ＥＧＦＲ抗体及びＳＲＣ阻害剤を用いる治療方法及び関連製剤
本発明は、ＥＧＦＲ及びｓｒｃを組み合わせてまたは同時に抑制または阻止することによるＥＧＦＲ媒介性疾患、特に癌の治療に関する。本発明は、１つ以上のＥＧＦＲモジュレーター及びｓｒｃ阻害剤を組み合わせて用いる癌、特にＥＧＦＲ媒介性疾患の治療、予防またはモジュレーションに関する。本発明は更に、抗ＥＧＦＲ抗体及びｓｒｃ阻害剤を用いる癌の治療に関する。抗体の抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ８０６をｓｒｃ阻害剤と組み合わせてまたは連続して用いる癌の治療方法及び組成物が記載されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲ媒介性疾患、特に癌の治療に関する。ＥＧＦＲモジュレーター（特に、ＥＧＦＲ抗体）及びｓｒｃ阻害剤の組合せを用いる癌の治療方法が提供される。ＭＡｂ８０６抗体及びｓｒｃ阻害剤の方法及び組合せが提供される。
【背景技術】
【０００２】
標的癌治療は、発癌及び腫瘍増殖に必要な特定分子の機能を破壊し、よって癌細胞を死滅させまたはその増殖を予防するように設計されている（Ｊｉ Ｈら（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，５（１８）：２０７２−２０７６，２００６年９月ｌ５日電子版）。従来の細胞毒性化学療法とは対照的に、標的癌治療はより有効であったり、正常細胞に対する害が少ないことがあり得る。標的癌治療分野における主な努力は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする物質の開発に向けられてきた。ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）やＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含めた密接に関連する受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲを活性化すると、受容体チロシンキナーゼが活性化され、細胞増殖、運動性、接着、侵入及び化学療法に対する耐性を媒介する一連の下流シグナル伝達事象、並びに癌細胞の連続的増殖及び生存にとって重要なプロセスであるアポトーシスの抑制が生じる。
【０００３】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異受容体の発現は腫瘍細胞に限られているので、抗体治療に対するかなり特異的な標的に相当する。従って、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのユニークペプチドに対して特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体が作成された。ユニークなｄｅ２−７ ペプチドを用いて免疫化後単離した一連のマウスｍＡｂはいずれも、ヌードマウスで増殖させた末端切断型受容体及び標的化ｄｅ２−７ ＥＧＦＲポジティブ移植移植片に対して選択性及び特異性を示した（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５５：３１４０−３１４８；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｓら（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７３：１３６６−１３７２；Ｈｉｌｌｓ Ｄら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６３：５３７−５４３；Ｒｅｉｓｔ ＣＪら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５７：１５１０−１５１５；Ｒｅｉｓｔ ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：４３７５−４３８２；米国特許第５，４０１，８２８号明細書）。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の例には、ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ）、ＤＨ８．３、Ｌ８Ａ．４及びＹ１０が含まれる。
【０００４】
ＭＡｂ８０６は、元々免疫原としてＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体を発現する全細胞を用いてユニークな末端切断型変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩを認識するように産生させた新規なマウス抗体である。重要なことは、ｍＡｂ８０６により認識されるエピトープは不活性野生型（ｗｔ）ＥＧＦＲでは接近できないが、ＥＧＦＲが過剰発現し、ＥＧＦＲｖＩＩＩが発現している細胞ではトランジション形態のｗｔ ＥＧＦＲで露出している。ＭＡｂ８０６はＥＧＦＲｖＩＩＩ／Δ２−７ ＥＧＦＲ変異体中に存在しているかまたは利用可能なエピトープに結合するが、変異の結合ペプチドＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨとは異なるエピトープを認識する。エピトープ研究は、８０６抗体が神経膠腫及び広範囲の上皮癌中に存在するエピトープに結合するが、正常なヒト組織には結合しないことを立証している免疫組織化学的研究により裏付けられている。これらのデータ及び他の前臨床データから、ｍＡｂ８０６はセツキマブや他の抗ＥＧＦＲ抗体とは異なる各種臨床活性スペクトル及び副作用プロフィールを有するであろうと示唆された。異種移植片モデルで、ｍＡｂ８０６は正常組織を標的とすることなく強力な抗腫瘍活性を発揮した。よって、ｍＡｂ８０６のユニークな標的能力は癌特異的分子標的治療に対する新しいモデルとなる。
【０００５】
非受容体タンパク質チロシンのＳｒｃは、増殖、分化、遊走、接着、侵入、血管形成及び免疫機能のような多くの細胞プロセスの調節において重要な役割を果たすＳｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒ、Ｂｌｋ及びＹｒｋを含めた９遺伝子ファミリーのメンバーである６０ｋＤａタンパク質である（Ｙｅａｔｍａｎ ＴＪ（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４（６）：４７０−８０；Ｆｒａｍｅ ＭＣ（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１７：９８９−９８）。Ｓｒｃファミリーキナーゼは余り保存されないドメイン及び３つの保存Ｓｒｃ相同ドメイン、すなわちＳＨ２、ＳＨ３及びＳＨ１、またはタンパク質チロシンキナーゼドメインを含んでいる。Ｓｒｃの調節には、Ｃ末端Ｓｒｃキナーゼ（Ｃｓｋ）によりリン酸化したときより不活性なＳｒｃコンホメーションを生ずるＣＯＯＨ末端チロシン（Ｙ５３０）が重要である。Ｓｒｃは、入力シグナルに応じて多くのタンパク質と相互作用する。更に、Ｙ５３０の脱リン酸化及びＹ４１８の自動リン酸化によるその活性コンホメーションを推測する。Ｓｒｃは構造及びシグナル伝達タンパク質にも関係し、生じた複合体は各種細胞プロセスにおけるＳｒｃの役割にとって重要である。Ｓｒｃは、大腸癌、乳癌、メラノーマ、卵巣癌、胃癌，頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、脳腫瘍及び血液癌のような多数の癌において過剰発現または異常に活性化されると報告されている（Ｄｅｈｍ ＳＭ ａｎｄ Ｂｏｎｈａｍ Ｋ（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００４；８２：２６３−７４）。いろいろなｓｒｃの小分子阻害剤が公知であり、幾つか、例えばダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＤ１６６３２６が臨床トライアルに入っている。
【０００６】
癌を含めたＥＧＦＲ媒介性疾患に対する改善された、より効率的で、より広く有効な治療プロトコルが臨床上必要とされている。
【０００７】
ここに挙げられている参考文献は本発明に対する従来技術であることを容認するものとは解釈されない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，４０１，８２８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｉ Ｈら（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，５（１８）：２０７２−２０７６，２００６年９月ｌ５日電子版
【非特許文献２】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５５：３１４０−３１４８
【非特許文献３】Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｓら（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７３：１３６６−１３７２
【非特許文献４】Ｈｉｌｌｓ Ｄら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６３：５３７−５４３
【非特許文献５】Ｒｅｉｓｔ ＣＪら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５７：１５１０−１５１５
【非特許文献６】Ｒｅｉｓｔ ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：４３７５−４３８２
【非特許文献７】Ｙｅａｔｍａｎ ＴＪ（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４（６）：４７０−８０
【非特許文献８】Ｆｒａｍｅ ＭＣ（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１７：９８９−９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ｓｒｃ発現または活性を変化させると抗ＥＧＦＲ治療の有効性が高まるという知見に関する。特に、ｓｒｃ発現または活性を変化させると抗ＥＧＦＲ抗体の有効性、特にｍＡｂ８０６抗体の活性が劇的に高まる。
【００１１】
本発明は、癌または他のＥＧＦＲ媒介性疾患を治療するためのＥＧＦＲ及びｓｒｃ阻害剤の組合せに関する。
【００１２】
本発明は更に、哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を組み合わせて、同時に、または順々に連続して投与することを含む前記哺乳動物におけるＥＧＦＲ媒介性癌の治療方法を提供する。１つの態様で、ｓｒｃ阻害剤はチロシンキナーゼ阻害剤である。１つの態様で、抗ＥＧＦＲ抗体はＭＡｂ８０６である。
【００１３】
方法の特定実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６抗体またはその活性フラグメントである。ＭＡｂ８０６には、マウス抗体、組換え抗体またはヒト化抗体が含まれる。
【００１４】
ＥＧＦＲ媒介性癌は、神経膠芽腫、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、神経系の癌、消化器癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、尿生殖器癌及び膀胱癌から選択され得る。癌は、更に結腸癌、乳癌、メラノーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍及び血液癌から選択され得る。特に、癌は神経膠腫であり得る。
【００１５】
本発明は、哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時に、組み合わせて、または順々に連続して投与することを含む前記哺乳動物における癌の治療方法を提供する。この方法の１態様では、抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である。この態様の特定実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである。
【００１６】
上記方法では、ｓｒｃ阻害剤は、ダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択され得る。この方法では、ｓｒｃ阻害剤は特にチロシンキナーゼ阻害剤である。上記方法の特定の実施形態では、ｓｒｃ阻害剤はダサチニブであり、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６である。
【００１７】
癌は、神経膠芽腫、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、神経系の癌、消化器癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、尿生殖器癌、膀胱癌、結腸癌、メラノーマ、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍及び血液癌から選択され得る。
【００１８】
本発明は、哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時に、組み合わせて、または順々に連続して投与することを含む前記哺乳動物におけるＥＧＦＲ媒介性癌の腫瘍増殖の阻止または縮小方法を提供する。この方法の特定実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である。抗ＥＧＦＲ抗体は特にｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである。
【００１９】
本発明は、哺乳動物に対して阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を投与することを含む前記哺乳動物におけるＥＧＦＲ媒介性癌の腫瘍増殖の阻止または縮小方法を提供し、前記ｓｒｃ阻害剤はダサチニブであり、前記抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６である。
【００２０】
ＥＧＦＲ媒介性癌は、神経膠芽腫、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、神経系の癌、消化器癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、尿生殖器癌及び膀胱癌から選択され得る。
【００２１】
本発明は更に、哺乳動物に対して抗ＥＧＦＲ抗体及びｓｒｃ阻害剤の組合せを投与することを含む前記哺乳動物における抗ＥＧＦＲ抗体の有効性または活性の増強方法を提供する。ｓｒｃ阻害剤は、ダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択され得る。抗ＥＧＦＲ抗体は特に、腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である。この態様の特定実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６である。
【００２２】
本発明は更に、医薬的に許容され得る担体または希釈剤中に抗ＥＧＦＲ抗体及び１つ以上のｓｒｃ阻害剤を含む医薬組成物に関する。この組成物には、抗ＥＧＦＲ抗体が腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である組成物が含まれる。この組成物の特定実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６である。
【００２３】
他の目的及び作用効果は、図面を参照してなされる以下の記載の検討から当業者には自明である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＥＧＦＲの概略図。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲにおいて欠失している細胞外領域は丸括弧で同定されている。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのデッドキナーゼバージョンは７２１位に単一点突然変異（Ｋ→Ｍ）を含んでいる。ｄｅ２−７ ＥＧＦのＤＹ２バージョンは残基１０６８及び１１７３にＹ→Ｆ突然変異を有しており、ＤＹ５バージョンはこれらの置換を９９２、１０８６及び１１４８にも有している。
【図２Ａ】各種異種移植片のＥＧＦＲ特異的抗体に対する感受性。ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に３×１０６個の細胞を注入することにより異種移植片を樹立させた。異種移植片が約１００ｍｍ３の平均容積に達したら抗体治療を開始した。マウスを１ｍｇのｍＡｂ５２８（左パネル）またはｍＡｂ８０６（右パネル）を用いて週３回、２週間（すなわち、全部で６回注射）治療した。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図２Ｂ】各種異種移植片のＥＧＦＲ特異的抗体に対する感受性。ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に３×１０６個の細胞を注入することにより異種移植片を樹立させた。異種移植片が約１００ｍｍ３の平均容積に達したら抗体治療を開始した。マウスを１ｍｇのｍＡｂ５２８（左パネル）またはｍＡｂ８０６（右パネル）を用いて週３回、２週間（すなわち、全部で６回注射）治療した。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図３】Ｕ８７Ｍをベースとする細胞株の異種移植片増殖曲線。増殖曲線を作成するために、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に１×１０６個の細胞を注入することにより異種移植片を樹立させた。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図４】Ａ及びＢは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ及びＵ８７ＭＧ．ＤＹ５細胞におけるｄｅ２−７ ＥＧＦＲ変異体のインビトロリン酸化。Ａ：ｄｅ２−７ ＥＧＦＲタンパク質をｍＡｂ８０６、ｍＡｂ５２８、または無関係なアイソタイプマッチド対照抗体を用いて免疫沈降させ、生じたサンプルをイムノブロッティングした。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ変異体はすべてユビキチン化及び分解に関連する主要部位であるＹ１０４５でのリン酸化に対してポジティブであった（上部パネル）。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲはＹ１１７３位で構成的にリン酸化されたのに対して、ＤＫ及びＤＹ５変異体は両方とも予想されたようにこの部位でのリン酸化に対してネガティブであった（中央パネル）。ＥＧＦＲの存在をＥＧＦＲに対する家兎ｃ末端ポリクローナル抗体を用いて確認した（下部パネル）。このｃ末端抗体はＹ１０６８Ｆ突然変異を含んでいるためにＤＹ５変異体を認識しなかった。このことから、抗体結合のための重要な残基であることが分かる。よって、全ＤＹ５タンパク質の存在がｍＡｂ８０６を用いてイムノブロッティングすることにより（Ｂ）で確認された。
【図５】高レベルのｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ細胞。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞を低（Ｌ）、中（Ｍ）及び高（Ｈ）発現集団にＦＡＣＳ分類した。Ａ：細胞を３６時間血清飢餓させた後溶解し、ｄｅ２−７発現（Ｃ１３）及びｄｅ２−７ ＥＧＦＲのチロシンリン酸化（４Ｇ１０）についてイムノブロッティングにより分析した。リン酸化レベルはｄｅ２−７ ＥＧＦＲと相関していた。Ｂ：増殖曲線を作成するために、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に１×１０６個の細胞を注入することにより親Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ−Ｌ、Ｕ８７ＭＧ−Ｍ及びＵ８７ＭＧ−Ｈ異種移植片を樹立させた。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。Ｃ：（Ｂ）からの腫瘍をｄｅ２−７ ＥＧＦＲ（Ｃ１３）の発現についてイムノブロッティングにより分析した。Ｄ：Ｕ８７ＭＧ−Ｈ異種移植片を有するマウスを１ｍｇのｍＡｂ５２８またはｍＡｂ８０６を用いて週２回、３週間（４、６、８、１１、１３及び１５日目に）治療した。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図６】Ａ〜Ｃは、ＮＲ６．Δ２−７異種移植片のＥＧＦＲ特異的抗体を用いる治療。ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に３×１０６個の細胞を注入することにより異種移植片を樹立させた。異種移植片の平均容積が約１００ｍｍ３に達したら抗体治療を開始した。マウスを１ｍｇのｍＡｂ８０６（Ａ）またはｍＡｂ５２８（Ｂ）を用いて週３回、２週間（２２、２５、２９、３２、３６及び３９日目に）、またはｍＡｂ５２８（Ｃ）を用いて週２回、３週間（２７、３０、３４、３７、４１及び４４日目に）治療した。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図７】Ａ〜Ｃは、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲとＳｒｃの相互作用。（Ａ）細胞を一晩血清飢餓させた後、１０μＭ ＰＰ１またはＰＰ２、或いはビヒクル（ＤＭＳＯ）を用いて３０分間または２４時間治療し、次いでｍＡｂ５２８、ｍＡｂ８０６、または無関係のアイソタイプ対照を用いて免疫沈降させた。イムノブロッティングをＥＧＦＲのＹ８４５に対して特異的な抗体を用いて実施し、全ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを家兎ｃ末端ポリクローナル抗体を用いて可視化した。示した結果は４つの独立した実験の代表例である。（Ｂ）増殖曲線を作成するために、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に１×１０６個の細胞を注入することによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７ベクター対照及びＵ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ異種移植片を樹立させた。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。（Ｃ）ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に３×１０６個の細胞を注入することによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ異種移植片を樹立させた。異種移植片の平均容積が約１００ｍｍ３に達したら抗体治療を開始した。マウスを１ｍｇのｍＡｂ８０６を用いて週３回、２週間（１８、２０、２２、２５、２７及び２９日目に）治療した。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図８】Ａ及びＢは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞における内部移行したｍＡｂ８０６−Ｃｙ３とＥＥＡｌまたはｌｇｐ−１２０の共局在。（Ａ）カバーグラス上に接種した細胞をｍＡｂ８０６−Ｃｙ３（赤色）と４℃（０分）でプレインキュベートした。３７℃で１０、２０及び３０分間インキュベートすることにより内部移行を刺激した。細胞を固定し、透過化処理した後、抗ＥＥＡ１及びＣｙ２コンジュゲートしたロバ抗マウス抗体を用いて順次染色した（緑色）。共局在は合併像に黄色で示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）細胞にＧＦＰを標識したｌｇｐ−１２０（ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰ；緑色）を一時的にトランスフェクトした。ポジティブにトランスフェクトされた細胞をｌｇｐ−１２０−ＧＦＰパネルに緑色アローヘッドにより示す。トランスフェクトした後、細胞を４℃でｍＡｂ８０６−ｃｙ３とインキュベートした（赤色；０分）後、３７℃で３０、６０及び１２０分間インキュベートすることにより内部移行を誘導した。その後、サンプルを固定し、ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３とｌｇｐ−１２０−ＧＦＰの共局在を合併像（白色矢）において黄色の存在により示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図９】Ａ〜Ｆは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞においてｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合させた後のクラスリン媒介エンドサイトーシス及びｍＡｂ８０６の細胞内輸送の電子顕微鏡分析。金粒子（ｍＡｂ８０６−Ａｕ；アローヘッド）は、５分間の内部移行の誘導後クラスリン被覆ピット（Ａ−Ｂ）及び小胞（Ｃ）において容易に検出された。小窩に似た構造中には金粒子は存在していなかった（白抜きアローヘッド）（Ｄ）。１０〜１５分間内部移行後、金粒子が初期エンドソームに似た管状小胞構造において検出された（Ｅ）。長時間内部移行させた後、金粒子は多胞体において見られた（Ｆ）。スケールバー＝１０μｍ。
【図１０】ＮＲ６．Δ２−７細胞におけるｍＡｂ８０６及びｍＡｂ５２８の内部移行。細胞を４℃（０分）でｍＡｂ８０６−Ｃｙ３（左パネル）またはｍＡｂ５２８−Ｃｙ３（右パネル）とプレインキュベートした後、内部移行を誘導するために３７℃で異なる時間インキュベートした。３７℃での１５、３０及び６０分間のインキュベーションを表す像を示す。内部移行前の両抗体での染色は細胞間の膜接合（青色アローヘッド）及びフォーカルアドヒージョン（赤色アローヘッド）に関連しているが、幾つかの細胞は殆ど膜染色を示さなかった（黄色アローヘッド）。後に内部移行した抗体を白色矢印で示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図１１】ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ変異体と他の細胞成分の相互作用の概略図。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲは活性キナーゼを有しており、よって自動リン酸化、トランスリン酸化し得、または他のキナーゼによるリン酸化の標的であり得る。対照的に、デッドキナーゼｄｅ２−７ ＥＧＦＲはリン酸化の標的にすぎない。最後に、ＤＹ５構築物はリン酸化の標的であり得、ｗｔ ＥＧＦＲのような他の細胞標的をトランスリン酸化し得る。ｍＡｂ５２８及び８０６の両方はＵ８７ＭＧ．ＤＹ５異種移植片を抑制するが、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片を抑制し得ないと仮定すると、これらの抗体が他の細胞成分のリン酸化を予防する能力が抗腫瘍活性にとって重要であると示唆される。
【図１２】Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ｓｒｃ異種移植片のｍＡｂ８０６及びダサチニブの単独または組合せでの治療。ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に１×１０６個の細胞を注入することによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７ｓｒｃ異種移植片を樹立させた。異種移植片の平均容積が約８０ｍｍ３に達したら治療を開始した。マウスはビヒクル（ｄＨ２Ｏ中４％ ＤＭＳＯ）、ＰＢＳ中１ｍｇのｍＡｂ８０６、ｄＨ２Ｏ中４％ ＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｋｇ−１のダサチニブ、または両方の組合せを用いて週３回、指定した日にちで２週間治療した。データを平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。３３日目に、組合せ治療群はｍＡｂ８０６単独で治療した群に比して有意に小さかった（ｐ＜０．００７６）。
【図１３】Ｕ８７ＭＧΔ２−７ｓｒｃ異種移植片のｍＡｂ８０６及びダサチニブの単独または組合せでの治療。上記実験からのデータをカプラン−マイヤ−生存曲線に変換し、瀕死の、すなわち＞１５００ｍｍ３の腫瘍容積のデュアルエンドポイントを用いるウィルコクソン分析により分析した。組合せ群は他の群よりも長く生存した。ログランクｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明によれば、当業界の技術の範囲内の一般的な分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術が使用され得る。これらの技術は文献に詳しく説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）］；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（１９９４））］；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）］；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照されたい。
【００２６】
従って、本明細書中に現れたなら、以下の用語は下記する定義を有している。
【００２７】
用語「抗体」は、天然で産生されるか或いは部分的または完全に合成されるかにかかわらず免疫グロブリンを指す。抗体には、抗体及びそのフラグメントを含めた特異的エピトープを結合する免疫グロブリンが含まれる。この用語はポリクローナル、モノクローナル、組換え、ヒト化及びキメラ抗体を包含する。この用語は、抗体結合ドメインであるかまたは抗体結合ドメインと相同である結合ドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質をも包含する。ＣＤＲグラフト化抗体もこの用語に包含される。
【００２８】
