本発明によると、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）のキナーゼ部分を第２タンパク質の部分と結合する融合タンパク質をもたらす、染色体２を含む新規な遺伝子欠失及び転座が、ヒト固形腫瘍、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）中で同定された。第２タンパク質は微小管関連タンパク質様４（Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like 4；ＥＭＬ−４）及びＴＲＫ−融合遺伝子（ＴＦＧ）を含有している。ＡＬＫチロシンキナーゼ活性を保持しているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質は、この突然変異によって特徴付けられるＮＳＣＬＣの増殖及び生存を促進することが確認された。従って、本発明は、ある側面で、開示される突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド及びベクター、それを検出するプローブ、単離された突然変異ポリペプチド、組み換えポリペプチド、及び融合及び切断されたポリペプチドを検出する試薬を提供する。開示される、この新規な融合タンパク質の同定は、生体試料におけるこれら突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドの存在を判定する新規な方法、このタンパク質を阻害する化合物をスクリーニングする方法、及び突然変異ポリヌクレオチド又はポリペプチドによって特徴付けられる癌の進行を阻害する方法を可能にして、これらもまた本発明により提供される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１又は配列番号１８のアミノ酸配列を含有している微小管結合タンパク質様４／未分化リンパ腫キナーゼ（Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like 4/Anaplastic Lymphoma Kinase; ＥＭＬ４−ＡＬＫ）融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、そのヌクレオチド配列は配列番号２又は配列番号１９のヌクレオチド配列を含有している；
（ｃ）ＥＭＬ−４のＮ−末端アミノ酸配列（配列番号３の残基１−２３３又は配列番号３の残基１−４９５）及びＡＬＫのキナーゼドメイン（配列番号５の残基１１１６−１３８３）を含有しているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）ＥＭＬ−４のＮ−末端ヌクレオチド配列（配列番号４の１−７００ヌクレオチド又は配列番号４の１−１４８６ヌクレオチド）及びＡＬＫのキナーゼドメインヌクレオチド配列（配列番号６の３３４８−４１４９ヌクレオチド）を含有しているヌクレオチド配列；
（ｅ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドの融合接合部（配列番号２の７００−７０１ヌクレオチド又は配列番号１９の１４８６−１４８７ヌクレオチド）を包含するする少なくとも６つの隣接ヌクレオチドを含有しているヌクレオチド配列；
（ｆ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（配列番号１の残基２３３−２３４又は配列番号１８の残基４９５−４９６）を包含する少なくとも６つの隣接アミノ酸を含有しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のヌクレオチド配列の何れかと相同性があるヌクレオチド配列：
よりなる群から選ばれる配列と少なくとも９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含有している、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドであって、当該ハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＡ残基のみ又はＴ残基のみを含有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズしない、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
当該ポリヌクレオチドが更に検出可能な標識を含有している、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入することを含有してなる、組み換えベクターを形成する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法で作成された組み換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組み換えベクターを宿主細胞に導入することを含有してなる、組み換え宿主細胞を作成する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法で形成された組み換え宿主細胞。
【請求項８】
当該方法がＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現に適している条件下で、請求項７に記載の組み換え宿主細胞を培養し、そして当該ポリペプチドを回収することを含有してなる、組み換えＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断された活性ＡＬＫポリペプチドを作成する方法。
【請求項９】
（ａ）配列番号１又は配列番号１８のアミノ酸配列を含有している、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするアミノ酸配列；
（ｂ）ＥＭＬ−４のＮ−末端アミノ酸配列（配列番号３の残基１−２３３又は配列番号３の残基１−４９５）及びＡＬＫのキナーゼドメイン（配列番号５の残基１１１６−１３８３）を含有している、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするアミノ酸配列；及び
（ｃ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（配列番号１の残基２３３−２３４又は配列番号１８の残基４９５−４９６）を包含する少なくとも６つの隣接アミノ酸を含有しているポリペプチドをコードするアミノ酸配列：
よりなる群から選ばれる配列に少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含有している、単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項５に記載の組み換えベクター又は請求項７に記載の組み換え宿主細胞を用いて作成された組み換えＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断された活性ＡＬＫポリペプチド。
【請求項１１】
請求項９に記載のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的に結合するか又はこれを検出するが、野生型のＥＭＬ−４又は野生型のＡＬＫの何れとも結合しないか又はこれを検出しない、単離された試薬。
【請求項１２】
当該試薬が抗体又は重同位体標識化（ＡＱＵＡ）ペプチドである、請求項１１に記載の単離された試薬。
【請求項１３】
当該試薬がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プローブ又は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブである、請求項１１に記載の単離された試薬。
【請求項１４】
当該ペプチドがＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部又は野生型ＡＬＫの切断点のアミノ酸配列を含有している、請求項１２に記載の重同位体標識化（ＡＱＵＡ）ペプチド。
【請求項１５】
当該方法が工程：
（ａ）哺乳類の癌から生体試料を得ること；及び
（ｂ）融合ポリヌクレオチド、又はＡＬＫの部分と二次タンパク質の部分を含有している、そのコードされた融合ポリペプチドを検出する少なくとも１つの試薬を用いて、ＡＬＫ突然変異ポリヌクレオチド及び／又はそのコードされた突然変異ＡＬＫポリペプチドが当該生体試料中に存在するか否かを判定すること：
を含有してなる、哺乳類の癌から得られる生体試料における、突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド又はそれがコードする突然変異ＡＬＫポリペプチドの存在を検出する方法。
【請求項１６】
当該癌が固形腫瘍、肉腫又は癌腫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
当該癌腫が肺癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
