ヒトシクロオキシゲナーゼ−３およびその用途
本発明は、本明細書でヒトシクロオキシゲナーゼ−３と命名されるシクロオキシゲナーゼ酵素の新規イソ酵素を記述する核酸およびポリペプチド配列を提供する。本発明の単離された核酸若しくはポリペプチド分子は、検出アッセイ、遺伝子治療およびスクリーニングアッセイで使用し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシクロオキシゲナーゼイソ酵素に関する。具体的には、本発明は、新規ヒトシクロオキシゲナーゼイソ酵素ＣＯＸ−３の単離された核酸分子およびポリペプチド、ならびにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は多様な形態で３，５００年以上も使用されている。この分類の抗炎症剤は抗炎症、鎮痛および解熱作用を発揮する。ＮＳＡＩＤの例は、限定されるものでないがアスピリン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ピロキシカム、ナプロキセン、スリンダク、サリチル酸コリン、ジフルニサル、フェノプロフェン、インドメタシン、メクロフェナメート、サルサラート、トルメチンおよびサリチル酸マグネシウムを挙げることができる。ＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）経路を介してプロスタグランジン（ＰＧ）（不飽和の２０炭素脂肪酸、主としてアラキドン酸由来の一群の化合物）の生成を阻害することによりはたらくと考えられている。
【０００３】
炎症の部位でＣＯＸはアラキドン酸をエンドペルオキシドＰＧＧ２に転化し、それはその後プロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）に分解する。ＰＧＨ２は、順に、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２およびトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）を包含するプロスタノイドに転化される。ＰＧＥ２のようなプロスタノイドの局所生成が疼痛神経末端を過敏にしかつ血流を増大させて痛みの感覚を促進しかつ組織の腫脹および発赤を駆動し得る。
【０００４】
ＮＳＡＩＤはＣＯＸ活性を選択的に阻害してそれによりＰＧＥ２形成を阻害しかつ炎症を最小化する（非特許文献１）。不幸なことに、ＮＳＡＩＤの使用はしばしば胃腸出血、潰瘍、腎不全および他者のような副作用により制限される。これらの副作用は、一般にプロスタグランジンの望ましくない減少により引き起こされる。プロスタグランジンは、正常な生理学の維持のために正常な細胞中でオートクリンおよびパラクリン刺激物質として機能し得る。正常細胞中でのプロスタグランジン生成を変えることなく標的細胞中でのプロスタグランジンの減少を達成することによりより特異的に作用することができる新たな作用剤の開発は、ＮＳＡＩＤ研究の主要な最終目標の１つである。
【０００５】
アセトアミノフェンは、口腔外科手術、会陰切開、分娩後疼痛、癌、変形性関節症、頭痛、月経困難症などに関連する軽度ないし中等度の疼痛の緩和のための安全かつ有効な鎮痛薬である。アスピリンのようなＮＳＡＩＤと異なり、アセトアミノフェンは強力な解熱および鎮痛作用を有する（非特許文献２）。臨床試験は、アセトアミノフェンがアスピリンの胃腸の副作用を欠くことを示した。さらに、アセトアミノフェンは小児において止血機構に対する影響を有さず、そしてアスピリンの使用が危険な出血を引き起こしうる臨床状況で使用し得る。その広範な使用にもかかわらず、アセトアミノフェンの作用機序は完全に解明されてはいない。
【０００６】
ごく最近までに、シクロオキシゲナーゼの２種のアイソフォーム、すなわち、構成的に発現されるＣＯＸ−１および誘導可能であるＣＯＸ−２のみが同定された。ＣＯＸ−１は胃腸（ＧＩ）管中でのＰＧＩ２およびＰＧＥ２のような生理学的に関連するプロスタノイドの生成の原因であるようであり、それによりそれらは胃に対し保護的である。Ｃｏｘ−１はまた血小板凝集の強力な誘導物質ＴｘＡ２の生成にも関与しかつ血管攣縮を引き起こす。抗炎症におけるそれらの役割に加え、アスピリンのようなＣＯＸ−１の阻害剤は血液凝固を阻害し、また、ＧＩ毒性を伴う。ＣＯＸ−２は炎症部位で迅速にアップレギュレー
トされ、そして炎症前プロスタノイドの形成の原因であるようである。より選択的なＣＯＸ−２阻害剤はＧＩ毒性を低下させていたことがありそうであるとみられるがしかしそれでもなお疼痛ならびに熱、発赤および腫脹のような炎症の他の古典的兆候を緩和すると思われる。ＣＯＸ−１もＣＯＸ−２も、全細胞若しくは細胞ホモジェネートでアッセイする場合に治療濃度のアセトアミノフェンで該薬物に対し感受性でなく、ＣＯＸ−１もＣＯＸ−２もアセトアミノフェンの作用の良好な標的でないことを示唆している。
【０００７】
第三のシクロオキシゲナーゼイソ酵素すなわちＣＯＸ−３をコードする遺伝子がイヌ大脳皮質から最近同定された（非特許文献３）。ＣＯＸ−３の阻害はアセトアミノフェンの主要な中心的作用機序を表すことが示唆された。イヌＣＯＸ−３遺伝子はイントロン１の保持を伴うイヌＣＯＸ−１遺伝子のスプライシングバリアントである。イヌＣＯＸ−３タンパク質はカルボキシル末端にイヌＣＯＸ−１タンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、およびアミノ末端に３３アミノ酸の挿入を含有する。イヌＣＯＸ−３のｍＲＮＡはイヌ大脳皮質で、および分析した他の組織中でより少量で発現される。機能研究は、イヌＣＯＸ−３がグリコシル化依存性のシクロオキシゲナーゼ活性を有しかつ数種の（しかし全部ではない）ＮＳＡＩＤにより強力に阻害されることを示した。イヌＣＯＸ−３活性のネズミのＣＯＸ−１および−２との比較は、イヌＣＯＸ−３がアセトアミノフェン、フェナセチン、アンチピリンおよびジピロンのような鎮痛／解熱薬により選択的に阻害されることを示している。例えば、５ｍＭの基質濃度で、アセトアミノフェンはネズミのＣＯＸ−２に対しイヌＣＯＸ−３の阻害について１００倍選択的、およびネズミのＣＯＸ−１に対し２倍選択的である（非特許文献３）。
【０００８】
イヌＣＯＸ−３はイヌ大脳皮質から同定されたとは言え、ヒトＣＯＸ−３の存在はさらなる実験を必要とした。公表されたヒトゲノム配列に基づけばヒトＣＯＸ−１のイントロン１はヒトＣＯＸ−１のコーディング配列の残りと同じフレームでないからである。公表されたヒトゲノム配列が真正の多型であるか若しくはシークェンシングの誤りであるかは知られていなかった（非特許文献３）。ヒトＣＯＸ−３の存在若しくはその欠如を示すための慎重に設計された研究が実施される必要がある。ヒトＣＯＸ−３研究からの結果は、アセトアミノフェンのような既存の鎮痛薬の機序の解明において、また、より少ない副作用を伴うより特異的な鎮痛薬を開発するために有用であり得る。
【非特許文献１】Ｗａｒｎｅｒら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１３３７１−１３３７３
【非特許文献２】Ｂｏｔｔｉｎｇ、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ．３１：Ｓ２０２−１０
【非特許文献３】Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１３９２６−３１
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明は、本明細書でヒトＣＯＸ−３と称される新規ヒトシクロオキシゲナーゼイソ酵素をコードする単離された核酸分子、該単離された核酸配列によりコードされるポリペプチド、ならびに該核酸分子およびそのポリペプチドの使用に関する。
【００１０】
本発明の他の局面、特徴および利点は、本発明の詳細な記述およびその好ましい態様ならびに付属として付けられる請求の範囲を包含する以下の開示から明らかであろう。
［発明の詳細な記述］
本出願で引用される全部の刊行物はこれにより引用することにより組み込まれる。別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されると同一の意味するところを有する。
【００１１】
「包含すること」、「含んでなること」、「含有すること」および「有すること」という用語は、本明細書でそれらの公然の制限しない意味で使用する。
【００１２】
以下は本明細でときに使用される略語である：
ｂｐ＝塩基対
ｃＤＮＡ＝相補ＤＮＡ
ＣＮＳ＝中枢神経系
ＣＯＸ＝シクロオキシゲナーゼ
ｋｂ＝キロ塩基対；１０００塩基対
ｋＤａ＝キロダルトン；１０００ダルトン
ＮＳＡＩＤ＝非ステロイド性抗炎症薬
ｎｔ＝ヌクレオチド
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＧ＝プロスタグランジン
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ｓｉＲＮＡ＝低分子干渉ＲＮＡ
ＵＴＲ＝非翻訳領域
本発明のポリペプチド若しくは核酸の「活性」、「生物活性」若しくは「機能的活性」は、標準的技術に従ってｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されるところの本発明のポリペプチド若しくは核酸分子により発揮される活性を指す。こうした活性は第二のタンパク質との会合若しくはそれに対する酵素活性のような直接活性、または該タンパク質の第二のタンパク質との相互作用により媒介される細胞シグナル伝達活性のような間接的活性であり得る。ヒトＣＯＸ−３と関連する例示的一生物活性はアラキドン酸をＰＧＨ２に転化するその酵素活性であり、そして、本活性はアセトアミノフェンのような鎮痛／解熱薬により選択的に阻害される。
【００１３】
「鎮痛剤（ａｎａｌｇｅｓｉｃ）」若しくは「鎮痛薬（ａｎａｌｇｅｓｉｃ ｄｒｕｇ）」は意識の喪失を引き起こすことなく疼痛を軽減する剤である。「解熱剤（ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ）」若しくは「解熱薬（ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ ｄｒｕｇ）」は熱を緩和すなわち低下させる剤である。「解熱剤（ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ）」は解熱剤（ａｎｔｉｆｅｂｒｉｌｅ）、解熱剤（ａｎｔｉｔｈｅｒｍｉｃ）若しくは解熱剤（ｆｅｂｒｉｆｕｇｅ）と同義語である。「抗炎症薬」は炎症を打ち消す若しくは抑制する剤である。「鎮痛／解熱薬」は「鎮痛」および「解熱」双方の活性を有する剤である。
【００１４】
本明細書で使用されるところの「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわち本発明のポリペプチドのような抗原、例えば本発明のポリペプチドのあるエピトープを特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の所定のポリペプチドに特異的に結合する分子は、該ポリペプチドを結合するがしかし該ポリペプチドを天然に含有するサンプル、例えば生物学的サンプル中の異なる型の分子を実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分の例は、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより生成させ得るＦａｂおよびＦ（ａｂ）’２フラグメントを包含する。
【００１５】
「抗体」はモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体であり得る。「モノクローナル抗体」若しくは「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特定の一エピトープと免疫反応することが可能な抗原結合部位の１種のみを含有する抗体分子の一集団を指す。「ポリクローナル抗体」という用語は１種以上のエピトープと免疫反応することが可能な本発明のポリペプチド（１種若しくは複数）に向けられた抗体を指す。とりわけ好ましいポリクローナル抗体調製物は、本発明のポリペプチド（１種若しくは複数）に向けられた
抗体のみを含有するものである。
【００１６】
本明細書で使用されるところの「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して体液性および／若しくは細胞性の抗原特異的応答をなすことができる１種若しくはそれ以上のエピトープを含有する分子を指す。該用語はまた本明細書で「免疫原」と互換的にも使用する。本明細書で使用されるところの「エピトープ」という用語は、特異的抗体分子が結合する抗原若しくはハプテン上の部位を指す。該用語はまた本明細書で「抗原決定基」若しくは「抗原決定基部位」と互換的にも使用する。
【００１７】
「生物学的サンプル」という用語は生物体（例えば患者）若しくは生物体の構成成分（例えば細胞）から得られるサンプルを指す。サンプルはいずれの生物学的組織、細胞（１個若しくは複数）または液体のものであってよい。サンプルは、患者由来のサンプルである「臨床サンプル」であってよい。こうしたサンプルは、限定されるものでないが唾液、血液、血液細胞（例えば白血球）、羊水、血漿、精液、骨髄および組織若しくは細径針生検サンプル、尿、腹水および胸水またはそれらからの細胞を挙げることができる。生物学的サンプルはまた、組織学的目的上採取される凍結切片のような組織の切片も包含してよい。生物学的サンプルはまた「患者サンプル」とも称されることがある。「生物学的サンプル」はまた、実質的に精製若しくは単離されたタンパク質、膜調製物、または細胞培養物も包含してよい。
【００１８】
「クローン」は有糸分裂により単一細胞若しくは共通の祖先に由来する細胞の一集団である。「細胞株」は多世代の間ｉｎ ｖｉｔｒｏで安定な増殖が可能である初代細胞のクローンである。
【００１９】
「プロスタグランジンエンドペルオキシドＨシンターゼ」すなわち「ＰＧＨＳ」ともまた称される「シクロオキシゲナーゼ」、「シクロオキシゲナーゼ酵素」、「ＣＯＸ」若しくは「ＣＯＸ酵素」という用語は、プロスタグランジン生合成において２段階を触媒しかつアラキドン酸からプロスタグランジンおよびトロンボキサンを生成する、大部分の組織中に存在する酵素である。シクロオキシゲナーゼは、アラキドン酸のヒドロペルオキシドプロスタグランジンＧ２への酸化（シクロオキシゲナーゼ反応）およびプロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）へのそのその後の還元（ペルオキシダーゼ反応）の双方を触媒する。ＰＧＨ２は、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２およびトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）を包含するプロスタノイドへのその後の異性化若しくは環化の共通の中間体である。ＮＳＡＩＤはシクロオキシゲナーゼ活性を阻害し、これがそれらの抗炎症効果を説明する。
【００２０】
「ＣＯＸ−３活性に関係する障害」は、ＣＯＸ−３酵素の過活性若しくは不十分な活性と関連する障害若しくは疾患、およびこの障害若しくは疾患に付随する状態を包含する。「ＣＯＸ−３酵素の過活性」は、１）ＣＯＸ−３を通常は発現しない細胞中でのＣＯＸ−３発現；２）増大したＣＯＸ−３発現；３）ＣＯＸ−３酵素１単位あたりの増大したＣＯＸ−３活性；または４）１種若しくはそれ以上のＣＯＸ−３の生物活性の構成的活性化につながる突然変異のいずれかを指す。「ＣＯＸ−３酵素の不十分な活性」は、１）ＣＯＸ−３を通常発現する細胞中でのＣＯＸ−３発現の非存在；２）低下したＣＯＸ−３発現；３）ＣＯＸ−３酵素１単位あたりの低下したＣＯＸ−３活性；または４）１種若しくはそれ以上のＣＯＸ−３の生物活性の構成的不活性化につながる突然変異のいずれかを指す。
【００２１】
「遺伝子」は、コーディング領域、コーディング領域に先行する（「５’ＵＴＲ」）および後に続く（「３’ＵＴＲ」）非コーディング領域を包含するペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の生成に関与するＤＮＡの一セグメントである。「遺伝子」はまた個々のコーディングセグメント（「エキソン」）間に介在する非コーディング配列（「イン
トロン」）も包含しうる。「プロモーター」は遺伝子の転写を開始するＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡの制御配列を意味している。プロモーターはしばしば遺伝子の転写開始部位の上流（「に対し５’」）にある。「制御配列」は遺伝子の発現を制御し得る遺伝子の部分を指す。「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、ならびにポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位（細菌発現について）および／若しくはオペレーターのような他の発現制御要素を包含し得る。「コーディング領域」は、トリプレット塩基コドンを介してアミノ酸ならびに翻訳の開始および終止シグナルをコードする遺伝子の部分を指す。
【００２２】
「遺伝子治療」は、遺伝子欠損を是正するための生存細胞中へのいずれかの適する手段による何らかの供給源からの機能的遺伝子（１種若しくは複数）すなわち核酸フラグメントの導入を意味している。
【００２３】
「遺伝的バリアント」若しくは「バリアント」は、一集団中の最低１個体の特定の一遺伝子座に存在しかつ野性型対立遺伝子と異なる特定の一対立遺伝子を意味している。「野性型対立遺伝子」は一集団中の所定のヌクレオチド配列の最も頻繁に遭遇する対立遺伝子を意味している。
【００２４】
「宿主細胞」はベクター上か若しくは細胞染色体中に組込まれたかのいずれかの本発明のＤＮＡ分子を含有する細胞を指す。「宿主細胞」は本発明のＤＮＡ分子を内因性に発現する内因性宿主細胞若しくは組換え宿主細胞のいずれでもあり得る。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「ヒトシクロオキシゲナーゼ−３」、「ヒトＣＯＸ−３」若しくは「ｈＣＯＸ−３」は、アラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することが可能でありかつ配列番号４若しくは配列番号６に対する約６０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼの新規１メンバーを指す。ｈＣＯＸ−３の例は、アラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することが可能でありかつ配列番号４若しくは配列番号６に対する約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ酵素の新規１メンバーを包含する。一態様においてｈＣＯＸ−３は配列番号９を含んでなる。別の態様においてｈＣｏｘ−３は配列番号１１を含んでなる。
【００２６】
１フラグメント若しくはフラグメントの物理的会合は完全長のｈＣＯＸ−３と関連する生物活性を有し得るが、しかしながら、個々のｈＣＯＸ−３フラグメントと関連するｈＣＯＸ−３活性の程度は変動し得る。「ヒトシクロオキシゲナーゼ−３の活性フラグメント」は、アラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することがなお可能であるヒトシクロオキシゲナーゼ−３のフラグメントを指す。「ヒトシクロオキシゲナーゼ−３の活性フラグメント」の例は、配列番号４若しくは配列番号６の最低５個の隣接するアミノ酸配列の配列に対する約９０若しくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、そして、ｈＣＯＸ−３のこうした活性フラグメントはアラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することがなお可能である。
【００２７】
「炎症」という用語は、有害な剤および傷害された組織双方を破壊する、効力を弱める若しくは遮断（隔離）するようはたらく組織の傷害若しくは破壊により導き出される限局した保護応答を指す。「炎症」は、急性の形態において、疼痛（ｄｏｌｏｒ）、発熱（ｃａｌｏｒ）、発赤（ｒｕｂｏｒ）、腫脹（ｔｕｍｏｕｒ）および機能喪失（ｆｕｎｃｔｉｏ ｌａｅｓａ）の古典的兆候を特徴とする。組織学的には、炎症は、炎症の中心への血漿タンパク質および白血球遊走を包含する、増大した透過性および血流、液体の滲出を伴
う小動脈、毛細血管および細静脈の拡張を包含する複雑な一連の事象を伴う。
【００２８】
「単離された」核酸分子は他の核酸分子から分離されているものである。「単離された」核酸分子は、例えば、該核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中でその５’および３’端で該核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の最低１種を含まない核酸分子であり得る。単離された核酸分子は、制限なしに、他の配列に依存しない分離した核酸分子（例えばＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生じられるｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡフラグメント）、ならびにベクター、自律複製性プラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス若しくはヘルペスウイルス）または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組込まれている核酸分子を包含する。加えて、単離された核酸分子はハイブリッド若しくは融合核酸分子の一部である核酸分子を包含し得る。単離された核酸分子は：（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅される；（ｉｉ）例えば化学合成により合成される；（ｉｉｉ）クローニングにより組換え的に製造される；または（ｉｖ）切断および電気泳動若しくはクロマトグラフィー分離によるように精製される核酸配列であり得る。
【００２９】
「単離された」若しくは「精製された」タンパク質若しくはその生物学的に活性の部分は、該タンパク質が由来する細胞若しくは組織供給源からの細胞性物質若しくは他の汚染するタンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合は化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」という語は、該タンパク質が単離若しくは組換え的に製造される細胞の細胞性成分から該タンパク質が分離されているタンパク質の調製物を包含する。従って、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％若しくは５％（乾燥重量）未満の異種タンパク質（「汚染するタンパク質」ともまた本明細書で称される）を有するタンパク質の調製物を包含する。タンパク質若しくはその生物学的に活性の部分を組換え的に製造する場合、それはまた好ましくは培地を実質的に含まない。すなわち、培地はタンパク質調製物の体積の約２０％、１０％若しくは５％未満を表す。タンパク質を化学合成により製造する場合、それは好ましくは化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。すなわち、それは化学的前駆体若しくは該タンパク質の合成に関与する他の化学物質から分離されている。従って、タンパク質のこうした調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の化学的前駆体若しくは目的のポリペプチド以外の他の化学物質を有する。単離された生物学的に活性のポリペプチドはいくつかの異なる物理的形態を有する。単離されたポリペプチドは、完全長の生来のすなわちプロセシングされないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチド若しくはプロセシングされたポリペプチドの組合せとして存在し得る。単離された若しくは実質的に精製されたポリペプチドは、単離された核酸配列によりコードされるポリペプチド、ならびに例えば化学合成の方法により合成されたポリペプチド、および生物学的材料から分離されかつその後それらが本明細書に記述される方法により使用されることを可能にする程度まで慣習的なタンパク質分析若しくは調製手順を使用して精製されたポリペプチドであり得る。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「核酸」は、１個若しくはそれ以上のヌクレオチドすなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド若しくは双方から構成される分子を指す。該用語はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの単量体および多量体を包含し、リボヌクレオチドおよび／若しくはデオキシリボヌクレオチドは、多量体の場合に５’から３’の結合を介して一緒に結合される。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの多量体は一本鎖であっても若しくは二本鎖であってもよい。しかしながら、結合は、例えば５’から３’の結合を含んでなる核酸を包含する当該技術分野で既知の結合のいずれを包含してもよい。ヌクレオチドは天然に存在しても、若しくは天然に存在する塩基対と塩基対の関係を形成することが可能である合成で製造したアナログであってもよい。天然に存在する塩基対の例は、チミジン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラ
シルであり；それぞれＴ、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵと略記される。塩基対形成の関係を形成することが可能である天然に存在しない塩基の例は、限定されるものでないが、アザおよびデアザピリミジンアナログ、アザおよびデアザプリンアナログ、ならびにピリミジン環の炭素および窒素原子の１個若しくはそれ以上がヘテロ原子、例えば酸素、イオウ、セレン、リンなどにより置換されている他の複素環塩基アナログを挙げることができる。さらに、「核酸配列」という用語は相補配列を企図しており、そして、具体的には、核酸配列およびその相補物双方に実質的に相同であるいかなる核酸配列も包含する。
【００３１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は比較的短い長さ（例えば１００残基長未満）の一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列を指す。多くの方法について長さ約１６〜２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが有用であるとは言え、約２５ヌクレオチド以上のより長いオリゴヌクレオチドをときには利用しうる。数種のオリゴヌクレオチドは相補的核酸鎖の合成のための「プライマー」として使用し得る。例えば、ＤＮＡプライマーは、相補配列にハイブリダイズしてＤＮＡポリメラーゼを使用する反応で相補ＤＮＡ鎖の合成を開始させ得る。オリゴヌクレオチドはまた、例えばノーザンブロッティングでの核酸検出のためのハイブリダイゼーションにも有用である。
【００３２】
「多型」は一集団中の個体間の特定の一遺伝子座の一組の遺伝的バリアントを指す。
【００３３】
「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合により一緒に結合された最低２ヌクレオチドの直鎖状ポリマーを指し、そしてリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドのいずれを含んでもよい。
【００３４】
「ポリペプチド」若しくは「タンパク質」は１ポリマー中のアミノ酸残基の配置を指す。ポリペプチドは希なアミノ酸および合成アミノ酸アナログに加えて標準的な２０種の天然に存在するアミノ酸から構成され得る。より短いポリペプチドは一般にペプチドと称される。「組換えポリペプチド」は組換えＤＮＡ技術により製造される；すなわち所望のポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から生成されるポリペプチドを指す。「合成ポリペプチド」は化学合成により製造されるものを指す。
【００３５】
「プロモーター」は遺伝子の転写を開始するＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡの制御配列を意味している。プロモーターはしばしば遺伝子の転写開始部位の上流（「に対し５’」）にある。
【００３６】
「プロスタノイド」はプロスタグランジン、プロスタサイクリンおよびトロンボキサンの集合的用語である。それは、シクロオキシゲナーゼ経路を介して不飽和の２０炭素脂肪酸（主としてアラキドン酸）から生じる一群の化合物を包含する。それらは炎症を包含する多彩な一群の生理学的過程の極めて強力な媒介物質である。プロスタノイドの例は、限定されるものでないがＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２およびトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）を挙げることができる。
【００３７】
「組換え」は、分子生物学技術を使用してその天然の状態以外の何かに改変されている核酸、核酸によりコードされるタンパク質、細胞、若しくはウイルス粒子を指す。例えば、組換え細胞は、天然の（非組換え）形態の該細胞内で見出されないヌクレオチド配列を含有し得るか、または、別の方法で異常に発現されるか、過少発現されるか、若しくは全く発現されない天然の遺伝子を発現し得る。組換え細胞はまた、人工的手段により改変されかつ天然の形態の細胞中に再導入されている該細胞中で見出される遺伝子も含有し得る。該用語は、細胞から核酸を取り出すことなく改変されている、細胞に対し内因性の核酸を含有する細胞もまた包含し；こうした改変は例えば遺伝子置換および部位特異的突然変異により得られるものを包含する。
【００３８】
「組換え宿主細胞」は組換えＤＮＡ配列を含有する細胞である。組換えＤＮＡ配列は、例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、微小注入法、形質転換、微粒子銃およびウイルス感染を包含するいずれかの適する方法を使用して宿主細胞に導入し得る。組換えＤＮＡは、該細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組込まれ（共有結合され）ても組込まれなくてもよい。例えば、組換えＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素上に維持され得る。あるいは、安定に形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞に関しては、組換えＤＮＡは、それが染色体複製により娘細胞により遺伝されるように染色体中に組込まれたようになっている。この安定性は、外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の一集団から構成される細胞株すなわちクローンを樹立する安定に形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞の能力により示される。組換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株のような哺乳動物細胞、ならびにキイロショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコ由来の細胞株のような昆虫細胞を包含する原核生物若しくは真核生物であってよい。「組換え宿主細胞」という用語が特定の一細胞を指すのみならずしかしまたこうした細胞の子孫若しくは潜在的な子孫も指すことがさらに理解される。突然変異若しくは環境の影響のいずれかにより後続世代である種の改変が起こり得るため、こうした子孫は事実上親細胞に同一でないかもしれないが、しかしなお本明細書で使用されるところの該用語の範囲内に包含される。
【００３９】
「配列」は、単量体が多量体中に存在する直線状の順序、例えばポリペプチド中のアミノ酸の順序若しくはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序を意味している。
【００４０】
当該技術分野で既知のところの「配列の同一性若しくは類似性」は、配列を比較することにより決定されるところの２種若しくはそれ以上のポリペプチド配列または２種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、同一性はまた、場合によっては一連のこうした配列間の適合により決定されるところのポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の程度も意味している。２種のアミノ酸配列若しくは２種の核酸の同一性若しくは類似性のパーセントを決定するために、配列を至適の比較の目的上整列する（例えば、第二のアミノ酸若しくは核酸配列との至適のアライメントのために第一のアミノ酸の配列若しくは核酸配列中にギャップを導入し得る）。対応するアミノ酸位置若しくはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基若しくはヌクレオチドをその後比較する。第一の配列中のある位置が第二の配列中の対応する位置と同一の若しくは類似のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドにより占有される場合には、該分子はその位置で同一若しくは類似である。２配列間の同一性若しくは類似性のパーセントは、該配列により共有される同一若しくは類似の位置の数の関数である（すなわち同一性％＝同一の位置の数／位置（例えばオーバーラップする位置）の総数×１００）。一態様において、該２配列は同一長さである。
【００４１】
同一性および類似性の双方は容易に計算し得る。配列間の同一性若しくは類似性の一般に使用される決定方法は、限定されるものでないがＣａｒｉｌｌｏら、（１９８８）、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｍａｔｈ．４８、１０７３に開示されるものを挙げることができる。同一性の好ましい決定方法は試験される配列間で最大の適合を与えるように設計する。同一性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムにコード化されている。
【００４２】
２配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの制限しない一例は、Ｋａｒｌｉｎら、（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７中のとおり改変されたＫａｒｌｉｎら、（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。こうしたアルゴ
リズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組込まれている。比較の目的上、ギャップをつけたアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記述されるとおり利用し得る。あるいは、分子間の離れた関係を検出するＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して反復検索を実施し得る。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用し得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。加えて、ＦＡＳＴＡ法（Ａｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３）もまた使用し得る。
【００４３】
配列の比較に有用な数学的アルゴリズムの別の制限しない例はＭｙｅｒｓら、（１９８８）、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれている。
【００４４】
好ましい一態様において、２配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手可能）に組込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して決定される。ＧＣＧのＧＡＰプログラムは、適合の数を最大化しかつギャップの数を最小化するように２種の完全な配列を整列する。
【００４５】
別の好ましい態様において、２配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＢｅｓｔＦｉｔプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手可能）に組込まれているＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８１、１４７（１）：１９５−７）の局部的相同性アルゴリズムを使用して決定される。ＢｅｓｔＦｉｔプログラムは２配列間の最良の類似セグメントの至適のアライメントを作成する。至適のアライメントは、適合の数を最大化するようにギャップを挿入することにより見出される。
【００４６】
ハイブリダイゼーションは、２種のポリヌクレオチドが相互に実質的に同一であることを示すための試験としてもまた使用し得る。十分な程度の同一性を共有するポリヌクレオチドはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で相互とハイブリダイズすることができる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、（１９８９）に記述されるところの当該技術分野で既知の意味するところを有する。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次いで５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での１回若しくはそれ以上の洗浄を含んでなる。
【００４７】
本明細書で使用されるところの「実質的に類似」は、同一の配列、ならびに、いずれかの生物学的に活性の部分を維持しかつその保存されたモチーフのいずれかを有するポリヌクレオチド若しくはポリペプチド配列に対する欠失、置換若しくは付加を包含する。
【００４８】
本明細書で使用されるところの「被験体」は、処置、観察若しくは実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【００４９】
本明細書で使用されるところの「標識（ｔａｇ）」は、該標識を含有するタンパク質の単離、精製若しくは検出を助長するアミノ酸配列若しくはアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。多様なこうした標識が当業者に既知でありかつ本発明での使用に適する。適する標識は、限定されるものでないがＨＡペプチド、ポリヒスチジンペプチド、ビオチン／アビジン、および多様な抗体エピトープ結合部位を挙げることができる。
【００５０】
本明細書で使用されるところの「治療上有効な量」という用語は、治療されている疾患若しくは障害の症状の軽減を包含する、研究者、獣医師、医師若しくは他の臨床家により探究されている組織系、動物若しくはヒトにおいて生物学的若しくは医学的応答を導き出す有効成分若しくは製薬学的剤の量を意味している。本製薬学的組成物の治療上有効な用量の決定方法は当該技術分野で既知である。
【００５１】
「ベクター」は、結合されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントを挿入し得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは付加的なＤＮＡセグメントを挿入し得るウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノム中に組込まれ、そしてそれにより宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクター、発現ベクターは、それらが作動可能に結合されている遺伝子の発現を指図することが可能である。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用なベクターはしばしばプラスミドの形態である。しかしながら、本発明は、同等の機能を供するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のようなこうした他の形態のベクターを包含することを意図している。
本発明の単離された核酸分子
本発明は、ヒトＣＯＸ−１遺伝子のエキソン１とエキソン２との間のイントロン１の保持の後の１回若しくは１回以上のＲＮＡ編集事象を介して形成されるヒトＣＯＸ−３遺伝子の存在を初めて示した。ヒトＣＯＸ−３ａタンパク質（配列番号９）は、ヒトＣＯＸ−１のエキソン１によりコードされるアミノ酸配列、ＲＮＡ編集後のヒトＣＯＸ−１のイントロン１によりコードされる３１アミノ酸（配列番号４）の挿入（配列番号３）、およびヒトＣＯＸ−１のエキソン２ないし１１によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる。ヒトＣＯＸ−３ｂタンパク質（配列番号１１）は、ヒトＣＯＸ−１のエキソン１によりコードされるアミノ酸配列、異なる部位でのＲＮＡ編集後のヒトＣＯＸ−１のイントロン１によりコードされる３１アミノ酸（配列番号６）の挿入（配列番号５）、およびヒトＣＯＸ−１のエキソン２ないし１１によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる。ヒトＣｏｘ−１のクローニングは以前に記述された（Ｙｏｋｏｙａｍａら、（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１６５（２）：８８８−９４）。ヒトＣＯＸ−１のｃＤＮＡ若しくはタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はそれぞれＮＭ＿０００９６２若しくはＮＰ＿０００９５３である。ヒトＣＯＸ−３およびＣＯＸ−１の遺伝子構造の比較を図２に具体的に説明する。
【００５２】
本発明の一局面は、ヒトＣＯＸ−３若しくはその生物学的に活性の部分をコードする単離された核酸分子、ならびに本発明のヒトＣＯＸ−３ポリペプチドをコードする核酸分子を同定若しくは増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ若しくはＰＣＲプライマーとしての使用のための長さ最低１２の連続したヌクレオチドの核酸分子に関する。
【００５３】
一態様において、本発明は、アラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することが可能でありかつ配列番号４若しくは配列番号６に対する約６０％以上のアミノ酸配列の同一性、好ましくは約６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、シクロオキシゲ
ナーゼ酵素の１メンバーをコードするヌクレオチド配列またはそれらの相補物を含んでなる単離された核酸分子を提供する。所定のヌクレオチド配列の相補物である核酸分子は、それが高ストリンジェンシーすなわちストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で所定のヌクレオチド配列にハイブリダイズしてそれにより安定な二重鎖を形成し得るように該所定のヌクレオチド配列に対し十分に相補性であるものである。
【００５４】
別の態様において、本発明は配列番号３若しくは配列番号５またはそれらの相補物の最低１２の連続するヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子を提供する。こうした単離された核酸分子は、他の細胞型中、例えば他の組織からのＣＯＸ−３の相同体ならびに他の哺乳動物からの相同体を同定かつ／若しくはクローン化するための核酸プローブとして使用し得る。該プローブ／プライマーは、典型的には、ストリンジェントな条件下で配列番号３若しくは配列番号５のセンス若しくはアンチセンス配列の最低約１２、２５、５０、７５若しくは９０の隣接するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる。
【００５５】
好ましい一態様において、本発明は配列番号８若しくは配列番号１０のヌクレオチド配列またはそれらの相補物を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【００５６】
別の好ましい態様において、本発明は、配列番号９若しくは配列番号１１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれらの相補物を含んでなる単離された核酸分子を提供する。例えば、本発明は、配列番号８若しくは配列番号１０に示されるところのヒトＣＯＸ−３ ｃＤＮＡの保存的置換である核酸分子若しくはその相補物を含んでなる単離された核酸分子を提供する。特定の１アミノ酸をコードするのに１種以上の遺伝暗号が使用される可能性があることが既知であり、そして従って配列番号９若しくは配列番号１１に描かれるところのヒトＣＯＸ−３のアミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡ分子のいずれかによりコードされ得る。該組の１メンバーのみが配列番号８若しくは配列番号１０に示されるところのｃＤＮＡ配列に同一であることができる。しかしながら、下で縮重バリアントと称される全バリアントが本発明の範囲内で企図されている。この中で、配列番号９若しくは配列番号１１として示されるアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする１種若しくはそれ以上の代替コドンをもつ核酸分子は、それぞれ配列番号８若しくは配列番号１０に示されるところのヒトＣＯＸ−３ ＤＮＡの保存的置換として定義される。
【００５７】
ヒトＣＯＸ−３核酸分子の天然の対立遺伝子バリアントがこの点に関してとりわけ好ましい。アミノ酸配列中の変化に至るＤＮＡ配列の多型が集団（例えばヒト集団）内に存在し得る。こうした遺伝子多型は天然の対立遺伝子変異により１集団内の個体間で存在し得る。対立遺伝子は所定の遺伝子座で代替に存在する一群の遺伝子の１つである。こうした天然の対立遺伝子変異は、典型的に、所定の１遺伝子のヌクレオチド配列中の１〜５％の不一致をもたらし得る。代替の対立遺伝子は、多数の異なる個体中の目的の遺伝子をシークェンシングすることにより、若しくは多様な個体中の同一の遺伝子座を同定するためにハイブリダイゼーションプローブを使用することにより同定し得る。
【００５８】
天然に存在するヒトＣＯＸ−３タンパク質と異なるがしかしその機能的活性をなお維持する特性を有するポリペプチドをコードする天然に存在することが知られていないいかなるおよび全部のこうしたヌクレオチド変異を有する核酸分子が、この点に関してさらにとりわけ好ましい。天然に存在する対立遺伝子バリアントのような天然に存在するバリアントに加え、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドのバリアントは天然に存在することが知られていないバリアントでもまたあり得る。ＤＮＡ配列は、天然に存在するペプチドのものと異なる特性を有するペプチドをコードするように人的に変えることができる。ＤＮＡ配列の変更方法は、限定されるものでないが部位特異的突然変異誘発、キメラ置換および遺伝子融合を挙げることができる。部位特異的突然変異誘発はサイレント変異、保存的
変異若しくは非保存的変異をもたらし得る１若しくはそれ以上のＤＮＡ残基を変えるのに使用する。キメラ遺伝子は類似の若しくは異なる遺伝子のドメインを交換してＣＯＸ−３遺伝子中の類似のドメインを置き換えることにより製造する。同様に、遺伝子およびタンパク質の同定および単離を助長するための親和性標識のようなドメインをＣＯＸ−３に付加する融合遺伝子を製造し得る。