抗体は多数の方法で修飾され得るように、用語「抗体」は、所要の特異性を有する結合ドメインを有する特異的結合メンバーまたは物質を包含すると解釈されるべきである。よって、この用語は、天然で産生されるか或いは部分的または完全に合成されるかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含むポリペプチドを含めて抗体の抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能均等物及びホモログを包含する。従って、別のポリペプチドに融合している免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子または均等物が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は欧州特許出願公開第０１２０６９４号明細書及び同第０１２５０２３号、並びに米国特許第４，８１６，３９７号明細書及び同第４，８１６，５６７号明細書に記載されている。
【００２９】
完全抗体のフラグメントが結合抗原の機能を発揮し得ることが判明した。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨｌドメインから構成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨｌドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインから構成されるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂフラグメントからなる二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが会合して抗原結合部位が形成され得るように２つのドメインがリンカーにより連結されている単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；（ｖｉｉｉ）多価抗体フラグメント（ｓｃＦｖダイマー、トリマー及び／またはテトラマー（Ｐｏｗｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４２：１９３−２０４ ９（２０００））；（ｉｘ）二重特異性単鎖Ｆｖダイマー（国際特許出願第ＵＳ９２／０９９６５号明細書）；及び（ｘ）遺伝子融合物により構築される多価または多重特異性フラグメントである“二重特異性抗体”（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３））である。
【００３０】
「抗体結合部位」は、特異的に抗原を結合する軽鎖または重鎖の可変及び超可変領域からなる抗体分子の構造部分である。
【００３１】
本明細書中で使用されているいろいろな文法的で形のフレーズ「抗体分子」は、インタクトな免疫グロブリン及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を意味する。
【００３２】
抗体分子の例は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、及び本明細書に記載されている治療方法で使用するのに好ましいパラトープを含む免疫グロブリン分子の部分であり、これらの部分にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）として当業界で公知の部分が含まれる。
【００３３】
抗体は、その抗体の１つの結合ドメインが本発明の特異的結合ドメインであり、他の結合ドメインが例えばエフェクター機能等を補強するような別の特異性を有している二重特異性であってもよい。本発明の二重特異性抗体には、その抗体の１つの結合ドメインが本発明の特異的結合ドメインまたはそのフラグメントであり、他の結合ドメインが別個の抗体またはそのフラグメントであるものが含まれ、前記した別個の抗体には抗ＥＧＦＲ抗体、例えば抗体５２８（米国特許第４，９４３，５３３号明細書）、キメラ及びヒト化２２５抗体（米国特許第４，９４３，５３３号明細書及び国際公開第９６４０２１０号パンフレット）、抗ｄｅ２−７抗体、例えばＤＨ８．３（Ｈｉｌｌｓ，Ｄ．ら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６３（４）：５３７−５４３）、抗体Ｌ８Ａ４及びＹ１０（Ｒｅｉｓｔ，ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（１９）：４３７５−４３８２；Ｆｏｕｌｏｎ ＣＦら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０（１６）：４４５３−４４６０），ＩＣＲ６２（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ Ｈら（１９９３）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｊａｎ−Ｊｕｎ；２２（１−３）：１２９−４６；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら（２００２）Ｐ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｒ．，５５（１４）：３１４０−３１４８）、またはＷｉｋｓｔｒａｎｄらの抗体（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ Ｃ．ら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（１４）：３１４０−３１４８）が含まれる。他の結合ドメインは中性または膠細胞特異的抗体の場合のように特定細胞型を認識するまたは標的とする抗体であり得る。本発明の二重特異性抗体では、本発明の抗体の１つの結合ドメインは、特定の細胞受容体を認識する及び／または細胞を特定の様式でモジュレートする他の結合ドメインまたは分子、例えば免疫モジュレーター（例えば、インターロイキン、成長モジュレーターまたはサイトカイン（例：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、具体的には全文を本明細書中に組み入れる２００２年２月１３日出願の米国特許出願第６０／３５５，８３８号明細書に示されているＴＮＦ二重特異性モダリティー）、毒素（例えば、リシン）、または抗−有糸分裂またはアポトーシス物質または因子と組み合わされ得る。
【００３４】
抗体分子のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２部分は、公知の方法により実質的にインタクトな抗体分子に対してパパイン及びペプシンをタンパク質分解反応することにより生成され得る。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓらの米国特許第４，３４２，５６６号明細書を参照されたい。Ｆａｂ’抗体分子部分も公知であり、Ｆ（ａｂ’）２部分から２つの重鎖部分を連結するジスルフィド結合をメルカプトエタノールを用いて還元し、生じたタンパク質メルカプタンを試薬（例えば、ヨードアセトアミド）を用いてアルキル化することにより生成される。本発明では、インタクトな抗体を含む抗体が好ましい。
【００３５】
いろいろな文法の形のフレーズ「モノクローナル抗体」は、特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合部位の化学種を１つしか有していない抗体を指す。よって、モノクローナル抗体は典型的には免疫反応する抗原に対して単一の結合アフィニティーを示す。モノクローナル抗体は、各々が別々の抗原に対して免疫特異性である抗体結合部位を複数有する抗体分子、例えば二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体をも含み得る。
【００３６】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部または全部に対して特異的に結合し、相補的である領域を含む抗体の一部を指す。抗原が大きい場合には、抗体はエピトープと称される抗原の特定部分のみにしか結合し得ない。抗原結合ドメインは１つ以上の抗体可変ドメインにより与えられ得る。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）からなる。
【００３７】
用語「ｍＡｂ８０６」、「８０６抗体」、「モノクローナル抗体８０６」、「ｃｈ８０６」、「ヒト化８０６」及び具体的にリストされていない変異体は本明細書中で互換可能に使用されており、明細書及び請求の範囲を通じて使用されているとき を指す。従って、組換え、キメラ、遺伝子組換えまたは代替抗体を含めて実質的に均等なまたは改変した活性を示す抗体も考えられる。これらの修飾は例えば部位特異的突然変異により得られる修飾のような故意であっても、抗体またはそのフラグメントの産生株である宿主での突然変異により得られるような偶然であってもよい。同様に、用語「ｍＡｂ８０６」、「８０６抗体」、「モノクローナル抗体８０６」、「ｃｈ８０６」、「ヒト化８０６」はその範囲に本明細書中に具体的に記載されている、当業者に公知である、公表されているタンパク質及び免疫グロブリン、並びにすべての実質的に相同のアナログ及びアレリック変異体を含むと意図される。その世代を含めたｍＡｂ８０６抗体、特定活性、アミノ酸及び核酸配列、抗原結合ドメイン、可変領域配列は国際公開第０２／０９２７７１号明細書；Ｌｕｗｏｒ ＲＢら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６１：５３５５−５３６１；Ｍｉｓｈｉｍａ Ｋら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６１：５３４９−５３５４；Ｊｏｈｎｓ ＴＧら（２００２）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９８：３９８−４０８；Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ ＡＡら（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１００（２）：６３９−６４４に開示されており、当業者に公知である。各文献の全部は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３８】
公表されており、当業者に公知のｍＡｂ８０６抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ抗体、その抗原結合ドメインまたはその活性フラグメントをコードするが、公知のｍＡｂ８０６配列に縮重される有効な抗ＥＧＦＲ抗体、特にｍＡｂ８０６及びｃｈ８０６を含めた有効な抗ＥＧＦＲ抗体をコード化及び／または発現するＤＮＡ配列が本発明の方法で使用するための組成物の範囲内に入ると考えられるべきである。「縮重」とは、具体的アミノ酸を特定するために異なる３文字コドンが使用されることを意味する。
【００３９】
フレーズ「ｓｒｃ阻害剤」は、ｓｒｃの発現または活性を低下させる、特にＥＧＦＲ上のｓｒｃリン酸化部位のリン酸化を低下させる、またはｓｒｃキナーゼカスケードのシグナルを減少させるモジュレーターを意図し、含まれる。モジュレーターには化合物、ペプチド、抗体、または他の物質等が含まれ得る。モジュレーターにはキナーゼ阻害剤、ホスファターゼ等が含まれ得る。
【００４０】
数個のｓｒｃの小分子阻害剤が公知であり、幾つか、例えばダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］− ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＤ１６６３２６が臨床トライアルに入っている。
【００４１】
フレーズ「医薬的に許容され得る」は、生理的に許容され得、ヒトに投与したとき典型的にはアレルギーまたは類似の不適当な反応（例えば、胃の不調、めまい等）を生じない分子及び組成物を指す。
【００４２】
フレーズ「治療有効量」は、標的細胞塊のＳ相活性の臨床上有意な変化、或いは標的細胞塊または腫瘍のサイズまたは寸法の有意な変化、または存在及び活性を伴うことがあるような他の病理学的特徴を予防する、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましく少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％減少させるのに十分な量を意味するように本明細書中で使用されている。
【００４３】
抗体または活性フラグメントは、中和された医薬的に許容され得る塩の形態として治療用組成物中に配合され得る。医薬的に許容され得る塩には、（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基を用いて形成される）酸付加塩、及び無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等）を用いて形成される酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基から形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等）からも誘導され得る。
【００４４】
治療用抗体または活性フラグメントを含有する組成物は例えば単位用量を注射するように従来通り静脈内に投与される。本発明の治療用組成物を言及して使用されるとき、用語「単位用量」は、ヒトに対する１回用量として適した物理的にバラバラの単位を指し、各単位は所望の治療効果が生ずるように計算された所定量の活性物質を必要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと一緒に含んでいる。
【００４５】
組成物は用量及び製剤に適合する方法で治療有効量投与される。投与量は治療対象の被験者、その被験者の免疫系の活性成分を利用する能力、及び標的とされる腫瘍塊の所望の抑制度または程度に依存する。投与するのに必要な活性成分の正確な量は担当医の判断に依存し、各個人に固有である。しかしながら、適当な用量は約０．１〜２０ｍｇ、好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ、より好ましくは１〜数ｍｇ−活性成分／ｋｇ−個人の体重／日の範囲であり得、投与ルートに依存する。初期投与及び追加投与のための適当なレジメも変更可能であるが、典型的には初期投与後、１時間以上の間隔で注射または他の投与により繰り返し投与する。或いは、血液中に１０ナノモル〜１０マイクロモルの濃度を維持するのに十分な連続静脈注射も考えられる。
【００４６】
本明細書中で使用されている「ｐｇ」はピコグラムを意味する。「ｎｇ」はナノグラムを意味する。「ｕｇ」または「μｇ」はマイクログラムを意味する。「ｍｇ」はミリグラムを意味する。「ｕｌ」または「μｌ」はマイクロリッターを意味する。「ｍｌ」はミリリッターを意味する。「ｌ」はリッターを意味する。
【００４７】
よって、抗ＥＧＦＲ抗体、特にｍＡｂ８０６の抗腫瘍活性を立証することにより治療及び診断用途並びに方法が提供され、発案された。以前に示唆され、本明細書で更に詳記されているように、本発明は、キナーゼドメイン突然変異、一次的及び二次的耐性突然変異を含めたＥＧＦＲ突然変異に関連する腫瘍形成能をモジュレートするためにＥＧＦＲが関与する反応及びシグナル伝達のカスケードにおける医薬的介入を考えている。
【００４８】
本発明は更に、哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を投与することを含む前記哺乳動物におけるＥＧＦＲ媒介性癌の治療方法を提供する。１つの態様では、ｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時に投与する。１つの態様では、一般的な化学療法の前またはその後にｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時にまたは順次繰り返し投与する。
【００４９】
本発明の方法において抗ＥＧＦＲ抗体、特にｍＡｂ８０６は単独で投与しても、他の抗ＥＧＦＲ抗体と一緒に投与してもよい。ＭＡｂ８０６をセツキマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ）、ＤＨ８．３、Ｌ８Ａ４を含めた他の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体及び／またはその活性フラグメンと連続してまたは一緒に投与してもよい。本発明の方法において、ｓｒｃ阻害剤は単独で投与しても、１つ以上の抗ＥＧＦＲ抗体と一緒に投与してもよく、場合によっては１つ以上のｓｒｃ阻害剤を投与してもよい。
【００５０】
抗ＥＧＦＲ抗体は適当な担体と一緒に、患者に対していろいろな手段により投与するために有効な濃度で医薬組成物中に配合され得る。各種の投与技術が利用され得、その中には皮下、静脈内及び腹腔内注射、カテーテル法等のような非経口技術が含まれる。抗体またはその活性フラグメントの量は変更可能であり、本明細書中に記載されている結果及びデータの考慮を含めて資格のある医師または獣医師の推奨及び処方に基づいていなければならない。
【００５１】
ｓｒｃ阻害剤は適当な担体と一緒に、患者に対していろいろな手段により投与するために有効な濃度で医薬組成物中に配合され得る。各種の投与技術が利用され得、その中には皮下、筋肉内、静脈内及び腹腔内注射、カテーテル法等のような非経口技術及び／または経口投与または経皮投与もしくは適用が含まれる。ｓｒｃ阻害剤の量は変更可能であり、特に本明細書中に記載されている結果及びデータの考慮を含めて資格のある医師または獣医師の推奨及び処方に基づいていなければならない。１つ以上の抗ＥＧＦＲ抗体及び１つ以上のｓｒｃ阻害剤の組合せである医薬組成物を投与に適するように製造してもよい。
【００５２】
本発明の抗体は、検出可能なまたは機能的な標識を用いて標識され得る。検出可能な標識には、同位元素３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃ及び８６Ｒｅのような放射標識が含まれるが、これらに限定されない。これらの放射標識は抗体イメージングの分野で公知の一般的な化学を用いて本発明の抗体に結合され得る。標識には蛍光標識及びＭＲＩ−ＣＴイメージングのために当業界で慣用されている標識が含まれる。これらにはホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素標識も含まれる。標識には更に、特異的同族の検出可能部分に結合することにより検出され得るビオチンのような化学物質（例えば、標識アビジン）が含まれる。
【００５３】
機能的標識には、腫瘍部位を破壊させるべく腫瘍の部位を標的とするように設計されている物質が含まれる。機能的標識には、細胞毒性剤（例えば、５−フルオロウラシルまたはリシン）及び酵素（例えば、細菌性カルボキシペプチダーゼまたはニトロレダクターゼ）が含まれ、これらは腫瘍部位でブロドラッグを活性薬物に変換させることができる。
【００５４】
放射標識した抗ＥＧＦＲ抗体及びそのフラグメントはインビトロ診断技術、インビボ放射イメージング技術及び放射免疫治療において有用である。インビボイメージングの場合、本発明の特異的結合メンバーは放射性同位元素よりもイメージング剤にコンジュゲートされ得る。イメージング剤の中には、例えば抗体分子にキレート基を介して多数の常磁性イオンが充填されている磁性共鳴イメージング増強剤が含まれるが、これに限定されない。キレート基の例には、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル及びポリオキシムが含まれる。常磁性イオンの例には、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユウロピウム、ランタン、ホルミウム及びフェルビウムが含まれる。本発明の更なる態様では、放射標識した特異的結合メンバー、特に抗体及びフラグメント、とりわけラジオイムノコンジュゲートは放射免疫治療において、特に癌治療のための放射標識した抗体として使用される。更なる態様では、放射標識した特異的結合メンバー、特に抗体及びそのフラグメントは放射性免疫誘導手術技術において使用され、癌細胞、前癌細胞、腫瘍細胞及び過剰増殖性細胞を除去するための手術前、その間またはその後に前記細胞の存在及び／または位置を同定し、示し得る。
【００５５】
本発明の特異的結合メンバー、特に抗体及びそのフラグメントが他の分子または物質にコンジュゲートまたは結合されている本発明のイムノコンジュゲートまたは抗体融合タンパク質には、更に化学的アブレーション剤、毒素、イムノモジュレーター、サイトカイン、細胞毒性物質、化学療法剤または薬物にコンジュゲートされている結合メンバーが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
放射免疫療法（ＲＡＩＴ）は、各種の抗体イムノコンジュゲートを用いて臨床段階に入っており、有効性が立証されている。１３１Ｉ標識されているヒト化抗癌胎児性抗原（抗ＣＥＡ）抗体ｈＭＮ−１４は大腸癌で評価されており（Ｂｅｈｒ ＴＭら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ，９４（４Ｓｕｐｐｌ）：１３７３−８１）、９０Ｙで標識した同一抗体は甲状腺髄様癌で評価されている（Ｓｔｅｉｎ Ｒら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ，９４（１）：５１−６１）。モノクローナル抗体を用いる放射免疫療法は非ホジキンリンパ腫瘍及び膵臓癌に対して評価され、報告されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ＤＭ（２００１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ，３９（ｌ−２）：１９５−２０１；Ｇｏｌｄ ＤＶら（２００１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ，３９（１−２），１４７−５４）。特定の抗体を用いる放射免疫療法も米国特許第６，３０６，３９３号明細書及び同第６，３３１，１７５号明細書に記載されている。放射性免疫誘導手術（ＲＩＧＳ）も臨床段階に入っており、効果及び有用性が立証されており、例えば抗ＣＥＡ抗体及び腫瘍関連抗原に対する抗体が使用されている（Ｋｉｍ ＪＣら（２００２）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９７（４）：５４２−７；Ｓｃｈｎｅｅｂａｕｍ Ｓら（２００１）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ，２５（１２）：１４９５−８；Ａｖｉｔａｌ Ｓら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ，８９（８）：１６９２−８；ＭｃＩｎｔｏｓｈ ＤＧら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ，１２（４）：２８７−９４）。
【００５７】
本発明の抗体は、治療を要する患者に対して適当なルートを介して、通常血流またはＣＳＦに、または直接腫瘍部位に注入することにより投与され得る。正確な量は、抗体が診断用か治療用であるか、腫瘍の大きさ及び場所、抗体の正確な種類（全抗体、フラグメント、二重特異性抗体等かどうか）、抗体に結合させる検出可能なまたは機能性標識の種類を含めた複数の要因に依存する。治療のために放射性核種を使用する場合には、適当な１回用量は最大約４５ｍＣｉ／ｍ２〜最大約２５０ｍＣｉ／ｍ２である。好ましい用量は１５〜４０ｍＣｉの範囲である。更に好ましい用量範囲は２０〜３０ｍＣｉまたは１０〜３０ｍＣｉである。前記治療は骨髄または幹細胞置換を必要とすることがある。腫瘍イメージングまたは腫瘍治療のために典型的な抗体用量は０．５〜４０ｍｇ、好ましくは１〜４ｍｇのＦ（ａｂ’）２形態の抗体の範囲である。１回投与あたり２０〜１０００ｍｇタンパク質、２０〜５００ｍｇのタンパク質、または２０〜１００ｍｇのタンパク質の用量で裸の抗体を投与することが好ましい。これは、成人患者に対する１回治療あたりの用量であり、幼児及び小児に対しては比例して調節され得、他の抗体フォーマットの場合には分子量に比例しても調節され得る。医師の裁量で治療を毎日、１週間に２回、毎週または毎月の間隔で繰り返してもよい。ｓｒｃ阻害剤の用量及び投与は医師または他の当業者により決定され、変更され得る。
【００５８】
本発明は以下の非限定的実施例を参照することにより更に理解されるであろう。これらの実施例は本発明の例示として与えられている。以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を更に十分に説明するために提示されており、決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【実施例１】
【００５９】
ＥＧＦＲ特異的抗体の有効性はＳＲＣを不活化及び抑制すると高まる
ＥＧＦＲに対する治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の有効性に影響を及ぼす要因は余り知られていないままであり、特に神経膠腫ではそうである。２つのＥＧＦＲ特異的ｍＡｂ（ｍＡｂ８０６及び５２８）の有効性をＥＧＦＲ変異体を発現するＵ８７ＭＧ由来神経膠腫異種移植片に対して調べた。このアプローチを使用すると、遺伝的背景を一定に維持しながらＥＧＦＲの形態を変化させることができた。これらの変異体には、神経膠腫で発現されるＥＧＦＲの構成的に活性な突然変異であるｄｅ２−７ ＥＧＦＲ（または、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）が含まれる。
【００６０】
ｍＡｂの有効性はＥＧＦＲ数に相関していたが、最も重要な要因は受容体活性化であった。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ異種移植片は治療に応答したが、デッドキナーゼｄｅ２−７ ＥＧＦＲを示すＵ８７ＭＧ異種移植片は難治性であった。キナーゼ活性であったが、自動リン酸化欠乏であった修飾ｄｅ２−７ ＥＧＦＲも応答した。このことから、これらのｍＡｂはトランスリン酸化を阻止することによりｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現異種移植片において機能することが示唆された。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現Ｕ８７ＭＧ異種移植片はｗｔ ＥＧＦＲを共発現するので、ｍＡｂの有効性を単離状態でｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現したＮＲ６異種移植片に対しても試験した。ｍＡｂ８０６はＮＲ６異種移植片に対して抗腫瘍活性を示したが、ｍＡｂ５２８治療は有効でなかった。このことから、ｍＡｂ５２８はｄｅ２−７とｗｔ ＥＧＦＲの相互作用を壊すことによりその抗腫瘍活性を媒介することが示唆された。
【００６１】
最後に、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ異種移植片におけるＳｒｃの遺伝子破壊はｍＡｂ８０６の有効性を劇的に高めた。神経膠腫におけるＥＧＦＲ特異的抗体の効果的使用は活性化ＥＧＦＲを有する腫瘍の同定に依存している。ＥＧＦＲとＳｒｃ阻害剤の組合せは神経膠腫の治療に対して新しく有効な戦略を提供する。
【００６２】
背景
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は固有のチロシンキナーゼ活性を有する貫膜糖タンパク質である。ＥＧＦＲの過剰発現は多くの上皮腫瘍で観察され、しばしば悪い臨床予後に関連している（１〜３）。ＥＧＦＲの過剰発現はＥＧＦＲ遺伝子増幅、特に神経膠腫でのＥＧＦＲ遺伝子増幅により生じ得る（４）。神経膠腫では、遺伝子増幅は、コード配列のエキソン２〜７の範囲の８０１塩基対のインフレーム欠失を特徴とするｄｅ２−７ ＥＧＦＲ（またはＥＧＦＲｖＩＩＩ）の最も一般的な突然変異を有するＥＧＦＲ転位に関連している（４〜６）。この転位により、細胞外ドメインから２６７アミノ酸が欠失し、融合部位に新しいグリシンが挿入され、合わせてユニークな接合ペプチドが生ずる。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲは公知のリガンドに結合できないが、受容体は低レベルの構成的活性化を示し、神経膠腫及び乳癌異種移植片の増殖を高めることができる（７、８）。
【００６３】
ＥＧＦＲを抑制することは、新しい癌治療を開発するための合理的な戦略である。考えられる治療には、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、Ｃ２２５、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ ５５９００）（９〜１１）及びＥＧＦＲの低分子量チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）（例えば、ＺＤ１８３９、ＯＳＩ ７７４）（１２）が含まれる。実際、これらの治療薬の幾つかは肺癌（ＺＤｌ ８３９、イレッサ）及び結腸癌（Ｃ２２５、エルビタックス）の限定的な臨床的使用に対して容認されている。これらの臨床トライアルから、ＥＧＦＲに対してポジティブなすべての患者がこれらの標的治療に応答するとは限らないことがきわめて明白である（表１）。患者をＥＧＦＲ治療に対して感受性とする要因を決定することが患者の福祉及び経済の点から重要な目標である。また、ＥＧＦＲ治療に対する耐性の種類を理解すると、前記耐性を解消するためのアプローチを同定する助けとなり得る。
【００６４】
【表１】
【００６５】
ＥＧＦＲ標的ＴＫＩに対して耐性／感受性を引き起こすメカニズムは広く研究されてきたが、抗ＥＧＦＲ抗体の有効性に影響を及ぼす要因は余り知られていないままである（表１参照）。ＴＫＩに関する研究から幾つかの一般論が引き出され得る。第一に、ＴＫＩによる阻害に対する細胞株の感受性は増えている細胞表面ＥＧＦＲと相関しており（表１）、このことから阻害在を機能させるにはＥＧＦＲ発現の若干の固有レベルが必要であることが示唆される。第二に、ＥＧＦＲ不活化後ＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ経路によりシグナル伝達を持続させる能力によりＴＫＩの有効性が低下する（表１）。これらの研究の大多数はインビトロで実施されており、これらの知見がインビボ設定でも当てはまるかどうかは分からない。最近、多数の研究でイレッサ（ＺＤ１８３９）で治療した肺癌患者におけるＥＧＦＲ遺伝子の状態を分析しており、治療に応答した患者は多くの場合キナーゼドメインにおける機能突然変異の増加を有していたことを知見した（表１）。更に、イレッサ耐性を導く二次キナーゼ突然変異も記載されている（表１）。しかしながら、最初の研究から、これらの知見が一般的でなく、肺患者で見られた突然変異は他の腫瘍型では観察されないと示唆される。
【００６６】
抗ＥＧＦＲ抗体を用いた限定数の研究から、該抗体に対する感受性に関する一般論を引き出すことは難しい（表１）。インビボ研究がないことに加えて、感受性研究の多くが細胞パネルを用いてなされており、そのため細胞株の間のシグナル伝達経路の変化及び他のＥｒｂＢファミリーメンバーの存在または不在を仮定すると、ＥＧＦＲ感受性または耐性に関連する単一要因を同定することが困難となる。これらの問題の幾つかを解決するために、我々は中程度レベルの野生型（ｗｔ）ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞株の２つのＥＧＦＲ特異的抗体に対するインビボ感受性を試験した。その後、我々は、受容体の数及び活性化が抗体治療に対する感受性に対してどのような影響を有するかを調べるためにＵ８７ＭＧ細胞に各種のｗｔ及びｄｅ２−７ ＥＧＦＲ構築物をトランスフェクトさせた。
