ＩＣＡＭ−１のｓｉＲＮＡ阻害のための組成物及び方法
【解決手段】 ＩＣＡＭ−１遺伝子に特異的な低分子干渉ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉は、この遺伝子の発現を阻害する。ＩＣＡＭ−１仲介性細胞接着を伴う疾患、例えば、炎症性疾患及び自己免疫疾患、糖尿病性網膜症及び糖尿病Ｉ型から生じる他の合併症、年齢関連性黄斑変性症、及び様々なタイプの癌などを、前記低分子干渉ＲＮＡを投与することによって治療され得るものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、２００３年１月１６日出願の米国仮出願番号第６０／４４０，５７９号明細書に対して優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、特に、細胞間接着に関する疾患若しくは状態を治療するための、低分子干渉ＲＮＡによるＩＣＡＭ−１遺伝子発現の制御に関するものある。
【背景技術】
【０００３】
多くの生理学的過程において、細胞は、他の細胞若しくは細胞外マトリックスに密接に接触し、接着していることが必要とされている。細胞−細胞、及び細胞−マトリックス間の相互作用は、細胞間接着分子若しくは"ＩＣＡＭｓ"のいくつかのファミリーを通じて仲介される。
【０００４】
ＩＣＡＭ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーの１１０キロダルトンメンバーであり（Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ.，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３３１:６２４〜６２７）、限られた数の細胞上に発現し、刺激がなければ低レベルで発現する（Ｄｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７，２４５〜２５４）。炎症介在物質で刺激した場合、異なる組織で様々な細胞タイプがそれらの表面に高レベルでＩＣＡＭ−１を発現する（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｄｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｒｏｔｈｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１６６５〜１６６９）。刺激されＩＣＡＭ−１を発現した細胞は、血管内皮細胞、胸腺や他の上皮細胞、及び線維芽細胞などの非造血性細胞、及び組織マクロファージ、分裂促進因子で刺激されたＴリンパ球芽細胞、及び扁桃腺、リンパ節、パイエル板における胚中心樹状細胞などの造血性細胞を含む。ＩＣＡＭ−１誘導は、ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの転写の増加を介して生じ（Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ.，ｓｕｐｒａ）、誘導後４時間で検出可能になり、誘導後１６〜２４時間でピークとなる。
【０００５】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によって、ＩＣＡＭ−１に対する抗体がサイトカイン活性化内皮細胞への白血球の接着を阻害することが示された（Ｂｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０９５〜３０９９；Ｄｕｓｔｉｎ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９８８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０７：３２１〜３３１）。従って、ＩＣＡＭ−１発現は、免疫細胞の炎症部位への血管外遊走に必要とされるように見える。ＩＣＡＭ−１に対する抗体は、Ｔ細胞死滅、混合性リンパ球反応、及びＴ細胞仲介性Ｂ細胞分化も阻害し、これはＩＣＡＭ−１がこれら同族細胞相互作用に必要であることを意味している（Ｂｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。抗原が存在する場合のＩＣＡＭ−１の関与は、ＩＣＡＭ−１欠損マウスＢ細胞変異が抗原依存性Ｔ細胞増殖を刺激することができないことによって示された（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４０８２〜４０９１）。反対に、マウスＬ細胞は、ヒトＴ細胞に対する抗原が存在するために、ＨＬＡ−ＤＲに加えてヒトＩＣＡＭ−１での形質移入を必要とする（Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３３８：５１２〜５１４）。従って、ＩＣＡＭ−１機能を阻害することによって、移植拒絶の間の免疫細胞の認識と活性を阻害することができ、リュウマチ性関節炎、喘息、及び再灌流損傷の動物モデルの治療に有効である。
【０００６】
ＩＣＡＭ−１の発現は、アレルギー性接触皮膚炎、固定薬剤皮疹、扁平苔癬、及び乾癬などの炎症性皮膚障害にも関連している（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２２：６４〜６８；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ａｎｄ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，１９８９，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３５：１０４５〜１０５３；Ｌｉｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２０：４７９〜４８４；Ｓｈｉｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２５：１３７１〜１３７６）。さらに、ＩＣＡＭ−１発現は、リウマチ性関節炎の患者の滑膜において（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｒｔｈ.Ｒｈｅｕｍ.，３２:２２〜３０）、糖尿病の膵臓Ｂ細胞において（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ８６:４２８２〜４２８６）、バゼドウ病の患者の甲状腺濾胞細胞において（Ｗｅｅｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２２:１８５〜１９１）、腎臓及び肝臓同種移植片拒絶において（Ｆａｕｌｌ ａｎｄ Ｒｕｓｓ，１９８９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４８:２２６〜２３０;Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｌａｎｃｅｔ １１２２〜１１２５）、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）組織において（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｔ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４６:４２５〜３４）も検出された。
【０００７】
ＩＣＡＭ−１発現は、既存の血管からの新規血管の形成である血管新生においても関係がある。血管新生とは、細胞遊走、増殖、及び分化に関連した内皮細胞遺伝子発現の特性の変化を伴う複雑な過程であり、親血管の基底膜の局在性分解から始まるものである。次にその内皮細胞は親血管から間質性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へと遊走し、ＥＣＭの内皮細胞の継続した遊走や増殖に起因して伸張する毛細血管出芽を形成する。血管新生の間の内皮細胞とＥＣＭとの相互作用は、部分的にはＩＣＡＭ−１発現の増加によって引き起こされる細胞−マトリックス接触の変化を必要とする。
【０００８】
異常血管新生、若しくは新規血管の病的な増殖は、様々な状態を意味している。これらの状態としては、糖尿病性網膜症、乾癬、滲出性若しくは"濡れた"年齢関連性黄斑変性症（"ＡＭＤ"）、リュウマチ性関節炎や他の炎症疾患、及びほとんどの癌が挙げられる。ＡＭＤは特に、臨床的に重要な血管新生病である。この状態は、高齢者の片目若しくは両目における脈絡叢新生血管によって特徴付けられ、先進工業国における失明の主要な原因である。
【０００９】
糖尿病Ｉ型で共通に見られるいくつかの合併症にも、ＩＣＡＭ−１の発現が関与している。例えば毛細血管内皮への白血球のＩＣＡＭ−１仲介性接着（"ｌｅｕｋｏｓｔａｓｉｓ"とも呼ばれる）は、糖尿病の特定の組織、例えば網膜、末梢神経、及び腎臓などにおいて微小血管虚血を引き起こすことができる。これはこれらの組織の毛細非灌流を生じ、次に糖尿病性網膜症（Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６:１７３３〜１７３９；Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ ＵＳＡ ９６:１０８３６〜１０８４）、神経障害（Ｊｕｄｅ ＥＢ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４１：３３０〜６）、若しくは腎障害を導く。Ｍｉｙａｍｏｔｏら（１９９９，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ ＵＳＡ ９６：１０８３６〜１０８４１）は、ＩＣＡＭ−１仲介性ｌｅｕｋｏｓｔａｓｉｓの阻害によって糖尿病に関連した網膜異常を阻害することができると示唆した。しかしながら、少なくとも１つの研究では、糖尿病の"ウィスター系脂肪"ラットモデルにおける糖尿病性腎障害の発展には、糸球体におけるＩＣＡＭ−１発現の関与は見られないと報告した（Ｍａｔｓｕｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．３２：1〜9）。
【００１０】
ＩＣＡＭ−１は、糖尿病Ｉ型における大血管性疾患（例えば冠動脈疾患、脳血管疾患、及び末梢血管疾患など）の発病にも関与しており、これは部分的には、アテローム性動脈硬化症の促進、及び血栓症の増加に起因するものである。例えば、ＩＣＡＭ−１は、アテローム性硬化硬化型プラークにおいて発見され、糖尿病におけるアテローム性動脈硬化症の開始と発展を伴っているようである（Ｊｕｄｅ ＥＢ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３：１８５〜１８９）。
【００１１】
従って、ＩＣＡＭ−１は、正常過程及び病態生理学的過程の両方において絶対不可欠な役割を担っている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２２３〜２５２）。従って、ＩＣＡＭ−１機能或いは発現を阻害することによる細胞接着を媒介するための戦略が開発されてきた。そのような戦略では一般的に、抗ＩＣＡＭ−１抗体、ＩＣＡＭ−１結合を競合的に阻害するリガンド、若しくはＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸分子を用いる。しかしながら、そのような治療で用いられた作用因子は、ＩＣＡＭ−１の化学量論的な減少のみ産生し、一般的には罹患細胞若しくは活性化細胞によるＩＣＡＭ−１の異常な高産生によって圧倒される。従って、これらの戦略によって達成された結果は満足できるものではなかった。
【００１２】
ＲＮＡ干渉（以後"ＲＮＡｉ"とする）は、転写後遺伝子制御の方法であり、多くの真核生物を通じて保存されているものである。ＲＮＡｉは、すべての細胞に存在する、短い（例えば、<３０ヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ（"ｄｓＲＮＡ"）分子によって誘導される（Ｆｉｒｅ Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０５〜８１１）。"低分子干渉ＲＮＡ"若しくは"ｓｉＲＮＡ"と呼ばれるこれらの短いｄｓＲＮＡ分子は、前記ｓｉＲＮＡと配列相同性を有しているメッセンジャーＲＮＡｓ（"ｍＲＮＡｓ"）を破壊することで１ヌクレオチドの範囲での分解を引き起こす（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１５：１８８〜２００）。このｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡは、前記標的ｍＲＮＡを切断する"ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体"若しくは"ＲＩＳＣ"に結合すると考えられている。ｓｉＲＮＡは明らかに複数−回転（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｔｕｒｎｏｖｅｒ）酵素と同様に再利用され、１つのｓｉＲＮＡ分子は約１０００ｍＲＮＡ分子の切断を誘導することが可能である。従って、ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ仲介ＲＮＡｉ分解は、標的遺伝子の発現を阻害するための現在利用可能な技術に比べてより効果的である。
【００１３】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭら（（２００１），ｓｕｐｒａ）は、２１及び２２ヌクレオチド長で短い３’オーバーハングを有する合成ｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエ細胞可溶化液中の標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを誘導することができることを示した。培養哺乳類細胞でも合成ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉが見られ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４〜４９８）、さらに、合成ｓｉＲＮＡによって誘導されたＲＮＡｉ分解は最近、生きているマウスでも示された（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ＡＰ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８：３８〜３９；Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０）。ｓｉＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉ分解の治療上の潜在能力は、ＨＩＶ−１感染のｓｉＲＮＡ指向性（ｓｉＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）阻害（Ｎｏｖｉｎａ ＣＤ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：６８１〜６８６）、及び神経毒性ポリグルタミン疾患タンパク質発現の減少（Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），ｓｕｐｒａ）を含む、最近のいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究で実証された。
【００１４】
従って、ＩＣＡＭ−１仲介性細胞接着を効果的に減少する若しくは阻害するＩＣＡＭ−１の発現を阻害する、触媒的若しくは半化学量論的量の作用因子が必要とされている。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、特にＩＣＡＭ−１遺伝子からのｍＲＮＡのＲＮＡｉ誘導分解を標的にし、それを引き起こすｓｉＲＮＡに関するものである。本発明のｓｉＲＮＡ化合物や組成物は、細胞接着及び細胞接着仲介性病態を治療するために用いられる。特に、本発明のｓｉＲＮＡは、例えば、癌性腫瘍、年齢関連性黄斑変性症、及び他の血管新生病の治療などにおいて、血管新生を阻害するために有用である。
【００１６】
従って、本発明は、ヒトＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング型、変異体若しくは同族体を標的とする単離されたｓｉＲＮＡを提供する。前記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ二本鎖を形成するセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを有する。前記センスＲＮＡ鎖は、標的ｍＲＮＡにおける近接した約１９〜約２５ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を有している。
【００１７】
本発明は、本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドとウイルス性ベクター、さらに本発明のｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物も提供する。
【００１８】
本発明はさらに、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング型、変異体、若しくは同族体の発現を阻害する方法を提供し、これは標的ｍＲＮＡが分解されるように本発明のｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有するものである。
【００１９】
本発明はさらに、細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態を治療する方法も提供し、これはヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング型、変異体、若しくは同族体を標的としたｓｉＲＮＡの有効量をそのような治療を必要としている対象に投与する工程を有するものである。
【００２０】
本発明はさらに、対象における血管新生を阻害する方法も提供し、これはヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング型、変異体若しくは同族体を標的としたｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有するものである。
【００２１】
本発明はさらに、対象における糖尿病Ｉ型による合併症を治療する方法も提供し、これはヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング型、変異体若しくは同族体を標的としたｓｉＲＮＡの有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する工程を有するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
特に指示しない限り、この中の全ての核酸配列は５’から３’方向に示されているものとする。また、核酸配列における全てのデオキシリボヌクレオチドは、大文字で表されており（例えばデオキシチミジンは"Ｔ"である）、核酸配列におけるリボヌクレオチドは、小文字で表されている（例えばウリジンは"ｕ"である）。
【００２３】
ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡを有する組成物及び方法は、細胞接着及び細胞接着仲介性病態の阻害若しくは予防において有利に用いられる。ここで用いられたように"細胞接着及び細胞接着仲介性病態"とは、疾患若しくは状態を発病する及び／若しくは維持するために、ある細胞と他の細胞との若しくはある細胞と細胞外マトリックスとのＩＣＡＭ−１仲介性接着を必要とするあらゆる疾患若しくは状態を言及する。例えば、血管新生は内皮細胞の細胞外マトリックスとのＩＣＡＭ−１仲介性接着を必要とするように、当業者にとってそのような疾患や状態は周知である。さらに、炎症部位への免疫細胞の血管外遊走は、白血球のサイトカイン活性化内皮細胞へのＩＣＡＭ−１仲介性接着を必要とする。他の細胞接着及び細胞接着仲介性病態としては、ＡＩＤＳ関連性痴呆、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、血管新生（病原性若しくは非病原性血管新生を含む）、抗原提示、喘息、アテローム性動脈硬化症、ある種の毒性及び免疫性腎炎、接触性経皮過敏症、角膜／辺縁系損傷、糖尿病Ｉ型、例えば糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、及び大血管性疾患などの糖尿病Ｉ型から生じる合併症、バゼドウ病、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎やクローン病を含む）、炎症性肺疾患、ウイルス感染の炎症性続発症、炎症性皮膚障害（例えば、アレルギー性接触皮膚炎、固定薬剤皮疹、扁平苔癬、及び乾癬など）、腎臓、肝臓及び骨髄移植を含む移植（同種移植）拒絶における免疫細胞認識と活性、免疫細胞相互作用（例えば、Ｔ細胞死滅、混合性リンパ球反応、及びＴ細胞仲介性Ｂ細胞分化など）、髄膜炎、多発性硬化症、多発性骨髄腫、心筋症、肺線維症、再灌流損傷、再狭窄、網膜炎、リュウマチ性関節炎、敗血性関節炎、脳卒中、腫瘍増殖と転移、及びｕｖｅｉｔｉｔｉｓを含む。
【００２４】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ−１遺伝子のタンパク質産物が産生しない、若しくは少量で産生されるように、ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こす。ＩＣＡＭ−１遺伝子産物は、特定の細胞間若しくは細胞−ＥＣＭ接着現象を必要とするため、ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ仲介性分解は細胞間若しくは細胞−ＥＣＭ接着を阻害する。従って、細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態は、本発明のｓｉＲＮＡを用いてＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ分解を誘導することによって治療され得る。
【００２５】
従って、本発明は単離されたｓｉＲＮＡを提供し、これは、前記標的ｍＲＮＡを標的とした約１７ヌクレオチド〜２９ヌクレオチド長の、好ましくは約１９〜２５ヌクレオチド長の短い二本鎖ＲＮＡを有するものである。前記ｓｉＲＮＡは、標準ワトソン−クリック塩基対相互作用（ここでは以後"塩基対の（ｂａｓｅ−ｐａｉｒｅｄ）"とする）によってアニールされたセンスＲＮＡ鎖と相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖とを有している。以下により詳細に記載されているように、前記センス鎖は、前記標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と実質的に同一な核酸配列を有している。
【００２６】
ここで用いられたように、前記標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と"実質的に同一な"核酸配列とは、標的配列と同一な、若しくは１若しくはそれ以上のヌクレオチドが前記標的配列とは異なっている、核酸配列である。標的配列に実質的に同一な核酸配列を有する本発明のセンス鎖は、そのようなセンス鎖を有するｓｉＲＮＡが前記標的配列に含まれるｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を誘導するという点で特徴付けられる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解がｓｉＲＮＡによって誘導される限りで、１、２、或いは３、若しくはそれ以上のヌクレオチドが標的配列と異なっている核酸配列を有しているセンス鎖を有することができる。
【００２７】
本発明のｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖は、２つの相補的で一本鎖ＲＮＡ分子を有することができる、若しくは２つの相補的な部分は塩基対であり、一本鎖"ヘアピン"領域で共有結合的にリンクしている、１分子を有することができる。あらゆる理論に束縛されることなく、後者タイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、"ダイサー"タンパク質（若しくはその等価物）によって細胞間を切断され、２つの独立した塩基対ＲＮＡ分子を形成すると信じられている（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），ｓｕｐｒａを参照のこと）。
【００２８】
ここで用いられたように"単離された"とは、合成の、若しくはヒトの介入を通じて天然状態から変化した或いは除去されたことを意味する。例えば、生きた動物中に天然に存在するｓｉＲＮＡは"単離され"てないが、合成ｓｉＲＮＡ、若しくはその天然状態の共存物質から部分的に或いは完全に分離されたｓｉＲＮＡは"単離され"ている。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で存在し得る、若しくは例えば、ｓｉＲＮＡが運搬された細胞などの非天然環境中に存在し得る。一例として、天然過程により細胞内部に生産されるが、"単離された"前駆分子から生成されるｓｉＲＮＡは、"単離された"分子である。従って、単離されたｄｓＲＮＡ若しくはタンパク質は、標的細胞へ導入され得、ダイサータンパク質（若しくはその等価物）によって単離されたｓｉＲＮＡ内へプロセシングされる。
【００２９】
ここで用いられたように"標的ｍＲＮＡ"とは、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの変異体或いは選択的スプライシング体、若しくは同族ＩＣＡＭ−１遺伝子からのｍＲＮＡを意味する。ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ配列は、ｃＤＮＡに相当するものとして、配列ＩＤ番号：１に示されている。当業者は、ｃＤＮＡ配列はｍＲＮＡ配列と同等であり、ここにおいて同じ目的、すなわち、ＩＣＡＭ−１の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの産生で用いることが可能であることを理解するであろう。
【００３０】
ここで用いられたように、ヒトＩＣＡＭ−１と"同族な"遺伝子若しくはｍＲＮＡは、ヒトＩＣＡＭ−１と相同な別の哺乳類種からの遺伝子若しくはｍＲＮＡである。例えば、マウスからの同族ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに相当するものとして、配列ＩＤ番号：２に示されている。
【００３１】
ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、選択的スプライシング体に対して本分野ではよく知られた技術を用いて解析され得る。そのような技術は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、及びｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが含まれる。ｍＲＮＡ配列を解析するための技術は、例えば、Ｂｕｓｔｉｎｇ ＳＡ（２０００），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１６９〜１９３に記載されており、そこで開示された全てはこの参照によって本明細書に組み込まれる。選択的スプライシングｍＲＮＡを同定するための代表的な技術は、以下にも記載されている。
【００３２】
例えば、所定の疾患遺伝子に関連したヌクレオチド配列を含むデータベースは、選択的スプライシングｍＲＮＡを同定するために使用することができる。そのようなデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｅｍｂａｓｅ、ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）データベースが含まれる。例えば、このＣＧＡＰデータベースは、様々なタイプのヒト癌からの発現遺伝子配列（ＥＳＴｓ）を含む。ＩＣＡＭ−１遺伝子からのｍＲＮＡ若しくは遺伝子配列は、選択的スプライシングｍＲＮＡｓを表すＥＳＴｓが発見されたかどうかを決定するためにそのようなデータベースをクエリーするために使用することができる。
【００３３】
"ＲＮＡｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）保護"と呼ばれる技術は、選択的スプライシングＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを同定するために使用することができる。ＲＮＡｓｅ保護は、例えば、ＩＣＡＭ−１を発現するように誘導された細胞などの他の細胞に由来したＲＮＡとハイブリダイズされた合成ＲＮＡへの遺伝子配列の翻訳を必要とするものである。次にこのハイブリダイズされたＲＮＡは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドミスマッチを認識する酵素をともにインキュベートされる。予想より小さい断片（フラグメント）は、選択的スプライシングｍＲＮＡｓの存在を意味している。推定上の選択的スプライシングｍＲＮＡｓは、当業者にはよく知られた方法によって、クローニングされ、配列決定される。
【００３４】
ＲＴ−ＰＣＲも、選択的スプライシングＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡｓを同定するために使用することができる。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、活性化白血球からのｍＲＮＡ、炎症性腸疾患組織の細胞からのｍＲＮＡ、若しくはＩＣＡＭ−１を発現すると知られている他の組織の細胞からのｍＲＮＡは、当業者にはよく知られた方法を用いて、酵素逆転写によってｃＤＮＡへ変換される。次にこのｃＤＮＡの全コード配列は、３’非翻訳領域に位置付けられた前方（フォワード）プライマーと、５’非翻訳領域に位置付けられた後方（リバース）プライマーとを用いるＰＣＲによって増幅される。増幅産物は、例えば、正常なスプライシングｍＲＮＡから発現した産物のサイズと増幅された産物のサイズとを比較すること（すなわち、アガロースゲル電気泳動）によって、選択的スプライシング体のための解析ができる。前記増幅産物のサイズにおけるどんな変化も、選択的スプライシングを意味するものである。
【００３５】
変異ＩＣＡＭ−１遺伝子から産生されたｍＲＮＡも、ＩＣＡＭ−１選択的スプライシング体を同定するための上述された技術を用いて、容易に解析され得る。ここで用いられたように"変異ＩＣＡＭ−１遺伝子若しくはｍＲＮＡ"は、ここで説明されたＩＣＡＭ−１配列からの配列とは異なるヒトＩＣＡＭ−１遺伝子、若しくはｍＲＮＡを含む。従って、ＩＣＡＭ−１遺伝子対立遺伝子型、及びそれらからのｍＲＮＡ産物は、本発明の目的のために"変異体"として考えられる。
【００３６】
ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡは、そのそれぞれの選択的スプライシング体、同族体、若しくは変異体と共通した標的配列を含む可能性があると理解されている。従って、そのような共通の標的配列を有している１つのｓｉＲＮＡは、共通の標的配列を含むそれらの異なるｍＲＮＡｓのＲＮＡｉ仲介性分解を誘導することができる。
【００３７】
本発明のｓｉＲＮＡは、１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換及び／若しくは変更による天然由来のＲＮＡとは異なる変化ＲＮＡと同様に、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、若しくは組換え的に生成されたＲＮＡを有し得る。そのような変化は、例えば、ｓｉＲＮＡの末端へ或いは１若しくはそれ以上の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化耐性にするような修飾（例えば、２’−置換リボヌクレオチドの使用、若しくは糖−リン酸バックボーンの修飾など）、若しくは、ｓｉＲＮＡの１若しくはそれ以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドでの置換を含むことができる。血清、涙液（ｌａｃｈｒｙｍａｌ ｆｌｕｉｄ）、若しくは他のヌクレアーゼが豊富な環境にさらされたｓｉＲＮＡ、若しくは局所的に運搬された（例えば目薬などで）ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性が増加するように変えられていることが好ましい。例えば、血管内に、若しくは眼に局所的に投与されたｓｉＲＮＡは、１若しくはそれ以上のホスホロチオエート連鎖を有し得る。
