コラーゲン産生促進剤、光老化防止剤、保湿機能改善剤および皮膚用剤組成物
【課題】γ−グルタミルトランスペプチダーゼ阻害活性を発揮することによってコラーゲン産生を促進させる化合物を有効成分とし、皮膚のしわ・たるみ等の老化防止・改善に有用なコラーゲン産生促進剤、光老化防止剤および保湿機能改善剤を提供し、並びに該コラーゲン産生促進剤、光老化防止剤または保湿機能改善剤を含有し、皮膚のしわ・たるみまたは光老化等の老化防止・改善、皮膚の保湿機能の維持改善に有効な皮膚用剤用組成物を提供する。
【解決手段】皮膚の線維芽細胞内のグルタチオン量を減少させるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ阻害剤を有効成分とするものであって、皮膚の線維芽細胞におけるコラーゲン産生を著明に促進させる作用を有する皮膚用剤を提供する。また紫外線ダメージを軽減する皮膚用剤を提供する。また保湿機能改善のための皮膚用剤を提供する。
【解決手段】皮膚の線維芽細胞内のグルタチオン量を減少させるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ阻害剤を有効成分とするものであって、皮膚の線維芽細胞におけるコラーゲン産生を著明に促進させる作用を有する皮膚用剤を提供する。また紫外線ダメージを軽減する皮膚用剤を提供する。また保湿機能改善のための皮膚用剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガンマ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−Ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ＧＧＴ）阻害活性に基づき、皮膚の真皮層線維芽細胞におけるコラーゲン産生能を活性化する作用、また紫外線ダメージを軽減する作用並びに角質水分量を上昇させる作用により、皮膚の張り、艶や保湿効果を維持、増強し、皮膚のしわ・たるみ、また光老化等の老化症状を防止・改善する著明な効果を有する成分を含有する皮膚用剤用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は表皮、真皮、脂肪層（皮下組織）の３層構造を示し、真皮は線維組織と弾性組織でできた厚い層で、そのほとんどはコラーゲン等の細胞外マトリックスからなり、この層が皮膚に弾力性と強さを与え、張りや艶のあるみずみずしい肌の状態を保っている。しかしながら、紫外線の照射や乾燥等の外的因子の影響、又は加齢によって、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少するとともに、コラーゲン分解酵素であるマトリクス・メタロプロテアーゼ量が増加し、その結果として、真皮中のコラーゲンの減少、分解、変性が加速することにより、皮膚のバリア機能が低下し、保湿機能や弾力性がそこなわれ、皮膚の張りや艶がなくなり、しわ・たるみ等の皮膚の老化症状を呈するようになる。
【０００３】
皮膚の加齢変化に見られるしわ・たるみ等の発生は、外見上の老化現象の主たるものであり、多くの中高齢者にとって切実な問題となっている。従来、このような皮膚症状を改善する方法としては、コラーゲンを配合した化粧料を塗布することが主流であったが、一過性に皮膚表面の保湿性を補うものであることから、十分な効果を発揮するものではなかった。そこで、コラーゲン量の低下を改善する安全性の高い有効成分が望まれている。
【０００４】
かかる状況の中で、皮膚の張り、艶の維持や皮膚の保湿機能の改善等を含む皮膚の老化防止・改善を目的として、皮膚のコラーゲン量を増加させる化粧料の開発が進められてきた。例えば、天然物由来の抽出物が、１型コラーゲン産生促進作用を有することが報告され（特許文献１及び２）、真皮細胞外マトリクスを構成するコラーゲン合成を刺激する作用を有する成分として、アスコルビン酸等を含有させたものなどが報告されている（特許文献３）。また、本発明者らによって、皮膚線維芽細胞のコラーゲン産生量が、該線維芽細胞内のグルタチオン量の減少と関連して増加してくることを見出し、この機序によってコラーゲン産生を亢進する活性を有する化合物群について報告している（特許文献４）。
【０００５】
一方、細胞内のグルタチオンを分解する酵素として、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−Ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ＧＧＴ）が知られている。ＧＧＴは、細胞外の主なシステイン（Ｃｙｓ）のプールであるグルタチオンを分解し、グルタチオン生合成に必要なＣｙｓを細胞に供給する酵素として重要な役割をはたし、その阻害剤は、細胞のグルタチオン量を制御する生理作用があると考えられる。本発明者らは、高い活性ならびに高い選択性を有するＧＧＴ阻害剤について、特許文献５に報告した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１８６４７１号公報
【特許文献２】特開２００７−３０２６０７号公報
【特許文献３】特開２００４−０７５６４６号公報
【特許文献４】特開２００６−１５１８６０号公報
【特許文献５】ＷＯ ２００７／０６６７０５ Ａ１公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cutrin et al., Kidney International, Vol. 57 (2000), pp. 526-533）
【非特許文献２】Aberkane et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 285, 1162-1167 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＧＧＴ阻害活性を発揮することによってコラーゲン産生を促進させるだけでなく、紫外線によるダメージを防ぎ、光老化も防止できる化合物を有効成分とし、皮膚のしわ・たるみ等の老化防止・改善に有用なコラーゲン産生促進剤、光老化防止剤および保湿機能改善剤を提供し、並びに該コラーゲン産生促進剤、光老化防止剤または保湿機能改善剤を含有し、皮膚のしわ・たるみ、あるいは紫外線ダメージによる光老化、または保湿機能改善等の老化防止・改善、整肌作用に有効な皮膚用剤用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決することを主な目的として、種々の検討を重ねた結果、線維芽細胞内グルタチオン量の減少がコラーゲン産生量の増加と関連していることを見出し、さらに、ＧＧＴ阻害剤の機能を鋭意検討した結果、ＧＧＴ阻害剤が(i)線維芽細胞内グルタチオン量を減少させ、コラーゲン産生量を増加させること、(ii)紫外線による皮膚ダメージを防ぎ、光老化を防止・改善できること、および(iii)角質水分量を増加させ得ること等の新規機能を有することを発見し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明のコラーゲン産生促進剤は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とするものである。また、本発明の光老化防止剤は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とするものである。また、本発明の保湿機能改善剤は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とするものである。
【００１１】
本発明のコラーゲン産生促進剤、光老化防止剤または保湿機能改善剤において、前記化合物は、脱離基を有するホスホン酸ジエステル誘導体を含むことが好ましい。また前記化合物は、下記一般式（１）で（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が脱離基を表し、Ｒ１およびＲ２の少なくともいずれか一方が下記一般式（２）〜一般式（６）（式中、Ｒ３が置換基を有していてもよいアリール基、および置換基を有していてもよい複素環残基のいずれかであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８およびＲ９のそれぞれが、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、および電子吸引基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基であり、Ｒ４〜Ｒ８の置換基のうち隣接する２つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。）のいずれかを表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体を含むことが好ましい。また前記化合物は、２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸を含むことが好ましい。
【００１２】
また、本発明には、上記コラーゲン産生促進剤、光老化防止剤または保湿機能改善剤を含有する、皮膚用剤用組成物も含まれる。また、皮膚用剤用組成物は、しわまたは肌弾力の改善用であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、線維芽細胞内グルタチオン量を減少させるＧＧＴ阻害剤を有効成分とするものであって、皮膚の線維芽細胞におけるコラーゲン産生を著明に促進させる作用を有するものである。これにより、本発明のコラーゲン産生促進剤は、皮膚の線維芽細胞におけるコラーゲン産生を著明に促進する作用を有し、皮膚の老化防止・改善、具体的には、皮膚のハリ、艶の維持改善によるしわ・たるみの防止・改善、又は皮膚の保湿機能の維持改善等において有効な作用を発揮する。
【００１４】
また、本発明の光老化防止剤は、皮膚の細胞が紫外線により受けるダメージを軽減させることもできる。
【００１５】
また、本発明の保湿機能改善剤は、皮膚の角質水分量を上昇させることにより、皮膚の保湿機能を改善することができる。
【００１６】
そして、本発明のＧＧＴ阻害活性によるコラーゲン産生促進剤を含有する皮膚用剤用組成物は、皮膚の線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を著明に向上させる作用を有し、また肌弾力およびしわを改善させ得る。また本発明のＧＧＴ阻害活性による光老化防止剤を含有する皮膚用剤用組成物は、紫外線によるダメージを軽減し、光老化の防止・改善等において有効な作用を発揮する。また、本発明のＧＧＴ阻害活性による保湿機能改善剤を含有する皮膚用剤用組成物は、角質層の水分量を上昇させることにより、肌の保湿機能改善および整肌において有効な作用を発揮する。それゆえ、皮膚の老化防止・改善用または整肌用として、具体的には、皮膚のハリ、艶の維持改善によるしわ・たるみの防止・改善用として、又は光老化の防止・改善、あるいは皮膚の保湿機能の維持改善用などとして、有効に利用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例において得られたヒト皮膚由来線維芽細胞の細胞内グルタチオン量の測定結果を示す図面である。
【図２】実施例において得られたヒト皮膚由来線維芽細胞のコラーゲン染色像の結果を示す図面である。
【図３】実施例において得られた化粧水連用による角質水分量の変化率をしめす図である。
【図４】実施例において得られた化粧水連用３ヶ月の肌粘弾性の経時変化を示す図である。
【図５】実施例において得られた化粧水連用３ヶ月後のしわスコアを示す図である。
【図６】実施例において得られたＵＶ照射下におけるヒト正常皮膚由来線維芽細胞の生存率に及ぼすＧＧＴ阻害剤の影響を示す図である。
【図７】実施例において得られたＵＶ照射下におけるヒト正常皮膚由来線維芽細胞内のＨ２Ｏ２産生量の上昇におよぼすＧＧＴ阻害剤の影響を示す図である。
【図８】実施例において得られたＵＶ曝露によって亢進したヒト皮膚線維芽細胞の細胞内Ｈ２Ｏ２産生量におよぼすＧＧＴ阻害剤の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
従来、ＧＧＴは細胞外のグルタチオンを分解する酵素であることが知られていた。そこで、一般的に考えて、ＧＧＴの活性を阻害すれば、グルタチオンの分解が妨げられるため、細胞内のグルタチオン量も増加ないしは維持されるものと考えられる。この予測を裏付ける学術論文として、例えば、非特許文献１が挙げられる。本文献では、ラット腎臓にＧＧＴ阻害剤であるアシビシンを投与すると、コントロールと比較してグルタチオン量が上昇する（Fig.6）。また、アシビシン投与によりＧＧＴ活性も低下することが示されている（Fig.1）。つまり、非特許文献１では、ＧＧＴ阻害剤を加えることで、グルタチオンの分解が抑制され、その結果、グルタチオン量が増加することが示されている。また、非特許文献２には、ヒトＧＧＴを高度に発現させたＶ７９ＧＧＴ細胞系にアシビシンを投与しても、細胞内グルタチオン量に大きな差は認められないというデータが記載されている（Table 2）。なお、ＧＧＴはアシビシンにより濃度依存的に阻害されている（Table 1）。一方、細胞内のグルタチオン量は、ＧＧＴ以外にも、生合成や代謝、輸送といった様々な要因が関係するため、単純にＧＧＴ活性とグルタチオン量の関係性を導くのは難しい。さらに、従来、ＧＧＴ阻害剤として頻用されてきたアシビシンは、ＧＧＴ以外の酵素も幅広く阻害し、細胞の生合成系を多岐にわたって撹乱することから、アシビシンを使った従来の研究におけるグルタチオン量とＧＧＴの関係性については未だ不明瞭なままである。
【００１９】
そこで、本発明者らは、アシビシンに代わるGGT選択的な阻害剤を用いて、独自に鋭意検討したところ、選択的ＧＧＴ阻害剤が線維芽細胞内のグルタチオン量を減少させるという現象を世界で初めて発見した。このような知見は、例えば、上記非特許文献１，２にはもちろんのこと、上記特許文献４，５にも全く開示も示唆もされていない。本発明者らは、この新規知見に基づき、本ＧＧＴ阻害剤が細胞内グルタチオン量を減少させ、結果としてコラーゲン産生を促進させること、また紫外線によるダメージを軽減すること、加えて角質水分量を上昇させ得ること等のＧＧＴ阻害剤の新規機能を見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は、本発明者らが独自に見出した全く新規で独創的なものであるといえる。
【００２０】
また、本発明者らは、後述する実施例に示すように、ＧＧＴ阻害剤が、コラーゲン産生促進だけでなく、皮膚の線維芽細胞が紫外線照射によって受けるダメージを軽減し得ることを見出している。皮膚の老化として光老化がある。光老化は紫外線を浴びることによって生じる老化であり、その原因の１つに活性酸素種による生体内成分の酸化があげられる。光老化によって皮膚のコラーゲン量が減少するため、皮膚の弾力性が衰え、皺が出現する。コラーゲンの減少は、コラーゲン分解能の亢進が大きく関与していることが知られている。後述する実施例に示すように、ＧＧＴ阻害剤は紫外線曝露によって増加した細胞内活性酸素種産生量を有意に低下させたことから、光老化に対する予防効果あるいは改善効果を有することが明らかとなった。なお、本発明でいう光老化防止剤とは、光老化を防止および／または改善する組成物のことを意図する。
