する。これはTAQMAN（商標）プローブと称される。Luthra et al., Am. J. Pathol. １５３：６３−６８（１９９８）； Kuimelis et al., Nucl. Acids Symp. Ser. ３７：２５５−２５６（１９９７）；およびMullah et al., Nucl. Acids Res. ２６（４）：１０２６−１０３１（１９９８））参照。反応の間にプローブの切断はレポーター色素およびクエンチャー色素を分離し、結果的にレポーターの蛍光が増加する。ＰＣＲ生成物の蓄積をレポーター色素の蛍光の増加をモニタリングすることにより直接的に検出する。Heid et al., Genome Res. ６（６）：９８６−９９４（１９９６））。核酸標的の出発コピー数が多いほど、蛍光の有意な増加の観察が早くなる。Gibson, Heid & Williams et al., Genome Res. ６：９９５−１００１（１９９６）参照。
【０１０９】
細胞の転写状態を測定するためのその他のテクノロジーは二重制限酵素消化を相調整（phasing）プライマー（例えば欧州特許第０５３４８５８Ａ１号参照）と組み合わせた方法、または定義されたｍＲＮＡ末端に最も近い部位を有する制限フラグメントを選択する方法のような電気泳動分析のための限定的で複雑な制限フラグメントのプールを生み出す。（例えばPrashar & Weissman, Proc.°Natl. Acad. Sci. USA ９３（２）６５９−６６３（１９９６）参照）。
【０１１０】
その他の方法は複数のｃＤＮＡの各々で各ｃＤＮＡを同定するために十分な塩基、例えば２０−５０塩基をシークエンシングすることによる、または定義されたｍＲＮＡ末端経路パターンに相対した公知の位置で生じる短いタグ、例えば９−１０塩基をシークエンシングすることによるようにｃＤＮＡプールを統計的に試料採取する。例えばVelculescu, Science ２７０： ４８４−４８７（１９９５）参照。試料中のｃＤＮＡレベルを定量し、そして当業者に周知の標準的な統計手段を用いることにより各ｃＤＮＡの平均（mean）、平均（average）および標準偏差を決定する。Norman T.J. Bailey, Statistical Methods In Biology, ３rd Edition（Cambridge University Press, １９９５）。
【０１１１】
ポリペプチドの検出、免疫学的検出方法
検出可能なように標識された、または続いて標識できるプローブにより本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を検出することができる。「標識された」なる用語はプローブまたは抗体に関しては、結合、すなわち物理学的連結によるプローブまたは抗体の直接標識、プローブまたは抗体に対して検出可能な物質、および直接標識されている別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含すると意図される。間接的標識の実例には蛍光標識二次抗体を用いる一次抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようなＤＮＡプローブのビオチンでの末端標識が挙げられる。一般的にプローブは発現されたタンパク質を認識する抗体である。種々の形式を用いて試料が所定の抗体に結合する標的タンパク質を含有するかどうかを決定することができる。本発明の標識ポリペプチドの検出に有用なイムノアッセイ法には、限定するものではないが例えばドットブロッティング、ウェスタンブロッティング、タンパク質チップ、競合および非競合タンパク質結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、ならびに一般に用いられそして科学的および特許文献において広く記載されているその他のものおよび多くの市販により用いられるものが含まれる。当業者は細胞が本発明のマーカーを発現するかどうか、および血液またはその他の身体組織中のその特異的ポリペプチド発現生成物の相対濃度を決定するのに使用するための公知のタンパク質／抗体検出方法を容易に適合させることができる。当業者に周知である技術を用いて個体からのタンパク質を単離することができる。用いられるタンパク質単離方法は例えばHarlow & Lane, Antibodies：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, １９８８））に記載されているようなものでよい。
【０１１２】
開示される遺伝子の一つによりコードされるタンパク質に対する抗体の生成のために、ポリペプチドまたはその一部を注射することにより種々の宿主動物を免疫することができる。かかる宿主動物には、限定するものではないがウサギ、マウスおよびラットが含まれる。宿主の種に依存して、限定するものではないがフロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル；リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような界面活性物質；ならびにカルメットゲ・ラン桿菌（ＢＣＧ）およびコリネバクテリウム・パルバムのような有用な可能性のあるヒトアジュバントを含む種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増強させることができる。
【０１１３】
培養下の連続的な細胞系による抗体分子の生成を提供する任意の技術により、特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を得ることができる。これらには、限定するものではないがKohler & Milstein, Nature ２５６：４９５−４９７（１９７５）；および米国特許第４３７６１１０号のハイブリドーマ技術； Kosbor et al., Immunol. Today ４：７２（１９８３）； Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８０：２０２６−２０３０（１９８３）のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術； ならびにCole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy（Alan R. Liss, Inc., １９８５）pp. ７７−９６のＥＢＶハイブリドーマ技術が挙げられる。
【０１１４】
加えて適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生成のために開発された技術（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８１：６８５１−６８５５（１９８４）； Neuberger et al., Nature ３１２：６０４−６０８（１９８４）； およびTakeda et al., Nature ３１４：４５２−４５４（１９８５）参照）を用いることができる。キメラ抗体は、ネズミｍＡｂおよびヒト免疫グロブリン定常領域から誘導された可変または超可変領域を有するもののような、異なるタンパク質が異なる動物種から誘導される分子である。
【０１１５】
これに代えて、一本鎖抗体の生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号； Bird, Science ２４２：４２３−４２６（１９８８）； Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびWard et al., Nature ３３４：５４４−５４６（１９８９））を差次的に発現された遺伝子一本鎖抗体を生成するために適合させることができる。
【０１１６】
「ヒト化抗体」の生成に有用な技術をタンパク質、そのフラグメントまたは誘導体に対する抗体の生成に適合させることができる。かかる技術は米国特許第５９３２４４８号；第５６９３７６２号；第５６９３７６１号；第５５８５０８９号；第５５３０１０１号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５７８９６５０号；第５６６１０１６号；および第５７７０４２９号に開示されている。
【０１１７】
発現されたタンパク質を検出するために、抗体または抗体フラグメントをウェスタンブロットまたは免疫蛍光技術のような方法において用いることができる。かかる使用において抗体またはタンパク質のいずれかを固体支持体上に固定するのが一般に好ましい。適当な固相支持体または担体には抗原または抗体と結合できる任意の支持体が含まれる。周知の支持体または担体にはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩およびマグネタイトが含まれる。
【０１１８】
検出の容易さに関して有用な方法はサンドウィッチＥＬＩＳＡであり、その多くの変法が存在し、その全てが本発明の方法およびアッセイで用いられると意図される。本明細書で用いる「サンドウィッチアッセイ」は基本的な二部位技術の全ての変法を包含すると意図される。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は双方共に当分野において十分に確立されている。しかしながら、放射性同位体、化学的発光または生物発光分子のようなその他のレポーター分子を用いることもできる。必要とされる使用に適合するためにどのように手順を変化させるかは当業者には明白であろう。
【０１１９】
結合部位が細胞ゲノムによりコードされる複数のタンパク質種に特異的な、固定された、好ましくはモノクローナルの抗体を含むマイクロアレイを構築することにより、タンパク質の全ゲノム、すなわち「プロテオーム」を実施することができる。好ましくはコードされたタンパク質の実質的な分画に関する、または少なくとも目的の生物学的ネットワークモデルの試験もしくは確認に関係するこれらのタンパク質に関する抗体が存在する。前記で記したようにモノクローナル抗体を作成するための方法は周知である。例えばHarlow & Lane, Antibodies：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８８））参照。好ましい実施態様では、細胞のゲノム配列に基づいて設計された合成ペプチドフラグメントに対してモノクローナル抗体を上昇させる。かかる抗体アレイを用いて、細胞からのタンパク質をアレイと接触させ、そしてその結合を当分野において公知のアッセイで測定する。
【０１２０】
ポリペプチドの検出、二次元ゲル電気泳動
二次元ゲル電気泳動は当分野において周知であり、そして典型的には一次元目に等電点電気泳動、続いて二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を伴う。例えばHames et al., Gel Electrophoresis of Proteins：A Practical Approach（IRL Press, New York, １９９０）； Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３：１４４４０−１４４４５（１９９６）； Sagliocco et al., Yeast １２：１５１９−１５３３（１９９６）；およびLander, Science ２７４：５３６−５３９（１９９６）参照。
【０１２１】
ポリペプチドの検出、質量分析
標的ポリペプチドの同一性および発現レベルを、質量分析技術（ＭＳ）を用いて決定することができる。ＭＳ基盤の分析方法論は単離された標的ポリペプチドの分析および生物学的試料中の標的ポリペプチドの分析に有用である。標的ポリペプチドの分析に使用するためのＭＳ様式には、限定するものではないがマトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）のようなイオン化（Ｉ）技術、イオンスプレーまたはサーモスプレー、およびマッシブクラスター衝撃（ＭＣＩ）のような連続的またはパルス的エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および関連する方法が含まれる。かかるイオン供給源は、直線的または非直線的リフレクトロン飛行時間（ＴＯＦ）、単一または複数の四重極、単一または複数の磁場セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、イオントラップおよびイオントラップ／ＴＯＦのようなその組み合わせを含む検出形式に適合させることができる。イオン化には非常に多くのマトリックス／波長の組み合わせ（例えばマトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ））または溶媒の組み合わせ（例えばＥＳＴ）を用いることができる。
【０１２２】
質量分析（ＭＳ）に関しては、標的ポリペプチドを適切な溶液または試薬系中で可溶化することができる。溶液または試薬系、例えば有機または無機溶媒の選択は標的ポリペプチドの特性および実施するＭＳの型に依存し、そして当分野において周知の方法に基づく。例えばＭＡＬＤＩに関してはVorm et al., Anal. Chem. ６１：３２８１（１９９４）；およびＥＳＩに関してはValaskovic et al., Anal. Chem. ６７：３８０２（１９９５）を参照されたい。ペプチドのＭＳはまた例えば国際ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９３／２４８３４号および米国特許第５７９２６６４号にも記載されている。標的ペプチドが気化過程のために導入されたエネルギーにより分解される危険性を最小にする溶媒を選択する。例えばマトリックスに試料を包埋することにより標的ポリペプチド分解の危険性の低減を達成することができる。適当なマトリックスは糖、例えばペントースもしくはヘキソースまたはセルロースのような多糖類のような有機化合物でよい。かかる化合物は熱分解によりＣＯ２およびＨ２Ｏに分解され、化学反応を導き得る残留物は形成されない。マトリックスはまた本質的に何ら残留物を残さないで分解されるアンモニウムの硝酸塩のような無機化合物でもよい。これらのおよびその他の溶媒の使用は当業者に公知である。例えば米国特許第５０６２９３５号参照。エレクトロスプレーＭＳはFenn et al., J. Phys. Chem. ８８：４４５１−４４５９（１９８４）；およびＰＣＴ出願番号第ＷＯ９０／１４１４８号；に記載されており、そして本出願は総説において要約されている。Smith et al., Anal. Chem. ６２：８８２−８９（１９９０）；およびArdrey, Spectroscopy ４： １０−１８（１９９２）参照。
【０１２３】
ＭＳにより決定された標的ポリペプチドの質量を対応する公知のポリペプチドの質量と比較することができる。例えば標的ポリペプチドが変異タンパク質である場合、対応する公知のポリペプチドは対応する非変異タンパク質、例えば野生型タンパク質でよい。ＥＳＩを用いるフェムトモル量での分子量の決定は複数のイオンピークの存在のために非常に正確であり、その全てを質量計算に用いることができる。サブアトモルレベルのタンパク質は例えばＥＳＩ ＭＳ（Valaskovic et al., Science ２７３：１１９９−１２０２（１９９６））およびＭＡＬＤＩ ＭＳ（Li et al., J.°Am. Chem. Soc. １１８：１６６２−１６６３（１９９６））を用いて検出されている。
【０１２４】
マトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）
生物学的試料、例えば体液または組織試料中の標的タンパク質のレベルを、限定するものではないがさらに以下に詳記するようなマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）および表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）として当分野において公知のこれらの技術を含む質量分析（ＭＳ）法を用いて測定することができる。ＭＡＬＤＩを実施するための方法は当業者に周知である。例えばJuhasz et al., Analysis, Anal. Chem. ６８：９４１−９４６（１９９６）を参照されたく、そしてＭＡＬＤＩおよびディレイドエクストラクションプロトコールの記載に関しては例えば米国特許第５７７７３２５号；第５７４２０４９号；第５６５４５４５号；第５６４１９５９号；第５６５４５４５号および第５７６０３９３号もまた参照されたい。分解能を改善するための非常に多くの方法もまた公知である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳはHillenkamp et al., Biological Mass Spectrometry, Burlingame & McCloskey, eds.（Elsevier Science Publ., Amsterdam, １９９０）pp. ４９−６０により記載されている。
【０１２５】
質量分析を用いるマーカー検出のための種々の技術を用いることができる。Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, Hillenkamp, Ed., pp. ３５４−３６２（１９８８）； Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, Karas & Hillenkamp, Eds., pp. ４１６−４１７（１９８８）； Karas & Hillenkamp, Anal. Chem. °６０：２２９９−２３０１（１９８８）；およびKaras et al., Biomed. Environ. Mass Spectrum １８：８４１−８４３（１９８９）参照。ＴＯＦ−ＭＳでのレーザービームの使用は米国特許第４６９４１６７号；第４６８６３６６号、第４２９５０４６号および第５０４５６９４号にて示されており、それはその全てを出典明示により本明細書の一部とする。その他のＭＳ技術によりフラグメント化することなく高分子量バイオポリマーを気化するのに成功でき、そして広範な生物学的高分子を質量分析により分析することが可能になっている。
【０１２６】
表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）
アフィニティー質量分析（ＡＭＳ）として記載されるように、プローブエレメントが特異的被分析物の捕捉およびドッキングに積極的に参加することが可能になる表面を有する新しいＭＳプローブエレメント組成物を用いるその他の技術を用いる。ＳＥＬＤＩ特許米国特許第５７１９０６０号；第５８９４０６３号；第６０２０２０８号；第６０２７９４２号；第６１２４１３７号；および米国特許出願第Ｕ.Ｓ.２００３／０００３４６５号参照。いくつかの型の新しいＭＳプローブエレメントは表面エンハンス型アフィニティーキャプチャー（ＳＥＡＣ）を伴って設計されている。Hutchens & Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom.°７：５７６−５８０（１９９３）参照。ＳＥＡＣプローブエレメントを用いて、タンパク質表面構造および生体特異的分子認識について公知であることを活用することにより、異なるクラスのバイオポリマー、特にタンパク質を取り出し、そして拘束することに成功している。ＭＳプローブエレメント表面に固定したアフィニティーキャプチャー装置、すなわちＳＥＡＣはプローブ表面のために被分析物の位置および親和性（特異性）を決定し、したがって続く分析用ＭＳ過程が効率的である。
【０１２７】
ＳＥＬＤＩの一般的なカテゴリー内に三つの別個のサブカテゴリーが存在する：（１）プローブエレメント表面、すなわち試料提示手段が表面に直接的（ニート）に加えられた被分析物の脱離イオン化を促すために「マトリックス」の代わりにエネルギー吸収分子（ＥＡＭ）を含有するように設計されている表面エンハンス型ニート脱離(Surfaces Enhanced for Neat Desorption)（ＳＥＮＤ）。（２）プローブエレメント表面、すなわち試料提示手段が種々の機構（たいていは非共有結合）により被分析物のプローブ表面への特異的または非特異的いずれかの付着または吸収（いわゆるドッキングまたは拘束）を促すために化学的に定義された、および／または生物学的に定義されたアフィニティーキャプチャー装置を含有するように設計されているＳＥＡＣ。（３）プローブエレメント表面、すなわち試料提示手段が共有結合ドッキング装置として提供されるために一つもしくはそれより多い型の化学的に定義された架橋分子を含有するように設計または修飾されている表面エンハンス型光解離性付着／放出（Surfaces Enhanced for Photolabile Attachment and Release）（ＳＥＰＡＲ）。ＳＥＰＡＲ試料提示手段（すなわちプローブエレメント表面）と被分析物（例えばタンパク質）との間の光解離性分子付着点の型および数を決定する化学的特異性は被分析物にいずれか一つもしくはそれより多い数の異なる残基または化学構造を伴い得る（例えばタンパク質およびペプチドの場合、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、ＰｈｅおよびＣｙｓ残基）。
【０１２８】
機能化ポリペプチド
本発明のポリペプチドを修飾して固体支持体への抱合を促すことができる。化学的または物理的部分を適切な位置でポリペプチドに組み込むことができる。例えばポリペプチドのカルボキシル末端もしくはアミノ末端に、またはペプチドのアミノ酸に（例えば反応性側鎖にまたはペプチドバックボーンに）適切な官能基を加えることにより目的のポリペプチドを修飾することができる。しかしながら当業者は、かかる修飾、例えばビオチン部分の組み込みが特定の試薬がポリペプチドと特異的に相互作用する能力に影響し得ることを認識し、そしてしたがって関係がある場合、目的のポリペプチドをどのように修飾するのが最適であるかを選択するにあたりこの因子を考慮するであろう。通常ポリペプチドに存在する天然発生アミノ酸はまたポリペプチドを固体支持体に抱合させるのに適当な官能基を含有することもできる。例えばポリペプチドに存在するシステイン残基を用いて、ジスルフィド連結を介してスルフヒドリル基を含有する支持体、例えばそこに付着したシステイン残基を有する支持体にポリペプチドを抱合させることができる。２個のアミノ酸間に形成され得るその他の結合には、限定するものではないが例えばポリペプチドに組み込まれ得る非天然発生アミノ酸である２個のランチオニン残基間のモノスルフィド結合；Ｇｌｕのｙカルボキシル基（またはＡｓｐのアルファカルボキシル基）とＬｙｓのアミノ基との間のような酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸の側鎖の間のアミノ基転移反応により形成されるラクタム結合；または例えばＳｅｒのヒドロキシ基とＧｌｕのカルボキシル基との間の架橋により生成されるラクトン結合が含まれる。したがって、望ましいアミノ酸残基、例えばＧｌｕ残基を含有するように固体支持体を修飾することができ、そしてＳｅｒ残基、特にＮ末端またはＣ末端のＳｅｒ残基を有するポリペプチドをラクトン結合の形成を介して固体支持体に抱合させることができる。ポリペプチドのＳｅｒでラクトン様結合を形成するのが望ましい場合、支持体を特定のアミノ酸、例えばＧｌｕを含有するように修飾する必要はないが、代わりに接近可能なカルボキシル基を含有する様に修飾し、したがってＧｌｕのアルファカルボキシル基に相当する官能基を提供することができる。
【０１２９】
チオール反応性機能
チオール反応性機能はポリペプチドの固体支持体への抱合に特に有用である。チオール反応性機能は求核性チオール部分と速やかに反応して共有結合、例えばジスルフィド結合またはチオエーテル結合を生じることができる化学的基である。種々のチオール反応性機能は当分野において公知であり、例えばヨードアセチルのようなハロアセチル；ジアゾケトン；エポキシケトン、アルファエノンおよびベータエノンのようなアルファおよびベータ不飽和カルボニル；ならびにマレイミドのようなその他の反応性マイケル受容体；酸ハロゲン化物；ベンジルハロゲン化物；等が含まれる。Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, ２nd Edition（John Wiley & Sons, １９９１）参照。
【０１３０】
所望により光解離性保護基でチオール基を遮断することができ、次いでそれを例えばフォトリソグラフィーにより選択的に切断して目的のポリペプチドの固定のために活性化された表面の部分を提供することができる。光切断可能な保護基は当分野において公知であり（例えば公開国際ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９２／１００９２号；およびMcCray et al., Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. １８：２３９−２７０（１９８９）参照）、そして例えばフォトリソグラフィーマスクを用いて表面の選択された面積の照射により選択的に遮断解除することができる。
【０１３１】
リンカー
リンカーを介して目的のポリペプチドを直接支持体に付着させることができる。直接かまたはスペーサーを介してかのいずれかでペプチドまたはアミノ酸の支持体への連結に適当であることが当業者に公知の任意のリンカーを用いることができる。例えば可変スペーサーの手段によりポリペプチドをビーズのような支持体に抱合させることができる。リンカーにはリンクアミドリンカー（例えばリンク、Tetrahedron Lett. ２８：３７８７（１９７６）参照）；塩化トリチルリンカー（例えばLeznoff, Ace Chem. Res. １１：３２７（１９７８）参照）；およびメリフィールドリンカー（例えばBodansky et al., Peptide Synthesis, ２nd Edition（Academic Press, New York, １９７６）参照）が含まれる。例えばトリチルリンカーが公知である。例えば米国特許第５４１００６８号および第５６１２４７４号参照。アミノトリチルリンカーもまた公知である。例えば米国特許第５１９８５３１号参照。その他のリンカーには融合タンパク質に組み込まれ、そして宿主細胞において発現され得るものが含まれる。かかるリンカーをアミノ酸、酵素基質または任意の適当なペプチドから選択することができる。核酸を単離する場合、リンカーを例えばプライマーの適切な選択により作成することができる。これに代えて、それらを目的のタンパク質の翻訳後修飾により加えることができる。ペプチドの支持体への化学的連結に適当であるリンカーにはジスルフィド結合、チオエーテル結合、ヒンダードジスルフィド結合ならびにアミンおよびチオール基のような遊離反応性基間の共有結合が含まれる。
【０１３２】
切断可能なリンカー
リンカーは選択条件下で切断されるように可逆的な連結を提供することができる。とりわけ光切断可能なリンカー（米国特許第５６４３７２２号参照）、酸切断可能なリンカー（Fattom et al., Infect. Immun. ６０：５８４−５８９（１９９２）参照）、酸不安定性リンカー（Welhoener et al., J. Biol. Chem. ２６６：４３０９−４３１４（１９９１）参照）および熱感受性リンカーを含む選択的に切断可能なリンカーが有用である。連結は例えばメルカプトエタノールもしくはジチオエリスロールにより化学的に切断可能であるジスルフィド結合；光切断可能にできるビオチン／ストレプトアビジン連結；酸性条件に暴露することにより、もしくはＭＳ条件下で切断することができるトリチルエーテル基のヘテロ二機能性誘導体（Koester et al, Tetrahedron Lett. ３１：７０９５（１９９０）参照）；ヒドラジニウム／酢酸バッファーを用いてほぼ中性の条件下で切断できるレブリニル媒介連結；そのいずれかをトリプシンのようなエンドペプチダーゼにより切断することができるアルギニン−アルギニンもしくはリジン−リジン結合；ピロホスファターゼにより切断することができるピロリン酸結合；またはリボヌクレアーゼを用いて、もしくはアルカリ条件に暴露することにより切断することができるリボヌクレオチド結合でよい。３−アミノ−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸のような光解離性架橋を固体支持体からのポリペプチドの切断のための手段として用いることができる。Brown et al., Mol Divers, pp. ４−１２（１９９５）； Rothschild et al., Nucl. Acids. Res. ２４：３５１−６６（１９９６）；および米国特許第５６４３７２２号。その他のリンカーには、リボザイムおよびその他のＲＮＡ酵素により切断可能であるＲＮＡリンカー、ならびにヒトＩｇＧ１の定常領域からのＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３のような種々ドメインのようなリンカーが含まれる。Batra et al., Mol Immunol ３０：３７９−３９６（１９９３）参照。
【０１３３】