【００３８】
一本鎖若しくは両鎖の本発明のｓｉＲＮＡは、３’オーバーハングも有することができる。ここで用いられたように、"３’オーバーハング"とは、ＲＮＡ鎖の３’末端から伸長した少なくとも１つの不対ヌクレオチドを意味する。
【００３９】
従って、１実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドを含む）長、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２〜約４ヌクレオチド長、からなる少なくとも１つの３’オーバーハングを有している。
【００４０】
ｓｉＲＮＡ分子の二本鎖は３’オーバーハングを有しているという１実施形態において、前記オーバーハングの長さは、各鎖で同じ若しくは異なってもよい。最も好ましい実施形態において、前記３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば、本発明のｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（"ＴＴ"）若しくはジウリジル酸（"ｕｕ"）の３’オーバーハングを有することができる。
【００４１】
本発明のｓｉＲＮＡの安定性を増強するために、前記３’オーバーハングも分解に対して安定化され得る。１実施形態において、前記オーバーハングは、アデノシン若しくはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことによって安定化される。あるいは、例えば３’オーバーハングのウリジンヌクレオチドの２’−デオキシチミジンでの置換などの、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換は、耐容性を示し、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を与えないものである。特に、２’−デオキシチミジンに２’ヒドロキシルが存在しないと、組織培養液中の３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性が著しく増強する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ若しくはＮＡ（Ｎ２１）を有しており、ここにおいてＮはあらゆるヌクレオチドである。これらのｓｉＲＮＡは、約３０〜７０％ Ｇ／Ｃを有し、好ましくは約５０％ Ｇ／Ｃを有している。センスｓｉＲＮＡ鎖の配列は、それぞれ（Ｎ１９）ＴＴ若しくはＮ２１（すなわち、３〜２３位）と一致するものである。後者の場合において、前記センスｓｉＲＮＡの３’末端はＴＴに変換される。この配列変換の理論的な解釈としては、センス及びアンチセンス鎖３’オーバーハングの配列組成に関して対照的な二本鎖を生じることである。次に前記アンチセンスＲＮＡ鎖は、前記センス鎖の１〜２１位を補完するものとして合成される。
【００４３】
これらの実施例における２３−ｎｔセンス鎖の１位は、アンチセンス鎖による配列特異的な方法では認識されないので、前記アンチセンス鎖のほとんどの３’−ヌクレオチド残基は意図的に選択され得る。しかしながら、前記アンチセンス鎖の最後から２番目のヌクレオチド（いずれの実施形態においても２３−ｎｔセンス鎖の２位を補完するもの）は、一般的に標的配列を補完するものである。
【００４４】
別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、配列ＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮを有しており、ここにおいてＲはプリン（例えばＡ若しくはＧ）であり、Ｙはピリミジン（例えばＣ若しくはＵ／Ｔ）である。従って、本実施形態の２１−ｎｔセンス及びアンチセンスＲＮＡ鎖のそれぞれは、一般的にプリンヌレオチドで始まる。最初に転写されたヌクレオチドがプリンである場合、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡｓの発現が唯一効果的であると信じられているように、そのようなｓｉＲＮＡは、標的部位を変更することなく、ｐｏｌ ＩＩＩ発現ベクターから発現され得る。
【００４５】
本発明のｓｉＲＮＡは、あらゆる標的ｍＲＮＡ配列（"標的配列"）における一続きの約１９〜２５の近接したヌクレオチドを標的とし得る。ｓｉＲＮＡのための標的配列を選択するための技術は、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ Ｔらの"Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ"（２００２年１０月１１日改訂）に示されており、そこに開示されている全てはこの参照によって本明細書に組み込まれる。"Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ"は、Ｔｈｏｍａｓ Ｔｕｓｃｈｌ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡＧ１０５，Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７０７７ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって維持されているウェブサイトのワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上で入手可能であり、Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトにアクセスし、キーワード"ｓｉＲＮＡ"で検索ことによって発見することができる。従って、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡにおけるあらゆる近接した一続きの約１９〜約２５ヌクレオチドと実質的に同一なヌクレオチド配列を有している。
【００４６】
一般的に、標的ｍＲＮＡの標的配列は、標的ｍＲＮＡに対応する特定の、好ましくは開始コドンから５０〜１００ｎｔ下流（すなわち３’方向）から始まるｃＤＮＡ配列から選択され得る。しかしながら前記標的配列は、５’或いは３’非翻訳領域に、若しくは開始コドンに近接する領域に位置付けられ得る。例えば、ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡ配列中の適切な標的配列としては、
【００４７】
【化１】
【００４８】
従って、この配列を標的とし、各鎖に３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で表している）を有する本発明のｓｉＲＮＡとしては、
【００４９】
【化２】
である。
【００５０】
配列ＩＤ番号：３を標的としているが、各鎖に３’ＴＴオーバーハング（オーバーハングは太字で表している）を有する本発明のｓｉＲＮＡとしては、
【００５１】
【化３】
である。
【００５２】
本発明のｓｉＲＮＡが由来され得る他のＩＣＡＭ−１標的配列は、表１に記載された配列と、配列ＩＤ番号：２０〜９４に記載された配列とを含む。ここに記載された前記標的配列は、ヒトＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡを参照とし、従ってそれらの配列は"Ｔ"で示されたデオキシチミジンを含むことが理解される。当業者は、ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの実際の標的配列において、前記デオキシチミジンがウリジン（"ｕ"）で置換されることを理解するであろう。同様に、本発明のｓｉＲＮＡ内に含まれる標的配列も、デオキシチミジンの代わりにウリジンを含むことが可能である。
【００５３】
【表１】
【００５４】
本発明のｓｉＲＮＡは、当業者に知られた多くの技術を用いて得ることができる。例えば、Ｔｕｓｃｈｌらによる米国公開公報第２００２／００８６３５６号に記載されたｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｉｎ ｖｉｔｒｏシステム（この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。）などのｓｉＲＮＡは従来技術において知られた方法を用いて、化学的に合成され得る、若しくは組換え的に産生され得る。
【００５５】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、保護リボヌクレオシドホスホラミダイト、及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを適切に用いて化学的に合成されるものである。ｓｉＲＮＡは、２つ分離した相補的なＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として合成され得る。合成ＲＮＡ分子若しくは合成試薬の商業的供給元としては、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）、 Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、コロラド州、アメリカ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅの一部，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、アメリカ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ヴァージニア州、アメリカ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、マサチューセッツ州、アメリカ）、及びＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、英国）を含む。
【００５６】
あるいは、ｓｉＲＮＡは、あらゆる適切なプロモーターを用いて組換え環状ＤＮＡプラスミド、若しくは直線ＤＮＡプラスミドからも発現され得る。プラスミドからの本発明のｓｉＲＮＡを発現するための適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、若しくはサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技術範囲内である。本発明の前記組換えプラスミドは、特定の組織或いは特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導性プロモーター若しくは制御可能なプロモーターも有することができる。
【００５７】
組換えプラスミドから発現されたｓｉＲＮＡは、標準技術によって培養細胞発現システムから単離され得る、若しくは細胞内で発現され得る。本発明のｓｉＲＮＡを細胞へｉｎ ｖｉｖｏで運搬するための組換えプラスミドの使用は、以下でより詳細に論じる。
【００５８】
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離した相補的なＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的な領域を有する１つのＲＮＡ分子として、組換えプラスミドから発現され得る。
【００５９】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するのに適したプラスミドの選択、前記ｓｉＲＮＡを発現するためにプラスミドへ核酸配列を挿入する方法、及び、目的細胞へ組換えプラスミドを運搬する方法は、当業者の技術範囲内である。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６〜４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ＴＲ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０〜５５３；ＭｉｙａｇｉｓｈｉＭ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｈｎｏｌ．２０：４９７〜５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ＰＪ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：９４８〜９５８；Ｌｅｅ ＮＳ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００〜５０５；Ｐａｕｌ ＣＰ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５〜５０８を参照のこと（これらに開示された全体は、この参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
１実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡを発現するプラスミドは、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つセンスＲＮＡ鎖コード（翻訳）領域と、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つアンチセンスＲＮＡ鎖コード領域とを有する。そのようなプラスミドは、本発明のｓｉＲＮＡを発現するための組換えアデノ随伴ウイルスベクターを産生する場合に用いられ得る。
【００６１】
ここで用いられたように、"ｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結"とは、センス鎖若しくはアンチセンス鎖をコード化する核酸配列が５’方向のｐｏｌｙＴ終止シグナルと即座に隣接することを意味する。前記プラスミドからの前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖の転写の間、前記ｐｏｌｙＴ終止シグナルは転写を終了する働きをする。
【００６２】
ここで用いられたように、プロモーターの"制御下"とは、前記プロモーターがセンス若しくはアンチセンスコード配列の転写を開始することができるように、前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖をコード化する核酸配列がプロモーターの３’に位置することを意味する。
【００６３】
本発明のｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞内で組換えウイルスベクターからも発現され得る。本発明の組換えウイルスは、本発明のｓｉＲＮＡをコード化する配列と、ｓｉＲＮＡ配列を発現するための適切な任意のプロモーターとを有する。適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６或いはＨ１ ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列、及びサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技術範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織若しくは特定の細胞内環境においてｓｉＲＮＡを発現するための誘導性若しくは制御可能なプロモーターも有することができる。本発明のｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで細胞へ運搬するための組換えウイルスベクターの使用は、以下により詳細に述べる。
【００６４】
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離した相補的なＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的な領域を持つ１つのＲＮＡ分子として、組換えウイルスベクターから発現され得る。
【００６５】
ｓｉＲＮＡ分子を発現するためのコード配列を受容する能力があるあらゆるウイルスベクターで用いられ得、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えばレンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス、及びそれと同等なものから由来したベクターなどである。ウイルスベクターの指向性は、ベクターをエンベロープタンパク質や他のウイルスからの別の表面抗原によってシュードタイピングすることによって、若しくは異なるウイルスキャプシドタンパク質で置換することによって、適切に修飾され得る。
【００６６】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、 Ｍｏｋｏｌａウイルス、およびそれと同等なものからの表面タンパク質でシュードタイピングされ得る。本発明のＡＡＶベクターは、異なるキャプシドタンパク質血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）を発現するようにベクターを設計することによって、異なる細胞を標的として作成され得る。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２キャプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクターにおけるこの血清型２キャプシド遺伝子は、ＡＡＶ２／５ベクターを産生するために、血清型５キャプシド遺伝子によって置換され得る。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構成するための技術は、当業者の技術範囲内であり、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１〜８０１を参照のこと（なお、この全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。）。
【００６７】
好ましいウイルスベクターは、レンチウイルス、ＡＶ若しくはＡＡＶから由来したベクターである。特に好ましい実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６或いはＨ１ＲＮＡプロモーター、若しくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有する組換えＡＡＶベクターから、２つの分離した相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現される。本発明のｓｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構成するための方法、及び前記ベクターを標的細胞へ運搬するための方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０に記載されている。
【００６８】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構成するための方法、及び前記ベクターを標的細胞へ運搬する方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６〜３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ ＫＪ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０〜５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２６；米国特許第５，１３９，９４１号公報；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号に記載されており、これらの全体の開示は、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６９】
標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こすための所定の標的配列を含むｓｉＲＮＡの能力は、細胞中のＲＮＡレベル若しくはタンパク質レベルを測定するための標準技術を用いて評価され得る。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは培養細胞へ運搬され得、標的ｍＲＮＡのレベルはノーザンブロット若しくはドットブロッティング技術によって、若しくは定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定され得る。或いは、培養細胞中のＩＣＡＭ−１タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡ若しくはウエスタンブロットによって測定され得る。
【００７０】
例えば、天然にＩＣＡＭ−１を発現している、若しくはＩＣＡＭ−１が発現するように誘導される細胞は、９６ウェルマイクロタイタープレート中でコンフルウエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで増殖される。天然にＩＣＡＭ−１を発現している細胞に対して、この細胞は、ＩＣＡＭ−１発現を刺激するために、インターロイキン−１若しくは腫瘍壊死因子で８〜２４時間、刺激され得る。本発明のｓｉＲＮＡは、第１群のＩＣＡＭ−１発現細胞に投与される。非特異的ｓｉＲＮＡ（若しくはｓｉＲＮＡなし）は、対照として、第２群のＩＣＡＭ−１発現細胞に投与される。細胞は洗浄され、１〜２％パラホルムアルデヒドでマイクロタイタープレートのウェルに直接固定された。マイクロタイタープレート上の非特異結合部位は、２％ウシ血清アルブミンでブロックされ、細胞はＩＣＡＭ−１特異的モノクローナル抗体とインキュベートされた。ＩＣＡＭ−１抗体の結合は、例えば、１：１０００希釈のビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，Ｍｄ）と１時間、３７℃でインキュベーションし、１：１０００希釈のベータ−ガラクトシダーゼと共役したスレプトアビジン（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１時間３７℃でインキュベーションすることによって、検出される。ＩＣＡＭ−１特異的モノクローナル抗体と結合したベータ−ガラクトシダーゼは、例えば、３．３ｍＭクロロフェノールレッド−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド。５０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．２）の溶液で、２〜１５分、３７℃でマイクロタイタープレートを展開し、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートリーダーを用いて５７５ｎｍで結合した抗体の濃度を測定することによって決定される。
【００７１】
ＩＣＡＭ−１発現を下方制御する本発明のｓｉＲＮＡの能力は、神経突起伸長、内皮細胞間の接着、上皮細胞間の接着（例えば、正常ラット腎臓細胞及び／若しくはヒト皮膚）、若しくは癌細胞間の接着を当業者の技術範囲内の技術によって測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでも評価され得る。
【００７２】
適切な神経突起伸長アッセイは、ＩＣＡＭ−１を天然に発現している、若しくはＩＣＡＭ−１の発現を誘導されている単層細胞上の培養ニューロンを有する。ＩＣＡＭ−１発現細胞上のニューロン伸長は、ＩＣＡＭ−１が発現していない細胞上で培養されたニューロンに比べて、長く突起が伸長していた。例えば、ニューロンは、ＩＣＡＭ−１をコードしているｃＤＮＡで形質移入された３Ｔ３細胞の単層上に培養され得、基本的には、Ｄｏｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｗａｌｓｈ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．４：４９〜５５、及びＳａｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｅｕｒｏｎ １８：２３１〜２４２に記載された通りであり、これらに開示された全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。簡潔に説明すると、対照３Ｔ３線維芽細胞、及びＩＣＡＭ−１を発現した３Ｔ３線維芽細胞の単層は、８ウェル組織培養ディッシュの各ウェルに８０，０００細胞を一晩培養することによって、達成される。出生前３日目のマウス脳から単離された３０００個の小脳ニューロンは、様々な単層上で１８時間培養される。次にその培養は固定され、標準技術を用いてニューロン特異的抗体（例えばＧＡＰ４３）で染色される。対照細胞及び本発明のｓｉＲＮＡで処理された細胞の神経突起の長さは、コンピュータ補助形態計測によって測定される。テスト細胞中のＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉ分解は、対照細胞と比較して少なくとも５０％、平均神経突起の長さが増加することによって示される。
【００７３】
本発明のｓｉＲＮＡによるＩＣＡＭ−１のＲＮＡｉ分解は、細胞接着の離開を検出することによっても評価され得る。例えば、ＩＣＡＭ−１を天然に発現している、若しくはＩＣＡＭ−１発現が誘導された細胞は、細胞接着が可能な標準条件下で播種される。本発明のｓｉＲＮＡを投与することによる細胞接着の離開は、細胞の他の細胞からの退縮を観察することによって、２４時間以内に視覚的に決定される。細胞接着の離開を検出するための適切なアッセイは、以下の通りである。ウシ肺動脈内皮細胞は、無菌除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）と、０．１％コラゲナーゼ（タイプＩＩ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ニュージャージー州）での消化によって播種される。播種された細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と、１％抗生剤−抗真菌剤が添加されたダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、７％ ＣＯ２（空気中）において培養される。この培養は、トリプシン−ＥＤＴＡで週１回継代され、２０，０００細胞／ｃｍ２で組織培養プラスチックへ播種される。培養コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が達成された後の約３日後である１週間の培養後、細胞は本発明のｓｉＲＮＡ、若しくは対照非特異的ｓｉＲＮＡで処理（例えば３０分）される。この細胞は、ｓｉＲＮＡが投与されて２４時間以内に１％パラホルムアルデヒドで固定され、細胞接着の離開の程度を、細胞の他の細胞からの退縮を観察することによって決定された。
【００７４】
本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡ仲介性分解は、例えば、未熟網膜症（"ＲＯＰ"）マウスモデル、脈絡叢新血管新生（"ＣＮＶ"）マウス及びラットモデルなどの、新血管新生の動物モデルでも評価され得る。例えば、ＣＮＶラットにおける新血管新生領域は、以下の実施例２にあるように、本発明のｓｉＲＮＡの投与前後で測定され得る。ｓｉＲＮＡの投与による新血管新生領域における減少は、ＩＣＭＡ−１ ｍＲＮＡの下方制御と細胞接着の離開とを意味する。ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの下方制御と、細胞接着の離開とは、以下の、ストレプトゾトシン誘導糖尿病性網膜症ラットモデル（実施例３）、ＶＥＧＦ誘導性網膜血管透過性とｌｅｕｋｏｓｔａｓｉｓのラットモデル（実施例４）、及び角膜／輪部損傷による眼球新血管新生のラットモデル（実施例５）にも示されている。
【００７５】
上述したように、本発明のｓｉＲＮＡは、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング体、変異体或いは同族体のＲＮＡｉ仲介性分解を標的にし、引き起こす。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、ＩＣＡＭ−１遺伝子からの機能遺伝子産物の産生を減少する。従って、本発明は、対象中のＩＣＡＭ−１の発現を阻害する方法を提供し、これは、標的ｍＲＮＡが分解されるように、本発明のｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有する。
【００７６】
ＩＣＡＭ−１遺伝子の産物は細胞間接着若しくは細胞とＲＣＭとの接着に必要とされるので、本発明は、細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態を患っている対象における細胞接着を阻害する方法も提供する。１実施形態において、ＩＣＡＭ−１仲介性細胞接着は血管新生を開始し維持するために必要とされるので、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解によって対象における血管新生を阻害する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は糖尿病Ｉ型から生じる合併症を患った対象を、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解によって治療する方法を提供する。好ましくは、本発明の方法によって治療される糖尿病Ｉ型から生じた合併症としては、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、及び大血管性疾患（冠動脈疾患、脳血管疾患、及び末梢血管疾患を含む）である。
【００７７】
ここで用いられたように、"対象"とは、ヒト、若しくは非ヒト動物を含む。好ましくは、前記対象はヒトである。
【００７８】
ここで用いられたように、ｓｉＲＮＡの"有効量"とは、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こすのに十分な量、若しくは対象における細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態の開始若しくは進行を阻害するのに十分な量を指す。
【００７９】
標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解は、上述したｍＲＮＡ若しくはタンパク質の単離及び定量するための標準技術を用いて、対象の細胞中の標的ｍＲＮＡレベル若しくはタンパク質レベルを測定することによって検出され得る。
【００８０】
細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態の阻害は、例えば、炎症、網膜症、神経障害、腎障害、若しくは対象が治療される疾患若しくは障害の特性を示す他の症状の程度を検出することによって、対象における病態の進行を測定することによっても評価され得る。
【００８１】
例えば、血管新生の阻害は、本発明のｓｉＲＮＡで処理する前後の新血管新生領域のサイズを観察することによってなど、対象における病原性若しくは非病原性血管新生の進行を直接測定することによって評価され得る。新血管新生領域が同じか減少していた場合は、血管新生の阻害を意味している。対象における新血管新生領域のサイズを観察及び測定するための技術は、当業者の技術範囲内であり、例えば、脈絡膜新血管新生の領域が検眼鏡検査によって観察され得る。
【００８２】
血管新生の阻害は、血管新生に関連した病的状態における変化若しくは回復の観察を通じて推測することも可能である。例えば、ＡＭＤにおいて、視覚消失の遅延、停止、若しくは回復は、脈絡膜における血管新生の阻害を意味している。腫瘍に対しては、腫瘍成長の遅延、停止、或いは逆転、若しくは腫瘍転移の停止は、腫瘍部位での或いは近くでの血管新生の阻害を意味している。非病原性血管新生の阻害は、例えば、本発明のｓｉＲＮＡの投与による脂肪消失若しくはコレステロールレベルでの減少など、からも推測され得る。
【００８３】
本発明の方法は、非病原性である血管新生、すなわち、対象における正常過程に起因する血管新生、を阻害するために用いられ得る。非病原性血管新生の例えとしては、子宮内膜新血管新生、及び脂肪組織或いはコレステロールの産生に関連した過程を含む。従って、本発明は、例えば、体重を調節する或いは脂肪消失を促進するための、コレステロールレベルを減少するための、若しくは堕胎薬としての、非病原性血管新生を阻害するための方法も提供する。
【００８４】
本発明の方法は、血管新生病、すなわち、不適切な或いは非制御の血管新生に関連した病原性の病気、に関連した血管新生も阻害することができる。例えば、ほとんどの癌性固形腫瘍は、腫瘍内と周囲に血管新生を誘導することによって腫瘍自体に十分な血液供給を発生する。この腫瘍誘導性血管新生は、腫瘍成長に対してしばしば必要とされ、転移性細胞が血流に入ることを可能にする。
【００８５】
