ＣＮＳ障害の治療のためのラノラジン
本発明は、治療的有効量のラノラジンの投与を含む、癲癇および片頭痛などのＣＮＳ障害のための方法に関する。本発明の一部の態様では、ラノラジンは、ＳＣＮ１Ａ変異に関連するＣＮＳ障害の治療または予防のために投与される。ＳＣＮ１Ａにおける変異に関連する状態には、熱性痙攣プラスを伴う全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）２型、乳児重症ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）、家族性片麻痺性片頭痛３型（ＦＨＭ３）、熱性痙攣プラスを伴う全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）１型が挙げられるが、これらに限定されない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラノラジンの投与による癲癇および他の中枢神経系（ＣＮＳ）障害の治療方法に関する。この方法は、ナトリウムチャネルが阻害されるのが有益であると考えられる、癲癇および片頭痛などのいかなるＣＮＳ状態の治療にも有用性を見出す。本発明は、そのような併用投与に適している医薬製剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１（この明細書は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、ラノラジン、（±）−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−４−［２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシフェノキシ）−プロピル］−１−ピペラジンアセトアミドおよびその薬学的に許容される塩、ならびに不整脈、異形狭心症と労作性狭心症、および心筋梗塞を含む心血管疾患の治療におけるその使用を開示している。その二塩酸塩の形態では、ラノラジンは、式
【０００３】
【化１】
により表される。
【０００４】
この特許は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール４００、Ｔｗｅｅｎ８０および０．９％生理食塩水をさらに含む、ラノラジン二塩酸塩の静注（ＩＶ）製剤も開示する。
【０００５】
特許文献２（この特許は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、心臓麻痺、心筋もしくは骨格筋または脳組織への低酸素または再灌流傷害を含む、物理的または化学的損傷を受けた組織の治療および移植における使用のための、ラノラジンとその薬学的に許容される塩およびエステルの使用を開示している。放出制御製剤を含む、経口および非経口製剤が開示されている。特に、特許文献２の実施例７Ｄは、放出制御ポリマーで被膜されたラノラジンと微結晶性セルロースのマイクロスフィアを含むカプセル型の放出制御製剤を記載している。この特許は、低末端では、約５重量％デキストロースを含有するＩＶ溶液のミリリットルあたり５ｍｇのラノラジンを含むＩＶラノラジン製剤も開示している。さらに、高末端では、約４重量％デキストロースを含有するＩＶ溶液のミリリットルあたり２００ｍｇのラノラジンを含有するＩＶ溶液が開示されている。
【０００６】
ラノラジンとその薬学的に許容される塩およびエステルの現在好ましい投与経路は経口である。典型的な経口剤形は、圧縮錠剤、混合粉末もしくは顆粒を充填された硬質ゼラチンカプセル、または液剤もしくは懸濁剤が充填された軟質ゼラチンカプセル（ソフトジェル）である。特許文献３（この明細書は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、硬質ゼラチンカプセルまたはソフトジェルのための充填溶液として過冷却された液体ラノラジンを用いる高用量経口製剤を開示している。
【０００７】
特許文献４（この明細書は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、製剤が胃内の酸性環境と腸内のより塩基性の環境の両方を通過する間に満足のいく血漿レベルのラノラジンを与える問題を克服し、狭心症および他の心血管疾患の治療に必要な血漿レベルを提供するのに非常に効果的であることが判明している徐放製剤を開示している。
【０００８】
特許文献５（この明細書は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、不整脈、異形狭心症と労作性狭心症、および心筋梗塞を含む、心血管疾患の治療法を開示している。
【０００９】
特許文献６（この明細書は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、ラノラジンが３５〜５０％、好ましくは４０〜４５％ラノラジンが存在している経口徐放剤形を開示している。一実施形態では、この発明のラノラジン徐放製剤は、ｐＨ依存性結合剤、ｐＨ非依存性結合剤および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。適切なｐＨ依存性結合剤には、メタクリル酸コポリマー、たとえば、メタクリル酸コポリマーを約１〜２０％、たとえば、約３〜６％の程度まで中和するのに十分な量で、強塩基、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化アンモニウムを用いて部分的に中和されているＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５のシュードラテックスなど）が挙げられるが、これに限定されない。適切なｐＨ非依存性結合剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、たとえば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標）Ｅ１０Ｍ Ｐｒｅｍｉｕｍ ＣＲグレードＨＰＭＣまたはＭｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標）Ｅ４Ｍ Ｐｒｅｍｉｕｍ ＨＰＭＣが挙げられるが、これらに限定されない。適切な薬学的に許容される賦形剤には、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ｐＨ１０１）が挙げられる。
【００１０】
国立癲癇協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ）によれば、４０以上の異なる種類の癲癇が存在する。各種類は、発作型、発症年齢、ＥＥＧ所見のその独自の組合せにより定義される。発作の部位および／または分布も使用して、癲癇の種類は分類される。いずれか１種類の癲癇の特定の因果関係は分からないことがあるが、遺伝子ＳＣＮ１Ａに変異が起こると、いくつかの特定種類の癲癇およびＣＮＳ障害が生じることが現在では公知である。
【００１１】
ＳＣＮ１Ａは、脳電位開口型ナトリウム（Ｎａｖ）チャネルＮａｖ１．１のポア形成αサブユニットをコードし、遺伝性癲癇を引き起こすもっとも一般的な変異遺伝子である。変異Ｎａｖ１．１チャネルは、熱性痙攣プラスを伴う比較的良性の全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）から衰弱性の乳児重症ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）までの広範囲の癲癇症候群を引き起こす。さらに最近では、ＳＣＮ１Ａの変異は、遺伝性片頭痛症候群家族性片麻痺性片頭痛３型（ＦＨＭ３）を引き起こすことが見出された。いくつかのＮａｖ１．１変異体について観察される共通の特徴は著しく増加した永久電流であり、これは活動電位発生および伝搬を促進することにより神経興奮性亢進を引き起こすと考えられている。
【００１２】
ラノラジンはいくつかの分子標的に対して活性を示すが、主要な治療作用機序は、Ｎａｖチャネル永久電流の遮断であると考えられている。この効果は、永久ナトリウム電流が毒素ＡＴＸ−ＩＩにより誘導されるＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）のモルモット心室筋細胞モデルにおいてはじめて明らかにされた（Ｗｕら、非特許文献１；Ｓｏｎｇら、非特許文献２）。その後、ラノラジンは、Ｎａｖ１．５ＬＱＴ変異チャネルにより直接搬送される増加した永久電流を優先的に遮断することが明らかにされた（Ｆｒｅｄｊら、非特許文献３；Ｒａｊａｍａｎｉら、非特許文献４）。さらに最近では、ラノラジンは、筋肉（Ｎａｖ１．４）（Ｗａｎｇら、非特許文献５）、心臓（Ｎａｖ１．５）（Ｗａｎｇら、２００８年）および末梢神経（Ｎａｖ１．７とＮａｖ１．８）（Ｗａｎｇ、２００８年；Ｒａｊａｍａｎｉら、非特許文献６）中で発現される様々な野生型Ｎａｖチャネルアイソフォームを遮断することが明らかにされている。
【００１３】
しかし、脳Ｎａｖチャネルアイソフォーム（たとえば、Ｎａｖ１．１またはＮａｖ１．２）を阻害するラノラジンの能力はこれまで報告されていない。ラノラジンは、変異Ｎａｖ１．１チャネルにより発生される永久電流を優先的に遮断する能力を有することが現在では発見されている。ラノラジンは、持続と使用依存性遮断パラダイムの両方においてＮａｖ１．１の高親和性阻害を示す。ラノラジンなどのＮａｖ１．１永久電流選択薬の臨床可能性は、ＳＣＮ１Ａ関連癲癇および片頭痛症候群などのＣＮＳ障害に対する新たな治療選択肢を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第４，５６７，２６４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５０６，２２９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４７２，７０７号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５０３，９１１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，８５２，７２４号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００６／０１７７５０２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】（２００４年）． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３１０巻：５９９〜６０５頁
【非特許文献２】（２００４年）． Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４４巻：１９２〜１９９頁
【非特許文献３】（２００６年）． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １４８巻：１６〜２４頁
【非特許文献４】（２００９年）． Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ ６巻：１６２５〜１６３１頁
【非特許文献５】（２００８年）． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７３巻：９４０〜９４８頁
【非特許文献６】（２００８年ａ）Ｃｈａｎｎｅｌｓ ２巻：４４９〜４６０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の目的は、片頭痛および癲癇を含むがこれらに限定されないＣＮＳ障害を治療するための方法であって、治療的有効量、または予防的有効量のラノラジン、または薬学的に許容されるその塩を、ＣＮＳ障害の治療を必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供することである。
【００１７】
本発明の一部の態様では、ラノラジンは、ＳＣＮ１Ａ変異に関連するＣＮＳ障害の治療または予防のために投与される。ＳＣＮ１Ａにおける変異に関連する状態には、熱性痙攣プラスを伴う全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）２型、乳児重症ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）、家族性片麻痺性片頭痛３型（ＦＨＭ３）、熱性痙攣プラスを伴う全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）１型が挙げられるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１に対するラノラジンの効果を示している。図１（Ａ）は、対照溶液に続いて３０μＭラノラジンの逐次灌流中に記録される代表的なホールセルナトリウム電流を表示している。電流は、−１２０ｍＶの保持電位から−８０から＋２０ｍＶの間までの電圧ステップにより活性化された。図１（Ｂ）は、試験パルスにより様々な電位まで誘発され、対照溶液（白四角）に続いて３０μＭラノラジン（黒丸）の逐次灌流中に記録される細胞キャパシタンスに正規化されるピーク電流密度を表示している。図１（Ｃ）は、−１４０から−１０ｍＶの間までの１００ｍｓプレパルスを用いて決定される急速不活性化の電圧依存性と共にプロットされる−８０から＋２０ｍＶの間までの電圧ステップ中に測定される活性化の電圧依存性を示している（符号はＢにおいて定義されるのと同じである）。パルスプロトコールはパネル挿入図として表示されており、フィットパラメータは表１に提供されている。図１（Ｄ）は、−１０ｍＶまでの１００ｍｓ不活性化プレパルスに続く急速不活性化からの時間依存性回復を表示している（符号は図１（Ｂ）において定義されるのと同じである）。パルスプロトコールはパネル挿入図として表示されており、フィットパラメータは表１に提供されている。
【図２】図２は、ラノラジンがＮａｖ１．１永久電流をどのようにして優先的に抑制するかを例示している。Ｎａｖ１．１ピークおよび永久電流の持続性抑制は、−１２０ｍＶの保持電位から−１０ｍＶまでの２００ｍｓ電圧ステップを使用して測定される。代表的なＴＴＸ減算ホールセルナトリウム電流は、対照溶液（黒色線）に続いて３０μＭラノラジン（灰色線）の逐次灌流中に、ＷＴ−Ｎａｖ１．１、図２（Ａ）およびＲ１６４８Ｈ、図２（Ｂ）について記録される。破線はゼロ電流レベルを示している。図２（Ｃ）および２（Ｄ）は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１とＲ１６４８Ｈピーク電流（白四角）および永久電流（黒四角）の濃度依存性持続性遮断をラノラジンがどのようにして示すかを図表で表示している。ラノラジン灌流中に測定されるピークと永久電流は、対照溶液において測定される電流に正規化された。フィットパラメータは実施例１の表２に提供されている。
【図３】図３は、ラノラジンによるＮａｖ１．１の使用依存性遮断を支持するデータを示している。反復刺激中のＮａｖ１．１アベイラビリティは、−１２０ｍＶの保持電位からの脱分極パルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス、１０Ｈｚ）を用いて評価された。代表的ホールセルナトリウム電流は、図３（Ａ）に示される対照溶液、続いて３０μＭラノラジン、図３（Ｂ）の逐次灌流中、ＷＴ−Ｎａｖ１．１から記録される。明確にするため、パルス１、３０および３００からの電流トレースのみが表示されている。図３（Ｃ）および３（Ｄ）は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１とＲ１６４８Ｈピーク電流の濃度依存性および使用依存性遮断をラノラジンがどのように示すかを図表で表示している（黒四角）。ＷＴ−Ｎａｖ１．１もＲ１６４８Ｈも、無薬物対照溶液に曝露される場合はアベイラビリティの使用依存性減少は示さなかった（白四角）。フィットパラメータは実施例１の表２に提供されている。
【図４】図４は、ラノラジンによる永久電流の優先的遮断を図表で例示している。ピークと永久電流の持続性遮断は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１および変異Ｎａｖ１．１チャネルについて、３０μＭラノラジンの適用中、−１０ｍＶまでの２００ｍｓ電圧ステップを使用して測定される。図４（Ａ）は、ピーク（黒色バー）と永久（白色バー）電流振幅が、細胞ごとに（ｎ＝５〜７）無薬物対照溶液において記録される値に正規化されていたことを図表で表している。図４（Ｂ）は、３０μＭラノラジンについて同じ電圧プロトコール中に記録されるピーク電流の百分率として表される永久電流を図表で表している。無薬物溶液におけるＷＴ−Ｎａｖ１．１からの有意差は、＊（ｐ＜０．０５）および◆（Ｐ＜０．０１）により示されている。図４（Ｃ）は、３０μＭラノラジンの灌流中のＷＴ−Ｎａｖ１．１および変異チャネルの使用依存性遮断を図表で表している（ｎ＝５〜７）。ＷＴ−Ｎａｖ１．１も変異Ｎａｖ１．１チャネルも、無薬物対照溶液に曝露される場合はアベイラビリティの使用依存性減少は示さなかった（黒色バー）。ＷＴからの有意差は、＊（ｐ＜０．０５）および◇（ｐ＜０．０１）により示されている。
【図５】図４は、ラノラジンがランプと使用依存性電流をどのように抑制するのかを詳記している。図５（Ａ）は、対照溶液に続いて３μＭラノラジンの逐次灌流中の−１２０ｍＶの保持電位からの２０ｍＶ／ｓ電圧ランプ中に測定される代表的ＴＴＸ減算ランプ電流を表示している。点線はゼロ電流を示している。図５（Ｂ）は、Ｒ１６４８Ｈがこのランプの−４０と０ｍＶの間で著しく多い電荷を伝導し、これは３μＭラノラジンによりＷＴ−Ｎａｖ１．１のレベルまで抑制されたことを図表で例示している（ｎ＝９〜１０）。図５（Ｃ）は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１とＲ１６４８Ｈアベイラビリティが、対照溶液に続いてラノラジンの逐次灌流中１０から１３５Ｈｚの間の周波数で脱分極パルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス）を用いた反復刺激中に評価されたデータを表している。正規化ピーク電流（パルス３００／パルス１）はパルス列ごとに周波数に対してプロットされた（それぞれｎ＝９および８）。図５（Ｄ）は、３μＭラノラジンおよび対照条件中チャネルアベイラビリティの比として計算される正規化ピーク電流の抑制を示す曲線を表している。ＷＴ−Ｎａｖ１．１とＲ１６４８Ｈ間の有意差は、＊（ｐ＜０．０５）、◆（ｐ＜０．０１）および
【００１９】
【数１】
（ｐ＜０．０１）により示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義および一般的パラメータ
本明細書で使用されるとき、以下の単語および語句は、単語および語句が使用される文脈が他のことを示す程度を除いて、以下に記載される意味を有することが一般に意図されている。
【００２１】
「任意選択の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、その記載は前記事象または状況が起きる例および前記事象または状況が起こらない例を含むことを意味する。
【００２２】
「非経口投与」は、注射を介した患者への治療薬の全身送達のことである。
【００２３】