任意のリンカーの組み合わせもまた本明細書では意図される。例えばシリル連結または光切断可能な連結のようなＭＳ条件下で切断可能であるリンカーをこれらの条件下で切断されないが、別の条件下で切断され得るアビジンビオチン連結のようなリンカーと組み合わせることができる。酸不安定性結合は３−ＨＰＡマトリックス溶液の添加時に標的ポリペプチドのコンディショニングの間に切断されるので、酸不安定性リンカーは質量分析、特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのためにとりわけ有用な化学的に切断可能なリンカーである。酸不安定性結合を別個のリンカー基、例えば酸不安定性トリチル基として導入することができるか、またはジイソプロピルシリルを用いて一つもしくはそれより多いシリル橋を導入し、それによりポリペプチドと固体支持体との間にジイソプロピルシリル連結を形成することにより合成リンカーに組み込むことができる。１.５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または３−ＨＰＡ／１％ＴＦＡ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリックス溶液のような穏やかな酸性条件を用いてジイソプロピルシリル連結を切断することができる。ジイソプロピルシリル連結およびその類似体の調製のための方法は当分野において周知である。例えばSaha et al., J. Org. Chem. ５８：７８２７−７８３１（１９９３）参照。
【０１３４】
ポリペプチドを固定するためのピンツールの使用
ピンツールを用いる目的のポリペプチドの固体支持体への固定が特に有利であり得る。ピンツールには本明細書で開示するもの、またはそれ以外の当分野において公知のものが含まれる。例えば米国出願番号第０８／７８６９８８号および第０８／７８７６３９号；および国際ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９８／２０１６６号参照。
【０１３５】
アレイ、例えば４X４アレイのピンツールを目的のポリペプチドを容れるウェルに適用することができる。ピンツールが各ピンチップ付着した官能基を有するか、または固体支持体例えば機能化ビーズもしくは常磁性ビーズが各ピンに付着している場合、ウェルのポリペプチドを捕捉することができる（最大能力１ピコモル）。捕捉工程の間、捕捉効率を高めるためにピンを動かし続けることができる（垂直方向、道程１−２ｍｍ）。インビトロ転写のような反応がウェル中で実施される場合、ピンの動きが反応の効率を高めることができる。ピンツールに電場を適用することによりさらに固定させることができる。電圧をピンツールに適用すると、ポリペプチドはその正味電荷に依存して陽極または陰極に付着する。
【０１３６】
さらに具体的には、目的のポリペプチドのみがピンに結合するようにピンツール（電圧を伴うかまたは伴わない）を、目的のポリペプチドに特異的な試薬をそこに抱合しているように修飾することができる。例えばポリヒスチジン配列を含有するポリペプチドのみが結合するように、ピンにニッケルイオンを付着させることができる。同様に、抗体に認識されるエピトープを含有する標的ポリペプチドのみがピンに結合するように、ピンはそこに付着した、または今度はピンに付着しているビーズに付着した、標的ポリペプチドに特異的な抗体を有することができる。
【０１３７】
例えばＵＶ／ＶＩＳ、ＩＲ、蛍光、化学発光、ＮＭＲ分光法、ＭＳもしくはその他の当分野において公知の方法、またはその組み合わせのような分光測定技術を含む種々の手段により捕捉したポリペプチドを分析することができる。条件が捕捉したポリペプチドの直接分析を妨げる場合、試料濃度の利点が失われないような条件下でポリペプチドをピンから遊離または移動させることができる。したがって、最小容量の溶出液を用いて、そして試料を何ら喪失することなく、ピンからポリペプチドを除去することができる。ポリペプチドがピンに付着したビーズに結合している場合、ポリペプチドを含有するビーズをピンから除去し、そしてビーズから直接測定することができる。
【０１３８】
ピンツールはアレイで空間的にアドレス指定可能な様式で目的のポリペプチドを固定するのに有用であり得る。かかる空間的にアドレス指定可能なまたはプレアドレス指定可能なアレイは例えば品質管理およびアミノ酸シークエンシング診断を含む種々の方法で有用である。米国出願番号第０８／７８６９８８号および第０８／７８７６３９号ならびに国際ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９８／２０１６６号に記載されるピンツールは固体支持体表面でポリペプチドのマルチエレメントアレイを作成するために用いることができる連続および並行分配用具である。アレイ表面は平坦でビーズを伴うか、またはビーズを含有できるウェルを含むように形状的に変化させることができる。加えてＭＳ形状をピンツール装置を収容するために適合させることができる。
【０１３９】
生物学的状況のその他の態様
本発明の種々の実施態様では、薬物および経路応答を得るために生物学的に活性な状況の態様、または混ざり合った態様を測定することができる。細胞機能の特徴付けに関係するタンパク質の活性を測定することができ、そして本発明の実施態様はかかる測定を基礎とすることができる。特徴付けされている特定の活性に適切な任意の機能的、生化学的または物理学的手段により活性測定を実施することができる。活性が化学的変換を伴う場合、細胞タンパク質を天然基質と接触させ、そして変換の速度を測定することができる。活性が多量体単位での関連性、例えば活性化されたＤＮＡ結合複合体とＤＮＡとの関連性を伴う場合、転写されたｍＲＮＡの量のような関連するタンパク質の量または関連性の二次的な結果を測定することができる。また、例えば細胞サイクル制御におけるような機能的活性のみが公知である場合、機能の実施を観察することができる。タンパク質活性の変化は公知でっても、測定されていても、本発明の方法により分析された応答データを形成する。代替えの、および非限定的な実施態様では、応答データは細胞の生物学的状況の混ざり合った態様の形態を為し得る。例えば特定のｍＲＮＡの存在量の変化、特定のタンパク質の存在量の変化および特定のタンパク質活性の変化から応答データを構築することができる。
【０１４０】
本発明の好ましい実施態様をさらに十分に説明するために以下の実施例を提示する。この実施例を添付の請求の範囲に定義されるように本発明の範囲を限定するとは決して解釈すべきではない。
【実施例】
【０１４１】
（実施例）
遺伝子ＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＡＣＡＣＢおよびＳＣＤ１における遺伝的多様性は北米白色人種の２型糖尿病に関連する
序文および要旨
この実施例の目的は疾患の同一性に関するバイオマーカーを提供することによりさらに正確に２型糖尿病を定義することである。かかるバイオマーカーはより良好な診療のために薬物標的を同定し、そして個体に合わせた医薬品に基づいてより効果的に患者を処置することを助ける。
【０１４２】
Ｔ２ＤＭ多型関連解析において用いられる集団の層
分析は１０００人を超える２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の参加者および１０００人を超える正常な対照からなった。ＵＳＡコレクションのみを用いて研究を行った。参加者は白色人種のみに限定され、中央および南アメリカからの参加者は排除された。
【０１４３】
糖尿病参加者のための研究基準
サーベイソース（ＵＳコレクションのみ）を用いて以下の基準を参加者選択に適用した：（１）糖尿病参加者は２型糖尿病を有するが、１型糖尿病を有さないことを確認した。（２）参加者の空腹時血糖レベルは少なくとも１回の測定で≧１４０ｍｇ／ｄｌであった。（３）ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨＢＡ１Ｃ）試験は少なくとも１回の測定で≧７であった。１００４人の糖尿病参加者がこれらの基準に合致した。糖尿病参加者の年齢は＞３０歳および≦８０歳であった。診断時の参加者の年齢もまた＞３０歳および≦８０歳であった。糖尿病参加者の肥満度指数（ＢＭＩ）は≧２５および≦４０であった。
【０１４４】
対照のための研究基準
対照に関しては以下の基準を適用した：対照は１型または２型糖尿病を有さなかった。１６０９人の対照参加者がこれらの基準に合致した。対照参加者の年齢は＞３０歳であった。対照参加者の肥満度指数（ＢＭＩ）は≧２５および≦４０であった。
【０１４５】
適合基準および症例対照比較
以下の基準を用いて糖尿病の症例および対照が一致した：（１）性別の正確な一致、（２）＋／−５歳の年齢の一致（すなわち糖尿病と対照との間の最大年齢差＝５歳）。（３）肥満度指数（ＢＭＩ）＋／−５単位の一致。最終的に糖尿病と対照との間の最大差＝４.９単位。各々の糖尿病参加者および対照から血液試料を収集した。
【０１４６】
一塩基多型遺伝子型分類
９個の遺伝子で全部で１１５個のＳＮＰの遺伝子型分類に成功した。ＯＭＩＭ、ＳＮＰコンソーシアム、Locus LinkおよびｄｂＳＮＰのようなデータベースからの情報を用いてＳＮＰアッセイを設計した。
【０１４７】
一塩基伸長、続いてSequenom’s MassArray（商標）テクノロジーを用いる質量分析により全てのＳＮＰの遺伝子型分類を実施した。Ross et al., Nat. Biotechnol. １６：１３４７−１３５１（１９９８）。この系での遺伝子型の確認は均一な質量増加（homogenous Mass Extension）（ｈＭＥ）反応生成物のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析に基づく。ｈＭＥ反応の間、プライマーはＳＮＰアレルに依存して特定数のヌクレオチドおよびＳＮＰのすぐ３’の数個の塩基により伸長する。伸長は所定のアレルに一致する３個のジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）のいずれか一つを組み込むことにより停止するか、または対立のアレルに一致する１個のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を用いて持続される。したがってｈＭＥ反応は異なる質量（ダルトン）のアレル特異的伸長生成物を生成する。これらのｈＭＥ生成物の質量差に基づいて多くの異なるアッセイを同時に行うことができ（マルチプレックス）、それにより費用効率が高く、そして高処理の遺伝子型分類が提供される。各々の質量特異的ピークはマルチプレックスで各ＳＮＰからの二つの伸長生成物の公知の配列に基づいて特異的アレルと称される。過程を通じてバーコード化された追跡を用いて自動化することにより全遺伝子型分類過程を支援する。最終的な遺伝子型データは承認され、そしてプラットフォーム系から最終統計分析のためのデータベースに移される。組み合わされた保守的および適度なコールの通過率が９５％よりも大きいかまたはそれに等しく、そして公称ＨＷＥ ｐ値が０.０１またはそれより高い場合、遺伝子型データは所定のアッセイで通用すると考えられる。
【０１４８】
検定した全ＳＮＰのリストを表２に記載する。
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【０１４９】
ＳＮＰ関連性検定に関する統計方法、単一マーカー関連性検定
見せかけの状態とマーカーの各々との間の関連性の検定をアレル頻度および遺伝子型頻度の双方に基づいて実施した。アレル頻度測定のために、二つの見せかけの群の各アレルの観察された数をまとめた分割表を自由度（ｄｆ）１のｘ２検定と関連性のない帰無仮説からの期待値と比較した。少なくとも一つのスパースマージン(sparse margin)（観測数＜１０）を有する分割表では代わりにフィッシャーの正確確率検定を使用した。同様に遺伝子型に基づく関連性に関しては、２ｄｆのｘ２検定、または少なくとも一つのスパースマージンを有する分割表に関するフィッシャーの正確確率検定を用いて二つの見せかけの群の遺伝子型の数を、疾患と遺伝学との関連性がない期待値と比較した。加えて遺伝の劣勢または優勢様式から誘導される遺伝子型基盤の関連性を検出するために、観察されたデータに関する分割表の構築において、ヘテロ接合型遺伝子型の数をメジャーまたはマイナーアレルの各々に関するホモ接合型遺伝子型の数と比較した。再度１ｄｆのｘ２検定、またはフィッシャーの正確確率検定のいずれかを用いて、遺伝の特異的モデルを示す見せかけの状況と関連性のない帰無仮説からの偏差を評価した。
【０１５０】
アレル基盤および遺伝子型基盤の双方の仮説検定に関しては、Westfall P & Young S, Resampling−based multiple testing： examples and methods for p−value adjustment（Wiley, New York, １９９３）p. ３４０の標準的な再抽出手順により分析分布からの有意性を確認した。帰無仮説を推定するために検定統計を、少なくとも５０００のシミュレーションデータセットに関してコンピューター処理したが、その各々は置き換えなしに無作為に抽出することにより対象に再割り当てされた見せかけの状態を有するが、元来のデータからの遺伝子型割り当てを保存している。関連性の有意性をさらに評価するために、またシミュレーション帰無分布を用いてマーカーに関して補正されたｐ値をコンピューター処理した。ＳＮＰの各群（すなわち単一の遺伝子の全てのＳＮＰまたは全てのシングルトンＳＮＰを一緒に）は複数の仮説の別個のセットと見なされた。各群に関して最良のマーカーの統計を、補正されたｐ値を推定するために再抽出されたデータから誘導される最大値分布と比較した。各群の残りのマーカーの統計に関して、被験マーカーｐ値より大きいかまたはそれと等しい未補正ｐ値を有したこれらのマーカーのみを含有する元来の群からのマーカーのサブセットの再抽出されたデータから推定された最大値分布との比較から補正ｐ値を誘導した。時には最大値に関するこれらの入れ子型帰無分布が、その未補正のものと同一の方式で指定されなかった補正ｐ値を生じた。これらのマーカーに関して、最も近く、より小さい未補正ｐ値を有するマーカーに関する補正ｐ値に等しい補正ｐ値を設定することにより単調性を課した。Westfall P & Young S, Resampling−based multiple testing： examples and methods for p−value adjustment（Wiley, New York, １９９３）p. ３４０； Schaid DJ et al., Am. J. Hum. Genet. ７０（２）：４２５−３４（２００２）参照。
【０１５１】
遺伝子型分類の特質を評価するために、および分析した集団の潜在的層構造を検出するために、各ＳＮＰに関して観察された遺伝子型頻度を１ｄｆのｘ２検定によりサンプルから推定されたアレル頻度に基づくハーディワインベルグ期待値と比較した。
【０１５２】
この分析ではＲ統計パッケージ（Becker R et al., The new S language：A programming environment for data analysis and graphics（Wadsworth & Brooks／Cole Advanced Books, Pacific Grove, １９８８）p. ７０２）およびハプロタイプブロック構造の分析にはハプロビュー（Barrett JC et al., 「Haploview：analysis and visualization of LD and haaplotype maps」 Bioinformatics（２００４））を使用した。
【０１５３】
ハプロタイプ分析
バイナリ形質（binary trait）に関する推奨されるパラメーターを用いてＲのhaplo.statsパッケージのhaplo.scoreプログラムを用い全てのハプロタイプ関連解析を実施したBecker R, Chambers J & Willks A, The new S language： a programming environment for data analysis and graphics（Wadsworth & Brooks／Cole Advanced Books, Pacific Grove, １９８８）p. ７０２； Schaid DJ et al., Am. J. Hum. Genet. ７０（２）：４２５−３４（２００２）参照。haplo.score はＥＭアルゴリズムを用いて遺伝子型からハプロタイプを推測し、そして遺伝子座での個体のハプロタイプおよびハプロタイプの全セットの双方に関して形質との関連性を検定する。双方の検定に関する関連性の有意性を分析分布から、および再抽出による実証的帰無分布から決定し、実証的分布は前記したような最も密接に関連したハプロタイプに関する最大値統計を評価するためにも使用した。haplo.scoreの使用説明書は、遺伝子型データを欠いている対象はハプロタイプ推論を劇的に劣化させると警告しており、そして我々の経験によりこの注意はさらに強調された。とりわけ遺伝子ＡＣＡＣＢに関するhaplo.scoreでのハプロタイプ推論および完全なデータは、遺伝子座を２個の群（ＳＮＰ Ｔ２７４５６Ｃ−Ａ７０９４１ＧおよびＡ７１４３４Ｇ−Ａ１３６１７８Ｇ）に分けなければ集まらず、そして次にさらにパラメーターをそのデフォルト設定から変化させなければならなかった。とりわけ基準パラメーター「挿入バッチサイズ」はそのデフォルト設定の６から下げなければならなかった（表３参照）。したがって各遺伝子に関して、全データセットのみならず全ＳＮＰに関する、およびプログラムハプロビューによるブロック構造から決定されるような主要なハプロタイプ多様性を捕捉すると推測された「タグ」ＳＮＰの数の低下に関する完全な遺伝子型情報を有した個体のサブセットまでにも分析を実施した。「タグ」ＳＮＰ法は、いくつかの遺伝子型データを欠いている個体を含むＳＮＰの全てを用いるハプロタイプ推論と、完全なデータを有する個体のみを含むＳＮＰの全てを用いるハプロタイプ推論との間の妥協を示す。異なる分析の様式での適格な対象の数に関しては表３を参照されたい。
【０１５４】
【表１４】
【表１５】
【０１５５】
ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）関連性
遺伝子ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）における遺伝的多様性は２型糖尿病と関連する。３個の遺伝子型（相互優勢モデル）全てを用いる遺伝子型分析により、遺伝子型分類された１４個のＳＮＰのうち３個のＳＮＰ（ｒｓ３８７０７４７、ｒｓ７８４９およびｒｓ１３９３４９１）が糖尿病表現型と統計的に有意な関連性を示した（Ｐ＜０.０５）。
【０１５６】
ＳＣＤは不飽和脂肪酸の合成および脂質生成における律速段階を触媒する。ＳＣＤの主要な生成物はオレイン酸であり、それはステアリン酸の不飽和化により形成される。遺伝的肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ）の肝臓の転写プロファイリングの分析により、レプチンはＳＣＤ１のＲＮＡレベルおよび酵素活性を特異的に抑制することが示された。Ｓｃｄ１を欠くマウスはやせて、そして代謝亢進状態であり；Ｓｃｄ１に変異を有するｏｂ／ｏｂマウスはｏｂ／ｏｂ対照よりも有意に肥満が少なく、そしてエネルギー消費が著明に増加していた。ＳＣＤ１に変異を有するｏｂ／ｏｂマウスは組織学的に正常な肝臓を有し、トリグリセリド貯蔵およびＶＬＤＬ生成が有意に低下していた。ＳＣＤ１欠損の主な結果はトリグリセリド合成および貯蔵の低下に加えて脂質酸化の活性化であると仮定される。Cohen P et al., Science ２９７：２４０−２４３（２００２）。
【０１５７】
したがってＳＣＤ阻止は肥満、インスリン抵抗性、脂肪肝疾患およびＴ２ＤＭを処置するための有望な研究法である。
【０１５８】
表４はこの分析に用いたＳＣＤ ＳＮＰをまとめている。３個の遺伝子型（相互優勢モデル）全てを用いる遺伝子型分析により、遺伝子型分類に成功した１４個のうち３個のＳＮＰ（ｒｓ３８７０７４７、ｒｓ７８４９およびｒｓ１３９３４９１）が糖尿病表現型と統計的に有意な関連性を示した（Ｐ＜０.０５）。表は対照および糖尿病患者における各ＳＮＰの頻度ならびに二つの関連解析方法（アレルによるものおよび遺伝子型によるもの）を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるハーディワインベルグ平衡（ＨＷＥ）はｒｓ３８７０７４７を除く、これらのＳＮＰのうちの２個に関して良好である。
【０１５９】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【０１６０】
要約すれば、我々の結果により複数のＳＣＤバリアントがＴ２ＤＭに関与することが示唆される。これらのＳＮＰを用いてＴ２ＤＭ診断を改善し、患者のより良好な階層化により臨床試験設計を助けることができる。
【０１６１】
肝細胞核因子１β（ＨＮＦ１α、ＨＮＦ２、ＴＣＦ２）関連性
アレル特異的分析（ｐ＜０.０１）ならびに優性および劣性双方のモデルを用いる遺伝子型分析（ｐ＜０.０５）の双方によりＳＮＰ ｒｓ１１６５１７５５のＧアレルはＴ２ＤＭの高い出現率と関連する。
【０１６２】
転写因子肝細胞核因子１β（ＨＮＦ１β、ＨＮＦ２、ＴＣＦ２）を含有するホメオドメインにおける変異は、しばしば早期発症型進行性非糖尿病性腎機能障害に関連する若年発症成人型糖尿病のまれなサブタイプを引き起こすことがわかっている。 Horikawa Y et al.,（Letter）Nature Genet. １７：３８４−３８５（１９９７）。ＴＣＦ２はまた２型糖尿病のより一般的な形態に関する可能性のある候補遺伝子であろうと仮定された。
【０１６３】
ＴＣＦ２のイントロン領域内に位置するＳＮＰ ｒｓ１１６５１７５５をこの分析に使用した。配列番号：１６６は周辺配列内のバリアントの正確な位置を示す：ＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＡＧＴＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣＣＧＴＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣＡＣＴＡＡＣＣＴＣＲ（Ａ／Ｇ）ＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＴＧＡＧＧＴＧＴＡＣＣＧＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＧＧＣＣＴＣＡＴＧＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡＧＴＴＧＴＡＧＣＴＴＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＧＡＣＣＡＴＡＧＧＴＡＧＣＡＣＣＣＣＣＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＣＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＡＡＣＣＡＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＣＴＡＧＴＧＡＧＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号：１６６）。
【０１６４】
表５は結果をまとめている。Ｇに関する全体のアレル頻度は非糖尿病患者の４８.０８％と比較して糖尿病患者で５２.６４％である。アレル特異的分析（ｐ＜０.０１）ならびに３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）および優性および劣性のモデルのいずれかを用いる遺伝子型分析（ｐ＜０.０５）の双方によりＧアレルはＴ２ＤＭの高い出現率と関連する。
【０１６５】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【０１６６】
この分析により、ＭＯＤＹ５におけるその重要な役割に加えて、ＴＣＦ２はＴ２ＤＭのより一般的な形態に関する病因に関与することが示される。
【０１６７】
エストロゲン関連受容体α（ＥＳＲＲＡ）関連性
アレル特異的分析ならびに３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）および優性モデルを用いる遺伝子型分析の双方によりＳＮＰ（ｇｓ２２９６０１６２３およびｒｓ１１６００９９０）がＴ２ＤＭとの関連性を示した（ｐ＜０.０５）。３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）および優性モデルを用いる遺伝子型分析によりＳＮＰ ｒｓ２２７６０１４はＴ２ＤＭの高い出現率と関連する（ｐ＜０.０５）。
【０１６８】
ＥＳＲＲＡは腎臓、心臓および褐色脂肪細胞、脂肪酸を優先的に代謝する全ての組織で高度に発現されるオーファン核受容体転写因子である。ミトコンドリア発生およびインビボでの細胞エネルギー平衡を調節するのに重要な役割を果たすと仮定されている。インスリン抵抗性は骨格筋におけるトリグリセリド沈着と組織の脂肪酸酸化能力との間の不均衡の結果として発達し得る。この能力は組織ミトコンドリア密度に直接的に依存する。したがってミトコンドリア発生の刺激による骨格筋ミトコンドリア密度の上昇は脂肪酸酸化能力を高め、インスリン感受性の改善に至ると予測される。
【０１６９】
したがってＥＳＲＲＡ刺激は肥満、脂質代謝異常、インスリン抵抗性およびＴ２ＤＭを処置するための有望な研究法である。
【０１７０】
表６はこの分析に用いたＥＳＲＲＡ ＳＮＰをまとめている。３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）または優性モデルを用いる遺伝子型分析により３個のＳＮＰ（ｇｓ２２９６０１６２３、ｒｓ２２７６０１４およびｒｓ１１６００９９０）がＴ２ＤＭとの関連性（を示したｐ＜０.０５）。アレル特異的分析によりこれら３個のＳＮＰのうちの２個（ｇｓ２２９６０１６２３およびｒｓ１１６００９９０）もまたＴ２ＤＭと関連性を示した（ｐ＜０.０５）。表は対照および糖尿病患者における各ＳＮＰの頻度および二つの関連解析方法を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるＨＷＥはこれらのＳＮＰに関して良好である。
【０１７１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【０１７２】
要約すれば、我々の結果により複数のＥＳＲＲＡバリアントがＴ２ＤＭの発達に寄与しているかもしれないことが示唆される。これらのＳＮＰおよびハプロタイプを用いてＴ２ＤＭ診断を改善し、患者のより良好な階層化により臨床試験設計を助けることができる。
【０１７３】
ＥＳＲＲＡハプロタイプ分析
加えて、ＥＳＲＲＡゲノム領域内の１個のハプロタイプ（ｈａｐ３）との有意な関連性（ｐ＜０.０５）もまた見出された。二つのハプロタイプ関連性方法をこの分析に使用した：Global ｐおよびMax−Stat ｐ（表３および表７参照）。
【０１７４】
【表２５】
【表２６】
【０１７５】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマコアクチベーター１α（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ；ＰＧＣ−１α）関連性
アレル特異的分析および３個の表現型全てを用いるかまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析により２個のＳＮＰ（ｒｓ２３０５６８３およびｒｓ４４６９０６４）がＴ２ＤＭとの関連性を示した（ｐ＜０.０５）。３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）を用いる遺伝子型分析により１個のさらなるＳＮＰ（ｒｓ１５３２１９５）がＴ２ＤＭのより高い出現率と関連する（ｐ＜０.０５）。
【０１７６】
ＰＧＣ１αは脱共役タンパク質２（Ｕｃｐ２）の誘導により、ならびに核呼吸因子、Ｎｒｆ１およびＮｒｆ２の調節により、マウスの筋肉細胞においてミトコンドリア生合成および呼吸を刺激する。Wu Z et al., Cell ９８：１１５−１２４（１９９９）。それは肝臓でインスリン調節される糖新生において重要な役割を果たす。Yoon JC et al., Nature ４１３：１３１−１３８（２００１）。
【０１７７】
マイクロアレイ発現研究により、ヒト糖尿病の筋肉における酸化的リン酸化に関与する遺伝子のセットの発現の少しであるが協調的な低下が示された。これらの遺伝子の発現はインスリン媒介の糖処理の部位で高く、ＰＧＣ１αにより活性化され、そして全身有酸素容量と相関する。ＰＧＣ１α発現は糖尿病患者では低い。Mootha VK et al., Proc Natl Acad Sci U S A. １０１（１７）：６５７０−５（April ２７, ２００４）。
【０１７８】
これらのデータにより、ＰＧＣ−１αはヒトＴ２ＤＭの発達において重要な役割を果たし、そしてＰＧＣ−１α媒介の酸化的リン酸化経路の改善が糖尿病を処置するための可能性のある研究法であることが示唆される。
【０１７９】
表８はこの分析で用いたＰＧＣ−１α ＳＮＰをまとめている。アレル特異的分析および３個の表現型全てを用いるかまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析により２個のＳＮＰ（ｒｓ２３０５６８３およびｒｓ４４６９０６４）がＴ２ＤＭとの関連性を示した（ｐ＜０.０５）。３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）を用いる遺伝子型分析により１個のさらなるＳＮＰ（ｒｓ１５３２１９５）がＴ２ＤＭのより高い出現率と関連する（ｐ＜０.０５）。表はまた対照および糖尿病患者における各ＳＮＰのアレル頻度および二つの関連解析方法を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるＨＷＥはｒｓ１５３２１９５を除くこれらの２個のＳＮＰに関して良好である。
【０１８０】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【０１８１】
要約すれば、複数のＰＧＣ−１αバリアントがＴ２ＤＭと関連している。これらのＳＮＰおよびハプロタイプを用いてＴ２ＤＭ診断を改善し、患者のより良好な階層化により臨床試験設計を助けることができる。
【０１８２】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体δ（ＰＰＡＲＤ）関連性
