ドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤
【課題】ドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤を提供する。
【解決手段】トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤。
【解決手段】トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されメラニン産生が亢進した結果生じるものと考えられている。生体内において、色素メラニンは色素細胞（メラノサイト）内のメラノソームにおいて、前駆体であるチロシンから生合成される。このメラニン生合成に関わる酵素であるチロシナーゼに変異が生じると、皮膚、毛髪のメラニン色素の形成が異常となることが報告されている（非特許文献１参照）。
メラニン生合成におけるチロシナーゼの重要度の高さから、チロシナーゼは美白素材のターゲットとしても古くから注目されてきた。チロシナーゼはチロシンヒドロキシラーゼ活性、ドーパオキシダーゼ活性及びDHI活性を有し、チロシンを前駆体としたメラニン合成反応を触媒する。チロシナーゼ酵素活性はドーパオキシダーゼ活性を指標とすることができ、チロシナーゼ酵素活性阻害作用をもつメラニン産生抑制素材を評価する際にもその指標として用いられている（非特許文献２参照）。したがって、メラノサイト内ドーパオキシダーゼ活性を抑制することで、最終的な生合成産物であるメラニンの産出を抑制することができる。
従来から、チロシナーゼの活性を阻害してメラニン産生を抑制したり、産生したメラニンを減少させる物質の使用が検討され、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸、グルタチオン等に当該作用があることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
しかし、これらの物質には、メラニン産生抑制効果が十分でない等の問題がある場合もあり、未だ十分に満足できるものは得られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】King RA．Oetting WS．Hearing VJ．In Metabolic bases of inherited disease（Scriver CR．Beaudet AL．Sly WS．Valle D.，eds.)，McGraw-Hill，New York，4353-4392，1995
【非特許文献２】Wrathall JR．et al.，JCB 1973 57:406-423
【非特許文献３】美白戦略（南江堂）ＩＶ．，美白剤の薬理と臨床，ｐ９５−１１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制することができるドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニンの産生を抑制する美白剤および皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ある種の植物の抽出物がドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有することを見い出した。さらに、この抽出物を用いることで、優れたドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤を提供することができることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
本発明は、トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤、美白剤およびドーパオキシダーゼ活性抑制剤に関する。
【０００７】
本発明において、「美白（作用）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制することができる。また、本発明の美白剤および皮膚外用剤は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニンの産生を抑制することができ、美白効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤は、トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、コクリロ（Veratrum nigrum L.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）及びセネシオ グラシリス（Senecio gracilis）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する。
前記植物の抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制効果を有する。そのため、前記植物の抽出物を含有することで本発明の美白剤および皮膚外用剤は、皮膚におけるメラニンの産生を抑制することができ、美白効果を奏する。
【００１０】
本発明におけるトウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）は、センダン科（Meliaceae）に属する植物である。
【００１１】
本発明におけるソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）は、ショウガ科（Zingiberaceae）に属する植物である。
【００１２】
本発明におけるセネシオ グラシリス（Senecio gracilis）は、キク科（Asteraceae）に属する植物である。
【００１３】
本発明におけるコクリロ（Veratrum nigrum L.）はユリ科（Liliaceae）に属する植物である。
【００１４】
本発明において、前記植物の全ての任意の部分が使用可能である。例えば、上記植物の全木、または任意の部位（根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、果実、種子等）、およびそれらの組み合わせのいずれか１つまたは複数を使用することができる。
【００１５】
本発明において、トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）の抽出物を得るためには、前記植物の果実を用いるのが好ましく、トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）を基原植物として得られた生薬（川楝子（センレンシ））を用いることもできる。
【００１６】
