Ｋｅａｐ１タンパク質結合化合物、該Ｋｅａｐ１タンパク質結合化合物とＫｅａｐ１タンパク質の複合体の結晶及びその製造方法
【課題】Ｋｅａｐ１タンパク質と複合体を形成し、Ｎｒｆ２結合部位で相互作用するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を提供し、酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬の開発に貢献すること。
【解決手段】本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸からなる群から選択される一以上のアミノ酸残基と相互作用し、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と複合体を形成するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を提供する。
【解決手段】本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸からなる群から選択される一以上のアミノ酸残基と相互作用し、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と複合体を形成するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｋｅａｐ１タンパク質結合化合物、該Ｋｅａｐ１タンパク質結合化合物とＫｅａｐ１タンパク質の複合体の結晶及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のバイオテクノロジーの進歩により、医薬品の標的タンパク質のアミノ酸配列が容易に決定できるようになり、Ｘ線構造解析法やコンピューター技術の発展に伴って、これらのアミノ酸配情報から標的タンパク質の立体構造が解明されるようになってきた。医薬品の標的タンパク質の立体構造は、新たな医薬品を設計する上で有力な情報となるため、医薬分子設計（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ；以下、ＳＢＤＤ）と呼ばれる創薬手法が開発され、現在では医薬品の候補化合物を探索する上での主要なアプローチの一つとなっている（非特許文献１及び２）。
【０００３】
このＳＢＤＤは、標的タンパク質の立体構造情報を利用し、標的タンパク質に結合して生理作用（例えば、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用）を発揮し得る化合物を合理的に設計する技術である（非特許文献３）。ＳＢＤＤに必要な標的タンパク質の立体構造情報は、Ｘ線結晶構造解析、電子顕微鏡による解析、核磁気共鳴法による解析等により得ることができるが、中でも、Ｘ線結晶構造解析で得られる立体構造情報は精度が高く情報量も多いため、特に有用であるとされている。
【０００４】
一方、酸化ストレスは、生体に対して種々のダメージを与えることが知られており、癌、種々の循環器疾患、糖尿病、神経変性疾患（非特許文献４〜９）の原因の一つになっていると考えられている。Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）タンパク質は、酸化ストレスに対する生体防御機構に関与するタンパク質であり、酸化ストレスを感知するセンサーとしての役割を果たしていることが知られている。
【０００５】
Ｋｅａｐ１タンパク質は、平常時、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導する転写因子であるＮｒｆ２（ＮＦ−Ｅ２−ｒｅｌａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ２）と結合し、Ｎｒｆ２を細胞質に留めているが、細胞が一旦酸化ストレスに曝されると、Ｋｅａｐ１タンパク質はＮｒｆ２を遊離するため、Ｎｒｆ２は核内へと移行して抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化するからである（非特許文献１０）。
【０００６】
これまでに、Ｋｅａｐ１タンパク質を構成する一部のアミノ酸配列からなるＫｅａｐ１部分タンパク質の単体やＫｅａｐ１部分タンパク質とペプチド化合物との複合体のＸ線結晶構造解析の結果が開示されている（非特許文献１１及び１２）。また、結合部位等の詳細な立体構造情報については不明であるが、Ｋｅａｐ１タンパク質に対して相互作用する化合物の報告もされている（非特許文献１３及び１４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｕｎｔｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２年、２５７巻、p.１０７８〜１０８２
【非特許文献２】Ｌｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、１９９７年、９４巻、p.７３〜７８
【非特許文献３】石黒、「科学」、岩波書店、１９９６年、６６巻、ｐ．５５６〜５６６、
【非特許文献４】Ａｍｅｓら、１９９３年、「ＤＮＡ ａｎｄ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ」（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ， Ｂ． ａｎｄ Ａｒｕｏｍａ， Ｏ．Ｉ．， ｅｄｓ．）、Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｔｄ．、ｐ．１〜１５
【非特許文献５】Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１年、４７７巻、ｐ．７〜２１
【非特許文献６】Ｂｏｎｎｅｆｏｎｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃａｒｅ、２００２年、５巻、ｐ．５６１〜５６８
【非特許文献７】Ｃｅｃｏｎｉら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２００３年、４２０巻、ｐ．２１７〜２２１
【非特許文献８】Ｇｈａｎｂａｒｉら、Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ、２００４年、３巻、ｐ．４１〜４４
【非特許文献９】Ｍｈａｔｒｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、２００４年、６巻、ｐ．１４７〜１５７
【非特許文献１０】Ｔｒｕｙｅｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９年、２８４巻、ｐ．１３２９１〜１３２９５
【非特許文献１１】Ｌｏら、Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、２５巻、ｐ．３６０５〜３６１７
【非特許文献１２】Ｌｉら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、２７９巻、ｐ．５４７５０〜５４７５８
【非特許文献１３】Ｂａｅｋら、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年、５巻、ｐ．１１７６〜１１８２
【非特許文献１４】Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、２００２年、９９巻、p.１１９０８〜１１９１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これまでの知見より、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に相互作用する化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質とＮｒｆ２の結合を阻害してＮｒｆ２を強制的に遊離させることができるため、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化できる医薬品の候補化合物になると考えられたが、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に相互作用する化合物についての報告は一切なく、この考えの立証に利用できる化合物はなかった。なお、非特許文献１３及び１４に記載されたＫｅａｐ１タンパク質に対して相互作用する化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に結合する化合物ではなく、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化できる医薬品にはなり得ないものであった。
【０００９】
また、ＳＢＤＤには、少なくともタンパク質の詳細な立体構造の情報が必要不可欠であり、さらにタンパク質に相互作用する低分子化合物との複合体の原子座標の情報が必要となるが、ＳＢＤＤに利用可なＫｅａｐ１と低分子化合物との複合体の詳細な立体構造の情報についての報告もなかった。
【００１０】
そこで本発明は、Ｋｅａｐ１タンパク質と複合体を形成し、Ｎｒｆ２結合部位で相互作用するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を提供し、酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬の開発に貢献することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｋｅａｐ１タンパク質の部分アミノ酸配列からなるタンパク質と複合体を形成する尿素誘導体を化学合成するとともに、新たな共結晶化法を構築することにより該複合体を結晶化することに成功し、該複合体の結晶の原子座標の解析からＫｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に相互作用するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物の特性を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸からなる群から選択される一以上のアミノ酸残基と相互作用し、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と複合体を形成するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を提供する。
【００１３】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に相互作用し、Ｋｅａｐ１タンパク質とＮｒｆ２の結合を阻害してＮｒｆ２を遊離させることができるため、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化できる。
【００１４】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第１９５番目のヒスチジン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用することが好ましい。
【００１５】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位により強く結合でき、Ｋｅａｐ１タンパク質とＮｒｆ２の結合を阻害してＮｒｆ２を強制的に遊離させることができるため、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を迅速に誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構をより強く活性化できる。
【００１６】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用することがより好ましく、例えば、下記の化学式（Ｉ）で示される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩であればさらに好ましい。
【化１】
【００１７】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に特に強く結合でき、Ｋｅａｐ１タンパク質と複合体を形成できる。Ｎｒｆ２の結合を阻害してＮｒｆ２を強制的に遊離させることができるため、抗酸化ストレスタンパク質群の発現をさらに迅速に誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を特に強く活性化できる。
【００１８】
また本発明は、上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物と、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と、の複合体の結晶を提供する。
【００１９】
上記の結晶は、Ｘ線構造解析を利用することにより、タンパク質と低分子化合物の原子の位置座標も含めた結合状態に関する詳細な情報を得ることができるため、ＳＢＤＤを用いた酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬、その他有益な低分子化合物の創出に利用できる。
【００２０】
さらに本発明は、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質を１〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する標的タンパク質水溶液を調製するＡ工程と、上記標的タンパク質水溶液に含まれる上記Ｋｅａｐ１タンパク質又は上記Ｋｅａｐ１部分タンパク質のモル量に対し、モル過剰量の上記Ｋｅａｐ１タンパク質結合化合物を上記標的タンパク質水溶液に加えるＢ工程と、Ｂ工程の後に、平均分子量が１０００〜１００００のポリエチレングリコールを５〜３０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有する５〜２０ｍＭ酢酸カルシウム溶液を上記標的タンパク質水溶液に加え、上記の結晶を成長させ、塩析させるＣ工程と、を備える、上記の複合体の共結晶の製造方法を提供する。
【００２１】
上記の製造方法によれば、Ｋｅａｐ１タンパク質又はＫｅａｐ１タンパク質の部分アミノ酸配列からなるＫｅａｐ１部分タンパク質と上記の化学式（Ｉ）で示される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩との複合体の良質な結晶を製造できる。特に、Ｘ線結晶構造解析に供した際に、２．２Å以下の分解能を与えるだけの品質を有する結晶を取得できるため、ＳＢＤＤを用いた酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬、その他有益な低分子化合物の創出に利用できる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に相互作用し、Ｋｅａｐ１タンパク質とＮｒｆ２の結合を阻害してＮｒｆ２を遊離させることができるため、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化できる。また、本発明のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、酸化ストレスを軽減できるため、酸化ストレスを原因とする疾患（癌、種々の循環器疾患、糖尿病、神経変性疾患等）の治療薬又は予防薬の候補化合物とすることができる。さらに、本発明の複合体、結晶及び共結晶化方法は、Ｋｅａｐ１タンパク質と相互作用する化合物をＳＢＤＤで探索する際に必要な立体構造情報の取得を可能にし、酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬、その他有益な低分子化合物の創出に利用できる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において、「複合体」とは、タンパク質と低分子化合物が互いに相互作用し合い、又は結合して一体となっているものを指す。
【００２４】
「相互作用」とは、タンパク質や低分子化合物などが互いに影響を及ぼすことを指し、例えば、静電作用や分子間力、水素結合などの影響が挙げられる。
【００２５】
「共結晶化法」とは、タンパク質とそのタンパク質と相互作用する化合物を混合して、その複合体の結晶を作製する方法を指す。この他に複合体の結晶を作製する方法としてはソーキング法が用いられる。ソーキング法は事前にタンパク質の結晶を作製し、その結晶を化合物の溶液に浸漬することで複合体の結晶を作製する方法である。共結晶化法の具体的な手法は、「タンパク質の結晶化」坂部知平ら監修、２００５年、京都大学学術出版会等に記載されている。共結晶の例としてはプロテインデータバンク（ＰＤＢ）で見ることができる。