【００５９】
本発明のヒトＣＯＸ−３核酸分子のバリアントは、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号３若しくは配列番号５にハイブリダイズすることが可能である。
【００６０】
本発明の核酸分子のなお別の好ましい態様はヒトＣＯＸ−３遺伝子に対応するｓｉＲＮＡである。多くの生物体は、遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞中に存在する場合にＲＮＡ干渉として知られる過程により遺伝子発現を抑制させるための機構を有する。特定の１遺伝子の活性を低下させるためにｄｓＲＮＡを使用する技術は、蠕虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を使用して最初に開発され、そしてＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉと命名された（Ｆｉｒｅら、（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１）。ＲＮＡｉは以来、多くの生物体で有用であることが見出され、そして最近、哺乳動物細胞に拡大された（Ｍｏｓｓによる総説、（２００１）、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：Ｒ７７２−５を参照されたい）。
【００６１】
ＲＮＡｉが２１〜２５ヌクレオチドの低分子ＲＮＡの生成を伴うことが示された場合に重要な進歩がなされた（Ｈａｍｍｏｎｄら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：２９３−６；Ｚａｍｏｒｅら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：２５−３３）。これらの低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡは、最初は該過程を開始するより大きなｄｓＲＮＡに由来するとみられ、そして最終的に分解される標的ＲＮＡに相補的である。ｓｉＲＮＡはそれら自身が各端で短い突出と二本鎖形成する。それらはガイドＲＮＡとしてはたらき、相補性領域中の標的の単一の切断を指図する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、（２００１）Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ １５：１８８−２００；Ｚａｍｏｒｅら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：２５−３３）。
【００６２】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは配列番号３若しくは配列番号５に示されるＣＯＸ−１のイントロン１のヌクレオチド配列に相補的である約２１〜２５ヌクレオチドを含んでなる。
【００６３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ系からの長さが好ましくは２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）のｓｉＲＮＡの製造方法、および細胞若しくは生物体中の遺伝子のｍＲＮＡを妨害するためのｓｉＲＮＡの使用は、第ＷＯ０１７５１６４ Ａ２号明細書に記述されている。
【００６４】
ｓｉＲＮＡは安定発現系を使用してｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物細胞からもまた作成し得る。例えば哺乳動物細胞中でのｓｉＲＮＡの合成を指図するｐＳＵＰＥＲと命名されたベクター系が報告された（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−３．）。
【００６５】
本発明はヒトＣＯＸ−３核酸分子の単離方法を提供する。ヒトＣＯＸ−３転写物、好ましくは高レベルのｈＣＯＸ−３転写物を有する細胞若しくは組織がｈＣＯＸ−３のｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡの単離に適する。適するｃＤＮＡ源の選択は、配列番号３若しくは配列番号５に描かれるところのＣＯＸ−１のイントロン１の転写物に特異的にハイブリダイズするプライマーを使用するヌクレオチドハイブリダイゼーション若しくはＲＴ−ＰＣＲ分析により細胞抽出物若しくは全細胞中のｈＣＯＸ−３転写物の存在についてスクリーニングすることにより実施し得る。ＣＯＸ−３核酸の単離のための例示的一供給源は大脳皮
質である。
【００６６】
当該技術分野で既知の多様な手順のいずれかを使用してヒトＣＯＸ−３タンパク質をコードする核酸分子を単離し得る。例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡライブラリー、または上で同定された適する細胞からの全ｍＲＮＡを鋳型としてかつ適切なオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、本発明の核酸分子を標準的なＰＣＲ増幅技術により増幅し得る。ＰＣＲからそのように増幅された核酸を適切なベクターにクローン化しかつＤＮＡ配列分析により特徴付けし得る。当業者は、配列番号３若しくは配列番号５の最低１２の隣接するヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドがプライマーとしてとりわけ有用であることを認識するであろう。プライマーは標準的合成技術により、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用して製造し得る。とりわけ好ましいプライマーは、ｈＣＯＸ−３遺伝子を検出するのに使用し得るがしかしＣＯＸ−１若しくはＣＯＸ−２のような他の既知のＣＯＸ遺伝子に結合しないものである。
【００６７】
ｈＣＯＸ−３核酸分子の別の単離方法は、当業者により認識される手順を使用して１種若しくはそれ以上の天然の若しくは人工的に設計したプローブでゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリー、またはあるいは全ｍＲＮＡをプロービングすることである。例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｅｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、１９８９、１９９２を参照されたい。当業者は、配列番号３若しくは配列番号５の最低１２の隣接するヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドがとりわけ有用なプローブであることを認識するであろう。プローブは最低２０、３０、４０若しくは５０塩基のような異なる長さを有し得る。こうしたプローブが、該プローブの同定を助長するように分析上検出可能な試薬で標識され得かつ好ましくは標識されることもまた認識される。有用な試薬は、限定されるものでないが放射性同位元素、蛍光色素若しくは検出可能な生成物の形成を触媒することが可能な酵素を挙げることができる。該プローブは、当業者が、全部過度の実験を伴わずに、ヒト、哺乳動物若しくは他の動物の供給源からのＣＯＸ−３タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡポリヌクレオチドの相補的なコピーを単離するか、またはこうした供給源、例えば家族の付加的なメンバー、型および／若しくはサブタイプを、転写調節および制御要素ならびに本明細書で開示されるコーディング配列に関し５’および／若しくは３’である領域からの他の安定性、プロセシング、翻訳および組織特異性を決定する領域を包含する関連配列についてスクリーニングすることを可能にする。
【００６８】
本発明の核酸分子の全部若しくは一部分に対応する核酸分子の別の製造方法は、標準的合成技術、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用することによる。
【００６９】
ｈＣＯＸ−３核酸分子の別の単離方法は逆遺伝学の方法を使用することによる。この例において、ＣＯＸ−３を精製し、そして部分的アミノ酸配列を自動化アミノ酸配列決定装置により決定する。特定の一アミノ酸配列の長さ全体を決定することは必要でないが、しかし、タンパク質からの４ないし８アミノ酸の２領域の直鎖配列が部分的なＣＯＸ−３のｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーの製造に必要である。適するアミノ酸配列が一旦同定されれば、それらをコードすることが可能なＤＮＡ配列を標準的合成技術により、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用するか、あるいはｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡライブラリーまたは全ｍＲＮＡを鋳型としてかつ該アミノ酸配列から推定される１５ないし３０の縮重オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する確立したＰＣＲ増幅技術に従った縮重ＰＣＲによるかのいずれかで合成し得る。１種以上の遺伝暗号が特定の１アミノ酸をコードするのに使用されている可能性があるため、アミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされ得る。従って、既知のアミノ
酸配列に基づく縮重ＰＣＲプライマーの設計において、特定の宿主におけるコドン使用頻度を考慮に入れる。しばしば、各プライマーは、鋳型ＤＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを助長するようにオリゴヌクレオチドのプールを含有する。最大でプールの１メンバーのみがｈＣＯＸ−３配列に同一であることができかつｈＣＯＸ−３ ＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であることができるとは言え、わずかに不適合のプライマーもまた、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でｈＣＯＸ−３ ＤＮＡにハイブリダイズしてＰＣＲ増幅反応を開始することが可能である。
【００７０】
同定された供給源細胞からのｃＤＮＡライブラリーの調製もまた当該技術分野で公知の標準的技術により実施し得る。公知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に見出し得る。
【００７１】
同定された供給源細胞からの全ｍＲＮＡの単離は当該技術分野で公知の標準的技術により実施し得る。公知の全ｍＲＮＡ単離技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、上記に見出し得る。
【００７２】
ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は当該技術分野で公知の標準的技術により実施し得る。公知のゲノムＤＮＡライブラリーの構築技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記に見出し得る。
組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の局面は本発明の核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
【００７３】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含んでなる。組換え発現ベクターは発現に使用されるべき宿主細胞に基づき選択された１個若しくはそれ以上の制御配列を包含する。これらの制御配列は発現されるべき核酸配列に作動可能に結合される。組換え発現ベクター内で、「作動可能に結合される」という用語は、目的のヌクレオチド配列が該ヌクレオチド配列の発現（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、若しくはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞中で）を見込む様式で制御配列（１種若しくは複数）に結合されることを意味している。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル、および遺伝子発現の当業者に既知であるその他の考慮のような因子に依存し得ることが当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、本明細書に記述されるところの核酸によりコードされる融合タンパク質若しくはペプチドを包含するタンパク質若しくはペプチドを生成させ得る。
【００７４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））若しくは真核生物細胞（例えば、例えばバキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞）、酵母細胞若しくは哺乳動物細胞）中での本発明のポリペプチドの発現のため設計し得る。適する宿主細胞は当業者に既知である。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで転写かつ翻訳し得る。
【００７５】
原核生物中でのタンパク質の発現は、しばしば、融合若しくは非融合いずれかのタンパク質の発現を指図する構成的若しくは誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で実施する。融合ベクターは該ベクターによりコードされるタンパク質に多数のアミノ酸を付加する（通常は組換えタンパク質のアミノ末端にアミノ酸を付加する）。こうした融合ベクターは、典型的に４つの目的、すなわち１）組換えタン
パク質の発現を増大させること；２）組換えタンパク質の溶解性を増大させること；３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製にて補助すること；４）マーカーとしてはたらくことにより組換えタンパク質の検出を助長することにかなう。しばしば、融合発現ベクターにおいては、融合タンパク質の精製後の融合部分からの組換えタンパク質の精製を可能にするように、タンパク質分解性の切断部位が融合部分および組換えタンパク質の結合部に導入される。こうした酵素およびそれらのコグネイトの認識配列は第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、プロテインＡ、若しくはポリ−Ｈｉｓを融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈら、（１９８８）、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、若しくはｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ）を包含する。こうしたベクターは本発明の範囲内に企図されている。
【００７６】
適する誘導可能な非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、（１９８８）、Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）６０−８９）を包含する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での組換えタンパク質発現を最大化するための一戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解性に切断する損なわれた能力を伴う宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で優先的に利用されるものとなるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである。本発明の核酸配列のこうした変更は標準的ＤＮＡ合成技術により実施し得る。
【００７７】
別の態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）中での発現のためのベクターの例は、例えば、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒＪａｎら、（１９８２）、Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）、Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）およびｐＰｉｃＺ若しくはＰｉｃｈｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州サンディエゴ）を包含する。
【００７８】
あるいは、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、限定されるものでないがｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗら、（１９８９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）ならびにｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を挙げることができる。
【００７９】
なお別の態様において、発現ベクターは哺乳動物発現ベクターである。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの調節要素により提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０由来である。哺乳動物発現ベクターの例は、限定されるものでないがｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｉｎａｎら、（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ ６：１８７−１９５）を挙げることができる。組換えＣＯＸ−３発現に適し得る商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、限定されるものでないがｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤ
ＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）およびｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）を挙げることができる。
【００８０】
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指図することが可能である（例えば、組織特異的調節要素を使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節要素は当該技術分野で既知である。適する組織特異的プロモーターの制限しない例は、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら、（１９８７）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、Ｔ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏら、（１９８９）、ＥＭＢＯ Ｊ ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（ＢａｎｅｉＪｉら、（１９８３）、Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎら、（１９８３）、Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）のプロモーターを包含するリンパ球様特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅら、（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）を包含する。他のプロモーターはニューロン特異的プロモーター（例えば神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｍｅら、（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）および乳腺特異的プロモーター（例えばミルクホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）を包含する。発達で調節されるプロモーターは例えば海生ｈｏｘ（ｍａｒｉｎｅ ｈｏｘ）プロモーター（Ｋｅｓｓｅｌら、（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびβ−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓら、（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含する。
【００８１】
本発明はさらに、アンチセンスの向きで発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換えベクターを提供する。すなわち、該ＤＮＡ分子は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を見込む様式で制御配列に作動可能に結合される。多様な細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図することが可能である、アンチセンスの向きでクローン化された核酸に作動可能に結合された制御配列を選択し得、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的若しくは細胞型特異的発現を指図するウイルスのプロモーターおよび／若しくはエンハンサーまたは制御配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率の調節領域（その活性は該ベクターが導入された細胞型により決定され得る）の制御下で生成される、組換えプラスミド、ファージミド若しくは弱毒性ウイルスの形態であり得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）１９８６）を参照されたい。
【００８２】
本発明はまた、哺乳動物細胞中での低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成を指図する組換えベクター系も提供する。哺乳動物細胞中でのｓｉＲＮＡの合成を指図する例示的一ベクター系はｐＳＵＰＥＲ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、２００２、上記）である。ｐＳＵＰＥＲ上で、Ｈ１−ＲＮＡプロモーターを遺伝子特異的ターゲッティング配列（同一配列の逆相補物から短いスペーサーにより分離されている標的転写物からの１９ｎｔの配列）および終止シグナルとしての５個のチミジン（Ｔ５）の前にクローン化した。生じる転写物は、それ自身上で折り返されてＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＬｅｔ−７のものに似た１９塩基対のステム−ループ構造を形成すると予測される。該ループ（短い
スペーサー）の大きさは好ましくは９ｂｐである。ポリアデノシン尾部を欠き、十分に定義された転写開始および一列の５個のチミジン（Ｔ５）よりなる終止シグナルを伴う低分子ＲＮＡ転写物が生成された。最も重要なことには、終止部位での該転写物の切断が第二のウリジンの後であり２個の３’の突出したＴ若しくはＵヌクレオチドもまた含有する合成ｓｉＲＮＡの末端に似た転写物を生じる。ｐＳＵＰＥＲから発現されるｓｉＲＮＡは合成ｓｉＲＮＡと同じくらい効率的に遺伝子発現を崩壊させることが可能である。
【００８３】
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母若しくは細菌−動物細胞若しくは細菌−真菌細胞若しくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡのシャトリングを可能にする。多数のクローニングベクターが当業者に既知であり、そして適切なクローニングベクターの選択は選択の問題である。原核生物および真核生物双方の細胞のための他の適する発現系については、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記の第１６および１７章を参照されたい。
【００８４】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された組換え宿主細胞に関する。
【００８５】
トランスフェクションに適することができかつ商業的に入手可能である哺乳動物種由来の細胞株は、限定されるものでないが、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、キイロショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）若しくはネズミのＬ−細胞、およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）ならびにサル腎細胞を挙げることができる。
【００８６】
ベクターＤＮＡは慣習的な形質転換若しくはトランスフェクション技術を介して原核生物若しくは真核生物細胞に導入し得る。本明細書で使用されるところの「形質転換」若しくは「トランスフェクション」という用語は、細胞が外来ＤＮＡを取り込みかつその外来ＤＮＡをそれらの染色体に組込んでも若しくは組込まなくてもよい過程を指す。トランスフェクションは例えばリン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法、プロトプラスト融合を包含する多様な技術により達成し得る。宿主細胞の適する形質転換若しくはトランスフェクション方法はＭａｎｉａｔｉｓら（上記）および他の実験室手引き書に見出し得る。
【００８７】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小画分のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組込みうることが既知である。これらの組込み体を同定かつ選択するために、選択可能なマーカー（例えばある薬物に対する耐性についての）をコードする遺伝子を一般に目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を賦与するものを包含する。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞を薬物選択により同定し得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組込んだ細胞は生き残ることができる一方、他の細胞は死ぬ）。
【００８８】
別の態様において、細胞、細胞株若しくは微生物内の内因性のｈＣＯＸ−３核酸の発現の特徴を、挿入された調節要素が内因性遺伝子と効果的に結合しかつ該内因性遺伝子を制御、調節若しくは活性化するような細胞、安定細胞株若しくはクローン化微生物のゲノム中に目的の内因性遺伝子に対し異種のＤＮＡ調節要素を挿入することにより改変し得る。
【００８９】
異種調節要素は安定細胞株若しくはクローン化微生物中に挿入し得、その結果、それは当業者に公知でありかつ例えばＣｈａｐｐｅｌ、米国特許第５，２７２，０７１号明細書；１９９１年５月１６日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ ９１／０６６６７号明細書に記述されるターゲッティングされた（ｔａｒｇｅｔｅｄ）相同的組換えのような技術を使用して、内因性のｈＣＯＸ−３遺伝子に効果的に結合されかつそれの発現を活性化する。
【００９０】
本発明の組換え宿主細胞はまたヒト以外のトランスジェニック動物を製造するのにも使用し得る。例えば、一態様において、本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドをコードする配列を導入した受精卵若しくは胚幹細胞である。こうした宿主細胞をその後、本発明のポリペプチドをコードする外因性の配列がそれらのゲノム中に導入されたヒト以外のトランスジェニック動物、若しくは本発明のポリペプチドをコードする内因性の配列が変えられた相同的組換え動物を創製するのに使用し得る。こうした動物は該ポリペプチドの機能および／若しくは活性を研究するため、ならびにポリペプチド活性の調節物質を同定かつ／若しくは評価するために有用である。本明細書で使用されるところの「トランスジェニック動物」は、該動物の細胞の１個若しくはそれ以上が導入遺伝子を包含するヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラット若しくはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例はヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを包含する。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれかつ成熟動物のゲノム中に留まってそれにより該トランスジェニック動物の１種若しくはそれ以上の細胞型若しくは組織中でのコードされる遺伝子産物の発現を指図する外因性ＤＮＡである。ヒト以外のトランスジェニック動物のクローンはＷｉｌｍｕｔら、（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３ ８ ５：８ １０−８１３ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ ９７／０７６６８号および同第ＷＯ ９７／０７６６９号明細書に記述される方法に従ってもまた製造し得る。
本発明の単離されたポリペプチド
本発明の他の一局面は実質的に精製されたｈＣＯＸ−３ポリペプチドに関する。本発明は、アラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することが可能でありかつ配列番号４若しくは配列番号６に対する約６０％以上のアミノ酸配列の同一性、好ましくは約６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。２種のポリペプチド間の配列の同一性は上述された方法を使用して決定し得る。
【００９１】
好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは配列番号９若しくは配列番号１１に実質的に同一であるアミノ酸配列を含んでなる。
【００９２】
本発明の単離されたポリペプチドはキメラ若しくは融合タンパク質を包含する。本明細書で使用されるところの「キメラタンパク質」若しくは「融合タンパク質」は異種ポリペプチド（すなわち本発明の同一のポリペプチド以外のポリペプチド）の全部若しくは一部に作動可能に結合された本発明のポリペプチドの全部若しくは（好ましくは生物学的に活性の）一部を含んでなる。融合タンパク質内で、「作動可能に結合される」という用語は、本発明のポリペプチドおよび該異種ポリペプチドが相互にインフレームで融合されることを示すことを意図している。異種ポリペプチドは本発明のポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に融合し得る。
【００９３】
有用な融合タンパク質の一例は、本発明のポリペプチドがＨＡおよびポリＨｉｓから作成される標識にＣ末端で融合されるＨＡＨｉｓ融合タンパク質である。こうした融合タンパク質は本発明の組換えポリペプチドの検出および精製を助長する。
【００９４】
本発明は本発明のポリペプチドの発現若しくは単離方法に関する。一態様において、ポ
リペプチドは標準的なタンパク質精製技術を使用した適切な精製スキームにより、天然に該タンパク質を発現する細胞若しくは組織供給源から単離し得る。別の態様において、本発明のポリペプチドは組換えＤＮＡ技術により製造する。あるいは、本発明のポリペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および／若しくは転写系で合成し得る。さらにあるいは、本発明のポリペプチドは標準的ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【００９５】
本発明のポリペプチドは、本発明のＤＮＡ分子を上述された発現ベクターにクローン化すること、こうしたベクターを本明細書に記述される原核生物若しくは真核生物宿主細胞に導入すること、および組換えｈＣＯＸ−３タンパク質の生成に適する条件下で該宿主細胞を増殖させることにより組換え的に発現させ得る。発現ベクターを含有する細胞をクローン的に繁殖させ、そして個別に分析してそれらがｈＣＯＸ−３タンパク質を生成するかどうかを決定する。ｈＣＯＸ−３を発現する宿主細胞クローンの同定は、限定されるものでないが、抗ｈＣＯＸ−３抗体との免疫学的反応性および宿主細胞と関連するｈＣＯＸ−３活性の存在を挙げることができるいくつかの手段により行うことができる。適切な増殖条件および回収方法の選択は当該技術分野の熟練内にある。ポリペプチドの組換え的発現技術はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ，ら、上記に完全に記述され、そして当該技術分野で公知である。
【００９６】
本発明のポリペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および／若しくは転写系を使用してもまた製造し得る。こうした方法は当業者に既知である。例えば、合成のｈＣＯＸ−３ ｍＲＮＡ若しくはｈＣＯＸ−３生成細胞から単離したｍＲＮＡは、限定されるものでないがコムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳され得る。あるいは、ｈＣＯＸ−３ ｃＤＮＡのコーディング配列をＴ７プロモーターの制御下にクローン化し得る。その後、この構築物を鋳型として使用して、例えばＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から商業的に入手可能なもののようなＴＮＴ Ｔ７と組み合わせた（ｃｏｕｐｌｅｄ）網状赤血球ライセート系を使用して、ｈＣＯＸ−３タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳系で生成させ得る。
【００９７】
本発明のポリペプチドはまた、既知のアミノ酸配列若しくは目的の遺伝子のＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列を使用する自動化ペプチド合成機での固相ペプチド合成のような化学合成によっても製造し得る。
【００９８】
ヒトＣＯＸ−３タンパク質は当業者に既知の方法により精製し得る。例えば、天然の宿主細胞からのｈＣＯＸ−３、若しくは組換え宿主からの組換えｈＣＯＸ−３を、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ならびにＦＰＬＣ、ならびに抗体／リガンドアフィニティークロマトグラフィーの多様な組合せ若しくは個別の適用により、細胞ライセートおよび抽出物若しくは馴化培地から精製し得る。
【００９９】
例えば、ｈＣＯＸ−３タンパク質は、生来のｈＣＯＸ−３若しくはそのフラグメントに特異的なモノクローナル若しくはポリクローナル抗体を用いて作成した免疫親和性カラムの使用により他の細胞性タンパク質から分離し得る。抗体アフィニティーカラムは、該抗体がゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようなゲル支持体に抗体を添加することにより作成する。好ましい共有結合は抗体上に含有されるアミン、アルデヒド若しくはスルフヒドリル残基により作成される。抗体上のアルデヒド若しくは遊離スルフヒドリル基の生成方法は当該技術分野で公知であり、例えば、アミン基は一例においてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応性である。該アフィニティー樹脂をその後、適する緩衝液、例えばリン酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化し、そしてｈＣＯＸ−３を含有する細胞培養上清若しくは細胞抽出物にカラムをゆっくりと通過させる。カラムをその後、
光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドまで下落するまで緩衝液で洗浄する。その後、０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）のような緩衝液を使用してｐＨを低下させることによるような緩衝条件を変えることによりタンパク質を溶出する。精製したｈＣＯＸ−３タンパク質をその後、リン酸緩衝生理的食塩水のような適する緩衝液に対し透析する。
本発明のポリペプチドに対する抗体
本発明の別の局面は本発明のヒトＣＯＸ−３に特異的に結合する抗体に関する。とりわけ、該抗体は配列番号４若しくは配列番号６に対する約６０％以上のアミノ酸配列の同一性、好ましくは約６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドに特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体はヒトＣＯＸ−１若しくはヒトＣＯＸ−２を認識することができないがしかしヒトＣＯＸ−３のみを認識することができる。多様な態様において、本発明の実質的に精製された抗体若しくはそれらのフラグメントはヒト、ヒト以外、キメラおよび／若しくはヒト化抗体であり得る。本発明のこうした抗体および抗体フラグメントは、限定されるものでないがヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウマ、ニワトリ若しくはウサギ抗体のような多様な供給源由来であり得る。本発明に関する抗体はポリクローナル若しくはモノクローナル抗体であり得る。
【０１００】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造のための標準的技術を使用して抗体を生成するための免疫原として使用し得る配列番号４若しくは配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド、またはそれらのフラグメント。とりわけ好ましい免疫原組成物は、例えば動物以外の宿主細胞すなわち細菌宿主細胞から組換え的に発現された免疫原若しくは化学合成したオリゴペプチドのような他の動物タンパク質を含有しないものである。
【０１０１】
ポリクローナル抗体は、免疫アジュバントとともに若しくは伴わずに本発明の免疫原でマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなど（ウサギが好ましい）のような適する被験体動物を免疫することにより生じさせ得る。免疫前血清を第一の免疫化前に収集し得る。好ましくは、各動物は許容できる免疫アジュバントと会合した若しくはしていない約０．００１ｍｇと約１０００ｍｇとの間の免疫原を受領する。こうした許容できるアジュバントは、限定されるものでないがフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈殿物、ざ瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）およびｔＲＮＡを含有する油中水型乳剤を挙げることができる。初期免疫化は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）のいずれか若しくは双方の複数の部位での好ましくはフロイントの完全アジュバント中の免疫原よりなる。各動物は定期的な間隔で（好ましくは毎週）採血して抗体力価を測定する。動物は初期免疫化後に追加免疫注入を受領しても若しくはしなくてもよい。追加免疫注入を受領する動物は、一般に、フロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を同一経路により与えられる。追加免疫注入は最大の力価が得られるまで約３週間隔で与える。各追加免疫注入後７日に、若しくは単一の免疫化後ほぼ毎週、動物を採血し、血清を収集し、そしてアリコートを約−２０℃で保存する。
【０１０２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は近交系マウス（好ましくはＢａｌｂ／ｃ）を免疫原で免疫して製造する。マウスは、上で論考されたとおり、等容量の許容できるアジュバント中に組込んだ約０．１ｍｌの緩衝液若しくは生理的食塩水中の約０．００１ｍｇないし約１．０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇの免疫原でＩＰ若しくはＳＣ経路により免疫する。フロイントのアジュバントが好ましく、フロイントの完全アジュバントを初回免疫化に使用しかつフロイントの不完全アジュバントをその後使用する。マウスは第０日に初回免疫化を受領しかつ約２ないし約３０週間休ませる。免疫したマウスに、リン酸緩衝生理的食塩水のような緩衝溶液中の約０．００１ないし約１．０ｍｇのヒトＣＯＸ−３若しくはそ
のフラグメントの１回若しくはそれ以上の追加免疫を静脈内（ＩＶ）経路により与える。抗体陽性マウスからのリンパ球（好ましくは脾リンパ球）は、免疫したマウスから当該技術分野で既知の標準的手順により脾を取り出すことにより得る。ハイブリドーマ細胞は、安定なハイブリドーマの形成を可能にすることができる条件下で脾リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と混合することにより製造する。融合パートナーは限定されるものでないが：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０を挙げることができ、Ｓｐ２／０が一般に好ましい。抗体生成細胞および骨髄腫細胞を約３０％から約５０％までの濃度のポリエチレングリコール（分子量約１０００）中で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、当該技術分野で既知の手順によりヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での増殖により選択する。上清液体を増殖陽性のウェルから約第１４、１８および２１日に収集し、そして抗原としてヒトＣＯＸ−３若しくはそのフラグメントを使用する固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより抗体生成についてスクリーニングする。培養液体はまた、ｍＡｂのアイソタイプを決定するためにオークターロニー沈降アッセイでも試験し得る。抗体陽性のウェルからのハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＫｒｕｓｅとＰａｔｅｒｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９７３中のソフトアガー技術のような既知の技術若しくは制限希釈技術によりクローン化する。
【０１０３】
モノクローナル抗体は、プライミング後最低約４日の約１×１０６ないし約６×１０６ハイブリドーマ細胞を用いるマウスあたりおよそ０．５ｍｌのプリスタンでプライミングしたＢａｌｂ／ｃマウスの注入によりｉｎ ｖｉｖｏで生成させる。細胞移入後およそ８〜１２日に腹水を収集し、そしてモノクローナル抗体を当該技術分野で既知の技術により精製する。
【０１０４】
モノクローナルＡｂはまた、当該技術分野で公知の組織培地中でハイブリドーマを増殖させることによりｉｎ ｖｉｔｒｏでも製造し得る。高密度のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物を伝導して、当該技術分野で公知の中空ファイバー培養技術、エアリフトリアクター、ローラーボトル若しくはスピナーフラスコ培養技術を使用して大量のｍＡｂを生成させる。ｍＡｂは当該技術分野で既知の技術により精製する。
【０１０５】
腹水若しくはハイブリドーマ培養液体の抗体力価は、限定されるものでないが沈降法、受動凝集、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を挙げることができる多様な血清学的若しくは免疫学的アッセイにより測定する。類似のアッセイを使用して体液若しくは組織および細胞抽出物中のＣＯＸ−３の存在を検出する。
【０１０６】
抗体分子は哺乳動物（例えば血液）若しくは培養細胞から単離しかつプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製してＩｇＧ画分を得ることができる。あるいは、本発明のタンパク質若しくはポリペプチドに特異的な抗体は例えばアフィニティークロマトグラフィーについて選択（例えば部分的に精製）若しくはそれにより精製し得る。例えば、本発明の組換えで発現されかつ精製（若しくは部分的に精製）されるタンパク質を本明細書に記述されるとおり製造し、そして例えばクロマトグラフィーカラムのような固体支持体に共有若しくは非共有結合する。その後該カラムを使用して、多数の異なるエピトープに向けられた抗体を含有するサンプルから本発明のタンパク質に特異的な抗体をアフィニティー精製して、それにより実質的に精製された抗体組成物、すなわち汚染する抗体を実質的に含まないものを生成させ得る。実質的に精製された抗体組成物により、この情況において、抗体サンプルがせいぜいわずか３０％（乾燥重量）の本発明の所望のタンパク質若しくはポリペプチド上のもの以外のエピトープに向けられた汚染する
抗体を含有することを意味しており、そして、好ましくはサンプルのせいぜい２０％、なおより好ましくはせいぜい１０％、および最も好ましくはせいぜい５％（乾燥重量）が汚染する抗体である。精製された抗体組成物は、該組成物中の抗体の最低９９％が本発明の所望のタンパク質若しくはポリペプチドに向けられていることを意味している。
【０１０７】
加えて、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作成し得るヒトおよびヒト以外の双方の部分を含んでなるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗体が本発明の範囲内にある。キメラ抗体は、その中で多様な部分がマウスｍＡｂ由来の可変領域−およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような異なる動物種由来である分子である（例えばＣａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。ヒト化抗体はヒト以外の種からの１種若しくはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からの枠組み領域を有するヒト以外の種からの抗体分子である（例えばQｕｅｅｎ、米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照されたい）。こうしたキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ ８７／０２６７１号明細書に記述される方法を使用して、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により製造し得る。
【０１０８】
完全にヒトの抗体がヒト患者の治療的処置にとりわけ望ましい。こうした抗体は例えば内因性の免疫グロブリンＨおよびＬ鎖遺伝子を発現することが不可能でありかつヒトＨおよびＬ鎖遺伝子もまた発現し得るトランスジェニックマウスを使用して製造し得る。該トランスジェニックマウスを、選択した抗原、例えば本発明のポリペプチドの全部若しくは一部分で通常の様式で免疫する。該抗原に向けられたモノクローナル抗体は慣習的ハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスにより担持されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子がＢ細胞分化の間に再配列し、そしてその後クラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。従って、こうした技術を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を製造することが可能である。ヒト抗体の製造のためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇら、（１９９５）、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照されたい。
