ＮＡＤＰＨ消費生合成経路のために最適化された微生物菌株
【課題】本発明は、ＮＡＤＰＨ消費生合成経路を有する、分子のバイオトランスフォーメーションによる生成のために最適化された微生物菌株に関する。
【解決手段】本発明の菌株はＮＡＤＰＨを消費するバイオトランスフォーメーションプロセスで利用できる。それらの菌株は、ＮＡＤＰＨを酸化する１つまたは複数の活性が制限されていることを特徴とする。
【解決手段】本発明の菌株はＮＡＤＰＨを消費するバイオトランスフォーメーションプロセスで利用できる。それらの菌株は、ＮＡＤＰＨを酸化する１つまたは複数の活性が制限されていることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）は、その還元形のＮＡＤＰＨで、デヒドロゲナーゼまたはレダクターゼ活性を持つ酵素を含む細胞内酸化還元反応に関与している。
【０００２】
本発明は、ＮＡＤＰＨ消費生合成経路を用いた、バイオトランスフォーメーションによる物質の生成のために最適化された微生物菌株に関する。本発明による菌株は、ＮＡＤＰＨ消費バイオトランスフォーメーションプロセスで使用できる。本発明によって定義された菌株は、原核生物または真核生物でありうる。好ましい実施形態において、原核生物菌株は、エシェリキア・コリの菌株である。さらなる実施形態において、真核生物菌株は、サッカロミセス、特にＳ．セレビシエの菌株である。
【０００３】
本発明は、本発明によって最適化された菌株の適切な培地での増殖による、バイオトランスフォーメーションによる物質の調製のプロセスにも関し、最適化された菌株は、そのような物質の調製に必要な遺伝要素も含む。
【背景技術】
【０００４】
バイオトランスフォーメーションプロセスが開発されて、必要な物質の大量かつ低コストでの生産を可能にすると同時に、各種の工業および農業副生成物の有益な使用が可能となっている。
【０００５】
生体内バイオトランスフォーメーションによって興味のある物質を生成するための２つの主な手法がある。
１）物質が簡単な炭素源から微生物によって生成される、発酵（たとえば、グルコースの存在下でのＣ．グルタミカムの発酵によるリジンの生成について述べる、国際公開第０１／０２５４７号）。
２）微生物による、所与の補基質の興味のある物質への生物変換（たとえばＲ−ピペリジンの誘導体の生成について述べる、国際公開第００／１２７４５号、およびタガトースの生成について述べる、国際公開第００／６８３９７号）。補基質は同化されず、炭素源とは異なり、バイオマスおよび生物変換に必要なＮＡＤＰＨを生成するためのみに使用される。
【０００６】
バイオトランスフォーメーションプロセスの改良は、温度、酸素化、培地組成、回収プロセスなどの各種の因子に関係しうる。興味のある物質の生成および／または排出を増加するために、微生物を修飾することもできる。
【０００７】
たとえば発酵手法において、たとえば遺伝子調節を修飾することによって、または関与する酵素の特徴を変更するために遺伝子を修飾することによって、または補因子の再生を最適化することによって、生合成経路を改良できる。
【０００８】
生物変換手法において、副生成物の生成を削減することと、１つまたは複数の生物変換ステップに関与する補因子の再生を最適化することとが重要視されるであろう。
【０００９】
バイオトランスフォーメーションに関与する補因子のうちで、ＮＡＤＰＨはアミノ酸（たとえばアルギニン、プロリン、イソロイシン、メチオニン、リジン）、ビタミン（たとえばパントテン酸塩、フィロキノン、トコフェロール）、芳香族化合物（たとえば国際公開第９４／０１５６４号）、ポリオール（たとえばキシリトール）、ポリアミン（たとえばスペルミジン）、ヒドロキシエステル（たとえばエチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート）および他の高付加価値物質の生成で特に重要である。
【特許文献１】国際公開第０１／０２５４７号
【特許文献２】国際公開第００／１２７４５号
【特許文献３】国際公開第００／６８３９７号
【特許文献４】国際公開第９４／０１５６４号
【特許文献５】国際公開第０１／２７３０７号
【特許文献６】欧州特許第０８８５９６２号
【非特許文献１】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９
【非特許文献２】Ｄａｔｓｅｎｋｏ Ｋ．Ａ．，Ｗａｎｎｅｒ Ｂ．Ｌ．，Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７；６６４０−６６４５，２０００
【非特許文献３】Ｂａｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，３３２９−３３３０，１９９３
【非特許文献４】Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｄｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｏｒ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｙｅａｓｔ １０，１７９３−１８０８，１９９４
【非特許文献５】Ｂｒａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８Ｃ：ａ ｕｓｅｆｕｌ ｓｅｔ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｙｅａｓｔ．１４：１１５−３２，１９９８
【非特許文献６】Ｂｏｃａｎｅｇｒａ，Ｊ．Ａ．Ｓｃｒｕｔｔｏｎ，Ｎ．Ｓ．；Ｐｅｒｈａｍ，Ｒ．Ｎ．，Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：２７３７−２７４０，１９９３
【非特許文献７】Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＪＢ，Ｄｅｗｅｅｓｅ−Ｓｃｏｔｔ Ｃ，Ｆｅｄｏｒｏｖａ ＮＤ，Ｇｅｅｒ ＬＹ，Ｈｅ Ｓ，Ｈｕｒｗｉｔｚ ＤＩ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＪＤ，Ｊａｃｏｂｓ ＡＲ， Ｌａｎｃｚｙｃｋｉ ＣＪ， Ｌｉｅｂｅｒｔ ＣＡ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｍａｄｅｊ Ｔ，Ｍａｒｃｈｌｅｒ ＧＨ，Ｍａｚｕｍｄｅｒ Ｒ，Ｎｉｋｏｌｓｋａｙａ ＡＮ，Ｐａｎｃｈｅｎｋｏ ＡＲ，Ｒａｏ ＢＳ，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ＢＡ，Ｓｉｍｏｎｙａｎ Ｖ，Ｓｏｎｇ ＪＳ，Ｔｈｉｅｓｓｅｎ ＰＡ，Ｖａｓｕｄｅｖａｎ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ ＲＡ，Ｙｉｎ ＪＪ．Ｂｒｙａｎｔ ＳＨ．ＣＤＤ：ａ ｃｕｒａｔｅｄ Ｅｎｔｒｅｚ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：３８３−３８７，２００３
【非特許文献８】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３２；１２０−１２８，１９４６
【非特許文献９】Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２
【非特許文献１０】Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：８８−９６，１９９９
【非特許文献１１】Ｈｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８４：２４０４−２４１０，２００２
【非特許文献１２】Ｓｚｃｚｅｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：１４３−１４９，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＮＡＤＰＨ消費生合成経路を用いた物質の生成のために最適化された微生物の菌株に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
各バイオトランスフォーメーションのために微生物でのＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を最適化しようと努める代わりに、発明者らは異なるＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を得るために修飾微生物を生成することを選択し、次に修飾微生物を使用してＮＡＤＰＨ消費バイオトランスフォーメーションを実施した。
【００１２】
本発明により、微生物の菌株は、その種の少なくとも１つの微生物を含む同じ種の微生物のセットを意味すると見なされる。それゆえその菌株について説明された特徴は、その菌株の微生物それぞれに当てはまる。同様に、菌株の微生物のいずれか１つについて説明された特徴は、その菌株の微生物のセット全体に当てはまる。
【００１３】
本発明によって最適化された微生物は、細菌、酵母および糸状カビ、特に以下の種に属する細菌および酵母：アスペルギルス種、バチラス種、ブレビバクテリウム種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種、エシェリキア種、グルコノバクター種、ペニシリウム種、ピキア種、シュードモナス種、ロドコッカス種、サッカロミセス種、ストレプトミセス種、キサントモナス種、カンジダ種を含む。
【００１４】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比の最適化の原理をＥ．コリおよびＳ．セレビシエについて以下で説明する。同じ原理が好気性条件下で増殖したすべての微生物に同様に適用される。
【００１５】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比の最適化の原理は、ＮＡＤＰＨの酸化に関与する酵素活性を制限することおよび／またはＮＡＤＰ＋の還元を可能にする酵素活性に好都合であることに存する。ＮＡＤＰＨの酸化に関与する酵素活性は、これらの活性、特にキノンオキシドレダクターゼおよび／または可溶性トランスヒドロゲナーゼなどの活性を低下させること、特に不活性化することによって制限される。ＮＡＤＰ＋の還元に好都合である酵素活性は、ペントースホスフェートサイクルを介して炭素流量を設定することによって、および／または少なくとも１つの酵素の補因子特異性を修飾することによって向上するので、通常の補因子であるＮＡＤに優先してＮＡＤＰを使用する。
【００１６】
本発明によって最適化された菌株は、分子生物学方法によって得られる。当業者には、微生物の遺伝的形質を修飾するのに使用されるプロトコルが公知である。これらの方法は、当業者によって記録され、ただちに実施できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）。
【００１７】
酵素活性を制限するために使用する方法は、それを発現する遺伝子を、適切な方法によって、たとえば関与する遺伝子のコード化部分において１つ以上の変異を引き起こすことによって、またはプロモータ領域を修飾することによって、特に遺伝子発現を低減する配列と置換することによって修飾することに存する。
【００１８】
酵素を不活性化するために使用する方法は、その発現が防止されるように（たとえばその発現に必要なプロモータ領域の一部または全部を欠失させる）、または発現生成物がその機能を失うように（たとえば関与する遺伝子のコード化部分における欠失によって）、関与する遺伝子の発現の生成物を適切な方法によって不活性化すること、または関与する遺伝子の発現を阻害すること、または関与する遺伝子の少なくとも一部を欠失させることに存する。
【００１９】
好ましくは、遺伝子の欠失は、その遺伝子の除去、および必要ならば、本発明によって最適化された菌株の同定、単離および精製を促進するための選択マーカー遺伝子によるその置換を含む。
【００２０】
Ｅ．コリ内の遺伝子の不活性化は好ましくは、相同組換えによって実施される（Ｄａｔｓｅｎｋｏ Ｋ．Ａ．，Ｗａｎｎｅｒ Ｂ．Ｌ．（２０００）Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７；６６４０−６６４５）。プロトコルの原理は、簡潔には以下の通りである：直鎖状断片であって、その遺伝子に隣接する２つの領域と、これらの２つの領域間に位置する少なくとも１つの選択遺伝子（一般に抗生物質抵抗性遺伝子）とを含む、試験管内で得られた直鎖状断片を細胞内に導入する。それゆえこの断片は不活性化遺伝子を含有する。組換え事象を受け、導入断片が組込まれた細胞は次に、選択培地にプレーティングすることによって選択される。野生遺伝子が不活性化遺伝子によって置換された、二重組換え事象を受けた細胞が次に選択される。このプロトコルは、二重組換え事象の検出を速めるために、ポジティブおよびネガティブ選択システムを使用することによって改良される。
【００２１】
Ｓ．セレビシエ内の遺伝子の不活性化も、相同組換えによって優先的に実施される（Ｂａｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，３３２９−３３３０，１９９３；Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ １０，１７９３−１８０８，１９９４；Ｂｒａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ．１４：１１５−３２，１９９８）。
【００２２】
酵素活性に好都合なプロセスは、関与する遺伝子の発現の生成物を、適切な手段によって、たとえばアロステリックエフェクタに対するその感度を低下させることによって、または生成される酵素の量を増大させるために遺伝子の発現を上昇させることによって、安定化することを含む。
【００２３】
遺伝子の過剰発現は、その遺伝子のプロモータをインサイチュで強力なまたは誘導性のプロモータと置換することによって実現できる。あるいは、複製プラスミド（１個または複数のコピー）を、遺伝子が過剰発現される細胞中に、適切なプロモータの制御下で導入する。エシェリキア・コリの修飾の場合、たとえばプロモータＰｌａｃ−ｏ、Ｐｔｒｃ−ｏ、およびｐｔａｃ−ｏ、すなわちそれらを構成型にするためにｌａｃオペレータ（ｌａｃＯ）が欠失された３つの強力な細菌プロモータを使用することができる。サッカロミセス・セレビシエの修飾の場合、たとえばプロモータＰｐｇｋ、Ｐａｄｈ１、Ｐｇａｌ１、Ｐｇａｌ１０を使用することができる。
【００２４】
ＮＡＤに優先してＮＡＤＰを使用するように酵素の補因子特異性を修飾するために使用できるプロセスは、酵素の発現を可能にする遺伝子の配列を修飾することを含む（Ｂｏｃａｎｇｒａ，Ｊ．Ａ．Ｓｃｒｕｔｔｏｎ，Ｎ．Ｓ．；Ｐｅｒｈａｍ，Ｒ．Ｎ．（１９９３）Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：２７３７−２７４０）。
【００２５】
本発明によって最適化された（すなわちＮＡＤＰ＋還元に関して向上した能力を備えた）菌株は、１つ以上のＮＡＤＰＨ酸化酵素活性、特にキノンオキシドレダクターゼおよび／または可溶性トランスヒドロゲナーゼ型の活性の減弱または不活性化を特徴とする。
【００２６】
以下にＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性および遺伝子のある非制限的な例を挙げる。
【００２７】
【表１】
【００２８】
本発明によって最適化された（すなわちＮＡＤＰ＋還元について向上した能力を備えた）菌株は、１つ以上のＮＡＤＰ＋還元酵素活性に好都合である修飾、特にペントースホスフェート経路を介した炭素流量を設定する修飾、および／またはその通常の補因子であるＮＡＤに優先してＮＡＤＰを利用するようにする、少なくとも１つの酵素の補因子特異性に関する修飾も含む。
【００２９】
本発明によって最適化された（すなわちＮＡＤＰ＋還元について向上した能力を備えた）菌株における、１つ以上のＮＡＤＰ＋還元酵素活性に好都合である修飾を受けやすい活性を以下に挙げる。
【００３０】
【表２】
【００３１】
本発明による最適化菌株における修飾を受けやすい酵素活性は主に、Ｅ．コリまたはＳ．セレビシエ中のタンパク質または遺伝子の種類を使用して定義される。しかしながら、この用法は本発明に従いより一般的な意味を有し、他の微生物における対応する酵素活性をカバーする。Ｅ．コリまたはＳ．セレビシエ中のタンパク質および遺伝子の配列を使用して、当業者はＥ．コリまたはＳ．セレビシエ以外の微生物中の同等の遺伝子を同定することができる。
【００３２】
相同配列および相同性のそのパーセンテージを同定する手段は当業者に周知であり、特にデフォルトパラメータが示されたウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から使用できる、ＢＬＡＳＴプログラムを含む。得られた配列は次に、たとえばＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラム（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）またはＭＵＬＴＡＬＩＮプログラム（http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl）を使用して、それらのウェブサイトに示されたデフォルトパラメータで利用（たとえば配列比較）することができる。
【００３３】
あるいは、ＣＤ−Ｓｅａｒｃｈプログラム（http://www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）を使用して、Ｅ．コリまたはＳ．セレビシエのタンパク質配列中の保存ドメインを同定して、同じ１つまたは複数のドメインを示す他の微生物の配列を探索することができる。保存ドメインは、ＰＦＡＭまたはＣＯＧ型のデータを集めたＣＤＤデータベースに記録されている（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ；Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＪＢ，ＤｅＷｅｅｓｅ−Ｓｃｏｔｔ Ｃ，Ｆｅｄｏｒｏｖａ ＮＤ，Ｇｅｅｒ ＬＹ，Ｈｅ Ｓ，Ｈｕｒｗｉｔｚ ＤＩ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＪＤ，Ｊａｃｏｂｓ ＡＲ， Ｌａｎｃｚｙｃｋｉ ＣＪ， Ｌｉｅｂｅｒｔ ＣＡ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｍａｄｅｊ Ｔ，Ｍａｒｃｈｌｅｒ ＧＨ，Ｍａｚｕｍｄｅｒ Ｒ，Ｎｉｋｏｌｓｋａｙａ ＡＮ，Ｐａｎｃｈｅｎｋｏ ＡＲ，Ｒａｏ ＢＳ，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ＢＡ，Ｓｉｍｏｎｙａｎ Ｖ，Ｓｏｎｇ ＪＳ，Ｔｈｉｅｓｓｅｎ ＰＡ，Ｖａｓｕｄｅｖａｎ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ ＲＡ，Ｙｉｎ ＪＪ，Ｂｒｙａｎｔ ＳＨ．ＣＤＤ：ａ ｃｕｒａｔｅｄ Ｅｎｔｒｅｚ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：３８３−３８７（２００３））。
【００３４】
ＰＦＡＭ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＦＡＭｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ（配列比較および隠れマルコフモデルのタンパク質ファミリーデータベース）；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列の配列比較の大規模なコレクションである。各ＰＦＡＭは、複数の配列比較を描出して、タンパク質ドメインを調査し、生物間での分布を評価して、他のデータベースにアクセスし、既知のタンパク質構造を描出することを可能にする。
【００３５】
ＣＯＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（タンパク質のオルソロガスグループのクラスタ）；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）は、３０個の主要な系統発生系を表す４３個の完全に配列決定されたゲノムからのタンパク質配列を比較することによって得られる。各ＣＯＧは少なくとも３つの系統から定義され、それゆえ古代の保存ドメインを同定することを可能にする。
【００３６】
これらの各種の方法から同定されたコンセンサス配列より、縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計して、別の微生物中の相当する遺伝子をクローニングすることが可能である。これらの慣用的な分子生物学方法は、当業者に周知であり、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）で述べられている。
【００３７】
【表３】
【００３８】
【表４】
【００３９】
本発明によって最適化された（すなわちＮＡＤＰ＋還元について向上した能力を備えた）菌株は、ＮＡＤＰＨ酸化活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子の欠失、特にキノンオキシドレダクターゼをコード化する遺伝子（たとえばｑｏｒ、ＺＴＡ１）および／または可溶性トランスヒドロゲナーゼ活性をコード化する遺伝子（たとえばｕｄｈＡ）の欠失を特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、ｕｄｈＡおよびｑｏｒ遺伝子はどちらも欠失される。
【００４１】
本発明の特定の実施形態において、本発明により最適化された菌株は、ホスホグルコースイソメラーゼ活性（たとえばｐｇｉ，ＰＧＩ１）および／またはホスホフルクトキナーゼ活性（たとえばｐｆｋＡ、ＰＦＫ１）をコード化する１つまたは複数の遺伝子の欠失も特徴とする。
【００４２】
本発明のさらなる特定の実施形態において、本発明により最適化された菌株は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（たとえばｌｐｄ、ＬＰＤ１）および／またはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（たとえばｇａｐＡ、ＴＤＨ１）活性をコード化する１つまたは複数の遺伝子の修飾も特徴とし、その修飾は、酵素にその通常の補因子であるＮＡＤよりもＮＡＤＰを優先させることに存する。
【００４３】
ホスホグルコースイソメラーゼおよび／またはホスホフルクトキナーゼ活性をコード化する遺伝子の欠失を特徴とする本発明の菌株は特に、バイオトランスフォーメーションプロセスに十分に適合している。
【００４４】
