アルファ−シヌクレインキナーゼ
本発明は、患者脳のレヴィー小体病（ＬＢＤ）関連疾患を治療するための因子および方法を提供する。このような疾患としては、パーキンソン病（ＰＤ）、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、レヴィー小体異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、ＰＤとアルツハイマー病（ＡＤ）との併発、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）とみなされる症候群が挙げられる。一部の方法は、表１Ａ、Ｂ；Ｃ、表２、表１２または表１３に示したキナーゼの活性または発現を調節する因子を特定し、この因子がＬＢＤの動物モデルにおいてこの疾患を治療するのに有用な活性を示すか否かを決定するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
この出願は、本明細書においてその全体が参考として全ての目的のために援用される、２００６年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／７６４，０００号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
レヴィー小体病（ＬＢＤ）の特徴は、ドーパミン作動系の変性、運動性変調、認知障害、およびレヴィー小体（ＬＢ）の形成である（非特許文献１）。ＬＤＢとしては、パーキンソン病、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、レヴィー小体異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、パーキンソン病（ＰＤ）とアルツハイマー病（ＡＤ）との併発、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）とみなされる症候群が挙げられる。レヴィー小体を伴う痴呆（ＤＬＢ）というのは、ＬＢＤ間の専門用語の相違を調整するために作られた用語である。ＬＢを有する疾患は、依然として、高齢者における運動性疾患および認識力低下に共通する原因となっている（非特許文献２）。この疾患の発生率は増加し続けており、深刻な公衆衛生問題を生じているが、今日まで、こうした疾患に対して認可された治療法はない（非特許文献３）。ＬＢＤの原因については意見の分かれるところであり、各種の神経毒および遺伝的感受性要因などのさまざまな要因が役割を果たしていると提唱されている。
【０００３】
近年、ＬＢＤの病因の理解に関して新たな可能性が浮上した。具体的には、いくつかの研究によって、（１）シナプス蛋白質アルファ−シヌクレインがＬＢ内に蓄積すること（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）、（２）アルファ−シヌクレイン遺伝子の突然変異体が稀な家族型パーキンソン病に伴って単離されること（非特許文献７、非特許文献８）、ならびに（３）遺伝子導入マウス（非特許文献９）およびショウジョウバエ（非特許文献１０）におけるその過剰発現によってＰＤのいくつかの病理学的側面が再現されることから、アルファ−シヌクレインはＰＤの病因に中心的な役割を果たしていることが分かった。すなわち、脳内のアルファ−シヌクレインの蓄積がヒト、マウス、ハエといった多様な種において同様な形態学的および神経学的変化を伴うという事実から、この分子がＰＤ発症の一因となっていることが示唆される。
【非特許文献１】ＭｃＫｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ （ＤＬＢ）： Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＬＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （１９９６） ４７：１１１３−２４
【非特許文献２】Ｇａｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ． Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． （１９９４） ５１：８８８−９５
【非特許文献３】Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ａｋｉｎｅｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． （２０００） １３：４２７−３０
【非特許文献４】Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３３８：ｐ８３９−４０
【非特許文献５】Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２：ｐ３６７−７２
【非特許文献６】Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ．（１９９７）２３９：ｐ４５−８
【非特許文献７】Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．（１９９８年）１８：ｐ１０６−８
【非特許文献８】Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：ｐ２０４５−７）
【非特許文献９】Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ）（２０００）２８７：ｐ１２６５−９
【非特許文献１０】Ｆｅａｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：ｐ３９４−８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要約）
一態様として、本発明は、レヴィー小体病（ＬＢＤ）を治療する活性について因子をスクリーニングする方法を提供する。このような疾患としては、パーキンソン病（ＰＤ）、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、レヴィー小体異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、ＰＤとアルツハイマー病（ＡＤ）との併発、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）とみなされる症候群が挙げられる。一部の方法は、表１Ａ、Ｂ；Ｃ、表２、表１２または表１３に示したキナーゼの活性または発現を調節する因子を特定し、この因子がＬＢＤの動物モデルにおいてこの疾患を治療するのに有用な活性を示すか否かを決定するものである。一部の方法では、この調節は阻害することである。一部の方法では、工程（ａ）は、この因子が上記キナーゼを阻害するか否かを特定することを含む。一部の方法では、工程（ａ）は、このキナーゼおよび／またはアルファ−シヌクレインを発現する核酸で形質転換した細胞において行われる。一部の方法では、工程（ａ）はインビトロで行う。一部の方法では、工程（ｂ）はＬＢ疾患のトランスジェニック動物モデルにおいて行われ、このトランスジェニック動物はヒト・アルファ−シヌクレインを発現する導入遺伝子を有することができる。好ましくは、このキナーゼはＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、ＧＡＫ、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＭＥＴのうちの少なくとも１種であり、その調節は阻害である。より好ましくは、このキナーゼはＰＬＫ２またはＧＲＫ６であり、その調節は阻害である。このキナーゼはＰＬＫ２であることがさらに好ましい。好ましくは一部の方法において、このキナーゼはＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３またはＧＡＫであり、その調節は賦活化することである。一部の態様として、工程（ｂ）は、このトランスジェニック動物を上記因子と接触させ、この因子がこの因子を処置していない対照トランスジェニック動物と比較してアルファ−シヌクレインの沈着物の形成を抑制するかどうかを明らかにするものである。
【０００５】
別の態様として、本発明はＬＢＤの治療もしくは予防を行う方法を提供する。この方法のいくつかの例は、この病気に罹患しているか罹患するリスクのある患者に対して、キナーゼの活性または発現を調節するのに有効な因子の有効な療法を施行するものである。このキナーゼは、表１Ａ、ＢもしくはＣ、表２、表１２または表１３に示したもののうちの１種とすることができる。また、上記因子は、このキナーゼに対する抗体、このキナーゼの発現を調節する亜鉛フィンガー蛋白質またはこのキナーゼの核酸配列に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムもしくはＲＮＡであることが好ましい。一部の方法では、この調節は阻害することであり、好ましくはこのキナーゼは以下のＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＭＥＴのうちの少なくとも１種である。より好ましくは、このキナーゼはＰＬＫ２またはＧＲＫ６である。このキナーゼはＰＬＫ２であることがさらに好ましい。上記方法の一部では、このキナーゼはＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫのうちの少なくとも１種であり、その調節は活性化である。
【０００６】
別の態様として、本発明は、アルファ−シヌクレインを発現する細胞に対してキナーゼをコードしている遺伝子に相補的な配列を有する核酸またはこの遺伝子に特異的に結合する亜鉛フィンガー蛋白質をトランスフェクトすることによりアルファ−シヌクレインをリン酸化するキナーゼを特定する方法を提供する。このトランスフェクトした核酸または亜鉛フィンガー蛋白質はキナーゼの発現を阻害するが、このとき、この細胞のリン酸化アルファ−シヌクレインの量を、ｓｉＲＮＡまたは該ｓｉＲＮＡをコードしている核酸をトランスフェクトしていない対照細胞との比較で測定することができる。この場合、リン酸化アルファ−シヌクレインの減少は、このキナーゼがアルファ−シヌクレインをリン酸化することの指標となる。また、一部の方法として、この細胞により産生されたアルファ−シヌクレインの量を、上記核酸をトランスフェクトしていない対照細胞との比較で測定する方法が挙げられる。一部の方法では、この核酸は、ｓｉＲＮＡまたはそれをコードしているＤＮＡ分子である。
【０００７】
他の態様として、本発明は、シンフィリンの活性または発現を調節する因子を特定し、この因子がレヴィー小体病（ＬＢＤ）の動物モデルにおいてＬＢＤを治療するのに有用な活性を示すか否かを決定する工程によってこの疾患を治療する活性について因子をスクリーニングする方法を提供する。
【０００８】
他の態様として、本発明は、細菌細胞内にアルファ−シヌクレインをコードしているプラスミドおよびＰＬＫ２をコードしているプラスミドを供給し、この細胞を培養することによりこれらのプラスミドが同時発現してアルファ−シヌクレインおよびＰＬＫ２を産生する状態にして細菌細胞内でＰＬＫ２にアルファ−シヌクレインをリン酸化させ、この細胞からリン酸化アルファ−シヌクレインを単離することによって、Ｓｅｒ−１２９リン酸化アルファ−シヌクレインを作製する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
定義
「因子」という用語は、薬理活性を有するか、有する可能性のある化合物を記述するのに用いている。因子としては、既知の薬物である化合物、薬理活性は確認されているが、さらに治療上の評価が行われている化合物、および薬理活性についてスクリーニングされることになっているコレクションおよびライブラリを構成する物質である化合物が挙げられる。
【００１０】
「薬理」活性とは、因子が疾患の予防もしくは治療に有用であるか、有用である可能性を有することを示すスクリーニング系において、ある因子が活性を発現することを意味する。このスクリーニング系はインビトロ系、細胞系、動物系もしくはヒト系とすることができる。因子は、疾患の処置における実際的な予防もしくは治療的有用性を立証するにはさらに試験を必要とする可能性があるにしても、薬理活性を有すると評することができる。
【００１１】
レヴィー様小体は、ヒト患者に存在するレヴィー小体の特徴の一部または全てと類似している、トランスジェニック動物に見いだされる水／界面活性剤不溶性のアルファ−シヌクレイン沈着物である。これらの特徴としては密なアルファ−シヌクレイン陽性封入体であることが好ましい。こうした封入体は年齢依存性に形成されることが好ましい。アルファ−シヌクレイン陽性封入体が形成されると、細胞病変が観察可能となり、患部神経細胞の機能が失われることになる。患部神経細胞の機能の喪失は、行動試験、神経薬理学的反応評価および電気生理学によって確認することができる。
【００１２】
「特異的に結合する」という語句は、蛋白質類その他の生体物質の不均一な集団の存在下に上記蛋白質の存在を決定するような結合反応のことを意味する。すなわち、所定の条件下においては、特定のリガンドは特定の蛋白質に選択的に結合し、試料中に存在する他の蛋白質とは有意な量で結合しない。多くの場合、蛋白質に特異的に結合する抗体などの分子の結合定数は、少なくとも１０６Ｍ−１もしくは１０７Ｍ−１、好ましくは１０８Ｍ−１乃至１０９Ｍ−１、より好ましくは約１０１０Ｍ−１乃至１０１１Ｍ−１以上である。種々のイムノアッセイ方式を用いて特定の蛋白質に対し特異的な免疫反応性を示す抗体を選定することができる。例えば、蛋白質に対し特異的な免疫反応性を示すモノクロナール抗体を選定するのに固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ法が日常的に用いられている。特異的な免疫反応性を測定するのに用いることができるイムノアッセイ方式および条件の解説については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ニューヨークを参照されたい。
【００１３】
配列の比較においては、通常、１つの配列を試験配列と比較する対照配列として用いる。配列比較アルゴリズムを用いる際には、試験および対照配列をコンピュータに入力し、必要な場合、部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）を指定し、次に、配列アルゴリズム・プログラム・パラメータを指定する。次いで、指定したプログラム・パラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムにより、対照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【００１４】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ、Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２：ｐ４８２（１９８１年）の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８：４４３（１９７０年）のホモロジー・アラインメント・アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５：２４４４（１９８８年）の類似性検索法（ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ）、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、５７５サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｄｒ．、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、もしくは目視検査（ｖｉｓｕａｌ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌほかの上記文献参照）によって行うことができる。
【００１５】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌほか、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９０年）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。このアルゴリズムは、先ず、データベース配列中の同じ長さの文字列（ｗｏｒｄ）と整列させた時にある正値の閾値スコアＴにマッチするかこれを満たす検索（ｑｕｅｒｙ）配列中の長さＷの短い文字列を特定することによって高相同性スコア（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ）配列対（ＨＳＰ）を同定するものである。Ｔは、近傍文字列スコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌほか、上記文献）と呼ばれる。これらの初期の近傍文字列ヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとなる。次いで、これらの文字列ヒットは、累積アラインメント・スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータＭ（一対の一致残基のスコア値（ｒｅｗａｒｄ）；常に＞０）およびＮ（不一致残基のペナルティ値；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合、スコアリング・マトリクス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）を用いて累積スコアを算出する。文字列ヒットの各方向への延長は、以下の場合、即ち、上記累積アラインメント・スコアがその最大到達値から数量Ｘだけ減少した場合、この累積スコアが１つ以上のネガチブ・スコア（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ）残基アラインメントの蓄積によりゼロ以下になった場合、もしくはどちらの配列においても末端に到達した場合に停止する。ある核酸もしくはポリペプチドが本発明の範囲内にあるかどうかを確認するためには、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルト・パラメータが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクスを用いる。ＴＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の代わりに蛋白質配列を用いる）は、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクスを用いる。（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９８９）参照）。
【００１６】
配列同一性パーセントを算出する他に、ＢＬＡＳＴアルゴニズムは２つの配列間の類似性の統計的な解析をも行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３年）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴニズムにより得られる類似性の１つの指標は、２つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標となる最小合計確率（ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と対照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、この核酸は対照配列と類似していると考えられる。
【００１７】
アミノ酸置換を保存的もしくは非保存的なものとして分類するために、アミノ酸を以下のようにグループ分けする：グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅｕ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は同じクラスのアミノ酸間の置換を行うものである。非保存的置換は、これらのクラスの中の１つのアミノ酸を別のクラスのアミノ酸と交換することから成る。
【００１８】
通常、本発明の治療剤は好ましくない夾雑物を実質的に含まない。このことは、因子が、妨害蛋白質および夾雑物を実質的に含まないばかりでなく、通常、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であることを意味する。場合によっては、こうした因子の純度は、少なくとも約８０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９０もしくは約９５％ｗ／ｗである。しかしながら、従来の蛋白質精製法を用いると、少なくとも９９％ｗ／ｗの均一なペプチドを得ることができる。
【００１９】
「抗体」もしくは「免疫グロブリン」という用語は、完全な状態の抗体およびその結合性断片を含めて用いている。通常、断片は、それが由来する完全な状態の抗体と、個々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを含む抗原断片への特異的結合に対して競合する。断片は、組換えＤＮＡ法、もしくは完全な状態の免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって作製することができる。また、「抗体」という用語は、他の蛋白質との融合蛋白質へと化学的に結合させ、もしくはこうした融合蛋白質として発現させた１種以上の免疫グロブリン鎖を含む。また、「抗体」という用語は、二重特異性抗体を含む。二重特異性もしくは二官能性抗体は、２種の重／軽鎖対および２種の結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合もしくはＦａｂ’断片間の結合を含む種々の方法によって作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ、Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９： ３１５−３２１ （１９９０年）； Ｋｏｓｔｅｌｎｙほか、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： １５４７−１５５３ （１９９２年）を参照されたい。
【００２０】
疾患の症候とは、正常な機能、知覚または外見からの逸脱を意味する疾患を有する個体が経験する現象を意味する。
【００２１】
疾患の徴候とは、疾患の存在またはリスクを意味することにつながる何らかの身体症状である。
【００２２】
「患者」という用語は、予防的もしくは治療的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物の対象を含む。
【００２３】
記載された１つ以上の要素を「含む」組成物もしくは方法には、特に記載されていない他の要素を含めることができる。例えば、アルファ−シヌクレイン・ペプチドを含む組成物は、アルファ−シヌクレイン・ペプチド単体と、より大きなポリペプチド配列の構成成分としてのアルファ−シヌクレイン・ペプチドとの両方を包含する。
【００２４】
特に文脈から明らかでない限り、本発明の各実施態様、要素、工程もしくは特徴は、任意の他のものとの組み合わせで用いることができる。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
Ｉ． 概要
本発明は、アルファ−シヌクレインをリン酸化し、および／またはその産生を阻害する１種以上のキナーゼを阻害することによりレヴィー小体病（ＬＤＢ）を抑制することができるという洞察に、部分的に基づいている。アルファ−シヌクレインはレヴィー小体（ＬＢ）に存在する主要な蛋白質である。本発明の実施はメカニズムの理解に左右されるものではないが、アルファ−シヌクレインのコドン１２９におけるリン酸化は、アルファ−シヌクレインの細胞内沈着物の形成をもたらす一連の分子事象の１つであると考えられている。ｓｅｒ−１２９でリン酸化されているアルファ−シヌクレインは、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）および家族型パーキンソン病（ＰＤ）のレヴィー小体（ＬＢ）に極めて多く含まれている。ＬＢにおけるリン酸化アルファ−シヌクレインの異常な蓄積は、リン酸化シヌクレインがＬＢ形成を駆動する病原性種であること、およびそのリン酸化に関与し、またはアルファ−シヌクレイン自体の産生を調節するキナーゼ（類）が多発性シヌクレオパチー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）の治療における治療上の標的（群）であることを示している。このシリーズの他の事象としては、リン酸化に続く蛋白質分解的切断が挙げられそうである（２００４年５月１９日出願の国際公開公報第ＷＯ２００５／０１３８８９号参照）。本願では、その阻害がアルファ−シヌクレインのリン酸化の減少および／またはトータル・アルファ−シヌクレイン濃度の低下を伴う数種のキナーゼを特定したことを報告する。本発明はこれらのキナーゼの活性および発現の調節物質を特定する方法ならびにレヴィー小体病を処置する方法を提供する。
【００２６】
ＩＩ．本発明のキナーゼ
表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃには、蛋白質であって、これを阻害することによりｓｅｒ−１２９の位置のリン酸化が調節される蛋白質を示した。表１Ａにはセリンおよび／またはスレオニン残基および、場合によっては、チロシンをリン酸化することができるキナーゼを示した。表１Ｂにはセリン残基を（知られている限り）修飾することができないチロシンキナーゼを示した。表１Ｃにはキナーゼ活性を有しないことが知られている蛋白質を示した。表１Ａの上部からのキナーゼはアルファ−シヌクレインのｓｅｒ−１２９を直接リン酸化することができる候補である。また、表１Ｂの上部からのキナーゼは、アルファ−シヌクレインを間接的にリン酸化する役割を介する治療上の有用な標的である。表１Ｃの上部の蛋白質も、同じ理由から治療上の有用な標的である。各表の第１、２および３欄には、遺伝子名、キナーゼ名およびキナーゼのジェンバンク・アセッション番号を示した。その次の欄には、キナーゼの阻害がリン酸化を低下させる（「下降（ｄｏｗｎ）」）のか、増大させる（「上昇（ｕｐ）」）のかを示した。その次の３欄には、リン酸化の測定レベルが３回の独立した実験の平均値から外れる標準偏差の数を示した。最後の２欄にはキナーゼファミリー（即ち、アミノ酸特異性）および群を示した。
【００２７】
表２および３には、キナーゼであって、これを阻害することによってリン酸化の割合を変えないでヒト・アルファ−シヌクレインの全体的濃度が調節されるキナーゼを示した。表２にはヒト・アルファ−シヌクレインの濃度の低下が最も強いキナーゼの全てを示した。表の欄には表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃと同様に名称をつけた。
【００２８】
表４および５には、ヒト・アルファ−シヌクレインの全体的濃度を調節することが実施例で確認された、表１、２および３からのキナーゼを示した。実証されたキナーゼとしては、直接的または間接的にアルファ−シヌクレインをリン酸化するキナーゼであるＰＬＫ２、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＧＲＫ１、２、６および７が挙げられる。阻害されるとアルファ−シヌクレインのリン酸化を増大させることが見いだされたキナーゼであるＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫは、アルファ−シヌクレインのリン酸化の負の調節因子である可能性が高い。さらに、インビトロのリン酸化研究からのデータによって、ＰＫＬ２ならびにＧＲＫ２、５、６および７はインビトロでアルファ−シヌクレインをリン酸化することができるものと確認され、また、ＣＫＩＩおよびＩＫＢＫＢも確認された。さらに、組織培養による研究から、ＰＫＬ２およびＧＲＫ６は組織培養においてアルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができることが分かった。これらのデータは免疫組織化学を用いて裏付けられた。要約すると、ＰＫＬ２および、それほどではないにせよＧＲＫ６も、アルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができるので、レヴィー小体病における治療的介入の特に好ましい標的である。ＰＫＬ２およびＧＲＫ６を阻害する因子はアルファ−シヌクレインのリン酸化も抑制するので、レヴィー小体病の治療または予防に用いることができる。また、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩ、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６およびＧＲＫ７は、直接キナーゼの間接的な活性化因子である可能性が高いので、レヴィー小体病における治療的介入の標的である。従って、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩ、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６およびＧＲＫ７を阻害する因子は、アルファ−シヌクレインのリン酸化も抑制し、レヴィー小体病の治療または予防に用いることができる。ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫはアルファ−シヌクレインのリン酸化の負の調節因子である。従って、これらのキナーゼを活性化する因子はアルファ−シヌクレインのリン酸化を低下させ、レヴィー小体病の治療または予防に用いることができる。
【００２９】
ＰＫＬ２は、ＳＮＫとも称するが、Ｇ１細胞周期蛋白質であるポロ（Ｐｏｌｏ）様キナーゼであり、細胞内での代謝回転が速く、また、脳において発現され、ここでシナプス可塑性に関与する。一貫性を持たせるために、本特許出願の全体を通してＰＫＬ２という名称を用いる。ＰＫＬ２は、活性化されると、賦活化された神経細胞の樹状突起を標的にし、そこでシナプス終末内の蛋白質をリン酸化すると考えられている。ＰＫＬ２の代表的なアセッション番号は表１Ａに示した。また、ＰＫＬ２の配列は、Ｍａほか、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、２３ （１９）： ６９３６−６９４３ （２００３年）、Ｂｕｒｎｓほか、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、２３ （１６）： ５５５６−５５７１ （２００３）、Ｍａｔｓｕｄａほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２ （２１）： ３３０７−３３１８ （２００３年）、Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｙｏｓｈｉｄａほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２８９ （２）： ４９１−４９８ （２００１年）、Ｌｉｂｙほか、ＤＮＡ ｓｅｑ．、１１ （６）： ５２７−５３３ （２００１年）、Ｈｏｌｔｒｉｃｈほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９ （４２）： ４８３２−４８３９、Ｏｕｙａｎｇほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８ （４４）： ６０２９−６０３６ （１９９９年）およびＫａｕｓｅｌｍａｎｎほか、ＥＭＢＯ Ｊ．、１８ （２０）： １５５２８−５５３９のうちのいずれかに見いだすことができるが、ＰＫＬ２のアミノ酸もしくは核酸配列という表現にはこれらの参考文献の全ての配列またはその対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３０】
ＧＰＫ６は、ＧＰＲＫ６とも称するが、Ｇ蛋白質共役受容体キナーゼであり、シグナル伝達に関与している。Ｇ蛋白質共役受容体キナーゼはリガンド活性化型Ｇ蛋白質共役受容体をリン酸化し、脱感作する。これまでに、ＧＲＫ６の発現は多くの脳領域においてＭＰＴＰ損傷群で有意に高くなることが明らかにされている。一貫性を持たせるために、本特許出願全体を通してＧＲＫ６という名称を用いる。代表的なアセッション番号を表１Ａに示した。ＧＲＫ６の配列は、Ｔｅｌｉほか、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ９８ （２）： ３４３−３４８ （２００３）、Ｍｉｙａｇａｗａほか、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３００ （３）： ６６９−６７３ （２００３年）、Ｇａｕｄｒｅａｕほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７ （３５）： ３１５６７−３１５７６ （２００２年）、Ｇｒａｎｇｅ−Ｍｉｄｒｏｉｔほか、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １０１ （１−２）： ３９−５１ （２００２年）、Ｗｉｌｌｅｔｓほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７ （１８）： １５５２３−１５５２９ （２００２年）、Ｂｌａｕｋａｔほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６ （４４）： ４０４３１−４０４４０ （２００１年）、Ｚｈｏｕほか、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２９８ （３）： １２４３−１２５１ （２００１年）、Ｐｒｏｎｉｎほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５ （３４）： ２６５１５−２６５２２ （２０００年）、Ｔｉｒｕｐｐａｔｈｉ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７ （１３）： ７４４０−７４４５ （２０００年）、Ｐｒｅｍｏｎｔほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４ （４１）： ２９３８１−２９３８９ （１９９９年）、Ｂｒｅｎｎｉｎｌｍｅｉｊｅｒほか、Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １６２ （３）： ４０１−４０８ （１９９９年）、Ｈａｌｌほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４ （３４）： ２４３２８−２４３３４ （１９９９年）、Ｌａｚａｒｉほか、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３ （６）： ８６６−８７８ （１９９９年）、Ｍｉｌｃｅｎｔほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｏｎ． ２５９ （１）： ２２４−２２９ （１９９９年）、Ｐｒｅｍｏｎｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５ （２４）： １４０８２−１４０８７ （１９９８年）、Ｓｔｏｆｆｅｌほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７ （４６）： １６０５３−１６０５９ （１９９８年）、Ｌｏｕｄｏｎほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２ （４３）： ２７４２２−２７４２７ （１９９７年）、Ｆｒｅｅｄｍａｎほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２ （２８）： １７７３４−１７７４３ （１９９７年）、Ｂｕｌｌｒｉｃｈほか、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ７０ （３−４）： ２５０−２５４ （１９９５年）、Ｓｔｏｆｆｅｌほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９ （４５）： ２７７９１−２７７９４ （１９９４年）、Ｌｏｕｄｏｎほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９ （３６）： ２２６９１−２２６９７ （１９９４年）、Ｈａｒｉｂａｂｕ、Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０ （２０）： ９３９８−９４０２ （１９９３年）およびＢｅｎｏｖｉｃ、Ｇｏｍｅｚ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８ （２６）： １９５２１−１９５２７ （１９９３年）のうちのいずれかに記載されているが、ＧＲＫ６のアミノ酸もしくは核酸配列という表現にはこれらの参考文献の全てのアミノ酸もしくは核酸配列またはその対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３１】
カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ、ＣＳＮＫ２およびＣＳＮＫＩＩとも称する）はアルファ−シヌクレインをリン酸化すると報告されている。一貫性を持たせるため、本明細書ではＣＫＩＩの名称を用いる。ＣＫＩＩの配列は、ＮＭ＿００１８９６およびＮＭ＿００１３２０のアセッション番号でジェンバンクに登録され、および／または、Ｐａｎａｓｙｕほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１ （４２）： ３１１８８−３１２０１ （２００６年）、Ｓａｌｖｉほか、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５８０ （１６）： ３９４８−３９５２ （２００６年）、Ｌｉｍほか、Ｃｅｌｌ １２５ （４）： ８０１−８１４ （２００６年）、Ｌｌｏｒｅｎｓほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３９４ （Ｐｔ． １）： ２２７−２３６ （２００６年）、Ｂｊｏｒｌｉｎｇ−Ｐｏｕｌｓｅｎほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４ （４０）： ６１９４−６２００ （２００５年）、Ｓｃｈｕｂｅｒｔほか、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０４ （２）： ８７５−８８３ （１９９１年）、Ｖｏｓｓほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６ （２１）： １３７０６−１３７１１ （１９９１年）、Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇほか、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８ （４）， ７４１−７４２ （１９９０年）、Ｈｅｌｌｅｒ−Ｈａｒｒｉｓｏｎほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８ （２３）， ９０５３−９０５８ （１９８９年）、Ａｃｋｅｒｍａｎｎほか、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｒｎ． ２７４ （１−２）： ９１−１０１ （２００５年）、Ｂａｒｒｉｏｓ−Ｒｏｄｉｌｅｓほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０７ （５７１５）： １６２１−１６２５ （２００５年）、Ａｎｄｅｒｓｅｎほか、Ｎａｔｕｒｅ ４３３ （７０２１）， ７７−８３ （２００５年）、Ｂａｌｌｉｆほか、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ３ （１１）： １０９３−１１０１ （２００４年）、Ｂｅａｕｓｏｌｅｉｌほか、ＰＮＡＳ， ＵＳＡ １０１ （３３）： １２１３０−１２１３５ （２００４年）およびＭａｒａｉｓほか、ＥＭＢＯ Ｊ． １１（１）： ９７−１０５ （１９９２年）のうちのいずれかに記載されている。ＣＫＩＩのアミノ酸もしくは核酸配列という表現にはこれらの参考文献の全てのアミノ酸もしくは核酸配列およびその対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３２】
ＩＫＢＫＢおよびこれと関連のＩＫＢＫＡはＮＦｋＢ炎症経路の正の調節因子である。ＩＫＢＫＢの配列はＮＭ＿００１５５６のアセッション番号でジェンバンクに登録されており、および／または、Ｃａｔｅｒｉｎｏほか、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５８０ （２８−２９）、６５２７−６５３２ （２００６年）、Ｃａｓｔｌｅほか、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ４ （１０）： Ｒ６６ （２００３年）、Ｓａｔｏｈほか、Ｂｉｏｃｈｉｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １６００ （１０３）： ６１−６７ （２００２年）、Ｃａｏｈｕｙ、Ｐｏｌｌａｒｄ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７ （２８）： ２５２１７−２５２２５ （２００２年）、Ｙｕほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ； ２７７ （１８）： １５８１９−１５８２７ （２００２年）、Ｓｅｌｂｅｒｔほか、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １０８ （Ｐｔ．１）： ８５０９５ （１９９５年）、Ｓｈｉｒｖａｎほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ （２２）： ６８８８−６９０１ （１９９４年）、Ｃｒｅｕｔｚほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８４ （１）： ３４７−３５２ （１９９２年）、Ｍｅｇｅｎｄｚｏほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６ （５）： ３２２８−３２３２ （１９９１年）、Ｂｕｍｓほか、ＰＮＡＳ， ＵＳＡ ８６ （１０）： ３７９８−３８０２ （１９８９年）のうちのいずれかに記載されている。ＩＫＢＫＢのアミノ酸もしくは核酸配列という表現にはこれらの参考文献の全てのアミノ酸もしくは核酸配列およびその対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３３】
シンフィリンは、アルファ−シヌクレインに結合することが分かっているシヌクレイン関連蛋白質である。シンフィリンは、キナーゼそのものではないが、特にＰＬＫ２との組合せでシヌクレインのリン酸化を促進することが本明細書で明らかにされている。このシンフィリンは、ＰＬＫ２依存性にシヌクレインのリン酸化を促進するように思われた。シンフィリンの配列は、ＮＭ＿００５４６０のアセッション番号でジェンバンクに登録されており、および／または、Ｔａｎｊｉほか、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １６９ （２）： ５５３−５６５ （２００６年）、Ｅｙａｌほか、ＰＮＡＳ， ＵＳＡ １０３ （１５）： ５９１７−５９２２ （２００６年）、Ａｖｒａｈａｍほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０ （５２）： ４２８７７−４２８８６ （２００５年）、Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙほか、Ｎｅｕｒｏｈｉｏｌ． Ｄｉｓ． ２０ （２）： ４０１−４１１ （２００５年）、Ｌｉｍほか、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２５ （８）： ２００２−２００９ （２００５年）、Ｒｉｂｅｉｒｏほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７ （２６）： ２３９２７−２３９３３ （２００２年）、Ｃｈｕｎｇほか、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ７ （１０）： １１４４−１１５０ （２００１年）、Ｅｎｇｅｌｅｎｄｅｒほか、Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ １１ （９）： ７６３−７６６ （２０００年）およびＥｎｇｅｌｅｎｄｅｒほか、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２２ （１）， １１０−１１４ （１９９９年）のうちのいずれかに記載されている。シンフィリンのアミノ酸もしくは核酸配列という表現にはこれらの参考文献の全てのアミノ酸もしくは核酸配列およびその対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３４】