【００６７】
本研究で使用した２つの抗体はｍＡｂ８０６及び５２８であった。ＭＡｂ８０６は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞に対して産生させた新規な抗ＥＧＦＲ特異的抗体である（１３）。興味深いことに、ｍＡｂ８０６は明らかにｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合するが、受容体を過剰発現する細胞の表面で発現するｗｔ ＥＧＦＲの部分集合にも結合する（１３）。最近の分析から、ｍＡｂ８０６エピトープは受容体が不活性状態から活性状態に移動すると一時的に存在するＥＧＦＲのコンホメーション形態においてのみ露出していることが判明した（１４）。ｗｔ ＥＧＦＲとは異なり、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲは構成的にこの移行コンホメーション状態にあり、よってｍＡｂ８０６結合のために利用され得る。我々の以前の研究から、ｄｅ２−７を発現するかまたはｗｔ ＥＧＦＲを過剰発現する異種移植片をｍＡｂ８０６で治療すると腫瘍増殖が有意に抑制されることが判明している（１５〜１７）。５２８抗体はＣ２２５抗体（エルビタックス）のマウスバージョンと同時に産生、単離され、非常に類似した特性を示している（１８）。ＭＡｂ５２８はリガンドアンタゴニストとして作用し、異種移植片として増殖させたときインビトロ及びインビボの両方でＥＧＦＲ発現細胞の増殖を抑制する（１８）。
【００６８】
材料及び方法
（細胞株及びモノクローナル抗体）
Ｕ８７ＭＧトランスフェクト細胞株Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔ、Ｕ８７ＭＧ．ＤＹ５及びＵ８７ＭＧ．ＤＹ２は他のところにも詳細に記載されている（１６、１９）。Ａ４３１細胞株も既に記載されている（２０）。すべての細胞株をＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；ニューヨーク州グランド・アイランドに所在のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、または１０％ ＦＣＳ（豪州ビクトリア州メルボルンに所在のＣＳＬ）、２ｍＭ グルタミン（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ニューヨーク州グランド・アイランドに所在のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含有しているＲＰＭＩにおいて維持した。加えて、トランスフェクト細胞株を４００ｍｇ／ｍｌのジェネテシン（豪州ビクトリア州メルボルンに所在のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において維持した。
【００６９】
ｍＡｂ８０６及び５２８をＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（豪州メルボルンに所在のＬｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）において作製し、精製した。ＥＧＦＲの特異的チロシンリン酸化部位に対する抗体及び家兎ポリクローナル抗ＥＧＦＲ抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州ダンバースに所在）から入手した。Ｓｒｃは、マウスモノクローナル抗体ｖ−Ｓｒｃ ３２７（米国カリフォルニア州に所在のＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）またはｃ−Ｓｒｃ Ｈ−１２（米国カリフォルニア州に所在のＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を用いて検出した。ホスホ−Ｓｒｃを検出するためには家兎ポリクローナル抗体ＰＹ４１８（米国カリフォルニア州に所在のＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を使用した。抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０はＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ニューヨーク州レイク・プラシッドに所在）から購入した。野生型及び末端切断型ＥＧＦＲの両方を検出するために使用されるＣ１３はＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（カリフォルニア州サンジェゴに所在）から入手した。
【００７０】
（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ細胞株の作製）
ドミナントネガティブな（ＤＮ）キナーゼデッドＳｒｃ構築物（Ｋ２９６Ｒ／Ｙ５２８Ｆ）はＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国ニューヨーク州レイク・プラシッドに所在）から入出した。ＤＮＳｒｃを含有するＨｉｎｄ ＩＩＩ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州カールズバッド所在）から入手したｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターにサブクローン化し、生じた構築物をエレクトロポレーションによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞にトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏベクターのみをトランスフェクトした第二細胞株も作製した。細胞を１ｍｌアリコートで９６ウェルプレートにおいて約２×１０４細胞／ウェルの密度でプレートアウトし、３７℃で４８時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（独国マンハイムに所在のＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加した。クローンが得られたら（約２週間後）、細胞を４００μｇ／ｍｌのジェネテシン及びハイグロマイシン中に戻した。
【００７１】
まず、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲの発現が保持されているかを確認するために、トランスフェクト細胞をＦＡＣＳ分析によりスクリーニングした。次いで、クローンを全細胞溶解または免疫沈降にかけた後、Ｓｒｃ特異的抗体（ｖ−Ｓｒｃ ３２７、ｃ−Ｓｒｃ Ｈ−１２）を用いるウェスタンブロッティングにかけた。全Ｓｒｃレベル（Ｓｒｃレベルは元の細胞株では非常に低い）の劇的な上昇を示す数個のクローンを同定し、増大させた。更に、３５Ｓ標識細胞ライゼートをｖ−Ｓｒｃ ３２７抗体を用いて免疫沈降させ、生じた沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び定量オートラジオグラフィーにかけることにより、高いＳｒｃレベルを確認した。最高レベルのＤＮＳｒｃを発現したクローンを選択し、ＤＮＳｒｃはＹ４１８位でリン酸化されていることが判明した。これは正しく折りたたまれていることを示唆している。
【００７２】
（インビトロ増殖アッセイ）
ｍＡｂ８０６及び５２８のインビトロでの抗増殖作用を既に詳記されているように調べた（１８）。簡単に説明すると、細胞を２４ウェルプレートにおいて１×１０４細胞／ウェルで０．５％ ＦＣＳを含有する培地に接種した。４日後、細胞をトリプシンを用いて除去し、血球計算器を用いてカウントした。抗体を、異種移植片内で得られたものと一致する濃度である１００μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。
【００７３】
（異種移植片モデル）
１００μｌのＰＢＳ中の腫瘍細胞（３×１０６個）を４〜６週齢の雌ヌードマウス（豪州パースに所在のＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）の両脇腹に皮下接種した。すべての研究を既報（１５、１６）されているように樹立腫瘍モデルを用いて実施した。腫瘍の平均容積が約１００ｍｍ３に達したら治療を開始した。腫瘍容積（ｍｍ３）は、式（長さ×幅２）／２（ここで、長さは最長の軸であり、幅はその軸に直角な測定値である）を用いて測定した。データは、各治療群について平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。すべてのデータをスチューデントｔ検定により有意さについて分析する。各研究において、１群あたり最低１０個の異種移植片を使用した。
【００７４】
（イムノブロッティング）
細胞を冷溶解バッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＦ、１％ トリトンＸ−１００、２００μＭ ＮａＯ３Ｖ、０．４％ Ｈ２Ｏ、及び５００μＭ ＡＥＢＳＦ，１５０ｎＭ アプロチニン，１μＭ Ｅ−６４プロテアーゼ阻害剤，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び１μＭ ロイペプチンを含有するプロテアーゼ阻害剤カクテル組１（ｐＨ７．４，カリフォルニア州サンジェゴに所在のＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中に溶解させた。ライゼートをｍＡｂ８０６または５２８を用いて免疫沈降させ、生じた沈降物を我々が詳細に記載しているように（２１）イムノブロッティングにより分析した。
【００７５】
（免疫蛍光顕微鏡検査）
ＭＡｂ８０６及び５２８を直接Ｃｙ３モノクローナル抗体標識キット（英国バッキンガムジャーに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ Ｌｔｄ）を用いて製造業者の使用説明書に従ってシアニン３（Ｃｙ３）染料を用いて標識した。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞への結合をフローサイトメトリー分析することにより抗体の標識が成功したかを調べた。初期エンドソーム特異的抗マウス初期エンドソーム自己抗原１（ＥＥＡｌ）モノクローナル抗体はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国カリフォルニア州サンジェゴに所在）から購入した。Ｃｙ２コンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントロバ抗マウスＩｇＧ二次抗体及び非標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂフラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ阻止抗体はＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国ペンシルバニア州ウェスト・グローブに所在）から購入した。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７またはＮＲ６．Δ２−７細胞を１２ｍｍカバーガラスまたは１２ｍｍ Ｂｉｏｃｏａｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓポリ−Ｄ−リシンカバーガラス（米国マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｌａｂｗａｒｅ）上で１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びグルタメートを補充したＭＥＭ（米国ニューヨーク州グランド・アイランドに所在のＧｉｂｃｏＢＲＬ）において３７℃で増殖させた。細胞に対する抗体結合を０．２５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（米国ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の存在下で実施した。Ｃｙ３−コンジュゲートしたｍＡｂ８０６及び５２８はそれぞれ５μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの濃度で使用し、表面標識は湿潤条件下４℃で２０分間実施した。細胞を氷冷０．２５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳで３回洗浄した。個々のカバーガラスを３７℃でインキュベートすることにより表面結合抗体の内部移行を開始させた。異なる時間内部移行させた後、個々のカバーガラスを３７℃で外し、内部移行を停止させるために氷冷ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄し、４％ ＰＦＡを用いて室温で２０分間固定した。次いで、カバーガラスをＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、再蒸留水（ＤＤＷ）で洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ封入培地（米国アラバマ州バーミンガムに所在のＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてガラススライド上に載せた。サンプルを適切な波長設定で共焦点顕微鏡（日本国神奈川県に所在のニコンインステック社）を用いて分析した。共局在研究のために、細胞を０．１％ トリトンＸ−１００を用いて１分間透明化処理した。次いで、サンプルを洗浄し、すべての存在しているマウス結合部位（すなわち、内部移行したｍＡｂ８０６または５２８）をブロックするために非標識ヤギ抗マウスＦａｂフラグメントと室温で２０分間インキュベートした。次いで、サンプルをＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、抗ＥＥＡ１と室温で２０分間インキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、Ｃｙ２コンジュゲートした二次ロバ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントとインキュベートした。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−標識したリソソーム糖タンパク質１２０（ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰ）に対するＤＮＡベクターは米国コネチカット州ニュー・ヘイブンに所在のエール医科大学細胞生物学部のＩｒａ Ｍｅｌｌｍａ教授らから善意で提供された。細胞を、包埋１４ｍｍカバーガラスを含むｍａｔ−ｔｅｋガラス底マイクロウェル皿（米国マサチューセッツ州アッシュランドに所在のＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐ．）において増殖させ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（豪州ビクトリア州マルグレイヴに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商品名）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の使用説明書に従って使用して一晩トランスフェクトさせた。トランスフェクトしてから２４時間後に、４８８ｎｍの波長光で励起したとき緑色蛍光を発するポジティブにトランスフェクトされた細胞の共焦点像を撮影した。
【００７６】
結果
（インビトロ及びインビボ感受性の相関関係）
表１に記載されている研究の多くはインビトロで実施されている。ｍＡｂ及びＴＫＩ標的ＥＧＦＲ治療の両方を用いた我々の経験から、インビトロ感受性及びインビボ応答が確実には相関しないことが明らかに立証されている。実際、我々は最近インビトロでＥＧＦＲ特異的ＴＫＩ ＡＧ １４７８に対して類似の感受性を示す２つの細胞株が同一物質に対するインビボ応答の点で顕著な差があった例を発表した（２２）。Ｃ２２５について既報されている標準のインビトロ増殖抑制アッセイ及び異種移植片部位で得られる抗体濃度と一致する抗体濃度を用いて、我々はインビトロ及びインビボ抗腫瘍活性の抗体抑制の間に殆ど相関性がないことを知見した（表２）。ｍＡｂ５２も８０６もインビトロでＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞の増殖を抑制しなかったが、これらの抗体は免疫エフェクター機能と非依存性であったインビボでロバストな抗腫瘍活性を示す（図２参照）。また、たとえ１つのＥＧＦＲ標的抗体が特定細胞株においてインビトロ及びインビボで相関関係を示したとしても（例えば、Ａ４３１細胞及び異種移植片でのｍＡｂ５２８、表２）、これは別のＥＧＦＲ特異的抗体が同一細胞株において相関していることを必ずしも暗示しなかった（例えば、Ａ４３１細胞及び異種移植片におけるｍＡｂ８０６、表２）。この簡単な分析と我々の以前の所見から、ＥＧＦＲ治療に対する感受性を調べる際のインビトロアッセイの限界が明らかとなった。
【００７７】
【表２】
【００７８】
（各種形態のＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ神経膠腫異種移植片の抗体治療）
中レベルのｗｔ ＥＧＦＲを発現する親Ｕ８７ＭＧ細胞、或いは追加のｗｔ ＥＧＦＲ、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲまたはｄｅ２−７ ＥＧＦＲの各種修飾形態（図１）をトランスフェクトした同一細胞をヌードマウスに皮下注入し、腫瘍異種移植片として樹立させた。異種移植片が約１００ｍｍ３に達したら抗体治療を開始した。すべての腫瘍を１ｍｇのｍＡｂ５２８または８０６を用いて週３回、２週間治療した。この抗体治療の用量及びスケジュールは、我々の標準Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片モデルで強い抗腫瘍応答を引き出すように選択したが、さほど効率的でなく、ＥＧＦＲの各種変異体を含む他のＵ８７ＭＧ由来細胞株で見られる高い抗腫瘍活性を弱めるであろう。以下に詳細に検討するように、ｍＡｂ８０６及び５２８の抗腫瘍効果はすべてのＵ８７ＭＧ由来神経膠腫異種移植片において類似であった（図２）。
【００７９】
１．親細胞（Ｕ８７ＭＧ）：
中レベルでＥＧＦＲを発現する（〜５×１０４受容体／細胞）という事実があるにもかかわらず（１３）、いずれの抗体もＵ８７ＭＧ異種移植片の増殖を抑制しなかった。
【００８０】
２．ｗｔ ＥＧＦＲを過剰発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．ｗｔ）：
発現を増加させるために（約１×１０６受容体／細胞）Ｕ８７ＭＧ細胞にｗｔ ＥＧＦＲをトランスフェクトしても、異種移植片のインビボ増殖速度は変化しなかったが（図３Ａ）、腫瘍は両抗体に対して感受性となった。このことはｍＡｂ８０６がｗｔ ＥＧＦＲを過剰発現する細胞に優先的に結合するのでこの抗体では驚くことではないが、ｍＡｂ５２８ではやや予期せぬことであった。なぜならば、表現型の不在下で受容体の数が増加しても抗体治療に対する応答が誘発され得ると示唆されるからである。対照群を犠牲にした３１日目では、ベヒクル群における異種移植片の平均腫瘍容積が９５０ｍｍ３であったのに比してｍＡｂ５２８治療群では４５０ｍｍ３であったようにｍＡｂ５２８により誘発される抑制は有意であった（ｐ＜０．０１）。３９日目でのｍＡｂ実験の分析から、腫瘍容積がＰＢＳ群及びｍＡｂ８０６群のそれぞれで９６０ｍｍ３及び４７０ｍｍ３であったように抗体治療が異種移植片の増殖を有意に（ｐ＜０．００１）抑制したことが判明した。
【００８１】
３．ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７）：
構成的に活性であるがリガンド非依存性であるｄｅ２−７ ＥＧＦＲをトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ異種移植片の増殖も両抗体により抑制された（図２）。ｗｔ ＥＧＦＲの過剰発現とは異なり、内因性ｗｔ ＥＧＦＲの存在下でｄｅ２−７ ＥＧＦＲを過剰発現させるとＵ８７ＭＧ異種移植片に対する有意な増殖有利性が生じる（図３Ｂ）。この受容体の構成的リン酸化をイムノブロッティングにより確認した（図４）。接種後２０日目のビヒクル群の平均腫瘍容積が１１７０ｍｍ３であったのに比してｍＡｂ５２８群の平均腫瘍容積が５１０ｍｍ３であったように、ｍＡｂ５２８で治療すると腫瘍増殖が有意に（ｐ＜０．００５）抑制された。ｍＡｂ５２８の主要機能がリガンド拮抗であると推測されたと仮定すると、リガンド非依存性ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する異種移植片に対するその腫瘍活性は予期せぬことであった。よって、ｍＡｂ５２８は多分リガンドをブロックする能力とは異なる他のメカニズムによりＥＧＦＲシグナル伝達を破壊するであろう。また、これらの細胞においてｄｅ２−７ ＥＧＦＲを結合するがｗｔ ＥＧＦＲを結合しないｍＡｂ８０６は、異種移植片を発現するｄｅ２−７ ＥＧＦＲの増殖をｍＡｂ５２８と類似レベルまで抑制したようにリガンド相互作用に対する作用とは無関係に抗腫瘍活性を媒介しなければならない。ビヒクル群を抜粋した２１日目では、対照異種移植片は１５００ｍｍ３の平均腫瘍容積を有していたのに比較してｍＡｂ８０６治療群は３９０ｍｍ２であり、有意に（ｐ＜０．０００１）低かった。よって、両抗体はリガンド非依存性であるが構成的に活性な形態のＥＧＦＲを発現する神経膠腫異種移植片を抑制し得る。
【００８２】
４．ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのデッドキナーゼバージョンを発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ）：
ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのデッドキナーゼ（ＤＫ）バージョンをトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ細胞を異種移植片として親細胞と類似の速度で増殖させ（図３Ｂ）、いずれの抗体によっても容易に抑制されなかった（図２）。この受容体はシグナル伝達に関連する主要部位ではリン酸化されないが、受容体内部移行及び分解に関連する部位ではリン酸化されたままである（図４）。これらの細胞への両抗体の結合はインビトロ及びインビボでｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現細胞で見られる結合と類似している（１６）。更に、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのＤＫ変異体は１つの細胞間点突然変異しか含んでいないので、両細胞該ドメインを結合するｍＡｂ８０６及び５２８のアフィニティーは変化してはならない。この結果から、インビボでこれらの抗体により媒介される免疫エフェクター機能は抗腫瘍応答を開始するには十分でないことが立証される。更に、抗ＥＧＦＲ抗体の抗腫瘍活性は機能的キナーゼドメインを有する受容体を必要とすることが示される。
【００８３】
５．自己リン酸化に対する２つの主要部位が欠失しているｄｅ２−７ ＥＧＦＲのバージョンを発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．ＤＹ２）：
２つの主要自己リン酸化部位（チロシン１０６８及び１１７３がフェニルアラニンに変化）で自己リン酸化できないｄｅ２−７ ＥＧＦＲ構築物を発現するＵ８７ＭＧ異種移植片は、腫瘍異種移植片として増殖させたとき両抗体により有意に抑制された（ｍＡｂ５２８及び８０６のそれぞれについてｐ＜０．０１及び０．００６）（図２）。これらの所見とＵ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片に対して見られた活性の欠如とから、自己リン酸化とは反対にキナーゼ活性は抗体治療に対する応答性に相関していることが示唆される。
【００８４】
６．自己リン酸化できないｄｅ２−７ ＥＧＦＲのバージョンを発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．ＤＹ５）：
シグナル伝達に関係する５つの主要自己リン酸化部位（チロシン１１７３、１１４８、１０８６、１０６８及び９９２がフェニルアラニンに変化）で自己リン酸化できないｄｅ２−７ ＥＧＦＲ構築物を発現するＵ８７ＭＧ細胞を腫瘍異種移植片として増殖させた。この受容体はシグナル伝達に関係する主要部位ではリン酸化されないが、受容体内部移行及び分解に関連する部位ではリン酸化されたままである（図４）。ＤＹ２異種移植片で得た結果と整合して、両抗体はＤＹ５ ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ構築物を発現する異種移植片の増殖を有意に抑制した（両抗体についてｐ＜０．０００１）（図２）。この結果がやや予期せぬことと仮定して、我々はこの実験を両抗体を用いてより低い用量（注射１回あたり０．５ｍｇ対１ｍｇ）で繰り返し、再び両方の場合で腫瘍増殖が有意に抑制される結果を得た（データ示さず）。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのＤＹ５形態は下流シグナル伝達にとって不可欠であるアダプター分子を直接結合し得ないので、これらの分子の相互作用よりもむしろ活性キナーゼドメインがＥＧＦＲ特異的抗体に対する応答性につながる不可欠な要件であると示唆される。
【００８５】
（高レベルのｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ異種移植片の治療）
図２中のデータから、異種移植片がＥＧＦＲシグナル伝達に対してより依存性となるとＥＧＦＲ特異的抗体治療に対する応答がより高くなることが示唆される。従って、ＦＡＣＳソーティングを用いて、我々は非常に高レベルでｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７高）を単離した（図５Ａ）。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７高異種移植片は元のＵ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片よりもより速く増殖した（図５Ｂ）。このことから、これらの異種移植片の急速増殖は高レベルのｄｅ２−７ ＥＧＦＲに頼っていることが示唆される。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現のレベルは、異種移植片ライゼートをイムノブロッティングして調べたところインビボで保持されていた（図５Ｃ）。ｍＡｂ８０６またはｍＡｂ５２８の治療によりＵ８７ＭＧ．Δ２−７高異種移植片が有意に抑制され、これは他のＵ８７ＭＧ由来細胞株について観察されたよりも高かった（図５Ｄ）。対照群を倫理的理由で犠牲にした１８日目では、ビヒクル群、ｍＡｂ８０６及びｍＡｂ５２８群の平均腫瘍容積はそれぞれ１７６０、９０及び９０ｍｍ３であった（ｐ＜０．００１）。有意には、以前のＵ８７ＭＧ由来治療研究では完全な退縮はなかったが（図２）、ｍＡｂ８０６治療したＵ８７ＭＧ．Δ２−７高異種移植片の４０％及びｍＡｂ５２８治療したＵ８７ＭＧ．Δ２−７高異種移植片の２０％が完全に退縮した。ｍＡｂ８０６腫瘍の１つは接種から４６日目に再発したが、他の腫瘍はマウスを犠牲にした１２６日目まで再発しなかった。よって、ＥＧＦＲの構成的に活性な形態の過剰発現により誘導される異種移植片はＥＧＦＲ特異的抗体に対してより感受性である。
【００８６】
（樹立ＮＲ６由来異種移植片のｍＡｂ８０６及び５２８治療）
ＮＲ６マウス線維芽細胞株はＥｒｂＢファミリーのメンバーを内因的に発現せず（２３）、これは我々がＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３についてＦＡＣＳにより確認した所見である（データ示さず）。次いで、これらの細胞にヒトｄｅ２−７ ＥＧＦＲ（ＮＲ６．Δ２−７）をトランスフェクトした。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲに対するｍＡｂ８０６及び５２８の有効性を調べるために使用したＵ８７ＭＧ由来細胞株はすべてｗｔ ＥＧＦＲを共発現するので、我々は樹立ＮＲ６．Δ２−７異種移植片を有するマウスにおいて治療有効性を評価した。ｍＡｂ８０６治療により、接種から４２日目で非常に高かったビヒクルでの治療に比して全腫瘍増殖速度が遅くなった（Ｐ＜０．００３）（図６）。治療最終日（３９日目）の平均腫瘍容積はビヒクル治療群及びｍＡｂ８０６治療群のそれぞれで１５２０及び６７０ｍｍ３であった（図６Ａ）。
【００８７】
樹立ＮＲ６．Δ２−７異種移植片を有するマウスもｍＡｂ５２８で治療した。動物を倫理的理由で殺した接種から５６日目では、ｍＡｂ５２８で治療した腫瘍のサイズはビヒクル治療した異種移植片の腫瘍のサイズと差がなかった（図６Ｂ）。我々は、マウスに抗体を週２回、３週間与えるようにプロトコルを僅かに変更してｍＡｂ５２８を用いて第二の治療実験を実施した。この場合も、ｍＡｂ５２８がこれらの条件下で樹立ＮＲ６．Δ２−７異種移植片の増殖を抑制できなかった（図６Ｃ）。よって、ｍＡｂ８０６とは異なり、ｍＡｂ５２８はｗｔ ＥＧＦＲの非存在下でｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する異種移植片を抑制できない。
【００８８】
（Ｓｒｃ活性はｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現異種移植片の抗体治療に対する応答をモジュレートする）
ｍＡｂ８０６及び５２８はｄｅ２−７ＥＧＦＲのＤＹ５バージョンを発現する異種移植片を抑制し、またいずれの抗体もインビボで単一物質としてｄｅ２−７ ＥＧＦＲリン酸化を低下させないので（１６）、これらの抗体はｄｅ２−７ ＥＧＦＲの下流の標的のトランスリン酸化を破壊することにより抗腫瘍活性を媒介するようである。ＮＲ６．Δ２−７異種移植片を用いた我々の観察から、ｍＡｂ５２８の抗腫瘍活性はＥｒｂＢファミリーの別のメンバーとの共発現に依存性であり、ｍＡｂ８０６活性はこの相互作用と非依存性であることが示唆される。従って、ｄｅ２−７“ＥＧＦＲ”がｗｔ ＥＧＦＲの場合のようにＳｒｃと相互作用し得るか、この可能性ある相互作用がｍＡｂ８０６有効性に関連しているかを調べた。
【００８９】