本発明によって最適化された微生物中で利用可能なＮＡＤＰＨの量を増加させるためには、以下の酵素活性：グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（たとえばｚｗｆ、ＺＷＦ１）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（たとえばＳＯＬ１）、６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ（たとえばｇｎｄ、ＧＮＤ１）、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（たとえばｉｃｄ、ＩＤＰ１）および膜結合性トランスヒドロゲナーゼ（たとえばｐｎｔＡ）の１つをコード化する少なくとも１つの遺伝子を過剰発現させること、および／または以下の酵素活性：ホスホグルコナートデヒドラターゼ（たとえばｅｄｄ）、マレートシンターゼ（たとえばａｃｅＢ、ＤＡＬ７）、イソシトレートリアーゼ（たとえばａｃｅＡ、ＩＣＬ１）およびイソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼ（たとえばａｃｅＫ）の少なくとも１つをコード化する少なくとも１つの遺伝子を欠失することが好都合であり得る。
【００４５】
本発明のさらなる目的は、上記および下記で定義するようなＮＡＤＰＨの生成のために最適化された微生物であり、該微生物は、興味のある物質のバイオトランスフォーメーションに関与する酵素活性をコード化する１つまたは複数の遺伝子および１つまたは複数の選択マーカー遺伝子も含有する。
【００４６】
これらの遺伝子は、本発明によって最適化された菌株に固有であるか、または微生物のゲノムへの組込み、または複製ベクターのどちらかにより、適切なベクターを使用する変換によって、本発明によって最適化された菌株に導入することが可能であり、該適切なベクターは、興味のある適切な物質のバイオトランスフォーメーションに関与する適切な酵素をコード化する１つまたは複数の遺伝子および／または適切な選択マーカーを有する。
【００４７】
これらの遺伝子は、興味のある物質のバイオトランスフォーメーションに関与する酵素および／または選択マーカーをコード化する核酸配列を含み、該コード化配列は、バイオトランスフォーメーションのために選択された原核および／または真核細胞内で有効なプロモータ配列と融合される。ベクター（またはプラスミド）は、Ｅ．コリと別の微生物との間のシャトルベクターでありうる。
【００４８】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比について最適化された菌株の選択は、バイオトランスフォーメーション（発酵または生物変換）の種類、考慮される生物変換経路におけるＮＡＤＰＨに対する総要求、１つまたは複数の炭素源の性質、バイオマス流量要求などに従って決定される。
【００４９】
解糖とペントースホスフェート経路との間の炭素流量の分布を制御できない場合に、ホスホグルコースイソメラーゼおよび／またはホスホフルクトキナーゼ活性をコード化する遺伝子の欠失が必要となるであろう。ホスホグルコースイソメラーゼをコード化する遺伝子の欠失は発酵に、またはＮＡＤＰＨへの要求が移入グルコース１モル当たりＮＡＤＰ＋２モルの最小還元流量を必要とするときに好ましい。ホスホフルクトキナーゼをコード化する遺伝子の欠失は、生物変換に、またはＮＡＤＰＨへの要求が移入グルコース１モル当たりＮＡＤＰ＋３〜４モルの最小還元流量を必要とするときに、優先的に選択されるであろう。上記および下記で説明するように、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼおよび／またはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子の修飾は、バイオトランスフォーメーションが移入グルコース１モル当たりＮＡＤＰ＋３モルを超える最小還元流量を必要とするときに、特に菌株Ｅ．コリΔ（ｕｄｈＡ、ｑｏｒ）またはＥ．コリΔ（ｕｄｈＡ、ｑｏｒ、ｐｇｉ）またはＥ．コリΔ（ｕｄｈＡ、ｑｏｒ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ）を最適化するために実施されるであろう。他の提示された修飾、すなわち以下の酵素活性：グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼおよび膜トランスヒドロゲナーゼの１つをコード化する少なくとも１つの遺伝子の過剰発現、および／または以下の酵素活性：６−ホスホグルコナートデヒドラターゼ、マレートシンターゼ、イソシトレートリアーゼまたはイソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼの１つをコード化する少なくとも１つの遺伝子の欠失は、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比の最適化を、考慮されている細胞およびバイオトランスフォーメーションプロセスの要求に合せて微調整するために実施することができる。
【００５０】
本発明は、それらがＮＡＤＰを優先的に使用するための、キノンオキシドレダクターゼまたは可溶性トランスヒドロゲナーゼ活性をコード化する遺伝子の欠失によって、おそらくグルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼまたは６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性をコード化する遺伝子の欠失によって、および／またはＮＡＤ酵素、特にジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼまたはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコード化する少なくとも１つの遺伝子の修飾によって、そして必要ならば、６−ホスホグルコナートデヒドラターゼ、マレートシンターゼ、イソシトレートリアーゼまたはイソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼをコード化する少なくとも１つの遺伝子の欠失によって特徴付けられ（該欠失および修飾は、適切な手段によって実施される）、および／または過剰発現を可能にする適切なベクターを使用して菌株を修飾すること、または過剰発現させる遺伝子を制御する内在性プロモータの強度を変更することのどちらかによる、以下の活性：グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼまたは膜トランスヒドロゲナーゼをコード化する少なくとも１つの遺伝子の過剰発現によって特徴付けられる、上記および下記で定義するように本発明に従って最適化された菌株を調製する手順にも関する。
【００５１】
本発明の特定の実施形態において、本発明による菌株を調製するプロセスは、興味のある物質のバイオトランスフォーメーションに関与する１つ以上の酵素をコード化する１つ以上の遺伝子、および１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む、少なくとも１つの適切なベクターを用いた最適化菌株の変換も含む。
【００５２】
本発明のさらなる目的は、ＮＡＤＰＨ依存性バイオトランスフォーメーションのために本発明に従って最適化されたこれらの菌株の使用と、それによりＮＡＤＰＨについて最適化されていない菌株と比較して改善したバイオトランスフォーメーション収率を得ることに関する。
【００５３】
バイオトランスフォーメーションは、ＮＡＤＰＨ依存性反応を触媒する酵素活性をコード化する遺伝子が発現される、本発明に従って定義された菌株を使用して実施される。当業者は、そのような酵素を容易に同定できる。それらは特に以下を含む：ＥＣ １．１．１．１０ Ｌ−キシルロースレダクターゼ、ＥＣ １．１．１．２１ メチルグリオキサルレダクターゼ、ＥＣ １．１．１．５１ ３（または１７）β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．５４ アリルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．８０ イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．１３４ ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−タロース４−デヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．１４９ ２０α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．１５１ ２１−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．１８９ プロスタグランジン−Ｅ２ ９−レダクターゼ、ＥＣ １．１．１．１９１ インドール−３−アセトアルデヒドレダクターゼ、ＥＣ １．１．１．２０７ （−）−メントールデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．２３４ フラバノン４−レダクターゼ、ＥＣ １．２．１．５０ 長鎖脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ、ＥＣ １．３．１．４ コルチゾンα−レダクターゼ、ＥＣ １．３．１．２３ コレステノン５β−レダクターゼ、ＥＣ １．３．１．７０ Δ１４−ステロールレダクターゼ、ＥＣ １．４．１．１２ ２，４−ジアミノペンタノアートデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．５．１．１０ サッカロピンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタメート形成、ＥＣ １．７．１．６ アゾベンゼンレダクターゼ、ＥＣ １．８．１．５ ２−オキソプロピル−ＣｏＭレダクターゼ（カルボキシル化）、ＥＣ １．１０．１．１ トランス−アセナフテン−１，２−ジオールデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１４．１３．７ フェノール２−モノオキシゲナーゼ、ＥＣ １．１４．１３．１２ ベンゾアート４−モノ−オキシゲナーゼ、ＥＣ １．１４．１３．２６ ホスファチジルコリン１２−モノオキシゲナーゼ、ＥＣ １．１４．１３．６４ ４−ヒドロキシベンゾアート １−ヒドロキシラーゼ、ＥＣ １．１４．１３．７０ ステロール１４−デメチラーゼ、ＥＣ １．１６．１．５ アクアコバラミンレダクターゼ、ＥＣ １．１７．１．１ ＣＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシグルコースレダクターゼ、ＥＣ １．１８．１．２ フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ。
【００５４】
本発明は、以下のステップを含むことを特徴とする、少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存反応を含む生合成経路によって形成される興味のある物質を生成するプロセスにも関する。
ａ）その増殖に好都合であり、ＮＡＤＰＨを除いて、発酵または生物変換によるバイオトランスフォーメーションを実施するために必要な物質を含有する適切な培養培地における、本発明に従って最適化された微生物の培養での増殖。
ｂ）培地からの興味のある物質の抽出および必要ならばその精製。
【００５５】
好ましくは興味のある物質は、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、脂肪酸、有機酸、ポリオール、またはヒドロキシエステルでありうる。アミノ酸およびその前駆物質は特に、リジン、メチオニン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、ホモセリン、イソロイシン、およびバリンを含む。ビタミンおよびその前駆物質は特に、パントアート、トランス−ニューロスポレン、フィロキノンおよびトコフェロールを含む。ステロールは特に、スクアレン、コレステロール、テストステロン、プロゲステロンおよびコルチゾンを含む。フラボノイドは特に、フランビノンおよびベスチトンを含む。有機酸はクマリン酸および３−ヒドロキシプロピオン酸を含む。ポリオールは、ソルビトール、キシリトールおよびグリセロールを含む。ヒドロキシエステルは、エチル−３−ヒドロキシブチラートおよびエチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートを含む。
【００５６】
生物変換の場合、プロセスは、変換される基質の適切な培養培地への添加も含む。
【００５７】
上述の本発明によるプロセスのステップｂ）で挙げた培養培地は、各種の同化可能な糖、たとえばグルコース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、糖蜜、またはこれらの糖の副生成物のいずれかであり得る少なくとも１つの同化可能な炭水化物を含有する。特に好ましい単純な炭素源はグルコースである。別の好ましい単純な炭素源はスクロースである。培養培地は、微生物の増殖および／または興味のある物質の生成に好都合な１つ以上の物質（たとえばアミノ酸、ビタミンまたは無機塩）も含有し得る。特にＥ．コリの無機培地はそれゆえ、Ｍ９培地（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９４６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３２：１２０−１２８）、Ｍ６３培地（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２；Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）またはＳｃｈａｅｆｅｒら（１９９９，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：８８−９６）によって述べられるような培地と同じまたは類似の組成を有することができる。
【００５８】
バイオトランスフォーメーションの条件は、当業者によって設定される。特に微生物は、Ｓ．セレビシエでは２０℃〜５５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、好ましくは約３０℃の温度にて、Ｅ．コリでは約３７℃にて発酵させる。
【００５９】
以下の実施例は、例示のためのみであり、本発明の実施形態または範囲を決して限定しない。
【実施例１】
【００６０】
エチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換での理論的最適収率の計算
ａ）Ｅ．コリによる生物変換
ＭＥＴａｂｏｌｉｃ ＥＸｐｌｏｒｅｒ社が開発した化学量論モデルであるアルゴリズムＭｅｔＯｐｔ（登録商標）−Ｃｏｌｉを使用して予測モデル化を実施し、それを用いると１）エチルアセトアセテートからのエチル−３−ヒドロキシブチラートの最大生成収率と、２）細胞が増殖して、最大生物変換収率に達するために必要な増殖および酸化還元平衡への要求を満足する、グルコースからの最良の流量分布を決定することが可能であった。
【００６１】
モデル変数の具体的な設定は、１）３ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１のグルコース移入流量、２）０、０．１５および０．２５ｈ−１の可変増殖速度、３）１ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１以下の可変膜結合性トランスヒドロゲナーゼ流量（ｐｎｔＡＢ）；膜結合性トランスヒドロゲナーゼ流量の制限値は、文献（Ｈａｎｓｏｎ，１９７９；Ａｎｄｅｒｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｅｍｍｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）から決定した、４）５〜２２ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１に制限された維持流量であった。
【００６２】
すべての場合において、モデルはｕｄｈＡおよびｑｏｒ遺伝子の欠失を示唆した。しかしながら、実際にはペントースホスフェート経路と解糖との間の炭素流量の適切な分布を維持することが困難であり、この分布は増殖速度に従って変化するので、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］は、理論的最適収率に等しい収率を与えない。実際に、したがって菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）］または[Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）］が好ましく、その間の選択は生物変換プロセス中の菌株の増殖速度に依存する。
【００６３】
エチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換の理論的最適収率は、本発明に従って最適化されたＥ．コリの各種の菌株について計算した。
【００６４】
【表５】
【００６５】
ＮＡＤＰ＋還元能力について最適化されたＥ．コリの菌株によるエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換の理論的最適収率（グルコース１ｍｏｌ当たりのｍｏｌ）
本発明に従って最適化された菌株の理論的最適収率をさらに改善するために、さらなる修飾、たとえばｚｗｆ、ｇｎｄ、ｐｎｔＡ、ｐｎｔＢまたはｉｃｄでありうる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現および／またはｅｄｄ、ａｃｅＡ、ａｃｅＢまたはａｃｅＫでありうる少なくとも１つの遺伝子の欠失を実施できる。
【００６６】
ｂ）Ｓ．セレビシエによる生物変換
ＭＥＴａｂｏｌｉｃ ＥＸｐｌｏｒｅｒ社が開発した化学量論モデルであるアルゴリズムＭｅｔＯｐｔ（登録商標）−Ｓｃｅｒｅを使用して予測モデル化を実施し、それを用いると１）エチルアセトアセテートからのエチル−３−ヒドロキシブチラートの最大生成収率と、２）細胞が増殖して、最大生物変換収率に達するために必要な増殖および酸化還元平衡への要求を満足する、グルコースからの最良の流量分布を決定することが可能であった。
【００６７】
モデル変数の具体的な設定は、１）３ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１のグルコース移入流量、２）０、０．１５および０．２５ｈ−１の可変増殖速度、３）２２ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１以下の維持流量、４）非可逆的であり、アセテート＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→アセトアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）の方向に設定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ反応（ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ６）、および５）ｕｄｈＡまたはｐｎｔＡ、Ｂに等しい活性なしであった。
【００６８】
モデルは、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム区画化を考慮した。
【００６９】
すべての場合において、モデルは、ＮＡＤＰＨを酸化する酵素をコード化する遺伝子、特に遺伝子ＺＴＡ１の欠失を示唆した。しかしながら実際には、ペントースホスフェート経路と解糖との間の炭素流量の適切な分布を維持することが困難であり、この分布は増殖速度と共に変化するので、菌株Ｓ．セレビシエ［ΔＺＴＡ１］は理論的最適収率に等しい収率を与えない。実際に菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＦＫ１，ＰＦＫ２）］または［Δ（ＺＴＡ１，ＰＧＩ１）］を使用することが好ましく、それらの間の選択は生物変換プロセス中の菌株の増殖速度に依存する。
【００７０】
エチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換の理論的最適収率は、本発明に従って最適化されたＳ．セレビシエの各種の菌株について計算した。
【００７１】
【表６】
【００７２】
ＮＡＤＰ＋還元能力について最適化されたＳ．セレビシエの菌株によるエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換の理論的最適収率（グルコース１ｍｏｌ当たりのｍｏｌ）
本発明に従って最適化された菌株の理論的最適収率をさらに改善するために、さらなる修飾、たとえばＺＷＦ、ＳＯＬ１、ＳＯＬ２、ＳＯＬ３、ＳＯＬ４、ＧＮＤ１、ＧＮＤ２、ＩＤＰ１、ＩＤＰ２またはＩＤＰ３でありうる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現および／またはＩＣＬ１またはＤＡＬ７でありうる少なくとも１つの遺伝子の欠失を実施できる。
【実施例２】
【００７３】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］の作成
ｕｄｈＡ遺伝子の不活性化は、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｒａｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７：６６４０−６６４５）によって述べられた方法を使用して、相同組換えによって実施した。
【００７４】
本方法は、抗生物質（クロラムフェニコール）耐性カセットを挿入すると同時に、関与する遺伝子の大半を欠失させることに存する。このために、それぞれ１００ｐｂより成るヌクレオチド対を合成し、そのうち８０ｂｐ（小文字）は欠失される遺伝子（たとえばｕｄｈＡ）と相同性であり、２０ｂｐ（大文字）はクロラムフェニコール耐性カセットと相同性であった。
DudhAF
ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG
DudhAR
CccagaatctcttttgtttcccgatggaacaaaattttcagcgtgcccacgttcatgccgacgatttgtgcgcgtgccagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
【００７５】