用語「治療的有効量」とは、そのような治療を必要とする哺乳動物へ投与された場合、下に定義される治療を達成するのに十分である式１の化合物の量のことである。治療的有効量は、使用されている治療薬の比活性、患者の病態の重症度、ならびに患者の年齢、健康状態、他の病態の存在、および栄養状態に応じて変わることになる。さらに、患者が受けている場合がある他の薬物療法があれば投与する治療薬の治療的有効量の決定に影響を与えることになる。
【００２４】
用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、
（ｉ）疾患を予防する、すなわち、疾患の臨床症状を発症させないこと、
（ｉｉ）疾患を抑制する、すなわち、臨床症状の進行を抑止すること、および／または
（ｉｉｉ）疾患を軽減する、すなわち、臨床症状を退行させること
を含む、哺乳動物における疾患の任意の治療を意味する。
【００２５】
「チャネル病」とは、イオンチャネル奇形に関連する疾患または状態のことである。
【００２６】
ラノラジンはアミノ基および／もしくはカルボキシル基またはそれに類似の基の存在によって酸性塩および／または塩基性塩を形成することができる。用語「薬学的に許容される塩」とは、ラノラジンの生物学的有効性と特性を保持しており、生物学的にまたは他の点で有害ではない塩のことである。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基から調製することが可能である。無機塩基由来の塩には、ほんの一例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩が挙げられる。有機塩基由来の塩には、アルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、置換アルキルアミン、ジ（置換アルキル）アミン、トリ（置換アルキル）アミン、アルケニルアミン、ジアルケニルアミン、トリアルケニルアミン、置換アルケニルアミン、ジ（置換アルケニル）アミン、トリ（置換アルケニル）アミン、シクロアルキルアミン、ジ（シクロアルキル）アミン、トリ（シクロアルキル）アミン、置換シクロアルキルアミン、二置換シクロアルキルアミン、三置換シクロアルキルアミン、シクロアルケニルアミン、ジ（シクロアルケニル）アミン、トリ（シクロアルケニル）アミン、置換シクロアルケニルアミン、二置換シクロアルケニルアミン、三置換シクロアルケニルアミン、アリールアミン、ジアリールアミン、トリアリールアミン、ヘテロアリールアミン、ジヘテロアリールアミン、トリヘテロアリールアミン、複素環アミン、ジ複素環式アミン、トリ複素環式アミン、アミン上の置換基のうちの少なくとも２つが異なっており、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環などからなる群から選択される混合ジおよびトリアミンなどの第一級、第二級および第三級アミンの塩が挙げられるがこれらに限定されない。２つまたは３つの置換基がアミノ窒素と共に複素環またはヘテロアリール基を形成しているアミンも挙げられる。
【００２７】
適切なアミンの特定の例には、ほんの一例として、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリ（イソプロピル）アミン、トリ（ｎ−プロピル）アミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、Ｎ−エチルピペリジンなどが挙げられる。
【００２８】
薬学的に許容される酸付加塩は無機および有機酸から調製され得る。無機酸由来の塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。有機酸由来の塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被膜剤、抗菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野では周知である。いかなる従来の媒体または薬剤でも活性成分と適合しない場合を除いて、治療組成物中でのその使用が企図されている。補助的活性成分もこの組成物に取り込むことが可能である。
【００３０】
ラノラジンは、Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−４−［２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシフェノキシ）プロピル］−１−ピペラジンアセトアミドと命名されているが｛１−［３−（２−メトキシフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピル］−４−［（２，６−ジメチルフェニル）−アミノカルボニルメチル］−ピペラジンとしても公知｝、ラセミ混合物、もしくはその鏡像異性体、またはその鏡像異性体の混合物、または薬学的に許容されるその塩として存在することが可能である。ラノラジンは、米国特許第４，５６７，２６４号に記載される通りに調製することが可能であり、この明細書は参照により本明細書に組み込まれている。
【００３１】
「即時放出」（「ＩＲ」）とは、インビトロで急速に溶解し、胃または上部消化管において完全に溶解され吸収されることが意図されている製剤または用量単位のことである。従来、そのような製剤は、投与から３０分以内にその活性成分の少なくとも９０％を放出する。
【００３２】
「徐放」（「ＳＲ」）とは、約６時間またはそれ以上の期間かけて胃および消化管において緩徐に連続して溶解され吸収される本明細書で使用される製剤または用量単位のことである。好ましい徐放製剤は、下記の投与あたり２個またはそれ未満の錠剤の一日２回以下の投与に適したラノラジンの血漿中濃度を示す製剤である。
【００３３】
「異性体」は同じ分子式を有する異なる化合物である。
【００３４】
「立体異性体」は、空間における原子の配置の仕方のみが異なる異性体である。
【００３５】
「鏡像異性体」は、互いに重ね合わせることができない鏡像である一対の立体異性体である。一対の鏡像異性体の１対１混合物は「ラセミ」混合物である。必要に応じて、用語「（±）」を使用してラセミ混合物であることを指定する。
【００３６】
「ジアステレオ異性体」は、少なくとも２つの非対称性原子を有するが、互いの鏡像ではない立体異性体である。
【００３７】
絶対立体化学は、カーン−インゴルド−プレローグＲ−Ｓ法に従って特定される。化合物が純粋な鏡像異性体である場合、各キラル炭素における立体化学はＲまたはＳのどちらかにより特定され得る。その絶対配置が未知の分割された化合物は、その化合物がナトリウムＤ線の波長で偏光の平面を回転させる方向（右旋性または左旋性）に応じて（＋）または（−）のどちらかを指定される。
【００３８】
本発明の方法
本発明の方法は、ラノラジンが永久Ｎａｖ１．１電流を抑制するという驚くべき発見に基づいている。電位開口型ナトリウムチャネルは、フェニトインおよびラモトリギンなどのいくつかの広く使用されている抗癲癇薬の重要な標的である。これらの薬物は、一部において不活性化状態を安定化し、それによってナトリウムチャネルアベイラビリティを減少させ、ニューロンが繰返し発火する能力を制限することにより機能する。反復的ニューロン活動中にナトリウムチャネルアベイラビリティを減少させることに加えて、これらの薬物の別の潜在的に重要な効果は、永久ナトリウム電流の抑止であり得る（Ｓｔａｆｓｔｒｏｍ ＣＥ （２００７年）、Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｃｕｒｒ ７巻：１５〜２２頁）。脳全体の数種類のニューロンは、活性化されたナトリウムチャネルの不完全な閉鎖から生じる低振幅永久電流を示す。小さいが、永久ナトリウム電流は、ニューロン発火行動にかなり影響を与えることが可能であり、癲癇活性の伝播を可能にするのに決定的に重要であり得る（Ｓｔａｆｓｔｒｏｍ、２００７年）。
【００３９】
様々な癲癇において発見されたニューロンナトリウムチャネル変異の機能的意義が明らかにされると、癲癇の病因における永久ナトリウム電流の重要性はさらに注目された。ＧＥＦＳ＋および他の癲癇に関連するＳＣＮ１Ａのいくつかの変異は、優勢な生物物理学的異常としてときに永久電流の増加を示す（Ｌｏｓｓｉｎら、（２００２年）、Ｎｅｕｒｏｎ ３４巻：８７７〜８８４頁；Ｒｈｏｄｅｓら、（２００４年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１巻：１１１４７〜１１１５２頁；Ｋａｈｌｉｇ Ｋら、（２００６年）、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２６巻：１０９５８〜１０９６６頁；Ｋａｈｌｉｇら、（２００８年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５巻：９７９９〜９８０４頁；Ｓｐａｍｐａｎａｔｏら、（２００４年）． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４巻：１００２２〜１００３４頁）。これらの所見は、癲癇発作における説得力のある病態生理学的因子として永久電流の増加を強調し、永久電流の選択的抑止が、この種のナトリウムチャネル機能障害を促進する変異に関連する珍しい家族性癲癇に治療戦略を提供し得るという着想を刺激した。
【００４０】
慢性安定狭心症の治療に承認された薬物であるラノラジンは、ＳＣＮ１Ａ変異により誘起される永久電流の増加を選択的に抑止することができることが現在発見されている。ラノラジンは、ピーク電流の持続性遮断および使用依存性遮断と比べて永久電流の抑制の大きさはそれぞれ１６倍と５倍を示すことが現在では確定されている。この抑制は、低マイクロモーラー濃度範囲で最大の選択性を有する濃度依存性であり、この抑制は通常の治療血漿中濃度の２〜１０μＭに匹敵する（Ｓｉｃｏｕｒｉら、（２００８年）、Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ ５巻： １０１９〜１０２６頁；Ｃｈａｉｔｍａｎ ＢＲ （２００６年）、Ｃｉｒｃ １１３巻：２４６２〜２４７２頁）。
【００４１】
ラノラジンは電流密度、活性化および不活性化の電圧依存性に重大な効果を持たないが、化合物は確かにある程度の不活性化された状態安定化を示すことがある不活性化からの回復を遅くするように思われる。ラノラジンは、ＷＴおよび変異Ｎａｖ１．１の使用依存性遮断も発揮し、不活性化安定化の追加の証拠を提供するが、これらの効果に必要な濃度は、薬物の通常の治療血漿内レベルよりもはるかに高い。
【００４２】
理論に縛られたくはないが、ラノラジンのＮａｖ１．１およびＮａｖ１．２への結合は、他のナトリウムアイソフォームで報告されている薬物−受容体部位相互作用を必要とすると考えられている。Ｎａｖ１．４およびＮａｖ１．７の遮断を調べた以前の報告では、Ｗａｎｇらは、ラノラジンは開口状態に選択的に結合し、閉鎖または不活性化状態への結合は最小であると断定した（Ｗａｎｇら、（２００８年）、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７３巻：９４０〜９４８頁）。彼らの研究は、ステップ持続時間が増加していく電圧列プロトコールを利用して、ラノラジン使用依存性抑制とオープン構造の提示を相関させた。この筆者らは、Ｎａｖ１．４での適度に急速な会合速度（Ｋｏｎ＝８．２μＭ−１ｓ−１）も報告しており、これによりチャネルが膜脱分極に正常に応答した後にのみ薬物結合が可能になると筆者らは示唆していた。残念ながら、電流量を制御するために、この研究では逆ナトリウム勾配（６５ｍＭ外側および１３０ｍＭ内側）が用いられ、特にラノラジンがオープン構造内のイオン伝導経路近くに結合した場合には、結果としてのナトリウムイオンの非生理的流出が薬物結合動態に影響した可能性がある。Ｒａｊａｍａｎｉらによる別の研究も、Ｎａｖ１．７およびＮａｖ１．８チャネルへのラノラジンの状態依存性結合を調べた（Ｒａｊａｍａｎｉら、（２００８年ａ）． Ｃｈａｎｎｅｌｓ ２巻：４４９〜４６０頁）。
【００４３】
前のデータと組み合わされた実施例１に示されるデータは、ナトリウムチャンルアイソフォーム間のラノラジンの多様な作用を強調している。それにもかかわらず、ラノラジンによるナトリウムチャネルの抑制を調べている各研究が、９から１７倍の選択性での永久電流の優先的遮断を報告していた（Ｗａｎｇら、（２００８年）；Ｆｒｅｄｊら、（２００６年）． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １４８巻：１６〜２４頁；Ｒａｊａｍａｎｉら、（２００９年）． Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ ６巻：１６２５〜１６３１頁）。
【００４４】
ラノラジンによる永久電流遮断についての考え得る作用機序には、１）開口状態に結合しポアを閉鎖すること；２）開口状態に結合し二次不活性化安定化を提供すること；３）不活性化状態に結合し直接安定化不活性化にいたること；または４）それぞれの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。細胞内局所麻酔薬結合部位の関与の証拠は、Ｎａｖ１．５およびＮａｖ１．４において結合部位を変異させるとラノラジンの効力が減少するという知見により支持される（Ｗａｎｇら、（２００８年）；Ｆｒｅｄｊら（２００６年））。
【００４５】
通常の臨床用量では、ラノラジンに耐容性がよいのは、眩暈、悪心、頭痛および便秘などの軽度の副作用を起こす患者のうちの少数である（Ｎａｓｈら、（２００８年）、Ｌａｎｃｅｔ ３７２巻：１３３５〜１３４１頁）。ラノラジンは、心臓の電圧開口型カリウムチャンルＨＥＲＧも遮断し（Ｒａｊａｍａｎｉら、（２００８年ｂ）、Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５１巻：５８１〜５８９頁）、このことが一部の被験体において観察される軽度のＱＴ間隔延長を説明する。下の実施例１において考察されるように、ラノラジンは血液脳関門を通過することができ、このことが薬物を受けた被験体により報告される眩暈および頭痛などのある種の副作用を説明し得ることが現在では確定している。さらに、ラノラジン脳透過性が実証されたことは、本薬物が、実施例１において試験される変異などのある種のナトリウムチャネル変異を抱える人物において抗癲癇効果を発揮することになるという結論を支持している。
【００４６】
本発明の一実施形態では、ラノラジンは前記薬物により発揮されるいくらか限られた程度の使用依存性遮断に基づいて活発な発作を中断させるのではなく、癲癇予防を予防する手段として投与される。ある程度のナトリウムチャネル使用依存性抑制は抗痙攣効果のためにおそらく重要であり、ラノラジンなどの永久電流に対して選択性のある薬物の治療効果は、これら２つの薬理作用の適正なバランスに依拠している可能性がある。したがって、本発明の別の実施形態は、高度に選択性の永久電流遮断剤とより慣用的な抗癲癇薬の同時投与を含む、ＣＮＳ障害を治療するための方法である。そのような方法は、それを必要とする患者に相乗効果を提供することになる。
【００４７】
有用性試験および投与
一般的有用性
本発明の方法は、癲癇および片頭痛を含むが、これらに限定されないＣＮＳ障害を治療するのに有用である。理論に縛られたくはないが、そのようなＣＮＳ障害を治療するラノラジンの能力は、脳における永久Ｎａｖ１．１および／またはＮａｖ１．２電流の抑制剤として作用するラノラジンの驚くべき能力の結果であると考えられている。
【００４８】
医薬組成物および投与
ラノラジンは通常、医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明は、活性成分としてラドラジンまたは薬学的に許容されるその塩もしくはエステル、ならびに、不活性固体希釈剤と充填剤を含む１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、無菌水溶液と様々な有機溶媒を含む希釈剤、可溶化剤およびアジュバントを含有する医薬組成物を提供する。ラノラジンは単独で、または他の治療薬と組み合わせて投与され得る。そのような組成物は医薬分野で周知の方法で調製される（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ １７ｔｈ Ｅｄ．（１９８５年）および「Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ． ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｇ．Ｓ． Ｂａｎｋｅｒ ＆ ＣＴ． Ｒｈｏｄｅｓ， Ｅｄｓ．参照）。
【００４９】
ラノラジンは、たとえば、直腸、頬側、鼻腔内と経皮経路、動脈内注射により、静脈内に、腹腔内に、非経口的に、筋肉内に、皮下に、経口的に、局所的に、吸入剤として、または、たとえば、ステントもしくは動脈挿入円筒形ポリマーなどの浸透性もしくは被膜デバイスを介するものを含む、参照により組み込まれている特許および特許出願に記載されている類似の有用性を有する薬剤の認められた投与様式のうちのいずれによっても、単回投与または複数回投与のどちらかで投与され得る。
【００５０】
適切な賦形剤のいくつかの例には、ラクトース、デキストロース、好くロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、減菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。前記製剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどの滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルなどの保存剤；甘味剤；ならびに香味剤をさらに含むことが可能である。
【００５１】
経口投与はラノラジンの投与のための好ましい経路である。投与は、カプセルもしくは腸溶コーティング錠などを介してであってよい。ラノラジンを含む医薬組成物を製造する際には、前記活性成分は通常、賦形剤により希釈されるおよび／またはカプセル、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、紙もしくは他の容器の形態であり得るような担体内に封入される。賦形剤が希釈剤として働く場合、賦形剤は固体、半流動性、または液状物質（上記）であることが可能であり、これらは活性成分のためのビヒクル、担体または媒体として作用する。したがって、前記組成物は、錠剤、丸薬、散剤、ロゼンジ剤、サシェ、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エアロゾル（固体としてもしくは液体媒体で）、たとえば、活性化合物を最大５０重量％含有する軟膏剤、軟質および硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射用溶液、および滅菌パッケージ化された粉末の形態であり得る。
【００５２】
ラノラジンは、当技術分野で公知の手順を用いることにより、患者への投与後、活性成分の急速、持続または遅延放出を提供するように処方することも可能である。経口投与のための制御放出薬物送達システムには、ポリマー被膜貯蔵器または薬物ポリマーマトリックス製剤を含有する浸透圧ポンプシステムおよび溶解システムが挙げられる。制御放出システムの例は、米国特許第３，８４５，７７０号、米国特許第４，３２６，５２５号、米国特許第４，９０２，５１４号、および米国特許第５，６１６，３４５号に与えられている。本発明の方法における使用のための別の製剤は、経皮送達デバイス（「パッチ」）を用いている。そのような経皮パッチを使用して、制御された量での本発明の化合物の連続または不連続注入を提供し得る。医薬品の送達のための経皮パッチの構築および使用は当技術分野では周知である。たとえば、米国特許第５，０２３，２５２号、米国特許第４，９９２，４４５号、および米国特許第５，００１，１３９号を参照されたい。そのようなパッチは、医薬品の連続性、拍動性またはオンデマンド送達のために構築され得る。