ＩＩＩ． アルファ−シヌクレインの単離
ヒト・アルファ−シヌクレインは次のアミノ酸配列を有するアミノ酸１４０個のポリペプチドである：
【００３５】
【化１】
（配列番号：１）
（Ｕｅｄａほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９３年） ９０： １１２８２−６；ジェンバンク・アセッション番号：Ｐ３７８４０）。この蛋白質は、認識される３つのドメイン、即ち、１から６１番目のアミノ酸をカバーするＫＴＫＥ繰返し配列ドメイン（ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ）、約６０番目から９５番目のアミノ酸に及ぶＮＡＣ（非アミロイド成分）ドメイン、および約９８番目から１４０番目のアミノ酸に及ぶＣ末端酸性ドメインを有する。
【００３６】
特に文脈から明らかでない限り、アルファ−シヌクレインという表現には上記の天然のヒト型アミノ酸配列ならびに天然のヒト型アルファ−シヌクレインと少なくとも９０％の配列同一性を有する対立遺伝子、種および誘発変異体（例えば、Ｅ８３Ｑ、Ａ９０Ｖ、Ａ７６Ｔ）などの類似体を含める。上記の類似体と天然ヒト型アミノ酸配列とを最大限に整列させた場合、この類似体のアミノ酸にはこのヒト型アミノ酸配列の対応するアミノ酸と同じ番号が付与される。類似体は、１もしくは２カ所、または数カ所で天然ペプチドと異なるが、これは多くの場合、保存的置換によるものである。一部の対立遺伝子変異体は、遺伝性ＬＢＤと遺伝的な関連がある。「対立遺伝子変異体」という用語は、同一種の異なる個体の遺伝子間の変異およびこれらの遺伝子によりコードされている蛋白質の対応する変異のことを指して用いている。対立遺伝子変異体としては、Ｅ４６Ｋ、Ａ３０Ｐ、Ａ５３Ｔ（最初の文字は配列番号：１におけるアミノ酸を示し、数字は配列番号：１におけるそのコドンの位置であり、２番目の文字は対立遺伝子変異体における対応するアミノ酸である）などの家族性突然変異体もしくは変異体が挙げられる。類似体としては対立遺伝子変異体間の任意の組合せを挙げることができる。Ａ５３Ｔの変異は、この突然変異を有さない病気ではない個体におけるリン酸化の基準に対する、突然変異を有する個体におけるアルファ−シヌクレインの１２９番目の位置のリン酸化のレベルの上昇と関連がある。
【００３７】
アルファ−シヌクレイン、その断片および類似体は、固相ペプチド合成法もしくは組換え発現法によって合成することができ、または自然源から入手することができる。自動ペプチド合成機が、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスター・シティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州などの数多くの製造業者から市販されている。組換え発現では大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞などにおいて行うことができる。組換え発現の方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．プレス、ニューヨーク、第２版、１９８９年）に記載されている。
【００３８】
細菌発現系において野生型Ｓ−１２９リン酸化アルファ−シヌクレイン、突然変異体および／または家族型を大量調製する方法をここに開発した。細菌中で組換えｈＰＬＫ２をアルファ−シヌクレインと同時発現させると、その細胞中に産生されたＳ−１２９リン酸化アルファ−シヌクレインは極めて高い収率および純度で回収された。これは、多くの大腸菌蛋白質と異なり、このアルファ−シヌクレインは加熱に耐えることができたからである。細菌溶解物を煮沸した後のアルファ−シヌクレインの純度はクロマトグラフィーの前に約９５％に達した。
【００３９】
細菌系において組換え蛋白質を同時発現させるために、各対象遺伝子を収容するプラスミドは、これらが異なる複製起点および異なる抗生物質選択性を有するようにすることによってその細菌細胞内で共存できるものを選択した。このアルファ−シヌクレイン遺伝子をｐＤＥＳＴ２４適合性ベクターであるｐＣＤＦ１ｂ中にサブクローニングした。次に、ＢＬ２１−ＤＥ３菌を、ｐＤＥＳＴ２４含有野生型ｈＰＬＫ２もしくはｈＰＬＫ２構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）突然変異体でＧＳＴ標識を有しない構造物およびｐＣＤＦ１ｂ／ＡＳプラスミドの両者で同時形質転換した。この菌の溶解物を煮沸し、アルファ−シヌクレインを含有すると期待される上清について、抗−Ｓ１２９リン酸化アルファ−シヌクレイン抗体（１１Ａ５）を用いるウェスタンブロット法、シプロ・ルビー（ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ） （商標）およびプロＺダイアモンド（ＰｒｏＺＤｉａｍｏｎｄ） （商標） 染色剤 （それぞれ、トータル蛋白質およびホスホ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ特異的染色剤）を用いる方法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法ならびに質量分析法によって分析した。その結果、極めて純粋なＳ１２９リン酸化アルファ−シヌクレインが単離され、これは、質量分析法での分析で９５％超リン酸化されていることが明らかとなった。最終生成物が１００％リン酸化されていて高純度となるように、最後の遠心の上清は１１Ａ５−セファロース−アフィニティ精製カラムを１度以上通過させた。どのような異物もＨＰＬＣを用いて除去した。
【００４０】
ＩＶ．発現を調節する因子
既知の配列の任意の目的遺伝子の発現を抑制するのに、亜鉛フィンガー蛋白質、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどの特性のよく分かった一般的クラスの多くの因子を用いることができる。亜鉛フィンガー蛋白質は、目的遺伝子の発現を活性化するのに用いることもできる。抑制の対象となる遺伝子は、好ましくはＰＬＫ２またはＧＲＫ６である。何故なら、これらの遺伝子によりコードされているキナーゼはアルファ−シヌクレインを直接リン酸化するからである。ＰＬＫ２が特に好ましい。また、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＣＲＫ６、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＧＲＫ７は、これらが直接キナーゼの間接的活性化因子である可能性が高いので、抑制の好ましい標的である。ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫはレヴィー小体病における活性化の好ましい候補である。何故なら、これらはアルファ−シヌクレインのリン酸化の負の調節因子であるからである。シンフィリンは抑制の好ましい標的である。何故なら、これは、キナーゼではないが、（通常、ＰＬＫ２などのキナーゼの存在下に）アルファ−シヌクレインのリン酸化の増大に関係しているからである。
【００４１】
亜鉛フィンガー蛋白質は、既知配列のキナーゼ遺伝子内の任意の所望標的部位に結合するように設計もしくは選択することができる。これらの蛋白質の１クラス（Ｃ２Ｈ２クラス）を特徴付ける代表的なモチーフは−Ｃｙｓ−（Ｘ）２−４−Ｃｙｓ−（Ｘ）１２−Ｈｉｓ−（Ｘ）３−５−Ｈｉｓ （ただし、Ｘは任意のアミノ酸である）である。単一フィンガードメインはアミノ酸約３０個の長さであるが、いくつかの構造研究によって、これが亜鉛を介して配位されるベータ・ターン中の２つの不変ヒスチジン残基および２つの不変システイン残基を含有するアルファヘリックスを含むことが明らかとなった。一部の方法では、その標的部位はプロモータまたはエンハンサ内にある。他の方法では、その標的部位は構造遺伝子内にある。一部の方法では、その亜鉛フィンガー蛋白質は、ヒトＫＯＸ−１蛋白質からのＫＲＡＢ抑制ドメイン（Ｔｈｉｅｓｅｎほか、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２： ３６３−３７４ （１９９０年）、Ｍａｒｇｏｌｉｎほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ４５０９−｝５１３ （１９９４年）、Ｐｅｎｇｕｅほか、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ２９０８−２９１４ （１９９４年）、Ｗｉｔｚｇａｌｌほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ４５１４−４５１８ （１９９４年））などの転写レプレッサーに結合する。一部の方法では、この亜鉛フィンガー蛋白質は、ＶＩＰ１６などの転写活性化因子に結合する。亜鉛フィンガー蛋白質により標的にするのに好適な標的部位を選択する方法および選択した標的部位に結合させるように亜鉛フィンガー蛋白質を設計する方法については国際公開公報第ＷＯ００／００３８８号に記載されている。ファージディスプレイを用いて標的に結合する亜鉛フィンガー蛋白質を選択する方法についてはＥＰ．９５９０８６１４．１に記載されている。亜鉛フィンガー蛋白質を設計するのに用いられる標的部位は通常９乃至１９ヌクレオチドのオーダーである。
【００４２】
リボザイムは酵素として働くＲＮＡ分子であり、他のＲＮＡ分子を特異的部位で切断するように設計することができる。リボザイム自体はこの過程で消費されることはなく、触媒的に作用してｍＲＮＡ標的分子の多数のコピーを切断することができる。標的ＲＮＡをトランス切断するリボザイムの設計のための一般則については、Ｈａｓｅｌｏｆｆ、Ｇｅｒｌａｃｈ、（１９８８年） Ｎａｔｕｒｅ ３３４： ５８５−５９１、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｃｋ、（１９８７年） Ｎａｔｕｒｅ ３２８： ５９６−６０３および米国特許第５，４９６，６９８号に記載されている。リボザイムは、通常、本発明のキナーゼをコードしている遺伝子の転写物上の２つの部位（標的亜部位）に対して相補性を示して結合する２つのフランキングセグメントおよびこれらフランキングセグメント間の触媒領域を含む。これらフランキングセグメントの長さは、通常５乃至９ヌクレオチド、最適には６乃至８ヌクレオチドである。このリボザイムの触媒領域の長さは、一般に約２２ヌクレオチドである。上記ｍＲＮＡ標的分子は一般式ＮＵＮ、好ましくはＧＵＣを有する上記標的亜部位間のコンセンサス切断部位を含む。（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ、Ｓｃａｎｌｏｎ、（１９９５年） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２： ２１３−２２３、Ｐｅｒｒｉｍａｎほか、（１９９２年） Ｇｅｎｅ （Ａｍｓｔ．） １１３： １５７−１６３、Ｒｕｆｆｉｅｒほか、（１９９０年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９： １０６９５−１０７０２、Ｂｉｒｉｋｈほか、（１９９７年） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４５： １−１６、Ｐｅｒｒｅａｌｔほか、（１９９１年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０： ４０２０−４０２５）。リボザイムの特異性は、標的亜部位、従って、このような亜部位に相補的であるリボザイムのフランキングセグメントの選択によってコントロールすることができる。リボザイムは、ＲＮＡ分子として、または複製可能なベクターの成分としてリボザイムをコードしているＤＮＡの形で、もしくは下記のような複製可能でない形で送達することができる。
【００４３】
また、標的キナーゼ遺伝子の発現は、この標的遺伝子の調節領域（即ち、標的遺伝子のプロモータおよび／またはエンハンサ）に相補的な配列を有する核酸を送達して三重らせん構造を形成させ、これにより体内の標的細胞内のこの標的遺伝子の転写を阻止することによって、低下させることができる。概して、Ｈｅｌｅｎｅ、（１９９１年）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６（６）： ５６９−５８４、Ｈｅｌｅｎｅほか、（１９９２年）、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６０： ２７−３６およびＭａｈｅｒ、（１９９２年）、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）： ８０７−８１５を参照されたい。
【００４４】
アンチセンス・ポリヌクレオチドは、センスｍＲＮＡに結合してその翻訳を妨げ、転写を妨げ、ＲＮＡ前駆体のプロセッシングもしくは局在化を妨げ、ｍＲＮＡの転写を抑制し、または何らかの他の機構（例えば、Ｓａｌｌｅｎｇｅｒほか、Ｎａｔｕｒｅ ４１８： ２５２ （２００２年）参照）により作用することによって抑制を引き起こすことができる。アンチセンス分子が発現を低下させる特定の機構が重要なのではない。通常、アンチセンス・ポリヌクレオチドは、本発明のキナーゼ遺伝子のｍＲＮＡからの配列に特異的にハイブリダイズする、少なくとも７乃至１０個から典型的には２０個以上のヌクレオチドの一本鎖アンチセンス配列からなる。一部のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、長さが約１０乃至約５０ヌクレオチドまたは約１４乃至約３５ヌクレオチドである。一部のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、約１００ヌクレオチド未満または約２００ヌクレオチド未満のポリヌクレオチドである。一般に、アンチセンス・ポリヌクレオチドは、安定な二本鎖を形成するのに十分長く、送達様式にもよるが、必要に応じてイン・ビボで投与するのに十分短くなければならない。標的配列への特異的なハイブリダイゼーションに必要なポリヌクレオチドの最小の長さは、いくつかの要因、例えば、Ｇ／Ｃ含量、ミスマッチ塩基（あるとすれば、その）の配置、標的ポリヌクレオチドの集団と比較した場合の配列の特異性の程度、ポリヌクレオチドの化学的性質（例えば、メチルホスホネートバックボーン、ペプチド核酸、ホスホロチオエート）などに依存している。
【００４５】
ｓｉＲＮＡは、キナーゼ転写物のような相補性ｍＲＮＡ転写物の発現を阻害する働きをする比較的短く少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡ分子である。本発明の実施ために機構の理解が必要とされるものではないが、ｓｉＲＮＡは相補性ｍＲＮＡ転写物の分解を引き起こすことにより作用すると考えられる。ｓｉＲＮＡの設計および使用の原則については概ね国際公開公報第ＷＯ９９／３２６１９号、Ｅｌｂａｓｈｉｒ、ＥＭＢＯ Ｊ． ２０： ６８７７−６８８８ （２００１年）およびＮｙｋａｎｅｎほか、Ｃｅｌｌ １０７： ３０９−３２１ （２００１年）；国際公開公報第ＷＯ０１／２９０５８号に記載されている。ｓｉＲＮＡは２本の少なくとも部分的に相補性のＲＮＡから形成され、各鎖の好ましい長さは１０乃至３０、１５乃至２５もしくは１７乃至２３もしくは１９乃至２１ヌクレオチドである。これらの鎖はその長さ全体にわたって互いと完全に相補的であってもよいし、あるいは二本鎖分子の一端もしくは両端に一本鎖３’−オーバーハングを有するものであってもよい。一本鎖オーバーハングは、存在する場合には、通常１乃至６塩基、好ましくは１または２塩基である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、本発明の遺伝子からの転写物のセグメントに対して実質的に相補性（例えば、少なくとも８０、９０、９５％、好ましくは１００％相補性）であるものを選択する。どのミスマッチ塩基もｓｉＲＮＡの鎖の末端またはその近傍に生じることが好ましい。末端のミスマッチ塩基はデオキシリボヌクレオチドとすることができる。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、対象遺伝子転写物のセグメントの相補体と類似の関係を示す。各鎖が完全な相補性の１９塩基を有する２本の鎖を有し、センス鎖およびアンチセンスの３’末端にそれぞれ２個および１個のマッチしない塩基を有するｓｉＲＮＡは特に好適である。
【００４６】
ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡをコードしているＤＮＡの形とは異なって、それ自体を投与することになる場合には、ｓｉＲＮＡの鎖には１種以上のヌクレオチド類似体を含ませることができる。このヌクレオチド類似体は、阻害活性が実質的にもたらされない位置、例えば、５’−末端および／または３’−末端の領域、特に、一本鎖オーバーハング領域に配置する。好ましいヌクレオチド類似体は糖もしくはバックボーン修飾リボヌクレオチドである。また、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、即ち、天然型核酸塩基ではなく非天然型核酸塩基、例えば、５位を修飾したウリジンもしくはシチジン（５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジンなど）；８位を修飾したアデノシンおよびグアノシン（８−ブロモグアノシンなど）；デアザヌクレオチド（７−デアザ−アデノシンなど）；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド（Ｎ６−メチルアデノシンなど）を含有するリボヌクレオチドも好適である。好ましい糖修飾リボヌクレオチドにおいては、２’ＯＨ基はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮ（但し、ＲはＣ１乃至Ｃ６アルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩである）から選ばれる基によって置換されている。好ましいバックボーン修飾リボヌクレオチドにおいては、隣接のリボヌクレオチドに接続するリン酸エステル基は、修飾されている基によって置換されており、例えば、ホスホチオエート基である。さらに好ましい修飾は、ｓｉＲＮＡの５’水酸化物残基にリン酸基を導入することである。このような基は、ｓｉＲＮＡをＡＴＰおよびＴ４キナーゼで処理することにより導入することができる。また、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素もしくは硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１種を含むよう修飾することができる。ＲＮＡ構造の修飾は、特異的な遺伝子阻害を可能にすると同時に、ｄｓＲＮＡにより引き起こされる一部の生体における全般的なパニック反応が起こるのを防止するように調製することができる。同様に、塩基はアデノシン・デアミナーゼの活性をブロックするように修飾することができる。
【００４７】
Ｖ．キナーゼの特定
アルファ−シヌクレインのリン酸化またはその産生を直接的もしくは間接的に調節するキナーゼは、実施例で示したように、特定することができる。一般に、潜在的阻害剤のライブラリはキナーゼ遺伝子のコレクションの既知の配列に基づいて設計される。このライブラリを構成する物質は、上述した種類の分子のいずれかとすることができる。次に、このライブラリの構成物質をアルファ−シヌクレイン発現細胞に導入する。この細胞およびアルファ−シヌクレインはいずれもヒトのものであることが好ましい。通常、このような細胞にはヒト・アルファ−シヌクレインをコードしているＤＮＡおよび試験対象のライブラリ構成物質をコードしているＤＮＡの両者がトランスフェクトされる。ライブラリ構成物質は個別に、または、まとめてスクリーニングすることができる。ライブラリ構成物質を導入し、このライブラリ構成物質が発現されてそのキナーゼを抑制するのに十分な期間培養した後、トータル・アルファ−シヌクレインおよびリン酸化アルファ−シヌクレインの濃度を測定し、キナーゼ発現を抑制するライブラリ構成物質を処置しなかったがその他の点では同様な対照細胞における対応する濃度と比較する。測定は、アルファ−シヌクレインのトータル濃度を測定するためのアルファ−シヌクレイン（好ましくは、ヒト・アルファ−シヌクレイン）に特異的な抗体およびリン酸化アルファ−シヌクレインの濃度を測定するためのリン酸化アルファ−シヌクレインに特異的な抗体を用いてイムノアッセイにより行った。代表的な抗体については２００４年１１月８日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７４４４に記載されている（引用により本明細書に組み込まれている）。通常の測定誤差の範囲から外れるという意味で有意である、処置および対照細胞間でのリン酸化アルファ−シヌクレイン濃度の低下は、この細胞に導入した阻害剤がキナーゼを阻害し、これによりアルファ−シヌクレインのリン酸化が直接的または間接的に影響を受けたことを示すものである。このキナーゼの同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、阻害剤を個々にスクリーニングすることにより、あるいは阻害剤をまとめてスクリーニングする場合には阻害剤をコードしている核酸の配列を決定することにより、阻害剤の同一性から決めることができる。同様に、アルファ−シヌクレインのトータル濃度に関して、そのような濃度の測定における通常の測定誤差の範囲を外れる、処置および対照細胞間での低下は、阻害剤がアルファ−シヌクレインの発現レベルに間接的に影響するキナーゼを阻害することを示すものである。
【００４８】
次いで、最初のスクリーニングにより特定されたキナーゼ、特に、セリン・キナーゼであることが知られているキナーゼは、インビトロ、細胞またはトランスジェニック動物モデルにおいてアルファ−シヌクレインをリン酸化するその能力について試験することができる。インビトロ・アッセイは、アルファ−シヌクレインを直接リン酸化するかどうかを示すものであり、従って、アルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができると考えらる、最初のスクリーニングで特定されたキナーゼにのみ有用である。細胞およびトランスジェニック動物によるアッセイは、直接的または間接的にリン酸化に影響を与えるキナーゼをスクリーニングするのに用いることができる。インビトロ・アッセイは、アルファ−シヌクレインを試験対象のキナーゼおよびＡＴＰと適当な緩衝液中で接触させることによって行う。好ましくは、ＡＴＰはγ−３２Ｐ ＡＴＰであり、この場合、リン酸化アルファ−シヌクレインは放射標識され、ゲル上で検出することができる。また、リン酸化については、前述のようなリン酸化アルファ−シヌクレインに特異的な抗体を用いて測定することができる。あるいは、結合アッセイを用いてＡＴＰ消費を測定することにより、間接的にリン酸化を測定することができ、このアッセイでは、Ｎａｔｕｒｅ ７８： ６３２ （１９５６年）、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６： ３１−４０ （１９７０年）に記載されているようにしてＡＤＰを検出する。リン酸化の程度は、キナーゼまたはＡＴＰまたはこれらの両者を除いた対照と比較することができる。リン酸化の増大は、キナーゼがアルファ−シヌクレインを直接リン酸化することを示すものである。細胞によるアッセイは、細胞内にトランスフェクトしたアルファ−シヌクレイン、好ましくはヒト・アルファ−シヌクレインを発現する細胞で行う。キナーゼを発現することができる核酸も細胞内にトランスフェクトする。細胞内のリン酸化アルファ−シヌクレインの濃度は、このトランスフェクトキナーゼを欠く同様な対照細胞内のそれとの比較で測定する。リン酸化の増大は、キナーゼがアルファ−シヌクレインを直接的または間接的にリン酸化することを示すものである。トランスジェニック動物によるアッセイは、レヴィー小体様沈着物を形成する傾向のある、ヒト・アルファ−シヌクレインを発現するトランスジェニック動物と、キナーゼ導入遺伝子をも発現する同様な動物とを比較することによって行うことができる。導入遺伝子としてアルファ−シヌクレインのみを有するトランスジェニック動物に比し、さらにキナーゼ導入遺伝子を有するトランスジェニック動物においてリン酸化アルファ−シヌクレインおよび／またはレヴィー小体様沈着物が減少することは、このキナーゼがアルファ−シヌクレインのリン酸化に直接的または間接的に関与していることを示すものである。
【００４９】
ＶＩ．活性を調節する化合物
種々の化合物について、キナーゼの発現または活性を調節（通常、阻害）する能力をスクリーニングすることができる。ＰＬＫ２またはＧＲＫ６は、アルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができるキナーゼ候補であるため、阻害のための好ましいキナーゼである。ＰＬＫ２は、ＧＲＫ６またはここで試験した他のキナーゼよりもはるかに高レベルでアルファ−シヌクレインをリン酸化することが分かっているので、特に好ましいキナーゼである。ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＧＲＫ７も、この直接キナーゼの間接的な活性化因子である可能性が高いので、阻害のための好ましいキナーゼである。ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫは、アルファ−シヌクレインのリン酸化の負の調節因子であるので、レヴィー小体病における活性化のための好ましいキナーゼである。あるいは、こうしたキナーゼ自体または同様な活性を有するその断片もしくは模倣剤はアルファ−シヌクレインのリン酸化の阻害剤としてそのまま用いることができる。シヌクレインは、アルファ−シヌクレインのリン酸化の阻害のための治療上の代替的な標的として用いることができる。例えば、アルファ−シヌクレインおよびＰＬＫ２発現を有するアッセイにシンフィリンを加えて、シンフィリンの阻害剤を特定することができる。
【００５０】
キナーゼの発現または活性の調節能力についてスクリーニング対象となる化合物としてはセクションＩＶに記載した発現の調節物質が挙げられる。また、これらの化合物としては多くの既知のキナーゼ阻害剤の例が挙げられ、その一部については既に治療的使用が承認され、または通常癌の治療のための臨床試験が行われている。先導（ｌｅａｄ）構造としてはキナゾリン類、ピリド［ｄ］−およびピリミドール［ｄ］ピリミジン類、ピラゾロ［ｄ］−ピリミジン類、ピロロ［ｄ］ピリミジン類、フェイルアミノ−ピリミジン類、１−オキソ−３−アリール−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸誘導体類、置換インドリン−２−オン類ならびにスタウロスポリンなどの天然物類が挙げられる（Ｔｒａｘｌｅｒほか、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２１： ４９９−５１２ （２００１年）参照）。そのような化合物の一部はカルビオケム−ノバビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｃｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）（ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州）から市販されており、例えば、Ｈ８９、Ｙ２７６３２、ＡＴ８７７ （塩酸ファスジル）、ロットレリン、ＫＮ６２、Ｕ０１２３、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ワートマニン、Ｌｉ＋、Ｒｏ３１８２２０、ケレリスレイン（ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｅｉｎ）および１０−［３−（１−ピペリジニル）プロピル］−２−トリフルオロメチル−フェノチアジンが挙げられる（Ｄａｖｉｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３５１： ９５−１０５ （２０００年）参照）。現在臨床試験中の他の化合物としては、ＳＴ１５７１（ギルベックＴＭ （ＧｌｉｖｅｃＴＭ）、フェニルアミノ−ピリミジン誘導体）（ノバルティス社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、ＺＤ１８３９（イレッサ）（アストラゼネカ社（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））、ＯＳＩ−７７４（ロシュ／ＯＳＩ社）、ＰＫＩ１６６（ノバルティス社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、ＣＩ１０３３（ファイザー／ワーナー−ランバート社（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｗａｍｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ））、ＥＫＢ−５６９（ワイス−エルスト社）、ＳＵ５４１６（ＳＵＧＥＮ社）、アニリン−フタラジン誘導体ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２４５８４（ノバルティス／シェリングＡＧ社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ））、ＳＵ６６６８（ＳＵＧＥＮ社）、ＺＤ６４７４（アストラゼネカ社（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））およびＣＥＰ２５８３（セファロン社（Ｃｅｐｈａｌｏｎ））が挙げられる。カベオリン−１はＧＲＫキナーゼの活性を調節することが知られている化合物の１例である。ＰＬＫ２／ＳＮＫキナーゼの活性を調節することが知られている化合物の例としては、ｈＶＰＳ１８（液胞蛋白輸送関連蛋白１８）のＲＩＮＧ−Ｈ２ドメインならびにカルシウム−およびインテグリン−結合蛋白ＣＩＢが挙げられる。他の化合物は、例えば、海洋微生物、藻類、植物、真菌類などの自然源から得ることができる。試験することができる他の化合物としては、シンフィリンなどのアルファ−シヌクレインと相互作用することが知られている化合物が挙げられる。あるいは、ペプチドもしくは低分子化合物を含む因子のコンビナトリアルライブラリから、または産業において、例えば、化学、医薬品、環境、農、海洋、薬用化粧、製薬およびバイオテクノロジー産業によって合成された化学物質の既存の在庫から化合物を得ることができる。化合物としては、例えば、因子、治療剤、環境、農業もしくは工業用薬剤、汚染物質、薬用化粧品、医薬物質、有機化合物、脂質、糖質コルチコイド、抗生物質、ペプチド、蛋白質、糖、炭水化物およびキメラ分子を挙げることができる。
【００５１】
コンビナトリアル・ライブラリは、段階的な方法で合成することができる多くの種類の化合物について作製することができる。このような化合物としては、ポリペプチド、蛋白質、核酸、β−ターン模倣物質、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン、およびオリゴカルバメートが挙げられる。これらの化合物の大きなコンビナトリアル・ライブラリは、アフィマックス社（Ａｆｆｙｍａｘ）の国際公開第９５／１２６０８号、アフィマックス社（Ａｆｆｙｍａｘ）の国際公開第９３／０６１２１号、コロンビア大学（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の国際公開第９４／０８０５１号、ファーマコペア社（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）の国際公開第９５／３５５０３号およびスクリップス社（Ｓｃｒｉｐｐｓ）の国際公開第９５／３０６４２号（これらはいずれも、あらゆる目的で引用により本明細書に組み込まれている）に記載されているコード化合成ライブラリ（ＥＳＬ）法によって構築することができる。また、ペプチド・ライブラリは、ファージ・ディスプレイ法によって作製することもできる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎの国際公開第９１／１８９８０号を参照されたい。また、スクリーニング対象の化合物は、例えば、国立がんセンター研究所（ＮＣＩ）天然物リポジトリ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、ベセズダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、メリーランド州、ＮＣＩ公開合成化合物コレクション（Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ベセズダ、メリーランド州、ＮＣＩ治療開発プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）などの政府系または私的供給源から入手することもできる。
【００５２】
上記化合物としては、本発明のキナーゼに特異的に結合する完全な状態の抗体およびＦａｂ、Ｆｖなどのその結合断片が挙げられる。通常、この抗体はモノクロナール抗体であるが、ポリクロナール抗体も組換え技術によって発現させることはできる（例えば、米国特許第６，５５５，３１０号参照）。発現させることができる抗体の例としては、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、合体（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体およびヒト抗体が挙げられる。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖の遺伝子が、異なる種に由来する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、通常遺伝子操作によって構築された抗体である（例えば、Ｂｏｙｃｅほか、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４： ５２０−５３５ （２００３年）参照）。例えば、マウス・モノクロナール抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントをヒト定常（Ｃ）セグメントに結合させることができる。従って、代表的なキメラ抗体は、マウス抗体のＶ、即ち抗原結合ドメインと、ヒト抗体のＣ、即ちエフェクタ・ドメインとから成るハイブリッド抗体である。ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）からの可変領域フレームワーク残基、および実質的にマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと呼ばれる）からの相補性決定領域を有する。Ｑｕｅｅｎほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： １００２９−１００３３ （１９８９年）ならびに国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。また、定常領域は、もし存在させる場合、実質的または完全にヒト免疫グロブリンからのものとする。抗体は、とりわけ、従来のハイブリドーマ法、ファージ・ディスプレー法（例えば、Ｄｏｗｅｒほか、国際公開第ＷＯ ９１／１７２７１号およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙほか、国際公開第ＷＯ ９２／０１０４７号参照）、ならびにヒト免疫系を有する遺伝子導入マウスの使用（Ｌｏｎｂｅｒｇほか、国際公開第Ｗ０９３／１２２２７号 （１９９３年））によって得ることができる。免疫グロブリン鎖をコードしている核酸は、ハイブリドーマもしくは抗体産生細胞株から、または公表文献中の免疫グロブリンの核酸もしくはアミノ酸配列に基づいて得ることができる。
【００５３】
ＶＩＩ． レヴィー小体病のトランスジェニック動物モデル
トランスジェニック動物モデルは、上記のようにアルファ−シヌクレインをリン酸化し、レヴィー様小体を形成するキナーゼの能力を試験するのに有用である。また、トランスジェニック動物は、アルファ−シヌクレインのリン酸化または産生を調節する際の活性について因子をスクリーニングするのにも有用である。特に好ましい因子は、ＰＬＫ２およびＧＲＫ６、またはＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＧＲＫ７を含むキナーゼを阻害するか阻害すると考えられる因子である。また、キナーゼＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫを活性化するか活性化すると考えられる因子も好ましい。さらに、ノックアウト動物（即ち、ｓｉＲＮＡ、亜鉛フィンガー蛋白質などによる挿入不活化またはトランス抑制によって内因性キナーゼが不活化されている動物）は動物に対するキナーゼ活性除去の効果を確認するのに有用である。例えば、ＰＬＫ２−ノックアウトマウスを分析することによって、ＰＬＫ２阻害剤が何らかの副作用を示すかどうかが分かる。類似のノックアウトマウスによれば、他のキナーゼについての同様の情報が明らかとなる。
【００５４】
一般に、遺伝子導入モデルは、アルファ−シヌクレイン導入遺伝子をその発現を確実にするための１種以上の調節配列と動作可能に連鎖する形で含むゲノムを有する。この導入遺伝子が発現されると、アルファ−シヌクレインのレヴィー様沈着物がこの動物の脳内に形成されることになる。数種のこのようなトランスジェニック動物が科学および特許文献に記載されている（Ｍａｓｌｉａｈほか、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． （１９９６年） １４８： ２０１−１０６およびＦｅａｎｙほか、Ｎａｔｕｒｅ （２０００年） ４０４： ３９４−８））、（突然変異型ＡＰＰを有するトランスジェニック動物に関する）米国特許第５，８１１，６３３号参照）。一部のトランスジェニック動物は、アルファ−シヌクレインの家族性突然変異体Ａ３０Ｐ、Ａ５３ＴおよびＥ４６Ｋなどのアルファ−シヌクレイン変異体または突然変異体を発現する。一部のトランスジェニック動物は、上述のようなキナーゼをコードしている導入遺伝子などの更なる導入遺伝子を有する。また、アルファ−シヌクレイン蛋白質を発現する導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、アルツハイマー病のモデルなどの神経原性疾患の他の遺伝子導入モデルと交配させることもできる。例えば、切断型アルファ−シヌクレイン蛋白質を発現する導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、例えば、Ｇａｍｅｓほか、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：５２３（１９９５年）： ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅほか、米国特許第５，６１２，４８６号； Ｈｓｉａｏほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９（１９９６年）； Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９４：１３２８７−１３２９２（１９９７年）； Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１３２８７−１３２９２（１９９７年）； Ｂｏｒｃｈｅｌｔほか、Ｎａｔｕｒｅ １９：９３９−９４５（１９９７年）に記載されている、導入遺伝子により発現されるＦＡＤ突然変異を含むＡＰＰを有するトランスジェニック動物と交配させることができる。このような交配を実施する方法については、例えば、Ｍａｓｌｉａｈほか、ＰＮＡＳ ＵＳＡ９８：１２２４５−１２２５０（２００１年）に記載されており、これには完全長のアルファ−シヌクレインを発現する遺伝子導入マウスとＧａｍｅｓ他により記載されているようなＰＤＡＰＰマウスとの交配が報告されている。本発明のトランスジェニック動物は、好ましくは、マウス、ラットなどの齧歯動物、もしくはショウジョウバエなどの昆虫である。トランスジェニック動物は生殖細胞段階で導入遺伝子を導入することによって作製することができ、この場合、このトランスジェニック動物の細胞の全てもしくは（体細胞突然変異によるまれな損失を除き）実質的に全てがゲノムに組み込まれた導入遺伝子を含む。導入遺伝子は微量注入、核移植またはウイルス感染によって細胞または動物内に導入することができる。レンチウイルスは後者において特に好適である。あるいは、導入遺伝子は、ウイルス感染によって動物の脳内に導入することができる。このような導入遺伝子はレシピエント動物の生殖細胞の一部ではなく、病気に関与する脳の領域（例えば、黒質）を標的にすることができる。このような動物モデルはアルファ−シヌクレインを脳細胞のゲノムに組み入れており、ＬＤＢ病の少なくとも１つの特徴を生じる傾向がある。レンチウイルスは脳内にアルファ−シヌクレイン導入遺伝子をそのように導入するための好適な伝達体となる（Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３： ３６４−３７２ （２００３年）； Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２６， ３８６−９２ （２００３年）； Ｌｏｔｈａｒｉｕｓほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７： ３８８８４−９４ （２００２年）； Ｚｈｏｕほか、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８６６： ３３−４３ （２０００年）参照）。また、トランスジェニック動物には、アルファ−シヌクレインを発現する導入遺伝子の代わりに、またはこれと共に、本発明のキナーゼのうちの１種を発現することができる導入遺伝子（例えば、このキナーゼを、動物の脳内でのその発現を確実にするための調節エレメントと動作可能に連鎖する形でコードしている核酸）を組み込むこともできる。必要に応じて、シンフィリンを発現する導入遺伝子を組み込むこともできる。
【００５５】
また、レヴィー小体病の細胞モデルも本発明のスクリーニング方法に用いることができる。アルファ−シヌクレインをトランスフェクトした細胞は凝集アルファ−シヌクレインを含む封入体を形成する。この形質転換細胞はＧＴ１−７神経細胞（Ｈｓｕｅほか、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５７： ４０１−４１０ （２０００年））、ＰＣ１２細胞またはＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞などの神経細胞であることが好ましい。ＰＥＡＫおよび／またはＨＣＣ細胞を用いることもできる（実施例１１参照）。細胞はヒト細胞であることが好ましい。アルファ−シヌクレインを、その発現の発現を確実にする１種以上の調節配列に動作可能なように連結した形をコードしているセグメントを含むベクターを細胞中にトランスフェクトする。また、細胞には、上記のような本発明のキナーゼをコードしている核酸をトランスフェクトすることもできる。トランスフェクト細胞は、アルファ−シヌクレイン封入体の除去における活性について因子をスクリーニングするのに用いることができる。代表的な細胞モデルを実施例１１で確認するが、この実施例では、ＬＢ形成に対応するシヌクレインの凝集およびリン酸化が起こるようにＨＣＣ神経細胞にシヌクレインおよびＰＬＫ２をトランスフェクトする。キナーゼの阻害剤を特定するために、阻害剤をシヌクレインおよびＰＬＫ２と共に発現させ、リン酸化および／または凝集の量の減少を確認する。
【００５６】
ＶＩＩＩ．調節因子の特定
アルファ−シヌクレインを直接的または間接的にリン酸化するキナーゼの発現または活性を調節する因子は種々のアッセイによって特定することができる。特に好ましい因子は、キナーゼＰＬＫ２もしくはＧＲＫ６、またはＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＧＲＫ７を阻害する因子、あるいはＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫを活性化させる因子である。発現を調節する因子は細胞を利用したアッセイで特定することができるが、このアッセイでは、アルファ−シヌクレイン、およびアルファ−シヌクレインを直接または間接的にリン酸化するかトータル・アルファ−シヌクレインの濃度を調節するキナーゼを発現する細胞中に試験対象の因子を導入する。必要に応じて、特にＰＬＫ２の場合、さらにシンフィリンを発現させることによりこのキナーゼの活性を増強することができる。この因子は、直接、またはこの因子をコードし発現することができる核酸の形で導入することができる。細胞は自然界でアルファ−シヌクレインおよびキナーゼを発現することができ、あるいはこれらの片方または両方を適当な核酸のトランスフェクトによって細胞内に導入することができる。この因子のキナーゼ発現に対する効果は、このキナーゼもしくはそのｍＲＮＡの濃度から直接的に、あるいは前述のように、リン酸化アルファ−シヌクレインまたはトータル・アルファ−シヌクレインの濃度を測定することにより間接的に測定することができる。キナーゼｍＲＮＡの濃度はハイブリダイゼーション型アッセイによって分析することができる。キナーゼの濃度はイムノアッセイによって分析することができる。必要に応じて、キナーゼは、検出を容易にするためにフラッグ（Ｆｌａｇ）（商標）などのペプチド標識で標識する（Ｈｏｐｐほか、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０ （１９８８年））。キナーゼの濃度を低下させ、アルファ−シヌクレインのリン酸化のレベルを減少させ、および／または因子を処置されていない同様な対照細胞との比較でトータル・アルファ−シヌクレインの濃度を低下させる因子は、レヴィー小体病の治療に有用な可能性のある薬理活性を有する。
