アンジオポエチン１、２、及びそれらの受容体ＴＩＥ２のｓｉＲＮＡ阻害のための組成物及びその方法
【解決手段】 Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子から産生されたｍＲＮＡに特異的な低分子干渉ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉は、これらの遺伝子の発現を阻害する。例えば、炎症性及び自己免疫性疾患、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症、及び多くのタイプの癌などの、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２仲介性血管新生に関わる疾患は、前記低分子干渉ＲＮＡを投与することによって治療され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年４月１８日に出願された米国仮出願番号第６０／４６３，９８１号に対して優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、低分子干渉ＲＮＡによる、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、及びＴｉｅ２遺伝子発現の制御に関するものであり、特に、血管新生に関する疾患若しくは状態を治療することを目的としているものである。
【背景技術】
【０００３】
血管新生若しくは"新血管新生"は、既存の血管の内皮細胞（ＥＣ）からの新しい血管の形成である。この過程は、ＥＣ遊走、増殖、及び分化を含み、親血管における基底膜の限局性分解で始まる。次に、ＥＣは、親血管から間質性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へと遊走し、毛細管出芽を形成し、この毛細管出芽は細胞の継続的な遊走と増殖に起因して伸長する。
【０００４】
血管新生は、通常厳密な制御下にあり、正常条件下では、特定の限定生理的過程においてのみ起こる。例えば、血管新生は、胚形成、出産後の成長、創傷修復、及び月経の間に起こる。しかしながら、非制御血管新生は病的状態を生じ、成長中の血管は周囲の組織を破壊する若しくは悪性度を持続する。そのような病的状態は、糖尿病性網膜症、乾癬、滲出性或いは"ｗｅｔ"加齢性黄斑変性症（"ＡＭＤ"）、炎症性障害、及び全ての癌を含む。特にＡＭＤは、臨床的に重大な血管新生病である。この状態は、高齢者の片眼若しくは両眼における脈絡叢の新血管新生によって特徴付けられ、先進工業国における失明の主な原因である。
【０００５】
血管新生の鍵となる２つの制御因子は、アンジオポエチン−１（"Ａｎｇ１"）及びアンジオポエチン−２（"Ａｎｇ２"）である。Ａｎｇ１若しくはＡｎｇ２単独の阻害は新血管新生を阻止するように見えるが、これらの制御因子は、血管内皮増殖因子（"ＶＥＧＦ"）と連携して作用し血管新生を制御することができる。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＶＥＧＦは、２つのＶＥＧＦ受容体と"免疫グロブリン及び上皮細胞成長因子相同性ドメインを有するチロシンキナーゼ２（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎｓ ２）"若しくは"Ｔｉｅ２"と呼ばれている別のチロシンキナーゼとを介してＥＣに効果を発揮する（Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．１９２：１８２〜１８７）。ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＦＧＦの結合は血管新生過程を開始するために不可欠であるのに対し、Ａｎｇ１及びＡｎｇ２はＴｉｅ２へ結合し、新血管の成熟を調節する。Ａｎｇ１及びＡｎｇ２は、内皮細胞の統合性を維持することにも関与している（Ｌｏｂｏｖ ｅｔ ａｌ．(２００２)，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１２０５〜１１２１０）。以下に説明するように、Ｔｉｅ２受容体に結合し阻止する因子は、血管新生も阻害できる。
【０００６】
Ａｎｇ１及びＡｎｇ２は、個別に発現され、初期の研究では、Ａｎｇ１は新血管新生を促進し、Ａｎｇ２は血管新生アンタゴニストであると示唆されていた。しかしながら現在、Ａｎｇ２は血管の直径を増大し、基底膜のリモデリングを促進することができるという結果が示された。Ａｎｇ２は、ＶＥＧＦ存在下で、ＥＣ増殖、遊走、及び血管の出芽を誘導することも明らかになった（Ｌｏｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００２，ｓｕｐｒａ）。
【０００７】
Ａｎｇ１は、胚発生の間、特に細胞−間質（ストロマ）伝達の調節を通じて、及び血管の成熟や安定性を制御することによって、血管新生を促進すると報告されている（Ｌｉｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８８２９〜８８３４(１９９８)）。しかしながら、血管内皮におけるＡｎｇ１及びＴｉｅ２の広範囲の発現、及び静止状態の成体脈管構造におけるＴｉｅ２のリン酸化によって、Ａｎｇ１が出生後の血管新生に関与していると示唆されている（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｎｖ．Ｏｐｈｔｈａｌｍ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：３９３〜４０２）。
【０００８】
Ａｎｇ１とＴｉｅ２の詳細な発現パターンに比べて、Ａｎｇ２は、血管リモデリングの部位でのみ発現されているように見える（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．（２００３），ｓｕｐｒａ）。例えば、Ａｎｇ２発現は、月経中の卵巣、子宮及び胎盤において著しく増加した。Ａｎｇ２発現レベルも、この構造の静止状態、血管新生、血管退行のサイクルに対応する、黄体の発現の周期性パターンに従っている（すなわち、Ａｎｇ２レベルは静止状態では低く、血管新生及び退行の間では高い）（Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，ｓｕｐｒａ）。Ａｎｇ２は、ＶＥＧＦを含む低酸素サイトカインによっても誘導され、腫瘍、ＡＭＤに関連した病原性血管新生が起こっている組織、及び網膜虚血の動物モデルにおいて発現している（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｓｕｐｒａ．）。さらに、Ａｎｇ２は、虚血性網膜障害を患った患者の網膜上膜において上方制御されているが、非虚血性網膜障害の患者からの膜では上方制御されていない。しかしながら、Ａｎｇ１の発現は、虚血性若しくは非虚血性障害の患者の網膜上膜において同じである（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｓｕｐｒａ．）。
【０００９】
Ａｎｇ２及びＴｉｅ２は、高度に血管新生化された領域のＥＣにおいて共存しており、Ｔｉｅ２は、血管リモデリングの部位において過剰発現している。Ａｓａｈａｒａ Ｔ．ら（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８３：２２３〜２４０）は、Ａｎｇ１及びＡｎｇ２は、ＶＥＧＦと同様な相乗効果を有しており、マウス角膜新血管新生アッセイにおける血管新生を促進すると報告していた。従って、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２は、発生及び生体生物における正常及び病原性新血管新生の両方で重要な役割を演じている。
【００１０】
従って、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２は、病原性血管新生の治療に対する魅力的な治療標的である。例えば、Ｌｉｎ Ｐら（（１９９８），ｓｕｐｒａ）は、マウスモデルにおける腫瘍成長及び転移は、可溶性組換えＴｉｅ２受容体の発現によって阻害されることを報告した。この組換えＴｉｅ２タンパク質は、内因性Ｔｉｅ２受容体へのリガンド結合を阻止するが、Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２結合の化学量論的な減少のみを引き起こしやすい。Ｔａｋａｇｉら（２００３，ｓｕｐｒａ）は、Ｔｉｅ２の外質ドメインを有する可溶性融合タンパク質によってＴｉｅ２シグナル伝達が阻害され、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方において低酸素誘導性網膜血管新生を抑制したと報告した。Ａｓａｈａｒａら（（１９９８），ｓｕｐｒａ）は、可溶性Ｔｉｅ２受容体を投与することにより、マウス角膜における、ＶＥＧＦ誘導性新血管新生に対するＡｎｇ１若しくはＡｎｇ２の効果を消滅させることを示した。ただし、可溶性Ｔｉｅ２受容体などの因子に基づいた治療的戦略は好ましくなく、なぜならそのような因子は、高度に血管新生化された領域のＥＣでは、Ａｎｇ２若しくはＴｉｅ２が高生産されることによって圧倒される可能性が高いからである。
【００１１】
ＲＮＡ干渉（以後"ＲＮＡｉ"）は、多くの真核生物を通じて保存されている転写後遺伝子制御の方法である。ＲＮＡｉは、細胞内に存在する短い（すなわち、<３０ヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ（"ｄｓＲＮＡ"）分子によって誘導される（Ｆｉｒｅ Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６〜８１１）。これらの短ｄｓＲＮＡ分子（"低分子干渉ＲＮＡ"若しくは"ｓｉＲＮＡ"と呼ばれている）は、１ヌクレオチド分解能の精度で、前記ｓｉＲＮＡと配列相同性を共有しているメッセンジャーＲＮＡ（"ｍＲＮＡ"）の破壊を引き起こす（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１５：１８８〜２００）。このｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを切断する"ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体"若しくは"ＲＩＳＣ"と結合する。ｓｉＲＮＡは、複数回ターンオーバーする酵素のように再利用され、１個のｓｉＲＮＡ分子で、約１０００個のｍＲＮＡ分子の切断を誘導する能力を有している。従って、ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ仲介性ＲＮＡｉ分解は、標的遺伝子の発現を阻害するための現在利用可能な技術よりも効果的である。
【００１２】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭら（（２００１），ｓｕｐｒａ）は、２１及び２２ヌクレオチド長で、短い３’オーバーハングを有する合成ｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエ細胞溶解液において標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを誘導することができることを示した。培養哺乳類細胞も、合成ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ分解を示し（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｔ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４〜４９８）、合成ｓｉＲＮＡによって誘導されたＲＮＡｉ分解は、生きているマウスにおいても最近観察された（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ＡＰ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８：３８〜３９；Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０）。ｓｉＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉ分解の治療可能性は、最近いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究で示されており、これらの中にはＨＩＶ−１感染のｓｉＲＮＡ誘導性阻害（Ｎｏｖｉｎａ ＣＤ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：６８１〜６８６）や、神経毒性ポリグルタミン病タンパク質発現の減少（Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），ｓｕｐｒａ）などが含まれている。
【００１３】
従って、血管新生を効果的に減少若しくは阻止するための、触媒作用的な若しくは半化学量論的な量での、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２若しくはＴｉｅ２の発現を選択的に阻害する因子及び方法が必要とされている。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、特にＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２遺伝子を標的にし、それらのｍＲＮＡのＲＮＡｉ誘導性分解を引き起こすｓｉＲＮＡに関するものである。これらのｓｉＲＮＡは、半化学量論的な量でＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡを分解する。従って、本発明のｓｉＲＮＡ化合物及び組成物は、血管新生を阻害するために用いられる。特に、本発明のｓｉＲＮＡは、癌性腫瘍（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｔｕｍｏｒｓ）、及び加齢性黄斑変性症や糖尿病性網膜症などの眼内新血管新生に関連した障害を治療するのに有用である。
【００１５】
従って、本発明は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を標的にした単離ｓｉＲＮＡを提供する。前記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ二本鎖を形成するセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を有している。前記センスＲＮＡ鎖は、前記標的ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を有している。
【００１６】
本発明は、本発明の前記ｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミド及びウイルス性ベクターを提供し、さらに本発明のｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体とからなる薬学的組成物も提供する。
【００１７】
本発明はさらに、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、前記標的ｍＲＮＡが分解されるように、本発明の前記ｓｉＲＮＡの有効量を対象へ投与する工程を有している。
【００１８】
本発明はさらに、対象中の血管新生を阻害する方法を提供し、この方法は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を標的としたｓｉＲＮＡの有効量を対象へ投与する工程を有している。
【００１９】
本発明はさらに、血管新生病を治療する方法を提供し、この方法は、血管新生病に関連した血管新生が阻害されるように、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を標的としたｓｉＲＮＡの有効量を、そのような治療を必要としている対象へ投与する工程を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
特に指示がない限り、本明細書の全ての核酸配列は、５’から３’の方向で標示されている。また、核酸配列における全てのデオキシリボヌクレオチドは、大文字（例えばデオキシチミジンは"Ｔ"）で表されており、核酸配列における全てのリボヌクレオチドは、小文字（例えばウリジンは"ｕ"）で表されている。
【００２１】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２ ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡを有する組成物及び方法は、血管新生を阻害するために、特に血管新生病の治療に対して有利に用いられる。本発明の前記ｓｉＲＮＡは、これらのｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こし、その結果、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２遺伝子のタンパク質産生がなされない或いは少ない量で産生されると考えられる。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２は血管新生に関与するため、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ仲介性分解は、血管新生の過程を阻害する。
【００２２】
ここで用いられたように"Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡを標的とした"ｓｉＲＮＡは、二本鎖の第１鎖が、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ配列の一部のヌクレオチド配列と実質的に同一であるｓｉＲＮＡを意味している。前記ｓｉＲＮＡ二本鎖の第２鎖は、前記ｓｉＲＮＡ二本鎖の第１鎖、及びＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡの同一部分の両方に相補的であることが理解される。
【００２３】
従って、本発明は、約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド長の、好ましくは約１９〜約２５ヌクレオチド長の、前記標的ｍＲＮＡを標的とした短い二本鎖ＲＮＡを有する単離ｓｉＲＮＡを提供する。前記ｓｉＲＮＡはセンスＲＮＡ鎖と相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を有しており、これらは標準的なワトソン−クリック塩基対相互作用（以後、"塩基対"）によってアニーリングされている。以下により詳細に記載するように、前記センス鎖は、前記標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と実質的に同一である核酸配列を有している。
【００２４】
ここで用いられたように、前記標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と"実質的に同一"である核酸配列は、前記標的配列と同一である、若しくは前記標的配列と１若しくはそれ以上のヌクレオチドが異なる核酸配列である。標的配列と実質的に同一である核酸配列を有する本発明のセンス鎖は、そのようなセンス鎖を有するｓｉＲＮＡは、前記標的配列を含むｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を誘導するという点で特徴付けられる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、前記標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解が前記ｓｉＲＮＡによって誘導される範囲で、標的配列と１、２、或いは３若しくはそれ以上のヌクレオチドが異なる核酸配列を有するセンス鎖を有することができる。
【００２５】
本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、２つの相補的なＲＮＡ分子、一本鎖ＲＮＡ分子を有する、若しくは、２つの相補的部分が塩基対をなす、一本鎖"ヘアピン"領域によって共有結合的に結合している１つの分子を有している。どんな理論によっても制限されることなく、後者のタイプのｓｉＲＮＡ分子の前記ヘアピン領域は、"ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）"タンパク質（若しくはその同等物）によって細胞内で切断され、２つの個別の塩基対をなすＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられる（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），ｓｕｐｒａを参照のこと）。以下に記載されたように、前記ｓｉＲＮＡは、１若しくはそれ以上のリボヌクレオチド塩基の変化、置換、若しくは修飾も含む。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、変化、置換、若しくは修飾され、１若しくはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を含むこともできる。
【００２６】
ここで用いられたように、"単離"は、合成、若しくは自然条件から人の介入を介して変化或いは除去されたことを意味する。例えば、生きている動物中に自然に存在するｓｉＲＮＡは、"単離"されていないが、合成ｓｉＲＮＡ、若しくはその自然条件の共存物質から分離された部分的或いは完全なｓｉＲＮＡは"単離"される。単離ｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で存在する、若しくは、例えば前記ｓｉＲＮＡが運搬された細胞などの非自然環境で存在することができる。例によると、自然な過程によって細胞内部に産生されるが、"単離"された前駆体分子から産生されたｓｉＲＮＡは、それ自身"単離"された分子である。従って、単離ｄｓＲＮＡは、標的細胞へ導入され、ダイサータンパク質（若しくはその同等物）によって単離ｓｉＲＮＡへと処理される。
【００２７】
ここで用いられたように"標的ｍＲＮＡ"は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡの変異体或いは選択的スプライシング体、同族Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子からのｍＲＮＡを意味している。ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２ ｍＲＮＡ配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＹ１２４３８０、ＮＭ＿００１４７、及びＬ０６１３９に、ｃＤＮＡ同等物として記載されている。ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２ ｍＲＮＡ配列は、本明細書においてはそれぞれ配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、及び配列ＩＤ番号３で、ｃＤＮＡ同等物として表されている。当業者は、前記ｃＤＮＡ配列は、前記ｍＲＮＡと同等であり、ここでの同じ目的、すなわちＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの生成のために用いられることを理解するであろう。
【００２８】
ここで用いられたように、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２に"同族"な遺伝子若しくはｍＲＮＡは、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２に相同的である別の哺乳類種からの遺伝子若しくはｍＲＮＡである。例えば、飼い犬（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）のＡｎｇ１ ｍＲＮＡの部分配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＦ３４５９３２にｃＤＮＡ同等物として記載されており、ここでは配列ＩＤ番号４として表されている。Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）Ａｎｇ２ ｍＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＮＭ＿００７４２６にｃＤＮＡ同等物として記載されており、ここでは配列ＩＤ番号５として表されている。Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）及びＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）Ｔｉｅ２ ｍＲＮＡ配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＮＭ＿０１３６９０及びＮＷ＿０４３８５６にｃＤＮＡ同等物として記載されている。マウス及びラットＴｉｅ２ ｍＲＮＡ配列は、本明細書ではそれぞれ配列ＩＤ番号６及び配列ＩＤ番号７として表されている。
【００２９】
ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２の選択的スプライシング体も既知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＹ１２１５０４を参照すると、ヒトＡｎｇ１のスプライス変異体がｃＤＮＡ同等物として記載されている（配列ＩＤ番号８）。Ｋｉｍ Ｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２４），１８５５０〜１８５５６（２０００））及びＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＦ１８７８５８には、９６〜１４８のアミノ酸が欠如したＡｎｇ２タンパク質をコード化したＡｎｇ２スプライス変異体が、ｃＤＮＡ同等物として記載されている（配列ＩＤ番号９）。さらに、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＢ０８６８２５を参照すると、上皮細胞成長因子様ドメインが欠如したＴｉｅ２タンパク質をコード化したＴｉｅ２のスプライス変異がｃＤＮＡ同等物として記載されている（配列ＩＤ番号１０）。
【００３０】
ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、本分野では良く知られた技術を用いて、選択的スプライシング体でも解析される。そのような技術は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、及びｉｎ−ｓｉｔｕ（生体内原位置）ハイブリダイゼーションが含まれる。ｍＲＮＡ配列を解析するための技術は、例えば、Ｂｕｓｔｉｎｇ ＳＡ（（２０００），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１６９〜１９３）に記載されており、その全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。選択的スプライシングｍＲＮＡを同定するための代表的な技術も、以下に記載されている。
【００３１】
例えば、既知の疾患遺伝子に関連したヌクレオチド配列を有するデータベースは、選択的スプライシングｍＲＮＡを同定するために用いられ得る。そのようなデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｅｍｂａｓｅ、及びＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）データベースを含む。例えば、ＣＧＡＰデータベースは、ヒト癌の様々なタイプの発現遺伝子配列断片（ＥＳＴｓ）を含む。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２のｍＲＮＡ若しくは遺伝子配列は、選択的スプライシングｍＲＮＡを表すＥＳＴｓが発見されるかどうか決定するために、そのようなデータベースをクエリーするために用いられ得る。
【００３２】
"ＲＮＡｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（ＲＮＡ分解酵素保護）"と呼ばれる技術も、選択的スプライシングＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡを同定するために用いられ得る。ＲＮＡｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎは、合成ＲＮＡへの遺伝子配列の翻訳を含み、他の細胞、例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を発現するように誘導された細胞から由来したＲＮＡへハイブリダイズされる。ハイブリダイズされたＲＮＡは、次にＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドミスマッチを認識する酵素と共にインキュベートされる。予想される断片より小さいということは、選択的スプライシングｍＲＮＡが存在することを示している。推定上の選択的スプライシングｍＲＮＡは、クローン化され、当業者には良く知られた方法によって配列決定される。
【００３３】
ＲＴ−ＰＣＲも、選択的スプライシングＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡを同定するために用いられ得る。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、血管内皮細胞若しくはＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を発現すると知られている他の組織の細胞からのｍＲＮＡは、本分野の範囲内である方法を用いて、酵素である逆転写酵素によってｃＤＮＡへ変換される。ｃＤＮＡの完全コード配列は、次に３’非翻訳領域に位置するフォワード（前方向）プライマーと、５’非翻訳領域に位置するリバース（逆方向）プライマーＰＣＲによって増幅される。増幅産物は、例えば、増幅産物のサイズと、正常にスプライシングされたｍＲＮＡからの予想産物のサイズとを、例えばアガロースゲル電気泳動によって比較することで、選択的スプライシング体が解析される。増幅産物のサイズにおける全ての変化は、選択的スプライシングを示している。
【００３４】
変異Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子から産生されたｍＲＮＡも、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２選択的スプライシング体を同定するための上述した技術によって容易に同定され得る。ここで用いられたように"変異"Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子若しくはｍＲＮＡは、ここにおいて説明された前記Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２配列とは配列の点で異なる、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子若しくはｍＲＮＡを含む。従って、前記Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子、若しくはそれらから産生されたｍＲＮＡの対立遺伝子体は、本発明の目的によると"変異体"であると考えられる。さらに、国際特許第ＷＯ０２／２０７３４号公報を参照すると、Ｔｉｅ２のいくつかの変異体が記載されており、それらのうち１つはＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＸ３９８３５６に記載されている。また、本明細書ではｃＤＮＡ同等物として配列ＩＤ１１に表している。
【００３５】
ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡは、その代表的な選択的スプライシング体、同族体、若しくは変異体と共通した標的配列を含むことが理解される。従って、そのような共通標的配列を有する単一ｓｉＲＮＡは、前記共通標的配列を含むそれら異なるｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を誘導することができる。
【００３６】
本発明のｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、若しくは組換え的に産生されたＲＮＡ、さらに１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換及び／若しくは変更によって天然由来のＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含むことができる。そのような改変は、前記ｓｉＲＮＡの末端或いは前記ｓｉＲＮＡの１若しくはそれ以上の内部ヌクレオチドなどへの非ヌクレオチド物質の付加、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に耐性にする修飾（例えば、２’−置換リボヌクレアーゼの使用、或いは糖リン酸バックボーンへの修飾など）、若しくは前記ｓｉＲＮＡにおける１若しくはそれ以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレアーゼでの置換、を含むことができる。血清、涙液（ｌａｃｈｒｙｍａｌ ｆｌｕｉｄ）、或いはヌクレアーゼが豊富な環境に曝されたｓｉＲＮＡ、若しくは局所的に運搬された（例えば目薬などによって）ｓｉＲＮＡは、好ましくはそれらのヌクレアーゼ分解に対する耐性が増加するように改変されている。例えば、血管内に、或いは眼へ局所的に投与されるｓｉＲＮＡは、１若しくはそれ以上のホスホロチオネート結合を有することができる。