【００２６】
「緩衝水溶液」とは、酸または塩基を溶液に加えた場合に溶液のｐＨの変化を最小限にする基質を含む水性基剤の溶液を指し、例えば、トリス緩衝液やリン酸緩衝液などが挙げられる。
【００２７】
「蒸気拡散法」とは、結晶化溶液を気体相のみを通して沈殿剤貯留層溶液によって平衡化させる当技術分野で周知のタンパク質結晶化法を指し、液滴の置き方によって、ハンギングドロップ法及びシッティングドロップ法がある。ハンギングドロップ法は、タンパク質溶液の液滴をカバーガラス上に配置し、カバーガラスを貯留層上で反転させ、密封する方法である。一方、シッティングドロップ法は、貯留層内部に適切な液滴台を設置し、タンパク質溶液の液滴を液滴台上に配置し、カバーガラス等で貯留層を密封する方法である。
【００２８】
「アポ型単結晶」とは、化合物が結合せずに形成されたタンパク質の結晶を意味し、例えば、前述の蒸気拡散法などを用いた結晶化法で作製できる。
【００２９】
「分子置換法」とは、同じ機能を有するタンパク質構造を初期モデルとして位相角結晶構造を決定する方法であり、具体的な手法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１１５，５５−７７（１９８５），Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎ編等に記載されている。
【００３０】
「原子座標」とは、結晶形態におけるタンパク質の原子に含まれる電子によるＸ線の回折により得られる個々の回折点の回折強度を数値化し、解析することによって導かれる数学的座標であって、上記タンパク質の原子の位置を３次元座標として表したものを指す。例えば、図１に示したように、タンパク質、低分子化合物などを構成する個々の原子についての座標を表す。
【００３１】
「ファーマコフォア」とは、ある薬理活性を示すために必須の構造的特徴を意味し、例えば、相互作用に必要な複数の官能基群とそれらの空間的な位置関係を表している。
【００３２】
「特性球」とは、疎水性、水素結合供与体、水素結合受容体、などの種々の物理化学的性質を保持した空間的領域を意味し、例えば、脂溶性官能基やカルボニル構造、アミノ基などが挙げられる。
【００３３】
本発明のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸からなる群から選択される一以上のアミノ酸残基と相互作用し、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と複合体を形成することを特徴としている。
【００３４】
ここで、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列とは、ヒトのＫｅａｐ１タンパク質の一部を構成する領域のアミノ酸配列であり、転写因子であるＮｒｆ２がＫｅａｐ１タンパク質に結合する領域（Ｎｒｆ２結合領域）のアミノ酸配列を包含する。なお、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ヒトのＫｅａｐ１タンパク質の全長のアミノ酸配列を示している。
【００３５】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と複合体を形成することにより、Ｋｅａｐ１タンパク質に結合しているＮｒｆ２を遊離させ、Ｎｒｆ２の核内移行を導き、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導する活性を発揮し、最終的に酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化することとなる。
【００３６】
また、上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第１９５番目のヒスチジン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用することが好ましく、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用することがより好ましく、例えば、下記の化学式（Ｉ）で示される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩であればさらに好ましい。
【化２】
【００３７】
上記の尿素誘導体（２−（３−（（３−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ウレイド）メチル）フェノキシ）酢酸）又はその薬理学的に許容される塩は、水和物又は溶媒和物であってもよく、結晶多形を形成してもよく、例えば、以下に記載する製造方法に従って製造することができる。
【００３８】
以下に記載する製造方法において、原料化合物はその塩を用いてもよい。原料化合物の塩としては、例えば、酸付加塩として塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、グルタル酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、フタル酸塩などの有機カルボン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩などの有機スルホン酸塩などが挙げられる。また、塩基との塩であってもよく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩、さらにはトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン塩などの有機塩基塩などが挙げられる。以下の製造方法により得られた上記の尿素誘導体は、公知の手段、例えば、溶媒抽出、再結晶及び／又はクロマトグラフィーによって単離精製でき、公知の方法又はそれに準じる方法によって目的とする塩に変換でき、上記の尿素誘導体が塩の状態で得られた場合には、公知の方法又はそれに準ずる方法によって別途目的とする他の塩に変換できる。
【００３９】
（製造方法１） 上記の尿素誘導体の製造方法：
上記の尿素誘導体は、以下の通り、塩基の存在下又は非存在下で、１，３，４−オキサジアゾリルアミン（ＩＩ）とベンジルアミン（ＩＩＩ）を縮合させることにより製造できる。
【化３】
［式中、Ｌは、脱離基であり、例えば、アルコキシ基又はアリールオキシ基が挙げられる。］
【００４０】
ベンジルアミン（ＩＩＩ）の使用量としては、１，３，４−オキサジアゾリルアミン（ＩＩ）１モルに対して０．４〜２モルが好ましく、０．８〜１．５モルがより好ましい。
【００４１】
塩基の使用量は、１，３，４−オキサジアゾリルアミン（ＩＩ）１モルに対して１〜３．０モルが好ましく、１〜２．０モルがより好ましい。
【００４２】
塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム若しくは炭酸セシウムなどの金属炭酸塩類、水酸化ナトリウム若しくは水酸化カリウムなどの無機塩基類、ピリジン若しくはルチジンなどの芳香族アミン類、トリエチルアミン、トリイソプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキシルジメチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピロリジン若しくはＮ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンなどの第３級アミン類、水素化ナトリウム若しくは水素化カリウムなどのアルカリ金属水素化物類、ナトリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド若しくはリチウムヘキサメチルジシラジドなどの金属アミド類又はナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド若しくはカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドなどの金属アルコキシド類が挙げられる。
【００４３】
本反応は一般に溶媒中で行われ、反応を阻害しない溶媒が適宜選択される。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、ピリジンなどの芳香族アミン類、ジクロロメタン若しくは１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、ヘプタン若しくはヘキサンなどの脂肪族炭化水素類、トルエン、クロロベンゼン若しくはキシレンなどの芳香族炭化水素類、テトラヒドロフラン若しくは１，４−ジオキサンなどのエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド若しくはＮ−メチルピロリドンなどのアミド類又はアセトニトリル若しくはプロピオニトリルなどの脂肪族ニトリル類が挙げられるが、ピリジン、トルエン又はプロピオニトリルが好ましい。ピリジンなどの芳香族アミン類を溶媒として選択した場合は、塩基非存在下にて反応を行うことができる。
【００４４】
反応温度としては、５０〜２００℃が好ましく、６０〜１００℃がより好ましい。また、反応時間としては、３時間〜７２時間が好ましく、６時間〜２４時間がより好ましい。
【００４５】
１，３，４−オキサジアゾリルアミン（ＩＩ）は、自体公知の方法又はこれらに準じた方法に従って製造することができる。例えば、市販されている２−アミノ−５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾールより、公知の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、４８巻、５４６５〜５４６８）又はこれに準ずる方法に従い製造することができる。
【００４６】
（製造方法２） ベンジルアミン（ＩＩＩ）の製造方法：
ベンジルアミン（ＩＩＩ）は、以下の通り、３−ヒドロキシベンゾニトリル（ＩＶ）のアルキル化工程である工程１、加水分解工程である工程２及び還元工程である工程３塩を経る方法で製造できる。
【化４】
【００４７】
（工程１）
ベンゾニトリル（Ｖ）は、例えば、塩基の存在下又は非存在下、３−ヒドロキシベンゾニトリル（ＩＶ）にブロモ酢酸エチルを作用させるアルキル化反応により、製造することができる。ブロモ酢酸エチルの使用量は、３−ヒドロキシベンゾニトリル（ＩＶ）１モルに対して０．８〜５．０モルが好ましく、１．２〜３．０モルがより好ましい。
【００４８】
塩基の使用量は、３−ヒドロキシベンゾニトリル（ＩＶ）１モルに対して０．８〜５．０モルが好ましく、１．２〜３．０モルがより好ましい。
【００４９】
塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム若しくは炭酸セシウムなどの金属炭酸塩類、水酸化ナトリウム若しくは水酸化カリウムなどの無機塩基類、水素化ナトリウム若しくは水素化カリウムなどのアルカリ金属水素化物類又はカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドなどの金属アルコキシド類が挙げられる。
本反応は一般に溶媒中で行われ、反応を阻害しない溶媒が適宜選択される。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トルエン、クロロベンゼン若しくはキシレンなどの芳香族炭化水素類、テトラヒドロフラン若しくは１，４−ジオキサンなどのエーテル類、アセトンなどのケトン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド若しくはＮ−メチルピロリドンなどのアミド類又はアセトニトリル若しくはプロピオニトリルなどの脂肪族ニトリル類が挙げられるが、アセトン又はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。
【００５０】
反応温度としては、２０〜５０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。また、反応時間としては、１５分〜２４時間が好ましく、３０分〜１２時間がより好ましい。
【００５１】
（工程２）
カルボン酸（ＶＩ）は、例えば塩基の存在下、エステル（Ｖ）を公知の方法で加水分解することにより、製造できる。
【００５２】
加水分解反応には、例えば、塩基として、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム若しくは水酸化カリウムなどの無機塩基類が挙げられる。本反応は一般に溶媒中で行われ、反応を阻害しない溶媒が適宜選択される。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類、テトラヒドロフラン若しくは１，４−ジオキサンなどのエーテル類、又はそれらエーテル類と水との混合溶媒が挙げられるが、テトラヒドロフランと水との混合溶媒が好ましい。
【００５３】
反応温度としては、２０〜５０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。また、反応時間としては、１５分〜２４時間が好ましく、３０分〜１２時間がより好ましい。
【００５４】
（工程３）
ベンジルアミン（ＩＩＩ）は、例えば、ベンゾニトリル（ＶＩ）を公知の方法で還元することにより、製造することができる。
【００５５】
還元反応には、例えば、還元剤として、例えば、ジイソブチルアルミニウムヒドリド、リチウムアルミニウムヒドリド、ナトリウムビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムヒドリド又はボラン錯体などの金属水素化物を用いる方法と、水素雰囲気下で遷移金属触媒を用いる方法が挙げられる。該遷移金属触媒としては、例えば、パラジウム−炭素、水酸化パラジウム又は４価酸化白金が挙げられる。触媒の使用量は、ベンゾニトリル（ＶＩ）１モルに対して０．０１〜１．０モルが好ましい。反応温度としては、２０〜５０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。また、反応時間としては、１５分〜２４時間が好ましく、３０分〜１２時間がより好ましい。
【００５６】
また本発明の結晶は、上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物と、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質との複合体の共結晶であることを特徴としている。
【００５７】
上記の複合体の結晶は、タンパク質水溶液の調整工程、複合体を形成する工程、共結晶化工程で製造できる。特に好ましい製造方法としては、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質を１〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する標的タンパク質水溶液を調製するＡ工程と、上記標的タンパク質水溶液に含まれる上記Ｋｅａｐ１タンパク質又は上記Ｋｅａｐ１部分タンパク質のモル量に対し、モル過剰量の上記Ｋｅａｐ１タンパク質結合化合物を上記標的タンパク質水溶液に加えるＢ工程と、Ｂ工程の後に、平均分子量が１０００〜１００００のポリエチレングリコールを５〜３０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有する５〜２０ｍＭ酢酸カルシウム溶液を上記標的タンパク質水溶液に加え、上記の共結晶を成長させ、塩析させるＣ工程と、を備える製造方法が挙げられる。
【００５８】
具体的には、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質を緩衝水溶液に溶解する。緩衝水溶液は、例えば、トリス緩衝液やリン酸緩衝液などが挙げられ、トリス緩衝液が好ましい。タンパク質の濃度は０．１〜２０ｍｇ／ｍＬが好ましく、１〜１２ｍｇ／ｍＬがより好ましい。
【００５９】
その後、上記標的タンパク質水溶液にモル過剰量のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を加えて、そのまま静置すれば複合体が形成される。モル過剰量としては、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質１モルに対して１〜３０モルが好ましく、５〜２０モルがより好ましい。静置する時間は１分〜３日が好ましく、２時間〜１日がより好ましい。静置する温度としては、３〜２５℃が好ましく、４℃がより好ましい。
【００６０】
