シャルコー・マリー・トゥース病および関連した障害を処置するためのピロカルピンおよびメチマゾールの組み合わせ
本発明は、シャルコー・マリー・トゥース病および関連した末梢神経障害の処置のための組成物および方法に関する。更に詳しくは、本発明は、被検体におけるムスカリンレセプターシグナリングおよび甲状腺ホルモン経路に同時に影響を与えることにより前記疾患を処置するための組み合わせた治療に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シャルコー・マリー・トゥース病および関連した障害の処置のための組成物および方法に関する。
【０００２】
シャルコー・マリー・トゥース病（「ＣＭＴ」）は、オーファン遺伝子末梢多発性神経障害である。約２，５００個体に１人が罹患するので、この疾患は、末梢神経系の最も普通の遺伝病である。その発症は、典型的には、人生の１０代または２０代の期間に起るが、幼児期に検出されることがある。疾患の進行は、漸進的な神経筋変性を伴って慢性的である。この疾患は、神経痛およびひどい筋肉障害を伴う症例を伴い無力化性(invalidating)である。ＣＭＴは、フランスでは約３０，０００症例を有する最もよく研究された病理である。大多数のＣＭＴ患者は、ミエリン遺伝子：ＰＭＰ２２を含有する染色体１７フラグメントの重複を有し（形態ＣＭＴ１Ａ）、２ダースの遺伝子が異なる形態のＣＭＴにおいて関係している。したがって、起源において単一遺伝子性であるけれども、この病理は、可能なモジュレータ遺伝子により臨床的異質性を示す。ＣＭＴ患者において突然変異した遺伝子は、シュワン細胞またはニューロンの分化に影響を与えるかまたは末梢神経におけるこれらの細胞の相互作用を変化させる密接に関連した分子経路のまわりにクラスタリングしている。
【０００３】
ＰＭＰ２２は、末梢神経系における本質的にすべての有髄繊維のコンパクトな部分に発現されたミエリンの主要な成分であり、そして主としてシュワン細胞により産生される。更に、ＰＭＰ２２遺伝子は、神経線維腫症、カフェオーレ班および皮膚の線維腫性腫瘍(fibromatous tumors)により特徴付けられる常染色体優性障害、を有する患者の新形成の発生に関与していると推測される。正常なＰＭＰ２２タンパク質のあまり多くない１．５倍の過剰発現が、ＣＭＴ患者における重複のためのヘテロ接合のシュワン細胞においても観察される（あるまれな症例では、ＣＭＴ１Ａ様発現型はＰＭＰ２２タンパク質における構造的突然変異にも関連しうる）(Lupski et al., 1992; Suter et al, 1992; Roa et al., 1993; Thomas et al., 1997; Suter ＆ Scherer, 2003; Nave ＆ Sereda, 2007)。異常なＰＭＰ２２遺伝子量(dosage)がＣＭＴ１Ａ様表現型を引き起こす直接の証拠は、ＰＭＰ２２タンパク質の過剰発現を有するげっ歯類モデルにおけるトランスジェニック実験により与えられた(Niemann et al., 1999; Perea et al., 2001; Robaglia-Schlupp et al., 2002; Meyer et al., 2006; Sereda ＆ Nave, 2006)。
【０００４】
更に、プロゲステロンレセプターの阻害剤およびアスコルビン酸による治療介入は、トランスジェニック動物におけるこの発現を減少させて、疾患表現型の進行を改善または遅くした(Sereda et al., 2003; Passage et al., 2004; Meyer zu Horste et al., 2007)。
【０００５】
Bussi et al., 1978は、神経障害および脳脊髄炎と関連した甲状腺中毒症の処置におけるメチマゾールの使用に関する。
【０００６】
CeltrixのWO00/20024は、甲状腺障害であるＩＧＦ依存性障害の症状を軽減するためのメチマゾールの使用に関する。
【０００７】
WO2004/019938は、神経障害痛の症候群の処置におけるピロカルピンの使用に関する。
【０００８】
筋緊張性乳頭異常の処置のためのピロカルピン単独の使用は、Keltner et al., 1975により示唆された。しかしながら、ＣＭＴの処置のためのピロカルピンの使用は記載されていない。更に、任意の他の化合物との組み合わせにおけるピロカルピンの使用も示唆されていない。
【０００９】
最後に、ＣＭＴ疾患を処置するための効果的なかつ改良された治療の必要がある。
【００１０】
発明の要約
本発明の目的は、ＣＭＴおよび関連した障害を処理するための新規な治療アプローチを提供することである。更に詳しくは、本発明者等は、ＣＭＴおよび関連した障害をもたらす経路に有効に影響を与える新規な組み合わせ治療を同定し、そしてこれらの障害の処置のための新規なアプローチを提示する。したがって、本発明は、ＣＭＴ病および関連した障害を処置するための新規な組み合わせ製品および組成物ならびにその使用を提供する。
【００１１】
本発明の目的は、更に特定的には、ＣＭＴまたは関連した障害を処置する（ための医薬の製造の）ための化合物の組み合わせの使用であって、該化合物の組み合わせが、ムスカリンレセプターアゴニストまたはそのプロドラッグおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤またはそのプロドラッグから選ばれる、化合物の組み合わせの使用に関する。
【００１２】
本発明の他の目的は、同時にまたは順次に被検体に一団にして投与するかまたは別々に投与するための、ムスカリンレセプターアゴニストまたはそのプロドラッグおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤またはそのプロドラッグを含む組み合わせ製品にある。
【００１３】
本発明は、ムスカリンレセプターアゴニストおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤またはそのプロドラッグおよび場合により薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む薬学的組成物にも関する。
【００１４】
最も好ましい態様においては、ムスカリンレセプターアゴニストは、ピロカルピン薬剤の有効作用物質である、（３Ｓ，４Ｒ）−３−エチル−４−［（３−メチルイミダゾール−４−イル）メチル］オキソラン−２−オン（ＣＡＳ９２−１３−７）又はそのプロドラッグである。
【００１５】
更に、最も好ましい態様においては、甲状腺ホルモン合成の阻害剤は、更にプロスタグランジンシグナリングにおける活性を示す。このような化合物の好ましい例は、１−メチル−３Ｈ−イミダゾール−２−チオン（ＣＡＳ６０−５６−０、メチマゾール薬剤の有効作用物質である）またはそのプロドラッグ、例えばカルビマゾールを含む。
【００１６】
他の態様においては、本発明は、被検体のＣＭＴの処置のためのムスカリンレセプターアゴニストおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤を含む組成物であって、該処置が、患者がＣＭＴ１Ａを有するかどうかを決定するための工程を更に含む、組成物に関する。
【００１７】
これに関して、本発明の特定の目的は、ピロカルピン、またはそのプロドラッグおよびメチマゾールまたはそのプロドラッグ、および場合により薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む組成物に関する。実施例に示されたとおり、このような組み合わせは、認知された動物モデルにおいてＣＭＴを有効に処置することを可能とする。
【００１８】
本発明の製品または組成物は、更に、好ましくは、ラパマイシン、バクロフェン、ソルビトール、ミフェプリストン、ナルトレキソン、フルルビプロフェンおよびケトプロフェンからなる群より選ばれる少なくとも１つの追加の有効化合物を更に含むことができる。 好ましい態様においては、本発明に従う組成物は、少なくとも、
−ピロカルピン、メチマゾールおよびミフェプリストン；
−ピロカルピン、メチマゾールおよびバクロフェン；または
−ピロカルピン、メチマゾールおよびソルビトール；
を含む。
【００１９】
他の好ましい態様においては、本発明に従う組成物は、少なくとも、
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、バクロフェンおよびソルビトール；または
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、バクロフェン、ソルビトールおよびナルトレキソン、
を含む。
【００２０】
他の態様においては、本発明は、メチマゾール、プロカルピンおよび２つの追加の有効化合物、好ましくはミフェプリストンおよびソルビトールを含む製品または組成物に関する。
【００２１】
他の態様においては、本発明は、メチマゾール、プロカルピンおよび３つの追加の有効化合物、好ましくは；
−ミフェプリストン、バクロフェンおよびソルビトール；または
−ミフェプリストン、ソルビトールおよびラパマイシン；または
−ミフェプリストン、ソルビトールおよびケトプロフェン；または
−ミフェプリストン、ソルビトールおよびフルルビプロフェン、を含む製品または組成に関する。
【００２２】
他の態様においては、本発明は、メチマゾール、プロカルピンおよび４つの追加の有効化合物、好ましくは；
−ミフェプリストン、ソルビトール、バクロフェンおよびナルトレキソン；
−ミフェプリストン、ソルビトール、バクロフェンおよびラパマイシン；
−ミフェプリストン、ソルビトール、ナルトレキソンおよびラパマイシン；
を含む製品または組成物に関する。
【００２３】
他の態様においては、本発明は、表１に開示された任意のドラッグ組み合わせを含む製品または組成物に関する。
【００２４】
他の特定の態様においては、本発明は、
−メチマゾール、バクロフェン；または
−メチマゾールおよびセビメリン、
を含む製品または組成物にも関する。
【００２５】
他の特定の態様においては、本発明は、
−メチマゾールおよびバクロフェン；または
−メチマゾールおよびセビメリン、
を含む製品または組成物に関する。
【００２６】
他の態様においては、本発明は、ピロカルピンおよびプロピルチオウラシルを含む製品または組成物にも関する。
【００２７】
本発明の他の目的は、ピロカルピンとメチマゾールの組み合わせの使用またはこれらの２つの化合物単独の使用または、ＣＭＴまたは関連した障害の処置（のための医薬の製造）のためのこれらの２つの化合物の効果を高める他の化合物との組み合わせにおけるこれらの２つの化合物の使用に関する。
【００２８】
本発明の他の目的は、本発明の他の目的は、毒性神経障害の処置（のための医薬の製造）のための、ピロカルピンとメチマゾールの組み合わせの使用またはこれらの２つの化合物単独の使用または、これらの２つの化合物の効果を高める他の化合物との組み合わせにおけるこれらの２つの化合物の使用に関する。
【００２９】
本発明の他の目的は、ＡＬＳ（筋委縮性側索硬化症）の処置（のための医薬の製造）のための、ピロカルピンとメチマゾールの組み合わせの使用またはこれらの２つの化合物単独の使用または、これらの２つの化合物の効果を高める他の化合物との組み合わせにおけるこれらの２つの化合物の使用に関する。
【００３０】
好ましくは、ＣＭＴの処置のためのピロカルピンおよびメチマゾールの効果を高める化合物は、ミフェプリストン、バクロフェン、ソルビトール、ナルトレキソン、ラパマイシン、フルルビプロフェンおよびケトプロフェンからなる群より選ばれる。
【００３１】
別の態様においては、ピロカルピンおよびメチマゾール混合物は、ＣＭＴまたは関連した障害の処置のために、１つの追加の有効化合物、好ましくはミフェプリストンまたはバクロフェンと組み合わせて使用される。
【００３２】
他の態様においては、ピロカルピンおよびメチマゾール混合物は、２つの追加の有効化合物、好ましくはミフェプリストンおよびソルビトールと組み合わせて使用される。
【００３３】
他の態様においては、ピロカルピンおよびメチマゾール混合物は、バクロフェン、ラパマイシン、ケトプロフェンまたはフルビプロフェンから選ばれる第３化合物との組み合わせた好ましくは、ミフェプリストンおよびソルビトールからなる、３つの追加の有効化合物と組み合わせて使用される。
【００３４】
他の態様においては、ピロカルピンおよびメチマゾール混合物は、４つの追加の有効化合物、好ましくは、ミフェプリストン、ソルビトール、バクロフェンおよびナルトレキソンもしくはラパマイシン；またはミフェプリストン、ソルビトール、ナルトレキソンおよびラパマイシンと組み合わせて使用される。
【００３５】
本発明は、更に、ＣＭＴまたは関連した障害、特にＣＭＴを処置することを必要とする被検体に、ムスカリンレセプターアゴニストまたはそのプロドラッグ、および甲状腺ホルモン合成の阻害剤またはそのプロドラッグの有効量の組み合わせを投与することを含む、ＣＭＴまたは関連した障害、特にＣＭＴを処置するための方法を提供する。
【００３６】
本発明は、更に、ピロカルピンまたはそのプロドラッグおよびメチマゾールまたはそのプロドラッグの有効量の組み合わせを被検体に投与することを含む、被検体におけるＣＭＴを処置する方法にも関する。
【００３７】
本発明は、ピロカルピンおよびメチマゾールと、優先的には、ラパマイシン、バクロフェン、ソルビトール、ミフェプリストン、ナルトレキソン、フルルビプロフェンおよびケトプロフェンからなる群より選ばれる少なくとも１つの追加の有効化合物との有効量の組み合わせを被検体に投与することを含む、被検体におけるＣＭＴを処置する方法にも関する。
【００３８】
別の態様においては、本発明は、
−ピロカルピン、メチマゾールおよび、少なくとも１つ追加の有効化合物であって、バクロフェン、ミフェプリストン、ソルビトールおよびナルトレキソンから選ばれる化合物；
−ピロカルピン、メチマゾールおよびバクロフェン；
−ピロカルピン、メチマゾールおよびミフェプリストン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトールおよびバクロフェン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトールおよびラパマイシン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトールおよびケトプロフェン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトールおよびフルルビプロフェン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトール、バクロフェンおよびナルトレキソン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトール、バクロフェンおよびラパマイシン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトール、ナルトレキソンおよびラパマイシン；
−メチマゾールおよびバクロフェン；
−メチマゾールおよびセビメリン；または
−ピロカルピンおよびプロピルチオウラシル、
の有効量の組み合わせを被検体に投与することを含む、被検体におけるＣＭＴを処置する方法にも関する。
【００３９】
本発明は、任意の哺乳動物被検体、特にヒト被検体におけるＣＭＴまたは関連した障害を処置するために使用されうる。本発明は、ＣＭＴ１ａを処置するのに特に適している。
【００４０】
この点で、本発明の特定の目的は、ピロカルピンまたはそのプロドラッグおよびメチマゾールまたそのプロドラッグの有効量の組み合わせを被検体に投与することを含む、被検体におけるＣＭＴ１ａを処置する方法である。
【００４１】
本発明の更なる目的は、ＣＭＴ１ａを処置する方法であって、（１）被検体がＣＭＴ１ａを有するかどうかを評価し、そして（２）ＣＭＴ１ａを有する被検体を、ピロカルピンまたはそのプロドラッグおよびメチマゾールまたそのプロドラッグの有効量の組み合わせにより処置する、ことを含む方法である。
【００４２】
被検体がＣＭＴ１Ａを有するかどうかを決定することは、当技術分野でそれ自体知られている種々の試験、例えばＤＮＡアッセイによりなされうる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】相対的レベルは、化合物ＡおよびＢで２４時間処理された初代ラットシュワン細胞におけるＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現の％として示される。左側には、１mMまたは１μMの化合物Ａ（メチマゾール）添加の２４時間後のＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現レベルの％が示される。ＰＭＰ２２ｍＲＮＡは、初代シュワン細胞において有意に減少すること、および化合物Ａのより低い用量は最も重要なＰＭＰ２２ダウンレギュレーションを誘導することが観察された。＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００１；コントロールとは有意に異なる（ペアーワイズスチューデントのｔ検定）。右側には、化合物Ｂ（ピロカルピン）に２４時間暴露されて、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現のレベルは、非常に低い用量で（１０nMおよび５０nM）ですら初代シュワン細胞において有意にダウンレギュレーションされる。同様に、本発明者等は、化合物Ｂ（１μM）が２４時間のインキュベーションの後にＰＭＰ２２タンパク質の発現レベルを有意に、初代シュワン細胞において３８％減少させることを観察した。この効果は、４８時間のインキュベーションの後依然として有意である（−１８％、ｐ＜０．００１）。
【図２】ＲＴ４−Ｄ６Ｐ２Ｔシュワン細胞腫細胞におけるＲＴ−Ｑ−ＰＣＲにより定量されたＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現レベルに対する選ばれた薬物の効果。＊＊＊：ｐ＜０．０００１；コントロール（薬物なし）とは有意に異なる。ΔΔＣｔ値に対する両側スチューデントのｔ検定。
【図３】傾向の形態で表わされた処理研究全体にわたりバー試験における雌ラットの運動評価の結果。ＷＴプラセボ：プラセボで処理された正常なラット；ＴＧプラセボ：プラセボで処理されたコントロールトランスジェニックラット；ＴＧｐｔｘ２５：ネガティブコントロール物質で処理されたトランスジェニックラット；ＴＧＡ：メチマゾール０．２mg／kgの１日用量で処理されたトランスジェニックラット；ＴＧＢ：ピロカルピン０．３５mg／kgの１日用量で処理されたトランスジェニックラット。
【図４】２０週の期間薬物で処理されたＣＭＴラットにおける感覚神経電位振幅の電気生理学的評価。ＴＧプラセボ：プラセボで処理されたコントロールトランスジェニックラット；ＴＧｐｔｘ２５：ネガティブコントロール物質で処理されたトランスジェニックラット；ＴＧＡ：メチマゾール０．２mg／kgの１日用量で処理されたトランスジェニックラット；ＴＧＢ：ピロカルピン０．３５mg／kgの１日用量で処理されたトランスジェニックラット。
【図５】図３の説明に記載の通りの薬物で処理された動物から得られた死後のサンプルの分析。２０週間薬物およびプラセボで処理されたラットを深く麻酔しそして全体の坐骨神経およびヒラメ筋を注意深くサンプリングしそして重量を計った。グラフは、これらの測定３０の平均値を提示する。
【図６】足どり評価試験（雌ラット）における混合物１のポジティブ効果；黒線はプラセボで処理されたコントロールラットを表わし；黒太線は、プラセボで処理されたトランスジェニックラットを表わし；点線は混合物１で処理されたトランスジェニックラットを表わす。ｐ＜０．０５；黒＊：ｗｔプラセボ対ｔｇプラセボ；グレー＊：ｔｇプラセボ対ｔｇ混合物１．統計学は、スチューデント両側検定で行い；平均は±ｓ．ｅ．ｍ．で表わされる。
【図７】尾の神経の興奮性閾値に対する混合物２のポジティブ効果（白いバーはプラセボで処置されたコントロール雄ラットを表わし；黒いバーはプラセボで処理されたトランスジェニック雄ラットを表わし；グレーのバーは混合物２で処理されたトランスジェニック雄ラットを表わす。統計学は、スチューデント両側検定で行い；平均は±ｓ．ｅ．ｍ．で表わされる。
【図８】バー試験における４週間の処理後の混合物２のポジティブ効果（白いバーはプラセボで処理されたコントロール雄ラットを表わし；黒いバーはプラセボで処理されたトランスジェニック雄ラットを表わし；グレーのバーは混合物２で処理されたトランスジェニック雄ラットを表わす）。統計学は、スチューデント両側検定で行い；平均は±ｓ．ｅ．ｍ．で表わされる。
【図９】３週間の処理の後の混合物２の足どりに対するポジティブ効果（白いバーは流れるような足どりで歩く各群における雄ラットの百分率を表わし；グレイのバーは流れるようではない足どりを表わし；黒いバーは無能力を表わす）。統計学は、スチューデント両側検定で行われる。
【図１０】慢性ＯＸＡＬＰＮモデルにおける抗アロディニア効果。青はコントロール動物のアセトン試験における反応時間を示し、赤はオキサリプラチン処理された動物を示し、緑色はオキサリプラチンおよび混合物２で処理された動物を示す。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＭＴまたは関連した障害を処置するための新規な治療アプローチを提供する。本発明は、既知の薬物の組み合わせから製造された新規な組成物およびこのような疾患の有効な矯正のためのそれらの新規な使用を開示し、そして任意の哺乳動物被検体において使用されうる。
【００４５】
本発明に関して、用語「ＣＭＴに関連した障害」は、遺伝的および後天性の両方の他の末梢神経障害を意味する。
【００４６】
ＣＭＴの主要な形態、ＣＭＴ１Ａは、ＰＭＰ２２遺伝子の重複により引き起こされる。ＰＭＰ２２は、末梢神経系における本質的にすべての有髄繊維の密な部分において発現されるミエリンの主要な成分である。ＰＭＰ２２タンパク質は、他の構造的ミエリンタンパク質Ｐ０と相互作用し、したがって、変化したＰＭＰ２２／Ｐ０タンパク質比は、ミエリン鞘の緻密化に影響を与えうる(Vallat et al., 1996; D'Urso et al., 1999)。ｉｎ−ｖｉｔｒｏ研究で証明されたとおり、ＰＭＰ２２タンパク質はＲｈｏ依存性方式で細胞伸展の調節にも関与しており、したがって軸索被覆に影響を与えることができる(Brancolini et al., 1999)。更に、ＰＭＰ２２はα６β４インテグリンと複合体を形成し、そして細胞外マトリックスとシュワン細胞の相互作用を媒介することができる(Amici et al., 2006; Amici et al., 2007)。更に、ＰＭＰ２２タンパク質の増加したレベルは、Ａｒｆ６で調節された形質膜エンドソーム回収経路を変えそして後期エンドソームにおけるＰＭＰ２２の蓄積をもたらすことができる(Chies et al., 2003)。過剰発現したＰＭＰ２２タンパク質は細胞内タンパク質ソーティングを乱しそしてシュワン細胞におけるタンパク質分解装置をオーバーロードすることも証明された(Notterpek et al., 1997; Tobler et al., 2002; Fortun et al., 2003; Fortun et al., 2006; Fortun et al., 2007; Khajavi et al., 2007)。最後に、ＰＭＰ２２は、細胞増殖およびプログラムされた細胞死のコントロールに直接関与しており(Sancho et al., 2001; Atanasoski et al., 2002) そして突然変異体ＰＭＰ２２タンパク質は、深部再構成(profound reorganization)および軸索イオンチャネルの異常な発現を促進することが示された(Ulzheimer et al., 2004; Devaux ＆ Scherer, 2005)。
【００４７】
結果として、用語「ＣＭＴに関連した障害」は、末梢障害、例えば、ＡＬＳ、毒性神経障害、特発性神経障害、糖尿病性神経障害、癌およびＨＩＶで誘導される神経障害、ギランバレー症候群を含む。
【００４８】
好ましい態様においては、ＣＭＴに関連した障害は、ＨＮＰＰ（圧迫性麻痺になりやすい性質を有する遺伝性神経障害）、ＣＭＴ１Ｂ、ＣＭＴ１Ｃ、ＣＭＴ１Ｄ、ＣＭＴ１Ｘ、ＣＭＴ２Ａ、ＣＭＴ２Ｂ、ＣＭＴ２Ｄ、ＣＭＴ２Ｅ、ＣＭＴ２−Ｐ０、重症脱髄神経障害ＤＳＳ（Dejerine-Sottas症候群）、ＣＨＮ（先天性ミエリン形成減少性神経障害）、ＣＭＴ４Ａ、ＣＭＴ４Ｂ１、ＣＭＴ４Ｂ２、ＣＭＴ４Ｄ、ＣＭＴ４Ｆ、ＣＭＴ４、ＡＲ−ＣＭＴ２Ａ、ＨＳＮ１を含む、脱髄神経障害などの神経障害を意味する。
【００４９】
本発明はＣＭＴ１Ａを処置するのに特に適している。
【００５０】
本明細書で使用された、障害の「処置」は、障害により引き起こされた痛みの治療、防止、予防、遅延または減少を含む。処置という用語は、特に疾患進行および関連した症状のコントロールを含む。
【００５１】
化合物という用語は、本願において特定的に名付けられた化合物、およびその任意の薬学的に許容されうる塩、水和物、エステル、エーテル、異性体、ラセミ体（racemates）、コンジュゲート、プロドラッグを意味する。
【００５２】
用語「組み合わせ」は、少なくとも２つの薬物が被検体に共投与されて生物学的効果を引き起こす処置を意味する。組み合わせた治療においては、少なくとも２つの薬物を一緒にまたは順次に一緒に又は別々に「投与することができる。少なくとも２つの薬物は、異なる経路およびプロトコールにより投与することができる。
【００５３】