【００５７】
また、アルファ−シヌクレインをリン酸化し、またはアルファ−シヌクレインのトータル濃度を増加させると考えられるキナーゼの活性を調節する活性について因子をスクリーニングする。最初のスクリーニングは、キナーゼに特異的に結合することができる因子のサブセットを選択するために行う。このようなアッセイは、単離キナーゼまたはキナーゼ活性を有するその断片を用いてインビトロで行うことができる。
【００５８】
次に、このようなスクリーニングにより特定した因子については機能的なアッセイを行うことができる。また、因子は、上記結合アッセイを行わずに、機能的アッセイに直接かけることもできる。アルファ−シヌクレインを直接リン酸化するキナーゼの場合、調節剤は、このキナーゼ、アルファ−シヌクレイン、ＡＴＰおよび調節剤を併用するインビトロアッセイによって、この調節剤を除外した対照との比較でスクリーニングすることができる。必要に応じて、特にキナーゼがＰＬＫ２である場合には、リン酸化を増大させるためにシンフィリンを含めることもできる。調節剤は、対照との比較で通常の実験誤差の範囲を超えてリン酸化のレベルを低下させる場合には、有用な可能性のある薬理活性を有する。
【００５９】
また、因子は、アルファ−シヌクレイン、試験対象のキナーゼ、および、必要に応じて、特にキナーゼがＰＬＫ２である場合、シンフィリンを発現する細胞でスクリーニングすることもできる。このようなスクリーニングは、キナーゼが直接的または間接的にアルファ−シヌクレインをリン酸化するか、そうではなくアルファ−シヌクレインの濃度に影響するかにかかわらず、効果的である。細胞を因子と接触させ、トータル・アルファ−シヌクレインおよびリン酸化アルファ−シヌクレインの濃度を、この因子を処置しなかった対照細胞との比較で上述のようにして測定する。リン酸化アルファ−シヌクレインまたはトータル・アルファ−シヌクレインの濃度が通常の実験誤差の範囲を超えて、上記因子を処置しなかった対照細胞の対応する濃度と比較して低下することは、この化合物がレヴィー小体病の治療に有用な可能性のある薬理活性を有することを示すものである。
【００６０】
また、因子は、レヴィー小体病のトランスジェニック動物モデル単独または上述の他のアッセイとの組合せでスクリーニングすることもできる。アルファ−シヌクレイン、リン酸化アルファ−シヌクレインあるいはレヴィー様小体またはレヴィー小体病変もしくは症状の他のインディカのトータル濃度を、試験対象因子を処置したトランスジェニック動物において、この因子を処置しなかった同様な対照動物における対応する濃度との比較で測定する。これらの濃度のうちの１つ以上が低下することは、この因子がレヴィー小体病の治療に有用な可能性のある薬理活性を有することを示すものである。
【００６１】
上記アッセイならびに細胞および遺伝子導入モデルに用いるキナーゼは、本願に示した参考文献またはアセッション番号のうちの１つに配列が記載されているヒト・キナーゼであることが好ましい。しかしながら、このようなキナーゼの対立遺伝子変異体（種内の変異体）および種変異体（種間の変異体）も、変異体がそのようなキナーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し得るので、用いることができる。その後の臨床使用においては、このようなアッセイによって特定された因子は天然のキナーゼ、好ましくはヒトに存在する型のキナーゼの活性または発現を調節することができる。
【００６２】
ＩＸ．レヴィー小体病
レヴィー小体病（ＬＢＤ）の特徴は、ドーパミン作動系の変性、運動性変調、認知障害、およびレヴィー小体（ＬＢ）の形成である。（ＭｃＫｅｉｔｈほか、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ （ＤＬＢ）： Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＬＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （１９９６年） ４７：１１１３−２４）。レヴィー小体は神経細胞に見出される球状の蛋白質沈着物である。これが脳内に存在すると、アセチルコリン、ドーパミンなどの化学的メッセンジャーの作用が遮断されて脳の正常な機能が妨げられる。レヴィー小体病としては、（特発性パーキンソン病（ＰＤ）を含む）パーキンソン病、レヴィー小体を有する痴呆（ＤＬＢ）としても知られるびまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病とパーキンソン病との併発、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）が挙げられる。ＤＬＢＤは、アルツハイマーおよびパーキンソン病の症状を共有する。ＤＬＢＤは、主にレヴィー小体の存在部位がパーキンソン病と異なる。ＤＬＢＤではレヴィー小体は主として皮質に形成される。パーキンソン病ではこれは主として黒質に形成される。他のレヴィー小体病としては、自律神経失調症、レヴィー小体性燕下困難（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｙｓｐｈａｇｉａ）、偶発性ＬＤＢ、遺伝性ＬＤＢ（例えば、アルファ−シヌクレイン遺伝子の突然変異体ＰＡＲＫ３およびＰＡＲＫ４）ならびに多系統萎縮症（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群）が挙げられる。
【００６３】
Ｘ．治療方法
本発明は、レヴィー小体病に罹患しているか、罹患するリスクを有する患者においてこの疾患を予防もしくは治療するいくつかの方法を提供する。治療剤としては、アルファ−シヌクレインのリン酸化を阻害し、および／またはアルファ−シヌクレインのトータル濃度を低下させる上記因子の全てが挙げられる。
【００６４】
治療の対象となる患者としては、現在ＬＢＤの症状を示している患者ばかりでなく、ＬＢＤに罹患するリスクを有するが、症状は出ていない者も含まれる。従って、本方法は、ＬＢＤの遺伝的リスクを有することが分かっている個体に予防的に施行することができる。このような個体としては、本疾患に罹患したことのある血縁者を有する個体、および遺伝子もしくは生化学的マーカーの解析によってリスクが明らかにされている個体が挙げられる。ＰＤに対するリスクの遺伝子マーカーとしては、アルファ−シヌクレインもしくはパーキン（Ｐａｒｋｉｎ）、ＵＣＨＬＩ、ＬＲＲＫ２およびＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の突然変異；特に、アルファ−シヌクレイン遺伝子の３０および５３番目の位置の突然変異が挙げられる。ＰＤに対するリスクの別の遺伝子マーカーにはそのレベルまたはＳＮＣＡ量もしくは転写の測定がある。現在パーキンソン病に罹患している個体は、静止振戦、筋固縮、運動緩徐および姿勢の不安定を含む臨床症状によって見分けることができる。
【００６５】
一部の方法では、上記患者は、レヴィー小体を特徴とする疾患以外のどんなアミロイド生成性疾患の臨床症状もしくはリスク要因も有さない者である。一部の方法では、上記患者は、細胞外アミロイド沈着を特徴とするどんな疾患の臨床症状もしくはリスク要因も有さない者である。
【００６６】
一般的には、治療は、ある期間にわたって多回投与することを必要とする。治療は、治療すべき疾患の徴候や症状を治療開始前のベースライン測定値との比較で測定することによってチェックすることができる。一部の方法では、因子の投与により細胞内の凝集アルファ−シヌクレインのレベルが低下する。一部の方法では、因子の投与によりリン酸化のレベルが低下する。一部の方法では、因子の投与により、パーキンソン病の場合の運動もしくは認識機能のようなＬＢＤの臨床症状が改善する。
【００６７】
予防的な適用では、医薬用組成物もしくは因子を、ＬＢＤに罹りやすいか、それとも罹るリスクのある患者に対して、そのリスクを除去もしくは低下させ、その重症度を軽減し、あるいはこの疾患の生理学的、生化学的、組織学的および／または行動上の症状、その合併症ならびにこの疾患の進行中に発現する中間的な病理学的表現型を含むこの疾患の発現を遅らせるのに十分な投与量および投与頻度のこの組成物もしくは因子を含む治療法において投与する。治療的な適用では、組成物もしくは因子を、そのような疾患が疑われるか、すでに罹患している患者に対して、その合併症およびこの疾患の進行中に発現する中間的な病理学的表現型を含むこの疾患の（生理学的、生化学的、組織学的および／または行動上の）症状を治すか、少なくとも部分的に抑えるのに十分な投与量および投与頻度のこの組成物を含む治療法において投与する。治療的もしくは予防的処置を遂行するのに適切な量は、治療的もしくは予防的有効用量と定義される。治療的もしくは予防的処置を遂行するのに適切な量および投与頻度の組み合わせは、治療的もしくは予防的有効療法と定義される。
【００６８】
上述の症状の処置のための本発明の組成物の有効用量は、多くの種々の要因、例えば、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトか動物か、他の投与因子、および処置が予防的なものか治療的なものかによって異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。処置用量は、安全性および有効性を最適化するために漸増する必要がある。
【００６９】
投与量および投与頻度は、処置が予防的なものか治療的なものかによっても異なることがある。指針は、キナーゼ阻害剤の投与スケジュールから、または他の適応についての臨床試験において得ることができる。０．１乃至１０００ｍｇ、好ましくは１０乃至５００ｍｇの範囲の投与量。投与頻度（例えば、日、週または月当たり）は薬物の半減期によって変わる。予防的適用では、比較的低用量を長期間比較的低頻度の間隔で投与する。一部の患者では、その後の生涯にわたって処置が継続される。治療的適用では、疾患の進行が低減するか停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量を投与することが必要な場合がある。その後は、この患者に予防療法を施行することができる。
【００７０】
治療剤は、予防的および／または治療的処置において、非経口的、局所的、経静脈的、経口的、経皮下的、経動脈的、経頭蓋内的、経髄腔内的、経腹腔内的、経鼻腔内的もしくは経筋肉内的手段によって投与することができる。一部の方法では、因子を、沈着物が蓄積している特定の組織に直接注射（例えば、頭蓋内注射）する。一部の方法では、因子を、徐放組成物もしくはデバイス、例えば、メディパッド（Ｍｅｄｉｐａｄ）（商標）デバイスとして投与する。血液脳関門を十分に通過する小分子は、通常経口的に投与されるが、静脈内投与することもできる。
【００７１】
必要に応じて、本発明の因子は、ＬＢＤの処置に少なくとも部分的に有効である他の因子との併用で投与することができる。また、本発明の因子は、脳血液関門に対する本発明の因子の通過を促進する他の因子と併用して投与することもできる。
【００７２】
多くの場合、本発明の因子は、有効な治療剤および各種の他の医薬用として許容可能な成分を含む医薬用組成物として投与する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８０年）を参照されたい。好ましい形態は、所望の投与様式および治療用途によって決まる。また、この組成物には、所望の製剤に応じて、動物もしくはヒトへの投与用の医薬用組成物を処方するために一般的に用いられる賦形剤と定義される、医薬用として許容可能で毒性のない担体もしくは希釈剤を含めることができる。この希釈剤は、その組み合わせの生物活性に影響を与えないように選択する。このような希釈剤の例としては、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、およびハンクス液がある。さらに、この医薬用組成物もしくは製剤は、他の担体、アジュバント、もしくは毒性がなく治療用ではない非免疫原性の安定化剤なども含むことができる。
【００７３】
また、医薬用組成物には、蛋白質、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および（ラテックス官能化セファロース（ｌａｔｅｘ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）、アガロース、セルロースなどの）コポリマー、アミノ酸重合体、アミノ酸共重合体、ならびに（油滴、リポソームなどの）脂質凝集物などの大きくてゆっくりと代謝される高分子を含めることもできる。
【００７４】
非経口投与の場合、本発明の因子は、水、油、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの滅菌液とすることができる医薬用担体を含む生理的に許容可能な希釈剤を用いたこの物質の溶液もしくは懸濁液として、注射可能な用量を投与することができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤などの補助剤を組成物に加えることができる。医薬用組成物の他の成分としては、石油、動物、植物もしくは合成由来の成分、例えば、ピーナッツ油、大豆油および鉱油がある。一般に、プロピレングリコール、ポリエチレン・グリコールなどのグリコール類が、特に注射用溶液には好ましい液体担体である。抗体は、有効成分の持続放出を可能にするように処方することができるデポー注射剤もしくは植込み製剤の形で投与することができる。例示的な組成物は、５０ｍＭのＬ−ヒスチジンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌからなり、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整した水性緩衝液に配合したモノクロナール抗体を５ｍｇ／ｍＬ含む。通常、非経口投与用の組成物は、実質的に無菌で、実質的に等張であり、ＦＤＡもしくは同様な機関のＧＭＰ条件下に製造される。
【００７５】
通常、組成物は溶液もしくは懸濁液の形の注射剤として調製するが、注射に先立って液体溶媒に溶解もしくは懸濁するのに適した固形物として調製することもできる。また、この製剤は、上述のアジュバント効果を増強するために、リポソームもしくはポリラクチド、ポリグリコリド、コポリマーなどの微粒子を用いて乳化もしくは封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７（１９９０年）およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７−１１９（１９９７年）参照）。本発明の因子は、有効成分の持続もしくはパルス放出を可能にするように処方することができるデポー注射剤もしくは植込み製剤の形で投与することができる。
【００７６】
他の投与様式に適した別の製剤としては、経口用、鼻腔内用および呼吸器用（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）製剤、坐剤ならびに経皮投与剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。坐剤の場合、結合剤および担体としては、例えば、ポリアルキレン・グリコールもしくはトリグリセリドが挙げられ、このような坐剤は、本有効成分を０．５％乃至１０％、好ましくは１％乃至２％含む混合物から作製することができる。経口用製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含む。この組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤もしくは散剤の形をとり、有効成分を１０％乃至９５％、好ましくは２５％乃至７０％含む。
【００７７】
局所に適用すると、経皮的に、もしくは皮内から送達させることができる。本剤をコレラトキシンまたはその無毒化誘導体もしくはサブユニットあるいは他の同様な細菌毒素と同時投与することにより局所投与を容易にすることができる（Ｇｌｅｎｎほか、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８５１（１９９８年））。同時投与は、これらの成分を混合物として、または化学的架橋結合もしくは融合蛋白質としての発現により得られる結合分子として用いることにより達成することができる。あるいは、スキン・パス（ｓｋｉｎ ｐａｔｈ）もしくはトランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）を用いて経皮的送達を達成することができる（Ｐａｕｌほか、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２５：３５２１−２４（１９９５年）； Ｃｅｖｃほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３６８：２０１−１５（１９９８年））。
【００７８】
以下の実施例では、細胞に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクトおよび特異的キナーゼ標的のノックダウンを行ってアルファ−シヌクレインのリン酸化を直接的または間接的に調節するキナーゼを特定した。その後のインビトロおよび組織培養の実験ではこれらのキナーゼのうちの２種、ＰＬＫ２およびＧＲＫ６が直接的かつ特異的にアルファ−シヌクレインのセリン１２９をリン酸化することが分かった。さらに行った実験から、ＰＬＫ２によるアルファ−シヌクレインのセリン１２９のリン酸化の程度はＧＲＫ６や本明細書に記載した他のキナーゼのそれをはるかに超えるものであった。従って、ＰＬＫ２はシヌクレインキナーゼである可能性が非常に高い。
【実施例】
【００７９】
（実施例）
実施例１：アルファ−シヌクレインのリン酸化を調節するキナーゼのスクリーニング
α−シヌクレインをセリン１２９においてリン酸化するキナーゼもしくはキナーゼ類を特定するために、定量化可能な量のリン酸化α−シヌクレインを含む細胞を用いてｓｉＲＮＡキナーゼ・ライブラリ（アンビオン社）をスクリーニングした。ＣＭＶプロモータの制御下にあるヒトの野生型α−シヌクレインを安定的にトランスフェクトしたヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３細胞（ＰＥＡＫ細胞）（ＰＥＡＫ−Ｓｙｎ細胞）に対して、５９７種のヒト・キナーゼを標的とするｓｉＲＮＡを１００ｎＭトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定してトータルおよびリン酸化シヌクレイン濃度を定量した。リン酸化アルファ−シヌクレインの割合を変えるｓｉＲＮＡに対して９５種のキナーゼが特定された（表１乃至３参照）。このうち２８種はセリン残基をリン酸化するキナーゼのクラスに属し、従って、α−シヌクレインをセリン１２９において直接リン酸化することができた。その他はチロシンキナーゼであった。チロシンキナーゼはα−シヌクレインをｓｅｒ−１２９において直接リン酸化しないが、アルファ−シヌクレインキナーゼの上流調節剤として作用することができる。これらのｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼのうちの２種、カゼインキナーゼ２およびカルシウム／カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼＩＩはα−シヌクレインをインビトロでリン酸化することが報告されており（Ｐｒｏｎｉｎほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ２６５１５−２６５２２ （２０００年）； Ｏｋｏｃｈｏａほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ３９０−３９７ （２０００年）； Ｎａｋａｊｏほか、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１７： １０５７−１０６３ （１９９３年））、カゼインキナーゼ２阻害剤は細胞内のリン酸化シヌクレイン濃度を増加させることが報告されている（Ｏｋｏｃｈｏａほか、２０００年）。ＧＲＫファミリーの構成キナーゼのうちの数種は（ＧＲＫではないが）アルファ−シヌクレインをインビトロでリン酸化することが報告されている（Ｐｒｏｎｉｎほか、２０００年）。ハエにおけるＧＲＫ２の発現はリン酸化シヌクレイン濃度を増加させることが報告されている（Ｃｈｅｎ、Ｆｅａｎｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８： ６５７−６６３ （２００５年））。
【００８０】
リン酸化シヌクレイン濃度を低下させるキナーゼの他に、そのｓｉＲＮＡがＰＥＡＫ−Ｓｙｎ細胞内のトータルα−シヌクレイン濃度を変化させる９９種のキナーゼが特定され（表２）、このようなものとしてはフコキナーゼ（ＦＵＫ）、ジェンバンク番号ＮＭ＿１４５０５９；プロテインキナーゼＮ１（ＰＲＫＣＬ１、ＰＫＮ１）、ジェンバンク番号ＮＭ＿００２７４１；ダブルコルチンおよびＣａＭキナーゼ様−１（ＤＣＡＭＫＬ１）ＮＭ＿００４７３４；分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＫ）、ＮＭ＿００５８８１；オーロラキナーゼＣ（ＡＵＲＫＣ、ＳＴＫ１３）、ＮＭ＿００３１６０；ｒａｓ２のキナーゼサプレッサー（ＦＬＪ２５９６５）、ＮＭ＿１７３５９８；ＦＬＪ３２７０４；ＭＡＰ２Ｋ６；ならびにタウズルド（Ｔｏｕｓｌｅｄ）様キナーゼ２（ＴＬＫ２）、ＮＭ＿００６８４２が挙げられた。作用メカニズムは、アルファ−シヌクレインの代謝回転または合成を調節するものであると考えられる（表３参照）。
【００８１】
表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃには、キナーゼであって、その阻害によりｓｅｒ−１２９の位置のリン酸化が調節されるキナーゼを示した。各表の上部の正常型は、キナーゼの発現が阻害されるとリン酸化が低下するようなキナーゼを示し、各表の下部の陰影型のものは、キナーゼが阻害されるとリン酸化が増大するようなキナーゼを示した。表１Ａ、ＢおよびＣはキナーゼの種類が異なる。表１Ａにはセリン残基および、多くの場合、チロシンおよび／またはスレオニンをもリン酸化することができるキナーゼを示した。表１Ｂにはセリン残基を（知られている限り）修飾することができないチロシンキナーゼを示した。表１Ｃにはキナーゼ活性を有しないことが知られている蛋白質を示した。表１Ａの上部のキナーゼはアルファ−シヌクレインのｓｅｒ−１２９を直接リン酸化する候補である。また、表１Ｂの上部のキナーゼは、アルファ−シヌクレインを間接的にリン酸化する役割を介する有用な治療上の標的である。表１Ｃの上部の蛋白質も同じ理由で有用な治療上の標的である。各表の第１、２および３欄には、遺伝子名、キナーゼ名およびキナーゼのジェンバンク・アセッション番号を示した。その次の欄にはそのキナーゼの阻害がリン酸化を低下させる（「下降（ｄｏｗｎ）」）のか増大させる（「上昇（ｕｐ）」）のかを示した。その次の３欄にはリン酸化の測定レベルが３回の独立した実験の平均値から外れる標準偏差の数を示した。最後の２欄にはキナーゼファミリー（即ち、アミノ酸特異性）および群を示した。
【００８２】
表２および３には、キナーゼであって、これを阻害することによってリン酸化の割合を変えないでヒト・アルファ−シヌクレインの全体的濃度が調節されるキナーゼを示した。表２にはヒト・アルファ−シヌクレインの濃度の低下が最も強いキナーゼの全てを示した。表の欄には表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃと同様に名称をつけた。
【００８３】
表１Ａ−Ｃ：リン酸化を低下させるキナーゼ候補の完全リスト
表１Ａ：セリン／スレオニンキナーゼ
【００８４】
【表１−１】
【００８５】
【表１−２】
【００８６】
【表１−３】
表１Ｂ：チロシンキナーゼ
【００８７】
【表１−４】
表１Ｃ：蛋白質リン酸化活性なし
【００８８】
【表１−５】
【００８９】
【表１−６】
表２：阻害することによりシヌクレイン濃度が調節されるキナーゼ
【００９０】
【表２−１】
【００９１】
【表２−２】
【００９２】
【表２−３】
【００９３】
【表２−４】
【００９４】
【表２−５】
【００９５】
【表２−６】
【００９６】
【表２−７】
実施例２：再スクリーニングおよびｑＲＴ−ＰＣＲによるアルファ−シヌクレインリン酸化調節の確認
アルファ−シヌクレインのリン酸化の増大または低下を示した実施例１のキナーゼについて、アルファ−シヌクレインに対する効果を確認するために再試験した。この確認のためのスクリーニングは、実施例１で特定した標的および対象とする数種の別のキナーゼに対して１０ｎＭのｓｉＲＮＡを用いて行った。実施例１でより高い濃度のｓｉＲＮＡを用いたのは、不完全に設計されたｓｉＲＮＡに引き起こされるほんの僅かのノックダウンも観察することができるようにするためであった。この確認スクリーニングではるかに低いｓｉＲＮＡ濃度を用いることによって、候補のリストを極めて特異的な調節を示すものにのみ絞ることができた。アンビオン社によってその後無効であると報告された一部のｓｉＲＮＡについても再スクリーニングした（下記のリプレースメントライブラリ・スクリーニング参照）。最後に、いく種かの新たに特定したキナーゼについてスクリーニングし、これらの結果をすでにプールされている結果に加えた。候補として特定したキナーゼを定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって試験することにより、これらが実際にＰＥＡＫ−Ｓｙｎ細胞内に存在すること確認した（実施例６参照）。この確認および再スクリーニングの実験方法および結果は以下の通りであった。
【００９７】
確認スクリーニング
確認スクリーニングの結果は下記に示す４つのカテゴリーにグループ分けした。
【００９８】
完全確認：このカテゴリーには、３つのｓｉＲＮＡの全てが１０ｎＭスクリーニングおよび１００ｎＭスクリーニングにおいて同一の表現型を生じるキナーゼを含めた。
【００９９】
大部分確認：このカテゴリーには、これらのｓｉＲＮＡの２／３が１０ｎＭスクリーニングおよび１００ｎＭスクリーニングにおいて同一の表現型を生じるが、３分の１は生じないキナーゼ、あるいは、１つのｓｉＲＮＡの結果は再現されるが、２番目のｓｉＲＮＡの場合に表現型は同じであるものの最初のスクリーニングに用いたのとｓｉＲＮＡが異なる傾向があるキナーゼを含めた。
【０１００】
部分的確認：このカテゴリーには、これらのｓｉＲＮＡの１／３が１０ｎＭスクリーニングおよび１００ｎＭスクリーニングにおいて同一の表現型を生じるキナーゼを含めた。
【０１０１】
確認できず：このカテゴリーには、以下のいずれかまたは両方が認められるキナーゼを含めた：
ａ）３つのｓｉＲＮＡのいずれも１０ｎＭでリン酸化シヌクレイン濃度に何ら影響を及ぼさない、および／または
ｂ）これらのｓｉＲＮＡが１００ｎＭでの一次スクリーニングで認められたのと逆の表現型を生じる。
【０１０２】
それぞれのカテゴリーに分類されるキナーゼの数を集計し、その結果を表４に示した。７種のキナーゼが「完全確認」され、これらを表５に一覧表示した。これら７種のうち、３種のみがアルファ−シヌクレインをｓｅｒ−１２９で直接リン酸化するキナーゼの良い候補になる質の高さを有すると見なされた。これは、３種のみがいずれもｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼであり、このキナーゼの濃度を特異的ｓｉＲＮＡにより低下させるとリン酸化アルファ−シヌクレインの濃度を低下させたからである。これらのものとしては、平滑筋の増殖および分化において役割を果たしていると考えられているＡＰＥＧ１、脳で発現され、正常な細胞分裂において役割を果たしていると考えられているＰＬＫ２（ＳＮＫ）ならびにキナーゼ活性を有する細胞分裂周期蛋白質であるＣＤＣ７Ｌ１があった。これら３種のうち、ＰＬＫ２は、細胞、特に活性化神経細胞におけるその役割および局在のため、最も興味深いものであった。アルファ−シヌクレインは、シナプス可塑性および小胞輸送に関与していると考えられているシナプス関連蛋白質である。このため、ＰＬＫ２はアルファ−シヌクレインを直接リン酸化するキナーゼの極めて良好な候補とみなされた。
【０１０３】
表４：１０ｎＭ確認スクリーニングからの該当候補の内訳
【０１０４】
【表４】
注：以下の全ての表に対して
＊＊＊は、リプレースメントｓｉＲＮＡについて検討し、無効なｓｉＲＮＡからのデータの代わりにこの新たなデータを用いた箇所を意味する。
陰影付けの意味：
【０１０５】
【化２】
表５：完全確認該当
【０１０６】
【表５】
表５には１０ｎＭで結果が完全に再現された７種の候補を示した。最初の３種のみが直接キナーゼである可能性が強いと見なされた。というのは、これらは、キナーゼ濃度の低下時にリン酸化シヌクレイン濃度を低下させるｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼであるからである。
【０１０７】
２９種のキナーゼが大部分確認のカテゴリーに分類され、このうちの１２種が直接キナーゼの候補であった。これらは表６に一覧表示した。１７種の別のキナーゼが１０ｎＭで大部分確認された。これらは直接キナーゼではないと思われるが、直接キナーゼの調節において役割を果たすことができたものであり、表７に一覧表示した。２２種のキナーゼが部分的確認のカテゴリーに分類された。リン酸化アルファ−シヌクレインを減少させたｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼ（即ち、可能なアルファ−シヌクレインの直接キナーゼ）を表８に一覧表示し、残りの潜在的に調節性のキナーゼを表９に一覧表示した。
【０１０８】
表６：１０ｎＭのｓｉＲＮＡで「大部分確認」であった可能な直接セリン／スレオニンキナーゼ
【０１０９】
【表６−１】
【０１１０】
【表６−２】
表６に示したｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼは、キナーゼ濃度の低下時にリン酸化シヌクレイン濃度を有意に低下させるので、アルファ−シヌクレインをリン酸化する直接キナーゼである可能性を有すると見なされた。ｓｉＲＮＡの２／３は１０ｎＭで１００ｎＭの場合と同一の結果をもたらし、従って、「大部分確認」該当とした。
【０１１１】
表７のキナーゼは、ｓｉＲＮＡの２／３が１０ｎＭおよび１００ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡで同一の結果をもたらしたので、「大部分確認」とした。しかしながら、これらは、適切な表現型を生じなかったか、間違ったクラスのキナーゼ（即ち、ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼとは違い、ｔｙｒもしくは非蛋白質キナーゼ）であったので、アルファ−シヌクレインのｓｅｒ−１２９をリン酸化する直接キナーゼではないと思われると認定された。それよりむしろ、これらはアルファ−シヌクレインのリン酸化の上流調節因子であるかもしれない。
【０１１２】
表７： １０ｎＭのｓｉＲＮＡで「大部分確認」であったその他のキナーゼ
【０１１３】
【表７−１】
【０１１４】
【表７−２】
表８： １０ｎＭのｓｉＲＮＡで「部分的確認」であった可能な直接セリン／スレオニンキナーゼ
【０１１５】
【表８】
表８に示したｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼは、キナーゼ濃度の低下時にリン酸化シヌクレイン濃度を有意に低下させるので、アルファ−シヌクレインをリン酸化する直接キナーゼである可能性を有すると見なされた。ｓｉＲＮＡの１／３のみが１０ｎＭで１００ｎＭの場合と同一の結果をもたらし、従って、「部分的確認」該当とした。
表９： １０ｎＭのｓｉＲＮＡで「部分的確認」であったその他のキナーゼ
【０１１６】
【表９−１】
【０１１７】
【表９−２】
表９のキナーゼは、アルファ−シヌクレインのｓｅｒ−１２９でのリン酸化における直接キナーゼである可能性は少ないと見なされたが、アルファ−シヌクレインのリン酸化の上流調節因子であるかもしれない。ｓｉＲＮＡの１／３が１０ｎＭで１００ｎＭの場合と同一の結果をもたらし、従って、「部分的確認」該当とした。しかしながら、いく種かは、矛盾する結果を生じ、従って、アルファ−シヌクレインの直接キナーゼである可能性は少ないと見なされた。
【０１１８】
４２種のキナーゼは、最初の結果が１０ｎＭで確認されなかった。これらのうち、１９種は上記に掲載されたカテゴリーａ）に分類され、表１０に一覧表示した。１０ｎＭでは、１０ｎＭの３種のｓｉＲＮＡのいずれもリン酸化アルファ−シヌクレインの表現型に何らの変化ももたらさず、１００ｎＭスクリーニングからのこれらのキナーゼの結果は標的から外れた効果によるものであったことが分かった。２３種のキナーゼ（表１１）は１００ｎＭよりも１０ｎＭでリン酸化アルファ−シヌクレイン濃度に対して逆の効果を生じた。１０ｎＭでの結果は、１００ｎＭでは結果が的外れの効果によってマスクされることがあるという事実のために真の効果であった可能性がある。このことは、はるかに高いｓｉＲＮＡ濃度でも起こり得る。あるいは、この真の効果は高濃度でみられたかもしれない。とにかく、これらのキナーゼは、アルファ−シヌクレインの直接キナーゼである可能性は低いとみなされた。
【０１１９】
表１０に示した１９種のキナーゼは１０ｎＭで対照に比し有意な反応性を示さなかった。従って、１００ｎＭで認められたリン酸化シヌクレイン濃度の変化は高濃度のｓｉＲＮＡにより引き起こされた標的から外れた効果によるものであった可能性がある。ＧＰＲＫ５およびＧＰＲＫ７は最初の１００ｎＭスクリーニングでは候補ではなかったが、アルファ−シヌクレインのリン酸化におけるこれらの役割に特別な関心があったため１０ｎＭで検討した。
【０１２０】
表１０：１０ｎＭのｓｉＲＮＡで反応性を示さなかったキナーゼ
【０１２１】
【表１０−１】
【０１２２】
【表１０−２】
表１１のキナーゼの結果は、１０ｎＭではリン酸化シヌクレイン濃度に対して１００ｎＭでみられたのと逆の効果を示したので、「確認されず」であった。しかしながら、１０ｎＭのｓｉＲＮＡでの結果は真の結果であり、ｓｉＲＮＡの高濃度（１００ｎＭ）は真の効果をマスクしていた可能性がある。また、１００ｎＭでみられた最初の効果が真の効果である可能性もある。これらはアルファ−シヌクレインの直接キナーゼであるらしいとみなし、後日さらに試験するために取って置くこととした。
【０１２３】
表１１：結果が一次スクリーニングと逆であったキナーゼ
【０１２４】
【表１１−１】
【０１２５】
【表１１−２】
リプレースメントおよび更新ライブラリのスクリーニング
最初のスクリーニングで使用した一部のｓｉＲＮＡは質が劣るとみなされたので、リプレースメントｓｉＲＮＡを用いて両濃度でスクリーニングを行った。リプレースメントｓｉＲＮＡのデータは、最初のスクリーニングからの特異的ｓｉＲＮＡで得られた結果のデータと取替えるために用いた。統計データは各キナーゼの３種のｓｉＲＮＡについて一覧にし、これを用いて、９種の別のキナーゼを一次スクリーニングとしてとらえ損ねた、最初のスクリーニングからの候補と認定した。これらを再試験したところ、このうちの２種のキナーゼが１０ｎＭのｓｉＲＮＡで「部分的確認」であった。これらはＢＣＫＤＫおよびＦＬＪ２５９６５（ＫＳＲ２）であった。
【０１２６】
この過程において多くの新たなキナーゼが特定され、ｓｉＲＮＡが利用可能になった。これらは、アンビオン・アップデーツ（ＡＭＢＩＯＮ Ｕｐ−Ｄａｔｅｓ）ライブラリおよび新規キナーゼ候補が特定されるので、実施例１と同様に試験した。これらの新たに特定されたキナーゼの多くはＧＯ（遺伝子オントロジーコンソーシアム（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ））分類に入るものであった。従って、これらのキナーゼの一部については詳細な情報を見いだすことは困難であった。このカテゴリーに含まれる遺伝子のうちの数種は真のキナーゼではなく、キナーゼ結合蛋白質、即ち、アダプター蛋白質であった。１０ｎＭのｓｉＲＮＡでは、１３種のキナーゼがアルファ−シヌクレインに直接作用する候補であることが確認された。これらのうちの２種は直接キナーゼである可能性のある候補であった。表１２を参照されたい。残りの１１種は、リン酸化シヌクレイン濃度に対する、考えられる間接的調節因子とみなされた。表１２を参照されたい。表１２には、２００５年１１月１日現在でジェンバンクに登録されているこれらキナーゼ配列のジェンバンク・アセッション番号を示した。
【０１２７】
表１２： アンビオン・アップデーツ・ライブラリからの可能な該当キナーゼ
【０１２８】
【表１２−１】
【０１２９】
【表１２−２】
実施例１および２で特定され立証されたキナーゼｓｉＲＮＡを示す結果を要約して表１３および１４に示した。これらの結果から、ＰＬＫ２、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩならびにＧＲＫ１、２、６および７は、アルファ−シヌクレインを直接または間接的にリン酸化する可能性が極めて高いキナーゼとして特定された。アルファ−シヌクレインのリン酸化を増大させるｓｉＲＮＡを有すると見なされたキナーゼ（ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫ）は、ひょっとするとアルファ−シヌクレインのリン酸化の負の調節因子であるかもしれない。
【０１３０】
表１３および１４：確認研究のまとめ
【０１３１】
【表１３】
表１４
ＧＲＫの結果−「大部分確認」、「部分的確認」および「確認できず」の混成
【０１３２】
【表１４】
以下の実施例では、実施例１および２で特定された多くの標的と考えられるキナーゼについてインビトロでキナーゼアッセイを行った。
【０１３３】
実施例３： インビトロにおけるアルファ−シヌクレインの直接的リン酸化の確認
上記のｓｉＲＮＡスクリーニングからのキナーゼのどれがアルファ−シヌクレインを直接リン酸化するのかを明らかにするために、精製キナーゼをアルファ−シヌクレインとインキュベートしてインビトロのキナーゼ反応を行わせた。この結果から、ＰＬＫ２ならびにＧＲＫ２、５、６および７ （ＧＰＲＫ２、５、６および７）は全てアルファ−シヌクレインを特異的にセリン１２９でリン酸化することができ、インビトロではセリン８７をリン酸化しないことが示され、これらがアルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができることが分かった。また、ＭＥＴ、ＣＤＣ７Ｌ１およびＩＫＢＫＢはアルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができないことが示された（図１Ａ乃至Ｃ）。
【０１３４】
組換えアルファ−シヌクレインのセリン１２９に対して組換えキナーゼの活性を試験するアッセイ条件を確立し、この条件はイムノブロットおよびＥＬＩＳＡ分析により再現性があることが分かった。可能な場合、市販の組換えキナーゼを用いた。市販されていないものについては組換え手段により、示したようにして作製した。
【０１３５】
図１Ａ乃至Ｃでは、各反応でアルファ−シヌクレイン基質に対してキナーゼを一定のモル比に標準化（予想成熟蛋白質のＭＷから誘導）することにより組換えキナーゼをインビトロのアルファ−シヌクレイン（ＡＳ）アッセイに用いた（１：２００；キナーゼ：ｒＡＳ）。−対照、＋キナーゼ；図１Ａでは、各反応において等価の基質（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を示すトータル・アルファ−シヌクレイン（ＡＳ）のプローブ（ｍＡｂ Ｓｙｎ−１；０．１μｇ／ｍＬ）を用い；図１Ｂでは、Ｓ１２９リン酸化について平行ブロットをプローブした（ｍＡｂ １１Ａ５１μｇ／ｍＬ）。目立ったシグナルは（これまで活性標準化によって試験されていない）ＧＲＫ６、ＣＫＩ、ＣＫＩＩおよびＰＬＫ２によってもたらされた。図１Ｃでは、Ｓ８７リン酸化について平行ブロットをプローブした（ｐＡｂ、ＥＬＡＤＷ−１１０ ５μｇ／ｍＬ）。シグナルはＣＫＩリン酸化の場合にのみ検出された。
【０１３６】
図１Ｄ乃至Ｆでは、各反応でアルファ−シヌクレイン（ＡＳ）基質に対してキナーゼを一定のモル比に標準化（予想成熟蛋白質のＭＷから誘導）することによるインビトロのＡＳアッセイ（１：２００；キナーゼ：ｒＡＳ）に、ＧＰＣＲ受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリーからの組換えキナーゼおよびＰＬＫ２を用いてさらに的を絞った検討を含めた。−対照、＋キナーゼ；ＣＡＭキナーゼは負の対照であり、同時にＣＫＩおよびＣＫＩＩは正の対照である。図１Ｄでは、各反応において等価の基質（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を示すトータルＡＳのプローブ（ｍＡｂ Ｓｙｎ−１；０．１μｇ／ｍＬ）を用い；図１Ｅでは、Ｓ１２９リン酸化について平行ブロットをプローブした（ｍＡｂ １１Ａ５１μｇ／ｍＬ）。目立ったシグナルは、ＧＲＫ７を除く全てのＧＲＫ類によってもたらされた。シグナルによってＧＲＫ類間に特異性をみることができた。その特異性は、ＣＫＩ＞ＧＲＫ６＞ＰＬＫ２＞ＧＲＫ４＞ＧＲＫ５＞ＧＲＫ２と表すことができる。図１Ｆでは、Ｓ８７リン酸化について平行ブロットをプローブした（ｐＡｂ、ＥＬＡＤＷ−１１０ ５μｇ／ｍＬ）。シグナルはＣＫＩリン酸化の場合にのみ検出された。
【０１３７】
このアッセイ条件は表１５にまとめてあり、試験した全てのキナーゼについて一定に保った。リストアップしたキナーゼの全ては、ＣＤＣ７Ｌ１、ＰＲＫＧ１およびＡＰＥＧ以外は標識／組換え蛋白質として入手可能であった。それらの推定標的はインビトロの翻訳系で発現させ、蛋白質濃度もしくは活性を測定することなくインビトロＡＳアッセイで試験した。
【０１３８】
【表１５−１】
【０１３９】
【表１５−２】
【０１４０】
【表１５−３】
標準条件は、４０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ； １ｍＭ ＥＤＴＡ ＭｇＣｌ １０ｍＭ ｐＨ８．０、０．１％ＢＭＥ； ０．０１％ Ｂｒｉｊ−３５； ５ｕｇ ＢＳＡ、１００ｕＭ ＡＴＰ （５ｘ ［基質］）、１００ｕＬ容； ３００ｎｇ ｒ−ｗｔ−ＡＳ （２０８ ｎＭ）、（１：２００ キナーゼ：ＡＳまたは標準化活性０．０３Ｕ／反応液、３４Ｃ； １７時間であった。さらに、スクリーニングデータの組合せからの種々のレベルの意義（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）／確認を有するこれらのキナーゼは、組換え標識蛋白質として購入し、注記を付け、（合成基質から製造者により決定された）活性単位またはＭＷおよび反応容量から求めた基質：酵素モル比への標準化に基づいて比較可能なインビトロ・アッセイを確立するために図表形式に組み入れた。反応条件の詳細は表１５に明記した。Ｋｉｎ．＝キナーゼ。確認に関しては、大部分＝大部分確認、部分的＝部分的確認、欠落＝確認欠落、確認＝確認。
【０１４１】
キナーゼ活性は、最初、非天然基質（ペプチドまたはカゼイン）から求められる活性単位でＡＳに対して試験した。この方法は、キナーゼ間の特異性およびＡＳがキナーゼ・パネルのインビトロ基質となるかどうかについておおよその見積を得るために用いた。この検討の結果は図２および３に含まれている。この実験のときには、入手可能なキナーゼのうちのほんの一部を入手し、「最も確からしい７種の「確認」」からの２／３のキナーゼを含めた（ＰＬＫ２は試験しなかった）。最も顕著な結果はＧＲＫ６（Ｇ蛋白質共役受容体キナーゼ６）によってもたらされた。ＣＫＩでは適度な活性が得られ、ＣＫＩＩは検出可能ではなかった。両ＣＫキナーゼはＳ１２９ＡＳをリン酸化することが知られているので、活性単位での標準化は、ＡＳに対して試験基質への比活性がより高いキナーゼに対してバイアスがかかっていた。このことが、活性単位を限定するペプチド基質よりも基質としてＡＳを好んだと考えられるＧＲＫ６の事情と思われる。
【０１４２】
以下の実施例では、実施例１および２で特定された多くの標的と考えられるキナーゼについてインビトロでキナーゼ・アッセイを行った。上記活性バイアスを補正するために、キナーゼを再試験し、新たに入手したキナーゼについてモル濃度に関して標準化したアッセイを行った。これによって、酵素と基質間の化学量論的比率の測定が良好となり、このため、ＡＳ／キナーゼ相互作用の関数としてリン酸化事象が記録された。これは、非関連基質／キナーゼ・リン酸化が測定される事象とは対照的であった。図３Ａ乃至Ｃには、ＣＫＩ、ＣＲＫ６およびＰＬＫ２（７種の高度「確認」のうちの１種）との間でリン酸化ｓｅｒ−１２９の濃度がほぼ同等のＡＳリン酸化のより実際的な図を示す。ＣＫＩＩは数分の１の低下を示したが、これは同様なアッセイ条件を用いた以前のＥＬＩＳＡのデータと一貫している。ＣＫＩを除き、試験したキナーゼのいずれもＡＳをｓｅｒ−８７残基でリン酸化することができなかった。この観察結果から、これらのキナーゼがｓｅｒ−１２９部位に対して特異的／選択的であり、ｓｅｒ−８７部位に対しては特異性／選択性は低いことが確認された。しかしながら、ＣＫＩは両部位をリン酸化することが報告されている。
【０１４３】
アッセイ結果に対する酸性リン脂質の影響
上記インビトロ・アッセイにおけるＧＲＫ６およびＰＬＫ２（ＧＲＫファミリーと系統的に関連のあるポロ様キナーゼ）による活性の有意なレベルは、上記ＲＮＡｉスクリーニングにおけるリン酸化の低下因子としてのＰＬＫ２、ＧＲＫ２およびＧＲＫ１の特定と相俟って、他のＧＲＫ類のさらに包括的な調査を促進した。図４ＡおよびＢには、このインビトロ・アッセイで比較したＧＲＫ２、４、５、６および７ならびにＰＬＫ２の結果を示した。これらの結果は、デンシトメトリー比較においてＳ１２９リン酸化に対する特異性が明確であることを示すものである。この選択性は、ＣＫＩ＞ＧＲＫ６＞ＰＬＫ２＞ＧＲＫ４＞ＧＲＫ５＞ＧＲＫ２と表すことができる。ＧＲＫ７は容易に検出できるほどのレベルでリン酸化することができなかった。酸性配列フランキングアミノ酸１２９に特異性を示す全てのＧＲＫ類はｓｅｒ−８７をリン酸化することはできなかった。こうした反応はＥＬＩＳＡ測定により定量化して確認した。これらの値は、ＧＲＫ類に対してＰＬＫ２濃度の明らかな減少を示すイムノブロットデータとおおよそ一致した。ＡＳ基質の大部分は上記アッセイデザインに基づいて使い果たされた（リン酸化された）のであり、その測定値は反応における最大ＯＤ／基質を表すものと考えられる。