プラスミドｐＫＤ３が保有する抗生物質カセットは、オリゴヌクレオチドＤｕｄｈＡＦおよびＤｕｄｈＡＲを使用してＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲ生成物を次に、相同組換えを触媒する酵素であるＲｅｄリコンビナーゼをコード化する遺伝子を保有する菌株Ｅ．コリ［ｐＫＤ４６］に電気穿孔によって導入した。次にクロラムフェニコール耐性形質変換体を選択して、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドＵｄｈＡＦおよびＵｄｈＡＲを使用してＰＣＲ解析によってチェックした。
UdhaF
Ggccgctcaggatatagccagataaatgac
UdhaR
Gcgggatcactttactgccagcgctggctg
【００７６】
次にクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。これを行うために、クロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを保有するプラスミドｐＣＰ２０を電気穿孔によって組換え菌株に導入した。４２℃での一連の培養の後、抗生物質耐性カセットの消失を、オリゴヌクレオチドＵｄｈＡＦおよびＵｄｈＡＲを使用してＰＣＲ解析によってチェックした。
【００７７】
遺伝子ｑｏｒの不活性化は、以下のオリゴヌクレオチドを使用して同じ方法によって実施した。
DqorF
ggtggcccggaagtacttcaagccgtagagttcactcctgccgatccggcggagaatgaaatccaggtcgaaaataaagcCATATGAATATCCTCCTTAG
DqorR
cgcccggctttccagaatctcatgcgcacgctgcgcatccttcagcggatatttctgctgctcggcgacatcgaccttaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
QorF
Cgcccaacaccgactgctccgcttcgatcg
QorR
cagcgttatgaccgctggcgttactaaggg
【００７８】
実際的な理由で、２つの遺伝子を同時に欠失させることは有用であり得る。これを行うために、各遺伝子を異なる抗生物質耐性カセット（たとえばｕｄｈＡではクロラムフェニコール、ｑｏｒではカナマイシン）によって置換した。
【００７９】
得られた菌株は、Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］であった。
【実施例３】
【００８０】
プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐの作成、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］への導入およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの変換
プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡは、プロモータｇａｐＡのベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（ｐＳＫ）への挿入によって作成した。これを行うために、Ｅ．コリのプロモータｇａｐＡを、染色体ＤＮＡからポリメラーゼＰｗｏを用いて増幅した。
【００８１】
得られたＰＣＲ生成物を次に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって消化して、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって消化して脱リン酸化したベクターｐＳＫに連結して、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡを得た。ベクターｐＳＫは、Ｅ．コリの複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を保有していた。
【００８２】
作成の検証のために、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡを次に菌株Ｅ．コリＤＨ５αに導入した。次にオリゴヌクレオチドユニバーサルＭ１３フォワードを用いて、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡのプロモータｇａｐＡの配列決定を実施して、作成を確認した。
【００８３】
プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐは、遺伝子ＧＲＥ２ｐのプラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡへの挿入によって作成した。これを行うために、サッカロミセス・セレビシエの遺伝子ＧＲＥ２ｐを、染色体ＤＮＡから、ポリメラーゼＰｗｏを用いて以下のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した。
Ome119_GRE2F (NdeI)
Acgtacgtggcatatgtcagttttcgtttcaggtgctaacggg
Ome120_GRE2R (PstI)
Acgtacctgcagttatattctgccctcaaattttaaaatttggg
【００８４】
得られたＰＣＲ生成物を次に、制限酵素ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩによって消化して、制限酵素ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩによって消化して脱リン酸化したベクターｐＳＫ−ＰｇａｐＡに連結して、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを得た。プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡは、Ｅ．コリの複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を保有していた。
【００８５】
作成の検証のために、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを次に菌株Ｅ．コリＤＨ５αに導入した。次にオリゴヌクレオチドユニバーサルＭ１３リバースおよびユニバーサルＭ１３フォワードを用いて、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐの遺伝子ＧＲＥ２ｐの配列決定を実施して、作成を確認した。
【００８６】
検証されたプラスミドは、電気穿孔によって菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］（実施例２）に導入した。
【００８７】
得られた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。Ｅ．コリ［ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の菌株を同じ条件で増殖させた。
【００８８】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【００８９】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることが見出された。
【実施例４】
【００９０】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
実施例２で述べた方法および以下のオリゴヌクレオチドを使用して、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］（実施例２）における遺伝子ｐｇｉの不活性化を実施した。
DpgiF
ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DpgiR
gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG
pgiF
gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc
pgiR
cggtatgatttccgttaaattacagacaag
【００９１】
作成は富栄養培地（たとえばＬＢ）で実施した。プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを次に、得られた菌株（実施例３）中に電気穿孔によって導入して、生じた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］を富栄養培地上で選択した。
【００９２】
得られた菌株を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。Ｅ．コリ［ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の菌株を同じ条件で増殖させた。
【００９３】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【００９４】
発明者らは、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【００９５】
【表７】
【実施例５】
【００９６】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｅｄｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
実施例２で述べた方法および以下のオリゴヌクレオチドを使用して、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）］（実施例４）における遺伝子ｅｄｄの不活性化を実施した。
DeddF (1932582-1932499)
CgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgttcatcgttcgcagttggcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DeddR (1930866-1930943)
cgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcccacgcgtgacgcgctcaggtcaggaatgtgcggttcgcgagcagccCATATGAATATCCTCCTTAG
EddF (1932996-1932968)
Gggtagactccattactgaggcgtgggcg
EddR (1930439-1930462)
Ccccggaatcagaggaatagtccc
【００９７】
作成は富栄養培地（たとえばＬＢ）で実施した。プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを次に、得られた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｅｄｄ）］（実施例３）中に電気穿孔によって導入して、生じた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｅｄｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］を富栄養培地上で選択した。
【００９８】
得られた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｅｄｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。Ｅ．コリ［ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の菌株を同じ条件で増殖させた。
【００９９】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１００】
発明者らは、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｅｄｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【実施例６】
【０１０１】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
実施例２で述べた方法および以下のオリゴヌクレオチドを使用して、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］（実施例２）における遺伝子ｐｆｋＡおよびｐｆｋＢの不活性化を実施した。
DpfkAF
ggt gtg ttg aca agc ggc ggt gat gcg cca ggc atg aac gcc gca att cgc ggg gtt gtt cgt tct gcg ctg aca gaa ggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DpfkAR
Ttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgcttcatgttttcgatagcgtcgatgatgtcgtggtgaaccagctgcatatgaatatcctccttag
PfkAF
Cgcacgcggcagtcagggccgacccgc
PfkAR
ccctacgccccacttgttcatcgcccg
DpfkBF (1804421-1804499)
gcgccctctctcgatagcgcaacaattaccccgcaaatttatcccgaaggaaaactgcgctgtaccgcaccggtgttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DpfkBR (1805320-1805241)
gcgggaaaggtaagcgtaaattttttgcgtatcgtcatgggagcacagacgtgttccctgattgagtgtggctgcactccCATATGAATATCCTCCTTAG
PfkBF (1803996-1804025)
tggcaggatcatccatgacagtaaaaacgg
PfkBR (1805657-1805632)
gccggttgcactttgggtaagccccg
【０１０２】
作成は富栄養培地（たとえばＬＢ）で実施した。プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを次に、得られた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）］（実施例３）中に電気穿孔によって導入して、生じた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］を富栄養培地上で選択した。
【０１０３】
得られた菌株［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］は次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。Ｅ．コリ［ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の菌株を同じ条件で増殖させた。
【０１０４】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１０５】
発明者らは、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【０１０６】
【表８】
【実施例７】
【０１０７】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）ｐｌｐｄ＊，ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
多酵素複合体ピルビン酸デヒドロゲナーゼに関与するＮＡＤ依存性ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子ｌｐｄを、初期菌株が野生菌株の代わりに実施例４で述べた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）］であることを除いて、実施例２で述べた方法を使用して欠失させた。修飾菌株の作成および選択は、富栄養培地（たとえばＬＢ）で実施した。得られた菌株はＥ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）］であった。
【０１０８】
加えて、ＮＡＤＰ依存性ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼの過剰発現を可能にする、プラスミドｐ−ｌｐｄ＊を作成した。酵素の補因子特異性を修飾する各種の考えられる方法がある。たとえばＢｏｃａｎｅｇｒａら（１９９３）は、ＮＡＤＰ依存性ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼを作成する方法を報告している。
【０１０９】
プラスミドｐ−ｌｐｄ＊およびｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを次に、電気穿孔によって菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）］に導入した。あるいはｌｐｄ＊をｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐにクローニングして、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ−ｌｐｄ＊を得て、次に電気穿孔によって菌株Ｅ．コリ［（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）］に導入した。修飾菌株の作成および選択は、富栄養培地（たとえばＬＢ）で実施した。
【０１１０】
得られた菌株Ｅ．コリ［（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ，ｐ−ｌｐｄ＊）］を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。Ｅ．コリ［ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の菌株を同じ条件で増殖させた。
【０１１１】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１１２】
発明者らは、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ，ｐ−ｌｐｄ＊）］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【実施例８】
【０１１３】
プラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐの作成
プラスミドｐＹＧＫは、ベクターｐＹＰＧ２のプロモータＰｐｇｋ、マルチクローニング部位およびターミネータｃｙｃ１の、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（ｐＳＫ）への挿入によって作成した。これを行うために、プロモータＰｐｇｋ、マルチクローニング部位、およびターミネータｃｙｃ１をベクターｐＹＰＧ２からＰｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを用いて増幅した。得られたＰＣＲ生成物を次に、制限酵素ＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩによって消化して、制限酵素ＡｐａＩ−ＳｍａＩによって消化し、連結し、制限酵素ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩによって消化し、脱リン酸化したベクターｐＳＫに連結して、プラスミドｐＹＧＫを得た。
【０１１４】
作成の検証のために、プラスミドｐＹＧＫを次に菌株Ｅ．コリＤＨ５αに導入した。次にオリゴヌクレオチドユニバーサルＭ１３リバースおよびユニバーサルＭ１３フォワードを用いて、プラスミドｐＹＧＫのプロモータＰｐｇｋ、マルチクローニング部位およびターミネータｃｙｃ１の配列決定を実施して、作成を確認した。
【０１１５】
次にプラスミドｐＹＧＫ−ＧＲＥ２ｐは、遺伝子ＧＲＥ２ｐのプラスミドｐＹＧＫへの挿入によって作成した。これを行うために、サッカロミセス・セレビシエの遺伝子ＧＲＥ２ｐを、染色体ＤＮＡから、ポリメラーゼＰｗｏを用いて以下のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した。
Ome376_Gre2 pYGK F (SmaI)
Acgtacgtcccccgggaaaaatgtcagttttcgtttcaggtgc
Ome377_Gre2 pYGK R (ApaI)
ACGTACGGGCCCTTATATTCTGCCCTCAAATTTTAAAATTTGGG
【０１１６】
得られたＰＣＲ生成物を次に、制限酵素ＡｐａＩ−ＳｍａＩによって消化して、制限酵素ＡｐａＩ−ＳｍａＩによって消化し、脱リン酸化したベクターｐＹＧＫに連結して、プラスミドｐＹＧＫ−ＧＲＥ２ｐを得た。
【０１１７】
作成の検証のために、プラスミドｐＹＧＫ−ＧＲＥ２ｐを次に菌株Ｅ．コリＤＨ５αに導入した。次にオリゴヌクレオチドユニバーサルＭ１３リバースおよびユニバーサルＭ１３フォワードを用いて、プラスミドｐＹＧＫ−ＧＲＥ２ｐの遺伝子ＧＲＥ２ｐの配列決定を実施して、作成を確認した。
【０１１８】
プラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐを、制限酵素ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩによるプラスミドｐＹＧＫ−ＧＲＥ２ｐおよびｐＲＳ４２６の消化と、それに続く連結とによって最終的に得た。
【実施例９】
【０１１９】
菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
遺伝子ＺＴＡ１の不活性化は、マーカー（抗生物質耐性、栄養要求性）を挿入すると同時に、関与する遺伝子の大半を欠失させることによって実施した。使用した技法は、Ｂｒａｃｈｍａｎｎらによって述べられている（Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ Ｓ２８８Ｃ：ａ ｕｓｅｆｕｌ ｓｅｔ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｙｅａｓｔ，１９９８，１４：１１５−３２）。Ｗａｃｈらによって述べられた方法を使用することも可能である（Ｎｅｗ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｄｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｏｒ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｙｅａｓｔ，１９９４，１０：１７９３−１８０８）。