【０１０９】
選択したエピトープを認識する完全にヒトの抗体は「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技術を使用して生成し得る。このアプローチにおいて、選択したヒト以外のモノクローナル抗体（例えばマウス抗体）を使用して、同一エピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択が誘導される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、（１９９４）、Ｂｉｏｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【０１１０】
本発明の抗体（例えばモノクローナル抗体）を使用して、アフィニティークロマトグラフィー若しくは免疫沈降法のような標準的技術により本発明のポリペプチドを単離し得る。さらに、こうした抗体を使用して、該ポリペプチドの豊富さおよび発現パターンを評価するために（例えば細胞ライセート若しくは細胞上清または細胞膜調製物中の）該タンパク質を検出し得る。該抗体は例えば、例えば所定の処置レジメンの有効性を決定するための臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターするために診断的にもまた使用し得る。検出は抗体を検出可能な物質に結合することにより助長し得る。検出可能な物質の例は、多様な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射活性物質を包含する。適する酵素の例は、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適する補欠分子団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適する蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド若しくはフィコエリトリンを包含し；発光物質の一例はルミノールを包含し；生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを包含し、そして適する放
射活性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ若しくは３Ｈを包含する。
【０１１１】
さらに、抗体（若しくはそのフラグメント）はサイトトキシン、治療薬若しくは放射活性金属イオンのような治療的部分に複合させ得る。サイトトキシンすなわち細胞傷害性の剤は細胞に有害であるいかなる剤も包含する。例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、Ｉ−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらのアナログ若しくは相同体を包含する。治療薬は、限定されるものでないが、代謝拮抗薬（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮ−ＬＪ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（１１）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソラビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂薬（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）を挙げることができる。
【０１１２】
本発明の複合物は所定の生物学的応答を改変するのに使用し得、該薬物部分は古典的な化学的治療薬に制限されると解釈されるべきでない。例えば、薬物部分は所望の生物活性を有するタンパク質若しくはポリヌクレオチドであり得る。あるいは、抗体を第二の抗体と複合させて米国特許第４，６７６，９８０号明細書にＳｅｇａｌにより記述されるところの抗体異種複合物を形成し得る。
検出方法
本発明はまた、サンプル中の本発明のポリペプチド若しくは核酸の検出方法にも関する。該サンプルは、限定されるものでないが被験体から採取した生物学的サンプル、化学合成したサンプルおよび実質的に精製されたサンプルを挙げることができるいかなる型のサンプルでもあり得る。こうしたアッセイを診断目的上使用し得る。
【０１１３】
一態様において、本発明は、配列番号３若しくは配列番号５の配列をもつ核酸分子にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸プローブとサンプルを接触させる段階、および該プローブ−核酸分子複合体を検出する段階を含んでなる、ヒトＣＯＸ−３遺伝子の核酸分子の検出方法を提供する。限定されるものでないがノーザン若しくはサザンハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲを挙げることができる核酸分子の検出方法は当業者に既知である。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％、８０％若しくは９０％の配列の同一性を有するポリペプチドに選択的に結合する抗体とサンプルを接触させる段階、および該タンパク質−抗体複合体を検出する段階を含んでなる、ヒトＣＯＸ−３タンパク質の検出方法を提供する。限定されるものでないが酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫組織化学を挙げることができるポリペプチドの検出方法が当業者に既知である。
【０１１５】
ｈＣＯＸ−３タンパク質はまたサンプル内のシクロオキシゲナーゼ−３活性を測定することによっても検出し得る。こうしたアッセイは：ａ）シクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である剤とともに試験サンプルをインキュベートする段階；ｂ）シクロオキシゲナーゼの基質を試験サン
プルに曝露する段階；およびｃ）試験サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性を測定する段階、およびそれを対照のものと比較する段階を含んでなり、ここで、試験サンプルはシクロオキシゲナーゼの基質に曝露され、そしてシクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である剤に曝露されない。
【０１１６】
シクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である剤はイヌＣＯＸ−３の研究に基づき当該技術分野で既知である（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００２、上記）。こうした剤はアセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナク、イブプロフェンなどから選択し得る。
【０１１７】
上に列挙される剤はＣＯＸ−３活性を優先的に阻害するため、これらの剤は、ＣＯＸ−１若しくはＣＯＸ−２を含んでなるサンプル中よりもＣＯＸ−３を含んでなるサンプル中でより大きくシクロオキシゲナーゼ活性を低下させるであろう。
【０１１８】
多数の方法を使用して生物学的サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性を測定し得る。好ましい一態様において、ＣＯＸ活性は放射測定（Ｄｙｅｒら、１９９５、Ｉｎｆｌａｍ．Ｒｅｓ．４４、Ｓ２４１）若しくはイムノアッセイ技術（Ｒｅｉｔｚら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：３８７８−３８８１）を使用して、アラキドン酸から生成されるプロスタノイドの量により測定し得る。アラキドン酸から生成されるプロスタノイドは、限定されるものでないがＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２およびトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）を挙げることができる。一態様において、ＣＯＸ活性は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．からのキット、バイオトラク［ＢｉｏＴｒａｋ］ＴＭ ＰＧＥ２を使用するエンザイムイムノアッセイにより、アラキドン酸から生成されるＰＧＥ２の量により測定し得る。別の例において、ＣＯＸ活性は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙからの商業的に入手可能なキット（カタログ番号５６０１３１若しくは５６０１０１）を使用して、ＥＩＡを介してのＣＯＸ由来のＰＧＨ２のＳｎＣｌ還元により生成されるＰＧＦ２αの量により測定し得る。あるいは、ＣＯＸ活性は、ＰＧＥ２若しくはＰＧＦ２αの量を測定するためのものに類似の方法を使用して、アラキドン酸から生成される他のプロスタノイドの量により測定し得る。
【０１１９】
別の態様において、ＣＯＸ活性は基質の存在下でのＣＯＸ依存性の酸素消費量を測定することにより測定し得る（Ｓｃｈｅｗｅら、１９９１、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、４６、８０４−８０９；Ｈｓｕａｎｙｕら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１７６４９−１７６５７）。
【０１２０】
別の好ましい態様において、ＣＯＸ活性はＣＯＸ酵素と関連するペルオキシダーゼ活性により測定し得る。ペルオキシダーゼ活性はヒドロペルオキシドＰＧ２のＰＧＨ２へのその後の還元を触媒する。ＣＯＸのペルオキシダーゼ活性は、ホモバリニン酸（Ｐｅｒｃｉｖａｌら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１５：１１１−１１８）若しくはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）（Ｃｏｐｅｌａｎｄら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１１２０２−１１２０６）のような色素形成性若しくは蛍光発生性である還元剤の補助基質を使用して測定し得る。あるいは、ＣＯＸのペルオキシダーゼ活性はリアルタイム発光アッセイ（Ｆａｒａｎｚら、１９９８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６４：２１６−２２１）でのルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１−４−フタラジンジオン）の還元により測定し得る。
【０１２１】
多様な商業的に入手可能なキットを使用してＣＯＸと関連するペルオキシダーゼ活性を測定し得る。例えば、ペルオキシダーゼに誘導されるルミノール発光アッセイキットがＡ
ｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．（カタログ番号９０７−００３）から入手可能であり；また、化学発光アッセイキットはＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（カタログ番号７６０１０１）から入手可能であり；および比色アッセイキット（カタログ番号７６０１１１）はＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから。
【０１２２】
本発明はまた、生物学的サンプル（試験サンプル）中の本発明のポリペプチド若しくは核酸の存在を検出するためのキットも包含する。こうしたキットを使用して、被験体がｈＣＯＸ−３に関係する障害に罹っているか若しくはそれを発症する増大した危険にさらされているかどうかを決定し得る。こうしたキットは、好ましくは、緊密な局限の最低１個の容器中に保持するのに適する区分された担体を含んでなる。該担体は標識抗原若しくは酵素基質などのような検出のための手段を含有し得る。例えば、該キットは、該ポリペプチド若しくは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することが可能な標識化合物若しくは剤、ならびにサンプル中のポリペプチド若しくはｍＲＮＡの量を測定するための手段（例えば、該ポリペプチドを結合する抗体、または該ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含み得る。該キットはまた、該ポリペプチド若しくは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量が正常レベルより上若しくは下である場合に試験被験体が該ポリペプチドの異常発現と関連する障害に罹っているか若しくはそれを発症する危険にさらされているかどうかを決定するための説明書も包含し得る。
【０１２３】
抗体に基づくキットについて、該キットは、例えば：（１）配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに選択的に結合する第一の抗体（例えば固体支持体に結合された抗体）、および、場合によっては；（２）第一の抗体、若しくは、第一の抗体が異なるエピトープに結合しかつ第二の抗体が検出可能な剤に複合するポリペプチドのいずれかに結合する第二の抗体；および（３）陽性対照としての精製された組換えｈＣＯＸ−３タンパク質を含み得る。好ましくは、第一の抗体はヒトＣＯＸ−３にのみ結合するがしかしヒトＣＯＸ−１若しくはヒトＣＯＸ−２、またはイヌのような他の種からのＣＯＸ−３に結合しない。
【０１２４】
ｈＣＯＸ−３活性に基づくキットについて、該キットは、例えば：（１）ＣＯＸ−１若しくはＣＯＸ−２のいずれよりもＣＯＸ−３の阻害においてより強力である剤；（２）ＣＯＸ−３の基質；（３）ＣＯＸ活性を検出するのに使用し得る手段、および（４）陽性対照としての精製された組換えｈＣＯＸ−３タンパク質を含み得る。シクロオキシゲナーゼ−１若しくはＣＯＸ−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である剤は、アセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナク、イブプロフェンなどから選択し得る。ＣＯＸ−３の基質は、結合されたアラキドン酸、またはＣＯＸ−３のペルオキシダーゼ活性により触媒される場合に色素形成性、蛍光発生性若しくは発光を生成することが可能である還元剤の補助基質と結合されたアラキドン酸であり得る。こうした還元剤の補助基質は、限定されるものでないがホモバニリン酸、ＴＭＰＤ、ルミノールなどを挙げることができる。ＣＯＸ活性を検出するのに使用し得る手段は、ＥＩＡによりアラキドン酸からの生成されたプロスタノイドを検出する、または還元剤の補助基質から生じる色素形成、蛍光発生若しくは発光反応を検出するための手段であり得る。
【０１２５】
オリゴヌクレオチドに基づくキットについて、該キットは、例えば：（１）配列番号３若しくは配列番号５に対する最低８０％の配列の同一性を有する核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の配列の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を増幅するのに有用な一対のプライマーを含み得る。該キットはまた、例えば緩衝剤、保存剤若しくはタンパク質安定剤も含み得る。該キットはまた、
検出可能な剤（例えば酵素若しくは基質）を検出するのに必要な成分も含み得る。該キットはまた、アッセイしかつ試験サンプルと比較し得る１種の対照サンプル若しくは一連の対照サンプルも含有し得る。キットの各成分は通常は個々の容器内に入れられ、そして多様な容器の全部が好ましくは単一包装内に含有される。
【０１２６】
本発明はまた、ｈＣＯＸ−３遺伝子中の遺伝子の損傷若しくは突然変異の検出方法も提供する。好ましい態様において、該方法は：（ａ）サンプルからヒトシクロオキシゲナーゼ−３のポリヌクレオチドを単離する段階；および（ｂ）該ヒトシクロオキシゲナーゼ−３のポリヌクレオチドをシークェンシングして遺伝子配列中の変化を検出する段階を含んでなる。
【０１２７】
目的の遺伝子突然変異若しくは遺伝子の損傷の例は、限定されるものでないが：１）遺伝子からの１個若しくはそれ以上のヌクレオチドの欠失；２）遺伝子への１個若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加；３）遺伝子の１個若しくはそれ以上のヌクレオチドの置換；４）遺伝子の染色体再配列；５）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの変化；６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのような遺伝子の異常な修飾；７）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野性型のスプライシングパターンの存在；８）該遺伝子によりコードされるタンパク質の非野性型のレベル；９）遺伝子の対立遺伝子喪失；および１０）該遺伝子によりコードされるタンパク質の不適切な翻訳後修飾の検出を挙げることができる。これらの遺伝子の損傷若しくは突然変異の検出方法は当該技術分野で公知である。ＰＣＲ反応、制限酵素切断パターン、サンプルおよび対照核酸をハイブリダイズすること、シークェンシング反応、電気泳動の移動度の変化、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅および選択的プライマー伸長のような遺伝子中の損傷を検出するのに使用し得る当該技術分野で既知の多数のアッセイ技術が存在する。
遺伝子治療を使用する処置方法
本発明は、遺伝子治療を使用してｈＣＯＸ−３の発現を増大若しくは減少させることによるｈＣＯＸ−３に関係する障害の危険にさらされている若しくはそれに罹っている被験体の治療方法を提供する。
【０１２８】
イヌにおいて、ＣＯＸ−３はアセトアミノフェンのような鎮痛／解熱薬により選択的に阻害され、ＣＯＸ−３がこの型の薬物の標的でありうることを示唆している（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００２、上記）。従って、遺伝子治療を介してＣＯＸ−３の発現を低下させることが、熱を低下させることおよび疼痛を緩和することのようなアセトアミノフェン型の薬物で得られるものと類似の治療効果を達成するであろうことが予見可能である。遺伝子治療は、鎮痛薬の継続投与が必要とされる慢性の疼痛若しくは発熱の治療において好ましい。とりわけ、全部のＮＳＡＩＤでそうであるため、アセトアミノフェンの鎮痛作用は、用量の増大が効果の小さな増大のみを生じさせる天井効果により制限される（Ｂｅａｖｅｒ、１９８８、Ａｍ Ｊ．Ｍｅｄ．、８４（Ｓｕｐｐｌｅ ５Ａ）：３−１５）。
【０１２９】
加えて、統計学的に有意の逆相関がアセトアミノフェンの使用と卵巣癌の危険との間で見出された（Ｃｒａｍｅｒら、１９９８、Ｌａｎｃｅｔ ３５１：１０４−７）。従って、遺伝子治療を介してヒトＣＯＸ−３の発現を減少させることは、アセトアミノフェンを毎日服用していると報告した女性が使用を報告していない女性よりも卵巣癌からの４５％よりより低い死亡率を有したという前向き試験からの結果（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、１９９８、Ｌａｎｃｅｔ、３５２：１３５４−５）に基づき、卵巣癌の死亡率の低下において有用な治療でありうる。
【０１３０】
一態様において、ＣＯＸ−３アンチセンス治療を使用して細胞中のｈＣＯＸ−３の発現を低下させ得る。ＣＯＸ−３アンチセンス治療は低下されたｈＣＯＸ−３活性が望ましい
場合にとりわけ有用である。
【０１３１】
アンチセンスに基づく戦略の原理は、遺伝子発現の配列特異的抑制がｍＲＮＡと相補アンチセンス種との間の細胞内ハイブリダイゼーションにより達成され得るという仮説に基づく。ハイブリッドＲＮＡ二重鎖の形成は、その場合、標的ＣＯＸ−３ ｍＲＮＡのプロセシング／輸送／翻訳および／若しくは安定性を妨害し得る。ハイブリダイゼーションはアンチセンス効果が起こるために必要とされる。アンチセンス戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注入およびアンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクションを包含する多様なアプローチを使用し得る。センス鎖へのアンチセンスのハイブリダイゼーションにより誘導される表現型の効果は、タンパク質レベル、タンパク質活性の測定値および標的ｍＲＮＡレベルのような基準の変化に基づく。
【０１３２】
アンチセンス核酸は、ｈＣＯＸ−３遺伝子のコーディング鎖全体若しくはその一部分にのみ相補的であり得る。アンチセンス核酸分子はまた、ｈＣＯＸ−３遺伝子のコーディング鎖の非コーディング領域の全部若しくは一部に相補的であり得る。非コーディング領域（「５’および３’ＵＴＲ」）はコーディング領域に隣接しかつアミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。好ましくは、非コーディング領域はｈＣＯＸ−３遺伝子の転写若しくは翻訳のための調節領域である。
【０１３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば配列番号３若しくは配列番号５の相補配列から取られた長さ約１５、２５、３５、４５若しくは６５ヌクレオチド若しくはそれ以上であり得る。該配列は、標的ｍＲＮＡ配列への十分に強いアニーリングを達成して該配列の翻訳を予防するために長さが最低１８ヌクレオチドであることが好ましい。（Ｉｚａｎｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ、３６：１００７−１０１５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：７０３−７０６）。アンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手順を使用する化学合成および酵素的ライゲーション反応を使用して構築し得る。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または、分子の生物学的安定性を増大若しくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計した多様に修飾したヌクレオチドを使用して化学合成し得、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用し得る。アンチセンス核酸を生成させるのに使用し得る修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシトネチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｉ−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルエシトシン、．５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを包含する。アンチセンス核酸分子はＣＣ−アノマー核酸分子であり得る。ＣＣ−アノマー核酸分子は、通常のＰ単位と対照的に鎖が相互に平行に走る特異的二本鎖ハイブリッドを相補ＲＮＡと形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４ １）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリ
ボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）若しくはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）も含み得る。
【０１３４】
あるいは、アンチセンス核酸は、核酸が上述されたとおりアンチセンスの向きにサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的にもまた製造し得る。アンチセンス発現ベクターは、高効率の調節領域（その活性は該ベクターが導入された細胞型により決定され得る）の制御下でアンチセンス核酸が生成される、組換えプラスミド、ファージミド若しくは弱毒性ウイルスの形態であり得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩ若しくはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら（１９８５、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）、ｐｐ．２２−２５）を参照されたい。
【０１３５】
典型的には、アンチセンス核酸は、微小注入、リポソーム被包化により被験体に投与するか、または該アンチセンス配列をもつベクターからの発現によりｉｎ ｓｉｔｕで生成させる。アンチセンス核酸分子の投与経路の一例は組織部位での直接注入を包含する。アンチセンス核酸は、ウイルスベクターを宿主細胞に導入する場合に該アンチセンス核酸の移入を媒介するウイルスベクターに連結し得る。適するウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを包含する。あるいは、アンチセンス核酸分子は選択した細胞を標的とするように改変し得、そしてその後全身投与し得る。例えば、全身投与のため、アンチセンス分子は、例えば細胞表面の受容体若しくは抗原に結合するペプチド若しくは抗体に該アンチセンス核酸分子を結合することにより選択した細胞表面上で発現される受容体若しくは抗原にそれらが特異的に結合するように改変し得る。
【０１３６】
一旦細胞の内側にあれば、アンチセンス核酸分子はＣＯＸ−３タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／若しくはゲノムＤＮＡとハイブリダイズすなわち結合してそれにより例えば転写および／若しくは翻訳を阻害することにより発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための慣習的ヌクレオチド相補性、若しくは、例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には二重らせんの主溝中での特異的相互作用によることができる。
【０１３７】
好ましい一態様において、ＣＯＸ−３活性を低下させることが有益である場合は、ＣＯＸ−３の発現を低下させることが必要な被験体におけるＣＯＸ−３の発現の低下方法は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を必要とする。
【０１３８】
数種の生物体において、二本鎖ＲＮＡの導入がＲＮＡ干渉として知られる過程により遺伝子発現を抑制するための強力なツールであることが判明している。ｈＣＯＸ−３に対応するｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの製造方法は上述されている。本発明は、（ａ）分解のためヒトＣＯＸ−３遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを被験体の細胞に導入する段階；（ｂ）被験体の細胞中でのヒトＣＯＸ−３遺伝子のｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ干渉が起こる条件下で（ａ）で生じられた細胞を維持する段階を含んでなる、ｈＣＯＸ−３の発現の低下を必要とする被験体の細胞におけるｈＣＯＸ−３の発現の低下方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、本明細書に記述されるアンチセンス核酸のものに類似に手順を使用して被験体の細胞に導入し得る。
【０１３９】
別の態様において、被験体の細胞中でヒトＣＯＸ−３タンパク質を発現することが可能な核酸分子を導入することによりｈＣＯＸ−３の発現を増大させるのに遺伝子治療を使用
し得る。ＣＯＸ−３遺伝子治療は、ＣＯＸ−３活性を上昇させることが有益である疾患の処置にとりわけ有用であり得る。
【０１４０】
ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療の実施手順は米国特許第５，３９９，３４６号明細書およびまたその特許の出願歴で提出された証拠物（それらの全部は公的に入手可能な文書である）に概説されている。一般に、遺伝子治療は、遺伝子の機能的１コピーの被験体の細胞（１個若しくは複数）中へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの導入、および遺伝子的に工作した細胞（１個若しくは複数）を該被験体に戻すことを必要とし得る。遺伝子の機能的コピーは、遺伝子的に工作した細胞（１個若しくは複数）での遺伝子の発現を可能にする調節要素の作動可能な制御下にある。多数のトランスフェクションおよび形質導入技術、ならびに適切な発現ベクターは当業者に公知であり、それらのいくつかはＰＣＴ出願第ＷＯ９５／００６５４号明細書に記述されている。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療はアデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、およびエプスタイン−バーウイルスのようなヘルペスウイルスのようなベクターを使用する。遺伝子治療はまた、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで感染を必要とする非ウイルス手段を使用しても達成し得る。こうした手段は、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法およびプロトプラスト融合を包含し得る。標的を定めたリポソームもまた細胞中へのＤＮＡの送達に潜在的に有益であり得る。
【０１４１】
一例として、ヒトＣＯＸ−３タンパク質をコードするＤＮＡ分子を最初にレトロウイルスベクターにクローン化し得る。該ベクターからのＣＯＸ−３タンパク質の発現は、その内因性プロモーター若しくはレトロウイルスの末端反復配列若しくはある種の標的細胞に特異的なプロモーターから駆動され得る。該ベクターをその後被験体の細胞に導入して、標的細胞中でｈＣＯＸ−３タンパク質を成功裏に発現させ得る。該遺伝子は、好ましくは、有効な機能を提供するのに十分なタンパク質をコードするように細胞により使用され得る形態でそれらの細胞に送達され得る。レトロウイルスベクターは、しばしば、とりわけそれらの高い感染効率ならびに安定な組込みおよび発現により、遺伝子治療のための好ましい遺伝子送達ベクターである。あるいは、ｈＣＯＸ−３ ＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ複合物若しくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合物、リポフェクション膜融合または直接微小注入法を使用する受容体に媒介される標的を定めたＤＮＡ移入を包含する非ウイルス技術により遺伝子治療のため細胞中に移入し得る。これらの手順およびそれらの変形はｅｘ ｖｉｖｏならびにｉｎ ｖｉｖｏのＣＯＸ−３遺伝子治療に適する。ｈＣＯＸ−３遺伝子とともにの使用に適する遺伝子治療の分子方法論のプロトコルは、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｐａｕｌ Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓにより編、Ｈｕｍａｎ ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ、１９９６に記述されている。
【０１４２】
処置の間、個体に投与される本発明の核酸分子の有効量は、患者の型、種、齢、重量、性および医学的状態；治療されるべき状態の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに使用されるその特定の核酸分子を包含する多様な因子により変動し得る。遺伝子治療の特化した熟練の医師若しくは獣医師は、状態の進行を予防する、打ち消す若しくは停止するのに必要とされる有効量を決定かつ処方し得る。毒性を伴わずに有効性を生じる範囲内の濃度の達成における至適の精度は、標的部位への該核酸分子の利用可能性のキネティクスに基づくレジメンを必要とする。これは、遺伝子治療に関与する核酸分子の分布、平衡および排泄の考慮を必要とする。
【０１４３】
本明細書に開示される遺伝子治療は、いかなる潜在的な毒性も最小化しつつｈＣＯＸ−３活性の至適の増大若しくは減少を得るために、慣例の試験により定義される適切な投薬量で単独で使用し得る。加えて、他剤の共投与若しくは連続投与も望ましいことがある。数種の剤を組合せて所望の効果を達成する場合には、投与の投薬量を調節する。これらの多様な剤の投薬量は、独立に至適化し得、かつ、相乗的な結果を達成するように組合せ得
、そこでは、病状は、いずれかの剤を単独で使用した場合にそれがそうであろうよりも低下される。
【０１４４】
本発明はまた：
（ａ）細胞中でのヒトシクロオキシゲナーゼ−３の発現若しくは活性を増大若しくは減少させる有効量の組成物を細胞に投与する段階；
（ｂ）治療上有効な量の鎮痛／解熱薬を細胞に投与する段階：
（ｃ）細胞に対する該鎮痛／解熱薬の治療効果を測定する段階、および
（ｄ）該治療効果を対照のものと比較する段階
を含んでなる、細胞中での鎮痛／解熱薬の作用機序の評価方法も企図している。
【０１４５】
一態様において、該比較する段階は、該治療効果を、細胞中のヒトシクロオキシゲナーゼ−３の発現若しくは活性が該鎮痛／解熱薬の投与前の増大もしくは減少されていない対照のものと比較することを含んでなる。
【０１４６】
細胞の内側のヒトＣＯＸ−３を標的とする鎮痛／解熱薬は、ＣＯＸ−３発現若しくは活性のレベルが細胞の内側で変化される場合にその治療効果の明瞭な識別を示すことができる。ＣＯＸ−３発現のレベルは上述されたとおりアンチセンス若しくはｓｉＲＮＡ技術により減少させ得る。ＣＯＸ−３発現のレベルは、機能的シクロオキシゲナーゼ−３タンパク質をコードすることが可能な核酸分子を被験体中の細胞に導入することにより増大させ得る。ｈＣＯＸ−３活性のレベルはｈＣＯＸ−３の活性化物質若しくは阻害剤を使用して増大若しくは減少させ得、また、ｈＣＯＸ−３の活性化物質若しくは阻害剤は下述される化合物同定方法を使用して得ることができる。
ｈＣＯＸ−３の調節物質の同定方法
ｈＣＯＸ−３の「阻害剤」、「活性化物質」および「調節物質」は、ヒトＣＯＸ−３のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ結合アッセイを使用して同定される阻害若しくは活性化する分子を指す。好ましくはヒトＣＯＸ−３のシクロオキシゲナーゼ活性を測定することにより。
【０１４７】
とりわけ、「阻害剤」はＣＯＸ−３発現若しくは活性を減少、予防、不活性化、脱感作若しくはダウンレギュレートする化合物を指す。「活性化物質」はＣＯＸ−３発現若しくは活性を増大、活性化、助長、感作若しくはアップレギュレートする化合物である。「調節物質」は「阻害剤」および「活性化物質」双方を包含する。
【０１４８】
化合物の同定方法は、慣習的な実験室での形式を使用して若しくはハイスループットに適合されたアッセイで実施し得る。「ハイスループット」という用語は複数のサンプルの容易なスクリーニングを同時に可能にするアッセイ設計を指し、そしてロボット操作についての能力を包含し得る。ハイスループットアッセイの別の所望の特徴は、所望の分析を達成するための試薬使用を減少させるか若しくは操作の数を最小化するように至適化されているアッセイ設計である。アッセイ形式の例は、液体を取り扱う実験に使用される９６ウェル若しくは３８４ウェルプレート、空中浮遊液滴および「実験室チップ（ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ）」微小チャンネルチップを包含する。プラスチック型の小型化および液体取扱い装置が進歩しているため、若しくは改良されたアッセイ装置が設計されているために、本発明の設計を使用してそのより多数のサンプルを実行し得ることが当業者に公知である。
【０１４９】
候補化合物は多数の化学的分類を包含するとは言え、典型的にはそれらは有機化合物である。好ましくはそれらは低分子有機化合物である。候補化合物は、ポリペプチドとの構造上の相互作用に必要な官能性化学基を含んでなり、そして典型的には最低１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシル若しくはカルボキシル基、好ましくは該官能性化学基の最低
２個およびより好ましくは該官能性化学基の最低３個を包含する。候補化合物は、上で同定された官能基の１個若しくはそれ以上で置換されている環状炭素若しくは複素環構造および／または芳香族若しくは多芳香族構造を含み得る。候補化合物はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上の誘導体若しくは構造アナログ、またはそれらの組合せなどでもあり得る。化合物が核酸である場合、該化合物は典型的にはＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子であるとは言え、非天然の結合若しくはサブユニットを有する修飾核酸もまた企図している。
【０１５０】
候補化合物は合成若しくは天然の化合物のライブラリーを包含する多様な供給源から得られる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを包含する多様な有機化合物および生体分子の無作為のおよび有向の合成に多数の手段が利用可能である。候補化合物はまた：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相若しくは溶液相ライブラリー：デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）を包含する当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれを使用しても得ることができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが利用可能であるか若しくは容易に製造される。加えて、天然および合成で製造したライブラリーおよび化合物は、慣習的な化学的、物理的および生化学的手段により容易に改変し得る。
【０１５１】
さらに、既知の薬理学的剤をアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような有向の若しくは無作為の化学修飾にかけて該剤の構造的アナログを製造し得る。候補化合物は無作為に選択し得るか、あるいは、ＣＯＸ−１若しくはＣＯＸ−２の活性に結合かつ／またはその機能を調節する既存の化合物に基づき得る。従って、候補の剤の供給源は、より多い若しくはより少ない化学的部分または異なる化学的部分を含有するように該分子の１個若しくはそれ以上の位置で該化合物の構造が変えられている既知のＣＯＸ活性化物質若しくは阻害剤に基づく分子のライブラリーである。アナログの活性化物質／阻害剤のライブラリーの創製において該分子になされる構造変化は、有向性、無作為、または有向のおよび無作為双方の置換および／若しくは付加の組合せであり得る。コンビナトリアルライブラリーの製造の当業者は、既存のＮＳＡＩＤ若しくは鎮痛／解熱性化合物に基づくこうしたライブラリーを容易に製造し得る。
多様な他の試薬もまた該混合物中に包含し得る。これらは、至適のタンパク質−タンパク質および／若しくはタンパク質−核酸結合を助長するのに使用し得る塩、緩衝剤、中性タンパク質（例えばアルブミン）、洗剤などのような試薬を包含する。こうした試薬はまた、反応成分の非特異的すなわちバックグラウンドの相互作用も低下させ得る。ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を向上させる他の試薬もまた使用し得る。
【０１５２】
分子ライブラリーの合成方法の例は当該技術分野、例えば：Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）．Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８に見出し得る。化合物のライブラリーは溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（特許第５，５７１，６９８号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）若しくはファージ（例えばＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３ ８６−３９０を参照されたい）上に提示し得る。
【０１５３】
一態様において、本発明は：（ａ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の活性フラグメントを含んでなるポリペプチドを試験化合物およびシクロオキシゲナーゼの基質と接触させる段階；ならびに（ｂ）（ａ）中のシクロオキシゲナーゼ活性を測定する段階、およびヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の活性フラグメントを含んでなるポリペプチドがシクロオキシゲナーゼの基質にのみ曝露されるがしかし試験化合物に曝露されない対照のものとそれを比較する段階を含んでなる、ヒトＣＯＸ−３により触媒されるプロスタグランジン合成を増大若しくは減少させる化合物の同定方法を提供する。ｈＣＯＸ−３の活性化物質である化合物は、基質転化速度を増大させかつ時間の関数としての対照と比較したサンプル中のより大きなＣＯＸ活性をもたらすことができる。ＣＯＸ−３の阻害剤である化合物は、基質転化速度を低下させかつ時間の関数としての対照と比較したサンプル中のより低いＣＯＸ活性をもたらすことができる。
【０１５４】
好ましい一態様において、上述されたヒトＣＯＸ−３により触媒されるプロスタグランジン合成を増大若しくは減少させる化合物の同定方法は、試験化合物がヒトＣＯＸ−１若しくはヒトＣＯＸ−２のような別のシクロオキシゲナーゼ酵素のシクロオキシゲナーゼ活性を変えるかどうかを試験する段階をさらに含んでなる。好ましくは、試験化合物はｈＣＯＸ３のシクロオキシゲナーゼ活性のみを増大若しくは低下するが、しかしｈＣＯＸ−１若しくはｈＣＯＸ−２のものを増大若しくは低下させない。
【０１５５】
生物学的サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性を測定するのに多数の方法を使用し得、そしてそれらは上述した。
【０１５６】
好ましい一態様において、該アッセイ方法で使用されるＣＯＸタンパク質は、天然若しくは組換えの宿主細胞と会合している。米国特許第５８３７４７９号明細書は、ＣＯＸ−２の組換え細胞株を使用するＣＯＸ−２活性を阻害する化合物の同定方法を特許請求する。ｈＣＯＸ−３の宿主細胞を使用してｈＣＯＸ−３活性を阻害する化合物を同定するのに類似の方法を使用し得る。「細胞」という用語は最低１個の細胞を指すが、しかし、検出方法の感度に適切な複数の細胞を包含する。好ましくは、本発明の方法に適する細胞は真核生物である。
【０１５７】
別の好ましい態様において、該アッセイで使用されるＣＯＸタンパク質は単離された膜調製物の一部である。ＣＯＸ−１若しくは−２と同様にＣＯＸ−３は膜タンパク質である。ヒトＣＯＸ−３を含有する膜を当業者に既知の方法を使用してｈＣＯＸ−３宿主細胞から単離し得、そしてスクリーニングアッセイでｈＣＯＸ−３の供給源として使用し得る。
【０１５８】
なお別の好ましい態様において、該アッセイで使用されるＣＯＸタンパク質は精製すなわち単離され得る。
【０１５９】
別の好ましい態様において、結合アッセイを使用して、ヒトＣＯＸ−３タンパク質に結合しかつｈＣＯＸ−３タンパク質の生物活性を増大若しくは減少させることが潜在的に可能である化合物を同定し得る。例示的一方法は：（ａ）試験化合物をｈＣＯＸ−３タンパク質およびｈＣＯＸ−３タンパク質の標識リガンドとともにインキュベートする段階；（ｂ）ｈＣＯＸ−３タンパク質を未結合の標識リガンドから分離する段階；ならびに（ｃ）ｈＣＯＸ−３に結合する標識リガンドの量の減少により該サブユニットへのリガンド結合を阻害する化合物を同定する段階を含んでなる。ｈＣＯＸ−３タンパク質の標識リガンドの一例は、上述されたところの標識ｈＣＯＸ−３特異的抗体、またはアセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナクおよびイブプロフェンのようなｈＣＯＸ−１若しくはｈＣＯＸ−２のいずれよりもｈＣＯＸ−３の阻害においてより強力
である剤である。好ましくは、ｈＣＯＸ−３を発現するがしかしｈＣＯＸ−１若しくはｈＣＯＸ−２を発現しないｈＣＯＸ−３宿主細胞（組換え若しくは天然の）を結合アッセイに使用し得る。より好ましくは、ｈＣＯＸ−３宿主細胞から調製した細胞膜を結合アッセイに使用し得る。さらに好ましくは、実質的に精製されたｈＣＯＸ−３タンパク質を結合アッセイに使用し得る。
【０１６０】
未結合の標識リガンドからのｈＣＯＸ−３タンパク質の分離は多様な方法で達成し得る。慣習的には、成分の最低１種を固体支持体上に固定し、それから未結合の成分を容易に分離し得る。固体支持体は多様な素材からおよび多様な形状で作成し得る（例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子など）。該支持体は、好ましくはＳ／Ｎ比を最大化する（主としてバックグラウンド結合を最小化する）ように、ならびに分離の容易さおよび費用のために選ばれる。
【０１６１】
分離は、例えばビーズ若しくはディップスティックをリザーバから取り出すこと、マイクロタイタープレートのウェルのようなリザーバを空にするか若しくは希釈すること、またはビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラム若しくはフィルターを洗浄溶液若しくは溶媒ですすぐことにより遂げることができる。分離段階は好ましくは複数のすすぎ若しくは洗浄を包含する。例えば、固体支持体がマイクロタイタープレートである場合、塩、緩衝剤、洗剤、非特異的タンパク質などのような特異的結合に参画しないインキュベーション混合物の成分を典型的に包含する洗浄溶液でウェルを数回洗浄し得る。固体支持体が磁性ビーズである場合、該ビーズを洗浄溶液で１回若しくはそれ以上洗浄しかつ磁石を使用して単離し得る。
【０１６２】
直接検出（例えば放射活性、発光、光学若しくは電子密度など）、または間接的検出（例えばＦＬＡＧエピトープのようなエピトープ標識、ワサビペルオキシダーゼのような酵素標識など）を提供するもののような多様な標識を、ｈＣＯＸ−３のリガンドを標識するのに使用し得る。
【０１６３】
本発明の上のアッセイ方法の一以上の態様において、複合体形成した形態のｈＣＯＸ−３タンパク質の複合体形成していないものからの分離を助長するため、ならびにアッセイの自動化を適合するために、ｈＣＯＸ−３若しくはそのリガンドのいずれかを固定することが望ましい可能性がある。ポリペプチドへの試験化合物の結合、若しくは候補化合物の存在および非存在下での標的分子とのポリペプチドの相互作用は、反応体を含有するのに適するいかなる容器中でも達成し得る。こうした容器の例はマイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管を包含する。一態様において、ｈＣＯＸ−３およびそのリガンドの一方若しくは双方をマトリックスに結合させるドメインを付加するｈＣＯＸ−３の融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとのｈＣＯＸ−３の融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；ミズーリ州セントルイス）若しくはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させ得、それをその後試験化合物若しくは試験化合物およびｈＣＯＸ−３の標識リガンドと組合せ得、そして複合体形成を実施しうる条件（例えば塩およびｐＨについて生理学的条件）下で該混合物をインキュベートし得る。インキュベーション後に、ビーズ若しくはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄していかなる未結合成分も除去し、そして複合体形成を例えば上述されたとおり直接若しくは間接的にのいずれかで測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そして標準的技術を使用して本発明のポリペプチドの結合若しくは活性のレベルを測定し得る。