【００３７】
本発明のｓｉＲＮＡの１若しくは両方の鎖は、３’オーバーハングも有することができる。ここで用いられたように、"３’オーバーハング"は、ＲＮＡ鎖の３’末端から延びる少なくとも１つの不対ヌクレオチドを言及している。
【００３８】
従って、１実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの１〜約６ヌクレオチド長、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２〜約４ヌクレオチド長の３’オーバーハング（これはリボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドを有する）を有している。
【００３９】
ｓｉＲＮＡ分子の両鎖に３'オーバーハングを有している実施形態において、前記オーバーハングの長さは、各鎖で同じ若しくは異なってもよい。最も好ましい実施形態において、前記３’オーバーハングは、前記ｓｉＲＮＡの両鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば、本発明の前記ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（"ＴＴ"）若しくはジウリジル酸（"ｕｕ"）の３’オーバーハングを有することができる。
【００４０】
本発明のｓｉＲＮＡの安定性を増強するために、前記３’オーバーハングは、分解に対しても安定化される。１実施形態において、前記オーバーハングは、アデノシン或いはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことによって安定化されている。
或いは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換（例えば、３’オーバーハングにおける２’−デオキシチミジンでのウリジンヌクレオチドの置換）は、許容性を示し、ＲＮＡｉ分解の効率には影響を与えない。特に、２’−デオキシチミジンにおける２’−ヒドロキシの非存在は、組織培養液において３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性を著しく増強する。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ若しくはＮＡ（Ｎ２１）の配列を有しており、ここでＮはあらゆるヌクレオチドである。これらのｓｉＲＮＡは、約３０〜７０％のＧ／Ｃを有しており、好ましくは約５０％のＧ／Ｃを有している。前記センスｓｉＲＮＡ鎖の配列はそれぞれ、（Ｎ１９）ＴＴ若しくはＮ２１に対応する（すなわち３〜２３位）。後者の場合、前記センスｓｉＲＮＡ鎖の３’末端は、ＴＴに変換されている。この配列変換の原理は、前記センス及びアンチセンス鎖３’オーバーハングの配列組成に関して対称的な二本鎖を生成することである。次に、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は、前記センス鎖の１〜２１位に対して相補的に合成される。
【００４２】
これらの実施形態における前記２３ヌクレオチドセンス鎖の１位は、前記アンチセンス鎖によって配列特異的に認識されないため、前記アンチセンス鎖の３’−ヌクレオチド残基のほとんどは、慎重に選択される。しかしながら、前記アンチセンス鎖の最後から２番目のヌクレオチド（どの実施形態においても前記２３−ヌクレオチドセンス鎖の２位に相補的である）は、一般的に前記標的配列に相補的である。
【００４３】
別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、ＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮの配列を有しており、ここでＲはプリン（例えばＡ或いはＧ）であり、Ｙはピリミジン（例えばＣ或いはｕ／Ｔ）である。従って、この実施形態の代表的な２１−ヌクレオチドセンス及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、一般的にプリンヌクレオチドで始まる。そのようなｓｉＲＮＡは、最初に転写されたヌクレオチドがプリンである場合、ｐｏｌＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現のみが有効であると考えられている時、ターゲティング部位における変更なしに、ｐｏｌＩＩＩ発現ベクターから発現され得る。
【００４４】
本発明のｓｉＲＮＡは、いくつかの標的ｍＲＮＡ配列（前記"標的配列"）における約１９〜２５近接ヌクレオチドの任意のストレッチ（伸展）を標的にすることができる。ｓｉＲＮＡの標的配列を選択する技術は、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ Ｔらの"Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ"（２００２年１０月１１日改訂）において記載されており、この全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。"Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ"は、Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ Ｔｕｓｃｈｌ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡＧ １０５，Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７０７７ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって維持されているウェブサイトで利用可能であり、さらに、Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトにアクセスし、キーワード"ｓｉＲＮＡ"で検索すると見つけることができる。従って、本発明のｓｉＲＮＡの前記センス鎖は、前記標的ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５ヌクレオチドの任意の近接ストレッチと実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する。
【００４５】
一般的に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、前記標的ｍＲＮＡに一致するように、好ましくは開始コドンから５０〜１００ｎｔ下流（すなわち３’方向で）で開始するように、定められたｃＤＮＡ配列から選択され得る。ただし、前記標的配列は、５’或いは３’非翻訳領域に、若しくは開始コドン近隣の領域に位置付けされ得る。例えば、ヒトＡｎｇ２ ｃＤＮＡ配列における適切な標的配列は、
【００４６】
【化１】
【００４７】
従って、配列ＩＤ番号１２を標的とし、３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００４８】
【化２】
【００４９】
配列ＩＤ番号１２を標的とするが、３’ＴＴオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００５０】
【化３】
【００５１】
ヒトＡｎｇ２ ｃＤＮＡ配列からの別の標的配列は、
【００５２】
【化４】
【００５３】
従って、配列ＩＤ番号１７を標的とし、３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００５４】
【化５】
【００５５】
配列ＩＤ番号１７を標的とするが、３’ＴＴオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００５６】
【化６】
【００５７】
ヒトＡｎｇ１ ｃＤＮＡ配列における適切な標的配列は、
【００５８】
【化７】
【００５９】
従って、配列ＩＤ番号２２を標的とし、３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００６０】
【化８】
【００６１】
配列ＩＤ番号２２を標的とするが、３’ＴＴオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００６２】
【化９】
【００６３】
ヒトＡｎｇ１ ｃＤＮＡからの別の標的配列は、
【００６４】
【化１０】
【００６５】
配列ＩＤ番号２７を標的とするが、３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００６６】
【化１１】
【００６７】
配列ＩＤ番号２７を標的とするが、３’ＴＴオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００６８】
【化１２】
【００６９】
本発明のｓｉＲＮＡを導くことができる別のＡｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２標的配列は、ここに示したものを含む。適切なヒトＡｎｇ１標的配列は、配列ＩＤ番号３２〜２２７を含み、適切なヒトＡｎｇ２標的配列は、配列ＩＤ番号２２８〜４２７を含み、適切なヒトＴｉｅ２標的配列は、配列ＩＤ番号４２８〜７３９を含む。ここに示された前記標的配列は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｃＤＮＡを参照しており、従ってこれらの配列は、"Ｔ"で表されたデオキシチミジンを含むことが理解される。当業者は、前記ｍＲＮＡの実際の標的配列において、デオキシチミジンは、ウリジン（"ｕ"）で置換され得ることが理解されるであろう。同様に、本発明のｓｉＲＮＡ内に含まれる標的配列は、デオキシチミジンの代わりにウリジンも含むことができる。
【００７０】
本発明のｓｉＲＮＡは、当業者に知られた多くの技術を用いて得られる。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、化学的に合成される、若しくは、ショウジョウバエｉｎ ｖｉｔｒｏシステム（Ｔｕｓｃｈｌらの米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号に記載されており、その全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）など、本分野で知られた方法を用いて組換え技術的に産生される。
【００７１】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト、及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学的に合成される。前記ｓｉＲＮＡは、２つの分離した相補的ＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として合成され得る。合成ＲＮＡ分子若しくは合成試薬の商業的供給元としては、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，コロラド州、米国）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、バージニア州、米国）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、マサチューセッツ州、米国）及びＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，英国）を含む。
【００７２】
或いは、ｓｉＲＮＡは、任意の適切なプロモーターを用いて、組換え環状若しくは直線ＤＮＡプラスミドからも発現され得る。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現するために適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、及びサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技術範囲内である。本発明の前記組換えプラスミドは、特定の組織内若しくは特定の細胞内環境において、前記ｓｉＲＮＡの発現を誘導可能な或いは制御可能なプロモーターも有することができる。
【００７３】
組換えプラスミドから発現された前記ｓｉＲＮＡは、標準的な技術によって培養細胞発現システムから単離され得る、若しくは細胞内的に発現され得る。本発明の前記ｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで細胞へ運搬するための組換えプラスミドの使用は、以下により詳細に説明されている。
【００７４】
本発明のｓｉＲＮＡは、組換えプラスミドから２つの分離した相補的ＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として発現され得る。
【００７５】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するために適したプラスミドの選択、前記ｓｉＲＮＡを発現するために前記プラスミドへ核酸配列を挿入するための方法、及び目的の細胞へ前記組換えプラスミドを運搬する方法は、当業者の技術の範囲内である。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６〜４４８、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ＴＲ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０〜５５３、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７〜５００、Ｐａｄｄｉｓｏｎ ＰＪ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：９４８〜９５８、Ｌｅｅ ＮＳ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００〜５０５、及びＰａｕｌ ＣＰ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５〜５０８を参照のこと。また、これらの全体の開示は、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７６】
１実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡを発現するプラスミドは、ヒトＵ６ ＲＢＡプロモーターの制御下で、ｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化するセンスＲＮＡ鎖と、ヒトＵ６ ＲＢＡプロモーターの制御下で、ｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化するアンチセンスＲＮＡ鎖とを有している。そのようなプラスミドは、本発明のｓｉＲＮＡを発現するための組換えアデノ随伴ウイルスベクターを産生する際に用いられ得る。
【００７７】
ここで用いられたように、"ｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した"とは、前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖をコード化した核酸配列が、５’方向で前記ｐｏｌｙＴ終止シグナルにすぐに隣接していることを意味している。前記プラスミドからの前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖の転写の間、前記ｐｏｌｙＴ終止シグナルは、転写を終了するように働く。
【００７８】
ここで用いられたように、プロモーターの"制御下"とは、前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖をコード化した核酸配列は、前記プロモーターが前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖コード配列の転写を開始できるように、前記プロモーターの３’に位置付けられていることを意味する。
【００７９】
本発明のｓｉＲＮＡは、組換えウイルスベクターから細胞内にｉｎ ｖｉｖｏで発現され得る。本発明の前記組換えウイルスは、本発明のｓｉＲＮＡをコード化した配列と、前記ｓｉＲＮＡを発現するための適切なプロモーターとを有している。適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、及びサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技術範囲内である。本発明の前記組換えウイルスは、特定の組織内若しくは特定の細胞内環境において前記ｓｉＲＮＡの発現を誘導可能若しくは制御可能なプロモーターも有することができる。本発明のｓｉＲＮＡを細胞へｉｎ ｖｉｖｏで運搬するための組換えウイルスの使用は、以下により詳細に説明されている。
【００８０】
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離された相補的ＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として、組換えウイルスベクターから発現され得る。
【００８１】
発現される前記ｓｉＲＮＡ分子に対するコード配列を許容する能力を有するウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス、及びその同等物から由来したベクターが用いられ得る。ウイするベクターの指向性は、エンベロープタンパク質を有する前記ベクターのシュードタイピング、或いは他のウイルスからの他の表面抗原によって、若しくは異なるウイルスキャプシドタンパク質で置換することによって、適切に修飾され得る。
【００８２】
例えば、本発明のレンチウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ（Ｍｏｋｏｌａ）、及びその同等物からの表面タンパク質でシュードタイピング化され得る。本発明のＡＡＶベクターは、異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することによって異なる細胞を標的にするように作成され得る。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２キャプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ ２／２ベクターにおけるこの血清型２キャプシド遺伝子は、血清型５キャプシド遺伝子によって置換され、ＡＡＶ ２／５ベクターを産生する。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、当業者の技術範囲内であり、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１〜８０１を参照のこと（この全体の開示は、この参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
本発明の使用に適した組換えウイルスベクターの選択、前記ｓｉＲＮＡを発現するために核酸配列をベクターへ挿入する方法、及び前記ウイルスベクターを目的の細胞へ運搬する方法は、当業者の技術範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１〜３１０、Ｅｇｌｉｔｉｓ ＭＡ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８〜６１４、Ｍｉｌｌｅｒ ＡＤ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５〜１４、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＷＦ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５〜３０、及びＲｕｂｉｎｓｏｎ ＤＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１〜４０６を参照し、これら全体の開示は、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８４】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶ及びＡＶＶから由来したものである。特に好ましい実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離された相補的一本鎖ＲＮＡ分子として、例えばＵ６或いはＨ１ ＲＮＡプロモーター、若しくはサイトメガロウイルス（ＡＭＶ）プロモーターを有する組換えＡＡＶベクターから発現される。
【００８５】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するのに適切なＡＶベクター、前記組換えＡＶベクターを構築するための方法、及び標的細胞へ前記ベクターを運搬するための方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０に記載されている。
【００８６】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するために適切なＡＶベクター、前記組換えＡＶベクターを構築するための方法、及び、標的細胞へ前記ベクターを運搬するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６〜３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ ＫＪ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０〜５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２６、米国特許番号第５，２５２，４７９号、米国特許番号第５，１３９，９４１号、国際特許番号第ＷＯ ９４／１３７８８号明細書、及び国際特許番号第ＷＯ ９３／２４６４１号明細書に記載されており、これら全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
前記標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こす所定の標的配列を含むｓｉＲＮＡの能力は、細胞内のＲＮＡ若しくはタンパク質のレベルを測定するための標準的な技術を用いて評価され得る。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、培養細胞へ運搬され得、標的ｍＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット或いはドットブロッティング技術によって、若しくは定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定され得る。或いは、培養細胞におけるＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡ若しくはウエスタンブロットによって測定され得る。培養細胞へのｓｉＲＮＡの運搬に適切なプロトコール、及び培養細胞内におけるタンパク質及びｍＲＮＡレベルを検出するためのアッセイは、以下の実施例に示されている。
【００８８】
例えば、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を自然に発現した細胞、若しくは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を発現するように誘導された細胞は、例えば、１２或いは２５ウェル培養プレート或いは９６ウェルマイクロタイタープレートなどの適切な細胞培養容器においてコンフルエンスまで増殖される。本発明のｓｉＲＮＡは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２発現細胞の第１の群へ投与され得る。非特異的ｓｉＲＮＡ（若しくはｓｉＲＮＡなし）は、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２発現細胞の第２の群へ、対照として投与され得る。前記細胞は洗浄され、マイクロタイタープレートウェルへ１〜２％パラホルムアルデヒドで直接固定される。マイクロタイタープレートの非特異的結合部位は、２％ウシ血清アルブミンでブロックされ、前記細胞は、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２若しくはＴｉｅ２特異的モノクローナル抗体とインキュベートされる、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２抗体の結合は、例えば、１：１０００倍希釈のビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，メリーランド州）と１時間３７℃で、さらに１：１０００倍希釈のベータ−ガラクトシダーゼ共役ストレプトアビジン（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１時間３７℃でインキュベーションすることによって検出され得る。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２特異的モノクローナル抗体へのベータ−ガラクトシダーゼ結合の量は、例えば、マイクロタイタープレートを３．３ｍＭ クロロフェノールレッド−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２の溶液（ｐＨ７．２）中、２〜１５分３７℃で展開し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて５７５ｎＭで結合した抗体の濃度を測定することによって決定される。
【００８９】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２発現を下方制御する本発明のｓｉＲＮＡの能力も、当業者の技術範囲内の技術を用いて、ウシ網膜内皮細胞（ＢＲＥＣｓ）による管腔形成を測定することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで評価され得る。管腔形成の阻害は、本発明のｓｉＲＮＡによるＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２の下方制御を示している。
【００９０】
適切なＢＲＥＣ管腔形成アッセイは、５．５ｍＭ グルコース、１０％血小板由来ウマ血清（ＰＤＨＳ；Ｗｈｅａｔｏｎ，Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ，ペンシルバニア州）、５０ｍｇ／ｍＬヘパリン、及び５０Ｕ／ｍＬ内皮細胞増殖因子（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むフィブロネクチン−コーティングディッシュ上でＢＲＥＣｓを培養する工程を有する。管腔形成アッセイで使用するのに適したＢＲＥＣｓは、因子ＶＩＩＩ抗原に対する免疫反応性によって内皮均一性を示し、光学顕微鏡で確認されたように、これらの条件下で形態学的に変化せずにいるものである。
【００９１】
管腔形成アッセイは、Ｋｉｎｇ ＧＬ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：１０２８〜１０３６（１９８５）、及びＯｔａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８２：６１９〜６２８（１９９８）に記載されたように実行され得、これら全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。簡潔には、５マイクログラム／ｍＬフィブロネクチン及び５マイクログラム／ｍＬラミニンを含む、１０Ｘ ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）中にＶｉｔｒｏｇｅｎ １００（Ｃｅｌｔｒｉｘ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，カリフォルニア州）、０．２Ｎ ＮａＯＨ、及び２００ｍＭ ＨＥＰＥＳを８：１：１（４００マイクロリットル）で含む混合液を２４ウェルプレートに添加する。ゲルの重合後、１．０ｘ１０５の培養ＢＲＥＣｓを前記ウェルへ播種し、２０％ ＰＤＨＳを含むＤＭＥＭで２４時間３７℃でインキュベートした。当業者には既知であるように、その形状と管の長さを最適化するために細胞数を数えた（Ｋｉｎｇ ＧＬ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ｓｕｐｒａ、及びＯｔａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ｓｕｐｒａを参照のこと）。次に培地を除去し、追加のコラーゲンゲルを細胞層の上へ投入した。ＢＲＥＣｓによって形成された管状構造の表面積あたりの密度を測定するために、コラーゲンゲルになる前に、各ウェルの底の中央領域に基準点をランダムにマークした。次に、ＶＥＧＦ若しくは低酸素条件培地を前記ウェルに添加し、管腔形成を誘導した。次に、本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡは、任意の最適な手順によって（以下参照）特定のウェルのＢＲＥＣｓへ導入された。他のウェルは、対照として、ｓｉＲＮＡなし若しくは非特異的ｓｉＲＮＡで処理された。対照ウェルと比較した場合の、ｓｉＲＮＡで処理されたウェルにおける管腔形成の阻害は、標的ＲＮＡの発現が阻害されたことを示している。
【００９２】
本発明のｓｉＲＮＡによるＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解は、網膜症の未熟度（"ＲＯＰ"）若しくは脈絡叢新血管新生（"ＣＮＶ"）ラット或いはマウスモデルなどの、新血管新生の動物モデルでも評価され得る。例えば、ＣＮＶラット或いはマウスにおける新血管新生の領域は、以下の実施例６にあるように、本発明のｓｉＲＮＡの投与前後で測定され得る。前記ｓｉＲＮＡの投与による新血管新生領域の減少は、標的ｍＲＮＡの下方制御、及び血管新生の阻害を示している。標的ｍＲＮＡの下方制御及び血管新生の阻害は、以下のような、ストレプトゾトシン誘導糖尿病性網膜症ラットモデル（実施例３）、ＶＥＧＦ誘導網膜血管透過性及び白血球増多症（ｌｅｕｋｏｓｔａｓｉｓ）のラットモデル（実施例４）、及び角膜／角膜縁損傷によって誘導された眼球新血管新生のラットモデル（実施例５）でも例示されている。
【００９３】
Ｔａｋａｇｉら（２００３，ｓｕｐｒａ）で記載されたように、虚血誘導網膜新血管新生のマウスモデルは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２の本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ仲介性分解を検出するためにも用いられ得る。簡潔には、７日齢（"出産後日数７"若しくは"Ｐ７"）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのリターは、７５％±２％酸素に５日間さらされ、次にＰ１２で部屋の空気に戻され、網膜新血管新生を形成した。部屋の空気で維持された同年齢のマウスは、対照として用いた。最大網膜新血管新生は、一般的にＰ１７で観察され、５日後部屋の空気に戻された。本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡは、網膜下で各処理動物の１つの眼に、Ｐ１２とＰ１４で注入された。ｓｉＲＮＡなし、若しくは非特異的ｓｉＲＮＡは、反対側の眼に対象として注入された。Ｐ１７で、前記マウスはＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（１ｍＬ）による心臓灌流によって殺戮され、眼は脱核され、パラフィン包埋する前に、４％パラフォルムアルデヒドによって、４℃、オーバーナイトで固定された。前記パラフィン包埋された眼の連続的な切片は、網膜における新血管新生の程度を観察するために得られる。対照と比較した場合、本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡで処理された眼の網膜における新血管新生の減少は、標的ｍＲＮＡの発現の阻害を示している。
【００９４】
上で議論したように、本発明のｓｉＲＮＡは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体のＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こすことができる。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及び／若しくはＴｉｅ２遺伝子からの機能的遺伝子の産生を減少する。従って、本発明は、対象におけるＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、標的ｍＲＮＡが分解されるように、本発明のｓｉＲＮＡの有効量を対象へ投与する工程を有している。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２遺伝子の産生が血管新生に関与しているので、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解による、対象における血管新生を阻害する方法も提供する。
【００９５】
本発明の方法の実施において、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡに異なる標的配列を有する２若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡは、対象に投与され得る。同様に、異なる標的ｍＲＮＡ（すなわち、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２ ｍＲＮＡ）からの標的配列をそれぞれ有している２若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡは、対象へ投与され得る。
