ポイント・オブ・ケア分析器用マイクロ流体ベースのラボオンテストカード
マイクロ流体ベースのラボオンテストカードが記載されている。テストカードは、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）分析器で使用される。テストカードは、サンプルを受けとり、次いでＰＯＣ分析器を用いてサンプル中の特定の物質を定量化又はカウントするように設計されている。テストカードは、複数の層を具えてもよい。一実施例では、テストカードは、濾過表面、捕捉チャネル、及び粒子検出器を具える第一分離チャンバを具えている。テストカードは、ナノワイヤーセンサを具えていてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００８年１２月５日出願、発明の名称「半導体集積−ナノセンサ分析システム」、シリアル番号６１／１２０，２５３の米国暫定特許出願の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿、及びその他の体液などの生体サンプル中の抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、アプタマー、及び特定の細胞型又は物質の細胞受容体の検出は、病気の診断、治療効果の評価、及びその他の多くの目的で用いられる。現在の診断分析は、患者が医師を訪ねるか、研究所に赴く必要があるが、ポイント・オブ・ケア分析は診療室にいるかかりつけ医によって、又は自宅にいる患者によって、さらには遠隔地又は寝たきりの患者用の病院にいる医療提供者によっても実施することができる。
【０００３】
マイクロ流体技術は、従来の実験技術のいくつかの欠点に取り組むために適用されてきた。例えば、マイクロ流体技術は非常に少量の試薬を必要とする。しかしながら、マイクロ流体技術は、非常に少量の生体サンプルを処理することができるが、このことが検出するべき特定の細胞又は物質の量が非常に少ないときに感度を制限することになる。
【０００４】
安価で労働集約的でない生体サンプル中の特定の物質を検出するシステム及び方法が求められている。
【０００５】
ポイント・オブ・ケアで迅速に結果を出すことができる生体サンプル中の特定物質を検出するシステム及び方法が求められている。
【０００６】
非常に感度のよい生体サンプル中の特定物質を検出するシステム及び方法が求められている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、テストカードと共に使用するのに適したポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）分析器の一実施例を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、テストカードと共に使用するのに適したポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）分析器の一実施例を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、テストカードの一実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、テストカードの一実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図３Ａ】図３Ａは、第一分離チャンバの拡大図を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、孔の拡大図を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、捕捉チャネル２３８の一実施例の斜視図と断面図を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、捕捉チャネル２３８の一実施例の斜視図と断面図を示している。
【図５Ａ】図５Ａは、粒子検出器の一実施例の拡大図を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、粒子検出器の一実施例の拡大図を示している。
【図５Ｃ】図５Ｃは、粒子検出器の別の実施例の拡大図を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、テストカードの別の実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、テストカードの別の実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図７Ａ】図７Ａは、テストカードの別の実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、テストカードの別の実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、それぞれ第二分離層の平面と底面の拡大図を示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、それぞれ第二分離層の平面と底面の拡大図を示している。
【図９Ａ】図９Ａは、ナノワイヤセンサの一実施例の拡大図を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ナノワイヤセンサの応答の概略図を示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とメルカプトエタノールの混合自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）の概略図を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