【０１６４】
マトリックス上にタンパク質を固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイで使用し得る。例えば、ｈＣＯＸ−３若しくはそのリガンドのいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの複合を利用して固定し得る。
【０１６５】
ビオチニル化したポリペプチド若しくは標的分子を、当該技術分野で公知の技術（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；イリノイ州ロックフォード）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスセインイミド）から製造し得、そしてストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定し得る。あるいは、ｈＣＯＸ−３と反応性しかしｈＣＯＸ−３のその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化し得、そしてｈＣＯＸ−３を抗体複合により該ウェル中で捕捉し得る。こうした複合体の検出方法は、ＧＳＴで固定した複合体について上述されたものに加え、本発明のポリペプチドすなわち標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびに本発明のポリペプチドすなわち標的分子と関連した酵素活性を検出することに頼る酵素結合アッセイを包含する。
【０１６６】
本発明は本明細書に記述される特定の方法論、データベース、遺伝子配列および遺伝子配列分析方法などに制限されないことが理解される。これらは変動しうるからである。本明細書で使用される専門用語は本発明の範囲を制限することを意図していないこともまた理解されるべきである。本明細書および付属として付けられる請求の範囲で使用されるところの単数形「ａ」、「ａｎ」（１つの）および「ｔｈｅ」（該）は、情況が別の方法で明瞭に決定しない限り複数の言及を包含することを留意しなければならない。従って、例えば、「ａ ｇｅｎｅ（１遺伝子）」への言及は１若しくはそれ以上の遺伝子への言及でありかつ当業者に既知のその同等物を包含する、などである。事実、当業者は、本明細書に記述される方法を使用して、現在若しくは後に知られるいかなるＣＯＸ−３遺伝子およびタンパク質も同定かつ利用し得る。
実施例
【実施例１】
【０１６７】
ヒトＣｏｘ−１のイントロン１配列の確認
完全長のヒトＣＯＸ−１ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００９６２）をＮＣＢＩヒトゲノムデータベースを検索するためのクエリとして使用した。ヒトＣＯＸ−１遺伝子は第９染色体上に位置推定され、そして約２２ｋｂにわたる１１のエキソンおよび１０のイントロンを含んでなる。ＮＣＢＩからのエキソン１、イントロン１およびエキソン２の配列を図１Ａに示す。イヌＣｏｘ−３と同様にヒトＣｏｘ−３がヒトＣＯＸ−１のイントロン１全体を保持する場合、ヒトゲノムデータベースから得られる配列は翻訳でフレームがずれることができる。３種の可能な読み枠（ａ、ｂおよびｃ）のいずれも、ヒトＣｏｘ−１のエキソン１、イントロン１およびエキソン２によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをもたらさないとみられる（図１Ｂ）。従って、第一の疑問は、公表されたヒトゲノム配列が確かに正しいかどうかである。あるいは、公表されたゲノム配列が翻訳の早期終止をもたらすフレームシフト変異を含有するかどうか。
【０１６８】
ヒトＣＯＸ−１のエキソン１−イントロン１−エキソン２のゲノム配列を増幅するために２個のオリゴヌクレオチドを設計した。フォワードプライマーはエキソン１およびイントロン１配列の一部に基づき設計し、配列番号１、５’ＡＴＧＡＧＣＣＧＴＧＡＧＴＧＣＧＡＣＣＣＣＧＧＴ３’、そしてリバースプライマーはエキソン２に基づき、配列番号２、５’ＣＴＡＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＧＣＧＣＣＣＣＴＧＧＧＴ３’であった。ＰＣＲはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）から購入したアドバンテージ［Ａｄｖａｎｔａｇｅ］（Ｒ）−ＧＣゲノムＰＣＲキットを用いて実施した。反応混合物は、１μｇのヒトゲノムＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）、１０μｌの５×ＧＣゲノム反応緩衝液、０．５Ｍ ＧＣ−Ｍｅｌｔ、１．１ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２００μＭ ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマーおよび１μｌの５０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）−ＧＣゲノムＤＮＡポリメラーゼ混合物を含有した。ゲノムＰＣＲのサーマルサイクラーの
パラメータは：９４℃で１分間の初期変性、９４℃／３０秒および６８℃／２分の３５周期であった。ＰＣＲ産物（約１９０ｂｐのフラグメント）をｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔクローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州）にサブクローニングしかつシークェンシングした。
【０１６９】
配列分析は、ヒトＣＯＸ−１のエキソン１−イントロン１−エキソン２の配列がヒトゲノムデータベースに公表されたものと一致したことを示した。従って、イントロン１全体（９４ｂｐ）がｈＣＯＸ−３中に保持される場合、読み枠のシフトが存在してヒト組織中での活性のＣＯＸ３酵素の生成をもたらさないとみられる。少なくとも２つの機構、すなわち１）ＲＮＡ編集、すなわちｍＲＮＡレベルでのイントロン１全体の保持、次いで数ヌクレオチドの除去；若しくは２）イントロン１の部分的保持がオープンリーディングフレームを維持して活性のＣＯＸ３酵素の生成につながる可能性がある。
【実施例２】
【０１７０】
ヒトＣＯＸ−３のＮ末端をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒトＣＯＸ−３を同定するため、ゲノムＤＮＡ配列を増幅するために使用したものすなわち配列番号１と同一であるフォワードプライマー、およびヒトＣＯＸ−１のおよそｂｐ位置６００に位置するリバースプライマー 配列番号７、５’−ＴＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡ−３’を用いて、ヒト脳、胃および慢性骨髄性白血病のｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲは、５μｌのマラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］ＴＭヒト脳ｃＤＮＡ、５μｌの１０×反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマーおよび１μｌの５０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）−ＧＣ２ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）を含有する５０μｌの最終容量中で実施した。ＰＣＲ反応パラメータは：９４℃で１分間の初期変性、次いで９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で２分間の伸長の３０周期であった。ＰＣＲ後に０．６ｋｂのＰＣＲフラグメントを精製し、平滑化し（ｐｏｌｉｓｈｅｄ）かつｐＰＣＲｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。約２０個の独立したクローンを拾い、それらのプラスミドＤＮＡを単離しかつシークェンシングした。
【０１７１】
二本鎖ＤＮＡのシークェンシング分析は、ヒト組織中に３種の型のＣＯＸ−３スプライシングバリアントが存在することを示した。第一の型（型Ｉ）は、９４ｂｐのイントロン１全体が保持されて読み枠中のシフトをもたらし、ＣＯＸが不活性のタンパク質でありそうである非常に短いペプチドをコードするものである。第二の型（型ＩＩ若しくはＣＯＸ−３ａ、図１Ｃ）はイントロン１のほぼ全体を保持するがしかし位置６４のグアニジンが欠けており、読み枠中の短くかつ自己整流性の（ｓｅｌｆ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ）シフトにつながり、完全長かつＣＯＸ活性のタンパク質をコードする。ＣＯＸ−３ａのアミノ末端のヌクレオチド配列を配列番号３に描き、また、配列番号３によりコードされるアミノ酸配列を配列番号４に描く。ＩＩ型のスプライシングバリアントと同様、第三の型（型ＩＩＩ若しくはＣＯＸ−３ｂ、図１Ｄ）もまたイントロン１のほぼ全体を保持するがしかしｂｐ位置４３のシトシンが欠けており、読み枠中の別の短くかつ自己整流性のシフトにつながり、完全長かつＣＯＸ活性のタンパク質をコードする。ＣＯＸ−３ｂはそのＮ末端でＣｏｘ−３ａとわずかに異なるタンパク質をコードする。ＣＯＸ−３ｂのアミノ末端のヌクレオチド配列を配列番号５に描き、そして、配列番号５によりコードされるアミノ酸配列を配列番号６に描く。
【０１７２】
これらの結果はヒトＣｏｘ−３の存在を示し、ヒトＣＯＸ−３がイントロン１の保持後に１個若しくは１個以上のＲＮＡ編集事象を介して形成され得ることを示唆する。ヒトＣｏｘ−１のイントロン１の保持によりコードされるｈＣｏｘ−３ａ若しくはｈＣｏｘ−３ｂのＮ末端はイヌのものと大きく異なり、イヌＣｏｘ−３のものに対しそれぞれ約３３％
若しくは２６％の配列の同一性を表す（図１Ｅ）。ヒトＣＯＸ−１のイントロン１のヌクレオチド配列はイヌＣＯＸ−１のイントロン１のものに対する約７５％の配列の同一性を共有する（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００２、上記）。
【実施例３】
【０１７３】
ヒトＣＯＸ−１およびＣＯＸ−３のゲノム構造およびスプライシングバリアント
ヒトＣＯＸ−１およびＣＯＸ−３遺伝子の完全長のｃＤＮＡ配列を使用してＧｅｎｂａｎｋヒトゲノムデータベースを検索した。該検索は、ヒトＣＯＸ−１／ＣＯＸ−３タンパク質をコードする遺伝子が約２２ｋｂでありかつ第９染色体上に位置推定されることを示した。図２に示されるとおり、ヒトＣＯＸ−１タンパク質をコードする遺伝子は１１のエキソンおよび１０のイントロンから構成される。ＣＯＸ−１はエキソン１からエキソン１１によりコードされる一方、新規スプライシングバリアントＣＯＸ−３は、同一の数のエキソンおよびエキソン１とエキソン２との間の保持されたイントロン１によりコードされ、ＲＮＡ編集後にアミノ末端に３１残基の挿入をもたらす。
【実施例４】
【０１７４】
完全長のヒトＣＯＸ−３の集成
完全長のヒトＣＯＸ−３を集成するために、２種のヒトＣＯＸ−１特異的プライマー、すなわちフォワードプライマー、配列番号１２、５’ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＧＧ ＡＧＴ ＣＴＣ ＴＴＧ ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＴＣ、３’、およびＳａｌＩ制限酵素部位を含有するリバースプライマー、配列番号１３、５’ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＣＧ ＣＴＣ ＣＡＣ ３’を用いて、カルボキシル末端のｃＤＮＡフラグメントをマラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］ＴＭヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）から最初に増幅した。該ＰＣＲは、５μｌのマラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］ＴＭヒト脳ｃＤＮＡ、５μｌの１０×反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭの特異的プライマーおよび１μｌの５０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ＨＦ２ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有する５０μｌの最終容量中で実施した。ＰＣＲ反応パラメータは：９４℃で１分間の初期変性、次いで９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で２分間の伸長の３０周期であった。ＰＣＲ後に、１．７５ｋｂのＰＣＲフラグメントを精製し、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、１％アガロースゲル上で分離し、そして最終的に１．５５ｋｂのカルボキシル末端フラグメントを切り出した。
【０１７５】
完全長のヒトＣＯＸ−３ａ ｃＤＮＡを標準的な分子生物学の方法に従って集成しそしてｐＡＧＡ４ベクターにサブクローニングした。簡潔には、ｂｐ位置１（開始コドンを含むＮｄｅＩ部位）からｐｂ位置３３２（ＥｃｏＲＩ部位）までの０．３３ｋｂのＮ末端フラグメントおよび１．５５ｋｂのＣ末端フラグメント（ＥｃｏＲＩからＳａｌＩまで、上を参照されたい）を、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩにより予め消化したｐＡＧＡ４ベクターに直接サブクローニングした。生じる構築物をｈＣＯＸ−３／ｐＡＧＡ４と呼称した。最終構築物をＤＮＡシークェンシングにより確認した。完全長のヒトＣＯＸ−３ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号８に描き、また、完全長のヒトＣＯＸ−３ａのアミノ酸配列を配列番号９に描く。
【０１７６】
類似の手順に従って完全長のヒトＣｏｘ−３ｂ ｃＤＮＡもまた集成し得る。完全長のヒトＣＯＸ−３ｂ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１０に描き、また、完全長のヒトＣＯＸ−３ｂのアミノ酸配列を配列番号１１に描く。
【実施例５】
【０１７７】
ヒトＣＯＸ−３ａおよびＣＯＸ−１タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳分析
ヒトＣＯＸ−３ａおよびＣＯＸ−１タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を、供給元が推奨するプロトコルに従ってＴｎＴ（Ｒ）Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。簡潔には、１μｌの０．１μｇ／μｌ ｈＣＯＸ−３／ｐＡＧＡ４およびｈＣＯＸ−１／ｐＡＧＡ４構築物を、０．２μｌの［３５Ｓ］メチオニン（１０ｍＣｉ／ｍｌで１０００Ｃｉ／ｍｍｍｏｌ）を伴う９μｌのＴＮＴ Ｑｕｉｃｋマスターミックスに添加した。反応混合物を３０℃で９０分間インキュベートした。等容量の２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液反応を添加することにより反応を停止し、そしてその後サンプルを１０〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離にかけた。電気泳動後にゲルをクマシーブルーＲ２５０で染色し、乾燥しそしてＸ線フィルムに露光させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたヒトＣＯＸ−３ａタンパク質はＣＯＸ−１タンパク質よりわずかにより大きく、そして、双方とも、対応する核酸配列からのアミノ酸配列の翻訳により予測されるとおり、約７０ｋＤａの推定される分子量まで移動した。
【０１７８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたヒトＣＯＸ−３ａおよびＣＯＸ−１タンパク質をウエスタンブロットによってもまた分析した。簡潔には、２μｌのｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたヒトＣＯＸ−３およびＣＯＸ−１タンパク質を１０〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲル上のタンパク質をその後ニトロセルロースに転写した。ブロットをＴＴＢＳ（ｐＨ＝７．５の０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０、１００ｍＭトリス−ＨＣｌおよび０．９％ＮａＣｌ）中５％粉乳で室温で１時間ブロッキングし、そしてその後５００倍希釈の抗ヒトＣＯＸ−１モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに４℃で一夜インキュベートした。翌日、ブロットを１００ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄し、そしてワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに室温で１時間インキュベートした。１００ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄した後にブロットを発光試薬ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で可視化した。ウエスタンブロットの結果はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳分析からのものと一致した。
【実施例６】
【０１７９】
ヒトＣＯＸ−３発現のノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析を使用してヒトＣＯＸ−３の組織分布を評価した。ＣＯＸ−３のｂｐ３４−７１（イントロン１内）に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドｈｃｘｌ−１２をプローブとして使用した。ｈｃｘｌ−１２、配列番号１４のヌクレオチド配列は５’−ＴＧＧＣＡＴＴＣＡＡＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＣ−３’である。オリゴヌクレオチドプローブを［γ−３２Ｐ］ＡＴＰにより５’末端標識した。簡潔には、１０ｐｍｏｌのｈｃｘｌ−１２オリゴヌクレオチドを、２５μｌの総容量中で、３．５μｌの６０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１μｌの１０単位／μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）および供給元により提供された２．５μｌの１０×キナーゼ緩衝液の存在下、３７℃で３０分間インキュベートした。５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加により反応を停止した。標識プローブをその後、供給元のプロトコルに従ってクロマスピン（ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ）＋ＳＴＥ−３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）を使用して精製した。
【０１８０】
ヒトＭＴＮ（多組織ノーザン（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ））ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）から購入した。それらはヒトＭＴＮブロット（カタログ番号７７６０−１）、ヒトＩＩ ＭＴＮブロット（カタログ番号７７６７−１）、ヒトＩＩＩ ＭＴＮブロット（カタログ番号７７６７−１）およびヒト腫瘍ＭＴＮブロット（カタログ番号７７９２−１）である。各ブロットを５ｍｌのエクスプレスハイブ（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ）溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて４２℃で３０分間プレイハイブリダイズし、そしてその後２×１０６ｃｐｍ／μｌのヒトＣＯＸ−３オリゴヌクレオチドプローブの存在下に４２℃で２時間ハイブリダイズさせた。ブロ
ットを２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳですすぎ、そしてその後２００ｍｌの０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で室温で２時間２回洗浄した。最後にブロットを−８０℃の冷凍庫中で３日までＸ線フィルムに露光させた。
【０１８１】
ノーザンブロット分析は、ヒトＣＯＸ−３の主要な転写物が約４．５ｋｂであることを示す。該４．５ｋｂのＣＯＸ−３転写物はヒト胃中で最も豊富であり、次いで骨格筋、心、胎盤、肝、膵、脾、精巣、副腎および腎である。それは比較的低レベルで脳、肺、前立腺、小腸、白血球、甲状腺、脊髄、リンパ節および気管でもまた発現されている。胸腺、卵巣、結腸若しくは骨髄では有意の転写は観察されなかった。興味深いことに、４．５ｋｂのヒトＣＯＸ−３転写物のレベルは、われわれが試験した全部のヒト腫瘍組織で劇的に増大されたことが見出され、それが発癌である役割を演じているかもしれないことを示唆する。
【実施例７】
【０１８２】
ｈＣｏｘ−３に特異的なポリクローナル抗体の生成
ヒトＣＯＸ−３ａおよびＣｏｘ−３ｂのアミノ末端由来のオリゴペプチド配列を、ウサギでポリクローナル抗体を生じさせるために選択した。より良好な結合のため、該ペプチド中の内的システインをセリンに変えた。該オリゴペプチドのアミノ酸配列は配列番号１５、Ａｃ−ＭＳＲＥＣＤＰＧＡＲＷＧＣ−アミドであった。
【０１８３】
該ペプチドを合成しかつ抗体を生じさせ、そしてＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．により精製した。生じる抗体を該抗原ペプチドに対するＥＬＩＳＡにより試験し、そして同一ペプチドを用いてアフィニティー精製した。血清およびアフィニティー精製した抗体を、ウエスタンブロット、免疫沈降法、イムノＰＣＲ、免疫細胞化学および免疫組織化学を包含する免疫分析に使用した。
【実施例８】
【０１８４】
ヒトＣＯＸ−３発現のウエスタンブロット分析
ヒトＣＯＸ−３タンパク質発現を分析するために、特異的抗ヒトＣＯＸ−３ポリクローナル抗体を生成させかつ実施例７に記述されたとおりアフィニティー精製した。作成済みヒト多組織全タンパク質ブロットをＢｉｏｃｈａｉｎ（カリフォルニア州）から購入した。簡潔には、作成済みブロットをＴＴＢＳ（ｐＨ＝７．４の０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ）中５％粉乳を用い室温で２時間ブロッキングし、そしてその後、５％粉乳／ＴＴＢＳ中１０００倍希釈のアフィニティー精製した抗ヒトＣＯＸ−３抗体とともに４℃で一夜インキュベートした。１０，０００倍希釈のＨＲＰと結合した二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）を該ブロットにＲＴで１時間適用した。最後に、ＥＣＬ−ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してシグナルをＸ線フィルム上で可視化した。
【０１８５】
結果は、２種の主要な免疫反応性のタンパク質（それぞれ８０および５５ｋＤａ）がヒト全タンパク質ライセート中で同定されたことを示した。おそらくヒトＣＯＸ−３ａ若しくは−３ｂを表す８０ｋＤａのタンパク質は、心、脳、腎、肝、骨格筋、胃および小腸中で発現されている。Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら（ＰＮＡＳ、２００２、Ｖｏｌ．９９、ｐｐ１３９２６）により記述される別のＣＯＸ−１のスプライシングバリアントＰＣＯＸ−１ａに類似である５５ｋＤａのタンパク質は、試験したヒト組織中でより広範に発現されている。数種のより小さい特徴付けられていないタンパク質もまた同定された。
【実施例９】
【０１８６】
昆虫Ｓｆ９細胞中でのヒトＣＯＸ−３ａの組換え発現
構造および機能研究のため、完全長のヒトＣＯＸ−３ａ ｃＤＮＡをバキュロウイルス
発現ドナーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）にサブクローニングした。構築物の転位後にＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）細胞中で組換えバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）を作成した。組換えバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）でのトランスフェクション後に高力価（１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）の組換えバキュロウイルスを得、そしてその後２回増幅した。約７５ｋＤａで移動する顕著なペプチドのバンドが、クマシーブルーＲ２５０により染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで観察され、その同一性は抗ＣＯＸ−１モノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットによりさらに確認された。
【実施例１０】
【０１８７】
ＣＯＸ活性アッセイ
ミクロソームタンパク質画分をｈＣＯＸ−３ａ組換えバキュロウイルスに感染させたＳｆ９細胞から調製した。ミクロソーム膜タンパク質（２０μｇ）を、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェノールおよび１．５μＭハマチンを含有する１５０μｌの容量の緩衝液中で、指定された濃度のアラキドン酸とともにインキュベートした。室温で５分間インキュベートした後に、混合を伴う４０μｌの１Ｎ ＨＣｌの添加により反応を停止した。サンプルを４０μｌの１Ｎ ＮａＯＨで中性にした。ＰＧＦ２α産物の形成を、製造元により指示されるとおりにＰＧＦ２αイムノアッセイキット（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。
【０１８８】
ＣＯＸ−１およびＸＯＣ−２と同様、ヒトＣＯＸ−３ａは、それぞれ０．５４μＭおよび３．０７ｐｍｏｌ／ｍｇ／分のＫｍおよびＶｍａｘ値を伴い、濃度依存性の様式でのアラキドン酸からのＰＧＦ２αの合成を触媒することが可能であった（図３）。
【０１８９】
本発明の多様な局面を実施例および好ましい態様への言及により上に具体的に説明したとは言え、本発明の範囲は前述の記述により定義されず、しかし特許法の原理のもとで適正に解釈される以下の請求の範囲により定義されることが認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】図１Ａは、ＮＣＢＩヒトゲノムデータベースに公表されたところのヒトＣｏｘ−１のエキソン１、イントロン１およびエキソン２のＤＮＡ配列を示す。図１Ｂは、３個の読み取り枠（ａ、ｂおよびｃ）のいずれも、エキソン１、イントロン１およびエキソン２によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをもたらさないことを示す。翻訳の終止は＊により示す。エキソン１およびエキソン２のヌクレオチド配列、ならびにＣｏｘ−１中でのようなそれらのコードされるアミノ酸配列は影を付けられる。図１Ｃは、ＲＮＡ編集後のＣｏｘ−３ａの翻訳を示す。図１Ｄは、ＲＮＡ編集後のＣｏｘ−３ｂの翻訳を示す。図１Ｅは、ＲＮＡ編集を伴う（ヒト）若しくは伴わない（イヌ）ヒトおよびイヌＣＯＸ−３中のＣＯＸ−１のイントロン１によりコードされるペプチド配列の比較を示す。アライメントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して２種の完全な配列のアライメントを見出すように実施した。該アライメントは適合の数を最大化しかつギャップの数を最小化する。適合はアライメント（１種若しくは複数）のための閾値を表す。すなわち、｜＝同一性；：＝２；．＝１。
【図２】ヒトＣＯＸ−３およびＣＯＸ−１の遺伝子構造を具体的に説明する。
【図３】ヒトＣｏｘ−３ａタンパク質がアラキドン酸からのＰＧＦ２ａの合成を触媒したことを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明はシクロオキシゲナーゼイソ酵素に関する。具体的には、本発明は、新規ヒトシクロオキシゲナーゼイソ酵素ＣＯＸ−３の単離された核酸分子およびポリペプチド、ならびにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は多様な形態で３，５００年以上も使用されている。この分類の抗炎症剤は抗炎症、鎮痛および解熱作用を発揮する。ＮＳＡＩＤの例は、限定されるものでないがアスピリン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ピロキシカム、ナプロキセン、スリンダク、サリチル酸コリン、ジフルニサル、フェノプロフェン、インドメタシン、メクロフェナメート、サルサラート、トルメチンおよびサリチル酸マグネシウムを挙げることができる。ＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）経路を介してプロスタグランジン（ＰＧ）（不飽和の２０炭素脂肪酸、主としてアラキドン酸由来の一群の化合物）の生成を阻害することによりはたらくと考えられている。
【０００３】
炎症の部位でＣＯＸはアラキドン酸をエンドペルオキシドＰＧＧ２に転化し、それはその後プロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）に分解する。ＰＧＨ２は、順に、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２およびトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）を包含するプロスタノイドに転化される。ＰＧＥ２のようなプロスタノイドの局所生成が疼痛神経末端を過敏にしかつ血流を増大させて痛みの感覚を促進しかつ組織の腫脹および発赤を駆動し得る。
【０００４】
ＮＳＡＩＤはＣＯＸ活性を選択的に阻害してそれによりＰＧＥ２形成を阻害しかつ炎症を最小化する（非特許文献１）。不幸なことに、ＮＳＡＩＤの使用はしばしば胃腸出血、潰瘍、腎不全および他者のような副作用により制限される。これらの副作用は、一般にプロスタグランジンの望ましくない減少により引き起こされる。プロスタグランジンは、正常な生理学の維持のために正常な細胞中でオートクリンおよびパラクリン刺激物質として機能し得る。正常細胞中でのプロスタグランジン生成を変えることなく標的細胞中でのプロスタグランジンの減少を達成することによりより特異的に作用することができる新たな作用剤の開発は、ＮＳＡＩＤ研究の主要な最終目標の１つである。
【０００５】
アセトアミノフェンは、口腔外科手術、会陰切開、分娩後疼痛、癌、変形性関節症、頭痛、月経困難症などに関連する軽度ないし中等度の疼痛の緩和のための安全かつ有効な鎮痛薬である。アスピリンのようなＮＳＡＩＤと異なり、アセトアミノフェンは強力な解熱および鎮痛作用を有する（非特許文献２）。臨床試験は、アセトアミノフェンがアスピリンの胃腸の副作用を欠くことを示した。さらに、アセトアミノフェンは小児において止血機構に対する影響を有さず、そしてアスピリンの使用が危険な出血を引き起こしうる臨床状況で使用し得る。その広範な使用にもかかわらず、アセトアミノフェンの作用機序は完全に解明されてはいない。
【０００６】
ごく最近までに、シクロオキシゲナーゼの２種のアイソフォーム、すなわち、構成的に発現されるＣＯＸ−１および誘導可能であるＣＯＸ−２のみが同定された。ＣＯＸ−１は胃腸（ＧＩ）管中でのＰＧＩ２およびＰＧＥ２のような生理学的に関連するプロスタノイドの生成の原因であるようであり、それによりそれらは胃に対し保護的である。Ｃｏｘ−１はまた血小板凝集の強力な誘導物質ＴｘＡ２の生成にも関与しかつ血管攣縮を引き起こす。抗炎症におけるそれらの役割に加え、アスピリンのようなＣＯＸ−１の阻害剤は血液凝固を阻害し、また、ＧＩ毒性を伴う。ＣＯＸ−２は炎症部位で迅速にアップレギュレー
トされ、そして炎症前プロスタノイドの形成の原因であるようである。より選択的なＣＯＸ−２阻害剤はＧＩ毒性を低下させていたことがありそうであるとみられるがしかしそれでもなお疼痛ならびに熱、発赤および腫脹のような炎症の他の古典的兆候を緩和すると思われる。ＣＯＸ−１もＣＯＸ−２も、全細胞若しくは細胞ホモジェネートでアッセイする場合に治療濃度のアセトアミノフェンで該薬物に対し感受性でなく、ＣＯＸ−１もＣＯＸ−２もアセトアミノフェンの作用の良好な標的でないことを示唆している。
【０００７】
第三のシクロオキシゲナーゼイソ酵素すなわちＣＯＸ−３をコードする遺伝子がイヌ大脳皮質から最近同定された（非特許文献３）。ＣＯＸ−３の阻害はアセトアミノフェンの主要な中心的作用機序を表すことが示唆された。イヌＣＯＸ−３遺伝子はイントロン１の保持を伴うイヌＣＯＸ−１遺伝子のスプライシングバリアントである。イヌＣＯＸ−３タンパク質はカルボキシル末端にイヌＣＯＸ−１タンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、およびアミノ末端に３３アミノ酸の挿入を含有する。イヌＣＯＸ−３のｍＲＮＡはイヌ大脳皮質で、および分析した他の組織中でより少量で発現される。機能研究は、イヌＣＯＸ−３がグリコシル化依存性のシクロオキシゲナーゼ活性を有しかつ数種の（しかし全部ではない）ＮＳＡＩＤにより強力に阻害されることを示した。イヌＣＯＸ−３活性のネズミのＣＯＸ−１および−２との比較は、イヌＣＯＸ−３がアセトアミノフェン、フェナセチン、アンチピリンおよびジピロンのような鎮痛／解熱薬により選択的に阻害されることを示している。例えば、５ｍＭの基質濃度で、アセトアミノフェンはネズミのＣＯＸ−２に対しイヌＣＯＸ−３の阻害について１００倍選択的、およびネズミのＣＯＸ−１に対し２倍選択的である（非特許文献３）。
【０００８】
イヌＣＯＸ−３はイヌ大脳皮質から同定されたとは言え、ヒトＣＯＸ−３の存在はさらなる実験を必要とした。公表されたヒトゲノム配列に基づけばヒトＣＯＸ−１のイントロン１はヒトＣＯＸ−１のコーディング配列の残りと同じフレームでないからである。公表されたヒトゲノム配列が真正の多型であるか若しくはシークェンシングの誤りであるかは知られていなかった（非特許文献３）。ヒトＣＯＸ−３の存在若しくはその欠如を示すための慎重に設計された研究が実施される必要がある。ヒトＣＯＸ−３研究からの結果は、アセトアミノフェンのような既存の鎮痛薬の機序の解明において、また、より少ない副作用を伴うより特異的な鎮痛薬を開発するために有用であり得る。
【非特許文献１】Ｗａｒｎｅｒら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１３３７１−１３３７３
【非特許文献２】Ｂｏｔｔｉｎｇ、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ．３１：Ｓ２０２−１０
【非特許文献３】Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１３９２６−３１
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明は、本明細書でヒトＣＯＸ−３と称される新規ヒトシクロオキシゲナーゼイソ酵素をコードする単離された核酸分子、該単離された核酸配列によりコードされるポリペプチド、ならびに該核酸分子およびそのポリペプチドの使用に関する。
【００１０】
本発明の他の局面、特徴および利点は、本発明の詳細な記述およびその好ましい態様ならびに付属として付けられる請求の範囲を包含する以下の開示から明らかであろう。
［発明の詳細な記述］
本出願で引用される全部の刊行物はこれにより引用することにより組み込まれる。別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されると同一の意味するところを有する。
【００１１】
「包含すること」、「含んでなること」、「含有すること」および「有すること」という用語は、本明細書でそれらの公然の制限しない意味で使用する。
【００１２】
以下は本明細でときに使用される略語である：
ｂｐ＝塩基対
ｃＤＮＡ＝相補ＤＮＡ
ＣＮＳ＝中枢神経系
ＣＯＸ＝シクロオキシゲナーゼ
ｋｂ＝キロ塩基対；１０００塩基対
ｋＤａ＝キロダルトン；１０００ダルトン
ＮＳＡＩＤ＝非ステロイド性抗炎症薬
ｎｔ＝ヌクレオチド
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＧ＝プロスタグランジン
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ｓｉＲＮＡ＝低分子干渉ＲＮＡ
ＵＴＲ＝非翻訳領域
本発明のポリペプチド若しくは核酸の「活性」、「生物活性」若しくは「機能的活性」は、標準的技術に従ってｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されるところの本発明のポリペプチド若しくは核酸分子により発揮される活性を指す。こうした活性は第二のタンパク質との会合若しくはそれに対する酵素活性のような直接活性、または該タンパク質の第二のタンパク質との相互作用により媒介される細胞シグナル伝達活性のような間接的活性であり得る。ヒトＣＯＸ−３と関連する例示的一生物活性はアラキドン酸をＰＧＨ２に転化するその酵素活性であり、そして、本活性はアセトアミノフェンのような鎮痛／解熱薬により選択的に阻害される。
【００１３】
「鎮痛剤（ａｎａｌｇｅｓｉｃ）」若しくは「鎮痛薬（ａｎａｌｇｅｓｉｃ ｄｒｕｇ）」は意識の喪失を引き起こすことなく疼痛を軽減する剤である。「解熱剤（ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ）」若しくは「解熱薬（ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ ｄｒｕｇ）」は熱を緩和すなわち低下させる剤である。「解熱剤（ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ）」は解熱剤（ａｎｔｉｆｅｂｒｉｌｅ）、解熱剤（ａｎｔｉｔｈｅｒｍｉｃ）若しくは解熱剤（ｆｅｂｒｉｆｕｇｅ）と同義語である。「抗炎症薬」は炎症を打ち消す若しくは抑制する剤である。「鎮痛／解熱薬」は「鎮痛」および「解熱」双方の活性を有する剤である。
【００１４】
本明細書で使用されるところの「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわち本発明のポリペプチドのような抗原、例えば本発明のポリペプチドのあるエピトープを特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の所定のポリペプチドに特異的に結合する分子は、該ポリペプチドを結合するがしかし該ポリペプチドを天然に含有するサンプル、例えば生物学的サンプル中の異なる型の分子を実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分の例は、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより生成させ得るＦａｂおよびＦ（ａｂ）’２フラグメントを包含する。
【００１５】
「抗体」はモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体であり得る。「モノクローナル抗体」若しくは「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特定の一エピトープと免疫反応することが可能な抗原結合部位の１種のみを含有する抗体分子の一集団を指す。「ポリクローナル抗体」という用語は１種以上のエピトープと免疫反応することが可能な本発明のポリペプチド（１種若しくは複数）に向けられた抗体を指す。とりわけ好ましいポリクローナル抗体調製物は、本発明のポリペプチド（１種若しくは複数）に向けられた
抗体のみを含有するものである。
【００１６】
本明細書で使用されるところの「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して体液性および／若しくは細胞性の抗原特異的応答をなすことができる１種若しくはそれ以上のエピトープを含有する分子を指す。該用語はまた本明細書で「免疫原」と互換的にも使用する。本明細書で使用されるところの「エピトープ」という用語は、特異的抗体分子が結合する抗原若しくはハプテン上の部位を指す。該用語はまた本明細書で「抗原決定基」若しくは「抗原決定基部位」と互換的にも使用する。
【００１７】
「生物学的サンプル」という用語は生物体（例えば患者）若しくは生物体の構成成分（例えば細胞）から得られるサンプルを指す。サンプルはいずれの生物学的組織、細胞（１個若しくは複数）または液体のものであってよい。サンプルは、患者由来のサンプルである「臨床サンプル」であってよい。こうしたサンプルは、限定されるものでないが唾液、血液、血液細胞（例えば白血球）、羊水、血漿、精液、骨髄および組織若しくは細径針生検サンプル、尿、腹水および胸水またはそれらからの細胞を挙げることができる。生物学的サンプルはまた、組織学的目的上採取される凍結切片のような組織の切片も包含してよい。生物学的サンプルはまた「患者サンプル」とも称されることがある。「生物学的サンプル」はまた、実質的に精製若しくは単離されたタンパク質、膜調製物、または細胞培養物も包含してよい。
【００１８】
「クローン」は有糸分裂により単一細胞若しくは共通の祖先に由来する細胞の一集団である。「細胞株」は多世代の間ｉｎ ｖｉｔｒｏで安定な増殖が可能である初代細胞のクローンである。
【００１９】
「プロスタグランジンエンドペルオキシドＨシンターゼ」すなわち「ＰＧＨＳ」ともまた称される「シクロオキシゲナーゼ」、「シクロオキシゲナーゼ酵素」、「ＣＯＸ」若しくは「ＣＯＸ酵素」という用語は、プロスタグランジン生合成において２段階を触媒しかつアラキドン酸からプロスタグランジンおよびトロンボキサンを生成する、大部分の組織中に存在する酵素である。シクロオキシゲナーゼは、アラキドン酸のヒドロペルオキシドプロスタグランジンＧ２への酸化（シクロオキシゲナーゼ反応）およびプロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）へのそのその後の還元（ペルオキシダーゼ反応）の双方を触媒する。ＰＧＨ２は、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２およびトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）を包含するプロスタノイドへのその後の異性化若しくは環化の共通の中間体である。ＮＳＡＩＤはシクロオキシゲナーゼ活性を阻害し、これがそれらの抗炎症効果を説明する。
【００２０】
「ＣＯＸ−３活性に関係する障害」は、ＣＯＸ−３酵素の過活性若しくは不十分な活性と関連する障害若しくは疾患、およびこの障害若しくは疾患に付随する状態を包含する。「ＣＯＸ−３酵素の過活性」は、１）ＣＯＸ−３を通常は発現しない細胞中でのＣＯＸ−３発現；２）増大したＣＯＸ−３発現；３）ＣＯＸ−３酵素１単位あたりの増大したＣＯＸ−３活性；または４）１種若しくはそれ以上のＣＯＸ−３の生物活性の構成的活性化につながる突然変異のいずれかを指す。「ＣＯＸ−３酵素の不十分な活性」は、１）ＣＯＸ−３を通常発現する細胞中でのＣＯＸ−３発現の非存在；２）低下したＣＯＸ−３発現；３）ＣＯＸ−３酵素１単位あたりの低下したＣＯＸ−３活性；または４）１種若しくはそれ以上のＣＯＸ−３の生物活性の構成的不活性化につながる突然変異のいずれかを指す。
【００２１】
「遺伝子」は、コーディング領域、コーディング領域に先行する（「５’ＵＴＲ」）および後に続く（「３’ＵＴＲ」）非コーディング領域を包含するペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の生成に関与するＤＮＡの一セグメントである。「遺伝子」はまた個々のコーディングセグメント（「エキソン」）間に介在する非コーディング配列（「イン
トロン」）も包含しうる。「プロモーター」は遺伝子の転写を開始するＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡの制御配列を意味している。プロモーターはしばしば遺伝子の転写開始部位の上流（「に対し５’」）にある。「制御配列」は遺伝子の発現を制御し得る遺伝子の部分を指す。「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、ならびにポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位（細菌発現について）および／若しくはオペレーターのような他の発現制御要素を包含し得る。「コーディング領域」は、トリプレット塩基コドンを介してアミノ酸ならびに翻訳の開始および終止シグナルをコードする遺伝子の部分を指す。
【００２２】
「遺伝子治療」は、遺伝子欠損を是正するための生存細胞中へのいずれかの適する手段による何らかの供給源からの機能的遺伝子（１種若しくは複数）すなわち核酸フラグメントの導入を意味している。
【００２３】
「遺伝的バリアント」若しくは「バリアント」は、一集団中の最低１個体の特定の一遺伝子座に存在しかつ野性型対立遺伝子と異なる特定の一対立遺伝子を意味している。「野性型対立遺伝子」は一集団中の所定のヌクレオチド配列の最も頻繁に遭遇する対立遺伝子を意味している。
【００２４】
「宿主細胞」はベクター上か若しくは細胞染色体中に組込まれたかのいずれかの本発明のＤＮＡ分子を含有する細胞を指す。「宿主細胞」は本発明のＤＮＡ分子を内因性に発現する内因性宿主細胞若しくは組換え宿主細胞のいずれでもあり得る。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「ヒトシクロオキシゲナーゼ−３」、「ヒトＣＯＸ−３」若しくは「ｈＣＯＸ−３」は、アラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することが可能でありかつ配列番号４若しくは配列番号６に対する約６０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼの新規１メンバーを指す。ｈＣＯＸ−３の例は、アラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することが可能でありかつ配列番号４若しくは配列番号６に対する約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ酵素の新規１メンバーを包含する。一態様においてｈＣＯＸ−３は配列番号９を含んでなる。別の態様においてｈＣｏｘ−３は配列番号１１を含んでなる。
【００２６】