【００５３】
ラノラジンは広い用量範囲にわたり効果的であり、一般に薬学的有効量で投与される。典型的には、経口投与では、各用量単位は、１ｍｇ〜２ｇのラノラジン、より一般的には１〜７００ｍｇを、非経口投与では、１〜７００ｍｇのラノラジンを、より一般的には約２〜２００ｍｇを含有する。しかし、実際に投与されるラノラジンの量は、治療される状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物およびその相対活性、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度などを含む関連する状況を考慮して医者により決定されることになる。
【００５４】
錠剤などの固体組成物を調製するために、主要活性成分は医薬賦形剤と混合されて、本発明の化合物の均一混合物を含有する固形予備処方組成物を形成する。これらの予備処方組成物を均一と呼ぶ場合、組成物が錠剤、丸薬およびカプセルなどの等しく効果的な単位用量に容易に細分され得るように、活性成分が組成物全体に均等に分散していることを意味する。
【００５５】
本発明の錠剤または丸薬は、被膜されるか、または他の方法で配合されて、長期間の作用または胃の酸性条件から保護するという利点を与える剤形を提供し得る。たとえば、錠剤または丸薬は、内部投薬および外部投薬成分を含み、後者は前者をおおう包膜の形態であることが可能である。２つの成分は、胃における分解に抵抗する働きをし、内部成分を無傷のまま十二指腸まで通過させるか、または放出を遅延させる腸溶層により分離されることが可能である。種々の物質をそのような腸溶層または被膜のために使用し、そのような物質はいくつかのポリマー酸ならびにポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの物質の混合物を含むことが可能である。
【００５６】
投与のための１つの様式は、非経口、特に注射によるものである。ラノラジンが注射による投与のために組み込まれ得る形態には、ゴマ油、コーン油、綿実油、もしくはピーナッツ油を有する水性もしくは油性懸濁液または乳濁液の他にもエリキシル剤、マンニトール、デキストロースもしくは滅菌水溶液、および類似の医薬ビヒクルが挙げられる。生理食塩水溶液も注射のために従来、使用されているが、本発明の文脈ではそれほど好ましくはない。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど（およびその適切な混合物）、シクロデキストリン誘導体、ならびに植物油も用いられ得る。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどの被膜の使用により、分散剤の場合の必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することが可能である。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌薬、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことが可能である。
【００５７】
滅菌注射用液剤は、上に列挙される様々な他の成分と一緒に、本発明の化合物を適切な溶媒中に必要な量で取り込み、必要に応じて、続いて濾過および滅菌することにより調製される。一般に、分散剤は、様々な滅菌化された活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙される成分由来の必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに取り込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌粉末の場合は、好ましい調製法は、活性成分の粉末プラスその予め滅菌濾過された溶液由来の任意の追加の望ましい成分をもたらす真空乾燥および凍結乾燥法である。
【００５８】
ラノラジンの静注製剤は、以下の無菌充填工程を介して製造される。適切な器で、必要量のデキストロース一水和物を注射用水（ＷＦＩ）に約７８％の最終バッチ重量で溶解させる。絶えず攪拌しながら、必要量のラノラジン遊離塩基をデキストロース溶液に添加する。ラノラジンの溶解を促進するため、溶液ｐＨを０．１Ｎまたは１Ｎ塩酸水溶液を用いて３．８８〜３．９２の目標に調整する。さらに、０．１Ｎ ＨＣｌまたは１．０Ｎ ＮａＯＨを利用して、３．８８〜３．９２の目標ｐＨに溶液を最終調整してもよい。ラノラジンが溶解した後、バッチはＷＦＩを用いて最終重量に調整される。インプロセス仕様が満たされたと確認されると、ラノラジンバルク溶液は、２つの０．２μｍ滅菌濾過器を通した除菌により滅菌化される。それに続いて、滅菌ラノラジンバルク溶液は滅菌ガラスバイアルに無菌的に充填され、滅菌栓を用いて無菌的に栓をされる。次に、栓をされたバイアルは清潔な押し上げ式のアルミシールを用いて密封される。
【００５９】
前記組成物は好ましくは、単位剤形で処方される。用語「単位剤形」とは、単一用量としてヒト被験体および哺乳動物に適した物理的に個別の単位のことであり、各単位は、適切な医薬賦形剤（たとえば、錠剤、カプセル、アンプル）と共同して望ましい治療効果を生み出すように計算された所定量の活性物質を含有する。しかし、実際に投与されるラノラジンの量は、治療される状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物およびその相対活性、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度などを含む、関連する状況を考慮して医師により決定されることになると理解されるであろう。
【００６０】
一実施形態では、ラノラジンは、患者への投与後に活性成分の急速、持続または遅延放出、特に徐放製剤を提供するように処方される。そうではないと記述されなければ、明細書および実施例において使用されるラノラジン血漿中濃度とは、ラノラジン遊離塩基のことである。
【００６１】
本発明の好ましい徐放製剤は好ましくは、化合物ならびに胃における（典型的には約２）および腸における（典型的には約５．５）ｐＨの範囲にわたり水性媒体中での溶解速度を制御する部分的に中和されたｐＨ依存性結合剤の完全混和物を含む圧縮錠剤の形態である。徐放製剤の例は、米国特許第６，３０３，６０７号、米国特許第６，４７９，４９６号、米国特許第６，３６９，０６２号、および米国特許第６，５２５，０５７号に開示されており、その完全な開示はここに参照により組み込まれている。
【００６２】
併用療法
癲癇などのＣＮＳ障害の治療を受けている患者は、１つを超える治療薬を用いた治療により利益を得る場合が多い。よく使用されている抗痙攣薬には、カルバマゼピン、フェノバルビタール、フェニトインおよびバルプロ酸が挙げられる。他のよく使用されている抗癲癇薬には、ガバペンチン、ラモトリギン、トピラマート、エトスクシミド、クロナゼパムおよびアセタゾラミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
ラノラジンと治療的有効量の少なくとも１つの抗癲癇薬の同時投与により、患者が現在受けている看護治療の標準を高めることができる。したがって、本発明の一態様は、ＣＮＳ障害を治療するための方法であって、治療的有効量のラノラジンおよび治療的有効量の少なくとも１つの抗癲癇薬をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００６４】
併用療法の方法には、好ましくは、ラノラジンおよび１種または複数の治療薬がその治療影響を同時に発揮する期間が存在する、ラノラジンおよび１種または複数の治療薬を含有する単一製剤の同時投与、ラノラジンおよび１種または複数の治療薬を含む一つより多くの製剤の本質的に同時期の投与、ならびにいかなる順序であれラノラジンおよび治療薬または複数の治療薬の連続投与が挙げられる。好ましくは、ラノラジンは、本明細書に記載される経口投与量で投与される。
【００６５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下に続く実施例において開示される技法は、本発明の実施においてうまく機能することが本発明者により発見された技法を表しており、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられることを当業者であれば認識すべきである。しかし、当業者であれば、開示される特定の実施形態には多くの変更を加えることが可能であり、それでも本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることを、本開示を考慮して、認識すべきである。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
材料および方法
ヒトＮａｖ１．１ ｃＤＮＡの発現
すべての野生型（ＷＴ）および変異構築物は、以前我が研究所により研究されたことがあり（Ｋａｈｌｉｇ、２００８年；Ｌｏｓｓｉｎ、２００２年；Ｒｈｏｄｅｓ、２００４年）、ｃＤＮＡ発現は以前記載された通りに実施された（Ｋａｈｌｉｇ、２００８年）。手短に言えば、Ｎａｖ１．１の発現は、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬を使用して一過性トランスフェクションにより実現された（５．５μｇのＤＮＡは、ａ１：β１：β２について１０：１：１のプラスミド質量比でトランスフェクトされた）。ヒトβ１およびβ２ｃＤＮＡは、マーカー遺伝子ＤｓＲｅｄ（ＤｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ２−ｈβ１）またはＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ２−ｈβ２）を配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と共に含有するプラスミドにクローニングされた。そうではないと言及されなければ、すべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入されたものである。
【００６７】
電気生理学
以前記載された通りに（Ｋａｈｌｉｇ、２００８年）、ホールセル電圧クランプ記録法を使用してＷＴおよび変異Ｎａｖ１．１チャネルの生物物理学的特性を測定した。手短に言えば、ピペット溶液は、ｐＨ７．３５および容量オスモル濃度３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの１１０ＣｓＦ、１０ＮａＦ、２０ＣｓＣｌ、２ＥＧＴＡ、１０ＨＥＰＥＳ（ｍＭ）で構成された。バス（対照）溶液は、ｐＨ７．３５および容量オスモル濃度３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの１４５ＮａＣｌ、４ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、１０デキストロース、１０ＨＥＰＥＳ（ｍＭ）を含有していた。細胞は、電流を測定する前にホールセル配置が確立した後１０分間安定化させた。直列抵抗は、確実に電圧誤差＜２ｍＶでマイクロ秒以内にコマンド電位に到達するように９０％保証された。漏洩電流は、オンラインＰ／４手順を使用することにより減算され、全電流は、５ｋＨｚで低域Ｂｅｓｓｅｌフィルターされ、５０ｋＨｚでデジタル化された。明確にするために、代表的ランプ電流は、５０Ｈｚでオフラインにより低域フィルターされた。
【００６８】
反復刺激中のチャネル活性化、急速不活性化およびアベイラビリティを評価する特定の電圧クランププロトコールを、挿入図として描かれている通りに使用した。ホールセルコンダクタンスは、ＧＮａ＝ＩＮａ／（Ｖ−ＥＮａ）によりピーク電流振幅から計算され、−８０と＋２０ｍＶ間で最大コンダクタンスに正規化された。コンダクタンス−電圧および定常状態チャネルアベイラビリティ曲線は、最大半量活性化／不活性化（Ｖ１／２）および傾斜係数（ｋ）についての電圧を決定するためにボルツマン関数を用いてフィットさせた。不活性化への時間依存性進入および不活性化からの時間依存性回復は、ピーク電流回復を２つの指数関数、Ｉ／Ｉｍａｘ＝Ａｆ×［１−ｅｘｐ（−ｔ／τｆ）］＋Ａｓ×［１−ｅｘｐ（−ｔ／τｓ）］（τｆおよびτｓは時間定数（それぞれ、急速および緩徐成分）を意味し、ＡｆおよびＡｓは急速および緩徐分数振幅を表す）を用いてフィットさせることにより評価された。
【００６９】
使用依存性研究では、細胞は、−１２０ｍＶの保持電位から脱分極パルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス、１０Ｈｚ）を用いて刺激した。次に、電流は、各周波数列において第一パルスに応答して記録されたピーク電流に正規化された。持続遮断研究では、ピークおよび永久電流は、０．５μＭテトロドトキシン（ＴＴＸ）の存在および不在下で記録された電流のデジタルサブストラクションに続いて−１０ｍＶ（０．２Ｈｚ）までの２００ｍｓ脱分極に応答して評価された。永久電流は、２００ｍｓステップの最終１０ｍｓ中に計算された。データ解析は、Ｃｌａｍｐｆｉｔ９．２（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、Ｅｘｃｅｌ ２００２（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、およびＯｒｉｇｉｎＰｒｏ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）ソフトウェアを使用して実施された。結果は、平均±ＳＥＭとして示されている。そうではないと言及されなければ、ＷＴ−Ｎａｖ１．１に関連して、一元配置ＡＮＯＶＡに続いてチューキー事後検定を使用して統計的比較は行われた。
【００７０】
インビトロ薬理学
２０ｍＭラノラジン（Ｇｉｌｅａｄ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の保存液は０．１Ｍ ＨＣｌ中で調製された。バス溶液中のラノラジンの新鮮な希釈液は実験日ごとに調製され、そのｐＨは７．３５に再調整された。クランプされた細胞への灌流液の直接適用は、灌流ペンシル（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｐｅｎｃｉｌ）システム（Ａｕｔｏｍａｔｅ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を使用して実現された。直接細胞灌流は、２５０ミクロンチップを使用して、流速３５０μＬ／分で重力により推進された。このシステムは、クランプされた細胞を灌流の流れ内に隔離し、１秒以内の完全な溶液交換を可能にする。クランプされた細胞は、ホールセル配置を確立させた直後に開始して連続して灌流された。対照電流は、対照溶液灌流中に測定された。
【００７１】
ラノラジン含有溶液は、平衡（持続）薬物遮断を可能にするために電流記録に先立って３分間灌流された。ピークおよび永久電流の持続遮断は、この定常状態条件から測定された。３つの連続電流トレースは平均されて、記録条件ごとに（対照、ラノラジンおよびＴＴＸ）平均電流を得た。平均電流トレースは、オフライン減算および解析のために利用された。ピーク電流の使用依存性遮断は、−１２０ｍＶの保持電位からパルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス、１０Ｈｚ）のパルス数３００中に測定された。２つの連続パルス列刺激は平均されて、記録条件ごとに平均電流トレースを得、次に平均電流トレースはオフライン減算および解析のために使用された。ランプ電流の遮断は、３０秒ごとに刺激されて２０ｍＶ／秒の速度で−１２０ｍＶの保持電位から＋２０ｍＶまでの電圧ランプにより評価された。時間依存性電流ドリフトを最小限にするため、対照、ラノラジンまたはＴＴＸ灌流中に記録される１トレースのみが解析された。ＴＴＸは、ラノラジンの存在下で適用された。濃度抑制曲線は、ヒルの式：Ｉ／Ｉｍａｘ＝１／［１＋１０∧（ｌｏｇＩＣ５０−Ｉ）＊ｋ］（ＩＣ５０は、半抑制を生み出す濃度であり、ｋは斜面係数である）を用いてフィットされた。
【００７２】
インビボ薬理学
頸静脈にカニューレ処置されたオススプラーグドーリーラット（２５０〜３５０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）を使用して、インビボでのラノラジンの脳透過性を調べた。動物使用は、動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）、Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより承認された。群あたり３匹のラットが、８５．５μｇ／ｋｇ／分で生理食塩水中のラノラジンを静脈内に注入された。１、２．５または５時間後、動物は屠殺されて血漿および脳が採取され、ラノラジン濃度は、タンデム質量分析と連結させた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定された。脳組織は、１％２Ｎ ＨＣｌで酸性化された５％フッ化ナトリウム中でホモジネートされた（最終ホモジネートは３倍希釈された）。血漿および脳ホモジネート試料（５０μｌ）は、内部標準として重水素化Ｄ３−ラノラジンと一緒に沈殿され、ボルテックスされ遠心分離された。上清（５０μＬ）は移され、注射（１０μｌ）に先立って水（４５０μｌ）で希釈された。高速液体クロマトグラフィーは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＤ液体クロマトグラフおよび０．１％ギ酸（溶液Ａ）とアセトニトリル（溶液Ｂ）を含有する水からなる移動相を用いるＬｕｎａＣ１８（２）、３μｍ、２０×２．０ｍｍカラムを使用して実施され、均一濃度条件（７５％溶液Ａ、２５％溶液Ｂ；流速０．３００ｍｌ／分）下で実行された。質量分析は、陽イオンモードで作動する、ＭＲＭトランジション４２８．１＞９８のＡＰＩ３０００質量分光計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施された。脳対血漿ラノラジン比は、試料ごとにｎｇラノラジン／ｇ脳をｎｇラノラジン／ｍｌ血漿で割ることにより計算された。
【００７３】
結果
ラノラジンはＷＴ−Ｎａｖ１．１を阻害する能力を有することが現在実証されており、癲癇および片頭痛症候群ＧＥＦＳ＋、ＳＭＥＩおよびＦＨＭ３に関連するＮａｖ１．１変異チャネルのパネルはこれら変異チャネルが運ぶ永久電流の異常増加を優先的に遮断するラノラジンの能力を実証している。
【００７４】
ＷＴ−Ｎａｖ１．１活性化および不活性化に対するラノラジン効果