本発明は、ＣＭＴまたはＣＭＴ関連障害は、薬物の特定の組み合わせにより処置されうる。更に詳しくは、本発明は、メチマゾールおよびピロカルピン化合物を、組み合わせにおいて使用してＣＭＴおよび関連した障害を処置することができることを示す。これに関して、実験結果は、メチマゾールとピロカルピンの組み合わせは、ラットシュワン細胞におけるＰＭＰ２２の遺伝子のＲＮＡ発現のレベルを有意に減少させることを示す。更に、ヒトＣＭＴ疾患をモデル化するＰＭＰ２２トランスジェニックラットは、毎日メチマゾールおよびピロカルピンを含有する組み合わせにより処置された。挙動終点の有意な改良が観察された。
【００５４】
ピロカルピン：（３Ｓ，４Ｒ）−３−エチル−４−[（３−メチルイミダゾール−４−イル）メチル]オキソラン−２−オン
この薬物、Ｃ１１Ｈ１６Ｎ２Ｏは、ｉ）頭および頸の癌のための放射線治療により引き起こされた唾液腺機能低下からの乾燥口腔の症状；およびｉｉ）シェーグレン症候群を有する患者の乾燥口腔の症状の処置のために認可された。
【００５５】
ムスカリンレセプターのアゴニスト、それは、平滑筋繊維収縮（消化管、眼、気管支）を引き起こし、汗、唾液、気管支および胃分泌を刺激する。更に、それは、両副交感神経様作用（血管拡張）神経節興奮経路を刺激する複雑な心臓血管作用を示す。
【００５６】
本発明者等は、ピロカルピン、ムスカリンレセプターのアゴニストは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏでシュワン細胞におけるＰＭＰ２２タンパク質の発現を減少させることを証明した。本発明者等は、ピロカルピンによるムスカリンレセプターの刺激は、おそらく、複雑なセットの分子機構により、反対の方式でミエリン関連タンパク質マーカーの発現を調節するＥｒｋ／Ａｋｔ活性の細胞内バランスにおいて、より顕著なＥｒｋシグナリングにシフトさせる、ということを提唱する(Ogata et al., 2004)。
【００５７】
理論により束縛されるものではないが、ムスカリンレセプターの刺激は、いくつかの随伴する機構によりＡｋｔおよびＥｒｋキナーゼの活性を改変することができるということが推定される(Ma et al., 2004; Anger et al., 2007)。例えば、ムスカリンレセプターは、ＰＫＣによるＩＲＳ−１の阻害性チロシン脱リン酸化または阻害性セリンリン酸化を促進することによりＩＧＦ−１によるシグナリングを選択的にブロックすることができるが、ＰＤＧＦレセプターについてはできない。さらにまた、ムスカリンレセプターは、Ｓｒｃ様Ｆｙｎキナーゼを介するＥＲＫジグナリグの細胞内トランスアクチベーションを媒介することができ；その上、アデニル酸シクラーゼの活性を減少させることにより、ムスカリンレセプターは、ＰＫＡ媒介される機能によっても、Ａｋｔ／Ｇｓｋ−３βおよびＥｒｋキナーゼの機能的調節に関与している可能性がある。最後に、ムスカリンレセプターの刺激は、ＡＭＰＫの活性化により、Ａｋｔの脱リン酸化を一過性に引き起こすことができ、かくしてβ−カテニンの細胞内プールを減少させることができることが証明された(Batty et al., 2004; King et al., 2006)。
【００５８】
結果として、他のムスカリンレセプターアゴニスト、例えば、セビメリン（ＣＡＳ番号１０７２３３−０８−９）、カルバコール（ＣＡＳ番号５１−８３−２）、メタコリン（ＣＡＳ番号５５−９２−５）およびベタンコール（ＣＡＳ番号６７４−３８−４）も使用することができる。
【００５９】
メチマゾール：１−メチル−３Ｈ−イミダゾール−２−チオン
メチマゾールは、ヨウ化物をヨウ素に転換しそして得られるヨウ化物分子のチロシンのフェノール環への取り込みを触媒する甲状腺ペルオキシダーゼの活性をブロッキングすることにより、新規な甲状腺ホルモンの産生を阻害する。したがって、メチマゾールは、甲状腺ホルモンレセプターの転写活性を効率的に減少させることができる。更に、メチマゾールは、プロスタグランジンＨシンターゼ活性を減衰させることによりプロスタグランジン産生を抑制することが報告されている(Zelman et al., 1984)。プロスタグランジンは、それらの同族ＧＰＣＲレセプターを介して、ミエリン関連タンパク質の発現を促進するＡｋｔシグナリング経路の活性を更に増加させることができる(Ogata et al., 2004; Castellone et al., 20069)。したがって、甲状腺ホルモン合成を阻害しそしてプロスタグランジン産生またはシグナリングに影響を与える化合物は、本発明で使用するのに特に有利である。
【００６０】
メチマゾールに作用様式により関連した他の化合物は、カルビマゾール（メチマゾールのプロドラッグ−ＣＡＳ番号２２２３２−５４−８）およびプロピルチオウラシル（ＣＡＳ番号５１−５２−５）およびアミオダロン（ＣＡＳ番号１９５１−２５−３）である。
【００６１】
実施例で開示されたとおり、化合物メチマゾールおよびピロカルピンは、ＣＭＴに対する改良された治療効果をもたらす組み合わさった作用を及ぼし、減少した副作用で有効治療用量を削減することを可能とする。
【００６２】
本発明の特定の態様は、ＣＭＴまたは関連した障害、特にＣＭＴ１Ａを処置するための組み合わせ治療であって、該組み合わせ治療がメチマゾールおよびピロカルピン化合物を含みそして少なくともこの組み合わせの活性を高めることができる第３の化合物を含む、組み合わせ治療にある。
【００６３】
本発明の他の特定の態様は、ＡＬＳを処置するための組み合わせ治療であって、該組み合わせ治療がメチマゾールおよびピロカルピン化合物を含みそして少なくともこの組み合わせの活性を高めることができる第３の化合物を含む、組み合わせ治療にある。
【００６４】
本発明の他の特定の態様は、毒性神経障害を処置するための組み合わせ治療であって、該組み合わせ治療がメチマゾールおよびピロカルピン化合物を含みそして少なくともこの組み合わせの活性を高めることができる第３の化合物を含む、組み合わせ治療にある。
【００６５】
本発明の他の特定の態様は、化合物メチマゾールおよびピロカルピンだけを使用する、ＣＭＴまたは関連した障害を処置するための治療にある。
【００６６】
本発明の他の特定の態様は、メチマゾールおよび／またはピロカルピンを少なくとも１つの追加の有効化合物と組み合わせて使用する、ＣＭＴまたは関連した障害を処置するための治療にある。好ましい態様においては、該少なくとも１つの追加の化合物は、表１に列挙された化合物の群から選ばれる。
【００６７】
本発明の他の特定の態様は、表１に開示された任意の薬物組み合わせを含む製品または組成物にある。
【００６８】
本発明の他の特定の態様は、表１に開示された任意の薬物組み合わせを含む、ＣＭＴまたは関連した障害を処置するための組み合わせ治療にある。
【００６９】
本発明の他の特定の態様は、表１に開示された任意の薬物組み合わせを含む、ＡＬＳを処置するための組み合わせ治療にある。
【００７０】
本発明の他の特定の態様は、表１に開示された任意の薬物組み合わせを含む、毒性神経障害を処置するための組み合わせ治療にある。
【００７１】
本発明に従う治療は、場合により任意の他の治療と共同して薬物組み合わせとして行われる。本発明に従う治療は、家庭で、個人病院で、診療所で、病院の外来患者部門でまたは病院で提供されることができ、その結果、医師は治療効果を綿密に観察することができそして必要とされる任意の調整をすることができる。
【００７２】
治療の期間は、疾患の段階、患者の年齢および状態、および患者が処置にいかに応答するかに依存する。
【００７３】
更に、追加の神経障害を発生するリスクのより高いヒト（例えば、遺伝的に例えば糖尿病にかかりやすいかまたは糖尿病を有するヒトまたは腫瘍学的処置下にあるヒト等）は、最終的神経障害応答を軽減または遅延させるための予防処置を受けることができる。
【００７４】
組み合わせの各成分の投薬量、投与の頻度および投与方式を独立にコントロールすることができる。例えば、１つの薬物は経口的に投与されうるが、第２の薬物は、筋肉内に投与することができる。組み合わせ治療は、休止期間を含むオンアンドオフ（on-and-off）サイクルで与えられることができ、その結果、患者の身体は、まだ予測されない副作用などのいずれかからの回復ヘのチャンスを有する。薬物は、１つの投与が両薬物を送達するように一緒に製剤化することもできる。
【００７５】
医薬組成物の製剤化
組み合わせの各薬物の投与は、他の成分と組み合わせて、末梢神経に到達するとＰＭＰ２２の高められた発現の効果を矯正することができる薬物の濃度をもたらす任意の適当な手段によることができる。
【００７６】
組み合わせの有効成分が純粋な化学品として投与されることが可能であるが、この状況では製剤とも呼ばれる薬学的組成物としてそれらを提供することが好ましい。可能な組成物は、経口、直腸、局所（経皮、頬および舌下を含む）または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与に適当な組成物を含む。
【００７７】
より普通には、これらの医薬製剤は、数投与単位を含有する「患者パック」または、単一パッケージ、通常ブリスターパツクにおいて明確な処置期間の間使用するための通常計量された単位用量の投与のための他の手段において患者に処方される。患者パックは、患者が通常の処方に欠けている患者パックに含有されたパッケージインサートに常にアクセスできるという点で、薬剤師はバルク供給からの薬剤の患者の供給を分割するという、従来の処方に対する利点を有する。パッケージインサートの包含は、医師の指示に対する患者の応諾を改良することが示された。したがって、本発明は、更に、医薬製剤のために適当な包装材料と組み合わせた、本明細書で前記した、医薬製剤を含む。このような患者パックにおいては、組み合わせ処理のための製剤の意図する使用は、処理のために最も適当に製剤を使用するのを助けるためのインストラクション、施設、設備、条件適応および／または他の手段により推論される。このような手段は、患者パックを、本発明の組み合わせによる処置のために使用するのに特に適当ならしめそして適合させる。
【００７８】
薬物は、任意の適当な担体物質中に任意の適切な量で含有され得、そして組成物の全重量の１〜９９重量％の量で存在することができる。組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、筋肉内）、直腸、皮膚、鼻、膣、吸入剤、皮膚（パッチ）または眼投与経路用に適当な剤形で提供されうる。したがって、組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、ヒドロゲルを含むゲル剤、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、硬膏剤、水薬剤(drenches)、浸透送達装置、坐剤、浣腸剤、注射可能剤、移植片、噴霧剤またはエアゾル剤の形態にあることができる。
【００７９】
薬学的組成物は、慣用の製薬学的実施によって製剤化されうる(例えば、Remington: The Science and Practice of pharmacy(20th ed), ed. A.R.Gennaro, Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J.C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York)。
【００８０】
本発明にしたがう薬学的組成物は、投与すると実質的に直ちに有効薬物を放出するかまたは投与後の任意の所定の時間にまたは所定の時間の期間放出するように製剤化されうる。
【００８１】
コントロールされた放出製剤は、（ｉ）延長された時間の期間にわたって身体内に薬物の実質的に一定の濃度を作り出す製剤；（ｉｉ）所定の遅延時間の後に延長された時間の期間にわたって身体内に薬物の実質的に一定の濃度を作り出す製剤；（ｉｉｉ）有効薬物物質の血漿レベルのばらつきと関連した望ましくない副作用の最小化を伴って、身体における相対的に一定の有効薬物レベルを維持することにより、所定の時間の期間薬物作用を持続させる製剤；（ｉｖ）例えば、コントロールされた放出組成物を、疾患のある組織もしくは器官に隣接して空間的に配置するかまたは疾患のある組織もしくは器官に空間的に配置することにより薬物作用を局所化する製剤；および（ｖ）薬物を特定のターゲット細胞型に送達するように担体または化学的誘導体を使用することにより薬物作用をターゲティングする製剤を含む。
【００８２】
コントロールされた放出製剤の形態にある薬物の投与は、薬物が、単独でまたは組み合わせにおいて、（ｉ）狭い治療指数（即ち、有害な副作用または毒性反応をもたらす血漿濃度と治療効果をもたらす血漿濃度との差が小さい；一般に治療指数ＴＩは、５０％平均致死量（ＬＤ５０）対５０％平均有効量（ＥＤ５０）の比として定義される）；（ｉｉ）胃腸管における狭い収吸ウインドー；または（ｉｉｉ）血漿レベルを治療レベルに維持するために１日に頻繁に投与することが必要なような非常に短い生物学的半減期、を有する場合に特に好ましい。
【００８３】
放出の速度が問題の薬物の代謝の速度より勝っているコントロールされた放出を得るために、多数のストラテジーのいずれかを遂行することができる。コントロールされた放出は、例えば種々のタイプのコントロールされた放出組成物およびコーティングを含む、種々の製剤パラメーターおよび成分の適切な選択により得られうる。かくして、薬物は、適切な賦形剤により、投与されるとコントロールされた方式で薬物を放出する薬学的組成物（一単位または多数単位錠剤またはカプセル組成物、油溶液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル剤、マイクロスフェア剤、ナノ粒子、パッチ剤およびリポソーム剤）に製剤化されうる。
【００８４】
経口用途のための固体剤形
経口用途用の製剤は、無毒性の薬学的に許容されうる賦形剤との混合物において有効成分（１つまたは複数）を含有する錠剤を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、スクロース、微結晶セルロース、バレイショデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム）；顆粒化剤および崩壊剤（例えば、微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、バレイショデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギネートまたはアルギン酸）；結合剤（例えば、アラビアゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール）；および滑剤、スベリ剤(glidants)および接着防止剤（例えば、ステアリン酸、シリカまたはタルク）であることができる。他の薬学的に許容されうる賦形剤は、着色剤、矯味・矯臭剤、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤等であることができる。
【００８５】
錠剤は、コーティングされていなくてもよく、または錠剤は、場合により胃腸管における崩壊および収吸を遅延させ、それにより、より長い期間にわたり持続した作用を与えるために既知の技術によりコーティングされていてもよい。コーティングは、所定のパターンにおいて（例えば、コントロールされた放出製剤を達成するために）有効薬物物質を放出させるのに適合することができ、またはコーティングは、胃を通過した後まで有効薬物物質を放出しないように適合させることができる（腸溶コーティング）。コーティングは、糖衣、フイルムコーティング（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコールおよび／またはポリビニルピロリドンに基づく）または腸溶コーティング（例えば、メタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、ポリビニルアセテートフタレート、シェラックおよび／またはエチルセルロースに基づく）であることができる。時間遅延物質、例えばグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを使用することができる。
【００８６】
固体錠剤組成物は、望まれない化学変化（例えば、有効薬物物質の放出前の化学的分解）から組成物を保護するのに適合したコーティングを含むことができる。コーティングは、Encyclopedia of Pharmaceutical Technologyに記載の方法と同様な方法で固体剤形上に適用されうる。
【００８７】
２つの薬物は、錠剤において一緒に混合され得、または分配されうる。例えば、第１薬物は錠剤の内側に含有されそして第２薬物は外側にあり、それにより第２薬物の実質的部分は第１薬物の放出前に放出される。
【００８８】
経口用途用の製剤は、そしゃく錠としてまたは有効成分が不活性固体希釈剤（例えばバレイショデンプン、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合されている硬ゼラチンカプセル剤、または有効成分が水または油媒体、例えば液体パラフィンまたはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセル剤として提示されることもできる。散剤および顆粒剤は、慣用の方法で錠剤およびカプセル剤下の上記した成分を使用して調製されうる。
【００８９】
経口用のコントロールされた放出組成物は、例えば有効薬物物質の溶解および／または拡散をコントロールすることにより有効薬物を放出するように構成されうる。
溶解または拡散コントロールされた放出は、薬物の錠剤、カプセル剤、ペレット剤または顆粒製剤の適切なコーティングによりまたは薬物を適切なマトリックス中に配合することにより達成されうる。コントロールされた放出コーティングは、上記した１種以上のコーティング物質および／または例えばシェラック、ミツロウ、グリコワックス、キャスターワックス、カルナウバロウ、ステアリルアルコール、グリセリルモノステアレート、グリセリルジステアレート、グリセロールパルミトステアレート、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、セルロースアセテートブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３−ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、および／またはポリエチレングリコールを含むことができる。コントロールされた放出マトリックス製剤においては、マトリックス材料は、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバロウおよびステアリルアルコール、カルボポール９３４、シリコーン、グリセリルトリステアレート、メチルアクリレート−メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンおよび／またはハロゲン化フルオロカーボンを含むこともできる。
【００９０】
特許請求の範囲に請求された組み合わせの薬物の１種以上を含有するコントロールされた放出組成物は、浮遊錠剤またはカプセル剤（即ち、経口投与されると、ある長さの時間胃内容物の頂部に浮遊する錠剤またはカプセル剤）の形態にあることもできる。薬物（１つまたは複数）の浮遊錠剤製剤は、薬物（１つまたは複数）と賦形剤および２０〜７０％ｗ／ｗの親水コロイド、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースの混合物を顆粒化することにより調製されうる。次いで得られた顆粒剤を錠剤に圧縮成形することができる。胃液と接触すると、錠剤は、その表面近くに実質的に水不透過性ゲルバリアーを形成する。このゲルバリアーは、１より低い密度を維持するのを助けて、それにより錠剤が胃液中に浮遊したままであることを可能とする。
【００９１】
経口投与用の液剤
水の添加により水性懸濁剤の調製に適当な散剤、分散可能な散剤または顆粒剤は、経口投与用の便利な剤形である。懸濁剤としての製剤は、分散化剤もしくは湿潤剤、懸濁化剤および１種以上の保存剤との混合物中の有効成分を与える。適当な懸濁化剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等である。
【００９２】
非経口組成物
薬学的組成物は、慣用の無毒性の薬学的に許容されうる担体および佐剤を含有する剤形、製剤においてまたは適当な送達装置または移植片により注射、注入または移植（静脈内、筋肉内、皮下等）により非経口的に投与することもできる。このような組成物の製剤化および調製は、薬剤の分野の当業者には周知である。
【００９３】
非経口的用途用の組成物は、単位剤形において（例えば、一回投与アンプルにおいて）または数用量を含有しそして適当な保存剤を加えることができる（下記参照）バイアルにおいて提供されうる。組成物は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、注入装置、または移植用の送達装置の形態にあることができるか、またはそれは、使用前に適当な水または他の適当なビヒクルにより再構成されるべき乾燥散剤として提供されうる。有効薬物（１つまたは複数）とは別に、組成物は、適当な非経口的に許容されうる担体および／または賦形剤を含むことができる。有効薬物（１つまたは複数）は、コントロールされた放出のためにミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム等の中に含ませることができる。組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定剤、ｐＨ調節剤および／または分散化剤を含むことができる。
【００９４】
本発明に従う薬学的組成物は、無菌注射に適当な形態にあることができる。このような組成物を調製するために、適当な有効薬物（１つまたは複数）を、非経口的に許容されうる液体ビヒクル中に溶解または懸濁させる。なかでも、使用することができる許容されうるビヒクルは、水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウムもしくは適当な緩衝剤により適当なｐＨに調節された水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。水性製剤は、１種以上の保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチルまたはプロピル）を含有することもできる。薬物の１つが水に僅かにしか溶解しない場合には、溶解増強剤または可溶化剤を加えることができ、または溶媒は１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコール等を含むことができる。
【００９５】
コントロールされた放出非経口組成物は、水性懸濁剤、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁性ミクロスフェア、油溶液剤、油懸濁剤または乳剤の形態にあることができる。あるいは、有効薬物（１つまたは複数）は、生物適合性単体、リポソーム、ナノ粒子、移植片または注入装置中に含ませることができる。ミクロスフェアおよび／またはマイクロカプセルの調製に使用するための物質は、例えば、生物分解性／生物浸食性ポリマー、例えばポリガラクチン、ポリ−（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）である。コントロールされた放出非経口製剤を製造するときに使用することができ生物適合性担体は、炭水化物（例えばデキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン）、リポタンパク質または抗体である。移植片に使用するための物質は、非生物分解性（例えばポリジメチルシロキサン）または生物分解性（例えば（ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸）またはポリ（オルトエステル）であることができる。
【００９６】
直腸組成物
直腸用途のために、組成物用の適当な剤形は、坐剤（乳剤または懸濁剤型）および直腸ゼラチンカプセル（溶液剤または懸濁剤）を含む。典型的な坐剤製剤においては、有効薬物（１つまたは複数）は、適切な薬学的に許容されうる坐剤基材、例えば、カカオ脂、エステル化脂肪酸、グリセリン化ゼラチン、およびポリエチレングリコールのような種々の水溶性または水分散性基剤と組み合わされる。種々の添加剤、エンハンサーまたは界面活性剤を配合することができる。
【００９７】
経皮および局所組成物
薬学的組成物は、ミクロスフェアおよびリポソームを含む普通に無毒の薬学的に許容されうる担体および賦形剤を含有する剤形または製剤において経皮収吸のために皮膚に局所的に投与することもできる。製剤は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、リニメント剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、溶液剤、懸濁剤、スティック剤、噴霧剤、ペースト剤、硬膏剤、および他の種類の経皮薬物送達システムを含む。薬学的に許容されうる担体または賦形剤は、乳化剤、酸化防止剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、浸透増強剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、香料および皮膚保護剤を含むことができる。
【００９８】
乳化剤は、天然に存在するゴム（例えば、アラビアゴムまたはトラガントゴム）であることができる。