１フラグメント若しくはフラグメントの物理的会合は完全長のｈＣＯＸ−３と関連する生物活性を有し得るが、しかしながら、個々のｈＣＯＸ−３フラグメントと関連するｈＣＯＸ−３活性の程度は変動し得る。「ヒトシクロオキシゲナーゼ−３の活性フラグメント」は、アラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することがなお可能であるヒトシクロオキシゲナーゼ−３のフラグメントを指す。「ヒトシクロオキシゲナーゼ−３の活性フラグメント」の例は、配列番号４若しくは配列番号６の最低５個の隣接するアミノ酸配列の配列に対する約９０若しくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、そして、ｈＣＯＸ−３のこうした活性フラグメントはアラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することがなお可能である。
【００２７】
「炎症」という用語は、有害な剤および傷害された組織双方を破壊する、効力を弱める若しくは遮断（隔離）するようはたらく組織の傷害若しくは破壊により導き出される限局した保護応答を指す。「炎症」は、急性の形態において、疼痛（ｄｏｌｏｒ）、発熱（ｃａｌｏｒ）、発赤（ｒｕｂｏｒ）、腫脹（ｔｕｍｏｕｒ）および機能喪失（ｆｕｎｃｔｉｏ ｌａｅｓａ）の古典的兆候を特徴とする。組織学的には、炎症は、炎症の中心への血漿タンパク質および白血球遊走を包含する、増大した透過性および血流、液体の滲出を伴
う小動脈、毛細血管および細静脈の拡張を包含する複雑な一連の事象を伴う。
【００２８】
「単離された」核酸分子は他の核酸分子から分離されているものである。「単離された」核酸分子は、例えば、該核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中でその５’および３’端で該核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の最低１種を含まない核酸分子であり得る。単離された核酸分子は、制限なしに、他の配列に依存しない分離した核酸分子（例えばＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生じられるｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡフラグメント）、ならびにベクター、自律複製性プラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス若しくはヘルペスウイルス）または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組込まれている核酸分子を包含する。加えて、単離された核酸分子はハイブリッド若しくは融合核酸分子の一部である核酸分子を包含し得る。単離された核酸分子は：（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅される；（ｉｉ）例えば化学合成により合成される；（ｉｉｉ）クローニングにより組換え的に製造される；または（ｉｖ）切断および電気泳動若しくはクロマトグラフィー分離によるように精製される核酸配列であり得る。
【００２９】
「単離された」若しくは「精製された」タンパク質若しくはその生物学的に活性の部分は、該タンパク質が由来する細胞若しくは組織供給源からの細胞性物質若しくは他の汚染するタンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合は化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」という語は、該タンパク質が単離若しくは組換え的に製造される細胞の細胞性成分から該タンパク質が分離されているタンパク質の調製物を包含する。従って、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％若しくは５％（乾燥重量）未満の異種タンパク質（「汚染するタンパク質」ともまた本明細書で称される）を有するタンパク質の調製物を包含する。タンパク質若しくはその生物学的に活性の部分を組換え的に製造する場合、それはまた好ましくは培地を実質的に含まない。すなわち、培地はタンパク質調製物の体積の約２０％、１０％若しくは５％未満を表す。タンパク質を化学合成により製造する場合、それは好ましくは化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。すなわち、それは化学的前駆体若しくは該タンパク質の合成に関与する他の化学物質から分離されている。従って、タンパク質のこうした調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の化学的前駆体若しくは目的のポリペプチド以外の他の化学物質を有する。単離された生物学的に活性のポリペプチドはいくつかの異なる物理的形態を有する。単離されたポリペプチドは、完全長の生来のすなわちプロセシングされないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチド若しくはプロセシングされたポリペプチドの組合せとして存在し得る。単離された若しくは実質的に精製されたポリペプチドは、単離された核酸配列によりコードされるポリペプチド、ならびに例えば化学合成の方法により合成されたポリペプチド、および生物学的材料から分離されかつその後それらが本明細書に記述される方法により使用されることを可能にする程度まで慣習的なタンパク質分析若しくは調製手順を使用して精製されたポリペプチドであり得る。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「核酸」は、１個若しくはそれ以上のヌクレオチドすなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド若しくは双方から構成される分子を指す。該用語はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの単量体および多量体を包含し、リボヌクレオチドおよび／若しくはデオキシリボヌクレオチドは、多量体の場合に５’から３’の結合を介して一緒に結合される。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの多量体は一本鎖であっても若しくは二本鎖であってもよい。しかしながら、結合は、例えば５’から３’の結合を含んでなる核酸を包含する当該技術分野で既知の結合のいずれを包含してもよい。ヌクレオチドは天然に存在しても、若しくは天然に存在する塩基対と塩基対の関係を形成することが可能である合成で製造したアナログであってもよい。天然に存在する塩基対の例は、チミジン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラ
シルであり；それぞれＴ、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵと略記される。塩基対形成の関係を形成することが可能である天然に存在しない塩基の例は、限定されるものでないが、アザおよびデアザピリミジンアナログ、アザおよびデアザプリンアナログ、ならびにピリミジン環の炭素および窒素原子の１個若しくはそれ以上がヘテロ原子、例えば酸素、イオウ、セレン、リンなどにより置換されている他の複素環塩基アナログを挙げることができる。さらに、「核酸配列」という用語は相補配列を企図しており、そして、具体的には、核酸配列およびその相補物双方に実質的に相同であるいかなる核酸配列も包含する。
【００３１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は比較的短い長さ（例えば１００残基長未満）の一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列を指す。多くの方法について長さ約１６〜２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが有用であるとは言え、約２５ヌクレオチド以上のより長いオリゴヌクレオチドをときには利用しうる。数種のオリゴヌクレオチドは相補的核酸鎖の合成のための「プライマー」として使用し得る。例えば、ＤＮＡプライマーは、相補配列にハイブリダイズしてＤＮＡポリメラーゼを使用する反応で相補ＤＮＡ鎖の合成を開始させ得る。オリゴヌクレオチドはまた、例えばノーザンブロッティングでの核酸検出のためのハイブリダイゼーションにも有用である。
【００３２】
「多型」は一集団中の個体間の特定の一遺伝子座の一組の遺伝的バリアントを指す。
【００３３】
「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合により一緒に結合された最低２ヌクレオチドの直鎖状ポリマーを指し、そしてリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドのいずれを含んでもよい。
【００３４】
「ポリペプチド」若しくは「タンパク質」は１ポリマー中のアミノ酸残基の配置を指す。ポリペプチドは希なアミノ酸および合成アミノ酸アナログに加えて標準的な２０種の天然に存在するアミノ酸から構成され得る。より短いポリペプチドは一般にペプチドと称される。「組換えポリペプチド」は組換えＤＮＡ技術により製造される；すなわち所望のポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から生成されるポリペプチドを指す。「合成ポリペプチド」は化学合成により製造されるものを指す。
【００３５】
「プロモーター」は遺伝子の転写を開始するＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡの制御配列を意味している。プロモーターはしばしば遺伝子の転写開始部位の上流（「に対し５’」）にある。
【００３６】
「プロスタノイド」はプロスタグランジン、プロスタサイクリンおよびトロンボキサンの集合的用語である。それは、シクロオキシゲナーゼ経路を介して不飽和の２０炭素脂肪酸（主としてアラキドン酸）から生じる一群の化合物を包含する。それらは炎症を包含する多彩な一群の生理学的過程の極めて強力な媒介物質である。プロスタノイドの例は、限定されるものでないがＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２およびトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）を挙げることができる。
【００３７】
「組換え」は、分子生物学技術を使用してその天然の状態以外の何かに改変されている核酸、核酸によりコードされるタンパク質、細胞、若しくはウイルス粒子を指す。例えば、組換え細胞は、天然の（非組換え）形態の該細胞内で見出されないヌクレオチド配列を含有し得るか、または、別の方法で異常に発現されるか、過少発現されるか、若しくは全く発現されない天然の遺伝子を発現し得る。組換え細胞はまた、人工的手段により改変されかつ天然の形態の細胞中に再導入されている該細胞中で見出される遺伝子も含有し得る。該用語は、細胞から核酸を取り出すことなく改変されている、細胞に対し内因性の核酸を含有する細胞もまた包含し；こうした改変は例えば遺伝子置換および部位特異的突然変異により得られるものを包含する。
【００３８】
「組換え宿主細胞」は組換えＤＮＡ配列を含有する細胞である。組換えＤＮＡ配列は、例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、微小注入法、形質転換、微粒子銃およびウイルス感染を包含するいずれかの適する方法を使用して宿主細胞に導入し得る。組換えＤＮＡは、該細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組込まれ（共有結合され）ても組込まれなくてもよい。例えば、組換えＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素上に維持され得る。あるいは、安定に形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞に関しては、組換えＤＮＡは、それが染色体複製により娘細胞により遺伝されるように染色体中に組込まれたようになっている。この安定性は、外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の一集団から構成される細胞株すなわちクローンを樹立する安定に形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞の能力により示される。組換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株のような哺乳動物細胞、ならびにキイロショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコ由来の細胞株のような昆虫細胞を包含する原核生物若しくは真核生物であってよい。「組換え宿主細胞」という用語が特定の一細胞を指すのみならずしかしまたこうした細胞の子孫若しくは潜在的な子孫も指すことがさらに理解される。突然変異若しくは環境の影響のいずれかにより後続世代である種の改変が起こり得るため、こうした子孫は事実上親細胞に同一でないかもしれないが、しかしなお本明細書で使用されるところの該用語の範囲内に包含される。
【００３９】
「配列」は、単量体が多量体中に存在する直線状の順序、例えばポリペプチド中のアミノ酸の順序若しくはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序を意味している。
【００４０】
当該技術分野で既知のところの「配列の同一性若しくは類似性」は、配列を比較することにより決定されるところの２種若しくはそれ以上のポリペプチド配列または２種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、同一性はまた、場合によっては一連のこうした配列間の適合により決定されるところのポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の程度も意味している。２種のアミノ酸配列若しくは２種の核酸の同一性若しくは類似性のパーセントを決定するために、配列を至適の比較の目的上整列する（例えば、第二のアミノ酸若しくは核酸配列との至適のアライメントのために第一のアミノ酸の配列若しくは核酸配列中にギャップを導入し得る）。対応するアミノ酸位置若しくはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基若しくはヌクレオチドをその後比較する。第一の配列中のある位置が第二の配列中の対応する位置と同一の若しくは類似のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドにより占有される場合には、該分子はその位置で同一若しくは類似である。２配列間の同一性若しくは類似性のパーセントは、該配列により共有される同一若しくは類似の位置の数の関数である（すなわち同一性％＝同一の位置の数／位置（例えばオーバーラップする位置）の総数×１００）。一態様において、該２配列は同一長さである。
【００４１】
同一性および類似性の双方は容易に計算し得る。配列間の同一性若しくは類似性の一般に使用される決定方法は、限定されるものでないがＣａｒｉｌｌｏら、（１９８８）、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｍａｔｈ．４８、１０７３に開示されるものを挙げることができる。同一性の好ましい決定方法は試験される配列間で最大の適合を与えるように設計する。同一性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムにコード化されている。
【００４２】
２配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの制限しない一例は、Ｋａｒｌｉｎら、（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７中のとおり改変されたＫａｒｌｉｎら、（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。こうしたアルゴ
リズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組込まれている。比較の目的上、ギャップをつけたアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記述されるとおり利用し得る。あるいは、分子間の離れた関係を検出するＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して反復検索を実施し得る。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用し得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。加えて、ＦＡＳＴＡ法（Ａｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３）もまた使用し得る。
【００４３】
配列の比較に有用な数学的アルゴリズムの別の制限しない例はＭｙｅｒｓら、（１９８８）、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれている。
【００４４】
好ましい一態様において、２配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手可能）に組込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して決定される。ＧＣＧのＧＡＰプログラムは、適合の数を最大化しかつギャップの数を最小化するように２種の完全な配列を整列する。
【００４５】
別の好ましい態様において、２配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＢｅｓｔＦｉｔプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手可能）に組込まれているＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８１、１４７（１）：１９５−７）の局部的相同性アルゴリズムを使用して決定される。ＢｅｓｔＦｉｔプログラムは２配列間の最良の類似セグメントの至適のアライメントを作成する。至適のアライメントは、適合の数を最大化するようにギャップを挿入することにより見出される。
【００４６】
ハイブリダイゼーションは、２種のポリヌクレオチドが相互に実質的に同一であることを示すための試験としてもまた使用し得る。十分な程度の同一性を共有するポリヌクレオチドはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で相互とハイブリダイズすることができる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、（１９８９）に記述されるところの当該技術分野で既知の意味するところを有する。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次いで５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での１回若しくはそれ以上の洗浄を含んでなる。
【００４７】
本明細書で使用されるところの「実質的に類似」は、同一の配列、ならびに、いずれかの生物学的に活性の部分を維持しかつその保存されたモチーフのいずれかを有するポリヌクレオチド若しくはポリペプチド配列に対する欠失、置換若しくは付加を包含する。
【００４８】
本明細書で使用されるところの「被験体」は、処置、観察若しくは実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【００４９】
本明細書で使用されるところの「標識（ｔａｇ）」は、該標識を含有するタンパク質の単離、精製若しくは検出を助長するアミノ酸配列若しくはアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。多様なこうした標識が当業者に既知でありかつ本発明での使用に適する。適する標識は、限定されるものでないがＨＡペプチド、ポリヒスチジンペプチド、ビオチン／アビジン、および多様な抗体エピトープ結合部位を挙げることができる。
【００５０】
本明細書で使用されるところの「治療上有効な量」という用語は、治療されている疾患若しくは障害の症状の軽減を包含する、研究者、獣医師、医師若しくは他の臨床家により探究されている組織系、動物若しくはヒトにおいて生物学的若しくは医学的応答を導き出す有効成分若しくは製薬学的剤の量を意味している。本製薬学的組成物の治療上有効な用量の決定方法は当該技術分野で既知である。
【００５１】
「ベクター」は、結合されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントを挿入し得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは付加的なＤＮＡセグメントを挿入し得るウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノム中に組込まれ、そしてそれにより宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクター、発現ベクターは、それらが作動可能に結合されている遺伝子の発現を指図することが可能である。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用なベクターはしばしばプラスミドの形態である。しかしながら、本発明は、同等の機能を供するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のようなこうした他の形態のベクターを包含することを意図している。
本発明の単離された核酸分子
本発明は、ヒトＣＯＸ−１遺伝子のエキソン１とエキソン２との間のイントロン１の保持の後の１回若しくは１回以上のＲＮＡ編集事象を介して形成されるヒトＣＯＸ−３遺伝子の存在を初めて示した。ヒトＣＯＸ−３ａタンパク質（配列番号９）は、ヒトＣＯＸ−１のエキソン１によりコードされるアミノ酸配列、ＲＮＡ編集後のヒトＣＯＸ−１のイントロン１によりコードされる３１アミノ酸（配列番号４）の挿入（配列番号３）、およびヒトＣＯＸ−１のエキソン２ないし１１によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる。ヒトＣＯＸ−３ｂタンパク質（配列番号１１）は、ヒトＣＯＸ−１のエキソン１によりコードされるアミノ酸配列、異なる部位でのＲＮＡ編集後のヒトＣＯＸ−１のイントロン１によりコードされる３１アミノ酸（配列番号６）の挿入（配列番号５）、およびヒトＣＯＸ−１のエキソン２ないし１１によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる。ヒトＣｏｘ−１のクローニングは以前に記述された（Ｙｏｋｏｙａｍａら、（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１６５（２）：８８８−９４）。ヒトＣＯＸ−１のｃＤＮＡ若しくはタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はそれぞれＮＭ＿０００９６２若しくはＮＰ＿０００９５３である。ヒトＣＯＸ−３およびＣＯＸ−１の遺伝子構造の比較を図２に具体的に説明する。
【００５２】
本発明の一局面は、ヒトＣＯＸ−３若しくはその生物学的に活性の部分をコードする単離された核酸分子、ならびに本発明のヒトＣＯＸ−３ポリペプチドをコードする核酸分子を同定若しくは増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ若しくはＰＣＲプライマーとしての使用のための長さ最低１２の連続したヌクレオチドの核酸分子に関する。
【００５３】
一態様において、本発明は、アラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することが可能でありかつ配列番号４若しくは配列番号６に対する約６０％以上のアミノ酸配列の同一性、好ましくは約６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、シクロオキシゲ
ナーゼ酵素の１メンバーをコードするヌクレオチド配列またはそれらの相補物を含んでなる単離された核酸分子を提供する。所定のヌクレオチド配列の相補物である核酸分子は、それが高ストリンジェンシーすなわちストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で所定のヌクレオチド配列にハイブリダイズしてそれにより安定な二重鎖を形成し得るように該所定のヌクレオチド配列に対し十分に相補性であるものである。
【００５４】
別の態様において、本発明は配列番号３若しくは配列番号５またはそれらの相補物の最低１２の連続するヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子を提供する。こうした単離された核酸分子は、他の細胞型中、例えば他の組織からのＣＯＸ−３の相同体ならびに他の哺乳動物からの相同体を同定かつ／若しくはクローン化するための核酸プローブとして使用し得る。該プローブ／プライマーは、典型的には、ストリンジェントな条件下で配列番号３若しくは配列番号５のセンス若しくはアンチセンス配列の最低約１２、２５、５０、７５若しくは９０の隣接するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる。
【００５５】
好ましい一態様において、本発明は配列番号８若しくは配列番号１０のヌクレオチド配列またはそれらの相補物を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【００５６】
別の好ましい態様において、本発明は、配列番号９若しくは配列番号１１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれらの相補物を含んでなる単離された核酸分子を提供する。例えば、本発明は、配列番号８若しくは配列番号１０に示されるところのヒトＣＯＸ−３ ｃＤＮＡの保存的置換である核酸分子若しくはその相補物を含んでなる単離された核酸分子を提供する。特定の１アミノ酸をコードするのに１種以上の遺伝暗号が使用される可能性があることが既知であり、そして従って配列番号９若しくは配列番号１１に描かれるところのヒトＣＯＸ−３のアミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡ分子のいずれかによりコードされ得る。該組の１メンバーのみが配列番号８若しくは配列番号１０に示されるところのｃＤＮＡ配列に同一であることができる。しかしながら、下で縮重バリアントと称される全バリアントが本発明の範囲内で企図されている。この中で、配列番号９若しくは配列番号１１として示されるアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする１種若しくはそれ以上の代替コドンをもつ核酸分子は、それぞれ配列番号８若しくは配列番号１０に示されるところのヒトＣＯＸ−３ ＤＮＡの保存的置換として定義される。
【００５７】
ヒトＣＯＸ−３核酸分子の天然の対立遺伝子バリアントがこの点に関してとりわけ好ましい。アミノ酸配列中の変化に至るＤＮＡ配列の多型が集団（例えばヒト集団）内に存在し得る。こうした遺伝子多型は天然の対立遺伝子変異により１集団内の個体間で存在し得る。対立遺伝子は所定の遺伝子座で代替に存在する一群の遺伝子の１つである。こうした天然の対立遺伝子変異は、典型的に、所定の１遺伝子のヌクレオチド配列中の１〜５％の不一致をもたらし得る。代替の対立遺伝子は、多数の異なる個体中の目的の遺伝子をシークェンシングすることにより、若しくは多様な個体中の同一の遺伝子座を同定するためにハイブリダイゼーションプローブを使用することにより同定し得る。
【００５８】
天然に存在するヒトＣＯＸ−３タンパク質と異なるがしかしその機能的活性をなお維持する特性を有するポリペプチドをコードする天然に存在することが知られていないいかなるおよび全部のこうしたヌクレオチド変異を有する核酸分子が、この点に関してさらにとりわけ好ましい。天然に存在する対立遺伝子バリアントのような天然に存在するバリアントに加え、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドのバリアントは天然に存在することが知られていないバリアントでもまたあり得る。ＤＮＡ配列は、天然に存在するペプチドのものと異なる特性を有するペプチドをコードするように人的に変えることができる。ＤＮＡ配列の変更方法は、限定されるものでないが部位特異的突然変異誘発、キメラ置換および遺伝子融合を挙げることができる。部位特異的突然変異誘発はサイレント変異、保存的
変異若しくは非保存的変異をもたらし得る１若しくはそれ以上のＤＮＡ残基を変えるのに使用する。キメラ遺伝子は類似の若しくは異なる遺伝子のドメインを交換してＣＯＸ−３遺伝子中の類似のドメインを置き換えることにより製造する。同様に、遺伝子およびタンパク質の同定および単離を助長するための親和性標識のようなドメインをＣＯＸ−３に付加する融合遺伝子を製造し得る。
【００５９】
本発明のヒトＣＯＸ−３核酸分子のバリアントは、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号３若しくは配列番号５にハイブリダイズすることが可能である。
【００６０】
本発明の核酸分子のなお別の好ましい態様はヒトＣＯＸ−３遺伝子に対応するｓｉＲＮＡである。多くの生物体は、遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞中に存在する場合にＲＮＡ干渉として知られる過程により遺伝子発現を抑制させるための機構を有する。特定の１遺伝子の活性を低下させるためにｄｓＲＮＡを使用する技術は、蠕虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を使用して最初に開発され、そしてＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉと命名された（Ｆｉｒｅら、（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１）。ＲＮＡｉは以来、多くの生物体で有用であることが見出され、そして最近、哺乳動物細胞に拡大された（Ｍｏｓｓによる総説、（２００１）、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：Ｒ７７２−５を参照されたい）。
【００６１】
ＲＮＡｉが２１〜２５ヌクレオチドの低分子ＲＮＡの生成を伴うことが示された場合に重要な進歩がなされた（Ｈａｍｍｏｎｄら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：２９３−６；Ｚａｍｏｒｅら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：２５−３３）。これらの低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡは、最初は該過程を開始するより大きなｄｓＲＮＡに由来するとみられ、そして最終的に分解される標的ＲＮＡに相補的である。ｓｉＲＮＡはそれら自身が各端で短い突出と二本鎖形成する。それらはガイドＲＮＡとしてはたらき、相補性領域中の標的の単一の切断を指図する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、（２００１）Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ １５：１８８−２００；Ｚａｍｏｒｅら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：２５−３３）。
【００６２】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは配列番号３若しくは配列番号５に示されるＣＯＸ−１のイントロン１のヌクレオチド配列に相補的である約２１〜２５ヌクレオチドを含んでなる。
【００６３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ系からの長さが好ましくは２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）のｓｉＲＮＡの製造方法、および細胞若しくは生物体中の遺伝子のｍＲＮＡを妨害するためのｓｉＲＮＡの使用は、第ＷＯ０１７５１６４ Ａ２号明細書に記述されている。
【００６４】
ｓｉＲＮＡは安定発現系を使用してｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物細胞からもまた作成し得る。例えば哺乳動物細胞中でのｓｉＲＮＡの合成を指図するｐＳＵＰＥＲと命名されたベクター系が報告された（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−３．）。
【００６５】
本発明はヒトＣＯＸ−３核酸分子の単離方法を提供する。ヒトＣＯＸ−３転写物、好ましくは高レベルのｈＣＯＸ−３転写物を有する細胞若しくは組織がｈＣＯＸ−３のｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡの単離に適する。適するｃＤＮＡ源の選択は、配列番号３若しくは配列番号５に描かれるところのＣＯＸ−１のイントロン１の転写物に特異的にハイブリダイズするプライマーを使用するヌクレオチドハイブリダイゼーション若しくはＲＴ−ＰＣＲ分析により細胞抽出物若しくは全細胞中のｈＣＯＸ−３転写物の存在についてスクリーニングすることにより実施し得る。ＣＯＸ−３核酸の単離のための例示的一供給源は大脳皮
質である。
【００６６】
当該技術分野で既知の多様な手順のいずれかを使用してヒトＣＯＸ−３タンパク質をコードする核酸分子を単離し得る。例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡライブラリー、または上で同定された適する細胞からの全ｍＲＮＡを鋳型としてかつ適切なオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、本発明の核酸分子を標準的なＰＣＲ増幅技術により増幅し得る。ＰＣＲからそのように増幅された核酸を適切なベクターにクローン化しかつＤＮＡ配列分析により特徴付けし得る。当業者は、配列番号３若しくは配列番号５の最低１２の隣接するヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドがプライマーとしてとりわけ有用であることを認識するであろう。プライマーは標準的合成技術により、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用して製造し得る。とりわけ好ましいプライマーは、ｈＣＯＸ−３遺伝子を検出するのに使用し得るがしかしＣＯＸ−１若しくはＣＯＸ−２のような他の既知のＣＯＸ遺伝子に結合しないものである。
【００６７】
ｈＣＯＸ−３核酸分子の別の単離方法は、当業者により認識される手順を使用して１種若しくはそれ以上の天然の若しくは人工的に設計したプローブでゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリー、またはあるいは全ｍＲＮＡをプロービングすることである。例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｅｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、１９８９、１９９２を参照されたい。当業者は、配列番号３若しくは配列番号５の最低１２の隣接するヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドがとりわけ有用なプローブであることを認識するであろう。プローブは最低２０、３０、４０若しくは５０塩基のような異なる長さを有し得る。こうしたプローブが、該プローブの同定を助長するように分析上検出可能な試薬で標識され得かつ好ましくは標識されることもまた認識される。有用な試薬は、限定されるものでないが放射性同位元素、蛍光色素若しくは検出可能な生成物の形成を触媒することが可能な酵素を挙げることができる。該プローブは、当業者が、全部過度の実験を伴わずに、ヒト、哺乳動物若しくは他の動物の供給源からのＣＯＸ−３タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡポリヌクレオチドの相補的なコピーを単離するか、またはこうした供給源、例えば家族の付加的なメンバー、型および／若しくはサブタイプを、転写調節および制御要素ならびに本明細書で開示されるコーディング配列に関し５’および／若しくは３’である領域からの他の安定性、プロセシング、翻訳および組織特異性を決定する領域を包含する関連配列についてスクリーニングすることを可能にする。
【００６８】
本発明の核酸分子の全部若しくは一部分に対応する核酸分子の別の製造方法は、標準的合成技術、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用することによる。
【００６９】
ｈＣＯＸ−３核酸分子の別の単離方法は逆遺伝学の方法を使用することによる。この例において、ＣＯＸ−３を精製し、そして部分的アミノ酸配列を自動化アミノ酸配列決定装置により決定する。特定の一アミノ酸配列の長さ全体を決定することは必要でないが、しかし、タンパク質からの４ないし８アミノ酸の２領域の直鎖配列が部分的なＣＯＸ−３のｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーの製造に必要である。適するアミノ酸配列が一旦同定されれば、それらをコードすることが可能なＤＮＡ配列を標準的合成技術により、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用するか、あるいはｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡライブラリーまたは全ｍＲＮＡを鋳型としてかつ該アミノ酸配列から推定される１５ないし３０の縮重オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する確立したＰＣＲ増幅技術に従った縮重ＰＣＲによるかのいずれかで合成し得る。１種以上の遺伝暗号が特定の１アミノ酸をコードするのに使用されている可能性があるため、アミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされ得る。従って、既知のアミノ
酸配列に基づく縮重ＰＣＲプライマーの設計において、特定の宿主におけるコドン使用頻度を考慮に入れる。しばしば、各プライマーは、鋳型ＤＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを助長するようにオリゴヌクレオチドのプールを含有する。最大でプールの１メンバーのみがｈＣＯＸ−３配列に同一であることができかつｈＣＯＸ−３ ＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であることができるとは言え、わずかに不適合のプライマーもまた、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でｈＣＯＸ−３ ＤＮＡにハイブリダイズしてＰＣＲ増幅反応を開始することが可能である。
【００７０】
同定された供給源細胞からのｃＤＮＡライブラリーの調製もまた当該技術分野で公知の標準的技術により実施し得る。公知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に見出し得る。
【００７１】
同定された供給源細胞からの全ｍＲＮＡの単離は当該技術分野で公知の標準的技術により実施し得る。公知の全ｍＲＮＡ単離技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、上記に見出し得る。
【００７２】
ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は当該技術分野で公知の標準的技術により実施し得る。公知のゲノムＤＮＡライブラリーの構築技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記に見出し得る。
組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の局面は本発明の核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
【００７３】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含んでなる。組換え発現ベクターは発現に使用されるべき宿主細胞に基づき選択された１個若しくはそれ以上の制御配列を包含する。これらの制御配列は発現されるべき核酸配列に作動可能に結合される。組換え発現ベクター内で、「作動可能に結合される」という用語は、目的のヌクレオチド配列が該ヌクレオチド配列の発現（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、若しくはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞中で）を見込む様式で制御配列（１種若しくは複数）に結合されることを意味している。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル、および遺伝子発現の当業者に既知であるその他の考慮のような因子に依存し得ることが当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、本明細書に記述されるところの核酸によりコードされる融合タンパク質若しくはペプチドを包含するタンパク質若しくはペプチドを生成させ得る。
【００７４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））若しくは真核生物細胞（例えば、例えばバキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞）、酵母細胞若しくは哺乳動物細胞）中での本発明のポリペプチドの発現のため設計し得る。適する宿主細胞は当業者に既知である。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで転写かつ翻訳し得る。
【００７５】
原核生物中でのタンパク質の発現は、しばしば、融合若しくは非融合いずれかのタンパク質の発現を指図する構成的若しくは誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で実施する。融合ベクターは該ベクターによりコードされるタンパク質に多数のアミノ酸を付加する（通常は組換えタンパク質のアミノ末端にアミノ酸を付加する）。こうした融合ベクターは、典型的に４つの目的、すなわち１）組換えタン
パク質の発現を増大させること；２）組換えタンパク質の溶解性を増大させること；３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製にて補助すること；４）マーカーとしてはたらくことにより組換えタンパク質の検出を助長することにかなう。しばしば、融合発現ベクターにおいては、融合タンパク質の精製後の融合部分からの組換えタンパク質の精製を可能にするように、タンパク質分解性の切断部位が融合部分および組換えタンパク質の結合部に導入される。こうした酵素およびそれらのコグネイトの認識配列は第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、プロテインＡ、若しくはポリ−Ｈｉｓを融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈら、（１９８８）、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、若しくはｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ）を包含する。こうしたベクターは本発明の範囲内に企図されている。
【００７６】
適する誘導可能な非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、（１９８８）、Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）６０−８９）を包含する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での組換えタンパク質発現を最大化するための一戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解性に切断する損なわれた能力を伴う宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で優先的に利用されるものとなるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである。本発明の核酸配列のこうした変更は標準的ＤＮＡ合成技術により実施し得る。
【００７７】
別の態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）中での発現のためのベクターの例は、例えば、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒＪａｎら、（１９８２）、Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）、Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）およびｐＰｉｃＺ若しくはＰｉｃｈｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州サンディエゴ）を包含する。
【００７８】
あるいは、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、限定されるものでないがｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗら、（１９８９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）ならびにｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を挙げることができる。
【００７９】
なお別の態様において、発現ベクターは哺乳動物発現ベクターである。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの調節要素により提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０由来である。哺乳動物発現ベクターの例は、限定されるものでないがｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｉｎａｎら、（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ ６：１８７−１９５）を挙げることができる。組換えＣＯＸ−３発現に適し得る商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、限定されるものでないがｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤ
ＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）およびｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）を挙げることができる。
【００８０】