【０１４４】
ＡＳのリン酸化に対する酸性リン脂質のプラス効果についてはこれまでにＰｒｏｎｉｎほか、ＪＢＣ ２７５（３４）：２６５１５−２６５２２（２０００年）により報告されており、ＧＲＫ２および５に対する顕著な効果が認められた。この報告および酸性リン脂質がＡＳの立体構造を調節することを示した多くの研究があることから、ホスファチジルコリン（ＰＣ）：ホスファチジルセリン（ＰＳ）：ホスファチジルイノシトール３−リン酸（ＰＩＰ３）の混合物を作製し、上記で確立したインビトロ・アッセイに組み入れた。その結果、この脂質混合物は試験したキナーゼのほぼ全てのシグナルを増加させることがわかった。脂質環境を追加することにより、細胞の膜表面が模倣される可能性が高く、そこでＡＳとＧＲＫ類が結合するように思われる。以下の理論に拘束されるわけではないが、これは、脂質がＡＳのＮ末端ヘリックスに結合するとＡＳのＣ末端が良好に暴露されることによるものと考えられる。面白いことに、（ＣＫＩ反応にみられるような）ｓｅｒ−８７リン酸化に対する脂質効果はリン酸化のレベルの低下をもたらした。これは、ヘリックスが相互作用するとｓｅｒ−８７が埋められる場合には、脂質との相互作用によりエピトープ・マスキングが起こる結果であろう。
【０１４５】
実施例４：細胞株におけるアルファ−シヌクレインの直接的リン酸化の確認
キナーゼは細胞内におけるよりもインビトロでより無規律となり得るので、アッセイを細胞株を用いて行うことによりアルファ−シヌクレインとの直接的相互作用を確認した。実施例３からのインビトロでアルファ−シヌクレインをリン酸化したキナーゼのｃＤＮＡをＰＥＡＫ−Ｓｙｎ細胞株中にトランスフェクトしてどのキナーゼが細胞内でアルファ−シヌクレインのｓｅｒ−１２９をリン酸化することができるかを調べた。その結果から、ＧＲＫ６および、さらに著しくはＰＬＫ２が細胞内でアルファ−シヌクレインのリン酸化を媒介することができることが分かった（図５）。
【０１４６】
ＰＬＫ２、ＧＰＲＫ６、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７およびＰＲＫＧ１のｃＤＮＡクローンはオリジーン社（Ｏｒｉｇｅｎｅ）から入手した。このｃＤＮＡをリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（商標）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて細胞内に転写、トランスフェクトした。検討する各ｃＤＮＡについて、９６穴プレートの１２穴でトランスフェクトを行い、そのほかに、細胞にトランスフェクトしていない１２穴を対照とした。ＥＬＩＳＡスクリーニングプロトコルに従いトランスフェクト後４８時間に細胞を採取してＥＬＩＳＡによってトータルおよびリン酸化シヌクレインを分析し、値をトータル蛋白質に対して標準化した。組換え蛋白質として市販されていない標的キナーゼ（例えば、ＡＰＥＧ、ＰＲＫＧＩおよびＣＤＣ７ＬＩ）については、インビトロ網状赤血球無細胞系（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いてヒト完全長ｃＤＮＡクローン（オリジーン社）から蛋白質を発現させた。正しい配列を決定し、ＤＮＡを調製した。また、ＰＬＫ２およびＧＲＫ６ｃＤＮＡについても陽性対照として本検討に加えた。
【０１４７】
トランスフェクトしていない細胞におけるリン酸化シヌクレインの割合は７．８％と計算された。ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７およびＰＲＫＧｌｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞のリン酸化シヌクレインの割合は８．９％とトランスフェクトしていない細胞よりもごくわずかに高かった。これらのキナーゼはリン酸化シヌクレイン濃度を変えることにおいて否定的な結果を生じたと考えられ、他のキナーゼが受けているのと同じトランスフェクトの困難さに曝されているので、実験のための負の対照と考えられた。ＰＬＫ２に対するｃＤＮＡは２９３−シヌクレイン細胞にトランスフェクトした。細胞はトランスフェクト後４８時間に採取しＥＬＩＳＡによりトータルおよびリン酸化シヌクレイン濃度を分析した。ＥＬＩＳＡ値はトータル蛋白質濃度に対して補正した。ＰＬＫ２が過剰発現すると、リン酸化シヌクレイン濃度は劇的に増加し、その結果、リン酸化シヌクレインの発現がトランスフェクトしていない細胞での発現より４．３倍上昇した。
【０１４８】
α−シヌクレインをリン酸化する直接キナーゼを細胞内に導入すると、リン酸化シヌクレイン濃度の上昇がみられる可能性は高い。このことはＧＰＲＫ６およびＰＬＫ２のいずれについても当てはまった（図６）。ＧＰＲＫ６ ｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞のリン酸化シヌクレインの割合は８．９％から１８．９％へ劇的に増加した。この増加は、陰性キナーゼの場合に認められるリン酸化シヌクレインのパーセンテージより９．２５標準偏差分だけ上の値まで有意である。ＰＬＫ２トランスフェクト細胞のリン酸化シヌクレイン濃度の増加は、さらに劇的であり、リン酸化シヌクレインの割合はほぼ４倍の３３．２％まで増加した。これは極めて有意な変化、即ち、陰性キナーゼの場合に認められるリン酸化シヌクレイン濃度より２２．７５標準偏差分だけ上への増加である。この劇的な増加は、このアッセイの使用時にこれまでに認められた格段に大きな変化であった。このデータは、ＧＰＲＫ６および、特にＰＬＫ２がα−シヌクレインのリン酸化に関与する直接キナーゼとしての極めて確かな候補であることを強く示唆するものである。すなわち、図６に示したように、ＧＰＲＫ６ ｃＤＮＡをＨＥＫ−シヌクレイン細胞にトランスフェクトすると、リン酸化シヌクレインの発現が２倍になる。ＰＬＫ２ ｃＤＮＡを細胞内に導入すると、リン酸化シヌクレインの発現はさらに劇的に増加し、その変化は対照値のほぼ４倍になる。
【０１４９】
実施例５：ＰＬＫ２（ＳＮＫ）ＧＲＫ６、ＣＫＩＩおよびＩＫＢＫＢによるリン酸化
別の会社（ダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ））製のＰＬＫ２ ｓｉＲＮＡもアルファ−シヌクレインのリン酸化を阻害することを示すことによって、実施例４のデータはＰＬＫ２についてさらに裏付けられた。このことは、ＰＬＫ２がアルファ−シヌクレインをセリン１２９で直接リン酸化する細胞キナーゼとしての有望な候補であることを示すデータ（表２および１３）を補強するものであった。
【０１５０】
アルファ−シヌクレインを安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を１０ｎＭおよび１００ｎＭのスマートプール（ＳｍａｒｔＰｏｏｌ）ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。スマートプールｓｉＲＮＡには特異的標的に対する４つの個々のｓｉＲＮＡが含まれる。従って、これら４種のｓｉＲＮＡの各々の実際の濃度は、それぞれ２．５ｎＭおよび２５ｎＭであった。図７の結果から、ＰＬＫ２はリン酸化シヌクレイン濃度を有意に減少させ、その変化は約２５％であることが分かる。１０ｎＭではＧＰＲＫ６はリン酸化シヌクレインのパーセンテージを対照の陰性キナーゼの場合の平均値よりも１標準偏差分だけ増加させたが、１００ｎＭではそうはならなかった（図７）。これは、一次ｓｉＲＮＡスクリーニングで先に認められたのと逆の効果であり、最初または２番目のアッセイに用いたｓｉＲＮＡの品質によるのかも知れない。これらの結果は免疫組織化学によって確認した。
【０１５１】
異なる供給源からの種々のｓｉＲＮＡによるリン酸化シヌクレイン濃度の有意なノックダウンは、独立してデータを裏付け、強固なものにし、α−シヌクレインをリン酸化する直接キナーゼとしてのＰＬＫ２の役割を立証するものである。次いで、これらの実験を、対象とするべきスクリーニングで特定した２種の他のキナーゼ、カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）およびＩＫＢＫＢを用いて行った。
【０１５２】
本明細書に示したインビトロのデータから、ＣＫＩＩはアルファ−シヌクレインをリン酸化するが、そのリン酸化はＰＬＫ２ほど効率的ではないことが示唆される。個々のＣＫＩＩ触媒サブユニットは一次ｓｉＲＮＡスクリーニングのヒットであり（実施例１および表１Ｂ照）、１０ｍＭ ｓｉＲＮＡスクリーニングで確認された。個々のＣＫＩＩサブユニットα１およびα’は、ＰＬＫ２または互いと共に同時トランスフェクトするとアルファ−シヌクレインのリン酸化に対して相加効果を示すかどうかを明らかにすることは興味深いことであった。トランスフェクトは、個別のＣＫＩＩサブユニットＡ（α１）およびＢ（α’）を用い、ＰＬＫ２または互いと同時トランスフェクトして行った。これらの触媒サブユニットを過剰発現させると、リン酸化シヌクレイン濃度はそれぞれ１．７５および１標準偏差分だけ増加した（その効果は相加的ではなかった）。個々のサブユニットの各々をＰＬＫ２と同時トランスフェクトさせると、リン酸化シヌクレインの濃度は１．７５標準偏差分だけＰＬＫ２単独の場合（１８．６％リン酸化シヌクレイン）より増加してそれぞれ２２．８％リン酸化シヌクレインとなった。しかしながら、両サブユニットをＰＬＫ２と同時トランスフェクトすると、リン酸化シヌクレインの濃度はＰＬＫ２単独の場合（２１．４％リン酸化シヌクレイン）より有意に増加しなかった。
【０１５３】
ＩＫＢＫＢ ｓｉＲＮＡをノックダウンすると、アルファ−シヌクレインのリン酸化が有意に低下したので、この遺伝子のアルファ−シヌクレインリン酸化能について試験した。トランスフェクトおよびＥＬＩＳＡ分析は標準手順に従って実施した。これまでのインビトロ実験の結果、ＩＫＢＫＢは直接キナーゼ・アッセイでシヌクレインをリン酸化しなかった（実施例３参照）ので、直接シヌクレインキナーゼではないが、シヌクレインリン酸化の上流調節因子であるかもしれないことが分かった。従って、ＩＫＢＫＢをＨＥＫ−ｓｙｎ細胞で過剰発現させてシヌクレインのリン酸化に対する効果を確認した。ＩＫＢＫＢ ｃＤＮＡの細胞内への導入後、シヌクレインリン酸化は負（空ベクター）の対照の８．３％から２１．５％へ２．６倍の増加を示した。これはほぼ５３標準偏差分の有意なシヌクレインリン酸化の増加である。ＰＬＫ２正対照ではシヌクレインリン酸化は６５．８％と、ほぼ８倍の増加を示した（２３０標準偏差分で有意）。シヌクレインリン酸化に対する効果はＩＫＢＫＢの場合よりも関連キナーゼのＩＫＢＫＡの場合でずっと更にわずかであった（１．２倍）が、それでも１．４標準偏差分で有意であった。
【０１５４】
実施例６：代替的な治療標的としてのシヌクレイン
シンフィリンは、アルファ−シヌクレインを結合することが明らかにされているシヌクレイン関連蛋白質である。シンフィリンの存在がアルファ−シヌクレインのリン酸化を増強することができるかどうかを明らかにするために、アルファ−シヌクレインおよびＰＬＫ２を含むＨＥＫ細胞と含まないＨＥＫ細胞内にこれを過剰発現させた。標準的プロトコルに従ってトランスフェクトを行った後、アルファ−シヌクレインのＥＬＩＳＡおよび分析を実施した。また、細胞を採取してウエスタンブロット分析を行った。トランスフェクトした細胞の溶解物について、１Ｈ７抗体を用いてトータルシヌクレイン、１１Ａ５抗体を用いてセリン１２９リン酸化シヌクレインを分析した。細胞内にトランスフェクトされたＤＮＡの総量は９６穴プレートの穴当たり０．１６μｇと一定のままであった。細胞内に導入されるＤＮＡの種類は、ＤＮＡの完全な割り当て（ｑｕｏｔａ）を形成するのに用いるべき空のベクターによってさまざまに異なる。種々の濃度のアルファ−シヌクレイン、ＰＬＫ２およびシンフィリンｃＤＮＡを未処置のＨＥＫ細胞内に導入した。これら３種の全てをトランスフェクトした細胞はトータルシヌクレインのわずかな増加を示した。リン酸化シヌクレインについては、トランスフェクトしていない細胞中の濃度は定量限界未満であった。アルファ−シヌクレインを単独で導入すると、５．２％のリン酸化シヌクレインが得られ、これはシヌクレインとシンフィリンの同時トランスフェクトの場合（５．４％のリン酸化シヌクレイン）よりもわずかに少なかった。ＰＬＫ２とシヌクレインを同時トランスフェクトすると、６０％リン酸化シヌクレインと、ＨＥＫ−ｓｙｎ安定細胞内にＰＬＫ２をトランスフェクトした場合に認められたのと同様な濃度が得られた。驚くべきことに、３種のＤＮＡ（ＰＬＫ２、シヌクレインおよびシンフィリン）の全てを同時に過剰発現させると、ＨＥＫ細胞中のリン酸化シヌクレイン濃度は８３．３％となった。従って、ＰＬＫ２、シヌクレイン過剰発現ＨＥＫ細胞においてシンフィリンはシヌクレインのリン酸化を増大させた。
【０１５５】
シンフィリンの存在下にアルファ−シヌクレインのリン酸化が増大することは、シンフィリンがＰＬＫ２ポロ−ボックスに結合することによりＰＬＫ２によるシヌクレインのリン酸化を促進することによって説明することができる。
【０１５６】
実施例７： アルファ−シヌクレインおよびアルファ−シヌクレインの家族性突然変異体のＰＬＫ２活性によるリン酸化
アルファ−シヌクレインの多くの既知家族性突然変異体のＰＬＫ２によるリン酸化を検討するために、インビトロトランスフェクト研究を行い、アルファ−シヌクレインおよびその突然変異体のリン酸化を分析した。これらの家族性突然変異体（ＦＰＤ）はＡ３０Ｐ、Ａ５３ＴおよびＥ４６Ｋであった。
【０１５７】
全てのインビトロ反応は以下の条件で行った：１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭのＡＴＰ、２７ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５０ ｎｇ／ｍｌのＰＬＫ２、プロテアーゼ阻害剤溶液（反応緩衝液１ｍｌ中１錠）の５０倍希釈液、４０ｎＭニトロフェニルリン酸、１ｍｇ／ｍｌの９５％大豆由来ＩＩ型ホスファチジルコリン、および１０、１００または１，０００ｎＭアルファ−シヌクレイン（ＡＳ）。反応は３７°Ｃで培養した。活性はオートラジオグラフィーにより分析した。
【０１５８】
トランスフェクトは、２９３細胞をプレートに播き、リポフェクタミン２０００（商標）含有オプチ−ＭＥＭ（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）（商標）中（トータルＤＮＡを一定に保つために空のベクターを用いて）種々の量のＰＬＫ２およびアルファ−シヌクレインＤＮＡで処理することによって行った。細胞は、２日後にウエスタンブロット用にサンプル緩衝液中に、または１１Ａ５抗体使用ＥＬＩＳＡ用にプロテアーゼ阻害剤含有０．５Ｍグアニジン中に採取した。
【０１５９】
ＰＬＫ２はベータシヌクレインよりも野生型アルファ−シヌクレインに対して効力がより強いことが分かった。さらに、アルファ−シヌクレイン突然変異体は、所定の濃度（特に、低濃度で）野生型（ＷＴ）よりもより多くリン酸化された。その活性のレベルは突然変異体に対する選択および突然変異体がＷＴよりも低いＫｍを有することを反映している。ＰＬＫ２活性の傾向はＰＬＫ２活性がＦＰＤ突然変異体で最も高く、これに野生型アルファ−シヌクレインが続き、ベータシヌクレインに対して最も低いことと関連づけられた。この順序は、アルファ−シヌクレインのリン酸化がレヴィー小体の形成およびその後の病状を駆動するメカニズムと整合している。
【０１６０】
実施例８：ＨＥＫ−シヌクレインおよびＳＹ５Ｙ−シヌクレイン細胞中のキナーゼの存在の確認
対象キナーゼがＨＥＫ−シヌクレインおよびＳＹ５Ｙ−シヌクレイン細胞で発現されるかどうかを明らかにするためにｑＲＴ−ＰＣＲを行った。表１６では、全てのサンプルはＧＡＰＤＨ発現に対して標準化した。さらに、陰性キナーゼのうちの２種は各実験で対照として分析した。直接キナーゼである可能性のある２４種の候補のうち、ＨＥＫ２９３−シヌクレイン細胞ではＰＬＫ２を含む２０種が検出された。従って、残る「完全確認」キナーゼが上記細胞内に検出された（図９）。試験した直接キナーゼである可能性のあるもののうち、４種、即ち、ＧＰＲＫ１、ＧＰＲＫ７、ＥＲＫ８およびＲＩＰＫ３は検出されなかった。ＧＰＲＫ６は辛うじて検出可能であった。
【０１６１】
ｑＲＴ−ＰＣＲは以下の通り行った：ｍＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現レベルに標準化した。キアーゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔおよびプロトコルを用いて細胞ペレットからトータルＲＮＡを精製した。直接キナーゼと考えられるものおよび４種の間接「完全確認」キナーゼの２４種のプライマー／プローブセットは、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ阻害剤および標準ＰＣＲ試薬と共に、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（タックマン遺伝子発現アッセイ）に注文した。以下のサイクリング条件により２０ｎｇまたは２００ｎｇのトータルＲＮＡを用いて各プライマー／プローブセットにつき、ＡＢＰＩ７５００リアルタイムＰＣＲ機で一段ＲＴ−ＰＣＲ／ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を行った：４８°Ｃ／３０分（ＲＴ−ＰＣＲ工程）、９５°Ｃ／１０分（変性）、その後、９５°Ｃ／１５秒、６０°Ｃ／１分の４０サイクル。各プライマー／プローブセットにつき、ＲＴネガチブ反応およびＰＣＲネガチブ反応を行った。精製ＲＮＡに混入しているＤＮＡ（ＲＮＡではない）のバックグラウンド増幅のためのＲＴネガチブ対照。ＰＣＲネガチブ対照は、ＰＣＲ試薬の全てが混入しているＲＮＡおよびＤＮＡを含まず、シグナルを有さないことを保証するためのものである。
【０１６２】
「完全確認」の直接キナーゼと考えられるもののうちの３種の全ては、４種の「完全確認」の間接キナーゼと共に、ＳＹ５Ｙ−シヌクレイン細胞中に容易に検出され、このことから、この細胞株がキナーゼの更なる実験的分析のための神経由来細胞株の実行可能な選択肢であることが分かった。
【０１６３】
表１６ ＨＥＫ−シヌクレインおよびＳＹ５Ｙ−シヌクレイン細胞中のキナーゼの存在のｑＲＴ−ＰＣＲによる証明
【０１６４】
【表１６】
実施例９：２９３細胞および神経由来細胞株中におけるアルファ−シヌクレインのリン酸化増大の確認
アルファ−シヌクレインを安定的にトランスフェクトした２９３細胞にＰＬＫおよびＧＲＫを過剰発現させた。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを行ってＰＬＫおよびＧＲＫキナーゼによるリン酸化シヌクレインの増加を確認し、リン酸化の増大を証明した。別の方法を用いてその増大を、２９３細胞に対して免疫染色にＥＬＩＳＡで使用するのと同じビオチン化抗体（１１Ａ５）を用いることにより確認した。この方法では、ＰＬＫ２および、程度は少ないがＧＲＫをトランスフェクトした細胞中のリン酸化シヌクレインの増加も証明された。この増加は１１Ａ５で明るく染色される少数の細胞で検出され、全ての細胞での全般的な増加がみられるのではない。トータルシヌクレインの量（５Ｃ１２抗体を用いて測定）は変化しないように思われた。これは２９３細胞内のリン酸化の有意な増大であった。従って、こうした結果が神経芽腫細胞で再現され得るかどうかを調べることは重要であった。
【０１６５】
ＰＬＫ２およびＧＰＲＫ６を用いて認められたリン酸化シヌクレインの劇的な上方調節が神経由来細胞にも存在することを確認するために、同じ実験をヒト神経芽腫細胞（ＳＹ５Ｙ細胞）で行った。免疫染色の結果から、ＰＬＫ２が２９３細胞実験と極めてよく似たパターンで少数の細胞内にリン酸化シヌクレインの増加を引き起こすことが明らかとなった。定量は２つの方法でアレイスキャン（ＡｒｒａｙＳｃａｎ）（商標）を用いる免疫組織化学により行った。先ず、全ての細胞をカウントしたところ、何らの相違もみられなかった。次いで、明るい細胞のみをカウントしたところ、この分析から、ＰＬＫ２をトランスフェクトした１１Ａ５陽性細胞の数は約５乃至１０倍増加し、ＧＲＫ６の場合でもわずかに増加することが分かった。
【０１６６】
ＨＣＣ細胞でｃＤＮＡトランスフェクト実験を繰り返し、ＰＬＫ２およびＧＰＲＫ６をトランスフェクトした細胞に対して種々のアルファ−シヌクレイン抗体を用い、免疫組織化学を行った。このような方法で、この細胞内に封入体形成および／またはアルファ−シヌクレイン凝集が観察される。封入体／凝集を探すのに用いる抗体としては、ＬＢ５０９、ＳＹＮ−１、１１Ａ５およびＥＬＡＤＷ−１１０が挙げられる。
【０１６７】
次に、マウスモデルへの標的の導入に向けて一次培養神経細胞内にＰＬＫ２およびＧＰＲＫ６ ｓｉＲＮＡのｃＤＮＡをトランスフェクトする。この方法は実施例１と同様にして行う。ｑＲＴ−ＰＣＲはＳＹ５Ｙ−シヌクレインＲＮＡを用いて（実施例１と同様にして）実施する。ＳＹ５Ｙ−シヌクレイン細胞は神経芽腫細胞由来であり、ＷＴ−シヌクレイン・ベクターを用いて安定的にトランスフェクトされている。
【０１６８】
実施例１０： 細胞周期の調節におけるＰＬＫ２の関与の確認
ＰＬＫ２はＧ１相細胞周期調節蛋白質であるので、アルファ−シヌクレインのＰＬＫ２によるリン酸化が細胞周期調節に変化をもたらすかどうかを確認することは重要である。細胞がより集密的に増殖するにつれて細胞内のリン酸化シヌクレインの割合が減少することは、以前に（増殖が減速するに従って）観察された。このことは、アルファ−シヌクレインをリン酸化する１種以上の直接キナーゼが細胞周期の調節に関与していることと極めてよく一致している。従って、ＰＬＫ２に対する１種以上の抗体を用いてウエスタンブロットにより標準化蛋白質濃度を分析することによって、ＰＬＫ２濃度の減少がこの観察されたリン酸化シヌクレイン濃度の減少および細胞の集密化と相関しているかどうかを明らかにする
。
【０１６９】
実施例１１： ヒト培養皮質細胞内のレンチウイルス発現アルファ−シヌクレインの分布−レヴィー小体病の細胞モデル
重要なのはレヴィー小体病および／またはＰＤ病状の細胞モデルの特定であった。このため、イン・ビボでアルファ−シヌクレイン沈着のモデルを確立するために、ヒト培養皮質細胞においてアルファ−シヌクレインのレンチウイルス媒介発現を行った。従って、ドナーおよび野生型および変異型アルファ−シヌクレインを過剰発現するＨＣＣ細胞で実験を行い、細胞を断片化して細胞内の野生型アルファ−シヌクレインおよび変異型アルファ−シヌクレインの場所を特定した。以下の結果から、ＨＣＣ細胞はＬＢ病に合致する仕方でアルファ−シヌクレインの凝集を示したことが分かる。さらに、ＰＬＫ２を発現させると、その凝集だけでなくアルファ−シヌクレインのリン酸化も増大した。
【０１７０】
培養を延長することにより過剰発現されたシヌクレインの蓄積が増大して細胞がストレスを受け、このことがシヌクレイン沈着または毒性にとって好都合に働くかどうかを確認する実験をさらに実施した。そこで、ＨＣＣをＷＴ、Ａ５３Ｔ、Ｓ１２９ＡまたはＡ５３／Ｓ１２９Ａアルファ−シヌクレイン突然変異体を発現するウイルスベクターで形質転換した。形質転換後、細胞を９、１６または２３日間インビトロで増殖させ、その後、回収して断片化した。ＥＬＩＳＡの結果を蛋白質濃度に対して標準化したところ、この結果から、時間がたつと共に可溶性画分にシヌクレインが蓄積することが分かった。Ｓ１２９Ａ突然変異体ではややより多くの蓄積が認められた。
【０１７１】
さらに、ｗｔ、１１９−切断型およびＥ４６Ｋ ＡＳで実験を行ったところ、その結果は以下の通りであった。野生型の発現が高いほど可溶性画分に回収されるアルファ−シヌクレインの部分は大きかった。Ｅ４６Ｋシヌクレインではリン酸化アルファ−シヌクレインの量に５０乃至１００％の増加がみられた。しかしながら、このＥ４６Ｋ突然変異体では膜結合または不溶性画分に回収される相対量は著しくは影響されなかった。１１９アルファ−シヌクレインを発現させると、不溶性画分に蓄積する相対量がわずかに（ＷＴに対して約３倍）増加した。この増加は、切断型シヌクレインが完全長型よりもインビトロではるかにより容易にフィブリルを形成することを示唆する公表結果（Ｍｕｒｒａｙ、２００３年 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：８５３０）を考えると、予想されるものである。１１９切断の結果、Ｎ−末端ドメインが脂質二重層との結合に関与していることと一致した膜との結合の増大が生じた。この膜との結合の増大により、上記の可溶性蛋白質が凝集する傾向の増大が緩和されるかも知れない。過剰発現時の可溶性シヌクレイン濃度の増加および切断に対する上記不溶性画分の反応から、これを用いることによって神経細胞内環境における凝集に影響を与える因子を特定する方法が得られることが示唆される。
【０１７２】
ＣＨＡＰＳ抵抗性、ＵＴＣ抽出性アルファ−シヌクレインがＰＤ／またはＤＬＢ病変（レヴィー封入体）と共通点があるかどうかを明らかにするために別の実験を行う。例えば、同実験をベータ−シヌクレインを用いて行った。というのは、ベータ−シヌクレインはレヴィー封入体と結合せず、またインビトロで凝集しないからである。
【０１７３】
可溶性コンパートメントのアルファ−シヌクレインが増加すると、アルファ−シヌクレインがより脆弱である可能性のあるコンパートメントに移されるとも考えられ、このことが沈着の増加をもたらし得る変化につながる。アルファ−シヌクレインをＳｅｒ−１２９でリン酸化すると提唱されているキナーゼは可溶性であるので、可溶性アルファ−シヌクレインもまたリン酸化により利用されやすいと思われる。
【０１７４】
細胞モデルでリン酸化および／または凝集の阻害剤を発現させ、リン酸化および／または凝集の低下を確認することにより、この細胞においてこの阻害剤を確認するために別の実験を行った。
【０１７５】
実施例１２： アルファ−シヌクレインＫＯマウスにおける内因性キナーゼ活性の分析
推定アルファ−シヌクレインキナーゼの確認のためにアルファ−シヌクレインノックアウト（アルファ−シヌクレインＫＯ）マウス脳を利用することは、以下の点でｓｉＲＮＡスクリーニングよりも有利である： １） 脳材料を用いることにより、ＨＥＫ細胞株では得られないと思われる適切で恐らくより高いレベルの脳特異的キナーゼ活性が得られること、２）脳には、上記細胞には存在しないと思われる補因子（脂質、蛋白質など）が存在すること、および３）リン酸化ＡＳとして検出される可能性のある如何なる内因性アルファ−シヌクレインも存在しないこと。測定可能なキナーゼ活性が粗材料中に存在するかどうかを明らかにするために、組換えアルファ−シヌクレイン（ｒＡＳ）含有（可溶性および界面活性剤可溶性）抽出物２５乃至５０μｇの封入体を２５０μＭのＡＴＰを用いて評価した。図８ＡはｒＡＳの対応する使用量を表す各反応におけるトータルアルファ−シヌクレインを示す。図８Ｂでは、ｓｅｒ−１２９リン酸化アルファ−シヌクレインの濃度を調べた。ＴＢＳ（蔗糖可溶性）およびＴＸ抽出物の両者中のｒＡＳがリン酸化され、ＴＢＳ材料からのシグナルのレベルはＴＸ材料からのそれのほぼ２倍であった（但し、反応は蛋白質に対して標準化しなかった）。リン酸化レベルはＣＫＩの添加によって増大したが、大豆由来リン脂質の添加では有意な影響を受けなかった。図９のｓｅｒ−８７リン酸化では同一のブロットをプローブした。このｐＡｂは１００ｎｇのｒＡＳと交差反応性を示すので、バックグラウンドを超えるレベルはＳ８７部位での真のリン酸化を表す。ＴＢＳおよびＴＸ反応のいずれにおいても、この部位での有意なリン酸化は認められなかったが、ＣＫＩスパイクは測定可能なレベルのリン酸化に達した。これらの実験から、測定可能な紛れもないキナーゼ活性（類）がＫＯマウス脳の可溶性および膜画分に存在し、Ｓ８７に比しＳ１２９に対して特異的であることが示唆される。アルファ−シヌクレインには他のセリンまたはスレオニン部位におけるリン酸化の可能性が存在するが、そのような修飾を検出するための抗体はまだ利用可能ではない。このように、測定可能なレベルのｓｅｒ−１２９特異的キナーゼ活性／活性類がアルファ−シヌクレインＫＯマウス脳抽出物に存在するので、このような活性を有するものを脳からのキナーゼ精製の原料とすることができるかも知れない。
【０１７６】
図８Ａ、８Ｂ、９Ａおよび９Ｂでは、アルファ−シヌクレインＫＯマウス脳の皮質をダンス型ホモジナイザーによりホモジナイズして、プロテアーゼおよびホスファターゼのインヒビターが存在する２００ｍＭ蔗糖可溶性および０．１％トリトンＸ−１００可溶性抽出物を得た。サンプル２０μｌ（反応液の総容量１００μｌ）を、陽性対照としてのカゼインキナーゼＩ（ＣＫＩ）１，０００単位および／またはキナーゼ活性（類）を増大させるためのホスファチジルコリン（ＰＣ；大豆レシチン）の存在下または非存在下にｗｔ−ｒＡＳ ２．４μｇとインキュベートした。反応はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷し（総ＡＳ量１３０ｎｇ）、Ｓｙｎ−１（総Ｓｙｎ；０．１ｕｇ／ｍｌ）、１１Ａ５（ｓｅｒ−１２９リン酸化；１μｇ／ｍｌ）またはＥＬＡＤＷ１１０（ｓｅｒ−８７リン酸化；２μｇ／ｍｌ）でイムノブロットした。
【０１７７】
上記のデータから、ＰＬＫ２その他の直接および／または間接キナーゼ（ＧＲＫ６など）ならびにシンフィリンなどの調節因子はＤＬＢおよびＰＤにおける治療的介入の新規な標的であることが分かる。ＰＬＫ２は、アルファ−シヌクレインをｓｅｒ−１２９で直接リン酸化することができるので、好ましい標的である。
【０１７８】
以上の実施例は単に例示的なものであり、本発明を限定するものではない。従って、他の変形形態がありうることは当業者には容易に理解されよう。本発明の範囲は、これにより付与される全ての特許の請求範囲によってカバーされる。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照するのではなく、付与される特許請求の範囲をその均等物の全範囲と共に参照して決定されるべきである。本出願において引用した全ての刊行物、参考文献および特許文献は、個々の刊行物もしくは特許文献がそれぞれ、そのようにして個別に示されている場合と同程度に、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１Ａ】図１Ａ乃至Ｃは、種々の組換えキナーゼによるアルファ−シヌクレインのリン酸化に関するインビトロ・リン酸化アッセイの結果を示す。図１Ａはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｂはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９のリン酸化を示し、図１Ｃはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ乃至Ｃは、種々の組換えキナーゼによるアルファ−シヌクレインのリン酸化に関するインビトロ・リン酸化アッセイの結果を示す。図１Ａはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｂはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９のリン酸化を示し、図１Ｃはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ乃至Ｃは、種々の組換えキナーゼによるアルファ−シヌクレインのリン酸化に関するインビトロ・リン酸化アッセイの結果を示す。図１Ａはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｂはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９のリン酸化を示し、図１Ｃはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄ乃至Ｆは、ＧＰＣＲ受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリーからの組換えキナーゼおよびＰＬＫ２を用いた更に的を絞った検討結果を示す。図１Ｄはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｅはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９（ホスホ−ｓｅｒ−１２９）のリン酸化、図１Ｆはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化（ホスホ−ｓｅｒ−８７）を示す。
【図１Ｅ】図１Ｄ乃至Ｆは、ＧＰＣＲ受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリーからの組換えキナーゼおよびＰＬＫ２を用いた更に的を絞った検討結果を示す。図１Ｄはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｅはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９（ホスホ−ｓｅｒ−１２９）のリン酸化、図１Ｆはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化（ホスホ−ｓｅｒ−８７）を示す。
【図１Ｆ】図１Ｄ乃至Ｆは、ＧＰＣＲ受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリーからの組換えキナーゼおよびＰＬＫ２を用いた更に的を絞った検討結果を示す。図１Ｄはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｅはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９（ホスホ−ｓｅｒ−１２９）のリン酸化、図１Ｆはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化（ホスホ−ｓｅｒ−８７）を示す。
【図２Ａ】図２ＡおよびＢは、各種キナーゼにおけるインビトロでのキナーゼ活性の測定結果を示す。図２ＡはトータルＡＳを示す。図２Ｂはセリン１２９を示す。
【図２Ｂ】図２ＡおよびＢは、各種キナーゼにおけるインビトロでのキナーゼ活性の測定結果を示す。図２ＡはトータルＡＳを示す。図２Ｂはセリン１２９を示す。
【図３Ａ】図３Ａ乃至Ｃは各種キナーゼにおけるインビトロでのキナーゼ活性の測定結果を示す。図３ＡはトータルＡＳを示す。図３Ｂはセリン１２９を示す。図３Ｃはセリン８７を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ乃至Ｃは各種キナーゼにおけるインビトロでのキナーゼ活性の測定結果を示す。図３ＡはトータルＡＳを示す。図３Ｂはセリン１２９を示す。図３Ｃはセリン８７を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ乃至Ｃは各種キナーゼにおけるインビトロでのキナーゼ活性の測定結果を示す。図３ＡはトータルＡＳを示す。図３Ｂはセリン１２９を示す。図３Ｃはセリン８７を示す。
【図４Ａ】図４ＡおよびＢは、図３Ａおよび３Ｂのアッセイ結果に及ぼすリン脂質の影響を示す。図４ＡはトータルＡＳを示す。図４Ｂはセリン１２９を示す。
【図４Ｂ】図４ＡおよびＢは、図３Ａおよび３Ｂのアッセイ結果に及ぼすリン脂質の影響を示す。図４ＡはトータルＡＳを示す。図４Ｂはセリン１２９を示す。
【図５】図５は、ＰＬＫ２のｃＤＮＡを２９３−シヌクレイン細胞中にトランスフェクトした結果を示す。細胞は、ＥＬＩＳＡによってトータルおよびリン酸化シヌクレイン濃度について分析した。
【図６】図６は、ＧＰＲＫ６およびＰＬＫ２のｃＤＮＡをＨＥＫ−シヌクレイン細胞中にトランスフェクトした結果を示す。
【図７】図７は、別の供給源からのＰＬＫ２ ｓｉＲＮＡのノックダウンがリン酸化シヌクレインの発現の劇的な減少をもたらすことを示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂならびに９Ａおよび９Ｂは、アルファ−シヌクレインＫＯマウス脳内の推定キナーゼ標的によるアルファ−シヌクレインのインビトロ・リン酸化を示す。
【図９】図８Ａおよび８Ｂならびに９Ａおよび９Ｂは、アルファ−シヌクレインＫＯマウス脳内の推定キナーゼ標的によるアルファ−シヌクレインのインビトロ・リン酸化を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
この出願は、本明細書においてその全体が参考として全ての目的のために援用される、２００６年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／７６４，０００号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
レヴィー小体病（ＬＢＤ）の特徴は、ドーパミン作動系の変性、運動性変調、認知障害、およびレヴィー小体（ＬＢ）の形成である（非特許文献１）。ＬＤＢとしては、パーキンソン病、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、レヴィー小体異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、パーキンソン病（ＰＤ）とアルツハイマー病（ＡＤ）との併発、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）とみなされる症候群が挙げられる。レヴィー小体を伴う痴呆（ＤＬＢ）というのは、ＬＢＤ間の専門用語の相違を調整するために作られた用語である。ＬＢを有する疾患は、依然として、高齢者における運動性疾患および認識力低下に共通する原因となっている（非特許文献２）。この疾患の発生率は増加し続けており、深刻な公衆衛生問題を生じているが、今日まで、こうした疾患に対して認可された治療法はない（非特許文献３）。ＬＢＤの原因については意見の分かれるところであり、各種の神経毒および遺伝的感受性要因などのさまざまな要因が役割を果たしていると提唱されている。
【０００３】
近年、ＬＢＤの病因の理解に関して新たな可能性が浮上した。具体的には、いくつかの研究によって、（１）シナプス蛋白質アルファ−シヌクレインがＬＢ内に蓄積すること（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）、（２）アルファ−シヌクレイン遺伝子の突然変異体が稀な家族型パーキンソン病に伴って単離されること（非特許文献７、非特許文献８）、ならびに（３）遺伝子導入マウス（非特許文献９）およびショウジョウバエ（非特許文献１０）におけるその過剰発現によってＰＤのいくつかの病理学的側面が再現されることから、アルファ−シヌクレインはＰＤの病因に中心的な役割を果たしていることが分かった。すなわち、脳内のアルファ−シヌクレインの蓄積がヒト、マウス、ハエといった多様な種において同様な形態学的および神経学的変化を伴うという事実から、この分子がＰＤ発症の一因となっていることが示唆される。
【非特許文献１】ＭｃＫｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ （ＤＬＢ）： Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＬＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （１９９６） ４７：１１１３−２４
【非特許文献２】Ｇａｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ． Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． （１９９４） ５１：８８８−９５
【非特許文献３】Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ａｋｉｎｅｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． （２０００） １３：４２７−３０
【非特許文献４】Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３３８：ｐ８３９−４０
【非特許文献５】Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２：ｐ３６７−７２
【非特許文献６】Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ．（１９９７）２３９：ｐ４５−８
【非特許文献７】Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．（１９９８年）１８：ｐ１０６−８
【非特許文献８】Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：ｐ２０４５−７）
【非特許文献９】Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ）（２０００）２８７：ｐ１２６５−９
【非特許文献１０】Ｆｅａｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：ｐ３９４−８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要約）
一態様として、本発明は、レヴィー小体病（ＬＢＤ）を治療する活性について因子をスクリーニングする方法を提供する。このような疾患としては、パーキンソン病（ＰＤ）、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、レヴィー小体異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、ＰＤとアルツハイマー病（ＡＤ）との併発、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）とみなされる症候群が挙げられる。一部の方法は、表１Ａ、Ｂ；Ｃ、表２、表１２または表１３に示したキナーゼの活性または発現を調節する因子を特定し、この因子がＬＢＤの動物モデルにおいてこの疾患を治療するのに有用な活性を示すか否かを決定するものである。一部の方法では、この調節は阻害することである。一部の方法では、工程（ａ）は、この因子が上記キナーゼを阻害するか否かを特定することを含む。一部の方法では、工程（ａ）は、このキナーゼおよび／またはアルファ−シヌクレインを発現する核酸で形質転換した細胞において行われる。一部の方法では、工程（ａ）はインビトロで行う。一部の方法では、工程（ｂ）はＬＢ疾患のトランスジェニック動物モデルにおいて行われ、このトランスジェニック動物はヒト・アルファ−シヌクレインを発現する導入遺伝子を有することができる。好ましくは、このキナーゼはＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、ＧＡＫ、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＭＥＴのうちの少なくとも１種であり、その調節は阻害である。より好ましくは、このキナーゼはＰＬＫ２またはＧＲＫ６であり、その調節は阻害である。このキナーゼはＰＬＫ２であることがさらに好ましい。好ましくは一部の方法において、このキナーゼはＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３またはＧＡＫであり、その調節は賦活化することである。一部の態様として、工程（ｂ）は、このトランスジェニック動物を上記因子と接触させ、この因子がこの因子を処置していない対照トランスジェニック動物と比較してアルファ−シヌクレインの沈着物の形成を抑制するかどうかを明らかにするものである。
【０００５】
別の態様として、本発明はＬＢＤの治療もしくは予防を行う方法を提供する。この方法のいくつかの例は、この病気に罹患しているか罹患するリスクのある患者に対して、キナーゼの活性または発現を調節するのに有効な因子の有効な療法を施行するものである。このキナーゼは、表１Ａ、ＢもしくはＣ、表２、表１２または表１３に示したもののうちの１種とすることができる。また、上記因子は、このキナーゼに対する抗体、このキナーゼの発現を調節する亜鉛フィンガー蛋白質またはこのキナーゼの核酸配列に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムもしくはＲＮＡであることが好ましい。一部の方法では、この調節は阻害することであり、好ましくはこのキナーゼは以下のＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＭＥＴのうちの少なくとも１種である。より好ましくは、このキナーゼはＰＬＫ２またはＧＲＫ６である。このキナーゼはＰＬＫ２であることがさらに好ましい。上記方法の一部では、このキナーゼはＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫのうちの少なくとも１種であり、その調節は活性化である。
【０００６】
別の態様として、本発明は、アルファ−シヌクレインを発現する細胞に対してキナーゼをコードしている遺伝子に相補的な配列を有する核酸またはこの遺伝子に特異的に結合する亜鉛フィンガー蛋白質をトランスフェクトすることによりアルファ−シヌクレインをリン酸化するキナーゼを特定する方法を提供する。このトランスフェクトした核酸または亜鉛フィンガー蛋白質はキナーゼの発現を阻害するが、このとき、この細胞のリン酸化アルファ−シヌクレインの量を、ｓｉＲＮＡまたは該ｓｉＲＮＡをコードしている核酸をトランスフェクトしていない対照細胞との比較で測定することができる。この場合、リン酸化アルファ−シヌクレインの減少は、このキナーゼがアルファ−シヌクレインをリン酸化することの指標となる。また、一部の方法として、この細胞により産生されたアルファ−シヌクレインの量を、上記核酸をトランスフェクトしていない対照細胞との比較で測定する方法が挙げられる。一部の方法では、この核酸は、ｓｉＲＮＡまたはそれをコードしているＤＮＡ分子である。