【００９６】
上述したように、Ｔｉｅ２と結合したＡｎｇ１若しくはＡｎｇ２は、ＶＥＧＦ存在下で血管新生を促進するように見え、Ｔｉｅ２と結合したＡｎｇ２は、低酸素条件下で血管新生を促進するように見える。しかしながら、ＶＥＧＦ及び／若しくは低酸素条件がＡｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２仲介性血管新生に必要とされているかどうかは、明らかではない。従って、本発明の方法の実施において、ＶＥＧＦ若しくは低酸素の存在を検証する必要はない。
【００９７】
ここで用いられたように、"対象"とは、ヒト、若しくは非ヒト動物を含む。好ましくは、前記対象はヒトである。
【００９８】
ここで用いられたように、ｓｉＲＮＡの"有効量"とは、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こすのに十分な量、若しくは対象内の血管新生の進行を阻害するのに十分な量である。
【００９９】
前記標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解は、上述したように、ｍＲＮＡ若しくはタンパク質を単離し定量するための標準的な技術を用いて、対象の細胞内の前記標的ｍＲＮＡ若しくはタンパク質のレベルを測定することによって検出され得る。
【０１００】
血管新生の阻害は、対象における病原性若しくは非病原性血管新生の進行を直接測定することによって、例えば、本発明のｓｉＲＮＡで処理する前後の新血管新生領域のサイズを観察することによって、評価され得る。もし新血管新生領域のサイズが同じ若しくは減少していれば、血管新生の阻害を示している。対象内の新血管新生領域のサイズを観察し測定するための技術は、当業者の技術範囲内であり、例えば、脈絡叢新血管新生の領域は検眼鏡検査によって観察され得る。
【０１０１】
血管新生の阻害は、血管新生に関連した病的状態の変化若しくは逆転を観察することを通じても推測され得る。例えば、ＡＭＤにおいて、失明の遅延、停止、若しくは逆転は、脈絡叢における血管新生の阻害を示している。腫瘍に対しては、腫瘍成長の遅延、停止、或いは逆転、若しくは腫瘍転移の遅延或いは停止は、腫瘍部位での若しくはその周辺での血管新生の阻害を示している。非病原性血管新生の阻害は、例えば、本発明のｓｉＲＮＡの投与に対して脂肪消失若しくはコレステロールレベルの減少などからも推測され得る。
【０１０２】
本発明のｓｉＲＮＡは、半化学量論的な量で、ＲＮＡ干渉を仲介（及び血管新生を阻害）できることが理解される。あらゆる理論で束縛されることなく、本発明のｓｉＲＮＡは、触媒作用的方法で前記標的ｍＲＮＡを分解するためにＲＩＳＣを誘導すると考えられる。従って、細胞接着若しくは細胞接着仲介性病状に対する標準的な治療法と比較して、治療的効果を得るために必要とされる、対象に投与するｓｉＲＮＡは著しく少ない。
【０１０３】
当業者は、対象のサイズ及び体重、新血管新生の程度若しくは病状進行度、年齢、対象の健康や性別、投与経路、及び、投与が局所的か全身的かどうか、などの要因を考慮にいれることによって、ある対象に投与される本発明のｓｉＲＮＡの有効量を容易に決定できる。一般的に、本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、新血管新生部位或いはその周辺の細胞間濃度で約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭを含む。特に好ましい本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、新血管新生部位或いはその周辺の細胞間濃度で約１ｎＭ、約５ｎＭ、若しくは約２５ｎＭを含むことができる。ｓｉＲＮＡのより多くの或いはより少ない有効量を投与され得ることも考えられる。
【０１０４】
本発明の方法は、非病原性な血管新生、すなわち、対象における正常な過程に起因する血管新生を阻害するために用いられ得る。非病原性血管新生の例としては、子宮内膜新血管新生、及び脂肪組織或いはコレステロールの産生に関与する過程などがある。従って、本発明は、例えば、体重をコントロールする或いは脂肪消失を促進する、コレステロールレベルを減少する、月経周期の阻害、若しくは堕胎薬としてなどの目的で、非病原性血管新生を阻害するための方法を提供する。
【０１０５】
本発明の方法は、血管新生病、すなわち、病原性が不適切な或いは無制御な血管新生を導く疾患、に関連した血管新生も阻害することができる。例えば、多くの癌性固体腫瘍は、その主要部位やその周辺に血管新生を誘導することによって、それら自身のために十分な血液供給を生む。この腫瘍誘導性血管新生は、腫瘍成長にしばしば必要とされ、転移細胞が血流に入ることを可能にする。
【０１０６】
他の血管新生病は、ＡＭＤ、乾癬、リウマチ性関節炎、及び他の炎症性疾患を含む。これらの疾患は、新血管新生の領域における新しい血管の形成によって起こる正常組織の破壊によって特徴付けられる。例えば、ＡＭＤのｗｅｔ型において、脈絡叢は毛細血管に浸潤され破壊されている。ＡＭＤにおける脈絡叢の血管新生−駆動型の破壊は、最終的に部分的或いは完全な失明を引き起こす。
【０１０７】
別の実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解によって、Ｉ型糖尿病から生じる合併症を有する対象を治療する方法を提供する。好ましくは、本発明の方法によって治療されるＩ型糖尿病から生じた合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性腎症、及び大血管性疾患（冠動脈疾患、脳血管疾患、及び末梢血管疾患）である。
【０１０８】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、例えば、乳癌、肺癌、頭頚部癌、脳癌、腹腔癌、大腸癌、直腸結腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌（例えば黒色腫）、リンパ腫、及び血液癌などの癌に関連した固体腫瘍の成長若しくは転移を阻害するために用いられる。
【０１０９】
より好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性腎症、及び大血管性疾患などのＩ型糖尿病から生じる合併症を治療するために用いられる。
【０１１０】
特に好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、例えば、ＡＭＤにおける脈絡叢新血管新生を阻害するためなど、眼球新血管新生を阻害するために用いられる。
【０１１１】
血管新生病を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡは、本発明のｓｉＲＮＡとは異なる医薬品との組み合わせで、対象に投与され得る。或いは、本発明のｓｉＲＮＡは、血管新生病を治療するように設計された別の治療方法と組合わせて、対象に投与され得る。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、癌を治療するために或いは腫瘍転移を阻止するために従来用いられている治療方法（例えば、放射線療法、化学療法、及び手術）と組合わせて投与され得る。腫瘍を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、放射線療法を組合わせて、若しくはシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、若しくはタモキシフェンなどの化学療法薬と組合わせて、対象へ投与される。
【０１１２】
本発明において、本発明のｓｉＲＮＡは、裸のｓｉＲＮＡとして、運搬試薬と併せて、若しくは前記ｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミド或いはウイルス性ベクターとして、対象へ投与され得る。
【０１１３】
本発明のｓｉＲＮＡと併せて投与するための適切な運搬試薬は、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、或いはポリカチオン（例えば、ポリリシン）、若しくはリポソームを含む。好ましい運搬試薬は、リポソームである。
【０１１４】
リポソームは、網膜若しくは腫瘍組織など、特定の組織への前記ｓｉＲＮＡの運搬に役立ち、前記ｓｉＲＮＡの血液半減期も増加する。本発明における使用に適したリポソームは、中性若しくは負に荷電したリン脂質やコレステロールなどのステロールを一般的に含む、標準的なベシクル（小胞）形成脂質から形成される。脂質の選択は、望ましいリポソームサイズや血流におけるリポソームの半減期などの要因を考慮することによって一般的に導かれる。リポソームを調整するための様々な方法は既知であり、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．２：４６７、及び米国特許番号第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号に記載されており、これら全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを被包するリポソームは、血管新生部位で或いはその周辺でＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を発現している内皮細胞などの細胞を前記リポソームが標的とすることができるようなリガンド分子を有している。例えば、ＥＣ表面の抗原に結合したモノクローナル抗体などの、血管ＥＣに広く存在する受容体（レセプター）に結合したリガンドが好ましい。
【０１１６】
特に好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを被包する前記リポソームは、単核マクロファージ及び細網内皮性システムによって排除されることを避けるために、例えば、構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有するように、修飾される。１実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部位とリガンドの両方を有することができる。
【０１１７】
本発明のリポソームを調整する際に用いるオプソニン化阻害部位は、リポソーム膜に結合された一般的に大きい親水性ポリマーである。ここで用いられたように、例えば、膜自体へ脂質可溶性アンカーを挿入することによって、或いは、膜脂質の活性基へ直接結合することによって、それが前記膜に化学的に若しくは物理的に接着した場合、オプソニン化阻害部位は、リポソーム膜に"結合されている"。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、マクロファージ−単球システム（"ＭＭＳ"）及び、細網内皮性システム（"ＲＥＳ"）によるリポソームの取り込みを著しく減少する保護表面層を形成する（例えば、米国特許番号第４，９２０，０１６号に記載されており、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。従って、オプソニン化阻害部位で修飾されたリポソームは、修飾されていないリポソームより、より長く循環する。この理由のために、そのようなリポソームは、時々"ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）"リポソームと呼ばれる。
【０１１８】
ステルスリポソームは、多孔性若しくは"漏出性"の微小血管系から栄養を供給されている組織内で蓄積することで知られている。従って、そのような微小血管系の欠損によって特徴付けられている組織、例えば固体腫瘍などは、これらリポソームを効果的に蓄積するであろう（Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，１８：６９４９〜５３を参照のこと）。加えて、ＲＥＳによって減少された取り込みは、肝臓や脾臓における深刻な蓄積を阻害することによって、ステルスリポソームの毒性を低くする。従って、オプソニン化阻害部位で修飾された本発明のリポソームは、本発明のｓｉＲＮＡを腫瘍細胞へ運搬するために特に適している。
【０１１９】
リポソームを修飾するために適したオプソニン化阻害部位は、好ましくは約５００〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、若しくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体、例えば、メトキシＰＥＧ、及びＰＥＧ或いはＰＰＧステアレート、ポリアクリルアミド或いはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー、直線、分岐、或いはデンドリメリック（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ）ポリアミドアミン、ポリアクリル酸、例えばカルボキシル基或いはアミノ基が化学的に結合されたポリビニルアルコールやポリキシリトールなどのポリアルコール、及びガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドを含む。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、若しくはメトキシＰＥＧのコポリマー、若しくはそれらの誘導体も適している。加えて、前記オプソニン阻害ポリマーは、ＰＥＧのブロックコポリマー、及びポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、若しくはポリヌクレオチドであり得る。前記オプソニン化阻害ポリマーは、例えば、ガラクツロン酸、グルコロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン、アミン化多糖類或いはオリゴ糖（直線或いは分岐）、若しくはカルボキシル化多糖類或いはオリゴ糖（例えばカルボン酸の誘導体と反応した結果、カルボキシル酸と結合している）などの、アミノ酸もしくはカルボキシル酸を含む天然多糖類でもあり得る。
【０１２０】
好ましくは、前記オプソニン化阻害部位は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、若しくはそれらの誘導体である。ＰＥＧ若しくはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、時々"ＰＥＧ化リポソーム"と呼ばれる。
【０１２１】
前記オプソニン化阻害部位は、多数のよく知られた技術の任意の１つによってリポソーム膜へ結合され得る。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーへ結合され、次に膜へ結合され得る。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３及びテトラヒドロフランと水（３０：１２の割合）などの溶媒混合液を用いて、６０℃で、還元性アミノ化を介してステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化され得る。
【０１２２】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドは、上で説明された。そのような組換えプラスミドは、直接、若しくはＭｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＬＴ１親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェチン、ポリカチオン（例えばポリリシン）、若しくリポソームを含む適切な運搬試薬との組み合わせでも投与され得る。本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えウイルス性ベクターも、上述されており、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を発現している対象の細胞へそのようなベクターを運搬するための方法は、当業者の技術範囲内である。
【０１２３】
本発明のｓｉＲＮＡは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を発現している細胞へ前記ｓｉＲＮＡを運搬するために適した任意の手段によって、対象へ投与され得る。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、遺伝子銃、電気穿孔法によって、若しくは他の適切な非経口的或いは経腸性経路によって、投与され得る。
【０１２４】
適切な経腸性投与経路は、経口、直腸、若しくは鼻腔内運搬を含む。
【０１２５】
適切な非経口的投与経路は、血管内投与（例えば静脈内大量瞬時投与、静脈内注入、動脈内大量瞬時投与、動脈内注入、及び脈管腔増へのカテーテル滴下）、組織周囲及び組織内投与（例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注射、網膜内注射、或いは網膜下注射）、皮下注射或いは（例えば浸透圧性ポンプによる）皮下注入を含む堆積、例えばカテーテル或いは他の配置装置（例えば角膜ペレット或いは坐薬、目薬、若しくは多孔性、非多孔性、或いはゼラチン物質からなる移植片）などの新血管新生部位の或いはその周辺の領域への直接的（例えば局所的）施用、及び吸引を含む。適切な配置装置は、眼球移植片（米国特許番号第５，９０２，５９８号、及び第６，３７５，９７２号に記載されている）、及び生物分解性眼球移植片（米国特許番号第６，３３１，３１３、号に記載されており、これら全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる）を含む。そのような眼球移植片は、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，マサチューセッツ州）及びＯｃｕｌｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，カリフォルニア州）から利用可能である。
【０１２６】
好ましい実施形態において、前記ｓｉＲＮＡの注射若しくは注入は、親血管新生部位で、或いはその周辺で行われる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、眼の網膜色素上皮細胞へ運搬され得る。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡは、例えば、下眼瞼或いは結膜円蓋に対しては液体或いはゲル形態で、若しくは電気穿孔法或いはイオン注入によって、眼へ局所的に投与され、これは当業者の技術範囲内である（例えば、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ．ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３０：４２１〜４２９を参照のこと、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２７】
一般的に、本発明のｓｉＲＮＡは、約５マイクロリットル〜約７５マイクロリットル、好ましくは約１０マイクロリットル〜約３０マイクロリットルの容量で、眼へ局所的に投与される。本発明のｓｉＲＮＡは、水溶性溶液に非常に可溶し、７５マイクロリットル以上の容量でのｓｉＲＮＡの眼への局所的滴下は、流出や排出による眼からのｓｉＲＮＡの損出を生じることが理解される。従って、約５マイクロリットル〜約７５マイクロリットルの容量での眼への局所的滴下によって、高濃度のｓｉＲＮＡ（例えば約１０〜約２００ｍｇ／ｍｌ、若しくは約１００〜約１０００ｎＭ）を投与することが好ましい。
【０１２８】
特に好ましい非経口的投与経路は、眼内投与である。本発明のｓｉＲＮＡの眼内投与は、この投与経路によると前記ｓｉＲＮＡが眼へ入ることが可能である限り、眼への注射或いは直接（例えば局所的）投与によって達成され得る。上述した眼への局所的経路の投与に加えて、適切な眼内経路の投与は、硝子体内、網膜下、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼窩周囲及び眼窩後、トランス−角膜、及びトランス−強膜投与を含む。そのような眼内投与経路は、当業者の技術範囲内であり、例えば、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ ｅｔ ａｌ，２００２，ｓｕｐｒａ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１７６３〜１７６９、及びＡｍｂａｔｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２１：１４５〜１５１を参照のこと（これら全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２９】
本発明のｓｉＲＮＡは、単一用量で、若しくは複数用量で投与され得る。本発明のｓｉＲＮＡの投与が注入によるものである場合、前記注入は単一持続性用量であり得る、若しくは複数注入によって運搬され得る。
【０１３０】
当業者は、本発明のｓｉＲＮＡを所定の対象へ投与するための適切な用量も容易に決定できる。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、新血管新生部位へ或いはその周辺へ、単一注射或いは堆積によって対象へ１度投与され得る。或いは、前記ｓｉＲＮＡは、毎日若しくは毎週、複数回対象へ投与され得る。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、約３〜約２８週間、より好ましくは約７〜約１０週間の期間で１週間に１回、対象へ投与され得る。好ましい用量において、前記ｓｉＲＮＡは、１週間に１回で７週間、新血管新生部位へ或いはその周辺へ（例えば硝子体内で）注射される。不確定の長さの期間に対する本発明のｓｉＲＮＡの周期的な投与は、ｗｅｔ ＡＭＤ或いは糖尿病性網膜症などの慢性的な新血管新生疾患を患っている対象に対して必要とされることが理解される。
【０１３１】
用量が複数投与である、或いはそれぞれが異なる標的配列を有している２若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡの投与である場合、対象へ投与されるｓｉＲＮＡの有効量は、全体の用量以上に投与されるｓｉＲＮＡの総量を有することができることが理解される。
【０１３２】
本発明のｓｉＲＮＡは、本分野では既知である技術に従って、対象へ投与される前に、好ましくは薬学的組成物として処方される。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌で発熱物質がないものとして特徴付けられる。ここで用いられたように、"薬学的製剤"は、ヒト及び獣医学使用に対する製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調整するための方法は、当業者の技術範囲内であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ペンシルバニア州（１９８５））に記載されており、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
本発明の薬学的処方は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合された、本発明のｓｉＲＮＡ（例えば０．１〜９０重量％）若しくはそれらの生理学的に許容可能な塩類を含む。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は、水、緩衝化水、正常生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、及びそれらの同等物である。
【０１３４】
本発明の薬学的組成物は、従来の薬学的賦形剤及び／若しくは添加物も有することができる。適切な薬学的賦形剤は、安定剤、抗酸化剤、重量モル浸透圧濃度調整剤、緩衝液、及びｐＨ調整剤を含む。適切な添加物は、生理学的な生体適合性緩衝液（例えばトロメタミン塩酸塩）、キレート（ｃｈｅｌａｎｔｓ）の添加物（例えば、ＤＴＰＡ若しくはＤＴＰＡビスアミドなど）或いはカルシウムキレート複合体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡビスアミド）、若しくは任意に、カルシウム或いはナトリウム塩（例えば、塩酸カルシウム、アルコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、或いは乳酸カルシウム）を含む。本発明の薬学的組成物は、液体形態での使用に対しては包装され得る、若しくは凍結乾燥され得る。
【０１３５】
眼への局所的投与に対して、従来の眼内運搬試薬を用いることができる。例えば、局所的眼内運搬に対する本発明の薬学的組成物は、上述したように、生理食塩水、角膜浸透増強剤、不溶性粒子、ワセリン或いは他のゲルベース軟膏、ポリマー、眼への滴下用に粘性が増加されたポリマー、若しくは粘膜付着性ポリマーを有することができる。好ましくは、眼内運搬試薬は、角膜浸透を増加する、若しくは粘性効果を介して、或いは角膜上皮を覆うムチン層との物理化学的相互作用によってｓｉＲＮＡの眼球前面保持を延長する。
【０１３６】
局所的眼内運搬に適切な不溶性粒子は、リン酸カルシウム粒子（Ｂｅｌｌらによる米国特許番号第６，３５５，２７１号に記載されており、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）を含む。眼への滴下用に粘性が増加されたポリマーは、例えば、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ ４０７（例えば２５％の濃度で）、セルロースアセトフタレート（例えば３０％の濃度で）、若しくは例えばＧｅｌｒｉｔｅ（登録商標）（ＣＰ Ｋｅｌｃｏ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，デラウェア州で購入可能）などの低級アセチルゲル化（ｇｅｌｌａｎ）ガムなどのポリエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む。適切な粘膜付着性ポリマーは、例えばカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミド基及び／若しくは硫酸基などの複数の親水性機能基を有する親水コロイド、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸、高分子量ポリエチレングリコール（例えば>２００，０００平均分子量）、デキストラン、ヒアルロン酸、ポリガラクツロン酸、及びキシロカン（ｘｙｌｏｃａｎ）を含む。適切な角膜浸透増強剤は、シクロデキストリン、ベンザルコニウム塩化物、ポリオキシエチレングリコールラウリルエーテル（例えばＢｒｉｊ（登録商標）３５）、ポリオキシエチレングリコールステアリルエーテル（例えばＢｒｉｊ（登録商標）７８）、ポリオキシエチレングリコールオレイルエーテル（例えばＢｒｉｊ（登録商標）９８）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジギトニン、タウロコール酸ナトリウム、サポニン、及びＣｒｅｍａｐｈｏｒ ＥＬなどのポリオキシエチレン化ヒマシ油を含む。
【０１３７】
固体組成物のために、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、炭酸マグネシウム、及びそれらの同等物など、従来の非毒性固体担体が使用され得る。
【０１３８】
例えば、経口投与のための固体薬学的組成物は、上述した任意の担体及び賦形剤、及び１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡを含むことができる。エアロゾル（吸引）投与のための薬学的組成物は、上述したようにリポソームで被包された、０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％の本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡ、及び噴霧剤を有することができる。担体は、例えば、鼻腔内運搬に対してレシチン、など要望通りに含まれることもできる。
【０１３９】
本発明は以下の限定されない実施例によって説明される。
【実施例１】
【０１４０】
Ａｎｇ２ ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡによる培養ヒト細胞におけるＡｎｇ２発現の阻害
ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ−２９３細胞）を２４ウェルプレートにおいて、３７℃、５％ＣＯ２、オーバーナイトで標準増殖培地中で培養した。細胞が約７０％コンフルエンスになった次の日に形質転換を行った。ＨＥＫ−２９３細胞を、ＣａＰｉ形質転換試薬と混合したヒトＡｎｇ２（"ｈＡＮＧ２"）ｍＲＮＡを標的にした１２の異なるｓｉＲＮＡ（各２５ｎＭ）で別々に形質転換した。これら１２のｓｉＲＮＡは、表１に記載した配列を標的にしており、全てのｓｉＲＮＡは３’ＴＴオーバーハングを各鎖に有している。対照細胞は、ＣａＰｉ形質転換試薬と混合したｓｉＲＮＡのないＣａＰｉ形質転換試薬で、若しくは高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）を標的とした非特異的ｓｉＲＮＡで形質転換した。形質転換４８時間後、増殖培地を全てのウェルから除去し、Ｑｕａｎｔｉｌｉｎｅ ｈｕｍａｎ ＡＮＧ２ ＥＬＩＳＡプロトコールに記載されたように（この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）、ヒトＡＮＧ２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ミネソタ州）を実行した。ＥＬＩＳＡ結果は、ＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析し、図１に報告した。
【０１４１】
【表１】
【０１４２】
図１から分かるように、増殖培地に分泌されたｈＡＮＧ２タンパク質のレベルは、ｈＡＮＧ２＃２、＃３、＃４、＃９及び＃１０ ｓｉＲＮＡで形質転換したＨＥＫ−２９３細胞において減少した。非特異的ｓｉＲＮＡでのＨＥＫ−２９３細胞の形質転換は、ｈＡＮＧ２タンパク質レベルに影響を与えなかった。
【０１４３】
各ウェルから増殖培地を除去した後、細胞毒性アッセイを以下のように各細胞に行った。１０％ ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，カリフォルニア州）を含む完全な増殖培地を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２、３７℃で３時間インキュベーションした。細胞増殖は、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを含む培地の色の変化（細胞代謝活性に起因する）を検出することによって測定された。細胞毒性アッセイ結果は、ＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析し、図２に報告した。
【０１４４】
図２から分かるように、ｈＡＮＧ２＃８及び＃１２ ｓｉＲＮＡでのＨＥＫ−２９３細胞の形質転換は、対照細胞と比較すると、細胞増殖のわずかな減少を生じた。残りのｈＡＮＧ２ ｓｉＲＮＡは、対照細胞と比較しても細胞毒性は見られなかった。
【０１４５】
細胞毒性アッセイを行った後、各ウェルにおけるＡｌａｍａｒＢｌｕｅ含有培地を完全に除去し、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，テキサス州）を用いてＲＮＡ抽出を行った。ＨＥＫ−２９３細胞におけるｈＡＮＧ２ ｍＲＮＡのレベルは、定量的逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイによって測定した。ヒトグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを、内部対象として用いた。ＨＥＫ−２９３細胞におけるｈＡＮＧ２ ｍＲＮＡのレベルは、対照と比較すると、ｈＡＮＧ２ ｓｉＲＮＡでの形質転換によって減少し、これは図１に示したｈＡＮＧ２タンパク質の減少と一致するパターンを示した。
【実施例２】
【０１４６】
培養ヒト細胞におけるｈＡｎｇ２＃２及び＃３の用量反応
ＨＥＫ−２９３細胞は、上述した実施例１の通り、約７０％コンフルエンスになるまで増殖させた。次に細胞を、ＣａＰｉ形質転換試薬において１ナノモル（"ｎＭ"）、５ｎＭ、或いは２５ｎＭ用量のｈＡＮＧ２＃２或いは＃３ ｓｉＲＮＡで、若しくは形質転換試薬のみで形質転換した。ｈＡＮＧ２タンパク質レベルは、実施例１に記載したようにＡＮＧ２ ＥＬＩＳＡによって、形質転換４８時間後の増殖培地において測定し、その結果は図３に示した。
【０１４７】
図３から分かるように、ｈＡＮＧ２タンパク質レベルは、ｈＡＮＧ２＃２及び＃３ ｓｉＲＮＡで形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞において、用量依存的に減少した。全ての用量のｈＡＮＧ２＃２ ｓｉＲＮＡ及び５ｎＭと２５ｎＭ用量のｈＡＮＧ２＃３は、対照細胞と比較して、増殖培地に分泌されたｈＡＮＧ２タンパク質のレベルが減少した。１ｎＭ用量のｈＡＮＧ２＃３ ｓｉＲＮＡは、形質転換試薬のみでニセ形質転換された対照細胞と比較して、ｈＡＮＧ２タンパク質レベルは減少しなかった。しかしながら、１ｎＭ ｈＡＮＧ２＃３ ｓｉＲＮＡで形質転換された細胞から分泌されたｈＡＮＧ２タンパク質のレベルは、非特異的ｓｉＲＮＡで形質転換された対照細胞と比較して、わずかに減少した。非特異的ｓｉＲＮＡでの形質転換は、ｈＡＮＧ２タンパク質レベルに影響を及ぼさなかった。
【０１４８】