アレル特異的分析および３個の遺伝子型全てまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析によりＳＮＰ ｒｓ１０５３０４６はＴ２ＤＭとの関連性を示した（ｐ＜０.０１）。アレル特異的分析により４個のさらなるＳＮＰ（ｒｓ１１５７１５０４、ｒｓ９２９６１４８、ｒｓ９６５８１００およびｒｓ３７９８３４３）がＴ２ＤＭとの関連性を示し（ｐ＜０.０５）、そのうちの３個（ｒｓ１１５７１５０４、ｒｓ９２９６１４８、ｒｓ９６５８１００）はまた３個の遺伝子型全ておよび優性モデルを用いる遺伝子型分析により関連性を実証した（ｐ＜０.０５）。
【０１８３】
ＰＰＡＲＤは、ＰＰＡＲ−アルファ、ＰＰＡＲ−ガンマおよびＰＰＡＲ−デルタを含むペルオキシソーム増殖剤活性化受容体転写因子スーパーファミリーに属する。ＰＰＡＲ−アルファおよびＰＰＡＲ−ガンマは種々の脂肪酸および抗高脂血症化合物により活性化されることが示されており、そしてヒトＰＰＡＲＤおよびマウスＰＰＡＲＤはＣ１８不飽和脂肪酸により活性化されることがわかっている。ＰＰＡＲは身体の脂質代謝の重要なメディエーターである。
【０１８４】
中年のインスリン抵抗性肥満アカゲザルを選択的ＰＰＡＲＤアゴニストであるＧＷ５０１５１６で処置することにより血清高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの劇的な用量依存性の上昇が引き起こされるが、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、空腹時トリグリセリドおよび空腹時インスリンのレベルは低下する。Oliver WR Jr et al., Proc Natl Acad Sci U S A. ９８（９）：５３０６−１１（April ２４, ２００１）。高脂肪食を与えられたマウスおよび遺伝的肥満ｏｂ／ｏｂへのアゴニストの投与により肥満、糖尿病およびインスリン抵抗性が改善された。Tanaka T et al., Proc Natl Acad Sci U S A. １００（２６）：１５９２４−９（December ２３, ２００３）。
【０１８５】
したがってＰＰＡＲＤの刺激は肥満、脂質代謝異常、インスリン抵抗性およびＴ２ＤＭを処置するための有望な研究法である。
【０１８６】
表９はこの分析で用いたＰＰＡＲＤ ＳＮＰをまとめている。アレル特異的分析および３個の遺伝子型全てまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析により遺伝子型分類に成功した２４個のＳＮＰのうちＳＮＰ ｒｓ１０５３０４６がＴ２ＤＭとの関連性を示した（ｐ＜０.０１）。アレル特異的分析により４個のさらなるＳＮＰ（ｒｓ１１５７１５０４、ｒｓ９２９６１４８、ｒｓ９６５８１００およびｒｓ３７９８３４３）がＴ２ＤＭとの関連性を示し（ｐ＜０.０５）、そのうちの３個（ｒｓ１１５７１５０４、ｒｓ９２９６１４８、ｒｓ９６５８１００）もまた３個の遺伝子型全ておよび優性モデルを用いる遺伝子型分析により関連性を実証した（ｐ＜０.０５）。表はまた対照および糖尿病患者における各ＳＮＰのアレル頻度および二つの関連解析方法を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるＨＷＥはこれらのＳＮＰに関して良好である。
【０１８７】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【０１８８】
要約すれば、我々の結果により複数のＰＰＡＲＤバリアントがＴ２ＤＭの発達に寄与しているかもしれないと示唆される。これらのＳＮＰおよびハプロタイプを用いてＴ２ＤＭ診断を改善し、患者のより良好な階層化により臨床試験設計を助けることができる。
【０１８９】
ＰＰＡＲＤハプロタイプ分析
加えて、ＰＰＡＲＤゲノム領域内の１個のハプロタイプとの有意な関連性もまた見出された（ｐ＜０.０１）。二つのハプロタイプ関連性方法をこの分析に使用した：Global ｐおよびMax−Stat ｐ（表３および表１０参照）。
【０１９０】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【０１９１】
ＡＣＡＣＢハプロタイプ分析
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼベータ（ＡＣＣ−ベータ）は、マロニル−ＣｏＡのカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ１Ａ）を阻止する能力を用いる脂肪酸酸化、脂肪酸取り込みにおける律速段階およびミトコンドリアによる酸化を制御すると仮定される。ＡＣＣベータは主に心臓および骨格筋において発現される。
【０１９２】
Abu−Elheiga et al., Science ２９１（５５１３）：２６１３−６（２００１）は標的破壊によりＡＣＣ２を欠損するマウスを作成した。Ａｃｃ２−／−変異マウスは正常な寿命、高い脂肪酸酸化率、および低い脂肪量を有する。野生型と比較して、ＡＣＣ２欠損マウスの心臓および筋肉でマロニル−ＣｏＡのレベルは各々１０倍および３０倍低かった。Ａｃｃ２−／−マウスのヒラメ筋における脂肪酸酸化率は野生型マウスのものよりも３０％高く、そしてインスリンの添加により影響されなかったが、インスリンの野生型筋肉への添加は脂肪酸酸化を４５％まで低下させた。変異マウスのその脂肪組織における脂肪蓄積は野生型マウスよりも５０％少なかった。
【０１９３】
したがってＡＣＡＣＢ阻止は肥満、インスリン抵抗性、脂肪肝疾患およびＴ２ＤＭを処置するための有望な研究法である。
【０１９４】
個々のＳＮＰはほとんどないかまたは極弱い証拠しか提供しないが、ＡＣＡＣＢゲノム領域内の８個のハプロタイプでは糖尿病との有意な関連性が見出された：ｈａｐ１、ｐ＜０.００１；ｈａｐ２、３、３０、３１、３２、３３および３４、ｐ＜０.０５。二つのハプロタイプ関連性方法をこの分析に使用した：Global ｐおよびMax−Stat ｐ（表１１）。
【０１９５】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【０１９６】
要約すれば、我々の結果によりＡＣＡＣＢにおける変化がＴ２ＤＭと関連することが示唆される。これらのＳＮＰおよびハプロタイプを用いてＴ２ＤＭ診断を改善し、患者のより良好な階層化により臨床試験設計を助けることができる。
【０１９７】
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤＳＢ）関連性
アレル特異的分析および／または優性および劣性双方のモデルを用いる遺伝子型分析により、分析した１３個のＳＮＰのうちの１個がＴ２ＤＭの高い出現率と関連する（ｐ＜０.０５）。
【０１９８】
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤ）は脂肪酸または分岐したアミノ酸の代謝に関与するミトコンドリア酵素の一群である。ＡＣＡＤＳＢは短い分岐鎖アシル−ＣｏＡ誘導体、（Ｓ）−２−メチルブチリル−ＣｏＡに対して最も強い活性を有したが、その他の２−メチル−分岐鎖基質と、および短い直鎖アシル−ＣｏＡともまた有意に反応した。脂肪酸および脂質代謝の調節異常は肥満および２型真性糖尿病の原因論において重要であることは十分に確立されている。
【０１９９】
表１２はこの研究で使用したＡＣＡＤＳＢ ＳＮＰをまとめている。アレル特異的分析および３個の遺伝子型全てを用いるかまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析により遺伝子型分類および分析に成功した１３個のＳＮＰのうち１個のＳＮＰ（ｒｓ２４２１１６６）がＴ２ＤＭの高い出現率と関連することが示された（ｐ＜０.０５）。表は全体、対照および糖尿病患者における各ＳＮＰの頻度、集団のハーディワインベルグ平衡分析（ＨＷＥ）ならびに二つの関連解析方法を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるＨＷＥはこれらのＳＮＰに関して良好である。
【０２００】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【０２０１】
カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＡ（ＣＰＴ１Ａ）関連性
アレル特異的分析および／または優性および劣性双方のモデルを用いる遺伝子型分析により、分析した２０個のＳＮＰのうちの１個がＴ２ＤＭの高い出現率と関連する（ｐ＜０.０５）。
【０２０２】
ＣＰＴ１Ａ遺伝子は脂肪酸酸化に関与する肝臓酵素であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＡをコードする。脂肪酸酸化過程にわたる主要な制御はＣＰＴ Ｉのレベルで決定され、その活性は今度は細胞内の高レベルのマロニル−ＣｏＡ濃度により阻止される。脂肪酸および脂質代謝の調節異常は肥満および２型真性糖尿病の原因論において重要であることは十分に確立されている。
【０２０３】
表１３はこの研究で使用したＣＰＴ１Ａ ＳＮＰをまとめている。アレル特異的分析および３個の遺伝子型全てを用いるかまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析により遺伝子型分類および分析に成功した２０個のＳＮＰのうち１個のＳＮＰ（ｒｓ１０１７６４１）がＴ２ＤＭの高い出現率と関連することが示された（ｐ＜０.０５）。表は全体、対照および糖尿病患者における各ＳＮＰの頻度、集団のハーディワインベルグ平衡分析（ＨＷＥ）ならびに二つの関連解析方法を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるＨＷＥはこれらのＳＮＰに関して良好である。
【０２０４】
【表４３】
【表４４】
【表４５】
【０２０５】
等価物
本発明の一つもしくはそれより多い実施態様の詳細を伴う前記の記載において示す。本明細書に記載したものに類似するかまたは等価である任意の方法および材料を本発明を実施または試験するのに用いることができ、好ましい方法および材料をここで記載する。本発明のその他の特徴、目的および利点は記載および請求の範囲から明白であろう。本明細書および添付の請求の範囲では、局面が明確にそれ以外を指示する場合を除いて単数の形態は複数の指示対象を含む。別に定義されない場合、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。各個々の出版物、特許または特許出願は全目的のためにその全てを出典明示により本明細書の一部とすると具体的および個別に示されたかのように、本明細書に引用した全ての参照はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
【０２０６】
本発明は本出願に記載した特定の実施態様の用語に限定されるものではなく、それは本発明の個々の態様の個別の説明として意図される。当業者に明白であるように、その精神および範囲から逸脱することなく本発明の多くの修飾および変化を為すことができる。本明細書に列挙したものに加えて、本発明の範囲内である機能的に等価な方法および装置は前記の記載から当業者には明白であろう。かかる修飾および変化は添付の請求の範囲内に入ると意図される。本発明は添付の請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきであり、かかる請求の範囲が資格を有する等価物の全範囲も同様である。
【０２０７】
ＧＣＩ ＳＮＰリスト−ＳＮＰの５００ｂｐ上流および下流の配列
＞４|２３５１８０１２|rs１００３２７９５
【０２０８】
【表４６】
【０２０９】
【表４７】
【０２１０】
【表４８】
【０２１１】
【表４９】
【０２１２】
【表５０】
【０２１３】
【表５１】
【０２１４】
【表５２】
【０２１５】
【表５３】
【０２１６】
【表５４】
【０２１７】
【表５５】
【０２１８】
【表５６】
【０２１９】
【表５７】
【０２２０】
【表５８】
【０２２１】
【表５９】
【０２２２】
【表６０】
【０２２３】
【表６１】
【０２２４】
【表６２】
【０２２５】
【表６３】
【０２２６】
【表６４】
【０２２７】
【表６５】
【０２２８】
【表６６】
【０２２９】
【表６７】
【０２３０】
【表６８】
【０２３１】
【表６９】
【０２３２】
【表７０】
【０２３３】
【表７１】
【０２３４】
【表７２】
【０２３５】
【表７３】
【０２３６】
【表７４】
【０２３７】
【表７５】
【０２３８】
【表７６】
【０２３９】
【表７７】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般にインビトロでの組織試料の分析試験およびさらに特に２型真性糖尿病の指標である遺伝子多型の態様に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）はアメリカ人だけでおよそ１６００万人が罹患する糖尿病の一般的な形態である。Ｔ２ＤＭは患者集団の急激な増加ならびに多くの加齢性障害およびその合併症とのその関連性のために非常に大きな公衆衛生上の問題になりつつある。Amos AF et al., Diabet. Med. １４ Suppl ５：Ｓ１−８５（１９９７）。Ｔ２ＤＭはその発症に遺伝的および環境的な双方の因子が寄与し、起源的に多因子性である。しかしながら、疾患およびその処置の我々の理解は限定的で、そして満足のいくものではない。
【０００３】
２型真性糖尿病を含む疾患の診断および処置に対する従来の医学的研究法は臨床データだけに基づくか、または診断試験と組み合わせて行われる。かかる伝統的な実践はしばしば処方された薬物治療の効果に、または個体対象の副作用の可能性を最低にするのに最適ではない治療選択に至る。
【０００４】
治療特異的診断（治療的診断法とも称される）は新たな医療テクノロジー分野であり、これは疾患を診断し、正確な処置計画を選択し、そして対象の応答をモニタリングするのに有用な試験を提供する。換言すれば、治療的診断法は個体対象における薬物応答を予測および評価する、すなわち個別化医療に有用である。治療的診断試験はまた特に処置の恩恵を受ける可能性のある処置の対象を選択するか、または個体対象における処置の効果の早期のおよび客観的な指標を提供するのにも有用であり、そして遅延を最低限にして処置を変更することができる。
【０００５】
特定の薬物に対する応答と個体患者の遺伝的プロフィールとの間の相関性を確立する遺伝薬理学的の進歩は新しい治療的診断研究法の発達の基礎である。そのために当分野では遺伝子配列および遺伝子発現における患者間の変化を評定する必要がある。遺伝子プロファイリングの一般的な形態は一塩基多型（「ＳＮＰ」）と称されるＤＮＡ配列の変化の同定に依存し、これは疾患感受性、疾患の進行および個体の薬物応答における患者間の変化に至るか、またはそれに相関する遺伝子変異の一つの型である。当分野においてしたがって疾患感受性、進行、薬物応答性、副作用または最適用量に関連する対象の遺伝子型を同定するのに有用であるＳＮＰのような遺伝的多様性を同定および特徴づける必要があることになる。加えて、ＳＮＰおよびハプロタイプ（一つの染色体上に存在する密接に連関する遺伝子マーカーのセット、この局面ではＳＮＰ）を用いて患者の改善の階層化によりより良好な臨床試験を設計することができる。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は当分野における必要性に対応するものを提供する。ＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１における一塩基多型（ＳＮＰ）と糖尿病との間で重要な関連性が同定され、観察された。加えてＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤおよびＡＣＡＣＢのハプロタイプと糖尿病との間の重要な関連性もまた同定された。これらのＳＮＰおよびハプロタイプは２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の診断の改善およびより良好な患者の階層化による臨床試験の設計に有用である。
【０００７】
したがって本発明は個体の２型糖尿病を診断するための方法を提供する。個体の遺伝子型はＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１から選択される遺伝子において決定される。２型糖尿病に対する素因の指標であるＳＮＰが見いだされた場合、次いで個体は２型糖尿病に対する素因を有するとして診断される。
【０００８】
本発明はまたＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤまたはＡＣＡＣＢから選択される遺伝子における個体のハプロタイプを決定することにより、個体における２型糖尿病を診断するための方法をも提供する。２型糖尿病に対する素因の指標であるハプロタイプが見いだされた場合、次いで個体は２型糖尿病に対する素因を有するとして診断される。
【０００９】
本発明はさらに個体の２型糖尿病を処置するための治療的診断方法を提供する。２型糖尿病を有することが疑われる個体の遺伝子型またはハプロタイプを決定する。遺伝子型またはハプロタイプが、２型糖尿病を有することが疑われる個体が２型糖尿病を有するための素因を有することを示した場合、次いで個体は適当な抗糖尿病薬またはその他の治療で処置される。
【００１０】
本発明は、個体が抗糖尿病薬の研究に含まれるべきかどうかを決定するための方法を提供する。研究に含める候補の遺伝子型またはハプロタイプを決定する。遺伝子型またはハプロタイプが、候補が２型糖尿病を有するための素因を有することを示した場合、次いで個体は研究に含められる。遺伝子型またはハプロタイプが、候補が２型糖尿病を有するための素因を有さないことを示した場合、次いで個体は研究に含められないか、さもなければ対照として含められるかのいずれかである。
【００１１】
本発明はまた本発明の方法において使用するためのキットをも提供する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
Ｔ２ＤＭの種々の候補遺伝子の可能な役割を調べるために、民族的背景（白色人種）、性別、年齢（＋／−５歳）および肥満度指数（ＢＭＩ）（＋／−単位）が適合する１０００人を超える２型糖尿病の参加者および１０００人を超える対照に関して分析を実施した。ＳＮＰは公共データベースから選択されるか、または選択された遺伝子のゲノム領域の直接的なシークエンシングにより内部で開発された。ＳＮＰは各遺伝子（ＡＣＡＤＳＢ、ＡＣＡＣＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１）の全ゲノム領域にわたり少なくとも５ｋｂの平均間隔で空間があった。ＴＣＦ２に関しては、分析用に数個の候補ＳＮＰのみが文献から選択された。ＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１のＳＮＰと糖尿病との間に有意な関連性が観察された。加えて、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤおよびＡＣＡＣＢのハプロタイプと糖尿病との間にも有意な関連性が観察された。
【００１３】
本発明の実質的な理解を提供するために、本発明の特定の態様、様式、実施態様、変化および特徴を種々のレベルの詳細さで記載することは理解されよう。一般にかかる開示は、それを必要とする対象の診断および処置に有用なＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１のＳＮＰを含む遺伝的多様性を提供する。したがって、本発明の種々の態様は本発明の遺伝的多様性をコードするポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドをコードする発現ベクター、ならびに本発明の遺伝的多様性および／またはポリペプチドを発現する生物に関する。本発明の種々の態様はさらに疾患に対する素因を有する個体を同定するか、または薬物応答性、副作用もしくは最適な薬物用量に関して個体を分類するために本発明の遺伝的多様性を用いる診断／治療的診断方法およびキットに関する。その他の態様では、本発明は化合物バリデーションのための方法ならびに本発明の遺伝的多様性に関するデータを保存および分析するためのコンピューターシステムを提供する。したがってこれらの態様を説明する種々の特定の実施態様は以下のとおりである。
【００１４】
定義
本明細書で用いる特定の用語の定義を以下に提供する。その他の用語の定義はU.S. Department of Energy, Office of Science, Human Genome Project（http：／／www.ornl.gov／sci／techresources／Human_Genome／glossary／）により提供される用語集に見いだすことができる。２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）は異常に高い血糖レベルを特徴とする障害の臨床的および遺伝的に異種の群である。Ｔ２ＤＭは糖尿病症候群のおよそ９０％を構成する。恐らく前臨床段階で始まる筋肉、肝臓および脂肪組織におけるインスリン抵抗性を特徴とする。最終的にインスリン分泌の欠損がインスリン抵抗性を代償することができず、そして糖尿病の臨床的発症を誘起する高血糖症に至る。Harris MI, Chapter ３２：Definition and Classification of Diabetes Mellitus and the New Criteria for Diagnosis, pp. ３２６−３３４, in Diabetes Mellitus：a Fundamental and Clinical Text, ２nd Edition, editors：LeRoith D, Taylor SI, Olefsky JM；（Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania, ２０００）。
【００１５】
本明細書で用いる「アレル」なる用語は、特異的な染色体位置（遺伝子座）での遺伝子またはＤＮＡ配列の特定の形態を意味する。
【００１６】
本明細書で用いる「抗体」なる用語には、限定するものではないがポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体および抗体フラグメントがタンパク質に結合するのに十分な生物学的に機能的な抗体フラグメントを含む。
【００１７】
本明細書で用いる「臨床応答」なる用語は、以下の：応答、応答なし、および逆応答（すなわち副作用）の定量的手段；のいずれかまたは全てを意味する。
【００１８】
本明細書で用いる「臨床試験」なる用語は、特定の処置に対する応答に関する臨床データを収集するために設計された任意の調査研究を意味し、そして限定するものではないが第Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ相臨床試験を含む。標準的な方法を用いて患者集団を定義し、そして対象を登録する。
【００１９】
本明細書で用いる化合物の「有効量」なる用語は、望ましい治療的および／または予防的効果を達成するのに十分な量であり、例えば処置される疾患、例えば本明細書で同定される遺伝的多様性およびポリペプチドに関連する疾患に関連する病徴の防御または低減を招く量である。対象に投与される化合物の量は疾患の型および重篤度ならびに一般健康状態、年齢、性別、体重および薬物に対する耐容性のような個体の特性に依存する。それはまた疾患の程度、重篤度および型にも依存する。当業者はこれらおよびその他の因子に依存して適当な用量を決定することができる。典型的には、治療的または予防的効果を達成するのに十分な本発明の化合物の有効量は１日あたり体重ｋｇあたり約０.０００００１ｍｇから１日あたり体重ｋｇあたり約１００００ｍｇの範囲である。好ましくは、用量範囲は１日あたり体重ｋｇあたり約０.０００１ｍｇから１日あたり体重ｋｇあたり約１００ｍｇである。本発明の化合物を互いに、または一つもしくはそれより多いさらなる治療用化合物と組み合わせて投与することもできる。
【００２０】
本明細書で用いる「発現」は、限定するものではないが一つもしくはそれより多い以下の：遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写；成熟ｍＲＮＡを生成するための前駆体ｍＲＮＡのスプライシングおよびその他のプロセシング；ｍＲＮＡ安定性；成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドン使用およびｔＲＮＡ利用性を含む）；ならびに適当な発現および機能に必要な場合、翻訳生成物のグリコシル化および／またはその他の修飾；を含む。
【００２１】
本明細書で用いる「遺伝子」なる用語は、プロモーター、エクソン、イントロンおよび発現を制御するその他の非翻訳領域を含むＲＮＡ生成物の調節された生合成のための全ての情報を含有するＤＮＡのセグメントを意味する。
【００２２】
本明細書で用いる「遺伝子型」なる用語は、個体の相同染色体の一対の遺伝子座において一つもしくはそれより多い多型部位で見出されるヌクレオチド対の非位相５’から３’配列を意味する。本明細書で用いる遺伝子型は全遺伝子型および／またはサブ遺伝子型を含む。
【００２３】
本明細書で用いる「遺伝子座」なる用語は、遺伝子または身体的もしくは表現型的特徴に対応する染色体またはＤＮＡ分子上の位置を意味する。
【００２４】
本明細書で用いる「調整剤」なる用語は、調整剤が不在のときのポリペプチドの発現レベルまたは生物学的活性レベルに比較して、ポリペプチドの発現レベルまたは生物学的活性レベルを変更させる（例えば増加または減少させる）任意の化合物である。調整剤は小型分子、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ヌクレオチドまたはその組み合わせでよい。調整剤は有機化合物または無機化合物でよい。
【００２５】
本明細書で用いる「変異体」なる用語は、野生型からの任意の遺伝的な変化を意味し、すなわち変異、例えば一塩基多型の結果である。「変異体」なる用語は本明細書全体にわたって「マーカー」、「バイオマーカー」および「標的」なる用語と互換的に用いられる。
【００２６】
本明細書で用いる「医学的状態」なる用語には限定するものではないが、処置が望ましい一つもしくはそれより多い身体的および／または心理学的病徴として明示される任意の状態または疾患を含み、そして以前におよび新たに同定された疾患およびその他の障害を含む。
【００２７】
本明細書で用いる「ヌクレオチド対」なる用語は、個体からの染色体の２つのコピー上の多型部位で見出されるヌクレオチドを意味する。
【００２８】
本明細書で用いる「多型部位」なる用語は、集団において少なくとも２つの選択的配列が見出される遺伝子座内の位置を意味し、その最も高い頻度はせいぜい９９％である。
【００２９】
本明細書で用いる「相になる」なる用語は、遺伝子座の２つまたはそれより多い多型部位に関するヌクレオチド対の配列に適用する場合、公知である遺伝子座の単一のコピー上のこれらの多型部位に存在するヌクレオチドの組み合わせを意味する。
【００３０】
本明細書で用いる「多型」なる用語は、集団において＞１％の頻度で存在する任意の配列バリアントを意味する。配列バリアントは５％または１０％またはそれより多いような１％より有意に大きい頻度で存在し得る。また多型部位で個体において観察された配列変化を意味するために用語を用いることもできる。多型にはヌクレオチド置換、挿入、欠失およびマイクロサテライトを含み、そして必ずしもではないが、遺伝子発現またはタンパク質機能における検出可能な差異を招き得る。
【００３１】
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は任意のＲＮＡまたはＤＮＡを意味し、それは未修飾または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでよい。ポリヌクレオチドには限定するものではないが、一本および二本鎖ＤＮＡ、一本および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本および二本鎖ＲＮＡ、一本および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ならびに一本鎖またはさらに典型的には二本鎖または一本および二本鎖領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。加えてポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む三本鎖領域を意味する。ポリヌクレオチドなる用語はまた一つもしくはそれより多い修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性またはその他の理由のために修飾されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡをも含む。
【００３２】
本明細書で用いる「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわちペプチドイソスターにより互いに連結された２つまたはそれより多いアミノ酸を含む任意のポリペプチドを意味する。ポリペプチドは一般にペプチド、糖ペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖、および一般的にタンパク質と称される長鎖の双方を意味する。ポリペプチドは２０個の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは翻訳後プロセシングのような天然のプロセシングか、または当分野において周知である科学的修飾技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含む。かかる修飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な研究論文、ならびに膨大な研究文献において十分に記載されている。