保存剤、湿潤剤、浸透増強剤は、パラベン、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルおよび塩化ベンザルコニウム、グリセリン、プロピレングリコール、尿素等であることができる。
【００９９】
皮膚に対する局所投与用の上記した薬学的組成物は、処置されるべき身体の部分へのまたは該部分の近くへの局所的投与と一緒に使用されることもできる。組成物は、直接の適用に適合させることができ、または特定の薬物送達装置、例えば包帯剤、または替わるものとして硬膏剤、パッド剤、スポンジ剤、ストリップ剤または他の形態の適当な柔軟な材料による適用に適合させることができる。
【０１００】
投薬量および処置の期間
組み合わせの薬物は、同じまたは異なる製剤において同時に投与されうるかまたは順次に投与されうることが認識されるであろう。好ましい態様において、薬物は、同じ賦形剤または担体中に一緒に製剤化されうる。順次に投与される場合に、第２（または追加の）有効成分の投与における遅延は、有効成分の組み合わせの有効な効果の利点を失うようなものであるべきではない。この説明にしたがう組み合わせのための最小要件は、組み合わせが、有効成分の組み合わせの有効な効果の利点を伴う組み合わせた使用を意図するべきであるということである。組み合わせの意図した使用は、本発明に従う組み合わせを使用するのを助けるための施設、設備、適応物および／または他の手段により推測されうる。
【０１０１】
本発明の主題である治療的に有効量の２種以上の薬物は、ＰＭＰ２２遺伝子の増加した発現の効果を減少させるため、ＣＭＴ１Ａ疾患を発生するリスクを防止または減少させるため、一旦ＣＭＴ１Ａ疾患臨床的に明らかになってもＣＭＴ１Ａ疾患の進行を止めるかまたは遅くするため、および神経障害事象が最初にまたはその後に起こるリスクを防止または減少させるために有用な医薬の調製のために一緒に使用されうる。
【０１０２】
本発明の有効薬物は、例えば１日に２回または３回分割された用量で投与されうるけれども、組み合わせにおける各薬物の単一日用量が好ましく、単一薬学的組成物単位剤形）おけるすべての薬物の単一日用量が最も好ましい。
【０１０３】
投与は、数日から数年間毎日１〜数回であることができ、そして患者の一生の間であることさえできる。慢性的にまたは少なくとも周期的に反復する長期投与が大抵の症例で指示されるであろう。
・用語「単位剤形」は、ヒト被検体のための単位投薬量(unitary dosage)として適当な物理的に分離した単位（例えばカプセル剤、錠剤またはローディングされた注射器シリンダー）を指し、各単位は、必要な薬学的担体とともに、所望の治療効果を生じるように計算された必要な所定の量の有効物質（１つまたは複数）を含有する。
【０１０４】
単位投薬量のための好ましい組み合わせにおける各薬物の量は、処置されるべきヒトの一般的健康状態を考慮して、投与方法、患者の体重および年齢、ＣＭＴ１Ａ疾患により引き起こされた神経障害損傷の重症さまたは潜在的副作用のリスクを含むいくつかのファクターに依存する。
【０１０５】
更に、特定の患者に関するゲノム薬理学（薬物動態学、薬力学または治療の効能プロフィル）情報が使用される投薬量に影響を与えることができる。
【０１０６】
より高い投薬量が必要でありうる特に障害性のＣＭＴ疾患症例に応答するとき、またはより低い投薬量が選ばれるべき子供を処置するときを除いて、組み合わせにおける各薬物の好ましい投薬量は、通常、長期維持処置のために通常処方されたまたは多数の相３臨床的研究において安全であることが証明された範囲を超えない用量の範囲内にある。
例えば、
・メチマゾールでは、経口的に摂取されるならば１日当たり約０．５〜約１５mg。
局所的に投与されるならば、特定の用量が選ばれるべきである。
・ピロカルピンでは、経口的に摂取されるならば１日当たり約０．１〜約２０mg。
最も好ましい投薬量は、長期維持処理のために通常処方された量の１％〜１０％の量に相当する。
【０１０７】
実際に投与される薬物の量は、処置されるべき状態（１つまたは複数）、投与されるべき正確な組成、個々の患者の年齢、体重および応答、患者症状の重症度および選ばれた投与経路を含む関連した状況(relevant circumstances)に照らして、医師により決定される。したがって、上記投薬量範囲は、本明細書における教示のための一般的手引きおよび支持を与えることを意図するが、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１０８】
治療スキーム、投薬量および投与経路
以下に、ヒトにおける薬物組み合わせの投薬量（投与経路において異なる）を説明する。
【０１０９】
メチマゾールおよびピロカルピン
１−単一薬学的組成物として経口投与される：数ヶ月間経口的に毎日メチマゾール約０．５〜約１５mgおよびピロカルピン約０．１〜約２０mg、組成物中の両薬物の最も好ましい投薬量は０．６〜３５mg／単位（１日当たり）の範囲にある。
２−数ヶ月間経口的に同時に投与される：数ヶ月間経口的に毎日メチマゾール約０．１〜約１５mgおよびピロカルピン約０．０２〜約２０mg、組成物中の両薬物の最も好ましい投薬量は１．０２〜３５mg／単位（１日当たり）の範囲にある。
３−数ヶ月間に同時に投与される：数ヶ月間経口的に毎日メチマゾール約０．０５〜約１５mgおよびピロカルピン約０．０１〜約２０mg、組成物中の両薬物の最も好ましい投薬量は０．０６〜３５mg／単位（１日当たり）の範囲にある。
【０１１０】
本発明で開示された投薬量の中の任意の組み合わせにおけるこの薬物の投薬量は、男性または女性の処置のために提唱される製剤において異なることができる。
【０１１１】
本発明の追加の局面および利点は、説明のためのみであると考えられるべき下記の実験の節に開示される。
【０１１２】
実施例１
Ｉ．ｉｎ−ｖｉｔｒｏ実験
市販されているラット初代シュワン細胞
ラットシュワン細胞（ＳＣ）初代培養物(Sciencell # R1700)のバイアルを解凍しそしてポリ−Ｌ−リシンでプレコートされた７５cm2フラスコ中で「Sciencellシュワン細胞培地」（Sciencell # R1701からの基本培地）中に１００００細胞／cm2の密度で播種した。培養培地は、シュワン細胞の増殖を促進するための、基本培地、５％ウシ胎仔血清(3H-Biomedical AB # 1701-0025)、１％シュワン細胞増殖サプリメント（3H Biochemical AB # 1701-1752)、１％ゲンタマイシン（Sigma # G1397）および１０μMのフォースコリン(Forskolin(Sigma # F6886))からなる。
【０１１３】
コンフルーエンシー（confluency）に達した後（細胞バッチに依存して４〜１０日）シュワン細胞を、穏やかな攪拌または接着性繊維芽細胞からのＳC単離を可能とするｔｈｙ１．１イムノパニング(thy1.1 immunopanning)により精製して、少なくとも９５％純度の培養物を産生する。次いでＳＣを計数し（トリパンブルー法）そして同じＳＣ培地中にポリ−Ｌ−リシンでプレコートされた７５cm2フラスコ中に播種する。コンフルーエンシーにおいて、細胞をすすぎ、トリプシン処理し(Invitrogen# 15400654から希釈されたトリプシン−ＥＤＴＡ1x)、カルシウムおよびマグネシウムなしにＰＢＳ中に希釈された）、計数しそして、ＦＢＳ５％、細胞増殖サプリメント（ＣＧＳ）１％、４０μg／mlゲンタマイシンおよび４μMフォースコリンを有するＳｃｉｅｎｃｅｌｌシュワン細胞培地中で１２ウエルディッシュ（１４００００細胞／ウエル）においてプレート培養した。
【０１１４】
注文品ラット初代シュワン細胞
初代シュワン細胞培養物（ＳＣ）は、スプレーグ−ドーリー新生ラット（Ｐ０とＰ２間）坐骨神経から確立される。すべての新生ラットを犠牲にそしてペトリ皿に単離する。解剖を無菌条件下に行う。
【０１１５】
背側皮膚を後脚および下部胴から除去する。坐骨神経を単離しそして、1％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液(それぞれ、５０UI／mlおよび５０μg／ml、Invitrogen # 15070)およびウシ血清アルブミン(BSA, Sigma A6003)を補充された氷冷Leibovitz(L15,Invitrogen #11145)を入れた培養ディッシュに移す。ラットにつき両神経を氷冷Ｌ１５を入れた１５mlチューブに移す。次いでＬ１５培地を除去しそして１０mg／mlのコラゲナーゼ（Sigma #A6003）を有するＤＭＥＭ（Invitrogen # 21969035）２．４mlにより置き換える。神経を３７℃で３０分間この培地中でインキュベーションする。次いで培地を除去しそして両神経を、カルシウムおよびマグネシウムなしのＰＢＳ(Invitrogen# 2007-03)中に希釈されたトリプシン(１０％トリプシンＥＤＴＡ１０ｘ，Invitrogen # 15400054)により３７℃で２０分間はく離させる。反応を、ＤＮアーゼＩグレードＩＩ（０．１mg／ml Roche diagnostic # 104159）およびウシ胎仔血清（ＦＣＳ１０％、Invitrogen # 10270)を含有するＤＭＥＭの添加により停止させる。細胞懸濁液を１０mlピペットでトリチュレート（triturate）しそして５０mlチューブ中のフィルターを通過させた（２０μmナイロンメッシユフィルター、Fishersを有するSwinnex 13mm フィルターユニット、Milipore)。細胞懸濁液を室温（ＲＴ）で１０分間３５０gで遠心しそしてペレットを、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ中に懸濁させる。細胞を計数し（トリパンブルー法）そして５．１０５〜１０６細胞／ディッシュの密度でFalcon 100mm Primaria組織培養プレートに播種する。
【０１１６】
１日の培養の後、培地をＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０μMのシトシンｂ−Ｄ−アラビノフラノシド（Sigma # C1768）と取り換える。４８時間後、培地を除去しそして細胞をＤＭＥＭで３回洗浄する。次いで、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２μMのフォースコリン（Sigma # F6886）および１０μg／mlのウシ下垂体抽出物(PEX,Invitrogen # 13028)からなるＳＣ増殖培地を加える。この培地を２〜３日毎に取り換える。
【０１１７】
８日の培養後に（細胞バッチに依存して４〜１０日）、シュワン細胞はコンフルエンシーに達しそして大量の汚染性繊維芽細胞を含有する培養物をｔｈｙ１．１イムノパニング法により精製する。この精製の後、細胞を、ポリ−Ｌ−リシンでプレコートされた７５cm2フラスコ中で１００００細胞／m2で増殖培地中に懸濁させる。それらがコンフルーエンシーに達すると、細胞をすすぎ、トリプシン処理し（トリプシン−ＥＤＴＡ）、計数しそして１２ウエルディッシュ中でプレート培養する（１０００００細胞／ウエル）。
【０１１８】
薬物インキュベーション
細胞が１２ウエルディッシュ中でプレート培養されて後、培地を、１％のＮ２サプリメント（Invitrogen # 17502）、１％Ｌ−グルタミン（Invitrogen # 25030024)、２．５％ＦＢＳ（Sciencell # 0025）、０．０２mg／mlのコルチコステロン(Sigma # C2505)、４μMフォースコリンおよび５０μg／mlのゲンタマイシンを補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２（Invitrogen # 21331020）の混合物からなる規定された培地により取り換える。ＳＣ分化を促進するために、増殖因子はこの培地には加えられない。
【０１１９】
２４時間後、培地を、１％インスリン−トランスフェリン−セレン−Ｘ（ITS, Invitrogen # 51300）、１６μg／mlのプトレシン(Sigma # P5780)、０．０２μg／mlのコルチコステロンおよび５０μg／mlのゲンタマイシンを補充された規定された培地により取り換える。この工程で、プロゲステロンもフォースコリンも培地中に存在しない。
【０１２０】
１日後、初代シュワン細胞を２４時間薬物により刺激する(３ウエル／条件)。各化合物の調製は、細胞培養培地に添加するすぐ前に行われる。
【０１２１】
ピロカルピン（SIGMA）を、１０μM〜１０nM濃度範囲で初代シュワン細胞において試験し、メチマゾール（SIGMA）は１０μM、１μM、１００nMおよび１０nMで試験した。
【０１２２】
薬物を、１％インスリン−トランスフェリン−セレン−Ｘ（ITS, Invitrogen # 51300）、１６μg／mlのプトレシン、０．０２μg／mlのコルチコステロン、１０nMプロゲステロンおよび５０μg／mlのゲンタマイシンを有するＤＭＥＭ−Ｆ１２からなる規定された培地に加える。薬物刺激前および刺激期間中のフォースコリンの不存在は、アデニル酸シクラーゼ飽和を回避する。
【０１２３】
培養された神経鞘腫細胞
ラット神経鞘腫ＲＴ４−Ｄ６−Ｐ２Ｔ細胞系（ATCC # CRL-2468（商標））を、ＤＭＥＭ(ATCC # 30-2002)および１０％ＦＣＳ（invitrogen # 10106）中で解凍する。細胞を空気（９５％）−ＣＯ２（５％）の雰囲気中で加湿されたインキュベータ中で３７℃に維持する。継体数４において、細胞を３７℃で５〜１５分間トリプシン処理（＋１mlのトリプシン−ＥＤＴＡ、０．２５％−０．５３mM；Invitrogen）によりはく離させる。反応をウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％を含有するＤＭＥＭの添加により停止させる。トリパンブルー排除試験（Sigma）を使用するNeubauer 血球計算機においてウエルを計数する。懸濁液を１０mlピペットでトリチュレートし、次いで細胞を室温で１０分間３５０xgで遠心する。はく離した細胞のペレットを再懸濁させそして１２ウエルプレートに３００００細胞／mlの基準で播種し、４８時間後、培地を血清なしの培地（ＤＭＥＭ）により取り換える。１５時間後、ＲＴ４−Ｄ６Ｐ２Ｔウエルを、選ばれた濃度で細胞培養培地に加えられた薬物により刺激する。各個々の薬物（１つまたは複数）組み合わせの調製は、細胞培養培地へのその添加のすぐ前に行われる。
【０１２４】
定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）
定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、薬物刺激後のＰＭＰ２２ｍＲＮＡのレベルを、ＲＴ４−Ｄ６Ｐ２Ｔ細胞系におけるハウスキーピングＲＰＳ９ｍＲＮＡと相対的に比較する。
【０１２５】
薬物インキュベーションの８時間後、細胞を低温無菌化ＰＢＳですすぎ、各細胞サンプルからのトータルＲＮＡｓを、Qiagen RNeasyマイクロキット（Qiagen # 74004）を使用してＳＣから抽出しそして精製する。核酸を、１μlのＲＮＡサンプルを使用してナノドロップ分光光度計により定量する。ＲＮＡの品位は、BioAnalyzer(Agilent)装置により決定する。
【０１２６】
ＲＮＡｓを標準プロトコールにしたがいｃＤＮＡに逆転写する。ＰＣＲ増幅のためのｃＤＮＡテンプレートは、２０μlの最終容積において、オリゴ（ｄＴ）の存在下に４２℃で６０分間SuperScript II逆転写酵素(Invitrogen # 18064-014)を使用して１００ngのトータルＲＮＡから合成する。
【０１２７】
ｃＤＮＡを、<<Light Cycler（登録商標）480>>システム(Roche Molecular Systems Inc.)を使用してＰＣＲ増幅に付す。各ｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅のために使用する前に５倍希釈する。このｃＤＮＡ２μlは、１０μlの最終容積において５μlのMasterミックスキット(Roche # 04-887301001)と共にＰＣＲ反応溶液に入れる。予備実験は、両シーケンスについて増幅プロセスの対数期において定量がなされることおよび反応効率がターゲットとハウスキーピング遺伝子間で同様であることを確実にする。
【０１２８】
Ｔａｑｍａｎケミストリーを使用して、ＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ分析を行った。Sigma-Aldrichからの５００nMの各プライマー（ＦおよびＲ）および２００nMのプローブＴａｑ１を使用することによりラットＰＭＰ２２（ＮＭ＿０１７０３７）の増幅によりＰＣＲ反応を行う。
【０１２９】
下記のＰＣＲ条件を使用する：９５℃で５分間の変性、次いで９５℃で１０秒、６０℃で４０秒、および７２℃で１０秒および４０℃で１分（４０増幅サイクル）。ＰＭＰ２２遺伝子発現の相対的レベルを、ターゲット遺伝子ＰＭＰ２２から発生した産物の量を比較するＣｔ法および薬物インキュベーションの８時間、２４時間および４８時間後のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるＰＭＰ２２発現分析にしたがって測定し、初代ラットシュワン細胞の上清を回収し、遠心しそして冷凍する。ＳＣをトリプシン−ＥＤＴＡで分離する。大多数の細胞が懸濁液中にあるやいなや、トリプシンを１０％ＦＣＳを有するＤＭＥＭを使用して中和する。
【０１３０】
細胞を有する上清を回収しそして遠心する。細胞のペレットをマイクロチューブ中に移し、ＰＢＳ中で１回洗浄しそして特定の溶液(AbCys # Reagent A BUF09B)で固定する。１０分後、細胞をＰＢＳで１回洗浄しそして４℃に保つ。
【０１３１】
細胞固定の５日後、異なるインキュベーション時間を有するすべての細胞調製物を下記のプロトコールを使用して標識する。
【０１３２】
細胞を５分間７０００rpmで遠心し、そしてペレットを、透過性化の溶液(AbCys # Reagent A BUF09B)中に懸濁させそして室温で１時間初代ＰＭＰ２２抗体(Abcam # ab61220,1/50)で標識する。次いで細胞を５分間７０００rpmで遠心し、そして細胞ペレットをＰＢＳ中で１回すすぐ。二次抗体を加え、室温で１時間Alexa Fluor488(ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Molecular Probes # A11008,1/100)にカップリングさせる。次いで細胞を５分間７０００rpmで遠心しそして細胞ペレットをＰＢＳ中で１回すすぐ。標識化は、室温で１時間のインキュベーションでAlexa Fluor488(ニワトリ抗ヤギＩｇＧ、Molecular Probes # A21467,1/100)にカップリングさせた三次抗体を加えて増加させる。次いで細胞をＰＢＳ中で１回すすぐ。なんらの抗体なしのコントロール（標識されていない細胞）を自己蛍光のレベルを決定するのに使用しそして光電子増倍管の感度に適合させる。二次抗体および三次抗体を有するが一次抗体を有していないコントロールを、抗体の非特異的結合を評価するのに使用する。
【０１３３】
データ取得および分析は、５０００の細胞に関してＦＡＣＳ ＡｒｒａｙサイトメーターおよびＦＡＣＳ Ａｒｒａｙソフトウエア(Becton Dickinson)により行われる。細胞容積（サイズ）と相関した前方散乱（ＦＳＣ）および細胞内部の複雑さ（粒状性）に依存する側方散乱（ＳＳＣ）を分析する。ＰＭＰ２２の発現について、トータル細胞内で分析を行いそしてポジティブ細胞の百分率を計算する。ポジティブ細胞は二次抗体を有するコントロールより高い蛍光強度を有する細胞である。
【０１３４】
ＳＣの数を定量するために、コントロール培地中の細胞を、抗体抗Ｓ１００プロテインを使用して分析する。
【０１３５】
細胞を下記のプロトコールにしたがって調製する：シュワン細胞を室温で１時間抗体抗Ｓ１００プロテイン(Dako # S0311,1/100)で染色する。この抗体をＰＭＰ２２免疫染色で述べたプロトコールにしたがって、しかし三次抗体とのインキュベーションなしに、標識する。
【０１３６】
結果
本発明者等は、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベル（図１）が初代シュワン細胞において有意に減少していること、およびピロカルピンの１μM用量は、最も重要なＰＭＰ２２ダウンレギュレーションを誘導することを観察した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００１；コントロールとは有意に異なる（ペアーワイズスチューデントｔ検定）。右では、ピロカルピンに２４時間暴露されて、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現レベルが、低い用量（１０nMおよび５０nM）においてすら初代シュワン細胞において有意にダウンレギュレーションされる。同様に、本発明者等は、ピロカルピン（１μM）が、２４時間のインキュベーションの後ＰＭＰ２２タンパク質発現レベルを、初代シュワン細胞において３８％、有意に減少させることを観察した。この効果は、４８時間のインキュベーションの後も依然として有意である（−１８％、ｐ＜０．００１）。
【０１３７】
他の実験において、薬物（表１に列挙された）を、８時間の期間ラット神経鞘腫細胞系とインキュベーションしそしてＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−Ｑ−ＰＣＲにより定量する。本発明者等は、個々の薬物として使用された、メチマゾール（０．１nm）およびピロカルピン（０．００１nm）はＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現レベルに対する有意な活性を及ぼさず、この発現レベルはそれらの組み合わせにより有意に減少させられることを観察した。これらの２つの薬物の相乗性は図２に示される。これらのデータは、選ばれた濃度でピロカルピンとメチマゾールの組み合わせが培養された神経鞘腫細胞におけるＰＭＰ２２遺伝子の発現を有意にダウンレギュレーションすることができるが、初代シュワン細胞においてより高い濃度で活性なピロカルピンおよびメチマゾールはこの系におけるこの遺伝子の発現のレベルを減少させないことを証明する。
【０１３８】
ＩＩ．ＣＭＴ動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ実験
本発明者等は、ＣＭＴトランスジェニックラットモデルでの治療効果について化合物および組み合わせを試験したところ、マウスＰＭＰ２２遺伝子の３つの追加のコピーを有するヘミ接合ＰＭＰ２２トランスジェニックラットは末梢神経および頭側神経における脱髄の症状を示す(Sereda et al., 1996; Grandis et al., 2004)。ｍＲＮＡレベルでは、ＣＭＴラットにおけるＰＭＰ２２の平均１．６倍の過剰発現は臨床的表現型と相関する。野生型遺伝子が疾患遺伝子に変わるＰＭＰ２２過剰発現の推定的閾値レベルは、ＰＭＰ２２遺伝子発現を減少させることを目的とした処理により達成するべき明白な「目標」を示す。
【０１３９】
このＣＭＴラットモデルは、臨床的観点からはヒトＣＭＴ１Ａ疾患の良好な近似である。成熟ＣＭＴラットは、ＣＭＴ１Ａ患者の値と同様な、即ち５０％未満の値、を有する運動神経伝導速度の遅速化を示す。坐骨神経刺激後、複合筋活動電位は、減少した振幅および脱同期化を示す。組織学的および電気生理学的変化が運動障害の明白な臨床的兆候に先行する(Sereda et al., 1996, 2003)。組織学的に顕著な筋萎縮により確認される軸索損失は、ヒトＣＭＴ１Ａ症状と合致している。
【０１４０】
ＣＭＴラットは、実験的ＣＭＴ１Ａ治療用のモデルとして既に使用されている(Meyer zu Hoerste et al. 2007)。ＣＭＴ１Ａ疾患のこのモデルにおいて、病理の明白なおよび隠された兆候（運動欠損症、特に電気生理学的及び組織特性の特定の変化および最後にＰＭＰ２２過剰発現のレベル）はＣＭＴ１Ａ患者でみられる兆候に最も近いと思われる。
【０１４１】
本発明者等は、ラットモデルで治療効果について化合物および組み合わせを試験した。実験群は、別々に両性の若いラットで形成される。ラットは、体重に基づく無作為化スケジュールにしたがって群に割り当てられる。いくらかの実験では、無作為化は、バーテストにおけるラットの性能に基づく。両性は、数値的には処理群に等しいかまたは処理群より大きい別々のコントロール同腹子群により表わされる。ラットは、薬物生物利用性に依存して３または６週間の期間、薬物で慢性的に処理される−Ａｌｚｅｔ浸透圧皮下ポンプ（DURECT Corporation Cupertino,CA）により強制的に供給されるかまたは注射される。
【０１４２】
増加する体重に用量を調節するために、動物の体重を１週間に２回測定する。処理投与のために浸透圧ポンプが選ばれるならば、薬物の用量は、ポンプ持続の期間（６週間）にわたりその年齢について予測された動物の評価された平均体重に基づいて計算される。ポンプは適切な麻酔プロトコールにより、必要ならば再移植される。
【０１４３】
挙動試験
各３週間または４週間、動物を挙動試験に付す。各試験は、同じ部屋でかつその日の同じ時間に同じ研究者により行われ；この均一性は全実験にわたり維持される。すべての処置および遺伝子型決定は、研究者について盲検化される。「バー試験」および「掴み強度」か、研究全体にわたり性能を検討するために主として使用された。バー試験のスケジュールは、動物の成長につれて変えることができる（例えば、学習によるバイアスを回避するために）。
【０１４４】