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指図することが可能である（例えば、組織特異的調節要素を使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節要素は当該技術分野で既知である。適する組織特異的プロモーターの制限しない例は、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら、（１９８７）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、Ｔ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏら、（１９８９）、ＥＭＢＯ Ｊ ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（ＢａｎｅｉＪｉら、（１９８３）、Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎら、（１９８３）、Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）のプロモーターを包含するリンパ球様特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅら、（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）を包含する。他のプロモーターはニューロン特異的プロモーター（例えば神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｍｅら、（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）および乳腺特異的プロモーター（例えばミルクホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）を包含する。発達で調節されるプロモーターは例えば海生ｈｏｘ（ｍａｒｉｎｅ ｈｏｘ）プロモーター（Ｋｅｓｓｅｌら、（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびβ−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓら、（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含する。
【００８１】
本発明はさらに、アンチセンスの向きで発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換えベクターを提供する。すなわち、該ＤＮＡ分子は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を見込む様式で制御配列に作動可能に結合される。多様な細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図することが可能である、アンチセンスの向きでクローン化された核酸に作動可能に結合された制御配列を選択し得、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的若しくは細胞型特異的発現を指図するウイルスのプロモーターおよび／若しくはエンハンサーまたは制御配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率の調節領域（その活性は該ベクターが導入された細胞型により決定され得る）の制御下で生成される、組換えプラスミド、ファージミド若しくは弱毒性ウイルスの形態であり得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）１９８６）を参照されたい。
【００８２】
本発明はまた、哺乳動物細胞中での低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成を指図する組換えベクター系も提供する。哺乳動物細胞中でのｓｉＲＮＡの合成を指図する例示的一ベクター系はｐＳＵＰＥＲ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、２００２、上記）である。ｐＳＵＰＥＲ上で、Ｈ１−ＲＮＡプロモーターを遺伝子特異的ターゲッティング配列（同一配列の逆相補物から短いスペーサーにより分離されている標的転写物からの１９ｎｔの配列）および終止シグナルとしての５個のチミジン（Ｔ５）の前にクローン化した。生じる転写物は、それ自身上で折り返されてＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＬｅｔ−７のものに似た１９塩基対のステム−ループ構造を形成すると予測される。該ループ（短い
スペーサー）の大きさは好ましくは９ｂｐである。ポリアデノシン尾部を欠き、十分に定義された転写開始および一列の５個のチミジン（Ｔ５）よりなる終止シグナルを伴う低分子ＲＮＡ転写物が生成された。最も重要なことには、終止部位での該転写物の切断が第二のウリジンの後であり２個の３’の突出したＴ若しくはＵヌクレオチドもまた含有する合成ｓｉＲＮＡの末端に似た転写物を生じる。ｐＳＵＰＥＲから発現されるｓｉＲＮＡは合成ｓｉＲＮＡと同じくらい効率的に遺伝子発現を崩壊させることが可能である。
【００８３】
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母若しくは細菌−動物細胞若しくは細菌−真菌細胞若しくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡのシャトリングを可能にする。多数のクローニングベクターが当業者に既知であり、そして適切なクローニングベクターの選択は選択の問題である。原核生物および真核生物双方の細胞のための他の適する発現系については、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記の第１６および１７章を参照されたい。
【００８４】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された組換え宿主細胞に関する。
【００８５】
トランスフェクションに適することができかつ商業的に入手可能である哺乳動物種由来の細胞株は、限定されるものでないが、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、キイロショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）若しくはネズミのＬ−細胞、およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）ならびにサル腎細胞を挙げることができる。
【００８６】
ベクターＤＮＡは慣習的な形質転換若しくはトランスフェクション技術を介して原核生物若しくは真核生物細胞に導入し得る。本明細書で使用されるところの「形質転換」若しくは「トランスフェクション」という用語は、細胞が外来ＤＮＡを取り込みかつその外来ＤＮＡをそれらの染色体に組込んでも若しくは組込まなくてもよい過程を指す。トランスフェクションは例えばリン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法、プロトプラスト融合を包含する多様な技術により達成し得る。宿主細胞の適する形質転換若しくはトランスフェクション方法はＭａｎｉａｔｉｓら（上記）および他の実験室手引き書に見出し得る。
【００８７】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小画分のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組込みうることが既知である。これらの組込み体を同定かつ選択するために、選択可能なマーカー（例えばある薬物に対する耐性についての）をコードする遺伝子を一般に目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を賦与するものを包含する。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞を薬物選択により同定し得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組込んだ細胞は生き残ることができる一方、他の細胞は死ぬ）。
【００８８】
別の態様において、細胞、細胞株若しくは微生物内の内因性のｈＣＯＸ−３核酸の発現の特徴を、挿入された調節要素が内因性遺伝子と効果的に結合しかつ該内因性遺伝子を制御、調節若しくは活性化するような細胞、安定細胞株若しくはクローン化微生物のゲノム中に目的の内因性遺伝子に対し異種のＤＮＡ調節要素を挿入することにより改変し得る。
【００８９】
異種調節要素は安定細胞株若しくはクローン化微生物中に挿入し得、その結果、それは当業者に公知でありかつ例えばＣｈａｐｐｅｌ、米国特許第５，２７２，０７１号明細書；１９９１年５月１６日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ ９１／０６６６７号明細書に記述されるターゲッティングされた（ｔａｒｇｅｔｅｄ）相同的組換えのような技術を使用して、内因性のｈＣＯＸ−３遺伝子に効果的に結合されかつそれの発現を活性化する。
【００９０】
本発明の組換え宿主細胞はまたヒト以外のトランスジェニック動物を製造するのにも使用し得る。例えば、一態様において、本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドをコードする配列を導入した受精卵若しくは胚幹細胞である。こうした宿主細胞をその後、本発明のポリペプチドをコードする外因性の配列がそれらのゲノム中に導入されたヒト以外のトランスジェニック動物、若しくは本発明のポリペプチドをコードする内因性の配列が変えられた相同的組換え動物を創製するのに使用し得る。こうした動物は該ポリペプチドの機能および／若しくは活性を研究するため、ならびにポリペプチド活性の調節物質を同定かつ／若しくは評価するために有用である。本明細書で使用されるところの「トランスジェニック動物」は、該動物の細胞の１個若しくはそれ以上が導入遺伝子を包含するヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラット若しくはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例はヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを包含する。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれかつ成熟動物のゲノム中に留まってそれにより該トランスジェニック動物の１種若しくはそれ以上の細胞型若しくは組織中でのコードされる遺伝子産物の発現を指図する外因性ＤＮＡである。ヒト以外のトランスジェニック動物のクローンはＷｉｌｍｕｔら、（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３ ８ ５：８ １０−８１３ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ ９７／０７６６８号および同第ＷＯ ９７／０７６６９号明細書に記述される方法に従ってもまた製造し得る。
本発明の単離されたポリペプチド
本発明の他の一局面は実質的に精製されたｈＣＯＸ−３ポリペプチドに関する。本発明は、アラキドン酸をプロスタグランジン前駆体プロスタグランジンＨ２に転化することが可能でありかつ配列番号４若しくは配列番号６に対する約６０％以上のアミノ酸配列の同一性、好ましくは約６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。２種のポリペプチド間の配列の同一性は上述された方法を使用して決定し得る。
【００９１】
好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは配列番号９若しくは配列番号１１に実質的に同一であるアミノ酸配列を含んでなる。
【００９２】
本発明の単離されたポリペプチドはキメラ若しくは融合タンパク質を包含する。本明細書で使用されるところの「キメラタンパク質」若しくは「融合タンパク質」は異種ポリペプチド（すなわち本発明の同一のポリペプチド以外のポリペプチド）の全部若しくは一部に作動可能に結合された本発明のポリペプチドの全部若しくは（好ましくは生物学的に活性の）一部を含んでなる。融合タンパク質内で、「作動可能に結合される」という用語は、本発明のポリペプチドおよび該異種ポリペプチドが相互にインフレームで融合されることを示すことを意図している。異種ポリペプチドは本発明のポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に融合し得る。
【００９３】
有用な融合タンパク質の一例は、本発明のポリペプチドがＨＡおよびポリＨｉｓから作成される標識にＣ末端で融合されるＨＡＨｉｓ融合タンパク質である。こうした融合タンパク質は本発明の組換えポリペプチドの検出および精製を助長する。
【００９４】
本発明は本発明のポリペプチドの発現若しくは単離方法に関する。一態様において、ポ
リペプチドは標準的なタンパク質精製技術を使用した適切な精製スキームにより、天然に該タンパク質を発現する細胞若しくは組織供給源から単離し得る。別の態様において、本発明のポリペプチドは組換えＤＮＡ技術により製造する。あるいは、本発明のポリペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および／若しくは転写系で合成し得る。さらにあるいは、本発明のポリペプチドは標準的ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【００９５】
本発明のポリペプチドは、本発明のＤＮＡ分子を上述された発現ベクターにクローン化すること、こうしたベクターを本明細書に記述される原核生物若しくは真核生物宿主細胞に導入すること、および組換えｈＣＯＸ−３タンパク質の生成に適する条件下で該宿主細胞を増殖させることにより組換え的に発現させ得る。発現ベクターを含有する細胞をクローン的に繁殖させ、そして個別に分析してそれらがｈＣＯＸ−３タンパク質を生成するかどうかを決定する。ｈＣＯＸ−３を発現する宿主細胞クローンの同定は、限定されるものでないが、抗ｈＣＯＸ−３抗体との免疫学的反応性および宿主細胞と関連するｈＣＯＸ−３活性の存在を挙げることができるいくつかの手段により行うことができる。適切な増殖条件および回収方法の選択は当該技術分野の熟練内にある。ポリペプチドの組換え的発現技術はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ，ら、上記に完全に記述され、そして当該技術分野で公知である。
【００９６】
本発明のポリペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および／若しくは転写系を使用してもまた製造し得る。こうした方法は当業者に既知である。例えば、合成のｈＣＯＸ−３ ｍＲＮＡ若しくはｈＣＯＸ−３生成細胞から単離したｍＲＮＡは、限定されるものでないがコムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳され得る。あるいは、ｈＣＯＸ−３ ｃＤＮＡのコーディング配列をＴ７プロモーターの制御下にクローン化し得る。その後、この構築物を鋳型として使用して、例えばＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から商業的に入手可能なもののようなＴＮＴ Ｔ７と組み合わせた（ｃｏｕｐｌｅｄ）網状赤血球ライセート系を使用して、ｈＣＯＸ−３タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳系で生成させ得る。
【００９７】
本発明のポリペプチドはまた、既知のアミノ酸配列若しくは目的の遺伝子のＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列を使用する自動化ペプチド合成機での固相ペプチド合成のような化学合成によっても製造し得る。
【００９８】
ヒトＣＯＸ−３タンパク質は当業者に既知の方法により精製し得る。例えば、天然の宿主細胞からのｈＣＯＸ−３、若しくは組換え宿主からの組換えｈＣＯＸ−３を、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ならびにＦＰＬＣ、ならびに抗体／リガンドアフィニティークロマトグラフィーの多様な組合せ若しくは個別の適用により、細胞ライセートおよび抽出物若しくは馴化培地から精製し得る。
【００９９】
例えば、ｈＣＯＸ−３タンパク質は、生来のｈＣＯＸ−３若しくはそのフラグメントに特異的なモノクローナル若しくはポリクローナル抗体を用いて作成した免疫親和性カラムの使用により他の細胞性タンパク質から分離し得る。抗体アフィニティーカラムは、該抗体がゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようなゲル支持体に抗体を添加することにより作成する。好ましい共有結合は抗体上に含有されるアミン、アルデヒド若しくはスルフヒドリル残基により作成される。抗体上のアルデヒド若しくは遊離スルフヒドリル基の生成方法は当該技術分野で公知であり、例えば、アミン基は一例においてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応性である。該アフィニティー樹脂をその後、適する緩衝液、例えばリン酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化し、そしてｈＣＯＸ−３を含有する細胞培養上清若しくは細胞抽出物にカラムをゆっくりと通過させる。カラムをその後、
光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドまで下落するまで緩衝液で洗浄する。その後、０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）のような緩衝液を使用してｐＨを低下させることによるような緩衝条件を変えることによりタンパク質を溶出する。精製したｈＣＯＸ−３タンパク質をその後、リン酸緩衝生理的食塩水のような適する緩衝液に対し透析する。
本発明のポリペプチドに対する抗体
本発明の別の局面は本発明のヒトＣＯＸ−３に特異的に結合する抗体に関する。とりわけ、該抗体は配列番号４若しくは配列番号６に対する約６０％以上のアミノ酸配列の同一性、好ましくは約６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドに特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体はヒトＣＯＸ−１若しくはヒトＣＯＸ−２を認識することができないがしかしヒトＣＯＸ−３のみを認識することができる。多様な態様において、本発明の実質的に精製された抗体若しくはそれらのフラグメントはヒト、ヒト以外、キメラおよび／若しくはヒト化抗体であり得る。本発明のこうした抗体および抗体フラグメントは、限定されるものでないがヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウマ、ニワトリ若しくはウサギ抗体のような多様な供給源由来であり得る。本発明に関する抗体はポリクローナル若しくはモノクローナル抗体であり得る。
【０１００】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造のための標準的技術を使用して抗体を生成するための免疫原として使用し得る配列番号４若しくは配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド、またはそれらのフラグメント。とりわけ好ましい免疫原組成物は、例えば動物以外の宿主細胞すなわち細菌宿主細胞から組換え的に発現された免疫原若しくは化学合成したオリゴペプチドのような他の動物タンパク質を含有しないものである。
【０１０１】
ポリクローナル抗体は、免疫アジュバントとともに若しくは伴わずに本発明の免疫原でマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなど（ウサギが好ましい）のような適する被験体動物を免疫することにより生じさせ得る。免疫前血清を第一の免疫化前に収集し得る。好ましくは、各動物は許容できる免疫アジュバントと会合した若しくはしていない約０．００１ｍｇと約１０００ｍｇとの間の免疫原を受領する。こうした許容できるアジュバントは、限定されるものでないがフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈殿物、ざ瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）およびｔＲＮＡを含有する油中水型乳剤を挙げることができる。初期免疫化は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）のいずれか若しくは双方の複数の部位での好ましくはフロイントの完全アジュバント中の免疫原よりなる。各動物は定期的な間隔で（好ましくは毎週）採血して抗体力価を測定する。動物は初期免疫化後に追加免疫注入を受領しても若しくはしなくてもよい。追加免疫注入を受領する動物は、一般に、フロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を同一経路により与えられる。追加免疫注入は最大の力価が得られるまで約３週間隔で与える。各追加免疫注入後７日に、若しくは単一の免疫化後ほぼ毎週、動物を採血し、血清を収集し、そしてアリコートを約−２０℃で保存する。
【０１０２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は近交系マウス（好ましくはＢａｌｂ／ｃ）を免疫原で免疫して製造する。マウスは、上で論考されたとおり、等容量の許容できるアジュバント中に組込んだ約０．１ｍｌの緩衝液若しくは生理的食塩水中の約０．００１ｍｇないし約１．０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇの免疫原でＩＰ若しくはＳＣ経路により免疫する。フロイントのアジュバントが好ましく、フロイントの完全アジュバントを初回免疫化に使用しかつフロイントの不完全アジュバントをその後使用する。マウスは第０日に初回免疫化を受領しかつ約２ないし約３０週間休ませる。免疫したマウスに、リン酸緩衝生理的食塩水のような緩衝溶液中の約０．００１ないし約１．０ｍｇのヒトＣＯＸ−３若しくはそ
のフラグメントの１回若しくはそれ以上の追加免疫を静脈内（ＩＶ）経路により与える。抗体陽性マウスからのリンパ球（好ましくは脾リンパ球）は、免疫したマウスから当該技術分野で既知の標準的手順により脾を取り出すことにより得る。ハイブリドーマ細胞は、安定なハイブリドーマの形成を可能にすることができる条件下で脾リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と混合することにより製造する。融合パートナーは限定されるものでないが：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０を挙げることができ、Ｓｐ２／０が一般に好ましい。抗体生成細胞および骨髄腫細胞を約３０％から約５０％までの濃度のポリエチレングリコール（分子量約１０００）中で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、当該技術分野で既知の手順によりヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での増殖により選択する。上清液体を増殖陽性のウェルから約第１４、１８および２１日に収集し、そして抗原としてヒトＣＯＸ−３若しくはそのフラグメントを使用する固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより抗体生成についてスクリーニングする。培養液体はまた、ｍＡｂのアイソタイプを決定するためにオークターロニー沈降アッセイでも試験し得る。抗体陽性のウェルからのハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＫｒｕｓｅとＰａｔｅｒｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９７３中のソフトアガー技術のような既知の技術若しくは制限希釈技術によりクローン化する。
【０１０３】
モノクローナル抗体は、プライミング後最低約４日の約１×１０６ないし約６×１０６ハイブリドーマ細胞を用いるマウスあたりおよそ０．５ｍｌのプリスタンでプライミングしたＢａｌｂ／ｃマウスの注入によりｉｎ ｖｉｖｏで生成させる。細胞移入後およそ８〜１２日に腹水を収集し、そしてモノクローナル抗体を当該技術分野で既知の技術により精製する。
【０１０４】
モノクローナルＡｂはまた、当該技術分野で公知の組織培地中でハイブリドーマを増殖させることによりｉｎ ｖｉｔｒｏでも製造し得る。高密度のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物を伝導して、当該技術分野で公知の中空ファイバー培養技術、エアリフトリアクター、ローラーボトル若しくはスピナーフラスコ培養技術を使用して大量のｍＡｂを生成させる。ｍＡｂは当該技術分野で既知の技術により精製する。
【０１０５】
腹水若しくはハイブリドーマ培養液体の抗体力価は、限定されるものでないが沈降法、受動凝集、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を挙げることができる多様な血清学的若しくは免疫学的アッセイにより測定する。類似のアッセイを使用して体液若しくは組織および細胞抽出物中のＣＯＸ−３の存在を検出する。
【０１０６】
抗体分子は哺乳動物（例えば血液）若しくは培養細胞から単離しかつプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製してＩｇＧ画分を得ることができる。あるいは、本発明のタンパク質若しくはポリペプチドに特異的な抗体は例えばアフィニティークロマトグラフィーについて選択（例えば部分的に精製）若しくはそれにより精製し得る。例えば、本発明の組換えで発現されかつ精製（若しくは部分的に精製）されるタンパク質を本明細書に記述されるとおり製造し、そして例えばクロマトグラフィーカラムのような固体支持体に共有若しくは非共有結合する。その後該カラムを使用して、多数の異なるエピトープに向けられた抗体を含有するサンプルから本発明のタンパク質に特異的な抗体をアフィニティー精製して、それにより実質的に精製された抗体組成物、すなわち汚染する抗体を実質的に含まないものを生成させ得る。実質的に精製された抗体組成物により、この情況において、抗体サンプルがせいぜいわずか３０％（乾燥重量）の本発明の所望のタンパク質若しくはポリペプチド上のもの以外のエピトープに向けられた汚染する
抗体を含有することを意味しており、そして、好ましくはサンプルのせいぜい２０％、なおより好ましくはせいぜい１０％、および最も好ましくはせいぜい５％（乾燥重量）が汚染する抗体である。精製された抗体組成物は、該組成物中の抗体の最低９９％が本発明の所望のタンパク質若しくはポリペプチドに向けられていることを意味している。
【０１０７】
加えて、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作成し得るヒトおよびヒト以外の双方の部分を含んでなるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗体が本発明の範囲内にある。キメラ抗体は、その中で多様な部分がマウスｍＡｂ由来の可変領域−およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような異なる動物種由来である分子である（例えばＣａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。ヒト化抗体はヒト以外の種からの１種若しくはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からの枠組み領域を有するヒト以外の種からの抗体分子である（例えばQｕｅｅｎ、米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照されたい）。こうしたキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ ８７／０２６７１号明細書に記述される方法を使用して、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により製造し得る。
【０１０８】
完全にヒトの抗体がヒト患者の治療的処置にとりわけ望ましい。こうした抗体は例えば内因性の免疫グロブリンＨおよびＬ鎖遺伝子を発現することが不可能でありかつヒトＨおよびＬ鎖遺伝子もまた発現し得るトランスジェニックマウスを使用して製造し得る。該トランスジェニックマウスを、選択した抗原、例えば本発明のポリペプチドの全部若しくは一部分で通常の様式で免疫する。該抗原に向けられたモノクローナル抗体は慣習的ハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスにより担持されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子がＢ細胞分化の間に再配列し、そしてその後クラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。従って、こうした技術を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を製造することが可能である。ヒト抗体の製造のためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇら、（１９９５）、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照されたい。
【０１０９】
選択したエピトープを認識する完全にヒトの抗体は「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技術を使用して生成し得る。このアプローチにおいて、選択したヒト以外のモノクローナル抗体（例えばマウス抗体）を使用して、同一エピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択が誘導される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、（１９９４）、Ｂｉｏｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【０１１０】
本発明の抗体（例えばモノクローナル抗体）を使用して、アフィニティークロマトグラフィー若しくは免疫沈降法のような標準的技術により本発明のポリペプチドを単離し得る。さらに、こうした抗体を使用して、該ポリペプチドの豊富さおよび発現パターンを評価するために（例えば細胞ライセート若しくは細胞上清または細胞膜調製物中の）該タンパク質を検出し得る。該抗体は例えば、例えば所定の処置レジメンの有効性を決定するための臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターするために診断的にもまた使用し得る。検出は抗体を検出可能な物質に結合することにより助長し得る。検出可能な物質の例は、多様な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射活性物質を包含する。適する酵素の例は、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適する補欠分子団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適する蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド若しくはフィコエリトリンを包含し；発光物質の一例はルミノールを包含し；生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを包含し、そして適する放
射活性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ若しくは３Ｈを包含する。
【０１１１】
さらに、抗体（若しくはそのフラグメント）はサイトトキシン、治療薬若しくは放射活性金属イオンのような治療的部分に複合させ得る。サイトトキシンすなわち細胞傷害性の剤は細胞に有害であるいかなる剤も包含する。例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、Ｉ−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらのアナログ若しくは相同体を包含する。治療薬は、限定されるものでないが、代謝拮抗薬（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮ−ＬＪ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（１１）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソラビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂薬（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）を挙げることができる。
【０１１２】
本発明の複合物は所定の生物学的応答を改変するのに使用し得、該薬物部分は古典的な化学的治療薬に制限されると解釈されるべきでない。例えば、薬物部分は所望の生物活性を有するタンパク質若しくはポリヌクレオチドであり得る。あるいは、抗体を第二の抗体と複合させて米国特許第４，６７６，９８０号明細書にＳｅｇａｌにより記述されるところの抗体異種複合物を形成し得る。
検出方法
本発明はまた、サンプル中の本発明のポリペプチド若しくは核酸の検出方法にも関する。該サンプルは、限定されるものでないが被験体から採取した生物学的サンプル、化学合成したサンプルおよび実質的に精製されたサンプルを挙げることができるいかなる型のサンプルでもあり得る。こうしたアッセイを診断目的上使用し得る。
【０１１３】
一態様において、本発明は、配列番号３若しくは配列番号５の配列をもつ核酸分子にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸プローブとサンプルを接触させる段階、および該プローブ−核酸分子複合体を検出する段階を含んでなる、ヒトＣＯＸ−３遺伝子の核酸分子の検出方法を提供する。限定されるものでないがノーザン若しくはサザンハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲを挙げることができる核酸分子の検出方法は当業者に既知である。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％、８０％若しくは９０％の配列の同一性を有するポリペプチドに選択的に結合する抗体とサンプルを接触させる段階、および該タンパク質−抗体複合体を検出する段階を含んでなる、ヒトＣＯＸ−３タンパク質の検出方法を提供する。限定されるものでないが酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫組織化学を挙げることができるポリペプチドの検出方法が当業者に既知である。
【０１１５】
ｈＣＯＸ−３タンパク質はまたサンプル内のシクロオキシゲナーゼ−３活性を測定することによっても検出し得る。こうしたアッセイは：ａ）シクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である剤とともに試験サンプルをインキュベートする段階；ｂ）シクロオキシゲナーゼの基質を試験サン
プルに曝露する段階；およびｃ）試験サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性を測定する段階、およびそれを対照のものと比較する段階を含んでなり、ここで、試験サンプルはシクロオキシゲナーゼの基質に曝露され、そしてシクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である剤に曝露されない。
【０１１６】
シクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である剤はイヌＣＯＸ−３の研究に基づき当該技術分野で既知である（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００２、上記）。こうした剤はアセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナク、イブプロフェンなどから選択し得る。
【０１１７】
上に列挙される剤はＣＯＸ−３活性を優先的に阻害するため、これらの剤は、ＣＯＸ−１若しくはＣＯＸ−２を含んでなるサンプル中よりもＣＯＸ−３を含んでなるサンプル中でより大きくシクロオキシゲナーゼ活性を低下させるであろう。
【０１１８】
多数の方法を使用して生物学的サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性を測定し得る。好ましい一態様において、ＣＯＸ活性は放射測定（Ｄｙｅｒら、１９９５、Ｉｎｆｌａｍ．Ｒｅｓ．４４、Ｓ２４１）若しくはイムノアッセイ技術（Ｒｅｉｔｚら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：３８７８−３８８１）を使用して、アラキドン酸から生成されるプロスタノイドの量により測定し得る。アラキドン酸から生成されるプロスタノイドは、限定されるものでないがＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２およびトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）を挙げることができる。一態様において、ＣＯＸ活性は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．からのキット、バイオトラク［ＢｉｏＴｒａｋ］ＴＭ ＰＧＥ２を使用するエンザイムイムノアッセイにより、アラキドン酸から生成されるＰＧＥ２の量により測定し得る。別の例において、ＣＯＸ活性は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙからの商業的に入手可能なキット（カタログ番号５６０１３１若しくは５６０１０１）を使用して、ＥＩＡを介してのＣＯＸ由来のＰＧＨ２のＳｎＣｌ還元により生成されるＰＧＦ２αの量により測定し得る。あるいは、ＣＯＸ活性は、ＰＧＥ２若しくはＰＧＦ２αの量を測定するためのものに類似の方法を使用して、アラキドン酸から生成される他のプロスタノイドの量により測定し得る。
【０１１９】
別の態様において、ＣＯＸ活性は基質の存在下でのＣＯＸ依存性の酸素消費量を測定することにより測定し得る（Ｓｃｈｅｗｅら、１９９１、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、４６、８０４−８０９；Ｈｓｕａｎｙｕら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１７６４９−１７６５７）。
【０１２０】
別の好ましい態様において、ＣＯＸ活性はＣＯＸ酵素と関連するペルオキシダーゼ活性により測定し得る。ペルオキシダーゼ活性はヒドロペルオキシドＰＧ２のＰＧＨ２へのその後の還元を触媒する。ＣＯＸのペルオキシダーゼ活性は、ホモバリニン酸（Ｐｅｒｃｉｖａｌら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１５：１１１−１１８）若しくはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）（Ｃｏｐｅｌａｎｄら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１１２０２−１１２０６）のような色素形成性若しくは蛍光発生性である還元剤の補助基質を使用して測定し得る。あるいは、ＣＯＸのペルオキシダーゼ活性はリアルタイム発光アッセイ（Ｆａｒａｎｚら、１９９８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６４：２１６−２２１）でのルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１−４−フタラジンジオン）の還元により測定し得る。
【０１２１】
多様な商業的に入手可能なキットを使用してＣＯＸと関連するペルオキシダーゼ活性を測定し得る。例えば、ペルオキシダーゼに誘導されるルミノール発光アッセイキットがＡ
ｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．（カタログ番号９０７−００３）から入手可能であり；また、化学発光アッセイキットはＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（カタログ番号７６０１０１）から入手可能であり；および比色アッセイキット（カタログ番号７６０１１１）はＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから。
【０１２２】
本発明はまた、生物学的サンプル（試験サンプル）中の本発明のポリペプチド若しくは核酸の存在を検出するためのキットも包含する。こうしたキットを使用して、被験体がｈＣＯＸ−３に関係する障害に罹っているか若しくはそれを発症する増大した危険にさらされているかどうかを決定し得る。こうしたキットは、好ましくは、緊密な局限の最低１個の容器中に保持するのに適する区分された担体を含んでなる。該担体は標識抗原若しくは酵素基質などのような検出のための手段を含有し得る。例えば、該キットは、該ポリペプチド若しくは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することが可能な標識化合物若しくは剤、ならびにサンプル中のポリペプチド若しくはｍＲＮＡの量を測定するための手段（例えば、該ポリペプチドを結合する抗体、または該ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含み得る。該キットはまた、該ポリペプチド若しくは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量が正常レベルより上若しくは下である場合に試験被験体が該ポリペプチドの異常発現と関連する障害に罹っているか若しくはそれを発症する危険にさらされているかどうかを決定するための説明書も包含し得る。
【０１２３】
抗体に基づくキットについて、該キットは、例えば：（１）配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに選択的に結合する第一の抗体（例えば固体支持体に結合された抗体）、および、場合によっては；（２）第一の抗体、若しくは、第一の抗体が異なるエピトープに結合しかつ第二の抗体が検出可能な剤に複合するポリペプチドのいずれかに結合する第二の抗体；および（３）陽性対照としての精製された組換えｈＣＯＸ−３タンパク質を含み得る。好ましくは、第一の抗体はヒトＣＯＸ−３にのみ結合するがしかしヒトＣＯＸ−１若しくはヒトＣＯＸ−２、またはイヌのような他の種からのＣＯＸ−３に結合しない。
【０１２４】
ｈＣＯＸ−３活性に基づくキットについて、該キットは、例えば：（１）ＣＯＸ−１若しくはＣＯＸ−２のいずれよりもＣＯＸ−３の阻害においてより強力である剤；（２）ＣＯＸ−３の基質；（３）ＣＯＸ活性を検出するのに使用し得る手段、および（４）陽性対照としての精製された組換えｈＣＯＸ−３タンパク質を含み得る。シクロオキシゲナーゼ−１若しくはＣＯＸ−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である剤は、アセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナク、イブプロフェンなどから選択し得る。ＣＯＸ−３の基質は、結合されたアラキドン酸、またはＣＯＸ−３のペルオキシダーゼ活性により触媒される場合に色素形成性、蛍光発生性若しくは発光を生成することが可能である還元剤の補助基質と結合されたアラキドン酸であり得る。こうした還元剤の補助基質は、限定されるものでないがホモバニリン酸、ＴＭＰＤ、ルミノールなどを挙げることができる。ＣＯＸ活性を検出するのに使用し得る手段は、ＥＩＡによりアラキドン酸からの生成されたプロスタノイドを検出する、または還元剤の補助基質から生じる色素形成、蛍光発生若しくは発光反応を検出するための手段であり得る。
【０１２５】
オリゴヌクレオチドに基づくキットについて、該キットは、例えば：（１）配列番号３若しくは配列番号５に対する最低８０％の配列の同一性を有する核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の配列の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を増幅するのに有用な一対のプライマーを含み得る。該キットはまた、例えば緩衝剤、保存剤若しくはタンパク質安定剤も含み得る。該キットはまた、
検出可能な剤（例えば酵素若しくは基質）を検出するのに必要な成分も含み得る。該キットはまた、アッセイしかつ試験サンプルと比較し得る１種の対照サンプル若しくは一連の対照サンプルも含有し得る。キットの各成分は通常は個々の容器内に入れられ、そして多様な容器の全部が好ましくは単一包装内に含有される。
【０１２６】
本発明はまた、ｈＣＯＸ−３遺伝子中の遺伝子の損傷若しくは突然変異の検出方法も提供する。好ましい態様において、該方法は：（ａ）サンプルからヒトシクロオキシゲナーゼ−３のポリヌクレオチドを単離する段階；および（ｂ）該ヒトシクロオキシゲナーゼ−３のポリヌクレオチドをシークェンシングして遺伝子配列中の変化を検出する段階を含んでなる。
【０１２７】
目的の遺伝子突然変異若しくは遺伝子の損傷の例は、限定されるものでないが：１）遺伝子からの１個若しくはそれ以上のヌクレオチドの欠失；２）遺伝子への１個若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加；３）遺伝子の１個若しくはそれ以上のヌクレオチドの置換；４）遺伝子の染色体再配列；５）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの変化；６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのような遺伝子の異常な修飾；７）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野性型のスプライシングパターンの存在；８）該遺伝子によりコードされるタンパク質の非野性型のレベル；９）遺伝子の対立遺伝子喪失；および１０）該遺伝子によりコードされるタンパク質の不適切な翻訳後修飾の検出を挙げることができる。これらの遺伝子の損傷若しくは突然変異の検出方法は当該技術分野で公知である。ＰＣＲ反応、制限酵素切断パターン、サンプルおよび対照核酸をハイブリダイズすること、シークェンシング反応、電気泳動の移動度の変化、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅および選択的プライマー伸長のような遺伝子中の損傷を検出するのに使用し得る当該技術分野で既知の多数のアッセイ技術が存在する。
遺伝子治療を使用する処置方法
本発明は、遺伝子治療を使用してｈＣＯＸ−３の発現を増大若しくは減少させることによるｈＣＯＸ−３に関係する障害の危険にさらされている若しくはそれに罹っている被験体の治療方法を提供する。
【０１２８】
イヌにおいて、ＣＯＸ−３はアセトアミノフェンのような鎮痛／解熱薬により選択的に阻害され、ＣＯＸ−３がこの型の薬物の標的でありうることを示唆している（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００２、上記）。従って、遺伝子治療を介してＣＯＸ−３の発現を低下させることが、熱を低下させることおよび疼痛を緩和することのようなアセトアミノフェン型の薬物で得られるものと類似の治療効果を達成するであろうことが予見可能である。遺伝子治療は、鎮痛薬の継続投与が必要とされる慢性の疼痛若しくは発熱の治療において好ましい。とりわけ、全部のＮＳＡＩＤでそうであるため、アセトアミノフェンの鎮痛作用は、用量の増大が効果の小さな増大のみを生じさせる天井効果により制限される（Ｂｅａｖｅｒ、１９８８、Ａｍ Ｊ．Ｍｅｄ．、８４（Ｓｕｐｐｌｅ ５Ａ）：３−１５）。