他の血管新生病としては、糖尿病性網膜症及び年齢関連性黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む。これらの病気は、新血管新生の領域における新しく形成された血管による正常組織の破壊によって特徴付けられている。例えば、ＡＭＤにおいて、脈絡膜は、毛細血管によって侵入され、破壊されている。ＡＭＤにおける脈絡膜の血管新生に由来する破壊は、最終的には部分的な或いは完全な失明を導く。
【００８６】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、癌、例えば乳癌、肺癌、頭部と頚部の癌、脳腫瘍、腹腔内腫瘍、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、グリオーマ、肝癌、舌癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌（例えば黒色腫）、リンパ腫、及び血液癌などに関連した固形腫瘍の成長若しくは転移を阻害するために用いられる。
【００８７】
より好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、糖尿病Ｉ型から生じる合併症、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、及び大血管性疾患など、を治療するために用いられる。
【００８８】
細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態を治療するために、特に、血管新生病及び糖尿病Ｉ型から生じた合併症を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡは、本発明のｓｉＲＮＡとは異なる薬剤との組み合わせで対象に投与され得る。或いは、本発明のｓｉＲＮＡは、前記病態を治療するために設計された別の治療方法との組み合わせで対象に投与され得る。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、癌を治療する、若しくは腫瘍転移を予防するために現在用いられる医療方法（例えば、放射線療法、化学療法、及び手術）との組み合わせで投与され得る。腫瘍を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡは好ましくは、放射線療法との組み合わせで、若しくはシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、若しくはタモキシフェンなどの化学療法薬剤との組み合わせで、投与される。
【００８９】
本発明のｓｉＲＮＡは、サブ化学量論的な量でＲＮＡ干渉（従って、細胞接着を阻害する）を仲介することができることが理解される。どんな理論に束縛されることなく、本発明のｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを誘導し、触媒様態で標的ｍＲＮＡを分解すること考えられている。従って、細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態に対する標準的な治療法と比較して、治療的効果を発揮するように対象に投与される必要があるｓｉＲＮＡは、著しく少ない。
【００９０】
当業者は、例えば、対象のサイズや体重、疾患侵食度の程度（長さ）、年齢、対象の健康度と性別、投与経路、及び投与が局所的なのか全身的なのか、などの評価要素を配慮することによって、特定の対象に投与される本発明のｓｉＲＮＡの有効量を容易に決定することができる。一般的に、本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、細胞間若しくは細胞−マトリックス接着が阻害される部位での細胞内濃度が、約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭである。
【００９１】
本発明の方法において、本発明のｓｉＲＮＡは、運搬試薬との結合における裸の（ｎａｋｅｄ）ｓｉＲＮＡとして、若しくはｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミド或いはウイルスベクターとして、対象に投与され得る。
【００９２】
本発明のｓｉＲＮＡとの結合での投与に対する最適な運搬試薬は、ｔｈｅ Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ（遷移ＴＫＯ親油性試薬）、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、若しくはポリカチオン（例えば、ポリリジン）或いはリポソームを含む。好ましい運搬試薬は、リポソームである。
【００９３】
リポソームは、例えば、網膜若しくは腫瘍組織などの特定の組織へのｓｉＲＮＡの運搬を助け、ｓｉＲＮＡの血中半減期も増加することができる。本発明での使用に適したリポソームは、一般的に中性若しくは負電荷リン脂質及びコレステロールなどのステロールを含む、標準ベシクル（小胞）形成脂質から形成される。リポソームを準備するための様々な方法が知られており、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７、及び米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号公報があり、これら全体の開示はこの参照によって本発明に組み込まれる。
【００９４】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを被包するリポソームはリガンド分子を有しており、このリガンド分子は、血管新生部位、若しくは腫瘍などのＩＣＡＭ−１仲介性細胞接着が関連した他の病的過程の部位で或いは近くで、ＩＣＡＭ−１を発現する細胞に対するリポソームを標的とするものである。ＩＣＡＭ−１を発現する細胞は、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、及び腫瘍細胞を含む。腫瘍抗原若しくは内皮細胞表面抗原において広く見られる受容体と結合するリガンドは好ましい。
【００９５】
特に好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを被包しているリポソームは、例えば、構造の表面に結合するオプソニン化阻害部位を有することによって、単核マクロファージや網膜内皮性システムによるクリアランス（排除）を避けるように修飾される。１実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部位、及びリガンドの両方を有することができる。
【００９６】
本発明のリポソームを準備するために用いられるオプソニン化阻害部位は、リポソーム膜に結合する典型的に大きな親水性ポリマーである。ここで用いられたように、オプソニン化阻害部位は、化学的に或いは物理的にリポソーム膜に結合する場合、例えば、膜自体への脂質−可溶性アンカーの挿入によって、若しくは、膜脂質の活性基への直接的な結合によって、リポソーム膜へ"結合"されるものである。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、マクロファージ−単球システム（"ＭＭＳ"）及び網膜内皮性システム（"ＲＥＳ"）によるリポソームの取り込みが著しく減少した保護表面層を形成し、例えば、米国特許第４，９２０，０１６号公報に記載されており、これに開示された全体はこの参照によって本発明に組み込まれる。従って、オプソニン化阻害部位で修飾されたリポソームは、非修飾リポソームに比べて、より長く循環中に残る。この理由により、そのようなリポソームはしばしば"ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ；捕捉されない）"リポソームと呼ばれる。
【００９７】
ステルスリポソームは、多孔性或いは"漏出性"微小血管によって供給された組織内に蓄積されることが知られている。従って、そのような微小血管欠損によって特徴付けられた組織、例えば固形腫瘍などは、これらのリポソームが効率的に蓄積する（Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，１８：６９４９〜５３を参照のこと）。加えて、ＲＥＳによる減少した取り込みは、肝臓及び脾臓における蓄積を著しく阻止することによって、ステルスリポソームの毒性を低くする。従って、オプソニン化阻害部位で修飾された本発明のリポソームは、本発明のｓｉＲＮＡを腫瘍細胞へ運搬するのに特に適している。
【００９８】
リポソームを修飾するのに適しているオプソニン化阻害部位は、好ましくは、平均分子量が約５００〜約４０，０００ダルトンの水可溶性ポリマーであり、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの水可溶性ポリマーである。そのようなポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、若しくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体（例えばメトキシＰＥＧ或いはＰＰＧ、及びＰＥＧ或いはＰＰＧステアリン酸）、ポリアクリルアミド或いはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー、直線状、分枝状、或いは樹状（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ）ポリアミドアミン、ポリアクリル酸、ポリアルコール（例えば、カルボキシル基或いはアミノ基が化学的に結合したポリビニルアルコール及びポリキシリトール）、及びガングリオシドＧＭ１などのガングリオシド、を含む。ＰＥＧのコポリマー、メトキシＰＥＧ或いはメトキシＰＰＧ、若しくはそれらの誘導体も適している。加えて、前記オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧのブロックコポリマー、及びポリアミノ酸、ポリサッカライド、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、若しくはポリヌクレオチドも含むことができる。前記オプソニン化阻害ポリマーは、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン、アミノ化ポリサッカライド或いはオリゴサッカライド（直線状或いは分枝状）などのアミノ酸若しくはカルボキシル酸、若しくは、例えばカルボキシル基の結合の原因となるカルボン酸の誘導体と反応した、カルボキル化ポリサッカライド或いはオリゴサッカライド、を含む天然ポリサッカライドも含むことができる。
【００９９】
好ましくは、オプソニン化阻害部位は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、若しくはそれらの誘導体である。ＰＥＧ若しくはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、しばしば"ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）リポソーム"と呼ばれる。
【０１００】
オプソニン化阻害部位は、多数の既知技術における任意の一つによってリポソーム膜と結合可能である。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーと結合し、次に膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３、及び例えばテトロヒドロフランと水（３０：１２の割合）などの溶媒混合液を６０℃で用いて、還元性アミノ化を介してステアリルアミン脂溶性アンカーで誘導体化され得る。
【０１０１】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドは、上記で説明された。そのような組換えプラスミドは、直接若しくは、ｔｈｅ Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＬＴ１ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ（遷移ＬＴ１親油性試薬）、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、若しくはポリカチオン（例えば、ポリリジン）或いはリポソームを含む適切な運搬試薬との組み合わせで投与され得る。本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えウイルスベクターも、上記で説明されており、ＩＣＡＭ−１を発現している対象の細胞へそのようなベクターを運搬するための方法は、当業者の技術範囲内である。
【０１０２】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ−１を発現する細胞へ前記ｓｉＲＮＡを運搬するのに適したあらゆる手段によって対象へ投与され得る。ＩＣＡＭ−１を発現している細胞は、例えば、血管内皮細胞、胸腺及び他の上皮細胞、及び線維芽細胞などの非造血性細胞、及び組織マクロファージ、分裂促進因子で刺激されたＴリンパ球芽細胞、及び扁桃腺、リンパ節、パイエル板における胚中心樹状細胞などの造血性細胞を含む。当業者は、特定の細胞は特定の状態でＩＣＡＭ−１を発現する、例えば、ＩＣＡＭ−１は、糖尿病性網膜症或いはＡＭＤなどの眼球新生血管疾患における網膜血管内皮細胞で発現することを理解する。
【０１０３】
本発明のｓｉＲＮＡをＩＣＡＭ−１発現細胞へ運搬するのに適した技術としては、ジーンガン、電気穿孔法、ナノ粒子、マイクロ被包、及びそれらと同等のものによって、若しくは非経口及び経腸の投与経路によって、対象へ前記ｓｉＲＮＡを投与する方法を含む。
【０１０４】
適した経腸投与経路は、経口、直腸、若しくは鼻腔内運搬を含む。
【０１０５】
適した非経口投与経路は、血管内投与（例えば、静脈内大量瞬時投与、静脈内注入、動脈内大量瞬時投与、動脈内注入、及び脈管構造へのカテーテル滴下など）、組織周囲および組織内投与（例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注射、網膜内注射、若しくは網膜下注射など）、皮下注射、或いは（浸透圧ポンプなどによる）皮下注入を含む沈着、例えば、カテーテル或いは他の設置装置（例えば角膜ペレット或いは坐薬、目薬、若しくは多孔性、非多孔性、或いはゼラチン物質を有する移植片）による新生血管新生の領域或いは部位の周辺への直接（例えば局所的）投与、及び吸入、を含む。適した設置装置は、米国特許第５，９０２，５９８号及び第６，３７５，９７２号公報に記載された眼球移植片、及び米国特許第６，３３１，３１３号公報に記載された生分解性眼球移植片を含む。また、これら特許文献に開示された全体は、この参照により本明細書に組み込まれる。そのような眼球移植片は、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、マサチューセッツ州）、及びＯｃｕｌｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）から利用可能である。
【０１０６】
好ましい実施形態において、前記ｓｉＲＮＡの注射若しくは注入は、新生血管新生の部位に若しくは近くになされる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、眼の網膜色素上皮細胞へ運搬され得る。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡは局所的に眼へ、例えば、液体若しくはゲル状で下目瞼或いは結膜円蓋へ、投与され、これは当業者の技術範囲内である（Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ．ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３０：４２１〜４２９を参照のこと。またこの全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０７】
一般的に、本発明のｓｉＲＮＡは、約５μｌ〜約７５μｌの量で、例えば約７μｌ〜約５０μｌで、好ましくは約１０μｌ〜約３０μｌの量で、眼へ局所的に投与される。本発明のｓｉＲＮＡは、水溶液に高い溶解性を有しており、７５μｌ以上の量でのｓｉＲＮＡの眼への局所的滴下は、流出や排液による眼からのｓｉＲＮＡの損失に終わることになる。従って、高濃度のｓｉＲＮＡ（例えば、約１０〜約２００ｍｇ／ｍｌ、若しくは約１００〜約１０００ｎＭなど）を約５μｌ〜約７５μｌの量で眼へ局所滴下することによって投与することが好ましい。
【０１０８】
特に好ましい非経口投与経路は、眼内投与である。本発明のｓｉＲＮＡの眼内投与は、この投与経路によって前記ｓｉＲＮＡが眼に入ることが可能である限り、眼への注射若しくは直接（例えば局所的）投与によって達成され得る。上記の眼への局所的経路の投与に加えて、適した眼内投与経路としては、硝子体内、網膜内、網膜下、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼窩周辺及び眼窩後、トランス角膜及びトランス強膜投与を含む。そのような眼内投与経路は、当業者の技術範囲であり、例えば、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ ｅｔ ａｌ．，２００２、ｓｕｐｒａ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１７６３〜１７６９、及びＡｍｂａｔｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２１：１４５〜１５１を参照のこと（全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０９】
本発明のｓｉＲＮＡは、単一用量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）若しくは複数用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で投与され得る。本発明のｓｉＲＮＡを注入で投与する場合、この注入は単一持続性用量である、若しくは複数注射（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって運搬され得る。組織への直接的な前記ｓｉＲＮＡの注射は、新生血管新生の部位若しくはその近くであることが好ましい。新生血管新生の部位若しくはその近くの組織への前記ｓｉＲＮＡの複数注射は、特に好ましい。
【０１１０】
当業者は、本発明のｓｉＲＮＡを所定の対象へ投与するための適切な用量処方を容易に決定することもできる。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、単一注射若しくは新生血管新生部位へ若しくはその近くへの沈着など、対象へ一度で投与され得る。或いは、前記ｓｉＲＮＡは、毎日若しくは週１回で複数回、対象へ投与され得る。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、約３〜約２８週間、より好ましくは約７〜約１０週間の期間で、週１回対象へ投与され得る。好ましい用量処方において、前記ｓｉＲＮＡは、新生血管新生の部位へ若しくはその近くへ（例えば硝子体内へ）、週１回で７週間注射され得る。無期限の期間での本発明のｓｉＲＮＡの周期的な投与は、ｗｅｔ ＡＭＤ若しくは糖尿病性網膜症などの慢性新生血管新生病を患った対象にとって必要となることが理解される。
【０１１１】
用量処方が複数投与である場合、対象に投与されるｓｉＲＮＡの有効量は、全体の用量処方を超えて投与されたｓｉＲＮＡの総量より成ることが理解される。
【０１１２】
本発明のｓｉＲＮＡは、本分野で知られた技術によって、対象に投与する前に薬学的組成物として処方されることが好ましい。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌で発熱物質を含まないものとして特徴付けられる。ここで用いられる、"薬学的な処方"とは、ヒトへの及び獣医学的な使用に対する処方を含む。本発明の薬学的組成物を調合する方法は、当業者の技術範囲内であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ ｅｄ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に記載されており、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
本発明の薬学的な処方は、生理学的に許容可能な担体培地と混合された、本発明のｓｉＲＮＡ（例えば、０．１〜９０重量％）、若しくは生理学的に許容可能なその塩類を有する。好ましい生理学的に許容可能な担体培地は、水、緩衝液、食塩水（例えば、通常食塩水若しくはハンクス或いはアール平衡塩類溶液などの平衡塩類溶液）、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、及びそれらと同等のものである。
【０１１４】
本発明の薬学的組成物は、従来の薬学的賦形剤及び／若しくは添加剤も有する。適した薬学的賦形剤は、安定剤、抗酸化剤、重量モル浸透圧濃度調節因子、緩衝液、及びｐＨ調節因子を含む。適した添加剤は、生理学的な生体適合性緩衝液（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレートの添加（例えばＤＴＰＡ若しくはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）或いはカルシウムキレート複合剤（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなど）、若しくは任意に、カルシウム或いはナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、或いは乳酸カルシウムなど）を含む。本発明の薬学的組成物は、液状での使用のために調合（包装）される、若しくは凍結乾燥される。
【０１１５】
眼への局所的投与のために、従来の眼内運搬因子が用いられ得る。例えば、局所的眼内運搬のための本発明の薬学的組成物は、上述した食塩水、角膜浸透増進剤、不溶性粒子、ワセリン或いは他のゲル状軟膏、眼における滴下による粘性増加に耐えるポリマー、若しくは粘膜付着性ポリマーを有する。好ましくは、前記眼内運搬因子は、角膜浸透が増加する、若しくは粘性効果を通じて、或いは角膜上皮を覆っているムチン層との物理化学的な相互作用によって前記ｓｉＲＮＡの眼前（ｐｒｅｏｃｕｌａｒ）保持を延長する。
【０１１６】
局所的眼内運搬に適した不溶性粒子は、リン酸カルシウム粒子（Ｂｅｌｌらによる米国特許第６，３５５，２７１号公報に記載されており、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。眼における滴下による粘性増加に耐える、適したポリマーは、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ ４０７などのポリエチルエネポリオキシプロピレンブロックコポリマー（例えば２５％濃度）、セルロースアセトフタル酸（例えば、３０％濃度）、若しくはＧｅｌｒｉｔｅ（商標）（ＣＰ Ｋｅｌｃｏ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、デラウェア州）などの低アセチルゲラン（ｇｅｌｌａｎ）ガムを含む。適した粘膜付着性ポリマーは、カルボキシル、ヒドロキシル、アミド及び／若しくは硫酸基などの多数の親水性機能基を有する親水コロイド（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸、高分子量ポリエチレングリコール（例えば平均分子量が>２００，０００）、デキストラン、ヒアルロン酸、ポリガラクツロ酸、及びキシロカン（ｘｙｌｏｃａｎ））を含む。適した角膜浸透増進剤は、シクロデキストリン、ベンザルコニウム塩化物、ポリオキシエチレングリコールラウリルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（商標）３５）、ポリオキシエチレングリコールステアリルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（商標）７８）、ポリオキシエチレングリコールオレイルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（商標）９８）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジギトニン、タウロコール酸ナトリウム、サポニン、及びＣｒｅｍａｐｈｏｒ ＥＬなどのポリオキシエチル化ヒマシ油を含む。
【０１１７】
固体組成物のために、従来の無毒性固体単体が用いられ得、例えば、薬学的グレードのマンニトール、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム（滑石粉）、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム炭酸塩、及びそれらと同等なものである。
【０１１８】
例えば、経口投与のための固体薬学的組成物は、上記の任意の担体と賦形剤、及び１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１若しくはそれ以上の本発明のｓｉＲＮＡを有する。エアロゾル（吸入性）投与のための薬学的組成物は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１若しくはそれ以上の本発明のｓｉＲＮＡを有し、このｓｉＲＮＡは上述したようにリポソームに被包され、噴霧剤となる。例えば鼻腔内運搬のためのレシチンなどの担体も要望通りに含むことができる。
【０１１９】
本発明は、以下の限定されない実施例によって説明される。
【実施例１】
【０１２０】
ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡによるヒトＩＣＡＭ−１発現の阻害
サイトカイン若しくは低酸素によるＨＥＫ−２９３細胞中のＩＣＡＭ−１産生の刺激
ヒト胚性腎（ＨＥＫ）−２９３細胞におけるＩＣＡＭ−１の産生を刺激するための、低酸素若しくはサイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）やインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の能力を評価した。
【０１２１】
ＨＥＫ−２９３細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で一晩、２４ウェルプレートにおいて標準成長培養液で培養した。次に細胞を、１、１０、１００或いは１０００ｎｇのＴＮＦ−α若しくはＩＦＮ−γ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）で別々に処理した、若しくは、１００、２００或いは３００ｍＭデスフェリオキサミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）での処理によって低酸素とした。サイトカイン若しくはデスフェリオキサミンでの処理の１或いは２日後、細胞をＭ−ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（哺乳類タンパク質抽出試薬）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）で溶解した。ヒトＩＣＡＭ−１ ＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅヒト"ｓＩＣＡＭ１"ＥＬＩＳＡ手順に記載されたように、細胞溶解液で実行し、このＥＬＩＳＡの結果はＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で検出した。
【０１２２】
図１に示すように、ＨＥＫ−２９３細胞におけるヒトＩＣＡＭ−１タンパク質のレベルが上昇した唯一の条件は、１００ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−αで２日間細胞を処理したものであった。
【０１２３】
ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡによる、刺激されたＨＥＫ−２９３細胞の処理
ＨＥＫ−２９３細胞を、実施例１のように一晩培養した。細胞が約５０％コンフルエントになった時、実験細胞と対照細胞への形質移入を次の日実行した。実験細胞は、リン酸カルシウム形質転換試薬で混合した２５ｎＭヒトＩＣＡＭ−１ ｓｉＲＮＡで形質転換した。対照細胞は、ｓｉＲＮＡを欠いたリン酸カルシウム試薬で、若しくはリン酸カルシウム形質転換試薬中の２５ｎＭ非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）で処理した。
【０１２４】
実験細胞に対しては、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ内の異なる位置を標的とした１０個のｓｉＲＮＡを試験した。これらのｓｉＲＮＡは、表２に挙げた配列を標的としており、全てのｓｉＲＮＡは、３’ＴＴオーバーハングを各鎖に含んでいた。
【０１２５】
【表２】
【０１２６】
形質転換４時間後、ＨＥＫ−２９３細胞中のＩＣＡＭ−１の産生は、最終濃度１００ｎｇ/ｍｌでのＴＮＦ−αで処理することによって刺激した。形質転換後４８時間で、全てのウェルから上清を除去した。実験細胞及び対照細胞の第１群は、Ｍ−ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）で溶解した。ヒトＩＣＡＭ−１ ＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）を、実施例１と同様に細胞溶解液で実行した。図２に示したように、ｈＩＣＡＭ１＃２、ｈＩＣＡＭ１＃３、ｈＩＣＡＭ１＃７、ｈＩＣＡＭ１＃９、及びｈＩＣＡＭ１＃１０のｓｉＲＮＡで刺激された、ＨＥＫ−２９３細胞中に誘導されたＩＣＡＭ−１タンパク質のレベルは、ｓｉＲＮＡなし、若しくは非特異的ｓｉＲＮＡで形質転換された細胞と比較して減少した。
【０１２７】
細胞毒性アッセイは、実験細胞及び対照細胞の第２群で実行した。上述したように形質転換後４８時間で上清を除去した後、１０％ ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、カナダ）を含む完全増殖培養液を、対象細胞及び実験細胞へと添加し、３７℃、５％ ＣＯ２で３時間インキュベートした。細胞増殖は、細胞恒常性活性に起因する培養液の色変化を検出することによって測定した。この色変化は、ＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で検出し、その結果は図３に示した。図３から分かるように、ｈＩＣＡＭ１＃１〜９はＨＥＫ−２９３細胞における著しい細胞毒性を示さなかった。ｈＩＣＡＭ１＃１０は、対照細胞と比較して、ＨＥＫ−２９３細胞増殖のわずかな減少を引き起こした。
【０１２８】
細胞毒性アッセイが実行された後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを含む増殖培養液を完全に除去し、製造者説明書に従ってＲＮＡｑｕｅｏｕｓ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＲＮＡ単離キット）（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）を用いて、ＲＮＡをＨＥＫ−２９３細胞から抽出した。前記細胞中のヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのレベルは、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定し、内部標準としてはヒトグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのレベルを用いた。このＲＴ−ＰＣＲ実験によって、ＴＮＦ−αによって誘導されたＩＣＡＭ−１の産生は、ｓｉＲＮＡなし若しくは非特異的ｓｉＲＮＡで形質転換された細胞と比較して、ヒトＩＣＡＭ−１ ｓｉＲＮＡによって、転写レベルで抑制された。
【実施例２】
【０１２９】
ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡによるストレプトゾトシン誘導糖尿病性網膜症の治療
糖尿病性網膜症を患った個人の網膜における血管漏出と非灌流は、空間的、時間的に白血球静止と関連している。例えばＭｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６（１９）：１０８３６〜４１を参照し、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、白血球静止を減少し、従って糖尿病ラットにおける網膜血管透過性を減少すると予想される。