掴み強度のアッセイは、筋力、感受性の状態（例えば、痛みを伴う触覚は力の測定された値を変えることがある）、挙動成分（「誘因」）からなると思われる掴み性能の僅かな差の検出を可能とする。値は、前肢と後肢で異なりそして動物の年齢に大きく依存する。
【０１４５】
掴み強度試験は、動物が別々にその前脚またはその後脚により掴みをしっかりと握って離さない強度を測定する。強度を測定するための掴みを有する力量計を配置する(Force Gauge FG-5000A)。ラットは、ラットがその前脚またはその後脚で掴みを掴みそしてラットが掴みを離すまでラットを後方に穏やかに引っ張るように、実験者により保持される。動物が掴みを離すときに測定された力を記録する。
【０１４６】
動物当たり前脚力を測定する２つの引き続く実験および後脚力を測定する２つの引き続く実験を処理する；最大スコアのみ（前脚で１つおよび後脚で１つ）を記録する（Ｎにおいて）。
【０１４７】
バー試験
バー試験は、固定ロッドを掴み続けるラットの能力を評価する。筋肉の弱さを示すＰｍｐ２２ラットは、この試験で性能不足を示す(Sereda et al., 1996)。ラットを、ロッド（直径：２．５cm；長さ：５０cm;テーブルの上３０cm）の中央にその４つの脚を置く。実験を引き続いて行い；本発明者等の実験における試験の数（５または１０）および期間（３０または６０秒）は、動物のバッチに依存していた。試験におけるこの変動性は、実験の過程でＣＭＴラットの運動欠損の最善の検出に適合したスケジュールを決定するために導入された。
【０１４８】
性能指数を、各セッションで記録する。
−ロッド上に６０秒または３０秒保持するのに必要な試験の数。
−各試験でバー上で消費された平均時間（即ち、落下潜時(fall latency)）およびセッションでの平均。実験過程において、セッションは、ラットがバー上にカットオフ時間、即ち３０または６０秒間２回とどまった後終了する。カットオフ時間（３０または６０秒）の性能は、完了していない試験に割り当てられる。
−落下の数
【０１４９】
一般的健康評価
動物の体重、明白な兆候（毛の外観、体の姿勢、振せん）は実験全体にわたり監視される。評価スケールは、０＝正常、１＝異常を記録するために使用される。
【０１５０】
足どり
各ラットを５分間汚れなしの新規なラットケージ（寸法５５ｘ３３ｘ１８cm）において観察する。ラット足どりを４つのパラメーターで評価する。
−スコア０：正常な足どり（流れるような(fluid)）
−スコア１：異常な足どり（流れるようでないまたはラットは僅かなびっこを引く）
−スコア２：中程度の無能(incapability)（ラットは一方の脚を引きずり、そしてそれを直しそして歩くことができる）
−スコア３：重症の無能（ラットはその一方または両方の後脚を引きずるが、それ／それらを直すことができない）
【０１５１】
傾斜面試験
滑り装置は、０°（水平）から６０°までの角度で傾斜していることができる３０ｘ５０cmのプレキシガラス面を有していた。各ラットを、頭を上にした姿勢（ヘッドアップ方位）で２５°の角度の傾斜面に最初に置き、１分だけ離れた２つの試験を行う。３０分後、同じ実験を３５°の角度の傾斜面で行い、次いで４０°の角度の傾斜面で行う。この時間の間ラットをそのケージに戻した。面を各試験の後清浄にする。
【０１５２】
ラットの性能を４つの異なるスコアにより評価する：
−スコア０：滑りなし
−スコア１：僅かな滑り（一方または両方の脚）
−スコア２：中程度に滑る（４つの脚）が面の端部までは滑らない
−スコア３：ラットは面のまさにその最下部まで滑っている。
【０１５３】
電気生理学
適当ならば、ラットを電気生理学的評価に付す：感覚神経伝導速度(sensitive nerve conduction velocity)ならびに潜時および電位振幅を測定する。ＮＣＶ測定および電位獲得(potential acquisition)（皮下）を、増幅器、(AM System 1700および／またはEMG-UTC)、刺激装置(Havard apparatus 223)および獲得カードおよび獲得のためのソフトウエア(SPATOL)およびシグナル処理のためのソフトウエア（CALVISE）を備えたコンピュータからなるチェーンの助けにより行った。動物をケタミン／キサラジンを使用して麻酔しそして試験全体にわたりサーモスタットを備えたプレート上で３７℃に維持した（麻酔は必要に応じて補給された）。刺激性銀針電極を尾の近位部に挿入した。記録電極を尾の遠位部（刺激電極から４および６cm）において約１mmの皮膚を通して皮下に挿入した。一定の電流方形波刺激、期間が０．２秒、を秒当たり０．３の周波数で与えた。５．０００〜２０．０００倍に増幅された応答を可視化しそしてコンピュータに基づいたデータ獲得システムで収集した。潜時を、各波開始（ベースラインから最初に明らかに同定可能な偏位として定義された）で測定した。最も大きい偏位のピークからピークまでの振幅を計算して最大振幅を決定した。
【０１５４】
各記録について、少なくも１０回の同一刺激に対する平均応答に関して測定を行った。
感覚関連伝導速度(sensory related conduction velocity(SNCV)を、刺激カソード間の距離を２つの部位の刺激から得られた対応する潜時間の差で割ることにより計算した。
【０１５５】
組織学的測定
最後の試験（最後の日まで続けられている処理）が終わると、ラットを安楽死させた。野生型ラットおよびトランスジェニックラットの後足を切り離し、そして４％ホルマリン溶液中に浸漬することにより固定し、そして追加の２日間１０％ホルマリン溶液中に移した。水中で１５分間すすいだ後、次いでそれらを２６時間脱灰のための処理をした(Labonord Decalicifant rapide ｎ°3 # DC3_09128300)。次いで足を２つの片に横断方向に切断し、それらをオスミウム着色のために処理する。
【０１５６】
組織を１％四酸化オスミウム溶液(VWR, Osmium VIII oxide 0.5g # 20551.076)の上に２４時間つるし、次いで脱塩水で４〜６時間すすぐ。次いで組織を包埋の自動機械ートにおいて脱水し(VIP2000 Vertical, Bayer Diagnostics)そして古典的にパラフィン中に包埋した。
４μmの組織切片を引き続くキシレンおよびアルコール浴において脱水そして更なる分析のためにスライドに載せた(Pertex glue, # T/00911_MICROM)。
【０１５７】
像分析
６匹の動物からの切片を注意深く選んで同じ解剖学的レベル（趾接合部）を例示しそしてSaisam マイクロビジョンソフトウエア(Microvision InstrumentsによるArchimed pro(登録商標)1997-2000)とカップリングさせたOlympus 顕微鏡下に分析する。末梢神経を局所化しそして下記のとおり分析する：円形有髄繊維(circulary myelinated fibers)を計数する(神経繊維束少なくとも１５０繊維／動物)。有髄繊維の内周および同じ有髄繊維の外周に相当する軸索突起直径(cylindraxe diameters)を決定する。次いで、本発明者等は、野生型およびトランスジェニック動物の髄鞘厚さおよび軸索直径の分布を比較した。
【０１５８】
更に、本発明者等は、同じ神経切片の光学密度を測定して非有髄繊維含有率（オスミウム切片で見えず、それゆえ分析されない）がトランスジェニック動物でより高い（神経切片の全体的に青白い外観により反映される）かどうかを決定する。
【０１５９】
最後に、神経分析のために使用される以外の同じ切片に存在するすべての足筋肉を、手動で輪郭を描いて全体的筋肉表面を決定する。次いで本発明者等は、「筋肉含有率／切片表面」の比を計算した。
【０１６０】
坐骨神経を切除しそして重量測定のためおよび分子生物学および／または生化学アッセイのために使用する。（ＰＭＰ２２ｍＲＮＡのためのＲＴ−Ｑ−ＰＣＲおよびミエリンタンパク質定量のためのウエスタンブロット；アラキドン酸代謝物などの生化学的マーカーのためのCaymanのＥＩＡキット、ステロイドおよびアミンのためのＨＰＬＣ定量、一般的に使用されるプロトコールに従って行われるＣＮＴＦ、ＩＬ−６等のためおよび分析処理（薬物濃度測定）のためのＥＬＩＳＡ。
【０１６１】
後肢筋（ヒラメ筋）をサンプリングし、重量を測定し、急冷凍し(snap-frozen)、そして分析まで−８０℃に保存する（坐骨神経の場合と同じ）。
【０１６２】
結果
強制された供給により投与されたメチマゾール（０．３５mg／kg日用量）およびピロカルピン（０．２mg／kg日用量）は、処理手順全体にわたりバー試験性能を改善する（図３）が、化合物ＰＸＴ２５（比較のためにのみここに提示される）は、殆ど何らの改善も示さない。
【０１６３】
運動性能は、野生型（ＷＴ）群と比較してプラセボで処理された異なるＣＭＴ ＴＧラットにおいて平均して３倍少ない合格であった。メチマゾールおよびピロカルピンによる処理は、この実験ではＴＧ動物の改善を可能とし、効果は強制供給の８週間後で早くも統計的に有意となる。
【０１６４】
データは、これらの相対的に高い用量のメチマゾールおよびピロカルピンで処理されたＣＭＴラットは、プラセボ群と比較して有意によりよい性能となったことを示す。化合物ピロカルピンで処理された群は、ＷＴプラセボ群の性能のレベルと有意に異ならない性能のレベルを回復すらした。
【０１６５】
尾の遠位部で測定したＳＮＡＰは、ＴＧプラセボ群において有意に減少しており、これは脱髄による重要な軸索損失を反映している可能性がある。この電気生理学的パラメーターは、化合物Ａにより処理すると有意に改善されるが、図４、化合物Ｂで処理されたトランスジェニックラットのＳＮＡＰは、有意のための名目上の５％閾値に近付いている。
【０１６６】
この観察は、末梢神経のミエリン形成状態が測定可能に改善されないとしても、メチマゾールの作用が軸索損失を防止することができることを我々が推定することを可能とする。ピロカルピンの効果は、群内変動性のゆえにプラセボ群パラメーターとの差が統計的有意に達しなかったとしても、本質的に同じであると思われる。ＣＭＴ１Ａにおいて、（感覚神経活動電位）（ＳＮＡＰ）振幅は、より多く減少しそしてＳＮＡＰ期間はＣＭＴ２におけるよりも長い。ＣＭＴ１Ａにおける複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）およびＳＮＡＰ振幅の減少は、多分、脱髄および軸索機能不全の組み合わさった効果である(Bienfait et al., 2006)。
【０１６７】
研究の終わりに、形態学的分析を行った。後肢組織の測定は、坐骨神経およびヒラメ筋がコントロールＷＴラットと比較してプラセボで処理されたＣＭＴ雌ラットにおいて有意に減少していることを示す（図５）。
【０１６８】
これらの欠損は、化合物Ａ処理により完全に矯正されると思われる。：上記筋および神経の絶対質量は、コントロールＷＴラットにおけるよりも高くさえあるが、全体重は、プラセボ群（データは示されていない）と比較して、化合物Ａ群においてむしろ減少している。後肢筋および神経に対するピロカルピン処理の効果は、メチマゾールの効果より小さいと思われる。
【０１６９】
メチマゾール（４mkg／kg）およびピロカルピン（７mkg／kg）の５０倍低い用量の混合物１（表１）は、図６に示されたとおり１０週間の強制供給された処理の後雌ラットの足どりスコアを改善する。本発明者等は、６週間の処理の後ポジティブな傾向を観察した。
【０１７０】
下記の図は、３つの異なる挙動および電気生理学的試験における雄ラットに対するピロカルピン（７mkg／kg）；メチマゾール（４mkg／kg）、ミフェプリストン（４０mkg／kg）、ナルトレキソン（４mkg／kg）；バクロフェン（６０mkg／kg）およびソルビトール（２mg／kg）を含有する混合物２（表１）のポジティブな効果を示す。
【０１７１】
図７は、これらの用量での混合物２は、尾の神経電気的刺激の後ＣＭＴプラセボラットで見出された興奮性閾値の上昇を減少させることを示す。
図８は、バー試験での雄の性能に対するポジティブな効果を示し；４週間の処理の後、落下の数は減少しそしてロッドでの消費時間は増加する。
【０１７２】
図は、混合物２が３週間の処理の後雄ラットの足どり性能も改善し、流れるような足どりで歩くラットの百分率は、ＣＭＴプラセボラットと比較して処理されたラットで３５％増加することを示す。
【０１７３】
同様な結果が、他の組み合わせで得られそして結果の要約を表１に示す。
【表１】
【０１７４】
これらのデータは、ｉｎ ｖｉｖｏで、本発明の組み合わせおよび治療方式はＣＭＴの有効な処理を可能とすることができることを示す。
【０１７５】
ＩＩＩ．毒性神経障害のモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの効果
薬物処理または治療方式は、オキサリプラチン３mg／kgの最初の腹腔内注射の前の日（Ｄ−１）から最後の試験日の前の日（Ｄ１６）まで経口投与される。オキサリプラチン処理群に属する動物は、蒸留水を毎日投与される（１０ml／kg）。動物は、試験された処理および蒸留水を毎日朝の間投与されるが、これに対してオキサリプラチンは午後に投与される。
【０１７６】
試験日（即ち、Ｄ１、Ｄ４、Ｄ１０）の間、処理および蒸留水を試験の後に投与される。化合物およびビヒクル投与およびオキサリプラチン注射を含む、試験日（Ｄ４）に関して、処理および蒸留水は、試験後オキサリプラチンの注射の前に投与される。参照処理群からの動物は、試験日（Ｄ１、Ｄ４、Ｄ１０およびＤ１７）の間のみ投与される。
【０１７７】
低温アロディニア(cold allodynia)は、Ｄ１（オキサリプラチン３mg／kgの最初の注射の約２４時間後（オキサリプラチンの急性効果））、Ｄ４、Ｄ１０および（オキサリプラチンの慢性効果）およびＤ１７（処理の完了の１週間後のオキサリプラチンの残留効果）に熱的非侵害性刺激(non-nociceptive stimulation)に対する応答を測定すること（アセトン試験）により評価される。
試験は、参照の投与の２時間後アセトン試験を使用して行われる。
参照物質は、ガバペンチン、１００mg／kg、経口（１日１回×４試験日）。
【０１７８】
アセトン試験
低温アロディニアをアセトン試験により評価する。この試験において、後脚引っ込め(hind withdrawal)の潜時を、両後脚の足底表面にアセトンの滴を適用した後測定し（反応時間）そして応答の強度をスコア化する（低温スコア）。
【０１７９】
アセトンの冷却効果に対する反応時間は、アセトン適用後に２０秒（カットオフ）以内に測定する。アセトンに対する応答も下記の４ポイントスケールに等級別される：０（応答なし）；１（脚の速い引っ込め、払いのけ(flicking)）；２（脚の長期の引っ込めまたは顕著な払いのけ）：３（舐めまたは噛みを伴う脚の反復払いのけ）。ラットによる６試験を行う。各実験群について、結果は、±ＳＥＭと共に各ラットについて６つのスコアの和として定義された累積客観的スコアとして表わされる。最小スコアは０（６つの試験のいずれにも応答なし）でありそして最大可能なスコアは１８（６つの試験の各々に関して脚の反復払いのけおよび舐めおよび噛み）である。
【０１８０】
ガバペンチン：ソース：Zhejiang Chiral Medicine Chemicals,China
オキサリプラチン：ソース：Sigma,France
【０１８１】
結果
オキサリプラチンにおける混合物２の試験の結果を図１０に示す。混合物２は毒性薬物処理により誘導される神経障害から動物を保護することは明らかである。
【０１８２】
ＩＶ．ＡＬＳのモデルにおけるＩｎ ｖｉｖｏ効果
動物モデル
本発明者等は、筋萎縮性側索硬化症病理を模倣したＳＯＤ１Ｇ９３Ａラットモデル（Howland DS et al., 2002により発生された）を選んだ。このモデルは、脊髄、多くの脳領域および末梢組織における突然変異したＳＯＤ１遺伝子を過剰発現する(Howland DS et al., 2002）。このモデルの運動ニューロン疾患の発症は、約１１５日目であり（Howland DS et al., 2002）；それは後肢異常足どり(hind limb abnormal gait)として現れる。数日で、後肢の麻痺が生じる。
【０１８３】
実験手順
繁殖動物ＳＯＤ１Ｇ９３Ａをスプレーグ・ドーリー雌ラットと交配させることによりコロニーを得た。ヘテロ接合ＳＯＤ１Ｇ９３Ａラットは、ｈＳＯＤ１に特異的なプライマーで尾のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で同定された（Howland DS et al., 2002）。動物をコントロールされた照明（０５００〜１９００時に照明）および温度（２３±１℃）を有する部屋に保ち、そして食物および水を自由に摂取できるようにした。この研究におけるすべての動物処理は、動物医療のガイドライン標準にしたがって行われた。
【０１８４】
体重測定を毎週行い、そして挙動試験を６０日の年齢で開始しそして終点まで続けた。処理を５週間の年齢から経口または皮下の方法により毎日おこなった。
【０１８５】
観察試験：一般的局面の特徴付け
各ラットを５分間汚れなしの新規なラットケージ（寸法５５ｘ３３ｘ１８cm）において観察した。５つの異なるパラメーターを記録する。
【０１８６】
足どり（gait）
−スコア０：正常な足どり（流れるような(fluid)）
−スコア１：異常な足取り（流れるようでないまたはラットは僅かなびっこを引く）
−スコア２：中程度の無能(incapacity)（ラットは一方の脚を引きずり、そしてそれを直しそして歩くことができる）
−スコア３：重症の無能（ラットはその一方または両方の後脚を引きずるが、それ／それらを直すことができない）
【０１８７】
毛の様相
−スコア０：清浄および絹のような毛
−スコア１：立毛または汚れた毛
【０１８８】
震せん
−スコア０：震せんなし
−スコア１：震せん
【０１８９】
身体姿勢
−スコア０：正常
−スコア１：異常（平らになった(flattened)およびその背中を弓状に曲げる）
【０１９０】
後脚の姿勢
−スコア０：正常
−スコア１：後脚を広げる
【０１９１】
運動スコア試験：運動欠損の特徴付け
この試験は、ラットの３０秒以内に自分自身常態に戻して両側に回転する能力を評価する(立ち直り反射)を評価する(Gale. K et al, 1985)。
【０１９２】
ノンパラメトリックスコアリングシステムをこれらの基準にしたがって使用する(matsumoto A.et al, 2006; Thonhoff JR et al,2007)：
−スコア０：ラットは３０秒以内に両側から自分自身を立ち直らせることができない；
−スコア１：ラットは３０秒以内に一側のみから自分自身を立ち直らせることができない；
−スコア２：ラットは３０秒以内に両側から自分自身を立ち直らせることができるが、ケージの中で立つことができない；ラットは常に身体のある部分を引きずっている；
−スコア３：ラットは３０秒以内に両側から自分自身を立ち直らせることができ、ケージの中で立つことができないが、身体のある部分を引きずっていない；
−スコア４：ラットは３０秒以内に両側から自分自身を立ち直らせることができ、ケージの中で立つことができるが、可視機能欠損を有する；
−スコア５：ラットは３０秒以内に両側から自分自身を立ち直らせることができ、ケージの中で立つことができ、可視機能欠損を有していない。
【０１９３】
疾患の終点は、スコア０に決められ、ラットを次いで安楽死させる。
【０１９４】
傾斜面試験：運動欠損の特徴付け
滑り装置は、０°（水平）から６０°の角度で傾斜していることができる３０ｘ５０cmのプレキシガラス面を有していた。各ラットを、頭を上にした姿勢（ヘッドアップ方位）で２５°の角度の傾斜面に最初に置き、１分だけ離れた２つの試験を行う。３０分後、同じ実験を３５°の角度の傾斜面で行い、次いで４０°の角度の傾斜面で行う。この時間の間ラットをそのケージに戻した。面を各試験の後清浄にする。
【０１９５】
ラットの性能を４つの異なるスコアにより評価する：
−スコア０：滑りなし
−スコア１：僅かな滑り（一方または両方の脚）
−スコア２：中程度に滑る（４つの脚）が面の端部までは滑らない
−スコア３：ラットは面のまさにその最下部まで滑っている。
【０１９６】
金網試験：困難な状況における運動能力の特徴付け
金網を頂部で箱と接触させ（７０°の角度で）そして底部でテーブルの縁と接触させて置いた(Thonhoff JR et al, 2007)。各ラットを金網の底部に置き、そして箱の中には頂部にラットの同腹子を置くことにより上昇するための動機を与えられた。各ラットを１週間に１回訓練した（３試験）
記録されたパラメーターは金網の頂部にタッチするまでの潜時であった。
【０１９７】
オープンフィールド試験：運動活動の特徴付け
運動活動を、床上1cmおよび５cmに２つの軸に従う１６ホトセルビームを有するプレキシガラスボックス（４５ｘ４５ｘ３０cm、BIOSEB, Lyon, FranceによるActi-Traqck）において測定した。
【０１９８】
各ラットの自然に起こる活動および診査活動を３時間の間評価した。４つのパラメーターを記録した（トータル移動距離、立ち上がり(reariings)の数、移動した距離およびオープンフィールドの中心で過ごした時間の百分率）。
【０１９９】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シャルコー・マリー・トゥース病および関連した障害の処置のための組成物および方法に関する。
【０００２】
シャルコー・マリー・トゥース病（「ＣＭＴ」）は、オーファン遺伝子末梢多発性神経障害である。約２，５００個体に１人が罹患するので、この疾患は、末梢神経系の最も普通の遺伝病である。その発症は、典型的には、人生の１０代または２０代の期間に起るが、幼児期に検出されることがある。疾患の進行は、漸進的な神経筋変性を伴って慢性的である。この疾患は、神経痛およびひどい筋肉障害を伴う症例を伴い無力化性(invalidating)である。ＣＭＴは、フランスでは約３０，０００症例を有する最もよく研究された病理である。大多数のＣＭＴ患者は、ミエリン遺伝子：ＰＭＰ２２を含有する染色体１７フラグメントの重複を有し（形態ＣＭＴ１Ａ）、２ダースの遺伝子が異なる形態のＣＭＴにおいて関係している。したがって、起源において単一遺伝子性であるけれども、この病理は、可能なモジュレータ遺伝子により臨床的異質性を示す。ＣＭＴ患者において突然変異した遺伝子は、シュワン細胞またはニューロンの分化に影響を与えるかまたは末梢神経におけるこれらの細胞の相互作用を変化させる密接に関連した分子経路のまわりにクラスタリングしている。
【０００３】
ＰＭＰ２２は、末梢神経系における本質的にすべての有髄繊維のコンパクトな部分に発現されたミエリンの主要な成分であり、そして主としてシュワン細胞により産生される。更に、ＰＭＰ２２遺伝子は、神経線維腫症、カフェオーレ班および皮膚の線維腫性腫瘍(fibromatous tumors)により特徴付けられる常染色体優性障害、を有する患者の新形成の発生に関与していると推測される。正常なＰＭＰ２２タンパク質のあまり多くない１．５倍の過剰発現が、ＣＭＴ患者における重複のためのヘテロ接合のシュワン細胞においても観察される（あるまれな症例では、ＣＭＴ１Ａ様発現型はＰＭＰ２２タンパク質における構造的突然変異にも関連しうる）(Lupski et al., 1992; Suter et al, 1992; Roa et al., 1993; Thomas et al., 1997; Suter ＆ Scherer, 2003; Nave ＆ Sereda, 2007)。異常なＰＭＰ２２遺伝子量(dosage)がＣＭＴ１Ａ様表現型を引き起こす直接の証拠は、ＰＭＰ２２タンパク質の過剰発現を有するげっ歯類モデルにおけるトランスジェニック実験により与えられた(Niemann et al., 1999; Perea et al., 2001; Robaglia-Schlupp et al., 2002; Meyer et al., 2006; Sereda ＆ Nave, 2006)。
【０００４】
更に、プロゲステロンレセプターの阻害剤およびアスコルビン酸による治療介入は、トランスジェニック動物におけるこの発現を減少させて、疾患表現型の進行を改善または遅くした(Sereda et al., 2003; Passage et al., 2004; Meyer zu Horste et al., 2007)。
【０００５】
Bussi et al., 1978は、神経障害および脳脊髄炎と関連した甲状腺中毒症の処置におけるメチマゾールの使用に関する。
【０００６】
CeltrixのWO00/20024は、甲状腺障害であるＩＧＦ依存性障害の症状を軽減するためのメチマゾールの使用に関する。
【０００７】
WO2004/019938は、神経障害痛の症候群の処置におけるピロカルピンの使用に関する。
【０００８】
筋緊張性乳頭異常の処置のためのピロカルピン単独の使用は、Keltner et al., 1975により示唆された。しかしながら、ＣＭＴの処置のためのピロカルピンの使用は記載されていない。更に、任意の他の化合物との組み合わせにおけるピロカルピンの使用も示唆されていない。
【０００９】
最後に、ＣＭＴ疾患を処置するための効果的なかつ改良された治療の必要がある。
【００１０】
発明の要約
本発明の目的は、ＣＭＴおよび関連した障害を処理するための新規な治療アプローチを提供することである。更に詳しくは、本発明者等は、ＣＭＴおよび関連した障害をもたらす経路に有効に影響を与える新規な組み合わせ治療を同定し、そしてこれらの障害の処置のための新規なアプローチを提示する。したがって、本発明は、ＣＭＴ病および関連した障害を処置するための新規な組み合わせ製品および組成物ならびにその使用を提供する。
【００１１】