本発明において、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）の抽出物を得るためには、前記植物の果実を用いるのが好ましく、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）を基原植物として得られた生薬（草果（ソウカ））を用いることもできる。
【００１７】
本発明において、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）の抽出物を得るためには、前記植物の根を用いるのが好ましい。
【００１８】
本発明において、コクリロ（Veratrum nigrum L.）の抽出物を得るためには、前記植物の根茎を用いるのが好ましく、コクリロ（Veratrum nigrum L.）を基原植物として得られた生薬（黒藜蘆（コクリロ）や藜蘆（リロ、レイロ））を用いることもできる。
【００１９】
本発明において用いる、前記植物の抽出物は、適当な溶媒を用いた常法の抽出方法によって調製することができる。
【００２０】
本発明において、前記植物の抽出物の調製に、上記植物をそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等、より精製したものを用いることもでき、また市販品を利用することもできる。上記植物又はその水蒸気蒸留物若しくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
抽出に用いる溶媒としては、通常植物成分の抽出に用いられるもの、例えば水、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、トルエン、クロロホルム、エーテル、酢酸エチル、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等が挙げられ、特に水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコールが好ましい。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。また抽出条件も通常の条件を適用でき、例えば上記植物を５〜８０℃で２時間〜６０日間浸漬又は加熱還流すればよい。上記植物の抽出物は、そのまま使用できるが、さらに適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留、活性炭処理等により活性の高い画分を分画して用いることもできる。
【００２２】
本発明において、前記植物の抽出物はそのまま用いてもよい。または、当該抽出物を希釈、濃縮または凍結乾燥した後、粉末またはペースト状に調製して用いることもできる。
【００２３】
前記植物の抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有する。これら植物の抽出物を有効成分として含有させることで、本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤が得られる。
本発明において、前記植物の抽出物はそのままドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤として用いてもよい。または、上記抽出物に、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤を加えて用いてもよい。この場合、これら植物の抽出物の量は特に制限されないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５重量％含まれるのが好ましく、０．０００１〜０．５重量％含まれるのが特に好ましい。
【００２４】
本発明において、「皮膚外用剤」とは、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品、等として皮膚に適用されるものを意味する。従って、その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、ファンデーション、軟膏、シート状製品等の形態が挙げられる。
本発明の皮膚外用剤には、前記抽出物の他、通常の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、前記以外の美白剤、高分子化合物、防腐剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等を適宜配合できる。
【００２５】
本発明の皮膚外用剤の使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ２当たり０．１μｇ〜５μｇ、液状製剤の場合、同じく０．１μｇ〜１０μｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
（製造例１）トウセンダンの抽出物の調製
トウセンダンを基原植物とする生薬センレンシ（川楝子）（新和物産社製）５０ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で３日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量３４３ｍＬ、蒸発残分３．０８ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、トウセンダン抽出物を調製した。
【００２８】
（製造例２）ソウカの抽出物の調製
ソウカを基原植物とする生薬ソウカ（草果）（新和物産社製）１５０ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２４８ｍＬ、蒸発残分２．５４ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、ソウカ抽出物を調製した。
【００２９】
（製造例３）セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）の抽出物の調製
セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）の根（American botanicals社より購入）４０ｇを細切し、５０％エタノール４００ｍＬを加え、室温で２２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２９８ｍＬ、蒸発残分１．７６ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）抽出物を調製した。
【００３０】
（製造例４）コクリロ（Veratrum nigrum L.）の抽出物の調製
コクリロ（Veratrum nigrum L.）を基原植物とする生薬レイロ（藜蘆）（新和物産社製）５０ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量３８４ｍＬ、蒸発残分１．５１ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、コクリロ（Veratrum nigrum L.）抽出物を調製した。