【０１２０】
すべての場合において、Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）］の最終菌株が得られ、次にその中にプラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ（実施例８）を導入した。
【０１２１】
あるいはプラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐを入手可能なΔ（ＺＴＡ１）菌株、たとえば菌株ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ Ｙ３３１８３（遺伝子型：ＢＹ４７４３；Ｍａｔ ａ／α；ｈｉｓ３Ｄ１／ｈｉｓ３Ｄ１；ｌｅｕ２Ｄ０／ｌｅｕ２Ｄ０；ｌｙｓ２Ｄ０／ＬＹＳ２；ＭＥＴ１５／ｍｅｔ１５Ｄ０；ｕｒａ３Ｄ０／ｕｒａ３Ｄ０；ＹＢＲ０４６ｃ：：ｋａｎＭＸ４／ＹＢＲ０４６ｃ：：ｋａｎＭＸ４）に導入することも可能であった。次に胞子形成の後、Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］のホモ接合体菌株を回収することが可能であった。
【０１２２】
得られた菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］は次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。
【０１２３】
対照菌株Ｓ．セレビシエ［ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］を同じ条件で増殖させた。
【０１２４】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１２５】
発明者らは、菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを見出した。
【実施例１０】
【０１２６】
菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＧＩ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
実施例９で述べた方法および以下のオリゴヌクレオチドを使用して、菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］における遺伝子ＰＧＩ１の不活性化を実施した。
Dpgi1F
CCAACGCAGACCGCTGCCTGGCAGGCACTACAGAAACACTTCGATGAAATGAAAGACGTTACGATCGCCGATCTTTTTGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
Dpgi1R
GCGCCACGCTTTATAGCGGTTAATCAGACCATTGGTCGAGCTATCGTGGCTGCTGATTTCTTTATCATCTTTCAGCTCTGCATATGAATATCCTCCTTAG
Pgi1F
GCGGGGCGGTTGTCAACGATGGGGTCATGC
Pgi1R
CGGTATGATTTCCGTTAAATTACAGACAAG
【０１２７】
あるいは入手可能なΔ（ＰＧＩ１）菌株、たとえば菌株ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ Ｙ２３３３６（Ｍａｔ α／ａ；ｈｉｓ３Ｄ１／ｈｉｓ３Ｄ１；ｌｅｕ２Ｄ０／ｌｅｕ２Ｄ０；ｌｙｓ２Ｄ０／ＬＹＳ２；ＭＥＴ１５／ｍｅｔ１５Ｄ０；ｕｒａ３Ｄ０／ｕｒａ３Ｄ０；ＹＢＲ１９６ｃ：：ｋａｎＭＸ４／ＹＢＲ１９６ｃ）を使用することが可能であった。次に菌株をプラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ（実施例８）によって変換して、次に実施例９で述べた方法を使用して遺伝子ＺＴＡ１の欠失を実施した。
【０１２８】
得られた菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＧＩ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。
【０１２９】
対照菌株Ｓ．セレビシエ［ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］を同じ条件で増殖させた。
【０１３０】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１３１】
発明者らは、菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＧＩ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【実施例１１】
【０１３２】
菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＦＫ１，ＰＦＫ２）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
実施例９で述べた方法および以下のオリゴヌクレオチドを使用して、菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）］において遺伝子ＰＦＫ１およびＰＦＫ２を欠失させた。
Dpfk1F
ATGCAATCTCAAGATTCATGCTACGGTGTTGCATTCAGATCTATCATCACAAATGATGAAAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCG
Dpfk1R
TTTGTTTTCAGCGGCTAAAGCGGCTACCTCAGCTCTCAACTTTAATCTACCGGACAGGATGGGCCACTAGTGGATCTGATATC
Pfk1 int F
GCTTTCTTAGAAGCTACCTCCG
Pfk1 int R
GAACCGACAAGACCAACAATGG
Pfk2 int F
CAGTTGTACACTTTGGACCC
Pfk2 int R
GATCAGCACCAGTCAAAGAACC
【０１３３】
次に菌株をプラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ（実施例８）によって変換した。
【０１３４】
得られた菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＦＫ１，ＰＦＫ２）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。
【０１３５】
対照菌株Ｓ．セレビシエ［ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］を同じ条件で増殖させた。
【０１３６】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１３７】
発明者らは、菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＦＫ１，ＰＦＫ２）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【０１３８】
【表９】
【実施例１２】
【０１３９】
エシェリキア・コリによるエチル−３−ヒドロキシブチラートの生成の最適化のための代謝モデルを使用する、実験値と予測との比較
発明者らは、予測モデル化（実施例１）と実施例３、４、５、６、７、９、１０および１１に述べた実験結果との間に密接な相関を見出した。
【０１４０】
上の実施例１〜１１は、特許の具体的な適用であり、その範囲を制限しない。当業者は、ＮＡＤＰＨ依存性合成によって形成された物質のバイオトランスフォーメーションにこれらの例を容易に適合させることができる。アルゴリズムＭｅｔＯｐｔ（登録商標）およびＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比の最適化によるＮＡＤＰＨ依存性バイオトランスフォーメーションプロセスを最適化する方法を検証する。それゆえ本特許は、Ｅ．コリ、Ｓ．セレビシエまたは他のいずれかの微生物を使用した、ＭｅｔＯｐｔ（登録商標）、またはその派生物を用いてモデル化および予測できるすべてのＮＡＤＰＨ依存性バイオトランスフォーメーションをカバーする適用を請求する。
【実施例１３】
【０１４１】
Ｅ．コリにおける発酵プロセスでの理論的最適収率の計算
実施例１２は、ＭＥＴａｂｏｌｉｃ ＥＸｐｌｏｒｅｒ社によって開発されたモデルＭｅｔＯｐｔ（登録商標）が生物変換に利用可能であり、発酵などのバイオトランスフォーメーションにより一般的に利用可能なはずであることを示している。
【０１４２】
たとえばＭｅｔＯｐｔ（登録商標）−Ｃｏｌｉモデルは、本発明に従って最適化されたＥ．コリの菌株でのグルコース発酵によるシステインまたは３−ヒドロキシプロピオナートの生成に利用された。使用したパラメータは実施例１と同様であった、すなわち：１）３ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１のグルコース移入流量、２）０、０．１５および０．２５ｈ−１の可変増殖速度、３）１ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１以下の可変膜結合性トランスヒドロゲナーゼ流量（ｐｎｔＡＢ）；膜結合性トランスヒドロゲナーゼ流量の制限値は、文献（Ｈａｎｓｏｎ，１９７９；Ａｎｄｅｒｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｅｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）から決定した、４）５〜２２ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１に制限された維持流量。
ａ）グルコースの発酵によるシステインの生成の場合
【０１４３】
【表１０】
【０１４４】
ＮＡＤＰ＋還元能力について最適化されたＥ．コリの菌株によるシステインの生成の理論的最適収率（グルコース１ｍｏｌあたりのｍｏｌ）
本発明に従って最適化された菌株の理論的最適収率をさらに改善するために、さらなる修飾、たとえばｚｗｆ、ｇｎｄ、ｐｎｔＡ、ｐｎｔＢまたはｉｃｄでありうる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現および／またはｅｄｄ、ａｃｅＡ、ａｃｅＢまたはａｃｅＫでありうる少なくとも１つの遺伝子の欠失を実施できる。
【０１４５】
実際にそのような収率を得るために、本発明に従って最適化された菌株に対して、たとえば特許国際公開第０１／２７３０７号に述べられた遺伝子ｃｙｃＢを過剰発現させることによって、または欧州特許第０８８５９６２号に述べるような遺伝子ｃｙｃＥを修飾することによって、他の修飾を行う必要がある。
【０１４６】
ｂ）グルコースの発酵による３−ヒドロキシプロピオナートの生成の場合
３−ヒドロキシプロピオナートの生成は、３−ヒドロキシプロピオナート合成経路の酵素、たとえばＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのマロニル−ｃｏＡレダクターゼをコード化する遺伝子を含有するＥ．コリの菌株において実施した（Ｈｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００２，１８４：２４０４−２４１０）。
【０１４７】
【表１１】
【０１４８】
ＮＡＤＰ＋還元能力について最適化されたＥ．コリの菌株による３−ヒドロキシプロピオナートの生成の理論的最適収率（グルコース１ｍｏｌあたりのｍｏｌ）
本発明に従って最適化された菌株の理論的最適収率をさらに改善するために、さらなる修飾、たとえばｚｗｆ、ｇｎｄ、ｐｎｔＡ、ｐｎｔＢまたはｉｃｄでありうる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現および／またはｅｄｄ、ａｃｅＡ、ａｃｅＢまたはａｃｅＫでありうる少なくとも１つの遺伝子の欠失を実施できる。
【実施例１４】
【０１４９】
Ｓ．セレビシエにおける発酵プロセスでの理論的最適収率の計算；ヒドロコルチゾンの生成への応用
実施例１２は、ＭＥＴａｂｏｌｉｃ ＥＸｐｌｏｒｅｒ社によって開発されたモデルＭｅｔＯｐｔ（登録商標）が生物変換に利用可能であり、発酵などのバイオトランスフォーメーションにより一般的に利用可能なはずであることを示している。
【０１５０】
たとえばＭｅｔＯｐｔ（登録商標）−Ｓｃｅｒｅモデルは、本発明に従って最適化されたＳ．セレビシエの菌株でのグルコース発酵によるヒドロコルチゾンの生成に利用された。使用したパラメータは実施例１と同様であった、すなわち：１）３ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１のグルコース移入流量、２）０、０．１５および０．２５ｈ−１の可変増殖速度、３）２２ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１以下の維持流量、４）非可逆的であり、アセテート＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→アセトアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）の方向に設定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ反応（ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ６）、および５）ｕｄｈＡまたはｐｎｔＡ、Ｂに等しい活性なし。
【０１５１】
モデルは、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム区画化を考慮している。
【０１５２】
結果のこのような表現は、ＮＡＤＰＨ生成の改善への、そしてヒドロコルチゾン生成流量の改善への、本発明に従ってなされた各変異によってなされた真の寄与を証明している。
【０１５３】
ヒドロコルチゾンの生成は、ヒドロコルチゾン合成経路の酵素をコード化する遺伝子を含有するＳ．セレビシエの菌株において実現された（Ｓｚｃｚｅｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：１４３−１４９）。
【０１５４】
【表１２】
【０１５５】
ＮＡＤＰ＋還元能力について最適化されたＥ．コリの菌株によるヒドロコルチゾンの生成の理論的最適収率（グルコース１ｍｏｌあたりのｍｏｌ）
遺伝子ＰＦＫ１およびＰＦＫ２が欠失した菌株は、ヒドロコルチゾンを生成することができず、生存可能ですらない可能性がある。これは、ヒドロコルチゾンの生成がＮＡＤＰＨ要件によってよりも、炭素要求によってより制限されるためである。１つの解決策は、酵母におけるトランスヒドロゲナーゼタイプ活性の弱い発現を可能にすることである。しかしながらモデル化は、ＰＧＩＩ遺伝子が欠失されたときほどにはヒドロコルチゾン生成が高くならないことを示している。
【０１５６】
本発明に従って最適化された菌株の理論的最適収率をさらに改善するために、さらなる修飾、たとえばＺＷＦ、ＳＯＬ１、ＳＯＬ２、ＳＯＬ３、ＳＯＬ４、ＧＮＤ１、ＧＮＤ２、ＩＤＰ１、ＩＤＰ２またはＩＤＰ３でありうる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現および／またはＩＣＬ１またはＤＡＬ７でありうる少なくとも１つの遺伝子の欠失を実施できる。
【技術分野】
【０００１】
ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）は、その還元形のＮＡＤＰＨで、デヒドロゲナーゼまたはレダクターゼ活性を持つ酵素を含む細胞内酸化還元反応に関与している。
【０００２】
本発明は、ＮＡＤＰＨ消費生合成経路を用いた、バイオトランスフォーメーションによる物質の生成のために最適化された微生物菌株に関する。本発明による菌株は、ＮＡＤＰＨ消費バイオトランスフォーメーションプロセスで使用できる。本発明によって定義された菌株は、原核生物または真核生物でありうる。好ましい実施形態において、原核生物菌株は、エシェリキア・コリの菌株である。さらなる実施形態において、真核生物菌株は、サッカロミセス、特にＳ．セレビシエの菌株である。
【０００３】
本発明は、本発明によって最適化された菌株の適切な培地での増殖による、バイオトランスフォーメーションによる物質の調製のプロセスにも関し、最適化された菌株は、そのような物質の調製に必要な遺伝要素も含む。
【背景技術】
【０００４】
バイオトランスフォーメーションプロセスが開発されて、必要な物質の大量かつ低コストでの生産を可能にすると同時に、各種の工業および農業副生成物の有益な使用が可能となっている。
【０００５】
生体内バイオトランスフォーメーションによって興味のある物質を生成するための２つの主な手法がある。
１）物質が簡単な炭素源から微生物によって生成される、発酵（たとえば、グルコースの存在下でのＣ．グルタミカムの発酵によるリジンの生成について述べる、国際公開第０１／０２５４７号）。
２）微生物による、所与の補基質の興味のある物質への生物変換（たとえばＲ−ピペリジンの誘導体の生成について述べる、国際公開第００／１２７４５号、およびタガトースの生成について述べる、国際公開第００／６８３９７号）。補基質は同化されず、炭素源とは異なり、バイオマスおよび生物変換に必要なＮＡＤＰＨを生成するためのみに使用される。
【０００６】
バイオトランスフォーメーションプロセスの改良は、温度、酸素化、培地組成、回収プロセスなどの各種の因子に関係しうる。興味のある物質の生成および／または排出を増加するために、微生物を修飾することもできる。
【０００７】
たとえば発酵手法において、たとえば遺伝子調節を修飾することによって、または関与する酵素の特徴を変更するために遺伝子を修飾することによって、または補因子の再生を最適化することによって、生合成経路を改良できる。
【０００８】
生物変換手法において、副生成物の生成を削減することと、１つまたは複数の生物変換ステップに関与する補因子の再生を最適化することとが重要視されるであろう。
【０００９】
バイオトランスフォーメーションに関与する補因子のうちで、ＮＡＤＰＨはアミノ酸（たとえばアルギニン、プロリン、イソロイシン、メチオニン、リジン）、ビタミン（たとえばパントテン酸塩、フィロキノン、トコフェロール）、芳香族化合物（たとえば国際公開第９４／０１５６４号）、ポリオール（たとえばキシリトール）、ポリアミン（たとえばスペルミジン）、ヒドロキシエステル（たとえばエチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート）および他の高付加価値物質の生成で特に重要である。
【特許文献１】国際公開第０１／０２５４７号
【特許文献２】国際公開第００／１２７４５号
【特許文献３】国際公開第００／６８３９７号
【特許文献４】国際公開第９４／０１５６４号
【特許文献５】国際公開第０１／２７３０７号
【特許文献６】欧州特許第０８８５９６２号
【非特許文献１】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９
【非特許文献２】Ｄａｔｓｅｎｋｏ Ｋ．Ａ．，Ｗａｎｎｅｒ Ｂ．Ｌ．，Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７；６６４０−６６４５，２０００
【非特許文献３】Ｂａｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，３３２９−３３３０，１９９３
【非特許文献４】Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｄｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｏｒ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｙｅａｓｔ １０，１７９３−１８０８，１９９４
【非特許文献５】Ｂｒａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８Ｃ：ａ ｕｓｅｆｕｌ ｓｅｔ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｙｅａｓｔ．１４：１１５−３２，１９９８
【非特許文献６】Ｂｏｃａｎｅｇｒａ，Ｊ．Ａ．Ｓｃｒｕｔｔｏｎ，Ｎ．Ｓ．；Ｐｅｒｈａｍ，Ｒ．Ｎ．，Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：２７３７−２７４０，１９９３
【非特許文献７】Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＪＢ，Ｄｅｗｅｅｓｅ−Ｓｃｏｔｔ Ｃ，Ｆｅｄｏｒｏｖａ ＮＤ，Ｇｅｅｒ ＬＹ，Ｈｅ Ｓ，Ｈｕｒｗｉｔｚ ＤＩ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＪＤ，Ｊａｃｏｂｓ ＡＲ， Ｌａｎｃｚｙｃｋｉ ＣＪ， Ｌｉｅｂｅｒｔ ＣＡ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｍａｄｅｊ Ｔ，Ｍａｒｃｈｌｅｒ ＧＨ，Ｍａｚｕｍｄｅｒ Ｒ，Ｎｉｋｏｌｓｋａｙａ ＡＮ，Ｐａｎｃｈｅｎｋｏ ＡＲ，Ｒａｏ ＢＳ，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ＢＡ，Ｓｉｍｏｎｙａｎ Ｖ，Ｓｏｎｇ ＪＳ，Ｔｈｉｅｓｓｅｎ ＰＡ，Ｖａｓｕｄｅｖａｎ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ ＲＡ，Ｙｉｎ ＪＪ．Ｂｒｙａｎｔ ＳＨ．ＣＤＤ：ａ ｃｕｒａｔｅｄ Ｅｎｔｒｅｚ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：３８３−３８７，２００３
【非特許文献８】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３２；１２０−１２８，１９４６
【非特許文献９】Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２
【非特許文献１０】Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：８８−９６，１９９９
【非特許文献１１】Ｈｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８４：２４０４−２４１０，２００２