【００３３】
本明細書で用いる「ＳＮＰ核酸」なる用語は、個体または個体群の間でそれ以外は同一のヌクレオチド配列内で可変であるヌクレオチドを含み、したがってアレルとして存在する核酸を意味する。かかるＳＮＰ核酸は好ましくは約１５から約５００ヌクレオチド長である。ＳＮＰ核酸は染色体の一部でよいか、またはそれらは例えばＰＣＲもしくはクローニングによる染色体のそのような部分の増幅による染色体の一部の正確なコピーでよい。本明細書では以後ＳＮＰ核酸を簡単に「ＳＮＰ」と称する。ＳＮＰはゲノムの単一の位置でのヌクレオチド可変性の発生であり、そこで２つの選択的塩基はヒト集団においてかなりの頻度で（すなわち＞１％）発生する。ＳＮＰは遺伝子内またはゲノムの遺伝子間領域内で発生し得る。本発明によるＳＮＰプローブはＳＮＰ核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
「ハプロタイプ」は一緒に遺伝される傾向がある一つの染色体上に存在する密接に連関する遺伝子マーカーのセット、この局面ではＳＮＰである。
【００３５】
本明細書で用いる「対象」なる用語は、好ましくは対象がヒトのような哺乳動物であるが、動物、例えば家庭用動物（例えばイヌ、ネコ等）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）および実験動物（例えばサル（例えばカニクイザル）、ラット、マウス、モルモット等）でもよいことを意味する。
【００３６】
本明細書で用いるように、薬剤または薬物の対象または患者への投与には自己投与および他人による投与が含まれる。記載されるような医学的状態の処置または防御の種々の様式は「実質的である」ことを意味し、それは完全な処置または防御を含むが、完全に満たない処置または防御もまた含み、そしてそこでいくらかの生物学的または医学的に関係する結果が達成されることが意図されることもまた理解されよう。
【００３７】
遺伝子配列変化の同定および特徴付け
その保持率および蔓延する特性のために、ＳＮＰはヒト疾患状態に関与する遺伝子を位置決定するための重要な道具である可能性を有する。例えばWang et al., Science ２８０：１０７７−１０８２（１９９８）参照。いずれか一つのバリアントの影響は小さいかもしれないが、多くの共通する障害を発達させる危険性およびこれらの症状を処置するために用いられる医薬品の代謝は根本的なゲノム変化により実質的に影響を受けることがますます解明されてきている。
【００３８】
多型の存在のために、種のいくつかのメンバーが変異していない配列（すなわち元来のアレル）を有し得るが、一方その他のメンバーは変異した配列を有し得る（すなわちバリアントまたは変異アレル）という点でＳＮＰはアレルであると言われている。
【００３９】
ＳＮＰと特定の表現型との間の関連性は、ＳＮＰが表現型の原因であることを示すまたは要求する必要はない。それよりむしろ単にＳＮＰと、所定の表現型に実際に寄与するこれらの遺伝的因子との間のゲノム近接のためであり得て、そのためにＳＮＰおよび該遺伝的因子は密接に連関する。換言すれば、ＳＮＰは「真の」機能的バリアントとの連鎖不均衡（「ＬＤ」）であり得る。ゲノムの２つの異なる位置のアレルが予測よりもさらに高度に関連する場合、ＬＤ（アレル関連性とも称される）が存在する。したがって、特定の表現型を引き起こす変異に近接するので、ＳＮＰを価値のあるマーカーとして提供することができる。
【００４０】
本発明の多型部位の記載において便宜上遺伝子のセンス鎖を参照する。しかしながら、当業者には認識されるように、遺伝子を含有する核酸分子は相補的二本鎖分子でよく、そしてしたがってセンス鎖の特定の部位への参照は同様に相補的アンチセンス鎖の対応する部位への参照を意味する。換言すると、いずれかの鎖の同一の多型部位を参照することができ、そしてオリゴヌクレオチドは多型部位を含有する標的領域でいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。したがって本発明はまた本明細書で記載するゲノムバリアントのセンス鎖に相補的である一本鎖ポリヌクレオチドをも含む。
【００４１】
ＳＮＰの同定および特徴付け
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、変成高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）によるヘテロ二本鎖分析ならびに直接ＤＮＡシークエンシングおよびコンピューターによる方法を含む多くの異なる技術を用いてＳＮＰを同定および特徴付けすることができる。Shi et al., Clin. Chem. ４７：１６４−１７２（２００１）。公共データベースには豊富な配列情報がある。
【００４２】
最も一般的なＳＮＰ分類方法には現在ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、および切断法が含まれる。これらの方法の各々には適切な検出系が接続されていなければならない。検出テクノロジーには蛍光偏光法（Chan et al., Genome Res. ９：４９２−４９９（１９９９））、ピロリン酸放出の発光検出（ピロシークエンシング）（Ahmadiian et al., Anal. Biochem. ２８０：１０３−１０（２０００））、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）基盤の切断アッセイ、ＤＨＰＬＣ、および質量分析（Shi, Clin. Chem. ４７：１６４−１７２（２００１）；方法は米国特許第６２９７０１８号および第６３０００６３号に開示されるものである。
【００４３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【００４４】
INVADER（商標）テクノロジー（Third Wave Technologies Inc. Madison, Wisconsin, USAから入手可能）のような市販により入手可能である生成物を用いて多型を検出することもできる。このアッセイでは特異的な上流の「インベーダー」オリゴヌクレオチドおよび部分重複する下流プローブが相補的ＤＮＡ鋳型に結合した場合、一緒に特異的構造を形成する。この構造はCleavase酵素により認識され、そして特異的部位で切断され、結果的にプローブオリゴヌクレオチドの５’フラップが遊離される。次いでこのフラグメントを反応混合物に含有される合成２次標的および２次蛍光標識シグナルプローブに関して「インベーダー」オリゴヌクレオチドとして供する。Ryan D et al., Molecular Diagnosis ４（２）：１３５−１４４（１９９９）およびLyamichev V et al., Nature Biotechnology １７：２９２−２９６（１９９９）、米国特許第５８４６７１７号および第６００１５６７号もまた参照されたい。
【００４５】
限定するものではないがリボプローブ（Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８２：７５７５（１９８５）； Meyers et al., Science ２３０：１２４２（１９８５））および大腸菌ｍｕｔＳタンパク質（Modrich P. Ann Rev Genet ２５：２２９−２５３（１９９１））のようなヌクレオチド誤対合を認識するタンパク質を用いるＲＮアーゼ保護法を含む誤対合検出技術を用いて多型の同一性を決定することもできる。これに代えて、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（Orita et al., Genomics ５：８７４−８７９（１９８９）； Humphries et al., in Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, R. Elles, ed.,（１９９６）pp. ３２１−３４０）または変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Wartell et al., Nucl. Acids. Res. １８：２６９９−２７０６（１９９０）； Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：２３２−２３６（１９８９））によりバリアントアレルを同定することができる。ポリメラーゼ媒介プライマー伸長法を用いて多型を同定することもできる。いくつかのかかる方法は特許および科学文献に記載されており、そして「Genetic Bit Analysis」法（第ＷＯ９２／１５７１２号）およびリガーゼ／ポリメラーゼ媒介genetic bit analysis（米国特許第５６７９５２４号）を含む。関連する方法は第ＷＯ９１／０２０８７号、第ＷＯ９０／０９４５５号、第ＷＯ９５／１７６７６号ならびに米国特許第５３０２５０９号および第５９４５２８３号に開示されている。米国特許第５６０５７９８号に記載されるように多型を含有する伸長プライマーを質量分析により検出することができる。別のプライマー伸長法はアレル特異的ＰＣＲ（Ruafio et al., Nucl. Acids. Res. １７：８３９２（１９８９）； Ruafio et al., Nucl. Acids. Res. １９：６８７７−６８８２（１９９１）；第ＷＯ９３／２２４５６号； Turki et al., J. Clin. Invest. ９５：１６３５−１６４１（１９９５））である。加えて、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ８９／１０４１４号に記載されるようにアレル特異的プライマーのセットを用いて核酸の複数の領域を同時に増幅することにより複数の多型部位を調査することができる。
【００４６】
オリゴヌクレオチドのハプロタイプ分類および遺伝子型分類
本発明は個体において遺伝子をハプロタイプ分類および／または遺伝子型分類するための方法および組成物を提供する。本明細書で用いる「遺伝子型」および「ハプロタイプ」なる用語は各々本明細書で記載する一つもしくはそれより多い多型部位に存在するヌクレオチド対またはヌクレオチドを含有する遺伝子型またはハプロタイプを意味し、そして場合によっては遺伝子の一つもしくはそれより多いさらなる多型部位に存在するヌクレオチド対またはヌクレオチドをも含み得る。さらなる多型部位は現在公知の多型部位または後に見出される部位でよい。
【００４７】
本発明の組成物は、多型部位を含有するか、またはそれに隣接する一つもしくはそれより多い標的領域に特異的にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを含有する。本発明のオリゴヌクレオチド組成物は個体において遺伝子を遺伝子型分類および／またはハプロタイプ分類するための方法において有用である。本明細書で記載する多型部位で個体の遺伝子型またはハプロタイプを確立するための方法および組成物は、タンパク質の発現および機能により影響を受ける疾患の原因論において多型の影響を研究するのに、薬物ターゲティングの効率を研究するのに、タンパク質の発現および機能により影響を受ける疾患に対する個体の感受性を予測するのに、そして遺伝子生成物をターゲティングする薬物に対する個体の応答性を予測するのに有用である。
【００４８】
本発明の遺伝子型分類オリゴヌクレオチドをマイクロチップ、ビーズまたはガラススライドのような固体表面上に固定または合成することができる。例えば第ＷＯ９８／２００２０号および第ＷＯ９８／２００１９号参照。
【００４９】
遺伝子型分類オリゴヌクレオチドは本明細書で同定された多型部位の一つの下流１から数個のヌクレオチドに位置する標的領域にハイブリダイズすることができる。かかるオリゴヌクレオチドは本明細書で記載する多型の一つを検出するためのポリメラーゼ媒介プライマー伸長法で有用であり、そしてしたがってかかる遺伝子型分類オリゴヌクレオチドは本明細書では「プライマー伸長オリゴヌクレオチド」と称される。
【００５０】
本発明の直接的遺伝子型分類方法
本発明の遺伝子型分類方法は目的の遺伝子またはそのフラグメントの２個のコピーを含む核酸混合物を個体から単離し、そして２個のコピーの一つもしくはそれより多い多型部位でヌクレオチド対の同一性を決定することを含み得る。当業者には容易に理解されるように、個体の遺伝子の２個の「コピー」は同一のアレルでよいか、または異なるアレルでよい。特に好ましい実施態様では、遺伝子型分類方法は各多型部位でヌクレオチド対の同一性を決定することを含む。典型的には、血液試料または組織試料のような個体から採取した生物学的試料から核酸混合物を単離する。適当な組織試料には全血、精液、唾液、涙液、尿、糞便材料、汗、口腔塗抹、皮膚および毛髪が含まれる。
【００５１】
以下の実施例で用いる遺伝子型分類の方法は以下のとおりである：全てのＳＮＰの遺伝子型分類は一塩基伸長により実施し、Sequenom’s MassArray（商標）テクノロジーを用いる質量分析を続ける。Ross et al., Nat. Biotechnol. １６：１３４７−１３５１（１９９８）。この系の遺伝子型の確認は均一な質量増加（homogenous Mass Extension）（ｈＭＥ）反応生成物のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析に基づく。
【００５２】
本発明の直接的ハプロタイプ分類方法
本発明のハプロタイプ分類方法は目的の遺伝子またはそのフラグメントの２個のコピーのうちの１個のみを含有する核酸分子を個体から単離し、そしてそのコピーの一つもしくはそれより多い多型部位でヌクレオチドの同一性を決定することを含み得る。直接的ハプロタイプ分類方法には、例えばCLASPER System（商標）テクノロジー（米国特許第５８６６４０４号）またはアレル特異的ロングレンジＰＣＲ（Michalotos−Beloin et al., Nucl. Acids. Res. ２４：４８４１−４８４３（１９９６））が含まれる。遺伝子またはフラグメントの２個のコピーを分離することができる任意の方法を用いて核酸を単離することができる。当業者には容易に理解されるように、任意の個々のクローンは個体に存在する２個の遺伝子コピーのうちの１個のハプロタイプ情報のみを提供する。一つの実施態様では、個体に存在する遺伝子の各コピーの一つもしくはそれより多い多型部位でヌクレオチドの相になった配列を同定することによりハプロタイプ対を決定する。好ましい実施態様では、ハプロタイプ分類方法は遺伝子の各コピーの各多型部位の相になった配列を同定することを含む。
【００５３】
以下の実施例では、ハプロタイプ分類方法は以下のとおりであった：全てのハプロタイプ関連解析をバイナリ形質（binary trait）に関する推奨されるパラメーターを用いてＲのhaplo.statsパッケージのhaplo.scoreプログラムを用いて実施した。Becker R, Chambers J & Willks A, The new S language： a programming environment for data analysis and graphics（Wadsworth & Brooks／Cole Advanced Books, Pacific Grove, １９８８）p. ７０２； Schaid DJ et al., Am. J. Hum. Genet. ７０（２）：４２５−３４（２００２）参照。Haplo.score はＥＭアルゴリズムを用いて遺伝子型データからハプロタイプを推測し、そして遺伝子座での個体のハプロタイプおよびハプロタイプの全セットの双方に関して形質との関連性を検定する。
【００５４】
遺伝子型分類方法およびハプロタイプ分類方法の双方で、遺伝子またはそのフラグメントの一つまたは双方のコピーから直接的に多型部位を含有する標的領域を増幅し、そして従来の方法により増幅された領域をシークエンシングすることにより、多型部位でのヌクレオチド（またはヌクレオチド対）の同一性を決定することができる。第ＷＯ９５／１１９９５号に記載されるように遺伝子の一つまたは双方のコピーを含有する核酸試料を核酸アレイおよびサブアレイにハイブリダイズさせることにより個体の遺伝子に関する遺伝子型またはハプロタイプを決定することもできる。
【００５５】
標的多型と連鎖不均衡にある多型部位を用いる間接的遺伝子型分類方法
加えて、本発明のいずれかの多型部位に存在するアレルの同一性を、目的のこれらの部位と連鎖不均衡にあるその他の多型部位を遺伝子型分類することにより間接的に決定することができる。前記したように、一つの部位での特定のバリアントの存在が第２の部位での別のバリアントの存在の指標である場合、二つの部位は連鎖不均衡にあるといわれている。Stevens JC, Mol. Diag. ４：３０９−３１７（１９９９）。本発明の多型部位と連鎖不均衡にある多型部位は同一の遺伝子の領域またはその他のゲノム領域に位置し得る。
【００５６】
標的遺伝子領域の増幅
限定するものではないがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４９６５１８８号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：１８９−１９３（１９９１）； 公開ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９０／０１０６９号）およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Landegren et al., Science ２４１：１０７７−１０８０（１９８８））を含む任意のオリゴヌクレオチド指向性増幅方法を用いて標的領域を増幅することができる。かかる方法においてプライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドは多型部位を含有するかまたはそれに隣接する核酸の領域に特異的にハイブリダイズすべきである。典型的には、オリゴヌクレオチドは１０ヌクレオチド長と３５ヌクレオチド長の間であり、そして好ましくは１５ヌクレオチド長と３０ヌクレオチド長との間である。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは２０ヌクレオチド長と２５ヌクレオチド長の間である。オリゴヌクレオチドの正確な長さは当業者により日常的に考えられそして実行される多くの因子に依存する。
【００５７】
転写基盤の増幅系（米国特許第５１３０２３８号；欧州特許第３２９８２２号；米国特許第５１６９７６６号、公開ＰＣＴ特許出願第ＷＯ８９／０６７００号）および等温法（Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：３９２−３９６（１９９２））を含むその他の公知の核酸増幅手順を用いて標的領域を増幅することができる。
【００５８】
アレル特異的オリゴヌクレオチドの標的遺伝子へのハイブリダイズ
当分野において公知のいくつかのハイブリダイゼーション基盤の方法の一つを用いて増幅の前または後に標的領域における多型を検定することができる。典型的には、アレル特異的オリゴヌクレオチドをかかる方法の実施に利用する。アレル特異的オリゴヌクレオチドを、異なって標識されたプローブ対として用いることができ、対の一方のメンバーは標的配列の一つのバリアントと完全な対合を示し、他方のメンバーは異なるバリアントと完全な対合を示す。いくつかの実施態様ではアレル特異的オリゴヌクレオチドのセットまたはオリゴヌクレオチド対を用いて一を超える多型部位を一度に検出することができる。好ましくは、セットのメンバーは多型部位の各々へのハイブリダイゼーションが検出される場合、お互いの５℃以内、およびさらに好ましくは２℃以内の融点を有する。
【００５９】
アレル特異的オリゴヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを双方の実体と共に溶液中で実施することができるか、またはオリゴヌクレオチドもしくは標的ポリヌクレオチドのいずれかが共有結合的にもしくは非共有結合的に固体支持体に取り付けられている場合にかかるハイブリダイゼーションを実施することができる。付着は例えば抗体−抗原相互作用、ポリ−Ｌ−Ｌｙｓ、ストレプトアビジンまたはアビジン−ビオチン、塩橋、疎水性相互作用、化学的連結、ＵＶ架橋、焼き付け等により媒介され得る。アレル特異的オリゴヌクレオチドを固体支持体上で直接的に、または合成した後に固体支持体に付着させることができる。本発明の検出方法で用いるのに適当な固体支持体にはシリコン製の基質、ガラス、プラスチック、紙等が含まれ、これを例えばウェル（９６ウェルプレートのような）スライド、シート、膜、繊維、チップ、皿およびビーズに形成することができる。固体支持体を処理、コーティングまたは誘導してアレル特異的オリゴヌクレオチドまたは標的核酸の固定を促すことができる。
【００６０】
集団遺伝子型およびハプロタイプの決定ならびにそれらと形質との相関性
本発明は集団における遺伝子型またはハプロタイプの頻度を決定するための方法を提供する。方法は、集団の各メンバーに存在する遺伝子に関して遺伝子の一つもしくはそれより多い多型部位で検出されたヌクレオチド対またはヌクレオチドを含む遺伝子型またはハプロタイプを決定すること、および集団において遺伝子型またはハプロタイプが見出された頻度を計算することを含む。集団は参照集団、家族集団、同一性別集団、集団群、または形質集団（例えば医学的状態または治療的処置に対する応答のような目的の形質を呈する個体の群）でよい。
【００６１】
本発明の別の態様では、参照集団において見出された遺伝子型および／またはハプロタイプに関する頻度データを形質と遺伝子型またはハプロタイプとの間の関連性を同定するための方法において用いる。形質は限定するものではないが疾患に対する感受性または処置に対する応答性を含む任意の検出可能な表現型でよい。方法を参照集団における目的の遺伝子型またはハプロタイプの頻度に関する情報を得ること、および形質を呈する集団における遺伝子型またはハプロタイプの頻度とデータを比較することを伴う。前記で記載した方法の一つを用いて集団の各個体を遺伝子型分類またはハプロタイプ分類することにより、参照および形質集団の一つまたは双方に関する頻度データを得ることができる。形質集団に関するハプロタイプを直接的に、またはこれに代えて前記で記載した予測的な遺伝子型からハプロタイプへの研究法により決定することができる。
【００６２】
書面または電子形式でよい予め決定された頻度データを評価することにより、参照および／または形質集団に関する頻度データが得られる。例えば頻度データはコンピューターによりアクセス可能であるデータベースに存在し得る。一度頻度データが得られると、参照および形質集団の目的の遺伝子型またはハプロタイプの頻度を比較する。
【００６３】
多型を分析している場合、計算を実施して、偶然に見出され得る有意な関連性を補正することができる。本発明の方法で有用な統計方法に関しては、Statistical Methods in Biology, ３rd edition, Bailey NTJ,（Cambridge Univ. Press, １９９７）； Waterman MS, Introduction to Computational Biology（CRC Press, ２０００）およびBioinformatics, Baxevanis AD & Ouellette BFF editors（John Wiley & Sons, Inc., ２００１）を参照されたい。
【００６４】
別の実施態様では、異なる群に関するハプロタイプ頻度データを試験して、それらがハーディワインベルグ平衡 D.L. Hartl et al., Principles of Population Genomics, ３rd Ed.（Sinauer Associates, Sunderland, MA, １９９７）と合致するすかどうかを決定する。
【００６５】
別の実施態様では、ボンフェロニ補正した標準的なＡＮＯＶＡ検定、または何回も遺伝子型表現型相関性をシミュレートし、そして有意な値を計算するブートストラップ法を用いて統計分析を実施する。ＡＮＯＶＡを用いて、応答可変性が一つもしくはそれより多い形質または測定できる可変性により引き起こされるかまたはそれと相関するかどうかについての仮説を検定する。L.D. Fisher & G. vanBelle, Biostatistics：A Methodology for the Health Sciences（Wiley−lnterscience, New York, １９９３）Ch. １０。
【００６６】
ハプロタイプ対の予測のための一つの実施態様では、分析には以下のような割り当ての工程が含まれる：最初に可能なハプロタイプ対の各々を参照集団のハプロタイプ対と比較する。一般に参照集団のハプロタイプ対の一つのみが可能なハプロタイプ対と対合し、そしてその対を個体に割り当てる。時には参照ハプロタイプ対で示された一つのハプロタイプのみが個体の可能なハプロタイプ対と合致し、そしてそのような場合には個体はこの公知のハプロタイプおよび、可能なハプロタイプ対から公知のハプロタイプを除くことにより誘導される新しいハプロタイプを含有するハプロタイプ対に割り当てられる。
【００６７】
別の実施態様では、目的の遺伝子型またはハプロタイプと連鎖不均衡にある検出可能な遺伝子型またはハプロタイプを代理マーカーとして使用することができる。所定の遺伝子の特定の遺伝子型またはハプロタイプが参照集団におけるよりも可能性のある代理マーカー遺伝子型を実証する集団においてより高頻度である場合に、遺伝子型が別の遺伝子型と連鎖不均衡にあることが示される。頻度が統計的に有意であれば、次いでマーカー遺伝子型はその遺伝子型またはハプロタイプを予測し、そして代理マーカーとして使用され得る。
【００６８】
ハプロタイプの内容と臨床応答との間の相関性を見出すための別の方法は誤差最小化最適化アルゴリズムに基づく予測モデルであり、その一つは遺伝的アルゴリズムである。R. Judson, 「Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry」 in Reviews in Computational Chemistry １０：１−７３, K.B. Lipkowitz & D.B. Boyd, eds.（VCH Publishers, New York, １９９７）を参照されたい。シュミレーテッドアニーリング（Press et al., Numerical Recipes in C：The Art of Scientific Computing, Ch. １０（Cambridge University Press, Cambridge）１９９２）、ニューラルネットワーク（E. Rich & K. Knight, Artificial Intelligence, ２nd Edition, Ch. １０（McGraw−Hill, New York, １９９１）、標準的勾配下降法（Press et al., supra Ch. １０）またはその他の大域的もしくは局所的最適化研究法（see discussion in Judson, supra）を用いることもできる。
【００６９】
対象遺伝子型またはハプロタイプの処置応答性に対する相関性
好ましい実施態様では、形質は疾患に対する感受性、疾患の重篤度、疾患の段階化または薬物に対する応答である。かかる方法は遺伝子型と有効性測定、薬物動態測定および副作用測定を含む処置結果との間の関連性に関して可能性がある全ての遺伝薬理学的適用のための診断試験および治療的処置の開発において適用可能性を有している。
【００７０】
別の好ましい実施態様では、目的の形質は患者が呈するいくつかの治療的処置に対する臨床応答、例えば薬物ターゲティングまたは医学的症状のための治療的処置に対する応答である。
【００７１】
処置に対する臨床応答と遺伝子型またはハプロタイプとの間の相関性を推測するために、処置を受けた個体の集団（以後「臨床集団」と称する）が呈する臨床応答に関して遺伝子型またはハプロタイプデータを得る。すでに行われている臨床試験の結果を分析することにより、ならびに／または一つもしくはそれより多い新しい臨床試験を設計および実行することによりこの臨床データを得ることができる。
【００７２】
臨床集団に含まれる個体は通常目的の医学的症状の存在に関して等級分けされる。潜在的患者のこの等級分けには標準的な身体的試験または一つもしくはそれより多い実験室試験を用いることができる。これに代えて、患者の等級分けにはハプロタイプ対と疾患感受性または重篤度との間に強力な相関性がある状況に関してハプロタイプ分類を用いることができる。
【００７３】
目的の治療的処置は試験集団の各個体に投与され、そして各個体の処置に対する応答は一つもしくはそれより多い予め決定された診断基準を用いて測定される。多くの場合で試験集団は応答の範囲を提示し、そして研究者は種々の応答により作られた応答群の数（例えば、低、中、高）を選択することが意図される。加えて試験集団の各個体の遺伝子を遺伝子型分類および／またはハプロタイプ分類し、処置を施す前または後にそれを行うことができる。
【００７４】
次いでこれらの結果を分析して、多型群間で臨床応答における任意の観測された変化が統計的に有意であるかどうかを決定する。用いることができる統計分析方法はL.D. Fisher & G. vanBelle, Biostatistics：A Methodology for the Health Sciences（Wiley−lnterscience, New York, １９９３）に記載されている。この分析はまた遺伝子のどの多型部位が表現型における差異に最も有意に寄与するかの回帰計算をも含み得る。
【００７５】
臨床および多型の双方のデータが得られた後、個体応答と遺伝子型またはハプロタイプの内容との間の相関が創られる。いくつかの方式で相関を生むことができる。一つの方法では、その遺伝子型またはハプロタイプ（またはハプロタイプ対）により個体を群分けし（多型群とも称する）、そして次に各多型群のメンバーが呈した臨床応答の平均（average）および標準偏差を計算する。