ｗｔ ＥＧＦＲを活性化すると、Ｓｒｃキナーゼが一時的に活性化される。Ｓｒｃが活性化されると、相乗的に自己リン酸化部位ではなくむしくＳｒｃリン酸化に対する標的であるＥＧＦＲのチロシン８４５（Ｙ８４５）がリン酸化される（２４）。Ｙ８４５に対して特異的な抗体を用いて、我々はｄｅ２−７ ＥＧＦＲにおけるＹ８４５のリン酸化を調べた。Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞において発現させると、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲはＹ８４５のローバストなリン酸化を示した（図７Ａ）。Ｙ８４５でのリン酸化は、細胞をＳｒｃ−ファミリーキナーゼの阻害剤であるＰＰ１及びＰＰ２とインキュベートすることにより迅速に阻止されるのに対して、Ｙ１１７３での自己リン酸化部位は殆ど影響されなかった（図７Ａ）。
【００９０】
ｄｅ２−７ ＥＧＦＲはｗｔ ＥＧＦＲと同様にＳｒｃキナーゼリン酸化に対する標的であると見られると仮定して、我々はこの相互作用がｍＡｂ８０６ 活性にとって重要であったかを調べようとした。まず、我々はＹ８４５Ｆ置換を含むｄｅ２−７ ＥＧＦＲを構築したが、このタンパク質は複数の部位で少ないリン酸化を示し（Ｊｏｈｎｓ、未発表所見）、従ってこれらの研究にとって不適当であると見なされた。そこで、材料及び方法の欄に記載したように、我々はｄｅ２−７ ＥＧＦＲ及びＤＮＳｒｃを共発現するＵ８７ＭＧ細胞株（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ）を作製した。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ異種移植片をヌードマウスにおいて腫瘍異種移植片として増殖させたが、その増殖速度はベクター対照をトラクスフェクトしたＵ８７ＭＧ．Δ２−７よりも遅かった（図７Ｂ）。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃをｍＡｂ８０６で治療すると、腫瘍増殖がローバストに抑制された（図７Ｃ）。接種から３４日目で、ビヒクル群の平均異種移植片容積は１２２０ｍｍ３であったのに対して、ｍＡｂ８０６治療群では１００ｍｍ３であった（ｐ＜０．００１）（図７Ｃ）。更に、ｍＡｂ８０６治療群では、すべてのＵ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ異種移植片の６０％が完全に退縮し、接種から５０日目まで再発しなかった。よって、Ｓｒｃシグナル伝達を抑制するとｍＡｂ８０６治療の有効性が高まる（図７Ｃ対図２）。
【００９１】
（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞におけるｍＡｂ８０６の内部移行）
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞において発現させたｄｅ２−７ ＥＧＦＲへ結合させた後のｍＡｂ８０６の細胞内輸送を共焦点顕微鏡検査により研究した。ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３を４℃でインキュベートした後３７℃で追跡する前に、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合したｍＡｂ８０６を血漿膜に沿って配置した（図８Ａ；０分間，ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３）。３７℃でインキュベートした後、小さい点状細胞質小胞へ転移させるためにｍＡｂ８０６を観察した（図８Ａ；ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３）。その後、初期エンドソームを同定する抗初期エンドソーム自己抗原１（ＥＥＡ１）を用いて免疫染色すると（図８Ａ；ＥＥＡ１）、黄色蛍光の存在により可視化されるようにｍＡｂ８０６との部分的共局在が示された（図８Ａ；合併）。３７℃で６０分間追跡したところ、共局在は最小であった（図８Ａ；合併，６０分間）。このことから、大部分の抗体が初期エンドサイトーシス区画から移動したことが示唆された。これらの所見は、ｍＡｂ８０６は内部移行後直ちに初期エンドサイトーシス区画に局在化し、その後細胞内輸送サイクルにより別の位置に移動することを示している。
【００９２】
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞におけるｄｅ２−７ ＥＧＦＲの結合及び内部移行後のｍＡｂ８０６のリソソーム局在化は、ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰを一時的にトランスフェクトした細胞の共局在化分析により実施した（図８Ｂ）。ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰをポジティブにトランスフェクトした細胞は、予期されたようにリソソーム区画への局在化に整合する細胞質核周囲緑色蛍光を示した（図８Ｂ；ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰ）。内部移行を誘導する前、ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３は細胞表面でのみ検出され（図８Ｂ；０分間，ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３）、ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰと共局在されなかった（図８Ｂ；０分間，合併）。３７℃で３０分間加温した後、内部移行したｍＡｂ８０６に相当する小さい細胞内小胞構造が観察された（図８Ｂ；３０分間，ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３）。これらの構造の幾つかはｌｇｐ−１２０−ＧＦＰと共局在したが、赤色及び緑色シグナルの大部分は分離したままであった（図８Ｂ；３０分間，合併）。３７℃で長く６０分間及び１２０分間インキュベートすると、内部移行したｍＡｂ８０６−Ｃｙ３及びｌｇｐ−１２０−ＧＦＰの共局在が増加した（図８Ｂ；６０〜１２０分間，合併）。これらの所見は、ｍＡｂ８０６がまず初期エンドサイトーシス区画を横断するが、時間が経つとリソソーム区画に移動し、そこで蓄積するとの仮説と一致している。
【００９３】
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞で発現したｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合後のｍＡｂ８０６の内部移行も電子顕微鏡検査により分析した。３７℃で５分間インキュベートした後、ｍＡｂ８０６に相当する金粒子がクラスリン被覆ピットに似た構造で観察された（図９Ａ及びＢ）。金粒子は細胞質内にある遊離クラスリン被覆小孔でも検出された（図９Ｃ）。カベオラに類似している構造では金粒子は観察されなかった（図９Ｄ）。３７℃で１０分間追跡したところ、ｍＡｂ８０６は初期エンドサイトーシス区画に似た大きな管状小胞構造に局在していた（図９Ｅ）。より長く３０分間追跡すると、抗体は多小胞体に似た構造に局在した（図９Ｆ）。これらの所見は、ｍＡｂ８０６とｌｇｐ−１２０の共局在を３０〜６０分間示す免疫蛍光顕微鏡検査データと一致している。
【００９４】
（ＮＲ６Δ２−７細胞におけるＭＡｂ８０６及び５２８の内部移行）
ＮＲ６．Δ２−７異種移植片に対するｍＡｂ８０６及び５２８の治療有効性の差を仮定すると、各抗体の内部移行特徴をこの細胞株で研究した。更に、ＮＲ６．Δ２−７細胞はＥｒｂＢファミリーの内因性メンバーを発現しないので、ｗｔ ＥＧＦＲの存在が抗体の内部移行のために必要であるかをこの細胞株で調べた。４℃でｍＡｂ８０６−Ｃｙ３とインキュベートした細胞は予期されたように細胞内蛍光なしに膜染色を示した（図１０；ｍＡｂ８０６，０分間）。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞（図８）とは対照的に、膜染色は均一でなかった。より強い染色は細胞間の膜結合（図１０；ｍＡｂ８０６，０分間）及びフォーカルアドヒージョン（図１０；ｍＡｂ８０６，０分間）と関連していた。幾つかの細胞では膜染色を殆ど示さなかった（図１０；ｍＡｂ８０６，０分間）。温度を３７℃まで上げることにより内部移行を誘導した後、特徴的な細胞内点状小胞構造が観察された。核周囲パターンの蓄積（図１０；ｍＡｂ５２８，１５〜６０分間）は急速なリソソーム局在化と一致している。ｍＡｂ５２８の初期局在化（図１０；ｍＡｂ５２８，０分間）及びその後の内部移行（図１０；ｍＡｂ５２８，１〜６０分間）はｍＡｂ８０６のものと同一であった。よって、両抗体は、ｗｔ ＥＧＦＲの非存在下であってもｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合後迅速にリソソーム区画に内部移行した。
【００９５】
考察
（ｍＡｂ５２８）
すべてではないが、多くの以前の研究は、細胞表面上のＥＧＦＲの数がＥＧＦＲ標的治療、特にＴＫ１の有効性に影響を及ぼす１つの要因であると示唆している（表１）。しかしながら、これらの実験は常に各種細胞株を用いて抗腫瘍活性を比較しており、よって遺伝的背景、他のＥｒｂＢファミリーメンバーの存在、及びＥＧＦＲシグナル伝達経路をモジュレートし得る他の機能的受容体／キナーゼの存在の点で管理されていない。更に、これらの研究の多くはインビトロで実施されており、我々はインビボ活性と相関していないことを知見した。ｗｔ ＥＧＦＲ数が１０倍に増加すると、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫異種移植片はｍＡｂ５２８耐性から抗体応答性に変化する。ｗｔ ＥＧＦＲの数が増加してもＵ８７ＭＧ異種移植片の増殖速度は変化しなかったので、抗腫瘍活性の出現は単に誘導増殖有利性を抑制するｍＡｂ５２８の結果でなかった。Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片内により多くのｗｔ ＥＧＦＲが存在すると、ほぼ確実に腫瘍部位での抗体局在化が増加するであろう。ｍＡｂ５２８が低いが測定可能な免疫エフェクター機能を有していると仮定すると（２５）、腫瘍部位での抗体の高いレベルにより腫瘍増殖の抑制に寄与する補体の高い沈着及び免疫細胞の補充が生じ得る。しかしながら、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片での我々のデータを仮定すると、ｍＡｂ５２８の抗腫瘍活性の開始における免疫エフェクター機能の役割はありそうもないようである。これらの異種移植片はＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片くらい多くのｍＡｂ５２８結合部位を有しているが、抗体により抑制されない。我々の興味ある可能性は、ｗｔ ＥＧＦＲが過剰発現するとリガンド非依存性ＥＧＦＲシグナル伝達がもたらされ、親Ｕ８７ＭＧは強いオートクリン−リガンドループを有していないようである）、これにより細胞はＥＧＦＲシグナル伝達系により依存するようになる。よって、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片は、親細胞株とは異なりＥＧＦＲシグナル伝達経路は活性で機能的であるのでｍＡｂ５２８治療に応答する。従って、ｗｔ ＥＧＦＲの過剰発現はＥＧＦＲシグナル伝達に対する細胞依存性の代理マーカーであり、前記細胞はＥＧＦＲ治療に対して応答する可能性が高いが、保証されない（２６）。
【００９６】
ｍＡｂ５２８のような抗体の抗腫瘍活性は主にＥＧＦＲのリガンド活性化を拮抗させる能力により媒介されると推測されてきた。ｍＡｂ５２８が有意なリガンド発現の非存在下でＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片の増殖を抑制したとの仮定から、他のメカニズムが抗腫瘍効果に寄与し得ると示唆される。更に、ｍＡｂ５２８はリガンド非依存性ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する異種移植片に対して有意な有効性を示した。この抗腫瘍活性は、いずれも同一レベルのｗｔ ＥＧＦＲを発現する親Ｕ８７ＭＧまたはＵ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片の増殖を抑制しなかったようにｍＡｂ５２８がこれらの異種移植片で共発現する内因性ｗｔ ＥＧＦＲを結合することから生じ得る。免疫エフェクター機能を除外して、代替抗腫瘍メカニズムは受容体ダウンレギュレーション、不適切なシグナル伝達の誘導、受容体の不適切な膜ドメインへの転位、及び受容体ダイマー化及び／またはオリゴマー化との干渉を含み得る。実際、ＥＧＦＲに対する幾つかのＴＫＩはキナーゼ活性を阻害することにより機能するだけでなく、予期せぬ抗腫瘍メカニズム（２７）である過剰リガンドをモッピングし得る不活性ダイマーを誘導し得る。
【００９７】
興味深いことに、Ｃ２２５に対して異なる応答を示す結腸患者におけるＥＧＦＲ発現を分析する最近の免疫組織化学的研究は、数人のＥＧＦＲ「ネガティブ」患者はこのＥＧＦＲ特異的抗体に対して臨床応答を有していたことを報告した（２６）。多分、これらの患者のＥＧＦＲレベルは、存在するＥＧＦＲを活性化し、腫瘍増殖／生存に寄与する組織化学の検出感度以下である。この所見から、単にＥＧＦＲ発現のレベル以上のものがないならばＥＧＦＲ活性化が少なくとも重要であることが示唆される。ｍＡｂ５２８がこの末端切断型受容体のデッドキナーゼバージョンを発現するＵ８７ＭＧ異種移植片（Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ）の増殖を抑制しなかったことを示す我々のデータから、ＥＧＦＲ特異的抗体の有効性がキナーゼ活性受容体に緊密に関連している所見が裏付けられる。上に示唆されているように、ＥＧＦＲ過剰発現はこの活性化が起こり得る１つのメカニズムに相当する。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのような構成的に活性な変異体の発現は別のメカニズムを示している。このようにＥＧＦＲが連続的に活性化すると、細胞はＥＧＦＲシグナル伝達に対して中毒状態になる。そのために、これらの細胞は抗ＥＧＦＲ治療に対して感受性となる。この考えは、ＥＧＦＲ特異的ＴＫＩに応答する多くの患者がＥＧＦＲキナーゼドメインに活性化突然変異を有している肺癌患者の状況に類似している（２８）。
【００９８】
ｍＡｂ５２８がＵ８７ＭＧ．ＤＹ２またはＤＹ５異種移植片の増殖を抑制する能力は、有効性の決定要因としての自己リン酸化とは対照的に活性キナーゼドメインの有意性を強調している。よって、抗体治療に対する応答を決定するのは活性キナーゼであって、リン酸化チロシンのアダプターまたはシグナル伝達分子との直接相互作用ではない。この結果に対する１つの推論は、ｍＡｂ５２８は下流標的のトランスリン酸化を防止することによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７／ＤＹ２／ＤＹ５異種移植片の増殖を見かけ上抑制することである（図１１）。これらすべてのＵ８７ＭＧ由来細胞株はｗｔ ＥＧＦＲを共発現するので、我々が最近ｄｅ２−７ ＥＧＦＲがダイマーを形成し、ｗｔ ＥＧＦＲをリン酸化することを立証したとすると（２９）、ｗｔ ＥＧＦＲは多分この第二標的に対する候補となるであろう。この説は、ｗｔ ＥＧＦＲの非存在下でｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＮＲ６細胞がｍＡｂ５２８の抗腫瘍効果に対して完全に難治性であったという事実により裏付けられる。これらの研究をまとめると、そのリガンド阻止性と合わせて、ｍＡｂ５２８は過剰発現したｗｔ ＥＧＦＲのホモダイマー化及びｗｔとｄｅ２−７ ＥＧＦＲ間のヘテロダイマー化を防止することにより部分的に機能することが示唆される。興味深いことに、ＥＧＦＲと複合化したＣ２２５（ｍＡｂ５２８に非常に類似している抗体）の構造から、リガンド阻止とは別にこの抗体はＥＧＦＲ係留解除を部分的に抑制することによりＥＧＦＲダイマー化を防止し得ることが示唆される（３０）。
【００９９】
（ｍＡｂ８０６）
インビボでのＵ８７ＭＧ由来細胞株のｍＡｂ８０６に対する応答性はｍＡｂ５２８で観察された応答性を完全に反映しており、幾つかの大きな差はあるが上記原則の多くが当てはまることが指摘される。この研究は、ｍＡｂ８０６反応性がＥＧＦＲ活性化に関連していることを立証している我々の以前の研究（１６）を確認し、敷衍させる。ｍＡｂ５２８及び臨床評価中のすべての現在の抗体とは異なり、ｍＡｂ８０６は、ＥＧＦＲ活性化が肝臓のような臓器において殆どまたは全く検出され得ないように肝臓のような正常組織を標的としない。多くの要因が腫瘍内でＥＧＦＲ活性化を刺激し得る（検討のために、（３１）を参照されたい。）。我々は、これらのうちの少なくとも３つの要因、すなわちＥＧＦＲ過剰発現（１５）、突然変異（１７）及びオートクリンループの存在（Ｊｏｈｎｓら，準備中）がｍＡｂ８０６反応性をもたらし得ることを確認した。ｍＡｂ８０６抗腫瘍活性に対するｗｔ ＥＧＦＲ過剰発現の関連性は、過剰発現がＥＧＦＲグリコシル化におけるリガンド非依存性活性化及び変化のような複数のメカニズムによりｍＡｂ８０６により認識されるＥＧＦＲの一過性の非係留形態を増加させる（２１）ようにそのユニークな特異性と均密に関連している。本明細書に記載されている研究及びＥＧＦＲ特異的ＴＫＩで得られた臨床データからＥＧＦＲ阻害剤が活性化ＥＧＦＲを有する腫瘍に対して殆ど有効であることが示唆されると仮定すると、ｍＡｂ８０６がＥＧＦＲの活性化形態を特異的に認識するユニークな能力によりｍＡｂ８０６は有利な治療薬となる
分子モデリングから、ｍＡｂ８０６結合が活性ｗｔ ＥＧＦＲダイマーの形成を予防することが示唆され（１４）、この仮説についてエピトープと複合しているｍＡｂ８０６の結晶構造を解決することにより我々は確認した（Ｊｏｈｎｓら，準備中）。このｍＡｂ８０６は異種移植片モデルにおいてｄｅ２−７またはｗｔ ＥＧＦＲのリン酸化を有意に抑制しないにもかかわらず（１６）、ｍＡｂ８０６に対する作用の提案されているメカニズムには自己リン酸化の阻止以上を含むことが強く示唆される。更に、ＥＧＦＲシグナル伝達の公知の下流標的（例えば、Ａｋｔ及びＭＡＰＫ）はｍＡｂ８０６によっても抑制されない（Ｔ．Ｇ．Ｊｏｈｎｓ，未発表の所見）。この仮定と一致して、ｍＡｂ８０６は自己リン酸化が関連しない２つのモデルであるＵ８７ＭＧ．ＤＹ２／ＤＹ５異種移植片に対してローバストな抗腫瘍活性を示した。ｍＡｂ８０６がＵ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片に対して有効でないことから、活性キナーゼの存在及びトランスリン酸化事象の存在（図１１）は感受性をもたらす重要な要因であることが強調される。ｍＡｂ５２８とは対照的に、ｍＡｂ８０６は他のＥｒｂＢファミリーメンバーの非存在下でｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＮＲ６細胞の増殖を抑制し得た。この結果は、ｍＡｂ８０６はｗｔ ＥＧＦＲとは異なりｄｅ２−７ ＥＧＦＲトランスリン酸化の他の標的を潜在的に破壊することを示している。興味深いことに、ＮＲ６細胞において表面ｄｅ２−７ ＥＧＦＲへｍＡｂ８０６及び５２８を結合させた後の各抗体の内部移行及び細胞内輸送に明らかな差はなかった。このことから、抗体輸送がこの異種移植片モデルでの有効性の差に寄与しないことが示唆される。
【０１００】
我々はここで初めて、Ｙ８４５がＳｒｃ依存的にｄｅ２−７ ＥＧＦＲでリン酸化されることを報告している。よつて、我々はｄｅ２−７ ＥＧＦＲとＳｒｃの相互作用がｍＡｂ８０６活性の潜在的標的であったかどうかを試験した。ｍＡｂ８０６がこの相互作用を抑制することによりその抗腫瘍活性の一部を媒介したならば、この相互作用をＤＮＳｒｃを用いて遺伝的に破壊するとｍＡｂ８０６の有効性は低下せざるを得ない。この可能性とは対照的に、ＤＮＳｒｃの存在によりｍＡｂ８０６の抗腫瘍活性が劇的に強化された。このことから、ＳｒｃがＥＧＦＲ治療の有効性を制限する役割を有しており、ＳｒｃとＥＧＦＲ阻害剤の併用が合理的であることが示唆される。
【０１０１】
結論
これらの研究から、ＥＧＦＲ治療に対する細胞株の感受性を分析するためのインビボ研究の関連性が立証された。従来の研究とは異なり、我々は我々の分析の殆どを同一遺伝的背景で実施し、主要な変数をＥＧＦＲの種類とすることができた。このアプローチを用いて、我々は最終的に有効性に対する受容体数の有意差を示した。ＥＧＦＲ数はＥＧＦＲ治療感受性に関連しているが、この要因単独は受容体が機能キナーゼを含有する必要があるので十分でない。実際、やや直観的であるが、この研究は、ＥＧＦＲシグナル伝達を使用するためにｗｔ ＥＧＦＲの過剰発現または構成的に活性な変異体の発現により細胞株を強制すると、非応答性から応答性にスイッチされ得ることを形式的に示している。よって、ＥＧＦＲは細胞表面上に存在しているだけでなく、細胞の増殖及び生存に有意に関与しなければならない。従って、ＥＧＦＲ治療に応答する患者を選択するための戦略は単に受容体タンパク質の存在の有無だけでなく腫瘍がＥＧＦＲに対してかなり依存しているかを同定するように向けられなければならない。この仕事は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ遺伝子増幅またはキナーゼ活性化変異遺体が存在するような幾つかの場合には比較的進展しているが、ｗｔ ＥＧＦＲが遺伝的に正常である場合には明らかにより難しい。これらの場合、複数の受容体キナーゼの複雑な相互作用により真にＥＧＦＲシグナル伝達に依存している腫瘍を同定することが難しくなる。長い間、各受容体キナーゼにユニークなこれから同定されるであろう標的遺伝子の詳細な発現プロフィールがこの問題を解決するための唯一の実行可能なアプローチであり得る。
【０１０２】
【表３】
【実施例２】
【０１０３】
Ｓｒｃ阻害剤ダサチニブ及びｍＡｂ８０６治療の動物治療研究
抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６の単独またはｓｒｃ阻害剤ダサチニブとの組合せのインビボ効果を評価するために動物治療研究を実施した。８週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ ｎｕマウスに（１腫瘍部位あたり）１×１０６個のＵ８７ＭＧ．Δ２−７ＳＲＣ細胞を皮下注入した。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ＳＲＣ細胞は活性化Ｓｒｃ（Ｙ５２９Ｆ突然変異）及びΔ２−７変異ＥＧＦＲを発現する。右脇腹及び左脇腹の各々に前記細胞を注入することによりマウス１匹あたり２つの腫瘍を発生させた。平均腫瘍サイズが約８０ｍｍ３に達したときに治療を開始した。１群あたり４〜５匹のマウスで構成する４治療群のマウスを３回／週、２週間治療した。治療群は、（１）対照−ｌ００μｌの希釈剤４％ ＤＭＳＯ／ｄＨ２Ｏ；（２）ダサチニブ−希釈剤中に溶解させた１０ｍｇ／ｋｇの薬物；（３）ｍＡｂ８０６−ｌｍｇ；（４）ｍＡｂ８０６ ｌｍｇ及びダサチニブ １０ｍｇ／ｋｇであった。
【０１０４】
（抗体）
Ｓｒｃをマウスモノクローナル抗体ｖ−Ｓｒｃ ３２７（米国カリフォルニア州に所在のＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）またはｃ−Ｓｒｃ Ｈ−１２（米国カリフォルニア州に所在のＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を用いて検出した。ホスホ−Ｓｒｃを検出するためには家兎ポリクローナル抗体ＰＹ４１８（米国カリフォルニア州に所在のＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を使用した。
【０１０５】
（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ｓｒｃ細胞株の構築）
活性化Ｓｒｃ構築物（Ｙ５２９Ｆ突然変異）はＵｐｓｔａｔｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州レイク・プラシッドに所在）から入手した。活性化Ｓｒｃ ｃ−ＤＮＡを含むＰｍｅｌ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州カールスバッドに所在）から入手したｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターにサブクローン化した後、エレクトロポレーションによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７をトランスフェクトした。細胞を１ｍｌアリコートで９６ウェルプレートにおいて約２×１０４細胞／ウェルの細胞密度でプレートアウトし、３７℃で４８時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（独国マンハイムに所在のＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及び４００μｇ／ｍｌのジェネテシン（カリフォルニア州カールスバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。
【０１０６】
まず、トランスフェント細胞をＦＡＣＳ分析によりスクリーニングして、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲの発現が保持されているかを確認した。次いで、クローンを全細胞溶解または免疫沈降にかけた後、Ｓｒｃ特異的抗体（ｖ−Ｓｒｃ ３２７、ＰＹ４１８）を用いるウェスタンブロッティングにかけた。全Ｓｒｃ及びリン酸化Ｓｒｃのレベル（Ｓｒｃレベルは元の細胞株では非常に低い）の劇的な増加を示した数個のクローンを同定し、増大させた。
【０１０７】
（異種移植片モデル）
８週齢の雌ヌードマウス（豪州パースに所在のＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）の両脇腹に１００μｌのＰＢＳ中の腫瘍細胞（１×１０６個）を皮下接種した。すべての研究を上記したような樹立腫瘍モデルを用いて実施した。腫瘍の平均容積が約８０ｍｍ３に達したら治療を開始した。腫瘍容積（ｍｍ３）は、式（長さ×幅２）／２（ここで、長さは最長の軸であり、幅はその軸に直角な測定値である）を用いて求めた。データは、各治療群について平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する（図１２）。すべてのデータをスチューデントｔ検定により有意さについて分析する。データをカプラン−マイヤ−生存曲線に変換し、瀕死の、すなわち＞１５００ｍｍ３の腫瘍容積のデュアルエンドポイントを用いるウィルコクソン分析により分析した（図１３）。
【０１０８】
３３日目で、ｍＡｂ８０６とダサチニブの組合せで治療した群の腫瘍増殖はｍＡｂ８０６単独で治療した群よりも有意に小さかった（ｐ＜０．００７６）（図１２）。腫瘍増殖実験のデータをカプラン−マイヤ−生存曲線に変換し、瀕死の、すなわち＞１５００ｍｍ３の腫瘍容積のデュアルエンドポイントを用いるウィルコクソン分析により分析した（図１３）。ｍＡｂ８０６とダサチニブの組合せで治療した群はすべての他の群よりも長く生存した（ログランクｐ＜０．０００１）。
【０１０９】
本発明を本発明の趣旨または必須要件から逸脱することなく他の形態で具体化しても、または他の方法で実施してもよい。従って、本明細書の開示内容は、すべての点で例示され、限定的でないと見なされ、本発明の範囲は添付の請求の範囲により記載され、均等の意味及び範囲に入るすべての変化が本発明に包含されると意図される。
【０１１０】
本明細書を通じていろいろな文献が引用されており、各引用文献の全文は参照により本明細書に組み入れられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲ媒介性疾患、特に癌の治療に関する。ＥＧＦＲモジュレーター（特に、ＥＧＦＲ抗体）及びｓｒｃ阻害剤の組合せを用いる癌の治療方法が提供される。ＭＡｂ８０６抗体及びｓｒｃ阻害剤の方法及び組合せが提供される。
【背景技術】
【０００２】
標的癌治療は、発癌及び腫瘍増殖に必要な特定分子の機能を破壊し、よって癌細胞を死滅させまたはその増殖を予防するように設計されている（Ｊｉ Ｈら（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，５（１８）：２０７２−２０７６，２００６年９月ｌ５日電子版）。従来の細胞毒性化学療法とは対照的に、標的癌治療はより有効であったり、正常細胞に対する害が少ないことがあり得る。標的癌治療分野における主な努力は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする物質の開発に向けられてきた。ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）やＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含めた密接に関連する受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲを活性化すると、受容体チロシンキナーゼが活性化され、細胞増殖、運動性、接着、侵入及び化学療法に対する耐性を媒介する一連の下流シグナル伝達事象、並びに癌細胞の連続的増殖及び生存にとって重要なプロセスであるアポトーシスの抑制が生じる。
【０００３】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異受容体の発現は腫瘍細胞に限られているので、抗体治療に対するかなり特異的な標的に相当する。従って、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのユニークペプチドに対して特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体が作成された。ユニークなｄｅ２−７ ペプチドを用いて免疫化後単離した一連のマウスｍＡｂはいずれも、ヌードマウスで増殖させた末端切断型受容体及び標的化ｄｅ２−７ ＥＧＦＲポジティブ移植移植片に対して選択性及び特異性を示した（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５５：３１４０−３１４８；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｓら（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７３：１３６６−１３７２；Ｈｉｌｌｓ Ｄら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６３：５３７−５４３；Ｒｅｉｓｔ ＣＪら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５７：１５１０−１５１５；Ｒｅｉｓｔ ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：４３７５−４３８２；米国特許第５，４０１，８２８号明細書）。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の例には、ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ）、ＤＨ８．３、Ｌ８Ａ．４及びＹ１０が含まれる。
【０００４】