共結晶化工程は蒸気拡散法が好ましく、例えば、ハンギングドロップ法及びシッティングドロップ法が利用できる。具体的には、タンパク質と化合物複合体の溶液約１０μＬ未満を、貯留層溶液と混合し、このタンパク質／沈殿剤溶液と貯留層をカバーガラス等で密封し、結晶が成長するまで静置すればよい。
【００６１】
貯留層溶液としては、例えば、当該分野で公知の沈殿剤及び緩衝水溶液が挙げられ、沈殿剤と緩衝水溶液を組み合わせて使用しても良い。沈殿剤としては、硫酸アンモニウムやポリエチレングリコールが好ましく、ポリエチレングリコールがより好ましい。ポリエチレングリコールの平均分子量としては、２００〜２００００が好ましく、２０００〜８０００がより好ましい。ポリエチレングリコールの濃度は１〜４０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）がより好ましい。
【００６２】
緩衝水溶液は１〜２０ｍＭの市販の緩衝水溶液が好ましく、５〜２０ｍＭ酢酸カルシウム溶液がより好ましい。また、結晶を成長させる温度としては、３〜２５℃が好ましく、４℃がより好ましい。結晶を成長させる時間は１日〜１年が好ましく、３日〜３週間がより好ましい。
【００６３】
上記の結晶は、Ｘ線結晶構造解析に供した際に少なくとも１０Å以下の分解能、好ましくは４．０Å以下の分解能、より好ましくは３．４Å以下の分解能、特に好ましくは２．２Å以下の分解能を与えるだけの品質を有していることが好ましい。
【００６４】
こうして得られる上記の結晶及びその解析により得られる原子座標は、幅広い用途を有する。例えば、上記の結晶及び原子座標は、新しい治療物質を開発するためのアプローチとしてＫｅａｐ１タンパク質と結合する化合物を同定するために特に有用である。
【００６５】
具体的には、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と低分子化合物との複合体結晶の構造情報を解析し、疎水的な相互作用・イオン結合・水素結合を形成している部位やアミノ酸残基、さらには、複合体構造のＫｅａｐ１タンパク質の分子形状を解析することで、化合物の分子設計やスクリーニングに必要なファーマコフォアを提示（設計）することが可能となる。さらに、既に記述したアミノ酸残基の立体的配置や水分子の三次元的な配置を規定することで、コンピューターによるＫｅａｐ１タンパク質に結合する化合物の分子設計やスクリーニングができる。
【００６６】
以下に、Ｋｅａｐ１タンパク質に結合する化合物の分子設計方法、ファーマコフォアの設計方法及びファーマコフォアを用いたスクリーニング方法について記載する。
【００６７】
（Ｋｅａｐ１タンパク質に結合する化合物の分子設計方法）
本発明のＫｅａｐ１タンパク質の原子座標を用いることでＫｅａｐ１タンパク質に結合する化合物の分子設計（活性上昇、選択性付与など）が可能となる。また、得られた化合物の誘導最適化に活用することも可能となる。例えば、スクリーニングによって得られたＫｅａｐ１タンパク質に結合する化合物を、コンピューターによってドッキングモデル構造を予測することも可能である。このモデル構造は、化合物と近傍のアミノ酸残基との相互作用を増強させるような誘導方向性を見出す上で、非常に有用である。さらに、活性には影響を与えずに、代謝、毒性などの改善を進める上で適当な方向性を提示することもできる。加えて、薬理試験や代謝試験における種差の考察や、副作用軽減を目的として標的タンパク質に対する選択性を向上させるための誘導合成を支援する上で最も有用な情報を提供できる。
【００６８】
（ファーマコフォアの設計方法）
ファーマコフォアの設計は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と低分子化合物との複合体結晶の原子座標により表される３次元構造を解析し、ファーマコフォアとして使用し得る部分構造（アミノ酸残基、構造水等）を特定する工程、及び、該部分構造を特性球に変換し、ファーマコフォアを発生させる工程、により実施できる。
【００６９】
ファーマコフォアとして使用し得る部分構造を特定する工程は、目視及び／又は適切なコンピュータープログラムを使用しても良い。また、部分構造を特性球に変換し、ファーマコフォアを発生させる工程は、コンピューターシステムを用いることにより実施できる。例えば、市販のソフトウェアと該ソフトウェアを作動可能なコンピューターシステムが利用でき、ソフトウェアとしてはＭＯＥ（ｃｃｇ社）等が挙げられる。
【００７０】
（ファーマコフォアを用いたスクリーニング方法）
設計したファーマコフォアと解析用ソフトウェアを用いて、Ｋｅａｐ１タンパク質に結合する化合物のスクリーニングを行うことができる。ソフトウェアはリガンドからの化学的機能の抽出及び抽出した化学的機能と類似した空間配置を取り得る化合物の検索が可能なソフトウェアであれば何を用いても良く、例えば、解析用ソフトウェアであるＭＯＥ（ｃｃｇ社）やＳｙｂｙｌ（トライポス社）のモジュールであるＵｎｉｔｙ等を用いてもよい。この際、化合物のクラスタリングが必要であれば、Ｄａｙｌｉｇｈｔ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｓｓｉｏｎ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）等のプログラムを使用することが可能である。以下、ＭＯＥ（ｃｃｇ社）を使用した例を示す。
【００７１】
設計したファーマコフォアを用いて、あらかじめ準備したコンピュータースクリーニング用の化合物構造データベースを対象としてスクリーニングを実施する。ファーマコフォアの情報とある化合物の立体構造の空間配置とを比較し、該化合物がファーマコフォアの性質を満足させるものであるかどうかを計算により決定する。コンピュータースクリーニングの利点として、検索対象が理論上考え得る全ての化合物の部分集合であることが挙げられる。通常は、自社で保有する化合物のデータベース、市販化合物データベース（例えば、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＭＤＬ社）又はバーチャルコンビナトリアル合成手法等を用いて発生させた仮想化合物のデータベース、天然物由来の化合物データベース、医薬品データベース等をコンピューター検索用に変換して用いることができる。
【００７２】
また、検索式でヒットした化合物群をデータベース化し、引き続きタンパク質構造を市販のドッキングソフトウェアに適用することによってヒット率を増すこともできる。また、Ｋｅａｐ１タンパク質に結合する化合物は、ＭＶＤ（Ｍｏｌｒｅｇｒｏ社）等を用いてコンピュータースクリーニングする際に有効なフィルターとして使用することができるし、各ファーマコフォアに対して適合するフラグメントを配置した後に各フラグメントを適当な官能基で結合させて化合物を構築すること（Ｄｅ Ｎｏｖｏ設計的使用）も可能である。上記コンピュータースクリーニングによりヒットした化合物群は、一定の確率で、Ｋｅａｐ１タンパク質に結合する化合物となり得る。
【００７３】
本明細書に記載の原子座標は、さらに全長のＫｅａｐ１タンパク質又は変異Ｋｅａｐ１タンパク質の結晶構造と、化合物が結合したようなＫｅａｐ１タンパク質の複合体の結晶の構造とを決定するための位相調整モデルとして用いることができる。原子座標と、そこから得られる三次元構造とを用いてＮＭＲによって得られるような、本来のＫｅａｐ１タンパク質又は変異Ｋｅａｐ１タンパク質の溶液に基づく構造解析にも役立てることができる。このように、本発明の結晶及び原子座標は、Ｋｅａｐ１タンパク質の構造及び機能を解明するための手段を提供する。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例及び参考例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、以下の記載において、ＮＭＲデータ中の溶媒名は、測定に使用した溶媒を示している。
【００７５】
また、４００ ＭＨｚ ＮＭＲスペクトルは、ＪＮＭ−ＡＬ４００型核磁気共鳴装置（日本電子）を用いて測定した。ケミカルシフトは、テトラメチルシランを基準として、δ（単位：ｐｐｍ）で表し、シグナルはそれぞれｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｑｕｉｎｔ（五重線）、ｓｅｐｔ（七重線）、ｍ（多重線）、ｂｒ（幅広）、ｄｄ（二重二重線）、ｄｔ（二重三重線）、ｄｄｄ（二重二重二重線）、ｄｑ（二重四重線）、ｔｄ（三重二重線）、ｔｔ（三重三重線）で表した。ＩＲスペクトルはＦＴ／ＩＲ−４１０（日本分光）を、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ２Ｋ（Ｗａｔｅｒｓ）又は１２００ＬＣ／ＭＳＤ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて測定した。溶媒は全て市販のものを用いた。フラッシュクロマトグラフィーはＹＦＬＣ Ｗ−ｐｒｅｐ２ＸＹ（山善）を用いた。
【００７６】
上記の尿素誘導体（実施例１の化合物）の原料及び中間体については、以下の参考例に記載する方法で合成した。なお、参考例化合物の合成に使用される化合物で、合成法の記載のないものについては、市販の化合物を使用した。
【００７７】
（参考例１） ２−（３−シアノフェノキシ）酢酸エチルの合成：
【化５】
３−ヒドロキシベンゾニトリル（１．４２９ｇ、１２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．１５６ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）のアセトン（１２０ｍＬ）溶液に、ブロモ酢酸エチル（２．８１ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）を加えて室温にて攪拌した。１１時間撹拌を継続した後、セライトにより濾過し、濾液を減圧下濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、表題化合物（２．４６ｇ、１１．９ｍｍｏｌ、９９％）を無色油状物として得た。
1H‐NMR (400 MHz, CDCL3) δ: 1.29 (3H, t, J=7.8Hz), 4.13 (2H, q, J=7.8Hz), 4.96 (2H, s), 7.27‐7.48 (3H, m),7.61(1H, s)
ESI‐MS: m/z= 206 (M+H)+
【００７８】
（参考例２） ２−（３−シアノフェノキシ）酢酸の合成：
【化６】
２−（３−シアノフェノキシ）酢酸エチル（６１６ｍｇ、３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１２ｍＬ）及び水（６ｍＬ）溶液に、４ｍＭ水酸化リチウム水溶液（３．７５ｍＬ）を加え、１時間撹拌した。その後、１Ｎ塩酸水溶液を反応系に滴下し、液性をｐＨ＜１まで酸性とした後、塩化メチレン（２０ｍＬ）にて抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、濾液を減圧濃縮し、表題化合物を白色固体（５３１ｍｇ、９９％）として得た。
1H‐NMR (400 MHz, CDCL3) δ: 4.08 (2H, s), 7.27‐7.48 (3H, m),7.64(1H, s)
ESI‐MS: m/z= 177 (M+)
【００７９】
（参考例３） ２−（３−（アミノメチル）フェノキシ）酢酸の合成：
【化７】
２−（３−シアノフェノキシ）酢酸（１００ｍｇ、０．５６４ｍｍｏｌ）のメタノール（１．２ｍＬ）溶液に、酢酸（１．２ｍＬ）を添加し、パラジウム−炭素（１０ｍｇ）を加え、反応系を水素雰囲気下とした。４時間撹拌を継続した後、反応系をアルゴン雰囲気下へとした。セライトにより濾過し、濾液を減圧下濃縮し、表題化合物（１３８ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ、１３１％）を白色固体として得た。
1H‐NMR (400 MHz, CDCL3) δ: 4.36 (2H, s), 4.66 (2H, s), 6.79-7.01 (3H, m), 7.15 (1H, s),
ESI‐MS: m/z= 182 (M+H)+
【００８０】
（参考例４） ２，２，２−トリクロロエチル−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）カルバメートの合成：
【化８】
２−アミノ−５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール（３．０２ｇ、２０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８０ｍＬ）溶液に、１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）を添加し、ジイソプロピルエチルアミン（３．８８ｇ、３０ｍｍｏｌ）及びクロロ蟻酸２、２，２−トリクロロエチルエステル（４．４５ｇ、２１ｍｍｏｌ）を室温にて加え、室温で２０時間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、表題化合物（５．１１ｇ、７８％）を白色固体として得た。
1H‐NMR (400 MHz, CDCL3) δ: 4.84 (2H, s), 6.68 (1H, dd, J=1.5, 7.5Hz), 7.08 (1H, dd, J=1.5, 7.5Hz),7.86 (1H,dd, J=1.5, 7.5Hz) 9.15(1H,bs)
ESI‐MS: m/z= 325,327 (M+H)+
【００８１】
（実施例１） ２−（３−（（３−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ウレイド）メチル）フェノキシ）酢酸（以下、実施例１の化合物）の合成：
【化９】
２，２，２−トリクロロエチル−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）カルバメート（０．０９８ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、及び２−（３−（アミノメチル）フェノキシ）酢酸（０．０７２ｇ、０．３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．５ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．０８１ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、６０℃で１２時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、反応液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、さらにフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール）で精製し、２−（３−（（３−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ウレイド）メチル）フェノキシ）酢酸、すなわち、実施例１の化合物（０．０９０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、８４％）を白色固体として得た。
1H‐NMR (400 MHz, DMSO‐d6) δ: 4.38 (2H, d, J=5.6 Hz), 4.65 (2H, s), 6.78 (2H, tt, J=5.12, 2.56 Hz), 6.91 (2H, tt, J=5.6, 8.0 Hz), 7.18 (1H, td, J=2.2, 1.22 Hz), 7.25 (1H, t, J=7.93 Hz), 8.01 (2H, m, J=1.6 Hz), 11.6 (1H, brs), 13.0 (1H, brs)
ESI‐MS: m/z= 359 (M+H)+
【００８２】
（実施例２） Ｋｅａｐ１タンパク質の部分アミノ酸配列からなるタンパク質（以下、Ｋｅａｐ１部分タンパク質）の発現と精製：
１）Ｋｅａｐ１タンパク質部分タンパク質の発現：
Ｈｕｈ−７細胞のＴｏｔａｌ ＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを鋳型にして、ヒトＫｅａｐ１の塩基配列（ＲｅｆＳｅｑ番号：ＮＭ＿０１２２８９）に基づき設計した２つのプライマー、フォワード側：５’−ｃａｔａｔｇｇｃｇｃｃｃａａｇｇｔｇｇｇｃｃｇｃｃｔｇ−３’（配列番号３）及びリバース側：５’−ｇｇａｔｃｃｔｃａｇｇｔｇａｃａｇｃｃａｃｇｃｃｃａｃｃｃｃａｃ−３’（配列番号４）を用いて、ＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅し、そのＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＡ２（東洋紡社）にサブクローニングした。ポジティブクローンの塩基配列の解析を行い、目的とするＫｅａｐ１の部分塩基配列並びに、その５’末端に制限酵素ＮｄｅＩ及び３’末端にＢａｍＨＩ認識配列が付加された配列を有するクローンを得た。