本発明の目的は、更に特定的には、ＣＭＴまたは関連した障害を処置する（ための医薬の製造の）ための化合物の組み合わせの使用であって、該化合物の組み合わせが、ムスカリンレセプターアゴニストまたはそのプロドラッグおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤またはそのプロドラッグから選ばれる、化合物の組み合わせの使用に関する。
【００１２】
本発明の他の目的は、同時にまたは順次に被検体に一団にして投与するかまたは別々に投与するための、ムスカリンレセプターアゴニストまたはそのプロドラッグおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤またはそのプロドラッグを含む組み合わせ製品にある。
【００１３】
本発明は、ムスカリンレセプターアゴニストおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤またはそのプロドラッグおよび場合により薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む薬学的組成物にも関する。
【００１４】
最も好ましい態様においては、ムスカリンレセプターアゴニストは、ピロカルピン薬剤の有効作用物質である、（３Ｓ，４Ｒ）−３−エチル−４−［（３−メチルイミダゾール−４−イル）メチル］オキソラン−２−オン（ＣＡＳ９２−１３−７）又はそのプロドラッグである。
【００１５】
更に、最も好ましい態様においては、甲状腺ホルモン合成の阻害剤は、更にプロスタグランジンシグナリングにおける活性を示す。このような化合物の好ましい例は、１−メチル−３Ｈ−イミダゾール−２−チオン（ＣＡＳ６０−５６−０、メチマゾール薬剤の有効作用物質である）またはそのプロドラッグ、例えばカルビマゾールを含む。
【００１６】
他の態様においては、本発明は、被検体のＣＭＴの処置のためのムスカリンレセプターアゴニストおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤を含む組成物であって、該処置が、患者がＣＭＴ１Ａを有するかどうかを決定するための工程を更に含む、組成物に関する。
【００１７】
これに関して、本発明の特定の目的は、ピロカルピン、またはそのプロドラッグおよびメチマゾールまたはそのプロドラッグ、および場合により薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む組成物に関する。実施例に示されたとおり、このような組み合わせは、認知された動物モデルにおいてＣＭＴを有効に処置することを可能とする。
【００１８】
本発明の製品または組成物は、更に、好ましくは、ラパマイシン、バクロフェン、ソルビトール、ミフェプリストン、ナルトレキソン、フルルビプロフェンおよびケトプロフェンからなる群より選ばれる少なくとも１つの追加の有効化合物を更に含むことができる。 好ましい態様においては、本発明に従う組成物は、少なくとも、
−ピロカルピン、メチマゾールおよびミフェプリストン；
−ピロカルピン、メチマゾールおよびバクロフェン；または
−ピロカルピン、メチマゾールおよびソルビトール；
を含む。
【００１９】
他の好ましい態様においては、本発明に従う組成物は、少なくとも、
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、バクロフェンおよびソルビトール；または
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、バクロフェン、ソルビトールおよびナルトレキソン、
を含む。
【００２０】
他の態様においては、本発明は、メチマゾール、プロカルピンおよび２つの追加の有効化合物、好ましくはミフェプリストンおよびソルビトールを含む製品または組成物に関する。
【００２１】
他の態様においては、本発明は、メチマゾール、プロカルピンおよび３つの追加の有効化合物、好ましくは；
−ミフェプリストン、バクロフェンおよびソルビトール；または
−ミフェプリストン、ソルビトールおよびラパマイシン；または
−ミフェプリストン、ソルビトールおよびケトプロフェン；または
−ミフェプリストン、ソルビトールおよびフルルビプロフェン、を含む製品または組成に関する。
【００２２】
他の態様においては、本発明は、メチマゾール、プロカルピンおよび４つの追加の有効化合物、好ましくは；
−ミフェプリストン、ソルビトール、バクロフェンおよびナルトレキソン；
−ミフェプリストン、ソルビトール、バクロフェンおよびラパマイシン；
−ミフェプリストン、ソルビトール、ナルトレキソンおよびラパマイシン；
を含む製品または組成物に関する。
【００２３】
他の態様においては、本発明は、表１に開示された任意のドラッグ組み合わせを含む製品または組成物に関する。
【００２４】
他の特定の態様においては、本発明は、
−メチマゾール、バクロフェン；または
−メチマゾールおよびセビメリン、
を含む製品または組成物にも関する。
【００２５】
他の特定の態様においては、本発明は、
−メチマゾールおよびバクロフェン；または
−メチマゾールおよびセビメリン、
を含む製品または組成物に関する。
【００２６】
他の態様においては、本発明は、ピロカルピンおよびプロピルチオウラシルを含む製品または組成物にも関する。
【００２７】
本発明の他の目的は、ピロカルピンとメチマゾールの組み合わせの使用またはこれらの２つの化合物単独の使用または、ＣＭＴまたは関連した障害の処置（のための医薬の製造）のためのこれらの２つの化合物の効果を高める他の化合物との組み合わせにおけるこれらの２つの化合物の使用に関する。
【００２８】
本発明の他の目的は、本発明の他の目的は、毒性神経障害の処置（のための医薬の製造）のための、ピロカルピンとメチマゾールの組み合わせの使用またはこれらの２つの化合物単独の使用または、これらの２つの化合物の効果を高める他の化合物との組み合わせにおけるこれらの２つの化合物の使用に関する。
【００２９】
本発明の他の目的は、ＡＬＳ（筋委縮性側索硬化症）の処置（のための医薬の製造）のための、ピロカルピンとメチマゾールの組み合わせの使用またはこれらの２つの化合物単独の使用または、これらの２つの化合物の効果を高める他の化合物との組み合わせにおけるこれらの２つの化合物の使用に関する。
【００３０】
好ましくは、ＣＭＴの処置のためのピロカルピンおよびメチマゾールの効果を高める化合物は、ミフェプリストン、バクロフェン、ソルビトール、ナルトレキソン、ラパマイシン、フルルビプロフェンおよびケトプロフェンからなる群より選ばれる。
【００３１】
別の態様においては、ピロカルピンおよびメチマゾール混合物は、ＣＭＴまたは関連した障害の処置のために、１つの追加の有効化合物、好ましくはミフェプリストンまたはバクロフェンと組み合わせて使用される。
【００３２】
他の態様においては、ピロカルピンおよびメチマゾール混合物は、２つの追加の有効化合物、好ましくはミフェプリストンおよびソルビトールと組み合わせて使用される。
【００３３】
他の態様においては、ピロカルピンおよびメチマゾール混合物は、バクロフェン、ラパマイシン、ケトプロフェンまたはフルビプロフェンから選ばれる第３化合物との組み合わせた好ましくは、ミフェプリストンおよびソルビトールからなる、３つの追加の有効化合物と組み合わせて使用される。
【００３４】
他の態様においては、ピロカルピンおよびメチマゾール混合物は、４つの追加の有効化合物、好ましくは、ミフェプリストン、ソルビトール、バクロフェンおよびナルトレキソンもしくはラパマイシン；またはミフェプリストン、ソルビトール、ナルトレキソンおよびラパマイシンと組み合わせて使用される。
【００３５】
本発明は、更に、ＣＭＴまたは関連した障害、特にＣＭＴを処置することを必要とする被検体に、ムスカリンレセプターアゴニストまたはそのプロドラッグ、および甲状腺ホルモン合成の阻害剤またはそのプロドラッグの有効量の組み合わせを投与することを含む、ＣＭＴまたは関連した障害、特にＣＭＴを処置するための方法を提供する。
【００３６】
本発明は、更に、ピロカルピンまたはそのプロドラッグおよびメチマゾールまたはそのプロドラッグの有効量の組み合わせを被検体に投与することを含む、被検体におけるＣＭＴを処置する方法にも関する。
【００３７】
本発明は、ピロカルピンおよびメチマゾールと、優先的には、ラパマイシン、バクロフェン、ソルビトール、ミフェプリストン、ナルトレキソン、フルルビプロフェンおよびケトプロフェンからなる群より選ばれる少なくとも１つの追加の有効化合物との有効量の組み合わせを被検体に投与することを含む、被検体におけるＣＭＴを処置する方法にも関する。
【００３８】
別の態様においては、本発明は、
−ピロカルピン、メチマゾールおよび、少なくとも１つ追加の有効化合物であって、バクロフェン、ミフェプリストン、ソルビトールおよびナルトレキソンから選ばれる化合物；
−ピロカルピン、メチマゾールおよびバクロフェン；
−ピロカルピン、メチマゾールおよびミフェプリストン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトールおよびバクロフェン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトールおよびラパマイシン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトールおよびケトプロフェン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトールおよびフルルビプロフェン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトール、バクロフェンおよびナルトレキソン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトール、バクロフェンおよびラパマイシン；
−ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ソルビトール、ナルトレキソンおよびラパマイシン；
−メチマゾールおよびバクロフェン；
−メチマゾールおよびセビメリン；または
−ピロカルピンおよびプロピルチオウラシル、
の有効量の組み合わせを被検体に投与することを含む、被検体におけるＣＭＴを処置する方法にも関する。
【００３９】
本発明は、任意の哺乳動物被検体、特にヒト被検体におけるＣＭＴまたは関連した障害を処置するために使用されうる。本発明は、ＣＭＴ１ａを処置するのに特に適している。
【００４０】
この点で、本発明の特定の目的は、ピロカルピンまたはそのプロドラッグおよびメチマゾールまたそのプロドラッグの有効量の組み合わせを被検体に投与することを含む、被検体におけるＣＭＴ１ａを処置する方法である。
【００４１】
本発明の更なる目的は、ＣＭＴ１ａを処置する方法であって、（１）被検体がＣＭＴ１ａを有するかどうかを評価し、そして（２）ＣＭＴ１ａを有する被検体を、ピロカルピンまたはそのプロドラッグおよびメチマゾールまたそのプロドラッグの有効量の組み合わせにより処置する、ことを含む方法である。
【００４２】
被検体がＣＭＴ１Ａを有するかどうかを決定することは、当技術分野でそれ自体知られている種々の試験、例えばＤＮＡアッセイによりなされうる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】相対的レベルは、化合物ＡおよびＢで２４時間処理された初代ラットシュワン細胞におけるＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現の％として示される。左側には、１mMまたは１μMの化合物Ａ（メチマゾール）添加の２４時間後のＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現レベルの％が示される。ＰＭＰ２２ｍＲＮＡは、初代シュワン細胞において有意に減少すること、および化合物Ａのより低い用量は最も重要なＰＭＰ２２ダウンレギュレーションを誘導することが観察された。＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００１；コントロールとは有意に異なる（ペアーワイズスチューデントのｔ検定）。右側には、化合物Ｂ（ピロカルピン）に２４時間暴露されて、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現のレベルは、非常に低い用量で（１０nMおよび５０nM）ですら初代シュワン細胞において有意にダウンレギュレーションされる。同様に、本発明者等は、化合物Ｂ（１μM）が２４時間のインキュベーションの後にＰＭＰ２２タンパク質の発現レベルを有意に、初代シュワン細胞において３８％減少させることを観察した。この効果は、４８時間のインキュベーションの後依然として有意である（−１８％、ｐ＜０．００１）。
【図２】ＲＴ４−Ｄ６Ｐ２Ｔシュワン細胞腫細胞におけるＲＴ−Ｑ−ＰＣＲにより定量されたＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現レベルに対する選ばれた薬物の効果。＊＊＊：ｐ＜０．０００１；コントロール（薬物なし）とは有意に異なる。ΔΔＣｔ値に対する両側スチューデントのｔ検定。
【図３】傾向の形態で表わされた処理研究全体にわたりバー試験における雌ラットの運動評価の結果。ＷＴプラセボ：プラセボで処理された正常なラット；ＴＧプラセボ：プラセボで処理されたコントロールトランスジェニックラット；ＴＧｐｔｘ２５：ネガティブコントロール物質で処理されたトランスジェニックラット；ＴＧＡ：メチマゾール０．２mg／kgの１日用量で処理されたトランスジェニックラット；ＴＧＢ：ピロカルピン０．３５mg／kgの１日用量で処理されたトランスジェニックラット。
【図４】２０週の期間薬物で処理されたＣＭＴラットにおける感覚神経電位振幅の電気生理学的評価。ＴＧプラセボ：プラセボで処理されたコントロールトランスジェニックラット；ＴＧｐｔｘ２５：ネガティブコントロール物質で処理されたトランスジェニックラット；ＴＧＡ：メチマゾール０．２mg／kgの１日用量で処理されたトランスジェニックラット；ＴＧＢ：ピロカルピン０．３５mg／kgの１日用量で処理されたトランスジェニックラット。
【図５】図３の説明に記載の通りの薬物で処理された動物から得られた死後のサンプルの分析。２０週間薬物およびプラセボで処理されたラットを深く麻酔しそして全体の坐骨神経およびヒラメ筋を注意深くサンプリングしそして重量を計った。グラフは、これらの測定３０の平均値を提示する。
【図６】足どり評価試験（雌ラット）における混合物１のポジティブ効果；黒線はプラセボで処理されたコントロールラットを表わし；黒太線は、プラセボで処理されたトランスジェニックラットを表わし；点線は混合物１で処理されたトランスジェニックラットを表わす。ｐ＜０．０５；黒＊：ｗｔプラセボ対ｔｇプラセボ；グレー＊：ｔｇプラセボ対ｔｇ混合物１．統計学は、スチューデント両側検定で行い；平均は±ｓ．ｅ．ｍ．で表わされる。
【図７】尾の神経の興奮性閾値に対する混合物２のポジティブ効果（白いバーはプラセボで処置されたコントロール雄ラットを表わし；黒いバーはプラセボで処理されたトランスジェニック雄ラットを表わし；グレーのバーは混合物２で処理されたトランスジェニック雄ラットを表わす。統計学は、スチューデント両側検定で行い；平均は±ｓ．ｅ．ｍ．で表わされる。
【図８】バー試験における４週間の処理後の混合物２のポジティブ効果（白いバーはプラセボで処理されたコントロール雄ラットを表わし；黒いバーはプラセボで処理されたトランスジェニック雄ラットを表わし；グレーのバーは混合物２で処理されたトランスジェニック雄ラットを表わす）。統計学は、スチューデント両側検定で行い；平均は±ｓ．ｅ．ｍ．で表わされる。
【図９】３週間の処理の後の混合物２の足どりに対するポジティブ効果（白いバーは流れるような足どりで歩く各群における雄ラットの百分率を表わし；グレイのバーは流れるようではない足どりを表わし；黒いバーは無能力を表わす）。統計学は、スチューデント両側検定で行われる。
【図１０】慢性ＯＸＡＬＰＮモデルにおける抗アロディニア効果。青はコントロール動物のアセトン試験における反応時間を示し、赤はオキサリプラチン処理された動物を示し、緑色はオキサリプラチンおよび混合物２で処理された動物を示す。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＭＴまたは関連した障害を処置するための新規な治療アプローチを提供する。本発明は、既知の薬物の組み合わせから製造された新規な組成物およびこのような疾患の有効な矯正のためのそれらの新規な使用を開示し、そして任意の哺乳動物被検体において使用されうる。
【００４５】
本発明に関して、用語「ＣＭＴに関連した障害」は、遺伝的および後天性の両方の他の末梢神経障害を意味する。
【００４６】
ＣＭＴの主要な形態、ＣＭＴ１Ａは、ＰＭＰ２２遺伝子の重複により引き起こされる。ＰＭＰ２２は、末梢神経系における本質的にすべての有髄繊維の密な部分において発現されるミエリンの主要な成分である。ＰＭＰ２２タンパク質は、他の構造的ミエリンタンパク質Ｐ０と相互作用し、したがって、変化したＰＭＰ２２／Ｐ０タンパク質比は、ミエリン鞘の緻密化に影響を与えうる(Vallat et al., 1996; D'Urso et al., 1999)。ｉｎ−ｖｉｔｒｏ研究で証明されたとおり、ＰＭＰ２２タンパク質はＲｈｏ依存性方式で細胞伸展の調節にも関与しており、したがって軸索被覆に影響を与えることができる(Brancolini et al., 1999)。更に、ＰＭＰ２２はα６β４インテグリンと複合体を形成し、そして細胞外マトリックスとシュワン細胞の相互作用を媒介することができる(Amici et al., 2006; Amici et al., 2007)。更に、ＰＭＰ２２タンパク質の増加したレベルは、Ａｒｆ６で調節された形質膜エンドソーム回収経路を変えそして後期エンドソームにおけるＰＭＰ２２の蓄積をもたらすことができる(Chies et al., 2003)。過剰発現したＰＭＰ２２タンパク質は細胞内タンパク質ソーティングを乱しそしてシュワン細胞におけるタンパク質分解装置をオーバーロードすることも証明された(Notterpek et al., 1997; Tobler et al., 2002; Fortun et al., 2003; Fortun et al., 2006; Fortun et al., 2007; Khajavi et al., 2007)。最後に、ＰＭＰ２２は、細胞増殖およびプログラムされた細胞死のコントロールに直接関与しており(Sancho et al., 2001; Atanasoski et al., 2002) そして突然変異体ＰＭＰ２２タンパク質は、深部再構成(profound reorganization)および軸索イオンチャネルの異常な発現を促進することが示された(Ulzheimer et al., 2004; Devaux ＆ Scherer, 2005)。
【００４７】
結果として、用語「ＣＭＴに関連した障害」は、末梢障害、例えば、ＡＬＳ、毒性神経障害、特発性神経障害、糖尿病性神経障害、癌およびＨＩＶで誘導される神経障害、ギランバレー症候群を含む。
【００４８】
好ましい態様においては、ＣＭＴに関連した障害は、ＨＮＰＰ（圧迫性麻痺になりやすい性質を有する遺伝性神経障害）、ＣＭＴ１Ｂ、ＣＭＴ１Ｃ、ＣＭＴ１Ｄ、ＣＭＴ１Ｘ、ＣＭＴ２Ａ、ＣＭＴ２Ｂ、ＣＭＴ２Ｄ、ＣＭＴ２Ｅ、ＣＭＴ２−Ｐ０、重症脱髄神経障害ＤＳＳ（Dejerine-Sottas症候群）、ＣＨＮ（先天性ミエリン形成減少性神経障害）、ＣＭＴ４Ａ、ＣＭＴ４Ｂ１、ＣＭＴ４Ｂ２、ＣＭＴ４Ｄ、ＣＭＴ４Ｆ、ＣＭＴ４、ＡＲ−ＣＭＴ２Ａ、ＨＳＮ１を含む、脱髄神経障害などの神経障害を意味する。
【００４９】
本発明はＣＭＴ１Ａを処置するのに特に適している。
【００５０】
本明細書で使用された、障害の「処置」は、障害により引き起こされた痛みの治療、防止、予防、遅延または減少を含む。処置という用語は、特に疾患進行および関連した症状のコントロールを含む。
【００５１】
化合物という用語は、本願において特定的に名付けられた化合物、およびその任意の薬学的に許容されうる塩、水和物、エステル、エーテル、異性体、ラセミ体（racemates）、コンジュゲート、プロドラッグを意味する。
【００５２】
用語「組み合わせ」は、少なくとも２つの薬物が被検体に共投与されて生物学的効果を引き起こす処置を意味する。組み合わせた治療においては、少なくとも２つの薬物を一緒にまたは順次に一緒に又は別々に「投与することができる。少なくとも２つの薬物は、異なる経路およびプロトコールにより投与することができる。
【００５３】
本発明は、ＣＭＴまたはＣＭＴ関連障害は、薬物の特定の組み合わせにより処置されうる。更に詳しくは、本発明は、メチマゾールおよびピロカルピン化合物を、組み合わせにおいて使用してＣＭＴおよび関連した障害を処置することができることを示す。これに関して、実験結果は、メチマゾールとピロカルピンの組み合わせは、ラットシュワン細胞におけるＰＭＰ２２の遺伝子のＲＮＡ発現のレベルを有意に減少させることを示す。更に、ヒトＣＭＴ疾患をモデル化するＰＭＰ２２トランスジェニックラットは、毎日メチマゾールおよびピロカルピンを含有する組み合わせにより処置された。挙動終点の有意な改良が観察された。
【００５４】
ピロカルピン：（３Ｓ，４Ｒ）−３−エチル−４−[（３−メチルイミダゾール−４−イル）メチル]オキソラン−２−オン
この薬物、Ｃ１１Ｈ１６Ｎ２Ｏは、ｉ）頭および頸の癌のための放射線治療により引き起こされた唾液腺機能低下からの乾燥口腔の症状；およびｉｉ）シェーグレン症候群を有する患者の乾燥口腔の症状の処置のために認可された。
【００５５】
ムスカリンレセプターのアゴニスト、それは、平滑筋繊維収縮（消化管、眼、気管支）を引き起こし、汗、唾液、気管支および胃分泌を刺激する。更に、それは、両副交感神経様作用（血管拡張）神経節興奮経路を刺激する複雑な心臓血管作用を示す。
【００５６】
本発明者等は、ピロカルピン、ムスカリンレセプターのアゴニストは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏでシュワン細胞におけるＰＭＰ２２タンパク質の発現を減少させることを証明した。本発明者等は、ピロカルピンによるムスカリンレセプターの刺激は、おそらく、複雑なセットの分子機構により、反対の方式でミエリン関連タンパク質マーカーの発現を調節するＥｒｋ／Ａｋｔ活性の細胞内バランスにおいて、より顕著なＥｒｋシグナリングにシフトさせる、ということを提唱する(Ogata et al., 2004)。
【００５７】
理論により束縛されるものではないが、ムスカリンレセプターの刺激は、いくつかの随伴する機構によりＡｋｔおよびＥｒｋキナーゼの活性を改変することができるということが推定される(Ma et al., 2004; Anger et al., 2007)。例えば、ムスカリンレセプターは、ＰＫＣによるＩＲＳ−１の阻害性チロシン脱リン酸化または阻害性セリンリン酸化を促進することによりＩＧＦ−１によるシグナリングを選択的にブロックすることができるが、ＰＤＧＦレセプターについてはできない。さらにまた、ムスカリンレセプターは、Ｓｒｃ様Ｆｙｎキナーゼを介するＥＲＫジグナリグの細胞内トランスアクチベーションを媒介することができ；その上、アデニル酸シクラーゼの活性を減少させることにより、ムスカリンレセプターは、ＰＫＡ媒介される機能によっても、Ａｋｔ／Ｇｓｋ−３βおよびＥｒｋキナーゼの機能的調節に関与している可能性がある。最後に、ムスカリンレセプターの刺激は、ＡＭＰＫの活性化により、Ａｋｔの脱リン酸化を一過性に引き起こすことができ、かくしてβ−カテニンの細胞内プールを減少させることができることが証明された(Batty et al., 2004; King et al., 2006)。
【００５８】
結果として、他のムスカリンレセプターアゴニスト、例えば、セビメリン（ＣＡＳ番号１０７２３３−０８−９）、カルバコール（ＣＡＳ番号５１−８３−２）、メタコリン（ＣＡＳ番号５５−９２−５）およびベタンコール（ＣＡＳ番号６７４−３８−４）も使用することができる。
【００５９】
メチマゾール：１−メチル−３Ｈ−イミダゾール−２−チオン
メチマゾールは、ヨウ化物をヨウ素に転換しそして得られるヨウ化物分子のチロシンのフェノール環への取り込みを触媒する甲状腺ペルオキシダーゼの活性をブロッキングすることにより、新規な甲状腺ホルモンの産生を阻害する。したがって、メチマゾールは、甲状腺ホルモンレセプターの転写活性を効率的に減少させることができる。更に、メチマゾールは、プロスタグランジンＨシンターゼ活性を減衰させることによりプロスタグランジン産生を抑制することが報告されている(Zelman et al., 1984)。プロスタグランジンは、それらの同族ＧＰＣＲレセプターを介して、ミエリン関連タンパク質の発現を促進するＡｋｔシグナリング経路の活性を更に増加させることができる(Ogata et al., 2004; Castellone et al., 20069)。したがって、甲状腺ホルモン合成を阻害しそしてプロスタグランジン産生またはシグナリングに影響を与える化合物は、本発明で使用するのに特に有利である。
【００６０】
メチマゾールに作用様式により関連した他の化合物は、カルビマゾール（メチマゾールのプロドラッグ−ＣＡＳ番号２２２３２−５４−８）およびプロピルチオウラシル（ＣＡＳ番号５１−５２−５）およびアミオダロン（ＣＡＳ番号１９５１−２５−３）である。
【００６１】
実施例で開示されたとおり、化合物メチマゾールおよびピロカルピンは、ＣＭＴに対する改良された治療効果をもたらす組み合わさった作用を及ぼし、減少した副作用で有効治療用量を削減することを可能とする。
【００６２】
本発明の特定の態様は、ＣＭＴまたは関連した障害、特にＣＭＴ１Ａを処置するための組み合わせ治療であって、該組み合わせ治療がメチマゾールおよびピロカルピン化合物を含みそして少なくともこの組み合わせの活性を高めることができる第３の化合物を含む、組み合わせ治療にある。