ＭＡｂ８０６は、元々免疫原としてＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体を発現する全細胞を用いてユニークな末端切断型変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩを認識するように産生させた新規なマウス抗体である。重要なことは、ｍＡｂ８０６により認識されるエピトープは不活性野生型（ｗｔ）ＥＧＦＲでは接近できないが、ＥＧＦＲが過剰発現し、ＥＧＦＲｖＩＩＩが発現している細胞ではトランジション形態のｗｔ ＥＧＦＲで露出している。ＭＡｂ８０６はＥＧＦＲｖＩＩＩ／Δ２−７ ＥＧＦＲ変異体中に存在しているかまたは利用可能なエピトープに結合するが、変異の結合ペプチドＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨとは異なるエピトープを認識する。エピトープ研究は、８０６抗体が神経膠腫及び広範囲の上皮癌中に存在するエピトープに結合するが、正常なヒト組織には結合しないことを立証している免疫組織化学的研究により裏付けられている。これらのデータ及び他の前臨床データから、ｍＡｂ８０６はセツキマブや他の抗ＥＧＦＲ抗体とは異なる各種臨床活性スペクトル及び副作用プロフィールを有するであろうと示唆された。異種移植片モデルで、ｍＡｂ８０６は正常組織を標的とすることなく強力な抗腫瘍活性を発揮した。よって、ｍＡｂ８０６のユニークな標的能力は癌特異的分子標的治療に対する新しいモデルとなる。
【０００５】
非受容体タンパク質チロシンのＳｒｃは、増殖、分化、遊走、接着、侵入、血管形成及び免疫機能のような多くの細胞プロセスの調節において重要な役割を果たすＳｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒ、Ｂｌｋ及びＹｒｋを含めた９遺伝子ファミリーのメンバーである６０ｋＤａタンパク質である（Ｙｅａｔｍａｎ ＴＪ（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４（６）：４７０−８０；Ｆｒａｍｅ ＭＣ（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１７：９８９−９８）。Ｓｒｃファミリーキナーゼは余り保存されないドメイン及び３つの保存Ｓｒｃ相同ドメイン、すなわちＳＨ２、ＳＨ３及びＳＨ１、またはタンパク質チロシンキナーゼドメインを含んでいる。Ｓｒｃの調節には、Ｃ末端Ｓｒｃキナーゼ（Ｃｓｋ）によりリン酸化したときより不活性なＳｒｃコンホメーションを生ずるＣＯＯＨ末端チロシン（Ｙ５３０）が重要である。Ｓｒｃは、入力シグナルに応じて多くのタンパク質と相互作用する。更に、Ｙ５３０の脱リン酸化及びＹ４１８の自動リン酸化によるその活性コンホメーションを推測する。Ｓｒｃは構造及びシグナル伝達タンパク質にも関係し、生じた複合体は各種細胞プロセスにおけるＳｒｃの役割にとって重要である。Ｓｒｃは、大腸癌、乳癌、メラノーマ、卵巣癌、胃癌，頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、脳腫瘍及び血液癌のような多数の癌において過剰発現または異常に活性化されると報告されている（Ｄｅｈｍ ＳＭ ａｎｄ Ｂｏｎｈａｍ Ｋ（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００４；８２：２６３−７４）。いろいろなｓｒｃの小分子阻害剤が公知であり、幾つか、例えばダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＤ１６６３２６が臨床トライアルに入っている。
【０００６】
癌を含めたＥＧＦＲ媒介性疾患に対する改善された、より効率的で、より広く有効な治療プロトコルが臨床上必要とされている。
【０００７】
ここに挙げられている参考文献は本発明に対する従来技術であることを容認するものとは解釈されない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，４０１，８２８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｉ Ｈら（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，５（１８）：２０７２−２０７６，２００６年９月ｌ５日電子版
【非特許文献２】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５５：３１４０−３１４８
【非特許文献３】Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｓら（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７３：１３６６−１３７２
【非特許文献４】Ｈｉｌｌｓ Ｄら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６３：５３７−５４３
【非特許文献５】Ｒｅｉｓｔ ＣＪら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５７：１５１０−１５１５
【非特許文献６】Ｒｅｉｓｔ ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：４３７５−４３８２
【非特許文献７】Ｙｅａｔｍａｎ ＴＪ（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４（６）：４７０−８０
【非特許文献８】Ｆｒａｍｅ ＭＣ（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１７：９８９−９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ｓｒｃ発現または活性を変化させると抗ＥＧＦＲ治療の有効性が高まるという知見に関する。特に、ｓｒｃ発現または活性を変化させると抗ＥＧＦＲ抗体の有効性、特にｍＡｂ８０６抗体の活性が劇的に高まる。
【００１１】
本発明は、癌または他のＥＧＦＲ媒介性疾患を治療するためのＥＧＦＲ及びｓｒｃ阻害剤の組合せに関する。
【００１２】
本発明は更に、哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を組み合わせて、同時に、または順々に連続して投与することを含む前記哺乳動物におけるＥＧＦＲ媒介性癌の治療方法を提供する。１つの態様で、ｓｒｃ阻害剤はチロシンキナーゼ阻害剤である。１つの態様で、抗ＥＧＦＲ抗体はＭＡｂ８０６である。
【００１３】
方法の特定実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６抗体またはその活性フラグメントである。ＭＡｂ８０６には、マウス抗体、組換え抗体またはヒト化抗体が含まれる。
【００１４】
ＥＧＦＲ媒介性癌は、神経膠芽腫、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、神経系の癌、消化器癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、尿生殖器癌及び膀胱癌から選択され得る。癌は、更に結腸癌、乳癌、メラノーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍及び血液癌から選択され得る。特に、癌は神経膠腫であり得る。
【００１５】
本発明は、哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時に、組み合わせて、または順々に連続して投与することを含む前記哺乳動物における癌の治療方法を提供する。この方法の１態様では、抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である。この態様の特定実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである。
【００１６】
上記方法では、ｓｒｃ阻害剤は、ダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択され得る。この方法では、ｓｒｃ阻害剤は特にチロシンキナーゼ阻害剤である。上記方法の特定の実施形態では、ｓｒｃ阻害剤はダサチニブであり、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６である。
【００１７】
癌は、神経膠芽腫、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、神経系の癌、消化器癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、尿生殖器癌、膀胱癌、結腸癌、メラノーマ、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍及び血液癌から選択され得る。
【００１８】
本発明は、哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時に、組み合わせて、または順々に連続して投与することを含む前記哺乳動物におけるＥＧＦＲ媒介性癌の腫瘍増殖の阻止または縮小方法を提供する。この方法の特定実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である。抗ＥＧＦＲ抗体は特にｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである。
【００１９】
本発明は、哺乳動物に対して阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を投与することを含む前記哺乳動物におけるＥＧＦＲ媒介性癌の腫瘍増殖の阻止または縮小方法を提供し、前記ｓｒｃ阻害剤はダサチニブであり、前記抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６である。
【００２０】
ＥＧＦＲ媒介性癌は、神経膠芽腫、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、神経系の癌、消化器癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、尿生殖器癌及び膀胱癌から選択され得る。
【００２１】
本発明は更に、哺乳動物に対して抗ＥＧＦＲ抗体及びｓｒｃ阻害剤の組合せを投与することを含む前記哺乳動物における抗ＥＧＦＲ抗体の有効性または活性の増強方法を提供する。ｓｒｃ阻害剤は、ダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択され得る。抗ＥＧＦＲ抗体は特に、腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である。この態様の特定実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６である。
【００２２】
本発明は更に、医薬的に許容され得る担体または希釈剤中に抗ＥＧＦＲ抗体及び１つ以上のｓｒｃ阻害剤を含む医薬組成物に関する。この組成物には、抗ＥＧＦＲ抗体が腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である組成物が含まれる。この組成物の特定実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６である。
【００２３】
他の目的及び作用効果は、図面を参照してなされる以下の記載の検討から当業者には自明である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＥＧＦＲの概略図。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲにおいて欠失している細胞外領域は丸括弧で同定されている。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのデッドキナーゼバージョンは７２１位に単一点突然変異（Ｋ→Ｍ）を含んでいる。ｄｅ２−７ ＥＧＦのＤＹ２バージョンは残基１０６８及び１１７３にＹ→Ｆ突然変異を有しており、ＤＹ５バージョンはこれらの置換を９９２、１０８６及び１１４８にも有している。
【図２Ａ】各種異種移植片のＥＧＦＲ特異的抗体に対する感受性。ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に３×１０６個の細胞を注入することにより異種移植片を樹立させた。異種移植片が約１００ｍｍ３の平均容積に達したら抗体治療を開始した。マウスを１ｍｇのｍＡｂ５２８（左パネル）またはｍＡｂ８０６（右パネル）を用いて週３回、２週間（すなわち、全部で６回注射）治療した。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図２Ｂ】各種異種移植片のＥＧＦＲ特異的抗体に対する感受性。ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に３×１０６個の細胞を注入することにより異種移植片を樹立させた。異種移植片が約１００ｍｍ３の平均容積に達したら抗体治療を開始した。マウスを１ｍｇのｍＡｂ５２８（左パネル）またはｍＡｂ８０６（右パネル）を用いて週３回、２週間（すなわち、全部で６回注射）治療した。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図３】Ｕ８７Ｍをベースとする細胞株の異種移植片増殖曲線。増殖曲線を作成するために、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に１×１０６個の細胞を注入することにより異種移植片を樹立させた。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図４】Ａ及びＢは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ及びＵ８７ＭＧ．ＤＹ５細胞におけるｄｅ２−７ ＥＧＦＲ変異体のインビトロリン酸化。Ａ：ｄｅ２−７ ＥＧＦＲタンパク質をｍＡｂ８０６、ｍＡｂ５２８、または無関係なアイソタイプマッチド対照抗体を用いて免疫沈降させ、生じたサンプルをイムノブロッティングした。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ変異体はすべてユビキチン化及び分解に関連する主要部位であるＹ１０４５でのリン酸化に対してポジティブであった（上部パネル）。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲはＹ１１７３位で構成的にリン酸化されたのに対して、ＤＫ及びＤＹ５変異体は両方とも予想されたようにこの部位でのリン酸化に対してネガティブであった（中央パネル）。ＥＧＦＲの存在をＥＧＦＲに対する家兎ｃ末端ポリクローナル抗体を用いて確認した（下部パネル）。このｃ末端抗体はＹ１０６８Ｆ突然変異を含んでいるためにＤＹ５変異体を認識しなかった。このことから、抗体結合のための重要な残基であることが分かる。よって、全ＤＹ５タンパク質の存在がｍＡｂ８０６を用いてイムノブロッティングすることにより（Ｂ）で確認された。
【図５】高レベルのｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ細胞。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞を低（Ｌ）、中（Ｍ）及び高（Ｈ）発現集団にＦＡＣＳ分類した。Ａ：細胞を３６時間血清飢餓させた後溶解し、ｄｅ２−７発現（Ｃ１３）及びｄｅ２−７ ＥＧＦＲのチロシンリン酸化（４Ｇ１０）についてイムノブロッティングにより分析した。リン酸化レベルはｄｅ２−７ ＥＧＦＲと相関していた。Ｂ：増殖曲線を作成するために、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に１×１０６個の細胞を注入することにより親Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ−Ｌ、Ｕ８７ＭＧ−Ｍ及びＵ８７ＭＧ−Ｈ異種移植片を樹立させた。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。Ｃ：（Ｂ）からの腫瘍をｄｅ２−７ ＥＧＦＲ（Ｃ１３）の発現についてイムノブロッティングにより分析した。Ｄ：Ｕ８７ＭＧ−Ｈ異種移植片を有するマウスを１ｍｇのｍＡｂ５２８またはｍＡｂ８０６を用いて週２回、３週間（４、６、８、１１、１３及び１５日目に）治療した。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図６】Ａ〜Ｃは、ＮＲ６．Δ２−７異種移植片のＥＧＦＲ特異的抗体を用いる治療。ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に３×１０６個の細胞を注入することにより異種移植片を樹立させた。異種移植片の平均容積が約１００ｍｍ３に達したら抗体治療を開始した。マウスを１ｍｇのｍＡｂ８０６（Ａ）またはｍＡｂ５２８（Ｂ）を用いて週３回、２週間（２２、２５、２９、３２、３６及び３９日目に）、またはｍＡｂ５２８（Ｃ）を用いて週２回、３週間（２７、３０、３４、３７、４１及び４４日目に）治療した。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図７】Ａ〜Ｃは、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲとＳｒｃの相互作用。（Ａ）細胞を一晩血清飢餓させた後、１０μＭ ＰＰ１またはＰＰ２、或いはビヒクル（ＤＭＳＯ）を用いて３０分間または２４時間治療し、次いでｍＡｂ５２８、ｍＡｂ８０６、または無関係のアイソタイプ対照を用いて免疫沈降させた。イムノブロッティングをＥＧＦＲのＹ８４５に対して特異的な抗体を用いて実施し、全ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを家兎ｃ末端ポリクローナル抗体を用いて可視化した。示した結果は４つの独立した実験の代表例である。（Ｂ）増殖曲線を作成するために、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に１×１０６個の細胞を注入することによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７ベクター対照及びＵ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ異種移植片を樹立させた。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。（Ｃ）ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に３×１０６個の細胞を注入することによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ異種移植片を樹立させた。異種移植片の平均容積が約１００ｍｍ３に達したら抗体治療を開始した。マウスを１ｍｇのｍＡｂ８０６を用いて週３回、２週間（１８、２０、２２、２５、２７及び２９日目に）治療した。データは平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図８】Ａ及びＢは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞における内部移行したｍＡｂ８０６−Ｃｙ３とＥＥＡｌまたはｌｇｐ−１２０の共局在。（Ａ）カバーグラス上に接種した細胞をｍＡｂ８０６−Ｃｙ３（赤色）と４℃（０分）でプレインキュベートした。３７℃で１０、２０及び３０分間インキュベートすることにより内部移行を刺激した。細胞を固定し、透過化処理した後、抗ＥＥＡ１及びＣｙ２コンジュゲートしたロバ抗マウス抗体を用いて順次染色した（緑色）。共局在は合併像に黄色で示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）細胞にＧＦＰを標識したｌｇｐ−１２０（ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰ；緑色）を一時的にトランスフェクトした。ポジティブにトランスフェクトされた細胞をｌｇｐ−１２０−ＧＦＰパネルに緑色アローヘッドにより示す。トランスフェクトした後、細胞を４℃でｍＡｂ８０６−ｃｙ３とインキュベートした（赤色；０分）後、３７℃で３０、６０及び１２０分間インキュベートすることにより内部移行を誘導した。その後、サンプルを固定し、ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３とｌｇｐ−１２０−ＧＦＰの共局在を合併像（白色矢）において黄色の存在により示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図９】Ａ〜Ｆは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞においてｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合させた後のクラスリン媒介エンドサイトーシス及びｍＡｂ８０６の細胞内輸送の電子顕微鏡分析。金粒子（ｍＡｂ８０６−Ａｕ；アローヘッド）は、５分間の内部移行の誘導後クラスリン被覆ピット（Ａ−Ｂ）及び小胞（Ｃ）において容易に検出された。小窩に似た構造中には金粒子は存在していなかった（白抜きアローヘッド）（Ｄ）。１０〜１５分間内部移行後、金粒子が初期エンドソームに似た管状小胞構造において検出された（Ｅ）。長時間内部移行させた後、金粒子は多胞体において見られた（Ｆ）。スケールバー＝１０μｍ。
【図１０】ＮＲ６．Δ２−７細胞におけるｍＡｂ８０６及びｍＡｂ５２８の内部移行。細胞を４℃（０分）でｍＡｂ８０６−Ｃｙ３（左パネル）またはｍＡｂ５２８−Ｃｙ３（右パネル）とプレインキュベートした後、内部移行を誘導するために３７℃で異なる時間インキュベートした。３７℃での１５、３０及び６０分間のインキュベーションを表す像を示す。内部移行前の両抗体での染色は細胞間の膜接合（青色アローヘッド）及びフォーカルアドヒージョン（赤色アローヘッド）に関連しているが、幾つかの細胞は殆ど膜染色を示さなかった（黄色アローヘッド）。後に内部移行した抗体を白色矢印で示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図１１】ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ変異体と他の細胞成分の相互作用の概略図。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲは活性キナーゼを有しており、よって自動リン酸化、トランスリン酸化し得、または他のキナーゼによるリン酸化の標的であり得る。対照的に、デッドキナーゼｄｅ２−７ ＥＧＦＲはリン酸化の標的にすぎない。最後に、ＤＹ５構築物はリン酸化の標的であり得、ｗｔ ＥＧＦＲのような他の細胞標的をトランスリン酸化し得る。ｍＡｂ５２８及び８０６の両方はＵ８７ＭＧ．ＤＹ５異種移植片を抑制するが、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片を抑制し得ないと仮定すると、これらの抗体が他の細胞成分のリン酸化を予防する能力が抗腫瘍活性にとって重要であると示唆される。
【図１２】Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ｓｒｃ異種移植片のｍＡｂ８０６及びダサチニブの単独または組合せでの治療。ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に１×１０６個の細胞を注入することによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７ｓｒｃ異種移植片を樹立させた。異種移植片の平均容積が約８０ｍｍ３に達したら治療を開始した。マウスはビヒクル（ｄＨ２Ｏ中４％ ＤＭＳＯ）、ＰＢＳ中１ｍｇのｍＡｂ８０６、ｄＨ２Ｏ中４％ ＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｋｇ−１のダサチニブ、または両方の組合せを用いて週３回、指定した日にちで２週間治療した。データを平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。３３日目に、組合せ治療群はｍＡｂ８０６単独で治療した群に比して有意に小さかった（ｐ＜０．００７６）。
【図１３】Ｕ８７ＭＧΔ２−７ｓｒｃ異種移植片のｍＡｂ８０６及びダサチニブの単独または組合せでの治療。上記実験からのデータをカプラン−マイヤ−生存曲線に変換し、瀕死の、すなわち＞１５００ｍｍ３の腫瘍容積のデュアルエンドポイントを用いるウィルコクソン分析により分析した。組合せ群は他の群よりも長く生存した。ログランクｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明によれば、当業界の技術の範囲内の一般的な分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術が使用され得る。これらの技術は文献に詳しく説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）］；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（１９９４））］；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）］；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照されたい。
【００２６】
従って、本明細書中に現れたなら、以下の用語は下記する定義を有している。
【００２７】
用語「抗体」は、天然で産生されるか或いは部分的または完全に合成されるかにかかわらず免疫グロブリンを指す。抗体には、抗体及びそのフラグメントを含めた特異的エピトープを結合する免疫グロブリンが含まれる。この用語はポリクローナル、モノクローナル、組換え、ヒト化及びキメラ抗体を包含する。この用語は、抗体結合ドメインであるかまたは抗体結合ドメインと相同である結合ドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質をも包含する。ＣＤＲグラフト化抗体もこの用語に包含される。
【００２８】
抗体は多数の方法で修飾され得るように、用語「抗体」は、所要の特異性を有する結合ドメインを有する特異的結合メンバーまたは物質を包含すると解釈されるべきである。よって、この用語は、天然で産生されるか或いは部分的または完全に合成されるかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含むポリペプチドを含めて抗体の抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能均等物及びホモログを包含する。従って、別のポリペプチドに融合している免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子または均等物が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は欧州特許出願公開第０１２０６９４号明細書及び同第０１２５０２３号、並びに米国特許第４，８１６，３９７号明細書及び同第４，８１６，５６７号明細書に記載されている。
【００２９】
完全抗体のフラグメントが結合抗原の機能を発揮し得ることが判明した。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨｌドメインから構成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨｌドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインから構成されるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂフラグメントからなる二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが会合して抗原結合部位が形成され得るように２つのドメインがリンカーにより連結されている単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；（ｖｉｉｉ）多価抗体フラグメント（ｓｃＦｖダイマー、トリマー及び／またはテトラマー（Ｐｏｗｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４２：１９３−２０４ ９（２０００））；（ｉｘ）二重特異性単鎖Ｆｖダイマー（国際特許出願第ＵＳ９２／０９９６５号明細書）；及び（ｘ）遺伝子融合物により構築される多価または多重特異性フラグメントである“二重特異性抗体”（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３））である。
【００３０】
「抗体結合部位」は、特異的に抗原を結合する軽鎖または重鎖の可変及び超可変領域からなる抗体分子の構造部分である。
【００３１】
本明細書中で使用されているいろいろな文法的で形のフレーズ「抗体分子」は、インタクトな免疫グロブリン及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を意味する。
【００３２】
抗体分子の例は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、及び本明細書に記載されている治療方法で使用するのに好ましいパラトープを含む免疫グロブリン分子の部分であり、これらの部分にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）として当業界で公知の部分が含まれる。
【００３３】
抗体は、その抗体の１つの結合ドメインが本発明の特異的結合ドメインであり、他の結合ドメインが例えばエフェクター機能等を補強するような別の特異性を有している二重特異性であってもよい。本発明の二重特異性抗体には、その抗体の１つの結合ドメインが本発明の特異的結合ドメインまたはそのフラグメントであり、他の結合ドメインが別個の抗体またはそのフラグメントであるものが含まれ、前記した別個の抗体には抗ＥＧＦＲ抗体、例えば抗体５２８（米国特許第４，９４３，５３３号明細書）、キメラ及びヒト化２２５抗体（米国特許第４，９４３，５３３号明細書及び国際公開第９６４０２１０号パンフレット）、抗ｄｅ２−７抗体、例えばＤＨ８．３（Ｈｉｌｌｓ，Ｄ．ら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６３（４）：５３７−５４３）、抗体Ｌ８Ａ４及びＹ１０（Ｒｅｉｓｔ，ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（１９）：４３７５−４３８２；Ｆｏｕｌｏｎ ＣＦら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０（１６）：４４５３−４４６０），ＩＣＲ６２（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ Ｈら（１９９３）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｊａｎ−Ｊｕｎ；２２（１−３）：１２９−４６；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら（２００２）Ｐ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｒ．，５５（１４）：３１４０−３１４８）、またはＷｉｋｓｔｒａｎｄらの抗体（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ Ｃ．ら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（１４）：３１４０−３１４８）が含まれる。他の結合ドメインは中性または膠細胞特異的抗体の場合のように特定細胞型を認識するまたは標的とする抗体であり得る。本発明の二重特異性抗体では、本発明の抗体の１つの結合ドメインは、特定の細胞受容体を認識する及び／または細胞を特定の様式でモジュレートする他の結合ドメインまたは分子、例えば免疫モジュレーター（例えば、インターロイキン、成長モジュレーターまたはサイトカイン（例：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、具体的には全文を本明細書中に組み入れる２００２年２月１３日出願の米国特許出願第６０／３５５，８３８号明細書に示されているＴＮＦ二重特異性モダリティー）、毒素（例えば、リシン）、または抗−有糸分裂またはアポトーシス物質または因子と組み合わされ得る。