【０００７】
他の態様として、本発明は、シンフィリンの活性または発現を調節する因子を特定し、この因子がレヴィー小体病（ＬＢＤ）の動物モデルにおいてＬＢＤを治療するのに有用な活性を示すか否かを決定する工程によってこの疾患を治療する活性について因子をスクリーニングする方法を提供する。
【０００８】
他の態様として、本発明は、細菌細胞内にアルファ−シヌクレインをコードしているプラスミドおよびＰＬＫ２をコードしているプラスミドを供給し、この細胞を培養することによりこれらのプラスミドが同時発現してアルファ−シヌクレインおよびＰＬＫ２を産生する状態にして細菌細胞内でＰＬＫ２にアルファ−シヌクレインをリン酸化させ、この細胞からリン酸化アルファ−シヌクレインを単離することによって、Ｓｅｒ−１２９リン酸化アルファ−シヌクレインを作製する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
定義
「因子」という用語は、薬理活性を有するか、有する可能性のある化合物を記述するのに用いている。因子としては、既知の薬物である化合物、薬理活性は確認されているが、さらに治療上の評価が行われている化合物、および薬理活性についてスクリーニングされることになっているコレクションおよびライブラリを構成する物質である化合物が挙げられる。
【００１０】
「薬理」活性とは、因子が疾患の予防もしくは治療に有用であるか、有用である可能性を有することを示すスクリーニング系において、ある因子が活性を発現することを意味する。このスクリーニング系はインビトロ系、細胞系、動物系もしくはヒト系とすることができる。因子は、疾患の処置における実際的な予防もしくは治療的有用性を立証するにはさらに試験を必要とする可能性があるにしても、薬理活性を有すると評することができる。
【００１１】
レヴィー様小体は、ヒト患者に存在するレヴィー小体の特徴の一部または全てと類似している、トランスジェニック動物に見いだされる水／界面活性剤不溶性のアルファ−シヌクレイン沈着物である。これらの特徴としては密なアルファ−シヌクレイン陽性封入体であることが好ましい。こうした封入体は年齢依存性に形成されることが好ましい。アルファ−シヌクレイン陽性封入体が形成されると、細胞病変が観察可能となり、患部神経細胞の機能が失われることになる。患部神経細胞の機能の喪失は、行動試験、神経薬理学的反応評価および電気生理学によって確認することができる。
【００１２】
「特異的に結合する」という語句は、蛋白質類その他の生体物質の不均一な集団の存在下に上記蛋白質の存在を決定するような結合反応のことを意味する。すなわち、所定の条件下においては、特定のリガンドは特定の蛋白質に選択的に結合し、試料中に存在する他の蛋白質とは有意な量で結合しない。多くの場合、蛋白質に特異的に結合する抗体などの分子の結合定数は、少なくとも１０６Ｍ−１もしくは１０７Ｍ−１、好ましくは１０８Ｍ−１乃至１０９Ｍ−１、より好ましくは約１０１０Ｍ−１乃至１０１１Ｍ−１以上である。種々のイムノアッセイ方式を用いて特定の蛋白質に対し特異的な免疫反応性を示す抗体を選定することができる。例えば、蛋白質に対し特異的な免疫反応性を示すモノクロナール抗体を選定するのに固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ法が日常的に用いられている。特異的な免疫反応性を測定するのに用いることができるイムノアッセイ方式および条件の解説については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ニューヨークを参照されたい。
【００１３】
配列の比較においては、通常、１つの配列を試験配列と比較する対照配列として用いる。配列比較アルゴリズムを用いる際には、試験および対照配列をコンピュータに入力し、必要な場合、部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）を指定し、次に、配列アルゴリズム・プログラム・パラメータを指定する。次いで、指定したプログラム・パラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムにより、対照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【００１４】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ、Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２：ｐ４８２（１９８１年）の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８：４４３（１９７０年）のホモロジー・アラインメント・アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５：２４４４（１９８８年）の類似性検索法（ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ）、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、５７５サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｄｒ．、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、もしくは目視検査（ｖｉｓｕａｌ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌほかの上記文献参照）によって行うことができる。
【００１５】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌほか、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９０年）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。このアルゴリズムは、先ず、データベース配列中の同じ長さの文字列（ｗｏｒｄ）と整列させた時にある正値の閾値スコアＴにマッチするかこれを満たす検索（ｑｕｅｒｙ）配列中の長さＷの短い文字列を特定することによって高相同性スコア（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ）配列対（ＨＳＰ）を同定するものである。Ｔは、近傍文字列スコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌほか、上記文献）と呼ばれる。これらの初期の近傍文字列ヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとなる。次いで、これらの文字列ヒットは、累積アラインメント・スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータＭ（一対の一致残基のスコア値（ｒｅｗａｒｄ）；常に＞０）およびＮ（不一致残基のペナルティ値；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合、スコアリング・マトリクス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）を用いて累積スコアを算出する。文字列ヒットの各方向への延長は、以下の場合、即ち、上記累積アラインメント・スコアがその最大到達値から数量Ｘだけ減少した場合、この累積スコアが１つ以上のネガチブ・スコア（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ）残基アラインメントの蓄積によりゼロ以下になった場合、もしくはどちらの配列においても末端に到達した場合に停止する。ある核酸もしくはポリペプチドが本発明の範囲内にあるかどうかを確認するためには、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルト・パラメータが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクスを用いる。ＴＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の代わりに蛋白質配列を用いる）は、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクスを用いる。（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９８９）参照）。
【００１６】
配列同一性パーセントを算出する他に、ＢＬＡＳＴアルゴニズムは２つの配列間の類似性の統計的な解析をも行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３年）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴニズムにより得られる類似性の１つの指標は、２つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標となる最小合計確率（ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と対照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、この核酸は対照配列と類似していると考えられる。
【００１７】
アミノ酸置換を保存的もしくは非保存的なものとして分類するために、アミノ酸を以下のようにグループ分けする：グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅｕ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は同じクラスのアミノ酸間の置換を行うものである。非保存的置換は、これらのクラスの中の１つのアミノ酸を別のクラスのアミノ酸と交換することから成る。
【００１８】
通常、本発明の治療剤は好ましくない夾雑物を実質的に含まない。このことは、因子が、妨害蛋白質および夾雑物を実質的に含まないばかりでなく、通常、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であることを意味する。場合によっては、こうした因子の純度は、少なくとも約８０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９０もしくは約９５％ｗ／ｗである。しかしながら、従来の蛋白質精製法を用いると、少なくとも９９％ｗ／ｗの均一なペプチドを得ることができる。
【００１９】
「抗体」もしくは「免疫グロブリン」という用語は、完全な状態の抗体およびその結合性断片を含めて用いている。通常、断片は、それが由来する完全な状態の抗体と、個々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを含む抗原断片への特異的結合に対して競合する。断片は、組換えＤＮＡ法、もしくは完全な状態の免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって作製することができる。また、「抗体」という用語は、他の蛋白質との融合蛋白質へと化学的に結合させ、もしくはこうした融合蛋白質として発現させた１種以上の免疫グロブリン鎖を含む。また、「抗体」という用語は、二重特異性抗体を含む。二重特異性もしくは二官能性抗体は、２種の重／軽鎖対および２種の結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合もしくはＦａｂ’断片間の結合を含む種々の方法によって作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ、Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９： ３１５−３２１ （１９９０年）； Ｋｏｓｔｅｌｎｙほか、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： １５４７−１５５３ （１９９２年）を参照されたい。
【００２０】
疾患の症候とは、正常な機能、知覚または外見からの逸脱を意味する疾患を有する個体が経験する現象を意味する。
【００２１】
疾患の徴候とは、疾患の存在またはリスクを意味することにつながる何らかの身体症状である。
【００２２】
「患者」という用語は、予防的もしくは治療的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物の対象を含む。
【００２３】
記載された１つ以上の要素を「含む」組成物もしくは方法には、特に記載されていない他の要素を含めることができる。例えば、アルファ−シヌクレイン・ペプチドを含む組成物は、アルファ−シヌクレイン・ペプチド単体と、より大きなポリペプチド配列の構成成分としてのアルファ−シヌクレイン・ペプチドとの両方を包含する。
【００２４】
特に文脈から明らかでない限り、本発明の各実施態様、要素、工程もしくは特徴は、任意の他のものとの組み合わせで用いることができる。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
Ｉ． 概要
本発明は、アルファ−シヌクレインをリン酸化し、および／またはその産生を阻害する１種以上のキナーゼを阻害することによりレヴィー小体病（ＬＤＢ）を抑制することができるという洞察に、部分的に基づいている。アルファ−シヌクレインはレヴィー小体（ＬＢ）に存在する主要な蛋白質である。本発明の実施はメカニズムの理解に左右されるものではないが、アルファ−シヌクレインのコドン１２９におけるリン酸化は、アルファ−シヌクレインの細胞内沈着物の形成をもたらす一連の分子事象の１つであると考えられている。ｓｅｒ−１２９でリン酸化されているアルファ−シヌクレインは、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）および家族型パーキンソン病（ＰＤ）のレヴィー小体（ＬＢ）に極めて多く含まれている。ＬＢにおけるリン酸化アルファ−シヌクレインの異常な蓄積は、リン酸化シヌクレインがＬＢ形成を駆動する病原性種であること、およびそのリン酸化に関与し、またはアルファ−シヌクレイン自体の産生を調節するキナーゼ（類）が多発性シヌクレオパチー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）の治療における治療上の標的（群）であることを示している。このシリーズの他の事象としては、リン酸化に続く蛋白質分解的切断が挙げられそうである（２００４年５月１９日出願の国際公開公報第ＷＯ２００５／０１３８８９号参照）。本願では、その阻害がアルファ−シヌクレインのリン酸化の減少および／またはトータル・アルファ−シヌクレイン濃度の低下を伴う数種のキナーゼを特定したことを報告する。本発明はこれらのキナーゼの活性および発現の調節物質を特定する方法ならびにレヴィー小体病を処置する方法を提供する。
【００２６】
ＩＩ．本発明のキナーゼ
表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃには、蛋白質であって、これを阻害することによりｓｅｒ−１２９の位置のリン酸化が調節される蛋白質を示した。表１Ａにはセリンおよび／またはスレオニン残基および、場合によっては、チロシンをリン酸化することができるキナーゼを示した。表１Ｂにはセリン残基を（知られている限り）修飾することができないチロシンキナーゼを示した。表１Ｃにはキナーゼ活性を有しないことが知られている蛋白質を示した。表１Ａの上部からのキナーゼはアルファ−シヌクレインのｓｅｒ−１２９を直接リン酸化することができる候補である。また、表１Ｂの上部からのキナーゼは、アルファ−シヌクレインを間接的にリン酸化する役割を介する治療上の有用な標的である。表１Ｃの上部の蛋白質も、同じ理由から治療上の有用な標的である。各表の第１、２および３欄には、遺伝子名、キナーゼ名およびキナーゼのジェンバンク・アセッション番号を示した。その次の欄には、キナーゼの阻害がリン酸化を低下させる（「下降（ｄｏｗｎ）」）のか、増大させる（「上昇（ｕｐ）」）のかを示した。その次の３欄には、リン酸化の測定レベルが３回の独立した実験の平均値から外れる標準偏差の数を示した。最後の２欄にはキナーゼファミリー（即ち、アミノ酸特異性）および群を示した。
【００２７】
表２および３には、キナーゼであって、これを阻害することによってリン酸化の割合を変えないでヒト・アルファ−シヌクレインの全体的濃度が調節されるキナーゼを示した。表２にはヒト・アルファ−シヌクレインの濃度の低下が最も強いキナーゼの全てを示した。表の欄には表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃと同様に名称をつけた。
【００２８】
表４および５には、ヒト・アルファ−シヌクレインの全体的濃度を調節することが実施例で確認された、表１、２および３からのキナーゼを示した。実証されたキナーゼとしては、直接的または間接的にアルファ−シヌクレインをリン酸化するキナーゼであるＰＬＫ２、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＧＲＫ１、２、６および７が挙げられる。阻害されるとアルファ−シヌクレインのリン酸化を増大させることが見いだされたキナーゼであるＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫは、アルファ−シヌクレインのリン酸化の負の調節因子である可能性が高い。さらに、インビトロのリン酸化研究からのデータによって、ＰＫＬ２ならびにＧＲＫ２、５、６および７はインビトロでアルファ−シヌクレインをリン酸化することができるものと確認され、また、ＣＫＩＩおよびＩＫＢＫＢも確認された。さらに、組織培養による研究から、ＰＫＬ２およびＧＲＫ６は組織培養においてアルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができることが分かった。これらのデータは免疫組織化学を用いて裏付けられた。要約すると、ＰＫＬ２および、それほどではないにせよＧＲＫ６も、アルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができるので、レヴィー小体病における治療的介入の特に好ましい標的である。ＰＫＬ２およびＧＲＫ６を阻害する因子はアルファ−シヌクレインのリン酸化も抑制するので、レヴィー小体病の治療または予防に用いることができる。また、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩ、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６およびＧＲＫ７は、直接キナーゼの間接的な活性化因子である可能性が高いので、レヴィー小体病における治療的介入の標的である。従って、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩ、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６およびＧＲＫ７を阻害する因子は、アルファ−シヌクレインのリン酸化も抑制し、レヴィー小体病の治療または予防に用いることができる。ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫはアルファ−シヌクレインのリン酸化の負の調節因子である。従って、これらのキナーゼを活性化する因子はアルファ−シヌクレインのリン酸化を低下させ、レヴィー小体病の治療または予防に用いることができる。
【００２９】
ＰＫＬ２は、ＳＮＫとも称するが、Ｇ１細胞周期蛋白質であるポロ（Ｐｏｌｏ）様キナーゼであり、細胞内での代謝回転が速く、また、脳において発現され、ここでシナプス可塑性に関与する。一貫性を持たせるために、本特許出願の全体を通してＰＫＬ２という名称を用いる。ＰＫＬ２は、活性化されると、賦活化された神経細胞の樹状突起を標的にし、そこでシナプス終末内の蛋白質をリン酸化すると考えられている。ＰＫＬ２の代表的なアセッション番号は表１Ａに示した。また、ＰＫＬ２の配列は、Ｍａほか、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、２３ （１９）： ６９３６−６９４３ （２００３年）、Ｂｕｒｎｓほか、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、２３ （１６）： ５５５６−５５７１ （２００３）、Ｍａｔｓｕｄａほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２ （２１）： ３３０７−３３１８ （２００３年）、Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｙｏｓｈｉｄａほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２８９ （２）： ４９１−４９８ （２００１年）、Ｌｉｂｙほか、ＤＮＡ ｓｅｑ．、１１ （６）： ５２７−５３３ （２００１年）、Ｈｏｌｔｒｉｃｈほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９ （４２）： ４８３２−４８３９、Ｏｕｙａｎｇほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８ （４４）： ６０２９−６０３６ （１９９９年）およびＫａｕｓｅｌｍａｎｎほか、ＥＭＢＯ Ｊ．、１８ （２０）： １５５２８−５５３９のうちのいずれかに見いだすことができるが、ＰＫＬ２のアミノ酸もしくは核酸配列という表現にはこれらの参考文献の全ての配列またはその対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３０】
ＧＰＫ６は、ＧＰＲＫ６とも称するが、Ｇ蛋白質共役受容体キナーゼであり、シグナル伝達に関与している。Ｇ蛋白質共役受容体キナーゼはリガンド活性化型Ｇ蛋白質共役受容体をリン酸化し、脱感作する。これまでに、ＧＲＫ６の発現は多くの脳領域においてＭＰＴＰ損傷群で有意に高くなることが明らかにされている。一貫性を持たせるために、本特許出願全体を通してＧＲＫ６という名称を用いる。代表的なアセッション番号を表１Ａに示した。ＧＲＫ６の配列は、Ｔｅｌｉほか、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ９８ （２）： ３４３−３４８ （２００３）、Ｍｉｙａｇａｗａほか、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３００ （３）： ６６９−６７３ （２００３年）、Ｇａｕｄｒｅａｕほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７ （３５）： ３１５６７−３１５７６ （２００２年）、Ｇｒａｎｇｅ−Ｍｉｄｒｏｉｔほか、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １０１ （１−２）： ３９−５１ （２００２年）、Ｗｉｌｌｅｔｓほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７ （１８）： １５５２３−１５５２９ （２００２年）、Ｂｌａｕｋａｔほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６ （４４）： ４０４３１−４０４４０ （２００１年）、Ｚｈｏｕほか、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２９８ （３）： １２４３−１２５１ （２００１年）、Ｐｒｏｎｉｎほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５ （３４）： ２６５１５−２６５２２ （２０００年）、Ｔｉｒｕｐｐａｔｈｉ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７ （１３）： ７４４０−７４４５ （２０００年）、Ｐｒｅｍｏｎｔほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４ （４１）： ２９３８１−２９３８９ （１９９９年）、Ｂｒｅｎｎｉｎｌｍｅｉｊｅｒほか、Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １６２ （３）： ４０１−４０８ （１９９９年）、Ｈａｌｌほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４ （３４）： ２４３２８−２４３３４ （１９９９年）、Ｌａｚａｒｉほか、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３ （６）： ８６６−８７８ （１９９９年）、Ｍｉｌｃｅｎｔほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｏｎ． ２５９ （１）： ２２４−２２９ （１９９９年）、Ｐｒｅｍｏｎｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５ （２４）： １４０８２−１４０８７ （１９９８年）、Ｓｔｏｆｆｅｌほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７ （４６）： １６０５３−１６０５９ （１９９８年）、Ｌｏｕｄｏｎほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２ （４３）： ２７４２２−２７４２７ （１９９７年）、Ｆｒｅｅｄｍａｎほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２ （２８）： １７７３４−１７７４３ （１９９７年）、Ｂｕｌｌｒｉｃｈほか、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ７０ （３−４）： ２５０−２５４ （１９９５年）、Ｓｔｏｆｆｅｌほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９ （４５）： ２７７９１−２７７９４ （１９９４年）、Ｌｏｕｄｏｎほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９ （３６）： ２２６９１−２２６９７ （１９９４年）、Ｈａｒｉｂａｂｕ、Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０ （２０）： ９３９８−９４０２ （１９９３年）およびＢｅｎｏｖｉｃ、Ｇｏｍｅｚ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８ （２６）： １９５２１−１９５２７ （１９９３年）のうちのいずれかに記載されているが、ＧＲＫ６のアミノ酸もしくは核酸配列という表現にはこれらの参考文献の全てのアミノ酸もしくは核酸配列またはその対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３１】
カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ、ＣＳＮＫ２およびＣＳＮＫＩＩとも称する）はアルファ−シヌクレインをリン酸化すると報告されている。一貫性を持たせるため、本明細書ではＣＫＩＩの名称を用いる。ＣＫＩＩの配列は、ＮＭ＿００１８９６およびＮＭ＿００１３２０のアセッション番号でジェンバンクに登録され、および／または、Ｐａｎａｓｙｕほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１ （４２）： ３１１８８−３１２０１ （２００６年）、Ｓａｌｖｉほか、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５８０ （１６）： ３９４８−３９５２ （２００６年）、Ｌｉｍほか、Ｃｅｌｌ １２５ （４）： ８０１−８１４ （２００６年）、Ｌｌｏｒｅｎｓほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３９４ （Ｐｔ． １）： ２２７−２３６ （２００６年）、Ｂｊｏｒｌｉｎｇ−Ｐｏｕｌｓｅｎほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４ （４０）： ６１９４−６２００ （２００５年）、Ｓｃｈｕｂｅｒｔほか、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０４ （２）： ８７５−８８３ （１９９１年）、Ｖｏｓｓほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６ （２１）： １３７０６−１３７１１ （１９９１年）、Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇほか、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８ （４）， ７４１−７４２ （１９９０年）、Ｈｅｌｌｅｒ−Ｈａｒｒｉｓｏｎほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８ （２３）， ９０５３−９０５８ （１９８９年）、Ａｃｋｅｒｍａｎｎほか、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｒｎ． ２７４ （１−２）： ９１−１０１ （２００５年）、Ｂａｒｒｉｏｓ−Ｒｏｄｉｌｅｓほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０７ （５７１５）： １６２１−１６２５ （２００５年）、Ａｎｄｅｒｓｅｎほか、Ｎａｔｕｒｅ ４３３ （７０２１）， ７７−８３ （２００５年）、Ｂａｌｌｉｆほか、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ３ （１１）： １０９３−１１０１ （２００４年）、Ｂｅａｕｓｏｌｅｉｌほか、ＰＮＡＳ， ＵＳＡ １０１ （３３）： １２１３０−１２１３５ （２００４年）およびＭａｒａｉｓほか、ＥＭＢＯ Ｊ． １１（１）： ９７−１０５ （１９９２年）のうちのいずれかに記載されている。ＣＫＩＩのアミノ酸もしくは核酸配列という表現にはこれらの参考文献の全てのアミノ酸もしくは核酸配列およびその対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３２】
ＩＫＢＫＢおよびこれと関連のＩＫＢＫＡはＮＦｋＢ炎症経路の正の調節因子である。ＩＫＢＫＢの配列はＮＭ＿００１５５６のアセッション番号でジェンバンクに登録されており、および／または、Ｃａｔｅｒｉｎｏほか、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５８０ （２８−２９）、６５２７−６５３２ （２００６年）、Ｃａｓｔｌｅほか、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ４ （１０）： Ｒ６６ （２００３年）、Ｓａｔｏｈほか、Ｂｉｏｃｈｉｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １６００ （１０３）： ６１−６７ （２００２年）、Ｃａｏｈｕｙ、Ｐｏｌｌａｒｄ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７ （２８）： ２５２１７−２５２２５ （２００２年）、Ｙｕほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ； ２７７ （１８）： １５８１９−１５８２７ （２００２年）、Ｓｅｌｂｅｒｔほか、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １０８ （Ｐｔ．１）： ８５０９５ （１９９５年）、Ｓｈｉｒｖａｎほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ （２２）： ６８８８−６９０１ （１９９４年）、Ｃｒｅｕｔｚほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８４ （１）： ３４７−３５２ （１９９２年）、Ｍｅｇｅｎｄｚｏほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６ （５）： ３２２８−３２３２ （１９９１年）、Ｂｕｍｓほか、ＰＮＡＳ， ＵＳＡ ８６ （１０）： ３７９８−３８０２ （１９８９年）のうちのいずれかに記載されている。ＩＫＢＫＢのアミノ酸もしくは核酸配列という表現にはこれらの参考文献の全てのアミノ酸もしくは核酸配列およびその対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３３】
シンフィリンは、アルファ−シヌクレインに結合することが分かっているシヌクレイン関連蛋白質である。シンフィリンは、キナーゼそのものではないが、特にＰＬＫ２との組合せでシヌクレインのリン酸化を促進することが本明細書で明らかにされている。このシンフィリンは、ＰＬＫ２依存性にシヌクレインのリン酸化を促進するように思われた。シンフィリンの配列は、ＮＭ＿００５４６０のアセッション番号でジェンバンクに登録されており、および／または、Ｔａｎｊｉほか、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １６９ （２）： ５５３−５６５ （２００６年）、Ｅｙａｌほか、ＰＮＡＳ， ＵＳＡ １０３ （１５）： ５９１７−５９２２ （２００６年）、Ａｖｒａｈａｍほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０ （５２）： ４２８７７−４２８８６ （２００５年）、Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙほか、Ｎｅｕｒｏｈｉｏｌ． Ｄｉｓ． ２０ （２）： ４０１−４１１ （２００５年）、Ｌｉｍほか、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２５ （８）： ２００２−２００９ （２００５年）、Ｒｉｂｅｉｒｏほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７ （２６）： ２３９２７−２３９３３ （２００２年）、Ｃｈｕｎｇほか、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ７ （１０）： １１４４−１１５０ （２００１年）、Ｅｎｇｅｌｅｎｄｅｒほか、Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ １１ （９）： ７６３−７６６ （２０００年）およびＥｎｇｅｌｅｎｄｅｒほか、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２２ （１）， １１０−１１４ （１９９９年）のうちのいずれかに記載されている。シンフィリンのアミノ酸もしくは核酸配列という表現にはこれらの参考文献の全てのアミノ酸もしくは核酸配列およびその対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３４】
ＩＩＩ． アルファ−シヌクレインの単離
ヒト・アルファ−シヌクレインは次のアミノ酸配列を有するアミノ酸１４０個のポリペプチドである：
【００３５】
【化１】
（配列番号：１）
（Ｕｅｄａほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９３年） ９０： １１２８２−６；ジェンバンク・アセッション番号：Ｐ３７８４０）。この蛋白質は、認識される３つのドメイン、即ち、１から６１番目のアミノ酸をカバーするＫＴＫＥ繰返し配列ドメイン（ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ）、約６０番目から９５番目のアミノ酸に及ぶＮＡＣ（非アミロイド成分）ドメイン、および約９８番目から１４０番目のアミノ酸に及ぶＣ末端酸性ドメインを有する。
【００３６】
特に文脈から明らかでない限り、アルファ−シヌクレインという表現には上記の天然のヒト型アミノ酸配列ならびに天然のヒト型アルファ−シヌクレインと少なくとも９０％の配列同一性を有する対立遺伝子、種および誘発変異体（例えば、Ｅ８３Ｑ、Ａ９０Ｖ、Ａ７６Ｔ）などの類似体を含める。上記の類似体と天然ヒト型アミノ酸配列とを最大限に整列させた場合、この類似体のアミノ酸にはこのヒト型アミノ酸配列の対応するアミノ酸と同じ番号が付与される。類似体は、１もしくは２カ所、または数カ所で天然ペプチドと異なるが、これは多くの場合、保存的置換によるものである。一部の対立遺伝子変異体は、遺伝性ＬＢＤと遺伝的な関連がある。「対立遺伝子変異体」という用語は、同一種の異なる個体の遺伝子間の変異およびこれらの遺伝子によりコードされている蛋白質の対応する変異のことを指して用いている。対立遺伝子変異体としては、Ｅ４６Ｋ、Ａ３０Ｐ、Ａ５３Ｔ（最初の文字は配列番号：１におけるアミノ酸を示し、数字は配列番号：１におけるそのコドンの位置であり、２番目の文字は対立遺伝子変異体における対応するアミノ酸である）などの家族性突然変異体もしくは変異体が挙げられる。類似体としては対立遺伝子変異体間の任意の組合せを挙げることができる。Ａ５３Ｔの変異は、この突然変異を有さない病気ではない個体におけるリン酸化の基準に対する、突然変異を有する個体におけるアルファ−シヌクレインの１２９番目の位置のリン酸化のレベルの上昇と関連がある。
【００３７】
アルファ−シヌクレイン、その断片および類似体は、固相ペプチド合成法もしくは組換え発現法によって合成することができ、または自然源から入手することができる。自動ペプチド合成機が、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスター・シティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州などの数多くの製造業者から市販されている。組換え発現では大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞などにおいて行うことができる。組換え発現の方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．プレス、ニューヨーク、第２版、１９８９年）に記載されている。
【００３８】
細菌発現系において野生型Ｓ−１２９リン酸化アルファ−シヌクレイン、突然変異体および／または家族型を大量調製する方法をここに開発した。細菌中で組換えｈＰＬＫ２をアルファ−シヌクレインと同時発現させると、その細胞中に産生されたＳ−１２９リン酸化アルファ−シヌクレインは極めて高い収率および純度で回収された。これは、多くの大腸菌蛋白質と異なり、このアルファ−シヌクレインは加熱に耐えることができたからである。細菌溶解物を煮沸した後のアルファ−シヌクレインの純度はクロマトグラフィーの前に約９５％に達した。
【００３９】
細菌系において組換え蛋白質を同時発現させるために、各対象遺伝子を収容するプラスミドは、これらが異なる複製起点および異なる抗生物質選択性を有するようにすることによってその細菌細胞内で共存できるものを選択した。このアルファ−シヌクレイン遺伝子をｐＤＥＳＴ２４適合性ベクターであるｐＣＤＦ１ｂ中にサブクローニングした。次に、ＢＬ２１−ＤＥ３菌を、ｐＤＥＳＴ２４含有野生型ｈＰＬＫ２もしくはｈＰＬＫ２構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）突然変異体でＧＳＴ標識を有しない構造物およびｐＣＤＦ１ｂ／ＡＳプラスミドの両者で同時形質転換した。この菌の溶解物を煮沸し、アルファ−シヌクレインを含有すると期待される上清について、抗−Ｓ１２９リン酸化アルファ−シヌクレイン抗体（１１Ａ５）を用いるウェスタンブロット法、シプロ・ルビー（ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ） （商標）およびプロＺダイアモンド（ＰｒｏＺＤｉａｍｏｎｄ） （商標） 染色剤 （それぞれ、トータル蛋白質およびホスホ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ特異的染色剤）を用いる方法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法ならびに質量分析法によって分析した。その結果、極めて純粋なＳ１２９リン酸化アルファ−シヌクレインが単離され、これは、質量分析法での分析で９５％超リン酸化されていることが明らかとなった。最終生成物が１００％リン酸化されていて高純度となるように、最後の遠心の上清は１１Ａ５−セファロース−アフィニティ精製カラムを１度以上通過させた。どのような異物もＨＰＬＣを用いて除去した。
【００４０】
ＩＶ．発現を調節する因子
既知の配列の任意の目的遺伝子の発現を抑制するのに、亜鉛フィンガー蛋白質、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどの特性のよく分かった一般的クラスの多くの因子を用いることができる。亜鉛フィンガー蛋白質は、目的遺伝子の発現を活性化するのに用いることもできる。抑制の対象となる遺伝子は、好ましくはＰＬＫ２またはＧＲＫ６である。何故なら、これらの遺伝子によりコードされているキナーゼはアルファ−シヌクレインを直接リン酸化するからである。ＰＬＫ２が特に好ましい。また、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＣＲＫ６、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＧＲＫ７は、これらが直接キナーゼの間接的活性化因子である可能性が高いので、抑制の好ましい標的である。ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫはレヴィー小体病における活性化の好ましい候補である。何故なら、これらはアルファ−シヌクレインのリン酸化の負の調節因子であるからである。シンフィリンは抑制の好ましい標的である。何故なら、これは、キナーゼではないが、（通常、ＰＬＫ２などのキナーゼの存在下に）アルファ−シヌクレインのリン酸化の増大に関係しているからである。
【００４１】
亜鉛フィンガー蛋白質は、既知配列のキナーゼ遺伝子内の任意の所望標的部位に結合するように設計もしくは選択することができる。これらの蛋白質の１クラス（Ｃ２Ｈ２クラス）を特徴付ける代表的なモチーフは−Ｃｙｓ−（Ｘ）２−４−Ｃｙｓ−（Ｘ）１２−Ｈｉｓ−（Ｘ）３−５−Ｈｉｓ （ただし、Ｘは任意のアミノ酸である）である。単一フィンガードメインはアミノ酸約３０個の長さであるが、いくつかの構造研究によって、これが亜鉛を介して配位されるベータ・ターン中の２つの不変ヒスチジン残基および２つの不変システイン残基を含有するアルファヘリックスを含むことが明らかとなった。一部の方法では、その標的部位はプロモータまたはエンハンサ内にある。他の方法では、その標的部位は構造遺伝子内にある。一部の方法では、その亜鉛フィンガー蛋白質は、ヒトＫＯＸ−１蛋白質からのＫＲＡＢ抑制ドメイン（Ｔｈｉｅｓｅｎほか、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２： ３６３−３７４ （１９９０年）、Ｍａｒｇｏｌｉｎほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ４５０９−｝５１３ （１９９４年）、Ｐｅｎｇｕｅほか、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ２９０８−２９１４ （１９９４年）、Ｗｉｔｚｇａｌｌほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ４５１４−４５１８ （１９９４年））などの転写レプレッサーに結合する。一部の方法では、この亜鉛フィンガー蛋白質は、ＶＩＰ１６などの転写活性化因子に結合する。亜鉛フィンガー蛋白質により標的にするのに好適な標的部位を選択する方法および選択した標的部位に結合させるように亜鉛フィンガー蛋白質を設計する方法については国際公開公報第ＷＯ００／００３８８号に記載されている。ファージディスプレイを用いて標的に結合する亜鉛フィンガー蛋白質を選択する方法についてはＥＰ．９５９０８６１４．１に記載されている。亜鉛フィンガー蛋白質を設計するのに用いられる標的部位は通常９乃至１９ヌクレオチドのオーダーである。
【００４２】