【００２１】
また、本発明者らは、ＧＧＴ阻害剤は、皮膚の角質層の水分量を増加させる機能を有することも確認している。これにより、ＧＧＴ阻害剤を用いた肌の保湿機能を改善・維持し、整肌作用を有する組成物を提供することも本発明に含まれる。なお、本発明でいう保湿機能改善剤とは、皮膚（肌）の保湿機能を改善および／または保湿機能が低下するのを防止する（保湿機能を維持する）組成物のことを意図する。
【００２２】
以下、本発明の具体的な実施態様の一例について説明する。
【００２３】
本発明において用いるＧＧＴ阻害剤としては、酵素選択性が高く、不可逆的な阻害活性を発揮することを特徴とするホスホン酸ジエステル誘導体群（特許文献５）も使用することができる。このホスホン酸ジエステル誘導体群は、特に生体毒性が低いため、好ましく使用できる。
【００２４】
具体的には、例えば、以下に示すホスホン酸ジエステル誘導体群を好適に用いることができる。
【００２５】
１．一般式（１）
【００２６】
【化１】
【００２７】
（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が脱離基を表す。）で示される、ホスホン酸ジエステル誘導体。
【００２８】
２．上記一般式（１）
（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくともいずれか一方が一般式（２）〜一般式（６）
【００２９】
【化２】
【００３０】
（式中、Ｒ３が置換基を有していてもよいアリール基、および置換基を有していてもよい複素環残基のいずれかであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８およびＲ９のそれぞれが、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、および電子吸引基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基であり、Ｒ４〜Ｒ８の置換基のうち隣接する２つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。）のいずれかを表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００３１】
３．上記一般式（１）
（式中、Ｒ１がＯＲ１０であり、Ｒ２がＯＲ１１であり、Ｒ１０およびＲ１１が水素原子を除く。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００３２】
４．上記３に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、Ｒ１０が、置換基を有していてもよいアルキル基、および置換基を有していてもよいアリール基のいずれかであり、Ｒ１１が置換基を有していてもよいアリール基であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００３３】
５．上記４に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、前記置換基を有していてもよいアルキル基の置換基が、置換基を有していてもよいフェニル基、窒素を有する複素環残基、アルキルスルファニル基、アリールスルファニル基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、アルコキシ基、アミド基、カルボキシ基およびカルボキシ基の等価体からなる群より選択される少なくとも１つの基であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００３４】
６．上記４に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、前記Ｒ１０の置換基を有していてもよいアルキル基が、一般式（７）
【００３５】
【化３】
【００３６】
（式中、Ｒ１２が、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基および水素原子のいずれかを表し、Ｒ１３が、水素原子および一般式（８）
【００３７】
【化４】
【００３８】
（式中、ｎ１が０〜４の整数を、ｎ２が０および１のいずれかを、ｎ３が０〜４の整数を、Ｘ１がアミド基およびアルケニル基のいずれかを、Ｘ２がカルボキシ基、およびカルボキシ基の等価体のいずれかを、Ｒ１４が水素原子および低級アルキル基のいずれかを表す。）のいずれかを表す。）であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００３９】
７．上記５または６に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、カルボキシ基およびカルボキシ基の等価体が、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲ２、−ＣＯＲ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＨＣＯＲ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ３Ｒ、および−ＳＯ２ＮＲ２からなる群より選択される少なくとも１つの基であり、Ｒが水素原子およびアルキル基のいずれかであるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４０】
８．上記６に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、前記Ｒ１２の置換基を有していてもよいアルキル基の置換基が、置換基を有していてもよいフェニル基、窒素を有する複素環残基、アルキルスルファニル基、アリールスルファニル基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、アルコキシ基、およびアミド基からなる群より選択される少なくとも１つの基であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４１】
９．上記４に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、前記置換基を有していてもよいアリール基の置換基が、カルボキシ基およびカルボキシ基の等価体のいずれかにより置換されていてもよいアルキル基、電子吸引基、カルボキシ基、およびカルボキシ基の等価体からなる群より選択される少なくとも１つの基であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４２】
１０．前記置換基を有してもよいアリール基が、置換基を有してもよいフェニル基である上記４に示すホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４３】
１１．上記１０に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、前記置換基を有してもよいフェニル基が、一般式（９）
【００４４】
【化５】
【００４５】
（式中、Ｙ１が、−Ｒ’、−ＯＲ’、および電子吸引基からなる群より選択される１つの基を表し、Ｙ２が、カルボキシ基およびカルボキシ基の等価体のいずれかで置換されていてもよく、かつ二重結合を有していてもよいアルキル基、水素原子、カルボキシ基、ならびにカルボキシ基の等価体からなる群より選択される１つの基を表し、隣接する２つの置換基Ｙ１とＹ２とが互いに結合して環を形成してもよく、Ｒ’が水素原子、および二重結合を有していてもよいアルキル基のいずれかを表す。）であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４６】
１２．上記９または１１に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、電子吸引基が、ハロゲン原子、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＲ’２、−ＣＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＳＯ２Ｒ’、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＰＯ（ＯＲ’）２、および−ＮＯ２からなる群より選択される少なくとも１つの基であり、Ｒ’が前記と同じ意味を表すホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４７】
１３．上記９または１１に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、カルボキシ基およびカルボキシ基の等価体が、−ＣＯＯＲ”、−ＣＯＮＲ”２、−ＣＯＲ”、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＨＣＯＲ”、−ＯＲ”、−ＳＲ”、−ＯＣＯＲ”、−ＳＯ３Ｒ”、−ＳＯ２ＮＲ”２からなる群より選択される少なくとも１つの基であり、Ｒ”が水素原子および二重結合を有していてもよいアルキル基のいずれかであるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４８】
１４．一般式（１０）
【００４９】
【化６】
【００５０】
（式中、Ｒ１２，Ｒ１４，Ｘ２，Ｙ１およびｎ３は前記と同じ意味を表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００５１】
１５．一般式（１１）
【００５２】
【化７】
【００５３】
（式中、Ｒ１２，Ｒ１４，Ｘ２，Ｙ１，ｎ１およびｎ３は前記と同じ意味を表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００５４】
１６．一般式（１２）
【００５５】
【化８】
【００５６】
（式中、Ｒ１５が低級アルキル基を表し、Ｗが一般式（１３）〜一般式（１６）
【００５７】
【化９】
【００５８】
のいずれかを表し、Ｒ１６が水素原子および低級アルキル基のいずれかを表し、Ｙ１およびＹ２が前記と同じ意味を表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００５９】
１７．一般式（１７）
【００６０】
【化１０】
【００６１】
（式中、Ｒ１２およびＹ１は前記と同じ意味を表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００６２】
１８．一般式（１８）
【００６３】
【化１１】
【００６４】
（式中、Ｙ１およびＹ２は前記と同じ意味を表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００６５】
１９．一般式（１９）
【００６６】
【化１２】
【００６７】
（式中、Ｍがアルカリ金属を表し、Ｒ１７が置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基を含むアルコキシカルボニル基を表す。）で示される２−置換アミノ−４−ホスホノブタン酸の金属塩。
【００６８】
２０．一般式（２０）
【００６９】
【化１３】
【００７０】
（式中、Ｒ１８が置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基を表し、Ｒ１７が前記と同じ意味を表す。）で示される２−置換アミノ−４−ホスホノブタン酸エステル。
【００７１】
なお、上記１〜２０に示すホスホン酸ジエステル誘導体の詳細な製造方法や諸性質については特許文献５に開示されている。本発明ではこの特許文献５の記載を必要に応じて援用でき、またこの特許文献５の記載内容は本発明に適宜利用できることを付言する。つまり、この特許文献５の開示内容も本発明の一部であり、特許文献５の記載内容に基づき補正することも可能である。
【００７２】
なかでも特に、上記一般式（１２）において、Ｗが一般式（１３）または（１５）であるホスホン酸ジエステル誘導体は、特許文献５の実施例にて実際に合成され、かつＧＧＴ阻害活性も確認されており好ましい。
【００７３】
また上記ホスホン酸ジエステル誘導体は、脱離基がリン酸基から脱離することでＧＧＴ活性を発揮することが本発明者らの研究で確認されている。つまり、脱離基が脱離しやすい程、ＧＧＴ活性が向上する。しかし、この脱離基の脱離しやすさは、化合物の安定性とも関連するため、一概に脱離しやすい脱離基を有する化合物が好ましいとはいえない。この脱離基の脱離しやすさと安定性とのバランスが優れる化合物の例示として、上記１〜２０のホスホン酸ジエステル誘導体を挙げることができ、上記一般式（１２）において、Ｒ１５が一般式（１３）または（１５）であるホスホン酸ジエステル誘導体がより好ましく、さらに２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸が特に好ましい。
【００７４】
また、上記ホスホン酸ジエステル誘導体には単体および混合物のみならず、光学異性体が含まれていてもよい。例えば、実施例で用いている２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸であれば、２つのキラル原子が存在するため、合計４種の光学異性体の混合物である。
【００７５】
本発明のＧＧＴ阻害活性によるコラーゲン産生促進剤、光老化防止剤または保湿機能改善剤は、皮膚のハリ、艶の維持改善によるしわ・たるみの防止・改善用として、又は紫外線ダメージ（光老化）の防止・改善、あるいは皮膚の保湿機能の維持改善用といった皮膚用剤用組成物として皮膚に塗布して使用できるほか、パップ剤、化粧料、浴用剤、ときに皮下注射用剤としての剤形も目的に応じて任意に選択することができる。特に、好適には化粧料として広く利用することが可能で、クリーム、軟膏、乳液、溶液、ゲル、粉剤、顆粒剤等の剤形やパック、ローション、パウダー、スティック等の形態とすることができる。その製剤形態も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層系等、幅広い形態とすることができる。すなわち、基礎化粧料であれば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク等の形態に、上記の多様な剤形において広く利用可能である。また、メーキャップ化粧料であれば、ファンデーション等、トイレタリー製品としてはボディーソープ、石けん等の形態に広く利用可能である。さらに、医薬品等としては、各種の軟膏剤、クリーム剤等の形態に広く利用が可能である。そして、これらの剤形及び形態に、本発明のＧＧＴ阻害活性によるコラーゲン産生促進剤の製剤形態が限定されるものではない。
【００７６】
ＧＧＴ阻害剤の配合量は特に限定するものではなく、配合する剤形の種類、性状、品質、期待する効果の程度により異なるが、例えば、０．００００１〜５０．０重量％、より好ましくは０．００００５〜１０．０重量％、さらには０．０００５〜１．０重量％が特に好ましい。特に、ＧＧＴ阻害剤をリポソーム化する等して、浸透促進を行う場合、より少ない配合量でも効果が期待できる。