【００３１】
（実施例１）ドーパオキシダーゼ活性の測定
９６穴プレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイト１００μｌを１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように各穴に播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human Melanocyte Growth Supplement）（いずれもCascade Biologics社製）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、メラノサイト活性化因子エンドセリン−１（ＥＴ−１）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を、それぞれ培地中終濃度で１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3になるように添加した。
【００３２】
また、前記製造例１〜製造例４で調製した植物の抽出物を０．１０％となるように添加した。最終的に培地量は２００μｌ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。
【００３３】
なお、培地には、以下の添加物も添加されている。
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子） ３ｎｇ／ｍｌ
ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液） ０．２体積％
ＦＢＳ（ウシ胎児血清） ０．５体積％
ハイドロコーチゾン ５×１０-4ｍｏｌ／ｍ3
インスリン ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン ５μｇ／ｍｌ
ヘパリン ５μｇ／ｍｌ
【００３４】
培養終了後、各ウェルにアラマーブルー（Alamar Blue、商品名、インビトロジェン社製）試薬２０μｌを添加し、２〜３時間培養後、培地の蛍光強度（励起波長；５４４ｎｍ、蛍光波長；５９０ｎｍ）を測定して細胞増殖活性を測定した。その結果を表１に示す。
細胞増殖活性を測定したメラノサイトをＣａ2+およびＭｇ2+を除去したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を２０μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシターゼ活性の測定を行った。ドーパオキシターゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（例えば、Winder A．J.，Harris H.，Eur．J．Biochem.，198，317-326，1991参照）を参考に、以下のように行った。
【００３５】
可溶化した細胞溶液の各ｗｅｌｌに、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μｌ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。
その結果を表１に示す。なお、表１の細胞増殖活性の値は、各種植物の抽出物を添加しなかった場合の蛍光強度に対する相対値で示している。また、ドーパオキシダーゼ活性の値は、各種植物の抽出物を添加しなかった場合の吸光度に対する相対値で示している。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１に示したとおり、前記製造例１〜製造例４で調製した抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することが認められた。前述のように、ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生合成にするチロシナーゼの酵素活性の指標として用いられている。したがって、表１の結果から、本発明の前記製造例１〜製造例４で調製した抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニン産生を抑制し、その結果、美白作用を有することがわかる。
また、前記製造例１〜製造例４で調製した抽出物には、細胞増殖活性の上昇が認められた。したがって、本発明の前記植物抽出物は、細胞増殖活性を低下させる作用（すなわち、細胞増殖能を低下させる作用）がないことがわかった。
さらに、実施例１で得られた結果との比較から、本発明の前記植物抽出物は細胞増殖活性を抑制することなく、ドーパオキシダーゼ活性を抑制できることがわかった。
【００３８】
（処方例）
前記製造例で得られた抽出物を有効成分として、下記に示す組成のローション、乳液、美容液、クリーム及びパックを常法により各々調製した。
【００３９】
１．ローションの調製
（組成） （配合：質量％）
１，３−ブチレングリコール ８．０
グリセリン ５．０
エタノール ３．０
トウセンダン抽出物 ３．０
カミツレエキス ３．０
キキョウエキス １．０
チョウジエキス １．０
キサンタンガム ０．１
ヒアルロン酸 ０．１
リン酸二ナトリウム ０．１
リン酸二水素ナトリウム ０．１
アスコルビン酸２−グルコシド ２．０
精製水 残部
香料 適量
防腐剤 適量
【００４０】
２．ローションの調製
（組成）
ソウカ抽出物 ３．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
グリセリン ３．０
プロピレングリコール ３．０
エタノール ３．０
カミツレエキス ２．０
キサンタンガム ０．１
ヒアルロン酸 ０．１
リン酸二ナトリウム ０．１
リン酸二水素ナトリウム ０．１
精製水 残部
香料 適量
防腐剤 適量
【００４１】
３．乳液の調製
（組成） （配合：質量％）
セネシオ グラシリス抽出物 ５．０
カミツレエキス １．０
キキョウエキス １．０
アルテアエキス ２．０
スクワラン ３．０
オリブ油 ３．０
グリセリン ５．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：40） １．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
水酸化カリウム ０．１
キサンタンガム ０．２
エデト酸二ナトリウム ０．０２
精製水 残部
防腐剤 適量
【００４２】
４．美容液の調製
（組成） （配合：質量％）
コクリロ抽出物 ５．０
カミツレエキス １．０
キキョウエキス １．０
チョウジエキス １．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．２