リボザイムは酵素として働くＲＮＡ分子であり、他のＲＮＡ分子を特異的部位で切断するように設計することができる。リボザイム自体はこの過程で消費されることはなく、触媒的に作用してｍＲＮＡ標的分子の多数のコピーを切断することができる。標的ＲＮＡをトランス切断するリボザイムの設計のための一般則については、Ｈａｓｅｌｏｆｆ、Ｇｅｒｌａｃｈ、（１９８８年） Ｎａｔｕｒｅ ３３４： ５８５−５９１、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｃｋ、（１９８７年） Ｎａｔｕｒｅ ３２８： ５９６−６０３および米国特許第５，４９６，６９８号に記載されている。リボザイムは、通常、本発明のキナーゼをコードしている遺伝子の転写物上の２つの部位（標的亜部位）に対して相補性を示して結合する２つのフランキングセグメントおよびこれらフランキングセグメント間の触媒領域を含む。これらフランキングセグメントの長さは、通常５乃至９ヌクレオチド、最適には６乃至８ヌクレオチドである。このリボザイムの触媒領域の長さは、一般に約２２ヌクレオチドである。上記ｍＲＮＡ標的分子は一般式ＮＵＮ、好ましくはＧＵＣを有する上記標的亜部位間のコンセンサス切断部位を含む。（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ、Ｓｃａｎｌｏｎ、（１９９５年） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２： ２１３−２２３、Ｐｅｒｒｉｍａｎほか、（１９９２年） Ｇｅｎｅ （Ａｍｓｔ．） １１３： １５７−１６３、Ｒｕｆｆｉｅｒほか、（１９９０年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９： １０６９５−１０７０２、Ｂｉｒｉｋｈほか、（１９９７年） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４５： １−１６、Ｐｅｒｒｅａｌｔほか、（１９９１年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０： ４０２０−４０２５）。リボザイムの特異性は、標的亜部位、従って、このような亜部位に相補的であるリボザイムのフランキングセグメントの選択によってコントロールすることができる。リボザイムは、ＲＮＡ分子として、または複製可能なベクターの成分としてリボザイムをコードしているＤＮＡの形で、もしくは下記のような複製可能でない形で送達することができる。
【００４３】
また、標的キナーゼ遺伝子の発現は、この標的遺伝子の調節領域（即ち、標的遺伝子のプロモータおよび／またはエンハンサ）に相補的な配列を有する核酸を送達して三重らせん構造を形成させ、これにより体内の標的細胞内のこの標的遺伝子の転写を阻止することによって、低下させることができる。概して、Ｈｅｌｅｎｅ、（１９９１年）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６（６）： ５６９−５８４、Ｈｅｌｅｎｅほか、（１９９２年）、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６０： ２７−３６およびＭａｈｅｒ、（１９９２年）、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）： ８０７−８１５を参照されたい。
【００４４】
アンチセンス・ポリヌクレオチドは、センスｍＲＮＡに結合してその翻訳を妨げ、転写を妨げ、ＲＮＡ前駆体のプロセッシングもしくは局在化を妨げ、ｍＲＮＡの転写を抑制し、または何らかの他の機構（例えば、Ｓａｌｌｅｎｇｅｒほか、Ｎａｔｕｒｅ ４１８： ２５２ （２００２年）参照）により作用することによって抑制を引き起こすことができる。アンチセンス分子が発現を低下させる特定の機構が重要なのではない。通常、アンチセンス・ポリヌクレオチドは、本発明のキナーゼ遺伝子のｍＲＮＡからの配列に特異的にハイブリダイズする、少なくとも７乃至１０個から典型的には２０個以上のヌクレオチドの一本鎖アンチセンス配列からなる。一部のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、長さが約１０乃至約５０ヌクレオチドまたは約１４乃至約３５ヌクレオチドである。一部のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、約１００ヌクレオチド未満または約２００ヌクレオチド未満のポリヌクレオチドである。一般に、アンチセンス・ポリヌクレオチドは、安定な二本鎖を形成するのに十分長く、送達様式にもよるが、必要に応じてイン・ビボで投与するのに十分短くなければならない。標的配列への特異的なハイブリダイゼーションに必要なポリヌクレオチドの最小の長さは、いくつかの要因、例えば、Ｇ／Ｃ含量、ミスマッチ塩基（あるとすれば、その）の配置、標的ポリヌクレオチドの集団と比較した場合の配列の特異性の程度、ポリヌクレオチドの化学的性質（例えば、メチルホスホネートバックボーン、ペプチド核酸、ホスホロチオエート）などに依存している。
【００４５】
ｓｉＲＮＡは、キナーゼ転写物のような相補性ｍＲＮＡ転写物の発現を阻害する働きをする比較的短く少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡ分子である。本発明の実施ために機構の理解が必要とされるものではないが、ｓｉＲＮＡは相補性ｍＲＮＡ転写物の分解を引き起こすことにより作用すると考えられる。ｓｉＲＮＡの設計および使用の原則については概ね国際公開公報第ＷＯ９９／３２６１９号、Ｅｌｂａｓｈｉｒ、ＥＭＢＯ Ｊ． ２０： ６８７７−６８８８ （２００１年）およびＮｙｋａｎｅｎほか、Ｃｅｌｌ １０７： ３０９−３２１ （２００１年）；国際公開公報第ＷＯ０１／２９０５８号に記載されている。ｓｉＲＮＡは２本の少なくとも部分的に相補性のＲＮＡから形成され、各鎖の好ましい長さは１０乃至３０、１５乃至２５もしくは１７乃至２３もしくは１９乃至２１ヌクレオチドである。これらの鎖はその長さ全体にわたって互いと完全に相補的であってもよいし、あるいは二本鎖分子の一端もしくは両端に一本鎖３’−オーバーハングを有するものであってもよい。一本鎖オーバーハングは、存在する場合には、通常１乃至６塩基、好ましくは１または２塩基である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、本発明の遺伝子からの転写物のセグメントに対して実質的に相補性（例えば、少なくとも８０、９０、９５％、好ましくは１００％相補性）であるものを選択する。どのミスマッチ塩基もｓｉＲＮＡの鎖の末端またはその近傍に生じることが好ましい。末端のミスマッチ塩基はデオキシリボヌクレオチドとすることができる。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、対象遺伝子転写物のセグメントの相補体と類似の関係を示す。各鎖が完全な相補性の１９塩基を有する２本の鎖を有し、センス鎖およびアンチセンスの３’末端にそれぞれ２個および１個のマッチしない塩基を有するｓｉＲＮＡは特に好適である。
【００４６】
ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡをコードしているＤＮＡの形とは異なって、それ自体を投与することになる場合には、ｓｉＲＮＡの鎖には１種以上のヌクレオチド類似体を含ませることができる。このヌクレオチド類似体は、阻害活性が実質的にもたらされない位置、例えば、５’−末端および／または３’−末端の領域、特に、一本鎖オーバーハング領域に配置する。好ましいヌクレオチド類似体は糖もしくはバックボーン修飾リボヌクレオチドである。また、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、即ち、天然型核酸塩基ではなく非天然型核酸塩基、例えば、５位を修飾したウリジンもしくはシチジン（５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジンなど）；８位を修飾したアデノシンおよびグアノシン（８−ブロモグアノシンなど）；デアザヌクレオチド（７−デアザ−アデノシンなど）；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド（Ｎ６−メチルアデノシンなど）を含有するリボヌクレオチドも好適である。好ましい糖修飾リボヌクレオチドにおいては、２’ＯＨ基はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮ（但し、ＲはＣ１乃至Ｃ６アルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩである）から選ばれる基によって置換されている。好ましいバックボーン修飾リボヌクレオチドにおいては、隣接のリボヌクレオチドに接続するリン酸エステル基は、修飾されている基によって置換されており、例えば、ホスホチオエート基である。さらに好ましい修飾は、ｓｉＲＮＡの５’水酸化物残基にリン酸基を導入することである。このような基は、ｓｉＲＮＡをＡＴＰおよびＴ４キナーゼで処理することにより導入することができる。また、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素もしくは硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１種を含むよう修飾することができる。ＲＮＡ構造の修飾は、特異的な遺伝子阻害を可能にすると同時に、ｄｓＲＮＡにより引き起こされる一部の生体における全般的なパニック反応が起こるのを防止するように調製することができる。同様に、塩基はアデノシン・デアミナーゼの活性をブロックするように修飾することができる。
【００４７】
Ｖ．キナーゼの特定
アルファ−シヌクレインのリン酸化またはその産生を直接的もしくは間接的に調節するキナーゼは、実施例で示したように、特定することができる。一般に、潜在的阻害剤のライブラリはキナーゼ遺伝子のコレクションの既知の配列に基づいて設計される。このライブラリを構成する物質は、上述した種類の分子のいずれかとすることができる。次に、このライブラリの構成物質をアルファ−シヌクレイン発現細胞に導入する。この細胞およびアルファ−シヌクレインはいずれもヒトのものであることが好ましい。通常、このような細胞にはヒト・アルファ−シヌクレインをコードしているＤＮＡおよび試験対象のライブラリ構成物質をコードしているＤＮＡの両者がトランスフェクトされる。ライブラリ構成物質は個別に、または、まとめてスクリーニングすることができる。ライブラリ構成物質を導入し、このライブラリ構成物質が発現されてそのキナーゼを抑制するのに十分な期間培養した後、トータル・アルファ−シヌクレインおよびリン酸化アルファ−シヌクレインの濃度を測定し、キナーゼ発現を抑制するライブラリ構成物質を処置しなかったがその他の点では同様な対照細胞における対応する濃度と比較する。測定は、アルファ−シヌクレインのトータル濃度を測定するためのアルファ−シヌクレイン（好ましくは、ヒト・アルファ−シヌクレイン）に特異的な抗体およびリン酸化アルファ−シヌクレインの濃度を測定するためのリン酸化アルファ−シヌクレインに特異的な抗体を用いてイムノアッセイにより行った。代表的な抗体については２００４年１１月８日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７４４４に記載されている（引用により本明細書に組み込まれている）。通常の測定誤差の範囲から外れるという意味で有意である、処置および対照細胞間でのリン酸化アルファ−シヌクレイン濃度の低下は、この細胞に導入した阻害剤がキナーゼを阻害し、これによりアルファ−シヌクレインのリン酸化が直接的または間接的に影響を受けたことを示すものである。このキナーゼの同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、阻害剤を個々にスクリーニングすることにより、あるいは阻害剤をまとめてスクリーニングする場合には阻害剤をコードしている核酸の配列を決定することにより、阻害剤の同一性から決めることができる。同様に、アルファ−シヌクレインのトータル濃度に関して、そのような濃度の測定における通常の測定誤差の範囲を外れる、処置および対照細胞間での低下は、阻害剤がアルファ−シヌクレインの発現レベルに間接的に影響するキナーゼを阻害することを示すものである。
【００４８】
次いで、最初のスクリーニングにより特定されたキナーゼ、特に、セリン・キナーゼであることが知られているキナーゼは、インビトロ、細胞またはトランスジェニック動物モデルにおいてアルファ−シヌクレインをリン酸化するその能力について試験することができる。インビトロ・アッセイは、アルファ−シヌクレインを直接リン酸化するかどうかを示すものであり、従って、アルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができると考えらる、最初のスクリーニングで特定されたキナーゼにのみ有用である。細胞およびトランスジェニック動物によるアッセイは、直接的または間接的にリン酸化に影響を与えるキナーゼをスクリーニングするのに用いることができる。インビトロ・アッセイは、アルファ−シヌクレインを試験対象のキナーゼおよびＡＴＰと適当な緩衝液中で接触させることによって行う。好ましくは、ＡＴＰはγ−３２Ｐ ＡＴＰであり、この場合、リン酸化アルファ−シヌクレインは放射標識され、ゲル上で検出することができる。また、リン酸化については、前述のようなリン酸化アルファ−シヌクレインに特異的な抗体を用いて測定することができる。あるいは、結合アッセイを用いてＡＴＰ消費を測定することにより、間接的にリン酸化を測定することができ、このアッセイでは、Ｎａｔｕｒｅ ７８： ６３２ （１９５６年）、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６： ３１−４０ （１９７０年）に記載されているようにしてＡＤＰを検出する。リン酸化の程度は、キナーゼまたはＡＴＰまたはこれらの両者を除いた対照と比較することができる。リン酸化の増大は、キナーゼがアルファ−シヌクレインを直接リン酸化することを示すものである。細胞によるアッセイは、細胞内にトランスフェクトしたアルファ−シヌクレイン、好ましくはヒト・アルファ−シヌクレインを発現する細胞で行う。キナーゼを発現することができる核酸も細胞内にトランスフェクトする。細胞内のリン酸化アルファ−シヌクレインの濃度は、このトランスフェクトキナーゼを欠く同様な対照細胞内のそれとの比較で測定する。リン酸化の増大は、キナーゼがアルファ−シヌクレインを直接的または間接的にリン酸化することを示すものである。トランスジェニック動物によるアッセイは、レヴィー小体様沈着物を形成する傾向のある、ヒト・アルファ−シヌクレインを発現するトランスジェニック動物と、キナーゼ導入遺伝子をも発現する同様な動物とを比較することによって行うことができる。導入遺伝子としてアルファ−シヌクレインのみを有するトランスジェニック動物に比し、さらにキナーゼ導入遺伝子を有するトランスジェニック動物においてリン酸化アルファ−シヌクレインおよび／またはレヴィー小体様沈着物が減少することは、このキナーゼがアルファ−シヌクレインのリン酸化に直接的または間接的に関与していることを示すものである。
【００４９】
ＶＩ．活性を調節する化合物
種々の化合物について、キナーゼの発現または活性を調節（通常、阻害）する能力をスクリーニングすることができる。ＰＬＫ２またはＧＲＫ６は、アルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができるキナーゼ候補であるため、阻害のための好ましいキナーゼである。ＰＬＫ２は、ＧＲＫ６またはここで試験した他のキナーゼよりもはるかに高レベルでアルファ−シヌクレインをリン酸化することが分かっているので、特に好ましいキナーゼである。ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＧＲＫ７も、この直接キナーゼの間接的な活性化因子である可能性が高いので、阻害のための好ましいキナーゼである。ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫは、アルファ−シヌクレインのリン酸化の負の調節因子であるので、レヴィー小体病における活性化のための好ましいキナーゼである。あるいは、こうしたキナーゼ自体または同様な活性を有するその断片もしくは模倣剤はアルファ−シヌクレインのリン酸化の阻害剤としてそのまま用いることができる。シヌクレインは、アルファ−シヌクレインのリン酸化の阻害のための治療上の代替的な標的として用いることができる。例えば、アルファ−シヌクレインおよびＰＬＫ２発現を有するアッセイにシンフィリンを加えて、シンフィリンの阻害剤を特定することができる。
【００５０】
キナーゼの発現または活性の調節能力についてスクリーニング対象となる化合物としてはセクションＩＶに記載した発現の調節物質が挙げられる。また、これらの化合物としては多くの既知のキナーゼ阻害剤の例が挙げられ、その一部については既に治療的使用が承認され、または通常癌の治療のための臨床試験が行われている。先導（ｌｅａｄ）構造としてはキナゾリン類、ピリド［ｄ］−およびピリミドール［ｄ］ピリミジン類、ピラゾロ［ｄ］−ピリミジン類、ピロロ［ｄ］ピリミジン類、フェイルアミノ−ピリミジン類、１−オキソ−３−アリール−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸誘導体類、置換インドリン−２−オン類ならびにスタウロスポリンなどの天然物類が挙げられる（Ｔｒａｘｌｅｒほか、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２１： ４９９−５１２ （２００１年）参照）。そのような化合物の一部はカルビオケム−ノバビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｃｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）（ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州）から市販されており、例えば、Ｈ８９、Ｙ２７６３２、ＡＴ８７７ （塩酸ファスジル）、ロットレリン、ＫＮ６２、Ｕ０１２３、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ワートマニン、Ｌｉ＋、Ｒｏ３１８２２０、ケレリスレイン（ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｅｉｎ）および１０−［３−（１−ピペリジニル）プロピル］−２−トリフルオロメチル−フェノチアジンが挙げられる（Ｄａｖｉｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３５１： ９５−１０５ （２０００年）参照）。現在臨床試験中の他の化合物としては、ＳＴ１５７１（ギルベックＴＭ （ＧｌｉｖｅｃＴＭ）、フェニルアミノ−ピリミジン誘導体）（ノバルティス社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、ＺＤ１８３９（イレッサ）（アストラゼネカ社（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））、ＯＳＩ−７７４（ロシュ／ＯＳＩ社）、ＰＫＩ１６６（ノバルティス社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、ＣＩ１０３３（ファイザー／ワーナー−ランバート社（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｗａｍｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ））、ＥＫＢ−５６９（ワイス−エルスト社）、ＳＵ５４１６（ＳＵＧＥＮ社）、アニリン−フタラジン誘導体ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２４５８４（ノバルティス／シェリングＡＧ社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ））、ＳＵ６６６８（ＳＵＧＥＮ社）、ＺＤ６４７４（アストラゼネカ社（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））およびＣＥＰ２５８３（セファロン社（Ｃｅｐｈａｌｏｎ））が挙げられる。カベオリン−１はＧＲＫキナーゼの活性を調節することが知られている化合物の１例である。ＰＬＫ２／ＳＮＫキナーゼの活性を調節することが知られている化合物の例としては、ｈＶＰＳ１８（液胞蛋白輸送関連蛋白１８）のＲＩＮＧ−Ｈ２ドメインならびにカルシウム−およびインテグリン−結合蛋白ＣＩＢが挙げられる。他の化合物は、例えば、海洋微生物、藻類、植物、真菌類などの自然源から得ることができる。試験することができる他の化合物としては、シンフィリンなどのアルファ−シヌクレインと相互作用することが知られている化合物が挙げられる。あるいは、ペプチドもしくは低分子化合物を含む因子のコンビナトリアルライブラリから、または産業において、例えば、化学、医薬品、環境、農、海洋、薬用化粧、製薬およびバイオテクノロジー産業によって合成された化学物質の既存の在庫から化合物を得ることができる。化合物としては、例えば、因子、治療剤、環境、農業もしくは工業用薬剤、汚染物質、薬用化粧品、医薬物質、有機化合物、脂質、糖質コルチコイド、抗生物質、ペプチド、蛋白質、糖、炭水化物およびキメラ分子を挙げることができる。
【００５１】
コンビナトリアル・ライブラリは、段階的な方法で合成することができる多くの種類の化合物について作製することができる。このような化合物としては、ポリペプチド、蛋白質、核酸、β−ターン模倣物質、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン、およびオリゴカルバメートが挙げられる。これらの化合物の大きなコンビナトリアル・ライブラリは、アフィマックス社（Ａｆｆｙｍａｘ）の国際公開第９５／１２６０８号、アフィマックス社（Ａｆｆｙｍａｘ）の国際公開第９３／０６１２１号、コロンビア大学（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の国際公開第９４／０８０５１号、ファーマコペア社（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）の国際公開第９５／３５５０３号およびスクリップス社（Ｓｃｒｉｐｐｓ）の国際公開第９５／３０６４２号（これらはいずれも、あらゆる目的で引用により本明細書に組み込まれている）に記載されているコード化合成ライブラリ（ＥＳＬ）法によって構築することができる。また、ペプチド・ライブラリは、ファージ・ディスプレイ法によって作製することもできる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎの国際公開第９１／１８９８０号を参照されたい。また、スクリーニング対象の化合物は、例えば、国立がんセンター研究所（ＮＣＩ）天然物リポジトリ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、ベセズダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、メリーランド州、ＮＣＩ公開合成化合物コレクション（Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ベセズダ、メリーランド州、ＮＣＩ治療開発プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）などの政府系または私的供給源から入手することもできる。
【００５２】
上記化合物としては、本発明のキナーゼに特異的に結合する完全な状態の抗体およびＦａｂ、Ｆｖなどのその結合断片が挙げられる。通常、この抗体はモノクロナール抗体であるが、ポリクロナール抗体も組換え技術によって発現させることはできる（例えば、米国特許第６，５５５，３１０号参照）。発現させることができる抗体の例としては、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、合体（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体およびヒト抗体が挙げられる。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖の遺伝子が、異なる種に由来する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、通常遺伝子操作によって構築された抗体である（例えば、Ｂｏｙｃｅほか、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４： ５２０−５３５ （２００３年）参照）。例えば、マウス・モノクロナール抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントをヒト定常（Ｃ）セグメントに結合させることができる。従って、代表的なキメラ抗体は、マウス抗体のＶ、即ち抗原結合ドメインと、ヒト抗体のＣ、即ちエフェクタ・ドメインとから成るハイブリッド抗体である。ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）からの可変領域フレームワーク残基、および実質的にマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと呼ばれる）からの相補性決定領域を有する。Ｑｕｅｅｎほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： １００２９−１００３３ （１９８９年）ならびに国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。また、定常領域は、もし存在させる場合、実質的または完全にヒト免疫グロブリンからのものとする。抗体は、とりわけ、従来のハイブリドーマ法、ファージ・ディスプレー法（例えば、Ｄｏｗｅｒほか、国際公開第ＷＯ ９１／１７２７１号およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙほか、国際公開第ＷＯ ９２／０１０４７号参照）、ならびにヒト免疫系を有する遺伝子導入マウスの使用（Ｌｏｎｂｅｒｇほか、国際公開第Ｗ０９３／１２２２７号 （１９９３年））によって得ることができる。免疫グロブリン鎖をコードしている核酸は、ハイブリドーマもしくは抗体産生細胞株から、または公表文献中の免疫グロブリンの核酸もしくはアミノ酸配列に基づいて得ることができる。
【００５３】
ＶＩＩ． レヴィー小体病のトランスジェニック動物モデル
トランスジェニック動物モデルは、上記のようにアルファ−シヌクレインをリン酸化し、レヴィー様小体を形成するキナーゼの能力を試験するのに有用である。また、トランスジェニック動物は、アルファ−シヌクレインのリン酸化または産生を調節する際の活性について因子をスクリーニングするのにも有用である。特に好ましい因子は、ＰＬＫ２およびＧＲＫ６、またはＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＧＲＫ７を含むキナーゼを阻害するか阻害すると考えられる因子である。また、キナーゼＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫを活性化するか活性化すると考えられる因子も好ましい。さらに、ノックアウト動物（即ち、ｓｉＲＮＡ、亜鉛フィンガー蛋白質などによる挿入不活化またはトランス抑制によって内因性キナーゼが不活化されている動物）は動物に対するキナーゼ活性除去の効果を確認するのに有用である。例えば、ＰＬＫ２−ノックアウトマウスを分析することによって、ＰＬＫ２阻害剤が何らかの副作用を示すかどうかが分かる。類似のノックアウトマウスによれば、他のキナーゼについての同様の情報が明らかとなる。
【００５４】
一般に、遺伝子導入モデルは、アルファ−シヌクレイン導入遺伝子をその発現を確実にするための１種以上の調節配列と動作可能に連鎖する形で含むゲノムを有する。この導入遺伝子が発現されると、アルファ−シヌクレインのレヴィー様沈着物がこの動物の脳内に形成されることになる。数種のこのようなトランスジェニック動物が科学および特許文献に記載されている（Ｍａｓｌｉａｈほか、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． （１９９６年） １４８： ２０１−１０６およびＦｅａｎｙほか、Ｎａｔｕｒｅ （２０００年） ４０４： ３９４−８））、（突然変異型ＡＰＰを有するトランスジェニック動物に関する）米国特許第５，８１１，６３３号参照）。一部のトランスジェニック動物は、アルファ−シヌクレインの家族性突然変異体Ａ３０Ｐ、Ａ５３ＴおよびＥ４６Ｋなどのアルファ−シヌクレイン変異体または突然変異体を発現する。一部のトランスジェニック動物は、上述のようなキナーゼをコードしている導入遺伝子などの更なる導入遺伝子を有する。また、アルファ−シヌクレイン蛋白質を発現する導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、アルツハイマー病のモデルなどの神経原性疾患の他の遺伝子導入モデルと交配させることもできる。例えば、切断型アルファ−シヌクレイン蛋白質を発現する導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、例えば、Ｇａｍｅｓほか、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：５２３（１９９５年）： ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅほか、米国特許第５，６１２，４８６号； Ｈｓｉａｏほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９（１９９６年）； Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９４：１３２８７−１３２９２（１９９７年）； Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１３２８７−１３２９２（１９９７年）； Ｂｏｒｃｈｅｌｔほか、Ｎａｔｕｒｅ １９：９３９−９４５（１９９７年）に記載されている、導入遺伝子により発現されるＦＡＤ突然変異を含むＡＰＰを有するトランスジェニック動物と交配させることができる。このような交配を実施する方法については、例えば、Ｍａｓｌｉａｈほか、ＰＮＡＳ ＵＳＡ９８：１２２４５−１２２５０（２００１年）に記載されており、これには完全長のアルファ−シヌクレインを発現する遺伝子導入マウスとＧａｍｅｓ他により記載されているようなＰＤＡＰＰマウスとの交配が報告されている。本発明のトランスジェニック動物は、好ましくは、マウス、ラットなどの齧歯動物、もしくはショウジョウバエなどの昆虫である。トランスジェニック動物は生殖細胞段階で導入遺伝子を導入することによって作製することができ、この場合、このトランスジェニック動物の細胞の全てもしくは（体細胞突然変異によるまれな損失を除き）実質的に全てがゲノムに組み込まれた導入遺伝子を含む。導入遺伝子は微量注入、核移植またはウイルス感染によって細胞または動物内に導入することができる。レンチウイルスは後者において特に好適である。あるいは、導入遺伝子は、ウイルス感染によって動物の脳内に導入することができる。このような導入遺伝子はレシピエント動物の生殖細胞の一部ではなく、病気に関与する脳の領域（例えば、黒質）を標的にすることができる。このような動物モデルはアルファ−シヌクレインを脳細胞のゲノムに組み入れており、ＬＤＢ病の少なくとも１つの特徴を生じる傾向がある。レンチウイルスは脳内にアルファ−シヌクレイン導入遺伝子をそのように導入するための好適な伝達体となる（Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３： ３６４−３７２ （２００３年）； Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２６， ３８６−９２ （２００３年）； Ｌｏｔｈａｒｉｕｓほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７： ３８８８４−９４ （２００２年）； Ｚｈｏｕほか、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８６６： ３３−４３ （２０００年）参照）。また、トランスジェニック動物には、アルファ−シヌクレインを発現する導入遺伝子の代わりに、またはこれと共に、本発明のキナーゼのうちの１種を発現することができる導入遺伝子（例えば、このキナーゼを、動物の脳内でのその発現を確実にするための調節エレメントと動作可能に連鎖する形でコードしている核酸）を組み込むこともできる。必要に応じて、シンフィリンを発現する導入遺伝子を組み込むこともできる。
【００５５】
また、レヴィー小体病の細胞モデルも本発明のスクリーニング方法に用いることができる。アルファ−シヌクレインをトランスフェクトした細胞は凝集アルファ−シヌクレインを含む封入体を形成する。この形質転換細胞はＧＴ１−７神経細胞（Ｈｓｕｅほか、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５７： ４０１−４１０ （２０００年））、ＰＣ１２細胞またはＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞などの神経細胞であることが好ましい。ＰＥＡＫおよび／またはＨＣＣ細胞を用いることもできる（実施例１１参照）。細胞はヒト細胞であることが好ましい。アルファ−シヌクレインを、その発現の発現を確実にする１種以上の調節配列に動作可能なように連結した形をコードしているセグメントを含むベクターを細胞中にトランスフェクトする。また、細胞には、上記のような本発明のキナーゼをコードしている核酸をトランスフェクトすることもできる。トランスフェクト細胞は、アルファ−シヌクレイン封入体の除去における活性について因子をスクリーニングするのに用いることができる。代表的な細胞モデルを実施例１１で確認するが、この実施例では、ＬＢ形成に対応するシヌクレインの凝集およびリン酸化が起こるようにＨＣＣ神経細胞にシヌクレインおよびＰＬＫ２をトランスフェクトする。キナーゼの阻害剤を特定するために、阻害剤をシヌクレインおよびＰＬＫ２と共に発現させ、リン酸化および／または凝集の量の減少を確認する。
【００５６】
ＶＩＩＩ．調節因子の特定
アルファ−シヌクレインを直接的または間接的にリン酸化するキナーゼの発現または活性を調節する因子は種々のアッセイによって特定することができる。特に好ましい因子は、キナーゼＰＬＫ２もしくはＧＲＫ６、またはＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩおよびＧＲＫ７を阻害する因子、あるいはＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫを活性化させる因子である。発現を調節する因子は細胞を利用したアッセイで特定することができるが、このアッセイでは、アルファ−シヌクレイン、およびアルファ−シヌクレインを直接または間接的にリン酸化するかトータル・アルファ−シヌクレインの濃度を調節するキナーゼを発現する細胞中に試験対象の因子を導入する。必要に応じて、特にＰＬＫ２の場合、さらにシンフィリンを発現させることによりこのキナーゼの活性を増強することができる。この因子は、直接、またはこの因子をコードし発現することができる核酸の形で導入することができる。細胞は自然界でアルファ−シヌクレインおよびキナーゼを発現することができ、あるいはこれらの片方または両方を適当な核酸のトランスフェクトによって細胞内に導入することができる。この因子のキナーゼ発現に対する効果は、このキナーゼもしくはそのｍＲＮＡの濃度から直接的に、あるいは前述のように、リン酸化アルファ−シヌクレインまたはトータル・アルファ−シヌクレインの濃度を測定することにより間接的に測定することができる。キナーゼｍＲＮＡの濃度はハイブリダイゼーション型アッセイによって分析することができる。キナーゼの濃度はイムノアッセイによって分析することができる。必要に応じて、キナーゼは、検出を容易にするためにフラッグ（Ｆｌａｇ）（商標）などのペプチド標識で標識する（Ｈｏｐｐほか、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０ （１９８８年））。キナーゼの濃度を低下させ、アルファ−シヌクレインのリン酸化のレベルを減少させ、および／または因子を処置されていない同様な対照細胞との比較でトータル・アルファ−シヌクレインの濃度を低下させる因子は、レヴィー小体病の治療に有用な可能性のある薬理活性を有する。
【００５７】
また、アルファ−シヌクレインをリン酸化し、またはアルファ−シヌクレインのトータル濃度を増加させると考えられるキナーゼの活性を調節する活性について因子をスクリーニングする。最初のスクリーニングは、キナーゼに特異的に結合することができる因子のサブセットを選択するために行う。このようなアッセイは、単離キナーゼまたはキナーゼ活性を有するその断片を用いてインビトロで行うことができる。
【００５８】
次に、このようなスクリーニングにより特定した因子については機能的なアッセイを行うことができる。また、因子は、上記結合アッセイを行わずに、機能的アッセイに直接かけることもできる。アルファ−シヌクレインを直接リン酸化するキナーゼの場合、調節剤は、このキナーゼ、アルファ−シヌクレイン、ＡＴＰおよび調節剤を併用するインビトロアッセイによって、この調節剤を除外した対照との比較でスクリーニングすることができる。必要に応じて、特にキナーゼがＰＬＫ２である場合には、リン酸化を増大させるためにシンフィリンを含めることもできる。調節剤は、対照との比較で通常の実験誤差の範囲を超えてリン酸化のレベルを低下させる場合には、有用な可能性のある薬理活性を有する。
【００５９】
また、因子は、アルファ−シヌクレイン、試験対象のキナーゼ、および、必要に応じて、特にキナーゼがＰＬＫ２である場合、シンフィリンを発現する細胞でスクリーニングすることもできる。このようなスクリーニングは、キナーゼが直接的または間接的にアルファ−シヌクレインをリン酸化するか、そうではなくアルファ−シヌクレインの濃度に影響するかにかかわらず、効果的である。細胞を因子と接触させ、トータル・アルファ−シヌクレインおよびリン酸化アルファ−シヌクレインの濃度を、この因子を処置しなかった対照細胞との比較で上述のようにして測定する。リン酸化アルファ−シヌクレインまたはトータル・アルファ−シヌクレインの濃度が通常の実験誤差の範囲を超えて、上記因子を処置しなかった対照細胞の対応する濃度と比較して低下することは、この化合物がレヴィー小体病の治療に有用な可能性のある薬理活性を有することを示すものである。
【００６０】
また、因子は、レヴィー小体病のトランスジェニック動物モデル単独または上述の他のアッセイとの組合せでスクリーニングすることもできる。アルファ−シヌクレイン、リン酸化アルファ−シヌクレインあるいはレヴィー様小体またはレヴィー小体病変もしくは症状の他のインディカのトータル濃度を、試験対象因子を処置したトランスジェニック動物において、この因子を処置しなかった同様な対照動物における対応する濃度との比較で測定する。これらの濃度のうちの１つ以上が低下することは、この因子がレヴィー小体病の治療に有用な可能性のある薬理活性を有することを示すものである。
【００６１】
上記アッセイならびに細胞および遺伝子導入モデルに用いるキナーゼは、本願に示した参考文献またはアセッション番号のうちの１つに配列が記載されているヒト・キナーゼであることが好ましい。しかしながら、このようなキナーゼの対立遺伝子変異体（種内の変異体）および種変異体（種間の変異体）も、変異体がそのようなキナーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し得るので、用いることができる。その後の臨床使用においては、このようなアッセイによって特定された因子は天然のキナーゼ、好ましくはヒトに存在する型のキナーゼの活性または発現を調節することができる。
【００６２】
ＩＸ．レヴィー小体病
レヴィー小体病（ＬＢＤ）の特徴は、ドーパミン作動系の変性、運動性変調、認知障害、およびレヴィー小体（ＬＢ）の形成である。（ＭｃＫｅｉｔｈほか、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ （ＤＬＢ）： Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＬＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （１９９６年） ４７：１１１３−２４）。レヴィー小体は神経細胞に見出される球状の蛋白質沈着物である。これが脳内に存在すると、アセチルコリン、ドーパミンなどの化学的メッセンジャーの作用が遮断されて脳の正常な機能が妨げられる。レヴィー小体病としては、（特発性パーキンソン病（ＰＤ）を含む）パーキンソン病、レヴィー小体を有する痴呆（ＤＬＢ）としても知られるびまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病とパーキンソン病との併発、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）が挙げられる。ＤＬＢＤは、アルツハイマーおよびパーキンソン病の症状を共有する。ＤＬＢＤは、主にレヴィー小体の存在部位がパーキンソン病と異なる。ＤＬＢＤではレヴィー小体は主として皮質に形成される。パーキンソン病ではこれは主として黒質に形成される。他のレヴィー小体病としては、自律神経失調症、レヴィー小体性燕下困難（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｙｓｐｈａｇｉａ）、偶発性ＬＤＢ、遺伝性ＬＤＢ（例えば、アルファ−シヌクレイン遺伝子の突然変異体ＰＡＲＫ３およびＰＡＲＫ４）ならびに多系統萎縮症（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群）が挙げられる。
【００６３】
Ｘ．治療方法
本発明は、レヴィー小体病に罹患しているか、罹患するリスクを有する患者においてこの疾患を予防もしくは治療するいくつかの方法を提供する。治療剤としては、アルファ−シヌクレインのリン酸化を阻害し、および／またはアルファ−シヌクレインのトータル濃度を低下させる上記因子の全てが挙げられる。
【００６４】
治療の対象となる患者としては、現在ＬＢＤの症状を示している患者ばかりでなく、ＬＢＤに罹患するリスクを有するが、症状は出ていない者も含まれる。従って、本方法は、ＬＢＤの遺伝的リスクを有することが分かっている個体に予防的に施行することができる。このような個体としては、本疾患に罹患したことのある血縁者を有する個体、および遺伝子もしくは生化学的マーカーの解析によってリスクが明らかにされている個体が挙げられる。ＰＤに対するリスクの遺伝子マーカーとしては、アルファ−シヌクレインもしくはパーキン（Ｐａｒｋｉｎ）、ＵＣＨＬＩ、ＬＲＲＫ２およびＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の突然変異；特に、アルファ−シヌクレイン遺伝子の３０および５３番目の位置の突然変異が挙げられる。ＰＤに対するリスクの別の遺伝子マーカーにはそのレベルまたはＳＮＣＡ量もしくは転写の測定がある。現在パーキンソン病に罹患している個体は、静止振戦、筋固縮、運動緩徐および姿勢の不安定を含む臨床症状によって見分けることができる。
【００６５】
一部の方法では、上記患者は、レヴィー小体を特徴とする疾患以外のどんなアミロイド生成性疾患の臨床症状もしくはリスク要因も有さない者である。一部の方法では、上記患者は、細胞外アミロイド沈着を特徴とするどんな疾患の臨床症状もしくはリスク要因も有さない者である。
【００６６】
一般的には、治療は、ある期間にわたって多回投与することを必要とする。治療は、治療すべき疾患の徴候や症状を治療開始前のベースライン測定値との比較で測定することによってチェックすることができる。一部の方法では、因子の投与により細胞内の凝集アルファ−シヌクレインのレベルが低下する。一部の方法では、因子の投与によりリン酸化のレベルが低下する。一部の方法では、因子の投与により、パーキンソン病の場合の運動もしくは認識機能のようなＬＢＤの臨床症状が改善する。
【００６７】
予防的な適用では、医薬用組成物もしくは因子を、ＬＢＤに罹りやすいか、それとも罹るリスクのある患者に対して、そのリスクを除去もしくは低下させ、その重症度を軽減し、あるいはこの疾患の生理学的、生化学的、組織学的および／または行動上の症状、その合併症ならびにこの疾患の進行中に発現する中間的な病理学的表現型を含むこの疾患の発現を遅らせるのに十分な投与量および投与頻度のこの組成物もしくは因子を含む治療法において投与する。治療的な適用では、組成物もしくは因子を、そのような疾患が疑われるか、すでに罹患している患者に対して、その合併症およびこの疾患の進行中に発現する中間的な病理学的表現型を含むこの疾患の（生理学的、生化学的、組織学的および／または行動上の）症状を治すか、少なくとも部分的に抑えるのに十分な投与量および投与頻度のこの組成物を含む治療法において投与する。治療的もしくは予防的処置を遂行するのに適切な量は、治療的もしくは予防的有効用量と定義される。治療的もしくは予防的処置を遂行するのに適切な量および投与頻度の組み合わせは、治療的もしくは予防的有効療法と定義される。
【００６８】
上述の症状の処置のための本発明の組成物の有効用量は、多くの種々の要因、例えば、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトか動物か、他の投与因子、および処置が予防的なものか治療的なものかによって異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。処置用量は、安全性および有効性を最適化するために漸増する必要がある。
【００６９】
投与量および投与頻度は、処置が予防的なものか治療的なものかによっても異なることがある。指針は、キナーゼ阻害剤の投与スケジュールから、または他の適応についての臨床試験において得ることができる。０．１乃至１０００ｍｇ、好ましくは１０乃至５００ｍｇの範囲の投与量。投与頻度（例えば、日、週または月当たり）は薬物の半減期によって変わる。予防的適用では、比較的低用量を長期間比較的低頻度の間隔で投与する。一部の患者では、その後の生涯にわたって処置が継続される。治療的適用では、疾患の進行が低減するか停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量を投与することが必要な場合がある。その後は、この患者に予防療法を施行することができる。