【非特許文献１２】Ｓｚｃｚｅｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：１４３−１４９，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＮＡＤＰＨ消費生合成経路を用いた物質の生成のために最適化された微生物の菌株に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
各バイオトランスフォーメーションのために微生物でのＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を最適化しようと努める代わりに、発明者らは異なるＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を得るために修飾微生物を生成することを選択し、次に修飾微生物を使用してＮＡＤＰＨ消費バイオトランスフォーメーションを実施した。
【００１２】
本発明により、微生物の菌株は、その種の少なくとも１つの微生物を含む同じ種の微生物のセットを意味すると見なされる。それゆえその菌株について説明された特徴は、その菌株の微生物それぞれに当てはまる。同様に、菌株の微生物のいずれか１つについて説明された特徴は、その菌株の微生物のセット全体に当てはまる。
【００１３】
本発明によって最適化された微生物は、細菌、酵母および糸状カビ、特に以下の種に属する細菌および酵母：アスペルギルス種、バチラス種、ブレビバクテリウム種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種、エシェリキア種、グルコノバクター種、ペニシリウム種、ピキア種、シュードモナス種、ロドコッカス種、サッカロミセス種、ストレプトミセス種、キサントモナス種、カンジダ種を含む。
【００１４】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比の最適化の原理をＥ．コリおよびＳ．セレビシエについて以下で説明する。同じ原理が好気性条件下で増殖したすべての微生物に同様に適用される。
【００１５】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比の最適化の原理は、ＮＡＤＰＨの酸化に関与する酵素活性を制限することおよび／またはＮＡＤＰ＋の還元を可能にする酵素活性に好都合であることに存する。ＮＡＤＰＨの酸化に関与する酵素活性は、これらの活性、特にキノンオキシドレダクターゼおよび／または可溶性トランスヒドロゲナーゼなどの活性を低下させること、特に不活性化することによって制限される。ＮＡＤＰ＋の還元に好都合である酵素活性は、ペントースホスフェートサイクルを介して炭素流量を設定することによって、および／または少なくとも１つの酵素の補因子特異性を修飾することによって向上するので、通常の補因子であるＮＡＤに優先してＮＡＤＰを使用する。
【００１６】
本発明によって最適化された菌株は、分子生物学方法によって得られる。当業者には、微生物の遺伝的形質を修飾するのに使用されるプロトコルが公知である。これらの方法は、当業者によって記録され、ただちに実施できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）。
【００１７】
酵素活性を制限するために使用する方法は、それを発現する遺伝子を、適切な方法によって、たとえば関与する遺伝子のコード化部分において１つ以上の変異を引き起こすことによって、またはプロモータ領域を修飾することによって、特に遺伝子発現を低減する配列と置換することによって修飾することに存する。
【００１８】
酵素を不活性化するために使用する方法は、その発現が防止されるように（たとえばその発現に必要なプロモータ領域の一部または全部を欠失させる）、または発現生成物がその機能を失うように（たとえば関与する遺伝子のコード化部分における欠失によって）、関与する遺伝子の発現の生成物を適切な方法によって不活性化すること、または関与する遺伝子の発現を阻害すること、または関与する遺伝子の少なくとも一部を欠失させることに存する。
【００１９】
好ましくは、遺伝子の欠失は、その遺伝子の除去、および必要ならば、本発明によって最適化された菌株の同定、単離および精製を促進するための選択マーカー遺伝子によるその置換を含む。
【００２０】
Ｅ．コリ内の遺伝子の不活性化は好ましくは、相同組換えによって実施される（Ｄａｔｓｅｎｋｏ Ｋ．Ａ．，Ｗａｎｎｅｒ Ｂ．Ｌ．（２０００）Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７；６６４０−６６４５）。プロトコルの原理は、簡潔には以下の通りである：直鎖状断片であって、その遺伝子に隣接する２つの領域と、これらの２つの領域間に位置する少なくとも１つの選択遺伝子（一般に抗生物質抵抗性遺伝子）とを含む、試験管内で得られた直鎖状断片を細胞内に導入する。それゆえこの断片は不活性化遺伝子を含有する。組換え事象を受け、導入断片が組込まれた細胞は次に、選択培地にプレーティングすることによって選択される。野生遺伝子が不活性化遺伝子によって置換された、二重組換え事象を受けた細胞が次に選択される。このプロトコルは、二重組換え事象の検出を速めるために、ポジティブおよびネガティブ選択システムを使用することによって改良される。
【００２１】
Ｓ．セレビシエ内の遺伝子の不活性化も、相同組換えによって優先的に実施される（Ｂａｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，３３２９−３３３０，１９９３；Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ １０，１７９３−１８０８，１９９４；Ｂｒａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ．１４：１１５−３２，１９９８）。
【００２２】
酵素活性に好都合なプロセスは、関与する遺伝子の発現の生成物を、適切な手段によって、たとえばアロステリックエフェクタに対するその感度を低下させることによって、または生成される酵素の量を増大させるために遺伝子の発現を上昇させることによって、安定化することを含む。
【００２３】
遺伝子の過剰発現は、その遺伝子のプロモータをインサイチュで強力なまたは誘導性のプロモータと置換することによって実現できる。あるいは、複製プラスミド（１個または複数のコピー）を、遺伝子が過剰発現される細胞中に、適切なプロモータの制御下で導入する。エシェリキア・コリの修飾の場合、たとえばプロモータＰｌａｃ−ｏ、Ｐｔｒｃ−ｏ、およびｐｔａｃ−ｏ、すなわちそれらを構成型にするためにｌａｃオペレータ（ｌａｃＯ）が欠失された３つの強力な細菌プロモータを使用することができる。サッカロミセス・セレビシエの修飾の場合、たとえばプロモータＰｐｇｋ、Ｐａｄｈ１、Ｐｇａｌ１、Ｐｇａｌ１０を使用することができる。
【００２４】
ＮＡＤに優先してＮＡＤＰを使用するように酵素の補因子特異性を修飾するために使用できるプロセスは、酵素の発現を可能にする遺伝子の配列を修飾することを含む（Ｂｏｃａｎｇｒａ，Ｊ．Ａ．Ｓｃｒｕｔｔｏｎ，Ｎ．Ｓ．；Ｐｅｒｈａｍ，Ｒ．Ｎ．（１９９３）Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：２７３７−２７４０）。
【００２５】
本発明によって最適化された（すなわちＮＡＤＰ＋還元に関して向上した能力を備えた）菌株は、１つ以上のＮＡＤＰＨ酸化酵素活性、特にキノンオキシドレダクターゼおよび／または可溶性トランスヒドロゲナーゼ型の活性の減弱または不活性化を特徴とする。
【００２６】
以下にＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性および遺伝子のある非制限的な例を挙げる。
【００２７】
【表１】
【００２８】
本発明によって最適化された（すなわちＮＡＤＰ＋還元について向上した能力を備えた）菌株は、１つ以上のＮＡＤＰ＋還元酵素活性に好都合である修飾、特にペントースホスフェート経路を介した炭素流量を設定する修飾、および／またはその通常の補因子であるＮＡＤに優先してＮＡＤＰを利用するようにする、少なくとも１つの酵素の補因子特異性に関する修飾も含む。
【００２９】
本発明によって最適化された（すなわちＮＡＤＰ＋還元について向上した能力を備えた）菌株における、１つ以上のＮＡＤＰ＋還元酵素活性に好都合である修飾を受けやすい活性を以下に挙げる。
【００３０】
【表２】
【００３１】
本発明による最適化菌株における修飾を受けやすい酵素活性は主に、Ｅ．コリまたはＳ．セレビシエ中のタンパク質または遺伝子の種類を使用して定義される。しかしながら、この用法は本発明に従いより一般的な意味を有し、他の微生物における対応する酵素活性をカバーする。Ｅ．コリまたはＳ．セレビシエ中のタンパク質および遺伝子の配列を使用して、当業者はＥ．コリまたはＳ．セレビシエ以外の微生物中の同等の遺伝子を同定することができる。
【００３２】
相同配列および相同性のそのパーセンテージを同定する手段は当業者に周知であり、特にデフォルトパラメータが示されたウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から使用できる、ＢＬＡＳＴプログラムを含む。得られた配列は次に、たとえばＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラム（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）またはＭＵＬＴＡＬＩＮプログラム（http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl）を使用して、それらのウェブサイトに示されたデフォルトパラメータで利用（たとえば配列比較）することができる。
【００３３】
あるいは、ＣＤ−Ｓｅａｒｃｈプログラム（http://www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）を使用して、Ｅ．コリまたはＳ．セレビシエのタンパク質配列中の保存ドメインを同定して、同じ１つまたは複数のドメインを示す他の微生物の配列を探索することができる。保存ドメインは、ＰＦＡＭまたはＣＯＧ型のデータを集めたＣＤＤデータベースに記録されている（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ；Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＪＢ，ＤｅＷｅｅｓｅ−Ｓｃｏｔｔ Ｃ，Ｆｅｄｏｒｏｖａ ＮＤ，Ｇｅｅｒ ＬＹ，Ｈｅ Ｓ，Ｈｕｒｗｉｔｚ ＤＩ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＪＤ，Ｊａｃｏｂｓ ＡＲ， Ｌａｎｃｚｙｃｋｉ ＣＪ， Ｌｉｅｂｅｒｔ ＣＡ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｍａｄｅｊ Ｔ，Ｍａｒｃｈｌｅｒ ＧＨ，Ｍａｚｕｍｄｅｒ Ｒ，Ｎｉｋｏｌｓｋａｙａ ＡＮ，Ｐａｎｃｈｅｎｋｏ ＡＲ，Ｒａｏ ＢＳ，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ＢＡ，Ｓｉｍｏｎｙａｎ Ｖ，Ｓｏｎｇ ＪＳ，Ｔｈｉｅｓｓｅｎ ＰＡ，Ｖａｓｕｄｅｖａｎ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ ＲＡ，Ｙｉｎ ＪＪ，Ｂｒｙａｎｔ ＳＨ．ＣＤＤ：ａ ｃｕｒａｔｅｄ Ｅｎｔｒｅｚ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：３８３−３８７（２００３））。
【００３４】
ＰＦＡＭ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＦＡＭｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ（配列比較および隠れマルコフモデルのタンパク質ファミリーデータベース）；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列の配列比較の大規模なコレクションである。各ＰＦＡＭは、複数の配列比較を描出して、タンパク質ドメインを調査し、生物間での分布を評価して、他のデータベースにアクセスし、既知のタンパク質構造を描出することを可能にする。
【００３５】
ＣＯＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（タンパク質のオルソロガスグループのクラスタ）；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）は、３０個の主要な系統発生系を表す４３個の完全に配列決定されたゲノムからのタンパク質配列を比較することによって得られる。各ＣＯＧは少なくとも３つの系統から定義され、それゆえ古代の保存ドメインを同定することを可能にする。
【００３６】
これらの各種の方法から同定されたコンセンサス配列より、縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計して、別の微生物中の相当する遺伝子をクローニングすることが可能である。これらの慣用的な分子生物学方法は、当業者に周知であり、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）で述べられている。
【００３７】
【表３】
【００３８】
【表４】
【００３９】
本発明によって最適化された（すなわちＮＡＤＰ＋還元について向上した能力を備えた）菌株は、ＮＡＤＰＨ酸化活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子の欠失、特にキノンオキシドレダクターゼをコード化する遺伝子（たとえばｑｏｒ、ＺＴＡ１）および／または可溶性トランスヒドロゲナーゼ活性をコード化する遺伝子（たとえばｕｄｈＡ）の欠失を特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、ｕｄｈＡおよびｑｏｒ遺伝子はどちらも欠失される。
【００４１】
本発明の特定の実施形態において、本発明により最適化された菌株は、ホスホグルコースイソメラーゼ活性（たとえばｐｇｉ，ＰＧＩ１）および／またはホスホフルクトキナーゼ活性（たとえばｐｆｋＡ、ＰＦＫ１）をコード化する１つまたは複数の遺伝子の欠失も特徴とする。
【００４２】
本発明のさらなる特定の実施形態において、本発明により最適化された菌株は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（たとえばｌｐｄ、ＬＰＤ１）および／またはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（たとえばｇａｐＡ、ＴＤＨ１）活性をコード化する１つまたは複数の遺伝子の修飾も特徴とし、その修飾は、酵素にその通常の補因子であるＮＡＤよりもＮＡＤＰを優先させることに存する。
【００４３】
ホスホグルコースイソメラーゼおよび／またはホスホフルクトキナーゼ活性をコード化する遺伝子の欠失を特徴とする本発明の菌株は特に、バイオトランスフォーメーションプロセスに十分に適合している。
【００４４】
本発明によって最適化された微生物中で利用可能なＮＡＤＰＨの量を増加させるためには、以下の酵素活性：グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（たとえばｚｗｆ、ＺＷＦ１）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（たとえばＳＯＬ１）、６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ（たとえばｇｎｄ、ＧＮＤ１）、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（たとえばｉｃｄ、ＩＤＰ１）および膜結合性トランスヒドロゲナーゼ（たとえばｐｎｔＡ）の１つをコード化する少なくとも１つの遺伝子を過剰発現させること、および／または以下の酵素活性：ホスホグルコナートデヒドラターゼ（たとえばｅｄｄ）、マレートシンターゼ（たとえばａｃｅＢ、ＤＡＬ７）、イソシトレートリアーゼ（たとえばａｃｅＡ、ＩＣＬ１）およびイソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼ（たとえばａｃｅＫ）の少なくとも１つをコード化する少なくとも１つの遺伝子を欠失することが好都合であり得る。
【００４５】
本発明のさらなる目的は、上記および下記で定義するようなＮＡＤＰＨの生成のために最適化された微生物であり、該微生物は、興味のある物質のバイオトランスフォーメーションに関与する酵素活性をコード化する１つまたは複数の遺伝子および１つまたは複数の選択マーカー遺伝子も含有する。
【００４６】
これらの遺伝子は、本発明によって最適化された菌株に固有であるか、または微生物のゲノムへの組込み、または複製ベクターのどちらかにより、適切なベクターを使用する変換によって、本発明によって最適化された菌株に導入することが可能であり、該適切なベクターは、興味のある適切な物質のバイオトランスフォーメーションに関与する適切な酵素をコード化する１つまたは複数の遺伝子および／または適切な選択マーカーを有する。
【００４７】
これらの遺伝子は、興味のある物質のバイオトランスフォーメーションに関与する酵素および／または選択マーカーをコード化する核酸配列を含み、該コード化配列は、バイオトランスフォーメーションのために選択された原核および／または真核細胞内で有効なプロモータ配列と融合される。ベクター（またはプラスミド）は、Ｅ．コリと別の微生物との間のシャトルベクターでありうる。
【００４８】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比について最適化された菌株の選択は、バイオトランスフォーメーション（発酵または生物変換）の種類、考慮される生物変換経路におけるＮＡＤＰＨに対する総要求、１つまたは複数の炭素源の性質、バイオマス流量要求などに従って決定される。
【００４９】
解糖とペントースホスフェート経路との間の炭素流量の分布を制御できない場合に、ホスホグルコースイソメラーゼおよび／またはホスホフルクトキナーゼ活性をコード化する遺伝子の欠失が必要となるであろう。ホスホグルコースイソメラーゼをコード化する遺伝子の欠失は発酵に、またはＮＡＤＰＨへの要求が移入グルコース１モル当たりＮＡＤＰ＋２モルの最小還元流量を必要とするときに好ましい。ホスホフルクトキナーゼをコード化する遺伝子の欠失は、生物変換に、またはＮＡＤＰＨへの要求が移入グルコース１モル当たりＮＡＤＰ＋３〜４モルの最小還元流量を必要とするときに、優先的に選択されるであろう。上記および下記で説明するように、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼおよび／またはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子の修飾は、バイオトランスフォーメーションが移入グルコース１モル当たりＮＡＤＰ＋３モルを超える最小還元流量を必要とするときに、特に菌株Ｅ．コリΔ（ｕｄｈＡ、ｑｏｒ）またはＥ．コリΔ（ｕｄｈＡ、ｑｏｒ、ｐｇｉ）またはＥ．コリΔ（ｕｄｈＡ、ｑｏｒ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ）を最適化するために実施されるであろう。他の提示された修飾、すなわち以下の酵素活性：グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼおよび膜トランスヒドロゲナーゼの１つをコード化する少なくとも１つの遺伝子の過剰発現、および／または以下の酵素活性：６−ホスホグルコナートデヒドラターゼ、マレートシンターゼ、イソシトレートリアーゼまたはイソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼの１つをコード化する少なくとも１つの遺伝子の欠失は、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比の最適化を、考慮されている細胞およびバイオトランスフォーメーションプロセスの要求に合せて微調整するために実施することができる。
【００５０】
本発明は、それらがＮＡＤＰを優先的に使用するための、キノンオキシドレダクターゼまたは可溶性トランスヒドロゲナーゼ活性をコード化する遺伝子の欠失によって、おそらくグルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼまたは６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性をコード化する遺伝子の欠失によって、および／またはＮＡＤ酵素、特にジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼまたはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコード化する少なくとも１つの遺伝子の修飾によって、そして必要ならば、６−ホスホグルコナートデヒドラターゼ、マレートシンターゼ、イソシトレートリアーゼまたはイソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼをコード化する少なくとも１つの遺伝子の欠失によって特徴付けられ（該欠失および修飾は、適切な手段によって実施される）、および／または過剰発現を可能にする適切なベクターを使用して菌株を修飾すること、または過剰発現させる遺伝子を制御する内在性プロモータの強度を変更することのどちらかによる、以下の活性：グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼまたは膜トランスヒドロゲナーゼをコード化する少なくとも１つの遺伝子の過剰発現によって特徴付けられる、上記および下記で定義するように本発明に従って最適化された菌株を調製する手順にも関する。
【００５１】
本発明の特定の実施形態において、本発明による菌株を調製するプロセスは、興味のある物質のバイオトランスフォーメーションに関与する１つ以上の酵素をコード化する１つ以上の遺伝子、および１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む、少なくとも１つの適切なベクターを用いた最適化菌株の変換も含む。
【００５２】
本発明のさらなる目的は、ＮＡＤＰＨ依存性バイオトランスフォーメーションのために本発明に従って最適化されたこれらの菌株の使用と、それによりＮＡＤＰＨについて最適化されていない菌株と比較して改善したバイオトランスフォーメーション収率を得ることに関する。
【００５３】