【００７６】
前記で記載した分析から、遺伝子型またはハプロタイプ内容の関数として臨床応答を予測する当業者は数学的モデルを容易に構築することができる。臨床応答と遺伝子に関する遺伝子型またはハプロタイプ（またはハプロタイプ対）との間の関連性の同定は、処置に応答するもしくは応答しないか、またはこれに代えて低レベルで応答し、そしてしたがってさらなる処置、すなわちより高用量の薬物を必要とし得るこれらの個体を決定するための診断方法を設計するための基礎になり得る。診断方法はいくつかの形態の一つ：例えば直接ＤＮＡ試験（すなわち遺伝子の一つもしくはそれより多い多型部位を遺伝子型分類またはハプロタイプ分類する）血清学的試験または身体試験測定を取り得る。唯一の要件は診断検定結果と基礎となる遺伝子型またはハプロタイプとの間に良好な相関性があるということである。好ましい実施態様では、この診断方法は前記で記載した予測的ハプロタイプ分類方法を用いる。
【００７７】
対象の遺伝子型群への割り当て
当業者には理解されるように、この決定を行うにはある程度の不確実性が存在する。したがって、対照群レベルの標準偏差を用いて確率的決定を行い、そして遺伝子型群決定に基づく確率の広い範囲にわたって本発明の方法が適用される。したがって例えば、そして限定するものではないが、一つの実施態様では遺伝子発現生成物の測定レベルがいずれかの対照群の平均（mean）の標準偏差２.５以内に入る場合、次いでその個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。別の実施態様では、遺伝子発現生成物の測定レベルがいずれかの対照群の平均（mean）の標準偏差２.０以内に入る場合、次いでその個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。さらに別の実施態様では、遺伝子発現生成物の測定レベルがいずれかの対照群の平均（mean）の標準偏差１.５以内に入る場合、次いでその個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。なおさらに別の実施態様では、遺伝子発現生成物の測定レベルがいずれかの対照群レベルの平均（mean）の標準偏差１.０であるかまたはそれより小さい場合、次いでその個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。
【００７８】
この過程により種々の確率の程度でどの群に特異的対象をおくべきかの決定が可能になり、そして次に遺伝子型群へのかかる割り当てにより個体をおくべき危険性カテゴリーが決定される。
【００７９】
臨床応答と遺伝子型またはハプロタイプとの間の相関性
処置に対する臨床応答と遺伝子型またはハプロタイプとの間の相関性を推測するために、処置を受けた個体の集団（以後「臨床集団」と称する）が呈する臨床応答に関するデータを得ることが必要である。すでに行われている臨床試験の結果を分析することによりこの臨床データを得ることができ、そして／または一つもしくはそれより多い新しい臨床試験を設計および実行することによりこの臨床データを得ることができる。
【００８０】
したがって異なる対照群で決定される遺伝子発現生成物の標準的な対照レベルを、次いで所定の患者の遺伝子発現生成物の測定レベルと比較する。この遺伝子発現生成物はその特定の遺伝子型群またはその遺伝子型群のポリペプチド遺伝子発現生成物に関連する特徴的なｍＲＮＡでよい。次いで患者を所定の群に関する対照レベルと比較して測定レベルがどれほど類似していたかに基づいて特定の遺伝子型群に分類または割り当てることができる。
【００８１】
多型データを保存または表示するためのコンピューターシステム
本発明はまた遺伝子に関して決定された多型データを保存および表示するためのコンピューターシステムを提供する。コンピューターシステムはプロセシングユニット、ディスプレイおよび多型データを含有するデータベースを含む。多型データには参照集団の所定の遺伝子に関して同定された多型、遺伝子型およびハプロタイプが含まれる。好ましい実施態様では、コンピューターシステムはその進化的関係に従って体系化されたハプロタイプを示すディスプレイを作ることができる。コンピューターは本発明の方法の実施に関与する任意のまたは全ての分析的および数学的操作を遂行することができる。加えてコンピューターはディスプレイ装置に表示されたビュー（またはスクリーン）を作るプログラムを実行することができ、そしてそれを用いて使用者はビューと双方向作用し、そして染色体位置、遺伝子構造および遺伝子ファミリー、遺伝子発現データ、多型データ、遺伝子配列データならびに臨床集団データ（例えば一つもしくはそれより多い集団に関する民族地理学的起源、臨床応答、遺伝子型およびハプロタイプ）を含む遺伝子およびそのゲノム変化に関係する多量の情報を分析することができる。本明細書に記載した多型データをリレーショナルデータベース（例えばオラクルデータベースの一例またはＡＳＣＩＩフラットファイル）の部分として保存することができる。これらの多型データをコンピューターハード装置に保存することができるか、または例えばＣＤ−ＲＯＭまたはコンピューターによりアクセス可能な一つもしくはそれより多いその他の保存装置に保存することができる。例えばネットワークを介してコンピューターに接続されている一つもしくはそれより多いデータベースにデータを保存することができる。
【００８２】
核酸基盤の診断
別の態様では、本発明はその遺伝的多様性の型に従って対象を分類するのに有用であるＳＮＰプローブを提供する。本発明によるＳＮＰプローブは従来のアレル識別アッセイでＳＮＰ間を識別するオリゴヌクレオチドである。特定の好ましい実施態様では、本発明のこの態様によるオリゴヌクレオチドはＳＮＰ核酸の一つのアレルに相補的であるが、ＳＮＰ核酸の任意のその他のアレルには相補的でない。本発明のこの実施態様によるオリゴヌクレオチドは種々の方式でＳＮＰ間を識別することができる。例えばストリンジェントハイブリダイゼーション条件下では、適切な長さのオリゴヌクレオチドは一つのＳＮＰにハイブリダイズするが、任意のその他のものにはハイブリダイズしない。放射性標識または蛍光分子タグを用いてオリゴヌクレオチドを標識することができる。これに代えて適切な長さのオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして使用することができ、ここで３’末端ヌクレオチドはＳＮＰを含有する一つのアレルに相補的であるが、任意のその他のアレルには相補的でない。この実施態様ではＰＣＲによる増幅の存在または不在によりＳＮＰのハプロタイプが決定される。
【００８３】
本発明のゲノムおよびｃＤＮＡフラグメントは本明細書で同定した少なくとも一つの多型部位を含み、少なくとも１０ヌクレオチド長を有し、そして遺伝子の全長までにわたり得る。好ましくは本発明によるフラグメントは１００ヌクレオチド長と３０００ヌクレオチド長の間であり、さらに好ましくは２００ヌクレオチド長と２０００ヌクレオチド長の間であり、そして最も好ましくは５００ヌクレオチド長と１０００ヌクレオチド長の間である。
【００８４】
本発明のキット
本発明は個体の遺伝子をハプロタイプ分類および／または遺伝子型分類するのに有用な核酸およびポリペプチド検出キットを提供する。かかるキットは個体を分類する目的のために個体を分類するのに有用である。具体的には、本発明は生物学的試料、例えば限定するものではないが血清、血漿、リンパ液、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水または血液を含む任意の体液、および身体組織の生検試料を含む生物学的試料中の本発明のマーカーに相当するポリペプチドまたは核酸の存在を検出するためのキットを包含する。例えばキットは生物学的試料中の本発明のマーカーに相当するポリペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる標識化合物または薬剤および試料中のポリペプチドまたはｍＲＮＡの量を決定するための手段、例えばポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合するポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドプローブに結合する抗体を含むことができる。キットはまたキットを用いて得られた結果を解釈するための指示書を含むこともできる。
【００８５】
別の実施態様では、本発明は別個の容器に包装された少なくとも二つの遺伝子型分類オリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。キットはまた別個の容器に包装されたハイブリダイゼーションバッファー（ここでオリゴヌクレオチドはプローブとして用いられる）のようなその他の構成成分をも含有できる。これに代えて、オリゴヌクレオチドを用いて標的領域を増幅しようとする場合、ＰＣＲの場合のように、キットは別個の容器に包装されたポリメラーゼおよびポリメラーゼにより媒介されるプライマー伸長に最適化された反応バッファーを含有できる。好ましい実施態様では、かかるキットはさらにＤＮＡ試料収集手段を含むことができる。
【００８６】
抗体基盤のキットに関しては、キットは例えば（１）本発明のマーカーに相当するポリペプチドに結合する、例えば固体支持体に付着させた第一抗体；および場合によっては（２）ポリペプチドまたは第一抗体のいずれかに結合し、そして検出可能な標識に抱合させた第二の異なる抗体を含むことができる。
【００８７】
オリゴヌクレオチド基盤のキットに関しては、キットは例えば（１）本発明のマーカーに相当するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド；または（２）本発明のマーカーに相当する核酸分子を増幅するのに有用なプライマーの対を含むことができる。
【００８８】
キットはまた例えば緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定剤をも含むことができる。キットはさらに検出可能な標識、例えば酵素または基質を検出するのに必要な構成成分を含むことができる。キットはまた検定しそして被験試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料を含有することもできる。キットの各々の構成成分を個々の容器内に封入し、そして種々の容器の全てを、キットを用いて実施されたアッセイの結果を解釈するための指示書と一緒に単一の包装にすることができる。
【００８９】
本発明の核酸配列
一つの態様では、本発明は一つもしくはそれより多い単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明はまた同一物のアレルバリアント、すなわちポリヌクレオチドによりコードされるものと同一、相同または関連する変異ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドの天然発生の代替え形態をも包含する。これに代えて当分野において周知の変異誘発技術または直接合成技術により非天然発生バリアントを生成することができる。
【００９０】
したがって低ストリンジェントで本発明の変異ポリペプチドをコードする任意の核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列は本発明の範囲内であると考えられる。標準的なストリンジェント条件は標準的な分子生物学クローニングテキストにおいて十分に特徴付けされている。例えばMolecular Cloning A Laboratory Manual, ２nd Ed., ed., Sambrook, Fritsch, & Maniatis（Cold Spring Harbor Laboratory Press, １９８９）；DNA Cloning, Volumes I and II, D.N. Glover, ed.（１９８５）； Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait, ed.（１９８４）； Nucleic Acid Hybridization, B.D. Hames & S.J. Higgins, eds（１９８４）参照。
【００９１】
組換え発現ベクター
本発明の別の態様は変異ポリペプチドをコードする一つもしくはそれより多い核酸配列を含有するベクターを含む。本発明の実施において、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの多くの従来技術を用いる。これらの技術は周知であり、そして例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Vols. I−III, Ausubel, ed.（１９９７）； Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ２nd Ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, １９８９）；DNA Cloning：A Practical Approach, Vols. I and II, Glover, Ed.（１９８５）； Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed.（１９８４）； Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds.（１９８５）； Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds.（１９８４）； Animal Cell Culture, Freshney, ed.（１９８６）； Immobilized Cells and Enzymes（IRL Press, １９８６）； Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning； the series Methods in Enzymology,（Academic Press, Inc., １９８４）； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds.（Cold Spring Harbor Laboratory, New York, １９８７）；およびMethods in Enzymology, Vols. １５４ and １５５, Wu & Grossman, and Wu, Eds.の各々において説明されている。
【００９２】
本発明の一つもしくはそれより多いポリペプチドの組換え発現に関しては、当分野において周知組換えＤＮＡ技術により、ポリペプチドをコードする核酸配列の全てまたは一部を含有する核酸を適切なクローニングベクターまたは発現ベクター（すなわち挿入されたポリペプチドコード化配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクター）に挿入する。
【００９３】
プラスミドは最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、本明細書では「プラスミド」および「ベクター」を互換的に用いることができる。しかしながら、本発明はウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、等価な機能を提供する技術的にはプラスミドではない発現ベクターのかかるその他の形態を含むことが意図される。かかるウイルスベクターにより対象の感染およびその対象における化合物の発現が可能になる（Becker et al., Meth. Cell Biol. ４３：１６１ ８９（１９９４））。組換え発現ベクター内で「作動可能なように連結された」とは目的のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えばインビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）調節配列に連結されていることを意味すると意図される。「調節配列」なる用語はプロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むと意図される。かかる調節配列は例えばGoeddel, Gene Expression Technology：Methods In Enzymology １８５（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）に記載されている。調節配列には、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は形質転換される宿主細胞の選択、望ましいポリペプチドの発現のレベル等のような因子に依存し得ることは当業者には理解されよう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより本明細書に記載するような核酸によりコードされる融合ポリペプチドを含むポリペプチドまたはペプチド（例えば変異ポリペプチドおよび変異誘導融合ポリペプチド等）を生成することができる。
【００９４】
ポリペプチド発現宿主細胞
本発明の別の態様は本発明の一つもしくはそれより多い変異ポリペプチドをコードする核酸を含有するポリペプチド発現宿主細胞に関係する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」なる用語は本明細書では互換的に用いられる。かかる用語が特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫または潜在的子孫をも意味することは理解される。変異または環境の影響のいずれかのために後の世代で特定の修飾が生じ得るので、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で用いる用語の範囲内に依然含まれる。宿主細胞は任意の原核または真核細胞でよい。Sambrook et al. Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ２nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８９）。
【００９５】
従来の形質転換またはトランスフェクション技術によりベクターＤＮＡを原核または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」なる用語は外来の核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当分野で認識されている種々の技術を意味し、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが含まれると意図される。宿主を形質転換またはトランスフェクションするための適当な方法をSambrook et al. Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ２nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８９）、およびその他の実験室マニュアルに見出すことができる。細胞へのＤＮＡの導入に関しては、エレクトロポレーション、粒子ボンバードメント、リン酸カルシウム共沈およびウイルス形質導入が当分野において公知である；したがって方法の選択は当業者の能力および嗜好を伴い得る。
【００９６】
本発明の組換え細胞を調製するために、イソ遺伝子が染色体外に留まるように、望ましいイソ遺伝子をベクター中で宿主細胞に導入することができる。かかる状況では、遺伝子は染色体外位置から細胞により発現される。好ましい実施態様では、イソ遺伝子を細胞に存在する内因性遺伝子と組換えされるように細胞に導入する。組換えおよび染色体外維持の双方のための遺伝子の導入のためのベクターが当分野において公知であり、そして任意の適当なベクターまたはベクター構築物を本発明で用いることができる。
【００９７】
原核または真核細胞において変異ポリペプチドを発現するために本発明の組換え発現ベクターを設計することができる。例えば変異ポリペプチドを大腸菌（E. coli）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、真菌細胞、例えば酵母、または哺乳動物細胞において発現させることができる。適当な宿主細胞はさらにGoeddel, Gene Expression Technology：Methods In Enzymology １８５（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）において論じられている。
【００９８】
原核細胞におけるポリペプチドの発現は、融合または非融合ポリペプチドのいずれかの発現を指示する構成的または誘導プロモーターを含有するベクターを伴う大腸菌において最も頻繁に実施される。典型的な融合発現ベクターにはｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc； Smith and Johnson, １９８８. Gene ６７：３１ ４０）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, Mass., USA）およびグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合ポリペプチドまたはポリペプチドＡを各々標的組換えポリペプチドの融合させるｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, N.J., USA）が含まれる。適当な誘導非融合大腸菌発現ベクターの実例にはｐＴｒｃ（Amrann et al., Gene ６９：３０１ ３１５（１９８８））およびｐＥＴ１１ｄ（Studier et al., Gene Expression Technology：Methods In Enzymology（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）pp. ６０−８９）が含まれる。その他の試験計画はGottesman, Gene Expression Technology：Methods In Enzymology（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）pp. １１９−１２８ およびWada, et al., Nucl. Acids Res. ２０：２１１１−２１１８（１９９２））に記載されている。
【００９９】
ポリペプチド発現ベクターは酵母発現ベクターでよい。出芽酵母における発現のためのベクターの実例にはｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari et al., EMBO J. ６：２２９ ２３４（１９８７））、ｐＭＦａ（Kurjan & Herskowitz, Cell ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., Gene ５４：１１３ １２３（１９８７））、ｐＹＥＳ２（InVitrogen Corporation, San Diego, Calif. USA）およびｐｉｃＺ（InVitrogen Corp, San Diego, Calif., USA）が挙げられる。これに代えてバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において変異ポリペプチドを発現させることができる。培養された昆虫細胞（例えばＳＦ９細胞）におけるポリペプチドの発現に利用可能なバキュロウイルスベクターにはｐＡｃシリーズ（Smith et al., Mol. Cell. Biol. ３：２１５６ ２１６５（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（Lucklow & Summers, Virology １７０：３１ ３９（１９８９））が含まれる。ｐＣＤＭ８（Seed, Nature ３２９：８４２ ８４６（１９８７））またはｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al., EMBO J. ６：１８７ １９５（１９８７））のような哺乳動物発現ベクターを用いて本発明の核酸を哺乳動物細胞において発現させることができる。原核および真核細胞の双方のための発現系に適当なその他のものに関しては、例えばSambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ２nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８９）１６および１７章を参照されたい。組織特異的および発生学的に調節される調節エレメントは当分野において公知である。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節についての議論は例えばWeintraub et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Trends in Genetics １（１）（１９８６）を参照されたい。
【０１００】
培養下の原核または真核宿主細胞のような本発明の化合物を含む宿主細胞を用いて組換え変異ポリペプチドを生成（すなわち発現）することができる。組換えポリペプチドの精製は当分野において周知であり、そしてイオン交換精製技術または、例えば化合物に対する抗体を伴うアフィニティー精製技術が含まれる。
【０１０１】
トランスジェニック動物
当分野において公知の標準的な手順を用いて本発明のバリアント遺伝子を発現する組換え生物、すなわちトランスジェニック動物を調製する。当業者に公知のいくつかの方法により本発明の構築物を担持するトランスジェニック動物を作ることができる。例えば米国特許第５６１００５３号およびRecombinant DNA, Eds. J.D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski & M. Zoller（W.H. Freeman and Company, New York）pp. ２５４−２７２の「The Introduction of Foreign Genes into Mice」およびその引用文献を参照されたい。発現および／または活性異常に関係する疾患を研究するための、ならびにこれらの疾患の病徴または影響を低減させるための種々の候補薬物、化合物および処置計画をスクリーニングおよび検定するための生物学的モデルとしてヒトイソ遺伝子を安定して発現し、そしてヒトタンパク質を生成するトランスジェニック動物を用いることができる。
【０１０２】
遺伝子発現レベルの特徴付け
ｍＲＮＡレベル（すなわち遺伝子転写レベル）およびポリペプチド遺伝子発現生成物のレベル（すなわち遺伝子翻訳レベル）を検出および測定するための方法は当分野において周知であり、そしてヌクレオチドマイクロアレイの使用ならびに質量分析器および／または抗体検出および定量技術を伴うポリペプチド検出方法を含む。またTom Strachan & Andrew Read, Human Molecular Genetics, ２nd Edition.（John Wiley and Sons, Inc. Publication, New York, １９９９）も参照されたい。
【０１０３】
標的遺伝子転写の決定
生物学的試料、例えば個体の組織または体液中の遺伝子の発現生成物のレベルの決定を種々の方式で実施することができる。「生物学的試料」なる用語は対象から単離された組織、細胞、生物学的液体およびその単離体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および液体が含まれると意図される。多くの発現検出方法は単離されたＲＮＡを用いる。インビトロ法に関しては、ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技術を細胞からのＲＮＡの精製に利用することができる。例えばAusubel et al., Ed., Curr. Prot. Mol. Biol.（John Wiley & Sons, New York, １９８７−１９９９）参照。
【０１０４】
一つの実施態様では、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現生成物のレベルを決定する。特異的ｍＲＮＡのレベルを測定するための方法は当分野において周知であり、そしてノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＰＣＲまたはオリゴヌクレオチドアレイもしくはマイクロアレイへのハイブリダイゼーションによるものを含む。その他のさらに好ましい実施態様では、限定するものではないが血液または血清を含む体液または組織試料中のタンパク質または遺伝子のポリペプチド発現生成物のレベルを決定することにより発現のレベルの決定を実施することができる。例えば米国特許第４８４３１５５の一工程ＲＮＡ単離方法のような当業者に周知の技術を用いて多数の組織試料を容易に加工することができる。
【０１０５】
限定するものではないがサザンまたはノーザン分析、ＰＣＲ分析およびプローブアレイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて単離されたｍＲＮＡを用いることができる。ｍＲＮＡレベルを検出するための一つの好ましい診断方法は、検出されている遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と単離されたｍＲＮＡを接触させることを伴う。核酸プローブは例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのような、そしてストリンジェント条件下で本発明のマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分である全長ｃＤＮＡまたはその一部でよい。本発明の診断アッセイにおいて使用するためのその他の適当なプローブを本明細書で記載する。ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは問題のマーカーが発現されていることを示す。