水酸化カリウム ０．２
キサンタンガム ０．１
ヒアルロン酸 ０．２
クエン酸ナトリウム ０．１５
クエン酸 ０．０３
グリセリン １０．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
エデト酸二ナトリム ０．０５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００４３】
５．美容液の調製
（組成） （配合：質量％）
トウセンダン抽出物 ３．０
カミツレエキス １．０
チョウジエキス １．０
キキョウエキス １．０
キサンタンガム ０．２
カルボキシメチルセルロース ０．２
カルボキシビニルポリマー ０．２
水酸化カリウム ０．１
クエン酸 ０．０３
クエン酸ナトリウム ０．１５
グリセリン ５．０
プロピレングリコール ３．０
ポリエチレングリコール（分子量１５００） １．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール ０．５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００４４】
６．クリームの調製
（組成） （配合：質量％）
ソウカ抽出物 ３．０
カミツレエキス ２．０
キキョウエキス ２．０
チョウジエキス ２．０
メチルポリシロキサン ３．０
スクワラン ２．０
ジカプリン酸ネオペンチルグリコール ３．０
ステアリルアルコール １．５
セタノール １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：60） ０．５
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．３
水酸化カリウム ０．１５
キサンタンガム ０．１
エデト酸二ナトリウム ０．０５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００４５】
７．クリームの調製
（組成） （配合：質量％）
セネシオ グラシリス抽出物 ２．０
カミツレエキス ３．０
キキョウエキス ３．０
ポリオキシエチレンアルキルエーテル変性シリコーン ３．０
メチルポリシロキサン ５．０
デカメチルシクロペンタシロキサン １０
スクワラン ５．０
硫酸マグネシウム ０．５
グリセリン ５．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００４６】
８．パックの調製
（組成） （配合：質量％）
コクリロ抽出物 ３．０
カミツレエキス ２．０
キキョウエキス １．０
ジプロピレングリコール ３．０
ポリエチレングリコール（平均分子量１５００） ２．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
グリセリン ５．０
クエン酸ナトリウム ０．５
ポリビニルアルコール １０
乳酸 ０．３
ポリオキシエチレンデシルテトレデシルエーテル ０．５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されメラニン産生が亢進した結果生じるものと考えられている。生体内において、色素メラニンは色素細胞（メラノサイト）内のメラノソームにおいて、前駆体であるチロシンから生合成される。このメラニン生合成に関わる酵素であるチロシナーゼに変異が生じると、皮膚、毛髪のメラニン色素の形成が異常となることが報告されている（非特許文献１参照）。
メラニン生合成におけるチロシナーゼの重要度の高さから、チロシナーゼは美白素材のターゲットとしても古くから注目されてきた。チロシナーゼはチロシンヒドロキシラーゼ活性、ドーパオキシダーゼ活性及びDHI活性を有し、チロシンを前駆体としたメラニン合成反応を触媒する。チロシナーゼ酵素活性はドーパオキシダーゼ活性を指標とすることができ、チロシナーゼ酵素活性阻害作用をもつメラニン産生抑制素材を評価する際にもその指標として用いられている（非特許文献２参照）。したがって、メラノサイト内ドーパオキシダーゼ活性を抑制することで、最終的な生合成産物であるメラニンの産出を抑制することができる。
従来から、チロシナーゼの活性を阻害してメラニン産生を抑制したり、産生したメラニンを減少させる物質の使用が検討され、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸、グルタチオン等に当該作用があることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
しかし、これらの物質には、メラニン産生抑制効果が十分でない等の問題がある場合もあり、未だ十分に満足できるものは得られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】King RA．Oetting WS．Hearing VJ．In Metabolic bases of inherited disease（Scriver CR．Beaudet AL．Sly WS．Valle D.，eds.)，McGraw-Hill，New York，4353-4392，1995
【非特許文献２】Wrathall JR．et al.，JCB 1973 57:406-423
【非特許文献３】美白戦略（南江堂）ＩＶ．，美白剤の薬理と臨床，ｐ９５−１１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制することができるドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニンの産生を抑制する美白剤および皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ある種の植物の抽出物がドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有することを見い出した。さらに、この抽出物を用いることで、優れたドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤を提供することができることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
本発明は、トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤、美白剤およびドーパオキシダーゼ活性抑制剤に関する。
【０００７】