バイオトランスフォーメーションは、ＮＡＤＰＨ依存性反応を触媒する酵素活性をコード化する遺伝子が発現される、本発明に従って定義された菌株を使用して実施される。当業者は、そのような酵素を容易に同定できる。それらは特に以下を含む：ＥＣ １．１．１．１０ Ｌ−キシルロースレダクターゼ、ＥＣ １．１．１．２１ メチルグリオキサルレダクターゼ、ＥＣ １．１．１．５１ ３（または１７）β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．５４ アリルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．８０ イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．１３４ ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−タロース４−デヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．１４９ ２０α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．１５１ ２１−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．１８９ プロスタグランジン−Ｅ２ ９−レダクターゼ、ＥＣ １．１．１．１９１ インドール−３−アセトアルデヒドレダクターゼ、ＥＣ １．１．１．２０７ （−）−メントールデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１．１．２３４ フラバノン４−レダクターゼ、ＥＣ １．２．１．５０ 長鎖脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ、ＥＣ １．３．１．４ コルチゾンα−レダクターゼ、ＥＣ １．３．１．２３ コレステノン５β−レダクターゼ、ＥＣ １．３．１．７０ Δ１４−ステロールレダクターゼ、ＥＣ １．４．１．１２ ２，４−ジアミノペンタノアートデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．５．１．１０ サッカロピンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタメート形成、ＥＣ １．７．１．６ アゾベンゼンレダクターゼ、ＥＣ １．８．１．５ ２−オキソプロピル−ＣｏＭレダクターゼ（カルボキシル化）、ＥＣ １．１０．１．１ トランス−アセナフテン−１，２−ジオールデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．１４．１３．７ フェノール２−モノオキシゲナーゼ、ＥＣ １．１４．１３．１２ ベンゾアート４−モノ−オキシゲナーゼ、ＥＣ １．１４．１３．２６ ホスファチジルコリン１２−モノオキシゲナーゼ、ＥＣ １．１４．１３．６４ ４−ヒドロキシベンゾアート １−ヒドロキシラーゼ、ＥＣ １．１４．１３．７０ ステロール１４−デメチラーゼ、ＥＣ １．１６．１．５ アクアコバラミンレダクターゼ、ＥＣ １．１７．１．１ ＣＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシグルコースレダクターゼ、ＥＣ １．１８．１．２ フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ。
【００５４】
本発明は、以下のステップを含むことを特徴とする、少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存反応を含む生合成経路によって形成される興味のある物質を生成するプロセスにも関する。
ａ）その増殖に好都合であり、ＮＡＤＰＨを除いて、発酵または生物変換によるバイオトランスフォーメーションを実施するために必要な物質を含有する適切な培養培地における、本発明に従って最適化された微生物の培養での増殖。
ｂ）培地からの興味のある物質の抽出および必要ならばその精製。
【００５５】
好ましくは興味のある物質は、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、脂肪酸、有機酸、ポリオール、またはヒドロキシエステルでありうる。アミノ酸およびその前駆物質は特に、リジン、メチオニン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、ホモセリン、イソロイシン、およびバリンを含む。ビタミンおよびその前駆物質は特に、パントアート、トランス−ニューロスポレン、フィロキノンおよびトコフェロールを含む。ステロールは特に、スクアレン、コレステロール、テストステロン、プロゲステロンおよびコルチゾンを含む。フラボノイドは特に、フランビノンおよびベスチトンを含む。有機酸はクマリン酸および３−ヒドロキシプロピオン酸を含む。ポリオールは、ソルビトール、キシリトールおよびグリセロールを含む。ヒドロキシエステルは、エチル−３−ヒドロキシブチラートおよびエチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートを含む。
【００５６】
生物変換の場合、プロセスは、変換される基質の適切な培養培地への添加も含む。
【００５７】
上述の本発明によるプロセスのステップｂ）で挙げた培養培地は、各種の同化可能な糖、たとえばグルコース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、糖蜜、またはこれらの糖の副生成物のいずれかであり得る少なくとも１つの同化可能な炭水化物を含有する。特に好ましい単純な炭素源はグルコースである。別の好ましい単純な炭素源はスクロースである。培養培地は、微生物の増殖および／または興味のある物質の生成に好都合な１つ以上の物質（たとえばアミノ酸、ビタミンまたは無機塩）も含有し得る。特にＥ．コリの無機培地はそれゆえ、Ｍ９培地（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９４６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３２：１２０−１２８）、Ｍ６３培地（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２；Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）またはＳｃｈａｅｆｅｒら（１９９９，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：８８−９６）によって述べられるような培地と同じまたは類似の組成を有することができる。
【００５８】
バイオトランスフォーメーションの条件は、当業者によって設定される。特に微生物は、Ｓ．セレビシエでは２０℃〜５５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、好ましくは約３０℃の温度にて、Ｅ．コリでは約３７℃にて発酵させる。
【００５９】
以下の実施例は、例示のためのみであり、本発明の実施形態または範囲を決して限定しない。
【実施例１】
【００６０】
エチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換での理論的最適収率の計算
ａ）Ｅ．コリによる生物変換
ＭＥＴａｂｏｌｉｃ ＥＸｐｌｏｒｅｒ社が開発した化学量論モデルであるアルゴリズムＭｅｔＯｐｔ（登録商標）−Ｃｏｌｉを使用して予測モデル化を実施し、それを用いると１）エチルアセトアセテートからのエチル−３−ヒドロキシブチラートの最大生成収率と、２）細胞が増殖して、最大生物変換収率に達するために必要な増殖および酸化還元平衡への要求を満足する、グルコースからの最良の流量分布を決定することが可能であった。
【００６１】
モデル変数の具体的な設定は、１）３ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１のグルコース移入流量、２）０、０．１５および０．２５ｈ−１の可変増殖速度、３）１ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１以下の可変膜結合性トランスヒドロゲナーゼ流量（ｐｎｔＡＢ）；膜結合性トランスヒドロゲナーゼ流量の制限値は、文献（Ｈａｎｓｏｎ，１９７９；Ａｎｄｅｒｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｅｍｍｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）から決定した、４）５〜２２ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１に制限された維持流量であった。
【００６２】
すべての場合において、モデルはｕｄｈＡおよびｑｏｒ遺伝子の欠失を示唆した。しかしながら、実際にはペントースホスフェート経路と解糖との間の炭素流量の適切な分布を維持することが困難であり、この分布は増殖速度に従って変化するので、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］は、理論的最適収率に等しい収率を与えない。実際に、したがって菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）］または[Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）］が好ましく、その間の選択は生物変換プロセス中の菌株の増殖速度に依存する。
【００６３】
エチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換の理論的最適収率は、本発明に従って最適化されたＥ．コリの各種の菌株について計算した。
【００６４】
【表５】
【００６５】
ＮＡＤＰ＋還元能力について最適化されたＥ．コリの菌株によるエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換の理論的最適収率（グルコース１ｍｏｌ当たりのｍｏｌ）
本発明に従って最適化された菌株の理論的最適収率をさらに改善するために、さらなる修飾、たとえばｚｗｆ、ｇｎｄ、ｐｎｔＡ、ｐｎｔＢまたはｉｃｄでありうる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現および／またはｅｄｄ、ａｃｅＡ、ａｃｅＢまたはａｃｅＫでありうる少なくとも１つの遺伝子の欠失を実施できる。
【００６６】
ｂ）Ｓ．セレビシエによる生物変換
ＭＥＴａｂｏｌｉｃ ＥＸｐｌｏｒｅｒ社が開発した化学量論モデルであるアルゴリズムＭｅｔＯｐｔ（登録商標）−Ｓｃｅｒｅを使用して予測モデル化を実施し、それを用いると１）エチルアセトアセテートからのエチル−３−ヒドロキシブチラートの最大生成収率と、２）細胞が増殖して、最大生物変換収率に達するために必要な増殖および酸化還元平衡への要求を満足する、グルコースからの最良の流量分布を決定することが可能であった。
【００６７】
モデル変数の具体的な設定は、１）３ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１のグルコース移入流量、２）０、０．１５および０．２５ｈ−１の可変増殖速度、３）２２ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１以下の維持流量、４）非可逆的であり、アセテート＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→アセトアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）の方向に設定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ反応（ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ６）、および５）ｕｄｈＡまたはｐｎｔＡ、Ｂに等しい活性なしであった。
【００６８】
モデルは、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム区画化を考慮した。
【００６９】
すべての場合において、モデルは、ＮＡＤＰＨを酸化する酵素をコード化する遺伝子、特に遺伝子ＺＴＡ１の欠失を示唆した。しかしながら実際には、ペントースホスフェート経路と解糖との間の炭素流量の適切な分布を維持することが困難であり、この分布は増殖速度と共に変化するので、菌株Ｓ．セレビシエ［ΔＺＴＡ１］は理論的最適収率に等しい収率を与えない。実際に菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＦＫ１，ＰＦＫ２）］または［Δ（ＺＴＡ１，ＰＧＩ１）］を使用することが好ましく、それらの間の選択は生物変換プロセス中の菌株の増殖速度に依存する。
【００７０】
エチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換の理論的最適収率は、本発明に従って最適化されたＳ．セレビシエの各種の菌株について計算した。
【００７１】
【表６】
【００７２】
ＮＡＤＰ＋還元能力について最適化されたＳ．セレビシエの菌株によるエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換の理論的最適収率（グルコース１ｍｏｌ当たりのｍｏｌ）
本発明に従って最適化された菌株の理論的最適収率をさらに改善するために、さらなる修飾、たとえばＺＷＦ、ＳＯＬ１、ＳＯＬ２、ＳＯＬ３、ＳＯＬ４、ＧＮＤ１、ＧＮＤ２、ＩＤＰ１、ＩＤＰ２またはＩＤＰ３でありうる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現および／またはＩＣＬ１またはＤＡＬ７でありうる少なくとも１つの遺伝子の欠失を実施できる。
【実施例２】
【００７３】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］の作成
ｕｄｈＡ遺伝子の不活性化は、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｒａｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７：６６４０−６６４５）によって述べられた方法を使用して、相同組換えによって実施した。
【００７４】
本方法は、抗生物質（クロラムフェニコール）耐性カセットを挿入すると同時に、関与する遺伝子の大半を欠失させることに存する。このために、それぞれ１００ｐｂより成るヌクレオチド対を合成し、そのうち８０ｂｐ（小文字）は欠失される遺伝子（たとえばｕｄｈＡ）と相同性であり、２０ｂｐ（大文字）はクロラムフェニコール耐性カセットと相同性であった。
DudhAF
ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG
DudhAR
CccagaatctcttttgtttcccgatggaacaaaattttcagcgtgcccacgttcatgccgacgatttgtgcgcgtgccagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
【００７５】
プラスミドｐＫＤ３が保有する抗生物質カセットは、オリゴヌクレオチドＤｕｄｈＡＦおよびＤｕｄｈＡＲを使用してＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲ生成物を次に、相同組換えを触媒する酵素であるＲｅｄリコンビナーゼをコード化する遺伝子を保有する菌株Ｅ．コリ［ｐＫＤ４６］に電気穿孔によって導入した。次にクロラムフェニコール耐性形質変換体を選択して、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドＵｄｈＡＦおよびＵｄｈＡＲを使用してＰＣＲ解析によってチェックした。
UdhaF
Ggccgctcaggatatagccagataaatgac
UdhaR
Gcgggatcactttactgccagcgctggctg
【００７６】
次にクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。これを行うために、クロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを保有するプラスミドｐＣＰ２０を電気穿孔によって組換え菌株に導入した。４２℃での一連の培養の後、抗生物質耐性カセットの消失を、オリゴヌクレオチドＵｄｈＡＦおよびＵｄｈＡＲを使用してＰＣＲ解析によってチェックした。
【００７７】
遺伝子ｑｏｒの不活性化は、以下のオリゴヌクレオチドを使用して同じ方法によって実施した。
DqorF
ggtggcccggaagtacttcaagccgtagagttcactcctgccgatccggcggagaatgaaatccaggtcgaaaataaagcCATATGAATATCCTCCTTAG
DqorR
cgcccggctttccagaatctcatgcgcacgctgcgcatccttcagcggatatttctgctgctcggcgacatcgaccttaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
QorF
Cgcccaacaccgactgctccgcttcgatcg
QorR
cagcgttatgaccgctggcgttactaaggg
【００７８】
実際的な理由で、２つの遺伝子を同時に欠失させることは有用であり得る。これを行うために、各遺伝子を異なる抗生物質耐性カセット（たとえばｕｄｈＡではクロラムフェニコール、ｑｏｒではカナマイシン）によって置換した。
【００７９】
得られた菌株は、Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］であった。
【実施例３】
【００８０】
プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐの作成、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］への導入およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの変換
プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡは、プロモータｇａｐＡのベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（ｐＳＫ）への挿入によって作成した。これを行うために、Ｅ．コリのプロモータｇａｐＡを、染色体ＤＮＡからポリメラーゼＰｗｏを用いて増幅した。
【００８１】
得られたＰＣＲ生成物を次に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって消化して、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって消化して脱リン酸化したベクターｐＳＫに連結して、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡを得た。ベクターｐＳＫは、Ｅ．コリの複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を保有していた。
【００８２】
作成の検証のために、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡを次に菌株Ｅ．コリＤＨ５αに導入した。次にオリゴヌクレオチドユニバーサルＭ１３フォワードを用いて、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡのプロモータｇａｐＡの配列決定を実施して、作成を確認した。
【００８３】
プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐは、遺伝子ＧＲＥ２ｐのプラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡへの挿入によって作成した。これを行うために、サッカロミセス・セレビシエの遺伝子ＧＲＥ２ｐを、染色体ＤＮＡから、ポリメラーゼＰｗｏを用いて以下のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した。
Ome119_GRE2F (NdeI)
Acgtacgtggcatatgtcagttttcgtttcaggtgctaacggg
Ome120_GRE2R (PstI)
Acgtacctgcagttatattctgccctcaaattttaaaatttggg
【００８４】
得られたＰＣＲ生成物を次に、制限酵素ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩによって消化して、制限酵素ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩによって消化して脱リン酸化したベクターｐＳＫ−ＰｇａｐＡに連結して、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを得た。プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡは、Ｅ．コリの複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を保有していた。
【００８５】
作成の検証のために、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを次に菌株Ｅ．コリＤＨ５αに導入した。次にオリゴヌクレオチドユニバーサルＭ１３リバースおよびユニバーサルＭ１３フォワードを用いて、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐの遺伝子ＧＲＥ２ｐの配列決定を実施して、作成を確認した。
【００８６】
検証されたプラスミドは、電気穿孔によって菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］（実施例２）に導入した。
【００８７】
得られた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。Ｅ．コリ［ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の菌株を同じ条件で増殖させた。
【００８８】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【００８９】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることが見出された。
【実施例４】
【００９０】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