【０１３０】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ（ロングエバンス）ラット（約２００ｇ）に、一晩後、糖尿病を誘導するために、クエン酸緩衝液中のストレプトゾトシンを硝子体内に注射する。Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（約２００ｇ）に、一晩後、対照としてクエン酸緩衝液のみを注射する。血清血液糖を測定し、血圧を毎日記録する。対照動物と比較しての血清血液糖レベルの上昇は、糖尿病であると考えられる。
【０１３１】
ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、各ラットにおいてＯＤを実行する。非特異的ｓｉＲＮＡは対照ＯＳとして注射される。全体の群図式は、表３に示している。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、処理後７日目で、ラットをＡｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ（アクリジンオレンジ白血球蛍光光度分析：ＡＯＬＦ）に供する。簡潔に言うと、ラットを麻酔し、その瞳孔をトロピカミドで散大した。次にラットに無菌生理食塩水中に懸濁されたアクリジンオレンジを硝子体内に注射する。各眼の眼底を観察し、スキャニングレーザー眼底鏡（光源としてアルゴンブルーレーザー）を用いて白血球静止を画像化する。次にラットをフルオレセインデキストランで灌流し、眼をさらに画像化する。白血球静止の密度を、１０ディスク直径範囲における光ピクセルのパーセンテージとして計算する。この白血球静止の密度はエンドポイントとして用いられる。
【０１３４】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、７日目にラットはアイソトープ希釈技術にも供し、血管漏出を定量化する。簡潔に言うと、ラットに、第１の時点でＢＳＡ中のＩ１２５を、第２の時点でＩ１３１を硝子体内に注射する。このラットは第２の注射後、数分で屠殺し、その網膜を単離し、動脈サンプルを採取する。前記網膜及び前記動脈サンプルは、ヨウ素クリアランスの定量的指標を用いて網膜における活性を補正した後、γ−分光法を用いて解析する。次に測定値を、正確な用量を投与するために、体重及び組織重量を基に規準化する。γ活性の補正された量は、網膜内の血管漏出のマーカーとして用いる（第２エンドポイント）。実験動物の網膜内で減少するであろうγ活性は、血管漏出の減少を意味している。
【実施例３】
【０１３５】
ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡによるＶＥＧＦ誘導血管透過性及び白血球静止の治療
眼内のＶＥＧＦの存在は、網膜内の血管透過性及び毛細血管非灌流の増加に対応する、網膜白血球静止を引き起こす。例えば、Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６（５）：１７３３〜９を参照し、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、ラット内でＶＥＧＦの硝子体内注射によって作られた透過性及び白血球静止を減少すると予想される。
【０１３６】
Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（約２００ｇ）に麻酔をし、緩衝液ＯＵ中のＶＥＧＦを硝子体内に注射する。ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡは、硝子体内注射によって各ラットへ同時にＯＤを運搬する。非特異的ｓｉＲＮＡは対照ＯＳとして硝子体内に注射する。付加的な対照は、緩衝液のみ（ＶＥＧＦなし）を注射されたラットを含む。全体の群図式は、表４に示している。
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
注射後２４時間で、実施例１に記載したように、ラットをＡＯＬＦ、及びアイソトープ希釈技術に供する。
【実施例４】
【０１３９】
ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡによる角膜／辺縁系損傷を患った眼における新血管新生の治療
眼球表面の損傷は、角膜辺縁系幹細胞の破壊を生じる。これらの細胞の破壊は、ＶＥＧＦ依存性角膜新血管新生を誘導し、これは失明を導く。新血管新生を促進するＶＥＧＦは、好中球及び単球によって供給され、眼球表面に対する損傷の後、角膜を浸潤する。例えば、Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７（４）：１２７７〜８１を参照し、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。辺縁系損傷の後で角膜に適用される、ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡは、マウスにおける角膜の新血管新生の結果生じる領域を減少するであろうと予想される。新血管新生領域は、直接測定される。或いは、角膜新血管新生における減少は、角膜におけるＶＥＧＦ産生多形核細胞の数の減少から推測され得る。
【０１４０】
角膜新血管新生は、Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（ｓｕｐｒａ）で記載されたように、辺縁系の損傷によって、Ｃ５７Ｂ１／６において誘導される。簡潔に言うと、マウスを麻酔し、水酸化ナトリウムを角膜へ適用する。前記角膜と辺縁系上皮は、角膜ナイフを用いて壊死組織切除した（ＯＵ）。ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡを、除去後すぐ、及び実験の間（７日間）１日３回、角膜表面ＯＤに適用した。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照と同じ用量投与計画でＯＳに投与した。
【０１４１】
Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０００），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、角膜及び辺縁系上皮の壊死組織切除後２、４、及び７日目に、マウスは角膜新血管新生の程度を評価する。簡潔に言うと、内皮特異的フルオレセイン共役レクチンを硝子体内に注射する。注射後３０分で、マウスを屠殺し、その眼を回収し、２４時間ホルマリンで固定する。角膜のフラットマウント（ｆｌａｔ ｍｏｕｎｔｓ）を作成し、この角膜フラットマウントの写真を蛍光顕微鏡下で撮り、解析のためにＯｐｅｎｌａｂソフトウェアにインポートする。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを用いて、血管が見られる所でのみ蛍光の閾値レベルを設定する。蛍光血管の領域及び角膜の領域（辺縁系アーケードで境界を画定された）を計算する。血管の領域は、総角膜領域で分割され、この値は、新血管領域のパーセントと等しい。処置群及び対照群の新血管領域のパーセントを比較する。
【０１４２】
Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０００），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、角膜及び辺縁系上皮の壊死組織切除後２、４、及び７日目に、付加的なマウスは、角膜多形核細胞（ＰＭＮｓ）の定量化のために屠殺する。簡潔に言うと、マウスを屠殺し、その眼を回収し、２４時間ホルマリンで固定する。ホルマリン固定の後、眼球除去された眼をパラフィンで包埋し、切片を作成した。角膜の解剖学的な中心と相関する、各眼からの１つのパラフィン切片を選択し、顕微鏡用に用いる。この１切片上のＰＭＮｓ（多小葉からなる細胞として同定される）を数え、処理群及び対照群からの切片中のＰＭＮｓの数を比較する。
【実施例５】
【０１４３】
ＩＣＭＡ−１を標的としたｓｉＲＮＡによるレーザー誘導脈絡叢新血管新生の治療
Ｂｒｕｃｈ’ｓ膜を破裂するレーザー光凝固は、ウェット黄斑変性症において見られるものと同様な、脈絡叢新血管新生（ＣＮＶ）を誘導する。ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、マウスにおけるレーザー誘導ＣＮＶの領域を減少すると予想される。
【０１４４】
ＣＮＶはマウスにおいて、Ｓａｋｕｒａｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．&Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ．４４（６）：２７４３〜９（この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）に記載された手順によって誘導する。簡潔に言うと、Ｃ５７Ｂ１／６マウスを麻酔し、その瞳孔をトロピカミドで散大する。このマウスの網膜を、各網膜ＯＵの９、１２、及び３時の位置における１レーザースポットを用いてレーザー光凝固化する。レーザー光凝固化に続いて即座に、ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡを、ＯＤへ硝子体内に注射する。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照としてＯＳへ硝子体内に注射する。
【０１４５】
レーザー光凝固化の後１４日で、マウスを屠殺し、Ｓａｋｕｒａｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００３），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、ＣＮＶ領域定量化のために網膜フラットマウントを準備する。簡潔に言うと、マウスに麻酔をし、胸部を開き、下行性大動脈を遮断（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｍｐｅｄ）する。次に右心房を挟み、フルオレセイン標識デキストランを左心室にゆっくりと注射する。
【０１４６】
フルオレセイン標識デキストランの注射後、眼を眼球除去し、２４時間、パラホルムアルデヒドで固定する。次に前眼房及び網膜を除去し、解析のために、各脈絡叢のフラットマウントを準備する。脈絡叢フラットマウントは、蛍光顕微鏡下で写真を撮ることによって解析し、その写真をＯｐｅｎｌａｂソフトウェアへインポートする。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを用いて、新血管新生の領域の輪郭を描き（ｏｕｔｌｉｎｅｄ）、定量化する（その際、既知のレーザー位置を蛍光タフトと比較することを必ずすること）。処理動物の新血管新生領域を、対照動物の新血管新生領域と比較する。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、未処理ＨＥＫ−２９３細胞（"未処理"）の可溶化、若しくは１、１０、５０、１００ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子アルファ（"ＴＮＦ−α"）、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌのインターフェロンガンマ（"ＩＦＮ−γ"）、及び１００、２００、３００μＭのデスフェリオキサミン（"ＤＦＸ"）で１若しくは２日間処理したＨＥＫ−２９３細胞の可溶化液におけるヒトＩＣＡＭ−１タンパク質濃度の柱状図を示したものであり、それぞれはＯＤ４５０ナノメーターでＥＬＩＳＡによって測定した。
【図２】図２は、未処理ＨＥＫ−２９３細胞（"−"）の可溶化液、若しくは１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで処理したＨＥＫ−２９３細胞（"＋"）の可溶化液におけるヒトＩＣＡＭ−１タンパク質濃度の柱状図を示したものであり、それぞれはＯＤ４５０ナノメーターでＥＬＩＳＡによって測定した。前記細胞は、ｓｉＲＮＡでの形質移入なし（"なし"）、非特異的ｓｉＲＮＡで形質移入した（"ＥＧＦＰ"）、若しくはヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを標的とした１０個の異なるｓｉＲＮＡで形質移入した（"ｈＩＣＡＭ１＃１〜１０"）ものである。
【図３】図３は、未処理ＨＥＫ−２９３細胞（"−"）の可溶化液、若しくは１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで処理したＨＥＫ−２９３細胞（"＋"）の可溶化液における細胞毒性の柱状図を示したものであり、それぞれはＯＤ４５０ナノメーターでＥＬＩＳＡによって測定した。前記細胞は、ｓｉＲＮＡでの形質移入なし（"なし"）、非特異的ｓｉＲＮＡで形質移入した（"ＥＧＦＰ"）、若しくはヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを標的とした１０個の異なるｓｉＲＮＡで形質移入した（"ｈＩＣＡＭ１＃１〜１０"）ものである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、２００３年１月１６日出願の米国仮出願番号第６０／４４０，５７９号明細書に対して優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、特に、細胞間接着に関する疾患若しくは状態を治療するための、低分子干渉ＲＮＡによるＩＣＡＭ−１遺伝子発現の制御に関するものある。
【背景技術】
【０００３】
多くの生理学的過程において、細胞は、他の細胞若しくは細胞外マトリックスに密接に接触し、接着していることが必要とされている。細胞−細胞、及び細胞−マトリックス間の相互作用は、細胞間接着分子若しくは"ＩＣＡＭｓ"のいくつかのファミリーを通じて仲介される。
【０００４】
ＩＣＡＭ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーの１１０キロダルトンメンバーであり（Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ.，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３３１:６２４〜６２７）、限られた数の細胞上に発現し、刺激がなければ低レベルで発現する（Ｄｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７，２４５〜２５４）。炎症介在物質で刺激した場合、異なる組織で様々な細胞タイプがそれらの表面に高レベルでＩＣＡＭ−１を発現する（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｄｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｒｏｔｈｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１６６５〜１６６９）。刺激されＩＣＡＭ−１を発現した細胞は、血管内皮細胞、胸腺や他の上皮細胞、及び線維芽細胞などの非造血性細胞、及び組織マクロファージ、分裂促進因子で刺激されたＴリンパ球芽細胞、及び扁桃腺、リンパ節、パイエル板における胚中心樹状細胞などの造血性細胞を含む。ＩＣＡＭ−１誘導は、ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの転写の増加を介して生じ（Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ.，ｓｕｐｒａ）、誘導後４時間で検出可能になり、誘導後１６〜２４時間でピークとなる。
【０００５】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によって、ＩＣＡＭ−１に対する抗体がサイトカイン活性化内皮細胞への白血球の接着を阻害することが示された（Ｂｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０９５〜３０９９；Ｄｕｓｔｉｎ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９８８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０７：３２１〜３３１）。従って、ＩＣＡＭ−１発現は、免疫細胞の炎症部位への血管外遊走に必要とされるように見える。ＩＣＡＭ−１に対する抗体は、Ｔ細胞死滅、混合性リンパ球反応、及びＴ細胞仲介性Ｂ細胞分化も阻害し、これはＩＣＡＭ−１がこれら同族細胞相互作用に必要であることを意味している（Ｂｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。抗原が存在する場合のＩＣＡＭ−１の関与は、ＩＣＡＭ−１欠損マウスＢ細胞変異が抗原依存性Ｔ細胞増殖を刺激することができないことによって示された（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４０８２〜４０９１）。反対に、マウスＬ細胞は、ヒトＴ細胞に対する抗原が存在するために、ＨＬＡ−ＤＲに加えてヒトＩＣＡＭ−１での形質移入を必要とする（Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３３８：５１２〜５１４）。従って、ＩＣＡＭ−１機能を阻害することによって、移植拒絶の間の免疫細胞の認識と活性を阻害することができ、リュウマチ性関節炎、喘息、及び再灌流損傷の動物モデルの治療に有効である。
【０００６】
ＩＣＡＭ−１の発現は、アレルギー性接触皮膚炎、固定薬剤皮疹、扁平苔癬、及び乾癬などの炎症性皮膚障害にも関連している（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２２：６４〜６８；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ａｎｄ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，１９８９，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３５：１０４５〜１０５３；Ｌｉｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２０：４７９〜４８４；Ｓｈｉｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２５：１３７１〜１３７６）。さらに、ＩＣＡＭ−１発現は、リウマチ性関節炎の患者の滑膜において（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｒｔｈ.Ｒｈｅｕｍ.，３２:２２〜３０）、糖尿病の膵臓Ｂ細胞において（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ８６:４２８２〜４２８６）、バゼドウ病の患者の甲状腺濾胞細胞において（Ｗｅｅｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２２:１８５〜１９１）、腎臓及び肝臓同種移植片拒絶において（Ｆａｕｌｌ ａｎｄ Ｒｕｓｓ，１９８９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４８:２２６〜２３０;Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｌａｎｃｅｔ １１２２〜１１２５）、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）組織において（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｔ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４６:４２５〜３４）も検出された。
【０００７】
ＩＣＡＭ−１発現は、既存の血管からの新規血管の形成である血管新生においても関係がある。血管新生とは、細胞遊走、増殖、及び分化に関連した内皮細胞遺伝子発現の特性の変化を伴う複雑な過程であり、親血管の基底膜の局在性分解から始まるものである。次にその内皮細胞は親血管から間質性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へと遊走し、ＥＣＭの内皮細胞の継続した遊走や増殖に起因して伸張する毛細血管出芽を形成する。血管新生の間の内皮細胞とＥＣＭとの相互作用は、部分的にはＩＣＡＭ−１発現の増加によって引き起こされる細胞−マトリックス接触の変化を必要とする。
【０００８】
異常血管新生、若しくは新規血管の病的な増殖は、様々な状態を意味している。これらの状態としては、糖尿病性網膜症、乾癬、滲出性若しくは"濡れた"年齢関連性黄斑変性症（"ＡＭＤ"）、リュウマチ性関節炎や他の炎症疾患、及びほとんどの癌が挙げられる。ＡＭＤは特に、臨床的に重要な血管新生病である。この状態は、高齢者の片目若しくは両目における脈絡叢新生血管によって特徴付けられ、先進工業国における失明の主要な原因である。
【０００９】
糖尿病Ｉ型で共通に見られるいくつかの合併症にも、ＩＣＡＭ−１の発現が関与している。例えば毛細血管内皮への白血球のＩＣＡＭ−１仲介性接着（"ｌｅｕｋｏｓｔａｓｉｓ"とも呼ばれる）は、糖尿病の特定の組織、例えば網膜、末梢神経、及び腎臓などにおいて微小血管虚血を引き起こすことができる。これはこれらの組織の毛細非灌流を生じ、次に糖尿病性網膜症（Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６:１７３３〜１７３９；Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ ＵＳＡ ９６:１０８３６〜１０８４）、神経障害（Ｊｕｄｅ ＥＢ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４１：３３０〜６）、若しくは腎障害を導く。Ｍｉｙａｍｏｔｏら（１９９９，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ ＵＳＡ ９６：１０８３６〜１０８４１）は、ＩＣＡＭ−１仲介性ｌｅｕｋｏｓｔａｓｉｓの阻害によって糖尿病に関連した網膜異常を阻害することができると示唆した。しかしながら、少なくとも１つの研究では、糖尿病の"ウィスター系脂肪"ラットモデルにおける糖尿病性腎障害の発展には、糸球体におけるＩＣＡＭ−１発現の関与は見られないと報告した（Ｍａｔｓｕｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．３２：1〜9）。
【００１０】
ＩＣＡＭ−１は、糖尿病Ｉ型における大血管性疾患（例えば冠動脈疾患、脳血管疾患、及び末梢血管疾患など）の発病にも関与しており、これは部分的には、アテローム性動脈硬化症の促進、及び血栓症の増加に起因するものである。例えば、ＩＣＡＭ−１は、アテローム性硬化硬化型プラークにおいて発見され、糖尿病におけるアテローム性動脈硬化症の開始と発展を伴っているようである（Ｊｕｄｅ ＥＢ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３：１８５〜１８９）。
【００１１】
従って、ＩＣＡＭ−１は、正常過程及び病態生理学的過程の両方において絶対不可欠な役割を担っている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２２３〜２５２）。従って、ＩＣＡＭ−１機能或いは発現を阻害することによる細胞接着を媒介するための戦略が開発されてきた。そのような戦略では一般的に、抗ＩＣＡＭ−１抗体、ＩＣＡＭ−１結合を競合的に阻害するリガンド、若しくはＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸分子を用いる。しかしながら、そのような治療で用いられた作用因子は、ＩＣＡＭ−１の化学量論的な減少のみ産生し、一般的には罹患細胞若しくは活性化細胞によるＩＣＡＭ−１の異常な高産生によって圧倒される。従って、これらの戦略によって達成された結果は満足できるものではなかった。
【００１２】
ＲＮＡ干渉（以後"ＲＮＡｉ"とする）は、転写後遺伝子制御の方法であり、多くの真核生物を通じて保存されているものである。ＲＮＡｉは、すべての細胞に存在する、短い（例えば、<３０ヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ（"ｄｓＲＮＡ"）分子によって誘導される（Ｆｉｒｅ Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０５〜８１１）。"低分子干渉ＲＮＡ"若しくは"ｓｉＲＮＡ"と呼ばれるこれらの短いｄｓＲＮＡ分子は、前記ｓｉＲＮＡと配列相同性を有しているメッセンジャーＲＮＡｓ（"ｍＲＮＡｓ"）を破壊することで１ヌクレオチドの範囲での分解を引き起こす（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１５：１８８〜２００）。このｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡは、前記標的ｍＲＮＡを切断する"ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体"若しくは"ＲＩＳＣ"に結合すると考えられている。ｓｉＲＮＡは明らかに複数−回転（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｔｕｒｎｏｖｅｒ）酵素と同様に再利用され、１つのｓｉＲＮＡ分子は約１０００ｍＲＮＡ分子の切断を誘導することが可能である。従って、ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ仲介ＲＮＡｉ分解は、標的遺伝子の発現を阻害するための現在利用可能な技術に比べてより効果的である。
【００１３】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭら（（２００１），ｓｕｐｒａ）は、２１及び２２ヌクレオチド長で短い３’オーバーハングを有する合成ｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエ細胞可溶化液中の標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを誘導することができることを示した。培養哺乳類細胞でも合成ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉが見られ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４〜４９８）、さらに、合成ｓｉＲＮＡによって誘導されたＲＮＡｉ分解は最近、生きているマウスでも示された（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ＡＰ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８：３８〜３９；Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０）。ｓｉＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉ分解の治療上の潜在能力は、ＨＩＶ−１感染のｓｉＲＮＡ指向性（ｓｉＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）阻害（Ｎｏｖｉｎａ ＣＤ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：６８１〜６８６）、及び神経毒性ポリグルタミン疾患タンパク質発現の減少（Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），ｓｕｐｒａ）を含む、最近のいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究で実証された。
【００１４】
従って、ＩＣＡＭ−１仲介性細胞接着を効果的に減少する若しくは阻害するＩＣＡＭ−１の発現を阻害する、触媒的若しくは半化学量論的量の作用因子が必要とされている。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、特にＩＣＡＭ−１遺伝子からのｍＲＮＡのＲＮＡｉ誘導分解を標的にし、それを引き起こすｓｉＲＮＡに関するものである。本発明のｓｉＲＮＡ化合物や組成物は、細胞接着及び細胞接着仲介性病態を治療するために用いられる。特に、本発明のｓｉＲＮＡは、例えば、癌性腫瘍、年齢関連性黄斑変性症、及び他の血管新生病の治療などにおいて、血管新生を阻害するために有用である。
【００１６】
従って、本発明は、ヒトＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング型、変異体若しくは同族体を標的とする単離されたｓｉＲＮＡを提供する。前記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ二本鎖を形成するセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖とを有する。前記センスＲＮＡ鎖は、標的ｍＲＮＡにおける近接した約１９〜約２５ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を有している。
【００１７】
本発明は、本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドとウイルス性ベクター、さらに本発明のｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物も提供する。
【００１８】
本発明はさらに、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング型、変異体、若しくは同族体の発現を阻害する方法を提供し、これは標的ｍＲＮＡが分解されるように本発明のｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有するものである。
【００１９】
本発明はさらに、細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態を治療する方法も提供し、これはヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング型、変異体、若しくは同族体を標的としたｓｉＲＮＡの有効量をそのような治療を必要としている対象に投与する工程を有するものである。
【００２０】
本発明はさらに、対象における血管新生を阻害する方法も提供し、これはヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング型、変異体若しくは同族体を標的としたｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有するものである。
【００２１】
本発明はさらに、対象における糖尿病Ｉ型による合併症を治療する方法も提供し、これはヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング型、変異体若しくは同族体を標的としたｓｉＲＮＡの有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する工程を有するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
特に指示しない限り、この中の全ての核酸配列は５’から３’方向に示されているものとする。また、核酸配列における全てのデオキシリボヌクレオチドは、大文字で表されており（例えばデオキシチミジンは"Ｔ"である）、核酸配列におけるリボヌクレオチドは、小文字で表されている（例えばウリジンは"ｕ"である）。
【００２３】
ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡを有する組成物及び方法は、細胞接着及び細胞接着仲介性病態の阻害若しくは予防において有利に用いられる。ここで用いられたように"細胞接着及び細胞接着仲介性病態"とは、疾患若しくは状態を発病する及び／若しくは維持するために、ある細胞と他の細胞との若しくはある細胞と細胞外マトリックスとのＩＣＡＭ−１仲介性接着を必要とするあらゆる疾患若しくは状態を言及する。例えば、血管新生は内皮細胞の細胞外マトリックスとのＩＣＡＭ−１仲介性接着を必要とするように、当業者にとってそのような疾患や状態は周知である。さらに、炎症部位への免疫細胞の血管外遊走は、白血球のサイトカイン活性化内皮細胞へのＩＣＡＭ−１仲介性接着を必要とする。他の細胞接着及び細胞接着仲介性病態としては、ＡＩＤＳ関連性痴呆、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、血管新生（病原性若しくは非病原性血管新生を含む）、抗原提示、喘息、アテローム性動脈硬化症、ある種の毒性及び免疫性腎炎、接触性経皮過敏症、角膜／辺縁系損傷、糖尿病Ｉ型、例えば糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、及び大血管性疾患などの糖尿病Ｉ型から生じる合併症、バゼドウ病、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎やクローン病を含む）、炎症性肺疾患、ウイルス感染の炎症性続発症、炎症性皮膚障害（例えば、アレルギー性接触皮膚炎、固定薬剤皮疹、扁平苔癬、及び乾癬など）、腎臓、肝臓及び骨髄移植を含む移植（同種移植）拒絶における免疫細胞認識と活性、免疫細胞相互作用（例えば、Ｔ細胞死滅、混合性リンパ球反応、及びＴ細胞仲介性Ｂ細胞分化など）、髄膜炎、多発性硬化症、多発性骨髄腫、心筋症、肺線維症、再灌流損傷、再狭窄、網膜炎、リュウマチ性関節炎、敗血性関節炎、脳卒中、腫瘍増殖と転移、及びｕｖｅｉｔｉｔｉｓを含む。