【００７７】
上記の皮膚用剤には、上記コラーゲン産生促進剤成分以外に、通常化粧料や医薬品等の皮膚用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養・ビタミン剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００７８】
その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等のキレート剤、カフェイン、タンニン、トラネキサム酸及びその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸及びその誘導体または、その塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の他の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。
【００７９】
また、例えば、油脂類として、オリーブ油、アボカド油、パーム油、ヤシ油、硬化ヒマシ油等の植物油脂、牛脂、豚脂等の動物油脂を利用できる。また、ロウ類としては、例えば、ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリンなどが挙げられる。鉱物油としては、例えば、流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、スクワレン、スクワランなどが挙げられる。例えば、脂肪酸類としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などの天然脂肪酸のほか、イソノナン酸、カプロン酸などの合成脂肪酸も利用できる。
【００８０】
また、アルコール類として、エタノール、イソプロパノールなどの天然アルコール、２−ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、２−オクチルドデカノールなどの合成アルコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、バチルアルコール、ペンタエリトリトール、ソルビトール、マンニトール、ブドウ糖、ショ糖などの多価アルコール類なども利用できる。
【００８１】
その他、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル類、ステアリン酸アルミニウム等の金属セッケン、ガム質や水溶性高分子化合物として、アラビアゴム、カラギーナン、ゼラチン、アルギン酸およびその塩、ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロースなど配合してもよい。
【００８２】
界面活性剤（アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤）、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、動物あるいは植物、生薬の抽出物やエキス、微生物培養代謝物、α−ヒドロキシ酸、無機顔料、紫外線吸収剤、収斂剤、殺菌・消毒薬、頭髪用剤、香料、色素・着色剤、その他、ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、防腐・防バイ剤、清涼剤、安定化剤、乳化剤、動・植物性タンパク質およびその分解物、動・植物性多糖類およびその分解物、動・植物性糖タンパク質およびその分解物、血流促進剤、消炎剤・抗アレルギー剤、細胞賦活剤、角質溶解剤、創傷治療剤、増泡剤、増粘剤、口腔用剤、消臭・脱臭剤、苦味料、調味料、酵素なども利用可能である。
【００８３】
また、本発明には、皮膚線維芽細胞内のグルタチオン量を減少させることによって、前記皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進するコラーゲン産生促進剤において、γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤あるいは光老化防止剤も包含され得る。
【００８４】
なお、上述した本発明の実施態様において、コラーゲン産生促進剤は、ＧＧＴ阻害剤を用いてコラーゲン産生を促進する方法、あるいはコラーゲン産生の促進のためのＧＧＴ阻害剤の使用と読み替えることもできる。また、光老化防止剤は、ＧＧＴ阻害剤を用いて光老化を防止および／または改善する方法（紫外線ダメージを軽減する方法）、あるいは光老化の防止および／または改善のためのＧＧＴ阻害剤の使用（紫外線ダメージを軽減するためのＧＧＴ阻害剤の使用）と読み替えることもできる。また、保湿機能改善剤は、ＧＧＴ阻害剤を用いて皮膚の保湿機能を維持および／または改善する方法（保湿機能が低下するのを防止する方法）、あるいは保湿機能の維持および／または改善のためのＧＧＴ阻害剤の使用（保湿機能の低下を防止するためのＧＧＴ阻害剤の使用）と読み替えることもできる。
【００８５】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００８６】
＜１．細胞内グルタチオン量への影響＞
以下のような実験を行なって、ＧＧＴ阻害剤２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸（ＧＧＴ５ａ）のヒト正常皮膚由来線維芽細胞内グルタチオン量への影響を確認した。
【００８７】
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（CCD-1059SK、大日本製薬株式会社）を、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）を含むＤＭＥＭ培地で３〜６回継代培養した。次いで、細胞数が４.５×１０5個になるように直径３５ｍｍのＴＣシャーレ（Greiner社製）に播種し、ＧＧＴ５ａを添加して、０〜１０時間培養した。その後、２５ｍＭ Tris-HCl（pH7.4）溶液５００μlを用いて細胞を回収し、100,000×gで３０分間遠心分離した。上清（４８０μl）に０．５６Ｍ Borate Buffer(pH 10.4)溶液５００μｌ及びｏ−フタルアルデヒド溶液７３μｌを加え、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、細胞内グルタチオン量を測定した。HPLCの測定において、カラムはＯＤＳ Crestpak C18S(日本分光株式会社)）を用いた。溶出は、移動相Ａ（30 mM sodium acetate）及び移動相Ｂ（92.3%メタノール／7%アセトニトリル）を用いたグラジェント溶出により行なった。観測は、ｏ−フタルアルデヒド誘導体について、励起波長２３０ｎｍ、吸収波長４４４ｎｍで行なった。
【００８８】
この結果、ＧＧＴ阻害剤２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸（ＧＧＴ５ａ）が細胞内グルタチオン量を減少させることがわかった（図１）。
＜２．コラーゲン産生能の評価＞
上記のＧＧＴ阻害剤ＧＧＴ５ａのコラーゲン産生能向上作用を調べるために、以下の実験を行なった。
【００８９】
（１）試料の作製
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（CCD-1059SK、大日本製薬株式会社）を、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）を含むＤＭＥＭ培地で３〜６回継代培養した。次いで、細胞数が１×１０６個になるようにカルチャースライド（Culture slide：Falcon社製）に調製し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養して、細胞をスライドに固定させ、更に、細胞周期を合わせるためにＤＭＥＭ培地のみで２４時間培養した。その後、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地に交換し、同時にＧＧＴ５ａを添加して２４時間培養して、以下に示す各サンプル群を調製した。また、コントロールとして被験化合物を添加しない群、ポジティブコントロールとして、ビタミンＣ（ＶＣ）添加群を調製した。
【００９０】
＜サンプル群＞
１）コントロール群
２）ＧＧＴ５ａ １０μＭ添加群
３）ＶＣ １１４μＭ添加群（ポジティブコントロール）
（２）コラーゲンの産生量の測定
（１）で調製した１)〜３)のサンプル群について、次の手順により、コラーゲンの産生量を免疫組織化学的に解析した。
【００９１】
カルチャースライドをＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド溶液を添加して４℃で一晩静置し、サンプルを固定した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄後、３％Ｈ２Ｏ２溶液で５分間、内因性peroxidaseのブロッキングを行なった。次いで、１０％標準ヤギ血清（normal goat serum）を用いて５分間、非特異的反応のブロッキングを行なった。その後、抗ラット１型コラーゲン抗体（Anti-rat type I collagen 抗体（LSL社製）２００倍希釈液）を用いて一次抗体の反応を６０分間行なった。ＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄した後、ビオチン標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Biotinylated Goat anti-rabbit immunogloblins抗体（DAKO社製）４００倍希釈液）を用いて二次抗体の反応を３０分間行なった。ＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄した後、酵素溶液（Horseradish peroxidase-labelled streptavidine-biotine complex(DAKO社製)４００倍希釈液）による反応を３０分間行なった。ＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄した後、ＤＡＢ（3,3-diaminobenzidin tetra-hydrocheloride）溶液を５分間反応させ、peroxidase発色反応を行なった。ＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄した後、水溶性封入剤で封入して、標本を作製した。得られた標本における陽性反応（１型コラーゲンの発現）箇所における染色強度を、NIH imageソフトを用いて定量化し、画像解析により１型コラーゲンの産生量を解析した。
【００９２】
得られたコラーゲン産生量の解析結果を表１及び図２に示す。
【００９３】
表中の値は、コントロールを１００としたときの各サンプルの染色強度（１スライドにつき細胞２０個について測定して平均した値）の割合として表した。
【００９４】
【表１】
【００９５】
その結果、表１及び図２に示されるように、ＧＧＴ阻害剤ＧＧＴ５ａは、ポジティブコントロールとして用いたＶＣに比べて、極めて低濃度で著明なコラーゲン産生能向上作用を奏することが確認された。
＜３．角質水分量の評価＞
上記のＧＧＴ阻害剤ＧＧＴ５ａの肌への美容効果を検証するために、ＧＧＴ阻害剤を配合した化粧水の使用により角質水分量が変化するかを評価した。
（１）試験期間・被験者
・１２月中旬〜２月下旬（８週間連用、評価測定３回）
・２０代健常女性１名、３０代健常女性３名、４０代健常女性８名（全１２名）
（２）試験概要
ＧＧＴ５ａ（０．０００５％）を配合した化粧水を１日２回（朝・夜；プラセボ化粧水、ＧＧＴ５ａ配合化粧水を半顔ずつ）、８週間使用し、前後の肌状態を測定比較することでＧＧＴ阻害剤の皮膚の角質水分量への影響を評価した。なお、評価測定は、被験者が洗顔した後約２０分間、恒温恒湿室（室温２０℃、相対湿度５０％）で安静な状態を保ち馴化したのち、その一定環境下にて左右の頬部を対象に行った。化粧水の処方を以下に示す。なお、プラセボ化粧水はＧＧＴ阻害剤を配合していない以外は同じ処方である。
（処方） （重量％）
カルボキシメチルデキストランナトリウム塩 ０．０５
グリセリン ２
ＢＧ（ブチレングリコール） ２
１，２−ヘキサンジオール ０．５
ペンチレングリコール １
カプリリルグリコール ０．１
フェノキシエタノール ０．２
ヒアルロン酸水溶液 ２
チューベロース多糖体水溶液 １
ローズ水 ３
クエン酸 ０．０１
クエン酸ナトリウム ０．０４
ＧＧＴ阻害剤 ０．０００５
精製水 全体で１００となる量
皮膚表面水分測定装置Corneometer CM825(Courage+Khazaka electronic GmbH)を用い、左右の頬部に各１点ずつ設定した被験部位を、それぞれ１０回ずつ測定し角質水分量の変化率を計測した。測定値の上下２点ずつを除いた中間点６点の平均値をもって、その部位の角質水分量とした。グラフは、連用前の被験者平均を１００としたときの４週／８週連用後の角質水分量の変化を示している。
【００９６】
結果を図３に示す。同図に示すように、プラセボ化粧水では角質水分量が経時的に減少したのに対して、ＧＧＴ阻害剤配合化粧水を連用した場合には、有意な角質水分量の上昇が認められた。
＜４．肌弾力改善の評価＞
上記のＧＧＴ阻害剤ＧＧＴ５ａの肌への美容効果を検証するために、女性被験者１０名に対し、連用評価試験を行った。被験者１０名にＧＧＴ阻害剤を配合した化粧水を使用してもらい、使用前と１ヵ月後〜３ヵ月後まで１ヶ月ごとに肌を測定機器で測定し、結果をもとに評価を行った。また、ＧＧＴ阻害剤の相対的な有用性を評価するために、すでにしわの改善効果が認められている化粧品原料「マトリキシル」との比較を行った。マトリシキシルは、３％配合サンプルで、コラーゲン合成の増加により、しわの改善効果が認められている既知の化粧品原料である。なお、使用した化粧水の処方は、ＧＧＴ阻害剤の濃度を１０倍の０．００５重量％とした以外は、上記と同じ処方である。また、プラセボ化粧水は、ＧＧＴ阻害剤を配合していない以外は同じ組成である。またマトリキシル配合化粧水も、ＧＧＴ阻害剤に替えて、マトリキシルを３％配合した以外は同じ組成の化粧水である。
【００９７】
（１）試験内容
被験者 ：３０代〜５０代の一般女性１０名
試験期間：５月中旬〜８月下旬
測定回数：４回（連用前・１ヶ月目・２ヶ月目・３ヶ月目）
使用機器：Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ(Courage+Khazaka electronic GmbH)
測定部位：頬部（左・右）
なお、測定はすべて、洗顔後、恒温恒湿下（２０℃、ＲＨ５０％）で２０分間、肌を室温に馴化させてから行った。
【００９８】
（２）サンプル
１．プラセボ化粧水
２．マトリキシル（３％）配合化粧水
３．ＧＧＴ阻害剤（０．００５％）配合化粧水
被験者には、１日に朝・晩の２回、洗顔後にサンプルを使用してもらった。被験者を５人ずつ２群（Ａ群・Ｂ群）に分け、それぞれ以下の要領で顔に塗布し、その後、専用の保湿クリームを全顔に塗布してもらった。
【００９９】
Ａ群・・・左半顔：マトリキシル（３％）配合化粧水