【０１２９】
加えて、統計学的に有意の逆相関がアセトアミノフェンの使用と卵巣癌の危険との間で見出された（Ｃｒａｍｅｒら、１９９８、Ｌａｎｃｅｔ ３５１：１０４−７）。従って、遺伝子治療を介してヒトＣＯＸ−３の発現を減少させることは、アセトアミノフェンを毎日服用していると報告した女性が使用を報告していない女性よりも卵巣癌からの４５％よりより低い死亡率を有したという前向き試験からの結果（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、１９９８、Ｌａｎｃｅｔ、３５２：１３５４−５）に基づき、卵巣癌の死亡率の低下において有用な治療でありうる。
【０１３０】
一態様において、ＣＯＸ−３アンチセンス治療を使用して細胞中のｈＣＯＸ−３の発現を低下させ得る。ＣＯＸ−３アンチセンス治療は低下されたｈＣＯＸ−３活性が望ましい
場合にとりわけ有用である。
【０１３１】
アンチセンスに基づく戦略の原理は、遺伝子発現の配列特異的抑制がｍＲＮＡと相補アンチセンス種との間の細胞内ハイブリダイゼーションにより達成され得るという仮説に基づく。ハイブリッドＲＮＡ二重鎖の形成は、その場合、標的ＣＯＸ−３ ｍＲＮＡのプロセシング／輸送／翻訳および／若しくは安定性を妨害し得る。ハイブリダイゼーションはアンチセンス効果が起こるために必要とされる。アンチセンス戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注入およびアンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクションを包含する多様なアプローチを使用し得る。センス鎖へのアンチセンスのハイブリダイゼーションにより誘導される表現型の効果は、タンパク質レベル、タンパク質活性の測定値および標的ｍＲＮＡレベルのような基準の変化に基づく。
【０１３２】
アンチセンス核酸は、ｈＣＯＸ−３遺伝子のコーディング鎖全体若しくはその一部分にのみ相補的であり得る。アンチセンス核酸分子はまた、ｈＣＯＸ−３遺伝子のコーディング鎖の非コーディング領域の全部若しくは一部に相補的であり得る。非コーディング領域（「５’および３’ＵＴＲ」）はコーディング領域に隣接しかつアミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。好ましくは、非コーディング領域はｈＣＯＸ−３遺伝子の転写若しくは翻訳のための調節領域である。
【０１３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば配列番号３若しくは配列番号５の相補配列から取られた長さ約１５、２５、３５、４５若しくは６５ヌクレオチド若しくはそれ以上であり得る。該配列は、標的ｍＲＮＡ配列への十分に強いアニーリングを達成して該配列の翻訳を予防するために長さが最低１８ヌクレオチドであることが好ましい。（Ｉｚａｎｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ、３６：１００７−１０１５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：７０３−７０６）。アンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手順を使用する化学合成および酵素的ライゲーション反応を使用して構築し得る。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または、分子の生物学的安定性を増大若しくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計した多様に修飾したヌクレオチドを使用して化学合成し得、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用し得る。アンチセンス核酸を生成させるのに使用し得る修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシトネチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｉ−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルエシトシン、．５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを包含する。アンチセンス核酸分子はＣＣ−アノマー核酸分子であり得る。ＣＣ−アノマー核酸分子は、通常のＰ単位と対照的に鎖が相互に平行に走る特異的二本鎖ハイブリッドを相補ＲＮＡと形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４ １）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリ
ボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）若しくはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）も含み得る。
【０１３４】
あるいは、アンチセンス核酸は、核酸が上述されたとおりアンチセンスの向きにサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的にもまた製造し得る。アンチセンス発現ベクターは、高効率の調節領域（その活性は該ベクターが導入された細胞型により決定され得る）の制御下でアンチセンス核酸が生成される、組換えプラスミド、ファージミド若しくは弱毒性ウイルスの形態であり得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩ若しくはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら（１９８５、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）、ｐｐ．２２−２５）を参照されたい。
【０１３５】
典型的には、アンチセンス核酸は、微小注入、リポソーム被包化により被験体に投与するか、または該アンチセンス配列をもつベクターからの発現によりｉｎ ｓｉｔｕで生成させる。アンチセンス核酸分子の投与経路の一例は組織部位での直接注入を包含する。アンチセンス核酸は、ウイルスベクターを宿主細胞に導入する場合に該アンチセンス核酸の移入を媒介するウイルスベクターに連結し得る。適するウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを包含する。あるいは、アンチセンス核酸分子は選択した細胞を標的とするように改変し得、そしてその後全身投与し得る。例えば、全身投与のため、アンチセンス分子は、例えば細胞表面の受容体若しくは抗原に結合するペプチド若しくは抗体に該アンチセンス核酸分子を結合することにより選択した細胞表面上で発現される受容体若しくは抗原にそれらが特異的に結合するように改変し得る。
【０１３６】
一旦細胞の内側にあれば、アンチセンス核酸分子はＣＯＸ−３タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／若しくはゲノムＤＮＡとハイブリダイズすなわち結合してそれにより例えば転写および／若しくは翻訳を阻害することにより発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための慣習的ヌクレオチド相補性、若しくは、例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には二重らせんの主溝中での特異的相互作用によることができる。
【０１３７】
好ましい一態様において、ＣＯＸ−３活性を低下させることが有益である場合は、ＣＯＸ−３の発現を低下させることが必要な被験体におけるＣＯＸ−３の発現の低下方法は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を必要とする。
【０１３８】
数種の生物体において、二本鎖ＲＮＡの導入がＲＮＡ干渉として知られる過程により遺伝子発現を抑制するための強力なツールであることが判明している。ｈＣＯＸ−３に対応するｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの製造方法は上述されている。本発明は、（ａ）分解のためヒトＣＯＸ−３遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを被験体の細胞に導入する段階；（ｂ）被験体の細胞中でのヒトＣＯＸ−３遺伝子のｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ干渉が起こる条件下で（ａ）で生じられた細胞を維持する段階を含んでなる、ｈＣＯＸ−３の発現の低下を必要とする被験体の細胞におけるｈＣＯＸ−３の発現の低下方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、本明細書に記述されるアンチセンス核酸のものに類似に手順を使用して被験体の細胞に導入し得る。
【０１３９】
別の態様において、被験体の細胞中でヒトＣＯＸ−３タンパク質を発現することが可能な核酸分子を導入することによりｈＣＯＸ−３の発現を増大させるのに遺伝子治療を使用
し得る。ＣＯＸ−３遺伝子治療は、ＣＯＸ−３活性を上昇させることが有益である疾患の処置にとりわけ有用であり得る。
【０１４０】
ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療の実施手順は米国特許第５，３９９，３４６号明細書およびまたその特許の出願歴で提出された証拠物（それらの全部は公的に入手可能な文書である）に概説されている。一般に、遺伝子治療は、遺伝子の機能的１コピーの被験体の細胞（１個若しくは複数）中へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの導入、および遺伝子的に工作した細胞（１個若しくは複数）を該被験体に戻すことを必要とし得る。遺伝子の機能的コピーは、遺伝子的に工作した細胞（１個若しくは複数）での遺伝子の発現を可能にする調節要素の作動可能な制御下にある。多数のトランスフェクションおよび形質導入技術、ならびに適切な発現ベクターは当業者に公知であり、それらのいくつかはＰＣＴ出願第ＷＯ９５／００６５４号明細書に記述されている。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療はアデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、およびエプスタイン−バーウイルスのようなヘルペスウイルスのようなベクターを使用する。遺伝子治療はまた、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで感染を必要とする非ウイルス手段を使用しても達成し得る。こうした手段は、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法およびプロトプラスト融合を包含し得る。標的を定めたリポソームもまた細胞中へのＤＮＡの送達に潜在的に有益であり得る。
【０１４１】
一例として、ヒトＣＯＸ−３タンパク質をコードするＤＮＡ分子を最初にレトロウイルスベクターにクローン化し得る。該ベクターからのＣＯＸ−３タンパク質の発現は、その内因性プロモーター若しくはレトロウイルスの末端反復配列若しくはある種の標的細胞に特異的なプロモーターから駆動され得る。該ベクターをその後被験体の細胞に導入して、標的細胞中でｈＣＯＸ−３タンパク質を成功裏に発現させ得る。該遺伝子は、好ましくは、有効な機能を提供するのに十分なタンパク質をコードするように細胞により使用され得る形態でそれらの細胞に送達され得る。レトロウイルスベクターは、しばしば、とりわけそれらの高い感染効率ならびに安定な組込みおよび発現により、遺伝子治療のための好ましい遺伝子送達ベクターである。あるいは、ｈＣＯＸ−３ ＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ複合物若しくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合物、リポフェクション膜融合または直接微小注入法を使用する受容体に媒介される標的を定めたＤＮＡ移入を包含する非ウイルス技術により遺伝子治療のため細胞中に移入し得る。これらの手順およびそれらの変形はｅｘ ｖｉｖｏならびにｉｎ ｖｉｖｏのＣＯＸ−３遺伝子治療に適する。ｈＣＯＸ−３遺伝子とともにの使用に適する遺伝子治療の分子方法論のプロトコルは、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｐａｕｌ Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓにより編、Ｈｕｍａｎ ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ、１９９６に記述されている。
【０１４２】
処置の間、個体に投与される本発明の核酸分子の有効量は、患者の型、種、齢、重量、性および医学的状態；治療されるべき状態の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに使用されるその特定の核酸分子を包含する多様な因子により変動し得る。遺伝子治療の特化した熟練の医師若しくは獣医師は、状態の進行を予防する、打ち消す若しくは停止するのに必要とされる有効量を決定かつ処方し得る。毒性を伴わずに有効性を生じる範囲内の濃度の達成における至適の精度は、標的部位への該核酸分子の利用可能性のキネティクスに基づくレジメンを必要とする。これは、遺伝子治療に関与する核酸分子の分布、平衡および排泄の考慮を必要とする。
【０１４３】
本明細書に開示される遺伝子治療は、いかなる潜在的な毒性も最小化しつつｈＣＯＸ−３活性の至適の増大若しくは減少を得るために、慣例の試験により定義される適切な投薬量で単独で使用し得る。加えて、他剤の共投与若しくは連続投与も望ましいことがある。数種の剤を組合せて所望の効果を達成する場合には、投与の投薬量を調節する。これらの多様な剤の投薬量は、独立に至適化し得、かつ、相乗的な結果を達成するように組合せ得
、そこでは、病状は、いずれかの剤を単独で使用した場合にそれがそうであろうよりも低下される。
【０１４４】
本発明はまた：
（ａ）細胞中でのヒトシクロオキシゲナーゼ−３の発現若しくは活性を増大若しくは減少させる有効量の組成物を細胞に投与する段階；
（ｂ）治療上有効な量の鎮痛／解熱薬を細胞に投与する段階：
（ｃ）細胞に対する該鎮痛／解熱薬の治療効果を測定する段階、および
（ｄ）該治療効果を対照のものと比較する段階
を含んでなる、細胞中での鎮痛／解熱薬の作用機序の評価方法も企図している。
【０１４５】
一態様において、該比較する段階は、該治療効果を、細胞中のヒトシクロオキシゲナーゼ−３の発現若しくは活性が該鎮痛／解熱薬の投与前の増大もしくは減少されていない対照のものと比較することを含んでなる。
【０１４６】
細胞の内側のヒトＣＯＸ−３を標的とする鎮痛／解熱薬は、ＣＯＸ−３発現若しくは活性のレベルが細胞の内側で変化される場合にその治療効果の明瞭な識別を示すことができる。ＣＯＸ−３発現のレベルは上述されたとおりアンチセンス若しくはｓｉＲＮＡ技術により減少させ得る。ＣＯＸ−３発現のレベルは、機能的シクロオキシゲナーゼ−３タンパク質をコードすることが可能な核酸分子を被験体中の細胞に導入することにより増大させ得る。ｈＣＯＸ−３活性のレベルはｈＣＯＸ−３の活性化物質若しくは阻害剤を使用して増大若しくは減少させ得、また、ｈＣＯＸ−３の活性化物質若しくは阻害剤は下述される化合物同定方法を使用して得ることができる。
ｈＣＯＸ−３の調節物質の同定方法
ｈＣＯＸ−３の「阻害剤」、「活性化物質」および「調節物質」は、ヒトＣＯＸ−３のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ結合アッセイを使用して同定される阻害若しくは活性化する分子を指す。好ましくはヒトＣＯＸ−３のシクロオキシゲナーゼ活性を測定することにより。
【０１４７】
とりわけ、「阻害剤」はＣＯＸ−３発現若しくは活性を減少、予防、不活性化、脱感作若しくはダウンレギュレートする化合物を指す。「活性化物質」はＣＯＸ−３発現若しくは活性を増大、活性化、助長、感作若しくはアップレギュレートする化合物である。「調節物質」は「阻害剤」および「活性化物質」双方を包含する。
【０１４８】
化合物の同定方法は、慣習的な実験室での形式を使用して若しくはハイスループットに適合されたアッセイで実施し得る。「ハイスループット」という用語は複数のサンプルの容易なスクリーニングを同時に可能にするアッセイ設計を指し、そしてロボット操作についての能力を包含し得る。ハイスループットアッセイの別の所望の特徴は、所望の分析を達成するための試薬使用を減少させるか若しくは操作の数を最小化するように至適化されているアッセイ設計である。アッセイ形式の例は、液体を取り扱う実験に使用される９６ウェル若しくは３８４ウェルプレート、空中浮遊液滴および「実験室チップ（ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ）」微小チャンネルチップを包含する。プラスチック型の小型化および液体取扱い装置が進歩しているため、若しくは改良されたアッセイ装置が設計されているために、本発明の設計を使用してそのより多数のサンプルを実行し得ることが当業者に公知である。
【０１４９】
候補化合物は多数の化学的分類を包含するとは言え、典型的にはそれらは有機化合物である。好ましくはそれらは低分子有機化合物である。候補化合物は、ポリペプチドとの構造上の相互作用に必要な官能性化学基を含んでなり、そして典型的には最低１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシル若しくはカルボキシル基、好ましくは該官能性化学基の最低
２個およびより好ましくは該官能性化学基の最低３個を包含する。候補化合物は、上で同定された官能基の１個若しくはそれ以上で置換されている環状炭素若しくは複素環構造および／または芳香族若しくは多芳香族構造を含み得る。候補化合物はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上の誘導体若しくは構造アナログ、またはそれらの組合せなどでもあり得る。化合物が核酸である場合、該化合物は典型的にはＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子であるとは言え、非天然の結合若しくはサブユニットを有する修飾核酸もまた企図している。
【０１５０】
候補化合物は合成若しくは天然の化合物のライブラリーを包含する多様な供給源から得られる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを包含する多様な有機化合物および生体分子の無作為のおよび有向の合成に多数の手段が利用可能である。候補化合物はまた：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相若しくは溶液相ライブラリー：デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）を包含する当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれを使用しても得ることができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが利用可能であるか若しくは容易に製造される。加えて、天然および合成で製造したライブラリーおよび化合物は、慣習的な化学的、物理的および生化学的手段により容易に改変し得る。
【０１５１】
さらに、既知の薬理学的剤をアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような有向の若しくは無作為の化学修飾にかけて該剤の構造的アナログを製造し得る。候補化合物は無作為に選択し得るか、あるいは、ＣＯＸ−１若しくはＣＯＸ−２の活性に結合かつ／またはその機能を調節する既存の化合物に基づき得る。従って、候補の剤の供給源は、より多い若しくはより少ない化学的部分または異なる化学的部分を含有するように該分子の１個若しくはそれ以上の位置で該化合物の構造が変えられている既知のＣＯＸ活性化物質若しくは阻害剤に基づく分子のライブラリーである。アナログの活性化物質／阻害剤のライブラリーの創製において該分子になされる構造変化は、有向性、無作為、または有向のおよび無作為双方の置換および／若しくは付加の組合せであり得る。コンビナトリアルライブラリーの製造の当業者は、既存のＮＳＡＩＤ若しくは鎮痛／解熱性化合物に基づくこうしたライブラリーを容易に製造し得る。
多様な他の試薬もまた該混合物中に包含し得る。これらは、至適のタンパク質−タンパク質および／若しくはタンパク質−核酸結合を助長するのに使用し得る塩、緩衝剤、中性タンパク質（例えばアルブミン）、洗剤などのような試薬を包含する。こうした試薬はまた、反応成分の非特異的すなわちバックグラウンドの相互作用も低下させ得る。ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を向上させる他の試薬もまた使用し得る。
【０１５２】
分子ライブラリーの合成方法の例は当該技術分野、例えば：Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）．Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８に見出し得る。化合物のライブラリーは溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（特許第５，５７１，６９８号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）若しくはファージ（例えばＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３ ８６−３９０を参照されたい）上に提示し得る。
【０１５３】
一態様において、本発明は：（ａ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の活性フラグメントを含んでなるポリペプチドを試験化合物およびシクロオキシゲナーゼの基質と接触させる段階；ならびに（ｂ）（ａ）中のシクロオキシゲナーゼ活性を測定する段階、およびヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の活性フラグメントを含んでなるポリペプチドがシクロオキシゲナーゼの基質にのみ曝露されるがしかし試験化合物に曝露されない対照のものとそれを比較する段階を含んでなる、ヒトＣＯＸ−３により触媒されるプロスタグランジン合成を増大若しくは減少させる化合物の同定方法を提供する。ｈＣＯＸ−３の活性化物質である化合物は、基質転化速度を増大させかつ時間の関数としての対照と比較したサンプル中のより大きなＣＯＸ活性をもたらすことができる。ＣＯＸ−３の阻害剤である化合物は、基質転化速度を低下させかつ時間の関数としての対照と比較したサンプル中のより低いＣＯＸ活性をもたらすことができる。
【０１５４】
好ましい一態様において、上述されたヒトＣＯＸ−３により触媒されるプロスタグランジン合成を増大若しくは減少させる化合物の同定方法は、試験化合物がヒトＣＯＸ−１若しくはヒトＣＯＸ−２のような別のシクロオキシゲナーゼ酵素のシクロオキシゲナーゼ活性を変えるかどうかを試験する段階をさらに含んでなる。好ましくは、試験化合物はｈＣＯＸ３のシクロオキシゲナーゼ活性のみを増大若しくは低下するが、しかしｈＣＯＸ−１若しくはｈＣＯＸ−２のものを増大若しくは低下させない。
【０１５５】
生物学的サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性を測定するのに多数の方法を使用し得、そしてそれらは上述した。
【０１５６】
好ましい一態様において、該アッセイ方法で使用されるＣＯＸタンパク質は、天然若しくは組換えの宿主細胞と会合している。米国特許第５８３７４７９号明細書は、ＣＯＸ−２の組換え細胞株を使用するＣＯＸ−２活性を阻害する化合物の同定方法を特許請求する。ｈＣＯＸ−３の宿主細胞を使用してｈＣＯＸ−３活性を阻害する化合物を同定するのに類似の方法を使用し得る。「細胞」という用語は最低１個の細胞を指すが、しかし、検出方法の感度に適切な複数の細胞を包含する。好ましくは、本発明の方法に適する細胞は真核生物である。
【０１５７】
別の好ましい態様において、該アッセイで使用されるＣＯＸタンパク質は単離された膜調製物の一部である。ＣＯＸ−１若しくは−２と同様にＣＯＸ−３は膜タンパク質である。ヒトＣＯＸ−３を含有する膜を当業者に既知の方法を使用してｈＣＯＸ−３宿主細胞から単離し得、そしてスクリーニングアッセイでｈＣＯＸ−３の供給源として使用し得る。
【０１５８】
なお別の好ましい態様において、該アッセイで使用されるＣＯＸタンパク質は精製すなわち単離され得る。
【０１５９】
別の好ましい態様において、結合アッセイを使用して、ヒトＣＯＸ−３タンパク質に結合しかつｈＣＯＸ−３タンパク質の生物活性を増大若しくは減少させることが潜在的に可能である化合物を同定し得る。例示的一方法は：（ａ）試験化合物をｈＣＯＸ−３タンパク質およびｈＣＯＸ−３タンパク質の標識リガンドとともにインキュベートする段階；（ｂ）ｈＣＯＸ−３タンパク質を未結合の標識リガンドから分離する段階；ならびに（ｃ）ｈＣＯＸ−３に結合する標識リガンドの量の減少により該サブユニットへのリガンド結合を阻害する化合物を同定する段階を含んでなる。ｈＣＯＸ−３タンパク質の標識リガンドの一例は、上述されたところの標識ｈＣＯＸ−３特異的抗体、またはアセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナクおよびイブプロフェンのようなｈＣＯＸ−１若しくはｈＣＯＸ−２のいずれよりもｈＣＯＸ−３の阻害においてより強力
である剤である。好ましくは、ｈＣＯＸ−３を発現するがしかしｈＣＯＸ−１若しくはｈＣＯＸ−２を発現しないｈＣＯＸ−３宿主細胞（組換え若しくは天然の）を結合アッセイに使用し得る。より好ましくは、ｈＣＯＸ−３宿主細胞から調製した細胞膜を結合アッセイに使用し得る。さらに好ましくは、実質的に精製されたｈＣＯＸ−３タンパク質を結合アッセイに使用し得る。
【０１６０】
未結合の標識リガンドからのｈＣＯＸ−３タンパク質の分離は多様な方法で達成し得る。慣習的には、成分の最低１種を固体支持体上に固定し、それから未結合の成分を容易に分離し得る。固体支持体は多様な素材からおよび多様な形状で作成し得る（例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子など）。該支持体は、好ましくはＳ／Ｎ比を最大化する（主としてバックグラウンド結合を最小化する）ように、ならびに分離の容易さおよび費用のために選ばれる。
【０１６１】
分離は、例えばビーズ若しくはディップスティックをリザーバから取り出すこと、マイクロタイタープレートのウェルのようなリザーバを空にするか若しくは希釈すること、またはビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラム若しくはフィルターを洗浄溶液若しくは溶媒ですすぐことにより遂げることができる。分離段階は好ましくは複数のすすぎ若しくは洗浄を包含する。例えば、固体支持体がマイクロタイタープレートである場合、塩、緩衝剤、洗剤、非特異的タンパク質などのような特異的結合に参画しないインキュベーション混合物の成分を典型的に包含する洗浄溶液でウェルを数回洗浄し得る。固体支持体が磁性ビーズである場合、該ビーズを洗浄溶液で１回若しくはそれ以上洗浄しかつ磁石を使用して単離し得る。
【０１６２】
直接検出（例えば放射活性、発光、光学若しくは電子密度など）、または間接的検出（例えばＦＬＡＧエピトープのようなエピトープ標識、ワサビペルオキシダーゼのような酵素標識など）を提供するもののような多様な標識を、ｈＣＯＸ−３のリガンドを標識するのに使用し得る。
【０１６３】
本発明の上のアッセイ方法の一以上の態様において、複合体形成した形態のｈＣＯＸ−３タンパク質の複合体形成していないものからの分離を助長するため、ならびにアッセイの自動化を適合するために、ｈＣＯＸ−３若しくはそのリガンドのいずれかを固定することが望ましい可能性がある。ポリペプチドへの試験化合物の結合、若しくは候補化合物の存在および非存在下での標的分子とのポリペプチドの相互作用は、反応体を含有するのに適するいかなる容器中でも達成し得る。こうした容器の例はマイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管を包含する。一態様において、ｈＣＯＸ−３およびそのリガンドの一方若しくは双方をマトリックスに結合させるドメインを付加するｈＣＯＸ−３の融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとのｈＣＯＸ−３の融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；ミズーリ州セントルイス）若しくはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させ得、それをその後試験化合物若しくは試験化合物およびｈＣＯＸ−３の標識リガンドと組合せ得、そして複合体形成を実施しうる条件（例えば塩およびｐＨについて生理学的条件）下で該混合物をインキュベートし得る。インキュベーション後に、ビーズ若しくはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄していかなる未結合成分も除去し、そして複合体形成を例えば上述されたとおり直接若しくは間接的にのいずれかで測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そして標準的技術を使用して本発明のポリペプチドの結合若しくは活性のレベルを測定し得る。
【０１６４】
マトリックス上にタンパク質を固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイで使用し得る。例えば、ｈＣＯＸ−３若しくはそのリガンドのいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの複合を利用して固定し得る。
【０１６５】
ビオチニル化したポリペプチド若しくは標的分子を、当該技術分野で公知の技術（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；イリノイ州ロックフォード）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスセインイミド）から製造し得、そしてストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定し得る。あるいは、ｈＣＯＸ−３と反応性しかしｈＣＯＸ−３のその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化し得、そしてｈＣＯＸ−３を抗体複合により該ウェル中で捕捉し得る。こうした複合体の検出方法は、ＧＳＴで固定した複合体について上述されたものに加え、本発明のポリペプチドすなわち標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびに本発明のポリペプチドすなわち標的分子と関連した酵素活性を検出することに頼る酵素結合アッセイを包含する。
【０１６６】
本発明は本明細書に記述される特定の方法論、データベース、遺伝子配列および遺伝子配列分析方法などに制限されないことが理解される。これらは変動しうるからである。本明細書で使用される専門用語は本発明の範囲を制限することを意図していないこともまた理解されるべきである。本明細書および付属として付けられる請求の範囲で使用されるところの単数形「ａ」、「ａｎ」（１つの）および「ｔｈｅ」（該）は、情況が別の方法で明瞭に決定しない限り複数の言及を包含することを留意しなければならない。従って、例えば、「ａ ｇｅｎｅ（１遺伝子）」への言及は１若しくはそれ以上の遺伝子への言及でありかつ当業者に既知のその同等物を包含する、などである。事実、当業者は、本明細書に記述される方法を使用して、現在若しくは後に知られるいかなるＣＯＸ−３遺伝子およびタンパク質も同定かつ利用し得る。
実施例
【実施例１】
【０１６７】
ヒトＣｏｘ−１のイントロン１配列の確認
完全長のヒトＣＯＸ−１ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００９６２）をＮＣＢＩヒトゲノムデータベースを検索するためのクエリとして使用した。ヒトＣＯＸ−１遺伝子は第９染色体上に位置推定され、そして約２２ｋｂにわたる１１のエキソンおよび１０のイントロンを含んでなる。ＮＣＢＩからのエキソン１、イントロン１およびエキソン２の配列を図１Ａに示す。イヌＣｏｘ−３と同様にヒトＣｏｘ−３がヒトＣＯＸ−１のイントロン１全体を保持する場合、ヒトゲノムデータベースから得られる配列は翻訳でフレームがずれることができる。３種の可能な読み枠（ａ、ｂおよびｃ）のいずれも、ヒトＣｏｘ−１のエキソン１、イントロン１およびエキソン２によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをもたらさないとみられる（図１Ｂ）。従って、第一の疑問は、公表されたヒトゲノム配列が確かに正しいかどうかである。あるいは、公表されたゲノム配列が翻訳の早期終止をもたらすフレームシフト変異を含有するかどうか。
【０１６８】
ヒトＣＯＸ−１のエキソン１−イントロン１−エキソン２のゲノム配列を増幅するために２個のオリゴヌクレオチドを設計した。フォワードプライマーはエキソン１およびイントロン１配列の一部に基づき設計し、配列番号１、５’ＡＴＧＡＧＣＣＧＴＧＡＧＴＧＣＧＡＣＣＣＣＧＧＴ３’、そしてリバースプライマーはエキソン２に基づき、配列番号２、５’ＣＴＡＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＧＣＧＣＣＣＣＴＧＧＧＴ３’であった。ＰＣＲはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）から購入したアドバンテージ［Ａｄｖａｎｔａｇｅ］（Ｒ）−ＧＣゲノムＰＣＲキットを用いて実施した。反応混合物は、１μｇのヒトゲノムＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）、１０μｌの５×ＧＣゲノム反応緩衝液、０．５Ｍ ＧＣ−Ｍｅｌｔ、１．１ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２００μＭ ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマーおよび１μｌの５０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）−ＧＣゲノムＤＮＡポリメラーゼ混合物を含有した。ゲノムＰＣＲのサーマルサイクラーの
パラメータは：９４℃で１分間の初期変性、９４℃／３０秒および６８℃／２分の３５周期であった。ＰＣＲ産物（約１９０ｂｐのフラグメント）をｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔクローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州）にサブクローニングしかつシークェンシングした。
【０１６９】
配列分析は、ヒトＣＯＸ−１のエキソン１−イントロン１−エキソン２の配列がヒトゲノムデータベースに公表されたものと一致したことを示した。従って、イントロン１全体（９４ｂｐ）がｈＣＯＸ−３中に保持される場合、読み枠のシフトが存在してヒト組織中での活性のＣＯＸ３酵素の生成をもたらさないとみられる。少なくとも２つの機構、すなわち１）ＲＮＡ編集、すなわちｍＲＮＡレベルでのイントロン１全体の保持、次いで数ヌクレオチドの除去；若しくは２）イントロン１の部分的保持がオープンリーディングフレームを維持して活性のＣＯＸ３酵素の生成につながる可能性がある。
【実施例２】
【０１７０】
ヒトＣＯＸ−３のＮ末端をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒトＣＯＸ−３を同定するため、ゲノムＤＮＡ配列を増幅するために使用したものすなわち配列番号１と同一であるフォワードプライマー、およびヒトＣＯＸ−１のおよそｂｐ位置６００に位置するリバースプライマー 配列番号７、５’−ＴＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡ−３’を用いて、ヒト脳、胃および慢性骨髄性白血病のｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲは、５μｌのマラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］ＴＭヒト脳ｃＤＮＡ、５μｌの１０×反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマーおよび１μｌの５０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）−ＧＣ２ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）を含有する５０μｌの最終容量中で実施した。ＰＣＲ反応パラメータは：９４℃で１分間の初期変性、次いで９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で２分間の伸長の３０周期であった。ＰＣＲ後に０．６ｋｂのＰＣＲフラグメントを精製し、平滑化し（ｐｏｌｉｓｈｅｄ）かつｐＰＣＲｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。約２０個の独立したクローンを拾い、それらのプラスミドＤＮＡを単離しかつシークェンシングした。
【０１７１】
二本鎖ＤＮＡのシークェンシング分析は、ヒト組織中に３種の型のＣＯＸ−３スプライシングバリアントが存在することを示した。第一の型（型Ｉ）は、９４ｂｐのイントロン１全体が保持されて読み枠中のシフトをもたらし、ＣＯＸが不活性のタンパク質でありそうである非常に短いペプチドをコードするものである。第二の型（型ＩＩ若しくはＣＯＸ−３ａ、図１Ｃ）はイントロン１のほぼ全体を保持するがしかし位置６４のグアニジンが欠けており、読み枠中の短くかつ自己整流性の（ｓｅｌｆ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ）シフトにつながり、完全長かつＣＯＸ活性のタンパク質をコードする。ＣＯＸ−３ａのアミノ末端のヌクレオチド配列を配列番号３に描き、また、配列番号３によりコードされるアミノ酸配列を配列番号４に描く。ＩＩ型のスプライシングバリアントと同様、第三の型（型ＩＩＩ若しくはＣＯＸ−３ｂ、図１Ｄ）もまたイントロン１のほぼ全体を保持するがしかしｂｐ位置４３のシトシンが欠けており、読み枠中の別の短くかつ自己整流性のシフトにつながり、完全長かつＣＯＸ活性のタンパク質をコードする。ＣＯＸ−３ｂはそのＮ末端でＣｏｘ−３ａとわずかに異なるタンパク質をコードする。ＣＯＸ−３ｂのアミノ末端のヌクレオチド配列を配列番号５に描き、そして、配列番号５によりコードされるアミノ酸配列を配列番号６に描く。
【０１７２】
これらの結果はヒトＣｏｘ−３の存在を示し、ヒトＣＯＸ−３がイントロン１の保持後に１個若しくは１個以上のＲＮＡ編集事象を介して形成され得ることを示唆する。ヒトＣｏｘ−１のイントロン１の保持によりコードされるｈＣｏｘ−３ａ若しくはｈＣｏｘ−３ｂのＮ末端はイヌのものと大きく異なり、イヌＣｏｘ−３のものに対しそれぞれ約３３％
若しくは２６％の配列の同一性を表す（図１Ｅ）。ヒトＣＯＸ−１のイントロン１のヌクレオチド配列はイヌＣＯＸ−１のイントロン１のものに対する約７５％の配列の同一性を共有する（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００２、上記）。
【実施例３】
【０１７３】
ヒトＣＯＸ−１およびＣＯＸ−３のゲノム構造およびスプライシングバリアント
ヒトＣＯＸ−１およびＣＯＸ−３遺伝子の完全長のｃＤＮＡ配列を使用してＧｅｎｂａｎｋヒトゲノムデータベースを検索した。該検索は、ヒトＣＯＸ−１／ＣＯＸ−３タンパク質をコードする遺伝子が約２２ｋｂでありかつ第９染色体上に位置推定されることを示した。図２に示されるとおり、ヒトＣＯＸ−１タンパク質をコードする遺伝子は１１のエキソンおよび１０のイントロンから構成される。ＣＯＸ−１はエキソン１からエキソン１１によりコードされる一方、新規スプライシングバリアントＣＯＸ−３は、同一の数のエキソンおよびエキソン１とエキソン２との間の保持されたイントロン１によりコードされ、ＲＮＡ編集後にアミノ末端に３１残基の挿入をもたらす。
【実施例４】
【０１７４】
完全長のヒトＣＯＸ−３の集成
完全長のヒトＣＯＸ−３を集成するために、２種のヒトＣＯＸ−１特異的プライマー、すなわちフォワードプライマー、配列番号１２、５’ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＧＧ ＡＧＴ ＣＴＣ ＴＴＧ ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＴＣ、３’、およびＳａｌＩ制限酵素部位を含有するリバースプライマー、配列番号１３、５’ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＣＧ ＣＴＣ ＣＡＣ ３’を用いて、カルボキシル末端のｃＤＮＡフラグメントをマラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］ＴＭヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）から最初に増幅した。該ＰＣＲは、５μｌのマラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］ＴＭヒト脳ｃＤＮＡ、５μｌの１０×反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭの特異的プライマーおよび１μｌの５０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ＨＦ２ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有する５０μｌの最終容量中で実施した。ＰＣＲ反応パラメータは：９４℃で１分間の初期変性、次いで９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で２分間の伸長の３０周期であった。ＰＣＲ後に、１．７５ｋｂのＰＣＲフラグメントを精製し、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、１％アガロースゲル上で分離し、そして最終的に１．５５ｋｂのカルボキシル末端フラグメントを切り出した。
【０１７５】
完全長のヒトＣＯＸ−３ａ ｃＤＮＡを標準的な分子生物学の方法に従って集成しそしてｐＡＧＡ４ベクターにサブクローニングした。簡潔には、ｂｐ位置１（開始コドンを含むＮｄｅＩ部位）からｐｂ位置３３２（ＥｃｏＲＩ部位）までの０．３３ｋｂのＮ末端フラグメントおよび１．５５ｋｂのＣ末端フラグメント（ＥｃｏＲＩからＳａｌＩまで、上を参照されたい）を、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩにより予め消化したｐＡＧＡ４ベクターに直接サブクローニングした。生じる構築物をｈＣＯＸ−３／ｐＡＧＡ４と呼称した。最終構築物をＤＮＡシークェンシングにより確認した。完全長のヒトＣＯＸ−３ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号８に描き、また、完全長のヒトＣＯＸ−３ａのアミノ酸配列を配列番号９に描く。
【０１７６】
類似の手順に従って完全長のヒトＣｏｘ−３ｂ ｃＤＮＡもまた集成し得る。完全長のヒトＣＯＸ−３ｂ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１０に描き、また、完全長のヒトＣＯＸ−３ｂのアミノ酸配列を配列番号１１に描く。
【実施例５】
【０１７７】
ヒトＣＯＸ−３ａおよびＣＯＸ−１タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳分析
ヒトＣＯＸ−３ａおよびＣＯＸ−１タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を、供給元が推奨するプロトコルに従ってＴｎＴ（Ｒ）Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。簡潔には、１μｌの０．１μｇ／μｌ ｈＣＯＸ−３／ｐＡＧＡ４およびｈＣＯＸ−１／ｐＡＧＡ４構築物を、０．２μｌの［３５Ｓ］メチオニン（１０ｍＣｉ／ｍｌで１０００Ｃｉ／ｍｍｍｏｌ）を伴う９μｌのＴＮＴ Ｑｕｉｃｋマスターミックスに添加した。反応混合物を３０℃で９０分間インキュベートした。等容量の２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液反応を添加することにより反応を停止し、そしてその後サンプルを１０〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離にかけた。電気泳動後にゲルをクマシーブルーＲ２５０で染色し、乾燥しそしてＸ線フィルムに露光させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたヒトＣＯＸ−３ａタンパク質はＣＯＸ−１タンパク質よりわずかにより大きく、そして、双方とも、対応する核酸配列からのアミノ酸配列の翻訳により予測されるとおり、約７０ｋＤａの推定される分子量まで移動した。
【０１７８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたヒトＣＯＸ−３ａおよびＣＯＸ−１タンパク質をウエスタンブロットによってもまた分析した。簡潔には、２μｌのｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたヒトＣＯＸ−３およびＣＯＸ−１タンパク質を１０〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲル上のタンパク質をその後ニトロセルロースに転写した。ブロットをＴＴＢＳ（ｐＨ＝７．５の０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０、１００ｍＭトリス−ＨＣｌおよび０．９％ＮａＣｌ）中５％粉乳で室温で１時間ブロッキングし、そしてその後５００倍希釈の抗ヒトＣＯＸ−１モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに４℃で一夜インキュベートした。翌日、ブロットを１００ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄し、そしてワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに室温で１時間インキュベートした。１００ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄した後にブロットを発光試薬ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で可視化した。ウエスタンブロットの結果はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳分析からのものと一致した。
【実施例６】
【０１７９】