【００６３】
本発明の他の特定の態様は、ＡＬＳを処置するための組み合わせ治療であって、該組み合わせ治療がメチマゾールおよびピロカルピン化合物を含みそして少なくともこの組み合わせの活性を高めることができる第３の化合物を含む、組み合わせ治療にある。
【００６４】
本発明の他の特定の態様は、毒性神経障害を処置するための組み合わせ治療であって、該組み合わせ治療がメチマゾールおよびピロカルピン化合物を含みそして少なくともこの組み合わせの活性を高めることができる第３の化合物を含む、組み合わせ治療にある。
【００６５】
本発明の他の特定の態様は、化合物メチマゾールおよびピロカルピンだけを使用する、ＣＭＴまたは関連した障害を処置するための治療にある。
【００６６】
本発明の他の特定の態様は、メチマゾールおよび／またはピロカルピンを少なくとも１つの追加の有効化合物と組み合わせて使用する、ＣＭＴまたは関連した障害を処置するための治療にある。好ましい態様においては、該少なくとも１つの追加の化合物は、表１に列挙された化合物の群から選ばれる。
【００６７】
本発明の他の特定の態様は、表１に開示された任意の薬物組み合わせを含む製品または組成物にある。
【００６８】
本発明の他の特定の態様は、表１に開示された任意の薬物組み合わせを含む、ＣＭＴまたは関連した障害を処置するための組み合わせ治療にある。
【００６９】
本発明の他の特定の態様は、表１に開示された任意の薬物組み合わせを含む、ＡＬＳを処置するための組み合わせ治療にある。
【００７０】
本発明の他の特定の態様は、表１に開示された任意の薬物組み合わせを含む、毒性神経障害を処置するための組み合わせ治療にある。
【００７１】
本発明に従う治療は、場合により任意の他の治療と共同して薬物組み合わせとして行われる。本発明に従う治療は、家庭で、個人病院で、診療所で、病院の外来患者部門でまたは病院で提供されることができ、その結果、医師は治療効果を綿密に観察することができそして必要とされる任意の調整をすることができる。
【００７２】
治療の期間は、疾患の段階、患者の年齢および状態、および患者が処置にいかに応答するかに依存する。
【００７３】
更に、追加の神経障害を発生するリスクのより高いヒト（例えば、遺伝的に例えば糖尿病にかかりやすいかまたは糖尿病を有するヒトまたは腫瘍学的処置下にあるヒト等）は、最終的神経障害応答を軽減または遅延させるための予防処置を受けることができる。
【００７４】
組み合わせの各成分の投薬量、投与の頻度および投与方式を独立にコントロールすることができる。例えば、１つの薬物は経口的に投与されうるが、第２の薬物は、筋肉内に投与することができる。組み合わせ治療は、休止期間を含むオンアンドオフ（on-and-off）サイクルで与えられることができ、その結果、患者の身体は、まだ予測されない副作用などのいずれかからの回復ヘのチャンスを有する。薬物は、１つの投与が両薬物を送達するように一緒に製剤化することもできる。
【００７５】
医薬組成物の製剤化
組み合わせの各薬物の投与は、他の成分と組み合わせて、末梢神経に到達するとＰＭＰ２２の高められた発現の効果を矯正することができる薬物の濃度をもたらす任意の適当な手段によることができる。
【００７６】
組み合わせの有効成分が純粋な化学品として投与されることが可能であるが、この状況では製剤とも呼ばれる薬学的組成物としてそれらを提供することが好ましい。可能な組成物は、経口、直腸、局所（経皮、頬および舌下を含む）または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与に適当な組成物を含む。
【００７７】
より普通には、これらの医薬製剤は、数投与単位を含有する「患者パック」または、単一パッケージ、通常ブリスターパツクにおいて明確な処置期間の間使用するための通常計量された単位用量の投与のための他の手段において患者に処方される。患者パックは、患者が通常の処方に欠けている患者パックに含有されたパッケージインサートに常にアクセスできるという点で、薬剤師はバルク供給からの薬剤の患者の供給を分割するという、従来の処方に対する利点を有する。パッケージインサートの包含は、医師の指示に対する患者の応諾を改良することが示された。したがって、本発明は、更に、医薬製剤のために適当な包装材料と組み合わせた、本明細書で前記した、医薬製剤を含む。このような患者パックにおいては、組み合わせ処理のための製剤の意図する使用は、処理のために最も適当に製剤を使用するのを助けるためのインストラクション、施設、設備、条件適応および／または他の手段により推論される。このような手段は、患者パックを、本発明の組み合わせによる処置のために使用するのに特に適当ならしめそして適合させる。
【００７８】
薬物は、任意の適当な担体物質中に任意の適切な量で含有され得、そして組成物の全重量の１〜９９重量％の量で存在することができる。組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、筋肉内）、直腸、皮膚、鼻、膣、吸入剤、皮膚（パッチ）または眼投与経路用に適当な剤形で提供されうる。したがって、組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、ヒドロゲルを含むゲル剤、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、硬膏剤、水薬剤(drenches)、浸透送達装置、坐剤、浣腸剤、注射可能剤、移植片、噴霧剤またはエアゾル剤の形態にあることができる。
【００７９】
薬学的組成物は、慣用の製薬学的実施によって製剤化されうる(例えば、Remington: The Science and Practice of pharmacy(20th ed), ed. A.R.Gennaro, Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J.C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York)。
【００８０】
本発明にしたがう薬学的組成物は、投与すると実質的に直ちに有効薬物を放出するかまたは投与後の任意の所定の時間にまたは所定の時間の期間放出するように製剤化されうる。
【００８１】
コントロールされた放出製剤は、（ｉ）延長された時間の期間にわたって身体内に薬物の実質的に一定の濃度を作り出す製剤；（ｉｉ）所定の遅延時間の後に延長された時間の期間にわたって身体内に薬物の実質的に一定の濃度を作り出す製剤；（ｉｉｉ）有効薬物物質の血漿レベルのばらつきと関連した望ましくない副作用の最小化を伴って、身体における相対的に一定の有効薬物レベルを維持することにより、所定の時間の期間薬物作用を持続させる製剤；（ｉｖ）例えば、コントロールされた放出組成物を、疾患のある組織もしくは器官に隣接して空間的に配置するかまたは疾患のある組織もしくは器官に空間的に配置することにより薬物作用を局所化する製剤；および（ｖ）薬物を特定のターゲット細胞型に送達するように担体または化学的誘導体を使用することにより薬物作用をターゲティングする製剤を含む。
【００８２】
コントロールされた放出製剤の形態にある薬物の投与は、薬物が、単独でまたは組み合わせにおいて、（ｉ）狭い治療指数（即ち、有害な副作用または毒性反応をもたらす血漿濃度と治療効果をもたらす血漿濃度との差が小さい；一般に治療指数ＴＩは、５０％平均致死量（ＬＤ５０）対５０％平均有効量（ＥＤ５０）の比として定義される）；（ｉｉ）胃腸管における狭い収吸ウインドー；または（ｉｉｉ）血漿レベルを治療レベルに維持するために１日に頻繁に投与することが必要なような非常に短い生物学的半減期、を有する場合に特に好ましい。
【００８３】
放出の速度が問題の薬物の代謝の速度より勝っているコントロールされた放出を得るために、多数のストラテジーのいずれかを遂行することができる。コントロールされた放出は、例えば種々のタイプのコントロールされた放出組成物およびコーティングを含む、種々の製剤パラメーターおよび成分の適切な選択により得られうる。かくして、薬物は、適切な賦形剤により、投与されるとコントロールされた方式で薬物を放出する薬学的組成物（一単位または多数単位錠剤またはカプセル組成物、油溶液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル剤、マイクロスフェア剤、ナノ粒子、パッチ剤およびリポソーム剤）に製剤化されうる。
【００８４】
経口用途のための固体剤形
経口用途用の製剤は、無毒性の薬学的に許容されうる賦形剤との混合物において有効成分（１つまたは複数）を含有する錠剤を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、スクロース、微結晶セルロース、バレイショデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム）；顆粒化剤および崩壊剤（例えば、微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、バレイショデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギネートまたはアルギン酸）；結合剤（例えば、アラビアゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール）；および滑剤、スベリ剤(glidants)および接着防止剤（例えば、ステアリン酸、シリカまたはタルク）であることができる。他の薬学的に許容されうる賦形剤は、着色剤、矯味・矯臭剤、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤等であることができる。
【００８５】
錠剤は、コーティングされていなくてもよく、または錠剤は、場合により胃腸管における崩壊および収吸を遅延させ、それにより、より長い期間にわたり持続した作用を与えるために既知の技術によりコーティングされていてもよい。コーティングは、所定のパターンにおいて（例えば、コントロールされた放出製剤を達成するために）有効薬物物質を放出させるのに適合することができ、またはコーティングは、胃を通過した後まで有効薬物物質を放出しないように適合させることができる（腸溶コーティング）。コーティングは、糖衣、フイルムコーティング（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコールおよび／またはポリビニルピロリドンに基づく）または腸溶コーティング（例えば、メタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、ポリビニルアセテートフタレート、シェラックおよび／またはエチルセルロースに基づく）であることができる。時間遅延物質、例えばグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを使用することができる。
【００８６】
固体錠剤組成物は、望まれない化学変化（例えば、有効薬物物質の放出前の化学的分解）から組成物を保護するのに適合したコーティングを含むことができる。コーティングは、Encyclopedia of Pharmaceutical Technologyに記載の方法と同様な方法で固体剤形上に適用されうる。
【００８７】
２つの薬物は、錠剤において一緒に混合され得、または分配されうる。例えば、第１薬物は錠剤の内側に含有されそして第２薬物は外側にあり、それにより第２薬物の実質的部分は第１薬物の放出前に放出される。
【００８８】
経口用途用の製剤は、そしゃく錠としてまたは有効成分が不活性固体希釈剤（例えばバレイショデンプン、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合されている硬ゼラチンカプセル剤、または有効成分が水または油媒体、例えば液体パラフィンまたはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセル剤として提示されることもできる。散剤および顆粒剤は、慣用の方法で錠剤およびカプセル剤下の上記した成分を使用して調製されうる。
【００８９】
経口用のコントロールされた放出組成物は、例えば有効薬物物質の溶解および／または拡散をコントロールすることにより有効薬物を放出するように構成されうる。
溶解または拡散コントロールされた放出は、薬物の錠剤、カプセル剤、ペレット剤または顆粒製剤の適切なコーティングによりまたは薬物を適切なマトリックス中に配合することにより達成されうる。コントロールされた放出コーティングは、上記した１種以上のコーティング物質および／または例えばシェラック、ミツロウ、グリコワックス、キャスターワックス、カルナウバロウ、ステアリルアルコール、グリセリルモノステアレート、グリセリルジステアレート、グリセロールパルミトステアレート、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、セルロースアセテートブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３−ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、および／またはポリエチレングリコールを含むことができる。コントロールされた放出マトリックス製剤においては、マトリックス材料は、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバロウおよびステアリルアルコール、カルボポール９３４、シリコーン、グリセリルトリステアレート、メチルアクリレート−メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンおよび／またはハロゲン化フルオロカーボンを含むこともできる。
【００９０】
特許請求の範囲に請求された組み合わせの薬物の１種以上を含有するコントロールされた放出組成物は、浮遊錠剤またはカプセル剤（即ち、経口投与されると、ある長さの時間胃内容物の頂部に浮遊する錠剤またはカプセル剤）の形態にあることもできる。薬物（１つまたは複数）の浮遊錠剤製剤は、薬物（１つまたは複数）と賦形剤および２０〜７０％ｗ／ｗの親水コロイド、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースの混合物を顆粒化することにより調製されうる。次いで得られた顆粒剤を錠剤に圧縮成形することができる。胃液と接触すると、錠剤は、その表面近くに実質的に水不透過性ゲルバリアーを形成する。このゲルバリアーは、１より低い密度を維持するのを助けて、それにより錠剤が胃液中に浮遊したままであることを可能とする。
【００９１】
経口投与用の液剤
水の添加により水性懸濁剤の調製に適当な散剤、分散可能な散剤または顆粒剤は、経口投与用の便利な剤形である。懸濁剤としての製剤は、分散化剤もしくは湿潤剤、懸濁化剤および１種以上の保存剤との混合物中の有効成分を与える。適当な懸濁化剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等である。
【００９２】
非経口組成物
薬学的組成物は、慣用の無毒性の薬学的に許容されうる担体および佐剤を含有する剤形、製剤においてまたは適当な送達装置または移植片により注射、注入または移植（静脈内、筋肉内、皮下等）により非経口的に投与することもできる。このような組成物の製剤化および調製は、薬剤の分野の当業者には周知である。
【００９３】
非経口的用途用の組成物は、単位剤形において（例えば、一回投与アンプルにおいて）または数用量を含有しそして適当な保存剤を加えることができる（下記参照）バイアルにおいて提供されうる。組成物は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、注入装置、または移植用の送達装置の形態にあることができるか、またはそれは、使用前に適当な水または他の適当なビヒクルにより再構成されるべき乾燥散剤として提供されうる。有効薬物（１つまたは複数）とは別に、組成物は、適当な非経口的に許容されうる担体および／または賦形剤を含むことができる。有効薬物（１つまたは複数）は、コントロールされた放出のためにミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム等の中に含ませることができる。組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定剤、ｐＨ調節剤および／または分散化剤を含むことができる。
【００９４】
本発明に従う薬学的組成物は、無菌注射に適当な形態にあることができる。このような組成物を調製するために、適当な有効薬物（１つまたは複数）を、非経口的に許容されうる液体ビヒクル中に溶解または懸濁させる。なかでも、使用することができる許容されうるビヒクルは、水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウムもしくは適当な緩衝剤により適当なｐＨに調節された水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。水性製剤は、１種以上の保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチルまたはプロピル）を含有することもできる。薬物の１つが水に僅かにしか溶解しない場合には、溶解増強剤または可溶化剤を加えることができ、または溶媒は１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコール等を含むことができる。
【００９５】
コントロールされた放出非経口組成物は、水性懸濁剤、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁性ミクロスフェア、油溶液剤、油懸濁剤または乳剤の形態にあることができる。あるいは、有効薬物（１つまたは複数）は、生物適合性単体、リポソーム、ナノ粒子、移植片または注入装置中に含ませることができる。ミクロスフェアおよび／またはマイクロカプセルの調製に使用するための物質は、例えば、生物分解性／生物浸食性ポリマー、例えばポリガラクチン、ポリ−（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）である。コントロールされた放出非経口製剤を製造するときに使用することができ生物適合性担体は、炭水化物（例えばデキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン）、リポタンパク質または抗体である。移植片に使用するための物質は、非生物分解性（例えばポリジメチルシロキサン）または生物分解性（例えば（ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸）またはポリ（オルトエステル）であることができる。
【００９６】
直腸組成物
直腸用途のために、組成物用の適当な剤形は、坐剤（乳剤または懸濁剤型）および直腸ゼラチンカプセル（溶液剤または懸濁剤）を含む。典型的な坐剤製剤においては、有効薬物（１つまたは複数）は、適切な薬学的に許容されうる坐剤基材、例えば、カカオ脂、エステル化脂肪酸、グリセリン化ゼラチン、およびポリエチレングリコールのような種々の水溶性または水分散性基剤と組み合わされる。種々の添加剤、エンハンサーまたは界面活性剤を配合することができる。
【００９７】
経皮および局所組成物
薬学的組成物は、ミクロスフェアおよびリポソームを含む普通に無毒の薬学的に許容されうる担体および賦形剤を含有する剤形または製剤において経皮収吸のために皮膚に局所的に投与することもできる。製剤は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、リニメント剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、溶液剤、懸濁剤、スティック剤、噴霧剤、ペースト剤、硬膏剤、および他の種類の経皮薬物送達システムを含む。薬学的に許容されうる担体または賦形剤は、乳化剤、酸化防止剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、浸透増強剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、香料および皮膚保護剤を含むことができる。
【００９８】
乳化剤は、天然に存在するゴム（例えば、アラビアゴムまたはトラガントゴム）であることができる。
保存剤、湿潤剤、浸透増強剤は、パラベン、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルおよび塩化ベンザルコニウム、グリセリン、プロピレングリコール、尿素等であることができる。
【００９９】
皮膚に対する局所投与用の上記した薬学的組成物は、処置されるべき身体の部分へのまたは該部分の近くへの局所的投与と一緒に使用されることもできる。組成物は、直接の適用に適合させることができ、または特定の薬物送達装置、例えば包帯剤、または替わるものとして硬膏剤、パッド剤、スポンジ剤、ストリップ剤または他の形態の適当な柔軟な材料による適用に適合させることができる。
【０１００】
投薬量および処置の期間
組み合わせの薬物は、同じまたは異なる製剤において同時に投与されうるかまたは順次に投与されうることが認識されるであろう。好ましい態様において、薬物は、同じ賦形剤または担体中に一緒に製剤化されうる。順次に投与される場合に、第２（または追加の）有効成分の投与における遅延は、有効成分の組み合わせの有効な効果の利点を失うようなものであるべきではない。この説明にしたがう組み合わせのための最小要件は、組み合わせが、有効成分の組み合わせの有効な効果の利点を伴う組み合わせた使用を意図するべきであるということである。組み合わせの意図した使用は、本発明に従う組み合わせを使用するのを助けるための施設、設備、適応物および／または他の手段により推測されうる。
【０１０１】
本発明の主題である治療的に有効量の２種以上の薬物は、ＰＭＰ２２遺伝子の増加した発現の効果を減少させるため、ＣＭＴ１Ａ疾患を発生するリスクを防止または減少させるため、一旦ＣＭＴ１Ａ疾患臨床的に明らかになってもＣＭＴ１Ａ疾患の進行を止めるかまたは遅くするため、および神経障害事象が最初にまたはその後に起こるリスクを防止または減少させるために有用な医薬の調製のために一緒に使用されうる。
【０１０２】
本発明の有効薬物は、例えば１日に２回または３回分割された用量で投与されうるけれども、組み合わせにおける各薬物の単一日用量が好ましく、単一薬学的組成物単位剤形）おけるすべての薬物の単一日用量が最も好ましい。
【０１０３】
投与は、数日から数年間毎日１〜数回であることができ、そして患者の一生の間であることさえできる。慢性的にまたは少なくとも周期的に反復する長期投与が大抵の症例で指示されるであろう。
・用語「単位剤形」は、ヒト被検体のための単位投薬量(unitary dosage)として適当な物理的に分離した単位（例えばカプセル剤、錠剤またはローディングされた注射器シリンダー）を指し、各単位は、必要な薬学的担体とともに、所望の治療効果を生じるように計算された必要な所定の量の有効物質（１つまたは複数）を含有する。
【０１０４】
単位投薬量のための好ましい組み合わせにおける各薬物の量は、処置されるべきヒトの一般的健康状態を考慮して、投与方法、患者の体重および年齢、ＣＭＴ１Ａ疾患により引き起こされた神経障害損傷の重症さまたは潜在的副作用のリスクを含むいくつかのファクターに依存する。
【０１０５】
更に、特定の患者に関するゲノム薬理学（薬物動態学、薬力学または治療の効能プロフィル）情報が使用される投薬量に影響を与えることができる。
【０１０６】
より高い投薬量が必要でありうる特に障害性のＣＭＴ疾患症例に応答するとき、またはより低い投薬量が選ばれるべき子供を処置するときを除いて、組み合わせにおける各薬物の好ましい投薬量は、通常、長期維持処置のために通常処方されたまたは多数の相３臨床的研究において安全であることが証明された範囲を超えない用量の範囲内にある。
例えば、
・メチマゾールでは、経口的に摂取されるならば１日当たり約０．５〜約１５mg。
局所的に投与されるならば、特定の用量が選ばれるべきである。
・ピロカルピンでは、経口的に摂取されるならば１日当たり約０．１〜約２０mg。
最も好ましい投薬量は、長期維持処理のために通常処方された量の１％〜１０％の量に相当する。
【０１０７】
実際に投与される薬物の量は、処置されるべき状態（１つまたは複数）、投与されるべき正確な組成、個々の患者の年齢、体重および応答、患者症状の重症度および選ばれた投与経路を含む関連した状況(relevant circumstances)に照らして、医師により決定される。したがって、上記投薬量範囲は、本明細書における教示のための一般的手引きおよび支持を与えることを意図するが、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１０８】
治療スキーム、投薬量および投与経路
以下に、ヒトにおける薬物組み合わせの投薬量（投与経路において異なる）を説明する。
【０１０９】
メチマゾールおよびピロカルピン
１−単一薬学的組成物として経口投与される：数ヶ月間経口的に毎日メチマゾール約０．５〜約１５mgおよびピロカルピン約０．１〜約２０mg、組成物中の両薬物の最も好ましい投薬量は０．６〜３５mg／単位（１日当たり）の範囲にある。
２−数ヶ月間経口的に同時に投与される：数ヶ月間経口的に毎日メチマゾール約０．１〜約１５mgおよびピロカルピン約０．０２〜約２０mg、組成物中の両薬物の最も好ましい投薬量は１．０２〜３５mg／単位（１日当たり）の範囲にある。