【０１０６】
一つの形式では、プローブを固体表面に固定し、そしてｍＲＮＡを例えばAffymetrix 遺伝子チップアレイ（Affymetrix, Calif. USA）中プローブと接触させる。当業者は本発明のマーカーによりコードされるｍＲＮＡのレベルを検出するのに使用するために公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適合させることができる。
【０１０７】
試料中の本発明のマーカーに相当するｍＲＮＡのレベルを決定するための代替えの方法は例えばＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４６８３２０２号に示す実験的実施態様）；リガーゼ連鎖反応（Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：１８９−１９３（１９９１））、自律的配列複製（Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７：１８７４−１８７８（１９９０））；転写増幅系（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：１１７３−１１７７（１９８９））；Ｑベータレプリカーゼ（Lizardi et al., Biol. Technology ６：１１９７（１９８８））；ローリングサークル複製（U.S. Pat. No. ５,８５４,０３３）；または任意のその他の核酸増幅方法による核酸増幅の過程を伴い、続いて当業者に周知の技術を用いて増幅した分子を検出する。核酸分子が非常に低数で存在する場合、これらの検出スキームはかかる分子の検出に特に有用である。本明細書で用いるように、「増幅プライマー」は遺伝子の５’または３’領域にアニーリングし（各々プラスおよびマイナス鎖、またはその逆）、そしてその間に短い領域を含有することができる核酸分子の対であると定義される。一般に増幅プライマーは約１０−３０ヌクレオチド長であり、そして約５０−２００ヌクレオチド長の領域をフランキングする。
【０１０８】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は例えば本発明の遺伝子、例えば目的のＳＮＰおよび多型を含有する遺伝子の遺伝子発現レベルを評価するための一つの方式である。ＲＴ−ＰＣＲアッセイはｍＲＮＡ鎖を含むＲＮＡ鎖からのＤＮＡ鎖の合成を触媒するＲＮＡ逆転写酵素を利用する。得られたＤＮＡを特異的に検出および定量することができ、そしてこの方法を用いて特定の種類のｍＲＮＡのレベルを決定することができる。これを行うための一つの方法はTAQMAN（登録商標）（PE Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA）であり、そしてＰＣＲ反応中にAMPLITAQ GOLD（商標）ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を活用してプローブの特異的形態を切断する。これはTAQMAN（商標）プローブと称される。Luthra et al., Am. J. Pathol. １５３：６３−６８（１９９８）； Kuimelis et al., Nucl. Acids Symp. Ser. ３７：２５５−２５６（１９９７）；およびMullah et al., Nucl. Acids Res. ２６（４）：１０２６−１０３１（１９９８））参照。反応の間にプローブの切断はレポーター色素およびクエンチャー色素を分離し、結果的にレポーターの蛍光が増加する。ＰＣＲ生成物の蓄積をレポーター色素の蛍光の増加をモニタリングすることにより直接的に検出する。Heid et al., Genome Res. ６（６）：９８６−９９４（１９９６））。核酸標的の出発コピー数が多いほど、蛍光の有意な増加の観察が早くなる。Gibson, Heid & Williams et al., Genome Res. ６：９９５−１００１（１９９６）参照。
【０１０９】
細胞の転写状態を測定するためのその他のテクノロジーは二重制限酵素消化を相調整（phasing）プライマー（例えば欧州特許第０５３４８５８Ａ１号参照）と組み合わせた方法、または定義されたｍＲＮＡ末端に最も近い部位を有する制限フラグメントを選択する方法のような電気泳動分析のための限定的で複雑な制限フラグメントのプールを生み出す。（例えばPrashar & Weissman, Proc.°Natl. Acad. Sci. USA ９３（２）６５９−６６３（１９９６）参照）。
【０１１０】
その他の方法は複数のｃＤＮＡの各々で各ｃＤＮＡを同定するために十分な塩基、例えば２０−５０塩基をシークエンシングすることによる、または定義されたｍＲＮＡ末端経路パターンに相対した公知の位置で生じる短いタグ、例えば９−１０塩基をシークエンシングすることによるようにｃＤＮＡプールを統計的に試料採取する。例えばVelculescu, Science ２７０： ４８４−４８７（１９９５）参照。試料中のｃＤＮＡレベルを定量し、そして当業者に周知の標準的な統計手段を用いることにより各ｃＤＮＡの平均（mean）、平均（average）および標準偏差を決定する。Norman T.J. Bailey, Statistical Methods In Biology, ３rd Edition（Cambridge University Press, １９９５）。
【０１１１】
ポリペプチドの検出、免疫学的検出方法
検出可能なように標識された、または続いて標識できるプローブにより本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を検出することができる。「標識された」なる用語はプローブまたは抗体に関しては、結合、すなわち物理学的連結によるプローブまたは抗体の直接標識、プローブまたは抗体に対して検出可能な物質、および直接標識されている別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含すると意図される。間接的標識の実例には蛍光標識二次抗体を用いる一次抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようなＤＮＡプローブのビオチンでの末端標識が挙げられる。一般的にプローブは発現されたタンパク質を認識する抗体である。種々の形式を用いて試料が所定の抗体に結合する標的タンパク質を含有するかどうかを決定することができる。本発明の標識ポリペプチドの検出に有用なイムノアッセイ法には、限定するものではないが例えばドットブロッティング、ウェスタンブロッティング、タンパク質チップ、競合および非競合タンパク質結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、ならびに一般に用いられそして科学的および特許文献において広く記載されているその他のものおよび多くの市販により用いられるものが含まれる。当業者は細胞が本発明のマーカーを発現するかどうか、および血液またはその他の身体組織中のその特異的ポリペプチド発現生成物の相対濃度を決定するのに使用するための公知のタンパク質／抗体検出方法を容易に適合させることができる。当業者に周知である技術を用いて個体からのタンパク質を単離することができる。用いられるタンパク質単離方法は例えばHarlow & Lane, Antibodies：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, １９８８））に記載されているようなものでよい。
【０１１２】
開示される遺伝子の一つによりコードされるタンパク質に対する抗体の生成のために、ポリペプチドまたはその一部を注射することにより種々の宿主動物を免疫することができる。かかる宿主動物には、限定するものではないがウサギ、マウスおよびラットが含まれる。宿主の種に依存して、限定するものではないがフロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル；リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような界面活性物質；ならびにカルメットゲ・ラン桿菌（ＢＣＧ）およびコリネバクテリウム・パルバムのような有用な可能性のあるヒトアジュバントを含む種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増強させることができる。
【０１１３】
培養下の連続的な細胞系による抗体分子の生成を提供する任意の技術により、特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を得ることができる。これらには、限定するものではないがKohler & Milstein, Nature ２５６：４９５−４９７（１９７５）；および米国特許第４３７６１１０号のハイブリドーマ技術； Kosbor et al., Immunol. Today ４：７２（１９８３）； Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８０：２０２６−２０３０（１９８３）のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術； ならびにCole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy（Alan R. Liss, Inc., １９８５）pp. ７７−９６のＥＢＶハイブリドーマ技術が挙げられる。
【０１１４】
加えて適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生成のために開発された技術（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８１：６８５１−６８５５（１９８４）； Neuberger et al., Nature ３１２：６０４−６０８（１９８４）； およびTakeda et al., Nature ３１４：４５２−４５４（１９８５）参照）を用いることができる。キメラ抗体は、ネズミｍＡｂおよびヒト免疫グロブリン定常領域から誘導された可変または超可変領域を有するもののような、異なるタンパク質が異なる動物種から誘導される分子である。
【０１１５】
これに代えて、一本鎖抗体の生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号； Bird, Science ２４２：４２３−４２６（１９８８）； Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびWard et al., Nature ３３４：５４４−５４６（１９８９））を差次的に発現された遺伝子一本鎖抗体を生成するために適合させることができる。
【０１１６】
「ヒト化抗体」の生成に有用な技術をタンパク質、そのフラグメントまたは誘導体に対する抗体の生成に適合させることができる。かかる技術は米国特許第５９３２４４８号；第５６９３７６２号；第５６９３７６１号；第５５８５０８９号；第５５３０１０１号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５７８９６５０号；第５６６１０１６号；および第５７７０４２９号に開示されている。
【０１１７】
発現されたタンパク質を検出するために、抗体または抗体フラグメントをウェスタンブロットまたは免疫蛍光技術のような方法において用いることができる。かかる使用において抗体またはタンパク質のいずれかを固体支持体上に固定するのが一般に好ましい。適当な固相支持体または担体には抗原または抗体と結合できる任意の支持体が含まれる。周知の支持体または担体にはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩およびマグネタイトが含まれる。
【０１１８】
検出の容易さに関して有用な方法はサンドウィッチＥＬＩＳＡであり、その多くの変法が存在し、その全てが本発明の方法およびアッセイで用いられると意図される。本明細書で用いる「サンドウィッチアッセイ」は基本的な二部位技術の全ての変法を包含すると意図される。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は双方共に当分野において十分に確立されている。しかしながら、放射性同位体、化学的発光または生物発光分子のようなその他のレポーター分子を用いることもできる。必要とされる使用に適合するためにどのように手順を変化させるかは当業者には明白であろう。
【０１１９】
結合部位が細胞ゲノムによりコードされる複数のタンパク質種に特異的な、固定された、好ましくはモノクローナルの抗体を含むマイクロアレイを構築することにより、タンパク質の全ゲノム、すなわち「プロテオーム」を実施することができる。好ましくはコードされたタンパク質の実質的な分画に関する、または少なくとも目的の生物学的ネットワークモデルの試験もしくは確認に関係するこれらのタンパク質に関する抗体が存在する。前記で記したようにモノクローナル抗体を作成するための方法は周知である。例えばHarlow & Lane, Antibodies：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８８））参照。好ましい実施態様では、細胞のゲノム配列に基づいて設計された合成ペプチドフラグメントに対してモノクローナル抗体を上昇させる。かかる抗体アレイを用いて、細胞からのタンパク質をアレイと接触させ、そしてその結合を当分野において公知のアッセイで測定する。
【０１２０】
ポリペプチドの検出、二次元ゲル電気泳動
二次元ゲル電気泳動は当分野において周知であり、そして典型的には一次元目に等電点電気泳動、続いて二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を伴う。例えばHames et al., Gel Electrophoresis of Proteins：A Practical Approach（IRL Press, New York, １９９０）； Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３：１４４４０−１４４４５（１９９６）； Sagliocco et al., Yeast １２：１５１９−１５３３（１９９６）；およびLander, Science ２７４：５３６−５３９（１９９６）参照。
【０１２１】
ポリペプチドの検出、質量分析
標的ポリペプチドの同一性および発現レベルを、質量分析技術（ＭＳ）を用いて決定することができる。ＭＳ基盤の分析方法論は単離された標的ポリペプチドの分析および生物学的試料中の標的ポリペプチドの分析に有用である。標的ポリペプチドの分析に使用するためのＭＳ様式には、限定するものではないがマトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）のようなイオン化（Ｉ）技術、イオンスプレーまたはサーモスプレー、およびマッシブクラスター衝撃（ＭＣＩ）のような連続的またはパルス的エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および関連する方法が含まれる。かかるイオン供給源は、直線的または非直線的リフレクトロン飛行時間（ＴＯＦ）、単一または複数の四重極、単一または複数の磁場セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、イオントラップおよびイオントラップ／ＴＯＦのようなその組み合わせを含む検出形式に適合させることができる。イオン化には非常に多くのマトリックス／波長の組み合わせ（例えばマトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ））または溶媒の組み合わせ（例えばＥＳＴ）を用いることができる。
【０１２２】
質量分析（ＭＳ）に関しては、標的ポリペプチドを適切な溶液または試薬系中で可溶化することができる。溶液または試薬系、例えば有機または無機溶媒の選択は標的ポリペプチドの特性および実施するＭＳの型に依存し、そして当分野において周知の方法に基づく。例えばＭＡＬＤＩに関してはVorm et al., Anal. Chem. ６１：３２８１（１９９４）；およびＥＳＩに関してはValaskovic et al., Anal. Chem. ６７：３８０２（１９９５）を参照されたい。ペプチドのＭＳはまた例えば国際ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９３／２４８３４号および米国特許第５７９２６６４号にも記載されている。標的ペプチドが気化過程のために導入されたエネルギーにより分解される危険性を最小にする溶媒を選択する。例えばマトリックスに試料を包埋することにより標的ポリペプチド分解の危険性の低減を達成することができる。適当なマトリックスは糖、例えばペントースもしくはヘキソースまたはセルロースのような多糖類のような有機化合物でよい。かかる化合物は熱分解によりＣＯ２およびＨ２Ｏに分解され、化学反応を導き得る残留物は形成されない。マトリックスはまた本質的に何ら残留物を残さないで分解されるアンモニウムの硝酸塩のような無機化合物でもよい。これらのおよびその他の溶媒の使用は当業者に公知である。例えば米国特許第５０６２９３５号参照。エレクトロスプレーＭＳはFenn et al., J. Phys. Chem. ８８：４４５１−４４５９（１９８４）；およびＰＣＴ出願番号第ＷＯ９０／１４１４８号；に記載されており、そして本出願は総説において要約されている。Smith et al., Anal. Chem. ６２：８８２−８９（１９９０）；およびArdrey, Spectroscopy ４： １０−１８（１９９２）参照。
【０１２３】
ＭＳにより決定された標的ポリペプチドの質量を対応する公知のポリペプチドの質量と比較することができる。例えば標的ポリペプチドが変異タンパク質である場合、対応する公知のポリペプチドは対応する非変異タンパク質、例えば野生型タンパク質でよい。ＥＳＩを用いるフェムトモル量での分子量の決定は複数のイオンピークの存在のために非常に正確であり、その全てを質量計算に用いることができる。サブアトモルレベルのタンパク質は例えばＥＳＩ ＭＳ（Valaskovic et al., Science ２７３：１１９９−１２０２（１９９６））およびＭＡＬＤＩ ＭＳ（Li et al., J.°Am. Chem. Soc. １１８：１６６２−１６６３（１９９６））を用いて検出されている。
【０１２４】
マトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）
生物学的試料、例えば体液または組織試料中の標的タンパク質のレベルを、限定するものではないがさらに以下に詳記するようなマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）および表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）として当分野において公知のこれらの技術を含む質量分析（ＭＳ）法を用いて測定することができる。ＭＡＬＤＩを実施するための方法は当業者に周知である。例えばJuhasz et al., Analysis, Anal. Chem. ６８：９４１−９４６（１９９６）を参照されたく、そしてＭＡＬＤＩおよびディレイドエクストラクションプロトコールの記載に関しては例えば米国特許第５７７７３２５号；第５７４２０４９号；第５６５４５４５号；第５６４１９５９号；第５６５４５４５号および第５７６０３９３号もまた参照されたい。分解能を改善するための非常に多くの方法もまた公知である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳはHillenkamp et al., Biological Mass Spectrometry, Burlingame & McCloskey, eds.（Elsevier Science Publ., Amsterdam, １９９０）pp. ４９−６０により記載されている。
【０１２５】
質量分析を用いるマーカー検出のための種々の技術を用いることができる。Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, Hillenkamp, Ed., pp. ３５４−３６２（１９８８）； Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, Karas & Hillenkamp, Eds., pp. ４１６−４１７（１９８８）； Karas & Hillenkamp, Anal. Chem. °６０：２２９９−２３０１（１９８８）；およびKaras et al., Biomed. Environ. Mass Spectrum １８：８４１−８４３（１９８９）参照。ＴＯＦ−ＭＳでのレーザービームの使用は米国特許第４６９４１６７号；第４６８６３６６号、第４２９５０４６号および第５０４５６９４号にて示されており、それはその全てを出典明示により本明細書の一部とする。その他のＭＳ技術によりフラグメント化することなく高分子量バイオポリマーを気化するのに成功でき、そして広範な生物学的高分子を質量分析により分析することが可能になっている。
【０１２６】
表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）
アフィニティー質量分析（ＡＭＳ）として記載されるように、プローブエレメントが特異的被分析物の捕捉およびドッキングに積極的に参加することが可能になる表面を有する新しいＭＳプローブエレメント組成物を用いるその他の技術を用いる。ＳＥＬＤＩ特許米国特許第５７１９０６０号；第５８９４０６３号；第６０２０２０８号；第６０２７９４２号；第６１２４１３７号；および米国特許出願第Ｕ.Ｓ.２００３／０００３４６５号参照。いくつかの型の新しいＭＳプローブエレメントは表面エンハンス型アフィニティーキャプチャー（ＳＥＡＣ）を伴って設計されている。Hutchens & Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom.°７：５７６−５８０（１９９３）参照。ＳＥＡＣプローブエレメントを用いて、タンパク質表面構造および生体特異的分子認識について公知であることを活用することにより、異なるクラスのバイオポリマー、特にタンパク質を取り出し、そして拘束することに成功している。ＭＳプローブエレメント表面に固定したアフィニティーキャプチャー装置、すなわちＳＥＡＣはプローブ表面のために被分析物の位置および親和性（特異性）を決定し、したがって続く分析用ＭＳ過程が効率的である。
【０１２７】
ＳＥＬＤＩの一般的なカテゴリー内に三つの別個のサブカテゴリーが存在する：（１）プローブエレメント表面、すなわち試料提示手段が表面に直接的（ニート）に加えられた被分析物の脱離イオン化を促すために「マトリックス」の代わりにエネルギー吸収分子（ＥＡＭ）を含有するように設計されている表面エンハンス型ニート脱離(Surfaces Enhanced for Neat Desorption)（ＳＥＮＤ）。（２）プローブエレメント表面、すなわち試料提示手段が種々の機構（たいていは非共有結合）により被分析物のプローブ表面への特異的または非特異的いずれかの付着または吸収（いわゆるドッキングまたは拘束）を促すために化学的に定義された、および／または生物学的に定義されたアフィニティーキャプチャー装置を含有するように設計されているＳＥＡＣ。（３）プローブエレメント表面、すなわち試料提示手段が共有結合ドッキング装置として提供されるために一つもしくはそれより多い型の化学的に定義された架橋分子を含有するように設計または修飾されている表面エンハンス型光解離性付着／放出（Surfaces Enhanced for Photolabile Attachment and Release）（ＳＥＰＡＲ）。ＳＥＰＡＲ試料提示手段（すなわちプローブエレメント表面）と被分析物（例えばタンパク質）との間の光解離性分子付着点の型および数を決定する化学的特異性は被分析物にいずれか一つもしくはそれより多い数の異なる残基または化学構造を伴い得る（例えばタンパク質およびペプチドの場合、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、ＰｈｅおよびＣｙｓ残基）。
【０１２８】
機能化ポリペプチド
本発明のポリペプチドを修飾して固体支持体への抱合を促すことができる。化学的または物理的部分を適切な位置でポリペプチドに組み込むことができる。例えばポリペプチドのカルボキシル末端もしくはアミノ末端に、またはペプチドのアミノ酸に（例えば反応性側鎖にまたはペプチドバックボーンに）適切な官能基を加えることにより目的のポリペプチドを修飾することができる。しかしながら当業者は、かかる修飾、例えばビオチン部分の組み込みが特定の試薬がポリペプチドと特異的に相互作用する能力に影響し得ることを認識し、そしてしたがって関係がある場合、目的のポリペプチドをどのように修飾するのが最適であるかを選択するにあたりこの因子を考慮するであろう。通常ポリペプチドに存在する天然発生アミノ酸はまたポリペプチドを固体支持体に抱合させるのに適当な官能基を含有することもできる。例えばポリペプチドに存在するシステイン残基を用いて、ジスルフィド連結を介してスルフヒドリル基を含有する支持体、例えばそこに付着したシステイン残基を有する支持体にポリペプチドを抱合させることができる。２個のアミノ酸間に形成され得るその他の結合には、限定するものではないが例えばポリペプチドに組み込まれ得る非天然発生アミノ酸である２個のランチオニン残基間のモノスルフィド結合；Ｇｌｕのｙカルボキシル基（またはＡｓｐのアルファカルボキシル基）とＬｙｓのアミノ基との間のような酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸の側鎖の間のアミノ基転移反応により形成されるラクタム結合；または例えばＳｅｒのヒドロキシ基とＧｌｕのカルボキシル基との間の架橋により生成されるラクトン結合が含まれる。したがって、望ましいアミノ酸残基、例えばＧｌｕ残基を含有するように固体支持体を修飾することができ、そしてＳｅｒ残基、特にＮ末端またはＣ末端のＳｅｒ残基を有するポリペプチドをラクトン結合の形成を介して固体支持体に抱合させることができる。ポリペプチドのＳｅｒでラクトン様結合を形成するのが望ましい場合、支持体を特定のアミノ酸、例えばＧｌｕを含有するように修飾する必要はないが、代わりに接近可能なカルボキシル基を含有する様に修飾し、したがってＧｌｕのアルファカルボキシル基に相当する官能基を提供することができる。
【０１２９】
チオール反応性機能
チオール反応性機能はポリペプチドの固体支持体への抱合に特に有用である。チオール反応性機能は求核性チオール部分と速やかに反応して共有結合、例えばジスルフィド結合またはチオエーテル結合を生じることができる化学的基である。種々のチオール反応性機能は当分野において公知であり、例えばヨードアセチルのようなハロアセチル；ジアゾケトン；エポキシケトン、アルファエノンおよびベータエノンのようなアルファおよびベータ不飽和カルボニル；ならびにマレイミドのようなその他の反応性マイケル受容体；酸ハロゲン化物；ベンジルハロゲン化物；等が含まれる。Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, ２nd Edition（John Wiley & Sons, １９９１）参照。
【０１３０】
所望により光解離性保護基でチオール基を遮断することができ、次いでそれを例えばフォトリソグラフィーにより選択的に切断して目的のポリペプチドの固定のために活性化された表面の部分を提供することができる。光切断可能な保護基は当分野において公知であり（例えば公開国際ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９２／１００９２号；およびMcCray et al., Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. １８：２３９−２７０（１９８９）参照）、そして例えばフォトリソグラフィーマスクを用いて表面の選択された面積の照射により選択的に遮断解除することができる。
【０１３１】
リンカー
リンカーを介して目的のポリペプチドを直接支持体に付着させることができる。直接かまたはスペーサーを介してかのいずれかでペプチドまたはアミノ酸の支持体への連結に適当であることが当業者に公知の任意のリンカーを用いることができる。例えば可変スペーサーの手段によりポリペプチドをビーズのような支持体に抱合させることができる。リンカーにはリンクアミドリンカー（例えばリンク、Tetrahedron Lett. ２８：３７８７（１９７６）参照）；塩化トリチルリンカー（例えばLeznoff, Ace Chem. Res. １１：３２７（１９７８）参照）；およびメリフィールドリンカー（例えばBodansky et al., Peptide Synthesis, ２nd Edition（Academic Press, New York, １９７６）参照）が含まれる。例えばトリチルリンカーが公知である。例えば米国特許第５４１００６８号および第５６１２４７４号参照。アミノトリチルリンカーもまた公知である。例えば米国特許第５１９８５３１号参照。その他のリンカーには融合タンパク質に組み込まれ、そして宿主細胞において発現され得るものが含まれる。かかるリンカーをアミノ酸、酵素基質または任意の適当なペプチドから選択することができる。核酸を単離する場合、リンカーを例えばプライマーの適切な選択により作成することができる。これに代えて、それらを目的のタンパク質の翻訳後修飾により加えることができる。ペプチドの支持体への化学的連結に適当であるリンカーにはジスルフィド結合、チオエーテル結合、ヒンダードジスルフィド結合ならびにアミンおよびチオール基のような遊離反応性基間の共有結合が含まれる。