【００２４】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ−１遺伝子のタンパク質産物が産生しない、若しくは少量で産生されるように、ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こす。ＩＣＡＭ−１遺伝子産物は、特定の細胞間若しくは細胞−ＥＣＭ接着現象を必要とするため、ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ仲介性分解は細胞間若しくは細胞−ＥＣＭ接着を阻害する。従って、細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態は、本発明のｓｉＲＮＡを用いてＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ分解を誘導することによって治療され得る。
【００２５】
従って、本発明は単離されたｓｉＲＮＡを提供し、これは、前記標的ｍＲＮＡを標的とした約１７ヌクレオチド〜２９ヌクレオチド長の、好ましくは約１９〜２５ヌクレオチド長の短い二本鎖ＲＮＡを有するものである。前記ｓｉＲＮＡは、標準ワトソン−クリック塩基対相互作用（ここでは以後"塩基対の（ｂａｓｅ−ｐａｉｒｅｄ）"とする）によってアニールされたセンスＲＮＡ鎖と相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖とを有している。以下により詳細に記載されているように、前記センス鎖は、前記標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と実質的に同一な核酸配列を有している。
【００２６】
ここで用いられたように、前記標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と"実質的に同一な"核酸配列とは、標的配列と同一な、若しくは１若しくはそれ以上のヌクレオチドが前記標的配列とは異なっている、核酸配列である。標的配列に実質的に同一な核酸配列を有する本発明のセンス鎖は、そのようなセンス鎖を有するｓｉＲＮＡが前記標的配列に含まれるｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を誘導するという点で特徴付けられる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解がｓｉＲＮＡによって誘導される限りで、１、２、或いは３、若しくはそれ以上のヌクレオチドが標的配列と異なっている核酸配列を有しているセンス鎖を有することができる。
【００２７】
本発明のｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖は、２つの相補的で一本鎖ＲＮＡ分子を有することができる、若しくは２つの相補的な部分は塩基対であり、一本鎖"ヘアピン"領域で共有結合的にリンクしている、１分子を有することができる。あらゆる理論に束縛されることなく、後者タイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、"ダイサー"タンパク質（若しくはその等価物）によって細胞間を切断され、２つの独立した塩基対ＲＮＡ分子を形成すると信じられている（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），ｓｕｐｒａを参照のこと）。
【００２８】
ここで用いられたように"単離された"とは、合成の、若しくはヒトの介入を通じて天然状態から変化した或いは除去されたことを意味する。例えば、生きた動物中に天然に存在するｓｉＲＮＡは"単離され"てないが、合成ｓｉＲＮＡ、若しくはその天然状態の共存物質から部分的に或いは完全に分離されたｓｉＲＮＡは"単離され"ている。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で存在し得る、若しくは例えば、ｓｉＲＮＡが運搬された細胞などの非天然環境中に存在し得る。一例として、天然過程により細胞内部に生産されるが、"単離された"前駆分子から生成されるｓｉＲＮＡは、"単離された"分子である。従って、単離されたｄｓＲＮＡ若しくはタンパク質は、標的細胞へ導入され得、ダイサータンパク質（若しくはその等価物）によって単離されたｓｉＲＮＡ内へプロセシングされる。
【００２９】
ここで用いられたように"標的ｍＲＮＡ"とは、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの変異体或いは選択的スプライシング体、若しくは同族ＩＣＡＭ−１遺伝子からのｍＲＮＡを意味する。ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ配列は、ｃＤＮＡに相当するものとして、配列ＩＤ番号：１に示されている。当業者は、ｃＤＮＡ配列はｍＲＮＡ配列と同等であり、ここにおいて同じ目的、すなわち、ＩＣＡＭ−１の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの産生で用いることが可能であることを理解するであろう。
【００３０】
ここで用いられたように、ヒトＩＣＡＭ−１と"同族な"遺伝子若しくはｍＲＮＡは、ヒトＩＣＡＭ−１と相同な別の哺乳類種からの遺伝子若しくはｍＲＮＡである。例えば、マウスからの同族ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに相当するものとして、配列ＩＤ番号：２に示されている。
【００３１】
ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、選択的スプライシング体に対して本分野ではよく知られた技術を用いて解析され得る。そのような技術は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、及びｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが含まれる。ｍＲＮＡ配列を解析するための技術は、例えば、Ｂｕｓｔｉｎｇ ＳＡ（２０００），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１６９〜１９３に記載されており、そこで開示された全てはこの参照によって本明細書に組み込まれる。選択的スプライシングｍＲＮＡを同定するための代表的な技術は、以下にも記載されている。
【００３２】
例えば、所定の疾患遺伝子に関連したヌクレオチド配列を含むデータベースは、選択的スプライシングｍＲＮＡを同定するために使用することができる。そのようなデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｅｍｂａｓｅ、ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）データベースが含まれる。例えば、このＣＧＡＰデータベースは、様々なタイプのヒト癌からの発現遺伝子配列（ＥＳＴｓ）を含む。ＩＣＡＭ−１遺伝子からのｍＲＮＡ若しくは遺伝子配列は、選択的スプライシングｍＲＮＡｓを表すＥＳＴｓが発見されたかどうかを決定するためにそのようなデータベースをクエリーするために使用することができる。
【００３３】
"ＲＮＡｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）保護"と呼ばれる技術は、選択的スプライシングＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを同定するために使用することができる。ＲＮＡｓｅ保護は、例えば、ＩＣＡＭ−１を発現するように誘導された細胞などの他の細胞に由来したＲＮＡとハイブリダイズされた合成ＲＮＡへの遺伝子配列の翻訳を必要とするものである。次にこのハイブリダイズされたＲＮＡは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドミスマッチを認識する酵素をともにインキュベートされる。予想より小さい断片（フラグメント）は、選択的スプライシングｍＲＮＡｓの存在を意味している。推定上の選択的スプライシングｍＲＮＡｓは、当業者にはよく知られた方法によって、クローニングされ、配列決定される。
【００３４】
ＲＴ−ＰＣＲも、選択的スプライシングＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡｓを同定するために使用することができる。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、活性化白血球からのｍＲＮＡ、炎症性腸疾患組織の細胞からのｍＲＮＡ、若しくはＩＣＡＭ−１を発現すると知られている他の組織の細胞からのｍＲＮＡは、当業者にはよく知られた方法を用いて、酵素逆転写によってｃＤＮＡへ変換される。次にこのｃＤＮＡの全コード配列は、３’非翻訳領域に位置付けられた前方（フォワード）プライマーと、５’非翻訳領域に位置付けられた後方（リバース）プライマーとを用いるＰＣＲによって増幅される。増幅産物は、例えば、正常なスプライシングｍＲＮＡから発現した産物のサイズと増幅された産物のサイズとを比較すること（すなわち、アガロースゲル電気泳動）によって、選択的スプライシング体のための解析ができる。前記増幅産物のサイズにおけるどんな変化も、選択的スプライシングを意味するものである。
【００３５】
変異ＩＣＡＭ−１遺伝子から産生されたｍＲＮＡも、ＩＣＡＭ−１選択的スプライシング体を同定するための上述された技術を用いて、容易に解析され得る。ここで用いられたように"変異ＩＣＡＭ−１遺伝子若しくはｍＲＮＡ"は、ここで説明されたＩＣＡＭ−１配列からの配列とは異なるヒトＩＣＡＭ−１遺伝子、若しくはｍＲＮＡを含む。従って、ＩＣＡＭ−１遺伝子対立遺伝子型、及びそれらからのｍＲＮＡ産物は、本発明の目的のために"変異体"として考えられる。
【００３６】
ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡは、そのそれぞれの選択的スプライシング体、同族体、若しくは変異体と共通した標的配列を含む可能性があると理解されている。従って、そのような共通の標的配列を有している１つのｓｉＲＮＡは、共通の標的配列を含むそれらの異なるｍＲＮＡｓのＲＮＡｉ仲介性分解を誘導することができる。
【００３７】
本発明のｓｉＲＮＡは、１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換及び／若しくは変更による天然由来のＲＮＡとは異なる変化ＲＮＡと同様に、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、若しくは組換え的に生成されたＲＮＡを有し得る。そのような変化は、例えば、ｓｉＲＮＡの末端へ或いは１若しくはそれ以上の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化耐性にするような修飾（例えば、２’−置換リボヌクレオチドの使用、若しくは糖−リン酸バックボーンの修飾など）、若しくは、ｓｉＲＮＡの１若しくはそれ以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドでの置換を含むことができる。血清、涙液（ｌａｃｈｒｙｍａｌ ｆｌｕｉｄ）、若しくは他のヌクレアーゼが豊富な環境にさらされたｓｉＲＮＡ、若しくは局所的に運搬された（例えば目薬などで）ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性が増加するように変えられていることが好ましい。例えば、血管内に、若しくは眼に局所的に投与されたｓｉＲＮＡは、１若しくはそれ以上のホスホロチオエート連鎖を有し得る。
【００３８】
一本鎖若しくは両鎖の本発明のｓｉＲＮＡは、３’オーバーハングも有することができる。ここで用いられたように、"３’オーバーハング"とは、ＲＮＡ鎖の３’末端から伸長した少なくとも１つの不対ヌクレオチドを意味する。
【００３９】
従って、１実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドを含む）長、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２〜約４ヌクレオチド長、からなる少なくとも１つの３’オーバーハングを有している。
【００４０】
ｓｉＲＮＡ分子の二本鎖は３’オーバーハングを有しているという１実施形態において、前記オーバーハングの長さは、各鎖で同じ若しくは異なってもよい。最も好ましい実施形態において、前記３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば、本発明のｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（"ＴＴ"）若しくはジウリジル酸（"ｕｕ"）の３’オーバーハングを有することができる。
【００４１】
本発明のｓｉＲＮＡの安定性を増強するために、前記３’オーバーハングも分解に対して安定化され得る。１実施形態において、前記オーバーハングは、アデノシン若しくはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことによって安定化される。あるいは、例えば３’オーバーハングのウリジンヌクレオチドの２’−デオキシチミジンでの置換などの、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換は、耐容性を示し、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を与えないものである。特に、２’−デオキシチミジンに２’ヒドロキシルが存在しないと、組織培養液中の３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性が著しく増強する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ若しくはＮＡ（Ｎ２１）を有しており、ここにおいてＮはあらゆるヌクレオチドである。これらのｓｉＲＮＡは、約３０〜７０％ Ｇ／Ｃを有し、好ましくは約５０％ Ｇ／Ｃを有している。センスｓｉＲＮＡ鎖の配列は、それぞれ（Ｎ１９）ＴＴ若しくはＮ２１（すなわち、３〜２３位）と一致するものである。後者の場合において、前記センスｓｉＲＮＡの３’末端はＴＴに変換される。この配列変換の理論的な解釈としては、センス及びアンチセンス鎖３’オーバーハングの配列組成に関して対照的な二本鎖を生じることである。次に前記アンチセンスＲＮＡ鎖は、前記センス鎖の１〜２１位を補完するものとして合成される。
【００４３】
これらの実施例における２３−ｎｔセンス鎖の１位は、アンチセンス鎖による配列特異的な方法では認識されないので、前記アンチセンス鎖のほとんどの３’−ヌクレオチド残基は意図的に選択され得る。しかしながら、前記アンチセンス鎖の最後から２番目のヌクレオチド（いずれの実施形態においても２３−ｎｔセンス鎖の２位を補完するもの）は、一般的に標的配列を補完するものである。
【００４４】
別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、配列ＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮを有しており、ここにおいてＲはプリン（例えばＡ若しくはＧ）であり、Ｙはピリミジン（例えばＣ若しくはＵ／Ｔ）である。従って、本実施形態の２１−ｎｔセンス及びアンチセンスＲＮＡ鎖のそれぞれは、一般的にプリンヌレオチドで始まる。最初に転写されたヌクレオチドがプリンである場合、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡｓの発現が唯一効果的であると信じられているように、そのようなｓｉＲＮＡは、標的部位を変更することなく、ｐｏｌ ＩＩＩ発現ベクターから発現され得る。
【００４５】
本発明のｓｉＲＮＡは、あらゆる標的ｍＲＮＡ配列（"標的配列"）における一続きの約１９〜２５の近接したヌクレオチドを標的とし得る。ｓｉＲＮＡのための標的配列を選択するための技術は、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ Ｔらの"Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ"（２００２年１０月１１日改訂）に示されており、そこに開示されている全てはこの参照によって本明細書に組み込まれる。"Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ"は、Ｔｈｏｍａｓ Ｔｕｓｃｈｌ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡＧ１０５，Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７０７７ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって維持されているウェブサイトのワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上で入手可能であり、Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトにアクセスし、キーワード"ｓｉＲＮＡ"で検索ことによって発見することができる。従って、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡにおけるあらゆる近接した一続きの約１９〜約２５ヌクレオチドと実質的に同一なヌクレオチド配列を有している。
【００４６】
一般的に、標的ｍＲＮＡの標的配列は、標的ｍＲＮＡに対応する特定の、好ましくは開始コドンから５０〜１００ｎｔ下流（すなわち３’方向）から始まるｃＤＮＡ配列から選択され得る。しかしながら前記標的配列は、５’或いは３’非翻訳領域に、若しくは開始コドンに近接する領域に位置付けられ得る。例えば、ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡ配列中の適切な標的配列としては、
【００４７】
【化１】
【００４８】
従って、この配列を標的とし、各鎖に３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で表している）を有する本発明のｓｉＲＮＡとしては、
【００４９】
【化２】
である。
【００５０】
配列ＩＤ番号：３を標的としているが、各鎖に３’ＴＴオーバーハング（オーバーハングは太字で表している）を有する本発明のｓｉＲＮＡとしては、
【００５１】
【化３】
である。
【００５２】
本発明のｓｉＲＮＡが由来され得る他のＩＣＡＭ−１標的配列は、表１に記載された配列と、配列ＩＤ番号：２０〜９４に記載された配列とを含む。ここに記載された前記標的配列は、ヒトＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡを参照とし、従ってそれらの配列は"Ｔ"で示されたデオキシチミジンを含むことが理解される。当業者は、ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの実際の標的配列において、前記デオキシチミジンがウリジン（"ｕ"）で置換されることを理解するであろう。同様に、本発明のｓｉＲＮＡ内に含まれる標的配列も、デオキシチミジンの代わりにウリジンを含むことが可能である。
【００５３】
【表１】
【００５４】
本発明のｓｉＲＮＡは、当業者に知られた多くの技術を用いて得ることができる。例えば、Ｔｕｓｃｈｌらによる米国公開公報第２００２／００８６３５６号に記載されたｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｉｎ ｖｉｔｒｏシステム（この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。）などのｓｉＲＮＡは従来技術において知られた方法を用いて、化学的に合成され得る、若しくは組換え的に産生され得る。
【００５５】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、保護リボヌクレオシドホスホラミダイト、及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを適切に用いて化学的に合成されるものである。ｓｉＲＮＡは、２つ分離した相補的なＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として合成され得る。合成ＲＮＡ分子若しくは合成試薬の商業的供給元としては、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）、 Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、コロラド州、アメリカ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅの一部，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、アメリカ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ヴァージニア州、アメリカ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、マサチューセッツ州、アメリカ）、及びＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、英国）を含む。
【００５６】
あるいは、ｓｉＲＮＡは、あらゆる適切なプロモーターを用いて組換え環状ＤＮＡプラスミド、若しくは直線ＤＮＡプラスミドからも発現され得る。プラスミドからの本発明のｓｉＲＮＡを発現するための適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、若しくはサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技術範囲内である。本発明の前記組換えプラスミドは、特定の組織或いは特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導性プロモーター若しくは制御可能なプロモーターも有することができる。
【００５７】
組換えプラスミドから発現されたｓｉＲＮＡは、標準技術によって培養細胞発現システムから単離され得る、若しくは細胞内で発現され得る。本発明のｓｉＲＮＡを細胞へｉｎ ｖｉｖｏで運搬するための組換えプラスミドの使用は、以下でより詳細に論じる。
【００５８】
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離した相補的なＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的な領域を有する１つのＲＮＡ分子として、組換えプラスミドから発現され得る。
【００５９】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するのに適したプラスミドの選択、前記ｓｉＲＮＡを発現するためにプラスミドへ核酸配列を挿入する方法、及び、目的細胞へ組換えプラスミドを運搬する方法は、当業者の技術範囲内である。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６〜４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ＴＲ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０〜５５３；ＭｉｙａｇｉｓｈｉＭ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｈｎｏｌ．２０：４９７〜５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ＰＪ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：９４８〜９５８；Ｌｅｅ ＮＳ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００〜５０５；Ｐａｕｌ ＣＰ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５〜５０８を参照のこと（これらに開示された全体は、この参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
１実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡを発現するプラスミドは、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つセンスＲＮＡ鎖コード（翻訳）領域と、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つアンチセンスＲＮＡ鎖コード領域とを有する。そのようなプラスミドは、本発明のｓｉＲＮＡを発現するための組換えアデノ随伴ウイルスベクターを産生する場合に用いられ得る。
【００６１】
ここで用いられたように、"ｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結"とは、センス鎖若しくはアンチセンス鎖をコード化する核酸配列が５’方向のｐｏｌｙＴ終止シグナルと即座に隣接することを意味する。前記プラスミドからの前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖の転写の間、前記ｐｏｌｙＴ終止シグナルは転写を終了する働きをする。
【００６２】
ここで用いられたように、プロモーターの"制御下"とは、前記プロモーターがセンス若しくはアンチセンスコード配列の転写を開始することができるように、前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖をコード化する核酸配列がプロモーターの３’に位置することを意味する。
【００６３】
本発明のｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞内で組換えウイルスベクターからも発現され得る。本発明の組換えウイルスは、本発明のｓｉＲＮＡをコード化する配列と、ｓｉＲＮＡ配列を発現するための適切な任意のプロモーターとを有する。適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６或いはＨ１ ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列、及びサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技術範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織若しくは特定の細胞内環境においてｓｉＲＮＡを発現するための誘導性若しくは制御可能なプロモーターも有することができる。本発明のｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで細胞へ運搬するための組換えウイルスベクターの使用は、以下により詳細に述べる。
【００６４】
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離した相補的なＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的な領域を持つ１つのＲＮＡ分子として、組換えウイルスベクターから発現され得る。
【００６５】
ｓｉＲＮＡ分子を発現するためのコード配列を受容する能力があるあらゆるウイルスベクターで用いられ得、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えばレンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス、及びそれと同等なものから由来したベクターなどである。ウイルスベクターの指向性は、ベクターをエンベロープタンパク質や他のウイルスからの別の表面抗原によってシュードタイピングすることによって、若しくは異なるウイルスキャプシドタンパク質で置換することによって、適切に修飾され得る。
【００６６】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、 Ｍｏｋｏｌａウイルス、およびそれと同等なものからの表面タンパク質でシュードタイピングされ得る。本発明のＡＡＶベクターは、異なるキャプシドタンパク質血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）を発現するようにベクターを設計することによって、異なる細胞を標的として作成され得る。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２キャプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクターにおけるこの血清型２キャプシド遺伝子は、ＡＡＶ２／５ベクターを産生するために、血清型５キャプシド遺伝子によって置換され得る。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構成するための技術は、当業者の技術範囲内であり、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１〜８０１を参照のこと（なお、この全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。）。
【００６７】
好ましいウイルスベクターは、レンチウイルス、ＡＶ若しくはＡＡＶから由来したベクターである。特に好ましい実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６或いはＨ１ＲＮＡプロモーター、若しくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有する組換えＡＡＶベクターから、２つの分離した相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現される。本発明のｓｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構成するための方法、及び前記ベクターを標的細胞へ運搬するための方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０に記載されている。
【００６８】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構成するための方法、及び前記ベクターを標的細胞へ運搬する方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６〜３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ ＫＪ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０〜５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２６；米国特許第５，１３９，９４１号公報；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号に記載されており、これらの全体の開示は、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６９】
標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こすための所定の標的配列を含むｓｉＲＮＡの能力は、細胞中のＲＮＡレベル若しくはタンパク質レベルを測定するための標準技術を用いて評価され得る。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは培養細胞へ運搬され得、標的ｍＲＮＡのレベルはノーザンブロット若しくはドットブロッティング技術によって、若しくは定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定され得る。或いは、培養細胞中のＩＣＡＭ−１タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡ若しくはウエスタンブロットによって測定され得る。