実施例２で述べた方法および以下のオリゴヌクレオチドを使用して、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］（実施例２）における遺伝子ｐｇｉの不活性化を実施した。
DpgiF
ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DpgiR
gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG
pgiF
gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc
pgiR
cggtatgatttccgttaaattacagacaag
【００９１】
作成は富栄養培地（たとえばＬＢ）で実施した。プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを次に、得られた菌株（実施例３）中に電気穿孔によって導入して、生じた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］を富栄養培地上で選択した。
【００９２】
得られた菌株を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。Ｅ．コリ［ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の菌株を同じ条件で増殖させた。
【００９３】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【００９４】
発明者らは、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【００９５】
【表７】
【実施例５】
【００９６】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｅｄｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
実施例２で述べた方法および以下のオリゴヌクレオチドを使用して、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）］（実施例４）における遺伝子ｅｄｄの不活性化を実施した。
DeddF (1932582-1932499)
CgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgttcatcgttcgcagttggcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DeddR (1930866-1930943)
cgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcccacgcgtgacgcgctcaggtcaggaatgtgcggttcgcgagcagccCATATGAATATCCTCCTTAG
EddF (1932996-1932968)
Gggtagactccattactgaggcgtgggcg
EddR (1930439-1930462)
Ccccggaatcagaggaatagtccc
【００９７】
作成は富栄養培地（たとえばＬＢ）で実施した。プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを次に、得られた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｅｄｄ）］（実施例３）中に電気穿孔によって導入して、生じた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｅｄｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］を富栄養培地上で選択した。
【００９８】
得られた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｅｄｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。Ｅ．コリ［ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の菌株を同じ条件で増殖させた。
【００９９】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１００】
発明者らは、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｅｄｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【実施例６】
【０１０１】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
実施例２で述べた方法および以下のオリゴヌクレオチドを使用して、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ）］（実施例２）における遺伝子ｐｆｋＡおよびｐｆｋＢの不活性化を実施した。
DpfkAF
ggt gtg ttg aca agc ggc ggt gat gcg cca ggc atg aac gcc gca att cgc ggg gtt gtt cgt tct gcg ctg aca gaa ggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DpfkAR
Ttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgcttcatgttttcgatagcgtcgatgatgtcgtggtgaaccagctgcatatgaatatcctccttag
PfkAF
Cgcacgcggcagtcagggccgacccgc
PfkAR
ccctacgccccacttgttcatcgcccg
DpfkBF (1804421-1804499)
gcgccctctctcgatagcgcaacaattaccccgcaaatttatcccgaaggaaaactgcgctgtaccgcaccggtgttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
DpfkBR (1805320-1805241)
gcgggaaaggtaagcgtaaattttttgcgtatcgtcatgggagcacagacgtgttccctgattgagtgtggctgcactccCATATGAATATCCTCCTTAG
PfkBF (1803996-1804025)
tggcaggatcatccatgacagtaaaaacgg
PfkBR (1805657-1805632)
gccggttgcactttgggtaagccccg
【０１０２】
作成は富栄養培地（たとえばＬＢ）で実施した。プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを次に、得られた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）］（実施例３）中に電気穿孔によって導入して、生じた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］を富栄養培地上で選択した。
【０１０３】
得られた菌株［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］は次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。Ｅ．コリ［ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の菌株を同じ条件で増殖させた。
【０１０４】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１０５】
発明者らは、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【０１０６】
【表８】
【実施例７】
【０１０７】
菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）ｐｌｐｄ＊，ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
多酵素複合体ピルビン酸デヒドロゲナーゼに関与するＮＡＤ依存性ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子ｌｐｄを、初期菌株が野生菌株の代わりに実施例４で述べた菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ）］であることを除いて、実施例２で述べた方法を使用して欠失させた。修飾菌株の作成および選択は、富栄養培地（たとえばＬＢ）で実施した。得られた菌株はＥ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）］であった。
【０１０８】
加えて、ＮＡＤＰ依存性ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼの過剰発現を可能にする、プラスミドｐ−ｌｐｄ＊を作成した。酵素の補因子特異性を修飾する各種の考えられる方法がある。たとえばＢｏｃａｎｅｇｒａら（１９９３）は、ＮＡＤＰ依存性ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼを作成する方法を報告している。
【０１０９】
プラスミドｐ−ｌｐｄ＊およびｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐを次に、電気穿孔によって菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）］に導入した。あるいはｌｐｄ＊をｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐにクローニングして、プラスミドｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ−ｌｐｄ＊を得て、次に電気穿孔によって菌株Ｅ．コリ［（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）］に導入した。修飾菌株の作成および選択は、富栄養培地（たとえばＬＢ）で実施した。
【０１１０】
得られた菌株Ｅ．コリ［（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ，ｐ−ｌｐｄ＊）］を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。Ｅ．コリ［ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ］の菌株を同じ条件で増殖させた。
【０１１１】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１１２】
発明者らは、菌株Ｅ．コリ［Δ（ｕｄｈＡ，ｑｏｒ，ｐｇｉ，ｌｐｄ）ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ＧＲＥ２ｐ，ｐ−ｌｐｄ＊）］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【実施例８】
【０１１３】
プラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐの作成
プラスミドｐＹＧＫは、ベクターｐＹＰＧ２のプロモータＰｐｇｋ、マルチクローニング部位およびターミネータｃｙｃ１の、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（ｐＳＫ）への挿入によって作成した。これを行うために、プロモータＰｐｇｋ、マルチクローニング部位、およびターミネータｃｙｃ１をベクターｐＹＰＧ２からＰｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを用いて増幅した。得られたＰＣＲ生成物を次に、制限酵素ＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩによって消化して、制限酵素ＡｐａＩ−ＳｍａＩによって消化し、連結し、制限酵素ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩによって消化し、脱リン酸化したベクターｐＳＫに連結して、プラスミドｐＹＧＫを得た。
【０１１４】
作成の検証のために、プラスミドｐＹＧＫを次に菌株Ｅ．コリＤＨ５αに導入した。次にオリゴヌクレオチドユニバーサルＭ１３リバースおよびユニバーサルＭ１３フォワードを用いて、プラスミドｐＹＧＫのプロモータＰｐｇｋ、マルチクローニング部位およびターミネータｃｙｃ１の配列決定を実施して、作成を確認した。
【０１１５】
次にプラスミドｐＹＧＫ−ＧＲＥ２ｐは、遺伝子ＧＲＥ２ｐのプラスミドｐＹＧＫへの挿入によって作成した。これを行うために、サッカロミセス・セレビシエの遺伝子ＧＲＥ２ｐを、染色体ＤＮＡから、ポリメラーゼＰｗｏを用いて以下のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した。
Ome376_Gre2 pYGK F (SmaI)
Acgtacgtcccccgggaaaaatgtcagttttcgtttcaggtgc
Ome377_Gre2 pYGK R (ApaI)
ACGTACGGGCCCTTATATTCTGCCCTCAAATTTTAAAATTTGGG
【０１１６】
得られたＰＣＲ生成物を次に、制限酵素ＡｐａＩ−ＳｍａＩによって消化して、制限酵素ＡｐａＩ−ＳｍａＩによって消化し、脱リン酸化したベクターｐＹＧＫに連結して、プラスミドｐＹＧＫ−ＧＲＥ２ｐを得た。
【０１１７】
作成の検証のために、プラスミドｐＹＧＫ−ＧＲＥ２ｐを次に菌株Ｅ．コリＤＨ５αに導入した。次にオリゴヌクレオチドユニバーサルＭ１３リバースおよびユニバーサルＭ１３フォワードを用いて、プラスミドｐＹＧＫ−ＧＲＥ２ｐの遺伝子ＧＲＥ２ｐの配列決定を実施して、作成を確認した。
【０１１８】
プラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐを、制限酵素ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩによるプラスミドｐＹＧＫ−ＧＲＥ２ｐおよびｐＲＳ４２６の消化と、それに続く連結とによって最終的に得た。
【実施例９】
【０１１９】
菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
遺伝子ＺＴＡ１の不活性化は、マーカー（抗生物質耐性、栄養要求性）を挿入すると同時に、関与する遺伝子の大半を欠失させることによって実施した。使用した技法は、Ｂｒａｃｈｍａｎｎらによって述べられている（Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ Ｓ２８８Ｃ：ａ ｕｓｅｆｕｌ ｓｅｔ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｙｅａｓｔ，１９９８，１４：１１５−３２）。Ｗａｃｈらによって述べられた方法を使用することも可能である（Ｎｅｗ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｄｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｏｒ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｙｅａｓｔ，１９９４，１０：１７９３−１８０８）。
【０１２０】
すべての場合において、Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）］の最終菌株が得られ、次にその中にプラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ（実施例８）を導入した。
【０１２１】
あるいはプラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐを入手可能なΔ（ＺＴＡ１）菌株、たとえば菌株ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ Ｙ３３１８３（遺伝子型：ＢＹ４７４３；Ｍａｔ ａ／α；ｈｉｓ３Ｄ１／ｈｉｓ３Ｄ１；ｌｅｕ２Ｄ０／ｌｅｕ２Ｄ０；ｌｙｓ２Ｄ０／ＬＹＳ２；ＭＥＴ１５／ｍｅｔ１５Ｄ０；ｕｒａ３Ｄ０／ｕｒａ３Ｄ０；ＹＢＲ０４６ｃ：：ｋａｎＭＸ４／ＹＢＲ０４６ｃ：：ｋａｎＭＸ４）に導入することも可能であった。次に胞子形成の後、Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］のホモ接合体菌株を回収することが可能であった。
【０１２２】
得られた菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］は次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。
【０１２３】
対照菌株Ｓ．セレビシエ［ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］を同じ条件で増殖させた。
【０１２４】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１２５】
発明者らは、菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを見出した。
【実施例１０】
【０１２６】
菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＧＩ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
実施例９で述べた方法および以下のオリゴヌクレオチドを使用して、菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］における遺伝子ＰＧＩ１の不活性化を実施した。
Dpgi1F
CCAACGCAGACCGCTGCCTGGCAGGCACTACAGAAACACTTCGATGAAATGAAAGACGTTACGATCGCCGATCTTTTTGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
Dpgi1R
GCGCCACGCTTTATAGCGGTTAATCAGACCATTGGTCGAGCTATCGTGGCTGCTGATTTCTTTATCATCTTTCAGCTCTGCATATGAATATCCTCCTTAG
Pgi1F
GCGGGGCGGTTGTCAACGATGGGGTCATGC
Pgi1R
CGGTATGATTTCCGTTAAATTACAGACAAG
【０１２７】
あるいは入手可能なΔ（ＰＧＩ１）菌株、たとえば菌株ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ Ｙ２３３３６（Ｍａｔ α／ａ；ｈｉｓ３Ｄ１／ｈｉｓ３Ｄ１；ｌｅｕ２Ｄ０／ｌｅｕ２Ｄ０；ｌｙｓ２Ｄ０／ＬＹＳ２；ＭＥＴ１５／ｍｅｔ１５Ｄ０；ｕｒａ３Ｄ０／ｕｒａ３Ｄ０；ＹＢＲ１９６ｃ：：ｋａｎＭＸ４／ＹＢＲ１９６ｃ）を使用することが可能であった。次に菌株をプラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ（実施例８）によって変換して、次に実施例９で述べた方法を使用して遺伝子ＺＴＡ１の欠失を実施した。
【０１２８】
得られた菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＧＩ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。
【０１２９】
対照菌株Ｓ．セレビシエ［ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］を同じ条件で増殖させた。
【０１３０】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１３１】
発明者らは、菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＧＩ１）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【実施例１１】
【０１３２】
菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＦＫ１，ＰＦＫ２）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］の作成およびエチルアセトアセテートのエチル−３−ヒドロキシブチラートへの生物変換
実施例９で述べた方法および以下のオリゴヌクレオチドを使用して、菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１）］において遺伝子ＰＦＫ１およびＰＦＫ２を欠失させた。
Dpfk1F
ATGCAATCTCAAGATTCATGCTACGGTGTTGCATTCAGATCTATCATCACAAATGATGAAAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCG
Dpfk1R
TTTGTTTTCAGCGGCTAAAGCGGCTACCTCAGCTCTCAACTTTAATCTACCGGACAGGATGGGCCACTAGTGGATCTGATATC
Pfk1 int F
GCTTTCTTAGAAGCTACCTCCG
Pfk1 int R
GAACCGACAAGACCAACAATGG
Pfk2 int F
CAGTTGTACACTTTGGACCC
Pfk2 int R
GATCAGCACCAGTCAAAGAACC
【０１３３】
次に菌株をプラスミドｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ（実施例８）によって変換した。
【０１３４】
得られた菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＦＫ１，ＰＦＫ２）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］を次に、グルコースおよびエチルアセトアセテートを含有する最小培地で増殖させた。
【０１３５】
対照菌株Ｓ．セレビシエ［ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］を同じ条件で増殖させた。
【０１３６】
増殖が完了したときに、以下の変数を比較した。
−生物変換段階での各菌株のバイオマスの時間経過