右半顔：ＧＧＴ阻害剤（０．００５%）配合化粧水
Ｂ群・・・左半顔：プラセボ化粧水
右半顔：ＧＧＴ阻害剤（０．００５%）配合化粧水
なお、保湿クリームは、本試験用に作成した保湿クリームで、最低限の保湿効果が得られるように処方してあり、肌の弾力改善、美白効果、抗炎症効果をもつ原料は配合していない。
【０１００】
肌弾力の経時変化を調べた結果を図４に示す。連用前のそれぞれの数値を１００とした時の相対値をグラフにプロットし、縦軸は弾力パラメータＲ７（Ｕｒ／Ｕｆ;単位:なし）の平均変化率（単位：％）を表している。数値が１００よりも高いほど肌の弾力が連用前に比べて高くなったことを表している。同図に示すように、プラセボは１ヶ月以降から減少しているのに対し、マトリキシル、ＧＧＴ阻害剤を使用したものは１ヶ月後から持続的に数値の増加が見られる。また、マトリキシルは２ヶ月後〜３ヶ月後にほとんど変化が見られないが、ＧＧＴ阻害剤は２ヵ月後から３ヶ月後にかけて大きく数値が上昇しているのがわかる。
＜５．しわ改善の評価＞
顔画像解析機「VISIA evolution（ＴＭ）(Canfield Co.,Ltd.)」を用い、上記のＧＧＴ阻害剤配合化粧水を連用した部位」（以後、ＧＧＴ阻害剤（＋）部位）、「マトリキシル配合化粧水を連用した部位」（同、マトリキシル（＋）部位）、「プラセボ化粧水を連用した部位」（同、プラセボ部位）のそれぞれを１ヶ月ごとに撮影し、『一定の長さと形状（線状）が認められる部分をしわとして検出し、解析枠内に占めるその割合を表した値』を“しわスコア”として評価した。
【０１０１】
結果を図５に示す。ＧＧＴ阻害剤（＋）部位・マトリキシル（＋）部位・プラセボ部位のそれぞれについて、化粧水連用３ヶ月後のしわスコアを、試験開始前の状態を１００とした場合の相対値で示した。しわスコアは、その値が小さいほど、しわが少ない肌であることを意味している。
【０１０２】
３ヶ月後のしわスコアは、プラセボ部位で２５９．１%と大幅な増加が見られたのに対し、マトリキシル（＋）部位で８６．６%、ＧＧＴ阻害剤（＋）部位では８０．９%へ減少した。ＧＧＴ阻害剤が持つコラーゲン産生促進効果が、しわの改善につながっていることを確認できる結果となった。
＜６．紫外線（ＵＶ）ダメージの軽減機能の評価＞
ＧＧＴ阻害剤ＧＧＴ５ａの存在下で、皮膚由来の線維芽細胞に対して紫外線暴露した場合のダメージを評価した。具体的な実験方法は以下のとおり。
（１）ヒト正常皮膚由来線維芽細胞の培養
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞は、１０%牛胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（penicillin、50 units/ml、明治製菓）およびストレプトマイシン（streptomycin、50 mg/ml、明治製菓）を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ）培地（日水製薬）に細胞数が１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整し、３７℃、５%ＣＯ２に調整したインキュベータ内において培養し、２日ごとに培地交換した。細胞がコンフルエントになった時点で本培養を開始し、ＤＭＥＭ培地に交換すると同時にＧＧＴ阻害剤を濃度１０μＭとなるように添加して３時間培養した後、紫外線照射を行った。さらにその後、細胞内活性酸素種産生量の測定には１時間培養した後、実験に供した。また、細胞生存率の測定には２４時間培養した後、実験に供した。
（２）ヒト正常皮膚由来線維芽細胞への紫外線照射
紫外線照射にはＵＶランプ（ＴＯＳＨＩＢＡ殺菌ランプ ＧＬ１５）を使用した。ＵＶ−３４０ ＵＶ ＬＩＧＨＴ ＭＥＴＥＲ（佐藤商事株式会社）を用いて、ＵＶ強度が２０μＷとなるようにＵＶランプの高さを調節した。シャーレをＵＶランプ下に設置し、ふたを開けてＵＶを１分間照射した。
（３）細胞生存率の測定（ＭＴＴ法）
Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＭＴＴ）法は色素で生細胞を染色し、相対的な細胞量を簡便に測定する方法である。細胞内に取り込まれたほぼ無色素のテトラゾリウム塩が、ミトコンドリアの酸化還元酵素によって還元されて不溶性の着色物質（フォルマザン、ｆｏｒｍａｚａｎ）を形成する。生成したフォルマザン量は生細胞数に対応するため、この色素を有機溶媒で抽出して吸光度を測定した。
【０１０３】
細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調節して、直径３５ｍｍのプラスチックシャーレに１．０×１０３ｃｅｌｌｓずつ播き、各サンプルを添加した。本培養終了後、培地１ｍｌに対して０．５％ＭＴＴ溶液２００μｌを添加し、ＣＯ２インキュベータ内でさらに２時間インキュベートした。アスピレーターまたはマイクロピペットで培地を完全に取り除いた後、０．０４Ｎ ＨＣｌ／イソプロパノールを１ｍｌ添加し、ピペッティングしながら赤紫色のフォルマザンを溶解した。その後、吸光光度計（ＵＶ ｍｉｎｉ １２４０）を用いて５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
（４）細胞内過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）産生量の測定
活性酸素種（ＲＯＳ）産生量は、細胞内のｐｅｒｏｘｉｄｅｓをＤＣＦＨ−ＤＡの標識によって測定した。また、サンプルをＢｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク定量を行い、タンパク量あたりのＲＯＳ産生量を算出した。活性酸素種産生量の測定には、吸光度法および蛍光顕微鏡法の２つの方法を用いた。測定方法は以下の通りである。
【０１０４】
（ａ）吸光度法
・本培養終了３０分前に２．４ ｍＭ ＤＣＦＨ−ＤＡ液を５μｌ添加する。
・本培養終了後、培地を取り除き、ＰＢＳ １ｍｌで２回洗浄（氷上で行う）
・Ｈａｎｋｓ’ｓｏｌｕｔｉｏｎを１５０μｌ添加してラバーポリスマンで細胞をかきとり、１５０μｌ細胞液を９６穴プレートに入れる（２穴）。タンパク定量用に残り全量を別に冷凍保存しておく。
・マルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ）にて、波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光度を測定した。
・冷凍保存しておいたサンプル細胞液を超音波｛４ｍｉｎ、（３０ｓインターバル）×３回｝にかけ細胞膜を破壊する。
・遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）。
・タンパク定量は吸光光度計（ＵＶ ｍｉｎｉ １２４０）で５９５ｎｍの吸光度を測定する。
【０１０５】
（ｂ）蛍光顕微鏡法
・本培養終了３０分前に２．４ｍＭ ＤＣＦＨ−ＤＡ液を５μｌ添加する。
・本培養終了後、培地を取り除き、ＰＢＳ １ｍｌで２回洗浄（氷上で行う）。
・シャーレの壁をペンチで取り外し、少量のＨ２Ｏを滴下し、カバーガラス（２４ｍｍ×２４ｍｍ）を上にかぶせる。
・蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＬＳＣ１０１）下で観察し写真撮影する。
【０１０６】
結果を以下に示す。まず、紫外線照射下におけるヒト正常皮膚由来線維芽細胞の生存率に及ぼすＧＧＴ阻害剤の影響を調べた結果を図６に示す。同図に示すように、紫外線を照射することによって皮膚線維芽細胞の生存率は約２０％低下した。また、ＧＧＴ阻害剤を添加すると、紫外線によって低下した生存率を回復させる傾向が認められた。
【０１０７】
次に、紫外線照射下におけるヒト正常皮膚由来線維芽細胞のＨ２Ｏ２産生量の上昇におよぼすＧＧＴ阻害剤の影響を調べた結果を図７，図８に示す。同図に示すように、ヒト正常皮膚由来線維芽細胞のＨ２Ｏ２産生量は紫外線を照射することによって、照射していない群よりも高い値を示した。一方ＧＧＴ阻害剤は、紫外線照射によって上昇したＨ２Ｏ２量を減少させた。
【０１０８】
〔処方例：美容液〕
以下に示す処方の美容液を常法により製造した。
（組成） （重量％）
ソルビット ４．０
グリセリン ３．０
ブチレングリコール ３．０
ポリエチレングリコール １５００ ５．０
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル ０．５
ショ糖脂肪酸エステル ０．２
メチルセルロース ０．２
ＧＧＴ阻害剤 ０．００５
精製水 全体で１００となる量
〔処方例：乳液〕
以下に示す処方の乳液を常法により製造した。
（処方） （重量％）
グリセリン １．５
ショ糖脂肪酸エステル １．５
モノステアリン酸ソルビタン １．０
スクワラン ７．５
ジプロピレングリコール ５．０
ＧＧＴ阻害剤 ０．００５
精製水 全体で１００となる量
〔処方例：クリーム〕
以下に示す処方のクリームを常法により製造した。
（処方） （重量％）
グリセリン ３．０
ブチレングリコール ３．０
スクワラン １９．０
ステアリン酸 ５．０
モノステアリン酸グリセリン ５．０
モノステアリン酸ソルビタン １２．０
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン ３８．０
エデト酸ナトリウム ０．０３
ＧＧＴ阻害剤 ０．００５
精製水 全体で１００となる量
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明によれば、ＧＧＴ阻害活性を発揮することによってコラーゲン産生量を向上させるコラーゲン産生促進剤が提供される。また、ＧＧＴ阻害剤は、紫外線によるダメージの軽減効果や角質水分量の増加作用も奏する。このため、本発明によれば、皮膚のしわ・たるみ等の老化防止・改善、紫外線による光老化の防止・改善、さらに皮膚の保湿機能の維持改善等に好適な皮膚用剤が提供されるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガンマ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−Ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ＧＧＴ）阻害活性に基づき、皮膚の真皮層線維芽細胞におけるコラーゲン産生能を活性化する作用、また紫外線ダメージを軽減する作用並びに角質水分量を上昇させる作用により、皮膚の張り、艶や保湿効果を維持、増強し、皮膚のしわ・たるみ、また光老化等の老化症状を防止・改善する著明な効果を有する成分を含有する皮膚用剤用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は表皮、真皮、脂肪層（皮下組織）の３層構造を示し、真皮は線維組織と弾性組織でできた厚い層で、そのほとんどはコラーゲン等の細胞外マトリックスからなり、この層が皮膚に弾力性と強さを与え、張りや艶のあるみずみずしい肌の状態を保っている。しかしながら、紫外線の照射や乾燥等の外的因子の影響、又は加齢によって、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少するとともに、コラーゲン分解酵素であるマトリクス・メタロプロテアーゼ量が増加し、その結果として、真皮中のコラーゲンの減少、分解、変性が加速することにより、皮膚のバリア機能が低下し、保湿機能や弾力性がそこなわれ、皮膚の張りや艶がなくなり、しわ・たるみ等の皮膚の老化症状を呈するようになる。
【０００３】
皮膚の加齢変化に見られるしわ・たるみ等の発生は、外見上の老化現象の主たるものであり、多くの中高齢者にとって切実な問題となっている。従来、このような皮膚症状を改善する方法としては、コラーゲンを配合した化粧料を塗布することが主流であったが、一過性に皮膚表面の保湿性を補うものであることから、十分な効果を発揮するものではなかった。そこで、コラーゲン量の低下を改善する安全性の高い有効成分が望まれている。
【０００４】
かかる状況の中で、皮膚の張り、艶の維持や皮膚の保湿機能の改善等を含む皮膚の老化防止・改善を目的として、皮膚のコラーゲン量を増加させる化粧料の開発が進められてきた。例えば、天然物由来の抽出物が、１型コラーゲン産生促進作用を有することが報告され（特許文献１及び２）、真皮細胞外マトリクスを構成するコラーゲン合成を刺激する作用を有する成分として、アスコルビン酸等を含有させたものなどが報告されている（特許文献３）。また、本発明者らによって、皮膚線維芽細胞のコラーゲン産生量が、該線維芽細胞内のグルタチオン量の減少と関連して増加してくることを見出し、この機序によってコラーゲン産生を亢進する活性を有する化合物群について報告している（特許文献４）。
【０００５】
一方、細胞内のグルタチオンを分解する酵素として、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−Ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ＧＧＴ）が知られている。ＧＧＴは、細胞外の主なシステイン（Ｃｙｓ）のプールであるグルタチオンを分解し、グルタチオン生合成に必要なＣｙｓを細胞に供給する酵素として重要な役割をはたし、その阻害剤は、細胞のグルタチオン量を制御する生理作用があると考えられる。本発明者らは、高い活性ならびに高い選択性を有するＧＧＴ阻害剤について、特許文献５に報告した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１８６４７１号公報
【特許文献２】特開２００７−３０２６０７号公報
【特許文献３】特開２００４−０７５６４６号公報
【特許文献４】特開２００６−１５１８６０号公報
【特許文献５】ＷＯ ２００７／０６６７０５ Ａ１公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cutrin et al., Kidney International, Vol. 57 (2000), pp. 526-533）
【非特許文献２】Aberkane et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 285, 1162-1167 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＧＧＴ阻害活性を発揮することによってコラーゲン産生を促進させるだけでなく、紫外線によるダメージを防ぎ、光老化も防止できる化合物を有効成分とし、皮膚のしわ・たるみ等の老化防止・改善に有用なコラーゲン産生促進剤、光老化防止剤および保湿機能改善剤を提供し、並びに該コラーゲン産生促進剤、光老化防止剤または保湿機能改善剤を含有し、皮膚のしわ・たるみ、あるいは紫外線ダメージによる光老化、または保湿機能改善等の老化防止・改善、整肌作用に有効な皮膚用剤用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決することを主な目的として、種々の検討を重ねた結果、線維芽細胞内グルタチオン量の減少がコラーゲン産生量の増加と関連していることを見出し、さらに、ＧＧＴ阻害剤の機能を鋭意検討した結果、ＧＧＴ阻害剤が(i)線維芽細胞内グルタチオン量を減少させ、コラーゲン産生量を増加させること、(ii)紫外線による皮膚ダメージを防ぎ、光老化を防止・改善できること、および(iii)角質水分量を増加させ得ること等の新規機能を有することを発見し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明のコラーゲン産生促進剤は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とするものである。また、本発明の光老化防止剤は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とするものである。また、本発明の保湿機能改善剤は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とするものである。