ｔｓＡ２０１細胞において異種性に発現されるＷＴ−Ｎａｖ１．１の活性化および不活性化特性を変えるラノラジンの能力が確定された。図１（Ａ）は、対照溶液（無薬物）においてＷＴ−Ｎａｖ１．１を発現している細胞および３０μＭラノラジンを有する灌流中の同一細胞から記録された代表的ホールセルナトリウム電流を図示している。薬物の適用は、この高濃度でもＷＴ−Ｎａｖ１．１機能に対して顕著な効果を及ぼさなかった。同様に、対照溶液および３０μＭラノラジンの逐次適用中に記録されたピーク電流密度に対して薬物の著しい効果はなかった（図１（Ｂ））。さらに、３０μＭラノラジンはＷＴ−Ｎａｖ１．１活性化または不活性化の電圧依存性を著しく変化させることはなかった（図１（Ｃ）、表１）。これらの結果により、ラノラジンは、チャネルの活性化とは干渉しないことが示された。しかし、３０μＭラノラジンは、不活性化状態の安定性が増加したことと一致して、不活性化からのわずかであるが有意な回復の遅滞を確かに引き起こした（図１（Ｄ）、表１）。これらの結果から、３０μＭラノラジンはＷＴ−Ｎａｖ１．１機能に対して最小の効果を及ぼすことが示されている。
【００７５】
【表１】
永久電流の優先的ラノラジン遮断
ＷＴ−Ｎａｖ１．１および唯一の明白な生物物理学的欠陥として永久電流の著しい増加を示すことを発明者らが以前実証したＧＥＦＳ＋（Ｌｏｓｓｉｎら、２００２年；Ｋａｈｌｉｇら、２００６年）に関連する変異Ｎａｖ１．１（Ｒ１６４８Ｈ）により運ばれるピークおよび永久電流の濃度依然性持続抑制を発明者らは調べた。図２（Ａ）は、対照溶液（黒トレース）に続いて３０μＭラノラジン（灰色トレース）の逐次適用中、ＷＴ−Ｎａｖ１．１から記録されたホールセルナトリウム電流を図示している。データが拡大時間スケールでプロットされている挿入図により図示されるように、ＷＴ−Ｎａｖ１．１ピーク電流の持続遮断は最小限であった。図２（Ｂ）では、Ｒ１６４８Ｈについての同じ実験順序を図示しているが、永久電流は、無薬物条件と比べてラノラジンの灌流中は実質的に減少した。ＷＴ−Ｎａｖ１．１について観察されたように、３０μＭラノラジンは、Ｒ１６４８Ｈピーク電流の最小持続遮断を発揮した（図２（Ｂ）挿入図）。
【００７６】
ＷＴ−Ｎａｖ１．１とＲ１６４８Ｈの両方でのピーク電流と比べた場合、ラノラジンは永久電流のより大きな程度の持続抑制を示した（それぞれ図２（Ｃ）および２（Ｄ））。ヒルの式を用いた濃度抑制曲線のフィットは、持続ピーク電流遮断についてＷＴ−Ｎａｖ１．１では８７１μＭの、Ｒ１６４８Ｈでは４９０μＭのＩＣ５０値を提供したが（表２）、ＷＴ−Ｎａｖ１．１およびＲ１６４８Ｈにより運ばれる永久電流のラノラジン遮断は、それぞれ５３．７μＭおよび３０．２μＭのＩＣ５０値を示した。これらの結果から、ラノラジンはＷＴ−Ｎａｖ１．１またはＲ１６４８Ｈのどちらかにより運ばれる永久電流の持続遮断に対して約１６倍の選択性を有することが実証される。
【００７７】
【表２】
発明者らは、ラノラジンによるＷＴ−Ｎａｖ１．１およびＲ１６４８Ｈの使用依存性遮断も評価した。図３Ａは、対照溶液灌流中の反復脱分極プロトコール（５ｍｓ、−１０ｍＶ、３００パルス、１０Ｈｚ）に応答したＷＴ−Ｎａｖ１．１から記録されたホールセルナトリウム電流を図示している。無薬物対照溶液では、ＷＴ−Ｎａｖ１．１のアベイラビリティは反復脱分極中は変化していない。これとは対照的に、同じ細胞へ３０μＭラノラジンを適用すると反復パルシング中ピーク電流の減少を引き起こし、チャネルの使用依存性遮断と一致していた（図３（Ｂ））。ＷＴ−Ｎａｖ１．１およびＲ１６４８Ｈのラノラジン使用依存性遮断の濃度依存性は、それぞれ１９５μＭおよび１３８μＭのＩＣ５０値により特徴付けられた（図３（Ｃ）および３（Ｄ）、表２）。これらの結果から、ラノラジンは、ピーク電流の使用依存性遮断と比べて、ＷＴ−Ｎａｖ１．１およびＲ１６４８Ｈにより運ばれる永久電流を抑制するのにそれぞれ３．６倍および４．６倍強力であることが実証された。
【００７８】
変異Ｎａｖ１．１チャネルのラノラジン遮断
発明者らは、３つの臨床症状：ＧＥＦＳ＋（Ｒ１６４８Ｈ、Ｔ８７５Ｍ）、ＳＭＥＩ（Ｒ１６４８Ｃ、Ｆ１６６１Ｓ）およびＦＨＭ３（Ｌ２６３Ｖ、Ｑ１４８９９Ｋ）を表す６つのＮａｖ１．１変異チャネル間でラノラジン遮断の程度を比較した。図４（Ａ）は、無薬物対照溶液において記録された電流振幅に正規化された変異チャネルのこのパネルについて３０μＭラノラジンによるピークおよび永久電流の持続遮断を図示している。すべての変異体では、ピーク電流と比べて永久電流のラノラジン遮断の程度のほうがはるかに大きいことを発明者らは観察した。変異チャネルにより示される永久電流の大きさをＷＴ−Ｎａｖ１．１により伝導されるレベルにまで減少させるラノラジンの能力も発明者らは評価した。図４（Ｂ）では、永久電流はピーク電流のパーセントとして表され、無薬物条件に正規化されなかった。一般に、変異チャネルにより運ばれる永久電流のレベルは約５０％減少された（範囲４４〜６０％）が、一部の変異体（Ｒ１６４８Ｈ、Ｔ８７５Ｍ、Ｌ２６３Ｖ）では、ラノラジンの存在下でのレベルは、薬物の不在下でのＷＴ−Ｎａｖ１．１チャネルと有意に違ってはいなかった。
【００７９】
発明者らは、ラノラジンによる変異Ｎａｖ１．１ピーク電流の使用依存性遮断も評価した。図４（Ｃ）は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１および変異チャネルについての３０μＭラノラジンによるピーク電流の使用依存性遮断を図示している。ＷＴ−Ｎａｖ１．１もどの変異チャネルも３００ｔｈパルスによる対照溶液におけるチャネルアベイラビリティの著しい消失を示さなかったが、ＷＴ−Ｎａｖ１．１と変異チャネルの両方でラノラジン適用中チャネルアベイラビリティが著しく消失した。しかし、変異体のＲ１６４８Ｈ、Ｔ８７５ＭおよびＲ１６４８Ｃは、ＷＴ−Ｎａｖ１．１と比べて３０μＭラノラジンの存在下でチャンルアベイラビリティの著しく大きな減少を示した。
【００８０】
永久電流遮断の程度をピーク電流の使用依存性遮断の程度で割ることにより、変異Ｎａｖ１．１チャネルに対するラノラジンの効果を表す選択指数を発明者らは計算した。ラノラジンは、Ｌ２６３ＶおよびＦ１６６１Ｓチャネル上で永久電流のもっとも選択的な遮断を、Ｒ１６４８ＨおよびＲ１６４８Ｃチャネル上ではもっとも選択性の少ない遮断を示し、全体の順位序列はＬ２６３Ｖ＞Ｆ１６６１Ｓ＞Ｑ１４８９Ｋ＞Ｔ８７５Ｍ＞Ｒ１６４８Ｈ＝Ｒ１６４８Ｃであった。これらの関係は、増加した永久電流の選択的抑止をより受け入れられる可能性のあるＮａｖ１．１変異の分子サブセットを予想するのに役立ち得る。
【００８１】
ラノラジンの脳透過性
血液脳関門を通過するラノラジンの能力はこれまで報告されていない。１、２．５および５時間の薬物（８５．５μｇ／ｋｇ／分）の連続静脈内注入に続くラットにおけるラノラジンの脳透過性の程度を発明者らは測定した。ラノラジンは、すべての時点で著しい脳透過性を示し、５時間後に４７０ｎｇラノラジン／ｇ脳（約１．１μＭ、表３）でピークに達した。調べられた時間経過全体で、ラノラジンの平均脳レベルは、対応する血漿中レベルの約３分の１であった。ラノラジンの治療血漿中濃度が２〜１０μＭであることを考慮すると、最大３．３μＭの脳濃度がふさわしいはずである。
【００８２】
【表３】
治療ラノラジン濃度による永久電流の抑止
発明者らは次に、緩徐脱分極電圧ランプ、すなわち永久電流の増加に起因する現象中にＲ１６４８Ｈ活性化を抑止する、達成可能な脳濃度である３μＭラノラジンの能力を試験した。図５（Ａ）は、緩徐脱分極電圧ランプに応答して発生する代表的内向き電流を表示している。Ｒ１６４８Ｈ細胞は、３μＭラノラジン（薄い灰色トレース）により遮断される脱分極電流の増加（ＷＴと比べて；中間灰色対黒色トレース）を示した。平均内向き電荷（ｐＣ）は、チャネル発現の変化を説明するために、複数の細胞について−４０と０ｍＶ間の電流トレース下の面積として計算され、−１０ｍＶまでの電圧ステップにより発生する対応するピーク電流（ｎＡ）に正規化された。図５（Ｂ）は、対照溶液に続いて３μＭラノラジンの逐次灌流が、Ｒ１６４８Ｈにより伝導される電荷を薬物の不在下で記録されたＷＴチャネルを発現している細胞において観察されたレベルにまで減少させたことを実証している。
【００８３】
最後に、発明者らは、３μＭラノラジンによるＷＴおよび変異Ｎａｖ１．１の使用依存性遮断を評価した。図５（Ｃ）は、１０と１３５Ｈｚ間のパルシング周波数でのＷＴ−Ｎａｖ１．１およびＲ１６４８Ｈチャネルの使用依存性遮断を図示している。対照溶液では、ＷＴとＲ１６４８Ｈの両方が、チャネルアベイラビリティの予想される程度の周波数依存性消失を示したが、３μＭラノラジンを適用すると、２２Ｈｚよりも大きな周波数すべてにおいてアベイラビリティの消失を拡大した。これらの結果は３μＭラノラジンによる著しい使用依存性遮断と一致している。図５Ｄは、３μＭラノラジンが、１００ＨｚまでＷＴおよびＲ１６４８Ｈチャネルの類似する程度の遮断を生じたことを表示している。
【００８４】
（実施例２）
材料および方法
ヒトＮａｖ１．２ ｃＤＮＡの発現
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定的にトランスフェクトされた野生型（ＷＴ）ｃＤＮＡを使用して、Ｎａ＋電流を記録する。そうではないと言及されなければ、すべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入している。
【００８５】
電気生理学
ホールセル電圧クランプ記録を使用して、ＷＴの生物物理学的特性を測定する。手短に言えば、ピペット溶液は、ｐＨ７．３５および容量オスモル濃度３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの１１０ＣｓＦ、１０ＮａＦ、２０ＣｓＣｌ、２ＥＧＴＡ、１０ＨＥＰＥＳ（ｍＭ）からなる。バス（対照）溶液は、ｐＨ７．３５および容量オスモル濃度３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの１４５ＮａＣｌ、４ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、１０デキストロース、１０ＨＥＰＥＳ（ｍＭ）を含有する。細胞は、電流を測定する前にホールセル配置の確立後１０分間安定化させる。直列抵抗は、確実に電圧誤差＜２ｍＶでマイクロ秒以内にコマンド電位に到達するように９０％保証される。漏洩電流は、オンラインＰ／４手順を使用することにより減算され、全電流は、５ｋＨｚで低域Ｂｅｓｓｅｌフィルターされ、５０ｋＨｚでデジタル化される。
【００８６】
明確にするために、代表的ランプ電流は、５０Ｈｚでオフラインにより低域フィルターされる。反復刺激中のチャネル活性化、急速不活性化およびアベイラビリティを評価する特定の電圧クランププロトコールを使用する。結果は、平均±ＳＥＭとして表され、そうではないと言及されなければ、統計的比較は一元配置ＡＮＯＶＡを使用して行われる。
【００８７】
ピーク電流の持続遮断が測定される。平均電流トレースはオフライン減算および解析のために利用される。ピーク電流の使用依存性遮断は、−１２０ｍＶの保持電位から１０と１３５Ｈｚの間の周波数でパルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス）のパルス数３００中に測定される。２つの連続パルス列刺激は平均されて、記録条件ごとに平均電流トレースを得、次に平均電流トレースはオフライン減算および解析のために使用される。
【００８８】
反復刺激中のチャネル活性化、急速不活性化およびアベイラビリティを評価する特定の電圧クランププロトコールを使用する。ホールセルコンダクタンスは、ＧＮａ＝ＩＮａ／（Ｖ−ＥＮａ）によりピーク電流振幅から計算され、−８０と＋２０ｍＶ間の最大コンダクタンスに正規化される。コンダクタンス−電圧および定常状態チャネルアベイラビリティ曲線は、最大半量活性化／不活性化（Ｖ１／２）および傾斜係数（ｋ）の電圧を決定するためにボルツマン関数を用いてフィットさせる。不活性化への時間依存性進入および不活性化からの時間依存性回復は、ピーク電流回復を２つの指数関数、Ｉ／Ｉｍａｘ＝Ａｆ×［１−ｅｘｐ（−ｔ／τｆ）］＋Ａｓ×［１−ｅｘｐ（−ｔ／τｓ）］（τｆおよびτｓは時間定数（それぞれ、急速および緩徐成分）を意味し、ＡｆおよびＡｓは急速および緩徐分数振幅を表す）を用いてフィットさせることにより評価される。
【００８９】
使用依存性研究では、細胞は、−１２０ｍＶの保持電位から脱分極パルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス、１０Ｈｚ）を用いて刺激される。次に、電流は、各周波数列において第一パルスに応答して記録されたピーク電流に正規化される。持続遮断研究では、ピークおよび永久電流は、０．５μＭテトロドトキシン（ＴＴＸ）の存在および不在下で記録された電流のデジタルサブストラクションに続いて−１０ｍＶ（０．２Ｈｚ）までの２００ｍｓ脱分極に応答して評価される。永久電流は、２００ｍｓステップの最終１０ｍｓ中に計算される。データ解析は、Ｃｌａｍｐｆｉｔ９．２（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、Ｅｘｃｅｌ２００２（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、およびＯｒｉｇｉｎＰｒｏ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）ソフトウェアを使用して実施される。結果は、平均±ＳＥＭとして示されている。そうではないと言及されなければ、ＷＴ−Ｎａｖ１．２に関連して、一元配置ＡＮＯＶＡに続いてチューキー事後検定を使用して統計的比較は行われる。
【００９０】
インビトロ薬理学
２０ｍＭラノラジン（Ｇｉｌｅａｄ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の保存液は０．１Ｍ ＨＣｌ中で調製される。バス溶液中のラノラジンの新鮮な希釈液は実験日ごとに調製され、そのｐＨは７．３５に再調整される。クランプされた細胞への灌流液の直接適用は、灌流ペンシル（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｐｅｎｃｉｌ）システム（Ａｕｔｏｍａｔｅ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を使用して実現される。直接細胞灌流は、２５０ミクロンチップを使用して、流速３５０μＬ／分で重力により推進される。このシステムは、クランプされた細胞を灌流の流れ内に隔離し、１秒以内の完全な溶液交換を可能にする。クランプされた細胞は、ホールセル配置を確立させた直後に開始して連続して灌流される。対照電流は、対照溶液灌流中に測定される。
【００９１】
ラノラジン含有溶液は、平衡（持続）薬物遮断を可能にするために電流記録に先立って３分間灌流される。ピークおよび永久電流の持続遮断は、この定常状態条件から測定される。３つの連続電流トレースは平均されて、記録条件ごとに（対照、ラノラジンおよびＴＸＸ）平均電流を得る。平均電流トレースは、オフライン減算および解析のために利用される。ピーク電流の使用依存性遮断は、−１２０ｍＶの保持電位からパルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス、１０Ｈｚ）のパルス数３００中に測定される。２つの連続パルス列刺激は平均されて、記録条件ごとに平均電流トレースを得、次に平均電流トレースはオフライン減算および解析のために使用される。ランプ電流の遮断は、３０秒ごとに刺激されて２０ｍＶ／秒の速度で−１２０ｍＶの保持電位から＋２０ｍＶまでの電圧ランプにより評価される。時間依存性電流ドリフトを最小限にするため、対照、ラノラジンまたはＴＴＸ灌流中に記録される１トレースのみが解析される。ＴＴＸは、ラノラジンの存在下で適用される。濃度抑制曲線は、ヒルの式：Ｉ／Ｉｍａｘ＝１／［１＋１０∧（ｌｏｇＩＣ５０−Ｉ）＊ｋ］（ＩＣ５０は、半抑制を生み出す濃度であり、ｋは斜面係数である）を用いてフィットされる。
【００９２】
結果
したがって、ラノラジンはＷＴ−Ｎａｖ１．２を阻害する能力を有することが実証されており、このチャネルが運ぶ永久電流の異常増加を優先的に遮断するラノラジンの能力を実証している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラノラジンの投与による癲癇および他の中枢神経系（ＣＮＳ）障害の治療方法に関する。この方法は、ナトリウムチャネルが阻害されるのが有益であると考えられる、癲癇および片頭痛などのいかなるＣＮＳ状態の治療にも有用性を見出す。本発明は、そのような併用投与に適している医薬製剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１（この明細書は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、ラノラジン、（±）−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−４−［２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシフェノキシ）−プロピル］−１−ピペラジンアセトアミドおよびその薬学的に許容される塩、ならびに不整脈、異形狭心症と労作性狭心症、および心筋梗塞を含む心血管疾患の治療におけるその使用を開示している。その二塩酸塩の形態では、ラノラジンは、式
【０００３】
【化１】
により表される。
【０００４】
この特許は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール４００、Ｔｗｅｅｎ８０および０．９％生理食塩水をさらに含む、ラノラジン二塩酸塩の静注（ＩＶ）製剤も開示する。
【０００５】
特許文献２（この特許は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、心臓麻痺、心筋もしくは骨格筋または脳組織への低酸素または再灌流傷害を含む、物理的または化学的損傷を受けた組織の治療および移植における使用のための、ラノラジンとその薬学的に許容される塩およびエステルの使用を開示している。放出制御製剤を含む、経口および非経口製剤が開示されている。特に、特許文献２の実施例７Ｄは、放出制御ポリマーで被膜されたラノラジンと微結晶性セルロースのマイクロスフィアを含むカプセル型の放出制御製剤を記載している。この特許は、低末端では、約５重量％デキストロースを含有するＩＶ溶液のミリリットルあたり５ｍｇのラノラジンを含むＩＶラノラジン製剤も開示している。さらに、高末端では、約４重量％デキストロースを含有するＩＶ溶液のミリリットルあたり２００ｍｇのラノラジンを含有するＩＶ溶液が開示されている。
【０００６】
ラノラジンとその薬学的に許容される塩およびエステルの現在好ましい投与経路は経口である。典型的な経口剤形は、圧縮錠剤、混合粉末もしくは顆粒を充填された硬質ゼラチンカプセル、または液剤もしくは懸濁剤が充填された軟質ゼラチンカプセル（ソフトジェル）である。特許文献３（この明細書は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、硬質ゼラチンカプセルまたはソフトジェルのための充填溶液として過冷却された液体ラノラジンを用いる高用量経口製剤を開示している。
【０００７】
特許文献４（この明細書は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、製剤が胃内の酸性環境と腸内のより塩基性の環境の両方を通過する間に満足のいく血漿レベルのラノラジンを与える問題を克服し、狭心症および他の心血管疾患の治療に必要な血漿レベルを提供するのに非常に効果的であることが判明している徐放製剤を開示している。
【０００８】