対照ＨＥＫ−２９３細胞と、異なる用量のｈＡＮＧ２＃２、＃３ ｓｉＲＮＡで形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞とに、上の実施例１に記載したように細胞毒性アッセイを行った。図４から分かるように、５ｎＭ ｈＡＮＧ２＃２ ｓｉＲＮＡでのＨＥＫ−２９３細胞の形質転換は、形質転換試薬のみでニセ形質転換された対照細胞と比較すると、わずかに細胞増殖を減少した。非特異的ｓｉＲＮＡで形質転換された対照細胞と比較して、５ｎＭ ｈＡＮＧ２＃２ ｓｉＲＮＡ用量によっては、細胞毒性は生じなかった。残りの用量のｈＡＮＧ２＃２若しくは＃３ ｓｉＲＮＡは、非特異的ｓｉＲＮＡで、或いは形質転換試薬のみで形質転換した対照細胞と比較して、明らかな細胞毒性は見られなかった。
【実施例３】
【０１４９】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡでのストレプトゾトシン誘導性糖尿病性網膜症の治療
糖尿病性網膜症を患った個人の網膜における血管漏出及び非灌流は、空間的に及び時間的に白血球静止（ｌｅｕｋｏｃｙｔｏ ｓｔａｓｉｓ）に関連している（Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（１９）：１０８３６〜４１を参照し、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、糖尿病ラットにおける白血球静止を減少し、さらに網膜血管透過性も減少するであろうと予想された。
【０１５０】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａに記載されたように、ロングエバンスラット（約２００ｇ）に、糖尿病を誘導するために、オーバーナイト後、クエン酸緩衝液中のストレプトゾトシンを硝子体内に注射した。ロングエバンスラット（約２００ｇ）は、対照として、オーバーナイト後、クエン酸緩衝液のみ注射した。毎日、血清血糖を測定し、血圧を記録した。対照動物と比較して、血清血糖のレベルの上昇は、糖尿病であると考えられる。
【０１５１】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２（"実験的ｓｉＲＮＡ"）を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、各ラットにおいてＯＤを実行する。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照ＯＳとして注射される。全体の群スキームは、表２に示される通りである。
【０１５２】
【表２】
【０１５３】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａに記載されているように、処理７日後、ラットはアクリジンオレンジ白血球蛍光光度分析（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ、ＡＯＬＦ）にさらされた。簡潔には、ラットに麻酔し、その瞳孔をトロピカミドで拡張した。次にラットに、無菌生理食塩水と懸濁したアクリジンオレンジを硝子体内に注射した。血球静止に対して、各眼の基底を観察し、スキャニングレーザー検眼鏡（光源としてオレゴンブルーレーザー）で画像化した。次にラットは、蛍光デキストランで灌流され、眼をさらに画像化した。白血球静止の密度は、１０ディスク直径半径における光輝（ｂｒｉｇｈｔ）ピクセルのパーセンテージとして計算された。この白血球静止の密度は、終了点として用いられた。
【０１５４】
同じ７日目、Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、ラットにアイソトープ希釈技術を施し、血管漏出を定量化した。簡潔には、ラットに、第１点においてＢＳＡ中のＩ１２５を硝子体内に注射し、第２点においてＩ１３１を注射した。ラットは、第２の注入数分後に屠殺し、網膜を単離し、動脈サンプルをとった。網膜と動脈サンプルは、ヨウ素クリアランスの定量的インデックスを用いて網膜における活性を補正した後、γ−分光計を用いて解析した。次に、測定値を、投与された正確な用量、体重及び組織重量に対してノーマライズ（正常化）した。γ活性の補正された量は、網膜における血管漏出のマーカーとして用いた（第２の終了点）。γ活性は、実験動物の網膜において減少し、血管漏出の減少を示すと予想された。
【実施例４】
【０１５５】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡでのＶＥＧＦ誘導性血管透過性及び白血球静止の治療
眼におけるＶＥＧＦの存在は、網膜白血球静止を引き起こし、これは網膜における血管透過性の増加と毛細血管非灌流を引き起こす。例えば、Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６（５）：１７３３〜９を参照のこと（この全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる）。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、ラットにおいてＶＥＧＦを硝子体内に注射することによって生じた透過性と白血球静止を減少するのではないかと予想された。
【０１５６】
ロングエバンスラット（約２００ｇ）に麻酔をし、緩衝液ＯＵ中のＶＥＧＦを硝子体内に注射した。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡ（"実験的ｓｉＲＮＡ"）を、硝子体内注射によって各ラットへ同時に運搬した（ＯＤ）。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照として硝子体内に注射した（ＯＳ）。付加的な対照としては、緩衝液のみ（ＶＥＧＦなし）を注射したラットを含む。全体の群スキームは、表３に示した通りである。
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
注射後２４時間で、ラットをＡＯＬＦにさらし、実施例３で記載したようにアイソトープ希釈技術を行った。
【実施例５】
【０１５９】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡでの角膜／角膜縁損傷にさらされた眼における新血管新生の治療
眼球表面の損傷は、角膜の角膜縁幹細胞の破壊を引き起こすことがある。これらの細胞の破壊は、失明を引き起こす可能性があるＶＥＧＦ依存性角膜新血管新生を誘導する。新血管新生を促進するＶＥＧＦは、眼球表面の損傷後に角膜を浸潤する好中球及び単球によって供給される。例えば、Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７（４）：１２７７〜８１を参照のこと（この全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる）。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡは、角膜縁損傷後の角膜へ適用すると、マウスにおける角膜の新血管新生の領域が結果として減少すると予想される。新血管新生の領域は、直接測定され得る。或いは、角膜新血管新生の減少は、角膜内のＶＥＧＦ産生性多形核細胞の数が減少することから推測され得る。
【０１６０】
Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ．に記載されたように、角膜新血管新生は、角膜縁を損傷することによってＣ５７Ｂ１／６中に誘導される。簡潔には、マウスを麻酔し、水酸化ナトリウムを角膜に適用した。角膜及び角膜縁上皮を、角膜ナイフを用いて切除した（ＯＵ）。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を対象としたｓｉＲＮＡを除去後すぐに、角膜表面へ適用し（ＯＤ）、これを１日３回、実験期間（７日間）行った。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照として、同じ用量で投与された（ＯＳ）。
【０１６１】
Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ．に記載されたように、角膜及び角膜縁上皮の除去後２、４、及び７日目に、マウスの角膜新血管新生の程度を評価した。簡潔には、内皮特異的、フルオレセイン共役レクチンを硝子体内に注射した。注射３０分後、マウスを屠殺し、眼を回収し、２４時間ホルマリンで固定した。角膜のフラットマウントを、蛍光性顕微鏡観察下で採取し、解析するためにＯｐｅｎｌａｂソフトウェアへ取り込んだ。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを用いて、蛍光の閾値レベル、すなわち血管のみが見える範囲以上で設定した。蛍光性血管の領域及び角膜の領域（角膜縁アーケードによって分画される）を計算した。血管の領域は、総角膜領域によって分割され、この値は新血管領域のパーセンテージと同等である。新血管領域のパーセンテージは、処理群と対照群で比較した。
【０１６２】
Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ．に記載されたように、角膜及び角膜縁上皮の除去後２、４、及び７日目に、角膜多形核細胞（ＰＭＮｓ）を定量化するために付加的なマウスを屠殺した。簡潔には、マウスを屠殺し、眼を回収し、２４時間ホルマリンで固定した。ホルマリン固定の後、脱核された眼をパラフィンで被包し、切片化した。角膜の解剖学的中心と一致するような１つのパラフィン切片を各眼から選択し、毛顕微鏡観察に用いた。この１つの切片上のＰＭＮｓ（多小葉細胞として同定される）を計測し、この切片におけるＰＭＮｓの数は、処理群と対照群で比較した。
【実施例６】
【０１６３】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡでのレーザー誘導性脈絡叢新血管新生の治療
ブルッフ（Ｂｒｕｃｈ’ｓ）膜を破壊するレーザー光凝固は、ｗｅｔ黄斑性分解に見られるのと同様に、脈絡叢新血管新生（ＣＮＶ）を誘導する。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、マウスにおけるレーザー誘導性ＣＮＶを減少すると予想された。
【０１６４】
Ｓａｋｕｒａｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．&Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ．４４（６）：２７４３〜９（この全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる）に記載された手順によって、マウスにＣＮＶを誘導した。簡潔には、Ｃ５７Ｂ１／６マウスを麻酔し、それらの瞳孔をトロピカミドで拡張した。マウスの網膜に、各網膜の９、１２、及び３時の位置で１レーザースポットずつレーザー光凝固化した（ＯＵ）。レーザー光凝固化に続いてすぐに、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡを硝子体内に注射した（ＯＤ）。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照として、硝子体内に注射した（ＯＳ）。
【０１６５】
Ｓａｋｕｒａｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００３），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、レーザー光凝固後１４日で、マウスを屠殺し、ＣＮＶ領域を定量化するための網膜フラットマウントを調整した。簡潔には、マウスを麻酔し、胸部を開き、下行大動脈をクロスクランプ（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｍｐｅｄ）した。次に、右心房を挟み、蛍光標識デキストランを、左心室へゆっくりと注射した。
【０１６６】
蛍光標識デキストランの注射後、眼を脱核し、パラホルムアルデヒドで２４時間固定した。次に、前眼房及び網膜を除去し、各脈絡叢のフラットマウントを解析のために調整した。脈絡叢フラットマウントは、蛍光顕微鏡観察下でそれぞれの写真を撮ることによって解析し、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアにその写真を取り込んだ。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを用いて、新血管新生の領域の輪郭を描き、定量化し、既知のレーザー位置が蛍光タフトと比較されていることを確認した。処理された動物の新血管領域は、対照動物の新血管領域と比較した。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】図１は、ｓｉＲＮＡ候補のサイレンシング効果を示した柱状グラフである。これらは、ｈＡＮＧ２ ｍＲＮＡを標的とした１２の異なるｓｉＲＮＡ（ｈＡＮＧ２＃１〜ｈＡＮＧ１２）、高感度緑色蛍光タンパク質（"ＥＧＦＰ"）を標的とした対照非特異的ｓｉＲＮＡ、若しくは、ｓｉＲＮＡを含まない形質移入試薬（"なし"）で形質移入（トランスフェクト）されたＨＥＫ−２９３細胞を含む組織培養ウェルから除去された増殖培養液中のヒトアンジオポエチン２（"ｈＡＮＧ２"）タンパク質のレベルによって測定されたものである。ｈＡＮＧ２タンパク質レベルは、増殖培養液の１ミリリットル当たり何ピコグラムのタンパク質が含まれているかで標示しており（ｐｇ／ｍｌ）、これは形質移入後４８時間でｈＡＮＧ２ ＥＬＩＳＡを用いて測定された。
【図２】図２は、ｈＡＮＧ２ ｍＲＮＡを標的とした１２の異なるｓｉＲＮＡ（ｈＡＮＧ２＃１〜ｈＡＮＧ２＃１２）で形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞において細胞毒性がないことを示した柱状グラフである。対照細胞は、高感度緑色蛍光タンパク質（"ＥＧＦＰ"）を標的とした非特異的ｓｉＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡを含まない形質移入試薬で形質移入された（"なし"）。細胞毒性は、形質移入試薬のみで処理した細胞に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞の増殖パーセンテージとして測定した。
【図３】図３は、ＨＥＫ−２９３細胞によって分泌されたｈＡＮＧ２タンパク質のレベルにおけるｈＡＮＧ２＃２及びｈＡＮＧ２＃３の増加用量のサイレンシング効果を示した柱状グラフである。ＨＥＫ−２９３細胞は、１ナノモル（"ｎＭ"）、５ｎＭ、若しくは２５ｎＭのｈＡＮＧ２＃２或いはｈＡＮＧ２＃３ ｓｉＲＮＡで形質移入された。対照細胞は、高感度緑色蛍光タンパク質（"ＥＧＦＰ"）を標的とした非特異的ｓｉＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡを含まない形質移入試薬で形質移入された（"なし"）。ｈＡＮＧ２タンパク質レベルは、増殖培養液の１ミリリットル当たり何ピコグラムのタンパク質が含まれているかで標示しており（ｐｇ／ｍｌ）、これは形質移入後４８時間でｈＡＮＧ２ ＥＬＩＳＡを用いて測定された。
【図４】図４は、ｈＡＮＧ２＃２及びｈＡＮＧ２＃３ ｓｉＲＮＡの増加用量で形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞において細胞毒性がないことを示した柱状グラフである。対照細胞は、高感度緑色蛍光タンパク質（"ＥＧＦＰ"）を標的とした非特異的ｓｉＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡを含まない形質移入試薬で形質移入された（"なし"）。細胞毒性は、形質移入試薬のみで処理した細胞に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞の増殖パーセンテージとして測定した。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年４月１８日に出願された米国仮出願番号第６０／４６３，９８１号に対して優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、低分子干渉ＲＮＡによる、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、及びＴｉｅ２遺伝子発現の制御に関するものであり、特に、血管新生に関する疾患若しくは状態を治療することを目的としているものである。
【背景技術】
【０００３】
血管新生若しくは"新血管新生"は、既存の血管の内皮細胞（ＥＣ）からの新しい血管の形成である。この過程は、ＥＣ遊走、増殖、及び分化を含み、親血管における基底膜の限局性分解で始まる。次に、ＥＣは、親血管から間質性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へと遊走し、毛細管出芽を形成し、この毛細管出芽は細胞の継続的な遊走と増殖に起因して伸長する。
【０００４】
血管新生は、通常厳密な制御下にあり、正常条件下では、特定の限定生理的過程においてのみ起こる。例えば、血管新生は、胚形成、出産後の成長、創傷修復、及び月経の間に起こる。しかしながら、非制御血管新生は病的状態を生じ、成長中の血管は周囲の組織を破壊する若しくは悪性度を持続する。そのような病的状態は、糖尿病性網膜症、乾癬、滲出性或いは"ｗｅｔ"加齢性黄斑変性症（"ＡＭＤ"）、炎症性障害、及び全ての癌を含む。特にＡＭＤは、臨床的に重大な血管新生病である。この状態は、高齢者の片眼若しくは両眼における脈絡叢の新血管新生によって特徴付けられ、先進工業国における失明の主な原因である。
【０００５】
血管新生の鍵となる２つの制御因子は、アンジオポエチン−１（"Ａｎｇ１"）及びアンジオポエチン−２（"Ａｎｇ２"）である。Ａｎｇ１若しくはＡｎｇ２単独の阻害は新血管新生を阻止するように見えるが、これらの制御因子は、血管内皮増殖因子（"ＶＥＧＦ"）と連携して作用し血管新生を制御することができる。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＶＥＧＦは、２つのＶＥＧＦ受容体と"免疫グロブリン及び上皮細胞成長因子相同性ドメインを有するチロシンキナーゼ２（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎｓ ２）"若しくは"Ｔｉｅ２"と呼ばれている別のチロシンキナーゼとを介してＥＣに効果を発揮する（Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．１９２：１８２〜１８７）。ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＦＧＦの結合は血管新生過程を開始するために不可欠であるのに対し、Ａｎｇ１及びＡｎｇ２はＴｉｅ２へ結合し、新血管の成熟を調節する。Ａｎｇ１及びＡｎｇ２は、内皮細胞の統合性を維持することにも関与している（Ｌｏｂｏｖ ｅｔ ａｌ．(２００２)，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１２０５〜１１２１０）。以下に説明するように、Ｔｉｅ２受容体に結合し阻止する因子は、血管新生も阻害できる。
【０００６】
Ａｎｇ１及びＡｎｇ２は、個別に発現され、初期の研究では、Ａｎｇ１は新血管新生を促進し、Ａｎｇ２は血管新生アンタゴニストであると示唆されていた。しかしながら現在、Ａｎｇ２は血管の直径を増大し、基底膜のリモデリングを促進することができるという結果が示された。Ａｎｇ２は、ＶＥＧＦ存在下で、ＥＣ増殖、遊走、及び血管の出芽を誘導することも明らかになった（Ｌｏｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００２，ｓｕｐｒａ）。
【０００７】
Ａｎｇ１は、胚発生の間、特に細胞−間質（ストロマ）伝達の調節を通じて、及び血管の成熟や安定性を制御することによって、血管新生を促進すると報告されている（Ｌｉｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８８２９〜８８３４(１９９８)）。しかしながら、血管内皮におけるＡｎｇ１及びＴｉｅ２の広範囲の発現、及び静止状態の成体脈管構造におけるＴｉｅ２のリン酸化によって、Ａｎｇ１が出生後の血管新生に関与していると示唆されている（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｎｖ．Ｏｐｈｔｈａｌｍ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：３９３〜４０２）。
【０００８】
Ａｎｇ１とＴｉｅ２の詳細な発現パターンに比べて、Ａｎｇ２は、血管リモデリングの部位でのみ発現されているように見える（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．（２００３），ｓｕｐｒａ）。例えば、Ａｎｇ２発現は、月経中の卵巣、子宮及び胎盤において著しく増加した。Ａｎｇ２発現レベルも、この構造の静止状態、血管新生、血管退行のサイクルに対応する、黄体の発現の周期性パターンに従っている（すなわち、Ａｎｇ２レベルは静止状態では低く、血管新生及び退行の間では高い）（Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，ｓｕｐｒａ）。Ａｎｇ２は、ＶＥＧＦを含む低酸素サイトカインによっても誘導され、腫瘍、ＡＭＤに関連した病原性血管新生が起こっている組織、及び網膜虚血の動物モデルにおいて発現している（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｓｕｐｒａ．）。さらに、Ａｎｇ２は、虚血性網膜障害を患った患者の網膜上膜において上方制御されているが、非虚血性網膜障害の患者からの膜では上方制御されていない。しかしながら、Ａｎｇ１の発現は、虚血性若しくは非虚血性障害の患者の網膜上膜において同じである（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｓｕｐｒａ．）。
【０００９】
Ａｎｇ２及びＴｉｅ２は、高度に血管新生化された領域のＥＣにおいて共存しており、Ｔｉｅ２は、血管リモデリングの部位において過剰発現している。Ａｓａｈａｒａ Ｔ．ら（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８３：２２３〜２４０）は、Ａｎｇ１及びＡｎｇ２は、ＶＥＧＦと同様な相乗効果を有しており、マウス角膜新血管新生アッセイにおける血管新生を促進すると報告していた。従って、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２は、発生及び生体生物における正常及び病原性新血管新生の両方で重要な役割を演じている。
【００１０】
従って、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２は、病原性血管新生の治療に対する魅力的な治療標的である。例えば、Ｌｉｎ Ｐら（（１９９８），ｓｕｐｒａ）は、マウスモデルにおける腫瘍成長及び転移は、可溶性組換えＴｉｅ２受容体の発現によって阻害されることを報告した。この組換えＴｉｅ２タンパク質は、内因性Ｔｉｅ２受容体へのリガンド結合を阻止するが、Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２結合の化学量論的な減少のみを引き起こしやすい。Ｔａｋａｇｉら（２００３，ｓｕｐｒａ）は、Ｔｉｅ２の外質ドメインを有する可溶性融合タンパク質によってＴｉｅ２シグナル伝達が阻害され、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方において低酸素誘導性網膜血管新生を抑制したと報告した。Ａｓａｈａｒａら（（１９９８），ｓｕｐｒａ）は、可溶性Ｔｉｅ２受容体を投与することにより、マウス角膜における、ＶＥＧＦ誘導性新血管新生に対するＡｎｇ１若しくはＡｎｇ２の効果を消滅させることを示した。ただし、可溶性Ｔｉｅ２受容体などの因子に基づいた治療的戦略は好ましくなく、なぜならそのような因子は、高度に血管新生化された領域のＥＣでは、Ａｎｇ２若しくはＴｉｅ２が高生産されることによって圧倒される可能性が高いからである。
【００１１】
ＲＮＡ干渉（以後"ＲＮＡｉ"）は、多くの真核生物を通じて保存されている転写後遺伝子制御の方法である。ＲＮＡｉは、細胞内に存在する短い（すなわち、<３０ヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ（"ｄｓＲＮＡ"）分子によって誘導される（Ｆｉｒｅ Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６〜８１１）。これらの短ｄｓＲＮＡ分子（"低分子干渉ＲＮＡ"若しくは"ｓｉＲＮＡ"と呼ばれている）は、１ヌクレオチド分解能の精度で、前記ｓｉＲＮＡと配列相同性を共有しているメッセンジャーＲＮＡ（"ｍＲＮＡ"）の破壊を引き起こす（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１５：１８８〜２００）。このｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを切断する"ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体"若しくは"ＲＩＳＣ"と結合する。ｓｉＲＮＡは、複数回ターンオーバーする酵素のように再利用され、１個のｓｉＲＮＡ分子で、約１０００個のｍＲＮＡ分子の切断を誘導する能力を有している。従って、ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ仲介性ＲＮＡｉ分解は、標的遺伝子の発現を阻害するための現在利用可能な技術よりも効果的である。
【００１２】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭら（（２００１），ｓｕｐｒａ）は、２１及び２２ヌクレオチド長で、短い３’オーバーハングを有する合成ｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエ細胞溶解液において標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを誘導することができることを示した。培養哺乳類細胞も、合成ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ分解を示し（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｔ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４〜４９８）、合成ｓｉＲＮＡによって誘導されたＲＮＡｉ分解は、生きているマウスにおいても最近観察された（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ＡＰ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８：３８〜３９；Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０）。ｓｉＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉ分解の治療可能性は、最近いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究で示されており、これらの中にはＨＩＶ−１感染のｓｉＲＮＡ誘導性阻害（Ｎｏｖｉｎａ ＣＤ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：６８１〜６８６）や、神経毒性ポリグルタミン病タンパク質発現の減少（Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），ｓｕｐｒａ）などが含まれている。
【００１３】
従って、血管新生を効果的に減少若しくは阻止するための、触媒作用的な若しくは半化学量論的な量での、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２若しくはＴｉｅ２の発現を選択的に阻害する因子及び方法が必要とされている。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、特にＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２遺伝子を標的にし、それらのｍＲＮＡのＲＮＡｉ誘導性分解を引き起こすｓｉＲＮＡに関するものである。これらのｓｉＲＮＡは、半化学量論的な量でＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡを分解する。従って、本発明のｓｉＲＮＡ化合物及び組成物は、血管新生を阻害するために用いられる。特に、本発明のｓｉＲＮＡは、癌性腫瘍（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｔｕｍｏｒｓ）、及び加齢性黄斑変性症や糖尿病性網膜症などの眼内新血管新生に関連した障害を治療するのに有用である。
【００１５】
従って、本発明は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を標的にした単離ｓｉＲＮＡを提供する。前記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ二本鎖を形成するセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を有している。前記センスＲＮＡ鎖は、前記標的ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を有している。
【００１６】
本発明は、本発明の前記ｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミド及びウイルス性ベクターを提供し、さらに本発明のｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体とからなる薬学的組成物も提供する。
【００１７】
本発明はさらに、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、前記標的ｍＲＮＡが分解されるように、本発明の前記ｓｉＲＮＡの有効量を対象へ投与する工程を有している。
【００１８】
本発明はさらに、対象中の血管新生を阻害する方法を提供し、この方法は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を標的としたｓｉＲＮＡの有効量を対象へ投与する工程を有している。
【００１９】
本発明はさらに、血管新生病を治療する方法を提供し、この方法は、血管新生病に関連した血管新生が阻害されるように、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を標的としたｓｉＲＮＡの有効量を、そのような治療を必要としている対象へ投与する工程を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
特に指示がない限り、本明細書の全ての核酸配列は、５’から３’の方向で標示されている。また、核酸配列における全てのデオキシリボヌクレオチドは、大文字（例えばデオキシチミジンは"Ｔ"）で表されており、核酸配列における全てのリボヌクレオチドは、小文字（例えばウリジンは"ｕ"）で表されている。
【００２１】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２ ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡを有する組成物及び方法は、血管新生を阻害するために、特に血管新生病の治療に対して有利に用いられる。本発明の前記ｓｉＲＮＡは、これらのｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こし、その結果、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２遺伝子のタンパク質産生がなされない或いは少ない量で産生されると考えられる。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２は血管新生に関与するため、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ仲介性分解は、血管新生の過程を阻害する。
【００２２】
ここで用いられたように"Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡを標的とした"ｓｉＲＮＡは、二本鎖の第１鎖が、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ配列の一部のヌクレオチド配列と実質的に同一であるｓｉＲＮＡを意味している。前記ｓｉＲＮＡ二本鎖の第２鎖は、前記ｓｉＲＮＡ二本鎖の第１鎖、及びＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡの同一部分の両方に相補的であることが理解される。
【００２３】
従って、本発明は、約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド長の、好ましくは約１９〜約２５ヌクレオチド長の、前記標的ｍＲＮＡを標的とした短い二本鎖ＲＮＡを有する単離ｓｉＲＮＡを提供する。前記ｓｉＲＮＡはセンスＲＮＡ鎖と相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を有しており、これらは標準的なワトソン−クリック塩基対相互作用（以後、"塩基対"）によってアニーリングされている。以下により詳細に記載するように、前記センス鎖は、前記標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と実質的に同一である核酸配列を有している。
【００２４】