【００３４】
抗体分子のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２部分は、公知の方法により実質的にインタクトな抗体分子に対してパパイン及びペプシンをタンパク質分解反応することにより生成され得る。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓらの米国特許第４，３４２，５６６号明細書を参照されたい。Ｆａｂ’抗体分子部分も公知であり、Ｆ（ａｂ’）２部分から２つの重鎖部分を連結するジスルフィド結合をメルカプトエタノールを用いて還元し、生じたタンパク質メルカプタンを試薬（例えば、ヨードアセトアミド）を用いてアルキル化することにより生成される。本発明では、インタクトな抗体を含む抗体が好ましい。
【００３５】
いろいろな文法の形のフレーズ「モノクローナル抗体」は、特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合部位の化学種を１つしか有していない抗体を指す。よって、モノクローナル抗体は典型的には免疫反応する抗原に対して単一の結合アフィニティーを示す。モノクローナル抗体は、各々が別々の抗原に対して免疫特異性である抗体結合部位を複数有する抗体分子、例えば二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体をも含み得る。
【００３６】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部または全部に対して特異的に結合し、相補的である領域を含む抗体の一部を指す。抗原が大きい場合には、抗体はエピトープと称される抗原の特定部分のみにしか結合し得ない。抗原結合ドメインは１つ以上の抗体可変ドメインにより与えられ得る。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）からなる。
【００３７】
用語「ｍＡｂ８０６」、「８０６抗体」、「モノクローナル抗体８０６」、「ｃｈ８０６」、「ヒト化８０６」及び具体的にリストされていない変異体は本明細書中で互換可能に使用されており、明細書及び請求の範囲を通じて使用されているとき を指す。従って、組換え、キメラ、遺伝子組換えまたは代替抗体を含めて実質的に均等なまたは改変した活性を示す抗体も考えられる。これらの修飾は例えば部位特異的突然変異により得られる修飾のような故意であっても、抗体またはそのフラグメントの産生株である宿主での突然変異により得られるような偶然であってもよい。同様に、用語「ｍＡｂ８０６」、「８０６抗体」、「モノクローナル抗体８０６」、「ｃｈ８０６」、「ヒト化８０６」はその範囲に本明細書中に具体的に記載されている、当業者に公知である、公表されているタンパク質及び免疫グロブリン、並びにすべての実質的に相同のアナログ及びアレリック変異体を含むと意図される。その世代を含めたｍＡｂ８０６抗体、特定活性、アミノ酸及び核酸配列、抗原結合ドメイン、可変領域配列は国際公開第０２／０９２７７１号明細書；Ｌｕｗｏｒ ＲＢら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６１：５３５５−５３６１；Ｍｉｓｈｉｍａ Ｋら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６１：５３４９−５３５４；Ｊｏｈｎｓ ＴＧら（２００２）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９８：３９８−４０８；Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ ＡＡら（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１００（２）：６３９−６４４に開示されており、当業者に公知である。各文献の全部は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３８】
公表されており、当業者に公知のｍＡｂ８０６抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ抗体、その抗原結合ドメインまたはその活性フラグメントをコードするが、公知のｍＡｂ８０６配列に縮重される有効な抗ＥＧＦＲ抗体、特にｍＡｂ８０６及びｃｈ８０６を含めた有効な抗ＥＧＦＲ抗体をコード化及び／または発現するＤＮＡ配列が本発明の方法で使用するための組成物の範囲内に入ると考えられるべきである。「縮重」とは、具体的アミノ酸を特定するために異なる３文字コドンが使用されることを意味する。
【００３９】
フレーズ「ｓｒｃ阻害剤」は、ｓｒｃの発現または活性を低下させる、特にＥＧＦＲ上のｓｒｃリン酸化部位のリン酸化を低下させる、またはｓｒｃキナーゼカスケードのシグナルを減少させるモジュレーターを意図し、含まれる。モジュレーターには化合物、ペプチド、抗体、または他の物質等が含まれ得る。モジュレーターにはキナーゼ阻害剤、ホスファターゼ等が含まれ得る。
【００４０】
数個のｓｒｃの小分子阻害剤が公知であり、幾つか、例えばダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］− ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＤ１６６３２６が臨床トライアルに入っている。
【００４１】
フレーズ「医薬的に許容され得る」は、生理的に許容され得、ヒトに投与したとき典型的にはアレルギーまたは類似の不適当な反応（例えば、胃の不調、めまい等）を生じない分子及び組成物を指す。
【００４２】
フレーズ「治療有効量」は、標的細胞塊のＳ相活性の臨床上有意な変化、或いは標的細胞塊または腫瘍のサイズまたは寸法の有意な変化、または存在及び活性を伴うことがあるような他の病理学的特徴を予防する、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましく少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％減少させるのに十分な量を意味するように本明細書中で使用されている。
【００４３】
抗体または活性フラグメントは、中和された医薬的に許容され得る塩の形態として治療用組成物中に配合され得る。医薬的に許容され得る塩には、（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基を用いて形成される）酸付加塩、及び無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等）を用いて形成される酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基から形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等）からも誘導され得る。
【００４４】
治療用抗体または活性フラグメントを含有する組成物は例えば単位用量を注射するように従来通り静脈内に投与される。本発明の治療用組成物を言及して使用されるとき、用語「単位用量」は、ヒトに対する１回用量として適した物理的にバラバラの単位を指し、各単位は所望の治療効果が生ずるように計算された所定量の活性物質を必要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと一緒に含んでいる。
【００４５】
組成物は用量及び製剤に適合する方法で治療有効量投与される。投与量は治療対象の被験者、その被験者の免疫系の活性成分を利用する能力、及び標的とされる腫瘍塊の所望の抑制度または程度に依存する。投与するのに必要な活性成分の正確な量は担当医の判断に依存し、各個人に固有である。しかしながら、適当な用量は約０．１〜２０ｍｇ、好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ、より好ましくは１〜数ｍｇ−活性成分／ｋｇ−個人の体重／日の範囲であり得、投与ルートに依存する。初期投与及び追加投与のための適当なレジメも変更可能であるが、典型的には初期投与後、１時間以上の間隔で注射または他の投与により繰り返し投与する。或いは、血液中に１０ナノモル〜１０マイクロモルの濃度を維持するのに十分な連続静脈注射も考えられる。
【００４６】
本明細書中で使用されている「ｐｇ」はピコグラムを意味する。「ｎｇ」はナノグラムを意味する。「ｕｇ」または「μｇ」はマイクログラムを意味する。「ｍｇ」はミリグラムを意味する。「ｕｌ」または「μｌ」はマイクロリッターを意味する。「ｍｌ」はミリリッターを意味する。「ｌ」はリッターを意味する。
【００４７】
よって、抗ＥＧＦＲ抗体、特にｍＡｂ８０６の抗腫瘍活性を立証することにより治療及び診断用途並びに方法が提供され、発案された。以前に示唆され、本明細書で更に詳記されているように、本発明は、キナーゼドメイン突然変異、一次的及び二次的耐性突然変異を含めたＥＧＦＲ突然変異に関連する腫瘍形成能をモジュレートするためにＥＧＦＲが関与する反応及びシグナル伝達のカスケードにおける医薬的介入を考えている。
【００４８】
本発明は更に、哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を投与することを含む前記哺乳動物におけるＥＧＦＲ媒介性癌の治療方法を提供する。１つの態様では、ｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時に投与する。１つの態様では、一般的な化学療法の前またはその後にｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時にまたは順次繰り返し投与する。
【００４９】
本発明の方法において抗ＥＧＦＲ抗体、特にｍＡｂ８０６は単独で投与しても、他の抗ＥＧＦＲ抗体と一緒に投与してもよい。ＭＡｂ８０６をセツキマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ）、ＤＨ８．３、Ｌ８Ａ４を含めた他の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体及び／またはその活性フラグメンと連続してまたは一緒に投与してもよい。本発明の方法において、ｓｒｃ阻害剤は単独で投与しても、１つ以上の抗ＥＧＦＲ抗体と一緒に投与してもよく、場合によっては１つ以上のｓｒｃ阻害剤を投与してもよい。
【００５０】
抗ＥＧＦＲ抗体は適当な担体と一緒に、患者に対していろいろな手段により投与するために有効な濃度で医薬組成物中に配合され得る。各種の投与技術が利用され得、その中には皮下、静脈内及び腹腔内注射、カテーテル法等のような非経口技術が含まれる。抗体またはその活性フラグメントの量は変更可能であり、本明細書中に記載されている結果及びデータの考慮を含めて資格のある医師または獣医師の推奨及び処方に基づいていなければならない。
【００５１】
ｓｒｃ阻害剤は適当な担体と一緒に、患者に対していろいろな手段により投与するために有効な濃度で医薬組成物中に配合され得る。各種の投与技術が利用され得、その中には皮下、筋肉内、静脈内及び腹腔内注射、カテーテル法等のような非経口技術及び／または経口投与または経皮投与もしくは適用が含まれる。ｓｒｃ阻害剤の量は変更可能であり、特に本明細書中に記載されている結果及びデータの考慮を含めて資格のある医師または獣医師の推奨及び処方に基づいていなければならない。１つ以上の抗ＥＧＦＲ抗体及び１つ以上のｓｒｃ阻害剤の組合せである医薬組成物を投与に適するように製造してもよい。
【００５２】
本発明の抗体は、検出可能なまたは機能的な標識を用いて標識され得る。検出可能な標識には、同位元素３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃ及び８６Ｒｅのような放射標識が含まれるが、これらに限定されない。これらの放射標識は抗体イメージングの分野で公知の一般的な化学を用いて本発明の抗体に結合され得る。標識には蛍光標識及びＭＲＩ−ＣＴイメージングのために当業界で慣用されている標識が含まれる。これらにはホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素標識も含まれる。標識には更に、特異的同族の検出可能部分に結合することにより検出され得るビオチンのような化学物質（例えば、標識アビジン）が含まれる。
【００５３】
機能的標識には、腫瘍部位を破壊させるべく腫瘍の部位を標的とするように設計されている物質が含まれる。機能的標識には、細胞毒性剤（例えば、５−フルオロウラシルまたはリシン）及び酵素（例えば、細菌性カルボキシペプチダーゼまたはニトロレダクターゼ）が含まれ、これらは腫瘍部位でブロドラッグを活性薬物に変換させることができる。
【００５４】
放射標識した抗ＥＧＦＲ抗体及びそのフラグメントはインビトロ診断技術、インビボ放射イメージング技術及び放射免疫治療において有用である。インビボイメージングの場合、本発明の特異的結合メンバーは放射性同位元素よりもイメージング剤にコンジュゲートされ得る。イメージング剤の中には、例えば抗体分子にキレート基を介して多数の常磁性イオンが充填されている磁性共鳴イメージング増強剤が含まれるが、これに限定されない。キレート基の例には、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル及びポリオキシムが含まれる。常磁性イオンの例には、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユウロピウム、ランタン、ホルミウム及びフェルビウムが含まれる。本発明の更なる態様では、放射標識した特異的結合メンバー、特に抗体及びフラグメント、とりわけラジオイムノコンジュゲートは放射免疫治療において、特に癌治療のための放射標識した抗体として使用される。更なる態様では、放射標識した特異的結合メンバー、特に抗体及びそのフラグメントは放射性免疫誘導手術技術において使用され、癌細胞、前癌細胞、腫瘍細胞及び過剰増殖性細胞を除去するための手術前、その間またはその後に前記細胞の存在及び／または位置を同定し、示し得る。
【００５５】
本発明の特異的結合メンバー、特に抗体及びそのフラグメントが他の分子または物質にコンジュゲートまたは結合されている本発明のイムノコンジュゲートまたは抗体融合タンパク質には、更に化学的アブレーション剤、毒素、イムノモジュレーター、サイトカイン、細胞毒性物質、化学療法剤または薬物にコンジュゲートされている結合メンバーが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
放射免疫療法（ＲＡＩＴ）は、各種の抗体イムノコンジュゲートを用いて臨床段階に入っており、有効性が立証されている。１３１Ｉ標識されているヒト化抗癌胎児性抗原（抗ＣＥＡ）抗体ｈＭＮ−１４は大腸癌で評価されており（Ｂｅｈｒ ＴＭら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ，９４（４Ｓｕｐｐｌ）：１３７３−８１）、９０Ｙで標識した同一抗体は甲状腺髄様癌で評価されている（Ｓｔｅｉｎ Ｒら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ，９４（１）：５１−６１）。モノクローナル抗体を用いる放射免疫療法は非ホジキンリンパ腫瘍及び膵臓癌に対して評価され、報告されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ＤＭ（２００１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ，３９（ｌ−２）：１９５−２０１；Ｇｏｌｄ ＤＶら（２００１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ，３９（１−２），１４７−５４）。特定の抗体を用いる放射免疫療法も米国特許第６，３０６，３９３号明細書及び同第６，３３１，１７５号明細書に記載されている。放射性免疫誘導手術（ＲＩＧＳ）も臨床段階に入っており、効果及び有用性が立証されており、例えば抗ＣＥＡ抗体及び腫瘍関連抗原に対する抗体が使用されている（Ｋｉｍ ＪＣら（２００２）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９７（４）：５４２−７；Ｓｃｈｎｅｅｂａｕｍ Ｓら（２００１）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ，２５（１２）：１４９５−８；Ａｖｉｔａｌ Ｓら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ，８９（８）：１６９２−８；ＭｃＩｎｔｏｓｈ ＤＧら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ，１２（４）：２８７−９４）。
【００５７】
本発明の抗体は、治療を要する患者に対して適当なルートを介して、通常血流またはＣＳＦに、または直接腫瘍部位に注入することにより投与され得る。正確な量は、抗体が診断用か治療用であるか、腫瘍の大きさ及び場所、抗体の正確な種類（全抗体、フラグメント、二重特異性抗体等かどうか）、抗体に結合させる検出可能なまたは機能性標識の種類を含めた複数の要因に依存する。治療のために放射性核種を使用する場合には、適当な１回用量は最大約４５ｍＣｉ／ｍ２〜最大約２５０ｍＣｉ／ｍ２である。好ましい用量は１５〜４０ｍＣｉの範囲である。更に好ましい用量範囲は２０〜３０ｍＣｉまたは１０〜３０ｍＣｉである。前記治療は骨髄または幹細胞置換を必要とすることがある。腫瘍イメージングまたは腫瘍治療のために典型的な抗体用量は０．５〜４０ｍｇ、好ましくは１〜４ｍｇのＦ（ａｂ’）２形態の抗体の範囲である。１回投与あたり２０〜１０００ｍｇタンパク質、２０〜５００ｍｇのタンパク質、または２０〜１００ｍｇのタンパク質の用量で裸の抗体を投与することが好ましい。これは、成人患者に対する１回治療あたりの用量であり、幼児及び小児に対しては比例して調節され得、他の抗体フォーマットの場合には分子量に比例しても調節され得る。医師の裁量で治療を毎日、１週間に２回、毎週または毎月の間隔で繰り返してもよい。ｓｒｃ阻害剤の用量及び投与は医師または他の当業者により決定され、変更され得る。
【００５８】
本発明は以下の非限定的実施例を参照することにより更に理解されるであろう。これらの実施例は本発明の例示として与えられている。以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を更に十分に説明するために提示されており、決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【実施例１】
【００５９】
ＥＧＦＲ特異的抗体の有効性はＳＲＣを不活化及び抑制すると高まる
ＥＧＦＲに対する治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の有効性に影響を及ぼす要因は余り知られていないままであり、特に神経膠腫ではそうである。２つのＥＧＦＲ特異的ｍＡｂ（ｍＡｂ８０６及び５２８）の有効性をＥＧＦＲ変異体を発現するＵ８７ＭＧ由来神経膠腫異種移植片に対して調べた。このアプローチを使用すると、遺伝的背景を一定に維持しながらＥＧＦＲの形態を変化させることができた。これらの変異体には、神経膠腫で発現されるＥＧＦＲの構成的に活性な突然変異であるｄｅ２−７ ＥＧＦＲ（または、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）が含まれる。
【００６０】
ｍＡｂの有効性はＥＧＦＲ数に相関していたが、最も重要な要因は受容体活性化であった。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ異種移植片は治療に応答したが、デッドキナーゼｄｅ２−７ ＥＧＦＲを示すＵ８７ＭＧ異種移植片は難治性であった。キナーゼ活性であったが、自動リン酸化欠乏であった修飾ｄｅ２−７ ＥＧＦＲも応答した。このことから、これらのｍＡｂはトランスリン酸化を阻止することによりｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現異種移植片において機能することが示唆された。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現Ｕ８７ＭＧ異種移植片はｗｔ ＥＧＦＲを共発現するので、ｍＡｂの有効性を単離状態でｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現したＮＲ６異種移植片に対しても試験した。ｍＡｂ８０６はＮＲ６異種移植片に対して抗腫瘍活性を示したが、ｍＡｂ５２８治療は有効でなかった。このことから、ｍＡｂ５２８はｄｅ２−７とｗｔ ＥＧＦＲの相互作用を壊すことによりその抗腫瘍活性を媒介することが示唆された。
【００６１】
最後に、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ異種移植片におけるＳｒｃの遺伝子破壊はｍＡｂ８０６の有効性を劇的に高めた。神経膠腫におけるＥＧＦＲ特異的抗体の効果的使用は活性化ＥＧＦＲを有する腫瘍の同定に依存している。ＥＧＦＲとＳｒｃ阻害剤の組合せは神経膠腫の治療に対して新しく有効な戦略を提供する。
【００６２】
背景
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は固有のチロシンキナーゼ活性を有する貫膜糖タンパク質である。ＥＧＦＲの過剰発現は多くの上皮腫瘍で観察され、しばしば悪い臨床予後に関連している（１〜３）。ＥＧＦＲの過剰発現はＥＧＦＲ遺伝子増幅、特に神経膠腫でのＥＧＦＲ遺伝子増幅により生じ得る（４）。神経膠腫では、遺伝子増幅は、コード配列のエキソン２〜７の範囲の８０１塩基対のインフレーム欠失を特徴とするｄｅ２−７ ＥＧＦＲ（またはＥＧＦＲｖＩＩＩ）の最も一般的な突然変異を有するＥＧＦＲ転位に関連している（４〜６）。この転位により、細胞外ドメインから２６７アミノ酸が欠失し、融合部位に新しいグリシンが挿入され、合わせてユニークな接合ペプチドが生ずる。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲは公知のリガンドに結合できないが、受容体は低レベルの構成的活性化を示し、神経膠腫及び乳癌異種移植片の増殖を高めることができる（７、８）。
【００６３】
ＥＧＦＲを抑制することは、新しい癌治療を開発するための合理的な戦略である。考えられる治療には、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、Ｃ２２５、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ ５５９００）（９〜１１）及びＥＧＦＲの低分子量チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）（例えば、ＺＤ１８３９、ＯＳＩ ７７４）（１２）が含まれる。実際、これらの治療薬の幾つかは肺癌（ＺＤｌ ８３９、イレッサ）及び結腸癌（Ｃ２２５、エルビタックス）の限定的な臨床的使用に対して容認されている。これらの臨床トライアルから、ＥＧＦＲに対してポジティブなすべての患者がこれらの標的治療に応答するとは限らないことがきわめて明白である（表１）。患者をＥＧＦＲ治療に対して感受性とする要因を決定することが患者の福祉及び経済の点から重要な目標である。また、ＥＧＦＲ治療に対する耐性の種類を理解すると、前記耐性を解消するためのアプローチを同定する助けとなり得る。
【００６４】
【表１】
【００６５】
ＥＧＦＲ標的ＴＫＩに対して耐性／感受性を引き起こすメカニズムは広く研究されてきたが、抗ＥＧＦＲ抗体の有効性に影響を及ぼす要因は余り知られていないままである（表１参照）。ＴＫＩに関する研究から幾つかの一般論が引き出され得る。第一に、ＴＫＩによる阻害に対する細胞株の感受性は増えている細胞表面ＥＧＦＲと相関しており（表１）、このことから阻害在を機能させるにはＥＧＦＲ発現の若干の固有レベルが必要であることが示唆される。第二に、ＥＧＦＲ不活化後ＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ経路によりシグナル伝達を持続させる能力によりＴＫＩの有効性が低下する（表１）。これらの研究の大多数はインビトロで実施されており、これらの知見がインビボ設定でも当てはまるかどうかは分からない。最近、多数の研究でイレッサ（ＺＤ１８３９）で治療した肺癌患者におけるＥＧＦＲ遺伝子の状態を分析しており、治療に応答した患者は多くの場合キナーゼドメインにおける機能突然変異の増加を有していたことを知見した（表１）。更に、イレッサ耐性を導く二次キナーゼ突然変異も記載されている（表１）。しかしながら、最初の研究から、これらの知見が一般的でなく、肺患者で見られた突然変異は他の腫瘍型では観察されないと示唆される。
【００６６】
抗ＥＧＦＲ抗体を用いた限定数の研究から、該抗体に対する感受性に関する一般論を引き出すことは難しい（表１）。インビボ研究がないことに加えて、感受性研究の多くが細胞パネルを用いてなされており、そのため細胞株の間のシグナル伝達経路の変化及び他のＥｒｂＢファミリーメンバーの存在または不在を仮定すると、ＥＧＦＲ感受性または耐性に関連する単一要因を同定することが困難となる。これらの問題の幾つかを解決するために、我々は中程度レベルの野生型（ｗｔ）ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞株の２つのＥＧＦＲ特異的抗体に対するインビボ感受性を試験した。その後、我々は、受容体の数及び活性化が抗体治療に対する感受性に対してどのような影響を有するかを調べるためにＵ８７ＭＧ細胞に各種のｗｔ及びｄｅ２−７ ＥＧＦＲ構築物をトランスフェクトさせた。
【００６７】
本研究で使用した２つの抗体はｍＡｂ８０６及び５２８であった。ＭＡｂ８０６は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞に対して産生させた新規な抗ＥＧＦＲ特異的抗体である（１３）。興味深いことに、ｍＡｂ８０６は明らかにｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合するが、受容体を過剰発現する細胞の表面で発現するｗｔ ＥＧＦＲの部分集合にも結合する（１３）。最近の分析から、ｍＡｂ８０６エピトープは受容体が不活性状態から活性状態に移動すると一時的に存在するＥＧＦＲのコンホメーション形態においてのみ露出していることが判明した（１４）。ｗｔ ＥＧＦＲとは異なり、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲは構成的にこの移行コンホメーション状態にあり、よってｍＡｂ８０６結合のために利用され得る。我々の以前の研究から、ｄｅ２−７を発現するかまたはｗｔ ＥＧＦＲを過剰発現する異種移植片をｍＡｂ８０６で治療すると腫瘍増殖が有意に抑制されることが判明している（１５〜１７）。５２８抗体はＣ２２５抗体（エルビタックス）のマウスバージョンと同時に産生、単離され、非常に類似した特性を示している（１８）。ＭＡｂ５２８はリガンドアンタゴニストとして作用し、異種移植片として増殖させたときインビトロ及びインビボの両方でＥＧＦＲ発現細胞の増殖を抑制する（１８）。
【００６８】
材料及び方法
（細胞株及びモノクローナル抗体）
Ｕ８７ＭＧトランスフェクト細胞株Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔ、Ｕ８７ＭＧ．ＤＹ５及びＵ８７ＭＧ．ＤＹ２は他のところにも詳細に記載されている（１６、１９）。Ａ４３１細胞株も既に記載されている（２０）。すべての細胞株をＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；ニューヨーク州グランド・アイランドに所在のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、または１０％ ＦＣＳ（豪州ビクトリア州メルボルンに所在のＣＳＬ）、２ｍＭ グルタミン（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ニューヨーク州グランド・アイランドに所在のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含有しているＲＰＭＩにおいて維持した。加えて、トランスフェクト細胞株を４００ｍｇ／ｍｌのジェネテシン（豪州ビクトリア州メルボルンに所在のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において維持した。
【００６９】
ｍＡｂ８０６及び５２８をＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（豪州メルボルンに所在のＬｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）において作製し、精製した。ＥＧＦＲの特異的チロシンリン酸化部位に対する抗体及び家兎ポリクローナル抗ＥＧＦＲ抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州ダンバースに所在）から入手した。Ｓｒｃは、マウスモノクローナル抗体ｖ−Ｓｒｃ ３２７（米国カリフォルニア州に所在のＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）またはｃ−Ｓｒｃ Ｈ−１２（米国カリフォルニア州に所在のＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を用いて検出した。ホスホ−Ｓｒｃを検出するためには家兎ポリクローナル抗体ＰＹ４１８（米国カリフォルニア州に所在のＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を使用した。抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０はＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ニューヨーク州レイク・プラシッドに所在）から購入した。野生型及び末端切断型ＥＧＦＲの両方を検出するために使用されるＣ１３はＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（カリフォルニア州サンジェゴに所在）から入手した。