【００７０】
例えば、天然にＩＣＡＭ−１を発現している、若しくはＩＣＡＭ−１が発現するように誘導される細胞は、９６ウェルマイクロタイタープレート中でコンフルウエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで増殖される。天然にＩＣＡＭ−１を発現している細胞に対して、この細胞は、ＩＣＡＭ−１発現を刺激するために、インターロイキン−１若しくは腫瘍壊死因子で８〜２４時間、刺激され得る。本発明のｓｉＲＮＡは、第１群のＩＣＡＭ−１発現細胞に投与される。非特異的ｓｉＲＮＡ（若しくはｓｉＲＮＡなし）は、対照として、第２群のＩＣＡＭ−１発現細胞に投与される。細胞は洗浄され、１〜２％パラホルムアルデヒドでマイクロタイタープレートのウェルに直接固定された。マイクロタイタープレート上の非特異結合部位は、２％ウシ血清アルブミンでブロックされ、細胞はＩＣＡＭ−１特異的モノクローナル抗体とインキュベートされた。ＩＣＡＭ−１抗体の結合は、例えば、１：１０００希釈のビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，Ｍｄ）と１時間、３７℃でインキュベーションし、１：１０００希釈のベータ−ガラクトシダーゼと共役したスレプトアビジン（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１時間３７℃でインキュベーションすることによって、検出される。ＩＣＡＭ−１特異的モノクローナル抗体と結合したベータ−ガラクトシダーゼは、例えば、３．３ｍＭクロロフェノールレッド−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド。５０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．２）の溶液で、２〜１５分、３７℃でマイクロタイタープレートを展開し、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートリーダーを用いて５７５ｎｍで結合した抗体の濃度を測定することによって決定される。
【００７１】
ＩＣＡＭ−１発現を下方制御する本発明のｓｉＲＮＡの能力は、神経突起伸長、内皮細胞間の接着、上皮細胞間の接着（例えば、正常ラット腎臓細胞及び／若しくはヒト皮膚）、若しくは癌細胞間の接着を当業者の技術範囲内の技術によって測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでも評価され得る。
【００７２】
適切な神経突起伸長アッセイは、ＩＣＡＭ−１を天然に発現している、若しくはＩＣＡＭ−１の発現を誘導されている単層細胞上の培養ニューロンを有する。ＩＣＡＭ−１発現細胞上のニューロン伸長は、ＩＣＡＭ−１が発現していない細胞上で培養されたニューロンに比べて、長く突起が伸長していた。例えば、ニューロンは、ＩＣＡＭ−１をコードしているｃＤＮＡで形質移入された３Ｔ３細胞の単層上に培養され得、基本的には、Ｄｏｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｗａｌｓｈ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．４：４９〜５５、及びＳａｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｅｕｒｏｎ １８：２３１〜２４２に記載された通りであり、これらに開示された全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。簡潔に説明すると、対照３Ｔ３線維芽細胞、及びＩＣＡＭ−１を発現した３Ｔ３線維芽細胞の単層は、８ウェル組織培養ディッシュの各ウェルに８０，０００細胞を一晩培養することによって、達成される。出生前３日目のマウス脳から単離された３０００個の小脳ニューロンは、様々な単層上で１８時間培養される。次にその培養は固定され、標準技術を用いてニューロン特異的抗体（例えばＧＡＰ４３）で染色される。対照細胞及び本発明のｓｉＲＮＡで処理された細胞の神経突起の長さは、コンピュータ補助形態計測によって測定される。テスト細胞中のＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉ分解は、対照細胞と比較して少なくとも５０％、平均神経突起の長さが増加することによって示される。
【００７３】
本発明のｓｉＲＮＡによるＩＣＡＭ−１のＲＮＡｉ分解は、細胞接着の離開を検出することによっても評価され得る。例えば、ＩＣＡＭ−１を天然に発現している、若しくはＩＣＡＭ−１発現が誘導された細胞は、細胞接着が可能な標準条件下で播種される。本発明のｓｉＲＮＡを投与することによる細胞接着の離開は、細胞の他の細胞からの退縮を観察することによって、２４時間以内に視覚的に決定される。細胞接着の離開を検出するための適切なアッセイは、以下の通りである。ウシ肺動脈内皮細胞は、無菌除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）と、０．１％コラゲナーゼ（タイプＩＩ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ニュージャージー州）での消化によって播種される。播種された細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と、１％抗生剤−抗真菌剤が添加されたダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、７％ ＣＯ２（空気中）において培養される。この培養は、トリプシン−ＥＤＴＡで週１回継代され、２０，０００細胞／ｃｍ２で組織培養プラスチックへ播種される。培養コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が達成された後の約３日後である１週間の培養後、細胞は本発明のｓｉＲＮＡ、若しくは対照非特異的ｓｉＲＮＡで処理（例えば３０分）される。この細胞は、ｓｉＲＮＡが投与されて２４時間以内に１％パラホルムアルデヒドで固定され、細胞接着の離開の程度を、細胞の他の細胞からの退縮を観察することによって決定された。
【００７４】
本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡ仲介性分解は、例えば、未熟網膜症（"ＲＯＰ"）マウスモデル、脈絡叢新血管新生（"ＣＮＶ"）マウス及びラットモデルなどの、新血管新生の動物モデルでも評価され得る。例えば、ＣＮＶラットにおける新血管新生領域は、以下の実施例２にあるように、本発明のｓｉＲＮＡの投与前後で測定され得る。ｓｉＲＮＡの投与による新血管新生領域における減少は、ＩＣＭＡ−１ ｍＲＮＡの下方制御と細胞接着の離開とを意味する。ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの下方制御と、細胞接着の離開とは、以下の、ストレプトゾトシン誘導糖尿病性網膜症ラットモデル（実施例３）、ＶＥＧＦ誘導性網膜血管透過性とｌｅｕｋｏｓｔａｓｉｓのラットモデル（実施例４）、及び角膜／輪部損傷による眼球新血管新生のラットモデル（実施例５）にも示されている。
【００７５】
上述したように、本発明のｓｉＲＮＡは、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはその選択的スプライシング体、変異体或いは同族体のＲＮＡｉ仲介性分解を標的にし、引き起こす。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、ＩＣＡＭ−１遺伝子からの機能遺伝子産物の産生を減少する。従って、本発明は、対象中のＩＣＡＭ−１の発現を阻害する方法を提供し、これは、標的ｍＲＮＡが分解されるように、本発明のｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有する。
【００７６】
ＩＣＡＭ−１遺伝子の産物は細胞間接着若しくは細胞とＲＣＭとの接着に必要とされるので、本発明は、細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態を患っている対象における細胞接着を阻害する方法も提供する。１実施形態において、ＩＣＡＭ−１仲介性細胞接着は血管新生を開始し維持するために必要とされるので、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解によって対象における血管新生を阻害する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は糖尿病Ｉ型から生じる合併症を患った対象を、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解によって治療する方法を提供する。好ましくは、本発明の方法によって治療される糖尿病Ｉ型から生じた合併症としては、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、及び大血管性疾患（冠動脈疾患、脳血管疾患、及び末梢血管疾患を含む）である。
【００７７】
ここで用いられたように、"対象"とは、ヒト、若しくは非ヒト動物を含む。好ましくは、前記対象はヒトである。
【００７８】
ここで用いられたように、ｓｉＲＮＡの"有効量"とは、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こすのに十分な量、若しくは対象における細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態の開始若しくは進行を阻害するのに十分な量を指す。
【００７９】
標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解は、上述したｍＲＮＡ若しくはタンパク質の単離及び定量するための標準技術を用いて、対象の細胞中の標的ｍＲＮＡレベル若しくはタンパク質レベルを測定することによって検出され得る。
【００８０】
細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態の阻害は、例えば、炎症、網膜症、神経障害、腎障害、若しくは対象が治療される疾患若しくは障害の特性を示す他の症状の程度を検出することによって、対象における病態の進行を測定することによっても評価され得る。
【００８１】
例えば、血管新生の阻害は、本発明のｓｉＲＮＡで処理する前後の新血管新生領域のサイズを観察することによってなど、対象における病原性若しくは非病原性血管新生の進行を直接測定することによって評価され得る。新血管新生領域が同じか減少していた場合は、血管新生の阻害を意味している。対象における新血管新生領域のサイズを観察及び測定するための技術は、当業者の技術範囲内であり、例えば、脈絡膜新血管新生の領域が検眼鏡検査によって観察され得る。
【００８２】
血管新生の阻害は、血管新生に関連した病的状態における変化若しくは回復の観察を通じて推測することも可能である。例えば、ＡＭＤにおいて、視覚消失の遅延、停止、若しくは回復は、脈絡膜における血管新生の阻害を意味している。腫瘍に対しては、腫瘍成長の遅延、停止、或いは逆転、若しくは腫瘍転移の停止は、腫瘍部位での或いは近くでの血管新生の阻害を意味している。非病原性血管新生の阻害は、例えば、本発明のｓｉＲＮＡの投与による脂肪消失若しくはコレステロールレベルでの減少など、からも推測され得る。
【００８３】
本発明の方法は、非病原性である血管新生、すなわち、対象における正常過程に起因する血管新生、を阻害するために用いられ得る。非病原性血管新生の例えとしては、子宮内膜新血管新生、及び脂肪組織或いはコレステロールの産生に関連した過程を含む。従って、本発明は、例えば、体重を調節する或いは脂肪消失を促進するための、コレステロールレベルを減少するための、若しくは堕胎薬としての、非病原性血管新生を阻害するための方法も提供する。
【００８４】
本発明の方法は、血管新生病、すなわち、不適切な或いは非制御の血管新生に関連した病原性の病気、に関連した血管新生も阻害することができる。例えば、ほとんどの癌性固形腫瘍は、腫瘍内と周囲に血管新生を誘導することによって腫瘍自体に十分な血液供給を発生する。この腫瘍誘導性血管新生は、腫瘍成長に対してしばしば必要とされ、転移性細胞が血流に入ることを可能にする。
【００８５】
他の血管新生病としては、糖尿病性網膜症及び年齢関連性黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む。これらの病気は、新血管新生の領域における新しく形成された血管による正常組織の破壊によって特徴付けられている。例えば、ＡＭＤにおいて、脈絡膜は、毛細血管によって侵入され、破壊されている。ＡＭＤにおける脈絡膜の血管新生に由来する破壊は、最終的には部分的な或いは完全な失明を導く。
【００８６】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、癌、例えば乳癌、肺癌、頭部と頚部の癌、脳腫瘍、腹腔内腫瘍、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、グリオーマ、肝癌、舌癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌（例えば黒色腫）、リンパ腫、及び血液癌などに関連した固形腫瘍の成長若しくは転移を阻害するために用いられる。
【００８７】
より好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、糖尿病Ｉ型から生じる合併症、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、及び大血管性疾患など、を治療するために用いられる。
【００８８】
細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態を治療するために、特に、血管新生病及び糖尿病Ｉ型から生じた合併症を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡは、本発明のｓｉＲＮＡとは異なる薬剤との組み合わせで対象に投与され得る。或いは、本発明のｓｉＲＮＡは、前記病態を治療するために設計された別の治療方法との組み合わせで対象に投与され得る。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、癌を治療する、若しくは腫瘍転移を予防するために現在用いられる医療方法（例えば、放射線療法、化学療法、及び手術）との組み合わせで投与され得る。腫瘍を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡは好ましくは、放射線療法との組み合わせで、若しくはシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、若しくはタモキシフェンなどの化学療法薬剤との組み合わせで、投与される。
【００８９】
本発明のｓｉＲＮＡは、サブ化学量論的な量でＲＮＡ干渉（従って、細胞接着を阻害する）を仲介することができることが理解される。どんな理論に束縛されることなく、本発明のｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを誘導し、触媒様態で標的ｍＲＮＡを分解すること考えられている。従って、細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態に対する標準的な治療法と比較して、治療的効果を発揮するように対象に投与される必要があるｓｉＲＮＡは、著しく少ない。
【００９０】
当業者は、例えば、対象のサイズや体重、疾患侵食度の程度（長さ）、年齢、対象の健康度と性別、投与経路、及び投与が局所的なのか全身的なのか、などの評価要素を配慮することによって、特定の対象に投与される本発明のｓｉＲＮＡの有効量を容易に決定することができる。一般的に、本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、細胞間若しくは細胞−マトリックス接着が阻害される部位での細胞内濃度が、約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭである。
【００９１】
本発明の方法において、本発明のｓｉＲＮＡは、運搬試薬との結合における裸の（ｎａｋｅｄ）ｓｉＲＮＡとして、若しくはｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミド或いはウイルスベクターとして、対象に投与され得る。
【００９２】
本発明のｓｉＲＮＡとの結合での投与に対する最適な運搬試薬は、ｔｈｅ Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ（遷移ＴＫＯ親油性試薬）、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、若しくはポリカチオン（例えば、ポリリジン）或いはリポソームを含む。好ましい運搬試薬は、リポソームである。
【００９３】
リポソームは、例えば、網膜若しくは腫瘍組織などの特定の組織へのｓｉＲＮＡの運搬を助け、ｓｉＲＮＡの血中半減期も増加することができる。本発明での使用に適したリポソームは、一般的に中性若しくは負電荷リン脂質及びコレステロールなどのステロールを含む、標準ベシクル（小胞）形成脂質から形成される。リポソームを準備するための様々な方法が知られており、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７、及び米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号公報があり、これら全体の開示はこの参照によって本発明に組み込まれる。
【００９４】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを被包するリポソームはリガンド分子を有しており、このリガンド分子は、血管新生部位、若しくは腫瘍などのＩＣＡＭ−１仲介性細胞接着が関連した他の病的過程の部位で或いは近くで、ＩＣＡＭ−１を発現する細胞に対するリポソームを標的とするものである。ＩＣＡＭ−１を発現する細胞は、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、及び腫瘍細胞を含む。腫瘍抗原若しくは内皮細胞表面抗原において広く見られる受容体と結合するリガンドは好ましい。
【００９５】
特に好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを被包しているリポソームは、例えば、構造の表面に結合するオプソニン化阻害部位を有することによって、単核マクロファージや網膜内皮性システムによるクリアランス（排除）を避けるように修飾される。１実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部位、及びリガンドの両方を有することができる。
【００９６】
本発明のリポソームを準備するために用いられるオプソニン化阻害部位は、リポソーム膜に結合する典型的に大きな親水性ポリマーである。ここで用いられたように、オプソニン化阻害部位は、化学的に或いは物理的にリポソーム膜に結合する場合、例えば、膜自体への脂質−可溶性アンカーの挿入によって、若しくは、膜脂質の活性基への直接的な結合によって、リポソーム膜へ"結合"されるものである。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、マクロファージ−単球システム（"ＭＭＳ"）及び網膜内皮性システム（"ＲＥＳ"）によるリポソームの取り込みが著しく減少した保護表面層を形成し、例えば、米国特許第４，９２０，０１６号公報に記載されており、これに開示された全体はこの参照によって本発明に組み込まれる。従って、オプソニン化阻害部位で修飾されたリポソームは、非修飾リポソームに比べて、より長く循環中に残る。この理由により、そのようなリポソームはしばしば"ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ；捕捉されない）"リポソームと呼ばれる。
【００９７】
ステルスリポソームは、多孔性或いは"漏出性"微小血管によって供給された組織内に蓄積されることが知られている。従って、そのような微小血管欠損によって特徴付けられた組織、例えば固形腫瘍などは、これらのリポソームが効率的に蓄積する（Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，１８：６９４９〜５３を参照のこと）。加えて、ＲＥＳによる減少した取り込みは、肝臓及び脾臓における蓄積を著しく阻止することによって、ステルスリポソームの毒性を低くする。従って、オプソニン化阻害部位で修飾された本発明のリポソームは、本発明のｓｉＲＮＡを腫瘍細胞へ運搬するのに特に適している。
【００９８】
リポソームを修飾するのに適しているオプソニン化阻害部位は、好ましくは、平均分子量が約５００〜約４０，０００ダルトンの水可溶性ポリマーであり、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの水可溶性ポリマーである。そのようなポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、若しくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体（例えばメトキシＰＥＧ或いはＰＰＧ、及びＰＥＧ或いはＰＰＧステアリン酸）、ポリアクリルアミド或いはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー、直線状、分枝状、或いは樹状（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ）ポリアミドアミン、ポリアクリル酸、ポリアルコール（例えば、カルボキシル基或いはアミノ基が化学的に結合したポリビニルアルコール及びポリキシリトール）、及びガングリオシドＧＭ１などのガングリオシド、を含む。ＰＥＧのコポリマー、メトキシＰＥＧ或いはメトキシＰＰＧ、若しくはそれらの誘導体も適している。加えて、前記オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧのブロックコポリマー、及びポリアミノ酸、ポリサッカライド、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、若しくはポリヌクレオチドも含むことができる。前記オプソニン化阻害ポリマーは、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン、アミノ化ポリサッカライド或いはオリゴサッカライド（直線状或いは分枝状）などのアミノ酸若しくはカルボキシル酸、若しくは、例えばカルボキシル基の結合の原因となるカルボン酸の誘導体と反応した、カルボキル化ポリサッカライド或いはオリゴサッカライド、を含む天然ポリサッカライドも含むことができる。
【００９９】
好ましくは、オプソニン化阻害部位は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、若しくはそれらの誘導体である。ＰＥＧ若しくはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、しばしば"ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）リポソーム"と呼ばれる。
【０１００】
オプソニン化阻害部位は、多数の既知技術における任意の一つによってリポソーム膜と結合可能である。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーと結合し、次に膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３、及び例えばテトロヒドロフランと水（３０：１２の割合）などの溶媒混合液を６０℃で用いて、還元性アミノ化を介してステアリルアミン脂溶性アンカーで誘導体化され得る。
【０１０１】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドは、上記で説明された。そのような組換えプラスミドは、直接若しくは、ｔｈｅ Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＬＴ１ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ（遷移ＬＴ１親油性試薬）、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、若しくはポリカチオン（例えば、ポリリジン）或いはリポソームを含む適切な運搬試薬との組み合わせで投与され得る。本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えウイルスベクターも、上記で説明されており、ＩＣＡＭ−１を発現している対象の細胞へそのようなベクターを運搬するための方法は、当業者の技術範囲内である。
【０１０２】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ−１を発現する細胞へ前記ｓｉＲＮＡを運搬するのに適したあらゆる手段によって対象へ投与され得る。ＩＣＡＭ−１を発現している細胞は、例えば、血管内皮細胞、胸腺及び他の上皮細胞、及び線維芽細胞などの非造血性細胞、及び組織マクロファージ、分裂促進因子で刺激されたＴリンパ球芽細胞、及び扁桃腺、リンパ節、パイエル板における胚中心樹状細胞などの造血性細胞を含む。当業者は、特定の細胞は特定の状態でＩＣＡＭ−１を発現する、例えば、ＩＣＡＭ−１は、糖尿病性網膜症或いはＡＭＤなどの眼球新生血管疾患における網膜血管内皮細胞で発現することを理解する。
【０１０３】
本発明のｓｉＲＮＡをＩＣＡＭ−１発現細胞へ運搬するのに適した技術としては、ジーンガン、電気穿孔法、ナノ粒子、マイクロ被包、及びそれらと同等のものによって、若しくは非経口及び経腸の投与経路によって、対象へ前記ｓｉＲＮＡを投与する方法を含む。
【０１０４】
適した経腸投与経路は、経口、直腸、若しくは鼻腔内運搬を含む。
【０１０５】
適した非経口投与経路は、血管内投与（例えば、静脈内大量瞬時投与、静脈内注入、動脈内大量瞬時投与、動脈内注入、及び脈管構造へのカテーテル滴下など）、組織周囲および組織内投与（例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注射、網膜内注射、若しくは網膜下注射など）、皮下注射、或いは（浸透圧ポンプなどによる）皮下注入を含む沈着、例えば、カテーテル或いは他の設置装置（例えば角膜ペレット或いは坐薬、目薬、若しくは多孔性、非多孔性、或いはゼラチン物質を有する移植片）による新生血管新生の領域或いは部位の周辺への直接（例えば局所的）投与、及び吸入、を含む。適した設置装置は、米国特許第５，９０２，５９８号及び第６，３７５，９７２号公報に記載された眼球移植片、及び米国特許第６，３３１，３１３号公報に記載された生分解性眼球移植片を含む。また、これら特許文献に開示された全体は、この参照により本明細書に組み込まれる。そのような眼球移植片は、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、マサチューセッツ州）、及びＯｃｕｌｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）から利用可能である。
【０１０６】
好ましい実施形態において、前記ｓｉＲＮＡの注射若しくは注入は、新生血管新生の部位に若しくは近くになされる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、眼の網膜色素上皮細胞へ運搬され得る。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡは局所的に眼へ、例えば、液体若しくはゲル状で下目瞼或いは結膜円蓋へ、投与され、これは当業者の技術範囲内である（Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ．ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３０：４２１〜４２９を参照のこと。またこの全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０７】
一般的に、本発明のｓｉＲＮＡは、約５μｌ〜約７５μｌの量で、例えば約７μｌ〜約５０μｌで、好ましくは約１０μｌ〜約３０μｌの量で、眼へ局所的に投与される。本発明のｓｉＲＮＡは、水溶液に高い溶解性を有しており、７５μｌ以上の量でのｓｉＲＮＡの眼への局所的滴下は、流出や排液による眼からのｓｉＲＮＡの損失に終わることになる。従って、高濃度のｓｉＲＮＡ（例えば、約１０〜約２００ｍｇ／ｍｌ、若しくは約１００〜約１０００ｎＭなど）を約５μｌ〜約７５μｌの量で眼へ局所滴下することによって投与することが好ましい。
【０１０８】
特に好ましい非経口投与経路は、眼内投与である。本発明のｓｉＲＮＡの眼内投与は、この投与経路によって前記ｓｉＲＮＡが眼に入ることが可能である限り、眼への注射若しくは直接（例えば局所的）投与によって達成され得る。上記の眼への局所的経路の投与に加えて、適した眼内投与経路としては、硝子体内、網膜内、網膜下、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼窩周辺及び眼窩後、トランス角膜及びトランス強膜投与を含む。そのような眼内投与経路は、当業者の技術範囲であり、例えば、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ ｅｔ ａｌ．，２００２、ｓｕｐｒａ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１７６３〜１７６９、及びＡｍｂａｔｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２１：１４５〜１５１を参照のこと（全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０９】
本発明のｓｉＲＮＡは、単一用量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）若しくは複数用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で投与され得る。本発明のｓｉＲＮＡを注入で投与する場合、この注入は単一持続性用量である、若しくは複数注射（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって運搬され得る。組織への直接的な前記ｓｉＲＮＡの注射は、新生血管新生の部位若しくはその近くであることが好ましい。新生血管新生の部位若しくはその近くの組織への前記ｓｉＲＮＡの複数注射は、特に好ましい。
【０１１０】
当業者は、本発明のｓｉＲＮＡを所定の対象へ投与するための適切な用量処方を容易に決定することもできる。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、単一注射若しくは新生血管新生部位へ若しくはその近くへの沈着など、対象へ一度で投与され得る。或いは、前記ｓｉＲＮＡは、毎日若しくは週１回で複数回、対象へ投与され得る。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、約３〜約２８週間、より好ましくは約７〜約１０週間の期間で、週１回対象へ投与され得る。好ましい用量処方において、前記ｓｉＲＮＡは、新生血管新生の部位へ若しくはその近くへ（例えば硝子体内へ）、週１回で７週間注射され得る。無期限の期間での本発明のｓｉＲＮＡの周期的な投与は、ｗｅｔ ＡＭＤ若しくは糖尿病性網膜症などの慢性新生血管新生病を患った対象にとって必要となることが理解される。
【０１１１】
用量処方が複数投与である場合、対象に投与されるｓｉＲＮＡの有効量は、全体の用量処方を超えて投与されたｓｉＲＮＡの総量より成ることが理解される。
【０１１２】
本発明のｓｉＲＮＡは、本分野で知られた技術によって、対象に投与する前に薬学的組成物として処方されることが好ましい。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌で発熱物質を含まないものとして特徴付けられる。ここで用いられる、"薬学的な処方"とは、ヒトへの及び獣医学的な使用に対する処方を含む。本発明の薬学的組成物を調合する方法は、当業者の技術範囲内であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ ｅｄ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に記載されており、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
本発明の薬学的な処方は、生理学的に許容可能な担体培地と混合された、本発明のｓｉＲＮＡ（例えば、０．１〜９０重量％）、若しくは生理学的に許容可能なその塩類を有する。好ましい生理学的に許容可能な担体培地は、水、緩衝液、食塩水（例えば、通常食塩水若しくはハンクス或いはアール平衡塩類溶液などの平衡塩類溶液）、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、及びそれらと同等のものである。