【００７０】
治療剤は、予防的および／または治療的処置において、非経口的、局所的、経静脈的、経口的、経皮下的、経動脈的、経頭蓋内的、経髄腔内的、経腹腔内的、経鼻腔内的もしくは経筋肉内的手段によって投与することができる。一部の方法では、因子を、沈着物が蓄積している特定の組織に直接注射（例えば、頭蓋内注射）する。一部の方法では、因子を、徐放組成物もしくはデバイス、例えば、メディパッド（Ｍｅｄｉｐａｄ）（商標）デバイスとして投与する。血液脳関門を十分に通過する小分子は、通常経口的に投与されるが、静脈内投与することもできる。
【００７１】
必要に応じて、本発明の因子は、ＬＢＤの処置に少なくとも部分的に有効である他の因子との併用で投与することができる。また、本発明の因子は、脳血液関門に対する本発明の因子の通過を促進する他の因子と併用して投与することもできる。
【００７２】
多くの場合、本発明の因子は、有効な治療剤および各種の他の医薬用として許容可能な成分を含む医薬用組成物として投与する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８０年）を参照されたい。好ましい形態は、所望の投与様式および治療用途によって決まる。また、この組成物には、所望の製剤に応じて、動物もしくはヒトへの投与用の医薬用組成物を処方するために一般的に用いられる賦形剤と定義される、医薬用として許容可能で毒性のない担体もしくは希釈剤を含めることができる。この希釈剤は、その組み合わせの生物活性に影響を与えないように選択する。このような希釈剤の例としては、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、およびハンクス液がある。さらに、この医薬用組成物もしくは製剤は、他の担体、アジュバント、もしくは毒性がなく治療用ではない非免疫原性の安定化剤なども含むことができる。
【００７３】
また、医薬用組成物には、蛋白質、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および（ラテックス官能化セファロース（ｌａｔｅｘ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）、アガロース、セルロースなどの）コポリマー、アミノ酸重合体、アミノ酸共重合体、ならびに（油滴、リポソームなどの）脂質凝集物などの大きくてゆっくりと代謝される高分子を含めることもできる。
【００７４】
非経口投与の場合、本発明の因子は、水、油、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの滅菌液とすることができる医薬用担体を含む生理的に許容可能な希釈剤を用いたこの物質の溶液もしくは懸濁液として、注射可能な用量を投与することができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤などの補助剤を組成物に加えることができる。医薬用組成物の他の成分としては、石油、動物、植物もしくは合成由来の成分、例えば、ピーナッツ油、大豆油および鉱油がある。一般に、プロピレングリコール、ポリエチレン・グリコールなどのグリコール類が、特に注射用溶液には好ましい液体担体である。抗体は、有効成分の持続放出を可能にするように処方することができるデポー注射剤もしくは植込み製剤の形で投与することができる。例示的な組成物は、５０ｍＭのＬ−ヒスチジンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌからなり、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整した水性緩衝液に配合したモノクロナール抗体を５ｍｇ／ｍＬ含む。通常、非経口投与用の組成物は、実質的に無菌で、実質的に等張であり、ＦＤＡもしくは同様な機関のＧＭＰ条件下に製造される。
【００７５】
通常、組成物は溶液もしくは懸濁液の形の注射剤として調製するが、注射に先立って液体溶媒に溶解もしくは懸濁するのに適した固形物として調製することもできる。また、この製剤は、上述のアジュバント効果を増強するために、リポソームもしくはポリラクチド、ポリグリコリド、コポリマーなどの微粒子を用いて乳化もしくは封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７（１９９０年）およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７−１１９（１９９７年）参照）。本発明の因子は、有効成分の持続もしくはパルス放出を可能にするように処方することができるデポー注射剤もしくは植込み製剤の形で投与することができる。
【００７６】
他の投与様式に適した別の製剤としては、経口用、鼻腔内用および呼吸器用（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）製剤、坐剤ならびに経皮投与剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。坐剤の場合、結合剤および担体としては、例えば、ポリアルキレン・グリコールもしくはトリグリセリドが挙げられ、このような坐剤は、本有効成分を０．５％乃至１０％、好ましくは１％乃至２％含む混合物から作製することができる。経口用製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含む。この組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤もしくは散剤の形をとり、有効成分を１０％乃至９５％、好ましくは２５％乃至７０％含む。
【００７７】
局所に適用すると、経皮的に、もしくは皮内から送達させることができる。本剤をコレラトキシンまたはその無毒化誘導体もしくはサブユニットあるいは他の同様な細菌毒素と同時投与することにより局所投与を容易にすることができる（Ｇｌｅｎｎほか、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８５１（１９９８年））。同時投与は、これらの成分を混合物として、または化学的架橋結合もしくは融合蛋白質としての発現により得られる結合分子として用いることにより達成することができる。あるいは、スキン・パス（ｓｋｉｎ ｐａｔｈ）もしくはトランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）を用いて経皮的送達を達成することができる（Ｐａｕｌほか、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２５：３５２１−２４（１９９５年）； Ｃｅｖｃほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３６８：２０１−１５（１９９８年））。
【００７８】
以下の実施例では、細胞に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクトおよび特異的キナーゼ標的のノックダウンを行ってアルファ−シヌクレインのリン酸化を直接的または間接的に調節するキナーゼを特定した。その後のインビトロおよび組織培養の実験ではこれらのキナーゼのうちの２種、ＰＬＫ２およびＧＲＫ６が直接的かつ特異的にアルファ−シヌクレインのセリン１２９をリン酸化することが分かった。さらに行った実験から、ＰＬＫ２によるアルファ−シヌクレインのセリン１２９のリン酸化の程度はＧＲＫ６や本明細書に記載した他のキナーゼのそれをはるかに超えるものであった。従って、ＰＬＫ２はシヌクレインキナーゼである可能性が非常に高い。
【実施例】
【００７９】
（実施例）
実施例１：アルファ−シヌクレインのリン酸化を調節するキナーゼのスクリーニング
α−シヌクレインをセリン１２９においてリン酸化するキナーゼもしくはキナーゼ類を特定するために、定量化可能な量のリン酸化α−シヌクレインを含む細胞を用いてｓｉＲＮＡキナーゼ・ライブラリ（アンビオン社）をスクリーニングした。ＣＭＶプロモータの制御下にあるヒトの野生型α−シヌクレインを安定的にトランスフェクトしたヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３細胞（ＰＥＡＫ細胞）（ＰＥＡＫ−Ｓｙｎ細胞）に対して、５９７種のヒト・キナーゼを標的とするｓｉＲＮＡを１００ｎＭトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定してトータルおよびリン酸化シヌクレイン濃度を定量した。リン酸化アルファ−シヌクレインの割合を変えるｓｉＲＮＡに対して９５種のキナーゼが特定された（表１乃至３参照）。このうち２８種はセリン残基をリン酸化するキナーゼのクラスに属し、従って、α−シヌクレインをセリン１２９において直接リン酸化することができた。その他はチロシンキナーゼであった。チロシンキナーゼはα−シヌクレインをｓｅｒ−１２９において直接リン酸化しないが、アルファ−シヌクレインキナーゼの上流調節剤として作用することができる。これらのｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼのうちの２種、カゼインキナーゼ２およびカルシウム／カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼＩＩはα−シヌクレインをインビトロでリン酸化することが報告されており（Ｐｒｏｎｉｎほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ２６５１５−２６５２２ （２０００年）； Ｏｋｏｃｈｏａほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ３９０−３９７ （２０００年）； Ｎａｋａｊｏほか、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１７： １０５７−１０６３ （１９９３年））、カゼインキナーゼ２阻害剤は細胞内のリン酸化シヌクレイン濃度を増加させることが報告されている（Ｏｋｏｃｈｏａほか、２０００年）。ＧＲＫファミリーの構成キナーゼのうちの数種は（ＧＲＫではないが）アルファ−シヌクレインをインビトロでリン酸化することが報告されている（Ｐｒｏｎｉｎほか、２０００年）。ハエにおけるＧＲＫ２の発現はリン酸化シヌクレイン濃度を増加させることが報告されている（Ｃｈｅｎ、Ｆｅａｎｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８： ６５７−６６３ （２００５年））。
【００８０】
リン酸化シヌクレイン濃度を低下させるキナーゼの他に、そのｓｉＲＮＡがＰＥＡＫ−Ｓｙｎ細胞内のトータルα−シヌクレイン濃度を変化させる９９種のキナーゼが特定され（表２）、このようなものとしてはフコキナーゼ（ＦＵＫ）、ジェンバンク番号ＮＭ＿１４５０５９；プロテインキナーゼＮ１（ＰＲＫＣＬ１、ＰＫＮ１）、ジェンバンク番号ＮＭ＿００２７４１；ダブルコルチンおよびＣａＭキナーゼ様−１（ＤＣＡＭＫＬ１）ＮＭ＿００４７３４；分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＫ）、ＮＭ＿００５８８１；オーロラキナーゼＣ（ＡＵＲＫＣ、ＳＴＫ１３）、ＮＭ＿００３１６０；ｒａｓ２のキナーゼサプレッサー（ＦＬＪ２５９６５）、ＮＭ＿１７３５９８；ＦＬＪ３２７０４；ＭＡＰ２Ｋ６；ならびにタウズルド（Ｔｏｕｓｌｅｄ）様キナーゼ２（ＴＬＫ２）、ＮＭ＿００６８４２が挙げられた。作用メカニズムは、アルファ−シヌクレインの代謝回転または合成を調節するものであると考えられる（表３参照）。
【００８１】
表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃには、キナーゼであって、その阻害によりｓｅｒ−１２９の位置のリン酸化が調節されるキナーゼを示した。各表の上部の正常型は、キナーゼの発現が阻害されるとリン酸化が低下するようなキナーゼを示し、各表の下部の陰影型のものは、キナーゼが阻害されるとリン酸化が増大するようなキナーゼを示した。表１Ａ、ＢおよびＣはキナーゼの種類が異なる。表１Ａにはセリン残基および、多くの場合、チロシンおよび／またはスレオニンをもリン酸化することができるキナーゼを示した。表１Ｂにはセリン残基を（知られている限り）修飾することができないチロシンキナーゼを示した。表１Ｃにはキナーゼ活性を有しないことが知られている蛋白質を示した。表１Ａの上部のキナーゼはアルファ−シヌクレインのｓｅｒ−１２９を直接リン酸化する候補である。また、表１Ｂの上部のキナーゼは、アルファ−シヌクレインを間接的にリン酸化する役割を介する有用な治療上の標的である。表１Ｃの上部の蛋白質も同じ理由で有用な治療上の標的である。各表の第１、２および３欄には、遺伝子名、キナーゼ名およびキナーゼのジェンバンク・アセッション番号を示した。その次の欄にはそのキナーゼの阻害がリン酸化を低下させる（「下降（ｄｏｗｎ）」）のか増大させる（「上昇（ｕｐ）」）のかを示した。その次の３欄にはリン酸化の測定レベルが３回の独立した実験の平均値から外れる標準偏差の数を示した。最後の２欄にはキナーゼファミリー（即ち、アミノ酸特異性）および群を示した。
【００８２】
表２および３には、キナーゼであって、これを阻害することによってリン酸化の割合を変えないでヒト・アルファ−シヌクレインの全体的濃度が調節されるキナーゼを示した。表２にはヒト・アルファ−シヌクレインの濃度の低下が最も強いキナーゼの全てを示した。表の欄には表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃと同様に名称をつけた。
【００８３】
表１Ａ−Ｃ：リン酸化を低下させるキナーゼ候補の完全リスト
表１Ａ：セリン／スレオニンキナーゼ
【００８４】
【表１−１】
【００８５】
【表１−２】
【００８６】
【表１−３】
表１Ｂ：チロシンキナーゼ
【００８７】
【表１−４】
表１Ｃ：蛋白質リン酸化活性なし
【００８８】
【表１−５】
【００８９】
【表１−６】
表２：阻害することによりシヌクレイン濃度が調節されるキナーゼ
【００９０】
【表２−１】
【００９１】
【表２−２】
【００９２】
【表２−３】
【００９３】
【表２−４】
【００９４】
【表２−５】
【００９５】
【表２−６】
【００９６】
【表２−７】
実施例２：再スクリーニングおよびｑＲＴ−ＰＣＲによるアルファ−シヌクレインリン酸化調節の確認
アルファ−シヌクレインのリン酸化の増大または低下を示した実施例１のキナーゼについて、アルファ−シヌクレインに対する効果を確認するために再試験した。この確認のためのスクリーニングは、実施例１で特定した標的および対象とする数種の別のキナーゼに対して１０ｎＭのｓｉＲＮＡを用いて行った。実施例１でより高い濃度のｓｉＲＮＡを用いたのは、不完全に設計されたｓｉＲＮＡに引き起こされるほんの僅かのノックダウンも観察することができるようにするためであった。この確認スクリーニングではるかに低いｓｉＲＮＡ濃度を用いることによって、候補のリストを極めて特異的な調節を示すものにのみ絞ることができた。アンビオン社によってその後無効であると報告された一部のｓｉＲＮＡについても再スクリーニングした（下記のリプレースメントライブラリ・スクリーニング参照）。最後に、いく種かの新たに特定したキナーゼについてスクリーニングし、これらの結果をすでにプールされている結果に加えた。候補として特定したキナーゼを定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって試験することにより、これらが実際にＰＥＡＫ−Ｓｙｎ細胞内に存在すること確認した（実施例６参照）。この確認および再スクリーニングの実験方法および結果は以下の通りであった。
【００９７】
確認スクリーニング
確認スクリーニングの結果は下記に示す４つのカテゴリーにグループ分けした。
【００９８】
完全確認：このカテゴリーには、３つのｓｉＲＮＡの全てが１０ｎＭスクリーニングおよび１００ｎＭスクリーニングにおいて同一の表現型を生じるキナーゼを含めた。
【００９９】
大部分確認：このカテゴリーには、これらのｓｉＲＮＡの２／３が１０ｎＭスクリーニングおよび１００ｎＭスクリーニングにおいて同一の表現型を生じるが、３分の１は生じないキナーゼ、あるいは、１つのｓｉＲＮＡの結果は再現されるが、２番目のｓｉＲＮＡの場合に表現型は同じであるものの最初のスクリーニングに用いたのとｓｉＲＮＡが異なる傾向があるキナーゼを含めた。
【０１００】
部分的確認：このカテゴリーには、これらのｓｉＲＮＡの１／３が１０ｎＭスクリーニングおよび１００ｎＭスクリーニングにおいて同一の表現型を生じるキナーゼを含めた。
【０１０１】
確認できず：このカテゴリーには、以下のいずれかまたは両方が認められるキナーゼを含めた：
ａ）３つのｓｉＲＮＡのいずれも１０ｎＭでリン酸化シヌクレイン濃度に何ら影響を及ぼさない、および／または
ｂ）これらのｓｉＲＮＡが１００ｎＭでの一次スクリーニングで認められたのと逆の表現型を生じる。
【０１０２】
それぞれのカテゴリーに分類されるキナーゼの数を集計し、その結果を表４に示した。７種のキナーゼが「完全確認」され、これらを表５に一覧表示した。これら７種のうち、３種のみがアルファ−シヌクレインをｓｅｒ−１２９で直接リン酸化するキナーゼの良い候補になる質の高さを有すると見なされた。これは、３種のみがいずれもｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼであり、このキナーゼの濃度を特異的ｓｉＲＮＡにより低下させるとリン酸化アルファ−シヌクレインの濃度を低下させたからである。これらのものとしては、平滑筋の増殖および分化において役割を果たしていると考えられているＡＰＥＧ１、脳で発現され、正常な細胞分裂において役割を果たしていると考えられているＰＬＫ２（ＳＮＫ）ならびにキナーゼ活性を有する細胞分裂周期蛋白質であるＣＤＣ７Ｌ１があった。これら３種のうち、ＰＬＫ２は、細胞、特に活性化神経細胞におけるその役割および局在のため、最も興味深いものであった。アルファ−シヌクレインは、シナプス可塑性および小胞輸送に関与していると考えられているシナプス関連蛋白質である。このため、ＰＬＫ２はアルファ−シヌクレインを直接リン酸化するキナーゼの極めて良好な候補とみなされた。
【０１０３】
表４：１０ｎＭ確認スクリーニングからの該当候補の内訳
【０１０４】
【表４】
注：以下の全ての表に対して
＊＊＊は、リプレースメントｓｉＲＮＡについて検討し、無効なｓｉＲＮＡからのデータの代わりにこの新たなデータを用いた箇所を意味する。
陰影付けの意味：
【０１０５】
【化２】
表５：完全確認該当
【０１０６】
【表５】
表５には１０ｎＭで結果が完全に再現された７種の候補を示した。最初の３種のみが直接キナーゼである可能性が強いと見なされた。というのは、これらは、キナーゼ濃度の低下時にリン酸化シヌクレイン濃度を低下させるｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼであるからである。
【０１０７】
２９種のキナーゼが大部分確認のカテゴリーに分類され、このうちの１２種が直接キナーゼの候補であった。これらは表６に一覧表示した。１７種の別のキナーゼが１０ｎＭで大部分確認された。これらは直接キナーゼではないと思われるが、直接キナーゼの調節において役割を果たすことができたものであり、表７に一覧表示した。２２種のキナーゼが部分的確認のカテゴリーに分類された。リン酸化アルファ−シヌクレインを減少させたｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼ（即ち、可能なアルファ−シヌクレインの直接キナーゼ）を表８に一覧表示し、残りの潜在的に調節性のキナーゼを表９に一覧表示した。
【０１０８】
表６：１０ｎＭのｓｉＲＮＡで「大部分確認」であった可能な直接セリン／スレオニンキナーゼ
【０１０９】
【表６−１】
【０１１０】
【表６−２】
表６に示したｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼは、キナーゼ濃度の低下時にリン酸化シヌクレイン濃度を有意に低下させるので、アルファ−シヌクレインをリン酸化する直接キナーゼである可能性を有すると見なされた。ｓｉＲＮＡの２／３は１０ｎＭで１００ｎＭの場合と同一の結果をもたらし、従って、「大部分確認」該当とした。
【０１１１】
表７のキナーゼは、ｓｉＲＮＡの２／３が１０ｎＭおよび１００ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡで同一の結果をもたらしたので、「大部分確認」とした。しかしながら、これらは、適切な表現型を生じなかったか、間違ったクラスのキナーゼ（即ち、ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼとは違い、ｔｙｒもしくは非蛋白質キナーゼ）であったので、アルファ−シヌクレインのｓｅｒ−１２９をリン酸化する直接キナーゼではないと思われると認定された。それよりむしろ、これらはアルファ−シヌクレインのリン酸化の上流調節因子であるかもしれない。
【０１１２】
表７： １０ｎＭのｓｉＲＮＡで「大部分確認」であったその他のキナーゼ
【０１１３】
【表７−１】
【０１１４】
【表７−２】
表８： １０ｎＭのｓｉＲＮＡで「部分的確認」であった可能な直接セリン／スレオニンキナーゼ
【０１１５】
【表８】
表８に示したｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼは、キナーゼ濃度の低下時にリン酸化シヌクレイン濃度を有意に低下させるので、アルファ−シヌクレインをリン酸化する直接キナーゼである可能性を有すると見なされた。ｓｉＲＮＡの１／３のみが１０ｎＭで１００ｎＭの場合と同一の結果をもたらし、従って、「部分的確認」該当とした。
表９： １０ｎＭのｓｉＲＮＡで「部分的確認」であったその他のキナーゼ
【０１１６】
【表９−１】
【０１１７】
【表９−２】
表９のキナーゼは、アルファ−シヌクレインのｓｅｒ−１２９でのリン酸化における直接キナーゼである可能性は少ないと見なされたが、アルファ−シヌクレインのリン酸化の上流調節因子であるかもしれない。ｓｉＲＮＡの１／３が１０ｎＭで１００ｎＭの場合と同一の結果をもたらし、従って、「部分的確認」該当とした。しかしながら、いく種かは、矛盾する結果を生じ、従って、アルファ−シヌクレインの直接キナーゼである可能性は少ないと見なされた。
【０１１８】
４２種のキナーゼは、最初の結果が１０ｎＭで確認されなかった。これらのうち、１９種は上記に掲載されたカテゴリーａ）に分類され、表１０に一覧表示した。１０ｎＭでは、１０ｎＭの３種のｓｉＲＮＡのいずれもリン酸化アルファ−シヌクレインの表現型に何らの変化ももたらさず、１００ｎＭスクリーニングからのこれらのキナーゼの結果は標的から外れた効果によるものであったことが分かった。２３種のキナーゼ（表１１）は１００ｎＭよりも１０ｎＭでリン酸化アルファ−シヌクレイン濃度に対して逆の効果を生じた。１０ｎＭでの結果は、１００ｎＭでは結果が的外れの効果によってマスクされることがあるという事実のために真の効果であった可能性がある。このことは、はるかに高いｓｉＲＮＡ濃度でも起こり得る。あるいは、この真の効果は高濃度でみられたかもしれない。とにかく、これらのキナーゼは、アルファ−シヌクレインの直接キナーゼである可能性は低いとみなされた。
【０１１９】
表１０に示した１９種のキナーゼは１０ｎＭで対照に比し有意な反応性を示さなかった。従って、１００ｎＭで認められたリン酸化シヌクレイン濃度の変化は高濃度のｓｉＲＮＡにより引き起こされた標的から外れた効果によるものであった可能性がある。ＧＰＲＫ５およびＧＰＲＫ７は最初の１００ｎＭスクリーニングでは候補ではなかったが、アルファ−シヌクレインのリン酸化におけるこれらの役割に特別な関心があったため１０ｎＭで検討した。
【０１２０】
表１０：１０ｎＭのｓｉＲＮＡで反応性を示さなかったキナーゼ
【０１２１】
【表１０−１】
【０１２２】
【表１０−２】
表１１のキナーゼの結果は、１０ｎＭではリン酸化シヌクレイン濃度に対して１００ｎＭでみられたのと逆の効果を示したので、「確認されず」であった。しかしながら、１０ｎＭのｓｉＲＮＡでの結果は真の結果であり、ｓｉＲＮＡの高濃度（１００ｎＭ）は真の効果をマスクしていた可能性がある。また、１００ｎＭでみられた最初の効果が真の効果である可能性もある。これらはアルファ−シヌクレインの直接キナーゼであるらしいとみなし、後日さらに試験するために取って置くこととした。
【０１２３】
表１１：結果が一次スクリーニングと逆であったキナーゼ
【０１２４】
【表１１−１】
【０１２５】
【表１１−２】
リプレースメントおよび更新ライブラリのスクリーニング
最初のスクリーニングで使用した一部のｓｉＲＮＡは質が劣るとみなされたので、リプレースメントｓｉＲＮＡを用いて両濃度でスクリーニングを行った。リプレースメントｓｉＲＮＡのデータは、最初のスクリーニングからの特異的ｓｉＲＮＡで得られた結果のデータと取替えるために用いた。統計データは各キナーゼの３種のｓｉＲＮＡについて一覧にし、これを用いて、９種の別のキナーゼを一次スクリーニングとしてとらえ損ねた、最初のスクリーニングからの候補と認定した。これらを再試験したところ、このうちの２種のキナーゼが１０ｎＭのｓｉＲＮＡで「部分的確認」であった。これらはＢＣＫＤＫおよびＦＬＪ２５９６５（ＫＳＲ２）であった。
【０１２６】
この過程において多くの新たなキナーゼが特定され、ｓｉＲＮＡが利用可能になった。これらは、アンビオン・アップデーツ（ＡＭＢＩＯＮ Ｕｐ−Ｄａｔｅｓ）ライブラリおよび新規キナーゼ候補が特定されるので、実施例１と同様に試験した。これらの新たに特定されたキナーゼの多くはＧＯ（遺伝子オントロジーコンソーシアム（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ））分類に入るものであった。従って、これらのキナーゼの一部については詳細な情報を見いだすことは困難であった。このカテゴリーに含まれる遺伝子のうちの数種は真のキナーゼではなく、キナーゼ結合蛋白質、即ち、アダプター蛋白質であった。１０ｎＭのｓｉＲＮＡでは、１３種のキナーゼがアルファ−シヌクレインに直接作用する候補であることが確認された。これらのうちの２種は直接キナーゼである可能性のある候補であった。表１２を参照されたい。残りの１１種は、リン酸化シヌクレイン濃度に対する、考えられる間接的調節因子とみなされた。表１２を参照されたい。表１２には、２００５年１１月１日現在でジェンバンクに登録されているこれらキナーゼ配列のジェンバンク・アセッション番号を示した。
【０１２７】
表１２： アンビオン・アップデーツ・ライブラリからの可能な該当キナーゼ
【０１２８】
【表１２−１】
【０１２９】
【表１２−２】
実施例１および２で特定され立証されたキナーゼｓｉＲＮＡを示す結果を要約して表１３および１４に示した。これらの結果から、ＰＬＫ２、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩならびにＧＲＫ１、２、６および７は、アルファ−シヌクレインを直接または間接的にリン酸化する可能性が極めて高いキナーゼとして特定された。アルファ−シヌクレインのリン酸化を増大させるｓｉＲＮＡを有すると見なされたキナーゼ（ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫ）は、ひょっとするとアルファ−シヌクレインのリン酸化の負の調節因子であるかもしれない。
【０１３０】
表１３および１４：確認研究のまとめ
【０１３１】
【表１３】
表１４
ＧＲＫの結果−「大部分確認」、「部分的確認」および「確認できず」の混成
【０１３２】
【表１４】
以下の実施例では、実施例１および２で特定された多くの標的と考えられるキナーゼについてインビトロでキナーゼアッセイを行った。
【０１３３】
実施例３： インビトロにおけるアルファ−シヌクレインの直接的リン酸化の確認
上記のｓｉＲＮＡスクリーニングからのキナーゼのどれがアルファ−シヌクレインを直接リン酸化するのかを明らかにするために、精製キナーゼをアルファ−シヌクレインとインキュベートしてインビトロのキナーゼ反応を行わせた。この結果から、ＰＬＫ２ならびにＧＲＫ２、５、６および７ （ＧＰＲＫ２、５、６および７）は全てアルファ−シヌクレインを特異的にセリン１２９でリン酸化することができ、インビトロではセリン８７をリン酸化しないことが示され、これらがアルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができることが分かった。また、ＭＥＴ、ＣＤＣ７Ｌ１およびＩＫＢＫＢはアルファ−シヌクレインを直接リン酸化することができないことが示された（図１Ａ乃至Ｃ）。
【０１３４】
組換えアルファ−シヌクレインのセリン１２９に対して組換えキナーゼの活性を試験するアッセイ条件を確立し、この条件はイムノブロットおよびＥＬＩＳＡ分析により再現性があることが分かった。可能な場合、市販の組換えキナーゼを用いた。市販されていないものについては組換え手段により、示したようにして作製した。
【０１３５】
図１Ａ乃至Ｃでは、各反応でアルファ−シヌクレイン基質に対してキナーゼを一定のモル比に標準化（予想成熟蛋白質のＭＷから誘導）することにより組換えキナーゼをインビトロのアルファ−シヌクレイン（ＡＳ）アッセイに用いた（１：２００；キナーゼ：ｒＡＳ）。−対照、＋キナーゼ；図１Ａでは、各反応において等価の基質（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を示すトータル・アルファ−シヌクレイン（ＡＳ）のプローブ（ｍＡｂ Ｓｙｎ−１；０．１μｇ／ｍＬ）を用い；図１Ｂでは、Ｓ１２９リン酸化について平行ブロットをプローブした（ｍＡｂ １１Ａ５１μｇ／ｍＬ）。目立ったシグナルは（これまで活性標準化によって試験されていない）ＧＲＫ６、ＣＫＩ、ＣＫＩＩおよびＰＬＫ２によってもたらされた。図１Ｃでは、Ｓ８７リン酸化について平行ブロットをプローブした（ｐＡｂ、ＥＬＡＤＷ−１１０ ５μｇ／ｍＬ）。シグナルはＣＫＩリン酸化の場合にのみ検出された。
【０１３６】
図１Ｄ乃至Ｆでは、各反応でアルファ−シヌクレイン（ＡＳ）基質に対してキナーゼを一定のモル比に標準化（予想成熟蛋白質のＭＷから誘導）することによるインビトロのＡＳアッセイ（１：２００；キナーゼ：ｒＡＳ）に、ＧＰＣＲ受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリーからの組換えキナーゼおよびＰＬＫ２を用いてさらに的を絞った検討を含めた。−対照、＋キナーゼ；ＣＡＭキナーゼは負の対照であり、同時にＣＫＩおよびＣＫＩＩは正の対照である。図１Ｄでは、各反応において等価の基質（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を示すトータルＡＳのプローブ（ｍＡｂ Ｓｙｎ−１；０．１μｇ／ｍＬ）を用い；図１Ｅでは、Ｓ１２９リン酸化について平行ブロットをプローブした（ｍＡｂ １１Ａ５１μｇ／ｍＬ）。目立ったシグナルは、ＧＲＫ７を除く全てのＧＲＫ類によってもたらされた。シグナルによってＧＲＫ類間に特異性をみることができた。その特異性は、ＣＫＩ＞ＧＲＫ６＞ＰＬＫ２＞ＧＲＫ４＞ＧＲＫ５＞ＧＲＫ２と表すことができる。図１Ｆでは、Ｓ８７リン酸化について平行ブロットをプローブした（ｐＡｂ、ＥＬＡＤＷ−１１０ ５μｇ／ｍＬ）。シグナルはＣＫＩリン酸化の場合にのみ検出された。
【０１３７】
このアッセイ条件は表１５にまとめてあり、試験した全てのキナーゼについて一定に保った。リストアップしたキナーゼの全ては、ＣＤＣ７Ｌ１、ＰＲＫＧ１およびＡＰＥＧ以外は標識／組換え蛋白質として入手可能であった。それらの推定標的はインビトロの翻訳系で発現させ、蛋白質濃度もしくは活性を測定することなくインビトロＡＳアッセイで試験した。
【０１３８】
【表１５−１】
【０１３９】
【表１５−２】
【０１４０】
【表１５−３】
標準条件は、４０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ； １ｍＭ ＥＤＴＡ ＭｇＣｌ １０ｍＭ ｐＨ８．０、０．１％ＢＭＥ； ０．０１％ Ｂｒｉｊ−３５； ５ｕｇ ＢＳＡ、１００ｕＭ ＡＴＰ （５ｘ ［基質］）、１００ｕＬ容； ３００ｎｇ ｒ−ｗｔ−ＡＳ （２０８ ｎＭ）、（１：２００ キナーゼ：ＡＳまたは標準化活性０．０３Ｕ／反応液、３４Ｃ； １７時間であった。さらに、スクリーニングデータの組合せからの種々のレベルの意義（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）／確認を有するこれらのキナーゼは、組換え標識蛋白質として購入し、注記を付け、（合成基質から製造者により決定された）活性単位またはＭＷおよび反応容量から求めた基質：酵素モル比への標準化に基づいて比較可能なインビトロ・アッセイを確立するために図表形式に組み入れた。反応条件の詳細は表１５に明記した。Ｋｉｎ．＝キナーゼ。確認に関しては、大部分＝大部分確認、部分的＝部分的確認、欠落＝確認欠落、確認＝確認。
【０１４１】
キナーゼ活性は、最初、非天然基質（ペプチドまたはカゼイン）から求められる活性単位でＡＳに対して試験した。この方法は、キナーゼ間の特異性およびＡＳがキナーゼ・パネルのインビトロ基質となるかどうかについておおよその見積を得るために用いた。この検討の結果は図２および３に含まれている。この実験のときには、入手可能なキナーゼのうちのほんの一部を入手し、「最も確からしい７種の「確認」」からの２／３のキナーゼを含めた（ＰＬＫ２は試験しなかった）。最も顕著な結果はＧＲＫ６（Ｇ蛋白質共役受容体キナーゼ６）によってもたらされた。ＣＫＩでは適度な活性が得られ、ＣＫＩＩは検出可能ではなかった。両ＣＫキナーゼはＳ１２９ＡＳをリン酸化することが知られているので、活性単位での標準化は、ＡＳに対して試験基質への比活性がより高いキナーゼに対してバイアスがかかっていた。このことが、活性単位を限定するペプチド基質よりも基質としてＡＳを好んだと考えられるＧＲＫ６の事情と思われる。
【０１４２】
以下の実施例では、実施例１および２で特定された多くの標的と考えられるキナーゼについてインビトロでキナーゼ・アッセイを行った。上記活性バイアスを補正するために、キナーゼを再試験し、新たに入手したキナーゼについてモル濃度に関して標準化したアッセイを行った。これによって、酵素と基質間の化学量論的比率の測定が良好となり、このため、ＡＳ／キナーゼ相互作用の関数としてリン酸化事象が記録された。これは、非関連基質／キナーゼ・リン酸化が測定される事象とは対照的であった。図３Ａ乃至Ｃには、ＣＫＩ、ＣＲＫ６およびＰＬＫ２（７種の高度「確認」のうちの１種）との間でリン酸化ｓｅｒ−１２９の濃度がほぼ同等のＡＳリン酸化のより実際的な図を示す。ＣＫＩＩは数分の１の低下を示したが、これは同様なアッセイ条件を用いた以前のＥＬＩＳＡのデータと一貫している。ＣＫＩを除き、試験したキナーゼのいずれもＡＳをｓｅｒ−８７残基でリン酸化することができなかった。この観察結果から、これらのキナーゼがｓｅｒ−１２９部位に対して特異的／選択的であり、ｓｅｒ−８７部位に対しては特異性／選択性は低いことが確認された。しかしながら、ＣＫＩは両部位をリン酸化することが報告されている。
【０１４３】
アッセイ結果に対する酸性リン脂質の影響
上記インビトロ・アッセイにおけるＧＲＫ６およびＰＬＫ２（ＧＲＫファミリーと系統的に関連のあるポロ様キナーゼ）による活性の有意なレベルは、上記ＲＮＡｉスクリーニングにおけるリン酸化の低下因子としてのＰＬＫ２、ＧＲＫ２およびＧＲＫ１の特定と相俟って、他のＧＲＫ類のさらに包括的な調査を促進した。図４ＡおよびＢには、このインビトロ・アッセイで比較したＧＲＫ２、４、５、６および７ならびにＰＬＫ２の結果を示した。これらの結果は、デンシトメトリー比較においてＳ１２９リン酸化に対する特異性が明確であることを示すものである。この選択性は、ＣＫＩ＞ＧＲＫ６＞ＰＬＫ２＞ＧＲＫ４＞ＧＲＫ５＞ＧＲＫ２と表すことができる。ＧＲＫ７は容易に検出できるほどのレベルでリン酸化することができなかった。酸性配列フランキングアミノ酸１２９に特異性を示す全てのＧＲＫ類はｓｅｒ−８７をリン酸化することはできなかった。こうした反応はＥＬＩＳＡ測定により定量化して確認した。これらの値は、ＧＲＫ類に対してＰＬＫ２濃度の明らかな減少を示すイムノブロットデータとおおよそ一致した。ＡＳ基質の大部分は上記アッセイデザインに基づいて使い果たされた（リン酸化された）のであり、その測定値は反応における最大ＯＤ／基質を表すものと考えられる。
【０１４４】
ＡＳのリン酸化に対する酸性リン脂質のプラス効果についてはこれまでにＰｒｏｎｉｎほか、ＪＢＣ ２７５（３４）：２６５１５−２６５２２（２０００年）により報告されており、ＧＲＫ２および５に対する顕著な効果が認められた。この報告および酸性リン脂質がＡＳの立体構造を調節することを示した多くの研究があることから、ホスファチジルコリン（ＰＣ）：ホスファチジルセリン（ＰＳ）：ホスファチジルイノシトール３−リン酸（ＰＩＰ３）の混合物を作製し、上記で確立したインビトロ・アッセイに組み入れた。その結果、この脂質混合物は試験したキナーゼのほぼ全てのシグナルを増加させることがわかった。脂質環境を追加することにより、細胞の膜表面が模倣される可能性が高く、そこでＡＳとＧＲＫ類が結合するように思われる。以下の理論に拘束されるわけではないが、これは、脂質がＡＳのＮ末端ヘリックスに結合するとＡＳのＣ末端が良好に暴露されることによるものと考えられる。面白いことに、（ＣＫＩ反応にみられるような）ｓｅｒ−８７リン酸化に対する脂質効果はリン酸化のレベルの低下をもたらした。これは、ヘリックスが相互作用するとｓｅｒ−８７が埋められる場合には、脂質との相互作用によりエピトープ・マスキングが起こる結果であろう。
【０１４５】
実施例４：細胞株におけるアルファ−シヌクレインの直接的リン酸化の確認
キナーゼは細胞内におけるよりもインビトロでより無規律となり得るので、アッセイを細胞株を用いて行うことによりアルファ−シヌクレインとの直接的相互作用を確認した。実施例３からのインビトロでアルファ−シヌクレインをリン酸化したキナーゼのｃＤＮＡをＰＥＡＫ−Ｓｙｎ細胞株中にトランスフェクトしてどのキナーゼが細胞内でアルファ−シヌクレインのｓｅｒ−１２９をリン酸化することができるかを調べた。その結果から、ＧＲＫ６および、さらに著しくはＰＬＫ２が細胞内でアルファ−シヌクレインのリン酸化を媒介することができることが分かった（図５）。
【０１４６】
ＰＬＫ２、ＧＰＲＫ６、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７およびＰＲＫＧ１のｃＤＮＡクローンはオリジーン社（Ｏｒｉｇｅｎｅ）から入手した。このｃＤＮＡをリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（商標）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて細胞内に転写、トランスフェクトした。検討する各ｃＤＮＡについて、９６穴プレートの１２穴でトランスフェクトを行い、そのほかに、細胞にトランスフェクトしていない１２穴を対照とした。ＥＬＩＳＡスクリーニングプロトコルに従いトランスフェクト後４８時間に細胞を採取してＥＬＩＳＡによってトータルおよびリン酸化シヌクレインを分析し、値をトータル蛋白質に対して標準化した。組換え蛋白質として市販されていない標的キナーゼ（例えば、ＡＰＥＧ、ＰＲＫＧＩおよびＣＤＣ７ＬＩ）については、インビトロ網状赤血球無細胞系（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いてヒト完全長ｃＤＮＡクローン（オリジーン社）から蛋白質を発現させた。正しい配列を決定し、ＤＮＡを調製した。また、ＰＬＫ２およびＧＲＫ６ｃＤＮＡについても陽性対照として本検討に加えた。
【０１４７】
トランスフェクトしていない細胞におけるリン酸化シヌクレインの割合は７．８％と計算された。ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７およびＰＲＫＧｌｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞のリン酸化シヌクレインの割合は８．９％とトランスフェクトしていない細胞よりもごくわずかに高かった。これらのキナーゼはリン酸化シヌクレイン濃度を変えることにおいて否定的な結果を生じたと考えられ、他のキナーゼが受けているのと同じトランスフェクトの困難さに曝されているので、実験のための負の対照と考えられた。ＰＬＫ２に対するｃＤＮＡは２９３−シヌクレイン細胞にトランスフェクトした。細胞はトランスフェクト後４８時間に採取しＥＬＩＳＡによりトータルおよびリン酸化シヌクレイン濃度を分析した。ＥＬＩＳＡ値はトータル蛋白質濃度に対して補正した。ＰＬＫ２が過剰発現すると、リン酸化シヌクレイン濃度は劇的に増加し、その結果、リン酸化シヌクレインの発現がトランスフェクトしていない細胞での発現より４．３倍上昇した。
【０１４８】
α−シヌクレインをリン酸化する直接キナーゼを細胞内に導入すると、リン酸化シヌクレイン濃度の上昇がみられる可能性は高い。このことはＧＰＲＫ６およびＰＬＫ２のいずれについても当てはまった（図６）。ＧＰＲＫ６ ｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞のリン酸化シヌクレインの割合は８．９％から１８．９％へ劇的に増加した。この増加は、陰性キナーゼの場合に認められるリン酸化シヌクレインのパーセンテージより９．２５標準偏差分だけ上の値まで有意である。ＰＬＫ２トランスフェクト細胞のリン酸化シヌクレイン濃度の増加は、さらに劇的であり、リン酸化シヌクレインの割合はほぼ４倍の３３．２％まで増加した。これは極めて有意な変化、即ち、陰性キナーゼの場合に認められるリン酸化シヌクレイン濃度より２２．７５標準偏差分だけ上への増加である。この劇的な増加は、このアッセイの使用時にこれまでに認められた格段に大きな変化であった。このデータは、ＧＰＲＫ６および、特にＰＬＫ２がα−シヌクレインのリン酸化に関与する直接キナーゼとしての極めて確かな候補であることを強く示唆するものである。すなわち、図６に示したように、ＧＰＲＫ６ ｃＤＮＡをＨＥＫ−シヌクレイン細胞にトランスフェクトすると、リン酸化シヌクレインの発現が２倍になる。ＰＬＫ２ ｃＤＮＡを細胞内に導入すると、リン酸化シヌクレインの発現はさらに劇的に増加し、その変化は対照値のほぼ４倍になる。
【０１４９】
実施例５：ＰＬＫ２（ＳＮＫ）ＧＲＫ６、ＣＫＩＩおよびＩＫＢＫＢによるリン酸化
別の会社（ダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ））製のＰＬＫ２ ｓｉＲＮＡもアルファ−シヌクレインのリン酸化を阻害することを示すことによって、実施例４のデータはＰＬＫ２についてさらに裏付けられた。このことは、ＰＬＫ２がアルファ−シヌクレインをセリン１２９で直接リン酸化する細胞キナーゼとしての有望な候補であることを示すデータ（表２および１３）を補強するものであった。
【０１５０】
アルファ−シヌクレインを安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を１０ｎＭおよび１００ｎＭのスマートプール（ＳｍａｒｔＰｏｏｌ）ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。スマートプールｓｉＲＮＡには特異的標的に対する４つの個々のｓｉＲＮＡが含まれる。従って、これら４種のｓｉＲＮＡの各々の実際の濃度は、それぞれ２．５ｎＭおよび２５ｎＭであった。図７の結果から、ＰＬＫ２はリン酸化シヌクレイン濃度を有意に減少させ、その変化は約２５％であることが分かる。１０ｎＭではＧＰＲＫ６はリン酸化シヌクレインのパーセンテージを対照の陰性キナーゼの場合の平均値よりも１標準偏差分だけ増加させたが、１００ｎＭではそうはならなかった（図７）。これは、一次ｓｉＲＮＡスクリーニングで先に認められたのと逆の効果であり、最初または２番目のアッセイに用いたｓｉＲＮＡの品質によるのかも知れない。これらの結果は免疫組織化学によって確認した。
【０１５１】
異なる供給源からの種々のｓｉＲＮＡによるリン酸化シヌクレイン濃度の有意なノックダウンは、独立してデータを裏付け、強固なものにし、α−シヌクレインをリン酸化する直接キナーゼとしてのＰＬＫ２の役割を立証するものである。次いで、これらの実験を、対象とするべきスクリーニングで特定した２種の他のキナーゼ、カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）およびＩＫＢＫＢを用いて行った。
【０１５２】
本明細書に示したインビトロのデータから、ＣＫＩＩはアルファ−シヌクレインをリン酸化するが、そのリン酸化はＰＬＫ２ほど効率的ではないことが示唆される。個々のＣＫＩＩ触媒サブユニットは一次ｓｉＲＮＡスクリーニングのヒットであり（実施例１および表１Ｂ照）、１０ｍＭ ｓｉＲＮＡスクリーニングで確認された。個々のＣＫＩＩサブユニットα１およびα’は、ＰＬＫ２または互いと共に同時トランスフェクトするとアルファ−シヌクレインのリン酸化に対して相加効果を示すかどうかを明らかにすることは興味深いことであった。トランスフェクトは、個別のＣＫＩＩサブユニットＡ（α１）およびＢ（α’）を用い、ＰＬＫ２または互いと同時トランスフェクトして行った。これらの触媒サブユニットを過剰発現させると、リン酸化シヌクレイン濃度はそれぞれ１．７５および１標準偏差分だけ増加した（その効果は相加的ではなかった）。個々のサブユニットの各々をＰＬＫ２と同時トランスフェクトさせると、リン酸化シヌクレインの濃度は１．７５標準偏差分だけＰＬＫ２単独の場合（１８．６％リン酸化シヌクレイン）より増加してそれぞれ２２．８％リン酸化シヌクレインとなった。しかしながら、両サブユニットをＰＬＫ２と同時トランスフェクトすると、リン酸化シヌクレインの濃度はＰＬＫ２単独の場合（２１．４％リン酸化シヌクレイン）より有意に増加しなかった。
【０１５３】