【００１１】
本発明のコラーゲン産生促進剤、光老化防止剤または保湿機能改善剤において、前記化合物は、脱離基を有するホスホン酸ジエステル誘導体を含むことが好ましい。また前記化合物は、下記一般式（１）で（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が脱離基を表し、Ｒ１およびＲ２の少なくともいずれか一方が下記一般式（２）〜一般式（６）（式中、Ｒ３が置換基を有していてもよいアリール基、および置換基を有していてもよい複素環残基のいずれかであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８およびＲ９のそれぞれが、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、および電子吸引基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基であり、Ｒ４〜Ｒ８の置換基のうち隣接する２つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。）のいずれかを表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体を含むことが好ましい。また前記化合物は、２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸を含むことが好ましい。
【００１２】
また、本発明には、上記コラーゲン産生促進剤、光老化防止剤または保湿機能改善剤を含有する、皮膚用剤用組成物も含まれる。また、皮膚用剤用組成物は、しわまたは肌弾力の改善用であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、線維芽細胞内グルタチオン量を減少させるＧＧＴ阻害剤を有効成分とするものであって、皮膚の線維芽細胞におけるコラーゲン産生を著明に促進させる作用を有するものである。これにより、本発明のコラーゲン産生促進剤は、皮膚の線維芽細胞におけるコラーゲン産生を著明に促進する作用を有し、皮膚の老化防止・改善、具体的には、皮膚のハリ、艶の維持改善によるしわ・たるみの防止・改善、又は皮膚の保湿機能の維持改善等において有効な作用を発揮する。
【００１４】
また、本発明の光老化防止剤は、皮膚の細胞が紫外線により受けるダメージを軽減させることもできる。
【００１５】
また、本発明の保湿機能改善剤は、皮膚の角質水分量を上昇させることにより、皮膚の保湿機能を改善することができる。
【００１６】
そして、本発明のＧＧＴ阻害活性によるコラーゲン産生促進剤を含有する皮膚用剤用組成物は、皮膚の線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を著明に向上させる作用を有し、また肌弾力およびしわを改善させ得る。また本発明のＧＧＴ阻害活性による光老化防止剤を含有する皮膚用剤用組成物は、紫外線によるダメージを軽減し、光老化の防止・改善等において有効な作用を発揮する。また、本発明のＧＧＴ阻害活性による保湿機能改善剤を含有する皮膚用剤用組成物は、角質層の水分量を上昇させることにより、肌の保湿機能改善および整肌において有効な作用を発揮する。それゆえ、皮膚の老化防止・改善用または整肌用として、具体的には、皮膚のハリ、艶の維持改善によるしわ・たるみの防止・改善用として、又は光老化の防止・改善、あるいは皮膚の保湿機能の維持改善用などとして、有効に利用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例において得られたヒト皮膚由来線維芽細胞の細胞内グルタチオン量の測定結果を示す図面である。
【図２】実施例において得られたヒト皮膚由来線維芽細胞のコラーゲン染色像の結果を示す図面である。
【図３】実施例において得られた化粧水連用による角質水分量の変化率をしめす図である。
【図４】実施例において得られた化粧水連用３ヶ月の肌粘弾性の経時変化を示す図である。
【図５】実施例において得られた化粧水連用３ヶ月後のしわスコアを示す図である。
【図６】実施例において得られたＵＶ照射下におけるヒト正常皮膚由来線維芽細胞の生存率に及ぼすＧＧＴ阻害剤の影響を示す図である。
【図７】実施例において得られたＵＶ照射下におけるヒト正常皮膚由来線維芽細胞内のＨ２Ｏ２産生量の上昇におよぼすＧＧＴ阻害剤の影響を示す図である。
【図８】実施例において得られたＵＶ曝露によって亢進したヒト皮膚線維芽細胞の細胞内Ｈ２Ｏ２産生量におよぼすＧＧＴ阻害剤の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
従来、ＧＧＴは細胞外のグルタチオンを分解する酵素であることが知られていた。そこで、一般的に考えて、ＧＧＴの活性を阻害すれば、グルタチオンの分解が妨げられるため、細胞内のグルタチオン量も増加ないしは維持されるものと考えられる。この予測を裏付ける学術論文として、例えば、非特許文献１が挙げられる。本文献では、ラット腎臓にＧＧＴ阻害剤であるアシビシンを投与すると、コントロールと比較してグルタチオン量が上昇する（Fig.6）。また、アシビシン投与によりＧＧＴ活性も低下することが示されている（Fig.1）。つまり、非特許文献１では、ＧＧＴ阻害剤を加えることで、グルタチオンの分解が抑制され、その結果、グルタチオン量が増加することが示されている。また、非特許文献２には、ヒトＧＧＴを高度に発現させたＶ７９ＧＧＴ細胞系にアシビシンを投与しても、細胞内グルタチオン量に大きな差は認められないというデータが記載されている（Table 2）。なお、ＧＧＴはアシビシンにより濃度依存的に阻害されている（Table 1）。一方、細胞内のグルタチオン量は、ＧＧＴ以外にも、生合成や代謝、輸送といった様々な要因が関係するため、単純にＧＧＴ活性とグルタチオン量の関係性を導くのは難しい。さらに、従来、ＧＧＴ阻害剤として頻用されてきたアシビシンは、ＧＧＴ以外の酵素も幅広く阻害し、細胞の生合成系を多岐にわたって撹乱することから、アシビシンを使った従来の研究におけるグルタチオン量とＧＧＴの関係性については未だ不明瞭なままである。
【００１９】
そこで、本発明者らは、アシビシンに代わるGGT選択的な阻害剤を用いて、独自に鋭意検討したところ、選択的ＧＧＴ阻害剤が線維芽細胞内のグルタチオン量を減少させるという現象を世界で初めて発見した。このような知見は、例えば、上記非特許文献１，２にはもちろんのこと、上記特許文献４，５にも全く開示も示唆もされていない。本発明者らは、この新規知見に基づき、本ＧＧＴ阻害剤が細胞内グルタチオン量を減少させ、結果としてコラーゲン産生を促進させること、また紫外線によるダメージを軽減すること、加えて角質水分量を上昇させ得ること等のＧＧＴ阻害剤の新規機能を見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は、本発明者らが独自に見出した全く新規で独創的なものであるといえる。
【００２０】
また、本発明者らは、後述する実施例に示すように、ＧＧＴ阻害剤が、コラーゲン産生促進だけでなく、皮膚の線維芽細胞が紫外線照射によって受けるダメージを軽減し得ることを見出している。皮膚の老化として光老化がある。光老化は紫外線を浴びることによって生じる老化であり、その原因の１つに活性酸素種による生体内成分の酸化があげられる。光老化によって皮膚のコラーゲン量が減少するため、皮膚の弾力性が衰え、皺が出現する。コラーゲンの減少は、コラーゲン分解能の亢進が大きく関与していることが知られている。後述する実施例に示すように、ＧＧＴ阻害剤は紫外線曝露によって増加した細胞内活性酸素種産生量を有意に低下させたことから、光老化に対する予防効果あるいは改善効果を有することが明らかとなった。なお、本発明でいう光老化防止剤とは、光老化を防止および／または改善する組成物のことを意図する。
【００２１】
また、本発明者らは、ＧＧＴ阻害剤は、皮膚の角質層の水分量を増加させる機能を有することも確認している。これにより、ＧＧＴ阻害剤を用いた肌の保湿機能を改善・維持し、整肌作用を有する組成物を提供することも本発明に含まれる。なお、本発明でいう保湿機能改善剤とは、皮膚（肌）の保湿機能を改善および／または保湿機能が低下するのを防止する（保湿機能を維持する）組成物のことを意図する。
【００２２】
以下、本発明の具体的な実施態様の一例について説明する。
【００２３】
本発明において用いるＧＧＴ阻害剤としては、酵素選択性が高く、不可逆的な阻害活性を発揮することを特徴とするホスホン酸ジエステル誘導体群（特許文献５）も使用することができる。このホスホン酸ジエステル誘導体群は、特に生体毒性が低いため、好ましく使用できる。
【００２４】
具体的には、例えば、以下に示すホスホン酸ジエステル誘導体群を好適に用いることができる。
【００２５】
１．一般式（１）
【００２６】
【化１】
【００２７】
（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が脱離基を表す。）で示される、ホスホン酸ジエステル誘導体。
【００２８】
２．上記一般式（１）
（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくともいずれか一方が一般式（２）〜一般式（６）
【００２９】
【化２】
【００３０】
（式中、Ｒ３が置換基を有していてもよいアリール基、および置換基を有していてもよい複素環残基のいずれかであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８およびＲ９のそれぞれが、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、および電子吸引基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基であり、Ｒ４〜Ｒ８の置換基のうち隣接する２つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。）のいずれかを表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００３１】
３．上記一般式（１）
（式中、Ｒ１がＯＲ１０であり、Ｒ２がＯＲ１１であり、Ｒ１０およびＲ１１が水素原子を除く。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００３２】
４．上記３に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、Ｒ１０が、置換基を有していてもよいアルキル基、および置換基を有していてもよいアリール基のいずれかであり、Ｒ１１が置換基を有していてもよいアリール基であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００３３】
５．上記４に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、前記置換基を有していてもよいアルキル基の置換基が、置換基を有していてもよいフェニル基、窒素を有する複素環残基、アルキルスルファニル基、アリールスルファニル基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、アルコキシ基、アミド基、カルボキシ基およびカルボキシ基の等価体からなる群より選択される少なくとも１つの基であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００３４】
６．上記４に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、前記Ｒ１０の置換基を有していてもよいアルキル基が、一般式（７）
【００３５】
【化３】
【００３６】
（式中、Ｒ１２が、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基および水素原子のいずれかを表し、Ｒ１３が、水素原子および一般式（８）
【００３７】
【化４】
【００３８】
（式中、ｎ１が０〜４の整数を、ｎ２が０および１のいずれかを、ｎ３が０〜４の整数を、Ｘ１がアミド基およびアルケニル基のいずれかを、Ｘ２がカルボキシ基、およびカルボキシ基の等価体のいずれかを、Ｒ１４が水素原子および低級アルキル基のいずれかを表す。）のいずれかを表す。）であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００３９】
７．上記５または６に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、カルボキシ基およびカルボキシ基の等価体が、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲ２、−ＣＯＲ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＨＣＯＲ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ３Ｒ、および−ＳＯ２ＮＲ２からなる群より選択される少なくとも１つの基であり、Ｒが水素原子およびアルキル基のいずれかであるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４０】
８．上記６に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、前記Ｒ１２の置換基を有していてもよいアルキル基の置換基が、置換基を有していてもよいフェニル基、窒素を有する複素環残基、アルキルスルファニル基、アリールスルファニル基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、アルコキシ基、およびアミド基からなる群より選択される少なくとも１つの基であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４１】
９．上記４に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、前記置換基を有していてもよいアリール基の置換基が、カルボキシ基およびカルボキシ基の等価体のいずれかにより置換されていてもよいアルキル基、電子吸引基、カルボキシ基、およびカルボキシ基の等価体からなる群より選択される少なくとも１つの基であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４２】