【０１３２】
切断可能なリンカー
リンカーは選択条件下で切断されるように可逆的な連結を提供することができる。とりわけ光切断可能なリンカー（米国特許第５６４３７２２号参照）、酸切断可能なリンカー（Fattom et al., Infect. Immun. ６０：５８４−５８９（１９９２）参照）、酸不安定性リンカー（Welhoener et al., J. Biol. Chem. ２６６：４３０９−４３１４（１９９１）参照）および熱感受性リンカーを含む選択的に切断可能なリンカーが有用である。連結は例えばメルカプトエタノールもしくはジチオエリスロールにより化学的に切断可能であるジスルフィド結合；光切断可能にできるビオチン／ストレプトアビジン連結；酸性条件に暴露することにより、もしくはＭＳ条件下で切断することができるトリチルエーテル基のヘテロ二機能性誘導体（Koester et al, Tetrahedron Lett. ３１：７０９５（１９９０）参照）；ヒドラジニウム／酢酸バッファーを用いてほぼ中性の条件下で切断できるレブリニル媒介連結；そのいずれかをトリプシンのようなエンドペプチダーゼにより切断することができるアルギニン−アルギニンもしくはリジン−リジン結合；ピロホスファターゼにより切断することができるピロリン酸結合；またはリボヌクレアーゼを用いて、もしくはアルカリ条件に暴露することにより切断することができるリボヌクレオチド結合でよい。３−アミノ−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸のような光解離性架橋を固体支持体からのポリペプチドの切断のための手段として用いることができる。Brown et al., Mol Divers, pp. ４−１２（１９９５）； Rothschild et al., Nucl. Acids. Res. ２４：３５１−６６（１９９６）；および米国特許第５６４３７２２号。その他のリンカーには、リボザイムおよびその他のＲＮＡ酵素により切断可能であるＲＮＡリンカー、ならびにヒトＩｇＧ１の定常領域からのＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３のような種々ドメインのようなリンカーが含まれる。Batra et al., Mol Immunol ３０：３７９−３９６（１９９３）参照。
【０１３３】
任意のリンカーの組み合わせもまた本明細書では意図される。例えばシリル連結または光切断可能な連結のようなＭＳ条件下で切断可能であるリンカーをこれらの条件下で切断されないが、別の条件下で切断され得るアビジンビオチン連結のようなリンカーと組み合わせることができる。酸不安定性結合は３−ＨＰＡマトリックス溶液の添加時に標的ポリペプチドのコンディショニングの間に切断されるので、酸不安定性リンカーは質量分析、特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのためにとりわけ有用な化学的に切断可能なリンカーである。酸不安定性結合を別個のリンカー基、例えば酸不安定性トリチル基として導入することができるか、またはジイソプロピルシリルを用いて一つもしくはそれより多いシリル橋を導入し、それによりポリペプチドと固体支持体との間にジイソプロピルシリル連結を形成することにより合成リンカーに組み込むことができる。１.５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または３−ＨＰＡ／１％ＴＦＡ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリックス溶液のような穏やかな酸性条件を用いてジイソプロピルシリル連結を切断することができる。ジイソプロピルシリル連結およびその類似体の調製のための方法は当分野において周知である。例えばSaha et al., J. Org. Chem. ５８：７８２７−７８３１（１９９３）参照。
【０１３４】
ポリペプチドを固定するためのピンツールの使用
ピンツールを用いる目的のポリペプチドの固体支持体への固定が特に有利であり得る。ピンツールには本明細書で開示するもの、またはそれ以外の当分野において公知のものが含まれる。例えば米国出願番号第０８／７８６９８８号および第０８／７８７６３９号；および国際ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９８／２０１６６号参照。
【０１３５】
アレイ、例えば４X４アレイのピンツールを目的のポリペプチドを容れるウェルに適用することができる。ピンツールが各ピンチップ付着した官能基を有するか、または固体支持体例えば機能化ビーズもしくは常磁性ビーズが各ピンに付着している場合、ウェルのポリペプチドを捕捉することができる（最大能力１ピコモル）。捕捉工程の間、捕捉効率を高めるためにピンを動かし続けることができる（垂直方向、道程１−２ｍｍ）。インビトロ転写のような反応がウェル中で実施される場合、ピンの動きが反応の効率を高めることができる。ピンツールに電場を適用することによりさらに固定させることができる。電圧をピンツールに適用すると、ポリペプチドはその正味電荷に依存して陽極または陰極に付着する。
【０１３６】
さらに具体的には、目的のポリペプチドのみがピンに結合するようにピンツール（電圧を伴うかまたは伴わない）を、目的のポリペプチドに特異的な試薬をそこに抱合しているように修飾することができる。例えばポリヒスチジン配列を含有するポリペプチドのみが結合するように、ピンにニッケルイオンを付着させることができる。同様に、抗体に認識されるエピトープを含有する標的ポリペプチドのみがピンに結合するように、ピンはそこに付着した、または今度はピンに付着しているビーズに付着した、標的ポリペプチドに特異的な抗体を有することができる。
【０１３７】
例えばＵＶ／ＶＩＳ、ＩＲ、蛍光、化学発光、ＮＭＲ分光法、ＭＳもしくはその他の当分野において公知の方法、またはその組み合わせのような分光測定技術を含む種々の手段により捕捉したポリペプチドを分析することができる。条件が捕捉したポリペプチドの直接分析を妨げる場合、試料濃度の利点が失われないような条件下でポリペプチドをピンから遊離または移動させることができる。したがって、最小容量の溶出液を用いて、そして試料を何ら喪失することなく、ピンからポリペプチドを除去することができる。ポリペプチドがピンに付着したビーズに結合している場合、ポリペプチドを含有するビーズをピンから除去し、そしてビーズから直接測定することができる。
【０１３８】
ピンツールはアレイで空間的にアドレス指定可能な様式で目的のポリペプチドを固定するのに有用であり得る。かかる空間的にアドレス指定可能なまたはプレアドレス指定可能なアレイは例えば品質管理およびアミノ酸シークエンシング診断を含む種々の方法で有用である。米国出願番号第０８／７８６９８８号および第０８／７８７６３９号ならびに国際ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９８／２０１６６号に記載されるピンツールは固体支持体表面でポリペプチドのマルチエレメントアレイを作成するために用いることができる連続および並行分配用具である。アレイ表面は平坦でビーズを伴うか、またはビーズを含有できるウェルを含むように形状的に変化させることができる。加えてＭＳ形状をピンツール装置を収容するために適合させることができる。
【０１３９】
生物学的状況のその他の態様
本発明の種々の実施態様では、薬物および経路応答を得るために生物学的に活性な状況の態様、または混ざり合った態様を測定することができる。細胞機能の特徴付けに関係するタンパク質の活性を測定することができ、そして本発明の実施態様はかかる測定を基礎とすることができる。特徴付けされている特定の活性に適切な任意の機能的、生化学的または物理学的手段により活性測定を実施することができる。活性が化学的変換を伴う場合、細胞タンパク質を天然基質と接触させ、そして変換の速度を測定することができる。活性が多量体単位での関連性、例えば活性化されたＤＮＡ結合複合体とＤＮＡとの関連性を伴う場合、転写されたｍＲＮＡの量のような関連するタンパク質の量または関連性の二次的な結果を測定することができる。また、例えば細胞サイクル制御におけるような機能的活性のみが公知である場合、機能の実施を観察することができる。タンパク質活性の変化は公知でっても、測定されていても、本発明の方法により分析された応答データを形成する。代替えの、および非限定的な実施態様では、応答データは細胞の生物学的状況の混ざり合った態様の形態を為し得る。例えば特定のｍＲＮＡの存在量の変化、特定のタンパク質の存在量の変化および特定のタンパク質活性の変化から応答データを構築することができる。
【０１４０】
本発明の好ましい実施態様をさらに十分に説明するために以下の実施例を提示する。この実施例を添付の請求の範囲に定義されるように本発明の範囲を限定するとは決して解釈すべきではない。
【実施例】
【０１４１】
（実施例）
遺伝子ＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＡＣＡＣＢおよびＳＣＤ１における遺伝的多様性は北米白色人種の２型糖尿病に関連する
序文および要旨
この実施例の目的は疾患の同一性に関するバイオマーカーを提供することによりさらに正確に２型糖尿病を定義することである。かかるバイオマーカーはより良好な診療のために薬物標的を同定し、そして個体に合わせた医薬品に基づいてより効果的に患者を処置することを助ける。
【０１４２】
Ｔ２ＤＭ多型関連解析において用いられる集団の層
分析は１０００人を超える２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の参加者および１０００人を超える正常な対照からなった。ＵＳＡコレクションのみを用いて研究を行った。参加者は白色人種のみに限定され、中央および南アメリカからの参加者は排除された。
【０１４３】
糖尿病参加者のための研究基準
サーベイソース（ＵＳコレクションのみ）を用いて以下の基準を参加者選択に適用した：（１）糖尿病参加者は２型糖尿病を有するが、１型糖尿病を有さないことを確認した。（２）参加者の空腹時血糖レベルは少なくとも１回の測定で≧１４０ｍｇ／ｄｌであった。（３）ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨＢＡ１Ｃ）試験は少なくとも１回の測定で≧７であった。１００４人の糖尿病参加者がこれらの基準に合致した。糖尿病参加者の年齢は＞３０歳および≦８０歳であった。診断時の参加者の年齢もまた＞３０歳および≦８０歳であった。糖尿病参加者の肥満度指数（ＢＭＩ）は≧２５および≦４０であった。
【０１４４】
対照のための研究基準
対照に関しては以下の基準を適用した：対照は１型または２型糖尿病を有さなかった。１６０９人の対照参加者がこれらの基準に合致した。対照参加者の年齢は＞３０歳であった。対照参加者の肥満度指数（ＢＭＩ）は≧２５および≦４０であった。
【０１４５】
適合基準および症例対照比較
以下の基準を用いて糖尿病の症例および対照が一致した：（１）性別の正確な一致、（２）＋／−５歳の年齢の一致（すなわち糖尿病と対照との間の最大年齢差＝５歳）。（３）肥満度指数（ＢＭＩ）＋／−５単位の一致。最終的に糖尿病と対照との間の最大差＝４.９単位。各々の糖尿病参加者および対照から血液試料を収集した。
【０１４６】
一塩基多型遺伝子型分類
９個の遺伝子で全部で１１５個のＳＮＰの遺伝子型分類に成功した。ＯＭＩＭ、ＳＮＰコンソーシアム、Locus LinkおよびｄｂＳＮＰのようなデータベースからの情報を用いてＳＮＰアッセイを設計した。
【０１４７】
一塩基伸長、続いてSequenom’s MassArray（商標）テクノロジーを用いる質量分析により全てのＳＮＰの遺伝子型分類を実施した。Ross et al., Nat. Biotechnol. １６：１３４７−１３５１（１９９８）。この系での遺伝子型の確認は均一な質量増加（homogenous Mass Extension）（ｈＭＥ）反応生成物のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析に基づく。ｈＭＥ反応の間、プライマーはＳＮＰアレルに依存して特定数のヌクレオチドおよびＳＮＰのすぐ３’の数個の塩基により伸長する。伸長は所定のアレルに一致する３個のジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）のいずれか一つを組み込むことにより停止するか、または対立のアレルに一致する１個のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を用いて持続される。したがってｈＭＥ反応は異なる質量（ダルトン）のアレル特異的伸長生成物を生成する。これらのｈＭＥ生成物の質量差に基づいて多くの異なるアッセイを同時に行うことができ（マルチプレックス）、それにより費用効率が高く、そして高処理の遺伝子型分類が提供される。各々の質量特異的ピークはマルチプレックスで各ＳＮＰからの二つの伸長生成物の公知の配列に基づいて特異的アレルと称される。過程を通じてバーコード化された追跡を用いて自動化することにより全遺伝子型分類過程を支援する。最終的な遺伝子型データは承認され、そしてプラットフォーム系から最終統計分析のためのデータベースに移される。組み合わされた保守的および適度なコールの通過率が９５％よりも大きいかまたはそれに等しく、そして公称ＨＷＥ ｐ値が０.０１またはそれより高い場合、遺伝子型データは所定のアッセイで通用すると考えられる。
【０１４８】
検定した全ＳＮＰのリストを表２に記載する。
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【０１４９】
ＳＮＰ関連性検定に関する統計方法、単一マーカー関連性検定
見せかけの状態とマーカーの各々との間の関連性の検定をアレル頻度および遺伝子型頻度の双方に基づいて実施した。アレル頻度測定のために、二つの見せかけの群の各アレルの観察された数をまとめた分割表を自由度（ｄｆ）１のｘ２検定と関連性のない帰無仮説からの期待値と比較した。少なくとも一つのスパースマージン(sparse margin)（観測数＜１０）を有する分割表では代わりにフィッシャーの正確確率検定を使用した。同様に遺伝子型に基づく関連性に関しては、２ｄｆのｘ２検定、または少なくとも一つのスパースマージンを有する分割表に関するフィッシャーの正確確率検定を用いて二つの見せかけの群の遺伝子型の数を、疾患と遺伝学との関連性がない期待値と比較した。加えて遺伝の劣勢または優勢様式から誘導される遺伝子型基盤の関連性を検出するために、観察されたデータに関する分割表の構築において、ヘテロ接合型遺伝子型の数をメジャーまたはマイナーアレルの各々に関するホモ接合型遺伝子型の数と比較した。再度１ｄｆのｘ２検定、またはフィッシャーの正確確率検定のいずれかを用いて、遺伝の特異的モデルを示す見せかけの状況と関連性のない帰無仮説からの偏差を評価した。
【０１５０】
アレル基盤および遺伝子型基盤の双方の仮説検定に関しては、Westfall P & Young S, Resampling−based multiple testing： examples and methods for p−value adjustment（Wiley, New York, １９９３）p. ３４０の標準的な再抽出手順により分析分布からの有意性を確認した。帰無仮説を推定するために検定統計を、少なくとも５０００のシミュレーションデータセットに関してコンピューター処理したが、その各々は置き換えなしに無作為に抽出することにより対象に再割り当てされた見せかけの状態を有するが、元来のデータからの遺伝子型割り当てを保存している。関連性の有意性をさらに評価するために、またシミュレーション帰無分布を用いてマーカーに関して補正されたｐ値をコンピューター処理した。ＳＮＰの各群（すなわち単一の遺伝子の全てのＳＮＰまたは全てのシングルトンＳＮＰを一緒に）は複数の仮説の別個のセットと見なされた。各群に関して最良のマーカーの統計を、補正されたｐ値を推定するために再抽出されたデータから誘導される最大値分布と比較した。各群の残りのマーカーの統計に関して、被験マーカーｐ値より大きいかまたはそれと等しい未補正ｐ値を有したこれらのマーカーのみを含有する元来の群からのマーカーのサブセットの再抽出されたデータから推定された最大値分布との比較から補正ｐ値を誘導した。時には最大値に関するこれらの入れ子型帰無分布が、その未補正のものと同一の方式で指定されなかった補正ｐ値を生じた。これらのマーカーに関して、最も近く、より小さい未補正ｐ値を有するマーカーに関する補正ｐ値に等しい補正ｐ値を設定することにより単調性を課した。Westfall P & Young S, Resampling−based multiple testing： examples and methods for p−value adjustment（Wiley, New York, １９９３）p. ３４０； Schaid DJ et al., Am. J. Hum. Genet. ７０（２）：４２５−３４（２００２）参照。
【０１５１】
遺伝子型分類の特質を評価するために、および分析した集団の潜在的層構造を検出するために、各ＳＮＰに関して観察された遺伝子型頻度を１ｄｆのｘ２検定によりサンプルから推定されたアレル頻度に基づくハーディワインベルグ期待値と比較した。
【０１５２】
この分析ではＲ統計パッケージ（Becker R et al., The new S language：A programming environment for data analysis and graphics（Wadsworth & Brooks／Cole Advanced Books, Pacific Grove, １９８８）p. ７０２）およびハプロタイプブロック構造の分析にはハプロビュー（Barrett JC et al., 「Haploview：analysis and visualization of LD and haaplotype maps」 Bioinformatics（２００４））を使用した。
【０１５３】
ハプロタイプ分析
バイナリ形質（binary trait）に関する推奨されるパラメーターを用いてＲのhaplo.statsパッケージのhaplo.scoreプログラムを用い全てのハプロタイプ関連解析を実施したBecker R, Chambers J & Willks A, The new S language： a programming environment for data analysis and graphics（Wadsworth & Brooks／Cole Advanced Books, Pacific Grove, １９８８）p. ７０２； Schaid DJ et al., Am. J. Hum. Genet. ７０（２）：４２５−３４（２００２）参照。haplo.score はＥＭアルゴリズムを用いて遺伝子型からハプロタイプを推測し、そして遺伝子座での個体のハプロタイプおよびハプロタイプの全セットの双方に関して形質との関連性を検定する。双方の検定に関する関連性の有意性を分析分布から、および再抽出による実証的帰無分布から決定し、実証的分布は前記したような最も密接に関連したハプロタイプに関する最大値統計を評価するためにも使用した。haplo.scoreの使用説明書は、遺伝子型データを欠いている対象はハプロタイプ推論を劇的に劣化させると警告しており、そして我々の経験によりこの注意はさらに強調された。とりわけ遺伝子ＡＣＡＣＢに関するhaplo.scoreでのハプロタイプ推論および完全なデータは、遺伝子座を２個の群（ＳＮＰ Ｔ２７４５６Ｃ−Ａ７０９４１ＧおよびＡ７１４３４Ｇ−Ａ１３６１７８Ｇ）に分けなければ集まらず、そして次にさらにパラメーターをそのデフォルト設定から変化させなければならなかった。とりわけ基準パラメーター「挿入バッチサイズ」はそのデフォルト設定の６から下げなければならなかった（表３参照）。したがって各遺伝子に関して、全データセットのみならず全ＳＮＰに関する、およびプログラムハプロビューによるブロック構造から決定されるような主要なハプロタイプ多様性を捕捉すると推測された「タグ」ＳＮＰの数の低下に関する完全な遺伝子型情報を有した個体のサブセットまでにも分析を実施した。「タグ」ＳＮＰ法は、いくつかの遺伝子型データを欠いている個体を含むＳＮＰの全てを用いるハプロタイプ推論と、完全なデータを有する個体のみを含むＳＮＰの全てを用いるハプロタイプ推論との間の妥協を示す。異なる分析の様式での適格な対象の数に関しては表３を参照されたい。
【０１５４】
【表１４】
【表１５】
【０１５５】
ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）関連性
遺伝子ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）における遺伝的多様性は２型糖尿病と関連する。３個の遺伝子型（相互優勢モデル）全てを用いる遺伝子型分析により、遺伝子型分類された１４個のＳＮＰのうち３個のＳＮＰ（ｒｓ３８７０７４７、ｒｓ７８４９およびｒｓ１３９３４９１）が糖尿病表現型と統計的に有意な関連性を示した（Ｐ＜０.０５）。
【０１５６】
ＳＣＤは不飽和脂肪酸の合成および脂質生成における律速段階を触媒する。ＳＣＤの主要な生成物はオレイン酸であり、それはステアリン酸の不飽和化により形成される。遺伝的肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ）の肝臓の転写プロファイリングの分析により、レプチンはＳＣＤ１のＲＮＡレベルおよび酵素活性を特異的に抑制することが示された。Ｓｃｄ１を欠くマウスはやせて、そして代謝亢進状態であり；Ｓｃｄ１に変異を有するｏｂ／ｏｂマウスはｏｂ／ｏｂ対照よりも有意に肥満が少なく、そしてエネルギー消費が著明に増加していた。ＳＣＤ１に変異を有するｏｂ／ｏｂマウスは組織学的に正常な肝臓を有し、トリグリセリド貯蔵およびＶＬＤＬ生成が有意に低下していた。ＳＣＤ１欠損の主な結果はトリグリセリド合成および貯蔵の低下に加えて脂質酸化の活性化であると仮定される。Cohen P et al., Science ２９７：２４０−２４３（２００２）。
【０１５７】
したがってＳＣＤ阻止は肥満、インスリン抵抗性、脂肪肝疾患およびＴ２ＤＭを処置するための有望な研究法である。
【０１５８】
表４はこの分析に用いたＳＣＤ ＳＮＰをまとめている。３個の遺伝子型（相互優勢モデル）全てを用いる遺伝子型分析により、遺伝子型分類に成功した１４個のうち３個のＳＮＰ（ｒｓ３８７０７４７、ｒｓ７８４９およびｒｓ１３９３４９１）が糖尿病表現型と統計的に有意な関連性を示した（Ｐ＜０.０５）。表は対照および糖尿病患者における各ＳＮＰの頻度ならびに二つの関連解析方法（アレルによるものおよび遺伝子型によるもの）を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるハーディワインベルグ平衡（ＨＷＥ）はｒｓ３８７０７４７を除く、これらのＳＮＰのうちの２個に関して良好である。
【０１５９】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【０１６０】
要約すれば、我々の結果により複数のＳＣＤバリアントがＴ２ＤＭに関与することが示唆される。これらのＳＮＰを用いてＴ２ＤＭ診断を改善し、患者のより良好な階層化により臨床試験設計を助けることができる。
【０１６１】
肝細胞核因子１β（ＨＮＦ１α、ＨＮＦ２、ＴＣＦ２）関連性
アレル特異的分析（ｐ＜０.０１）ならびに優性および劣性双方のモデルを用いる遺伝子型分析（ｐ＜０.０５）の双方によりＳＮＰ ｒｓ１１６５１７５５のＧアレルはＴ２ＤＭの高い出現率と関連する。
【０１６２】
転写因子肝細胞核因子１β（ＨＮＦ１β、ＨＮＦ２、ＴＣＦ２）を含有するホメオドメインにおける変異は、しばしば早期発症型進行性非糖尿病性腎機能障害に関連する若年発症成人型糖尿病のまれなサブタイプを引き起こすことがわかっている。 Horikawa Y et al.,（Letter）Nature Genet. １７：３８４−３８５（１９９７）。ＴＣＦ２はまた２型糖尿病のより一般的な形態に関する可能性のある候補遺伝子であろうと仮定された。
【０１６３】
ＴＣＦ２のイントロン領域内に位置するＳＮＰ ｒｓ１１６５１７５５をこの分析に使用した。配列番号：１６６は周辺配列内のバリアントの正確な位置を示す：ＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＡＧＴＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣＣＧＴＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣＡＣＴＡＡＣＣＴＣＲ（Ａ／Ｇ）ＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＴＧＡＧＧＴＧＴＡＣＣＧＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＧＧＣＣＴＣＡＴＧＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡＧＴＴＧＴＡＧＣＴＴＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＧＡＣＣＡＴＡＧＧＴＡＧＣＡＣＣＣＣＣＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＣＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＡＡＣＣＡＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＣＴＡＧＴＧＡＧＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号：１６６）。
【０１６４】
表５は結果をまとめている。Ｇに関する全体のアレル頻度は非糖尿病患者の４８.０８％と比較して糖尿病患者で５２.６４％である。アレル特異的分析（ｐ＜０.０１）ならびに３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）および優性および劣性のモデルのいずれかを用いる遺伝子型分析（ｐ＜０.０５）の双方によりＧアレルはＴ２ＤＭの高い出現率と関連する。
【０１６５】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【０１６６】
この分析により、ＭＯＤＹ５におけるその重要な役割に加えて、ＴＣＦ２はＴ２ＤＭのより一般的な形態に関する病因に関与することが示される。
【０１６７】
エストロゲン関連受容体α（ＥＳＲＲＡ）関連性
アレル特異的分析ならびに３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）および優性モデルを用いる遺伝子型分析の双方によりＳＮＰ（ｇｓ２２９６０１６２３およびｒｓ１１６００９９０）がＴ２ＤＭとの関連性を示した（ｐ＜０.０５）。３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）および優性モデルを用いる遺伝子型分析によりＳＮＰ ｒｓ２２７６０１４はＴ２ＤＭの高い出現率と関連する（ｐ＜０.０５）。
【０１６８】
ＥＳＲＲＡは腎臓、心臓および褐色脂肪細胞、脂肪酸を優先的に代謝する全ての組織で高度に発現されるオーファン核受容体転写因子である。ミトコンドリア発生およびインビボでの細胞エネルギー平衡を調節するのに重要な役割を果たすと仮定されている。インスリン抵抗性は骨格筋におけるトリグリセリド沈着と組織の脂肪酸酸化能力との間の不均衡の結果として発達し得る。この能力は組織ミトコンドリア密度に直接的に依存する。したがってミトコンドリア発生の刺激による骨格筋ミトコンドリア密度の上昇は脂肪酸酸化能力を高め、インスリン感受性の改善に至ると予測される。
【０１６９】
したがってＥＳＲＲＡ刺激は肥満、脂質代謝異常、インスリン抵抗性およびＴ２ＤＭを処置するための有望な研究法である。
【０１７０】
表６はこの分析に用いたＥＳＲＲＡ ＳＮＰをまとめている。３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）または優性モデルを用いる遺伝子型分析により３個のＳＮＰ（ｇｓ２２９６０１６２３、ｒｓ２２７６０１４およびｒｓ１１６００９９０）がＴ２ＤＭとの関連性（を示したｐ＜０.０５）。アレル特異的分析によりこれら３個のＳＮＰのうちの２個（ｇｓ２２９６０１６２３およびｒｓ１１６００９９０）もまたＴ２ＤＭと関連性を示した（ｐ＜０.０５）。表は対照および糖尿病患者における各ＳＮＰの頻度および二つの関連解析方法を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるＨＷＥはこれらのＳＮＰに関して良好である。
【０１７１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【０１７２】
要約すれば、我々の結果により複数のＥＳＲＲＡバリアントがＴ２ＤＭの発達に寄与しているかもしれないことが示唆される。これらのＳＮＰおよびハプロタイプを用いてＴ２ＤＭ診断を改善し、患者のより良好な階層化により臨床試験設計を助けることができる。
【０１７３】
ＥＳＲＲＡハプロタイプ分析
加えて、ＥＳＲＲＡゲノム領域内の１個のハプロタイプ（ｈａｐ３）との有意な関連性（ｐ＜０.０５）もまた見出された。二つのハプロタイプ関連性方法をこの分析に使用した：Global ｐおよびMax−Stat ｐ（表３および表７参照）。
【０１７４】
【表２５】
【表２６】