【０１１４】
本発明の薬学的組成物は、従来の薬学的賦形剤及び／若しくは添加剤も有する。適した薬学的賦形剤は、安定剤、抗酸化剤、重量モル浸透圧濃度調節因子、緩衝液、及びｐＨ調節因子を含む。適した添加剤は、生理学的な生体適合性緩衝液（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレートの添加（例えばＤＴＰＡ若しくはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）或いはカルシウムキレート複合剤（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなど）、若しくは任意に、カルシウム或いはナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、或いは乳酸カルシウムなど）を含む。本発明の薬学的組成物は、液状での使用のために調合（包装）される、若しくは凍結乾燥される。
【０１１５】
眼への局所的投与のために、従来の眼内運搬因子が用いられ得る。例えば、局所的眼内運搬のための本発明の薬学的組成物は、上述した食塩水、角膜浸透増進剤、不溶性粒子、ワセリン或いは他のゲル状軟膏、眼における滴下による粘性増加に耐えるポリマー、若しくは粘膜付着性ポリマーを有する。好ましくは、前記眼内運搬因子は、角膜浸透が増加する、若しくは粘性効果を通じて、或いは角膜上皮を覆っているムチン層との物理化学的な相互作用によって前記ｓｉＲＮＡの眼前（ｐｒｅｏｃｕｌａｒ）保持を延長する。
【０１１６】
局所的眼内運搬に適した不溶性粒子は、リン酸カルシウム粒子（Ｂｅｌｌらによる米国特許第６，３５５，２７１号公報に記載されており、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。眼における滴下による粘性増加に耐える、適したポリマーは、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ ４０７などのポリエチルエネポリオキシプロピレンブロックコポリマー（例えば２５％濃度）、セルロースアセトフタル酸（例えば、３０％濃度）、若しくはＧｅｌｒｉｔｅ（商標）（ＣＰ Ｋｅｌｃｏ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、デラウェア州）などの低アセチルゲラン（ｇｅｌｌａｎ）ガムを含む。適した粘膜付着性ポリマーは、カルボキシル、ヒドロキシル、アミド及び／若しくは硫酸基などの多数の親水性機能基を有する親水コロイド（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸、高分子量ポリエチレングリコール（例えば平均分子量が>２００，０００）、デキストラン、ヒアルロン酸、ポリガラクツロ酸、及びキシロカン（ｘｙｌｏｃａｎ））を含む。適した角膜浸透増進剤は、シクロデキストリン、ベンザルコニウム塩化物、ポリオキシエチレングリコールラウリルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（商標）３５）、ポリオキシエチレングリコールステアリルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（商標）７８）、ポリオキシエチレングリコールオレイルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（商標）９８）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジギトニン、タウロコール酸ナトリウム、サポニン、及びＣｒｅｍａｐｈｏｒ ＥＬなどのポリオキシエチル化ヒマシ油を含む。
【０１１７】
固体組成物のために、従来の無毒性固体単体が用いられ得、例えば、薬学的グレードのマンニトール、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム（滑石粉）、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム炭酸塩、及びそれらと同等なものである。
【０１１８】
例えば、経口投与のための固体薬学的組成物は、上記の任意の担体と賦形剤、及び１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１若しくはそれ以上の本発明のｓｉＲＮＡを有する。エアロゾル（吸入性）投与のための薬学的組成物は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１若しくはそれ以上の本発明のｓｉＲＮＡを有し、このｓｉＲＮＡは上述したようにリポソームに被包され、噴霧剤となる。例えば鼻腔内運搬のためのレシチンなどの担体も要望通りに含むことができる。
【０１１９】
本発明は、以下の限定されない実施例によって説明される。
【実施例１】
【０１２０】
ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡによるヒトＩＣＡＭ−１発現の阻害
サイトカイン若しくは低酸素によるＨＥＫ−２９３細胞中のＩＣＡＭ−１産生の刺激
ヒト胚性腎（ＨＥＫ）−２９３細胞におけるＩＣＡＭ−１の産生を刺激するための、低酸素若しくはサイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）やインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の能力を評価した。
【０１２１】
ＨＥＫ−２９３細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で一晩、２４ウェルプレートにおいて標準成長培養液で培養した。次に細胞を、１、１０、１００或いは１０００ｎｇのＴＮＦ−α若しくはＩＦＮ−γ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）で別々に処理した、若しくは、１００、２００或いは３００ｍＭデスフェリオキサミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）での処理によって低酸素とした。サイトカイン若しくはデスフェリオキサミンでの処理の１或いは２日後、細胞をＭ−ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（哺乳類タンパク質抽出試薬）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）で溶解した。ヒトＩＣＡＭ−１ ＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅヒト"ｓＩＣＡＭ１"ＥＬＩＳＡ手順に記載されたように、細胞溶解液で実行し、このＥＬＩＳＡの結果はＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で検出した。
【０１２２】
図１に示すように、ＨＥＫ−２９３細胞におけるヒトＩＣＡＭ−１タンパク質のレベルが上昇した唯一の条件は、１００ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−αで２日間細胞を処理したものであった。
【０１２３】
ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡによる、刺激されたＨＥＫ−２９３細胞の処理
ＨＥＫ−２９３細胞を、実施例１のように一晩培養した。細胞が約５０％コンフルエントになった時、実験細胞と対照細胞への形質移入を次の日実行した。実験細胞は、リン酸カルシウム形質転換試薬で混合した２５ｎＭヒトＩＣＡＭ−１ ｓｉＲＮＡで形質転換した。対照細胞は、ｓｉＲＮＡを欠いたリン酸カルシウム試薬で、若しくはリン酸カルシウム形質転換試薬中の２５ｎＭ非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）で処理した。
【０１２４】
実験細胞に対しては、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ内の異なる位置を標的とした１０個のｓｉＲＮＡを試験した。これらのｓｉＲＮＡは、表２に挙げた配列を標的としており、全てのｓｉＲＮＡは、３’ＴＴオーバーハングを各鎖に含んでいた。
【０１２５】
【表２】
【０１２６】
形質転換４時間後、ＨＥＫ−２９３細胞中のＩＣＡＭ−１の産生は、最終濃度１００ｎｇ/ｍｌでのＴＮＦ−αで処理することによって刺激した。形質転換後４８時間で、全てのウェルから上清を除去した。実験細胞及び対照細胞の第１群は、Ｍ−ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）で溶解した。ヒトＩＣＡＭ−１ ＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）を、実施例１と同様に細胞溶解液で実行した。図２に示したように、ｈＩＣＡＭ１＃２、ｈＩＣＡＭ１＃３、ｈＩＣＡＭ１＃７、ｈＩＣＡＭ１＃９、及びｈＩＣＡＭ１＃１０のｓｉＲＮＡで刺激された、ＨＥＫ−２９３細胞中に誘導されたＩＣＡＭ−１タンパク質のレベルは、ｓｉＲＮＡなし、若しくは非特異的ｓｉＲＮＡで形質転換された細胞と比較して減少した。
【０１２７】
細胞毒性アッセイは、実験細胞及び対照細胞の第２群で実行した。上述したように形質転換後４８時間で上清を除去した後、１０％ ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、カナダ）を含む完全増殖培養液を、対象細胞及び実験細胞へと添加し、３７℃、５％ ＣＯ２で３時間インキュベートした。細胞増殖は、細胞恒常性活性に起因する培養液の色変化を検出することによって測定した。この色変化は、ＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で検出し、その結果は図３に示した。図３から分かるように、ｈＩＣＡＭ１＃１〜９はＨＥＫ−２９３細胞における著しい細胞毒性を示さなかった。ｈＩＣＡＭ１＃１０は、対照細胞と比較して、ＨＥＫ−２９３細胞増殖のわずかな減少を引き起こした。
【０１２８】
細胞毒性アッセイが実行された後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを含む増殖培養液を完全に除去し、製造者説明書に従ってＲＮＡｑｕｅｏｕｓ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＲＮＡ単離キット）（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）を用いて、ＲＮＡをＨＥＫ−２９３細胞から抽出した。前記細胞中のヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのレベルは、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定し、内部標準としてはヒトグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのレベルを用いた。このＲＴ−ＰＣＲ実験によって、ＴＮＦ−αによって誘導されたＩＣＡＭ−１の産生は、ｓｉＲＮＡなし若しくは非特異的ｓｉＲＮＡで形質転換された細胞と比較して、ヒトＩＣＡＭ−１ ｓｉＲＮＡによって、転写レベルで抑制された。
【実施例２】
【０１２９】
ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡによるストレプトゾトシン誘導糖尿病性網膜症の治療
糖尿病性網膜症を患った個人の網膜における血管漏出と非灌流は、空間的、時間的に白血球静止と関連している。例えばＭｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６（１９）：１０８３６〜４１を参照し、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、白血球静止を減少し、従って糖尿病ラットにおける網膜血管透過性を減少すると予想される。
【０１３０】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ（ロングエバンス）ラット（約２００ｇ）に、一晩後、糖尿病を誘導するために、クエン酸緩衝液中のストレプトゾトシンを硝子体内に注射する。Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（約２００ｇ）に、一晩後、対照としてクエン酸緩衝液のみを注射する。血清血液糖を測定し、血圧を毎日記録する。対照動物と比較しての血清血液糖レベルの上昇は、糖尿病であると考えられる。
【０１３１】
ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、各ラットにおいてＯＤを実行する。非特異的ｓｉＲＮＡは対照ＯＳとして注射される。全体の群図式は、表３に示している。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、処理後７日目で、ラットをＡｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ（アクリジンオレンジ白血球蛍光光度分析：ＡＯＬＦ）に供する。簡潔に言うと、ラットを麻酔し、その瞳孔をトロピカミドで散大した。次にラットに無菌生理食塩水中に懸濁されたアクリジンオレンジを硝子体内に注射する。各眼の眼底を観察し、スキャニングレーザー眼底鏡（光源としてアルゴンブルーレーザー）を用いて白血球静止を画像化する。次にラットをフルオレセインデキストランで灌流し、眼をさらに画像化する。白血球静止の密度を、１０ディスク直径範囲における光ピクセルのパーセンテージとして計算する。この白血球静止の密度はエンドポイントとして用いられる。
【０１３４】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、７日目にラットはアイソトープ希釈技術にも供し、血管漏出を定量化する。簡潔に言うと、ラットに、第１の時点でＢＳＡ中のＩ１２５を、第２の時点でＩ１３１を硝子体内に注射する。このラットは第２の注射後、数分で屠殺し、その網膜を単離し、動脈サンプルを採取する。前記網膜及び前記動脈サンプルは、ヨウ素クリアランスの定量的指標を用いて網膜における活性を補正した後、γ−分光法を用いて解析する。次に測定値を、正確な用量を投与するために、体重及び組織重量を基に規準化する。γ活性の補正された量は、網膜内の血管漏出のマーカーとして用いる（第２エンドポイント）。実験動物の網膜内で減少するであろうγ活性は、血管漏出の減少を意味している。
【実施例３】
【０１３５】
ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡによるＶＥＧＦ誘導血管透過性及び白血球静止の治療
眼内のＶＥＧＦの存在は、網膜内の血管透過性及び毛細血管非灌流の増加に対応する、網膜白血球静止を引き起こす。例えば、Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６（５）：１７３３〜９を参照し、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、ラット内でＶＥＧＦの硝子体内注射によって作られた透過性及び白血球静止を減少すると予想される。
【０１３６】
Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（約２００ｇ）に麻酔をし、緩衝液ＯＵ中のＶＥＧＦを硝子体内に注射する。ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡは、硝子体内注射によって各ラットへ同時にＯＤを運搬する。非特異的ｓｉＲＮＡは対照ＯＳとして硝子体内に注射する。付加的な対照は、緩衝液のみ（ＶＥＧＦなし）を注射されたラットを含む。全体の群図式は、表４に示している。
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
注射後２４時間で、実施例１に記載したように、ラットをＡＯＬＦ、及びアイソトープ希釈技術に供する。
【実施例４】
【０１３９】
ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡによる角膜／辺縁系損傷を患った眼における新血管新生の治療
眼球表面の損傷は、角膜辺縁系幹細胞の破壊を生じる。これらの細胞の破壊は、ＶＥＧＦ依存性角膜新血管新生を誘導し、これは失明を導く。新血管新生を促進するＶＥＧＦは、好中球及び単球によって供給され、眼球表面に対する損傷の後、角膜を浸潤する。例えば、Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７（４）：１２７７〜８１を参照し、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。辺縁系損傷の後で角膜に適用される、ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡは、マウスにおける角膜の新血管新生の結果生じる領域を減少するであろうと予想される。新血管新生領域は、直接測定される。或いは、角膜新血管新生における減少は、角膜におけるＶＥＧＦ産生多形核細胞の数の減少から推測され得る。
【０１４０】
角膜新血管新生は、Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（ｓｕｐｒａ）で記載されたように、辺縁系の損傷によって、Ｃ５７Ｂ１／６において誘導される。簡潔に言うと、マウスを麻酔し、水酸化ナトリウムを角膜へ適用する。前記角膜と辺縁系上皮は、角膜ナイフを用いて壊死組織切除した（ＯＵ）。ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡを、除去後すぐ、及び実験の間（７日間）１日３回、角膜表面ＯＤに適用した。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照と同じ用量投与計画でＯＳに投与した。
【０１４１】
Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０００），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、角膜及び辺縁系上皮の壊死組織切除後２、４、及び７日目に、マウスは角膜新血管新生の程度を評価する。簡潔に言うと、内皮特異的フルオレセイン共役レクチンを硝子体内に注射する。注射後３０分で、マウスを屠殺し、その眼を回収し、２４時間ホルマリンで固定する。角膜のフラットマウント（ｆｌａｔ ｍｏｕｎｔｓ）を作成し、この角膜フラットマウントの写真を蛍光顕微鏡下で撮り、解析のためにＯｐｅｎｌａｂソフトウェアにインポートする。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを用いて、血管が見られる所でのみ蛍光の閾値レベルを設定する。蛍光血管の領域及び角膜の領域（辺縁系アーケードで境界を画定された）を計算する。血管の領域は、総角膜領域で分割され、この値は、新血管領域のパーセントと等しい。処置群及び対照群の新血管領域のパーセントを比較する。
【０１４２】
Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０００），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、角膜及び辺縁系上皮の壊死組織切除後２、４、及び７日目に、付加的なマウスは、角膜多形核細胞（ＰＭＮｓ）の定量化のために屠殺する。簡潔に言うと、マウスを屠殺し、その眼を回収し、２４時間ホルマリンで固定する。ホルマリン固定の後、眼球除去された眼をパラフィンで包埋し、切片を作成した。角膜の解剖学的な中心と相関する、各眼からの１つのパラフィン切片を選択し、顕微鏡用に用いる。この１切片上のＰＭＮｓ（多小葉からなる細胞として同定される）を数え、処理群及び対照群からの切片中のＰＭＮｓの数を比較する。
【実施例５】
【０１４３】
ＩＣＭＡ−１を標的としたｓｉＲＮＡによるレーザー誘導脈絡叢新血管新生の治療
Ｂｒｕｃｈ’ｓ膜を破裂するレーザー光凝固は、ウェット黄斑変性症において見られるものと同様な、脈絡叢新血管新生（ＣＮＶ）を誘導する。ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、マウスにおけるレーザー誘導ＣＮＶの領域を減少すると予想される。
【０１４４】
ＣＮＶはマウスにおいて、Ｓａｋｕｒａｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．&Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ．４４（６）：２７４３〜９（この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）に記載された手順によって誘導する。簡潔に言うと、Ｃ５７Ｂ１／６マウスを麻酔し、その瞳孔をトロピカミドで散大する。このマウスの網膜を、各網膜ＯＵの９、１２、及び３時の位置における１レーザースポットを用いてレーザー光凝固化する。レーザー光凝固化に続いて即座に、ＩＣＡＭ−１を標的としたｓｉＲＮＡを、ＯＤへ硝子体内に注射する。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照としてＯＳへ硝子体内に注射する。
【０１４５】
レーザー光凝固化の後１４日で、マウスを屠殺し、Ｓａｋｕｒａｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００３），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、ＣＮＶ領域定量化のために網膜フラットマウントを準備する。簡潔に言うと、マウスに麻酔をし、胸部を開き、下行性大動脈を遮断（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｍｐｅｄ）する。次に右心房を挟み、フルオレセイン標識デキストランを左心室にゆっくりと注射する。
【０１４６】
フルオレセイン標識デキストランの注射後、眼を眼球除去し、２４時間、パラホルムアルデヒドで固定する。次に前眼房及び網膜を除去し、解析のために、各脈絡叢のフラットマウントを準備する。脈絡叢フラットマウントは、蛍光顕微鏡下で写真を撮ることによって解析し、その写真をＯｐｅｎｌａｂソフトウェアへインポートする。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを用いて、新血管新生の領域の輪郭を描き（ｏｕｔｌｉｎｅｄ）、定量化する（その際、既知のレーザー位置を蛍光タフトと比較することを必ずすること）。処理動物の新血管新生領域を、対照動物の新血管新生領域と比較する。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、未処理ＨＥＫ−２９３細胞（"未処理"）の可溶化、若しくは１、１０、５０、１００ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子アルファ（"ＴＮＦ−α"）、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌのインターフェロンガンマ（"ＩＦＮ−γ"）、及び１００、２００、３００μＭのデスフェリオキサミン（"ＤＦＸ"）で１若しくは２日間処理したＨＥＫ−２９３細胞の可溶化液におけるヒトＩＣＡＭ−１タンパク質濃度の柱状図を示したものであり、それぞれはＯＤ４５０ナノメーターでＥＬＩＳＡによって測定した。
【図２】図２は、未処理ＨＥＫ−２９３細胞（"−"）の可溶化液、若しくは１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで処理したＨＥＫ−２９３細胞（"＋"）の可溶化液におけるヒトＩＣＡＭ−１タンパク質濃度の柱状図を示したものであり、それぞれはＯＤ４５０ナノメーターでＥＬＩＳＡによって測定した。前記細胞は、ｓｉＲＮＡでの形質移入なし（"なし"）、非特異的ｓｉＲＮＡで形質移入した（"ＥＧＦＰ"）、若しくはヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを標的とした１０個の異なるｓｉＲＮＡで形質移入した（"ｈＩＣＡＭ１＃１〜１０"）ものである。
【図３】図３は、未処理ＨＥＫ−２９３細胞（"−"）の可溶化液、若しくは１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで処理したＨＥＫ−２９３細胞（"＋"）の可溶化液における細胞毒性の柱状図を示したものであり、それぞれはＯＤ４５０ナノメーターでＥＬＩＳＡによって測定した。前記細胞は、ｓｉＲＮＡでの形質移入なし（"なし"）、非特異的ｓｉＲＮＡで形質移入した（"ＥＧＦＰ"）、若しくはヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを標的とした１０個の異なるｓｉＲＮＡで形質移入した（"ｈＩＣＡＭ１＃１〜１０"）ものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたｓｉＲＮＡであって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有し、前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成するものであり、
前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ（配列ＩＤ番号：１）における約１９〜約２５の近接するヌクレオチドの標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列、若しくは、それらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ配列の同族体は、マウスＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ（配列ＩＤ番号：２）である。
【請求項３】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖は１つのＲＮＡ分子を有し、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は１つのＲＮＡ分子を有するものである。
【請求項４】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ＲＮＡ二本鎖を形成する前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、一本鎖ヘアピンによって共有結合的に連結されているものである。
【請求項５】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ｓｉＲＮＡはさらに、非ヌクレオチド物質を有するものである。
【請求項６】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ｓｉＲＮＡはさらに、１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換、若しくは変化を有するものである。
【請求項７】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ヌクレアーゼ分解に対して安定化されているものである。
【請求項８】
請求項１のｓｉＲＮＡであって、このｓｉＲＮＡは、さらに、
３’オーバーハングを有するものである。
【請求項９】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは、１〜約６ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１０】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは、約２ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１１】
請求項３のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖は、第１の３’オーバーハングを有し、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は、第２の３’オーバーハングを有するものである。
【請求項１２】
請求項１１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記第１及び第２の３’オーバーハングは、別々に１〜約６ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１３】
請求項１２のｓｉＲＮＡにおいて、
前記第１の３’オーバーハングはジヌクレオチドを有し、第２の３’オーバーハングはジヌクレオチドを有するものである。
【請求項１４】
請求項１３のｓｉＲＮＡにおいて、
前記第１と第２の３’オーバーハングを有する前記ジヌクレオチドは、ジチミジル酸（ＴＴ）若しくはジウリジル酸（ｕｕ）である。
【請求項１５】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは、ヌクレアーゼ分解に対して安定化されているものである。
【請求項１６】
請求項１のｓｉＲＮＡを有する、網膜内皮細胞。
【請求項１７】
センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を有する組換えプラスミドであって、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有する、組換えプラスミド。
【請求項１８】
請求項１７の組換えプラスミドにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列は、誘導性若しくは制御性プロモーターを有するものである。
【請求項１９】
請求項１７の組換えプラスミドにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列は、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つ配列をコード化するセンスＲＮＡ鎖と、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つ配列をコード化するアンチセンスＲＮＡ鎖とを有するものである。
【請求項２０】
請求項１７の組換えベクターにおいて、
前記プラスミドは、ＣＭＶプロモーターを有するものである。
【請求項２１】
センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を有する組換えウイルスベクターであって、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有する、組換えウイルスベクター。
【請求項２２】
請求項２１のウイルスベクターにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列は、誘導性若しくは制御性プロモーターを有するものである。
【請求項２３】
請求項２１のウイルスベクターにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列は、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つ配列をコード化するセンスＲＮＡ鎖と、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つ配列をコード化するアンチセンスＲＮＡ鎖とを有するものである。
【請求項２４】
請求項２１の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるものである。
【請求項２５】
請求項２１の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、若しくはＭｏｋｏｌａウイルスからの表面タンパク質でシュードタイピングされているものである。
【請求項２６】
請求項２４の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターを有するものである。
【請求項２７】
ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有し、前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有する、薬学的組成物。
【請求項２８】
請求項２７の薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、さらに、
リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、若しくはリポソームを有するものである。
【請求項２９】