１０．前記置換基を有してもよいアリール基が、置換基を有してもよいフェニル基である上記４に示すホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４３】
１１．上記１０に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、前記置換基を有してもよいフェニル基が、一般式（９）
【００４４】
【化５】
【００４５】
（式中、Ｙ１が、−Ｒ’、−ＯＲ’、および電子吸引基からなる群より選択される１つの基を表し、Ｙ２が、カルボキシ基およびカルボキシ基の等価体のいずれかで置換されていてもよく、かつ二重結合を有していてもよいアルキル基、水素原子、カルボキシ基、ならびにカルボキシ基の等価体からなる群より選択される１つの基を表し、隣接する２つの置換基Ｙ１とＹ２とが互いに結合して環を形成してもよく、Ｒ’が水素原子、および二重結合を有していてもよいアルキル基のいずれかを表す。）であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４６】
１２．上記９または１１に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、電子吸引基が、ハロゲン原子、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＲ’２、−ＣＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＳＯ２Ｒ’、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＰＯ（ＯＲ’）２、および−ＮＯ２からなる群より選択される少なくとも１つの基であり、Ｒ’が前記と同じ意味を表すホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４７】
１３．上記９または１１に示すホスホン酸ジエステル誘導体であって、カルボキシ基およびカルボキシ基の等価体が、−ＣＯＯＲ”、−ＣＯＮＲ”２、−ＣＯＲ”、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＨＣＯＲ”、−ＯＲ”、−ＳＲ”、−ＯＣＯＲ”、−ＳＯ３Ｒ”、−ＳＯ２ＮＲ”２からなる群より選択される少なくとも１つの基であり、Ｒ”が水素原子および二重結合を有していてもよいアルキル基のいずれかであるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００４８】
１４．一般式（１０）
【００４９】
【化６】
【００５０】
（式中、Ｒ１２，Ｒ１４，Ｘ２，Ｙ１およびｎ３は前記と同じ意味を表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００５１】
１５．一般式（１１）
【００５２】
【化７】
【００５３】
（式中、Ｒ１２，Ｒ１４，Ｘ２，Ｙ１，ｎ１およびｎ３は前記と同じ意味を表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００５４】
１６．一般式（１２）
【００５５】
【化８】
【００５６】
（式中、Ｒ１５が低級アルキル基を表し、Ｗが一般式（１３）〜一般式（１６）
【００５７】
【化９】
【００５８】
のいずれかを表し、Ｒ１６が水素原子および低級アルキル基のいずれかを表し、Ｙ１およびＹ２が前記と同じ意味を表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００５９】
１７．一般式（１７）
【００６０】
【化１０】
【００６１】
（式中、Ｒ１２およびＹ１は前記と同じ意味を表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００６２】
１８．一般式（１８）
【００６３】
【化１１】
【００６４】
（式中、Ｙ１およびＹ２は前記と同じ意味を表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００６５】
１９．一般式（１９）
【００６６】
【化１２】
【００６７】
（式中、Ｍがアルカリ金属を表し、Ｒ１７が置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基を含むアルコキシカルボニル基を表す。）で示される２−置換アミノ−４−ホスホノブタン酸の金属塩。
【００６８】
２０．一般式（２０）
【００６９】
【化１３】
【００７０】
（式中、Ｒ１８が置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基を表し、Ｒ１７が前記と同じ意味を表す。）で示される２−置換アミノ−４−ホスホノブタン酸エステル。
【００７１】
なお、上記１〜２０に示すホスホン酸ジエステル誘導体の詳細な製造方法や諸性質については特許文献５に開示されている。本発明ではこの特許文献５の記載を必要に応じて援用でき、またこの特許文献５の記載内容は本発明に適宜利用できることを付言する。つまり、この特許文献５の開示内容も本発明の一部であり、特許文献５の記載内容に基づき補正することも可能である。
【００７２】
なかでも特に、上記一般式（１２）において、Ｗが一般式（１３）または（１５）であるホスホン酸ジエステル誘導体は、特許文献５の実施例にて実際に合成され、かつＧＧＴ阻害活性も確認されており好ましい。
【００７３】
また上記ホスホン酸ジエステル誘導体は、脱離基がリン酸基から脱離することでＧＧＴ活性を発揮することが本発明者らの研究で確認されている。つまり、脱離基が脱離しやすい程、ＧＧＴ活性が向上する。しかし、この脱離基の脱離しやすさは、化合物の安定性とも関連するため、一概に脱離しやすい脱離基を有する化合物が好ましいとはいえない。この脱離基の脱離しやすさと安定性とのバランスが優れる化合物の例示として、上記１〜２０のホスホン酸ジエステル誘導体を挙げることができ、上記一般式（１２）において、Ｒ１５が一般式（１３）または（１５）であるホスホン酸ジエステル誘導体がより好ましく、さらに２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸が特に好ましい。
【００７４】
また、上記ホスホン酸ジエステル誘導体には単体および混合物のみならず、光学異性体が含まれていてもよい。例えば、実施例で用いている２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸であれば、２つのキラル原子が存在するため、合計４種の光学異性体の混合物である。
【００７５】
本発明のＧＧＴ阻害活性によるコラーゲン産生促進剤、光老化防止剤または保湿機能改善剤は、皮膚のハリ、艶の維持改善によるしわ・たるみの防止・改善用として、又は紫外線ダメージ（光老化）の防止・改善、あるいは皮膚の保湿機能の維持改善用といった皮膚用剤用組成物として皮膚に塗布して使用できるほか、パップ剤、化粧料、浴用剤、ときに皮下注射用剤としての剤形も目的に応じて任意に選択することができる。特に、好適には化粧料として広く利用することが可能で、クリーム、軟膏、乳液、溶液、ゲル、粉剤、顆粒剤等の剤形やパック、ローション、パウダー、スティック等の形態とすることができる。その製剤形態も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層系等、幅広い形態とすることができる。すなわち、基礎化粧料であれば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク等の形態に、上記の多様な剤形において広く利用可能である。また、メーキャップ化粧料であれば、ファンデーション等、トイレタリー製品としてはボディーソープ、石けん等の形態に広く利用可能である。さらに、医薬品等としては、各種の軟膏剤、クリーム剤等の形態に広く利用が可能である。そして、これらの剤形及び形態に、本発明のＧＧＴ阻害活性によるコラーゲン産生促進剤の製剤形態が限定されるものではない。
【００７６】
ＧＧＴ阻害剤の配合量は特に限定するものではなく、配合する剤形の種類、性状、品質、期待する効果の程度により異なるが、例えば、０．００００１〜５０．０重量％、より好ましくは０．００００５〜１０．０重量％、さらには０．０００５〜１．０重量％が特に好ましい。特に、ＧＧＴ阻害剤をリポソーム化する等して、浸透促進を行う場合、より少ない配合量でも効果が期待できる。
【００７７】
上記の皮膚用剤には、上記コラーゲン産生促進剤成分以外に、通常化粧料や医薬品等の皮膚用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養・ビタミン剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００７８】
その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等のキレート剤、カフェイン、タンニン、トラネキサム酸及びその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸及びその誘導体または、その塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の他の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。
【００７９】
また、例えば、油脂類として、オリーブ油、アボカド油、パーム油、ヤシ油、硬化ヒマシ油等の植物油脂、牛脂、豚脂等の動物油脂を利用できる。また、ロウ類としては、例えば、ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリンなどが挙げられる。鉱物油としては、例えば、流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、スクワレン、スクワランなどが挙げられる。例えば、脂肪酸類としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などの天然脂肪酸のほか、イソノナン酸、カプロン酸などの合成脂肪酸も利用できる。
【００８０】
また、アルコール類として、エタノール、イソプロパノールなどの天然アルコール、２−ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、２−オクチルドデカノールなどの合成アルコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、バチルアルコール、ペンタエリトリトール、ソルビトール、マンニトール、ブドウ糖、ショ糖などの多価アルコール類なども利用できる。
【００８１】
その他、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル類、ステアリン酸アルミニウム等の金属セッケン、ガム質や水溶性高分子化合物として、アラビアゴム、カラギーナン、ゼラチン、アルギン酸およびその塩、ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロースなど配合してもよい。
【００８２】
界面活性剤（アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤）、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、動物あるいは植物、生薬の抽出物やエキス、微生物培養代謝物、α−ヒドロキシ酸、無機顔料、紫外線吸収剤、収斂剤、殺菌・消毒薬、頭髪用剤、香料、色素・着色剤、その他、ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、防腐・防バイ剤、清涼剤、安定化剤、乳化剤、動・植物性タンパク質およびその分解物、動・植物性多糖類およびその分解物、動・植物性糖タンパク質およびその分解物、血流促進剤、消炎剤・抗アレルギー剤、細胞賦活剤、角質溶解剤、創傷治療剤、増泡剤、増粘剤、口腔用剤、消臭・脱臭剤、苦味料、調味料、酵素なども利用可能である。
【００８３】
また、本発明には、皮膚線維芽細胞内のグルタチオン量を減少させることによって、前記皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進するコラーゲン産生促進剤において、γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤あるいは光老化防止剤も包含され得る。
【００８４】
なお、上述した本発明の実施態様において、コラーゲン産生促進剤は、ＧＧＴ阻害剤を用いてコラーゲン産生を促進する方法、あるいはコラーゲン産生の促進のためのＧＧＴ阻害剤の使用と読み替えることもできる。また、光老化防止剤は、ＧＧＴ阻害剤を用いて光老化を防止および／または改善する方法（紫外線ダメージを軽減する方法）、あるいは光老化の防止および／または改善のためのＧＧＴ阻害剤の使用（紫外線ダメージを軽減するためのＧＧＴ阻害剤の使用）と読み替えることもできる。また、保湿機能改善剤は、ＧＧＴ阻害剤を用いて皮膚の保湿機能を維持および／または改善する方法（保湿機能が低下するのを防止する方法）、あるいは保湿機能の維持および／または改善のためのＧＧＴ阻害剤の使用（保湿機能の低下を防止するためのＧＧＴ阻害剤の使用）と読み替えることもできる。
【００８５】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００８６】
＜１．細胞内グルタチオン量への影響＞
以下のような実験を行なって、ＧＧＴ阻害剤２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸（ＧＧＴ５ａ）のヒト正常皮膚由来線維芽細胞内グルタチオン量への影響を確認した。
【００８７】
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（CCD-1059SK、大日本製薬株式会社）を、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）を含むＤＭＥＭ培地で３〜６回継代培養した。次いで、細胞数が４.５×１０5個になるように直径３５ｍｍのＴＣシャーレ（Greiner社製）に播種し、ＧＧＴ５ａを添加して、０〜１０時間培養した。その後、２５ｍＭ Tris-HCl（pH7.4）溶液５００μlを用いて細胞を回収し、100,000×gで３０分間遠心分離した。上清（４８０μl）に０．５６Ｍ Borate Buffer(pH 10.4)溶液５００μｌ及びｏ−フタルアルデヒド溶液７３μｌを加え、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、細胞内グルタチオン量を測定した。HPLCの測定において、カラムはＯＤＳ Crestpak C18S(日本分光株式会社)）を用いた。溶出は、移動相Ａ（30 mM sodium acetate）及び移動相Ｂ（92.3%メタノール／7%アセトニトリル）を用いたグラジェント溶出により行なった。観測は、ｏ−フタルアルデヒド誘導体について、励起波長２３０ｎｍ、吸収波長４４４ｎｍで行なった。
【００８８】