本発明において、「美白（作用）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制することができる。また、本発明の美白剤および皮膚外用剤は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニンの産生を抑制することができ、美白効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤は、トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、コクリロ（Veratrum nigrum L.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）及びセネシオ グラシリス（Senecio gracilis）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する。
前記植物の抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制効果を有する。そのため、前記植物の抽出物を含有することで本発明の美白剤および皮膚外用剤は、皮膚におけるメラニンの産生を抑制することができ、美白効果を奏する。
【００１０】
本発明におけるトウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）は、センダン科（Meliaceae）に属する植物である。
【００１１】
本発明におけるソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）は、ショウガ科（Zingiberaceae）に属する植物である。
【００１２】
本発明におけるセネシオ グラシリス（Senecio gracilis）は、キク科（Asteraceae）に属する植物である。
【００１３】
本発明におけるコクリロ（Veratrum nigrum L.）はユリ科（Liliaceae）に属する植物である。
【００１４】
本発明において、前記植物の全ての任意の部分が使用可能である。例えば、上記植物の全木、または任意の部位（根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、果実、種子等）、およびそれらの組み合わせのいずれか１つまたは複数を使用することができる。
【００１５】
本発明において、トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）の抽出物を得るためには、前記植物の果実を用いるのが好ましく、トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）を基原植物として得られた生薬（川楝子（センレンシ））を用いることもできる。
【００１６】
本発明において、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）の抽出物を得るためには、前記植物の果実を用いるのが好ましく、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）を基原植物として得られた生薬（草果（ソウカ））を用いることもできる。
【００１７】
本発明において、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）の抽出物を得るためには、前記植物の根を用いるのが好ましい。
【００１８】
本発明において、コクリロ（Veratrum nigrum L.）の抽出物を得るためには、前記植物の根茎を用いるのが好ましく、コクリロ（Veratrum nigrum L.）を基原植物として得られた生薬（黒藜蘆（コクリロ）や藜蘆（リロ、レイロ））を用いることもできる。
【００１９】
本発明において用いる、前記植物の抽出物は、適当な溶媒を用いた常法の抽出方法によって調製することができる。
【００２０】
本発明において、前記植物の抽出物の調製に、上記植物をそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等、より精製したものを用いることもでき、また市販品を利用することもできる。上記植物又はその水蒸気蒸留物若しくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
抽出に用いる溶媒としては、通常植物成分の抽出に用いられるもの、例えば水、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、トルエン、クロロホルム、エーテル、酢酸エチル、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等が挙げられ、特に水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコールが好ましい。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。また抽出条件も通常の条件を適用でき、例えば上記植物を５〜８０℃で２時間〜６０日間浸漬又は加熱還流すればよい。上記植物の抽出物は、そのまま使用できるが、さらに適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留、活性炭処理等により活性の高い画分を分画して用いることもできる。
【００２２】
本発明において、前記植物の抽出物はそのまま用いてもよい。または、当該抽出物を希釈、濃縮または凍結乾燥した後、粉末またはペースト状に調製して用いることもできる。
【００２３】
前記植物の抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有する。これら植物の抽出物を有効成分として含有させることで、本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤が得られる。
本発明において、前記植物の抽出物はそのままドーパオキシダーゼ活性抑制剤、美白剤および皮膚外用剤として用いてもよい。または、上記抽出物に、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤を加えて用いてもよい。この場合、これら植物の抽出物の量は特に制限されないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５重量％含まれるのが好ましく、０．０００１〜０．５重量％含まれるのが特に好ましい。
【００２４】
本発明において、「皮膚外用剤」とは、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品、等として皮膚に適用されるものを意味する。従って、その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、ファンデーション、軟膏、シート状製品等の形態が挙げられる。
本発明の皮膚外用剤には、前記抽出物の他、通常の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、前記以外の美白剤、高分子化合物、防腐剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等を適宜配合できる。