【００８３】
このクローンを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断して得られた、約８８０ｂｐのＫｅａｐ１の部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ開裂部位に挿入し、発現ベクターＫｅａｐ１／ｐＥＴ−１５ｂを得た。このクローンについて塩基配列を調べた結果、目的の配列が挿入されたクローンであることを確認した。なお、該クローンに含まれる約８８０ｂｐのＫｅａｐ１の部分塩基配列は、Ｋｅａｐ１タンパク質のアミノ酸残基第３２２番から第６０９番までのポリペプチド（配列番号１）をコードする塩基配列である。
【００８４】
このように構築した発現ベクターＫｅａｐ１／ｐＥＴ−１５ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ形質転換した。カルベニシリン（Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ；ナカライテスク社）選択培地で取得した、カルベニシリン耐性のシングルコロニーを、１０ｍＬのカルベニシリン含有ＬＢ（ＧＩＢＣＯ）培地で３７℃にて一晩培養した。翌日、この培養液５ｍＬを２７０ｍＬのカルベニシリン含有Ｐｌｕｓｇｒｏｗ（ナカライテスク社）培地に加え、３７℃にてＯＤ６００が０．８以上になるまで培養を行った。２０℃にて３０分間静置した後、終濃度０．４ｍｍｏｌ／ＬとなるようＩＰＴＧ（ナカライテスク社）を培地に添加し、２０℃にてタンパク質誘導を一晩行った。培養液を５，０００×ｇ、１０分間遠心して得られた大腸菌を、タンパク質精製を実施するまで−８０℃にて保存した。
【００８５】
２）Ｋｅａｐ１部分タンパク質の精製：
１）で得た大腸菌にＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＨＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて室温にて２０分間反応させることで溶菌した。溶菌した液を２０，０００×ｇ、２０分間遠心することで可溶画分と不溶画分に分画した。不溶画分は、８ｍｏｌ／Ｌ Ｕｒｅａ（ナカライテスク社）にて再溶解した。可溶画分を回収し、終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイミダゾール（ナカライテスク社）を添加した後、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、これを精製用サンプルとした。結合緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４（Ｗａｋｏ社）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ社））で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ５ｍＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に、ペリスタポンプを用いて精製用サンプルを添加した。精製用サンプル添加後、カラムをＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に接続し、２％の溶出緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ ｍｏｌ／Ｌ イミダゾール）でカラムを洗浄した。カラム洗浄後、３０％の溶出緩衝液を添加し、Ｋｅａｐ１部分タンパク質を溶出した。
【００８６】
Ｋｅａｐ１部分タンパク質を含む溶出画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＷＣＯ＝１０，０００）を用いて約５ｍＬまで濃縮し、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターでろ過した。次に、このろ液について、ゲルろ過緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）（ナカライテスク社）、１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ（ナカライテスク社））で平衡化したＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １２０ｍＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ｓを用いてゲルろ過を行った。
【００８７】
ゲルろ過により得られたＫｅａｐ１部分タンパク質を含む溶出画分を回収し、それをイオン交換緩衝液Ａ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ）で２倍に希釈した。この希釈した溶出画分を、ペリスタポンプを用いてイオン交換緩衝液Ａで平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ ５ｍＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に添加した。次に、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ｓにカラムを接続後、１０％のイオン交換緩衝液Ｂ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）でカラムを洗浄した。引き続き１００ｍＬで１０〜４０％のイオン交換緩衝液ＢになるようなリニアグラジエントでＫｅａｐ１部分タンパク質を溶出した。なお、ここで得られたＫｅａｐ１部分タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示されており、このアミノ酸配列は、配列番号２に示されるＫｅａｐ１タンパク質のＮ末端の第一のメチオニンを１番とした時に、アミノ酸残基第３２２番から第６０９番までに相当する。
【００８８】
３）Ｋｅａｐ１部分タンパク質の確認：
２）で得られたＫｅａｐ１部分タンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製度を確認した。ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて非還元下にて２００Ｖ、３５分間泳動した。なお、分子量マーカーにはＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。泳動終了後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてゲルをＣＢＢ染色し、約３５ｋＤａに目的のバンドを確認した。
【００８９】
（実施例３） 実施例１の化合物とＫｅａｐ１部分タンパク質の複合体の共結晶化：
共結晶化は、実施例２で得られたＫｅａｐ１部分タンパク質（配列番号１）を１２．０８ ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、２０ｍＭ ＤＴＴ及び実施例１の化合物（Ｋｅａｐ１部分タンパク質の１５倍濃度）を含有する溶液中で実施し、得られた結晶は、ハンギングドロップ法を使用して蒸気拡散法によって成長させた。
【００９０】
具体的には、下記の通りである。２４ウェル培養プレートの貯留層容器を、平均分子量約３３５０ダルトンの１０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール、０．１Ｍ酢酸カルシウムを含有する０．５ｍＬの沈殿剤溶液で満たした。実施例２で得られたＫｅａｐ１部分タンパク質（配列番号１）を１２．０８ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、２０ｍＭ ＤＴＴ及び実施例１の化合物（Ｋｅａｐ１部分タンパク質の１５倍濃度）を含有する溶液１μＬと沈殿剤１μＬとをガラス板上で混合して、ドロップを作製し、ガラス板を裏返して貯留層容器のふたになるようにドロップを下向きにして、２４ウェル培養プレートに設置し、隙間ができないようにグリースで密封させて４℃で保管して結晶化を開始した。結晶は、３日〜３週間で現れた。得られた結晶を、３０％（Ｗ／Ｖ）エチレングリコールを添加した母液に浸した後、液体窒素中で瞬間凍結した。
【００９１】
（実施例４） Ｘ線回折データ収集：
Ｘ線回折データはＳＰｒｉｎｇ−８（理化学研究所の播磨研究所）のＢＬ２６Ｂ２（理化学研究所の構造生物学ビームライン）で、波長１．０Åにて、ＭａｒＭｏｓａｉｃ２２５（Ｒａｙｏｎｉｘ社）のＣＣＤ検出器により収集した。Ｘ線回折データは、Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉらが発表したＨＫＬ２０００プログラム（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９７年、２７６巻、ｐ．３０７−３２６）によって処理し、分解能が１．８ÅまでのＸ線回折データを記録した。結晶の単位格子寸法は、ａ＝５１Å、ｂ＝６６Å、ｃ＝７７Å、α ＝ β ＝ γ ＝ ９０°を有し、空間群はＰ２（１）２（１）２（１）であると決定した。
【００９２】
（実施例５） 実施例１の化合物とＫｅａｐ１部分タンパク質の複合体の結晶の構造決定及び精密化：
実施例１の化合物とＫｅａｐ１部分タンパク質の複合体の構造は、実施例４で収集したＸ線回折データをもとに、Ｋｅａｐ１アポ型単結晶の立体構造（ＰＤＢコード：１Ｕ６Ｄ）をサーチモデルとして、プログラムＭｏｌｒｅｐ（ＣＣＰ４ｉ）を利用した分子置換法により決定した。立体構造の構築はプログラムＲｅｆｍａｃ（ＣＣＰ４ｉ）で行い、構造精密化は、Ｂｒｕｎｇｅｒらが発表したプログラムＣＮＳ（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ.、１９９８年、Ｄ５４巻、ｐ．９０５−９２１）を使った。
【００９３】
表１−１〜１−４６は、実施例１の化合物とＫｅａｐ１部分タンパク質の複合体の結晶の原子座標を示しており、当業者において一般的に用いられているプロテインデータバンク（ＰＤＢ）の表記方法に基づいて表記した。また、表１−１〜表１−４６は、データ量が多いため、１つの表を４６個の表に分断したものである。
【００９４】
なお、表には左から順に以下の内容が記載されている：
Ａｔｏｍ ｎｕｍｂｅｒ：座標表内の原子の識別番号
Ａｔｏｍ Ｎａｍｅ：特定の座標に存在する原子についての識別子
Ｒｅｓｉｄｕｅ：鎖中のアミノ酸や結晶中に存在する他の成分（例えば、化合物についてはＤＲＧ、水についてはＨＯＨで表す。）
Ｃｈａｉｎ ＩＤ：結晶中のタンパク質の一つのモノマーを鎖「Ｘ」で示す。タンパク質ダイマーの場合は、２つのＣｈａｉｎ ＩＤを有する。
Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｎｕｍｂｅｒ：鎖中のアミノ酸残基数
Ｘ、Ｙ、Ｚ：Ｘ、Ｙ及びＺ座標値
Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ：原子が結晶中に観察される時間の割合を表す。例えば、Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ＝１は、原子が常に存在することを意味し、Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ＝０．５は、原子がその時間の５０％はその位置に存在していることを示す。
Ｂ−ｆａｃｔｏｒ：原子の熱運動の測定値
Ｃｈａｉｎ ＩＤ：上記Ｃｈａｉｎ ＩＤと同様
Ｅｌｅｍｅｎｔ：元素の識別子
【００９５】
【表１−１】
【００９６】
【表１−２】
【００９７】
【表１−３】
【００９８】
【表１−４】
【００９９】
【表１−５】
【０１００】
【表１−６】
【０１０１】
【表１−７】
【０１０２】
【表１−８】
【０１０３】
【表１−９】
【０１０４】
【表１−１０】
【０１０５】
【表１−１１】
【０１０６】
【表１−１２】
【０１０７】
【表１−１３】
【０１０８】
【表１−１４】
【０１０９】
【表１−１５】
【０１１０】
【表１−１６】
【０１１１】
【表１−１７】
【０１１２】
【表１−１８】
【０１１３】
【表１−１９】
【０１１４】
【表１−２０】
【０１１５】
【表１−２１】
【０１１６】
【表１−２２】
【０１１７】
【表１−２３】
【０１１８】
【表１−２４】
【０１１９】
【表１−２５】
【０１２０】
【表１−２６】
【０１２１】
【表１−２７】
【０１２２】
【表１−２８】
【０１２３】
【表１−２９】
【０１２４】
【表１−３０】
【０１２５】
【表１−３１】
【０１２６】
【表１−３２】
【０１２７】
【表１−３３】
【０１２８】
【表１−３４】
【０１２９】
【表１−３５】
【０１３０】
【表１−３６】
【０１３１】
【表１−３７】
【０１３２】
【表１−３８】
【０１３３】
【表１−３９】
【０１３４】
【表１−４０】
【０１３５】
【表１−４１】
【０１３６】
【表１−４２】
【０１３７】
【表１−４３】
【０１３８】
【表１−４４】
【０１３９】
【表１−４５】
【０１４０】
【表１−４６】
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化できるため、酸化ストレスを原因とする疾患（癌、種々の循環器疾患、糖尿病、神経変性疾患等）の治療薬又は予防薬の候補化合物とすることができる。さらに、本発明の複合体、共結晶及び共結晶化方法は、Ｋｅａｐ１タンパク質と相互作用する化合物をＳＢＤＤで探索する際に必要な立体構造情報の取得を可能にし、酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬、その他有益な低分子化合物の創出に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４２】
配列番号１：Ｎｒｆ２結合領域を含むＫｅａｐ１部分タンパク質
配列番号２：Ｋｅａｐ１タンパク質
配列番号３及び４：ＰＣＲプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｋｅａｐ１タンパク質結合化合物、該Ｋｅａｐ１タンパク質結合化合物とＫｅａｐ１タンパク質の複合体の結晶及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のバイオテクノロジーの進歩により、医薬品の標的タンパク質のアミノ酸配列が容易に決定できるようになり、Ｘ線構造解析法やコンピューター技術の発展に伴って、これらのアミノ酸配情報から標的タンパク質の立体構造が解明されるようになってきた。医薬品の標的タンパク質の立体構造は、新たな医薬品を設計する上で有力な情報となるため、医薬分子設計（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ；以下、ＳＢＤＤ）と呼ばれる創薬手法が開発され、現在では医薬品の候補化合物を探索する上での主要なアプローチの一つとなっている（非特許文献１及び２）。
【０００３】
このＳＢＤＤは、標的タンパク質の立体構造情報を利用し、標的タンパク質に結合して生理作用（例えば、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用）を発揮し得る化合物を合理的に設計する技術である（非特許文献３）。ＳＢＤＤに必要な標的タンパク質の立体構造情報は、Ｘ線結晶構造解析、電子顕微鏡による解析、核磁気共鳴法による解析等により得ることができるが、中でも、Ｘ線結晶構造解析で得られる立体構造情報は精度が高く情報量も多いため、特に有用であるとされている。
【０００４】
一方、酸化ストレスは、生体に対して種々のダメージを与えることが知られており、癌、種々の循環器疾患、糖尿病、神経変性疾患（非特許文献４〜９）の原因の一つになっていると考えられている。Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）タンパク質は、酸化ストレスに対する生体防御機構に関与するタンパク質であり、酸化ストレスを感知するセンサーとしての役割を果たしていることが知られている。
【０００５】
Ｋｅａｐ１タンパク質は、平常時、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導する転写因子であるＮｒｆ２（ＮＦ−Ｅ２−ｒｅｌａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ２）と結合し、Ｎｒｆ２を細胞質に留めているが、細胞が一旦酸化ストレスに曝されると、Ｋｅａｐ１タンパク質はＮｒｆ２を遊離するため、Ｎｒｆ２は核内へと移行して抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化するからである（非特許文献１０）。