−細胞外培地に生成されたエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−細胞中に蓄積したエチル−３−ヒドロキシブチラートの量
−エチル−３−ヒドロキシブチラートに関しての生産性
−収率グルコース／エチル−３−ヒドロキシブチラート
【０１３７】
発明者らは、菌株Ｓ．セレビシエ［Δ（ＺＴＡ１，ＰＦＫ１，ＰＦＫ２）ｐＲＳＧＫ−ＧＲＥ２ｐ］が非最適化菌株よりもエチル−３−ヒドロキシブチラートのより高い収率を与えることを観察した。
【０１３８】
【表９】
【実施例１２】
【０１３９】
エシェリキア・コリによるエチル−３−ヒドロキシブチラートの生成の最適化のための代謝モデルを使用する、実験値と予測との比較
発明者らは、予測モデル化（実施例１）と実施例３、４、５、６、７、９、１０および１１に述べた実験結果との間に密接な相関を見出した。
【０１４０】
上の実施例１〜１１は、特許の具体的な適用であり、その範囲を制限しない。当業者は、ＮＡＤＰＨ依存性合成によって形成された物質のバイオトランスフォーメーションにこれらの例を容易に適合させることができる。アルゴリズムＭｅｔＯｐｔ（登録商標）およびＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比の最適化によるＮＡＤＰＨ依存性バイオトランスフォーメーションプロセスを最適化する方法を検証する。それゆえ本特許は、Ｅ．コリ、Ｓ．セレビシエまたは他のいずれかの微生物を使用した、ＭｅｔＯｐｔ（登録商標）、またはその派生物を用いてモデル化および予測できるすべてのＮＡＤＰＨ依存性バイオトランスフォーメーションをカバーする適用を請求する。
【実施例１３】
【０１４１】
Ｅ．コリにおける発酵プロセスでの理論的最適収率の計算
実施例１２は、ＭＥＴａｂｏｌｉｃ ＥＸｐｌｏｒｅｒ社によって開発されたモデルＭｅｔＯｐｔ（登録商標）が生物変換に利用可能であり、発酵などのバイオトランスフォーメーションにより一般的に利用可能なはずであることを示している。
【０１４２】
たとえばＭｅｔＯｐｔ（登録商標）−Ｃｏｌｉモデルは、本発明に従って最適化されたＥ．コリの菌株でのグルコース発酵によるシステインまたは３−ヒドロキシプロピオナートの生成に利用された。使用したパラメータは実施例１と同様であった、すなわち：１）３ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１のグルコース移入流量、２）０、０．１５および０．２５ｈ−１の可変増殖速度、３）１ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１以下の可変膜結合性トランスヒドロゲナーゼ流量（ｐｎｔＡＢ）；膜結合性トランスヒドロゲナーゼ流量の制限値は、文献（Ｈａｎｓｏｎ，１９７９；Ａｎｄｅｒｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｅｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）から決定した、４）５〜２２ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１に制限された維持流量。
ａ）グルコースの発酵によるシステインの生成の場合
【０１４３】
【表１０】
【０１４４】
ＮＡＤＰ＋還元能力について最適化されたＥ．コリの菌株によるシステインの生成の理論的最適収率（グルコース１ｍｏｌあたりのｍｏｌ）
本発明に従って最適化された菌株の理論的最適収率をさらに改善するために、さらなる修飾、たとえばｚｗｆ、ｇｎｄ、ｐｎｔＡ、ｐｎｔＢまたはｉｃｄでありうる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現および／またはｅｄｄ、ａｃｅＡ、ａｃｅＢまたはａｃｅＫでありうる少なくとも１つの遺伝子の欠失を実施できる。
【０１４５】
実際にそのような収率を得るために、本発明に従って最適化された菌株に対して、たとえば特許国際公開第０１／２７３０７号に述べられた遺伝子ｃｙｃＢを過剰発現させることによって、または欧州特許第０８８５９６２号に述べるような遺伝子ｃｙｃＥを修飾することによって、他の修飾を行う必要がある。
【０１４６】
ｂ）グルコースの発酵による３−ヒドロキシプロピオナートの生成の場合
３−ヒドロキシプロピオナートの生成は、３−ヒドロキシプロピオナート合成経路の酵素、たとえばＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのマロニル−ｃｏＡレダクターゼをコード化する遺伝子を含有するＥ．コリの菌株において実施した（Ｈｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００２，１８４：２４０４−２４１０）。
【０１４７】
【表１１】
【０１４８】
ＮＡＤＰ＋還元能力について最適化されたＥ．コリの菌株による３−ヒドロキシプロピオナートの生成の理論的最適収率（グルコース１ｍｏｌあたりのｍｏｌ）
本発明に従って最適化された菌株の理論的最適収率をさらに改善するために、さらなる修飾、たとえばｚｗｆ、ｇｎｄ、ｐｎｔＡ、ｐｎｔＢまたはｉｃｄでありうる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現および／またはｅｄｄ、ａｃｅＡ、ａｃｅＢまたはａｃｅＫでありうる少なくとも１つの遺伝子の欠失を実施できる。
【実施例１４】
【０１４９】
Ｓ．セレビシエにおける発酵プロセスでの理論的最適収率の計算；ヒドロコルチゾンの生成への応用
実施例１２は、ＭＥＴａｂｏｌｉｃ ＥＸｐｌｏｒｅｒ社によって開発されたモデルＭｅｔＯｐｔ（登録商標）が生物変換に利用可能であり、発酵などのバイオトランスフォーメーションにより一般的に利用可能なはずであることを示している。
【０１５０】
たとえばＭｅｔＯｐｔ（登録商標）−Ｓｃｅｒｅモデルは、本発明に従って最適化されたＳ．セレビシエの菌株でのグルコース発酵によるヒドロコルチゾンの生成に利用された。使用したパラメータは実施例１と同様であった、すなわち：１）３ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１のグルコース移入流量、２）０、０．１５および０．２５ｈ−１の可変増殖速度、３）２２ｍｍｏｌ・ｇ−１・ｈ−１以下の維持流量、４）非可逆的であり、アセテート＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→アセトアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）の方向に設定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ反応（ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ６）、および５）ｕｄｈＡまたはｐｎｔＡ、Ｂに等しい活性なし。
【０１５１】
モデルは、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム区画化を考慮している。
【０１５２】
結果のこのような表現は、ＮＡＤＰＨ生成の改善への、そしてヒドロコルチゾン生成流量の改善への、本発明に従ってなされた各変異によってなされた真の寄与を証明している。
【０１５３】
ヒドロコルチゾンの生成は、ヒドロコルチゾン合成経路の酵素をコード化する遺伝子を含有するＳ．セレビシエの菌株において実現された（Ｓｚｃｚｅｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：１４３−１４９）。
【０１５４】
【表１２】
【０１５５】
ＮＡＤＰ＋還元能力について最適化されたＥ．コリの菌株によるヒドロコルチゾンの生成の理論的最適収率（グルコース１ｍｏｌあたりのｍｏｌ）
遺伝子ＰＦＫ１およびＰＦＫ２が欠失した菌株は、ヒドロコルチゾンを生成することができず、生存可能ですらない可能性がある。これは、ヒドロコルチゾンの生成がＮＡＤＰＨ要件によってよりも、炭素要求によってより制限されるためである。１つの解決策は、酵母におけるトランスヒドロゲナーゼタイプ活性の弱い発現を可能にすることである。しかしながらモデル化は、ＰＧＩＩ遺伝子が欠失されたときほどにはヒドロコルチゾン生成が高くならないことを示している。
【０１５６】
本発明に従って最適化された菌株の理論的最適収率をさらに改善するために、さらなる修飾、たとえばＺＷＦ、ＳＯＬ１、ＳＯＬ２、ＳＯＬ３、ＳＯＬ４、ＧＮＤ１、ＧＮＤ２、ＩＤＰ１、ＩＤＰ２またはＩＤＰ３でありうる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現および／またはＩＣＬ１またはＤＡＬ７でありうる少なくとも１つの遺伝子の欠失を実施できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＰＨ酸化活性の１つ以上が制限されていることを特徴とする、微生物の菌株。
【請求項２】
ＮＡＤＰＨ酸化活性の１つ以上がキノンオキシドレダクターゼおよび／または可溶性トランスヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の欠失によって制限されていることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
ＮＡＤＰ＋還元酵素活性の１つ以上に好都合である修飾も受けていることを特徴とする、請求項１および２のいずれかに記載の菌株。
【請求項４】
ホスホグルコースイソメラーゼおよび／またはホスホフルクトキナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の欠失を受けていることを特徴とする、請求項３に記載の菌株。
【請求項５】
ＮＡＤＰを優先的に利用させるためにジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼおよび／またはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の修飾も受けていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の菌株。
【請求項６】
グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、または６−ホスホグルコノラクトナーゼ、または６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ、またはイソシトレートデヒドロゲナーゼまたは膜結合性トランスヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子も過剰発現することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の菌株。
【請求項７】
６−ホスホグルコナートデヒデヒドラターゼ、またはマレートシンターゼ、またはイソシトレートリアーゼ、またはイソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼをコード化する１つ以上の遺伝子の欠失も受けていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の菌株。
【請求項８】
興味のある物質のバイオトランスフォーメーションに関与する酵素をコード化する１つ以上の内在性または外来性遺伝子を保有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の菌株。
【請求項９】
１つ以上の選択マーカー遺伝子を保有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の菌株。
【請求項１０】
アスペルギルス種、バチラス種、ブレビバクテリウム種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種、エシェリキア種、グルコノバクター種、ペニシリウム種、ピキア種、シュードモナス種、ロドコッカス種、サッカロミセス種、ストレプトミセス種、キサントモナス種、またはカンジダ種から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１１】
興味のある物質のバイオトランスフォーメーションに関与する１つ以上の酵素をコード化する１つ以上の遺伝子および／または１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する適切なベクターによって菌株を変換すること、あるいは過剰発現させる１つまたは複数の遺伝子を制御する内在性の１つまたは複数のプロモータの強度を変更することのどちらかによる、ＮＡＤＰを優先的に利用させるための、キノンオキシドレダクターゼおよび／または可溶性トランスヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の欠失、ならびに必要ならばホスホグルコースイソメラーゼ、またはホスホフルクトキナーゼ、または６−ホスホグルコナートデヒドラターゼ、またはマレートシンターゼ、またはイソシトレートリアーゼまたはイソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼをコード化する１つ以上の遺伝子の欠失、ならびに／またはジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼおよび／またはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の修飾であって、適切な手段によって実施される修飾および欠失、ならびに／またはグルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、または６−ホスホグルコノラクトナーゼ、または６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ、またはイソシトレートデヒドロゲナーゼまたは膜トランスヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の過剰発現を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の最適化された菌株を調製する方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのステップがＮＡＤＰＨ依存性である生合成経路によって形成される興味のある物質の生成のための方法であって、
ａ）その増殖に好都合であり、ＮＡＤＰＨを除いて、発酵または生物変換によるバイオトランスフォーメーションを実施するために必要な物質を含有する適切な培養培地における、請求項１〜１０のいずれかに記載の最適化された微生物の培養での増殖と、
ｂ）培地からの興味のある物質の抽出および必要ならばその精製、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
興味のある物質がアミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、脂肪酸、有機酸、ポリオール、またはヒドロキシエステルであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
ＮＡＤＰＨ酸化活性の１つ以上が制限されていることを特徴とする、微生物の菌株。
【請求項２】
ＮＡＤＰＨ酸化活性の１つ以上がキノンオキシドレダクターゼおよび／または可溶性トランスヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の欠失によって制限されていることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
ＮＡＤＰ＋還元酵素活性の１つ以上に好都合である修飾も受けていることを特徴とする、請求項１および２のいずれかに記載の菌株。
【請求項４】
ホスホグルコースイソメラーゼおよび／またはホスホフルクトキナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の欠失を受けていることを特徴とする、請求項３に記載の菌株。
【請求項５】
ＮＡＤＰを優先的に利用させるためにジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼおよび／またはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の修飾も受けていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の菌株。
【請求項６】
グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、または６−ホスホグルコノラクトナーゼ、または６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ、またはイソシトレートデヒドロゲナーゼまたは膜結合性トランスヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子も過剰発現することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の菌株。
【請求項７】
６−ホスホグルコナートデヒデヒドラターゼ、またはマレートシンターゼ、またはイソシトレートリアーゼ、またはイソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼをコード化する１つ以上の遺伝子の欠失も受けていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の菌株。
【請求項８】
興味のある物質のバイオトランスフォーメーションに関与する酵素をコード化する１つ以上の内在性または外来性遺伝子を保有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の菌株。
【請求項９】
１つ以上の選択マーカー遺伝子を保有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の菌株。
【請求項１０】
アスペルギルス種、バチラス種、ブレビバクテリウム種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種、エシェリキア種、グルコノバクター種、ペニシリウム種、ピキア種、シュードモナス種、ロドコッカス種、サッカロミセス種、ストレプトミセス種、キサントモナス種、またはカンジダ種から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１１】
興味のある物質のバイオトランスフォーメーションに関与する１つ以上の酵素をコード化する１つ以上の遺伝子および／または１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する適切なベクターによって菌株を変換すること、あるいは過剰発現させる１つまたは複数の遺伝子を制御する内在性の１つまたは複数のプロモータの強度を変更することのどちらかによる、ＮＡＤＰを優先的に利用させるための、キノンオキシドレダクターゼおよび／または可溶性トランスヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の欠失、ならびに必要ならばホスホグルコースイソメラーゼ、またはホスホフルクトキナーゼ、または６−ホスホグルコナートデヒドラターゼ、またはマレートシンターゼ、またはイソシトレートリアーゼまたはイソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼをコード化する１つ以上の遺伝子の欠失、ならびに／またはジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼおよび／またはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の修飾であって、適切な手段によって実施される修飾および欠失、ならびに／またはグルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、または６−ホスホグルコノラクトナーゼ、または６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ、またはイソシトレートデヒドロゲナーゼまたは膜トランスヒドロゲナーゼをコード化する１つ以上の遺伝子の過剰発現を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の最適化された菌株を調製する方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのステップがＮＡＤＰＨ依存性である生合成経路によって形成される興味のある物質の生成のための方法であって、
ａ）その増殖に好都合であり、ＮＡＤＰＨを除いて、発酵または生物変換によるバイオトランスフォーメーションを実施するために必要な物質を含有する適切な培養培地における、請求項１〜１０のいずれかに記載の最適化された微生物の培養での増殖と、
ｂ）培地からの興味のある物質の抽出および必要ならばその精製、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
興味のある物質がアミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、脂肪酸、有機酸、ポリオール、またはヒドロキシエステルであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５１０４１１（Ｐ２００７−５１０４１１Ａ）
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３７３７３（Ｐ２００６−５３７３７３）
【出願日】平成１６年１１月５日（２００４．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／００２８４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７４９８
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５０６１５３３７６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月５日（２００４．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／００２８４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７４９８
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５０６１５３３７６）
【Ｆターム（参考）】
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