【００２５】
本発明の皮膚外用剤の使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ２当たり０．１μｇ〜５μｇ、液状製剤の場合、同じく０．１μｇ〜１０μｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
（製造例１）トウセンダンの抽出物の調製
トウセンダンを基原植物とする生薬センレンシ（川楝子）（新和物産社製）５０ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で３日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量３４３ｍＬ、蒸発残分３．０８ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、トウセンダン抽出物を調製した。
【００２８】
（製造例２）ソウカの抽出物の調製
ソウカを基原植物とする生薬ソウカ（草果）（新和物産社製）１５０ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２４８ｍＬ、蒸発残分２．５４ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、ソウカ抽出物を調製した。
【００２９】
（製造例３）セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）の抽出物の調製
セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）の根（American botanicals社より購入）４０ｇを細切し、５０％エタノール４００ｍＬを加え、室温で２２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２９８ｍＬ、蒸発残分１．７６ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）抽出物を調製した。
【００３０】
（製造例４）コクリロ（Veratrum nigrum L.）の抽出物の調製
コクリロ（Veratrum nigrum L.）を基原植物とする生薬レイロ（藜蘆）（新和物産社製）５０ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量３８４ｍＬ、蒸発残分１．５１ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、コクリロ（Veratrum nigrum L.）抽出物を調製した。
【００３１】
（実施例１）ドーパオキシダーゼ活性の測定
９６穴プレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイト１００μｌを１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように各穴に播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human Melanocyte Growth Supplement）（いずれもCascade Biologics社製）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、メラノサイト活性化因子エンドセリン−１（ＥＴ−１）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を、それぞれ培地中終濃度で１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3になるように添加した。
【００３２】
また、前記製造例１〜製造例４で調製した植物の抽出物を０．１０％となるように添加した。最終的に培地量は２００μｌ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。
【００３３】
なお、培地には、以下の添加物も添加されている。
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子） ３ｎｇ／ｍｌ
ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液） ０．２体積％
ＦＢＳ（ウシ胎児血清） ０．５体積％
ハイドロコーチゾン ５×１０-4ｍｏｌ／ｍ3
インスリン ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン ５μｇ／ｍｌ
ヘパリン ５μｇ／ｍｌ
【００３４】
培養終了後、各ウェルにアラマーブルー（Alamar Blue、商品名、インビトロジェン社製）試薬２０μｌを添加し、２〜３時間培養後、培地の蛍光強度（励起波長；５４４ｎｍ、蛍光波長；５９０ｎｍ）を測定して細胞増殖活性を測定した。その結果を表１に示す。
細胞増殖活性を測定したメラノサイトをＣａ2+およびＭｇ2+を除去したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を２０μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシターゼ活性の測定を行った。ドーパオキシターゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（例えば、Winder A．J.，Harris H.，Eur．J．Biochem.，198，317-326，1991参照）を参考に、以下のように行った。
【００３５】
可溶化した細胞溶液の各ｗｅｌｌに、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μｌ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。
その結果を表１に示す。なお、表１の細胞増殖活性の値は、各種植物の抽出物を添加しなかった場合の蛍光強度に対する相対値で示している。また、ドーパオキシダーゼ活性の値は、各種植物の抽出物を添加しなかった場合の吸光度に対する相対値で示している。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１に示したとおり、前記製造例１〜製造例４で調製した抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することが認められた。前述のように、ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生合成にするチロシナーゼの酵素活性の指標として用いられている。したがって、表１の結果から、本発明の前記製造例１〜製造例４で調製した抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニン産生を抑制し、その結果、美白作用を有することがわかる。