特許文献５（この明細書は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、不整脈、異形狭心症と労作性狭心症、および心筋梗塞を含む、心血管疾患の治療法を開示している。
【０００９】
特許文献６（この明細書は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）は、ラノラジンが３５〜５０％、好ましくは４０〜４５％ラノラジンが存在している経口徐放剤形を開示している。一実施形態では、この発明のラノラジン徐放製剤は、ｐＨ依存性結合剤、ｐＨ非依存性結合剤および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。適切なｐＨ依存性結合剤には、メタクリル酸コポリマー、たとえば、メタクリル酸コポリマーを約１〜２０％、たとえば、約３〜６％の程度まで中和するのに十分な量で、強塩基、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化アンモニウムを用いて部分的に中和されているＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５のシュードラテックスなど）が挙げられるが、これに限定されない。適切なｐＨ非依存性結合剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、たとえば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標）Ｅ１０Ｍ Ｐｒｅｍｉｕｍ ＣＲグレードＨＰＭＣまたはＭｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標）Ｅ４Ｍ Ｐｒｅｍｉｕｍ ＨＰＭＣが挙げられるが、これらに限定されない。適切な薬学的に許容される賦形剤には、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ｐＨ１０１）が挙げられる。
【００１０】
国立癲癇協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ）によれば、４０以上の異なる種類の癲癇が存在する。各種類は、発作型、発症年齢、ＥＥＧ所見のその独自の組合せにより定義される。発作の部位および／または分布も使用して、癲癇の種類は分類される。いずれか１種類の癲癇の特定の因果関係は分からないことがあるが、遺伝子ＳＣＮ１Ａに変異が起こると、いくつかの特定種類の癲癇およびＣＮＳ障害が生じることが現在では公知である。
【００１１】
ＳＣＮ１Ａは、脳電位開口型ナトリウム（Ｎａｖ）チャネルＮａｖ１．１のポア形成αサブユニットをコードし、遺伝性癲癇を引き起こすもっとも一般的な変異遺伝子である。変異Ｎａｖ１．１チャネルは、熱性痙攣プラスを伴う比較的良性の全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）から衰弱性の乳児重症ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）までの広範囲の癲癇症候群を引き起こす。さらに最近では、ＳＣＮ１Ａの変異は、遺伝性片頭痛症候群家族性片麻痺性片頭痛３型（ＦＨＭ３）を引き起こすことが見出された。いくつかのＮａｖ１．１変異体について観察される共通の特徴は著しく増加した永久電流であり、これは活動電位発生および伝搬を促進することにより神経興奮性亢進を引き起こすと考えられている。
【００１２】
ラノラジンはいくつかの分子標的に対して活性を示すが、主要な治療作用機序は、Ｎａｖチャネル永久電流の遮断であると考えられている。この効果は、永久ナトリウム電流が毒素ＡＴＸ−ＩＩにより誘導されるＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）のモルモット心室筋細胞モデルにおいてはじめて明らかにされた（Ｗｕら、非特許文献１；Ｓｏｎｇら、非特許文献２）。その後、ラノラジンは、Ｎａｖ１．５ＬＱＴ変異チャネルにより直接搬送される増加した永久電流を優先的に遮断することが明らかにされた（Ｆｒｅｄｊら、非特許文献３；Ｒａｊａｍａｎｉら、非特許文献４）。さらに最近では、ラノラジンは、筋肉（Ｎａｖ１．４）（Ｗａｎｇら、非特許文献５）、心臓（Ｎａｖ１．５）（Ｗａｎｇら、２００８年）および末梢神経（Ｎａｖ１．７とＮａｖ１．８）（Ｗａｎｇ、２００８年；Ｒａｊａｍａｎｉら、非特許文献６）中で発現される様々な野生型Ｎａｖチャネルアイソフォームを遮断することが明らかにされている。
【００１３】
しかし、脳Ｎａｖチャネルアイソフォーム（たとえば、Ｎａｖ１．１またはＮａｖ１．２）を阻害するラノラジンの能力はこれまで報告されていない。ラノラジンは、変異Ｎａｖ１．１チャネルにより発生される永久電流を優先的に遮断する能力を有することが現在では発見されている。ラノラジンは、持続と使用依存性遮断パラダイムの両方においてＮａｖ１．１の高親和性阻害を示す。ラノラジンなどのＮａｖ１．１永久電流選択薬の臨床可能性は、ＳＣＮ１Ａ関連癲癇および片頭痛症候群などのＣＮＳ障害に対する新たな治療選択肢を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第４，５６７，２６４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５０６，２２９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４７２，７０７号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５０３，９１１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，８５２，７２４号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００６／０１７７５０２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】（２００４年）． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３１０巻：５９９〜６０５頁
【非特許文献２】（２００４年）． Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４４巻：１９２〜１９９頁
【非特許文献３】（２００６年）． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １４８巻：１６〜２４頁
【非特許文献４】（２００９年）． Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ ６巻：１６２５〜１６３１頁
【非特許文献５】（２００８年）． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７３巻：９４０〜９４８頁
【非特許文献６】（２００８年ａ）Ｃｈａｎｎｅｌｓ ２巻：４４９〜４６０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の目的は、片頭痛および癲癇を含むがこれらに限定されないＣＮＳ障害を治療するための方法であって、治療的有効量、または予防的有効量のラノラジン、または薬学的に許容されるその塩を、ＣＮＳ障害の治療を必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供することである。
【００１７】
本発明の一部の態様では、ラノラジンは、ＳＣＮ１Ａ変異に関連するＣＮＳ障害の治療または予防のために投与される。ＳＣＮ１Ａにおける変異に関連する状態には、熱性痙攣プラスを伴う全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）２型、乳児重症ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）、家族性片麻痺性片頭痛３型（ＦＨＭ３）、熱性痙攣プラスを伴う全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）１型が挙げられるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１に対するラノラジンの効果を示している。図１（Ａ）は、対照溶液に続いて３０μＭラノラジンの逐次灌流中に記録される代表的なホールセルナトリウム電流を表示している。電流は、−１２０ｍＶの保持電位から−８０から＋２０ｍＶの間までの電圧ステップにより活性化された。図１（Ｂ）は、試験パルスにより様々な電位まで誘発され、対照溶液（白四角）に続いて３０μＭラノラジン（黒丸）の逐次灌流中に記録される細胞キャパシタンスに正規化されるピーク電流密度を表示している。図１（Ｃ）は、−１４０から−１０ｍＶの間までの１００ｍｓプレパルスを用いて決定される急速不活性化の電圧依存性と共にプロットされる−８０から＋２０ｍＶの間までの電圧ステップ中に測定される活性化の電圧依存性を示している（符号はＢにおいて定義されるのと同じである）。パルスプロトコールはパネル挿入図として表示されており、フィットパラメータは表１に提供されている。図１（Ｄ）は、−１０ｍＶまでの１００ｍｓ不活性化プレパルスに続く急速不活性化からの時間依存性回復を表示している（符号は図１（Ｂ）において定義されるのと同じである）。パルスプロトコールはパネル挿入図として表示されており、フィットパラメータは表１に提供されている。
【図２】図２は、ラノラジンがＮａｖ１．１永久電流をどのようにして優先的に抑制するかを例示している。Ｎａｖ１．１ピークおよび永久電流の持続性抑制は、−１２０ｍＶの保持電位から−１０ｍＶまでの２００ｍｓ電圧ステップを使用して測定される。代表的なＴＴＸ減算ホールセルナトリウム電流は、対照溶液（黒色線）に続いて３０μＭラノラジン（灰色線）の逐次灌流中に、ＷＴ−Ｎａｖ１．１、図２（Ａ）およびＲ１６４８Ｈ、図２（Ｂ）について記録される。破線はゼロ電流レベルを示している。図２（Ｃ）および２（Ｄ）は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１とＲ１６４８Ｈピーク電流（白四角）および永久電流（黒四角）の濃度依存性持続性遮断をラノラジンがどのようにして示すかを図表で表示している。ラノラジン灌流中に測定されるピークと永久電流は、対照溶液において測定される電流に正規化された。フィットパラメータは実施例１の表２に提供されている。
【図３】図３は、ラノラジンによるＮａｖ１．１の使用依存性遮断を支持するデータを示している。反復刺激中のＮａｖ１．１アベイラビリティは、−１２０ｍＶの保持電位からの脱分極パルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス、１０Ｈｚ）を用いて評価された。代表的ホールセルナトリウム電流は、図３（Ａ）に示される対照溶液、続いて３０μＭラノラジン、図３（Ｂ）の逐次灌流中、ＷＴ−Ｎａｖ１．１から記録される。明確にするため、パルス１、３０および３００からの電流トレースのみが表示されている。図３（Ｃ）および３（Ｄ）は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１とＲ１６４８Ｈピーク電流の濃度依存性および使用依存性遮断をラノラジンがどのように示すかを図表で表示している（黒四角）。ＷＴ−Ｎａｖ１．１もＲ１６４８Ｈも、無薬物対照溶液に曝露される場合はアベイラビリティの使用依存性減少は示さなかった（白四角）。フィットパラメータは実施例１の表２に提供されている。
【図４】図４は、ラノラジンによる永久電流の優先的遮断を図表で例示している。ピークと永久電流の持続性遮断は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１および変異Ｎａｖ１．１チャネルについて、３０μＭラノラジンの適用中、−１０ｍＶまでの２００ｍｓ電圧ステップを使用して測定される。図４（Ａ）は、ピーク（黒色バー）と永久（白色バー）電流振幅が、細胞ごとに（ｎ＝５〜７）無薬物対照溶液において記録される値に正規化されていたことを図表で表している。図４（Ｂ）は、３０μＭラノラジンについて同じ電圧プロトコール中に記録されるピーク電流の百分率として表される永久電流を図表で表している。無薬物溶液におけるＷＴ−Ｎａｖ１．１からの有意差は、＊（ｐ＜０．０５）および◆（Ｐ＜０．０１）により示されている。図４（Ｃ）は、３０μＭラノラジンの灌流中のＷＴ−Ｎａｖ１．１および変異チャネルの使用依存性遮断を図表で表している（ｎ＝５〜７）。ＷＴ−Ｎａｖ１．１も変異Ｎａｖ１．１チャネルも、無薬物対照溶液に曝露される場合はアベイラビリティの使用依存性減少は示さなかった（黒色バー）。ＷＴからの有意差は、＊（ｐ＜０．０５）および◇（ｐ＜０．０１）により示されている。
【図５】図４は、ラノラジンがランプと使用依存性電流をどのように抑制するのかを詳記している。図５（Ａ）は、対照溶液に続いて３μＭラノラジンの逐次灌流中の−１２０ｍＶの保持電位からの２０ｍＶ／ｓ電圧ランプ中に測定される代表的ＴＴＸ減算ランプ電流を表示している。点線はゼロ電流を示している。図５（Ｂ）は、Ｒ１６４８Ｈがこのランプの−４０と０ｍＶの間で著しく多い電荷を伝導し、これは３μＭラノラジンによりＷＴ−Ｎａｖ１．１のレベルまで抑制されたことを図表で例示している（ｎ＝９〜１０）。図５（Ｃ）は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１とＲ１６４８Ｈアベイラビリティが、対照溶液に続いてラノラジンの逐次灌流中１０から１３５Ｈｚの間の周波数で脱分極パルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス）を用いた反復刺激中に評価されたデータを表している。正規化ピーク電流（パルス３００／パルス１）はパルス列ごとに周波数に対してプロットされた（それぞれｎ＝９および８）。図５（Ｄ）は、３μＭラノラジンおよび対照条件中チャネルアベイラビリティの比として計算される正規化ピーク電流の抑制を示す曲線を表している。ＷＴ−Ｎａｖ１．１とＲ１６４８Ｈ間の有意差は、＊（ｐ＜０．０５）、◆（ｐ＜０．０１）および
【００１９】
【数１】
（ｐ＜０．０１）により示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義および一般的パラメータ
本明細書で使用されるとき、以下の単語および語句は、単語および語句が使用される文脈が他のことを示す程度を除いて、以下に記載される意味を有することが一般に意図されている。
【００２１】
「任意選択の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、その記載は前記事象または状況が起きる例および前記事象または状況が起こらない例を含むことを意味する。
【００２２】
「非経口投与」は、注射を介した患者への治療薬の全身送達のことである。
【００２３】
用語「治療的有効量」とは、そのような治療を必要とする哺乳動物へ投与された場合、下に定義される治療を達成するのに十分である式１の化合物の量のことである。治療的有効量は、使用されている治療薬の比活性、患者の病態の重症度、ならびに患者の年齢、健康状態、他の病態の存在、および栄養状態に応じて変わることになる。さらに、患者が受けている場合がある他の薬物療法があれば投与する治療薬の治療的有効量の決定に影響を与えることになる。
【００２４】
用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、
（ｉ）疾患を予防する、すなわち、疾患の臨床症状を発症させないこと、
（ｉｉ）疾患を抑制する、すなわち、臨床症状の進行を抑止すること、および／または
（ｉｉｉ）疾患を軽減する、すなわち、臨床症状を退行させること
を含む、哺乳動物における疾患の任意の治療を意味する。
【００２５】
「チャネル病」とは、イオンチャネル奇形に関連する疾患または状態のことである。
【００２６】
ラノラジンはアミノ基および／もしくはカルボキシル基またはそれに類似の基の存在によって酸性塩および／または塩基性塩を形成することができる。用語「薬学的に許容される塩」とは、ラノラジンの生物学的有効性と特性を保持しており、生物学的にまたは他の点で有害ではない塩のことである。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基から調製することが可能である。無機塩基由来の塩には、ほんの一例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩が挙げられる。有機塩基由来の塩には、アルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、置換アルキルアミン、ジ（置換アルキル）アミン、トリ（置換アルキル）アミン、アルケニルアミン、ジアルケニルアミン、トリアルケニルアミン、置換アルケニルアミン、ジ（置換アルケニル）アミン、トリ（置換アルケニル）アミン、シクロアルキルアミン、ジ（シクロアルキル）アミン、トリ（シクロアルキル）アミン、置換シクロアルキルアミン、二置換シクロアルキルアミン、三置換シクロアルキルアミン、シクロアルケニルアミン、ジ（シクロアルケニル）アミン、トリ（シクロアルケニル）アミン、置換シクロアルケニルアミン、二置換シクロアルケニルアミン、三置換シクロアルケニルアミン、アリールアミン、ジアリールアミン、トリアリールアミン、ヘテロアリールアミン、ジヘテロアリールアミン、トリヘテロアリールアミン、複素環アミン、ジ複素環式アミン、トリ複素環式アミン、アミン上の置換基のうちの少なくとも２つが異なっており、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環などからなる群から選択される混合ジおよびトリアミンなどの第一級、第二級および第三級アミンの塩が挙げられるがこれらに限定されない。２つまたは３つの置換基がアミノ窒素と共に複素環またはヘテロアリール基を形成しているアミンも挙げられる。
【００２７】
適切なアミンの特定の例には、ほんの一例として、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリ（イソプロピル）アミン、トリ（ｎ−プロピル）アミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、Ｎ−エチルピペリジンなどが挙げられる。
【００２８】
薬学的に許容される酸付加塩は無機および有機酸から調製され得る。無機酸由来の塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。有機酸由来の塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被膜剤、抗菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野では周知である。いかなる従来の媒体または薬剤でも活性成分と適合しない場合を除いて、治療組成物中でのその使用が企図されている。補助的活性成分もこの組成物に取り込むことが可能である。
【００３０】