３−数ヶ月間に同時に投与される：数ヶ月間経口的に毎日メチマゾール約０．０５〜約１５mgおよびピロカルピン約０．０１〜約２０mg、組成物中の両薬物の最も好ましい投薬量は０．０６〜３５mg／単位（１日当たり）の範囲にある。
【０１１０】
本発明で開示された投薬量の中の任意の組み合わせにおけるこの薬物の投薬量は、男性または女性の処置のために提唱される製剤において異なることができる。
【０１１１】
本発明の追加の局面および利点は、説明のためのみであると考えられるべき下記の実験の節に開示される。
【０１１２】
実施例１
Ｉ．ｉｎ−ｖｉｔｒｏ実験
市販されているラット初代シュワン細胞
ラットシュワン細胞（ＳＣ）初代培養物(Sciencell # R1700)のバイアルを解凍しそしてポリ−Ｌ−リシンでプレコートされた７５cm2フラスコ中で「Sciencellシュワン細胞培地」（Sciencell # R1701からの基本培地）中に１００００細胞／cm2の密度で播種した。培養培地は、シュワン細胞の増殖を促進するための、基本培地、５％ウシ胎仔血清(3H-Biomedical AB # 1701-0025)、１％シュワン細胞増殖サプリメント（3H Biochemical AB # 1701-1752)、１％ゲンタマイシン（Sigma # G1397）および１０μMのフォースコリン(Forskolin(Sigma # F6886))からなる。
【０１１３】
コンフルーエンシー（confluency）に達した後（細胞バッチに依存して４〜１０日）シュワン細胞を、穏やかな攪拌または接着性繊維芽細胞からのＳC単離を可能とするｔｈｙ１．１イムノパニング(thy1.1 immunopanning)により精製して、少なくとも９５％純度の培養物を産生する。次いでＳＣを計数し（トリパンブルー法）そして同じＳＣ培地中にポリ−Ｌ−リシンでプレコートされた７５cm2フラスコ中に播種する。コンフルーエンシーにおいて、細胞をすすぎ、トリプシン処理し(Invitrogen# 15400654から希釈されたトリプシン−ＥＤＴＡ1x)、カルシウムおよびマグネシウムなしにＰＢＳ中に希釈された）、計数しそして、ＦＢＳ５％、細胞増殖サプリメント（ＣＧＳ）１％、４０μg／mlゲンタマイシンおよび４μMフォースコリンを有するＳｃｉｅｎｃｅｌｌシュワン細胞培地中で１２ウエルディッシュ（１４００００細胞／ウエル）においてプレート培養した。
【０１１４】
注文品ラット初代シュワン細胞
初代シュワン細胞培養物（ＳＣ）は、スプレーグ−ドーリー新生ラット（Ｐ０とＰ２間）坐骨神経から確立される。すべての新生ラットを犠牲にそしてペトリ皿に単離する。解剖を無菌条件下に行う。
【０１１５】
背側皮膚を後脚および下部胴から除去する。坐骨神経を単離しそして、1％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液(それぞれ、５０UI／mlおよび５０μg／ml、Invitrogen # 15070)およびウシ血清アルブミン(BSA, Sigma A6003)を補充された氷冷Leibovitz(L15,Invitrogen #11145)を入れた培養ディッシュに移す。ラットにつき両神経を氷冷Ｌ１５を入れた１５mlチューブに移す。次いでＬ１５培地を除去しそして１０mg／mlのコラゲナーゼ（Sigma #A6003）を有するＤＭＥＭ（Invitrogen # 21969035）２．４mlにより置き換える。神経を３７℃で３０分間この培地中でインキュベーションする。次いで培地を除去しそして両神経を、カルシウムおよびマグネシウムなしのＰＢＳ(Invitrogen# 2007-03)中に希釈されたトリプシン(１０％トリプシンＥＤＴＡ１０ｘ，Invitrogen # 15400054)により３７℃で２０分間はく離させる。反応を、ＤＮアーゼＩグレードＩＩ（０．１mg／ml Roche diagnostic # 104159）およびウシ胎仔血清（ＦＣＳ１０％、Invitrogen # 10270)を含有するＤＭＥＭの添加により停止させる。細胞懸濁液を１０mlピペットでトリチュレート（triturate）しそして５０mlチューブ中のフィルターを通過させた（２０μmナイロンメッシユフィルター、Fishersを有するSwinnex 13mm フィルターユニット、Milipore)。細胞懸濁液を室温（ＲＴ）で１０分間３５０gで遠心しそしてペレットを、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ中に懸濁させる。細胞を計数し（トリパンブルー法）そして５．１０５〜１０６細胞／ディッシュの密度でFalcon 100mm Primaria組織培養プレートに播種する。
【０１１６】
１日の培養の後、培地をＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０μMのシトシンｂ−Ｄ−アラビノフラノシド（Sigma # C1768）と取り換える。４８時間後、培地を除去しそして細胞をＤＭＥＭで３回洗浄する。次いで、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２μMのフォースコリン（Sigma # F6886）および１０μg／mlのウシ下垂体抽出物(PEX,Invitrogen # 13028)からなるＳＣ増殖培地を加える。この培地を２〜３日毎に取り換える。
【０１１７】
８日の培養後に（細胞バッチに依存して４〜１０日）、シュワン細胞はコンフルエンシーに達しそして大量の汚染性繊維芽細胞を含有する培養物をｔｈｙ１．１イムノパニング法により精製する。この精製の後、細胞を、ポリ−Ｌ−リシンでプレコートされた７５cm2フラスコ中で１００００細胞／m2で増殖培地中に懸濁させる。それらがコンフルーエンシーに達すると、細胞をすすぎ、トリプシン処理し（トリプシン−ＥＤＴＡ）、計数しそして１２ウエルディッシュ中でプレート培養する（１０００００細胞／ウエル）。
【０１１８】
薬物インキュベーション
細胞が１２ウエルディッシュ中でプレート培養されて後、培地を、１％のＮ２サプリメント（Invitrogen # 17502）、１％Ｌ−グルタミン（Invitrogen # 25030024)、２．５％ＦＢＳ（Sciencell # 0025）、０．０２mg／mlのコルチコステロン(Sigma # C2505)、４μMフォースコリンおよび５０μg／mlのゲンタマイシンを補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２（Invitrogen # 21331020）の混合物からなる規定された培地により取り換える。ＳＣ分化を促進するために、増殖因子はこの培地には加えられない。
【０１１９】
２４時間後、培地を、１％インスリン−トランスフェリン−セレン−Ｘ（ITS, Invitrogen # 51300）、１６μg／mlのプトレシン(Sigma # P5780)、０．０２μg／mlのコルチコステロンおよび５０μg／mlのゲンタマイシンを補充された規定された培地により取り換える。この工程で、プロゲステロンもフォースコリンも培地中に存在しない。
【０１２０】
１日後、初代シュワン細胞を２４時間薬物により刺激する(３ウエル／条件)。各化合物の調製は、細胞培養培地に添加するすぐ前に行われる。
【０１２１】
ピロカルピン（SIGMA）を、１０μM〜１０nM濃度範囲で初代シュワン細胞において試験し、メチマゾール（SIGMA）は１０μM、１μM、１００nMおよび１０nMで試験した。
【０１２２】
薬物を、１％インスリン−トランスフェリン−セレン−Ｘ（ITS, Invitrogen # 51300）、１６μg／mlのプトレシン、０．０２μg／mlのコルチコステロン、１０nMプロゲステロンおよび５０μg／mlのゲンタマイシンを有するＤＭＥＭ−Ｆ１２からなる規定された培地に加える。薬物刺激前および刺激期間中のフォースコリンの不存在は、アデニル酸シクラーゼ飽和を回避する。
【０１２３】
培養された神経鞘腫細胞
ラット神経鞘腫ＲＴ４−Ｄ６−Ｐ２Ｔ細胞系（ATCC # CRL-2468（商標））を、ＤＭＥＭ(ATCC # 30-2002)および１０％ＦＣＳ（invitrogen # 10106）中で解凍する。細胞を空気（９５％）−ＣＯ２（５％）の雰囲気中で加湿されたインキュベータ中で３７℃に維持する。継体数４において、細胞を３７℃で５〜１５分間トリプシン処理（＋１mlのトリプシン−ＥＤＴＡ、０．２５％−０．５３mM；Invitrogen）によりはく離させる。反応をウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％を含有するＤＭＥＭの添加により停止させる。トリパンブルー排除試験（Sigma）を使用するNeubauer 血球計算機においてウエルを計数する。懸濁液を１０mlピペットでトリチュレートし、次いで細胞を室温で１０分間３５０xgで遠心する。はく離した細胞のペレットを再懸濁させそして１２ウエルプレートに３００００細胞／mlの基準で播種し、４８時間後、培地を血清なしの培地（ＤＭＥＭ）により取り換える。１５時間後、ＲＴ４−Ｄ６Ｐ２Ｔウエルを、選ばれた濃度で細胞培養培地に加えられた薬物により刺激する。各個々の薬物（１つまたは複数）組み合わせの調製は、細胞培養培地へのその添加のすぐ前に行われる。
【０１２４】
定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）
定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、薬物刺激後のＰＭＰ２２ｍＲＮＡのレベルを、ＲＴ４−Ｄ６Ｐ２Ｔ細胞系におけるハウスキーピングＲＰＳ９ｍＲＮＡと相対的に比較する。
【０１２５】
薬物インキュベーションの８時間後、細胞を低温無菌化ＰＢＳですすぎ、各細胞サンプルからのトータルＲＮＡｓを、Qiagen RNeasyマイクロキット（Qiagen # 74004）を使用してＳＣから抽出しそして精製する。核酸を、１μlのＲＮＡサンプルを使用してナノドロップ分光光度計により定量する。ＲＮＡの品位は、BioAnalyzer(Agilent)装置により決定する。
【０１２６】
ＲＮＡｓを標準プロトコールにしたがいｃＤＮＡに逆転写する。ＰＣＲ増幅のためのｃＤＮＡテンプレートは、２０μlの最終容積において、オリゴ（ｄＴ）の存在下に４２℃で６０分間SuperScript II逆転写酵素(Invitrogen # 18064-014)を使用して１００ngのトータルＲＮＡから合成する。
【０１２７】
ｃＤＮＡを、<<Light Cycler（登録商標）480>>システム(Roche Molecular Systems Inc.)を使用してＰＣＲ増幅に付す。各ｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅のために使用する前に５倍希釈する。このｃＤＮＡ２μlは、１０μlの最終容積において５μlのMasterミックスキット(Roche # 04-887301001)と共にＰＣＲ反応溶液に入れる。予備実験は、両シーケンスについて増幅プロセスの対数期において定量がなされることおよび反応効率がターゲットとハウスキーピング遺伝子間で同様であることを確実にする。
【０１２８】
Ｔａｑｍａｎケミストリーを使用して、ＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ分析を行った。Sigma-Aldrichからの５００nMの各プライマー（ＦおよびＲ）および２００nMのプローブＴａｑ１を使用することによりラットＰＭＰ２２（ＮＭ＿０１７０３７）の増幅によりＰＣＲ反応を行う。
【０１２９】
下記のＰＣＲ条件を使用する：９５℃で５分間の変性、次いで９５℃で１０秒、６０℃で４０秒、および７２℃で１０秒および４０℃で１分（４０増幅サイクル）。ＰＭＰ２２遺伝子発現の相対的レベルを、ターゲット遺伝子ＰＭＰ２２から発生した産物の量を比較するＣｔ法および薬物インキュベーションの８時間、２４時間および４８時間後のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるＰＭＰ２２発現分析にしたがって測定し、初代ラットシュワン細胞の上清を回収し、遠心しそして冷凍する。ＳＣをトリプシン−ＥＤＴＡで分離する。大多数の細胞が懸濁液中にあるやいなや、トリプシンを１０％ＦＣＳを有するＤＭＥＭを使用して中和する。
【０１３０】
細胞を有する上清を回収しそして遠心する。細胞のペレットをマイクロチューブ中に移し、ＰＢＳ中で１回洗浄しそして特定の溶液(AbCys # Reagent A BUF09B)で固定する。１０分後、細胞をＰＢＳで１回洗浄しそして４℃に保つ。
【０１３１】
細胞固定の５日後、異なるインキュベーション時間を有するすべての細胞調製物を下記のプロトコールを使用して標識する。
【０１３２】
細胞を５分間７０００rpmで遠心し、そしてペレットを、透過性化の溶液(AbCys # Reagent A BUF09B)中に懸濁させそして室温で１時間初代ＰＭＰ２２抗体(Abcam # ab61220,1/50)で標識する。次いで細胞を５分間７０００rpmで遠心し、そして細胞ペレットをＰＢＳ中で１回すすぐ。二次抗体を加え、室温で１時間Alexa Fluor488(ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Molecular Probes # A11008,1/100)にカップリングさせる。次いで細胞を５分間７０００rpmで遠心しそして細胞ペレットをＰＢＳ中で１回すすぐ。標識化は、室温で１時間のインキュベーションでAlexa Fluor488(ニワトリ抗ヤギＩｇＧ、Molecular Probes # A21467,1/100)にカップリングさせた三次抗体を加えて増加させる。次いで細胞をＰＢＳ中で１回すすぐ。なんらの抗体なしのコントロール（標識されていない細胞）を自己蛍光のレベルを決定するのに使用しそして光電子増倍管の感度に適合させる。二次抗体および三次抗体を有するが一次抗体を有していないコントロールを、抗体の非特異的結合を評価するのに使用する。
【０１３３】
データ取得および分析は、５０００の細胞に関してＦＡＣＳ ＡｒｒａｙサイトメーターおよびＦＡＣＳ Ａｒｒａｙソフトウエア(Becton Dickinson)により行われる。細胞容積（サイズ）と相関した前方散乱（ＦＳＣ）および細胞内部の複雑さ（粒状性）に依存する側方散乱（ＳＳＣ）を分析する。ＰＭＰ２２の発現について、トータル細胞内で分析を行いそしてポジティブ細胞の百分率を計算する。ポジティブ細胞は二次抗体を有するコントロールより高い蛍光強度を有する細胞である。
【０１３４】
ＳＣの数を定量するために、コントロール培地中の細胞を、抗体抗Ｓ１００プロテインを使用して分析する。
【０１３５】
細胞を下記のプロトコールにしたがって調製する：シュワン細胞を室温で１時間抗体抗Ｓ１００プロテイン(Dako # S0311,1/100)で染色する。この抗体をＰＭＰ２２免疫染色で述べたプロトコールにしたがって、しかし三次抗体とのインキュベーションなしに、標識する。
【０１３６】
結果
本発明者等は、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベル（図１）が初代シュワン細胞において有意に減少していること、およびピロカルピンの１μM用量は、最も重要なＰＭＰ２２ダウンレギュレーションを誘導することを観察した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００１；コントロールとは有意に異なる（ペアーワイズスチューデントｔ検定）。右では、ピロカルピンに２４時間暴露されて、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現レベルが、低い用量（１０nMおよび５０nM）においてすら初代シュワン細胞において有意にダウンレギュレーションされる。同様に、本発明者等は、ピロカルピン（１μM）が、２４時間のインキュベーションの後ＰＭＰ２２タンパク質発現レベルを、初代シュワン細胞において３８％、有意に減少させることを観察した。この効果は、４８時間のインキュベーションの後も依然として有意である（−１８％、ｐ＜０．００１）。
【０１３７】
他の実験において、薬物（表１に列挙された）を、８時間の期間ラット神経鞘腫細胞系とインキュベーションしそしてＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−Ｑ−ＰＣＲにより定量する。本発明者等は、個々の薬物として使用された、メチマゾール（０．１nm）およびピロカルピン（０．００１nm）はＰＭＰ２２ｍＲＮＡ発現レベルに対する有意な活性を及ぼさず、この発現レベルはそれらの組み合わせにより有意に減少させられることを観察した。これらの２つの薬物の相乗性は図２に示される。これらのデータは、選ばれた濃度でピロカルピンとメチマゾールの組み合わせが培養された神経鞘腫細胞におけるＰＭＰ２２遺伝子の発現を有意にダウンレギュレーションすることができるが、初代シュワン細胞においてより高い濃度で活性なピロカルピンおよびメチマゾールはこの系におけるこの遺伝子の発現のレベルを減少させないことを証明する。
【０１３８】
ＩＩ．ＣＭＴ動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ実験
本発明者等は、ＣＭＴトランスジェニックラットモデルでの治療効果について化合物および組み合わせを試験したところ、マウスＰＭＰ２２遺伝子の３つの追加のコピーを有するヘミ接合ＰＭＰ２２トランスジェニックラットは末梢神経および頭側神経における脱髄の症状を示す(Sereda et al., 1996; Grandis et al., 2004)。ｍＲＮＡレベルでは、ＣＭＴラットにおけるＰＭＰ２２の平均１．６倍の過剰発現は臨床的表現型と相関する。野生型遺伝子が疾患遺伝子に変わるＰＭＰ２２過剰発現の推定的閾値レベルは、ＰＭＰ２２遺伝子発現を減少させることを目的とした処理により達成するべき明白な「目標」を示す。
【０１３９】
このＣＭＴラットモデルは、臨床的観点からはヒトＣＭＴ１Ａ疾患の良好な近似である。成熟ＣＭＴラットは、ＣＭＴ１Ａ患者の値と同様な、即ち５０％未満の値、を有する運動神経伝導速度の遅速化を示す。坐骨神経刺激後、複合筋活動電位は、減少した振幅および脱同期化を示す。組織学的および電気生理学的変化が運動障害の明白な臨床的兆候に先行する(Sereda et al., 1996, 2003)。組織学的に顕著な筋萎縮により確認される軸索損失は、ヒトＣＭＴ１Ａ症状と合致している。
【０１４０】
ＣＭＴラットは、実験的ＣＭＴ１Ａ治療用のモデルとして既に使用されている(Meyer zu Hoerste et al. 2007)。ＣＭＴ１Ａ疾患のこのモデルにおいて、病理の明白なおよび隠された兆候（運動欠損症、特に電気生理学的及び組織特性の特定の変化および最後にＰＭＰ２２過剰発現のレベル）はＣＭＴ１Ａ患者でみられる兆候に最も近いと思われる。
【０１４１】
本発明者等は、ラットモデルで治療効果について化合物および組み合わせを試験した。実験群は、別々に両性の若いラットで形成される。ラットは、体重に基づく無作為化スケジュールにしたがって群に割り当てられる。いくらかの実験では、無作為化は、バーテストにおけるラットの性能に基づく。両性は、数値的には処理群に等しいかまたは処理群より大きい別々のコントロール同腹子群により表わされる。ラットは、薬物生物利用性に依存して３または６週間の期間、薬物で慢性的に処理される−Ａｌｚｅｔ浸透圧皮下ポンプ（DURECT Corporation Cupertino,CA）により強制的に供給されるかまたは注射される。
【０１４２】
増加する体重に用量を調節するために、動物の体重を１週間に２回測定する。処理投与のために浸透圧ポンプが選ばれるならば、薬物の用量は、ポンプ持続の期間（６週間）にわたりその年齢について予測された動物の評価された平均体重に基づいて計算される。ポンプは適切な麻酔プロトコールにより、必要ならば再移植される。
【０１４３】
挙動試験
各３週間または４週間、動物を挙動試験に付す。各試験は、同じ部屋でかつその日の同じ時間に同じ研究者により行われ；この均一性は全実験にわたり維持される。すべての処置および遺伝子型決定は、研究者について盲検化される。「バー試験」および「掴み強度」か、研究全体にわたり性能を検討するために主として使用された。バー試験のスケジュールは、動物の成長につれて変えることができる（例えば、学習によるバイアスを回避するために）。
【０１４４】
掴み強度のアッセイは、筋力、感受性の状態（例えば、痛みを伴う触覚は力の測定された値を変えることがある）、挙動成分（「誘因」）からなると思われる掴み性能の僅かな差の検出を可能とする。値は、前肢と後肢で異なりそして動物の年齢に大きく依存する。
【０１４５】
掴み強度試験は、動物が別々にその前脚またはその後脚により掴みをしっかりと握って離さない強度を測定する。強度を測定するための掴みを有する力量計を配置する(Force Gauge FG-5000A)。ラットは、ラットがその前脚またはその後脚で掴みを掴みそしてラットが掴みを離すまでラットを後方に穏やかに引っ張るように、実験者により保持される。動物が掴みを離すときに測定された力を記録する。
【０１４６】
動物当たり前脚力を測定する２つの引き続く実験および後脚力を測定する２つの引き続く実験を処理する；最大スコアのみ（前脚で１つおよび後脚で１つ）を記録する（Ｎにおいて）。
【０１４７】
バー試験
バー試験は、固定ロッドを掴み続けるラットの能力を評価する。筋肉の弱さを示すＰｍｐ２２ラットは、この試験で性能不足を示す(Sereda et al., 1996)。ラットを、ロッド（直径：２．５cm；長さ：５０cm;テーブルの上３０cm）の中央にその４つの脚を置く。実験を引き続いて行い；本発明者等の実験における試験の数（５または１０）および期間（３０または６０秒）は、動物のバッチに依存していた。試験におけるこの変動性は、実験の過程でＣＭＴラットの運動欠損の最善の検出に適合したスケジュールを決定するために導入された。
【０１４８】
性能指数を、各セッションで記録する。
−ロッド上に６０秒または３０秒保持するのに必要な試験の数。
−各試験でバー上で消費された平均時間（即ち、落下潜時(fall latency)）およびセッションでの平均。実験過程において、セッションは、ラットがバー上にカットオフ時間、即ち３０または６０秒間２回とどまった後終了する。カットオフ時間（３０または６０秒）の性能は、完了していない試験に割り当てられる。
−落下の数
【０１４９】
一般的健康評価
動物の体重、明白な兆候（毛の外観、体の姿勢、振せん）は実験全体にわたり監視される。評価スケールは、０＝正常、１＝異常を記録するために使用される。
【０１５０】
足どり
各ラットを５分間汚れなしの新規なラットケージ（寸法５５ｘ３３ｘ１８cm）において観察する。ラット足どりを４つのパラメーターで評価する。
−スコア０：正常な足どり（流れるような(fluid)）
−スコア１：異常な足どり（流れるようでないまたはラットは僅かなびっこを引く）
−スコア２：中程度の無能(incapability)（ラットは一方の脚を引きずり、そしてそれを直しそして歩くことができる）
−スコア３：重症の無能（ラットはその一方または両方の後脚を引きずるが、それ／それらを直すことができない）
【０１５１】
傾斜面試験
滑り装置は、０°（水平）から６０°までの角度で傾斜していることができる３０ｘ５０cmのプレキシガラス面を有していた。各ラットを、頭を上にした姿勢（ヘッドアップ方位）で２５°の角度の傾斜面に最初に置き、１分だけ離れた２つの試験を行う。３０分後、同じ実験を３５°の角度の傾斜面で行い、次いで４０°の角度の傾斜面で行う。この時間の間ラットをそのケージに戻した。面を各試験の後清浄にする。
【０１５２】
ラットの性能を４つの異なるスコアにより評価する：
−スコア０：滑りなし
−スコア１：僅かな滑り（一方または両方の脚）
−スコア２：中程度に滑る（４つの脚）が面の端部までは滑らない
−スコア３：ラットは面のまさにその最下部まで滑っている。
【０１５３】
電気生理学
適当ならば、ラットを電気生理学的評価に付す：感覚神経伝導速度(sensitive nerve conduction velocity)ならびに潜時および電位振幅を測定する。ＮＣＶ測定および電位獲得(potential acquisition)（皮下）を、増幅器、(AM System 1700および／またはEMG-UTC)、刺激装置(Havard apparatus 223)および獲得カードおよび獲得のためのソフトウエア(SPATOL)およびシグナル処理のためのソフトウエア（CALVISE）を備えたコンピュータからなるチェーンの助けにより行った。動物をケタミン／キサラジンを使用して麻酔しそして試験全体にわたりサーモスタットを備えたプレート上で３７℃に維持した（麻酔は必要に応じて補給された）。刺激性銀針電極を尾の近位部に挿入した。記録電極を尾の遠位部（刺激電極から４および６cm）において約１mmの皮膚を通して皮下に挿入した。一定の電流方形波刺激、期間が０．２秒、を秒当たり０．３の周波数で与えた。５．０００〜２０．０００倍に増幅された応答を可視化しそしてコンピュータに基づいたデータ獲得システムで収集した。潜時を、各波開始（ベースラインから最初に明らかに同定可能な偏位として定義された）で測定した。最も大きい偏位のピークからピークまでの振幅を計算して最大振幅を決定した。
【０１５４】
各記録について、少なくも１０回の同一刺激に対する平均応答に関して測定を行った。
感覚関連伝導速度(sensory related conduction velocity(SNCV)を、刺激カソード間の距離を２つの部位の刺激から得られた対応する潜時間の差で割ることにより計算した。
【０１５５】
組織学的測定