【００７０】
（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ細胞株の作製）
ドミナントネガティブな（ＤＮ）キナーゼデッドＳｒｃ構築物（Ｋ２９６Ｒ／Ｙ５２８Ｆ）はＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国ニューヨーク州レイク・プラシッドに所在）から入出した。ＤＮＳｒｃを含有するＨｉｎｄ ＩＩＩ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州カールズバッド所在）から入手したｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターにサブクローン化し、生じた構築物をエレクトロポレーションによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞にトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏベクターのみをトランスフェクトした第二細胞株も作製した。細胞を１ｍｌアリコートで９６ウェルプレートにおいて約２×１０４細胞／ウェルの密度でプレートアウトし、３７℃で４８時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（独国マンハイムに所在のＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加した。クローンが得られたら（約２週間後）、細胞を４００μｇ／ｍｌのジェネテシン及びハイグロマイシン中に戻した。
【００７１】
まず、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲの発現が保持されているかを確認するために、トランスフェクト細胞をＦＡＣＳ分析によりスクリーニングした。次いで、クローンを全細胞溶解または免疫沈降にかけた後、Ｓｒｃ特異的抗体（ｖ−Ｓｒｃ ３２７、ｃ−Ｓｒｃ Ｈ−１２）を用いるウェスタンブロッティングにかけた。全Ｓｒｃレベル（Ｓｒｃレベルは元の細胞株では非常に低い）の劇的な上昇を示す数個のクローンを同定し、増大させた。更に、３５Ｓ標識細胞ライゼートをｖ−Ｓｒｃ ３２７抗体を用いて免疫沈降させ、生じた沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び定量オートラジオグラフィーにかけることにより、高いＳｒｃレベルを確認した。最高レベルのＤＮＳｒｃを発現したクローンを選択し、ＤＮＳｒｃはＹ４１８位でリン酸化されていることが判明した。これは正しく折りたたまれていることを示唆している。
【００７２】
（インビトロ増殖アッセイ）
ｍＡｂ８０６及び５２８のインビトロでの抗増殖作用を既に詳記されているように調べた（１８）。簡単に説明すると、細胞を２４ウェルプレートにおいて１×１０４細胞／ウェルで０．５％ ＦＣＳを含有する培地に接種した。４日後、細胞をトリプシンを用いて除去し、血球計算器を用いてカウントした。抗体を、異種移植片内で得られたものと一致する濃度である１００μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。
【００７３】
（異種移植片モデル）
１００μｌのＰＢＳ中の腫瘍細胞（３×１０６個）を４〜６週齢の雌ヌードマウス（豪州パースに所在のＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）の両脇腹に皮下接種した。すべての研究を既報（１５、１６）されているように樹立腫瘍モデルを用いて実施した。腫瘍の平均容積が約１００ｍｍ３に達したら治療を開始した。腫瘍容積（ｍｍ３）は、式（長さ×幅２）／２（ここで、長さは最長の軸であり、幅はその軸に直角な測定値である）を用いて測定した。データは、各治療群について平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。すべてのデータをスチューデントｔ検定により有意さについて分析する。各研究において、１群あたり最低１０個の異種移植片を使用した。
【００７４】
（イムノブロッティング）
細胞を冷溶解バッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＦ、１％ トリトンＸ−１００、２００μＭ ＮａＯ３Ｖ、０．４％ Ｈ２Ｏ、及び５００μＭ ＡＥＢＳＦ，１５０ｎＭ アプロチニン，１μＭ Ｅ−６４プロテアーゼ阻害剤，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び１μＭ ロイペプチンを含有するプロテアーゼ阻害剤カクテル組１（ｐＨ７．４，カリフォルニア州サンジェゴに所在のＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中に溶解させた。ライゼートをｍＡｂ８０６または５２８を用いて免疫沈降させ、生じた沈降物を我々が詳細に記載しているように（２１）イムノブロッティングにより分析した。
【００７５】
（免疫蛍光顕微鏡検査）
ＭＡｂ８０６及び５２８を直接Ｃｙ３モノクローナル抗体標識キット（英国バッキンガムジャーに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ Ｌｔｄ）を用いて製造業者の使用説明書に従ってシアニン３（Ｃｙ３）染料を用いて標識した。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞への結合をフローサイトメトリー分析することにより抗体の標識が成功したかを調べた。初期エンドソーム特異的抗マウス初期エンドソーム自己抗原１（ＥＥＡｌ）モノクローナル抗体はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国カリフォルニア州サンジェゴに所在）から購入した。Ｃｙ２コンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントロバ抗マウスＩｇＧ二次抗体及び非標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂフラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ阻止抗体はＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国ペンシルバニア州ウェスト・グローブに所在）から購入した。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７またはＮＲ６．Δ２−７細胞を１２ｍｍカバーガラスまたは１２ｍｍ Ｂｉｏｃｏａｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓポリ−Ｄ−リシンカバーガラス（米国マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｌａｂｗａｒｅ）上で１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びグルタメートを補充したＭＥＭ（米国ニューヨーク州グランド・アイランドに所在のＧｉｂｃｏＢＲＬ）において３７℃で増殖させた。細胞に対する抗体結合を０．２５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（米国ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の存在下で実施した。Ｃｙ３−コンジュゲートしたｍＡｂ８０６及び５２８はそれぞれ５μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの濃度で使用し、表面標識は湿潤条件下４℃で２０分間実施した。細胞を氷冷０．２５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳで３回洗浄した。個々のカバーガラスを３７℃でインキュベートすることにより表面結合抗体の内部移行を開始させた。異なる時間内部移行させた後、個々のカバーガラスを３７℃で外し、内部移行を停止させるために氷冷ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄し、４％ ＰＦＡを用いて室温で２０分間固定した。次いで、カバーガラスをＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、再蒸留水（ＤＤＷ）で洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ封入培地（米国アラバマ州バーミンガムに所在のＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてガラススライド上に載せた。サンプルを適切な波長設定で共焦点顕微鏡（日本国神奈川県に所在のニコンインステック社）を用いて分析した。共局在研究のために、細胞を０．１％ トリトンＸ−１００を用いて１分間透明化処理した。次いで、サンプルを洗浄し、すべての存在しているマウス結合部位（すなわち、内部移行したｍＡｂ８０６または５２８）をブロックするために非標識ヤギ抗マウスＦａｂフラグメントと室温で２０分間インキュベートした。次いで、サンプルをＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、抗ＥＥＡ１と室温で２０分間インキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、Ｃｙ２コンジュゲートした二次ロバ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントとインキュベートした。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−標識したリソソーム糖タンパク質１２０（ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰ）に対するＤＮＡベクターは米国コネチカット州ニュー・ヘイブンに所在のエール医科大学細胞生物学部のＩｒａ Ｍｅｌｌｍａ教授らから善意で提供された。細胞を、包埋１４ｍｍカバーガラスを含むｍａｔ−ｔｅｋガラス底マイクロウェル皿（米国マサチューセッツ州アッシュランドに所在のＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐ．）において増殖させ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（豪州ビクトリア州マルグレイヴに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商品名）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の使用説明書に従って使用して一晩トランスフェクトさせた。トランスフェクトしてから２４時間後に、４８８ｎｍの波長光で励起したとき緑色蛍光を発するポジティブにトランスフェクトされた細胞の共焦点像を撮影した。
【００７６】
結果
（インビトロ及びインビボ感受性の相関関係）
表１に記載されている研究の多くはインビトロで実施されている。ｍＡｂ及びＴＫＩ標的ＥＧＦＲ治療の両方を用いた我々の経験から、インビトロ感受性及びインビボ応答が確実には相関しないことが明らかに立証されている。実際、我々は最近インビトロでＥＧＦＲ特異的ＴＫＩ ＡＧ １４７８に対して類似の感受性を示す２つの細胞株が同一物質に対するインビボ応答の点で顕著な差があった例を発表した（２２）。Ｃ２２５について既報されている標準のインビトロ増殖抑制アッセイ及び異種移植片部位で得られる抗体濃度と一致する抗体濃度を用いて、我々はインビトロ及びインビボ抗腫瘍活性の抗体抑制の間に殆ど相関性がないことを知見した（表２）。ｍＡｂ５２も８０６もインビトロでＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞の増殖を抑制しなかったが、これらの抗体は免疫エフェクター機能と非依存性であったインビボでロバストな抗腫瘍活性を示す（図２参照）。また、たとえ１つのＥＧＦＲ標的抗体が特定細胞株においてインビトロ及びインビボで相関関係を示したとしても（例えば、Ａ４３１細胞及び異種移植片でのｍＡｂ５２８、表２）、これは別のＥＧＦＲ特異的抗体が同一細胞株において相関していることを必ずしも暗示しなかった（例えば、Ａ４３１細胞及び異種移植片におけるｍＡｂ８０６、表２）。この簡単な分析と我々の以前の所見から、ＥＧＦＲ治療に対する感受性を調べる際のインビトロアッセイの限界が明らかとなった。
【００７７】
【表２】
【００７８】
（各種形態のＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ神経膠腫異種移植片の抗体治療）
中レベルのｗｔ ＥＧＦＲを発現する親Ｕ８７ＭＧ細胞、或いは追加のｗｔ ＥＧＦＲ、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲまたはｄｅ２−７ ＥＧＦＲの各種修飾形態（図１）をトランスフェクトした同一細胞をヌードマウスに皮下注入し、腫瘍異種移植片として樹立させた。異種移植片が約１００ｍｍ３に達したら抗体治療を開始した。すべての腫瘍を１ｍｇのｍＡｂ５２８または８０６を用いて週３回、２週間治療した。この抗体治療の用量及びスケジュールは、我々の標準Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片モデルで強い抗腫瘍応答を引き出すように選択したが、さほど効率的でなく、ＥＧＦＲの各種変異体を含む他のＵ８７ＭＧ由来細胞株で見られる高い抗腫瘍活性を弱めるであろう。以下に詳細に検討するように、ｍＡｂ８０６及び５２８の抗腫瘍効果はすべてのＵ８７ＭＧ由来神経膠腫異種移植片において類似であった（図２）。
【００７９】
１．親細胞（Ｕ８７ＭＧ）：
中レベルでＥＧＦＲを発現する（〜５×１０４受容体／細胞）という事実があるにもかかわらず（１３）、いずれの抗体もＵ８７ＭＧ異種移植片の増殖を抑制しなかった。
【００８０】
２．ｗｔ ＥＧＦＲを過剰発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．ｗｔ）：
発現を増加させるために（約１×１０６受容体／細胞）Ｕ８７ＭＧ細胞にｗｔ ＥＧＦＲをトランスフェクトしても、異種移植片のインビボ増殖速度は変化しなかったが（図３Ａ）、腫瘍は両抗体に対して感受性となった。このことはｍＡｂ８０６がｗｔ ＥＧＦＲを過剰発現する細胞に優先的に結合するのでこの抗体では驚くことではないが、ｍＡｂ５２８ではやや予期せぬことであった。なぜならば、表現型の不在下で受容体の数が増加しても抗体治療に対する応答が誘発され得ると示唆されるからである。対照群を犠牲にした３１日目では、ベヒクル群における異種移植片の平均腫瘍容積が９５０ｍｍ３であったのに比してｍＡｂ５２８治療群では４５０ｍｍ３であったようにｍＡｂ５２８により誘発される抑制は有意であった（ｐ＜０．０１）。３９日目でのｍＡｂ実験の分析から、腫瘍容積がＰＢＳ群及びｍＡｂ８０６群のそれぞれで９６０ｍｍ３及び４７０ｍｍ３であったように抗体治療が異種移植片の増殖を有意に（ｐ＜０．００１）抑制したことが判明した。
【００８１】
３．ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７）：
構成的に活性であるがリガンド非依存性であるｄｅ２−７ ＥＧＦＲをトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ異種移植片の増殖も両抗体により抑制された（図２）。ｗｔ ＥＧＦＲの過剰発現とは異なり、内因性ｗｔ ＥＧＦＲの存在下でｄｅ２−７ ＥＧＦＲを過剰発現させるとＵ８７ＭＧ異種移植片に対する有意な増殖有利性が生じる（図３Ｂ）。この受容体の構成的リン酸化をイムノブロッティングにより確認した（図４）。接種後２０日目のビヒクル群の平均腫瘍容積が１１７０ｍｍ３であったのに比してｍＡｂ５２８群の平均腫瘍容積が５１０ｍｍ３であったように、ｍＡｂ５２８で治療すると腫瘍増殖が有意に（ｐ＜０．００５）抑制された。ｍＡｂ５２８の主要機能がリガンド拮抗であると推測されたと仮定すると、リガンド非依存性ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する異種移植片に対するその腫瘍活性は予期せぬことであった。よって、ｍＡｂ５２８は多分リガンドをブロックする能力とは異なる他のメカニズムによりＥＧＦＲシグナル伝達を破壊するであろう。また、これらの細胞においてｄｅ２−７ ＥＧＦＲを結合するがｗｔ ＥＧＦＲを結合しないｍＡｂ８０６は、異種移植片を発現するｄｅ２−７ ＥＧＦＲの増殖をｍＡｂ５２８と類似レベルまで抑制したようにリガンド相互作用に対する作用とは無関係に抗腫瘍活性を媒介しなければならない。ビヒクル群を抜粋した２１日目では、対照異種移植片は１５００ｍｍ３の平均腫瘍容積を有していたのに比較してｍＡｂ８０６治療群は３９０ｍｍ２であり、有意に（ｐ＜０．０００１）低かった。よって、両抗体はリガンド非依存性であるが構成的に活性な形態のＥＧＦＲを発現する神経膠腫異種移植片を抑制し得る。
【００８２】
４．ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのデッドキナーゼバージョンを発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ）：
ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのデッドキナーゼ（ＤＫ）バージョンをトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ細胞を異種移植片として親細胞と類似の速度で増殖させ（図３Ｂ）、いずれの抗体によっても容易に抑制されなかった（図２）。この受容体はシグナル伝達に関連する主要部位ではリン酸化されないが、受容体内部移行及び分解に関連する部位ではリン酸化されたままである（図４）。これらの細胞への両抗体の結合はインビトロ及びインビボでｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現細胞で見られる結合と類似している（１６）。更に、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのＤＫ変異体は１つの細胞間点突然変異しか含んでいないので、両細胞該ドメインを結合するｍＡｂ８０６及び５２８のアフィニティーは変化してはならない。この結果から、インビボでこれらの抗体により媒介される免疫エフェクター機能は抗腫瘍応答を開始するには十分でないことが立証される。更に、抗ＥＧＦＲ抗体の抗腫瘍活性は機能的キナーゼドメインを有する受容体を必要とすることが示される。
【００８３】
５．自己リン酸化に対する２つの主要部位が欠失しているｄｅ２−７ ＥＧＦＲのバージョンを発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．ＤＹ２）：
２つの主要自己リン酸化部位（チロシン１０６８及び１１７３がフェニルアラニンに変化）で自己リン酸化できないｄｅ２−７ ＥＧＦＲ構築物を発現するＵ８７ＭＧ異種移植片は、腫瘍異種移植片として増殖させたとき両抗体により有意に抑制された（ｍＡｂ５２８及び８０６のそれぞれについてｐ＜０．０１及び０．００６）（図２）。これらの所見とＵ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片に対して見られた活性の欠如とから、自己リン酸化とは反対にキナーゼ活性は抗体治療に対する応答性に相関していることが示唆される。
【００８４】
６．自己リン酸化できないｄｅ２−７ ＥＧＦＲのバージョンを発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．ＤＹ５）：
シグナル伝達に関係する５つの主要自己リン酸化部位（チロシン１１７３、１１４８、１０８６、１０６８及び９９２がフェニルアラニンに変化）で自己リン酸化できないｄｅ２−７ ＥＧＦＲ構築物を発現するＵ８７ＭＧ細胞を腫瘍異種移植片として増殖させた。この受容体はシグナル伝達に関係する主要部位ではリン酸化されないが、受容体内部移行及び分解に関連する部位ではリン酸化されたままである（図４）。ＤＹ２異種移植片で得た結果と整合して、両抗体はＤＹ５ ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ構築物を発現する異種移植片の増殖を有意に抑制した（両抗体についてｐ＜０．０００１）（図２）。この結果がやや予期せぬことと仮定して、我々はこの実験を両抗体を用いてより低い用量（注射１回あたり０．５ｍｇ対１ｍｇ）で繰り返し、再び両方の場合で腫瘍増殖が有意に抑制される結果を得た（データ示さず）。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのＤＹ５形態は下流シグナル伝達にとって不可欠であるアダプター分子を直接結合し得ないので、これらの分子の相互作用よりもむしろ活性キナーゼドメインがＥＧＦＲ特異的抗体に対する応答性につながる不可欠な要件であると示唆される。
【００８５】
（高レベルのｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ異種移植片の治療）
図２中のデータから、異種移植片がＥＧＦＲシグナル伝達に対してより依存性となるとＥＧＦＲ特異的抗体治療に対する応答がより高くなることが示唆される。従って、ＦＡＣＳソーティングを用いて、我々は非常に高レベルでｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７高）を単離した（図５Ａ）。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７高異種移植片は元のＵ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片よりもより速く増殖した（図５Ｂ）。このことから、これらの異種移植片の急速増殖は高レベルのｄｅ２−７ ＥＧＦＲに頼っていることが示唆される。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現のレベルは、異種移植片ライゼートをイムノブロッティングして調べたところインビボで保持されていた（図５Ｃ）。ｍＡｂ８０６またはｍＡｂ５２８の治療によりＵ８７ＭＧ．Δ２−７高異種移植片が有意に抑制され、これは他のＵ８７ＭＧ由来細胞株について観察されたよりも高かった（図５Ｄ）。対照群を倫理的理由で犠牲にした１８日目では、ビヒクル群、ｍＡｂ８０６及びｍＡｂ５２８群の平均腫瘍容積はそれぞれ１７６０、９０及び９０ｍｍ３であった（ｐ＜０．００１）。有意には、以前のＵ８７ＭＧ由来治療研究では完全な退縮はなかったが（図２）、ｍＡｂ８０６治療したＵ８７ＭＧ．Δ２−７高異種移植片の４０％及びｍＡｂ５２８治療したＵ８７ＭＧ．Δ２−７高異種移植片の２０％が完全に退縮した。ｍＡｂ８０６腫瘍の１つは接種から４６日目に再発したが、他の腫瘍はマウスを犠牲にした１２６日目まで再発しなかった。よって、ＥＧＦＲの構成的に活性な形態の過剰発現により誘導される異種移植片はＥＧＦＲ特異的抗体に対してより感受性である。
【００８６】
（樹立ＮＲ６由来異種移植片のｍＡｂ８０６及び５２８治療）
ＮＲ６マウス線維芽細胞株はＥｒｂＢファミリーのメンバーを内因的に発現せず（２３）、これは我々がＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３についてＦＡＣＳにより確認した所見である（データ示さず）。次いで、これらの細胞にヒトｄｅ２−７ ＥＧＦＲ（ＮＲ６．Δ２−７）をトランスフェクトした。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲに対するｍＡｂ８０６及び５２８の有効性を調べるために使用したＵ８７ＭＧ由来細胞株はすべてｗｔ ＥＧＦＲを共発現するので、我々は樹立ＮＲ６．Δ２−７異種移植片を有するマウスにおいて治療有効性を評価した。ｍＡｂ８０６治療により、接種から４２日目で非常に高かったビヒクルでの治療に比して全腫瘍増殖速度が遅くなった（Ｐ＜０．００３）（図６）。治療最終日（３９日目）の平均腫瘍容積はビヒクル治療群及びｍＡｂ８０６治療群のそれぞれで１５２０及び６７０ｍｍ３であった（図６Ａ）。
【００８７】
樹立ＮＲ６．Δ２−７異種移植片を有するマウスもｍＡｂ５２８で治療した。動物を倫理的理由で殺した接種から５６日目では、ｍＡｂ５２８で治療した腫瘍のサイズはビヒクル治療した異種移植片の腫瘍のサイズと差がなかった（図６Ｂ）。我々は、マウスに抗体を週２回、３週間与えるようにプロトコルを僅かに変更してｍＡｂ５２８を用いて第二の治療実験を実施した。この場合も、ｍＡｂ５２８がこれらの条件下で樹立ＮＲ６．Δ２−７異種移植片の増殖を抑制できなかった（図６Ｃ）。よって、ｍＡｂ８０６とは異なり、ｍＡｂ５２８はｗｔ ＥＧＦＲの非存在下でｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する異種移植片を抑制できない。
【００８８】
（Ｓｒｃ活性はｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現異種移植片の抗体治療に対する応答をモジュレートする）
ｍＡｂ８０６及び５２８はｄｅ２−７ＥＧＦＲのＤＹ５バージョンを発現する異種移植片を抑制し、またいずれの抗体もインビボで単一物質としてｄｅ２−７ ＥＧＦＲリン酸化を低下させないので（１６）、これらの抗体はｄｅ２−７ ＥＧＦＲの下流の標的のトランスリン酸化を破壊することにより抗腫瘍活性を媒介するようである。ＮＲ６．Δ２−７異種移植片を用いた我々の観察から、ｍＡｂ５２８の抗腫瘍活性はＥｒｂＢファミリーの別のメンバーとの共発現に依存性であり、ｍＡｂ８０６活性はこの相互作用と非依存性であることが示唆される。従って、ｄｅ２−７“ＥＧＦＲ”がｗｔ ＥＧＦＲの場合のようにＳｒｃと相互作用し得るか、この可能性ある相互作用がｍＡｂ８０６有効性に関連しているかを調べた。
【００８９】
ｗｔ ＥＧＦＲを活性化すると、Ｓｒｃキナーゼが一時的に活性化される。Ｓｒｃが活性化されると、相乗的に自己リン酸化部位ではなくむしくＳｒｃリン酸化に対する標的であるＥＧＦＲのチロシン８４５（Ｙ８４５）がリン酸化される（２４）。Ｙ８４５に対して特異的な抗体を用いて、我々はｄｅ２−７ ＥＧＦＲにおけるＹ８４５のリン酸化を調べた。Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞において発現させると、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲはＹ８４５のローバストなリン酸化を示した（図７Ａ）。Ｙ８４５でのリン酸化は、細胞をＳｒｃ−ファミリーキナーゼの阻害剤であるＰＰ１及びＰＰ２とインキュベートすることにより迅速に阻止されるのに対して、Ｙ１１７３での自己リン酸化部位は殆ど影響されなかった（図７Ａ）。
【００９０】
ｄｅ２−７ ＥＧＦＲはｗｔ ＥＧＦＲと同様にＳｒｃキナーゼリン酸化に対する標的であると見られると仮定して、我々はこの相互作用がｍＡｂ８０６ 活性にとって重要であったかを調べようとした。まず、我々はＹ８４５Ｆ置換を含むｄｅ２−７ ＥＧＦＲを構築したが、このタンパク質は複数の部位で少ないリン酸化を示し（Ｊｏｈｎｓ、未発表所見）、従ってこれらの研究にとって不適当であると見なされた。そこで、材料及び方法の欄に記載したように、我々はｄｅ２−７ ＥＧＦＲ及びＤＮＳｒｃを共発現するＵ８７ＭＧ細胞株（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ）を作製した。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ異種移植片をヌードマウスにおいて腫瘍異種移植片として増殖させたが、その増殖速度はベクター対照をトラクスフェクトしたＵ８７ＭＧ．Δ２−７よりも遅かった（図７Ｂ）。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃをｍＡｂ８０６で治療すると、腫瘍増殖がローバストに抑制された（図７Ｃ）。接種から３４日目で、ビヒクル群の平均異種移植片容積は１２２０ｍｍ３であったのに対して、ｍＡｂ８０６治療群では１００ｍｍ３であった（ｐ＜０．００１）（図７Ｃ）。更に、ｍＡｂ８０６治療群では、すべてのＵ８７ＭＧ．Δ２−７ＤＮＳｒｃ異種移植片の６０％が完全に退縮し、接種から５０日目まで再発しなかった。よって、Ｓｒｃシグナル伝達を抑制するとｍＡｂ８０６治療の有効性が高まる（図７Ｃ対図２）。
【００９１】
（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞におけるｍＡｂ８０６の内部移行）
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞において発現させたｄｅ２−７ ＥＧＦＲへ結合させた後のｍＡｂ８０６の細胞内輸送を共焦点顕微鏡検査により研究した。ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３を４℃でインキュベートした後３７℃で追跡する前に、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合したｍＡｂ８０６を血漿膜に沿って配置した（図８Ａ；０分間，ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３）。３７℃でインキュベートした後、小さい点状細胞質小胞へ転移させるためにｍＡｂ８０６を観察した（図８Ａ；ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３）。その後、初期エンドソームを同定する抗初期エンドソーム自己抗原１（ＥＥＡ１）を用いて免疫染色すると（図８Ａ；ＥＥＡ１）、黄色蛍光の存在により可視化されるようにｍＡｂ８０６との部分的共局在が示された（図８Ａ；合併）。３７℃で６０分間追跡したところ、共局在は最小であった（図８Ａ；合併，６０分間）。このことから、大部分の抗体が初期エンドサイトーシス区画から移動したことが示唆された。これらの所見は、ｍＡｂ８０６は内部移行後直ちに初期エンドサイトーシス区画に局在化し、その後細胞内輸送サイクルにより別の位置に移動することを示している。
【００９２】