ラノラジンは、Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−４−［２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシフェノキシ）プロピル］−１−ピペラジンアセトアミドと命名されているが｛１−［３−（２−メトキシフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピル］−４−［（２，６−ジメチルフェニル）−アミノカルボニルメチル］−ピペラジンとしても公知｝、ラセミ混合物、もしくはその鏡像異性体、またはその鏡像異性体の混合物、または薬学的に許容されるその塩として存在することが可能である。ラノラジンは、米国特許第４，５６７，２６４号に記載される通りに調製することが可能であり、この明細書は参照により本明細書に組み込まれている。
【００３１】
「即時放出」（「ＩＲ」）とは、インビトロで急速に溶解し、胃または上部消化管において完全に溶解され吸収されることが意図されている製剤または用量単位のことである。従来、そのような製剤は、投与から３０分以内にその活性成分の少なくとも９０％を放出する。
【００３２】
「徐放」（「ＳＲ」）とは、約６時間またはそれ以上の期間かけて胃および消化管において緩徐に連続して溶解され吸収される本明細書で使用される製剤または用量単位のことである。好ましい徐放製剤は、下記の投与あたり２個またはそれ未満の錠剤の一日２回以下の投与に適したラノラジンの血漿中濃度を示す製剤である。
【００３３】
「異性体」は同じ分子式を有する異なる化合物である。
【００３４】
「立体異性体」は、空間における原子の配置の仕方のみが異なる異性体である。
【００３５】
「鏡像異性体」は、互いに重ね合わせることができない鏡像である一対の立体異性体である。一対の鏡像異性体の１対１混合物は「ラセミ」混合物である。必要に応じて、用語「（±）」を使用してラセミ混合物であることを指定する。
【００３６】
「ジアステレオ異性体」は、少なくとも２つの非対称性原子を有するが、互いの鏡像ではない立体異性体である。
【００３７】
絶対立体化学は、カーン−インゴルド−プレローグＲ−Ｓ法に従って特定される。化合物が純粋な鏡像異性体である場合、各キラル炭素における立体化学はＲまたはＳのどちらかにより特定され得る。その絶対配置が未知の分割された化合物は、その化合物がナトリウムＤ線の波長で偏光の平面を回転させる方向（右旋性または左旋性）に応じて（＋）または（−）のどちらかを指定される。
【００３８】
本発明の方法
本発明の方法は、ラノラジンが永久Ｎａｖ１．１電流を抑制するという驚くべき発見に基づいている。電位開口型ナトリウムチャネルは、フェニトインおよびラモトリギンなどのいくつかの広く使用されている抗癲癇薬の重要な標的である。これらの薬物は、一部において不活性化状態を安定化し、それによってナトリウムチャネルアベイラビリティを減少させ、ニューロンが繰返し発火する能力を制限することにより機能する。反復的ニューロン活動中にナトリウムチャネルアベイラビリティを減少させることに加えて、これらの薬物の別の潜在的に重要な効果は、永久ナトリウム電流の抑止であり得る（Ｓｔａｆｓｔｒｏｍ ＣＥ （２００７年）、Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｃｕｒｒ ７巻：１５〜２２頁）。脳全体の数種類のニューロンは、活性化されたナトリウムチャネルの不完全な閉鎖から生じる低振幅永久電流を示す。小さいが、永久ナトリウム電流は、ニューロン発火行動にかなり影響を与えることが可能であり、癲癇活性の伝播を可能にするのに決定的に重要であり得る（Ｓｔａｆｓｔｒｏｍ、２００７年）。
【００３９】
様々な癲癇において発見されたニューロンナトリウムチャネル変異の機能的意義が明らかにされると、癲癇の病因における永久ナトリウム電流の重要性はさらに注目された。ＧＥＦＳ＋および他の癲癇に関連するＳＣＮ１Ａのいくつかの変異は、優勢な生物物理学的異常としてときに永久電流の増加を示す（Ｌｏｓｓｉｎら、（２００２年）、Ｎｅｕｒｏｎ ３４巻：８７７〜８８４頁；Ｒｈｏｄｅｓら、（２００４年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１巻：１１１４７〜１１１５２頁；Ｋａｈｌｉｇ Ｋら、（２００６年）、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２６巻：１０９５８〜１０９６６頁；Ｋａｈｌｉｇら、（２００８年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５巻：９７９９〜９８０４頁；Ｓｐａｍｐａｎａｔｏら、（２００４年）． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４巻：１００２２〜１００３４頁）。これらの所見は、癲癇発作における説得力のある病態生理学的因子として永久電流の増加を強調し、永久電流の選択的抑止が、この種のナトリウムチャネル機能障害を促進する変異に関連する珍しい家族性癲癇に治療戦略を提供し得るという着想を刺激した。
【００４０】
慢性安定狭心症の治療に承認された薬物であるラノラジンは、ＳＣＮ１Ａ変異により誘起される永久電流の増加を選択的に抑止することができることが現在発見されている。ラノラジンは、ピーク電流の持続性遮断および使用依存性遮断と比べて永久電流の抑制の大きさはそれぞれ１６倍と５倍を示すことが現在では確定されている。この抑制は、低マイクロモーラー濃度範囲で最大の選択性を有する濃度依存性であり、この抑制は通常の治療血漿中濃度の２〜１０μＭに匹敵する（Ｓｉｃｏｕｒｉら、（２００８年）、Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ ５巻： １０１９〜１０２６頁；Ｃｈａｉｔｍａｎ ＢＲ （２００６年）、Ｃｉｒｃ １１３巻：２４６２〜２４７２頁）。
【００４１】
ラノラジンは電流密度、活性化および不活性化の電圧依存性に重大な効果を持たないが、化合物は確かにある程度の不活性化された状態安定化を示すことがある不活性化からの回復を遅くするように思われる。ラノラジンは、ＷＴおよび変異Ｎａｖ１．１の使用依存性遮断も発揮し、不活性化安定化の追加の証拠を提供するが、これらの効果に必要な濃度は、薬物の通常の治療血漿内レベルよりもはるかに高い。
【００４２】
理論に縛られたくはないが、ラノラジンのＮａｖ１．１およびＮａｖ１．２への結合は、他のナトリウムアイソフォームで報告されている薬物−受容体部位相互作用を必要とすると考えられている。Ｎａｖ１．４およびＮａｖ１．７の遮断を調べた以前の報告では、Ｗａｎｇらは、ラノラジンは開口状態に選択的に結合し、閉鎖または不活性化状態への結合は最小であると断定した（Ｗａｎｇら、（２００８年）、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７３巻：９４０〜９４８頁）。彼らの研究は、ステップ持続時間が増加していく電圧列プロトコールを利用して、ラノラジン使用依存性抑制とオープン構造の提示を相関させた。この筆者らは、Ｎａｖ１．４での適度に急速な会合速度（Ｋｏｎ＝８．２μＭ−１ｓ−１）も報告しており、これによりチャネルが膜脱分極に正常に応答した後にのみ薬物結合が可能になると筆者らは示唆していた。残念ながら、電流量を制御するために、この研究では逆ナトリウム勾配（６５ｍＭ外側および１３０ｍＭ内側）が用いられ、特にラノラジンがオープン構造内のイオン伝導経路近くに結合した場合には、結果としてのナトリウムイオンの非生理的流出が薬物結合動態に影響した可能性がある。Ｒａｊａｍａｎｉらによる別の研究も、Ｎａｖ１．７およびＮａｖ１．８チャネルへのラノラジンの状態依存性結合を調べた（Ｒａｊａｍａｎｉら、（２００８年ａ）． Ｃｈａｎｎｅｌｓ ２巻：４４９〜４６０頁）。
【００４３】
前のデータと組み合わされた実施例１に示されるデータは、ナトリウムチャンルアイソフォーム間のラノラジンの多様な作用を強調している。それにもかかわらず、ラノラジンによるナトリウムチャネルの抑制を調べている各研究が、９から１７倍の選択性での永久電流の優先的遮断を報告していた（Ｗａｎｇら、（２００８年）；Ｆｒｅｄｊら、（２００６年）． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １４８巻：１６〜２４頁；Ｒａｊａｍａｎｉら、（２００９年）． Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ ６巻：１６２５〜１６３１頁）。
【００４４】
ラノラジンによる永久電流遮断についての考え得る作用機序には、１）開口状態に結合しポアを閉鎖すること；２）開口状態に結合し二次不活性化安定化を提供すること；３）不活性化状態に結合し直接安定化不活性化にいたること；または４）それぞれの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。細胞内局所麻酔薬結合部位の関与の証拠は、Ｎａｖ１．５およびＮａｖ１．４において結合部位を変異させるとラノラジンの効力が減少するという知見により支持される（Ｗａｎｇら、（２００８年）；Ｆｒｅｄｊら（２００６年））。
【００４５】
通常の臨床用量では、ラノラジンに耐容性がよいのは、眩暈、悪心、頭痛および便秘などの軽度の副作用を起こす患者のうちの少数である（Ｎａｓｈら、（２００８年）、Ｌａｎｃｅｔ ３７２巻：１３３５〜１３４１頁）。ラノラジンは、心臓の電圧開口型カリウムチャンルＨＥＲＧも遮断し（Ｒａｊａｍａｎｉら、（２００８年ｂ）、Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５１巻：５８１〜５８９頁）、このことが一部の被験体において観察される軽度のＱＴ間隔延長を説明する。下の実施例１において考察されるように、ラノラジンは血液脳関門を通過することができ、このことが薬物を受けた被験体により報告される眩暈および頭痛などのある種の副作用を説明し得ることが現在では確定している。さらに、ラノラジン脳透過性が実証されたことは、本薬物が、実施例１において試験される変異などのある種のナトリウムチャネル変異を抱える人物において抗癲癇効果を発揮することになるという結論を支持している。
【００４６】
本発明の一実施形態では、ラノラジンは前記薬物により発揮されるいくらか限られた程度の使用依存性遮断に基づいて活発な発作を中断させるのではなく、癲癇予防を予防する手段として投与される。ある程度のナトリウムチャネル使用依存性抑制は抗痙攣効果のためにおそらく重要であり、ラノラジンなどの永久電流に対して選択性のある薬物の治療効果は、これら２つの薬理作用の適正なバランスに依拠している可能性がある。したがって、本発明の別の実施形態は、高度に選択性の永久電流遮断剤とより慣用的な抗癲癇薬の同時投与を含む、ＣＮＳ障害を治療するための方法である。そのような方法は、それを必要とする患者に相乗効果を提供することになる。
【００４７】
有用性試験および投与
一般的有用性
本発明の方法は、癲癇および片頭痛を含むが、これらに限定されないＣＮＳ障害を治療するのに有用である。理論に縛られたくはないが、そのようなＣＮＳ障害を治療するラノラジンの能力は、脳における永久Ｎａｖ１．１および／またはＮａｖ１．２電流の抑制剤として作用するラノラジンの驚くべき能力の結果であると考えられている。
【００４８】
医薬組成物および投与
ラノラジンは通常、医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明は、活性成分としてラドラジンまたは薬学的に許容されるその塩もしくはエステル、ならびに、不活性固体希釈剤と充填剤を含む１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、無菌水溶液と様々な有機溶媒を含む希釈剤、可溶化剤およびアジュバントを含有する医薬組成物を提供する。ラノラジンは単独で、または他の治療薬と組み合わせて投与され得る。そのような組成物は医薬分野で周知の方法で調製される（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ １７ｔｈ Ｅｄ．（１９８５年）および「Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ． ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｇ．Ｓ． Ｂａｎｋｅｒ ＆ ＣＴ． Ｒｈｏｄｅｓ， Ｅｄｓ．参照）。
【００４９】
ラノラジンは、たとえば、直腸、頬側、鼻腔内と経皮経路、動脈内注射により、静脈内に、腹腔内に、非経口的に、筋肉内に、皮下に、経口的に、局所的に、吸入剤として、または、たとえば、ステントもしくは動脈挿入円筒形ポリマーなどの浸透性もしくは被膜デバイスを介するものを含む、参照により組み込まれている特許および特許出願に記載されている類似の有用性を有する薬剤の認められた投与様式のうちのいずれによっても、単回投与または複数回投与のどちらかで投与され得る。
【００５０】
適切な賦形剤のいくつかの例には、ラクトース、デキストロース、好くロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、減菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。前記製剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどの滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルなどの保存剤；甘味剤；ならびに香味剤をさらに含むことが可能である。
【００５１】
経口投与はラノラジンの投与のための好ましい経路である。投与は、カプセルもしくは腸溶コーティング錠などを介してであってよい。ラノラジンを含む医薬組成物を製造する際には、前記活性成分は通常、賦形剤により希釈されるおよび／またはカプセル、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、紙もしくは他の容器の形態であり得るような担体内に封入される。賦形剤が希釈剤として働く場合、賦形剤は固体、半流動性、または液状物質（上記）であることが可能であり、これらは活性成分のためのビヒクル、担体または媒体として作用する。したがって、前記組成物は、錠剤、丸薬、散剤、ロゼンジ剤、サシェ、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エアロゾル（固体としてもしくは液体媒体で）、たとえば、活性化合物を最大５０重量％含有する軟膏剤、軟質および硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射用溶液、および滅菌パッケージ化された粉末の形態であり得る。
【００５２】
ラノラジンは、当技術分野で公知の手順を用いることにより、患者への投与後、活性成分の急速、持続または遅延放出を提供するように処方することも可能である。経口投与のための制御放出薬物送達システムには、ポリマー被膜貯蔵器または薬物ポリマーマトリックス製剤を含有する浸透圧ポンプシステムおよび溶解システムが挙げられる。制御放出システムの例は、米国特許第３，８４５，７７０号、米国特許第４，３２６，５２５号、米国特許第４，９０２，５１４号、および米国特許第５，６１６，３４５号に与えられている。本発明の方法における使用のための別の製剤は、経皮送達デバイス（「パッチ」）を用いている。そのような経皮パッチを使用して、制御された量での本発明の化合物の連続または不連続注入を提供し得る。医薬品の送達のための経皮パッチの構築および使用は当技術分野では周知である。たとえば、米国特許第５，０２３，２５２号、米国特許第４，９９２，４４５号、および米国特許第５，００１，１３９号を参照されたい。そのようなパッチは、医薬品の連続性、拍動性またはオンデマンド送達のために構築され得る。
【００５３】
ラノラジンは広い用量範囲にわたり効果的であり、一般に薬学的有効量で投与される。典型的には、経口投与では、各用量単位は、１ｍｇ〜２ｇのラノラジン、より一般的には１〜７００ｍｇを、非経口投与では、１〜７００ｍｇのラノラジンを、より一般的には約２〜２００ｍｇを含有する。しかし、実際に投与されるラノラジンの量は、治療される状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物およびその相対活性、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度などを含む関連する状況を考慮して医者により決定されることになる。
【００５４】
錠剤などの固体組成物を調製するために、主要活性成分は医薬賦形剤と混合されて、本発明の化合物の均一混合物を含有する固形予備処方組成物を形成する。これらの予備処方組成物を均一と呼ぶ場合、組成物が錠剤、丸薬およびカプセルなどの等しく効果的な単位用量に容易に細分され得るように、活性成分が組成物全体に均等に分散していることを意味する。
【００５５】
本発明の錠剤または丸薬は、被膜されるか、または他の方法で配合されて、長期間の作用または胃の酸性条件から保護するという利点を与える剤形を提供し得る。たとえば、錠剤または丸薬は、内部投薬および外部投薬成分を含み、後者は前者をおおう包膜の形態であることが可能である。２つの成分は、胃における分解に抵抗する働きをし、内部成分を無傷のまま十二指腸まで通過させるか、または放出を遅延させる腸溶層により分離されることが可能である。種々の物質をそのような腸溶層または被膜のために使用し、そのような物質はいくつかのポリマー酸ならびにポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの物質の混合物を含むことが可能である。
【００５６】
投与のための１つの様式は、非経口、特に注射によるものである。ラノラジンが注射による投与のために組み込まれ得る形態には、ゴマ油、コーン油、綿実油、もしくはピーナッツ油を有する水性もしくは油性懸濁液または乳濁液の他にもエリキシル剤、マンニトール、デキストロースもしくは滅菌水溶液、および類似の医薬ビヒクルが挙げられる。生理食塩水溶液も注射のために従来、使用されているが、本発明の文脈ではそれほど好ましくはない。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど（およびその適切な混合物）、シクロデキストリン誘導体、ならびに植物油も用いられ得る。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどの被膜の使用により、分散剤の場合の必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することが可能である。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌薬、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことが可能である。
【００５７】
滅菌注射用液剤は、上に列挙される様々な他の成分と一緒に、本発明の化合物を適切な溶媒中に必要な量で取り込み、必要に応じて、続いて濾過および滅菌することにより調製される。一般に、分散剤は、様々な滅菌化された活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙される成分由来の必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに取り込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌粉末の場合は、好ましい調製法は、活性成分の粉末プラスその予め滅菌濾過された溶液由来の任意の追加の望ましい成分をもたらす真空乾燥および凍結乾燥法である。