また、前記製造例１〜製造例４で調製した抽出物には、細胞増殖活性の上昇が認められた。したがって、本発明の前記植物抽出物は、細胞増殖活性を低下させる作用（すなわち、細胞増殖能を低下させる作用）がないことがわかった。
さらに、実施例１で得られた結果との比較から、本発明の前記植物抽出物は細胞増殖活性を抑制することなく、ドーパオキシダーゼ活性を抑制できることがわかった。
【００３８】
（処方例）
前記製造例で得られた抽出物を有効成分として、下記に示す組成のローション、乳液、美容液、クリーム及びパックを常法により各々調製した。
【００３９】
１．ローションの調製
（組成） （配合：質量％）
１，３−ブチレングリコール ８．０
グリセリン ５．０
エタノール ３．０
トウセンダン抽出物 ３．０
カミツレエキス ３．０
キキョウエキス １．０
チョウジエキス １．０
キサンタンガム ０．１
ヒアルロン酸 ０．１
リン酸二ナトリウム ０．１
リン酸二水素ナトリウム ０．１
アスコルビン酸２−グルコシド ２．０
精製水 残部
香料 適量
防腐剤 適量
【００４０】
２．ローションの調製
（組成）
ソウカ抽出物 ３．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
グリセリン ３．０
プロピレングリコール ３．０
エタノール ３．０
カミツレエキス ２．０
キサンタンガム ０．１
ヒアルロン酸 ０．１
リン酸二ナトリウム ０．１
リン酸二水素ナトリウム ０．１
精製水 残部
香料 適量
防腐剤 適量
【００４１】
３．乳液の調製
（組成） （配合：質量％）
セネシオ グラシリス抽出物 ５．０
カミツレエキス １．０
キキョウエキス １．０
アルテアエキス ２．０
スクワラン ３．０
オリブ油 ３．０
グリセリン ５．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：40） １．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
水酸化カリウム ０．１
キサンタンガム ０．２
エデト酸二ナトリウム ０．０２
精製水 残部
防腐剤 適量
【００４２】
４．美容液の調製
（組成） （配合：質量％）
コクリロ抽出物 ５．０
カミツレエキス １．０
キキョウエキス １．０
チョウジエキス １．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．２
水酸化カリウム ０．２
キサンタンガム ０．１
ヒアルロン酸 ０．２
クエン酸ナトリウム ０．１５
クエン酸 ０．０３
グリセリン １０．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
エデト酸二ナトリム ０．０５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００４３】
５．美容液の調製
（組成） （配合：質量％）
トウセンダン抽出物 ３．０
カミツレエキス １．０
チョウジエキス １．０
キキョウエキス １．０
キサンタンガム ０．２
カルボキシメチルセルロース ０．２
カルボキシビニルポリマー ０．２
水酸化カリウム ０．１
クエン酸 ０．０３
クエン酸ナトリウム ０．１５
グリセリン ５．０
プロピレングリコール ３．０
ポリエチレングリコール（分子量１５００） １．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール ０．５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００４４】
６．クリームの調製
（組成） （配合：質量％）
ソウカ抽出物 ３．０
カミツレエキス ２．０
キキョウエキス ２．０
チョウジエキス ２．０
メチルポリシロキサン ３．０
スクワラン ２．０
ジカプリン酸ネオペンチルグリコール ３．０
ステアリルアルコール １．５
セタノール １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：60） ０．５
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．３
水酸化カリウム ０．１５
キサンタンガム ０．１
エデト酸二ナトリウム ０．０５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００４５】
７．クリームの調製
（組成） （配合：質量％）
セネシオ グラシリス抽出物 ２．０
カミツレエキス ３．０
キキョウエキス ３．０
ポリオキシエチレンアルキルエーテル変性シリコーン ３．０
メチルポリシロキサン ５．０
デカメチルシクロペンタシロキサン １０
スクワラン ５．０
硫酸マグネシウム ０．５
グリセリン ５．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００４６】
８．パックの調製
（組成） （配合：質量％）
コクリロ抽出物 ３．０
カミツレエキス ２．０
キキョウエキス １．０
ジプロピレングリコール ３．０
ポリエチレングリコール（平均分子量１５００） ２．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
グリセリン ５．０
クエン酸ナトリウム ０．５
ポリビニルアルコール １０
乳酸 ０．３
ポリオキシエチレンデシルテトレデシルエーテル ０．５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
【請求項２】
トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する美白剤。
【請求項３】
トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤。
【請求項１】
トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
【請求項２】
トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する美白剤。
【請求項３】
トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤。
【公開番号】特開２０１０−１９５７３２（Ｐ２０１０−１９５７３２Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４４１９２（Ｐ２００９−４４１９２）
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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