ここで用いられたように、前記標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と"実質的に同一"である核酸配列は、前記標的配列と同一である、若しくは前記標的配列と１若しくはそれ以上のヌクレオチドが異なる核酸配列である。標的配列と実質的に同一である核酸配列を有する本発明のセンス鎖は、そのようなセンス鎖を有するｓｉＲＮＡは、前記標的配列を含むｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を誘導するという点で特徴付けられる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、前記標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解が前記ｓｉＲＮＡによって誘導される範囲で、標的配列と１、２、或いは３若しくはそれ以上のヌクレオチドが異なる核酸配列を有するセンス鎖を有することができる。
【００２５】
本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、２つの相補的なＲＮＡ分子、一本鎖ＲＮＡ分子を有する、若しくは、２つの相補的部分が塩基対をなす、一本鎖"ヘアピン"領域によって共有結合的に結合している１つの分子を有している。どんな理論によっても制限されることなく、後者のタイプのｓｉＲＮＡ分子の前記ヘアピン領域は、"ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）"タンパク質（若しくはその同等物）によって細胞内で切断され、２つの個別の塩基対をなすＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられる（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），ｓｕｐｒａを参照のこと）。以下に記載されたように、前記ｓｉＲＮＡは、１若しくはそれ以上のリボヌクレオチド塩基の変化、置換、若しくは修飾も含む。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、変化、置換、若しくは修飾され、１若しくはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を含むこともできる。
【００２６】
ここで用いられたように、"単離"は、合成、若しくは自然条件から人の介入を介して変化或いは除去されたことを意味する。例えば、生きている動物中に自然に存在するｓｉＲＮＡは、"単離"されていないが、合成ｓｉＲＮＡ、若しくはその自然条件の共存物質から分離された部分的或いは完全なｓｉＲＮＡは"単離"される。単離ｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で存在する、若しくは、例えば前記ｓｉＲＮＡが運搬された細胞などの非自然環境で存在することができる。例によると、自然な過程によって細胞内部に産生されるが、"単離"された前駆体分子から産生されたｓｉＲＮＡは、それ自身"単離"された分子である。従って、単離ｄｓＲＮＡは、標的細胞へ導入され、ダイサータンパク質（若しくはその同等物）によって単離ｓｉＲＮＡへと処理される。
【００２７】
ここで用いられたように"標的ｍＲＮＡ"は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡの変異体或いは選択的スプライシング体、同族Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子からのｍＲＮＡを意味している。ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２ ｍＲＮＡ配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＹ１２４３８０、ＮＭ＿００１４７、及びＬ０６１３９に、ｃＤＮＡ同等物として記載されている。ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２ ｍＲＮＡ配列は、本明細書においてはそれぞれ配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、及び配列ＩＤ番号３で、ｃＤＮＡ同等物として表されている。当業者は、前記ｃＤＮＡ配列は、前記ｍＲＮＡと同等であり、ここでの同じ目的、すなわちＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの生成のために用いられることを理解するであろう。
【００２８】
ここで用いられたように、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２に"同族"な遺伝子若しくはｍＲＮＡは、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２に相同的である別の哺乳類種からの遺伝子若しくはｍＲＮＡである。例えば、飼い犬（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）のＡｎｇ１ ｍＲＮＡの部分配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＦ３４５９３２にｃＤＮＡ同等物として記載されており、ここでは配列ＩＤ番号４として表されている。Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）Ａｎｇ２ ｍＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＮＭ＿００７４２６にｃＤＮＡ同等物として記載されており、ここでは配列ＩＤ番号５として表されている。Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）及びＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）Ｔｉｅ２ ｍＲＮＡ配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＮＭ＿０１３６９０及びＮＷ＿０４３８５６にｃＤＮＡ同等物として記載されている。マウス及びラットＴｉｅ２ ｍＲＮＡ配列は、本明細書ではそれぞれ配列ＩＤ番号６及び配列ＩＤ番号７として表されている。
【００２９】
ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２の選択的スプライシング体も既知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＹ１２１５０４を参照すると、ヒトＡｎｇ１のスプライス変異体がｃＤＮＡ同等物として記載されている（配列ＩＤ番号８）。Ｋｉｍ Ｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２４），１８５５０〜１８５５６（２０００））及びＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＦ１８７８５８には、９６〜１４８のアミノ酸が欠如したＡｎｇ２タンパク質をコード化したＡｎｇ２スプライス変異体が、ｃＤＮＡ同等物として記載されている（配列ＩＤ番号９）。さらに、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＢ０８６８２５を参照すると、上皮細胞成長因子様ドメインが欠如したＴｉｅ２タンパク質をコード化したＴｉｅ２のスプライス変異がｃＤＮＡ同等物として記載されている（配列ＩＤ番号１０）。
【００３０】
ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、本分野では良く知られた技術を用いて、選択的スプライシング体でも解析される。そのような技術は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、及びｉｎ−ｓｉｔｕ（生体内原位置）ハイブリダイゼーションが含まれる。ｍＲＮＡ配列を解析するための技術は、例えば、Ｂｕｓｔｉｎｇ ＳＡ（（２０００），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１６９〜１９３）に記載されており、その全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。選択的スプライシングｍＲＮＡを同定するための代表的な技術も、以下に記載されている。
【００３１】
例えば、既知の疾患遺伝子に関連したヌクレオチド配列を有するデータベースは、選択的スプライシングｍＲＮＡを同定するために用いられ得る。そのようなデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｅｍｂａｓｅ、及びＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）データベースを含む。例えば、ＣＧＡＰデータベースは、ヒト癌の様々なタイプの発現遺伝子配列断片（ＥＳＴｓ）を含む。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２のｍＲＮＡ若しくは遺伝子配列は、選択的スプライシングｍＲＮＡを表すＥＳＴｓが発見されるかどうか決定するために、そのようなデータベースをクエリーするために用いられ得る。
【００３２】
"ＲＮＡｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（ＲＮＡ分解酵素保護）"と呼ばれる技術も、選択的スプライシングＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡを同定するために用いられ得る。ＲＮＡｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎは、合成ＲＮＡへの遺伝子配列の翻訳を含み、他の細胞、例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を発現するように誘導された細胞から由来したＲＮＡへハイブリダイズされる。ハイブリダイズされたＲＮＡは、次にＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドミスマッチを認識する酵素と共にインキュベートされる。予想される断片より小さいということは、選択的スプライシングｍＲＮＡが存在することを示している。推定上の選択的スプライシングｍＲＮＡは、クローン化され、当業者には良く知られた方法によって配列決定される。
【００３３】
ＲＴ−ＰＣＲも、選択的スプライシングＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡを同定するために用いられ得る。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、血管内皮細胞若しくはＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を発現すると知られている他の組織の細胞からのｍＲＮＡは、本分野の範囲内である方法を用いて、酵素である逆転写酵素によってｃＤＮＡへ変換される。ｃＤＮＡの完全コード配列は、次に３’非翻訳領域に位置するフォワード（前方向）プライマーと、５’非翻訳領域に位置するリバース（逆方向）プライマーＰＣＲによって増幅される。増幅産物は、例えば、増幅産物のサイズと、正常にスプライシングされたｍＲＮＡからの予想産物のサイズとを、例えばアガロースゲル電気泳動によって比較することで、選択的スプライシング体が解析される。増幅産物のサイズにおける全ての変化は、選択的スプライシングを示している。
【００３４】
変異Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子から産生されたｍＲＮＡも、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２選択的スプライシング体を同定するための上述した技術によって容易に同定され得る。ここで用いられたように"変異"Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子若しくはｍＲＮＡは、ここにおいて説明された前記Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２配列とは配列の点で異なる、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子若しくはｍＲＮＡを含む。従って、前記Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２遺伝子、若しくはそれらから産生されたｍＲＮＡの対立遺伝子体は、本発明の目的によると"変異体"であると考えられる。さらに、国際特許第ＷＯ０２／２０７３４号公報を参照すると、Ｔｉｅ２のいくつかの変異体が記載されており、それらのうち１つはＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄアクセッション番号ＡＸ３９８３５６に記載されている。また、本明細書ではｃＤＮＡ同等物として配列ＩＤ１１に表している。
【００３５】
ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡは、その代表的な選択的スプライシング体、同族体、若しくは変異体と共通した標的配列を含むことが理解される。従って、そのような共通標的配列を有する単一ｓｉＲＮＡは、前記共通標的配列を含むそれら異なるｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を誘導することができる。
【００３６】
本発明のｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、若しくは組換え的に産生されたＲＮＡ、さらに１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換及び／若しくは変更によって天然由来のＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含むことができる。そのような改変は、前記ｓｉＲＮＡの末端或いは前記ｓｉＲＮＡの１若しくはそれ以上の内部ヌクレオチドなどへの非ヌクレオチド物質の付加、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に耐性にする修飾（例えば、２’−置換リボヌクレアーゼの使用、或いは糖リン酸バックボーンへの修飾など）、若しくは前記ｓｉＲＮＡにおける１若しくはそれ以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレアーゼでの置換、を含むことができる。血清、涙液（ｌａｃｈｒｙｍａｌ ｆｌｕｉｄ）、或いはヌクレアーゼが豊富な環境に曝されたｓｉＲＮＡ、若しくは局所的に運搬された（例えば目薬などによって）ｓｉＲＮＡは、好ましくはそれらのヌクレアーゼ分解に対する耐性が増加するように改変されている。例えば、血管内に、或いは眼へ局所的に投与されるｓｉＲＮＡは、１若しくはそれ以上のホスホロチオネート結合を有することができる。
【００３７】
本発明のｓｉＲＮＡの１若しくは両方の鎖は、３’オーバーハングも有することができる。ここで用いられたように、"３’オーバーハング"は、ＲＮＡ鎖の３’末端から延びる少なくとも１つの不対ヌクレオチドを言及している。
【００３８】
従って、１実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの１〜約６ヌクレオチド長、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２〜約４ヌクレオチド長の３’オーバーハング（これはリボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドを有する）を有している。
【００３９】
ｓｉＲＮＡ分子の両鎖に３'オーバーハングを有している実施形態において、前記オーバーハングの長さは、各鎖で同じ若しくは異なってもよい。最も好ましい実施形態において、前記３’オーバーハングは、前記ｓｉＲＮＡの両鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば、本発明の前記ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（"ＴＴ"）若しくはジウリジル酸（"ｕｕ"）の３’オーバーハングを有することができる。
【００４０】
本発明のｓｉＲＮＡの安定性を増強するために、前記３’オーバーハングは、分解に対しても安定化される。１実施形態において、前記オーバーハングは、アデノシン或いはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことによって安定化されている。
或いは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換（例えば、３’オーバーハングにおける２’−デオキシチミジンでのウリジンヌクレオチドの置換）は、許容性を示し、ＲＮＡｉ分解の効率には影響を与えない。特に、２’−デオキシチミジンにおける２’−ヒドロキシの非存在は、組織培養液において３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性を著しく増強する。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ若しくはＮＡ（Ｎ２１）の配列を有しており、ここでＮはあらゆるヌクレオチドである。これらのｓｉＲＮＡは、約３０〜７０％のＧ／Ｃを有しており、好ましくは約５０％のＧ／Ｃを有している。前記センスｓｉＲＮＡ鎖の配列はそれぞれ、（Ｎ１９）ＴＴ若しくはＮ２１に対応する（すなわち３〜２３位）。後者の場合、前記センスｓｉＲＮＡ鎖の３’末端は、ＴＴに変換されている。この配列変換の原理は、前記センス及びアンチセンス鎖３’オーバーハングの配列組成に関して対称的な二本鎖を生成することである。次に、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は、前記センス鎖の１〜２１位に対して相補的に合成される。
【００４２】
これらの実施形態における前記２３ヌクレオチドセンス鎖の１位は、前記アンチセンス鎖によって配列特異的に認識されないため、前記アンチセンス鎖の３’−ヌクレオチド残基のほとんどは、慎重に選択される。しかしながら、前記アンチセンス鎖の最後から２番目のヌクレオチド（どの実施形態においても前記２３−ヌクレオチドセンス鎖の２位に相補的である）は、一般的に前記標的配列に相補的である。
【００４３】
別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、ＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮの配列を有しており、ここでＲはプリン（例えばＡ或いはＧ）であり、Ｙはピリミジン（例えばＣ或いはｕ／Ｔ）である。従って、この実施形態の代表的な２１−ヌクレオチドセンス及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、一般的にプリンヌクレオチドで始まる。そのようなｓｉＲＮＡは、最初に転写されたヌクレオチドがプリンである場合、ｐｏｌＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現のみが有効であると考えられている時、ターゲティング部位における変更なしに、ｐｏｌＩＩＩ発現ベクターから発現され得る。
【００４４】
本発明のｓｉＲＮＡは、いくつかの標的ｍＲＮＡ配列（前記"標的配列"）における約１９〜２５近接ヌクレオチドの任意のストレッチ（伸展）を標的にすることができる。ｓｉＲＮＡの標的配列を選択する技術は、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ Ｔらの"Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ"（２００２年１０月１１日改訂）において記載されており、この全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。"Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ"は、Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ Ｔｕｓｃｈｌ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡＧ １０５，Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７０７７ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって維持されているウェブサイトで利用可能であり、さらに、Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトにアクセスし、キーワード"ｓｉＲＮＡ"で検索すると見つけることができる。従って、本発明のｓｉＲＮＡの前記センス鎖は、前記標的ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５ヌクレオチドの任意の近接ストレッチと実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する。
【００４５】
一般的に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、前記標的ｍＲＮＡに一致するように、好ましくは開始コドンから５０〜１００ｎｔ下流（すなわち３’方向で）で開始するように、定められたｃＤＮＡ配列から選択され得る。ただし、前記標的配列は、５’或いは３’非翻訳領域に、若しくは開始コドン近隣の領域に位置付けされ得る。例えば、ヒトＡｎｇ２ ｃＤＮＡ配列における適切な標的配列は、
【００４６】
【化１】
【００４７】
従って、配列ＩＤ番号１２を標的とし、３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００４８】
【化２】
【００４９】
配列ＩＤ番号１２を標的とするが、３’ＴＴオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００５０】
【化３】
【００５１】
ヒトＡｎｇ２ ｃＤＮＡ配列からの別の標的配列は、
【００５２】
【化４】
【００５３】
従って、配列ＩＤ番号１７を標的とし、３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００５４】
【化５】
【００５５】
配列ＩＤ番号１７を標的とするが、３’ＴＴオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００５６】
【化６】
【００５７】
ヒトＡｎｇ１ ｃＤＮＡ配列における適切な標的配列は、
【００５８】
【化７】
【００５９】
従って、配列ＩＤ番号２２を標的とし、３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００６０】
【化８】
【００６１】
配列ＩＤ番号２２を標的とするが、３’ＴＴオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００６２】
【化９】
【００６３】
ヒトＡｎｇ１ ｃＤＮＡからの別の標的配列は、
【００６４】
【化１０】
【００６５】
配列ＩＤ番号２７を標的とするが、３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００６６】
【化１１】
【００６７】
配列ＩＤ番号２７を標的とするが、３’ＴＴオーバーハング（オーバーハングは太字で示してある）を各鎖に持つ本発明のｓｉＲＮＡは、
【００６８】
【化１２】
【００６９】
本発明のｓｉＲＮＡを導くことができる別のＡｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２標的配列は、ここに示したものを含む。適切なヒトＡｎｇ１標的配列は、配列ＩＤ番号３２〜２２７を含み、適切なヒトＡｎｇ２標的配列は、配列ＩＤ番号２２８〜４２７を含み、適切なヒトＴｉｅ２標的配列は、配列ＩＤ番号４２８〜７３９を含む。ここに示された前記標的配列は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｃＤＮＡを参照しており、従ってこれらの配列は、"Ｔ"で表されたデオキシチミジンを含むことが理解される。当業者は、前記ｍＲＮＡの実際の標的配列において、デオキシチミジンは、ウリジン（"ｕ"）で置換され得ることが理解されるであろう。同様に、本発明のｓｉＲＮＡ内に含まれる標的配列は、デオキシチミジンの代わりにウリジンも含むことができる。
【００７０】
本発明のｓｉＲＮＡは、当業者に知られた多くの技術を用いて得られる。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、化学的に合成される、若しくは、ショウジョウバエｉｎ ｖｉｔｒｏシステム（Ｔｕｓｃｈｌらの米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号に記載されており、その全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）など、本分野で知られた方法を用いて組換え技術的に産生される。
【００７１】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト、及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学的に合成される。前記ｓｉＲＮＡは、２つの分離した相補的ＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として合成され得る。合成ＲＮＡ分子若しくは合成試薬の商業的供給元としては、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，コロラド州、米国）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、バージニア州、米国）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、マサチューセッツ州、米国）及びＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，英国）を含む。
【００７２】
或いは、ｓｉＲＮＡは、任意の適切なプロモーターを用いて、組換え環状若しくは直線ＤＮＡプラスミドからも発現され得る。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現するために適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、及びサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技術範囲内である。本発明の前記組換えプラスミドは、特定の組織内若しくは特定の細胞内環境において、前記ｓｉＲＮＡの発現を誘導可能な或いは制御可能なプロモーターも有することができる。
【００７３】
組換えプラスミドから発現された前記ｓｉＲＮＡは、標準的な技術によって培養細胞発現システムから単離され得る、若しくは細胞内的に発現され得る。本発明の前記ｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで細胞へ運搬するための組換えプラスミドの使用は、以下により詳細に説明されている。
【００７４】
本発明のｓｉＲＮＡは、組換えプラスミドから２つの分離した相補的ＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として発現され得る。
【００７５】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するために適したプラスミドの選択、前記ｓｉＲＮＡを発現するために前記プラスミドへ核酸配列を挿入するための方法、及び目的の細胞へ前記組換えプラスミドを運搬する方法は、当業者の技術の範囲内である。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６〜４４８、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ＴＲ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０〜５５３、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７〜５００、Ｐａｄｄｉｓｏｎ ＰＪ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：９４８〜９５８、Ｌｅｅ ＮＳ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００〜５０５、及びＰａｕｌ ＣＰ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５〜５０８を参照のこと。また、これらの全体の開示は、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７６】
１実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡを発現するプラスミドは、ヒトＵ６ ＲＢＡプロモーターの制御下で、ｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化するセンスＲＮＡ鎖と、ヒトＵ６ ＲＢＡプロモーターの制御下で、ｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化するアンチセンスＲＮＡ鎖とを有している。そのようなプラスミドは、本発明のｓｉＲＮＡを発現するための組換えアデノ随伴ウイルスベクターを産生する際に用いられ得る。
【００７７】
ここで用いられたように、"ｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した"とは、前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖をコード化した核酸配列が、５’方向で前記ｐｏｌｙＴ終止シグナルにすぐに隣接していることを意味している。前記プラスミドからの前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖の転写の間、前記ｐｏｌｙＴ終止シグナルは、転写を終了するように働く。
【００７８】
ここで用いられたように、プロモーターの"制御下"とは、前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖をコード化した核酸配列は、前記プロモーターが前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖コード配列の転写を開始できるように、前記プロモーターの３’に位置付けられていることを意味する。
【００７９】
本発明のｓｉＲＮＡは、組換えウイルスベクターから細胞内にｉｎ ｖｉｖｏで発現され得る。本発明の前記組換えウイルスは、本発明のｓｉＲＮＡをコード化した配列と、前記ｓｉＲＮＡを発現するための適切なプロモーターとを有している。適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、及びサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技術範囲内である。本発明の前記組換えウイルスは、特定の組織内若しくは特定の細胞内環境において前記ｓｉＲＮＡの発現を誘導可能若しくは制御可能なプロモーターも有することができる。本発明のｓｉＲＮＡを細胞へｉｎ ｖｉｖｏで運搬するための組換えウイルスの使用は、以下により詳細に説明されている。
【００８０】
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離された相補的ＲＮＡ分子として、若しくは２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として、組換えウイルスベクターから発現され得る。
【００８１】
発現される前記ｓｉＲＮＡ分子に対するコード配列を許容する能力を有するウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス、及びその同等物から由来したベクターが用いられ得る。ウイするベクターの指向性は、エンベロープタンパク質を有する前記ベクターのシュードタイピング、或いは他のウイルスからの他の表面抗原によって、若しくは異なるウイルスキャプシドタンパク質で置換することによって、適切に修飾され得る。
【００８２】
例えば、本発明のレンチウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ（Ｍｏｋｏｌａ）、及びその同等物からの表面タンパク質でシュードタイピング化され得る。本発明のＡＡＶベクターは、異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することによって異なる細胞を標的にするように作成され得る。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２キャプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ ２／２ベクターにおけるこの血清型２キャプシド遺伝子は、血清型５キャプシド遺伝子によって置換され、ＡＡＶ ２／５ベクターを産生する。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、当業者の技術範囲内であり、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１〜８０１を参照のこと（この全体の開示は、この参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