【０００６】
これまでに、Ｋｅａｐ１タンパク質を構成する一部のアミノ酸配列からなるＫｅａｐ１部分タンパク質の単体やＫｅａｐ１部分タンパク質とペプチド化合物との複合体のＸ線結晶構造解析の結果が開示されている（非特許文献１１及び１２）。また、結合部位等の詳細な立体構造情報については不明であるが、Ｋｅａｐ１タンパク質に対して相互作用する化合物の報告もされている（非特許文献１３及び１４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｕｎｔｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２年、２５７巻、p.１０７８〜１０８２
【非特許文献２】Ｌｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、１９９７年、９４巻、p.７３〜７８
【非特許文献３】石黒、「科学」、岩波書店、１９９６年、６６巻、ｐ．５５６〜５６６、
【非特許文献４】Ａｍｅｓら、１９９３年、「ＤＮＡ ａｎｄ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ」（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ， Ｂ． ａｎｄ Ａｒｕｏｍａ， Ｏ．Ｉ．， ｅｄｓ．）、Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｔｄ．、ｐ．１〜１５
【非特許文献５】Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１年、４７７巻、ｐ．７〜２１
【非特許文献６】Ｂｏｎｎｅｆｏｎｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃａｒｅ、２００２年、５巻、ｐ．５６１〜５６８
【非特許文献７】Ｃｅｃｏｎｉら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２００３年、４２０巻、ｐ．２１７〜２２１
【非特許文献８】Ｇｈａｎｂａｒｉら、Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ、２００４年、３巻、ｐ．４１〜４４
【非特許文献９】Ｍｈａｔｒｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、２００４年、６巻、ｐ．１４７〜１５７
【非特許文献１０】Ｔｒｕｙｅｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９年、２８４巻、ｐ．１３２９１〜１３２９５
【非特許文献１１】Ｌｏら、Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、２５巻、ｐ．３６０５〜３６１７
【非特許文献１２】Ｌｉら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、２７９巻、ｐ．５４７５０〜５４７５８
【非特許文献１３】Ｂａｅｋら、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年、５巻、ｐ．１１７６〜１１８２
【非特許文献１４】Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、２００２年、９９巻、p.１１９０８〜１１９１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これまでの知見より、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に相互作用する化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質とＮｒｆ２の結合を阻害してＮｒｆ２を強制的に遊離させることができるため、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化できる医薬品の候補化合物になると考えられたが、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に相互作用する化合物についての報告は一切なく、この考えの立証に利用できる化合物はなかった。なお、非特許文献１３及び１４に記載されたＫｅａｐ１タンパク質に対して相互作用する化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に結合する化合物ではなく、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化できる医薬品にはなり得ないものであった。
【０００９】
また、ＳＢＤＤには、少なくともタンパク質の詳細な立体構造の情報が必要不可欠であり、さらにタンパク質に相互作用する低分子化合物との複合体の原子座標の情報が必要となるが、ＳＢＤＤに利用可なＫｅａｐ１と低分子化合物との複合体の詳細な立体構造の情報についての報告もなかった。
【００１０】
そこで本発明は、Ｋｅａｐ１タンパク質と複合体を形成し、Ｎｒｆ２結合部位で相互作用するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を提供し、酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬の開発に貢献することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｋｅａｐ１タンパク質の部分アミノ酸配列からなるタンパク質と複合体を形成する尿素誘導体を化学合成するとともに、新たな共結晶化法を構築することにより該複合体を結晶化することに成功し、該複合体の結晶の原子座標の解析からＫｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に相互作用するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物の特性を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸からなる群から選択される一以上のアミノ酸残基と相互作用し、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と複合体を形成するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を提供する。
【００１３】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に相互作用し、Ｋｅａｐ１タンパク質とＮｒｆ２の結合を阻害してＮｒｆ２を遊離させることができるため、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化できる。
【００１４】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第１９５番目のヒスチジン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用することが好ましい。
【００１５】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位により強く結合でき、Ｋｅａｐ１タンパク質とＮｒｆ２の結合を阻害してＮｒｆ２を強制的に遊離させることができるため、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を迅速に誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構をより強く活性化できる。
【００１６】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用することがより好ましく、例えば、下記の化学式（Ｉ）で示される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩であればさらに好ましい。
【化１】
【００１７】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に特に強く結合でき、Ｋｅａｐ１タンパク質と複合体を形成できる。Ｎｒｆ２の結合を阻害してＮｒｆ２を強制的に遊離させることができるため、抗酸化ストレスタンパク質群の発現をさらに迅速に誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を特に強く活性化できる。
【００１８】
また本発明は、上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物と、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と、の複合体の結晶を提供する。
【００１９】
上記の結晶は、Ｘ線構造解析を利用することにより、タンパク質と低分子化合物の原子の位置座標も含めた結合状態に関する詳細な情報を得ることができるため、ＳＢＤＤを用いた酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬、その他有益な低分子化合物の創出に利用できる。
【００２０】
さらに本発明は、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質を１〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する標的タンパク質水溶液を調製するＡ工程と、上記標的タンパク質水溶液に含まれる上記Ｋｅａｐ１タンパク質又は上記Ｋｅａｐ１部分タンパク質のモル量に対し、モル過剰量の上記Ｋｅａｐ１タンパク質結合化合物を上記標的タンパク質水溶液に加えるＢ工程と、Ｂ工程の後に、平均分子量が１０００〜１００００のポリエチレングリコールを５〜３０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有する５〜２０ｍＭ酢酸カルシウム溶液を上記標的タンパク質水溶液に加え、上記の結晶を成長させ、塩析させるＣ工程と、を備える、上記の複合体の共結晶の製造方法を提供する。
【００２１】
上記の製造方法によれば、Ｋｅａｐ１タンパク質又はＫｅａｐ１タンパク質の部分アミノ酸配列からなるＫｅａｐ１部分タンパク質と上記の化学式（Ｉ）で示される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩との複合体の良質な結晶を製造できる。特に、Ｘ線結晶構造解析に供した際に、２．２Å以下の分解能を与えるだけの品質を有する結晶を取得できるため、ＳＢＤＤを用いた酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬、その他有益な低分子化合物の創出に利用できる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２結合部位に相互作用し、Ｋｅａｐ１タンパク質とＮｒｆ２の結合を阻害してＮｒｆ２を遊離させることができるため、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化できる。また、本発明のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、酸化ストレスを軽減できるため、酸化ストレスを原因とする疾患（癌、種々の循環器疾患、糖尿病、神経変性疾患等）の治療薬又は予防薬の候補化合物とすることができる。さらに、本発明の複合体、結晶及び共結晶化方法は、Ｋｅａｐ１タンパク質と相互作用する化合物をＳＢＤＤで探索する際に必要な立体構造情報の取得を可能にし、酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬、その他有益な低分子化合物の創出に利用できる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において、「複合体」とは、タンパク質と低分子化合物が互いに相互作用し合い、又は結合して一体となっているものを指す。
【００２４】
「相互作用」とは、タンパク質や低分子化合物などが互いに影響を及ぼすことを指し、例えば、静電作用や分子間力、水素結合などの影響が挙げられる。
【００２５】
「共結晶化法」とは、タンパク質とそのタンパク質と相互作用する化合物を混合して、その複合体の結晶を作製する方法を指す。この他に複合体の結晶を作製する方法としてはソーキング法が用いられる。ソーキング法は事前にタンパク質の結晶を作製し、その結晶を化合物の溶液に浸漬することで複合体の結晶を作製する方法である。共結晶化法の具体的な手法は、「タンパク質の結晶化」坂部知平ら監修、２００５年、京都大学学術出版会等に記載されている。共結晶の例としてはプロテインデータバンク（ＰＤＢ）で見ることができる。
【００２６】
「緩衝水溶液」とは、酸または塩基を溶液に加えた場合に溶液のｐＨの変化を最小限にする基質を含む水性基剤の溶液を指し、例えば、トリス緩衝液やリン酸緩衝液などが挙げられる。
【００２７】
「蒸気拡散法」とは、結晶化溶液を気体相のみを通して沈殿剤貯留層溶液によって平衡化させる当技術分野で周知のタンパク質結晶化法を指し、液滴の置き方によって、ハンギングドロップ法及びシッティングドロップ法がある。ハンギングドロップ法は、タンパク質溶液の液滴をカバーガラス上に配置し、カバーガラスを貯留層上で反転させ、密封する方法である。一方、シッティングドロップ法は、貯留層内部に適切な液滴台を設置し、タンパク質溶液の液滴を液滴台上に配置し、カバーガラス等で貯留層を密封する方法である。
【００２８】
「アポ型単結晶」とは、化合物が結合せずに形成されたタンパク質の結晶を意味し、例えば、前述の蒸気拡散法などを用いた結晶化法で作製できる。
【００２９】
「分子置換法」とは、同じ機能を有するタンパク質構造を初期モデルとして位相角結晶構造を決定する方法であり、具体的な手法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１１５，５５−７７（１９８５），Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎ編等に記載されている。
【００３０】
「原子座標」とは、結晶形態におけるタンパク質の原子に含まれる電子によるＸ線の回折により得られる個々の回折点の回折強度を数値化し、解析することによって導かれる数学的座標であって、上記タンパク質の原子の位置を３次元座標として表したものを指す。例えば、図１に示したように、タンパク質、低分子化合物などを構成する個々の原子についての座標を表す。
【００３１】
「ファーマコフォア」とは、ある薬理活性を示すために必須の構造的特徴を意味し、例えば、相互作用に必要な複数の官能基群とそれらの空間的な位置関係を表している。
【００３２】
「特性球」とは、疎水性、水素結合供与体、水素結合受容体、などの種々の物理化学的性質を保持した空間的領域を意味し、例えば、脂溶性官能基やカルボニル構造、アミノ基などが挙げられる。
【００３３】
本発明のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸からなる群から選択される一以上のアミノ酸残基と相互作用し、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と複合体を形成することを特徴としている。
【００３４】
ここで、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列とは、ヒトのＫｅａｐ１タンパク質の一部を構成する領域のアミノ酸配列であり、転写因子であるＮｒｆ２がＫｅａｐ１タンパク質に結合する領域（Ｎｒｆ２結合領域）のアミノ酸配列を包含する。なお、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ヒトのＫｅａｐ１タンパク質の全長のアミノ酸配列を示している。
【００３５】
上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と複合体を形成することにより、Ｋｅａｐ１タンパク質に結合しているＮｒｆ２を遊離させ、Ｎｒｆ２の核内移行を導き、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導する活性を発揮し、最終的に酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化することとなる。
【００３６】