ヒトＣＯＸ−３発現のノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析を使用してヒトＣＯＸ−３の組織分布を評価した。ＣＯＸ−３のｂｐ３４−７１（イントロン１内）に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドｈｃｘｌ−１２をプローブとして使用した。ｈｃｘｌ−１２、配列番号１４のヌクレオチド配列は５’−ＴＧＧＣＡＴＴＣＡＡＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＣ−３’である。オリゴヌクレオチドプローブを［γ−３２Ｐ］ＡＴＰにより５’末端標識した。簡潔には、１０ｐｍｏｌのｈｃｘｌ−１２オリゴヌクレオチドを、２５μｌの総容量中で、３．５μｌの６０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１μｌの１０単位／μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）および供給元により提供された２．５μｌの１０×キナーゼ緩衝液の存在下、３７℃で３０分間インキュベートした。５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加により反応を停止した。標識プローブをその後、供給元のプロトコルに従ってクロマスピン（ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ）＋ＳＴＥ−３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）を使用して精製した。
【０１８０】
ヒトＭＴＮ（多組織ノーザン（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ））ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）から購入した。それらはヒトＭＴＮブロット（カタログ番号７７６０−１）、ヒトＩＩ ＭＴＮブロット（カタログ番号７７６７−１）、ヒトＩＩＩ ＭＴＮブロット（カタログ番号７７６７−１）およびヒト腫瘍ＭＴＮブロット（カタログ番号７７９２−１）である。各ブロットを５ｍｌのエクスプレスハイブ（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ）溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて４２℃で３０分間プレイハイブリダイズし、そしてその後２×１０６ｃｐｍ／μｌのヒトＣＯＸ−３オリゴヌクレオチドプローブの存在下に４２℃で２時間ハイブリダイズさせた。ブロ
ットを２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳですすぎ、そしてその後２００ｍｌの０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で室温で２時間２回洗浄した。最後にブロットを−８０℃の冷凍庫中で３日までＸ線フィルムに露光させた。
【０１８１】
ノーザンブロット分析は、ヒトＣＯＸ−３の主要な転写物が約４．５ｋｂであることを示す。該４．５ｋｂのＣＯＸ−３転写物はヒト胃中で最も豊富であり、次いで骨格筋、心、胎盤、肝、膵、脾、精巣、副腎および腎である。それは比較的低レベルで脳、肺、前立腺、小腸、白血球、甲状腺、脊髄、リンパ節および気管でもまた発現されている。胸腺、卵巣、結腸若しくは骨髄では有意の転写は観察されなかった。興味深いことに、４．５ｋｂのヒトＣＯＸ−３転写物のレベルは、われわれが試験した全部のヒト腫瘍組織で劇的に増大されたことが見出され、それが発癌である役割を演じているかもしれないことを示唆する。
【実施例７】
【０１８２】
ｈＣｏｘ−３に特異的なポリクローナル抗体の生成
ヒトＣＯＸ−３ａおよびＣｏｘ−３ｂのアミノ末端由来のオリゴペプチド配列を、ウサギでポリクローナル抗体を生じさせるために選択した。より良好な結合のため、該ペプチド中の内的システインをセリンに変えた。該オリゴペプチドのアミノ酸配列は配列番号１５、Ａｃ−ＭＳＲＥＣＤＰＧＡＲＷＧＣ−アミドであった。
【０１８３】
該ペプチドを合成しかつ抗体を生じさせ、そしてＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．により精製した。生じる抗体を該抗原ペプチドに対するＥＬＩＳＡにより試験し、そして同一ペプチドを用いてアフィニティー精製した。血清およびアフィニティー精製した抗体を、ウエスタンブロット、免疫沈降法、イムノＰＣＲ、免疫細胞化学および免疫組織化学を包含する免疫分析に使用した。
【実施例８】
【０１８４】
ヒトＣＯＸ−３発現のウエスタンブロット分析
ヒトＣＯＸ−３タンパク質発現を分析するために、特異的抗ヒトＣＯＸ−３ポリクローナル抗体を生成させかつ実施例７に記述されたとおりアフィニティー精製した。作成済みヒト多組織全タンパク質ブロットをＢｉｏｃｈａｉｎ（カリフォルニア州）から購入した。簡潔には、作成済みブロットをＴＴＢＳ（ｐＨ＝７．４の０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ）中５％粉乳を用い室温で２時間ブロッキングし、そしてその後、５％粉乳／ＴＴＢＳ中１０００倍希釈のアフィニティー精製した抗ヒトＣＯＸ−３抗体とともに４℃で一夜インキュベートした。１０，０００倍希釈のＨＲＰと結合した二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）を該ブロットにＲＴで１時間適用した。最後に、ＥＣＬ−ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してシグナルをＸ線フィルム上で可視化した。
【０１８５】
結果は、２種の主要な免疫反応性のタンパク質（それぞれ８０および５５ｋＤａ）がヒト全タンパク質ライセート中で同定されたことを示した。おそらくヒトＣＯＸ−３ａ若しくは−３ｂを表す８０ｋＤａのタンパク質は、心、脳、腎、肝、骨格筋、胃および小腸中で発現されている。Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら（ＰＮＡＳ、２００２、Ｖｏｌ．９９、ｐｐ１３９２６）により記述される別のＣＯＸ−１のスプライシングバリアントＰＣＯＸ−１ａに類似である５５ｋＤａのタンパク質は、試験したヒト組織中でより広範に発現されている。数種のより小さい特徴付けられていないタンパク質もまた同定された。
【実施例９】
【０１８６】
昆虫Ｓｆ９細胞中でのヒトＣＯＸ−３ａの組換え発現
構造および機能研究のため、完全長のヒトＣＯＸ−３ａ ｃＤＮＡをバキュロウイルス
発現ドナーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）にサブクローニングした。構築物の転位後にＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）細胞中で組換えバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）を作成した。組換えバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）でのトランスフェクション後に高力価（１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）の組換えバキュロウイルスを得、そしてその後２回増幅した。約７５ｋＤａで移動する顕著なペプチドのバンドが、クマシーブルーＲ２５０により染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで観察され、その同一性は抗ＣＯＸ−１モノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットによりさらに確認された。
【実施例１０】
【０１８７】
ＣＯＸ活性アッセイ
ミクロソームタンパク質画分をｈＣＯＸ−３ａ組換えバキュロウイルスに感染させたＳｆ９細胞から調製した。ミクロソーム膜タンパク質（２０μｇ）を、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェノールおよび１．５μＭハマチンを含有する１５０μｌの容量の緩衝液中で、指定された濃度のアラキドン酸とともにインキュベートした。室温で５分間インキュベートした後に、混合を伴う４０μｌの１Ｎ ＨＣｌの添加により反応を停止した。サンプルを４０μｌの１Ｎ ＮａＯＨで中性にした。ＰＧＦ２α産物の形成を、製造元により指示されるとおりにＰＧＦ２αイムノアッセイキット（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。
【０１８８】
ＣＯＸ−１およびＸＯＣ−２と同様、ヒトＣＯＸ−３ａは、それぞれ０．５４μＭおよび３．０７ｐｍｏｌ／ｍｇ／分のＫｍおよびＶｍａｘ値を伴い、濃度依存性の様式でのアラキドン酸からのＰＧＦ２αの合成を触媒することが可能であった（図３）。
【０１８９】
本発明の多様な局面を実施例および好ましい態様への言及により上に具体的に説明したとは言え、本発明の範囲は前述の記述により定義されず、しかし特許法の原理のもとで適正に解釈される以下の請求の範囲により定義されることが認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】図１Ａは、ＮＣＢＩヒトゲノムデータベースに公表されたところのヒトＣｏｘ−１のエキソン１、イントロン１およびエキソン２のＤＮＡ配列を示す。図１Ｂは、３個の読み取り枠（ａ、ｂおよびｃ）のいずれも、エキソン１、イントロン１およびエキソン２によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをもたらさないことを示す。翻訳の終止は＊により示す。エキソン１およびエキソン２のヌクレオチド配列、ならびにＣｏｘ−１中でのようなそれらのコードされるアミノ酸配列は影を付けられる。図１Ｃは、ＲＮＡ編集後のＣｏｘ−３ａの翻訳を示す。図１Ｄは、ＲＮＡ編集後のＣｏｘ−３ｂの翻訳を示す。図１Ｅは、ＲＮＡ編集を伴う（ヒト）若しくは伴わない（イヌ）ヒトおよびイヌＣＯＸ−３中のＣＯＸ−１のイントロン１によりコードされるペプチド配列の比較を示す。アライメントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して２種の完全な配列のアライメントを見出すように実施した。該アライメントは適合の数を最大化しかつギャップの数を最小化する。適合はアライメント（１種若しくは複数）のための閾値を表す。すなわち、｜＝同一性；：＝２；．＝１。
【図２】ヒトＣＯＸ−３およびＣＯＸ−１の遺伝子構造を具体的に説明する。
【図３】ヒトＣｏｘ−３ａタンパク質がアラキドン酸からのＰＧＦ２ａの合成を触媒したことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３若しくは配列番号５に対する最低８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの相補配列を含んでなるポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号３若しくは配列番号５の最低１２の連続する塩基、またはそれらの相補配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低約７０％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ−３酵素をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子
【請求項５】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低約８０％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ−３酵素をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子
【請求項６】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低約９０％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ−３酵素をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号４若しくは配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ−３酵素をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号９若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ−３酵素をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号３若しくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号８若しくは配列番号１０のヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離かつ精製された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項１２】
請求項２に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項１３】
請求項３に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１１に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１２に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項１７】
アラキドン酸をプロスタグランジンＨ２に転化することが可能である、配列番号４若し
くは配列番号６に対する最低約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号４若しくは配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号９若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２２】
（ａ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質をコードすることが可能な発現ベクターを細胞に導入する段階；および
（ｂ）該発現ベクターからのヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の発現を可能にする条件下で該細胞を培養する段階
を含んでなる、組換え宿主細胞中でのヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の発現方法。
【請求項２３】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項２４】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低８０％の配列の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブを含んでなるキット。
【請求項２５】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに選択的に結合する抗体を含んでなるキット。
【請求項２６】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、シクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもヒトシクロオキシゲナーゼ−３活性を阻害することにおいてより強力である作用剤、シクロオキシゲナーゼの基質、およびシクロオキシゲナーゼ活性を検出するための手段を含んでなるキット。
【請求項２７】
シクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもヒトシクロオキシゲナーゼ−３活性を阻害することにおいてより強力である剤が、アセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナク若しくはイブプロフェンから選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
シクロオキシゲナーゼの基質がアラキドン酸である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
シクロオキシゲナーゼの基質が、シクロオキシゲナーゼのペルオキシダーゼ活性により触媒される場合に色素形成性、蛍光発生性、若しくは発光を生成することが可能である還元剤の補助基質と結合されているアラキドン酸を含んでなる、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
（ａ）配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子またはそれらの相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸プローブと試験サンプルを接触させる段階；および
（ｂ）プローブ−核酸分子複合体を検出する段階
を含んでなる、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３遺伝子の核酸分子の検出方法。
【請求項３１】
（ａ）配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに選択的に結合する抗体と試験サンプルを接触させる段階；および
（ｂ）タンパク質−抗体複合体を検出する段階
を含んでなる、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の検出方法。
【請求項３２】
ａ）シクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である作用剤とともに試験サンプルをインキュベートする段階；ｂ）シクロオキシゲナーゼの基質を試験サンプルに曝露させる段階；
ｃ）試験サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性を測定する段階、およびそれを対照の該活性と比較する段階［ここで、該試験サンプルはシクロオキシゲナーゼの基質にのみ曝露されるがしかしシクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である作用剤に曝露されない］
を含んでなる、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３活性の測定方法。
【請求項３３】
シクロオキシゲナーゼ−１若しくはシクロオキシゲナーゼ−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である作用剤が、アセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナク若しくはイブプロフェンから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
試験サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性が、基質アラキドン酸から生成されるプロスタノイドの量により測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
試験サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性が、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＦ２α、プロスタグランジンＩ２若しくはトロンボキサンＡ２から選択されるプロスタノイドの量により測定され、また、該プロスタノイドは基質アラキドン酸から生成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
試験サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性が、基質の存在下での酸素消費の量により測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
生物学的サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性が、シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性により測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性が、色素形成性若しくは蛍光発生性である還元剤の補助基質を使用して測定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
還元剤の補助基質がホモバニリン酸若しくはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性が発光アッセイにより測定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
発光アッセイがルミノール還元を伴うリアルタイム発光アッセイである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）サンプルからヒトシクロオキシゲナーゼ−３のポリヌクレオチドを単離する段階；および
（ｂ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３のポリヌクレオチドをシークェンシングして該遺伝子配列中の変化を検出する段階
を含んでなる、サンプル中のヒトシクロオキシゲナーゼ−３遺伝子配列中の変異の同定方法。
【請求項４３】
細胞中のシクロオキシゲナーゼ−３の発現を減少させる治療上有効な量の組成物と細胞を接触させることを含んでなる、細胞中のヒトシクロオキシゲナーゼ−３レベルの低下方法。
【請求項４４】
組成物が、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３遺伝子に特異的なアンチセンス核酸若しくはｓｉＲＮＡ分子を含んでなり、かつ、該アンチセンス核酸若しくはｓｉＲＮＡ分子がヒトシクロオキシゲナーゼ−３遺伝子発現を特異的に抑制する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）細胞中のヒトシクロオキシゲナーゼ−３の発現若しくは活性を増大若しくは減少させる有効量の組成物を細胞に投与する段階；
（ｂ）治療上有効な量の鎮痛／解熱薬を細胞に投与する段階；
（ｃ）細胞に対する該鎮痛／解熱薬の治療効果を測定する段階、および
（ｄ）該治療効果を対照のものと比較する段階
を含んでなる、細胞中での鎮痛／解熱薬の作用機序の評価方法。
【請求項４６】
ａ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の活性フラグメントを含んでなるポリペプチドを試験化合物およびシクロオキシゲナーゼの基質と接触させる段階；
ｂ）段階（ａ）のシクロオキシゲナーゼ活性を測定する段階、および、それを対照の該活性と比較する段階［ここで、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくは該ポリペプチドはシクロオキシゲナーゼの基質に曝露されかつ試験化合物に曝露されない］
を含んでなる、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３により触媒されるプロスタノイド合成を変える化合物の同定方法。
【請求項４７】
ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはポリペプチドが単離若しくは実質的に精製されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはポリペプチドが単離された膜調製物の一部である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはポリペプチドが組換え宿主細胞から発現される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
シクロオキシゲナーゼ活性が、基質アラキドン酸から生成されるプロスタノイドの量により測定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
シクロオキシゲナーゼ活性が、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＦ２α、プロスタグランジンＩ２若しくはトロンボキサンＡ２から選択されるプロスタノイドの量により測定され、かつ、該プロスタノイドは基質アラキドン酸から生成される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
生物学的サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性が、シクロオキシゲナーゼの基質の存在下での酸素消費の量により測定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
シクロオキシゲナーゼ活性が、シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性により測定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性が、色素形成性若しくは蛍光発生性である還元剤の補助基質を使用して測定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
還元剤の補助基質が、ホモバニリン酸若しくはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性が発光アッセイにより測定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
発光アッセイが、ルミノール還元を伴うリアルタイム発光アッセイである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
試験化合物が別のシクロオキシゲナーゼ酵素のシクロオキシゲナーゼ活性を変えるかどうかを試験する段階をさらに含んでなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
他のシクロオキシゲナーゼがヒトシクロオキシゲナーゼ−１若しくはヒトシクロオキシゲナーゼ−２から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
（ａ）試験化合物を、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはその活性フラグメント、およびヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の標識リガンドとともにインキュベートする段階；
（ｂ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはその活性フラグメントを未結合の標識リガンドから分離する段階；ならびに
（ｃ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３若しくはその活性フラグメントに結合する標識リガンドの量の減少によりヒトシクロオキシゲナーゼ−３へのリガンド結合を阻害する化合物を同定する段階
を含んでなる、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質に結合する化合物の同定方法。
【請求項６１】
前記ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはその活性フラグメントが単離若しくは実質的に精製されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはその活性フラグメントが単離された膜調製物の一部である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはその活性フラグメントが組換え宿主細胞から発現される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の前記標識リガンドが、アセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナク若しくはイブプロフェンから選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項１】
配列番号３若しくは配列番号５に対する最低８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの相補配列を含んでなるポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号３若しくは配列番号５の最低１２の連続する塩基、またはそれらの相補配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低約７０％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ−３酵素をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子
【請求項５】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低約８０％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ−３酵素をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子
【請求項６】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低約９０％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ−３酵素をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号４若しくは配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ−３酵素をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号９若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるシクロオキシゲナーゼ−３酵素をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号３若しくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号８若しくは配列番号１０のヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列を含んでなる、請求項２に記載の単離かつ精製された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項１２】
請求項２に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項１３】
請求項３に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１１に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１２に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項１７】
アラキドン酸をプロスタグランジンＨ２に転化することが可能である、配列番号４若し
くは配列番号６に対する最低約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号４若しくは配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号９若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２２】
（ａ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質をコードすることが可能な発現ベクターを細胞に導入する段階；および
（ｂ）該発現ベクターからのヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の発現を可能にする条件下で該細胞を培養する段階
を含んでなる、組換え宿主細胞中でのヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の発現方法。
【請求項２３】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項２４】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低８０％の配列の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブを含んでなるキット。
【請求項２５】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに選択的に結合する抗体を含んでなるキット。
【請求項２６】
配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、シクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもヒトシクロオキシゲナーゼ−３活性を阻害することにおいてより強力である作用剤、シクロオキシゲナーゼの基質、およびシクロオキシゲナーゼ活性を検出するための手段を含んでなるキット。
【請求項２７】
シクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもヒトシクロオキシゲナーゼ−３活性を阻害することにおいてより強力である剤が、アセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナク若しくはイブプロフェンから選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
シクロオキシゲナーゼの基質がアラキドン酸である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
シクロオキシゲナーゼの基質が、シクロオキシゲナーゼのペルオキシダーゼ活性により触媒される場合に色素形成性、蛍光発生性、若しくは発光を生成することが可能である還元剤の補助基質と結合されているアラキドン酸を含んでなる、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
（ａ）配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子またはそれらの相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸プローブと試験サンプルを接触させる段階；および
（ｂ）プローブ−核酸分子複合体を検出する段階
を含んでなる、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３遺伝子の核酸分子の検出方法。
【請求項３１】
（ａ）配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに選択的に結合する抗体と試験サンプルを接触させる段階；および
（ｂ）タンパク質−抗体複合体を検出する段階
を含んでなる、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の検出方法。
【請求項３２】
ａ）シクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である作用剤とともに試験サンプルをインキュベートする段階；ｂ）シクロオキシゲナーゼの基質を試験サンプルに曝露させる段階；
ｃ）試験サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性を測定する段階、およびそれを対照の該活性と比較する段階［ここで、該試験サンプルはシクロオキシゲナーゼの基質にのみ曝露されるがしかしシクロオキシゲナーゼ−１若しくは−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である作用剤に曝露されない］
を含んでなる、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３活性の測定方法。
【請求項３３】
シクロオキシゲナーゼ−１若しくはシクロオキシゲナーゼ−２のいずれよりもシクロオキシゲナーゼ−３の阻害においてより強力である作用剤が、アセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナク若しくはイブプロフェンから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
試験サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性が、基質アラキドン酸から生成されるプロスタノイドの量により測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
試験サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性が、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＦ２α、プロスタグランジンＩ２若しくはトロンボキサンＡ２から選択されるプロスタノイドの量により測定され、また、該プロスタノイドは基質アラキドン酸から生成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
試験サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性が、基質の存在下での酸素消費の量により測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
生物学的サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性が、シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性により測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性が、色素形成性若しくは蛍光発生性である還元剤の補助基質を使用して測定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
還元剤の補助基質がホモバニリン酸若しくはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性が発光アッセイにより測定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
発光アッセイがルミノール還元を伴うリアルタイム発光アッセイである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）サンプルからヒトシクロオキシゲナーゼ−３のポリヌクレオチドを単離する段階；および
（ｂ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３のポリヌクレオチドをシークェンシングして該遺伝子配列中の変化を検出する段階
を含んでなる、サンプル中のヒトシクロオキシゲナーゼ−３遺伝子配列中の変異の同定方法。
【請求項４３】
細胞中のシクロオキシゲナーゼ−３の発現を減少させる治療上有効な量の組成物と細胞を接触させることを含んでなる、細胞中のヒトシクロオキシゲナーゼ−３レベルの低下方法。
【請求項４４】
組成物が、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３遺伝子に特異的なアンチセンス核酸若しくはｓｉＲＮＡ分子を含んでなり、かつ、該アンチセンス核酸若しくはｓｉＲＮＡ分子がヒトシクロオキシゲナーゼ−３遺伝子発現を特異的に抑制する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）細胞中のヒトシクロオキシゲナーゼ−３の発現若しくは活性を増大若しくは減少させる有効量の組成物を細胞に投与する段階；
（ｂ）治療上有効な量の鎮痛／解熱薬を細胞に投与する段階；
（ｃ）細胞に対する該鎮痛／解熱薬の治療効果を測定する段階、および
（ｄ）該治療効果を対照のものと比較する段階
を含んでなる、細胞中での鎮痛／解熱薬の作用機序の評価方法。
【請求項４６】
ａ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の活性フラグメントを含んでなるポリペプチドを試験化合物およびシクロオキシゲナーゼの基質と接触させる段階；
ｂ）段階（ａ）のシクロオキシゲナーゼ活性を測定する段階、および、それを対照の該活性と比較する段階［ここで、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくは該ポリペプチドはシクロオキシゲナーゼの基質に曝露されかつ試験化合物に曝露されない］
を含んでなる、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３により触媒されるプロスタノイド合成を変える化合物の同定方法。
【請求項４７】
ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはポリペプチドが単離若しくは実質的に精製されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはポリペプチドが単離された膜調製物の一部である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはポリペプチドが組換え宿主細胞から発現される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
シクロオキシゲナーゼ活性が、基質アラキドン酸から生成されるプロスタノイドの量により測定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
シクロオキシゲナーゼ活性が、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＦ２α、プロスタグランジンＩ２若しくはトロンボキサンＡ２から選択されるプロスタノイドの量により測定され、かつ、該プロスタノイドは基質アラキドン酸から生成される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
生物学的サンプルのシクロオキシゲナーゼ活性が、シクロオキシゲナーゼの基質の存在下での酸素消費の量により測定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
シクロオキシゲナーゼ活性が、シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性により測定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性が、色素形成性若しくは蛍光発生性である還元剤の補助基質を使用して測定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
還元剤の補助基質が、ホモバニリン酸若しくはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
シクロオキシゲナーゼと関連するペルオキシダーゼ活性が発光アッセイにより測定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
発光アッセイが、ルミノール還元を伴うリアルタイム発光アッセイである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
試験化合物が別のシクロオキシゲナーゼ酵素のシクロオキシゲナーゼ活性を変えるかどうかを試験する段階をさらに含んでなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
他のシクロオキシゲナーゼがヒトシクロオキシゲナーゼ−１若しくはヒトシクロオキシゲナーゼ−２から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
（ａ）試験化合物を、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはその活性フラグメント、およびヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の標識リガンドとともにインキュベートする段階；
（ｂ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはその活性フラグメントを未結合の標識リガンドから分離する段階；ならびに
（ｃ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−３若しくはその活性フラグメントに結合する標識リガンドの量の減少によりヒトシクロオキシゲナーゼ−３へのリガンド結合を阻害する化合物を同定する段階
を含んでなる、ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質に結合する化合物の同定方法。
【請求項６１】
前記ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはその活性フラグメントが単離若しくは実質的に精製されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはその活性フラグメントが単離された膜調製物の一部である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質若しくはその活性フラグメントが組換え宿主細胞から発現される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
ヒトシクロオキシゲナーゼ−３タンパク質の前記標識リガンドが、アセトアミノフェン、フェナセチン、ジピロン、アスピリン、ジクロフェナク若しくはイブプロフェンから選択される、請求項６０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５２７２０２（Ｐ２００７−５２７２０２Ａ）
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２５０４（Ｐ２００６−５０２５０４）
【出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１０３９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４３１１
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（３９００３３００８）ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (616)
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ ＮＡＡＭＬＯＺＥ ＶＥＮＮＯＯＴＳＣＨＡＰ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１０３９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４３１１
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（３９００３３００８）ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (616)
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ ＮＡＡＭＬＯＺＥ ＶＥＮＮＯＯＴＳＣＨＡＰ
【Ｆターム（参考）】
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