本発明の使用に適した組換えウイルスベクターの選択、前記ｓｉＲＮＡを発現するために核酸配列をベクターへ挿入する方法、及び前記ウイルスベクターを目的の細胞へ運搬する方法は、当業者の技術範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１〜３１０、Ｅｇｌｉｔｉｓ ＭＡ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８〜６１４、Ｍｉｌｌｅｒ ＡＤ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５〜１４、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＷＦ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５〜３０、及びＲｕｂｉｎｓｏｎ ＤＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１〜４０６を参照し、これら全体の開示は、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８４】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶ及びＡＶＶから由来したものである。特に好ましい実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分離された相補的一本鎖ＲＮＡ分子として、例えばＵ６或いはＨ１ ＲＮＡプロモーター、若しくはサイトメガロウイルス（ＡＭＶ）プロモーターを有する組換えＡＡＶベクターから発現される。
【００８５】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するのに適切なＡＶベクター、前記組換えＡＶベクターを構築するための方法、及び標的細胞へ前記ベクターを運搬するための方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０に記載されている。
【００８６】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するために適切なＡＶベクター、前記組換えＡＶベクターを構築するための方法、及び、標的細胞へ前記ベクターを運搬するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６〜３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ ＫＪ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０〜５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２６、米国特許番号第５，２５２，４７９号、米国特許番号第５，１３９，９４１号、国際特許番号第ＷＯ ９４／１３７８８号明細書、及び国際特許番号第ＷＯ ９３／２４６４１号明細書に記載されており、これら全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
前記標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こす所定の標的配列を含むｓｉＲＮＡの能力は、細胞内のＲＮＡ若しくはタンパク質のレベルを測定するための標準的な技術を用いて評価され得る。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、培養細胞へ運搬され得、標的ｍＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット或いはドットブロッティング技術によって、若しくは定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定され得る。或いは、培養細胞におけるＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡ若しくはウエスタンブロットによって測定され得る。培養細胞へのｓｉＲＮＡの運搬に適切なプロトコール、及び培養細胞内におけるタンパク質及びｍＲＮＡレベルを検出するためのアッセイは、以下の実施例に示されている。
【００８８】
例えば、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を自然に発現した細胞、若しくは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を発現するように誘導された細胞は、例えば、１２或いは２５ウェル培養プレート或いは９６ウェルマイクロタイタープレートなどの適切な細胞培養容器においてコンフルエンスまで増殖される。本発明のｓｉＲＮＡは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２発現細胞の第１の群へ投与され得る。非特異的ｓｉＲＮＡ（若しくはｓｉＲＮＡなし）は、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２発現細胞の第２の群へ、対照として投与され得る。前記細胞は洗浄され、マイクロタイタープレートウェルへ１〜２％パラホルムアルデヒドで直接固定される。マイクロタイタープレートの非特異的結合部位は、２％ウシ血清アルブミンでブロックされ、前記細胞は、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２若しくはＴｉｅ２特異的モノクローナル抗体とインキュベートされる、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２抗体の結合は、例えば、１：１０００倍希釈のビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，メリーランド州）と１時間３７℃で、さらに１：１０００倍希釈のベータ−ガラクトシダーゼ共役ストレプトアビジン（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１時間３７℃でインキュベーションすることによって検出され得る。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２特異的モノクローナル抗体へのベータ−ガラクトシダーゼ結合の量は、例えば、マイクロタイタープレートを３．３ｍＭ クロロフェノールレッド−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２の溶液（ｐＨ７．２）中、２〜１５分３７℃で展開し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて５７５ｎＭで結合した抗体の濃度を測定することによって決定される。
【００８９】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２発現を下方制御する本発明のｓｉＲＮＡの能力も、当業者の技術範囲内の技術を用いて、ウシ網膜内皮細胞（ＢＲＥＣｓ）による管腔形成を測定することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで評価され得る。管腔形成の阻害は、本発明のｓｉＲＮＡによるＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２の下方制御を示している。
【００９０】
適切なＢＲＥＣ管腔形成アッセイは、５．５ｍＭ グルコース、１０％血小板由来ウマ血清（ＰＤＨＳ；Ｗｈｅａｔｏｎ，Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ，ペンシルバニア州）、５０ｍｇ／ｍＬヘパリン、及び５０Ｕ／ｍＬ内皮細胞増殖因子（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むフィブロネクチン−コーティングディッシュ上でＢＲＥＣｓを培養する工程を有する。管腔形成アッセイで使用するのに適したＢＲＥＣｓは、因子ＶＩＩＩ抗原に対する免疫反応性によって内皮均一性を示し、光学顕微鏡で確認されたように、これらの条件下で形態学的に変化せずにいるものである。
【００９１】
管腔形成アッセイは、Ｋｉｎｇ ＧＬ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：１０２８〜１０３６（１９８５）、及びＯｔａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８２：６１９〜６２８（１９９８）に記載されたように実行され得、これら全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。簡潔には、５マイクログラム／ｍＬフィブロネクチン及び５マイクログラム／ｍＬラミニンを含む、１０Ｘ ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）中にＶｉｔｒｏｇｅｎ １００（Ｃｅｌｔｒｉｘ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，カリフォルニア州）、０．２Ｎ ＮａＯＨ、及び２００ｍＭ ＨＥＰＥＳを８：１：１（４００マイクロリットル）で含む混合液を２４ウェルプレートに添加する。ゲルの重合後、１．０ｘ１０５の培養ＢＲＥＣｓを前記ウェルへ播種し、２０％ ＰＤＨＳを含むＤＭＥＭで２４時間３７℃でインキュベートした。当業者には既知であるように、その形状と管の長さを最適化するために細胞数を数えた（Ｋｉｎｇ ＧＬ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ｓｕｐｒａ、及びＯｔａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ｓｕｐｒａを参照のこと）。次に培地を除去し、追加のコラーゲンゲルを細胞層の上へ投入した。ＢＲＥＣｓによって形成された管状構造の表面積あたりの密度を測定するために、コラーゲンゲルになる前に、各ウェルの底の中央領域に基準点をランダムにマークした。次に、ＶＥＧＦ若しくは低酸素条件培地を前記ウェルに添加し、管腔形成を誘導した。次に、本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡは、任意の最適な手順によって（以下参照）特定のウェルのＢＲＥＣｓへ導入された。他のウェルは、対照として、ｓｉＲＮＡなし若しくは非特異的ｓｉＲＮＡで処理された。対照ウェルと比較した場合の、ｓｉＲＮＡで処理されたウェルにおける管腔形成の阻害は、標的ＲＮＡの発現が阻害されたことを示している。
【００９２】
本発明のｓｉＲＮＡによるＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解は、網膜症の未熟度（"ＲＯＰ"）若しくは脈絡叢新血管新生（"ＣＮＶ"）ラット或いはマウスモデルなどの、新血管新生の動物モデルでも評価され得る。例えば、ＣＮＶラット或いはマウスにおける新血管新生の領域は、以下の実施例６にあるように、本発明のｓｉＲＮＡの投与前後で測定され得る。前記ｓｉＲＮＡの投与による新血管新生領域の減少は、標的ｍＲＮＡの下方制御、及び血管新生の阻害を示している。標的ｍＲＮＡの下方制御及び血管新生の阻害は、以下のような、ストレプトゾトシン誘導糖尿病性網膜症ラットモデル（実施例３）、ＶＥＧＦ誘導網膜血管透過性及び白血球増多症（ｌｅｕｋｏｓｔａｓｉｓ）のラットモデル（実施例４）、及び角膜／角膜縁損傷によって誘導された眼球新血管新生のラットモデル（実施例５）でも例示されている。
【００９３】
Ｔａｋａｇｉら（２００３，ｓｕｐｒａ）で記載されたように、虚血誘導網膜新血管新生のマウスモデルは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２の本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ仲介性分解を検出するためにも用いられ得る。簡潔には、７日齢（"出産後日数７"若しくは"Ｐ７"）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのリターは、７５％±２％酸素に５日間さらされ、次にＰ１２で部屋の空気に戻され、網膜新血管新生を形成した。部屋の空気で維持された同年齢のマウスは、対照として用いた。最大網膜新血管新生は、一般的にＰ１７で観察され、５日後部屋の空気に戻された。本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡは、網膜下で各処理動物の１つの眼に、Ｐ１２とＰ１４で注入された。ｓｉＲＮＡなし、若しくは非特異的ｓｉＲＮＡは、反対側の眼に対象として注入された。Ｐ１７で、前記マウスはＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（１ｍＬ）による心臓灌流によって殺戮され、眼は脱核され、パラフィン包埋する前に、４％パラフォルムアルデヒドによって、４℃、オーバーナイトで固定された。前記パラフィン包埋された眼の連続的な切片は、網膜における新血管新生の程度を観察するために得られる。対照と比較した場合、本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡで処理された眼の網膜における新血管新生の減少は、標的ｍＲＮＡの発現の阻害を示している。
【００９４】
上で議論したように、本発明のｓｉＲＮＡは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体のＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こすことができる。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及び／若しくはＴｉｅ２遺伝子からの機能的遺伝子の産生を減少する。従って、本発明は、対象におけるＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、標的ｍＲＮＡが分解されるように、本発明のｓｉＲＮＡの有効量を対象へ投与する工程を有している。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２遺伝子の産生が血管新生に関与しているので、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解による、対象における血管新生を阻害する方法も提供する。
【００９５】
本発明の方法の実施において、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２ ｍＲＮＡに異なる標的配列を有する２若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡは、対象に投与され得る。同様に、異なる標的ｍＲＮＡ（すなわち、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２ ｍＲＮＡ）からの標的配列をそれぞれ有している２若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡは、対象へ投与され得る。
【００９６】
上述したように、Ｔｉｅ２と結合したＡｎｇ１若しくはＡｎｇ２は、ＶＥＧＦ存在下で血管新生を促進するように見え、Ｔｉｅ２と結合したＡｎｇ２は、低酸素条件下で血管新生を促進するように見える。しかしながら、ＶＥＧＦ及び／若しくは低酸素条件がＡｎｇ１、Ａｎｇ２、及びＴｉｅ２仲介性血管新生に必要とされているかどうかは、明らかではない。従って、本発明の方法の実施において、ＶＥＧＦ若しくは低酸素の存在を検証する必要はない。
【００９７】
ここで用いられたように、"対象"とは、ヒト、若しくは非ヒト動物を含む。好ましくは、前記対象はヒトである。
【００９８】
ここで用いられたように、ｓｉＲＮＡの"有効量"とは、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解を引き起こすのに十分な量、若しくは対象内の血管新生の進行を阻害するのに十分な量である。
【００９９】
前記標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解は、上述したように、ｍＲＮＡ若しくはタンパク質を単離し定量するための標準的な技術を用いて、対象の細胞内の前記標的ｍＲＮＡ若しくはタンパク質のレベルを測定することによって検出され得る。
【０１００】
血管新生の阻害は、対象における病原性若しくは非病原性血管新生の進行を直接測定することによって、例えば、本発明のｓｉＲＮＡで処理する前後の新血管新生領域のサイズを観察することによって、評価され得る。もし新血管新生領域のサイズが同じ若しくは減少していれば、血管新生の阻害を示している。対象内の新血管新生領域のサイズを観察し測定するための技術は、当業者の技術範囲内であり、例えば、脈絡叢新血管新生の領域は検眼鏡検査によって観察され得る。
【０１０１】
血管新生の阻害は、血管新生に関連した病的状態の変化若しくは逆転を観察することを通じても推測され得る。例えば、ＡＭＤにおいて、失明の遅延、停止、若しくは逆転は、脈絡叢における血管新生の阻害を示している。腫瘍に対しては、腫瘍成長の遅延、停止、或いは逆転、若しくは腫瘍転移の遅延或いは停止は、腫瘍部位での若しくはその周辺での血管新生の阻害を示している。非病原性血管新生の阻害は、例えば、本発明のｓｉＲＮＡの投与に対して脂肪消失若しくはコレステロールレベルの減少などからも推測され得る。
【０１０２】
本発明のｓｉＲＮＡは、半化学量論的な量で、ＲＮＡ干渉を仲介（及び血管新生を阻害）できることが理解される。あらゆる理論で束縛されることなく、本発明のｓｉＲＮＡは、触媒作用的方法で前記標的ｍＲＮＡを分解するためにＲＩＳＣを誘導すると考えられる。従って、細胞接着若しくは細胞接着仲介性病状に対する標準的な治療法と比較して、治療的効果を得るために必要とされる、対象に投与するｓｉＲＮＡは著しく少ない。
【０１０３】
当業者は、対象のサイズ及び体重、新血管新生の程度若しくは病状進行度、年齢、対象の健康や性別、投与経路、及び、投与が局所的か全身的かどうか、などの要因を考慮にいれることによって、ある対象に投与される本発明のｓｉＲＮＡの有効量を容易に決定できる。一般的に、本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、新血管新生部位或いはその周辺の細胞間濃度で約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭを含む。特に好ましい本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、新血管新生部位或いはその周辺の細胞間濃度で約１ｎＭ、約５ｎＭ、若しくは約２５ｎＭを含むことができる。ｓｉＲＮＡのより多くの或いはより少ない有効量を投与され得ることも考えられる。
【０１０４】
本発明の方法は、非病原性な血管新生、すなわち、対象における正常な過程に起因する血管新生を阻害するために用いられ得る。非病原性血管新生の例としては、子宮内膜新血管新生、及び脂肪組織或いはコレステロールの産生に関与する過程などがある。従って、本発明は、例えば、体重をコントロールする或いは脂肪消失を促進する、コレステロールレベルを減少する、月経周期の阻害、若しくは堕胎薬としてなどの目的で、非病原性血管新生を阻害するための方法を提供する。
【０１０５】
本発明の方法は、血管新生病、すなわち、病原性が不適切な或いは無制御な血管新生を導く疾患、に関連した血管新生も阻害することができる。例えば、多くの癌性固体腫瘍は、その主要部位やその周辺に血管新生を誘導することによって、それら自身のために十分な血液供給を生む。この腫瘍誘導性血管新生は、腫瘍成長にしばしば必要とされ、転移細胞が血流に入ることを可能にする。
【０１０６】
他の血管新生病は、ＡＭＤ、乾癬、リウマチ性関節炎、及び他の炎症性疾患を含む。これらの疾患は、新血管新生の領域における新しい血管の形成によって起こる正常組織の破壊によって特徴付けられる。例えば、ＡＭＤのｗｅｔ型において、脈絡叢は毛細血管に浸潤され破壊されている。ＡＭＤにおける脈絡叢の血管新生−駆動型の破壊は、最終的に部分的或いは完全な失明を引き起こす。
【０１０７】
別の実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ仲介性分解によって、Ｉ型糖尿病から生じる合併症を有する対象を治療する方法を提供する。好ましくは、本発明の方法によって治療されるＩ型糖尿病から生じた合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性腎症、及び大血管性疾患（冠動脈疾患、脳血管疾患、及び末梢血管疾患）である。
【０１０８】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、例えば、乳癌、肺癌、頭頚部癌、脳癌、腹腔癌、大腸癌、直腸結腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌（例えば黒色腫）、リンパ腫、及び血液癌などの癌に関連した固体腫瘍の成長若しくは転移を阻害するために用いられる。
【０１０９】
より好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性腎症、及び大血管性疾患などのＩ型糖尿病から生じる合併症を治療するために用いられる。
【０１１０】
特に好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、例えば、ＡＭＤにおける脈絡叢新血管新生を阻害するためなど、眼球新血管新生を阻害するために用いられる。
【０１１１】
血管新生病を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡは、本発明のｓｉＲＮＡとは異なる医薬品との組み合わせで、対象に投与され得る。或いは、本発明のｓｉＲＮＡは、血管新生病を治療するように設計された別の治療方法と組合わせて、対象に投与され得る。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、癌を治療するために或いは腫瘍転移を阻止するために従来用いられている治療方法（例えば、放射線療法、化学療法、及び手術）と組合わせて投与され得る。腫瘍を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、放射線療法を組合わせて、若しくはシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、若しくはタモキシフェンなどの化学療法薬と組合わせて、対象へ投与される。
【０１１２】
本発明において、本発明のｓｉＲＮＡは、裸のｓｉＲＮＡとして、運搬試薬と併せて、若しくは前記ｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミド或いはウイルス性ベクターとして、対象へ投与され得る。
【０１１３】
本発明のｓｉＲＮＡと併せて投与するための適切な運搬試薬は、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、或いはポリカチオン（例えば、ポリリシン）、若しくはリポソームを含む。好ましい運搬試薬は、リポソームである。
【０１１４】
リポソームは、網膜若しくは腫瘍組織など、特定の組織への前記ｓｉＲＮＡの運搬に役立ち、前記ｓｉＲＮＡの血液半減期も増加する。本発明における使用に適したリポソームは、中性若しくは負に荷電したリン脂質やコレステロールなどのステロールを一般的に含む、標準的なベシクル（小胞）形成脂質から形成される。脂質の選択は、望ましいリポソームサイズや血流におけるリポソームの半減期などの要因を考慮することによって一般的に導かれる。リポソームを調整するための様々な方法は既知であり、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．２：４６７、及び米国特許番号第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号に記載されており、これら全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを被包するリポソームは、血管新生部位で或いはその周辺でＡｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を発現している内皮細胞などの細胞を前記リポソームが標的とすることができるようなリガンド分子を有している。例えば、ＥＣ表面の抗原に結合したモノクローナル抗体などの、血管ＥＣに広く存在する受容体（レセプター）に結合したリガンドが好ましい。
【０１１６】
特に好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを被包する前記リポソームは、単核マクロファージ及び細網内皮性システムによって排除されることを避けるために、例えば、構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有するように、修飾される。１実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部位とリガンドの両方を有することができる。
【０１１７】
本発明のリポソームを調整する際に用いるオプソニン化阻害部位は、リポソーム膜に結合された一般的に大きい親水性ポリマーである。ここで用いられたように、例えば、膜自体へ脂質可溶性アンカーを挿入することによって、或いは、膜脂質の活性基へ直接結合することによって、それが前記膜に化学的に若しくは物理的に接着した場合、オプソニン化阻害部位は、リポソーム膜に"結合されている"。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、マクロファージ−単球システム（"ＭＭＳ"）及び、細網内皮性システム（"ＲＥＳ"）によるリポソームの取り込みを著しく減少する保護表面層を形成する（例えば、米国特許番号第４，９２０，０１６号に記載されており、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。従って、オプソニン化阻害部位で修飾されたリポソームは、修飾されていないリポソームより、より長く循環する。この理由のために、そのようなリポソームは、時々"ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）"リポソームと呼ばれる。
【０１１８】
ステルスリポソームは、多孔性若しくは"漏出性"の微小血管系から栄養を供給されている組織内で蓄積することで知られている。従って、そのような微小血管系の欠損によって特徴付けられている組織、例えば固体腫瘍などは、これらリポソームを効果的に蓄積するであろう（Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，１８：６９４９〜５３を参照のこと）。加えて、ＲＥＳによって減少された取り込みは、肝臓や脾臓における深刻な蓄積を阻害することによって、ステルスリポソームの毒性を低くする。従って、オプソニン化阻害部位で修飾された本発明のリポソームは、本発明のｓｉＲＮＡを腫瘍細胞へ運搬するために特に適している。
【０１１９】
リポソームを修飾するために適したオプソニン化阻害部位は、好ましくは約５００〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、若しくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体、例えば、メトキシＰＥＧ、及びＰＥＧ或いはＰＰＧステアレート、ポリアクリルアミド或いはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー、直線、分岐、或いはデンドリメリック（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ）ポリアミドアミン、ポリアクリル酸、例えばカルボキシル基或いはアミノ基が化学的に結合されたポリビニルアルコールやポリキシリトールなどのポリアルコール、及びガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドを含む。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、若しくはメトキシＰＥＧのコポリマー、若しくはそれらの誘導体も適している。加えて、前記オプソニン阻害ポリマーは、ＰＥＧのブロックコポリマー、及びポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、若しくはポリヌクレオチドであり得る。前記オプソニン化阻害ポリマーは、例えば、ガラクツロン酸、グルコロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン、アミン化多糖類或いはオリゴ糖（直線或いは分岐）、若しくはカルボキシル化多糖類或いはオリゴ糖（例えばカルボン酸の誘導体と反応した結果、カルボキシル酸と結合している）などの、アミノ酸もしくはカルボキシル酸を含む天然多糖類でもあり得る。
【０１２０】
好ましくは、前記オプソニン化阻害部位は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、若しくはそれらの誘導体である。ＰＥＧ若しくはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、時々"ＰＥＧ化リポソーム"と呼ばれる。
【０１２１】
前記オプソニン化阻害部位は、多数のよく知られた技術の任意の１つによってリポソーム膜へ結合され得る。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーへ結合され、次に膜へ結合され得る。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３及びテトラヒドロフランと水（３０：１２の割合）などの溶媒混合液を用いて、６０℃で、還元性アミノ化を介してステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化され得る。
【０１２２】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドは、上で説明された。そのような組換えプラスミドは、直接、若しくはＭｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＬＴ１親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェチン、ポリカチオン（例えばポリリシン）、若しくリポソームを含む適切な運搬試薬との組み合わせでも投与され得る。本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えウイルス性ベクターも、上述されており、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を発現している対象の細胞へそのようなベクターを運搬するための方法は、当業者の技術範囲内である。
【０１２３】
本発明のｓｉＲＮＡは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を発現している細胞へ前記ｓｉＲＮＡを運搬するために適した任意の手段によって、対象へ投与され得る。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、遺伝子銃、電気穿孔法によって、若しくは他の適切な非経口的或いは経腸性経路によって、投与され得る。
【０１２４】
適切な経腸性投与経路は、経口、直腸、若しくは鼻腔内運搬を含む。
【０１２５】
適切な非経口的投与経路は、血管内投与（例えば静脈内大量瞬時投与、静脈内注入、動脈内大量瞬時投与、動脈内注入、及び脈管腔増へのカテーテル滴下）、組織周囲及び組織内投与（例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注射、網膜内注射、或いは網膜下注射）、皮下注射或いは（例えば浸透圧性ポンプによる）皮下注入を含む堆積、例えばカテーテル或いは他の配置装置（例えば角膜ペレット或いは坐薬、目薬、若しくは多孔性、非多孔性、或いはゼラチン物質からなる移植片）などの新血管新生部位の或いはその周辺の領域への直接的（例えば局所的）施用、及び吸引を含む。適切な配置装置は、眼球移植片（米国特許番号第５，９０２，５９８号、及び第６，３７５，９７２号に記載されている）、及び生物分解性眼球移植片（米国特許番号第６，３３１，３１３、号に記載されており、これら全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる）を含む。そのような眼球移植片は、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，マサチューセッツ州）及びＯｃｕｌｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，カリフォルニア州）から利用可能である。
【０１２６】
好ましい実施形態において、前記ｓｉＲＮＡの注射若しくは注入は、親血管新生部位で、或いはその周辺で行われる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、眼の網膜色素上皮細胞へ運搬され得る。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡは、例えば、下眼瞼或いは結膜円蓋に対しては液体或いはゲル形態で、若しくは電気穿孔法或いはイオン注入によって、眼へ局所的に投与され、これは当業者の技術範囲内である（例えば、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ．ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３０：４２１〜４２９を参照のこと、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２７】