この結果、ＧＧＴ阻害剤２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸（ＧＧＴ５ａ）が細胞内グルタチオン量を減少させることがわかった（図１）。
＜２．コラーゲン産生能の評価＞
上記のＧＧＴ阻害剤ＧＧＴ５ａのコラーゲン産生能向上作用を調べるために、以下の実験を行なった。
【００８９】
（１）試料の作製
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（CCD-1059SK、大日本製薬株式会社）を、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）を含むＤＭＥＭ培地で３〜６回継代培養した。次いで、細胞数が１×１０６個になるようにカルチャースライド（Culture slide：Falcon社製）に調製し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養して、細胞をスライドに固定させ、更に、細胞周期を合わせるためにＤＭＥＭ培地のみで２４時間培養した。その後、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地に交換し、同時にＧＧＴ５ａを添加して２４時間培養して、以下に示す各サンプル群を調製した。また、コントロールとして被験化合物を添加しない群、ポジティブコントロールとして、ビタミンＣ（ＶＣ）添加群を調製した。
【００９０】
＜サンプル群＞
１）コントロール群
２）ＧＧＴ５ａ １０μＭ添加群
３）ＶＣ １１４μＭ添加群（ポジティブコントロール）
（２）コラーゲンの産生量の測定
（１）で調製した１)〜３)のサンプル群について、次の手順により、コラーゲンの産生量を免疫組織化学的に解析した。
【００９１】
カルチャースライドをＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド溶液を添加して４℃で一晩静置し、サンプルを固定した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄後、３％Ｈ２Ｏ２溶液で５分間、内因性peroxidaseのブロッキングを行なった。次いで、１０％標準ヤギ血清（normal goat serum）を用いて５分間、非特異的反応のブロッキングを行なった。その後、抗ラット１型コラーゲン抗体（Anti-rat type I collagen 抗体（LSL社製）２００倍希釈液）を用いて一次抗体の反応を６０分間行なった。ＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄した後、ビオチン標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Biotinylated Goat anti-rabbit immunogloblins抗体（DAKO社製）４００倍希釈液）を用いて二次抗体の反応を３０分間行なった。ＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄した後、酵素溶液（Horseradish peroxidase-labelled streptavidine-biotine complex(DAKO社製)４００倍希釈液）による反応を３０分間行なった。ＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄した後、ＤＡＢ（3,3-diaminobenzidin tetra-hydrocheloride）溶液を５分間反応させ、peroxidase発色反応を行なった。ＰＢＳ溶液で５分間、３回洗浄した後、水溶性封入剤で封入して、標本を作製した。得られた標本における陽性反応（１型コラーゲンの発現）箇所における染色強度を、NIH imageソフトを用いて定量化し、画像解析により１型コラーゲンの産生量を解析した。
【００９２】
得られたコラーゲン産生量の解析結果を表１及び図２に示す。
【００９３】
表中の値は、コントロールを１００としたときの各サンプルの染色強度（１スライドにつき細胞２０個について測定して平均した値）の割合として表した。
【００９４】
【表１】
【００９５】
その結果、表１及び図２に示されるように、ＧＧＴ阻害剤ＧＧＴ５ａは、ポジティブコントロールとして用いたＶＣに比べて、極めて低濃度で著明なコラーゲン産生能向上作用を奏することが確認された。
＜３．角質水分量の評価＞
上記のＧＧＴ阻害剤ＧＧＴ５ａの肌への美容効果を検証するために、ＧＧＴ阻害剤を配合した化粧水の使用により角質水分量が変化するかを評価した。
（１）試験期間・被験者
・１２月中旬〜２月下旬（８週間連用、評価測定３回）
・２０代健常女性１名、３０代健常女性３名、４０代健常女性８名（全１２名）
（２）試験概要
ＧＧＴ５ａ（０．０００５％）を配合した化粧水を１日２回（朝・夜；プラセボ化粧水、ＧＧＴ５ａ配合化粧水を半顔ずつ）、８週間使用し、前後の肌状態を測定比較することでＧＧＴ阻害剤の皮膚の角質水分量への影響を評価した。なお、評価測定は、被験者が洗顔した後約２０分間、恒温恒湿室（室温２０℃、相対湿度５０％）で安静な状態を保ち馴化したのち、その一定環境下にて左右の頬部を対象に行った。化粧水の処方を以下に示す。なお、プラセボ化粧水はＧＧＴ阻害剤を配合していない以外は同じ処方である。
（処方） （重量％）
カルボキシメチルデキストランナトリウム塩 ０．０５
グリセリン ２
ＢＧ（ブチレングリコール） ２
１，２−ヘキサンジオール ０．５
ペンチレングリコール １
カプリリルグリコール ０．１
フェノキシエタノール ０．２
ヒアルロン酸水溶液 ２
チューベロース多糖体水溶液 １
ローズ水 ３
クエン酸 ０．０１
クエン酸ナトリウム ０．０４
ＧＧＴ阻害剤 ０．０００５
精製水 全体で１００となる量
皮膚表面水分測定装置Corneometer CM825(Courage+Khazaka electronic GmbH)を用い、左右の頬部に各１点ずつ設定した被験部位を、それぞれ１０回ずつ測定し角質水分量の変化率を計測した。測定値の上下２点ずつを除いた中間点６点の平均値をもって、その部位の角質水分量とした。グラフは、連用前の被験者平均を１００としたときの４週／８週連用後の角質水分量の変化を示している。
【００９６】
結果を図３に示す。同図に示すように、プラセボ化粧水では角質水分量が経時的に減少したのに対して、ＧＧＴ阻害剤配合化粧水を連用した場合には、有意な角質水分量の上昇が認められた。
＜４．肌弾力改善の評価＞
上記のＧＧＴ阻害剤ＧＧＴ５ａの肌への美容効果を検証するために、女性被験者１０名に対し、連用評価試験を行った。被験者１０名にＧＧＴ阻害剤を配合した化粧水を使用してもらい、使用前と１ヵ月後〜３ヵ月後まで１ヶ月ごとに肌を測定機器で測定し、結果をもとに評価を行った。また、ＧＧＴ阻害剤の相対的な有用性を評価するために、すでにしわの改善効果が認められている化粧品原料「マトリキシル」との比較を行った。マトリシキシルは、３％配合サンプルで、コラーゲン合成の増加により、しわの改善効果が認められている既知の化粧品原料である。なお、使用した化粧水の処方は、ＧＧＴ阻害剤の濃度を１０倍の０．００５重量％とした以外は、上記と同じ処方である。また、プラセボ化粧水は、ＧＧＴ阻害剤を配合していない以外は同じ組成である。またマトリキシル配合化粧水も、ＧＧＴ阻害剤に替えて、マトリキシルを３％配合した以外は同じ組成の化粧水である。
【００９７】
（１）試験内容
被験者 ：３０代〜５０代の一般女性１０名
試験期間：５月中旬〜８月下旬
測定回数：４回（連用前・１ヶ月目・２ヶ月目・３ヶ月目）
使用機器：Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ(Courage+Khazaka electronic GmbH)
測定部位：頬部（左・右）
なお、測定はすべて、洗顔後、恒温恒湿下（２０℃、ＲＨ５０％）で２０分間、肌を室温に馴化させてから行った。
【００９８】
（２）サンプル
１．プラセボ化粧水
２．マトリキシル（３％）配合化粧水
３．ＧＧＴ阻害剤（０．００５％）配合化粧水
被験者には、１日に朝・晩の２回、洗顔後にサンプルを使用してもらった。被験者を５人ずつ２群（Ａ群・Ｂ群）に分け、それぞれ以下の要領で顔に塗布し、その後、専用の保湿クリームを全顔に塗布してもらった。
【００９９】
Ａ群・・・左半顔：マトリキシル（３％）配合化粧水
右半顔：ＧＧＴ阻害剤（０．００５%）配合化粧水
Ｂ群・・・左半顔：プラセボ化粧水
右半顔：ＧＧＴ阻害剤（０．００５%）配合化粧水
なお、保湿クリームは、本試験用に作成した保湿クリームで、最低限の保湿効果が得られるように処方してあり、肌の弾力改善、美白効果、抗炎症効果をもつ原料は配合していない。
【０１００】
肌弾力の経時変化を調べた結果を図４に示す。連用前のそれぞれの数値を１００とした時の相対値をグラフにプロットし、縦軸は弾力パラメータＲ７（Ｕｒ／Ｕｆ;単位:なし）の平均変化率（単位：％）を表している。数値が１００よりも高いほど肌の弾力が連用前に比べて高くなったことを表している。同図に示すように、プラセボは１ヶ月以降から減少しているのに対し、マトリキシル、ＧＧＴ阻害剤を使用したものは１ヶ月後から持続的に数値の増加が見られる。また、マトリキシルは２ヶ月後〜３ヶ月後にほとんど変化が見られないが、ＧＧＴ阻害剤は２ヵ月後から３ヶ月後にかけて大きく数値が上昇しているのがわかる。
＜５．しわ改善の評価＞
顔画像解析機「VISIA evolution（ＴＭ）(Canfield Co.,Ltd.)」を用い、上記のＧＧＴ阻害剤配合化粧水を連用した部位」（以後、ＧＧＴ阻害剤（＋）部位）、「マトリキシル配合化粧水を連用した部位」（同、マトリキシル（＋）部位）、「プラセボ化粧水を連用した部位」（同、プラセボ部位）のそれぞれを１ヶ月ごとに撮影し、『一定の長さと形状（線状）が認められる部分をしわとして検出し、解析枠内に占めるその割合を表した値』を“しわスコア”として評価した。
【０１０１】
結果を図５に示す。ＧＧＴ阻害剤（＋）部位・マトリキシル（＋）部位・プラセボ部位のそれぞれについて、化粧水連用３ヶ月後のしわスコアを、試験開始前の状態を１００とした場合の相対値で示した。しわスコアは、その値が小さいほど、しわが少ない肌であることを意味している。
【０１０２】
３ヶ月後のしわスコアは、プラセボ部位で２５９．１%と大幅な増加が見られたのに対し、マトリキシル（＋）部位で８６．６%、ＧＧＴ阻害剤（＋）部位では８０．９%へ減少した。ＧＧＴ阻害剤が持つコラーゲン産生促進効果が、しわの改善につながっていることを確認できる結果となった。
＜６．紫外線（ＵＶ）ダメージの軽減機能の評価＞
ＧＧＴ阻害剤ＧＧＴ５ａの存在下で、皮膚由来の線維芽細胞に対して紫外線暴露した場合のダメージを評価した。具体的な実験方法は以下のとおり。
（１）ヒト正常皮膚由来線維芽細胞の培養
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞は、１０%牛胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（penicillin、50 units/ml、明治製菓）およびストレプトマイシン（streptomycin、50 mg/ml、明治製菓）を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ）培地（日水製薬）に細胞数が１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整し、３７℃、５%ＣＯ２に調整したインキュベータ内において培養し、２日ごとに培地交換した。細胞がコンフルエントになった時点で本培養を開始し、ＤＭＥＭ培地に交換すると同時にＧＧＴ阻害剤を濃度１０μＭとなるように添加して３時間培養した後、紫外線照射を行った。さらにその後、細胞内活性酸素種産生量の測定には１時間培養した後、実験に供した。また、細胞生存率の測定には２４時間培養した後、実験に供した。
（２）ヒト正常皮膚由来線維芽細胞への紫外線照射
紫外線照射にはＵＶランプ（ＴＯＳＨＩＢＡ殺菌ランプ ＧＬ１５）を使用した。ＵＶ−３４０ ＵＶ ＬＩＧＨＴ ＭＥＴＥＲ（佐藤商事株式会社）を用いて、ＵＶ強度が２０μＷとなるようにＵＶランプの高さを調節した。シャーレをＵＶランプ下に設置し、ふたを開けてＵＶを１分間照射した。
（３）細胞生存率の測定（ＭＴＴ法）
Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＭＴＴ）法は色素で生細胞を染色し、相対的な細胞量を簡便に測定する方法である。細胞内に取り込まれたほぼ無色素のテトラゾリウム塩が、ミトコンドリアの酸化還元酵素によって還元されて不溶性の着色物質（フォルマザン、ｆｏｒｍａｚａｎ）を形成する。生成したフォルマザン量は生細胞数に対応するため、この色素を有機溶媒で抽出して吸光度を測定した。
【０１０３】
細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調節して、直径３５ｍｍのプラスチックシャーレに１．０×１０３ｃｅｌｌｓずつ播き、各サンプルを添加した。本培養終了後、培地１ｍｌに対して０．５％ＭＴＴ溶液２００μｌを添加し、ＣＯ２インキュベータ内でさらに２時間インキュベートした。アスピレーターまたはマイクロピペットで培地を完全に取り除いた後、０．０４Ｎ ＨＣｌ／イソプロパノールを１ｍｌ添加し、ピペッティングしながら赤紫色のフォルマザンを溶解した。その後、吸光光度計（ＵＶ ｍｉｎｉ １２４０）を用いて５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
（４）細胞内過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）産生量の測定
活性酸素種（ＲＯＳ）産生量は、細胞内のｐｅｒｏｘｉｄｅｓをＤＣＦＨ−ＤＡの標識によって測定した。また、サンプルをＢｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク定量を行い、タンパク量あたりのＲＯＳ産生量を算出した。活性酸素種産生量の測定には、吸光度法および蛍光顕微鏡法の２つの方法を用いた。測定方法は以下の通りである。
【０１０４】
（ａ）吸光度法
・本培養終了３０分前に２．４ ｍＭ ＤＣＦＨ−ＤＡ液を５μｌ添加する。
・本培養終了後、培地を取り除き、ＰＢＳ １ｍｌで２回洗浄（氷上で行う）
・Ｈａｎｋｓ’ｓｏｌｕｔｉｏｎを１５０μｌ添加してラバーポリスマンで細胞をかきとり、１５０μｌ細胞液を９６穴プレートに入れる（２穴）。タンパク定量用に残り全量を別に冷凍保存しておく。
・マルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ）にて、波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光度を測定した。
・冷凍保存しておいたサンプル細胞液を超音波｛４ｍｉｎ、（３０ｓインターバル）×３回｝にかけ細胞膜を破壊する。
・遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）。
・タンパク定量は吸光光度計（ＵＶ ｍｉｎｉ １２４０）で５９５ｎｍの吸光度を測定する。
【０１０５】
（ｂ）蛍光顕微鏡法