請求項１７のプラスミド若しくはその生理学的許容可能な塩類、及び薬学的に許容可能な担体を有する、薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項２９の薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、さらに、
リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、若しくはリポソームを有するものである。
【請求項３１】
請求項２１のウイルスベクター、及び薬学的に許容可能な担体を有する、薬学的組成物。
【請求項３２】
ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体の発現を阻害する方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有し、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有し、それにより前記ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体が分解される、方法。
【請求項３３】
請求項３２の方法において、
前記対象は、ヒトである。
【請求項３４】
請求項３２の方法において、
ヒトＩＣＭＡ−１ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、若しくは同族体の発現は、前記対象の片目若しくは両目において阻害されるものである。
【請求項３５】
請求項３２の方法において、
ヒトＩＣＭＡ−１ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、若しくは同族体の発現は、前記対象の網膜色素上皮細胞において阻害されるものである。
【請求項３６】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡの有効量は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである。
【請求項３７】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、運搬試薬との組み合わせで投与されるものである。
【請求項３８】
請求項３７の方法において、
前記運搬試薬は、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、及びリポソームからなる群から選択されるものである。
【請求項３９】
請求項３８の方法において、
前記運搬試薬は、リポソームである。
【請求項４０】
請求項３９の方法において、
前記リポソームは、ＩＣＡＭ−１を発現している細胞を前記リポソームが標的とするためのリガンドを有するものである。
【請求項４１】
請求項４０の方法において、
前記リガンドは、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、若しくは腫瘍細胞上の受容体に結合するものである。
【請求項４２】
請求項４１の方法において、
前記内皮細胞は、網膜血管上皮細胞である。
【請求項４３】
請求項４１の方法において、
前記造血細胞は、組織マクロファージ、分裂促進因子で刺激されたＴリンパ球芽細胞、扁桃腺における胚中心樹状細胞、リンパ節における胚中心樹状細胞、及びパイエル板における胚中心樹状細胞からなる群から選択されるものである。
【請求項４４】
請求項４１の方法において、前記リガンドは、モノクローナル抗体を有するものである。
【請求項４５】
請求項３９の方法において、
前記リポソームは、オプソニン化阻害部位で修飾されるものである。
【請求項４６】
請求項４５の方法において、
前記オプソニン化阻害部位は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、若しくはそれらの誘導体を有するものである。
【請求項４７】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、組換えプラスミドから発現されるものである。
【請求項４８】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、組換えウイルスベクターから発現されるものである。
【請求項４９】
請求項４８の方法において、
前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、若しくはヘルペスウイルスベクターを有するものである。
【請求項５０】
請求項４９の方法において、
前記組換えウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、若しくはＭｏｋｏｌａウイルスからの表面タンパク質でシュードタイピングされているレンチウイルスベクターである。
【請求項５１】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、経腸的投与経路によって投与されるものである。
【請求項５２】
請求項５１の方法において、
前記経腸的投与経路は、経口、直腸、及び鼻腔内からなる群から選択されるものである。
【請求項５３】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、非経口的投与経路によって投与されるものである。
【請求項５４】
請求項５３の方法において、
前記非経口的投与経路は、血管内投与、組織周辺及び組織内投与、皮下注射或いは沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、皮下注入、眼内投与、及び、新血管新生部位での或いはその近くでの直接適用からなる群から選択されるものである。
【請求項５５】
請求項５４の方法において、
前記血管内投与は、静脈内大量瞬時注射、静脈注入、動脈内大量瞬時注射、動脈内注入、及び脈管構造へのカテーテル滴下からなる群から選択されるものである。
【請求項５６】
請求項５４の方法において、
前記組織周辺及び組織内注射は、腫瘍周辺注射、腫瘍内注射、網膜内注射、及び網膜下注射からなる群から選択されるものである。
【請求項５７】
請求項５４の方法において、
前記眼内投与は、硝子体内、網膜内、網膜下、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼窩周辺及び眼窩後、トランス角膜及びトランス強膜投与を有するものである。
【請求項５８】
請求項５４の方法において、
前記新血管新生部位での或いはその近くでの直接投与は、カテーテル、角膜ペレット、点眼剤、坐薬、多孔性物質を有する移植片、非多孔性物質を有する移植片、若しくはゼラチン物質を有する移植片による適用を有するものである。
【請求項５９】
請求項５８の方法において、
前記新血管新生部位は眼にあり、新血管新生部位での或いはその近くでの前記直接投与は、点眼剤による適用を有するものである。
【請求項６０】
対象における細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態を阻害する方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有する、方法。
【請求項６１】
請求項６０の方法において、
前記細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態は、ＡＩＤＳ関連性痴呆、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、血管新生、抗原提示、喘息、アテローム性動脈硬化症、毒性腎炎、免疫性腎炎、接触性経皮過敏症、角膜／辺縁系損傷、糖尿病Ｉ型、糖尿病Ｉ型から生じる合併症、バゼドウ病、炎症性腸疾患、炎症性肺疾患、ウイルス感染の炎症性続発症、炎症性皮膚障害、同種移植片の拒絶、Ｔ細胞死滅、混合性リンパ球反応、及びＴ細胞仲介性Ｂ細胞分化などの免疫細胞相互作用、髄膜炎、多発性硬化症、多発性骨髄腫、心筋症、肺線維症、再灌流損傷、再狭窄、網膜炎、リュウマチ性関節炎、敗血性関節炎、脳卒中、腫瘍転移、及びｕｖｅｉｔｉｔｉｓからなる群から選択されるものである。
【請求項６２】
請求項６１の方法において、
前記炎症性皮膚障害は、アレルギー性接触皮膚炎、固定薬剤皮疹、扁平苔癬、及び乾癬である。
【請求項６３】
請求項６１の方法において、
前記同種移植片は、網膜、肝臓、若しくは骨髄移植である。
【請求項６４】
請求項６２の方法において、
前記血管新生は、非病原性であり、脂肪組織の産生、コレステロールの産生、若しくは子宮内膜新血管新生に関連するものである。
【請求項６５】
対象における血管新生病を治療する方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡを有するｓｉＲＮＡの有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する工程を有し、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有し、それにより血管新生病に関連する血管新生が阻害される、方法。
【請求項６６】
請求項６５の方法において、
前記血管新生病は、癌である。
【請求項６７】
請求項６６の方法において、
前記癌は、乳癌、肺癌、頭部と頚部の癌、脳腫瘍、腹腔内腫瘍、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、グリオーマ、肝癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、リンパ腫、及び血液癌からなる群から選択されるものである。
【請求項６８】
請求項６５の方法において、
前記血管新生病は、糖尿病性網膜症、及び年齢関連性黄斑変性症からなる群から選択されるものである。
【請求項６９】
請求項６８の方法において、
前記血管新生病は、年齢関連性黄斑変性症である。
【請求項７０】
請求項６５の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、血管新生病を治療するための薬剤との組み合わせで投与されるものであり、この薬剤は前記ｓｉＲＮＡとは異なるものである。
【請求項７１】
請求項７０の方法において、
前記血管新生病は癌であり、前記薬剤は化学療法薬剤を有するものである。
【請求項７２】
請求項７０の方法において、
前記化学療法薬剤は、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、及びタモキシフェンからなる群から選択されるものである。
【請求項７３】
請求項６５の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、血管新生病を治療するように設計された別の治療方法との組み合わせで、対象へ投与されるものである。
【請求項７４】
請求項７３の方法において、
前記血管新生病は癌であり、前記ｓｉＲＮＡは放射療法、化学療法、若しくは手術との組み合わせで投与されるものである。
【請求項７５】
対象における糖尿病Ｉ型から生じる合併症を治療するための方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量をそのような治療を必要としている対象に投与する工程を有し、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有する、方法。
【請求項７６】
請求項７５の方法において、
前記糖尿病Ｉ型から生じる合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、及び大血管性疾患からなる群から選択されるものである。
【請求項７７】
請求項７６の方法において、
前記大血管性疾患は、冠動脈疾患、脳血管疾患、若しくは末梢血管疾患である。
【請求項１】
単離されたｓｉＲＮＡであって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有し、前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成するものであり、
前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ（配列ＩＤ番号：１）における約１９〜約２５の近接するヌクレオチドの標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列、若しくは、それらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ配列の同族体は、マウスＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ（配列ＩＤ番号：２）である。
【請求項３】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖は１つのＲＮＡ分子を有し、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は１つのＲＮＡ分子を有するものである。
【請求項４】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ＲＮＡ二本鎖を形成する前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、一本鎖ヘアピンによって共有結合的に連結されているものである。
【請求項５】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ｓｉＲＮＡはさらに、非ヌクレオチド物質を有するものである。
【請求項６】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ｓｉＲＮＡはさらに、１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換、若しくは変化を有するものである。
【請求項７】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ヌクレアーゼ分解に対して安定化されているものである。
【請求項８】
請求項１のｓｉＲＮＡであって、このｓｉＲＮＡは、さらに、
３’オーバーハングを有するものである。
【請求項９】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは、１〜約６ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１０】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは、約２ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１１】
請求項３のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖は、第１の３’オーバーハングを有し、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は、第２の３’オーバーハングを有するものである。
【請求項１２】
請求項１１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記第１及び第２の３’オーバーハングは、別々に１〜約６ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１３】
請求項１２のｓｉＲＮＡにおいて、
前記第１の３’オーバーハングはジヌクレオチドを有し、第２の３’オーバーハングはジヌクレオチドを有するものである。
【請求項１４】
請求項１３のｓｉＲＮＡにおいて、
前記第１と第２の３’オーバーハングを有する前記ジヌクレオチドは、ジチミジル酸（ＴＴ）若しくはジウリジル酸（ｕｕ）である。
【請求項１５】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは、ヌクレアーゼ分解に対して安定化されているものである。
【請求項１６】
請求項１のｓｉＲＮＡを有する、網膜内皮細胞。
【請求項１７】
センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を有する組換えプラスミドであって、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有する、組換えプラスミド。
【請求項１８】
請求項１７の組換えプラスミドにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列は、誘導性若しくは制御性プロモーターを有するものである。
【請求項１９】
請求項１７の組換えプラスミドにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列は、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つ配列をコード化するセンスＲＮＡ鎖と、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つ配列をコード化するアンチセンスＲＮＡ鎖とを有するものである。
【請求項２０】
請求項１７の組換えベクターにおいて、
前記プラスミドは、ＣＭＶプロモーターを有するものである。
【請求項２１】
センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を有する組換えウイルスベクターであって、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有する、組換えウイルスベクター。
【請求項２２】
請求項２１のウイルスベクターにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列は、誘導性若しくは制御性プロモーターを有するものである。
【請求項２３】
請求項２１のウイルスベクターにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列は、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つ配列をコード化するセンスＲＮＡ鎖と、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でのｐｏｌｙＴ終止配列との操作可能な連結を持つ配列をコード化するアンチセンスＲＮＡ鎖とを有するものである。
【請求項２４】
請求項２１の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるものである。
【請求項２５】
請求項２１の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、若しくはＭｏｋｏｌａウイルスからの表面タンパク質でシュードタイピングされているものである。
【請求項２６】
請求項２４の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターを有するものである。
【請求項２７】
ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体とを有する薬学的組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有し、前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有する、薬学的組成物。
【請求項２８】
請求項２７の薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、さらに、
リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、若しくはリポソームを有するものである。
【請求項２９】
請求項１７のプラスミド若しくはその生理学的許容可能な塩類、及び薬学的に許容可能な担体を有する、薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項２９の薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、さらに、
リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、若しくはリポソームを有するものである。
【請求項３１】
請求項２１のウイルスベクター、及び薬学的に許容可能な担体を有する、薬学的組成物。
【請求項３２】
ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体の発現を阻害する方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有し、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有し、それにより前記ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体が分解される、方法。
【請求項３３】
請求項３２の方法において、
前記対象は、ヒトである。
【請求項３４】
請求項３２の方法において、
ヒトＩＣＭＡ−１ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、若しくは同族体の発現は、前記対象の片目若しくは両目において阻害されるものである。
【請求項３５】
請求項３２の方法において、
ヒトＩＣＭＡ−１ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、若しくは同族体の発現は、前記対象の網膜色素上皮細胞において阻害されるものである。
【請求項３６】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡの有効量は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである。
【請求項３７】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、運搬試薬との組み合わせで投与されるものである。
【請求項３８】
請求項３７の方法において、
前記運搬試薬は、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、及びリポソームからなる群から選択されるものである。
【請求項３９】
請求項３８の方法において、
前記運搬試薬は、リポソームである。
【請求項４０】
請求項３９の方法において、
前記リポソームは、ＩＣＡＭ−１を発現している細胞を前記リポソームが標的とするためのリガンドを有するものである。
【請求項４１】
請求項４０の方法において、
前記リガンドは、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、若しくは腫瘍細胞上の受容体に結合するものである。
【請求項４２】
請求項４１の方法において、
前記内皮細胞は、網膜血管上皮細胞である。
【請求項４３】
請求項４１の方法において、
前記造血細胞は、組織マクロファージ、分裂促進因子で刺激されたＴリンパ球芽細胞、扁桃腺における胚中心樹状細胞、リンパ節における胚中心樹状細胞、及びパイエル板における胚中心樹状細胞からなる群から選択されるものである。
【請求項４４】
請求項４１の方法において、前記リガンドは、モノクローナル抗体を有するものである。
【請求項４５】
請求項３９の方法において、
前記リポソームは、オプソニン化阻害部位で修飾されるものである。
【請求項４６】
請求項４５の方法において、
前記オプソニン化阻害部位は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、若しくはそれらの誘導体を有するものである。
【請求項４７】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、組換えプラスミドから発現されるものである。
【請求項４８】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、組換えウイルスベクターから発現されるものである。
【請求項４９】
請求項４８の方法において、
前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、若しくはヘルペスウイルスベクターを有するものである。
【請求項５０】
請求項４９の方法において、
前記組換えウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、若しくはＭｏｋｏｌａウイルスからの表面タンパク質でシュードタイピングされているレンチウイルスベクターである。
【請求項５１】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、経腸的投与経路によって投与されるものである。
【請求項５２】
請求項５１の方法において、
前記経腸的投与経路は、経口、直腸、及び鼻腔内からなる群から選択されるものである。
【請求項５３】
請求項３２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、非経口的投与経路によって投与されるものである。
【請求項５４】
請求項５３の方法において、
前記非経口的投与経路は、血管内投与、組織周辺及び組織内投与、皮下注射或いは沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、皮下注入、眼内投与、及び、新血管新生部位での或いはその近くでの直接適用からなる群から選択されるものである。
【請求項５５】
請求項５４の方法において、
前記血管内投与は、静脈内大量瞬時注射、静脈注入、動脈内大量瞬時注射、動脈内注入、及び脈管構造へのカテーテル滴下からなる群から選択されるものである。
【請求項５６】
請求項５４の方法において、
前記組織周辺及び組織内注射は、腫瘍周辺注射、腫瘍内注射、網膜内注射、及び網膜下注射からなる群から選択されるものである。
【請求項５７】
請求項５４の方法において、
前記眼内投与は、硝子体内、網膜内、網膜下、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼窩周辺及び眼窩後、トランス角膜及びトランス強膜投与を有するものである。
【請求項５８】
請求項５４の方法において、
前記新血管新生部位での或いはその近くでの直接投与は、カテーテル、角膜ペレット、点眼剤、坐薬、多孔性物質を有する移植片、非多孔性物質を有する移植片、若しくはゼラチン物質を有する移植片による適用を有するものである。
【請求項５９】
請求項５８の方法において、
前記新血管新生部位は眼にあり、新血管新生部位での或いはその近くでの前記直接投与は、点眼剤による適用を有するものである。
【請求項６０】
対象における細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態を阻害する方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有する、方法。
【請求項６１】
請求項６０の方法において、
前記細胞接着若しくは細胞接着仲介性病態は、ＡＩＤＳ関連性痴呆、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、血管新生、抗原提示、喘息、アテローム性動脈硬化症、毒性腎炎、免疫性腎炎、接触性経皮過敏症、角膜／辺縁系損傷、糖尿病Ｉ型、糖尿病Ｉ型から生じる合併症、バゼドウ病、炎症性腸疾患、炎症性肺疾患、ウイルス感染の炎症性続発症、炎症性皮膚障害、同種移植片の拒絶、Ｔ細胞死滅、混合性リンパ球反応、及びＴ細胞仲介性Ｂ細胞分化などの免疫細胞相互作用、髄膜炎、多発性硬化症、多発性骨髄腫、心筋症、肺線維症、再灌流損傷、再狭窄、網膜炎、リュウマチ性関節炎、敗血性関節炎、脳卒中、腫瘍転移、及びｕｖｅｉｔｉｔｉｓからなる群から選択されるものである。
【請求項６２】
請求項６１の方法において、
前記炎症性皮膚障害は、アレルギー性接触皮膚炎、固定薬剤皮疹、扁平苔癬、及び乾癬である。
【請求項６３】
請求項６１の方法において、
前記同種移植片は、網膜、肝臓、若しくは骨髄移植である。
【請求項６４】
請求項６２の方法において、
前記血管新生は、非病原性であり、脂肪組織の産生、コレステロールの産生、若しくは子宮内膜新血管新生に関連するものである。
【請求項６５】
対象における血管新生病を治療する方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡを有するｓｉＲＮＡの有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する工程を有し、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有し、それにより血管新生病に関連する血管新生が阻害される、方法。
【請求項６６】
請求項６５の方法において、
前記血管新生病は、癌である。
【請求項６７】
請求項６６の方法において、
前記癌は、乳癌、肺癌、頭部と頚部の癌、脳腫瘍、腹腔内腫瘍、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、グリオーマ、肝癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、リンパ腫、及び血液癌からなる群から選択されるものである。
【請求項６８】
請求項６５の方法において、
前記血管新生病は、糖尿病性網膜症、及び年齢関連性黄斑変性症からなる群から選択されるものである。
【請求項６９】
請求項６８の方法において、
前記血管新生病は、年齢関連性黄斑変性症である。
【請求項７０】
請求項６５の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、血管新生病を治療するための薬剤との組み合わせで投与されるものであり、この薬剤は前記ｓｉＲＮＡとは異なるものである。
【請求項７１】
請求項７０の方法において、
前記血管新生病は癌であり、前記薬剤は化学療法薬剤を有するものである。
【請求項７２】
請求項７０の方法において、
前記化学療法薬剤は、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、及びタモキシフェンからなる群から選択されるものである。
【請求項７３】
請求項６５の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、血管新生病を治療するように設計された別の治療方法との組み合わせで、対象へ投与されるものである。
【請求項７４】
請求項７３の方法において、
前記血管新生病は癌であり、前記ｓｉＲＮＡは放射療法、化学療法、若しくは手術との組み合わせで投与されるものである。
【請求項７５】
対象における糖尿病Ｉ型から生じる合併症を治療するための方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量をそのような治療を必要としている対象に投与する工程を有し、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接したヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有する、方法。
【請求項７６】
請求項７５の方法において、
前記糖尿病Ｉ型から生じる合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、及び大血管性疾患からなる群から選択されるものである。
【請求項７７】
請求項７６の方法において、
前記大血管性疾患は、冠動脈疾患、脳血管疾患、若しくは末梢血管疾患である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５２４３４９（Ｐ２００７−５２４３４９Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５００９８８（Ｐ２００６−５００９８８）
【出願日】平成１６年１月１６日（２００４．１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００１１６６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６５５４６
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【出願人】（５００４２９１０３）ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月１６日（２００４．１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００１１６６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６５５４６
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【出願人】（５００４２９１０３）ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Ｆターム（参考）】
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