一般的に、本発明のｓｉＲＮＡは、約５マイクロリットル〜約７５マイクロリットル、好ましくは約１０マイクロリットル〜約３０マイクロリットルの容量で、眼へ局所的に投与される。本発明のｓｉＲＮＡは、水溶性溶液に非常に可溶し、７５マイクロリットル以上の容量でのｓｉＲＮＡの眼への局所的滴下は、流出や排出による眼からのｓｉＲＮＡの損出を生じることが理解される。従って、約５マイクロリットル〜約７５マイクロリットルの容量での眼への局所的滴下によって、高濃度のｓｉＲＮＡ（例えば約１０〜約２００ｍｇ／ｍｌ、若しくは約１００〜約１０００ｎＭ）を投与することが好ましい。
【０１２８】
特に好ましい非経口的投与経路は、眼内投与である。本発明のｓｉＲＮＡの眼内投与は、この投与経路によると前記ｓｉＲＮＡが眼へ入ることが可能である限り、眼への注射或いは直接（例えば局所的）投与によって達成され得る。上述した眼への局所的経路の投与に加えて、適切な眼内経路の投与は、硝子体内、網膜下、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼窩周囲及び眼窩後、トランス−角膜、及びトランス−強膜投与を含む。そのような眼内投与経路は、当業者の技術範囲内であり、例えば、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ ｅｔ ａｌ，２００２，ｓｕｐｒａ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１７６３〜１７６９、及びＡｍｂａｔｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２１：１４５〜１５１を参照のこと（これら全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２９】
本発明のｓｉＲＮＡは、単一用量で、若しくは複数用量で投与され得る。本発明のｓｉＲＮＡの投与が注入によるものである場合、前記注入は単一持続性用量であり得る、若しくは複数注入によって運搬され得る。
【０１３０】
当業者は、本発明のｓｉＲＮＡを所定の対象へ投与するための適切な用量も容易に決定できる。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、新血管新生部位へ或いはその周辺へ、単一注射或いは堆積によって対象へ１度投与され得る。或いは、前記ｓｉＲＮＡは、毎日若しくは毎週、複数回対象へ投与され得る。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、約３〜約２８週間、より好ましくは約７〜約１０週間の期間で１週間に１回、対象へ投与され得る。好ましい用量において、前記ｓｉＲＮＡは、１週間に１回で７週間、新血管新生部位へ或いはその周辺へ（例えば硝子体内で）注射される。不確定の長さの期間に対する本発明のｓｉＲＮＡの周期的な投与は、ｗｅｔ ＡＭＤ或いは糖尿病性網膜症などの慢性的な新血管新生疾患を患っている対象に対して必要とされることが理解される。
【０１３１】
用量が複数投与である、或いはそれぞれが異なる標的配列を有している２若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡの投与である場合、対象へ投与されるｓｉＲＮＡの有効量は、全体の用量以上に投与されるｓｉＲＮＡの総量を有することができることが理解される。
【０１３２】
本発明のｓｉＲＮＡは、本分野では既知である技術に従って、対象へ投与される前に、好ましくは薬学的組成物として処方される。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌で発熱物質がないものとして特徴付けられる。ここで用いられたように、"薬学的製剤"は、ヒト及び獣医学使用に対する製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調整するための方法は、当業者の技術範囲内であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ペンシルバニア州（１９８５））に記載されており、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
本発明の薬学的処方は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合された、本発明のｓｉＲＮＡ（例えば０．１〜９０重量％）若しくはそれらの生理学的に許容可能な塩類を含む。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は、水、緩衝化水、正常生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、及びそれらの同等物である。
【０１３４】
本発明の薬学的組成物は、従来の薬学的賦形剤及び／若しくは添加物も有することができる。適切な薬学的賦形剤は、安定剤、抗酸化剤、重量モル浸透圧濃度調整剤、緩衝液、及びｐＨ調整剤を含む。適切な添加物は、生理学的な生体適合性緩衝液（例えばトロメタミン塩酸塩）、キレート（ｃｈｅｌａｎｔｓ）の添加物（例えば、ＤＴＰＡ若しくはＤＴＰＡビスアミドなど）或いはカルシウムキレート複合体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡビスアミド）、若しくは任意に、カルシウム或いはナトリウム塩（例えば、塩酸カルシウム、アルコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、或いは乳酸カルシウム）を含む。本発明の薬学的組成物は、液体形態での使用に対しては包装され得る、若しくは凍結乾燥され得る。
【０１３５】
眼への局所的投与に対して、従来の眼内運搬試薬を用いることができる。例えば、局所的眼内運搬に対する本発明の薬学的組成物は、上述したように、生理食塩水、角膜浸透増強剤、不溶性粒子、ワセリン或いは他のゲルベース軟膏、ポリマー、眼への滴下用に粘性が増加されたポリマー、若しくは粘膜付着性ポリマーを有することができる。好ましくは、眼内運搬試薬は、角膜浸透を増加する、若しくは粘性効果を介して、或いは角膜上皮を覆うムチン層との物理化学的相互作用によってｓｉＲＮＡの眼球前面保持を延長する。
【０１３６】
局所的眼内運搬に適切な不溶性粒子は、リン酸カルシウム粒子（Ｂｅｌｌらによる米国特許番号第６，３５５，２７１号に記載されており、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）を含む。眼への滴下用に粘性が増加されたポリマーは、例えば、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ ４０７（例えば２５％の濃度で）、セルロースアセトフタレート（例えば３０％の濃度で）、若しくは例えばＧｅｌｒｉｔｅ（登録商標）（ＣＰ Ｋｅｌｃｏ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，デラウェア州で購入可能）などの低級アセチルゲル化（ｇｅｌｌａｎ）ガムなどのポリエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む。適切な粘膜付着性ポリマーは、例えばカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミド基及び／若しくは硫酸基などの複数の親水性機能基を有する親水コロイド、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸、高分子量ポリエチレングリコール（例えば>２００，０００平均分子量）、デキストラン、ヒアルロン酸、ポリガラクツロン酸、及びキシロカン（ｘｙｌｏｃａｎ）を含む。適切な角膜浸透増強剤は、シクロデキストリン、ベンザルコニウム塩化物、ポリオキシエチレングリコールラウリルエーテル（例えばＢｒｉｊ（登録商標）３５）、ポリオキシエチレングリコールステアリルエーテル（例えばＢｒｉｊ（登録商標）７８）、ポリオキシエチレングリコールオレイルエーテル（例えばＢｒｉｊ（登録商標）９８）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジギトニン、タウロコール酸ナトリウム、サポニン、及びＣｒｅｍａｐｈｏｒ ＥＬなどのポリオキシエチレン化ヒマシ油を含む。
【０１３７】
固体組成物のために、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、炭酸マグネシウム、及びそれらの同等物など、従来の非毒性固体担体が使用され得る。
【０１３８】
例えば、経口投与のための固体薬学的組成物は、上述した任意の担体及び賦形剤、及び１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡを含むことができる。エアロゾル（吸引）投与のための薬学的組成物は、上述したようにリポソームで被包された、０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％の本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡ、及び噴霧剤を有することができる。担体は、例えば、鼻腔内運搬に対してレシチン、など要望通りに含まれることもできる。
【０１３９】
本発明は以下の限定されない実施例によって説明される。
【実施例１】
【０１４０】
Ａｎｇ２ ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡによる培養ヒト細胞におけるＡｎｇ２発現の阻害
ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ−２９３細胞）を２４ウェルプレートにおいて、３７℃、５％ＣＯ２、オーバーナイトで標準増殖培地中で培養した。細胞が約７０％コンフルエンスになった次の日に形質転換を行った。ＨＥＫ−２９３細胞を、ＣａＰｉ形質転換試薬と混合したヒトＡｎｇ２（"ｈＡＮＧ２"）ｍＲＮＡを標的にした１２の異なるｓｉＲＮＡ（各２５ｎＭ）で別々に形質転換した。これら１２のｓｉＲＮＡは、表１に記載した配列を標的にしており、全てのｓｉＲＮＡは３’ＴＴオーバーハングを各鎖に有している。対照細胞は、ＣａＰｉ形質転換試薬と混合したｓｉＲＮＡのないＣａＰｉ形質転換試薬で、若しくは高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）を標的とした非特異的ｓｉＲＮＡで形質転換した。形質転換４８時間後、増殖培地を全てのウェルから除去し、Ｑｕａｎｔｉｌｉｎｅ ｈｕｍａｎ ＡＮＧ２ ＥＬＩＳＡプロトコールに記載されたように（この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）、ヒトＡＮＧ２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ミネソタ州）を実行した。ＥＬＩＳＡ結果は、ＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析し、図１に報告した。
【０１４１】
【表１】
【０１４２】
図１から分かるように、増殖培地に分泌されたｈＡＮＧ２タンパク質のレベルは、ｈＡＮＧ２＃２、＃３、＃４、＃９及び＃１０ ｓｉＲＮＡで形質転換したＨＥＫ−２９３細胞において減少した。非特異的ｓｉＲＮＡでのＨＥＫ−２９３細胞の形質転換は、ｈＡＮＧ２タンパク質レベルに影響を与えなかった。
【０１４３】
各ウェルから増殖培地を除去した後、細胞毒性アッセイを以下のように各細胞に行った。１０％ ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，カリフォルニア州）を含む完全な増殖培地を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２、３７℃で３時間インキュベーションした。細胞増殖は、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを含む培地の色の変化（細胞代謝活性に起因する）を検出することによって測定された。細胞毒性アッセイ結果は、ＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析し、図２に報告した。
【０１４４】
図２から分かるように、ｈＡＮＧ２＃８及び＃１２ ｓｉＲＮＡでのＨＥＫ−２９３細胞の形質転換は、対照細胞と比較すると、細胞増殖のわずかな減少を生じた。残りのｈＡＮＧ２ ｓｉＲＮＡは、対照細胞と比較しても細胞毒性は見られなかった。
【０１４５】
細胞毒性アッセイを行った後、各ウェルにおけるＡｌａｍａｒＢｌｕｅ含有培地を完全に除去し、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，テキサス州）を用いてＲＮＡ抽出を行った。ＨＥＫ−２９３細胞におけるｈＡＮＧ２ ｍＲＮＡのレベルは、定量的逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイによって測定した。ヒトグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを、内部対象として用いた。ＨＥＫ−２９３細胞におけるｈＡＮＧ２ ｍＲＮＡのレベルは、対照と比較すると、ｈＡＮＧ２ ｓｉＲＮＡでの形質転換によって減少し、これは図１に示したｈＡＮＧ２タンパク質の減少と一致するパターンを示した。
【実施例２】
【０１４６】
培養ヒト細胞におけるｈＡｎｇ２＃２及び＃３の用量反応
ＨＥＫ−２９３細胞は、上述した実施例１の通り、約７０％コンフルエンスになるまで増殖させた。次に細胞を、ＣａＰｉ形質転換試薬において１ナノモル（"ｎＭ"）、５ｎＭ、或いは２５ｎＭ用量のｈＡＮＧ２＃２或いは＃３ ｓｉＲＮＡで、若しくは形質転換試薬のみで形質転換した。ｈＡＮＧ２タンパク質レベルは、実施例１に記載したようにＡＮＧ２ ＥＬＩＳＡによって、形質転換４８時間後の増殖培地において測定し、その結果は図３に示した。
【０１４７】
図３から分かるように、ｈＡＮＧ２タンパク質レベルは、ｈＡＮＧ２＃２及び＃３ ｓｉＲＮＡで形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞において、用量依存的に減少した。全ての用量のｈＡＮＧ２＃２ ｓｉＲＮＡ及び５ｎＭと２５ｎＭ用量のｈＡＮＧ２＃３は、対照細胞と比較して、増殖培地に分泌されたｈＡＮＧ２タンパク質のレベルが減少した。１ｎＭ用量のｈＡＮＧ２＃３ ｓｉＲＮＡは、形質転換試薬のみでニセ形質転換された対照細胞と比較して、ｈＡＮＧ２タンパク質レベルは減少しなかった。しかしながら、１ｎＭ ｈＡＮＧ２＃３ ｓｉＲＮＡで形質転換された細胞から分泌されたｈＡＮＧ２タンパク質のレベルは、非特異的ｓｉＲＮＡで形質転換された対照細胞と比較して、わずかに減少した。非特異的ｓｉＲＮＡでの形質転換は、ｈＡＮＧ２タンパク質レベルに影響を及ぼさなかった。
【０１４８】
対照ＨＥＫ−２９３細胞と、異なる用量のｈＡＮＧ２＃２、＃３ ｓｉＲＮＡで形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞とに、上の実施例１に記載したように細胞毒性アッセイを行った。図４から分かるように、５ｎＭ ｈＡＮＧ２＃２ ｓｉＲＮＡでのＨＥＫ−２９３細胞の形質転換は、形質転換試薬のみでニセ形質転換された対照細胞と比較すると、わずかに細胞増殖を減少した。非特異的ｓｉＲＮＡで形質転換された対照細胞と比較して、５ｎＭ ｈＡＮＧ２＃２ ｓｉＲＮＡ用量によっては、細胞毒性は生じなかった。残りの用量のｈＡＮＧ２＃２若しくは＃３ ｓｉＲＮＡは、非特異的ｓｉＲＮＡで、或いは形質転換試薬のみで形質転換した対照細胞と比較して、明らかな細胞毒性は見られなかった。
【実施例３】
【０１４９】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡでのストレプトゾトシン誘導性糖尿病性網膜症の治療
糖尿病性網膜症を患った個人の網膜における血管漏出及び非灌流は、空間的に及び時間的に白血球静止（ｌｅｕｋｏｃｙｔｏ ｓｔａｓｉｓ）に関連している（Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（１９）：１０８３６〜４１を参照し、この全体の開示はこの参照により本明細書に組み込まれる）。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、糖尿病ラットにおける白血球静止を減少し、さらに網膜血管透過性も減少するであろうと予想された。
【０１５０】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａに記載されたように、ロングエバンスラット（約２００ｇ）に、糖尿病を誘導するために、オーバーナイト後、クエン酸緩衝液中のストレプトゾトシンを硝子体内に注射した。ロングエバンスラット（約２００ｇ）は、対照として、オーバーナイト後、クエン酸緩衝液のみ注射した。毎日、血清血糖を測定し、血圧を記録した。対照動物と比較して、血清血糖のレベルの上昇は、糖尿病であると考えられる。
【０１５１】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２（"実験的ｓｉＲＮＡ"）を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、各ラットにおいてＯＤを実行する。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照ＯＳとして注射される。全体の群スキームは、表２に示される通りである。
【０１５２】
【表２】
【０１５３】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａに記載されているように、処理７日後、ラットはアクリジンオレンジ白血球蛍光光度分析（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ、ＡＯＬＦ）にさらされた。簡潔には、ラットに麻酔し、その瞳孔をトロピカミドで拡張した。次にラットに、無菌生理食塩水と懸濁したアクリジンオレンジを硝子体内に注射した。血球静止に対して、各眼の基底を観察し、スキャニングレーザー検眼鏡（光源としてオレゴンブルーレーザー）で画像化した。次にラットは、蛍光デキストランで灌流され、眼をさらに画像化した。白血球静止の密度は、１０ディスク直径半径における光輝（ｂｒｉｇｈｔ）ピクセルのパーセンテージとして計算された。この白血球静止の密度は、終了点として用いられた。
【０１５４】
同じ７日目、Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、ラットにアイソトープ希釈技術を施し、血管漏出を定量化した。簡潔には、ラットに、第１点においてＢＳＡ中のＩ１２５を硝子体内に注射し、第２点においてＩ１３１を注射した。ラットは、第２の注入数分後に屠殺し、網膜を単離し、動脈サンプルをとった。網膜と動脈サンプルは、ヨウ素クリアランスの定量的インデックスを用いて網膜における活性を補正した後、γ−分光計を用いて解析した。次に、測定値を、投与された正確な用量、体重及び組織重量に対してノーマライズ（正常化）した。γ活性の補正された量は、網膜における血管漏出のマーカーとして用いた（第２の終了点）。γ活性は、実験動物の網膜において減少し、血管漏出の減少を示すと予想された。
【実施例４】
【０１５５】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡでのＶＥＧＦ誘導性血管透過性及び白血球静止の治療
眼におけるＶＥＧＦの存在は、網膜白血球静止を引き起こし、これは網膜における血管透過性の増加と毛細血管非灌流を引き起こす。例えば、Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６（５）：１７３３〜９を参照のこと（この全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる）。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、ラットにおいてＶＥＧＦを硝子体内に注射することによって生じた透過性と白血球静止を減少するのではないかと予想された。
【０１５６】
ロングエバンスラット（約２００ｇ）に麻酔をし、緩衝液ＯＵ中のＶＥＧＦを硝子体内に注射した。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡ（"実験的ｓｉＲＮＡ"）を、硝子体内注射によって各ラットへ同時に運搬した（ＯＤ）。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照として硝子体内に注射した（ＯＳ）。付加的な対照としては、緩衝液のみ（ＶＥＧＦなし）を注射したラットを含む。全体の群スキームは、表３に示した通りである。
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
注射後２４時間で、ラットをＡＯＬＦにさらし、実施例３で記載したようにアイソトープ希釈技術を行った。
【実施例５】
【０１５９】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、若しくはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡでの角膜／角膜縁損傷にさらされた眼における新血管新生の治療
眼球表面の損傷は、角膜の角膜縁幹細胞の破壊を引き起こすことがある。これらの細胞の破壊は、失明を引き起こす可能性があるＶＥＧＦ依存性角膜新血管新生を誘導する。新血管新生を促進するＶＥＧＦは、眼球表面の損傷後に角膜を浸潤する好中球及び単球によって供給される。例えば、Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７（４）：１２７７〜８１を参照のこと（この全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる）。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡは、角膜縁損傷後の角膜へ適用すると、マウスにおける角膜の新血管新生の領域が結果として減少すると予想される。新血管新生の領域は、直接測定され得る。或いは、角膜新血管新生の減少は、角膜内のＶＥＧＦ産生性多形核細胞の数が減少することから推測され得る。
【０１６０】
Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ．に記載されたように、角膜新血管新生は、角膜縁を損傷することによってＣ５７Ｂ１／６中に誘導される。簡潔には、マウスを麻酔し、水酸化ナトリウムを角膜に適用した。角膜及び角膜縁上皮を、角膜ナイフを用いて切除した（ＯＵ）。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を対象としたｓｉＲＮＡを除去後すぐに、角膜表面へ適用し（ＯＤ）、これを１日３回、実験期間（７日間）行った。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照として、同じ用量で投与された（ＯＳ）。
【０１６１】
Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ．に記載されたように、角膜及び角膜縁上皮の除去後２、４、及び７日目に、マウスの角膜新血管新生の程度を評価した。簡潔には、内皮特異的、フルオレセイン共役レクチンを硝子体内に注射した。注射３０分後、マウスを屠殺し、眼を回収し、２４時間ホルマリンで固定した。角膜のフラットマウントを、蛍光性顕微鏡観察下で採取し、解析するためにＯｐｅｎｌａｂソフトウェアへ取り込んだ。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを用いて、蛍光の閾値レベル、すなわち血管のみが見える範囲以上で設定した。蛍光性血管の領域及び角膜の領域（角膜縁アーケードによって分画される）を計算した。血管の領域は、総角膜領域によって分割され、この値は新血管領域のパーセンテージと同等である。新血管領域のパーセンテージは、処理群と対照群で比較した。
【０１６２】
Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ．に記載されたように、角膜及び角膜縁上皮の除去後２、４、及び７日目に、角膜多形核細胞（ＰＭＮｓ）を定量化するために付加的なマウスを屠殺した。簡潔には、マウスを屠殺し、眼を回収し、２４時間ホルマリンで固定した。ホルマリン固定の後、脱核された眼をパラフィンで被包し、切片化した。角膜の解剖学的中心と一致するような１つのパラフィン切片を各眼から選択し、毛顕微鏡観察に用いた。この１つの切片上のＰＭＮｓ（多小葉細胞として同定される）を計測し、この切片におけるＰＭＮｓの数は、処理群と対照群で比較した。
【実施例６】
【０１６３】
Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡでのレーザー誘導性脈絡叢新血管新生の治療
ブルッフ（Ｂｒｕｃｈ’ｓ）膜を破壊するレーザー光凝固は、ｗｅｔ黄斑性分解に見られるのと同様に、脈絡叢新血管新生（ＣＮＶ）を誘導する。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡの硝子体内注射は、マウスにおけるレーザー誘導性ＣＮＶを減少すると予想された。
【０１６４】
Ｓａｋｕｒａｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．&Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ．４４（６）：２７４３〜９（この全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれる）に記載された手順によって、マウスにＣＮＶを誘導した。簡潔には、Ｃ５７Ｂ１／６マウスを麻酔し、それらの瞳孔をトロピカミドで拡張した。マウスの網膜に、各網膜の９、１２、及び３時の位置で１レーザースポットずつレーザー光凝固化した（ＯＵ）。レーザー光凝固化に続いてすぐに、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を標的としたｓｉＲＮＡを硝子体内に注射した（ＯＤ）。非特異的ｓｉＲＮＡは、対照として、硝子体内に注射した（ＯＳ）。
【０１６５】
Ｓａｋｕｒａｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００３），ｓｕｐｒａ．に記載されたように、レーザー光凝固後１４日で、マウスを屠殺し、ＣＮＶ領域を定量化するための網膜フラットマウントを調整した。簡潔には、マウスを麻酔し、胸部を開き、下行大動脈をクロスクランプ（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｍｐｅｄ）した。次に、右心房を挟み、蛍光標識デキストランを、左心室へゆっくりと注射した。
【０１６６】
蛍光標識デキストランの注射後、眼を脱核し、パラホルムアルデヒドで２４時間固定した。次に、前眼房及び網膜を除去し、各脈絡叢のフラットマウントを解析のために調整した。脈絡叢フラットマウントは、蛍光顕微鏡観察下でそれぞれの写真を撮ることによって解析し、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアにその写真を取り込んだ。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを用いて、新血管新生の領域の輪郭を描き、定量化し、既知のレーザー位置が蛍光タフトと比較されていることを確認した。処理された動物の新血管領域は、対照動物の新血管領域と比較した。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】図１は、ｓｉＲＮＡ候補のサイレンシング効果を示した柱状グラフである。これらは、ｈＡＮＧ２ ｍＲＮＡを標的とした１２の異なるｓｉＲＮＡ（ｈＡＮＧ２＃１〜ｈＡＮＧ１２）、高感度緑色蛍光タンパク質（"ＥＧＦＰ"）を標的とした対照非特異的ｓｉＲＮＡ、若しくは、ｓｉＲＮＡを含まない形質移入試薬（"なし"）で形質移入（トランスフェクト）されたＨＥＫ−２９３細胞を含む組織培養ウェルから除去された増殖培養液中のヒトアンジオポエチン２（"ｈＡＮＧ２"）タンパク質のレベルによって測定されたものである。ｈＡＮＧ２タンパク質レベルは、増殖培養液の１ミリリットル当たり何ピコグラムのタンパク質が含まれているかで標示しており（ｐｇ／ｍｌ）、これは形質移入後４８時間でｈＡＮＧ２ ＥＬＩＳＡを用いて測定された。
【図２】図２は、ｈＡＮＧ２ ｍＲＮＡを標的とした１２の異なるｓｉＲＮＡ（ｈＡＮＧ２＃１〜ｈＡＮＧ２＃１２）で形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞において細胞毒性がないことを示した柱状グラフである。対照細胞は、高感度緑色蛍光タンパク質（"ＥＧＦＰ"）を標的とした非特異的ｓｉＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡを含まない形質移入試薬で形質移入された（"なし"）。細胞毒性は、形質移入試薬のみで処理した細胞に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞の増殖パーセンテージとして測定した。
【図３】図３は、ＨＥＫ−２９３細胞によって分泌されたｈＡＮＧ２タンパク質のレベルにおけるｈＡＮＧ２＃２及びｈＡＮＧ２＃３の増加用量のサイレンシング効果を示した柱状グラフである。ＨＥＫ−２９３細胞は、１ナノモル（"ｎＭ"）、５ｎＭ、若しくは２５ｎＭのｈＡＮＧ２＃２或いはｈＡＮＧ２＃３ ｓｉＲＮＡで形質移入された。対照細胞は、高感度緑色蛍光タンパク質（"ＥＧＦＰ"）を標的とした非特異的ｓｉＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡを含まない形質移入試薬で形質移入された（"なし"）。ｈＡＮＧ２タンパク質レベルは、増殖培養液の１ミリリットル当たり何ピコグラムのタンパク質が含まれているかで標示しており（ｐｇ／ｍｌ）、これは形質移入後４８時間でｈＡＮＧ２ ＥＬＩＳＡを用いて測定された。
【図４】図４は、ｈＡＮＧ２＃２及びｈＡＮＧ２＃３ ｓｉＲＮＡの増加用量で形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞において細胞毒性がないことを示した柱状グラフである。対照細胞は、高感度緑色蛍光タンパク質（"ＥＧＦＰ"）を標的とした非特異的ｓｉＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡを含まない形質移入試薬で形質移入された（"なし"）。細胞毒性は、形質移入試薬のみで処理した細胞に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞の増殖パーセンテージとして測定した。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有する単離ｓｉＲＮＡであって、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２における約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、単離ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ配列の同族体は、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、若しくは配列ＩＤ番号７である。
【請求項３】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖は、１つのＲＮＡ分子を有し、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は、１つのＲＮＡ分子を有するものである。
【請求項４】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記二本鎖を形成するセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、一本鎖ヘアピンによって共有結合的に結合されているものである。
【請求項５】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ｓｉＲＮＡは、非ヌクレオチド物質をさらに有するものである。
【請求項６】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ｓｉＲＮＡは、１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換若しくは変換をさらに有するものである。
【請求項７】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ヌクレアーゼ分解に対して安定である。
【請求項８】
請求項１のｓｉＲＮＡであって、さらに、
３’オーバーハングを有するものである。
【請求項９】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは１〜約６ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１０】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは、約２ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１１】
請求項３のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖は、第１の３’オーバーハングを有しており、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は、第２の３’オーバーハングを有するものである。
【請求項１２】
請求項１１のｓｉＲＮＡであって、
前記第１と第２の３’オーバーハングは、独立して１〜約６ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１３】