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞におけるｄｅ２−７ ＥＧＦＲの結合及び内部移行後のｍＡｂ８０６のリソソーム局在化は、ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰを一時的にトランスフェクトした細胞の共局在化分析により実施した（図８Ｂ）。ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰをポジティブにトランスフェクトした細胞は、予期されたようにリソソーム区画への局在化に整合する細胞質核周囲緑色蛍光を示した（図８Ｂ；ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰ）。内部移行を誘導する前、ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３は細胞表面でのみ検出され（図８Ｂ；０分間，ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３）、ｌｇｐ−１２０−ＧＦＰと共局在されなかった（図８Ｂ；０分間，合併）。３７℃で３０分間加温した後、内部移行したｍＡｂ８０６に相当する小さい細胞内小胞構造が観察された（図８Ｂ；３０分間，ｍＡｂ８０６−Ｃｙ３）。これらの構造の幾つかはｌｇｐ−１２０−ＧＦＰと共局在したが、赤色及び緑色シグナルの大部分は分離したままであった（図８Ｂ；３０分間，合併）。３７℃で長く６０分間及び１２０分間インキュベートすると、内部移行したｍＡｂ８０６−Ｃｙ３及びｌｇｐ−１２０−ＧＦＰの共局在が増加した（図８Ｂ；６０〜１２０分間，合併）。これらの所見は、ｍＡｂ８０６がまず初期エンドサイトーシス区画を横断するが、時間が経つとリソソーム区画に移動し、そこで蓄積するとの仮説と一致している。
【００９３】
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞で発現したｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合後のｍＡｂ８０６の内部移行も電子顕微鏡検査により分析した。３７℃で５分間インキュベートした後、ｍＡｂ８０６に相当する金粒子がクラスリン被覆ピットに似た構造で観察された（図９Ａ及びＢ）。金粒子は細胞質内にある遊離クラスリン被覆小孔でも検出された（図９Ｃ）。カベオラに類似している構造では金粒子は観察されなかった（図９Ｄ）。３７℃で１０分間追跡したところ、ｍＡｂ８０６は初期エンドサイトーシス区画に似た大きな管状小胞構造に局在していた（図９Ｅ）。より長く３０分間追跡すると、抗体は多小胞体に似た構造に局在した（図９Ｆ）。これらの所見は、ｍＡｂ８０６とｌｇｐ−１２０の共局在を３０〜６０分間示す免疫蛍光顕微鏡検査データと一致している。
【００９４】
（ＮＲ６Δ２−７細胞におけるＭＡｂ８０６及び５２８の内部移行）
ＮＲ６．Δ２−７異種移植片に対するｍＡｂ８０６及び５２８の治療有効性の差を仮定すると、各抗体の内部移行特徴をこの細胞株で研究した。更に、ＮＲ６．Δ２−７細胞はＥｒｂＢファミリーの内因性メンバーを発現しないので、ｗｔ ＥＧＦＲの存在が抗体の内部移行のために必要であるかをこの細胞株で調べた。４℃でｍＡｂ８０６−Ｃｙ３とインキュベートした細胞は予期されたように細胞内蛍光なしに膜染色を示した（図１０；ｍＡｂ８０６，０分間）。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞（図８）とは対照的に、膜染色は均一でなかった。より強い染色は細胞間の膜結合（図１０；ｍＡｂ８０６，０分間）及びフォーカルアドヒージョン（図１０；ｍＡｂ８０６，０分間）と関連していた。幾つかの細胞では膜染色を殆ど示さなかった（図１０；ｍＡｂ８０６，０分間）。温度を３７℃まで上げることにより内部移行を誘導した後、特徴的な細胞内点状小胞構造が観察された。核周囲パターンの蓄積（図１０；ｍＡｂ５２８，１５〜６０分間）は急速なリソソーム局在化と一致している。ｍＡｂ５２８の初期局在化（図１０；ｍＡｂ５２８，０分間）及びその後の内部移行（図１０；ｍＡｂ５２８，１〜６０分間）はｍＡｂ８０６のものと同一であった。よって、両抗体は、ｗｔ ＥＧＦＲの非存在下であってもｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合後迅速にリソソーム区画に内部移行した。
【００９５】
考察
（ｍＡｂ５２８）
すべてではないが、多くの以前の研究は、細胞表面上のＥＧＦＲの数がＥＧＦＲ標的治療、特にＴＫ１の有効性に影響を及ぼす１つの要因であると示唆している（表１）。しかしながら、これらの実験は常に各種細胞株を用いて抗腫瘍活性を比較しており、よって遺伝的背景、他のＥｒｂＢファミリーメンバーの存在、及びＥＧＦＲシグナル伝達経路をモジュレートし得る他の機能的受容体／キナーゼの存在の点で管理されていない。更に、これらの研究の多くはインビトロで実施されており、我々はインビボ活性と相関していないことを知見した。ｗｔ ＥＧＦＲ数が１０倍に増加すると、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫異種移植片はｍＡｂ５２８耐性から抗体応答性に変化する。ｗｔ ＥＧＦＲの数が増加してもＵ８７ＭＧ異種移植片の増殖速度は変化しなかったので、抗腫瘍活性の出現は単に誘導増殖有利性を抑制するｍＡｂ５２８の結果でなかった。Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片内により多くのｗｔ ＥＧＦＲが存在すると、ほぼ確実に腫瘍部位での抗体局在化が増加するであろう。ｍＡｂ５２８が低いが測定可能な免疫エフェクター機能を有していると仮定すると（２５）、腫瘍部位での抗体の高いレベルにより腫瘍増殖の抑制に寄与する補体の高い沈着及び免疫細胞の補充が生じ得る。しかしながら、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片での我々のデータを仮定すると、ｍＡｂ５２８の抗腫瘍活性の開始における免疫エフェクター機能の役割はありそうもないようである。これらの異種移植片はＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片くらい多くのｍＡｂ５２８結合部位を有しているが、抗体により抑制されない。我々の興味ある可能性は、ｗｔ ＥＧＦＲが過剰発現するとリガンド非依存性ＥＧＦＲシグナル伝達がもたらされ、親Ｕ８７ＭＧは強いオートクリン−リガンドループを有していないようである）、これにより細胞はＥＧＦＲシグナル伝達系により依存するようになる。よって、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片は、親細胞株とは異なりＥＧＦＲシグナル伝達経路は活性で機能的であるのでｍＡｂ５２８治療に応答する。従って、ｗｔ ＥＧＦＲの過剰発現はＥＧＦＲシグナル伝達に対する細胞依存性の代理マーカーであり、前記細胞はＥＧＦＲ治療に対して応答する可能性が高いが、保証されない（２６）。
【００９６】
ｍＡｂ５２８のような抗体の抗腫瘍活性は主にＥＧＦＲのリガンド活性化を拮抗させる能力により媒介されると推測されてきた。ｍＡｂ５２８が有意なリガンド発現の非存在下でＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片の増殖を抑制したとの仮定から、他のメカニズムが抗腫瘍効果に寄与し得ると示唆される。更に、ｍＡｂ５２８はリガンド非依存性ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する異種移植片に対して有意な有効性を示した。この抗腫瘍活性は、いずれも同一レベルのｗｔ ＥＧＦＲを発現する親Ｕ８７ＭＧまたはＵ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片の増殖を抑制しなかったようにｍＡｂ５２８がこれらの異種移植片で共発現する内因性ｗｔ ＥＧＦＲを結合することから生じ得る。免疫エフェクター機能を除外して、代替抗腫瘍メカニズムは受容体ダウンレギュレーション、不適切なシグナル伝達の誘導、受容体の不適切な膜ドメインへの転位、及び受容体ダイマー化及び／またはオリゴマー化との干渉を含み得る。実際、ＥＧＦＲに対する幾つかのＴＫＩはキナーゼ活性を阻害することにより機能するだけでなく、予期せぬ抗腫瘍メカニズム（２７）である過剰リガンドをモッピングし得る不活性ダイマーを誘導し得る。
【００９７】
興味深いことに、Ｃ２２５に対して異なる応答を示す結腸患者におけるＥＧＦＲ発現を分析する最近の免疫組織化学的研究は、数人のＥＧＦＲ「ネガティブ」患者はこのＥＧＦＲ特異的抗体に対して臨床応答を有していたことを報告した（２６）。多分、これらの患者のＥＧＦＲレベルは、存在するＥＧＦＲを活性化し、腫瘍増殖／生存に寄与する組織化学の検出感度以下である。この所見から、単にＥＧＦＲ発現のレベル以上のものがないならばＥＧＦＲ活性化が少なくとも重要であることが示唆される。ｍＡｂ５２８がこの末端切断型受容体のデッドキナーゼバージョンを発現するＵ８７ＭＧ異種移植片（Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ）の増殖を抑制しなかったことを示す我々のデータから、ＥＧＦＲ特異的抗体の有効性がキナーゼ活性受容体に緊密に関連している所見が裏付けられる。上に示唆されているように、ＥＧＦＲ過剰発現はこの活性化が起こり得る１つのメカニズムに相当する。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのような構成的に活性な変異体の発現は別のメカニズムを示している。このようにＥＧＦＲが連続的に活性化すると、細胞はＥＧＦＲシグナル伝達に対して中毒状態になる。そのために、これらの細胞は抗ＥＧＦＲ治療に対して感受性となる。この考えは、ＥＧＦＲ特異的ＴＫＩに応答する多くの患者がＥＧＦＲキナーゼドメインに活性化突然変異を有している肺癌患者の状況に類似している（２８）。
【００９８】
ｍＡｂ５２８がＵ８７ＭＧ．ＤＹ２またはＤＹ５異種移植片の増殖を抑制する能力は、有効性の決定要因としての自己リン酸化とは対照的に活性キナーゼドメインの有意性を強調している。よって、抗体治療に対する応答を決定するのは活性キナーゼであって、リン酸化チロシンのアダプターまたはシグナル伝達分子との直接相互作用ではない。この結果に対する１つの推論は、ｍＡｂ５２８は下流標的のトランスリン酸化を防止することによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７／ＤＹ２／ＤＹ５異種移植片の増殖を見かけ上抑制することである（図１１）。これらすべてのＵ８７ＭＧ由来細胞株はｗｔ ＥＧＦＲを共発現するので、我々が最近ｄｅ２−７ ＥＧＦＲがダイマーを形成し、ｗｔ ＥＧＦＲをリン酸化することを立証したとすると（２９）、ｗｔ ＥＧＦＲは多分この第二標的に対する候補となるであろう。この説は、ｗｔ ＥＧＦＲの非存在下でｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＮＲ６細胞がｍＡｂ５２８の抗腫瘍効果に対して完全に難治性であったという事実により裏付けられる。これらの研究をまとめると、そのリガンド阻止性と合わせて、ｍＡｂ５２８は過剰発現したｗｔ ＥＧＦＲのホモダイマー化及びｗｔとｄｅ２−７ ＥＧＦＲ間のヘテロダイマー化を防止することにより部分的に機能することが示唆される。興味深いことに、ＥＧＦＲと複合化したＣ２２５（ｍＡｂ５２８に非常に類似している抗体）の構造から、リガンド阻止とは別にこの抗体はＥＧＦＲ係留解除を部分的に抑制することによりＥＧＦＲダイマー化を防止し得ることが示唆される（３０）。
【００９９】
（ｍＡｂ８０６）
インビボでのＵ８７ＭＧ由来細胞株のｍＡｂ８０６に対する応答性はｍＡｂ５２８で観察された応答性を完全に反映しており、幾つかの大きな差はあるが上記原則の多くが当てはまることが指摘される。この研究は、ｍＡｂ８０６反応性がＥＧＦＲ活性化に関連していることを立証している我々の以前の研究（１６）を確認し、敷衍させる。ｍＡｂ５２８及び臨床評価中のすべての現在の抗体とは異なり、ｍＡｂ８０６は、ＥＧＦＲ活性化が肝臓のような臓器において殆どまたは全く検出され得ないように肝臓のような正常組織を標的としない。多くの要因が腫瘍内でＥＧＦＲ活性化を刺激し得る（検討のために、（３１）を参照されたい。）。我々は、これらのうちの少なくとも３つの要因、すなわちＥＧＦＲ過剰発現（１５）、突然変異（１７）及びオートクリンループの存在（Ｊｏｈｎｓら，準備中）がｍＡｂ８０６反応性をもたらし得ることを確認した。ｍＡｂ８０６抗腫瘍活性に対するｗｔ ＥＧＦＲ過剰発現の関連性は、過剰発現がＥＧＦＲグリコシル化におけるリガンド非依存性活性化及び変化のような複数のメカニズムによりｍＡｂ８０６により認識されるＥＧＦＲの一過性の非係留形態を増加させる（２１）ようにそのユニークな特異性と均密に関連している。本明細書に記載されている研究及びＥＧＦＲ特異的ＴＫＩで得られた臨床データからＥＧＦＲ阻害剤が活性化ＥＧＦＲを有する腫瘍に対して殆ど有効であることが示唆されると仮定すると、ｍＡｂ８０６がＥＧＦＲの活性化形態を特異的に認識するユニークな能力によりｍＡｂ８０６は有利な治療薬となる
分子モデリングから、ｍＡｂ８０６結合が活性ｗｔ ＥＧＦＲダイマーの形成を予防することが示唆され（１４）、この仮説についてエピトープと複合しているｍＡｂ８０６の結晶構造を解決することにより我々は確認した（Ｊｏｈｎｓら，準備中）。このｍＡｂ８０６は異種移植片モデルにおいてｄｅ２−７またはｗｔ ＥＧＦＲのリン酸化を有意に抑制しないにもかかわらず（１６）、ｍＡｂ８０６に対する作用の提案されているメカニズムには自己リン酸化の阻止以上を含むことが強く示唆される。更に、ＥＧＦＲシグナル伝達の公知の下流標的（例えば、Ａｋｔ及びＭＡＰＫ）はｍＡｂ８０６によっても抑制されない（Ｔ．Ｇ．Ｊｏｈｎｓ，未発表の所見）。この仮定と一致して、ｍＡｂ８０６は自己リン酸化が関連しない２つのモデルであるＵ８７ＭＧ．ＤＹ２／ＤＹ５異種移植片に対してローバストな抗腫瘍活性を示した。ｍＡｂ８０６がＵ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片に対して有効でないことから、活性キナーゼの存在及びトランスリン酸化事象の存在（図１１）は感受性をもたらす重要な要因であることが強調される。ｍＡｂ５２８とは対照的に、ｍＡｂ８０６は他のＥｒｂＢファミリーメンバーの非存在下でｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するＮＲ６細胞の増殖を抑制し得た。この結果は、ｍＡｂ８０６はｗｔ ＥＧＦＲとは異なりｄｅ２−７ ＥＧＦＲトランスリン酸化の他の標的を潜在的に破壊することを示している。興味深いことに、ＮＲ６細胞において表面ｄｅ２−７ ＥＧＦＲへｍＡｂ８０６及び５２８を結合させた後の各抗体の内部移行及び細胞内輸送に明らかな差はなかった。このことから、抗体輸送がこの異種移植片モデルでの有効性の差に寄与しないことが示唆される。
【０１００】
我々はここで初めて、Ｙ８４５がＳｒｃ依存的にｄｅ２−７ ＥＧＦＲでリン酸化されることを報告している。よつて、我々はｄｅ２−７ ＥＧＦＲとＳｒｃの相互作用がｍＡｂ８０６活性の潜在的標的であったかどうかを試験した。ｍＡｂ８０６がこの相互作用を抑制することによりその抗腫瘍活性の一部を媒介したならば、この相互作用をＤＮＳｒｃを用いて遺伝的に破壊するとｍＡｂ８０６の有効性は低下せざるを得ない。この可能性とは対照的に、ＤＮＳｒｃの存在によりｍＡｂ８０６の抗腫瘍活性が劇的に強化された。このことから、ＳｒｃがＥＧＦＲ治療の有効性を制限する役割を有しており、ＳｒｃとＥＧＦＲ阻害剤の併用が合理的であることが示唆される。
【０１０１】
結論
これらの研究から、ＥＧＦＲ治療に対する細胞株の感受性を分析するためのインビボ研究の関連性が立証された。従来の研究とは異なり、我々は我々の分析の殆どを同一遺伝的背景で実施し、主要な変数をＥＧＦＲの種類とすることができた。このアプローチを用いて、我々は最終的に有効性に対する受容体数の有意差を示した。ＥＧＦＲ数はＥＧＦＲ治療感受性に関連しているが、この要因単独は受容体が機能キナーゼを含有する必要があるので十分でない。実際、やや直観的であるが、この研究は、ＥＧＦＲシグナル伝達を使用するためにｗｔ ＥＧＦＲの過剰発現または構成的に活性な変異体の発現により細胞株を強制すると、非応答性から応答性にスイッチされ得ることを形式的に示している。よって、ＥＧＦＲは細胞表面上に存在しているだけでなく、細胞の増殖及び生存に有意に関与しなければならない。従って、ＥＧＦＲ治療に応答する患者を選択するための戦略は単に受容体タンパク質の存在の有無だけでなく腫瘍がＥＧＦＲに対してかなり依存しているかを同定するように向けられなければならない。この仕事は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ遺伝子増幅またはキナーゼ活性化変異遺体が存在するような幾つかの場合には比較的進展しているが、ｗｔ ＥＧＦＲが遺伝的に正常である場合には明らかにより難しい。これらの場合、複数の受容体キナーゼの複雑な相互作用により真にＥＧＦＲシグナル伝達に依存している腫瘍を同定することが難しくなる。長い間、各受容体キナーゼにユニークなこれから同定されるであろう標的遺伝子の詳細な発現プロフィールがこの問題を解決するための唯一の実行可能なアプローチであり得る。
【０１０２】
【表３】
【実施例２】
【０１０３】
Ｓｒｃ阻害剤ダサチニブ及びｍＡｂ８０６治療の動物治療研究
抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６の単独またはｓｒｃ阻害剤ダサチニブとの組合せのインビボ効果を評価するために動物治療研究を実施した。８週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ ｎｕマウスに（１腫瘍部位あたり）１×１０６個のＵ８７ＭＧ．Δ２−７ＳＲＣ細胞を皮下注入した。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ＳＲＣ細胞は活性化Ｓｒｃ（Ｙ５２９Ｆ突然変異）及びΔ２−７変異ＥＧＦＲを発現する。右脇腹及び左脇腹の各々に前記細胞を注入することによりマウス１匹あたり２つの腫瘍を発生させた。平均腫瘍サイズが約８０ｍｍ３に達したときに治療を開始した。１群あたり４〜５匹のマウスで構成する４治療群のマウスを３回／週、２週間治療した。治療群は、（１）対照−ｌ００μｌの希釈剤４％ ＤＭＳＯ／ｄＨ２Ｏ；（２）ダサチニブ−希釈剤中に溶解させた１０ｍｇ／ｋｇの薬物；（３）ｍＡｂ８０６−ｌｍｇ；（４）ｍＡｂ８０６ ｌｍｇ及びダサチニブ １０ｍｇ／ｋｇであった。
【０１０４】
（抗体）
Ｓｒｃをマウスモノクローナル抗体ｖ−Ｓｒｃ ３２７（米国カリフォルニア州に所在のＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）またはｃ−Ｓｒｃ Ｈ−１２（米国カリフォルニア州に所在のＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を用いて検出した。ホスホ−Ｓｒｃを検出するためには家兎ポリクローナル抗体ＰＹ４１８（米国カリフォルニア州に所在のＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を使用した。
【０１０５】
（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７ｓｒｃ細胞株の構築）
活性化Ｓｒｃ構築物（Ｙ５２９Ｆ突然変異）はＵｐｓｔａｔｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州レイク・プラシッドに所在）から入手した。活性化Ｓｒｃ ｃ−ＤＮＡを含むＰｍｅｌ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州カールスバッドに所在）から入手したｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターにサブクローン化した後、エレクトロポレーションによりＵ８７ＭＧ．Δ２−７をトランスフェクトした。細胞を１ｍｌアリコートで９６ウェルプレートにおいて約２×１０４細胞／ウェルの細胞密度でプレートアウトし、３７℃で４８時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（独国マンハイムに所在のＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及び４００μｇ／ｍｌのジェネテシン（カリフォルニア州カールスバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。
【０１０６】
まず、トランスフェント細胞をＦＡＣＳ分析によりスクリーニングして、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲの発現が保持されているかを確認した。次いで、クローンを全細胞溶解または免疫沈降にかけた後、Ｓｒｃ特異的抗体（ｖ−Ｓｒｃ ３２７、ＰＹ４１８）を用いるウェスタンブロッティングにかけた。全Ｓｒｃ及びリン酸化Ｓｒｃのレベル（Ｓｒｃレベルは元の細胞株では非常に低い）の劇的な増加を示した数個のクローンを同定し、増大させた。
【０１０７】
（異種移植片モデル）
８週齢の雌ヌードマウス（豪州パースに所在のＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）の両脇腹に１００μｌのＰＢＳ中の腫瘍細胞（１×１０６個）を皮下接種した。すべての研究を上記したような樹立腫瘍モデルを用いて実施した。腫瘍の平均容積が約８０ｍｍ３に達したら治療を開始した。腫瘍容積（ｍｍ３）は、式（長さ×幅２）／２（ここで、長さは最長の軸であり、幅はその軸に直角な測定値である）を用いて求めた。データは、各治療群について平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する（図１２）。すべてのデータをスチューデントｔ検定により有意さについて分析する。データをカプラン−マイヤ−生存曲線に変換し、瀕死の、すなわち＞１５００ｍｍ３の腫瘍容積のデュアルエンドポイントを用いるウィルコクソン分析により分析した（図１３）。
【０１０８】
３３日目で、ｍＡｂ８０６とダサチニブの組合せで治療した群の腫瘍増殖はｍＡｂ８０６単独で治療した群よりも有意に小さかった（ｐ＜０．００７６）（図１２）。腫瘍増殖実験のデータをカプラン−マイヤ−生存曲線に変換し、瀕死の、すなわち＞１５００ｍｍ３の腫瘍容積のデュアルエンドポイントを用いるウィルコクソン分析により分析した（図１３）。ｍＡｂ８０６とダサチニブの組合せで治療した群はすべての他の群よりも長く生存した（ログランクｐ＜０．０００１）。
【０１０９】
本発明を本発明の趣旨または必須要件から逸脱することなく他の形態で具体化しても、または他の方法で実施してもよい。従って、本明細書の開示内容は、すべての点で例示され、限定的でないと見なされ、本発明の範囲は添付の請求の範囲により記載され、均等の意味及び範囲に入るすべての変化が本発明に包含されると意図される。
【０１１０】
本明細書を通じていろいろな文献が引用されており、各引用文献の全文は参照により本明細書に組み入れられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時に、組み合わせて、または順々に連続して投与することを含む前記哺乳動物における癌の治療方法。
【請求項２】
抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｓｒｃ阻害剤はダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｓｒｃ阻害剤はダサチニブであり、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
癌は神経膠芽腫、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、神経系の癌、消化器癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、尿生殖器癌、膀胱癌、結腸癌、メラノーマ、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍及び血液癌から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時に、組み合わせて、または順々に連続して投与することを含む前記哺乳動物におけるＥＧＦＲ媒介性癌の腫瘍増殖の阻止または縮小方法。
【請求項８】
抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｓｒｃ阻害剤はダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
阻害剤はダサチニブであり、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＧＦＲ媒介性癌は神経膠芽腫、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、神経系の癌、消化器癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、尿生殖器癌及び膀胱癌から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物に対して抗ＥＧＦＲ抗体とｓｒｃ阻害剤の組合せを投与することを含む前記哺乳動物における抗ＥＧＦＲ抗体の有効性または活性の増強方法。
【請求項１４】
ｓｒｃ阻害剤はダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗ＥＧＦＲ抗体及び１つ以上のｓｒｃ阻害剤を医薬的に許容され得る担体または希釈剤中に含む医薬組成物。
【請求項１８】
抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｓｒｃ阻害剤はダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択される請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
阻害剤はチロシンキナーゼ阻害剤である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１】
哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時に、組み合わせて、または順々に連続して投与することを含む前記哺乳動物における癌の治療方法。
【請求項２】
抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｓｒｃ阻害剤はダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｓｒｃ阻害剤はダサチニブであり、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
癌は神経膠芽腫、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、神経系の癌、消化器癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、尿生殖器癌、膀胱癌、結腸癌、メラノーマ、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍及び血液癌から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物に対してｓｒｃ阻害剤及び抗ＥＧＦＲ抗体を同時に、組み合わせて、または順々に連続して投与することを含む前記哺乳動物におけるＥＧＦＲ媒介性癌の腫瘍増殖の阻止または縮小方法。
【請求項８】
抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｓｒｃ阻害剤はダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
阻害剤はダサチニブであり、抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＧＦＲ媒介性癌は神経膠芽腫、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、神経系の癌、消化器癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、尿生殖器癌及び膀胱癌から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物に対して抗ＥＧＦＲ抗体とｓｒｃ阻害剤の組合せを投与することを含む前記哺乳動物における抗ＥＧＦＲ抗体の有効性または活性の増強方法。
【請求項１４】
ｓｒｃ阻害剤はダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗ＥＧＦＲ抗体及び１つ以上のｓｒｃ阻害剤を医薬的に許容され得る担体または希釈剤中に含む医薬組成物。
【請求項１８】
抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍原性、過剰増殖性または異常細胞中に見られるが、正常細胞では検出され得ないＥＧＦＲエピトープを認識する抗体である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
抗ＥＧＦＲ抗体はｍＡｂ８０６またはその活性フラグメントである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｓｒｃ阻害剤はダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＺＤ−０５３０、ＳＫＩ−６０６、ＰＰ１（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）、ＰＰ２（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン）及びＰＤ１６６３２６から選択される請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
阻害剤はチロシンキナーゼ阻害剤である請求項１７に記載の組成物。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１０−５２１４６８（Ｐ２０１０−５２１４６８Ａ）
【公表日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５３６３４（Ｐ２００９−５５３６３４）
【出願日】平成２０年３月１４日（２００８．３．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００３３６９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１５４０４
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５０００２５５７０）ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１４日（２００８．３．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００３３６９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１５４０４
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５０００２５５７０）ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ (16)
【Ｆターム（参考）】
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