【００５８】
ラノラジンの静注製剤は、以下の無菌充填工程を介して製造される。適切な器で、必要量のデキストロース一水和物を注射用水（ＷＦＩ）に約７８％の最終バッチ重量で溶解させる。絶えず攪拌しながら、必要量のラノラジン遊離塩基をデキストロース溶液に添加する。ラノラジンの溶解を促進するため、溶液ｐＨを０．１Ｎまたは１Ｎ塩酸水溶液を用いて３．８８〜３．９２の目標に調整する。さらに、０．１Ｎ ＨＣｌまたは１．０Ｎ ＮａＯＨを利用して、３．８８〜３．９２の目標ｐＨに溶液を最終調整してもよい。ラノラジンが溶解した後、バッチはＷＦＩを用いて最終重量に調整される。インプロセス仕様が満たされたと確認されると、ラノラジンバルク溶液は、２つの０．２μｍ滅菌濾過器を通した除菌により滅菌化される。それに続いて、滅菌ラノラジンバルク溶液は滅菌ガラスバイアルに無菌的に充填され、滅菌栓を用いて無菌的に栓をされる。次に、栓をされたバイアルは清潔な押し上げ式のアルミシールを用いて密封される。
【００５９】
前記組成物は好ましくは、単位剤形で処方される。用語「単位剤形」とは、単一用量としてヒト被験体および哺乳動物に適した物理的に個別の単位のことであり、各単位は、適切な医薬賦形剤（たとえば、錠剤、カプセル、アンプル）と共同して望ましい治療効果を生み出すように計算された所定量の活性物質を含有する。しかし、実際に投与されるラノラジンの量は、治療される状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物およびその相対活性、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度などを含む、関連する状況を考慮して医師により決定されることになると理解されるであろう。
【００６０】
一実施形態では、ラノラジンは、患者への投与後に活性成分の急速、持続または遅延放出、特に徐放製剤を提供するように処方される。そうではないと記述されなければ、明細書および実施例において使用されるラノラジン血漿中濃度とは、ラノラジン遊離塩基のことである。
【００６１】
本発明の好ましい徐放製剤は好ましくは、化合物ならびに胃における（典型的には約２）および腸における（典型的には約５．５）ｐＨの範囲にわたり水性媒体中での溶解速度を制御する部分的に中和されたｐＨ依存性結合剤の完全混和物を含む圧縮錠剤の形態である。徐放製剤の例は、米国特許第６，３０３，６０７号、米国特許第６，４７９，４９６号、米国特許第６，３６９，０６２号、および米国特許第６，５２５，０５７号に開示されており、その完全な開示はここに参照により組み込まれている。
【００６２】
併用療法
癲癇などのＣＮＳ障害の治療を受けている患者は、１つを超える治療薬を用いた治療により利益を得る場合が多い。よく使用されている抗痙攣薬には、カルバマゼピン、フェノバルビタール、フェニトインおよびバルプロ酸が挙げられる。他のよく使用されている抗癲癇薬には、ガバペンチン、ラモトリギン、トピラマート、エトスクシミド、クロナゼパムおよびアセタゾラミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
ラノラジンと治療的有効量の少なくとも１つの抗癲癇薬の同時投与により、患者が現在受けている看護治療の標準を高めることができる。したがって、本発明の一態様は、ＣＮＳ障害を治療するための方法であって、治療的有効量のラノラジンおよび治療的有効量の少なくとも１つの抗癲癇薬をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００６４】
併用療法の方法には、好ましくは、ラノラジンおよび１種または複数の治療薬がその治療影響を同時に発揮する期間が存在する、ラノラジンおよび１種または複数の治療薬を含有する単一製剤の同時投与、ラノラジンおよび１種または複数の治療薬を含む一つより多くの製剤の本質的に同時期の投与、ならびにいかなる順序であれラノラジンおよび治療薬または複数の治療薬の連続投与が挙げられる。好ましくは、ラノラジンは、本明細書に記載される経口投与量で投与される。
【００６５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下に続く実施例において開示される技法は、本発明の実施においてうまく機能することが本発明者により発見された技法を表しており、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられることを当業者であれば認識すべきである。しかし、当業者であれば、開示される特定の実施形態には多くの変更を加えることが可能であり、それでも本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることを、本開示を考慮して、認識すべきである。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
材料および方法
ヒトＮａｖ１．１ ｃＤＮＡの発現
すべての野生型（ＷＴ）および変異構築物は、以前我が研究所により研究されたことがあり（Ｋａｈｌｉｇ、２００８年；Ｌｏｓｓｉｎ、２００２年；Ｒｈｏｄｅｓ、２００４年）、ｃＤＮＡ発現は以前記載された通りに実施された（Ｋａｈｌｉｇ、２００８年）。手短に言えば、Ｎａｖ１．１の発現は、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬を使用して一過性トランスフェクションにより実現された（５．５μｇのＤＮＡは、ａ１：β１：β２について１０：１：１のプラスミド質量比でトランスフェクトされた）。ヒトβ１およびβ２ｃＤＮＡは、マーカー遺伝子ＤｓＲｅｄ（ＤｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ２−ｈβ１）またはＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ２−ｈβ２）を配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と共に含有するプラスミドにクローニングされた。そうではないと言及されなければ、すべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入されたものである。
【００６７】
電気生理学
以前記載された通りに（Ｋａｈｌｉｇ、２００８年）、ホールセル電圧クランプ記録法を使用してＷＴおよび変異Ｎａｖ１．１チャネルの生物物理学的特性を測定した。手短に言えば、ピペット溶液は、ｐＨ７．３５および容量オスモル濃度３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの１１０ＣｓＦ、１０ＮａＦ、２０ＣｓＣｌ、２ＥＧＴＡ、１０ＨＥＰＥＳ（ｍＭ）で構成された。バス（対照）溶液は、ｐＨ７．３５および容量オスモル濃度３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの１４５ＮａＣｌ、４ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、１０デキストロース、１０ＨＥＰＥＳ（ｍＭ）を含有していた。細胞は、電流を測定する前にホールセル配置が確立した後１０分間安定化させた。直列抵抗は、確実に電圧誤差＜２ｍＶでマイクロ秒以内にコマンド電位に到達するように９０％保証された。漏洩電流は、オンラインＰ／４手順を使用することにより減算され、全電流は、５ｋＨｚで低域Ｂｅｓｓｅｌフィルターされ、５０ｋＨｚでデジタル化された。明確にするために、代表的ランプ電流は、５０Ｈｚでオフラインにより低域フィルターされた。
【００６８】
反復刺激中のチャネル活性化、急速不活性化およびアベイラビリティを評価する特定の電圧クランププロトコールを、挿入図として描かれている通りに使用した。ホールセルコンダクタンスは、ＧＮａ＝ＩＮａ／（Ｖ−ＥＮａ）によりピーク電流振幅から計算され、−８０と＋２０ｍＶ間で最大コンダクタンスに正規化された。コンダクタンス−電圧および定常状態チャネルアベイラビリティ曲線は、最大半量活性化／不活性化（Ｖ１／２）および傾斜係数（ｋ）についての電圧を決定するためにボルツマン関数を用いてフィットさせた。不活性化への時間依存性進入および不活性化からの時間依存性回復は、ピーク電流回復を２つの指数関数、Ｉ／Ｉｍａｘ＝Ａｆ×［１−ｅｘｐ（−ｔ／τｆ）］＋Ａｓ×［１−ｅｘｐ（−ｔ／τｓ）］（τｆおよびτｓは時間定数（それぞれ、急速および緩徐成分）を意味し、ＡｆおよびＡｓは急速および緩徐分数振幅を表す）を用いてフィットさせることにより評価された。
【００６９】
使用依存性研究では、細胞は、−１２０ｍＶの保持電位から脱分極パルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス、１０Ｈｚ）を用いて刺激した。次に、電流は、各周波数列において第一パルスに応答して記録されたピーク電流に正規化された。持続遮断研究では、ピークおよび永久電流は、０．５μＭテトロドトキシン（ＴＴＸ）の存在および不在下で記録された電流のデジタルサブストラクションに続いて−１０ｍＶ（０．２Ｈｚ）までの２００ｍｓ脱分極に応答して評価された。永久電流は、２００ｍｓステップの最終１０ｍｓ中に計算された。データ解析は、Ｃｌａｍｐｆｉｔ９．２（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、Ｅｘｃｅｌ ２００２（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、およびＯｒｉｇｉｎＰｒｏ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）ソフトウェアを使用して実施された。結果は、平均±ＳＥＭとして示されている。そうではないと言及されなければ、ＷＴ−Ｎａｖ１．１に関連して、一元配置ＡＮＯＶＡに続いてチューキー事後検定を使用して統計的比較は行われた。
【００７０】
インビトロ薬理学
２０ｍＭラノラジン（Ｇｉｌｅａｄ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の保存液は０．１Ｍ ＨＣｌ中で調製された。バス溶液中のラノラジンの新鮮な希釈液は実験日ごとに調製され、そのｐＨは７．３５に再調整された。クランプされた細胞への灌流液の直接適用は、灌流ペンシル（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｐｅｎｃｉｌ）システム（Ａｕｔｏｍａｔｅ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を使用して実現された。直接細胞灌流は、２５０ミクロンチップを使用して、流速３５０μＬ／分で重力により推進された。このシステムは、クランプされた細胞を灌流の流れ内に隔離し、１秒以内の完全な溶液交換を可能にする。クランプされた細胞は、ホールセル配置を確立させた直後に開始して連続して灌流された。対照電流は、対照溶液灌流中に測定された。
【００７１】
ラノラジン含有溶液は、平衡（持続）薬物遮断を可能にするために電流記録に先立って３分間灌流された。ピークおよび永久電流の持続遮断は、この定常状態条件から測定された。３つの連続電流トレースは平均されて、記録条件ごとに（対照、ラノラジンおよびＴＴＸ）平均電流を得た。平均電流トレースは、オフライン減算および解析のために利用された。ピーク電流の使用依存性遮断は、−１２０ｍＶの保持電位からパルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス、１０Ｈｚ）のパルス数３００中に測定された。２つの連続パルス列刺激は平均されて、記録条件ごとに平均電流トレースを得、次に平均電流トレースはオフライン減算および解析のために使用された。ランプ電流の遮断は、３０秒ごとに刺激されて２０ｍＶ／秒の速度で−１２０ｍＶの保持電位から＋２０ｍＶまでの電圧ランプにより評価された。時間依存性電流ドリフトを最小限にするため、対照、ラノラジンまたはＴＴＸ灌流中に記録される１トレースのみが解析された。ＴＴＸは、ラノラジンの存在下で適用された。濃度抑制曲線は、ヒルの式：Ｉ／Ｉｍａｘ＝１／［１＋１０∧（ｌｏｇＩＣ５０−Ｉ）＊ｋ］（ＩＣ５０は、半抑制を生み出す濃度であり、ｋは斜面係数である）を用いてフィットされた。
【００７２】
インビボ薬理学
頸静脈にカニューレ処置されたオススプラーグドーリーラット（２５０〜３５０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）を使用して、インビボでのラノラジンの脳透過性を調べた。動物使用は、動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）、Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより承認された。群あたり３匹のラットが、８５．５μｇ／ｋｇ／分で生理食塩水中のラノラジンを静脈内に注入された。１、２．５または５時間後、動物は屠殺されて血漿および脳が採取され、ラノラジン濃度は、タンデム質量分析と連結させた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定された。脳組織は、１％２Ｎ ＨＣｌで酸性化された５％フッ化ナトリウム中でホモジネートされた（最終ホモジネートは３倍希釈された）。血漿および脳ホモジネート試料（５０μｌ）は、内部標準として重水素化Ｄ３−ラノラジンと一緒に沈殿され、ボルテックスされ遠心分離された。上清（５０μＬ）は移され、注射（１０μｌ）に先立って水（４５０μｌ）で希釈された。高速液体クロマトグラフィーは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＤ液体クロマトグラフおよび０．１％ギ酸（溶液Ａ）とアセトニトリル（溶液Ｂ）を含有する水からなる移動相を用いるＬｕｎａＣ１８（２）、３μｍ、２０×２．０ｍｍカラムを使用して実施され、均一濃度条件（７５％溶液Ａ、２５％溶液Ｂ；流速０．３００ｍｌ／分）下で実行された。質量分析は、陽イオンモードで作動する、ＭＲＭトランジション４２８．１＞９８のＡＰＩ３０００質量分光計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施された。脳対血漿ラノラジン比は、試料ごとにｎｇラノラジン／ｇ脳をｎｇラノラジン／ｍｌ血漿で割ることにより計算された。
【００７３】
結果
ラノラジンはＷＴ−Ｎａｖ１．１を阻害する能力を有することが現在実証されており、癲癇および片頭痛症候群ＧＥＦＳ＋、ＳＭＥＩおよびＦＨＭ３に関連するＮａｖ１．１変異チャネルのパネルはこれら変異チャネルが運ぶ永久電流の異常増加を優先的に遮断するラノラジンの能力を実証している。
【００７４】
ＷＴ−Ｎａｖ１．１活性化および不活性化に対するラノラジン効果
ｔｓＡ２０１細胞において異種性に発現されるＷＴ−Ｎａｖ１．１の活性化および不活性化特性を変えるラノラジンの能力が確定された。図１（Ａ）は、対照溶液（無薬物）においてＷＴ−Ｎａｖ１．１を発現している細胞および３０μＭラノラジンを有する灌流中の同一細胞から記録された代表的ホールセルナトリウム電流を図示している。薬物の適用は、この高濃度でもＷＴ−Ｎａｖ１．１機能に対して顕著な効果を及ぼさなかった。同様に、対照溶液および３０μＭラノラジンの逐次適用中に記録されたピーク電流密度に対して薬物の著しい効果はなかった（図１（Ｂ））。さらに、３０μＭラノラジンはＷＴ−Ｎａｖ１．１活性化または不活性化の電圧依存性を著しく変化させることはなかった（図１（Ｃ）、表１）。これらの結果により、ラノラジンは、チャネルの活性化とは干渉しないことが示された。しかし、３０μＭラノラジンは、不活性化状態の安定性が増加したことと一致して、不活性化からのわずかであるが有意な回復の遅滞を確かに引き起こした（図１（Ｄ）、表１）。これらの結果から、３０μＭラノラジンはＷＴ−Ｎａｖ１．１機能に対して最小の効果を及ぼすことが示されている。
【００７５】
【表１】
永久電流の優先的ラノラジン遮断
ＷＴ−Ｎａｖ１．１および唯一の明白な生物物理学的欠陥として永久電流の著しい増加を示すことを発明者らが以前実証したＧＥＦＳ＋（Ｌｏｓｓｉｎら、２００２年；Ｋａｈｌｉｇら、２００６年）に関連する変異Ｎａｖ１．１（Ｒ１６４８Ｈ）により運ばれるピークおよび永久電流の濃度依然性持続抑制を発明者らは調べた。図２（Ａ）は、対照溶液（黒トレース）に続いて３０μＭラノラジン（灰色トレース）の逐次適用中、ＷＴ−Ｎａｖ１．１から記録されたホールセルナトリウム電流を図示している。データが拡大時間スケールでプロットされている挿入図により図示されるように、ＷＴ−Ｎａｖ１．１ピーク電流の持続遮断は最小限であった。図２（Ｂ）では、Ｒ１６４８Ｈについての同じ実験順序を図示しているが、永久電流は、無薬物条件と比べてラノラジンの灌流中は実質的に減少した。ＷＴ−Ｎａｖ１．１について観察されたように、３０μＭラノラジンは、Ｒ１６４８Ｈピーク電流の最小持続遮断を発揮した（図２（Ｂ）挿入図）。
【００７６】
ＷＴ−Ｎａｖ１．１とＲ１６４８Ｈの両方でのピーク電流と比べた場合、ラノラジンは永久電流のより大きな程度の持続抑制を示した（それぞれ図２（Ｃ）および２（Ｄ））。ヒルの式を用いた濃度抑制曲線のフィットは、持続ピーク電流遮断についてＷＴ−Ｎａｖ１．１では８７１μＭの、Ｒ１６４８Ｈでは４９０μＭのＩＣ５０値を提供したが（表２）、ＷＴ−Ｎａｖ１．１およびＲ１６４８Ｈにより運ばれる永久電流のラノラジン遮断は、それぞれ５３．７μＭおよび３０．２μＭのＩＣ５０値を示した。これらの結果から、ラノラジンはＷＴ−Ｎａｖ１．１またはＲ１６４８Ｈのどちらかにより運ばれる永久電流の持続遮断に対して約１６倍の選択性を有することが実証される。
【００７７】
【表２】
発明者らは、ラノラジンによるＷＴ−Ｎａｖ１．１およびＲ１６４８Ｈの使用依存性遮断も評価した。図３Ａは、対照溶液灌流中の反復脱分極プロトコール（５ｍｓ、−１０ｍＶ、３００パルス、１０Ｈｚ）に応答したＷＴ−Ｎａｖ１．１から記録されたホールセルナトリウム電流を図示している。無薬物対照溶液では、ＷＴ−Ｎａｖ１．１のアベイラビリティは反復脱分極中は変化していない。これとは対照的に、同じ細胞へ３０μＭラノラジンを適用すると反復パルシング中ピーク電流の減少を引き起こし、チャネルの使用依存性遮断と一致していた（図３（Ｂ））。ＷＴ−Ｎａｖ１．１およびＲ１６４８Ｈのラノラジン使用依存性遮断の濃度依存性は、それぞれ１９５μＭおよび１３８μＭのＩＣ５０値により特徴付けられた（図３（Ｃ）および３（Ｄ）、表２）。これらの結果から、ラノラジンは、ピーク電流の使用依存性遮断と比べて、ＷＴ−Ｎａｖ１．１およびＲ１６４８Ｈにより運ばれる永久電流を抑制するのにそれぞれ３．６倍および４．６倍強力であることが実証された。
【００７８】
変異Ｎａｖ１．１チャネルのラノラジン遮断
発明者らは、３つの臨床症状：ＧＥＦＳ＋（Ｒ１６４８Ｈ、Ｔ８７５Ｍ）、ＳＭＥＩ（Ｒ１６４８Ｃ、Ｆ１６６１Ｓ）およびＦＨＭ３（Ｌ２６３Ｖ、Ｑ１４８９９Ｋ）を表す６つのＮａｖ１．１変異チャネル間でラノラジン遮断の程度を比較した。図４（Ａ）は、無薬物対照溶液において記録された電流振幅に正規化された変異チャネルのこのパネルについて３０μＭラノラジンによるピークおよび永久電流の持続遮断を図示している。すべての変異体では、ピーク電流と比べて永久電流のラノラジン遮断の程度のほうがはるかに大きいことを発明者らは観察した。変異チャネルにより示される永久電流の大きさをＷＴ−Ｎａｖ１．１により伝導されるレベルにまで減少させるラノラジンの能力も発明者らは評価した。図４（Ｂ）では、永久電流はピーク電流のパーセントとして表され、無薬物条件に正規化されなかった。一般に、変異チャネルにより運ばれる永久電流のレベルは約５０％減少された（範囲４４〜６０％）が、一部の変異体（Ｒ１６４８Ｈ、Ｔ８７５Ｍ、Ｌ２６３Ｖ）では、ラノラジンの存在下でのレベルは、薬物の不在下でのＷＴ−Ｎａｖ１．１チャネルと有意に違ってはいなかった。