当該肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
当該突然変異ＡＬＫポリペプチドが、ＡＬＫ（配列番号５）の残基１１１６−１３８３と当該二次タンパク質の部分を含有している融合ポリペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
当該二次タンパク質が、ＥＭＬ−４（配列番号３）及びＴＲＫ−融合遺伝子（ＴＦＧ）タンパク質（配列番号２２）よりなる群から選ばれる、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２１】
当該融合ポリペプチドがＥＭＬ−４（配列番号３）の残基１−２３３又は残基１−４９５、又はＴＦＧ（配列番号２２）の残基１−１３８を含有している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
当該融合ポリヌクレオチドが、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（配列番号２又は１９）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（配列番号２１）を含有している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
当該融合ポリペプチドが、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド（配列番号1又は１8）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド（配列番号２０）を含有している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
当該融合ポリヌクレオチドが、請求項１に記載の融合ポリヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
当該融合ポリペプドが、請求項９に記載の融合ポリペプドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
当該試薬が、請求項１に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項１１に記載の少なくとも１つの試薬を含有している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
当該試薬が、ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド（配列番号２０）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（配列番号２１）と特異的に結合するか又はこれを検出するが、野生型のＴＦＧ又は野生型のＡＬＫの何れとも結合しないか又は検出しない単離された試薬を含有している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
当該試薬が抗体又は重同位体標識化（ＡＱＵＡ）ペプチドである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
当該試薬がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プローブ又は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
当該重同位体標識化（ＡＱＵＡ）ペプチドがＴＧＦ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部又は野生型ＡＬＫの切断点のアミノ酸配列を含有している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
当該方法が、フローサイトメトリー（ＦＣ）、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、又は免疫蛍光法（ＩＦ）のアッセイ形式で実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３２】
当該方法が、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のアッセイ形式で実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
当該ＡＬＫ融合ポリペプチドの活性を検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３４】
当該方法が、当該癌におけるＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性を当該化合物が阻害するか否かを判定する工程を含有してなる、化合物がＡＬＫ融合ポリペプチドの発現を特徴としている哺乳類の固形腫瘍の進展を阻害するか否かを判定する方法。
【請求項３５】
当該ＡＬＫ融合ポリペプチドが、ＡＬＫ（配列番号５）の残基１１１６−１３８３と当該二次タンパク質の部分を含有している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
当該二次タンパク質が、ＥＭＬ−４（配列番号３）及びＴＲＫ−融合遺伝子（ＴＦＧ）タンパク質（配列番号２２）よりなる群から選ばれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
当該融合ポリペプチドがＥＭＬ−４（配列番号３）の残基１−２３３又は残基１−４９５、又はＴＦＧ（配列番号２２）の残基１−１３８を含有している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
当該ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性の阻害が、請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する少なくとも１つの試薬及び／又は請求項１１に記載の少なくとも１つの試薬及び／又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド又はポリペプチドを検出する少なくとも１つの試薬を用いて判定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
当該方法が、当該癌における当該ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害する工程を含有してなる、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現する癌の進展を阻害する方法。
【請求項４０】
当該方法が、当該癌における当該ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害する工程を含有してなる、ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現する固形腫瘍の進展を阻害する方法。
【請求項４１】
当該癌又は当該固形腫瘍が肺癌である、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
当該肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
当該ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は当該ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性が、ＷＨＩ−１３１及び／又はＷＨＩ−１５４、又はその類縁体を含有している組成物で阻害される、請求項３９又は４０に記載の方法。

【図２Ａ】

【図２Ｂ（１）】

【図２Ｂ（２）】

【図２Ｃ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ（１）】

【図３Ｂ（２）】

【図４Ａ】

【図４Ｂ（１）】

【図４Ｂ（２）】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図５Ａ−Ｂ】

【図５Ｃ−Ｄ】

【図６】

【公表番号】特表２０１０−５０１１７５（Ｐ２０１０−５０１１７５Ａ）
【公表日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２５５３８（Ｐ２００９−５２５５３８）
【出願日】平成１９年４月１３日（２００７．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００９２７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２７２４８
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０１０８７４９０）セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド (11)
【Ｆターム（参考）】