ＩＫＢＫＢ ｓｉＲＮＡをノックダウンすると、アルファ−シヌクレインのリン酸化が有意に低下したので、この遺伝子のアルファ−シヌクレインリン酸化能について試験した。トランスフェクトおよびＥＬＩＳＡ分析は標準手順に従って実施した。これまでのインビトロ実験の結果、ＩＫＢＫＢは直接キナーゼ・アッセイでシヌクレインをリン酸化しなかった（実施例３参照）ので、直接シヌクレインキナーゼではないが、シヌクレインリン酸化の上流調節因子であるかもしれないことが分かった。従って、ＩＫＢＫＢをＨＥＫ−ｓｙｎ細胞で過剰発現させてシヌクレインのリン酸化に対する効果を確認した。ＩＫＢＫＢ ｃＤＮＡの細胞内への導入後、シヌクレインリン酸化は負（空ベクター）の対照の８．３％から２１．５％へ２．６倍の増加を示した。これはほぼ５３標準偏差分の有意なシヌクレインリン酸化の増加である。ＰＬＫ２正対照ではシヌクレインリン酸化は６５．８％と、ほぼ８倍の増加を示した（２３０標準偏差分で有意）。シヌクレインリン酸化に対する効果はＩＫＢＫＢの場合よりも関連キナーゼのＩＫＢＫＡの場合でずっと更にわずかであった（１．２倍）が、それでも１．４標準偏差分で有意であった。
【０１５４】
実施例６：代替的な治療標的としてのシヌクレイン
シンフィリンは、アルファ−シヌクレインを結合することが明らかにされているシヌクレイン関連蛋白質である。シンフィリンの存在がアルファ−シヌクレインのリン酸化を増強することができるかどうかを明らかにするために、アルファ−シヌクレインおよびＰＬＫ２を含むＨＥＫ細胞と含まないＨＥＫ細胞内にこれを過剰発現させた。標準的プロトコルに従ってトランスフェクトを行った後、アルファ−シヌクレインのＥＬＩＳＡおよび分析を実施した。また、細胞を採取してウエスタンブロット分析を行った。トランスフェクトした細胞の溶解物について、１Ｈ７抗体を用いてトータルシヌクレイン、１１Ａ５抗体を用いてセリン１２９リン酸化シヌクレインを分析した。細胞内にトランスフェクトされたＤＮＡの総量は９６穴プレートの穴当たり０．１６μｇと一定のままであった。細胞内に導入されるＤＮＡの種類は、ＤＮＡの完全な割り当て（ｑｕｏｔａ）を形成するのに用いるべき空のベクターによってさまざまに異なる。種々の濃度のアルファ−シヌクレイン、ＰＬＫ２およびシンフィリンｃＤＮＡを未処置のＨＥＫ細胞内に導入した。これら３種の全てをトランスフェクトした細胞はトータルシヌクレインのわずかな増加を示した。リン酸化シヌクレインについては、トランスフェクトしていない細胞中の濃度は定量限界未満であった。アルファ−シヌクレインを単独で導入すると、５．２％のリン酸化シヌクレインが得られ、これはシヌクレインとシンフィリンの同時トランスフェクトの場合（５．４％のリン酸化シヌクレイン）よりもわずかに少なかった。ＰＬＫ２とシヌクレインを同時トランスフェクトすると、６０％リン酸化シヌクレインと、ＨＥＫ−ｓｙｎ安定細胞内にＰＬＫ２をトランスフェクトした場合に認められたのと同様な濃度が得られた。驚くべきことに、３種のＤＮＡ（ＰＬＫ２、シヌクレインおよびシンフィリン）の全てを同時に過剰発現させると、ＨＥＫ細胞中のリン酸化シヌクレイン濃度は８３．３％となった。従って、ＰＬＫ２、シヌクレイン過剰発現ＨＥＫ細胞においてシンフィリンはシヌクレインのリン酸化を増大させた。
【０１５５】
シンフィリンの存在下にアルファ−シヌクレインのリン酸化が増大することは、シンフィリンがＰＬＫ２ポロ−ボックスに結合することによりＰＬＫ２によるシヌクレインのリン酸化を促進することによって説明することができる。
【０１５６】
実施例７： アルファ−シヌクレインおよびアルファ−シヌクレインの家族性突然変異体のＰＬＫ２活性によるリン酸化
アルファ−シヌクレインの多くの既知家族性突然変異体のＰＬＫ２によるリン酸化を検討するために、インビトロトランスフェクト研究を行い、アルファ−シヌクレインおよびその突然変異体のリン酸化を分析した。これらの家族性突然変異体（ＦＰＤ）はＡ３０Ｐ、Ａ５３ＴおよびＥ４６Ｋであった。
【０１５７】
全てのインビトロ反応は以下の条件で行った：１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭのＡＴＰ、２７ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５０ ｎｇ／ｍｌのＰＬＫ２、プロテアーゼ阻害剤溶液（反応緩衝液１ｍｌ中１錠）の５０倍希釈液、４０ｎＭニトロフェニルリン酸、１ｍｇ／ｍｌの９５％大豆由来ＩＩ型ホスファチジルコリン、および１０、１００または１，０００ｎＭアルファ−シヌクレイン（ＡＳ）。反応は３７°Ｃで培養した。活性はオートラジオグラフィーにより分析した。
【０１５８】
トランスフェクトは、２９３細胞をプレートに播き、リポフェクタミン２０００（商標）含有オプチ−ＭＥＭ（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）（商標）中（トータルＤＮＡを一定に保つために空のベクターを用いて）種々の量のＰＬＫ２およびアルファ−シヌクレインＤＮＡで処理することによって行った。細胞は、２日後にウエスタンブロット用にサンプル緩衝液中に、または１１Ａ５抗体使用ＥＬＩＳＡ用にプロテアーゼ阻害剤含有０．５Ｍグアニジン中に採取した。
【０１５９】
ＰＬＫ２はベータシヌクレインよりも野生型アルファ−シヌクレインに対して効力がより強いことが分かった。さらに、アルファ−シヌクレイン突然変異体は、所定の濃度（特に、低濃度で）野生型（ＷＴ）よりもより多くリン酸化された。その活性のレベルは突然変異体に対する選択および突然変異体がＷＴよりも低いＫｍを有することを反映している。ＰＬＫ２活性の傾向はＰＬＫ２活性がＦＰＤ突然変異体で最も高く、これに野生型アルファ−シヌクレインが続き、ベータシヌクレインに対して最も低いことと関連づけられた。この順序は、アルファ−シヌクレインのリン酸化がレヴィー小体の形成およびその後の病状を駆動するメカニズムと整合している。
【０１６０】
実施例８：ＨＥＫ−シヌクレインおよびＳＹ５Ｙ−シヌクレイン細胞中のキナーゼの存在の確認
対象キナーゼがＨＥＫ−シヌクレインおよびＳＹ５Ｙ−シヌクレイン細胞で発現されるかどうかを明らかにするためにｑＲＴ−ＰＣＲを行った。表１６では、全てのサンプルはＧＡＰＤＨ発現に対して標準化した。さらに、陰性キナーゼのうちの２種は各実験で対照として分析した。直接キナーゼである可能性のある２４種の候補のうち、ＨＥＫ２９３−シヌクレイン細胞ではＰＬＫ２を含む２０種が検出された。従って、残る「完全確認」キナーゼが上記細胞内に検出された（図９）。試験した直接キナーゼである可能性のあるもののうち、４種、即ち、ＧＰＲＫ１、ＧＰＲＫ７、ＥＲＫ８およびＲＩＰＫ３は検出されなかった。ＧＰＲＫ６は辛うじて検出可能であった。
【０１６１】
ｑＲＴ−ＰＣＲは以下の通り行った：ｍＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現レベルに標準化した。キアーゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔおよびプロトコルを用いて細胞ペレットからトータルＲＮＡを精製した。直接キナーゼと考えられるものおよび４種の間接「完全確認」キナーゼの２４種のプライマー／プローブセットは、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ阻害剤および標準ＰＣＲ試薬と共に、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（タックマン遺伝子発現アッセイ）に注文した。以下のサイクリング条件により２０ｎｇまたは２００ｎｇのトータルＲＮＡを用いて各プライマー／プローブセットにつき、ＡＢＰＩ７５００リアルタイムＰＣＲ機で一段ＲＴ−ＰＣＲ／ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を行った：４８°Ｃ／３０分（ＲＴ−ＰＣＲ工程）、９５°Ｃ／１０分（変性）、その後、９５°Ｃ／１５秒、６０°Ｃ／１分の４０サイクル。各プライマー／プローブセットにつき、ＲＴネガチブ反応およびＰＣＲネガチブ反応を行った。精製ＲＮＡに混入しているＤＮＡ（ＲＮＡではない）のバックグラウンド増幅のためのＲＴネガチブ対照。ＰＣＲネガチブ対照は、ＰＣＲ試薬の全てが混入しているＲＮＡおよびＤＮＡを含まず、シグナルを有さないことを保証するためのものである。
【０１６２】
「完全確認」の直接キナーゼと考えられるもののうちの３種の全ては、４種の「完全確認」の間接キナーゼと共に、ＳＹ５Ｙ−シヌクレイン細胞中に容易に検出され、このことから、この細胞株がキナーゼの更なる実験的分析のための神経由来細胞株の実行可能な選択肢であることが分かった。
【０１６３】
表１６ ＨＥＫ−シヌクレインおよびＳＹ５Ｙ−シヌクレイン細胞中のキナーゼの存在のｑＲＴ−ＰＣＲによる証明
【０１６４】
【表１６】
実施例９：２９３細胞および神経由来細胞株中におけるアルファ−シヌクレインのリン酸化増大の確認
アルファ−シヌクレインを安定的にトランスフェクトした２９３細胞にＰＬＫおよびＧＲＫを過剰発現させた。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを行ってＰＬＫおよびＧＲＫキナーゼによるリン酸化シヌクレインの増加を確認し、リン酸化の増大を証明した。別の方法を用いてその増大を、２９３細胞に対して免疫染色にＥＬＩＳＡで使用するのと同じビオチン化抗体（１１Ａ５）を用いることにより確認した。この方法では、ＰＬＫ２および、程度は少ないがＧＲＫをトランスフェクトした細胞中のリン酸化シヌクレインの増加も証明された。この増加は１１Ａ５で明るく染色される少数の細胞で検出され、全ての細胞での全般的な増加がみられるのではない。トータルシヌクレインの量（５Ｃ１２抗体を用いて測定）は変化しないように思われた。これは２９３細胞内のリン酸化の有意な増大であった。従って、こうした結果が神経芽腫細胞で再現され得るかどうかを調べることは重要であった。
【０１６５】
ＰＬＫ２およびＧＰＲＫ６を用いて認められたリン酸化シヌクレインの劇的な上方調節が神経由来細胞にも存在することを確認するために、同じ実験をヒト神経芽腫細胞（ＳＹ５Ｙ細胞）で行った。免疫染色の結果から、ＰＬＫ２が２９３細胞実験と極めてよく似たパターンで少数の細胞内にリン酸化シヌクレインの増加を引き起こすことが明らかとなった。定量は２つの方法でアレイスキャン（ＡｒｒａｙＳｃａｎ）（商標）を用いる免疫組織化学により行った。先ず、全ての細胞をカウントしたところ、何らの相違もみられなかった。次いで、明るい細胞のみをカウントしたところ、この分析から、ＰＬＫ２をトランスフェクトした１１Ａ５陽性細胞の数は約５乃至１０倍増加し、ＧＲＫ６の場合でもわずかに増加することが分かった。
【０１６６】
ＨＣＣ細胞でｃＤＮＡトランスフェクト実験を繰り返し、ＰＬＫ２およびＧＰＲＫ６をトランスフェクトした細胞に対して種々のアルファ−シヌクレイン抗体を用い、免疫組織化学を行った。このような方法で、この細胞内に封入体形成および／またはアルファ−シヌクレイン凝集が観察される。封入体／凝集を探すのに用いる抗体としては、ＬＢ５０９、ＳＹＮ−１、１１Ａ５およびＥＬＡＤＷ−１１０が挙げられる。
【０１６７】
次に、マウスモデルへの標的の導入に向けて一次培養神経細胞内にＰＬＫ２およびＧＰＲＫ６ ｓｉＲＮＡのｃＤＮＡをトランスフェクトする。この方法は実施例１と同様にして行う。ｑＲＴ−ＰＣＲはＳＹ５Ｙ−シヌクレインＲＮＡを用いて（実施例１と同様にして）実施する。ＳＹ５Ｙ−シヌクレイン細胞は神経芽腫細胞由来であり、ＷＴ−シヌクレイン・ベクターを用いて安定的にトランスフェクトされている。
【０１６８】
実施例１０： 細胞周期の調節におけるＰＬＫ２の関与の確認
ＰＬＫ２はＧ１相細胞周期調節蛋白質であるので、アルファ−シヌクレインのＰＬＫ２によるリン酸化が細胞周期調節に変化をもたらすかどうかを確認することは重要である。細胞がより集密的に増殖するにつれて細胞内のリン酸化シヌクレインの割合が減少することは、以前に（増殖が減速するに従って）観察された。このことは、アルファ−シヌクレインをリン酸化する１種以上の直接キナーゼが細胞周期の調節に関与していることと極めてよく一致している。従って、ＰＬＫ２に対する１種以上の抗体を用いてウエスタンブロットにより標準化蛋白質濃度を分析することによって、ＰＬＫ２濃度の減少がこの観察されたリン酸化シヌクレイン濃度の減少および細胞の集密化と相関しているかどうかを明らかにする
。
【０１６９】
実施例１１： ヒト培養皮質細胞内のレンチウイルス発現アルファ−シヌクレインの分布−レヴィー小体病の細胞モデル
重要なのはレヴィー小体病および／またはＰＤ病状の細胞モデルの特定であった。このため、イン・ビボでアルファ−シヌクレイン沈着のモデルを確立するために、ヒト培養皮質細胞においてアルファ−シヌクレインのレンチウイルス媒介発現を行った。従って、ドナーおよび野生型および変異型アルファ−シヌクレインを過剰発現するＨＣＣ細胞で実験を行い、細胞を断片化して細胞内の野生型アルファ−シヌクレインおよび変異型アルファ−シヌクレインの場所を特定した。以下の結果から、ＨＣＣ細胞はＬＢ病に合致する仕方でアルファ−シヌクレインの凝集を示したことが分かる。さらに、ＰＬＫ２を発現させると、その凝集だけでなくアルファ−シヌクレインのリン酸化も増大した。
【０１７０】
培養を延長することにより過剰発現されたシヌクレインの蓄積が増大して細胞がストレスを受け、このことがシヌクレイン沈着または毒性にとって好都合に働くかどうかを確認する実験をさらに実施した。そこで、ＨＣＣをＷＴ、Ａ５３Ｔ、Ｓ１２９ＡまたはＡ５３／Ｓ１２９Ａアルファ−シヌクレイン突然変異体を発現するウイルスベクターで形質転換した。形質転換後、細胞を９、１６または２３日間インビトロで増殖させ、その後、回収して断片化した。ＥＬＩＳＡの結果を蛋白質濃度に対して標準化したところ、この結果から、時間がたつと共に可溶性画分にシヌクレインが蓄積することが分かった。Ｓ１２９Ａ突然変異体ではややより多くの蓄積が認められた。
【０１７１】
さらに、ｗｔ、１１９−切断型およびＥ４６Ｋ ＡＳで実験を行ったところ、その結果は以下の通りであった。野生型の発現が高いほど可溶性画分に回収されるアルファ−シヌクレインの部分は大きかった。Ｅ４６Ｋシヌクレインではリン酸化アルファ−シヌクレインの量に５０乃至１００％の増加がみられた。しかしながら、このＥ４６Ｋ突然変異体では膜結合または不溶性画分に回収される相対量は著しくは影響されなかった。１１９アルファ−シヌクレインを発現させると、不溶性画分に蓄積する相対量がわずかに（ＷＴに対して約３倍）増加した。この増加は、切断型シヌクレインが完全長型よりもインビトロではるかにより容易にフィブリルを形成することを示唆する公表結果（Ｍｕｒｒａｙ、２００３年 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：８５３０）を考えると、予想されるものである。１１９切断の結果、Ｎ−末端ドメインが脂質二重層との結合に関与していることと一致した膜との結合の増大が生じた。この膜との結合の増大により、上記の可溶性蛋白質が凝集する傾向の増大が緩和されるかも知れない。過剰発現時の可溶性シヌクレイン濃度の増加および切断に対する上記不溶性画分の反応から、これを用いることによって神経細胞内環境における凝集に影響を与える因子を特定する方法が得られることが示唆される。
【０１７２】
ＣＨＡＰＳ抵抗性、ＵＴＣ抽出性アルファ−シヌクレインがＰＤ／またはＤＬＢ病変（レヴィー封入体）と共通点があるかどうかを明らかにするために別の実験を行う。例えば、同実験をベータ−シヌクレインを用いて行った。というのは、ベータ−シヌクレインはレヴィー封入体と結合せず、またインビトロで凝集しないからである。
【０１７３】
可溶性コンパートメントのアルファ−シヌクレインが増加すると、アルファ−シヌクレインがより脆弱である可能性のあるコンパートメントに移されるとも考えられ、このことが沈着の増加をもたらし得る変化につながる。アルファ−シヌクレインをＳｅｒ−１２９でリン酸化すると提唱されているキナーゼは可溶性であるので、可溶性アルファ−シヌクレインもまたリン酸化により利用されやすいと思われる。
【０１７４】
細胞モデルでリン酸化および／または凝集の阻害剤を発現させ、リン酸化および／または凝集の低下を確認することにより、この細胞においてこの阻害剤を確認するために別の実験を行った。
【０１７５】
実施例１２： アルファ−シヌクレインＫＯマウスにおける内因性キナーゼ活性の分析
推定アルファ−シヌクレインキナーゼの確認のためにアルファ−シヌクレインノックアウト（アルファ−シヌクレインＫＯ）マウス脳を利用することは、以下の点でｓｉＲＮＡスクリーニングよりも有利である： １） 脳材料を用いることにより、ＨＥＫ細胞株では得られないと思われる適切で恐らくより高いレベルの脳特異的キナーゼ活性が得られること、２）脳には、上記細胞には存在しないと思われる補因子（脂質、蛋白質など）が存在すること、および３）リン酸化ＡＳとして検出される可能性のある如何なる内因性アルファ−シヌクレインも存在しないこと。測定可能なキナーゼ活性が粗材料中に存在するかどうかを明らかにするために、組換えアルファ−シヌクレイン（ｒＡＳ）含有（可溶性および界面活性剤可溶性）抽出物２５乃至５０μｇの封入体を２５０μＭのＡＴＰを用いて評価した。図８ＡはｒＡＳの対応する使用量を表す各反応におけるトータルアルファ−シヌクレインを示す。図８Ｂでは、ｓｅｒ−１２９リン酸化アルファ−シヌクレインの濃度を調べた。ＴＢＳ（蔗糖可溶性）およびＴＸ抽出物の両者中のｒＡＳがリン酸化され、ＴＢＳ材料からのシグナルのレベルはＴＸ材料からのそれのほぼ２倍であった（但し、反応は蛋白質に対して標準化しなかった）。リン酸化レベルはＣＫＩの添加によって増大したが、大豆由来リン脂質の添加では有意な影響を受けなかった。図９のｓｅｒ−８７リン酸化では同一のブロットをプローブした。このｐＡｂは１００ｎｇのｒＡＳと交差反応性を示すので、バックグラウンドを超えるレベルはＳ８７部位での真のリン酸化を表す。ＴＢＳおよびＴＸ反応のいずれにおいても、この部位での有意なリン酸化は認められなかったが、ＣＫＩスパイクは測定可能なレベルのリン酸化に達した。これらの実験から、測定可能な紛れもないキナーゼ活性（類）がＫＯマウス脳の可溶性および膜画分に存在し、Ｓ８７に比しＳ１２９に対して特異的であることが示唆される。アルファ−シヌクレインには他のセリンまたはスレオニン部位におけるリン酸化の可能性が存在するが、そのような修飾を検出するための抗体はまだ利用可能ではない。このように、測定可能なレベルのｓｅｒ−１２９特異的キナーゼ活性／活性類がアルファ−シヌクレインＫＯマウス脳抽出物に存在するので、このような活性を有するものを脳からのキナーゼ精製の原料とすることができるかも知れない。
【０１７６】
図８Ａ、８Ｂ、９Ａおよび９Ｂでは、アルファ−シヌクレインＫＯマウス脳の皮質をダンス型ホモジナイザーによりホモジナイズして、プロテアーゼおよびホスファターゼのインヒビターが存在する２００ｍＭ蔗糖可溶性および０．１％トリトンＸ−１００可溶性抽出物を得た。サンプル２０μｌ（反応液の総容量１００μｌ）を、陽性対照としてのカゼインキナーゼＩ（ＣＫＩ）１，０００単位および／またはキナーゼ活性（類）を増大させるためのホスファチジルコリン（ＰＣ；大豆レシチン）の存在下または非存在下にｗｔ−ｒＡＳ ２．４μｇとインキュベートした。反応はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷し（総ＡＳ量１３０ｎｇ）、Ｓｙｎ−１（総Ｓｙｎ；０．１ｕｇ／ｍｌ）、１１Ａ５（ｓｅｒ−１２９リン酸化；１μｇ／ｍｌ）またはＥＬＡＤＷ１１０（ｓｅｒ−８７リン酸化；２μｇ／ｍｌ）でイムノブロットした。
【０１７７】
上記のデータから、ＰＬＫ２その他の直接および／または間接キナーゼ（ＧＲＫ６など）ならびにシンフィリンなどの調節因子はＤＬＢおよびＰＤにおける治療的介入の新規な標的であることが分かる。ＰＬＫ２は、アルファ−シヌクレインをｓｅｒ−１２９で直接リン酸化することができるので、好ましい標的である。
【０１７８】
以上の実施例は単に例示的なものであり、本発明を限定するものではない。従って、他の変形形態がありうることは当業者には容易に理解されよう。本発明の範囲は、これにより付与される全ての特許の請求範囲によってカバーされる。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照するのではなく、付与される特許請求の範囲をその均等物の全範囲と共に参照して決定されるべきである。本出願において引用した全ての刊行物、参考文献および特許文献は、個々の刊行物もしくは特許文献がそれぞれ、そのようにして個別に示されている場合と同程度に、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１Ａ】図１Ａ乃至Ｃは、種々の組換えキナーゼによるアルファ−シヌクレインのリン酸化に関するインビトロ・リン酸化アッセイの結果を示す。図１Ａはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｂはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９のリン酸化を示し、図１Ｃはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ乃至Ｃは、種々の組換えキナーゼによるアルファ−シヌクレインのリン酸化に関するインビトロ・リン酸化アッセイの結果を示す。図１Ａはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｂはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９のリン酸化を示し、図１Ｃはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ乃至Ｃは、種々の組換えキナーゼによるアルファ−シヌクレインのリン酸化に関するインビトロ・リン酸化アッセイの結果を示す。図１Ａはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｂはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９のリン酸化を示し、図１Ｃはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄ乃至Ｆは、ＧＰＣＲ受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリーからの組換えキナーゼおよびＰＬＫ２を用いた更に的を絞った検討結果を示す。図１Ｄはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｅはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９（ホスホ−ｓｅｒ−１２９）のリン酸化、図１Ｆはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化（ホスホ−ｓｅｒ−８７）を示す。
【図１Ｅ】図１Ｄ乃至Ｆは、ＧＰＣＲ受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリーからの組換えキナーゼおよびＰＬＫ２を用いた更に的を絞った検討結果を示す。図１Ｄはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｅはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９（ホスホ−ｓｅｒ−１２９）のリン酸化、図１Ｆはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化（ホスホ−ｓｅｒ−８７）を示す。
【図１Ｆ】図１Ｄ乃至Ｆは、ＧＰＣＲ受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリーからの組換えキナーゼおよびＰＬＫ２を用いた更に的を絞った検討結果を示す。図１Ｄはトータル・アルファ−シヌクレインを示し、図１Ｅはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９（ホスホ−ｓｅｒ−１２９）のリン酸化、図１Ｆはアルファ−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化（ホスホ−ｓｅｒ−８７）を示す。
【図２Ａ】図２ＡおよびＢは、各種キナーゼにおけるインビトロでのキナーゼ活性の測定結果を示す。図２ＡはトータルＡＳを示す。図２Ｂはセリン１２９を示す。
【図２Ｂ】図２ＡおよびＢは、各種キナーゼにおけるインビトロでのキナーゼ活性の測定結果を示す。図２ＡはトータルＡＳを示す。図２Ｂはセリン１２９を示す。
【図３Ａ】図３Ａ乃至Ｃは各種キナーゼにおけるインビトロでのキナーゼ活性の測定結果を示す。図３ＡはトータルＡＳを示す。図３Ｂはセリン１２９を示す。図３Ｃはセリン８７を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ乃至Ｃは各種キナーゼにおけるインビトロでのキナーゼ活性の測定結果を示す。図３ＡはトータルＡＳを示す。図３Ｂはセリン１２９を示す。図３Ｃはセリン８７を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ乃至Ｃは各種キナーゼにおけるインビトロでのキナーゼ活性の測定結果を示す。図３ＡはトータルＡＳを示す。図３Ｂはセリン１２９を示す。図３Ｃはセリン８７を示す。
【図４Ａ】図４ＡおよびＢは、図３Ａおよび３Ｂのアッセイ結果に及ぼすリン脂質の影響を示す。図４ＡはトータルＡＳを示す。図４Ｂはセリン１２９を示す。
【図４Ｂ】図４ＡおよびＢは、図３Ａおよび３Ｂのアッセイ結果に及ぼすリン脂質の影響を示す。図４ＡはトータルＡＳを示す。図４Ｂはセリン１２９を示す。
【図５】図５は、ＰＬＫ２のｃＤＮＡを２９３−シヌクレイン細胞中にトランスフェクトした結果を示す。細胞は、ＥＬＩＳＡによってトータルおよびリン酸化シヌクレイン濃度について分析した。
【図６】図６は、ＧＰＲＫ６およびＰＬＫ２のｃＤＮＡをＨＥＫ−シヌクレイン細胞中にトランスフェクトした結果を示す。
【図７】図７は、別の供給源からのＰＬＫ２ ｓｉＲＮＡのノックダウンがリン酸化シヌクレインの発現の劇的な減少をもたらすことを示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂならびに９Ａおよび９Ｂは、アルファ−シヌクレインＫＯマウス脳内の推定キナーゼ標的によるアルファ−シヌクレインのインビトロ・リン酸化を示す。
【図９】図８Ａおよび８Ｂならびに９Ａおよび９Ｂは、アルファ−シヌクレインＫＯマウス脳内の推定キナーゼ標的によるアルファ−シヌクレインのインビトロ・リン酸化を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レヴィー小体病（ＬＢＤ）を治療する活性について因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）表１Ａ、Ｂ；Ｃ、表２、表１２または表１３に示したキナーゼの活性または発現を調節する因子を同定する工程、および
（ｂ）該因子がＬＢＤの動物モデルにおいて該疾患を治療するのに有用な活性を示すか否かを決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記調節が阻害である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）は、前記因子が前記キナーゼを阻害するか否かを特定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が、前記キナーゼおよび／またはアルファ−シヌクレインを発現する核酸で形質転換した細胞において行われる、請求項３の方法。
【請求項５】
前記細胞が神経細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）がインビトロで行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）がＬＢ疾患のトランスジェニック動物モデルにおいて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がヒト・アルファ−シヌクレインを発現する導入遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記アルファ−シヌクレインがアルファ−シヌクレインの家族性突然変異体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記家族性突然変異体がＡ３０Ｐ、Ａ５３ＴおよびＥ４６Ｋからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記キナーゼがＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、ＧＡＫ、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＣＫＩＩＡ２、ＣＫＩＩＡ１、ＩＫＢＫＢおよびＭＥＴからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記キナーゼがＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＣＫＩＩＡ２、ＣＫＩＩＡ１、ＩＫＢＫＢおよびＭＥＴからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記キナーゼがＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫからなる群から選ばれ、前記調節が活性化である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記キナーゼがＰＬＫ２、ＩＫＢＫＢおよびＧＲＫ６からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記キナーゼがＰＬＫ２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記キナーゼがＩＫＢＫＢである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記同定工程がシンフィリンの存在下に前記因子をＰＬＫ２蛋白質と接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）が前記トランスジェニック動物を前記因子と接触させ、該因子が、該因子を処置しなかった対照トランスジェニック動物と比べてアルファ−シヌクレインの沈着物の形成を阻害するか否かを決定することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物モデルがＡ３０Ｐ、Ａ５３ＴおよびＥ４６Ｋからなる群より選択される突然変異を有するアルファ−シヌクレイン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＬＢ疾患の治療もしくは予防を行う方法であって、
該疾患に罹患しているか罹患するリスクのある患者に対して、表１Ａ、ＢもしくはＣ、表２、表１２または表１３に示したキナーゼの活性または発現を調節するのに有効な因子の有効な療法を施行する工程を含み、該因子が
該キナーゼに対する抗体、
該キナーゼの発現を調節する亜鉛フィンガー蛋白質、
該キナーゼの核酸配列に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムもしくはＲＮＡ
である、方法。
【請求項２１】
前記調節が阻害である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記キナーゼがＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＣＫＩＩＡ２、ＣＫＩＩＡ１、ＩＫＢＫＢおよびＭＥＴからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記キナーゼがＰＬＫ２、ＩＫＢＫＢおよびＧＲＫ６からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記キナーゼがＰＬＫ２である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記キナーゼがＩＫＢＫＢである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
さらにシンフィリンの存在下にＰＬＫ２を調節する因子を特定することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記キナーゼがＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫからなる群から選ばれ、前記調節が活性化である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
アルファ−シヌクレインをリン酸化するキナーゼを同定する方法であって、
アルファ−シヌクレインを発現する細胞に対してキナーゼをコードしている遺伝子に相補的な配列を有する核酸または該遺伝子に特異的に結合する亜鉛フィンガー蛋白質をトランスフェクトする工程であって、これによって該トランスフクトされた核酸または亜鉛フィンガー蛋白質が該キナーゼの発現を阻害する、工程、および
該細胞のリン酸化アルファ−シヌクレインの量を、ｓｉＲＮＡまたは該ｓｉＲＮＡをコードしている核酸をトランスフェクトしていない対照細胞と比較して測定する工程であって、リン酸化アルファ−シヌクレインの減少が該キナーゼがアルファ−シヌクレインをリン酸化する指標を提供する、工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
さらに、前記核酸をトランスフェクトしていない対照細胞と比較して、前記細胞により産生されるアルファ−シヌクレインの量を測定することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸がｓｉＲＮＡまたは該ｓｉＲＮＡをコードしているＤＮＡ分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記アルファ−シヌクレインがアルファ−シヌクレインの家族性突然変異体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記家族性突然変異体がＡ３０Ｐ、Ａ５３ＴおよびＥ４６Ｋからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
レヴィー小体病（ＬＢＤ）を治療する活性について因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）シンフィリンの活性または発現を調節する因子を同定する工程、および
（ｂ）該因子がＬＢＤの動物モデルにおいて該疾患を治療するのに有用な活性を示すか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
Ｓｅｒ−１２９リン酸化アルファ−シヌクレインを産生するための方法であって、
細菌細胞内にアルファ−シヌクレインをコードしているプラスミドおよびＰＬＫ２をコードしているプラスミドを提供する工程、
該細胞を培養し、それにより該プラスミドが同時発現してアルファ−シヌクレインおよびＰＬＫ２を産生する工程であって、それにより該ＰＬＫ２が細菌細胞内でアルファ−スイ（ａｌｐｈａ−ｓｕｙ）をリン酸化する、工程、ならびに
該細胞からリン酸化アルファ−シヌクレインを単離する工程
を包含する、方法。
【請求項１】
レヴィー小体病（ＬＢＤ）を治療する活性について因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）表１Ａ、Ｂ；Ｃ、表２、表１２または表１３に示したキナーゼの活性または発現を調節する因子を同定する工程、および
（ｂ）該因子がＬＢＤの動物モデルにおいて該疾患を治療するのに有用な活性を示すか否かを決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記調節が阻害である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）は、前記因子が前記キナーゼを阻害するか否かを特定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が、前記キナーゼおよび／またはアルファ−シヌクレインを発現する核酸で形質転換した細胞において行われる、請求項３の方法。
【請求項５】
前記細胞が神経細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）がインビトロで行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）がＬＢ疾患のトランスジェニック動物モデルにおいて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がヒト・アルファ−シヌクレインを発現する導入遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記アルファ−シヌクレインがアルファ−シヌクレインの家族性突然変異体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記家族性突然変異体がＡ３０Ｐ、Ａ５３ＴおよびＥ４６Ｋからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記キナーゼがＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、ＧＡＫ、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＣＫＩＩＡ２、ＣＫＩＩＡ１、ＩＫＢＫＢおよびＭＥＴからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記キナーゼがＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＣＫＩＩＡ２、ＣＫＩＩＡ１、ＩＫＢＫＢおよびＭＥＴからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記キナーゼがＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫからなる群から選ばれ、前記調節が活性化である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記キナーゼがＰＬＫ２、ＩＫＢＫＢおよびＧＲＫ６からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記キナーゼがＰＬＫ２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記キナーゼがＩＫＢＫＢである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記同定工程がシンフィリンの存在下に前記因子をＰＬＫ２蛋白質と接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）が前記トランスジェニック動物を前記因子と接触させ、該因子が、該因子を処置しなかった対照トランスジェニック動物と比べてアルファ−シヌクレインの沈着物の形成を阻害するか否かを決定することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物モデルがＡ３０Ｐ、Ａ５３ＴおよびＥ４６Ｋからなる群より選択される突然変異を有するアルファ−シヌクレイン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＬＢ疾患の治療もしくは予防を行う方法であって、
該疾患に罹患しているか罹患するリスクのある患者に対して、表１Ａ、ＢもしくはＣ、表２、表１２または表１３に示したキナーゼの活性または発現を調節するのに有効な因子の有効な療法を施行する工程を含み、該因子が
該キナーゼに対する抗体、
該キナーゼの発現を調節する亜鉛フィンガー蛋白質、
該キナーゼの核酸配列に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムもしくはＲＮＡ
である、方法。
【請求項２１】
前記調節が阻害である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記キナーゼがＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＣＫＩＩＡ２、ＣＫＩＩＡ１、ＩＫＢＫＢおよびＭＥＴからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記キナーゼがＰＬＫ２、ＩＫＢＫＢおよびＧＲＫ６からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記キナーゼがＰＬＫ２である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記キナーゼがＩＫＢＫＢである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
さらにシンフィリンの存在下にＰＬＫ２を調節する因子を特定することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記キナーゼがＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３およびＧＡＫからなる群から選ばれ、前記調節が活性化である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
アルファ−シヌクレインをリン酸化するキナーゼを同定する方法であって、
アルファ−シヌクレインを発現する細胞に対してキナーゼをコードしている遺伝子に相補的な配列を有する核酸または該遺伝子に特異的に結合する亜鉛フィンガー蛋白質をトランスフェクトする工程であって、これによって該トランスフクトされた核酸または亜鉛フィンガー蛋白質が該キナーゼの発現を阻害する、工程、および
該細胞のリン酸化アルファ−シヌクレインの量を、ｓｉＲＮＡまたは該ｓｉＲＮＡをコードしている核酸をトランスフェクトしていない対照細胞と比較して測定する工程であって、リン酸化アルファ−シヌクレインの減少が該キナーゼがアルファ−シヌクレインをリン酸化する指標を提供する、工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
さらに、前記核酸をトランスフェクトしていない対照細胞と比較して、前記細胞により産生されるアルファ−シヌクレインの量を測定することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸がｓｉＲＮＡまたは該ｓｉＲＮＡをコードしているＤＮＡ分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記アルファ−シヌクレインがアルファ−シヌクレインの家族性突然変異体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記家族性突然変異体がＡ３０Ｐ、Ａ５３ＴおよびＥ４６Ｋからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
レヴィー小体病（ＬＢＤ）を治療する活性について因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）シンフィリンの活性または発現を調節する因子を同定する工程、および
（ｂ）該因子がＬＢＤの動物モデルにおいて該疾患を治療するのに有用な活性を示すか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
Ｓｅｒ−１２９リン酸化アルファ−シヌクレインを産生するための方法であって、
細菌細胞内にアルファ−シヌクレインをコードしているプラスミドおよびＰＬＫ２をコードしているプラスミドを提供する工程、
該細胞を培養し、それにより該プラスミドが同時発現してアルファ−シヌクレインおよびＰＬＫ２を産生する工程であって、それにより該ＰＬＫ２が細菌細胞内でアルファ−スイ（ａｌｐｈａ−ｓｕｙ）をリン酸化する、工程、ならびに
該細胞からリン酸化アルファ−シヌクレインを単離する工程
を包含する、方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５２５０４６（Ｐ２００９−５２５０４６Ａ）
【公表日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５３３３６（Ｐ２００８−５５３３３６）
【出願日】平成１９年１月３０日（２００７．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００２６８５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８９８６２
【国際公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【出願人】（３９９０１３９７１）エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド (75)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月３０日（２００７．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００２６８５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８９８６２
【国際公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【出願人】（３９９０１３９７１）エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド (75)
【Ｆターム（参考）】
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