・本培養終了３０分前に２．４ｍＭ ＤＣＦＨ−ＤＡ液を５μｌ添加する。
・本培養終了後、培地を取り除き、ＰＢＳ １ｍｌで２回洗浄（氷上で行う）。
・シャーレの壁をペンチで取り外し、少量のＨ２Ｏを滴下し、カバーガラス（２４ｍｍ×２４ｍｍ）を上にかぶせる。
・蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＬＳＣ１０１）下で観察し写真撮影する。
【０１０６】
結果を以下に示す。まず、紫外線照射下におけるヒト正常皮膚由来線維芽細胞の生存率に及ぼすＧＧＴ阻害剤の影響を調べた結果を図６に示す。同図に示すように、紫外線を照射することによって皮膚線維芽細胞の生存率は約２０％低下した。また、ＧＧＴ阻害剤を添加すると、紫外線によって低下した生存率を回復させる傾向が認められた。
【０１０７】
次に、紫外線照射下におけるヒト正常皮膚由来線維芽細胞のＨ２Ｏ２産生量の上昇におよぼすＧＧＴ阻害剤の影響を調べた結果を図７，図８に示す。同図に示すように、ヒト正常皮膚由来線維芽細胞のＨ２Ｏ２産生量は紫外線を照射することによって、照射していない群よりも高い値を示した。一方ＧＧＴ阻害剤は、紫外線照射によって上昇したＨ２Ｏ２量を減少させた。
【０１０８】
〔処方例：美容液〕
以下に示す処方の美容液を常法により製造した。
（組成） （重量％）
ソルビット ４．０
グリセリン ３．０
ブチレングリコール ３．０
ポリエチレングリコール １５００ ５．０
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル ０．５
ショ糖脂肪酸エステル ０．２
メチルセルロース ０．２
ＧＧＴ阻害剤 ０．００５
精製水 全体で１００となる量
〔処方例：乳液〕
以下に示す処方の乳液を常法により製造した。
（処方） （重量％）
グリセリン １．５
ショ糖脂肪酸エステル １．５
モノステアリン酸ソルビタン １．０
スクワラン ７．５
ジプロピレングリコール ５．０
ＧＧＴ阻害剤 ０．００５
精製水 全体で１００となる量
〔処方例：クリーム〕
以下に示す処方のクリームを常法により製造した。
（処方） （重量％）
グリセリン ３．０
ブチレングリコール ３．０
スクワラン １９．０
ステアリン酸 ５．０
モノステアリン酸グリセリン ５．０
モノステアリン酸ソルビタン １２．０
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン ３８．０
エデト酸ナトリウム ０．０３
ＧＧＴ阻害剤 ０．００５
精製水 全体で１００となる量
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明によれば、ＧＧＴ阻害活性を発揮することによってコラーゲン産生量を向上させるコラーゲン産生促進剤が提供される。また、ＧＧＴ阻害剤は、紫外線によるダメージの軽減効果や角質水分量の増加作用も奏する。このため、本発明によれば、皮膚のしわ・たるみ等の老化防止・改善、紫外線による光老化の防止・改善、さらに皮膚の保湿機能の維持改善等に好適な皮膚用剤が提供されるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とすることを特徴とする、コラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
前記化合物は、脱離基を有するホスホン酸ジエステル誘導体を含む、請求項１記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
前記化合物は、一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が脱離基を表し、Ｒ１およびＲ２の少なくともいずれか一方が一般式（２）〜一般式（６）
【化２】
（式中、Ｒ３が置換基を有していてもよいアリール基、および置換基を有していてもよい複素環残基のいずれかであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８およびＲ９のそれぞれが、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、および電子吸引基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基であり、Ｒ４〜Ｒ８の置換基のうち隣接する２つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。）のいずれかを表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体を含む請求項１または２記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
前記化合物は、２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項５】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とすることを特徴とする、光老化防止剤。
【請求項６】
前記化合物は、脱離基を有するホスホン酸ジエステル誘導体を含む、請求項５記載の光老化防止剤。
【請求項７】
前記化合物は、一般式（１）
【化３】
（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が脱離基を表し、Ｒ１およびＲ２の少なくともいずれか一方が一般式（２）〜一般式（６）
【化４】
（式中、Ｒ３が置換基を有していてもよいアリール基、および置換基を有していてもよい複素環残基のいずれかであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８およびＲ９のそれぞれが、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、および電子吸引基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基であり、Ｒ４〜Ｒ８の置換基のうち隣接する２つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。）のいずれかを表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体を含む請求項５または６記載の光老化防止剤。
【請求項８】
前記化合物は、２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸を含む、請求項５〜７のいずれかに記載の光老化防止剤。
【請求項９】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とすることを特徴とする、保湿機能改善剤。
【請求項１０】
前記化合物は、脱離基を有するホスホン酸ジエステル誘導体を含む、請求項９記載の保湿機能改善剤。
【請求項１１】
前記化合物は、一般式（１）
【化５】
（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が脱離基を表し、Ｒ１およびＲ２の少なくともいずれか一方が一般式（２）〜一般式（６）
【化６】
（式中、Ｒ３が置換基を有していてもよいアリール基、および置換基を有していてもよい複素環残基のいずれかであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８およびＲ９のそれぞれが、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、および電子吸引基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基であり、Ｒ４〜Ｒ８の置換基のうち隣接する２つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。）のいずれかを表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体を含む請求項９または１０記載の保湿機能改善剤。
【請求項１２】
前記化合物は、２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸を含む、請求項９〜１１のいずれかに記載の保湿機能改善剤。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤、請求項５〜８のいずれかに記載の光老化防止剤、あるいは請求項９〜１２のいずれかに記載の保湿機能改善剤を含有する、皮膚用剤用組成物。
【請求項１４】
しわまたは肌弾力の改善用である、請求項１３に記載の皮膚用剤用組成物。
【請求項１】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とすることを特徴とする、コラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
前記化合物は、脱離基を有するホスホン酸ジエステル誘導体を含む、請求項１記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
前記化合物は、一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が脱離基を表し、Ｒ１およびＲ２の少なくともいずれか一方が一般式（２）〜一般式（６）
【化２】
（式中、Ｒ３が置換基を有していてもよいアリール基、および置換基を有していてもよい複素環残基のいずれかであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８およびＲ９のそれぞれが、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、および電子吸引基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基であり、Ｒ４〜Ｒ８の置換基のうち隣接する２つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。）のいずれかを表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体を含む請求項１または２記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
前記化合物は、２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項５】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とすることを特徴とする、光老化防止剤。
【請求項６】
前記化合物は、脱離基を有するホスホン酸ジエステル誘導体を含む、請求項５記載の光老化防止剤。
【請求項７】
前記化合物は、一般式（１）
【化３】
（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が脱離基を表し、Ｒ１およびＲ２の少なくともいずれか一方が一般式（２）〜一般式（６）
【化４】
（式中、Ｒ３が置換基を有していてもよいアリール基、および置換基を有していてもよい複素環残基のいずれかであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８およびＲ９のそれぞれが、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、および電子吸引基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基であり、Ｒ４〜Ｒ８の置換基のうち隣接する２つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。）のいずれかを表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体を含む請求項５または６記載の光老化防止剤。
【請求項８】
前記化合物は、２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸を含む、請求項５〜７のいずれかに記載の光老化防止剤。
【請求項９】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とすることを特徴とする、保湿機能改善剤。
【請求項１０】
前記化合物は、脱離基を有するホスホン酸ジエステル誘導体を含む、請求項９記載の保湿機能改善剤。
【請求項１１】
前記化合物は、一般式（１）
【化５】
（式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が脱離基を表し、Ｒ１およびＲ２の少なくともいずれか一方が一般式（２）〜一般式（６）
【化６】
（式中、Ｒ３が置換基を有していてもよいアリール基、および置換基を有していてもよい複素環残基のいずれかであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８およびＲ９のそれぞれが、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、および電子吸引基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基であり、Ｒ４〜Ｒ８の置換基のうち隣接する２つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。）のいずれかを表す。）で示されるホスホン酸ジエステル誘導体を含む請求項９または１０記載の保湿機能改善剤。
【請求項１２】
前記化合物は、２−アミノ−４−｛［３−（カルボキシメチル）フェニル］（メチル）ホスホノ｝ブタン酸を含む、請求項９〜１１のいずれかに記載の保湿機能改善剤。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤、請求項５〜８のいずれかに記載の光老化防止剤、あるいは請求項９〜１２のいずれかに記載の保湿機能改善剤を含有する、皮膚用剤用組成物。
【請求項１４】
しわまたは肌弾力の改善用である、請求項１３に記載の皮膚用剤用組成物。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図８】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２７０１１５（Ｐ２０１０−２７０１１５Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９９９５７（Ｐ２０１０−９９９５７）
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【出願人】（５０６１２２３２７）公立大学法人大阪市立大学 (122)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【出願人】（５０６１２２３２７）公立大学法人大阪市立大学 (122)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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