【００７９】
発明者らは、ラノラジンによる変異Ｎａｖ１．１ピーク電流の使用依存性遮断も評価した。図４（Ｃ）は、ＷＴ−Ｎａｖ１．１および変異チャネルについての３０μＭラノラジンによるピーク電流の使用依存性遮断を図示している。ＷＴ−Ｎａｖ１．１もどの変異チャネルも３００ｔｈパルスによる対照溶液におけるチャネルアベイラビリティの著しい消失を示さなかったが、ＷＴ−Ｎａｖ１．１と変異チャネルの両方でラノラジン適用中チャネルアベイラビリティが著しく消失した。しかし、変異体のＲ１６４８Ｈ、Ｔ８７５ＭおよびＲ１６４８Ｃは、ＷＴ−Ｎａｖ１．１と比べて３０μＭラノラジンの存在下でチャンルアベイラビリティの著しく大きな減少を示した。
【００８０】
永久電流遮断の程度をピーク電流の使用依存性遮断の程度で割ることにより、変異Ｎａｖ１．１チャネルに対するラノラジンの効果を表す選択指数を発明者らは計算した。ラノラジンは、Ｌ２６３ＶおよびＦ１６６１Ｓチャネル上で永久電流のもっとも選択的な遮断を、Ｒ１６４８ＨおよびＲ１６４８Ｃチャネル上ではもっとも選択性の少ない遮断を示し、全体の順位序列はＬ２６３Ｖ＞Ｆ１６６１Ｓ＞Ｑ１４８９Ｋ＞Ｔ８７５Ｍ＞Ｒ１６４８Ｈ＝Ｒ１６４８Ｃであった。これらの関係は、増加した永久電流の選択的抑止をより受け入れられる可能性のあるＮａｖ１．１変異の分子サブセットを予想するのに役立ち得る。
【００８１】
ラノラジンの脳透過性
血液脳関門を通過するラノラジンの能力はこれまで報告されていない。１、２．５および５時間の薬物（８５．５μｇ／ｋｇ／分）の連続静脈内注入に続くラットにおけるラノラジンの脳透過性の程度を発明者らは測定した。ラノラジンは、すべての時点で著しい脳透過性を示し、５時間後に４７０ｎｇラノラジン／ｇ脳（約１．１μＭ、表３）でピークに達した。調べられた時間経過全体で、ラノラジンの平均脳レベルは、対応する血漿中レベルの約３分の１であった。ラノラジンの治療血漿中濃度が２〜１０μＭであることを考慮すると、最大３．３μＭの脳濃度がふさわしいはずである。
【００８２】
【表３】
治療ラノラジン濃度による永久電流の抑止
発明者らは次に、緩徐脱分極電圧ランプ、すなわち永久電流の増加に起因する現象中にＲ１６４８Ｈ活性化を抑止する、達成可能な脳濃度である３μＭラノラジンの能力を試験した。図５（Ａ）は、緩徐脱分極電圧ランプに応答して発生する代表的内向き電流を表示している。Ｒ１６４８Ｈ細胞は、３μＭラノラジン（薄い灰色トレース）により遮断される脱分極電流の増加（ＷＴと比べて；中間灰色対黒色トレース）を示した。平均内向き電荷（ｐＣ）は、チャネル発現の変化を説明するために、複数の細胞について−４０と０ｍＶ間の電流トレース下の面積として計算され、−１０ｍＶまでの電圧ステップにより発生する対応するピーク電流（ｎＡ）に正規化された。図５（Ｂ）は、対照溶液に続いて３μＭラノラジンの逐次灌流が、Ｒ１６４８Ｈにより伝導される電荷を薬物の不在下で記録されたＷＴチャネルを発現している細胞において観察されたレベルにまで減少させたことを実証している。
【００８３】
最後に、発明者らは、３μＭラノラジンによるＷＴおよび変異Ｎａｖ１．１の使用依存性遮断を評価した。図５（Ｃ）は、１０と１３５Ｈｚ間のパルシング周波数でのＷＴ−Ｎａｖ１．１およびＲ１６４８Ｈチャネルの使用依存性遮断を図示している。対照溶液では、ＷＴとＲ１６４８Ｈの両方が、チャネルアベイラビリティの予想される程度の周波数依存性消失を示したが、３μＭラノラジンを適用すると、２２Ｈｚよりも大きな周波数すべてにおいてアベイラビリティの消失を拡大した。これらの結果は３μＭラノラジンによる著しい使用依存性遮断と一致している。図５Ｄは、３μＭラノラジンが、１００ＨｚまでＷＴおよびＲ１６４８Ｈチャネルの類似する程度の遮断を生じたことを表示している。
【００８４】
（実施例２）
材料および方法
ヒトＮａｖ１．２ ｃＤＮＡの発現
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定的にトランスフェクトされた野生型（ＷＴ）ｃＤＮＡを使用して、Ｎａ＋電流を記録する。そうではないと言及されなければ、すべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入している。
【００８５】
電気生理学
ホールセル電圧クランプ記録を使用して、ＷＴの生物物理学的特性を測定する。手短に言えば、ピペット溶液は、ｐＨ７．３５および容量オスモル濃度３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの１１０ＣｓＦ、１０ＮａＦ、２０ＣｓＣｌ、２ＥＧＴＡ、１０ＨＥＰＥＳ（ｍＭ）からなる。バス（対照）溶液は、ｐＨ７．３５および容量オスモル濃度３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの１４５ＮａＣｌ、４ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、１０デキストロース、１０ＨＥＰＥＳ（ｍＭ）を含有する。細胞は、電流を測定する前にホールセル配置の確立後１０分間安定化させる。直列抵抗は、確実に電圧誤差＜２ｍＶでマイクロ秒以内にコマンド電位に到達するように９０％保証される。漏洩電流は、オンラインＰ／４手順を使用することにより減算され、全電流は、５ｋＨｚで低域Ｂｅｓｓｅｌフィルターされ、５０ｋＨｚでデジタル化される。
【００８６】
明確にするために、代表的ランプ電流は、５０Ｈｚでオフラインにより低域フィルターされる。反復刺激中のチャネル活性化、急速不活性化およびアベイラビリティを評価する特定の電圧クランププロトコールを使用する。結果は、平均±ＳＥＭとして表され、そうではないと言及されなければ、統計的比較は一元配置ＡＮＯＶＡを使用して行われる。
【００８７】
ピーク電流の持続遮断が測定される。平均電流トレースはオフライン減算および解析のために利用される。ピーク電流の使用依存性遮断は、−１２０ｍＶの保持電位から１０と１３５Ｈｚの間の周波数でパルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス）のパルス数３００中に測定される。２つの連続パルス列刺激は平均されて、記録条件ごとに平均電流トレースを得、次に平均電流トレースはオフライン減算および解析のために使用される。
【００８８】
反復刺激中のチャネル活性化、急速不活性化およびアベイラビリティを評価する特定の電圧クランププロトコールを使用する。ホールセルコンダクタンスは、ＧＮａ＝ＩＮａ／（Ｖ−ＥＮａ）によりピーク電流振幅から計算され、−８０と＋２０ｍＶ間の最大コンダクタンスに正規化される。コンダクタンス−電圧および定常状態チャネルアベイラビリティ曲線は、最大半量活性化／不活性化（Ｖ１／２）および傾斜係数（ｋ）の電圧を決定するためにボルツマン関数を用いてフィットさせる。不活性化への時間依存性進入および不活性化からの時間依存性回復は、ピーク電流回復を２つの指数関数、Ｉ／Ｉｍａｘ＝Ａｆ×［１−ｅｘｐ（−ｔ／τｆ）］＋Ａｓ×［１−ｅｘｐ（−ｔ／τｓ）］（τｆおよびτｓは時間定数（それぞれ、急速および緩徐成分）を意味し、ＡｆおよびＡｓは急速および緩徐分数振幅を表す）を用いてフィットさせることにより評価される。
【００８９】
使用依存性研究では、細胞は、−１２０ｍＶの保持電位から脱分極パルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス、１０Ｈｚ）を用いて刺激される。次に、電流は、各周波数列において第一パルスに応答して記録されたピーク電流に正規化される。持続遮断研究では、ピークおよび永久電流は、０．５μＭテトロドトキシン（ＴＴＸ）の存在および不在下で記録された電流のデジタルサブストラクションに続いて−１０ｍＶ（０．２Ｈｚ）までの２００ｍｓ脱分極に応答して評価される。永久電流は、２００ｍｓステップの最終１０ｍｓ中に計算される。データ解析は、Ｃｌａｍｐｆｉｔ９．２（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、Ｅｘｃｅｌ２００２（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、およびＯｒｉｇｉｎＰｒｏ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）ソフトウェアを使用して実施される。結果は、平均±ＳＥＭとして示されている。そうではないと言及されなければ、ＷＴ−Ｎａｖ１．２に関連して、一元配置ＡＮＯＶＡに続いてチューキー事後検定を使用して統計的比較は行われる。
【００９０】
インビトロ薬理学
２０ｍＭラノラジン（Ｇｉｌｅａｄ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の保存液は０．１Ｍ ＨＣｌ中で調製される。バス溶液中のラノラジンの新鮮な希釈液は実験日ごとに調製され、そのｐＨは７．３５に再調整される。クランプされた細胞への灌流液の直接適用は、灌流ペンシル（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｐｅｎｃｉｌ）システム（Ａｕｔｏｍａｔｅ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を使用して実現される。直接細胞灌流は、２５０ミクロンチップを使用して、流速３５０μＬ／分で重力により推進される。このシステムは、クランプされた細胞を灌流の流れ内に隔離し、１秒以内の完全な溶液交換を可能にする。クランプされた細胞は、ホールセル配置を確立させた直後に開始して連続して灌流される。対照電流は、対照溶液灌流中に測定される。
【００９１】
ラノラジン含有溶液は、平衡（持続）薬物遮断を可能にするために電流記録に先立って３分間灌流される。ピークおよび永久電流の持続遮断は、この定常状態条件から測定される。３つの連続電流トレースは平均されて、記録条件ごとに（対照、ラノラジンおよびＴＸＸ）平均電流を得る。平均電流トレースは、オフライン減算および解析のために利用される。ピーク電流の使用依存性遮断は、−１２０ｍＶの保持電位からパルス列（−１０ｍＶ、５ｍｓ、３００パルス、１０Ｈｚ）のパルス数３００中に測定される。２つの連続パルス列刺激は平均されて、記録条件ごとに平均電流トレースを得、次に平均電流トレースはオフライン減算および解析のために使用される。ランプ電流の遮断は、３０秒ごとに刺激されて２０ｍＶ／秒の速度で−１２０ｍＶの保持電位から＋２０ｍＶまでの電圧ランプにより評価される。時間依存性電流ドリフトを最小限にするため、対照、ラノラジンまたはＴＴＸ灌流中に記録される１トレースのみが解析される。ＴＴＸは、ラノラジンの存在下で適用される。濃度抑制曲線は、ヒルの式：Ｉ／Ｉｍａｘ＝１／［１＋１０∧（ｌｏｇＩＣ５０−Ｉ）＊ｋ］（ＩＣ５０は、半抑制を生み出す濃度であり、ｋは斜面係数である）を用いてフィットされる。
【００９２】
結果
したがって、ラノラジンはＷＴ−Ｎａｖ１．２を阻害する能力を有することが実証されており、このチャネルが運ぶ永久電流の異常増加を優先的に遮断するラノラジンの能力を実証している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系障害を治療するための方法であって、治療的有効量のラノラジンを中枢神経系障害の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記中枢神経系障害が片頭痛または癲癇である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中枢神経系障害がＳＣＮ１Ａ変異に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記中枢神経系障害が１つのＳＣＮ１Ａ変異に関連する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記中枢神経系障害が、熱性痙攣プラスを伴う全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）２型、乳児重症ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）、家族性片麻痺性片頭痛３型（ＦＨＭ３）、熱性痙攣プラスを伴う全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）１型からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ラノラジンが薬学的に許容される塩の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬学的に許容される塩が二塩酸塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ラノラジンが遊離塩基の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
中枢神経系障害を治療するための方法であって、治療的有効量のラノラジンおよび治療的有効量の少なくとも１つの抗癲癇薬を中枢神経系障害の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１０】
前記抗癲癇薬が、カルバマゼピン、フェノバルビタール、フェニトイン、バルプロ酸、ガバペンチン、ラモトリギン、トピラマート、エトスクシミド、クロナゼパムおよびアセタゾラミドからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラノラジンおよび前記抗癲癇薬が別々の剤形として投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ラノラジンおよび前記抗癲癇薬が単一剤形として投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラノラジンおよび前記抗癲癇薬が別々の剤形として投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ラノラジンおよび前記抗癲癇薬が単一剤形として投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
治療的有効量のラノラジン、治療的有効量の少なくとも１つの抗癲癇薬、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、医薬製剤。
【請求項１】
中枢神経系障害を治療するための方法であって、治療的有効量のラノラジンを中枢神経系障害の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記中枢神経系障害が片頭痛または癲癇である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中枢神経系障害がＳＣＮ１Ａ変異に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記中枢神経系障害が１つのＳＣＮ１Ａ変異に関連する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記中枢神経系障害が、熱性痙攣プラスを伴う全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）２型、乳児重症ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）、家族性片麻痺性片頭痛３型（ＦＨＭ３）、熱性痙攣プラスを伴う全般癲癇（ＧＥＦＳ＋）１型からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ラノラジンが薬学的に許容される塩の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬学的に許容される塩が二塩酸塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ラノラジンが遊離塩基の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
中枢神経系障害を治療するための方法であって、治療的有効量のラノラジンおよび治療的有効量の少なくとも１つの抗癲癇薬を中枢神経系障害の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１０】
前記抗癲癇薬が、カルバマゼピン、フェノバルビタール、フェニトイン、バルプロ酸、ガバペンチン、ラモトリギン、トピラマート、エトスクシミド、クロナゼパムおよびアセタゾラミドからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラノラジンおよび前記抗癲癇薬が別々の剤形として投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ラノラジンおよび前記抗癲癇薬が単一剤形として投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラノラジンおよび前記抗癲癇薬が別々の剤形として投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ラノラジンおよび前記抗癲癇薬が単一剤形として投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
治療的有効量のラノラジン、治療的有効量の少なくとも１つの抗癲癇薬、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、医薬製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５２６８４８（Ｐ２０１２−５２６８４８Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１０１９（Ｐ２０１２−５１１０１９）
【出願日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３４７７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３２６９６
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５０００２９４２０）ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド (141)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３４７７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３２６９６
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５０００２９４２０）ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド (141)
【Ｆターム（参考）】
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