最後の試験（最後の日まで続けられている処理）が終わると、ラットを安楽死させた。野生型ラットおよびトランスジェニックラットの後足を切り離し、そして４％ホルマリン溶液中に浸漬することにより固定し、そして追加の２日間１０％ホルマリン溶液中に移した。水中で１５分間すすいだ後、次いでそれらを２６時間脱灰のための処理をした(Labonord Decalicifant rapide ｎ°3 # DC3_09128300)。次いで足を２つの片に横断方向に切断し、それらをオスミウム着色のために処理する。
【０１５６】
組織を１％四酸化オスミウム溶液(VWR, Osmium VIII oxide 0.5g # 20551.076)の上に２４時間つるし、次いで脱塩水で４〜６時間すすぐ。次いで組織を包埋の自動機械ートにおいて脱水し(VIP2000 Vertical, Bayer Diagnostics)そして古典的にパラフィン中に包埋した。
４μmの組織切片を引き続くキシレンおよびアルコール浴において脱水そして更なる分析のためにスライドに載せた(Pertex glue, # T/00911_MICROM)。
【０１５７】
像分析
６匹の動物からの切片を注意深く選んで同じ解剖学的レベル（趾接合部）を例示しそしてSaisam マイクロビジョンソフトウエア(Microvision InstrumentsによるArchimed pro(登録商標)1997-2000)とカップリングさせたOlympus 顕微鏡下に分析する。末梢神経を局所化しそして下記のとおり分析する：円形有髄繊維(circulary myelinated fibers)を計数する(神経繊維束少なくとも１５０繊維／動物)。有髄繊維の内周および同じ有髄繊維の外周に相当する軸索突起直径(cylindraxe diameters)を決定する。次いで、本発明者等は、野生型およびトランスジェニック動物の髄鞘厚さおよび軸索直径の分布を比較した。
【０１５８】
更に、本発明者等は、同じ神経切片の光学密度を測定して非有髄繊維含有率（オスミウム切片で見えず、それゆえ分析されない）がトランスジェニック動物でより高い（神経切片の全体的に青白い外観により反映される）かどうかを決定する。
【０１５９】
最後に、神経分析のために使用される以外の同じ切片に存在するすべての足筋肉を、手動で輪郭を描いて全体的筋肉表面を決定する。次いで本発明者等は、「筋肉含有率／切片表面」の比を計算した。
【０１６０】
坐骨神経を切除しそして重量測定のためおよび分子生物学および／または生化学アッセイのために使用する。（ＰＭＰ２２ｍＲＮＡのためのＲＴ−Ｑ−ＰＣＲおよびミエリンタンパク質定量のためのウエスタンブロット；アラキドン酸代謝物などの生化学的マーカーのためのCaymanのＥＩＡキット、ステロイドおよびアミンのためのＨＰＬＣ定量、一般的に使用されるプロトコールに従って行われるＣＮＴＦ、ＩＬ−６等のためおよび分析処理（薬物濃度測定）のためのＥＬＩＳＡ。
【０１６１】
後肢筋（ヒラメ筋）をサンプリングし、重量を測定し、急冷凍し(snap-frozen)、そして分析まで−８０℃に保存する（坐骨神経の場合と同じ）。
【０１６２】
結果
強制された供給により投与されたメチマゾール（０．３５mg／kg日用量）およびピロカルピン（０．２mg／kg日用量）は、処理手順全体にわたりバー試験性能を改善する（図３）が、化合物ＰＸＴ２５（比較のためにのみここに提示される）は、殆ど何らの改善も示さない。
【０１６３】
運動性能は、野生型（ＷＴ）群と比較してプラセボで処理された異なるＣＭＴ ＴＧラットにおいて平均して３倍少ない合格であった。メチマゾールおよびピロカルピンによる処理は、この実験ではＴＧ動物の改善を可能とし、効果は強制供給の８週間後で早くも統計的に有意となる。
【０１６４】
データは、これらの相対的に高い用量のメチマゾールおよびピロカルピンで処理されたＣＭＴラットは、プラセボ群と比較して有意によりよい性能となったことを示す。化合物ピロカルピンで処理された群は、ＷＴプラセボ群の性能のレベルと有意に異ならない性能のレベルを回復すらした。
【０１６５】
尾の遠位部で測定したＳＮＡＰは、ＴＧプラセボ群において有意に減少しており、これは脱髄による重要な軸索損失を反映している可能性がある。この電気生理学的パラメーターは、化合物Ａにより処理すると有意に改善されるが、図４、化合物Ｂで処理されたトランスジェニックラットのＳＮＡＰは、有意のための名目上の５％閾値に近付いている。
【０１６６】
この観察は、末梢神経のミエリン形成状態が測定可能に改善されないとしても、メチマゾールの作用が軸索損失を防止することができることを我々が推定することを可能とする。ピロカルピンの効果は、群内変動性のゆえにプラセボ群パラメーターとの差が統計的有意に達しなかったとしても、本質的に同じであると思われる。ＣＭＴ１Ａにおいて、（感覚神経活動電位）（ＳＮＡＰ）振幅は、より多く減少しそしてＳＮＡＰ期間はＣＭＴ２におけるよりも長い。ＣＭＴ１Ａにおける複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）およびＳＮＡＰ振幅の減少は、多分、脱髄および軸索機能不全の組み合わさった効果である(Bienfait et al., 2006)。
【０１６７】
研究の終わりに、形態学的分析を行った。後肢組織の測定は、坐骨神経およびヒラメ筋がコントロールＷＴラットと比較してプラセボで処理されたＣＭＴ雌ラットにおいて有意に減少していることを示す（図５）。
【０１６８】
これらの欠損は、化合物Ａ処理により完全に矯正されると思われる。：上記筋および神経の絶対質量は、コントロールＷＴラットにおけるよりも高くさえあるが、全体重は、プラセボ群（データは示されていない）と比較して、化合物Ａ群においてむしろ減少している。後肢筋および神経に対するピロカルピン処理の効果は、メチマゾールの効果より小さいと思われる。
【０１６９】
メチマゾール（４mkg／kg）およびピロカルピン（７mkg／kg）の５０倍低い用量の混合物１（表１）は、図６に示されたとおり１０週間の強制供給された処理の後雌ラットの足どりスコアを改善する。本発明者等は、６週間の処理の後ポジティブな傾向を観察した。
【０１７０】
下記の図は、３つの異なる挙動および電気生理学的試験における雄ラットに対するピロカルピン（７mkg／kg）；メチマゾール（４mkg／kg）、ミフェプリストン（４０mkg／kg）、ナルトレキソン（４mkg／kg）；バクロフェン（６０mkg／kg）およびソルビトール（２mg／kg）を含有する混合物２（表１）のポジティブな効果を示す。
【０１７１】
図７は、これらの用量での混合物２は、尾の神経電気的刺激の後ＣＭＴプラセボラットで見出された興奮性閾値の上昇を減少させることを示す。
図８は、バー試験での雄の性能に対するポジティブな効果を示し；４週間の処理の後、落下の数は減少しそしてロッドでの消費時間は増加する。
【０１７２】
図は、混合物２が３週間の処理の後雄ラットの足どり性能も改善し、流れるような足どりで歩くラットの百分率は、ＣＭＴプラセボラットと比較して処理されたラットで３５％増加することを示す。
【０１７３】
同様な結果が、他の組み合わせで得られそして結果の要約を表１に示す。
【表１】
【０１７４】
これらのデータは、ｉｎ ｖｉｖｏで、本発明の組み合わせおよび治療方式はＣＭＴの有効な処理を可能とすることができることを示す。
【０１７５】
ＩＩＩ．毒性神経障害のモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの効果
薬物処理または治療方式は、オキサリプラチン３mg／kgの最初の腹腔内注射の前の日（Ｄ−１）から最後の試験日の前の日（Ｄ１６）まで経口投与される。オキサリプラチン処理群に属する動物は、蒸留水を毎日投与される（１０ml／kg）。動物は、試験された処理および蒸留水を毎日朝の間投与されるが、これに対してオキサリプラチンは午後に投与される。
【０１７６】
試験日（即ち、Ｄ１、Ｄ４、Ｄ１０）の間、処理および蒸留水を試験の後に投与される。化合物およびビヒクル投与およびオキサリプラチン注射を含む、試験日（Ｄ４）に関して、処理および蒸留水は、試験後オキサリプラチンの注射の前に投与される。参照処理群からの動物は、試験日（Ｄ１、Ｄ４、Ｄ１０およびＤ１７）の間のみ投与される。
【０１７７】
低温アロディニア(cold allodynia)は、Ｄ１（オキサリプラチン３mg／kgの最初の注射の約２４時間後（オキサリプラチンの急性効果））、Ｄ４、Ｄ１０および（オキサリプラチンの慢性効果）およびＤ１７（処理の完了の１週間後のオキサリプラチンの残留効果）に熱的非侵害性刺激(non-nociceptive stimulation)に対する応答を測定すること（アセトン試験）により評価される。
試験は、参照の投与の２時間後アセトン試験を使用して行われる。
参照物質は、ガバペンチン、１００mg／kg、経口（１日１回×４試験日）。
【０１７８】
アセトン試験
低温アロディニアをアセトン試験により評価する。この試験において、後脚引っ込め(hind withdrawal)の潜時を、両後脚の足底表面にアセトンの滴を適用した後測定し（反応時間）そして応答の強度をスコア化する（低温スコア）。
【０１７９】
アセトンの冷却効果に対する反応時間は、アセトン適用後に２０秒（カットオフ）以内に測定する。アセトンに対する応答も下記の４ポイントスケールに等級別される：０（応答なし）；１（脚の速い引っ込め、払いのけ(flicking)）；２（脚の長期の引っ込めまたは顕著な払いのけ）：３（舐めまたは噛みを伴う脚の反復払いのけ）。ラットによる６試験を行う。各実験群について、結果は、±ＳＥＭと共に各ラットについて６つのスコアの和として定義された累積客観的スコアとして表わされる。最小スコアは０（６つの試験のいずれにも応答なし）でありそして最大可能なスコアは１８（６つの試験の各々に関して脚の反復払いのけおよび舐めおよび噛み）である。
【０１８０】
ガバペンチン：ソース：Zhejiang Chiral Medicine Chemicals,China
オキサリプラチン：ソース：Sigma,France
【０１８１】
結果
オキサリプラチンにおける混合物２の試験の結果を図１０に示す。混合物２は毒性薬物処理により誘導される神経障害から動物を保護することは明らかである。
【０１８２】
ＩＶ．ＡＬＳのモデルにおけるＩｎ ｖｉｖｏ効果
動物モデル
本発明者等は、筋萎縮性側索硬化症病理を模倣したＳＯＤ１Ｇ９３Ａラットモデル（Howland DS et al., 2002により発生された）を選んだ。このモデルは、脊髄、多くの脳領域および末梢組織における突然変異したＳＯＤ１遺伝子を過剰発現する(Howland DS et al., 2002）。このモデルの運動ニューロン疾患の発症は、約１１５日目であり（Howland DS et al., 2002）；それは後肢異常足どり(hind limb abnormal gait)として現れる。数日で、後肢の麻痺が生じる。
【０１８３】
実験手順
繁殖動物ＳＯＤ１Ｇ９３Ａをスプレーグ・ドーリー雌ラットと交配させることによりコロニーを得た。ヘテロ接合ＳＯＤ１Ｇ９３Ａラットは、ｈＳＯＤ１に特異的なプライマーで尾のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で同定された（Howland DS et al., 2002）。動物をコントロールされた照明（０５００〜１９００時に照明）および温度（２３±１℃）を有する部屋に保ち、そして食物および水を自由に摂取できるようにした。この研究におけるすべての動物処理は、動物医療のガイドライン標準にしたがって行われた。
【０１８４】
体重測定を毎週行い、そして挙動試験を６０日の年齢で開始しそして終点まで続けた。処理を５週間の年齢から経口または皮下の方法により毎日おこなった。
【０１８５】
観察試験：一般的局面の特徴付け
各ラットを５分間汚れなしの新規なラットケージ（寸法５５ｘ３３ｘ１８cm）において観察した。５つの異なるパラメーターを記録する。
【０１８６】
足どり（gait）
−スコア０：正常な足どり（流れるような(fluid)）
−スコア１：異常な足取り（流れるようでないまたはラットは僅かなびっこを引く）
−スコア２：中程度の無能(incapacity)（ラットは一方の脚を引きずり、そしてそれを直しそして歩くことができる）
−スコア３：重症の無能（ラットはその一方または両方の後脚を引きずるが、それ／それらを直すことができない）
【０１８７】
毛の様相
−スコア０：清浄および絹のような毛
−スコア１：立毛または汚れた毛
【０１８８】
震せん
−スコア０：震せんなし
−スコア１：震せん
【０１８９】
身体姿勢
−スコア０：正常
−スコア１：異常（平らになった(flattened)およびその背中を弓状に曲げる）
【０１９０】
後脚の姿勢
−スコア０：正常
−スコア１：後脚を広げる
【０１９１】
運動スコア試験：運動欠損の特徴付け
この試験は、ラットの３０秒以内に自分自身常態に戻して両側に回転する能力を評価する(立ち直り反射)を評価する(Gale. K et al, 1985)。
【０１９２】
ノンパラメトリックスコアリングシステムをこれらの基準にしたがって使用する(matsumoto A.et al, 2006; Thonhoff JR et al,2007)：
−スコア０：ラットは３０秒以内に両側から自分自身を立ち直らせることができない；
−スコア１：ラットは３０秒以内に一側のみから自分自身を立ち直らせることができない；
−スコア２：ラットは３０秒以内に両側から自分自身を立ち直らせることができるが、ケージの中で立つことができない；ラットは常に身体のある部分を引きずっている；
−スコア３：ラットは３０秒以内に両側から自分自身を立ち直らせることができ、ケージの中で立つことができないが、身体のある部分を引きずっていない；
−スコア４：ラットは３０秒以内に両側から自分自身を立ち直らせることができ、ケージの中で立つことができるが、可視機能欠損を有する；
−スコア５：ラットは３０秒以内に両側から自分自身を立ち直らせることができ、ケージの中で立つことができ、可視機能欠損を有していない。
【０１９３】
疾患の終点は、スコア０に決められ、ラットを次いで安楽死させる。
【０１９４】
傾斜面試験：運動欠損の特徴付け
滑り装置は、０°（水平）から６０°の角度で傾斜していることができる３０ｘ５０cmのプレキシガラス面を有していた。各ラットを、頭を上にした姿勢（ヘッドアップ方位）で２５°の角度の傾斜面に最初に置き、１分だけ離れた２つの試験を行う。３０分後、同じ実験を３５°の角度の傾斜面で行い、次いで４０°の角度の傾斜面で行う。この時間の間ラットをそのケージに戻した。面を各試験の後清浄にする。
【０１９５】
ラットの性能を４つの異なるスコアにより評価する：
−スコア０：滑りなし
−スコア１：僅かな滑り（一方または両方の脚）
−スコア２：中程度に滑る（４つの脚）が面の端部までは滑らない
−スコア３：ラットは面のまさにその最下部まで滑っている。
【０１９６】
金網試験：困難な状況における運動能力の特徴付け
金網を頂部で箱と接触させ（７０°の角度で）そして底部でテーブルの縁と接触させて置いた(Thonhoff JR et al, 2007)。各ラットを金網の底部に置き、そして箱の中には頂部にラットの同腹子を置くことにより上昇するための動機を与えられた。各ラットを１週間に１回訓練した（３試験）
記録されたパラメーターは金網の頂部にタッチするまでの潜時であった。
【０１９７】
オープンフィールド試験：運動活動の特徴付け
運動活動を、床上1cmおよび５cmに２つの軸に従う１６ホトセルビームを有するプレキシガラスボックス（４５ｘ４５ｘ３０cm、BIOSEB, Lyon, FranceによるActi-Traqck）において測定した。
【０１９８】
各ラットの自然に起こる活動および診査活動を３時間の間評価した。４つのパラメーターを記録した（トータル移動距離、立ち上がり(reariings)の数、移動した距離およびオープンフィールドの中心で過ごした時間の百分率）。
【０１９９】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロカルピンおよびメチマゾールまたはそれらのプロドラッグおよび、場合により薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項２】
シャルコー・マリー・トゥース病またはＣＭＴに関連した障害の処置のための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＣＭＴ１Ａを処置するための、ピロカルピンおよびメチマゾールまたはそれらのプロドラッグおよび、場合により薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項４】
同時にまたは順次に、被検体に一団にして投与するかまたは別々に投与するための、ムスカリンレセプターアゴニストおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤、またはそれらのプロドラッグを含む組み合わせ製品。
【請求項５】
ムスカリンレセプターアゴニストおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤またはそれらのプロドラッグ、および薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項６】
シャルコー・マリー・トゥース病またはＣＭＴに関連した障害、特にＣＭＴ１Ａを処置するための、請求項４または５に記載の製品又は組成物。
【請求項７】
ムスカリンレセプターアゴニストが、ピロカルピンまたはそのプロドラッグである、請求項４〜６のいずれかに記載の製品または組成物。
【請求項８】
甲状腺ホルモン合成の阻害剤が更にプロスタグランジンシグナリングにおける活性を示す、請求項４〜７のいずれかに記載の製品または組成物。
【請求項９】
甲状腺ホルモン合成の阻害剤がメチマゾールまたはそのプロドラッグ、例えばカルビマゾールである、請求項８に記載の製品または組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの追加の有効化合物を更に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製品または組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つ追加の有効化合物が、バクロフェン、ミフェプリストン、ソルビトール、ナルトレキソン、ラパマイシン、ケトプロフェンおよびフルルビプロフェンから選ばれる、請求項１０に記載の製品または組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つ追加の有効化合物が、バクロフェンまたはミフェプリストンである、請求項１０または１１に記載の製品または組成物。
【請求項１３】
メチマゾール、ピロカルピン、バクロフェン、ミフェプリストンおよびソルビトールを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製品または組成物。
【請求項１４】
メチマゾール、ピロカルピン、バクロフェン、ミフェプリストン、ソルビトールおよびナルトレキソンを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製品または組成物。
【請求項１５】
表１に開示された任意の薬物組み合わせを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製品または組成物。
【請求項１６】
メチマゾールおよびバクロフェンを含む、製品または組成物。
【請求項１７】
化合物を、同時にまたは順次に、一団にして投与または別々の投与のために組み合わせる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
被検体におけるＣＭＴの処置のためのムスカリンレセプターアゴニストおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤を含む組成物であって、該処置は患者がＣＭＴ１Ａを有するかどうかを決定するための工程を更に含む、組成物。
【請求項１】
ピロカルピンおよびメチマゾールまたはそれらのプロドラッグおよび、場合により薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項２】
シャルコー・マリー・トゥース病またはＣＭＴに関連した障害の処置のための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＣＭＴ１Ａを処置するための、ピロカルピンおよびメチマゾールまたはそれらのプロドラッグおよび、場合により薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項４】
同時にまたは順次に、被検体に一団にして投与するかまたは別々に投与するための、ムスカリンレセプターアゴニストおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤、またはそれらのプロドラッグを含む組み合わせ製品。
【請求項５】
ムスカリンレセプターアゴニストおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤またはそれらのプロドラッグ、および薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項６】
シャルコー・マリー・トゥース病またはＣＭＴに関連した障害、特にＣＭＴ１Ａを処置するための、請求項４または５に記載の製品又は組成物。
【請求項７】
ムスカリンレセプターアゴニストが、ピロカルピンまたはそのプロドラッグである、請求項４〜６のいずれかに記載の製品または組成物。
【請求項８】
甲状腺ホルモン合成の阻害剤が更にプロスタグランジンシグナリングにおける活性を示す、請求項４〜７のいずれかに記載の製品または組成物。
【請求項９】
甲状腺ホルモン合成の阻害剤がメチマゾールまたはそのプロドラッグ、例えばカルビマゾールである、請求項８に記載の製品または組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの追加の有効化合物を更に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製品または組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つ追加の有効化合物が、バクロフェン、ミフェプリストン、ソルビトール、ナルトレキソン、ラパマイシン、ケトプロフェンおよびフルルビプロフェンから選ばれる、請求項１０に記載の製品または組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つ追加の有効化合物が、バクロフェンまたはミフェプリストンである、請求項１０または１１に記載の製品または組成物。
【請求項１３】
メチマゾール、ピロカルピン、バクロフェン、ミフェプリストンおよびソルビトールを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製品または組成物。
【請求項１４】
メチマゾール、ピロカルピン、バクロフェン、ミフェプリストン、ソルビトールおよびナルトレキソンを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製品または組成物。
【請求項１５】
表１に開示された任意の薬物組み合わせを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製品または組成物。
【請求項１６】
メチマゾールおよびバクロフェンを含む、製品または組成物。
【請求項１７】
化合物を、同時にまたは順次に、一団にして投与または別々の投与のために組み合わせる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
被検体におけるＣＭＴの処置のためのムスカリンレセプターアゴニストおよび甲状腺ホルモン合成の阻害剤を含む組成物であって、該処置は患者がＣＭＴ１Ａを有するかどうかを決定するための工程を更に含む、組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５２４８７８（Ｐ２０１１−５２４８７８Ａ）
【公表日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１４０３３（Ｐ２０１１−５１４０３３）
【出願日】平成２１年６月１７日（２００９．６．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５７５４４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５３２９１
【国際公開日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【出願人】（５１０１４９４７１）
【氏名又は名称原語表記】ＰＨＡＲＮＥＸＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１７日（２００９．６．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５７５４４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５３２９１
【国際公開日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【出願人】（５１０１４９４７１）
【氏名又は名称原語表記】ＰＨＡＲＮＥＸＴ
【Ｆターム（参考）】
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