また、上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第１９５番目のヒスチジン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用することが好ましく、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用することがより好ましく、例えば、下記の化学式（Ｉ）で示される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩であればさらに好ましい。
【化２】
【００３７】
上記の尿素誘導体（２−（３−（（３−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ウレイド）メチル）フェノキシ）酢酸）又はその薬理学的に許容される塩は、水和物又は溶媒和物であってもよく、結晶多形を形成してもよく、例えば、以下に記載する製造方法に従って製造することができる。
【００３８】
以下に記載する製造方法において、原料化合物はその塩を用いてもよい。原料化合物の塩としては、例えば、酸付加塩として塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、グルタル酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、フタル酸塩などの有機カルボン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩などの有機スルホン酸塩などが挙げられる。また、塩基との塩であってもよく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩、さらにはトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン塩などの有機塩基塩などが挙げられる。以下の製造方法により得られた上記の尿素誘導体は、公知の手段、例えば、溶媒抽出、再結晶及び／又はクロマトグラフィーによって単離精製でき、公知の方法又はそれに準じる方法によって目的とする塩に変換でき、上記の尿素誘導体が塩の状態で得られた場合には、公知の方法又はそれに準ずる方法によって別途目的とする他の塩に変換できる。
【００３９】
（製造方法１） 上記の尿素誘導体の製造方法：
上記の尿素誘導体は、以下の通り、塩基の存在下又は非存在下で、１，３，４−オキサジアゾリルアミン（ＩＩ）とベンジルアミン（ＩＩＩ）を縮合させることにより製造できる。
【化３】
［式中、Ｌは、脱離基であり、例えば、アルコキシ基又はアリールオキシ基が挙げられる。］
【００４０】
ベンジルアミン（ＩＩＩ）の使用量としては、１，３，４−オキサジアゾリルアミン（ＩＩ）１モルに対して０．４〜２モルが好ましく、０．８〜１．５モルがより好ましい。
【００４１】
塩基の使用量は、１，３，４−オキサジアゾリルアミン（ＩＩ）１モルに対して１〜３．０モルが好ましく、１〜２．０モルがより好ましい。
【００４２】
塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム若しくは炭酸セシウムなどの金属炭酸塩類、水酸化ナトリウム若しくは水酸化カリウムなどの無機塩基類、ピリジン若しくはルチジンなどの芳香族アミン類、トリエチルアミン、トリイソプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキシルジメチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピロリジン若しくはＮ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンなどの第３級アミン類、水素化ナトリウム若しくは水素化カリウムなどのアルカリ金属水素化物類、ナトリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド若しくはリチウムヘキサメチルジシラジドなどの金属アミド類又はナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド若しくはカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドなどの金属アルコキシド類が挙げられる。
【００４３】
本反応は一般に溶媒中で行われ、反応を阻害しない溶媒が適宜選択される。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、ピリジンなどの芳香族アミン類、ジクロロメタン若しくは１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、ヘプタン若しくはヘキサンなどの脂肪族炭化水素類、トルエン、クロロベンゼン若しくはキシレンなどの芳香族炭化水素類、テトラヒドロフラン若しくは１，４−ジオキサンなどのエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド若しくはＮ−メチルピロリドンなどのアミド類又はアセトニトリル若しくはプロピオニトリルなどの脂肪族ニトリル類が挙げられるが、ピリジン、トルエン又はプロピオニトリルが好ましい。ピリジンなどの芳香族アミン類を溶媒として選択した場合は、塩基非存在下にて反応を行うことができる。
【００４４】
反応温度としては、５０〜２００℃が好ましく、６０〜１００℃がより好ましい。また、反応時間としては、３時間〜７２時間が好ましく、６時間〜２４時間がより好ましい。
【００４５】
１，３，４−オキサジアゾリルアミン（ＩＩ）は、自体公知の方法又はこれらに準じた方法に従って製造することができる。例えば、市販されている２−アミノ−５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾールより、公知の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、４８巻、５４６５〜５４６８）又はこれに準ずる方法に従い製造することができる。
【００４６】
（製造方法２） ベンジルアミン（ＩＩＩ）の製造方法：
ベンジルアミン（ＩＩＩ）は、以下の通り、３−ヒドロキシベンゾニトリル（ＩＶ）のアルキル化工程である工程１、加水分解工程である工程２及び還元工程である工程３塩を経る方法で製造できる。
【化４】
【００４７】
（工程１）
ベンゾニトリル（Ｖ）は、例えば、塩基の存在下又は非存在下、３−ヒドロキシベンゾニトリル（ＩＶ）にブロモ酢酸エチルを作用させるアルキル化反応により、製造することができる。ブロモ酢酸エチルの使用量は、３−ヒドロキシベンゾニトリル（ＩＶ）１モルに対して０．８〜５．０モルが好ましく、１．２〜３．０モルがより好ましい。
【００４８】
塩基の使用量は、３−ヒドロキシベンゾニトリル（ＩＶ）１モルに対して０．８〜５．０モルが好ましく、１．２〜３．０モルがより好ましい。
【００４９】
塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム若しくは炭酸セシウムなどの金属炭酸塩類、水酸化ナトリウム若しくは水酸化カリウムなどの無機塩基類、水素化ナトリウム若しくは水素化カリウムなどのアルカリ金属水素化物類又はカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドなどの金属アルコキシド類が挙げられる。
本反応は一般に溶媒中で行われ、反応を阻害しない溶媒が適宜選択される。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トルエン、クロロベンゼン若しくはキシレンなどの芳香族炭化水素類、テトラヒドロフラン若しくは１，４−ジオキサンなどのエーテル類、アセトンなどのケトン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド若しくはＮ−メチルピロリドンなどのアミド類又はアセトニトリル若しくはプロピオニトリルなどの脂肪族ニトリル類が挙げられるが、アセトン又はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。
【００５０】
反応温度としては、２０〜５０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。また、反応時間としては、１５分〜２４時間が好ましく、３０分〜１２時間がより好ましい。
【００５１】
（工程２）
カルボン酸（ＶＩ）は、例えば塩基の存在下、エステル（Ｖ）を公知の方法で加水分解することにより、製造できる。
【００５２】
加水分解反応には、例えば、塩基として、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム若しくは水酸化カリウムなどの無機塩基類が挙げられる。本反応は一般に溶媒中で行われ、反応を阻害しない溶媒が適宜選択される。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類、テトラヒドロフラン若しくは１，４−ジオキサンなどのエーテル類、又はそれらエーテル類と水との混合溶媒が挙げられるが、テトラヒドロフランと水との混合溶媒が好ましい。
【００５３】
反応温度としては、２０〜５０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。また、反応時間としては、１５分〜２４時間が好ましく、３０分〜１２時間がより好ましい。
【００５４】
（工程３）
ベンジルアミン（ＩＩＩ）は、例えば、ベンゾニトリル（ＶＩ）を公知の方法で還元することにより、製造することができる。
【００５５】
還元反応には、例えば、還元剤として、例えば、ジイソブチルアルミニウムヒドリド、リチウムアルミニウムヒドリド、ナトリウムビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムヒドリド又はボラン錯体などの金属水素化物を用いる方法と、水素雰囲気下で遷移金属触媒を用いる方法が挙げられる。該遷移金属触媒としては、例えば、パラジウム−炭素、水酸化パラジウム又は４価酸化白金が挙げられる。触媒の使用量は、ベンゾニトリル（ＶＩ）１モルに対して０．０１〜１．０モルが好ましい。反応温度としては、２０〜５０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。また、反応時間としては、１５分〜２４時間が好ましく、３０分〜１２時間がより好ましい。
【００５６】
また本発明の結晶は、上記のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物と、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質との複合体の共結晶であることを特徴としている。
【００５７】
上記の複合体の結晶は、タンパク質水溶液の調整工程、複合体を形成する工程、共結晶化工程で製造できる。特に好ましい製造方法としては、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質を１〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する標的タンパク質水溶液を調製するＡ工程と、上記標的タンパク質水溶液に含まれる上記Ｋｅａｐ１タンパク質又は上記Ｋｅａｐ１部分タンパク質のモル量に対し、モル過剰量の上記Ｋｅａｐ１タンパク質結合化合物を上記標的タンパク質水溶液に加えるＢ工程と、Ｂ工程の後に、平均分子量が１０００〜１００００のポリエチレングリコールを５〜３０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有する５〜２０ｍＭ酢酸カルシウム溶液を上記標的タンパク質水溶液に加え、上記の共結晶を成長させ、塩析させるＣ工程と、を備える製造方法が挙げられる。
【００５８】
具体的には、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質を緩衝水溶液に溶解する。緩衝水溶液は、例えば、トリス緩衝液やリン酸緩衝液などが挙げられ、トリス緩衝液が好ましい。タンパク質の濃度は０．１〜２０ｍｇ／ｍＬが好ましく、１〜１２ｍｇ／ｍＬがより好ましい。
【００５９】
その後、上記標的タンパク質水溶液にモル過剰量のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を加えて、そのまま静置すれば複合体が形成される。モル過剰量としては、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質１モルに対して１〜３０モルが好ましく、５〜２０モルがより好ましい。静置する時間は１分〜３日が好ましく、２時間〜１日がより好ましい。静置する温度としては、３〜２５℃が好ましく、４℃がより好ましい。
【００６０】
共結晶化工程は蒸気拡散法が好ましく、例えば、ハンギングドロップ法及びシッティングドロップ法が利用できる。具体的には、タンパク質と化合物複合体の溶液約１０μＬ未満を、貯留層溶液と混合し、このタンパク質／沈殿剤溶液と貯留層をカバーガラス等で密封し、結晶が成長するまで静置すればよい。
【００６１】
貯留層溶液としては、例えば、当該分野で公知の沈殿剤及び緩衝水溶液が挙げられ、沈殿剤と緩衝水溶液を組み合わせて使用しても良い。沈殿剤としては、硫酸アンモニウムやポリエチレングリコールが好ましく、ポリエチレングリコールがより好ましい。ポリエチレングリコールの平均分子量としては、２００〜２００００が好ましく、２０００〜８０００がより好ましい。ポリエチレングリコールの濃度は１〜４０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）がより好ましい。
【００６２】
緩衝水溶液は１〜２０ｍＭの市販の緩衝水溶液が好ましく、５〜２０ｍＭ酢酸カルシウム溶液がより好ましい。また、結晶を成長させる温度としては、３〜２５℃が好ましく、４℃がより好ましい。結晶を成長させる時間は１日〜１年が好ましく、３日〜３週間がより好ましい。
【００６３】
上記の結晶は、Ｘ線結晶構造解析に供した際に少なくとも１０Å以下の分解能、好ましくは４．０Å以下の分解能、より好ましくは３．４Å以下の分解能、特に好ましくは２．２Å以下の分解能を与えるだけの品質を有していることが好ましい。
【００６４】
こうして得られる上記の結晶及びその解析により得られる原子座標は、幅広い用途を有する。例えば、上記の結晶及び原子座標は、新しい治療物質を開発するためのアプローチとしてＫｅａｐ１タンパク質と結合する化合物を同定するために特に有用である。
【００６５】
具体的には、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と低分子化合物との複合体結晶の構造情報を解析し、疎水的な相互作用・イオン結合・水素結合を形成している部位やアミノ酸残基、さらには、複合体構造のＫｅａｐ１タンパク質の分子形状を解析することで、化合物の分子設計やスクリーニングに必要なファーマコフォアを提示（設計）することが可能となる。さらに、既に記述したアミノ酸残基の立体的配置や水分子の三次元的な配置を規定することで、コンピューターによるＫｅａｐ１タンパク質に結合する化合物の分子設計やスクリーニングができる。
【００６６】
以下に、Ｋｅａｐ１タンパク質に結合する化合物の分子設計方法、ファーマコフォアの設計方法及びファーマコフォアを用いたスクリーニング方法について記載する。
【００６７】
（Ｋｅａｐ１タンパク質に結合する化合物の分子設計方法）
本発明のＫｅａｐ１タンパク質の原子座標を用いることでＫｅａｐ１タンパク質に結合する化合物の分子設計（活性上昇、選択性付与など）が可能となる。また、得られた化合物の誘導最適化に活用することも可能となる。例えば、スクリーニングによって得られたＫｅａｐ１タンパク質に結合する化合物を、コンピューターによってドッキングモデル構造を予測することも可能である。このモデル構造は、化合物と近傍のアミノ酸残基との相互作用を増強させるような誘導方向性を見出す上で、非常に有用である。さらに、活性には影響を与えずに、代謝、毒性などの改善を進める上で適当な方向性を提示することもできる。加えて、薬理試験や代謝試験における種差の考察や、副作用軽減を目的として標的タンパク質に対する選択性を向上させるための誘導合成を支援する上で最も有用な情報を提供できる。
【００６８】
（ファーマコフォアの設計方法）
ファーマコフォアの設計は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と低分子化合物との複合体結晶の原子座標により表される３次元構造を解析し、ファーマコフォアとして使用し得る部分構造（アミノ酸残基、構造水等）を特定する工程、及び、該部分構造を特性球に変換し、ファーマコフォアを発生させる工程、により実施できる。
【００６９】