請求項１２のｓｉＲＮＡにおいて、
前記第１の３’オーバーハングは、ジヌクレオチドを有しており、前記第２の３’オーバーハングは、ジヌクレオチドを有するものである。
【請求項１４】
請求項１３のｓｉＲＮＡにおいて、
前記第１と第２の３’オーバーハングを有する前記ジヌクレオチドは、ジチミジル酸（ＴＴ）若しくはジウリジル酸（ｕｕ）である。
【請求項１５】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは、ヌクレアーゼ分解に対して安定である。
【請求項１６】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を有する組換えプラスミドであって、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、組換えプラスミド。
【請求項１７】
請求項１６の組換えプラスミドにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための前記核酸配列は、誘導可能な、或いは制御可能なプロモーターを有するものである。
【請求項１８】
請求項１６の組換えプラスミドにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための前記核酸配列は、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化したセンスＲＮＡ鎖、及びヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化したアンチセンスＲＮＡ鎖を有するものである。
【請求項１９】
請求項１６の組換えプラスミドにおいて、
前記プラスミドは、ＣＭＶプロモーターを有するものである。
【請求項２０】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を有する組換えウイルスベクターであって、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、組換えウイルスベクター。
【請求項２１】
請求項２０の組換えウイルスベクターにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための前記核酸配列は、誘導可能な、或いは制御可能なプロモーターを有するものである。
【請求項２２】
請求項２０の組換えウイルスベクターにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための前記核酸配列は、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化したセンスＲＮＡ鎖、及びヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化したアンチセンスＲＮＡ鎖を有するものである。
【請求項２３】
請求項２０の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルス、レトロウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるものである。
【請求項２４】
請求項２０の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、若しくはモコラ（Ｍｏｋｏｌａ）ウイルスからの表面タンパク質でシュードタイピングされるものである。
【請求項２５】
請求項２３の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターを有するものである。
【請求項２６】
ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を有する薬学的組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有しており、前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項２６の薬学的組成物であって、さらに、
リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、若しくはリポソームを有するものである。
【請求項２８】
請求項１６のプラスミド、若しくはそれらの生理学的に許容可能な塩類、及び薬学的に許容可能な担体を有する薬学的組成物。
【請求項２９】
請求項２８の薬学的組成物であって、さらに、
リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェチン、ポリカチオン、若しくはリポソームを有するものである。
【請求項３０】
請求項２０のウイルスベクター、及び薬学的に許容可能な担体を有する薬学的組成物。
【請求項３１】
ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体の発現を阻害するための方法であって、
前記ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体が分解されるように、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有しており、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、方法。
【請求項３２】
請求項３１の方法において、前記対象は、ヒトである。
【請求項３３】
請求項３１の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、運搬試薬との組み合わせで投与されるものである。
【請求項３４】
請求項３３の方法において、
前記運搬試薬は、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェチン、ポリカチオン、及びリポソームからなる群から選択されるものである。
【請求項３５】
請求項３４の方法において、前記運搬試薬は、リポソームである。
【請求項３６】
請求項３５の方法において、
前記リポソームは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を発現している細胞を前記リポソームの標的とするリガンドを有するものである。
【請求項３７】
請求項３６の方法において、前記細胞は、内皮細胞である。
【請求項３８】
請求項３７の方法において、前記リガンドは、モノクローナル抗体を有するものである。
【請求項３９】
請求項３５の方法において、
前記リポソームは、オプソニン化阻害部位で修飾されているものである。
【請求項４０】
請求項３９の方法において、
前記オプソニン化阻害部位は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、若しくはそれらの誘導体を有するものである。
【請求項４１】
請求項３１の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、組換えプラスミドから発現されるものである。
【請求項４２】
請求項３１の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、組換えウイルスベクターから発現されるものである。
【請求項４３】
請求項４２の方法において、
前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、若しくはヘルペスウイルスベクターを有するものである。
【請求項４４】
請求項４３の方法において、
前記組換えウイルスベクターは、水疱口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、若しくはモコラ（Ｍｏｋｏｌａ）ウイルスからの表面タンパク質でシュードタイピングされるものである。
【請求項４５】
請求項４２の方法において、
前記組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターを有するものである。
【請求項４６】
請求項３１の方法において、
２若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡが対象へ投与され、各ｓｉＲＮＡは、異なるＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ標的配列に実質的に同一なヌクレオチド配列を有するものである。
【請求項４７】
請求項３１の方法において、
２若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡが対象へ投与され、投与された各ｓｉＲＮＡは、異なる標的ｍＲＮＡからの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を有するものである。
【請求項４８】
請求項３１の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、経腸的投与経路によって投与されるものである。
【請求項４９】
請求項４８の方法において、
前記経腸的投与経路は、経口、直腸、及び鼻腔内からなる群から選択されるものである。
【請求項５０】
請求項３１の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、非経口的投与経路によって投与されるものである。
【請求項５１】
請求項５０の方法において、
前記非経口的投与経路は、血管内投与、組織周辺及び組織内投与、皮下注射或いは堆積、皮下灌流、眼球内投与、及び新血管新生の部位へ或いはその周辺への直接適用からなる群から選択されるものである。
【請求項５２】
請求項５１の方法において、
前記血管内投与は、静脈内大量瞬時投与注射、静脈内注入、動脈内大量瞬時投与注射、動脈内注入、及び脈管腔増へのカテーテル滴下からなる群から選択されるものである。
【請求項５３】
請求項５１の方法において、
前記組織周辺及び組織内注射は、腫瘍周辺注射、腫瘍内注射、網膜内注射、及び網膜下注射からなる群から選択されるものである。
【請求項５４】
請求項５１の方法において、
前記眼球内投与は、硝子体内、網膜内、網膜下、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼窩周辺及び眼窩後、トランス角膜、若しくはトランス強膜投与を有するものである。
【請求項５５】
請求項５１の方法において、
新血管新生部位へ或いはその周辺への前記直接適用は、カテーテル、角膜ペレット、目薬、坐薬、多孔性物質を有する移植片、非多孔性物質を有する移植片、若しくはゼラチン物質を有する移植片による適用を有するものである。
【請求項５６】
請求項５５の方法において、
前記新血管新生部位は眼の中にあり、新血管新生部位へ或いはその周辺への前記直接適用は、目薬により適用を有するものである。
【請求項５７】
対象における血管新生を阻害する方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を対象へ投与する工程を有しており、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、方法。
【請求項５８】
請求項５７の方法において、前記血管新生は、病原性である。
【請求項５９】
請求項５７の方法において、前記血管新生は、非病原性である。
【請求項６０】
請求項５９の方法において、
前記非病原性血管新生は、脂肪組織の産生、若しくはコレステロール産生に関連するものである。
【請求項６１】
請求項５９の方法において、
前記非病原性血管新生は、子宮内膜新血管新生を有するものである。
【請求項６２】
対象における血管新生病を治療する方法であって、
血管新生病に関連した血管新生を阻害するように、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を、そのような治療が必要な対象へ投与する工程を有しており、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、方法。
【請求項６３】
請求項６２の方法において、
前記血管新生病は、癌に関連した腫瘍を有するものである。
【請求項６４】
請求項６３の方法において、
前記癌は、乳癌、肺癌、頭頚部癌、脳癌、腹腔癌、大腸癌、直腸結腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、リンパ腫、及び血液癌からなる群から選択されるものである。
【請求項６５】
請求項６２の方法において、
前記血管新生病は、糖尿病性網膜症、及び加齢性黄斑変性症からなる群から選択されるものである。
【請求項６６】
請求項６５の方法において、前記血管新生病は、加齢性黄斑変性症である。
【請求項６７】
請求項６２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、血管新生病を治療するための医薬品との組み合わせで投与されるものであり、この医薬品は前記ｓｉＲＮＡとは異なるものである。
【請求項６８】
請求項６７の方法において、
前記血管新生病は癌であり、前記医薬品は、化学療法薬を有するものである。
【請求項６９】
請求項６８の方法において、
前記化学療法薬は、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、及びタモキシフェンからなる群から選択されるものである。
【請求項７０】
請求項６２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、血管新生病を治療するように設計された別の治療方法との組み合わせで、対象へ投与されるものである。
【請求項７１】
請求項７０の方法において、
前記血管新生病は癌であり、前記ｓｉＲＮＡは、放射線療法、化学療法、若しくは手術との組み合わせで投与されるものである。
【請求項７２】
対象においてＩ型糖尿病から生じる合併症を治療する方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を、そのような治療が必要な対象へ投与する工程を有しており、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、方法。
【請求項７３】
請求項７２の方法において、
Ｉ型糖尿病から生じる前記合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性腎症、及び大血管性疾患からなる群から選択されるものである。
【請求項７４】
請求項７３の方法において、
前記大血管性疾患は、冠動脈疾患、脳血管疾患、若しくは末梢血管疾患である。
【請求項１】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有する単離ｓｉＲＮＡであって、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２における約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、単離ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ配列の同族体は、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、若しくは配列ＩＤ番号７である。
【請求項３】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖は、１つのＲＮＡ分子を有し、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は、１つのＲＮＡ分子を有するものである。
【請求項４】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記二本鎖を形成するセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、一本鎖ヘアピンによって共有結合的に結合されているものである。
【請求項５】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ｓｉＲＮＡは、非ヌクレオチド物質をさらに有するものである。
【請求項６】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記ｓｉＲＮＡは、１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換若しくは変換をさらに有するものである。
【請求項７】
請求項１のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ヌクレアーゼ分解に対して安定である。
【請求項８】
請求項１のｓｉＲＮＡであって、さらに、
３’オーバーハングを有するものである。
【請求項９】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは１〜約６ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１０】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは、約２ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１１】
請求項３のｓｉＲＮＡにおいて、
前記センスＲＮＡ鎖は、第１の３’オーバーハングを有しており、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は、第２の３’オーバーハングを有するものである。
【請求項１２】
請求項１１のｓｉＲＮＡであって、
前記第１と第２の３’オーバーハングは、独立して１〜約６ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１３】
請求項１２のｓｉＲＮＡにおいて、
前記第１の３’オーバーハングは、ジヌクレオチドを有しており、前記第２の３’オーバーハングは、ジヌクレオチドを有するものである。
【請求項１４】
請求項１３のｓｉＲＮＡにおいて、
前記第１と第２の３’オーバーハングを有する前記ジヌクレオチドは、ジチミジル酸（ＴＴ）若しくはジウリジル酸（ｕｕ）である。
【請求項１５】
請求項８のｓｉＲＮＡにおいて、
前記３’オーバーハングは、ヌクレアーゼ分解に対して安定である。
【請求項１６】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を有する組換えプラスミドであって、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、組換えプラスミド。
【請求項１７】
請求項１６の組換えプラスミドにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための前記核酸配列は、誘導可能な、或いは制御可能なプロモーターを有するものである。
【請求項１８】
請求項１６の組換えプラスミドにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための前記核酸配列は、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化したセンスＲＮＡ鎖、及びヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化したアンチセンスＲＮＡ鎖を有するものである。
【請求項１９】
請求項１６の組換えプラスミドにおいて、
前記プラスミドは、ＣＭＶプロモーターを有するものである。
【請求項２０】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を有する組換えウイルスベクターであって、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、組換えウイルスベクター。
【請求項２１】
請求項２０の組換えウイルスベクターにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための前記核酸配列は、誘導可能な、或いは制御可能なプロモーターを有するものである。
【請求項２２】
請求項２０の組換えウイルスベクターにおいて、
前記ｓｉＲＮＡを発現するための前記核酸配列は、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化したセンスＲＮＡ鎖、及びヒトＵ６ ＲＮＡプロモーターの制御下でｐｏｌｙＴ終止配列と操作可能に連結した配列をコード化したアンチセンスＲＮＡ鎖を有するものである。
【請求項２３】
請求項２０の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルス、レトロウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるものである。
【請求項２４】
請求項２０の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、若しくはモコラ（Ｍｏｋｏｌａ）ウイルスからの表面タンパク質でシュードタイピングされるものである。
【請求項２５】
請求項２３の組換えウイルスベクターにおいて、
前記組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターを有するものである。
【請求項２６】
ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を有する薬学的組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有しており、前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項２６の薬学的組成物であって、さらに、
リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、若しくはリポソームを有するものである。
【請求項２８】
請求項１６のプラスミド、若しくはそれらの生理学的に許容可能な塩類、及び薬学的に許容可能な担体を有する薬学的組成物。
【請求項２９】
請求項２８の薬学的組成物であって、さらに、
リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェチン、ポリカチオン、若しくはリポソームを有するものである。
【請求項３０】
請求項２０のウイルスベクター、及び薬学的に許容可能な担体を有する薬学的組成物。
【請求項３１】
ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体の発現を阻害するための方法であって、
前記ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体が分解されるように、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与する工程を有しており、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、方法。
【請求項３２】
請求項３１の方法において、前記対象は、ヒトである。
【請求項３３】
請求項３１の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、運搬試薬との組み合わせで投与されるものである。
【請求項３４】
請求項３３の方法において、
前記運搬試薬は、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェチン、ポリカチオン、及びリポソームからなる群から選択されるものである。
【請求項３５】
請求項３４の方法において、前記運搬試薬は、リポソームである。
【請求項３６】
請求項３５の方法において、
前記リポソームは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２を発現している細胞を前記リポソームの標的とするリガンドを有するものである。
【請求項３７】
請求項３６の方法において、前記細胞は、内皮細胞である。
【請求項３８】
請求項３７の方法において、前記リガンドは、モノクローナル抗体を有するものである。
【請求項３９】
請求項３５の方法において、
前記リポソームは、オプソニン化阻害部位で修飾されているものである。
【請求項４０】
請求項３９の方法において、
前記オプソニン化阻害部位は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、若しくはそれらの誘導体を有するものである。
【請求項４１】
請求項３１の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、組換えプラスミドから発現されるものである。
【請求項４２】
請求項３１の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、組換えウイルスベクターから発現されるものである。
【請求項４３】
請求項４２の方法において、
前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、若しくはヘルペスウイルスベクターを有するものである。
【請求項４４】
請求項４３の方法において、
前記組換えウイルスベクターは、水疱口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、若しくはモコラ（Ｍｏｋｏｌａ）ウイルスからの表面タンパク質でシュードタイピングされるものである。
【請求項４５】
請求項４２の方法において、
前記組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターを有するものである。
【請求項４６】
請求項３１の方法において、
２若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡが対象へ投与され、各ｓｉＲＮＡは、異なるＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡ標的配列に実質的に同一なヌクレオチド配列を有するものである。
【請求項４７】
請求項３１の方法において、
２若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡが対象へ投与され、投与された各ｓｉＲＮＡは、異なる標的ｍＲＮＡからの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を有するものである。
【請求項４８】
請求項３１の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、経腸的投与経路によって投与されるものである。
【請求項４９】
請求項４８の方法において、
前記経腸的投与経路は、経口、直腸、及び鼻腔内からなる群から選択されるものである。
【請求項５０】
請求項３１の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、非経口的投与経路によって投与されるものである。
【請求項５１】
請求項５０の方法において、
前記非経口的投与経路は、血管内投与、組織周辺及び組織内投与、皮下注射或いは堆積、皮下灌流、眼球内投与、及び新血管新生の部位へ或いはその周辺への直接適用からなる群から選択されるものである。
【請求項５２】
請求項５１の方法において、
前記血管内投与は、静脈内大量瞬時投与注射、静脈内注入、動脈内大量瞬時投与注射、動脈内注入、及び脈管腔増へのカテーテル滴下からなる群から選択されるものである。
【請求項５３】
請求項５１の方法において、
前記組織周辺及び組織内注射は、腫瘍周辺注射、腫瘍内注射、網膜内注射、及び網膜下注射からなる群から選択されるものである。
【請求項５４】
請求項５１の方法において、
前記眼球内投与は、硝子体内、網膜内、網膜下、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼窩周辺及び眼窩後、トランス角膜、若しくはトランス強膜投与を有するものである。
【請求項５５】
請求項５１の方法において、
新血管新生部位へ或いはその周辺への前記直接適用は、カテーテル、角膜ペレット、目薬、坐薬、多孔性物質を有する移植片、非多孔性物質を有する移植片、若しくはゼラチン物質を有する移植片による適用を有するものである。
【請求項５６】
請求項５５の方法において、
前記新血管新生部位は眼の中にあり、新血管新生部位へ或いはその周辺への前記直接適用は、目薬により適用を有するものである。
【請求項５７】
対象における血管新生を阻害する方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を対象へ投与する工程を有しており、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、方法。
【請求項５８】
請求項５７の方法において、前記血管新生は、病原性である。
【請求項５９】
請求項５７の方法において、前記血管新生は、非病原性である。
【請求項６０】
請求項５９の方法において、
前記非病原性血管新生は、脂肪組織の産生、若しくはコレステロール産生に関連するものである。
【請求項６１】
請求項５９の方法において、
前記非病原性血管新生は、子宮内膜新血管新生を有するものである。
【請求項６２】
対象における血管新生病を治療する方法であって、
血管新生病に関連した血管新生を阻害するように、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を、そのような治療が必要な対象へ投与する工程を有しており、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、方法。
【請求項６３】
請求項６２の方法において、
前記血管新生病は、癌に関連した腫瘍を有するものである。
【請求項６４】
請求項６３の方法において、
前記癌は、乳癌、肺癌、頭頚部癌、脳癌、腹腔癌、大腸癌、直腸結腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、リンパ腫、及び血液癌からなる群から選択されるものである。
【請求項６５】
請求項６２の方法において、
前記血管新生病は、糖尿病性網膜症、及び加齢性黄斑変性症からなる群から選択されるものである。
【請求項６６】
請求項６５の方法において、前記血管新生病は、加齢性黄斑変性症である。
【請求項６７】
請求項６２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、血管新生病を治療するための医薬品との組み合わせで投与されるものであり、この医薬品は前記ｓｉＲＮＡとは異なるものである。
【請求項６８】
請求項６７の方法において、
前記血管新生病は癌であり、前記医薬品は、化学療法薬を有するものである。
【請求項６９】
請求項６８の方法において、
前記化学療法薬は、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、及びタモキシフェンからなる群から選択されるものである。
【請求項７０】
請求項６２の方法において、
前記ｓｉＲＮＡは、血管新生病を治療するように設計された別の治療方法との組み合わせで、対象へ投与されるものである。
【請求項７１】
請求項７０の方法において、
前記血管新生病は癌であり、前記ｓｉＲＮＡは、放射線療法、化学療法、若しくは手術との組み合わせで投与されるものである。
【請求項７２】
対象においてＩ型糖尿病から生じる合併症を治療する方法であって、
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を有するｓｉＲＮＡの有効量を、そのような治療が必要な対象へ投与する工程を有しており、
前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成しており、前記センスＲＮＡ鎖は、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、或いはＴｉｅ２ ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の近接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはそれらの選択的スプライシング体、変異体、或いは同族体を有するものである、方法。
【請求項７３】
請求項７２の方法において、
Ｉ型糖尿病から生じる前記合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性腎症、及び大血管性疾患からなる群から選択されるものである。
【請求項７４】
請求項７３の方法において、
前記大血管性疾患は、冠動脈疾患、脳血管疾患、若しくは末梢血管疾患である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５２３４６４（Ｐ２００６−５２３４６４Ａ）
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１３１３２（Ｐ２００６−５１３１３２）
【出願日】平成１６年４月１９日（２００４．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１２０７２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９４６０６
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（５００４２９１０３）ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１９日（２００４．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１２０７２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９４６０６
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（５００４２９１０３）ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Ｆターム（参考）】
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