【０１７５】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマコアクチベーター１α（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ；ＰＧＣ−１α）関連性
アレル特異的分析および３個の表現型全てを用いるかまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析により２個のＳＮＰ（ｒｓ２３０５６８３およびｒｓ４４６９０６４）がＴ２ＤＭとの関連性を示した（ｐ＜０.０５）。３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）を用いる遺伝子型分析により１個のさらなるＳＮＰ（ｒｓ１５３２１９５）がＴ２ＤＭのより高い出現率と関連する（ｐ＜０.０５）。
【０１７６】
ＰＧＣ１αは脱共役タンパク質２（Ｕｃｐ２）の誘導により、ならびに核呼吸因子、Ｎｒｆ１およびＮｒｆ２の調節により、マウスの筋肉細胞においてミトコンドリア生合成および呼吸を刺激する。Wu Z et al., Cell ９８：１１５−１２４（１９９９）。それは肝臓でインスリン調節される糖新生において重要な役割を果たす。Yoon JC et al., Nature ４１３：１３１−１３８（２００１）。
【０１７７】
マイクロアレイ発現研究により、ヒト糖尿病の筋肉における酸化的リン酸化に関与する遺伝子のセットの発現の少しであるが協調的な低下が示された。これらの遺伝子の発現はインスリン媒介の糖処理の部位で高く、ＰＧＣ１αにより活性化され、そして全身有酸素容量と相関する。ＰＧＣ１α発現は糖尿病患者では低い。Mootha VK et al., Proc Natl Acad Sci U S A. １０１（１７）：６５７０−５（April ２７, ２００４）。
【０１７８】
これらのデータにより、ＰＧＣ−１αはヒトＴ２ＤＭの発達において重要な役割を果たし、そしてＰＧＣ−１α媒介の酸化的リン酸化経路の改善が糖尿病を処置するための可能性のある研究法であることが示唆される。
【０１７９】
表８はこの分析で用いたＰＧＣ−１α ＳＮＰをまとめている。アレル特異的分析および３個の表現型全てを用いるかまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析により２個のＳＮＰ（ｒｓ２３０５６８３およびｒｓ４４６９０６４）がＴ２ＤＭとの関連性を示した（ｐ＜０.０５）。３個の遺伝子型全て（相互優性モデル）を用いる遺伝子型分析により１個のさらなるＳＮＰ（ｒｓ１５３２１９５）がＴ２ＤＭのより高い出現率と関連する（ｐ＜０.０５）。表はまた対照および糖尿病患者における各ＳＮＰのアレル頻度および二つの関連解析方法を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるＨＷＥはｒｓ１５３２１９５を除くこれらの２個のＳＮＰに関して良好である。
【０１８０】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【０１８１】
要約すれば、複数のＰＧＣ−１αバリアントがＴ２ＤＭと関連している。これらのＳＮＰおよびハプロタイプを用いてＴ２ＤＭ診断を改善し、患者のより良好な階層化により臨床試験設計を助けることができる。
【０１８２】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体δ（ＰＰＡＲＤ）関連性
アレル特異的分析および３個の遺伝子型全てまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析によりＳＮＰ ｒｓ１０５３０４６はＴ２ＤＭとの関連性を示した（ｐ＜０.０１）。アレル特異的分析により４個のさらなるＳＮＰ（ｒｓ１１５７１５０４、ｒｓ９２９６１４８、ｒｓ９６５８１００およびｒｓ３７９８３４３）がＴ２ＤＭとの関連性を示し（ｐ＜０.０５）、そのうちの３個（ｒｓ１１５７１５０４、ｒｓ９２９６１４８、ｒｓ９６５８１００）はまた３個の遺伝子型全ておよび優性モデルを用いる遺伝子型分析により関連性を実証した（ｐ＜０.０５）。
【０１８３】
ＰＰＡＲＤは、ＰＰＡＲ−アルファ、ＰＰＡＲ−ガンマおよびＰＰＡＲ−デルタを含むペルオキシソーム増殖剤活性化受容体転写因子スーパーファミリーに属する。ＰＰＡＲ−アルファおよびＰＰＡＲ−ガンマは種々の脂肪酸および抗高脂血症化合物により活性化されることが示されており、そしてヒトＰＰＡＲＤおよびマウスＰＰＡＲＤはＣ１８不飽和脂肪酸により活性化されることがわかっている。ＰＰＡＲは身体の脂質代謝の重要なメディエーターである。
【０１８４】
中年のインスリン抵抗性肥満アカゲザルを選択的ＰＰＡＲＤアゴニストであるＧＷ５０１５１６で処置することにより血清高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの劇的な用量依存性の上昇が引き起こされるが、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、空腹時トリグリセリドおよび空腹時インスリンのレベルは低下する。Oliver WR Jr et al., Proc Natl Acad Sci U S A. ９８（９）：５３０６−１１（April ２４, ２００１）。高脂肪食を与えられたマウスおよび遺伝的肥満ｏｂ／ｏｂへのアゴニストの投与により肥満、糖尿病およびインスリン抵抗性が改善された。Tanaka T et al., Proc Natl Acad Sci U S A. １００（２６）：１５９２４−９（December ２３, ２００３）。
【０１８５】
したがってＰＰＡＲＤの刺激は肥満、脂質代謝異常、インスリン抵抗性およびＴ２ＤＭを処置するための有望な研究法である。
【０１８６】
表９はこの分析で用いたＰＰＡＲＤ ＳＮＰをまとめている。アレル特異的分析および３個の遺伝子型全てまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析により遺伝子型分類に成功した２４個のＳＮＰのうちＳＮＰ ｒｓ１０５３０４６がＴ２ＤＭとの関連性を示した（ｐ＜０.０１）。アレル特異的分析により４個のさらなるＳＮＰ（ｒｓ１１５７１５０４、ｒｓ９２９６１４８、ｒｓ９６５８１００およびｒｓ３７９８３４３）がＴ２ＤＭとの関連性を示し（ｐ＜０.０５）、そのうちの３個（ｒｓ１１５７１５０４、ｒｓ９２９６１４８、ｒｓ９６５８１００）もまた３個の遺伝子型全ておよび優性モデルを用いる遺伝子型分析により関連性を実証した（ｐ＜０.０５）。表はまた対照および糖尿病患者における各ＳＮＰのアレル頻度および二つの関連解析方法を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるＨＷＥはこれらのＳＮＰに関して良好である。
【０１８７】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【０１８８】
要約すれば、我々の結果により複数のＰＰＡＲＤバリアントがＴ２ＤＭの発達に寄与しているかもしれないと示唆される。これらのＳＮＰおよびハプロタイプを用いてＴ２ＤＭ診断を改善し、患者のより良好な階層化により臨床試験設計を助けることができる。
【０１８９】
ＰＰＡＲＤハプロタイプ分析
加えて、ＰＰＡＲＤゲノム領域内の１個のハプロタイプとの有意な関連性もまた見出された（ｐ＜０.０１）。二つのハプロタイプ関連性方法をこの分析に使用した：Global ｐおよびMax−Stat ｐ（表３および表１０参照）。
【０１９０】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【０１９１】
ＡＣＡＣＢハプロタイプ分析
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼベータ（ＡＣＣ−ベータ）は、マロニル−ＣｏＡのカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ１Ａ）を阻止する能力を用いる脂肪酸酸化、脂肪酸取り込みにおける律速段階およびミトコンドリアによる酸化を制御すると仮定される。ＡＣＣベータは主に心臓および骨格筋において発現される。
【０１９２】
Abu−Elheiga et al., Science ２９１（５５１３）：２６１３−６（２００１）は標的破壊によりＡＣＣ２を欠損するマウスを作成した。Ａｃｃ２−／−変異マウスは正常な寿命、高い脂肪酸酸化率、および低い脂肪量を有する。野生型と比較して、ＡＣＣ２欠損マウスの心臓および筋肉でマロニル−ＣｏＡのレベルは各々１０倍および３０倍低かった。Ａｃｃ２−／−マウスのヒラメ筋における脂肪酸酸化率は野生型マウスのものよりも３０％高く、そしてインスリンの添加により影響されなかったが、インスリンの野生型筋肉への添加は脂肪酸酸化を４５％まで低下させた。変異マウスのその脂肪組織における脂肪蓄積は野生型マウスよりも５０％少なかった。
【０１９３】
したがってＡＣＡＣＢ阻止は肥満、インスリン抵抗性、脂肪肝疾患およびＴ２ＤＭを処置するための有望な研究法である。
【０１９４】
個々のＳＮＰはほとんどないかまたは極弱い証拠しか提供しないが、ＡＣＡＣＢゲノム領域内の８個のハプロタイプでは糖尿病との有意な関連性が見出された：ｈａｐ１、ｐ＜０.００１；ｈａｐ２、３、３０、３１、３２、３３および３４、ｐ＜０.０５。二つのハプロタイプ関連性方法をこの分析に使用した：Global ｐおよびMax−Stat ｐ（表１１）。
【０１９５】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【０１９６】
要約すれば、我々の結果によりＡＣＡＣＢにおける変化がＴ２ＤＭと関連することが示唆される。これらのＳＮＰおよびハプロタイプを用いてＴ２ＤＭ診断を改善し、患者のより良好な階層化により臨床試験設計を助けることができる。
【０１９７】
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤＳＢ）関連性
アレル特異的分析および／または優性および劣性双方のモデルを用いる遺伝子型分析により、分析した１３個のＳＮＰのうちの１個がＴ２ＤＭの高い出現率と関連する（ｐ＜０.０５）。
【０１９８】
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤ）は脂肪酸または分岐したアミノ酸の代謝に関与するミトコンドリア酵素の一群である。ＡＣＡＤＳＢは短い分岐鎖アシル−ＣｏＡ誘導体、（Ｓ）−２−メチルブチリル−ＣｏＡに対して最も強い活性を有したが、その他の２−メチル−分岐鎖基質と、および短い直鎖アシル−ＣｏＡともまた有意に反応した。脂肪酸および脂質代謝の調節異常は肥満および２型真性糖尿病の原因論において重要であることは十分に確立されている。
【０１９９】
表１２はこの研究で使用したＡＣＡＤＳＢ ＳＮＰをまとめている。アレル特異的分析および３個の遺伝子型全てを用いるかまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析により遺伝子型分類および分析に成功した１３個のＳＮＰのうち１個のＳＮＰ（ｒｓ２４２１１６６）がＴ２ＤＭの高い出現率と関連することが示された（ｐ＜０.０５）。表は全体、対照および糖尿病患者における各ＳＮＰの頻度、集団のハーディワインベルグ平衡分析（ＨＷＥ）ならびに二つの関連解析方法を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるＨＷＥはこれらのＳＮＰに関して良好である。
【０２００】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【０２０１】
カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＡ（ＣＰＴ１Ａ）関連性
アレル特異的分析および／または優性および劣性双方のモデルを用いる遺伝子型分析により、分析した２０個のＳＮＰのうちの１個がＴ２ＤＭの高い出現率と関連する（ｐ＜０.０５）。
【０２０２】
ＣＰＴ１Ａ遺伝子は脂肪酸酸化に関与する肝臓酵素であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＡをコードする。脂肪酸酸化過程にわたる主要な制御はＣＰＴ Ｉのレベルで決定され、その活性は今度は細胞内の高レベルのマロニル−ＣｏＡ濃度により阻止される。脂肪酸および脂質代謝の調節異常は肥満および２型真性糖尿病の原因論において重要であることは十分に確立されている。
【０２０３】
表１３はこの研究で使用したＣＰＴ１Ａ ＳＮＰをまとめている。アレル特異的分析および３個の遺伝子型全てを用いるかまたは優性モデルを用いる遺伝子型分析により遺伝子型分類および分析に成功した２０個のＳＮＰのうち１個のＳＮＰ（ｒｓ１０１７６４１）がＴ２ＤＭの高い出現率と関連することが示された（ｐ＜０.０５）。表は全体、対照および糖尿病患者における各ＳＮＰの頻度、集団のハーディワインベルグ平衡分析（ＨＷＥ）ならびに二つの関連解析方法を提供する。サンプルの集団の混合を測定するために用いられるＨＷＥはこれらのＳＮＰに関して良好である。
【０２０４】
【表４３】
【表４４】
【表４５】
【０２０５】
等価物
本発明の一つもしくはそれより多い実施態様の詳細を伴う前記の記載において示す。本明細書に記載したものに類似するかまたは等価である任意の方法および材料を本発明を実施または試験するのに用いることができ、好ましい方法および材料をここで記載する。本発明のその他の特徴、目的および利点は記載および請求の範囲から明白であろう。本明細書および添付の請求の範囲では、局面が明確にそれ以外を指示する場合を除いて単数の形態は複数の指示対象を含む。別に定義されない場合、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。各個々の出版物、特許または特許出願は全目的のためにその全てを出典明示により本明細書の一部とすると具体的および個別に示されたかのように、本明細書に引用した全ての参照はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
【０２０６】
本発明は本出願に記載した特定の実施態様の用語に限定されるものではなく、それは本発明の個々の態様の個別の説明として意図される。当業者に明白であるように、その精神および範囲から逸脱することなく本発明の多くの修飾および変化を為すことができる。本明細書に列挙したものに加えて、本発明の範囲内である機能的に等価な方法および装置は前記の記載から当業者には明白であろう。かかる修飾および変化は添付の請求の範囲内に入ると意図される。本発明は添付の請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきであり、かかる請求の範囲が資格を有する等価物の全範囲も同様である。
【０２０７】
ＧＣＩ ＳＮＰリスト−ＳＮＰの５００ｂｐ上流および下流の配列
＞４|２３５１８０１２|rs１００３２７９５
【０２０８】
【表４６】
【０２０９】
【表４７】
【０２１０】
【表４８】
【０２１１】
【表４９】
【０２１２】
【表５０】
【０２１３】
【表５１】
【０２１４】
【表５２】
【０２１５】
【表５３】
【０２１６】
【表５４】
【０２１７】
【表５５】
【０２１８】
【表５６】
【０２１９】
【表５７】
【０２２０】
【表５８】
【０２２１】
【表５９】
【０２２２】
【表６０】
【０２２３】
【表６１】
【０２２４】
【表６２】
【０２２５】
【表６３】
【０２２６】
【表６４】
【０２２７】
【表６５】
【０２２８】
【表６６】
【０２２９】
【表６７】
【０２３０】
【表６８】
【０２３１】
【表６９】
【０２３２】
【表７０】
【０２３３】
【表７１】
【０２３４】
【表７２】
【０２３５】
【表７３】
【０２３６】
【表７４】
【０２３７】
【表７５】
【０２３８】
【表７６】
【０２３９】
【表７７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）個体から試料を得ること；そして
（ｂ）２型糖尿病に対する素因の指標であるＴＣＦ２（肝細胞核因子１β）、ＡＣＡＤＳＢ（アセチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＣＰＴ１Ａ（カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ）、ＥＳＲＲＡ（エストロゲン関連受容体 α）、ＰＰＡＲＤ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体δ）、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマコアクチベーター１α）およびＳＣＤ（ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ）からなる群から選択される遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）の決定が、個体が２型糖尿病に対する素因を有していることを診断する個体の遺伝子型を決定すること；
の工程を含む個体における２型糖尿病に対する素因を診断するための方法。
【請求項２】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＴＣＦ２遺伝子のＳＮＰがｒｓ１１６５１７５５である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＡＣＡＤＳＢ遺伝子のＳＮＰがｒｓ２４２１１６である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＣＰＴ１Ａ遺伝子のＳＮＰがｒｓ１０１７６４１である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＥＳＲＲＡ遺伝子のＳＮＰがｇｓ２２９６０１６２３およびｒｓ１１６００９０からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＰＰＡＲＤ遺伝子のＳＮＰがｒｓ１０５３０４６、ｒｓ１１５７１５０４、ｒｓ９２９６１４８、ｒｓ９６５８１００およびｒｓ３７９８３４３からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子のＳＮＰがｒｓ２３０５６８３、ｒｓ４４６９０６４およびｒｓ１５３２１９５からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＳＣＤ遺伝子のＳＮＰがｒｓ３８７０７４７、ｒｓ７８４９およびｒｓ５０８３８４からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）個体から試料を得ること；そして
（ｂ）２型糖尿病に対する素因の指標であるＥＳＲＲＡ（エストロゲン関連受容体α）、ＰＰＡＲＤ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体δ）、ＳＣＤ（ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ）およびＡＣＡＣＢ（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼβ）からなる群から選択される遺伝子におけるハプロタイプの決定が、個体が２型糖尿病に対する素因を有していることを診断する個体のハプロタイプを決定すること；
の工程を含む個体における２型糖尿病に対する素因を診断するための方法。
【請求項１０】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＥＳＲＲＡ遺伝子におけるハプロタイプがｈａｐ３である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＰＰＡＲＤ遺伝子におけるハプロタイプがｈａｐ１である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＡＣＡＣＢ遺伝子におけるハプロタイプがｈａｐ１、ｈａｐ２、ｈａｐ３、ｈａｐ３０、ｈａｐ３１、ｈａｐ３２、ｈａｐ３３およびｈａｐ３４からなる群から選択され、ここでｈａｐ１、ｈａｐ２またはｈａｐ３の存在は２型糖尿病に対する素因が低いことを示し、そしてｈａｐ３０、ｈａｐ３１、ｈａｐ３２、ｈａｐ３３またはｈａｐ３４の存在は２型糖尿病に対する素因が高いことを示す請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）２型糖尿病を有することが疑われる個体から試料を得ること；
（ｂ）決定された遺伝子型がＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１からなる群から選択される遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）であり、そして２型糖尿病に対する素因の指標である個体の遺伝子型を決定すること；
（ｃ）決定された遺伝子型が個体が２型糖尿病に対する素因を有していることを示す場合、個体に抗２型糖尿病治療を施すこと；
の工程を含む個体における２型糖尿病を処置するための方法。
【請求項１４】
抗２型糖尿病治療がナテグリニド、ＬＡＦ２３７およびＬＢＭ６４２からなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１からなる群から選択される遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）に基づいて選択された２型糖尿病患者の集団において処置するための医薬品の製造におけるナテグリニド、ＬＡＦ２３７およびＬＢＭ６４２からなる群から選択される化合物の使用。
【請求項１６】
（ａ）２型糖尿病を有することが疑われる個体から試料を得ること；
（ｂ）決定されたハプロタイプがＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤおよびＡＣＡＣＢからなる群から選択される遺伝子にあり、そして２型糖尿病に対する素因の指標である個体のハプロタイプを決定すること；
（ｃ）決定されたハプロタイプが個体が２型糖尿病に対する素因を有していることを示す場合、個体に抗２型糖尿病治療を施すこと；
の工程を含む個体における２型糖尿病を処置するための方法。
【請求項１】
（ａ）個体から試料を得ること；そして
（ｂ）２型糖尿病に対する素因の指標であるＴＣＦ２（肝細胞核因子１β）、ＡＣＡＤＳＢ（アセチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＣＰＴ１Ａ（カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ）、ＥＳＲＲＡ（エストロゲン関連受容体 α）、ＰＰＡＲＤ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体δ）、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマコアクチベーター１α）およびＳＣＤ（ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ）からなる群から選択される遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）の決定が、個体が２型糖尿病に対する素因を有していることを診断する個体の遺伝子型を決定すること；
の工程を含む個体における２型糖尿病に対する素因を診断するための方法。
【請求項２】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＴＣＦ２遺伝子のＳＮＰがｒｓ１１６５１７５５である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＡＣＡＤＳＢ遺伝子のＳＮＰがｒｓ２４２１１６である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＣＰＴ１Ａ遺伝子のＳＮＰがｒｓ１０１７６４１である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＥＳＲＲＡ遺伝子のＳＮＰがｇｓ２２９６０１６２３およびｒｓ１１６００９０からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＰＰＡＲＤ遺伝子のＳＮＰがｒｓ１０５３０４６、ｒｓ１１５７１５０４、ｒｓ９２９６１４８、ｒｓ９６５８１００およびｒｓ３７９８３４３からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子のＳＮＰがｒｓ２３０５６８３、ｒｓ４４６９０６４およびｒｓ１５３２１９５からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＳＣＤ遺伝子のＳＮＰがｒｓ３８７０７４７、ｒｓ７８４９およびｒｓ５０８３８４からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）個体から試料を得ること；そして
（ｂ）２型糖尿病に対する素因の指標であるＥＳＲＲＡ（エストロゲン関連受容体α）、ＰＰＡＲＤ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体δ）、ＳＣＤ（ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ）およびＡＣＡＣＢ（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼβ）からなる群から選択される遺伝子におけるハプロタイプの決定が、個体が２型糖尿病に対する素因を有していることを診断する個体のハプロタイプを決定すること；
の工程を含む個体における２型糖尿病に対する素因を診断するための方法。
【請求項１０】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＥＳＲＲＡ遺伝子におけるハプロタイプがｈａｐ３である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＰＰＡＲＤ遺伝子におけるハプロタイプがｈａｐ１である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＡＣＡＣＢ遺伝子におけるハプロタイプがｈａｐ１、ｈａｐ２、ｈａｐ３、ｈａｐ３０、ｈａｐ３１、ｈａｐ３２、ｈａｐ３３およびｈａｐ３４からなる群から選択され、ここでｈａｐ１、ｈａｐ２またはｈａｐ３の存在は２型糖尿病に対する素因が低いことを示し、そしてｈａｐ３０、ｈａｐ３１、ｈａｐ３２、ｈａｐ３３またはｈａｐ３４の存在は２型糖尿病に対する素因が高いことを示す請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）２型糖尿病を有することが疑われる個体から試料を得ること；
（ｂ）決定された遺伝子型がＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１からなる群から選択される遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）であり、そして２型糖尿病に対する素因の指標である個体の遺伝子型を決定すること；
（ｃ）決定された遺伝子型が個体が２型糖尿病に対する素因を有していることを示す場合、個体に抗２型糖尿病治療を施すこと；
の工程を含む個体における２型糖尿病を処置するための方法。
【請求項１４】
抗２型糖尿病治療がナテグリニド、ＬＡＦ２３７およびＬＢＭ６４２からなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
２型糖尿病に対する素因の指標であるＴＣＦ２、ＡＣＡＤＳＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＳＣＤ１からなる群から選択される遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）に基づいて選択された２型糖尿病患者の集団において処置するための医薬品の製造におけるナテグリニド、ＬＡＦ２３７およびＬＢＭ６４２からなる群から選択される化合物の使用。
【請求項１６】
（ａ）２型糖尿病を有することが疑われる個体から試料を得ること；
（ｂ）決定されたハプロタイプがＥＳＲＲＡ、ＰＰＡＲＤおよびＡＣＡＣＢからなる群から選択される遺伝子にあり、そして２型糖尿病に対する素因の指標である個体のハプロタイプを決定すること；
（ｃ）決定されたハプロタイプが個体が２型糖尿病に対する素因を有していることを示す場合、個体に抗２型糖尿病治療を施すこと；
の工程を含む個体における２型糖尿病を処置するための方法。
【公表番号】特表２００８−５３８１７７（Ｐ２００８−５３８１７７Ａ）
【公表日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０３１４７（Ｐ２００８−５０３１４７）
【出願日】平成１８年３月２２日（２００６．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１０４６４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０４８１２
【国際公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２２日（２００６．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１０４６４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０４８１２
【国際公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
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