ファーマコフォアとして使用し得る部分構造を特定する工程は、目視及び／又は適切なコンピュータープログラムを使用しても良い。また、部分構造を特性球に変換し、ファーマコフォアを発生させる工程は、コンピューターシステムを用いることにより実施できる。例えば、市販のソフトウェアと該ソフトウェアを作動可能なコンピューターシステムが利用でき、ソフトウェアとしてはＭＯＥ（ｃｃｇ社）等が挙げられる。
【００７０】
（ファーマコフォアを用いたスクリーニング方法）
設計したファーマコフォアと解析用ソフトウェアを用いて、Ｋｅａｐ１タンパク質に結合する化合物のスクリーニングを行うことができる。ソフトウェアはリガンドからの化学的機能の抽出及び抽出した化学的機能と類似した空間配置を取り得る化合物の検索が可能なソフトウェアであれば何を用いても良く、例えば、解析用ソフトウェアであるＭＯＥ（ｃｃｇ社）やＳｙｂｙｌ（トライポス社）のモジュールであるＵｎｉｔｙ等を用いてもよい。この際、化合物のクラスタリングが必要であれば、Ｄａｙｌｉｇｈｔ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｓｓｉｏｎ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）等のプログラムを使用することが可能である。以下、ＭＯＥ（ｃｃｇ社）を使用した例を示す。
【００７１】
設計したファーマコフォアを用いて、あらかじめ準備したコンピュータースクリーニング用の化合物構造データベースを対象としてスクリーニングを実施する。ファーマコフォアの情報とある化合物の立体構造の空間配置とを比較し、該化合物がファーマコフォアの性質を満足させるものであるかどうかを計算により決定する。コンピュータースクリーニングの利点として、検索対象が理論上考え得る全ての化合物の部分集合であることが挙げられる。通常は、自社で保有する化合物のデータベース、市販化合物データベース（例えば、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＭＤＬ社）又はバーチャルコンビナトリアル合成手法等を用いて発生させた仮想化合物のデータベース、天然物由来の化合物データベース、医薬品データベース等をコンピューター検索用に変換して用いることができる。
【００７２】
また、検索式でヒットした化合物群をデータベース化し、引き続きタンパク質構造を市販のドッキングソフトウェアに適用することによってヒット率を増すこともできる。また、Ｋｅａｐ１タンパク質に結合する化合物は、ＭＶＤ（Ｍｏｌｒｅｇｒｏ社）等を用いてコンピュータースクリーニングする際に有効なフィルターとして使用することができるし、各ファーマコフォアに対して適合するフラグメントを配置した後に各フラグメントを適当な官能基で結合させて化合物を構築すること（Ｄｅ Ｎｏｖｏ設計的使用）も可能である。上記コンピュータースクリーニングによりヒットした化合物群は、一定の確率で、Ｋｅａｐ１タンパク質に結合する化合物となり得る。
【００７３】
本明細書に記載の原子座標は、さらに全長のＫｅａｐ１タンパク質又は変異Ｋｅａｐ１タンパク質の結晶構造と、化合物が結合したようなＫｅａｐ１タンパク質の複合体の結晶の構造とを決定するための位相調整モデルとして用いることができる。原子座標と、そこから得られる三次元構造とを用いてＮＭＲによって得られるような、本来のＫｅａｐ１タンパク質又は変異Ｋｅａｐ１タンパク質の溶液に基づく構造解析にも役立てることができる。このように、本発明の結晶及び原子座標は、Ｋｅａｐ１タンパク質の構造及び機能を解明するための手段を提供する。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例及び参考例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、以下の記載において、ＮＭＲデータ中の溶媒名は、測定に使用した溶媒を示している。
【００７５】
また、４００ ＭＨｚ ＮＭＲスペクトルは、ＪＮＭ−ＡＬ４００型核磁気共鳴装置（日本電子）を用いて測定した。ケミカルシフトは、テトラメチルシランを基準として、δ（単位：ｐｐｍ）で表し、シグナルはそれぞれｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｑｕｉｎｔ（五重線）、ｓｅｐｔ（七重線）、ｍ（多重線）、ｂｒ（幅広）、ｄｄ（二重二重線）、ｄｔ（二重三重線）、ｄｄｄ（二重二重二重線）、ｄｑ（二重四重線）、ｔｄ（三重二重線）、ｔｔ（三重三重線）で表した。ＩＲスペクトルはＦＴ／ＩＲ−４１０（日本分光）を、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ２Ｋ（Ｗａｔｅｒｓ）又は１２００ＬＣ／ＭＳＤ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて測定した。溶媒は全て市販のものを用いた。フラッシュクロマトグラフィーはＹＦＬＣ Ｗ−ｐｒｅｐ２ＸＹ（山善）を用いた。
【００７６】
上記の尿素誘導体（実施例１の化合物）の原料及び中間体については、以下の参考例に記載する方法で合成した。なお、参考例化合物の合成に使用される化合物で、合成法の記載のないものについては、市販の化合物を使用した。
【００７７】
（参考例１） ２−（３−シアノフェノキシ）酢酸エチルの合成：
【化５】
３−ヒドロキシベンゾニトリル（１．４２９ｇ、１２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．１５６ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）のアセトン（１２０ｍＬ）溶液に、ブロモ酢酸エチル（２．８１ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）を加えて室温にて攪拌した。１１時間撹拌を継続した後、セライトにより濾過し、濾液を減圧下濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、表題化合物（２．４６ｇ、１１．９ｍｍｏｌ、９９％）を無色油状物として得た。
1H‐NMR (400 MHz, CDCL3) δ: 1.29 (3H, t, J=7.8Hz), 4.13 (2H, q, J=7.8Hz), 4.96 (2H, s), 7.27‐7.48 (3H, m),7.61(1H, s)
ESI‐MS: m/z= 206 (M+H)+
【００７８】
（参考例２） ２−（３−シアノフェノキシ）酢酸の合成：
【化６】
２−（３−シアノフェノキシ）酢酸エチル（６１６ｍｇ、３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１２ｍＬ）及び水（６ｍＬ）溶液に、４ｍＭ水酸化リチウム水溶液（３．７５ｍＬ）を加え、１時間撹拌した。その後、１Ｎ塩酸水溶液を反応系に滴下し、液性をｐＨ＜１まで酸性とした後、塩化メチレン（２０ｍＬ）にて抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、濾液を減圧濃縮し、表題化合物を白色固体（５３１ｍｇ、９９％）として得た。
1H‐NMR (400 MHz, CDCL3) δ: 4.08 (2H, s), 7.27‐7.48 (3H, m),7.64(1H, s)
ESI‐MS: m/z= 177 (M+)
【００７９】
（参考例３） ２−（３−（アミノメチル）フェノキシ）酢酸の合成：
【化７】
２−（３−シアノフェノキシ）酢酸（１００ｍｇ、０．５６４ｍｍｏｌ）のメタノール（１．２ｍＬ）溶液に、酢酸（１．２ｍＬ）を添加し、パラジウム−炭素（１０ｍｇ）を加え、反応系を水素雰囲気下とした。４時間撹拌を継続した後、反応系をアルゴン雰囲気下へとした。セライトにより濾過し、濾液を減圧下濃縮し、表題化合物（１３８ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ、１３１％）を白色固体として得た。
1H‐NMR (400 MHz, CDCL3) δ: 4.36 (2H, s), 4.66 (2H, s), 6.79-7.01 (3H, m), 7.15 (1H, s),
ESI‐MS: m/z= 182 (M+H)+
【００８０】
（参考例４） ２，２，２−トリクロロエチル−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）カルバメートの合成：
【化８】
２−アミノ−５−（２−フリル）−１，３，４−オキサジアゾール（３．０２ｇ、２０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８０ｍＬ）溶液に、１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）を添加し、ジイソプロピルエチルアミン（３．８８ｇ、３０ｍｍｏｌ）及びクロロ蟻酸２、２，２−トリクロロエチルエステル（４．４５ｇ、２１ｍｍｏｌ）を室温にて加え、室温で２０時間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、表題化合物（５．１１ｇ、７８％）を白色固体として得た。
1H‐NMR (400 MHz, CDCL3) δ: 4.84 (2H, s), 6.68 (1H, dd, J=1.5, 7.5Hz), 7.08 (1H, dd, J=1.5, 7.5Hz),7.86 (1H,dd, J=1.5, 7.5Hz) 9.15(1H,bs)
ESI‐MS: m/z= 325,327 (M+H)+
【００８１】
（実施例１） ２−（３−（（３−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ウレイド）メチル）フェノキシ）酢酸（以下、実施例１の化合物）の合成：
【化９】
２，２，２−トリクロロエチル−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）カルバメート（０．０９８ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、及び２−（３−（アミノメチル）フェノキシ）酢酸（０．０７２ｇ、０．３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．５ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．０８１ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、６０℃で１２時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、反応液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、さらにフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール）で精製し、２−（３−（（３−（５−（フラン−２−イル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ウレイド）メチル）フェノキシ）酢酸、すなわち、実施例１の化合物（０．０９０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、８４％）を白色固体として得た。
1H‐NMR (400 MHz, DMSO‐d6) δ: 4.38 (2H, d, J=5.6 Hz), 4.65 (2H, s), 6.78 (2H, tt, J=5.12, 2.56 Hz), 6.91 (2H, tt, J=5.6, 8.0 Hz), 7.18 (1H, td, J=2.2, 1.22 Hz), 7.25 (1H, t, J=7.93 Hz), 8.01 (2H, m, J=1.6 Hz), 11.6 (1H, brs), 13.0 (1H, brs)
ESI‐MS: m/z= 359 (M+H)+
【００８２】
（実施例２） Ｋｅａｐ１タンパク質の部分アミノ酸配列からなるタンパク質（以下、Ｋｅａｐ１部分タンパク質）の発現と精製：
１）Ｋｅａｐ１タンパク質部分タンパク質の発現：
Ｈｕｈ−７細胞のＴｏｔａｌ ＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを鋳型にして、ヒトＫｅａｐ１の塩基配列（ＲｅｆＳｅｑ番号：ＮＭ＿０１２２８９）に基づき設計した２つのプライマー、フォワード側：５’−ｃａｔａｔｇｇｃｇｃｃｃａａｇｇｔｇｇｇｃｃｇｃｃｔｇ−３’（配列番号３）及びリバース側：５’−ｇｇａｔｃｃｔｃａｇｇｔｇａｃａｇｃｃａｃｇｃｃｃａｃｃｃｃａｃ−３’（配列番号４）を用いて、ＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅し、そのＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＡ２（東洋紡社）にサブクローニングした。ポジティブクローンの塩基配列の解析を行い、目的とするＫｅａｐ１の部分塩基配列並びに、その５’末端に制限酵素ＮｄｅＩ及び３’末端にＢａｍＨＩ認識配列が付加された配列を有するクローンを得た。
【００８３】
このクローンを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断して得られた、約８８０ｂｐのＫｅａｐ１の部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ開裂部位に挿入し、発現ベクターＫｅａｐ１／ｐＥＴ−１５ｂを得た。このクローンについて塩基配列を調べた結果、目的の配列が挿入されたクローンであることを確認した。なお、該クローンに含まれる約８８０ｂｐのＫｅａｐ１の部分塩基配列は、Ｋｅａｐ１タンパク質のアミノ酸残基第３２２番から第６０９番までのポリペプチド（配列番号１）をコードする塩基配列である。
【００８４】
このように構築した発現ベクターＫｅａｐ１／ｐＥＴ−１５ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ形質転換した。カルベニシリン（Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ；ナカライテスク社）選択培地で取得した、カルベニシリン耐性のシングルコロニーを、１０ｍＬのカルベニシリン含有ＬＢ（ＧＩＢＣＯ）培地で３７℃にて一晩培養した。翌日、この培養液５ｍＬを２７０ｍＬのカルベニシリン含有Ｐｌｕｓｇｒｏｗ（ナカライテスク社）培地に加え、３７℃にてＯＤ６００が０．８以上になるまで培養を行った。２０℃にて３０分間静置した後、終濃度０．４ｍｍｏｌ／ＬとなるようＩＰＴＧ（ナカライテスク社）を培地に添加し、２０℃にてタンパク質誘導を一晩行った。培養液を５，０００×ｇ、１０分間遠心して得られた大腸菌を、タンパク質精製を実施するまで−８０℃にて保存した。
【００８５】
２）Ｋｅａｐ１部分タンパク質の精製：
１）で得た大腸菌にＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＨＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて室温にて２０分間反応させることで溶菌した。溶菌した液を２０，０００×ｇ、２０分間遠心することで可溶画分と不溶画分に分画した。不溶画分は、８ｍｏｌ／Ｌ Ｕｒｅａ（ナカライテスク社）にて再溶解した。可溶画分を回収し、終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイミダゾール（ナカライテスク社）を添加した後、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、これを精製用サンプルとした。結合緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４（Ｗａｋｏ社）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ社））で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ５ｍＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に、ペリスタポンプを用いて精製用サンプルを添加した。精製用サンプル添加後、カラムをＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に接続し、２％の溶出緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ ｍｏｌ／Ｌ イミダゾール）でカラムを洗浄した。カラム洗浄後、３０％の溶出緩衝液を添加し、Ｋｅａｐ１部分タンパク質を溶出した。
【００８６】
Ｋｅａｐ１部分タンパク質を含む溶出画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＷＣＯ＝１０，０００）を用いて約５ｍＬまで濃縮し、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターでろ過した。次に、このろ液について、ゲルろ過緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）（ナカライテスク社）、１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ（ナカライテスク社））で平衡化したＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １２０ｍＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ｓを用いてゲルろ過を行った。
【００８７】
ゲルろ過により得られたＫｅａｐ１部分タンパク質を含む溶出画分を回収し、それをイオン交換緩衝液Ａ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ）で２倍に希釈した。この希釈した溶出画分を、ペリスタポンプを用いてイオン交換緩衝液Ａで平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ ５ｍＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に添加した。次に、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ｓにカラムを接続後、１０％のイオン交換緩衝液Ｂ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）でカラムを洗浄した。引き続き１００ｍＬで１０〜４０％のイオン交換緩衝液ＢになるようなリニアグラジエントでＫｅａｐ１部分タンパク質を溶出した。なお、ここで得られたＫｅａｐ１部分タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示されており、このアミノ酸配列は、配列番号２に示されるＫｅａｐ１タンパク質のＮ末端の第一のメチオニンを１番とした時に、アミノ酸残基第３２２番から第６０９番までに相当する。
【００８８】
３）Ｋｅａｐ１部分タンパク質の確認：
２）で得られたＫｅａｐ１部分タンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製度を確認した。ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて非還元下にて２００Ｖ、３５分間泳動した。なお、分子量マーカーにはＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。泳動終了後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてゲルをＣＢＢ染色し、約３５ｋＤａに目的のバンドを確認した。
【００８９】
（実施例３） 実施例１の化合物とＫｅａｐ１部分タンパク質の複合体の共結晶化：
共結晶化は、実施例２で得られたＫｅａｐ１部分タンパク質（配列番号１）を１２．０８ ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、２０ｍＭ ＤＴＴ及び実施例１の化合物（Ｋｅａｐ１部分タンパク質の１５倍濃度）を含有する溶液中で実施し、得られた結晶は、ハンギングドロップ法を使用して蒸気拡散法によって成長させた。
【００９０】
具体的には、下記の通りである。２４ウェル培養プレートの貯留層容器を、平均分子量約３３５０ダルトンの１０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール、０．１Ｍ酢酸カルシウムを含有する０．５ｍＬの沈殿剤溶液で満たした。実施例２で得られたＫｅａｐ１部分タンパク質（配列番号１）を１２．０８ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、２０ｍＭ ＤＴＴ及び実施例１の化合物（Ｋｅａｐ１部分タンパク質の１５倍濃度）を含有する溶液１μＬと沈殿剤１μＬとをガラス板上で混合して、ドロップを作製し、ガラス板を裏返して貯留層容器のふたになるようにドロップを下向きにして、２４ウェル培養プレートに設置し、隙間ができないようにグリースで密封させて４℃で保管して結晶化を開始した。結晶は、３日〜３週間で現れた。得られた結晶を、３０％（Ｗ／Ｖ）エチレングリコールを添加した母液に浸した後、液体窒素中で瞬間凍結した。
【００９１】
（実施例４） Ｘ線回折データ収集：
Ｘ線回折データはＳＰｒｉｎｇ−８（理化学研究所の播磨研究所）のＢＬ２６Ｂ２（理化学研究所の構造生物学ビームライン）で、波長１．０Åにて、ＭａｒＭｏｓａｉｃ２２５（Ｒａｙｏｎｉｘ社）のＣＣＤ検出器により収集した。Ｘ線回折データは、Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉらが発表したＨＫＬ２０００プログラム（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９７年、２７６巻、ｐ．３０７−３２６）によって処理し、分解能が１．８ÅまでのＸ線回折データを記録した。結晶の単位格子寸法は、ａ＝５１Å、ｂ＝６６Å、ｃ＝７７Å、α ＝ β ＝ γ ＝ ９０°を有し、空間群はＰ２（１）２（１）２（１）であると決定した。
【００９２】
（実施例５） 実施例１の化合物とＫｅａｐ１部分タンパク質の複合体の結晶の構造決定及び精密化：
実施例１の化合物とＫｅａｐ１部分タンパク質の複合体の構造は、実施例４で収集したＸ線回折データをもとに、Ｋｅａｐ１アポ型単結晶の立体構造（ＰＤＢコード：１Ｕ６Ｄ）をサーチモデルとして、プログラムＭｏｌｒｅｐ（ＣＣＰ４ｉ）を利用した分子置換法により決定した。立体構造の構築はプログラムＲｅｆｍａｃ（ＣＣＰ４ｉ）で行い、構造精密化は、Ｂｒｕｎｇｅｒらが発表したプログラムＣＮＳ（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ.、１９９８年、Ｄ５４巻、ｐ．９０５−９２１）を使った。
【００９３】
表１−１〜１−４６は、実施例１の化合物とＫｅａｐ１部分タンパク質の複合体の結晶の原子座標を示しており、当業者において一般的に用いられているプロテインデータバンク（ＰＤＢ）の表記方法に基づいて表記した。また、表１−１〜表１−４６は、データ量が多いため、１つの表を４６個の表に分断したものである。
【００９４】
なお、表には左から順に以下の内容が記載されている：
Ａｔｏｍ ｎｕｍｂｅｒ：座標表内の原子の識別番号
Ａｔｏｍ Ｎａｍｅ：特定の座標に存在する原子についての識別子
Ｒｅｓｉｄｕｅ：鎖中のアミノ酸や結晶中に存在する他の成分（例えば、化合物についてはＤＲＧ、水についてはＨＯＨで表す。）
Ｃｈａｉｎ ＩＤ：結晶中のタンパク質の一つのモノマーを鎖「Ｘ」で示す。タンパク質ダイマーの場合は、２つのＣｈａｉｎ ＩＤを有する。
Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｎｕｍｂｅｒ：鎖中のアミノ酸残基数
Ｘ、Ｙ、Ｚ：Ｘ、Ｙ及びＺ座標値
Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ：原子が結晶中に観察される時間の割合を表す。例えば、Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ＝１は、原子が常に存在することを意味し、Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ＝０．５は、原子がその時間の５０％はその位置に存在していることを示す。
Ｂ−ｆａｃｔｏｒ：原子の熱運動の測定値
Ｃｈａｉｎ ＩＤ：上記Ｃｈａｉｎ ＩＤと同様
Ｅｌｅｍｅｎｔ：元素の識別子
【００９５】
【表１−１】
【００９６】
【表１−２】
【００９７】
【表１−３】
【００９８】
【表１−４】
【００９９】
【表１−５】
【０１００】
【表１−６】
【０１０１】
【表１−７】
【０１０２】
【表１−８】
【０１０３】
【表１−９】
【０１０４】
【表１−１０】
【０１０５】
【表１−１１】
【０１０６】
【表１−１２】
【０１０７】
【表１−１３】
【０１０８】
【表１−１４】
【０１０９】
【表１−１５】
【０１１０】
【表１−１６】
【０１１１】
【表１−１７】
【０１１２】
【表１−１８】
【０１１３】
【表１−１９】
【０１１４】
【表１−２０】
【０１１５】
【表１−２１】
【０１１６】
【表１−２２】
【０１１７】
【表１−２３】
【０１１８】
【表１−２４】
【０１１９】
【表１−２５】
【０１２０】
【表１−２６】
【０１２１】
【表１−２７】
【０１２２】
【表１−２８】
【０１２３】
【表１−２９】
【０１２４】
【表１−３０】
【０１２５】
【表１−３１】
【０１２６】
【表１−３２】
【０１２７】
【表１−３３】
【０１２８】
【表１−３４】
【０１２９】
【表１−３５】
【０１３０】
【表１−３６】
【０１３１】
【表１−３７】
【０１３２】
【表１−３８】
【０１３３】
【表１−３９】
【０１３４】
【表１−４０】
【０１３５】
【表１−４１】
【０１３６】
【表１−４２】
【０１３７】
【表１−４３】
【０１３８】
【表１−４４】
【０１３９】
【表１−４５】
【０１４０】
【表１−４６】
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物は、抗酸化ストレスタンパク質群の発現を誘導し、酸化ストレスに対する生体防御機構を活性化できるため、酸化ストレスを原因とする疾患（癌、種々の循環器疾患、糖尿病、神経変性疾患等）の治療薬又は予防薬の候補化合物とすることができる。さらに、本発明の複合体、共結晶及び共結晶化方法は、Ｋｅａｐ１タンパク質と相互作用する化合物をＳＢＤＤで探索する際に必要な立体構造情報の取得を可能にし、酸化ストレスを原因とする疾患の治療薬又は予防薬、その他有益な低分子化合物の創出に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４２】
配列番号１：Ｎｒｆ２結合領域を含むＫｅａｐ１部分タンパク質
配列番号２：Ｋｅａｐ１タンパク質
配列番号３及び４：ＰＣＲプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸からなる群から選択される一以上のアミノ酸残基と相互作用し、
Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と複合体を形成するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第１９５番目のヒスチジン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用する、請求項１記載のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物。
【請求項３】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用する、請求項１記載のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物。
【請求項４】
下記の化学式（Ｉ）で示される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩である、請求項３記載のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物。
【化１】
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物と、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と、の複合体の結晶。
【請求項６】
Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質を１〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する標的タンパク質水溶液を調製するＡ工程と、
前記標的タンパク質水溶液に含まれる前記Ｋｅａｐ１タンパク質又は前記Ｋｅａｐ１部分タンパク質のモル量に対し、モル過剰量の請求項１〜４のいずれか一項記載のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を前記標的タンパク質水溶液に加えるＢ工程と、
Ｂ工程の後に、平均分子量が１０００〜１００００のポリエチレングリコールを５〜３０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有する５〜２０ｍＭ酢酸カルシウム溶液を前記標的タンパク質水溶液に加え、請求項５記載の結晶を成長させ、塩析させるＣ工程と、
を備える、請求項５記載の複合体の共結晶の製造方法。
【請求項１】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸からなる群から選択される一以上のアミノ酸残基と相互作用し、
Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と複合体を形成するＫｅａｐ１タンパク質結合化合物。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第１９５番目のヒスチジン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用する、請求項１記載のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物。
【請求項３】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を規準とした場合における第１３番目のチロシン、第１５番目のアルギニン、第４２番目のセリン、第５９番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第１９５番目のヒスチジン、第１９７番目のシステイン、第１９９番目のチロシン、第２１５番目のアルギニン、第２５１番目のチロシン、第２５６番目のフェニルアラニン、第２６５番目のプロリン及び第２６６番目のアスパラギン酸と相互作用する、請求項１記載のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物。
【請求項４】
下記の化学式（Ｉ）で示される尿素誘導体又はその薬理学的に許容される塩である、請求項３記載のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物。
【化１】
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物と、Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質と、の複合体の結晶。
【請求項６】
Ｋｅａｐ１タンパク質又は配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含むＫｅａｐ１部分タンパク質を１〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する標的タンパク質水溶液を調製するＡ工程と、
前記標的タンパク質水溶液に含まれる前記Ｋｅａｐ１タンパク質又は前記Ｋｅａｐ１部分タンパク質のモル量に対し、モル過剰量の請求項１〜４のいずれか一項記載のＫｅａｐ１タンパク質結合化合物を前記標的タンパク質水溶液に加えるＢ工程と、
Ｂ工程の後に、平均分子量が１０００〜１００００のポリエチレングリコールを５〜３０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有する５〜２０ｍＭ酢酸カルシウム溶液を前記標的タンパク質水溶液に加え、請求項５記載の結晶を成長させ、塩析させるＣ工程と、
を備える、請求項５記載の複合体の共結晶の製造方法。
【公開番号】特開２０１３−２８５７５（Ｐ２０１３−２８５７５Ａ）
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６７５３７（Ｐ２０１１−１６７５３７）
【出願日】平成２３年７月２９日（２０１１．７．２９）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２９日（２０１１．７．２９）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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