図１Ａ−１Ｂは、テストカード２００と共に使用するのに適したポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）分析器１００の一実施例を示している。ＰＯＣ分析器１００は、カード差し込み口１１２、ディスプレイ１１４、及び制御手段１１６を具えている。カード差し込み口１１２は、テストカード２００を受けるように構成されている。ディスプレイ１１４は、ＰＯＣ分析器１００の状態と検査結果を示すものである。制御手段１１６は、ＰＯＣ分析器１００の電源を入れたり切ったり、検査を開始したり終了したり、及びディスプレイ１１４を変更したりする。
【０００９】
ＰＯＣ分析器１００は、テストカード２００を加圧するための、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、又はその他の適切なポンプなどの加圧器具を具えている。ＰＯＣ分析器１００はまた、テストカード２００上の対応する電気接点と結合するように構成された電気接点を具えている。
【００１０】
テストカード２００は、サンプルを受けとり、次いでＰＯＣ分析器１００を用いてサンプル中の特定の物質を定量化又はカウントするように設計されている。サンプルは、全血、血漿、血清、細針吸引物、骨髄サンプル、髄液、嚢胞液、関節液若しくは髄液、子宮内膜吸引サンプル、胃サンプル、眼液、卵巣液、組織培養媒体、尿素、又はその他の生体サンプル又は非生体サンプルでもよい。
【００１１】
一の実施例では、テストカード２００は、全血サンプルを受けて、サンプル中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）のおおよその数をカウントするように構成されている。同じ実施例又はその他の実施例では、テストカード２００を用いて、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ６４、又はＣＤ１５細胞表面マーカーのいずれかを欠くサンプル中の白血球のおおよその数のカウントすることができる。同じ実施例又はさらに別の実施例では、テストカード２００を用いて癌細胞の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）増幅、癌幹細胞のＣＤ１３３、又は抗原特異性のＴ細胞受容体といった特異的表面マーカーを有する細胞のおおよその数をカウントすることができる。
【００１２】
テストカード２００は、プラスチック、ガラス、又はその他の適切な材料で作られている。テストカード２００は、一又はそれ以上の層から構成されてもよい。エポキシ樹脂、熱接合、又はその他の適切な方法及び／又は材料を用いて、該層を互いに結合してもよい。テストカード２００は、約７０ｍｍ×５５ｍｍ×５ｍｍの寸法を有してもよい。テストカード２００は、バッファ電源が付いており、アクセスが容易になるように配置された電気接点を有していてもよい。
【００１３】
図２Ａ−２Ｂは、テストカード２００の一実施例の組み立て図と分解図を示している。テストカード２００は、全血サンプルを受けて、ＣＴＣｓのおおよその数を提供するのに適している。テストカード２００は、最上層２１０、粒子検出層２２０、第一分離層２３０、及び廃棄物回収層２６０を具える層の束で構成されている。これらの層の機能性は、製造及び経費検討に応じて、組み合わせても、より少ない層又はより多い層に分けてもよい。
【００１４】
第一分離層２３０は、サンプル入口２３１を具える。サンプル入口２３１は、約０．０１ｍｌから１０ｍｌの大量のサンプルを受けることができる。サンプル入口２３１は、目詰まりの可能性を最小限にする大きさである。サンプル入口２３１は、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、好ましくは５ｍｍの直径を有していてもよい。サンプル入口２３１は、最上層２１０と粒子検出層２２０を通って第一分離層２３０に到達している。
【００１５】
第一分離層２３０はまた、サンプル入口２３１と流体連通する第一分離チャンバ２３５を具えている。第一分離層２３０はまた、第一分離チャンバ２３５と流体連通する捕捉チャネル２３８を具える。
【００１６】
図３Ａは、第一分離チャンバ２３５の拡大図を示している。第一分離チャンバ２３５は、濾過表面２３６を具えている。濾過表面２３６は、適切なサイズの複数の孔２３７を具えている。全血中のＣＴＣｓを検出するために、孔２３７は、小型の白血球、赤血球、血小板、血漿、及びその他の血液成分は通過させるが、ＣＴＣｓと大型白血球は通過させないサイズ、又は約１μｍから３０μｍ、好ましくは約１６μｍの直径を有する。癌細胞の抗原、核酸、抗体、免疫グロブリン、その他のバイオマーカー、及び微生物の検出といった他の適用に、孔２３７は、約１μｍの直径を有していてもよい。濾過表面２３６は、多孔率が５０％を超えてもよい。多孔率とは、濾過表面２３６の孔２３７で構成される部分又はパーセンテージのことを言う。図３Ｂは、孔２３７の拡大図を示している。孔２３７は、六角形、矩形、その他の適切な形状で配置することができる。孔２３７は、円形、六角形、又はその他の適切な形状でもよい。孔２３７は、均一のサイズ又はさまざまなサイズであってもよい。濾過表面２３６は、約縦６ｍｍ×幅６ｍｍで、約１００，０００の孔を具えている。
【００１７】
サンプル入口２３１は、濾過表面２３６上方に位置している。サンプル入口２３１は、上記濾過表面２３６から第一分離チャンバ２３５に全血サンプルを誘導し、濾過表面２３６に対して実質的に垂直方向にサンプルが流れるようにしている。これが流速を増加させ、試験時間を減少させる効果をもたらしている。
【００１８】
第一分離層２３０はまた、第一分離チャンバ２３５と流体連通するバッファ入口２３２を具える。バッファ入口２３２は、最上層２１０と粒子検出層２２０を貫通して第一分離層２３０に達している。バッファ入口２３２は、ＰＯＣ分析器１００中の加圧器に流体連通することができる。バッファ入口２３２は、濾過表面２３６に実質的に平行方向において第一分離チャンバ２３５にバッファを誘導して、濾過表面２３６を横切って、捕捉チャネル２３８に向かって「一掃する」動作を生じさせる。バッファ入口２３２は、まず、実質的に濾過表面２３６の全側部に広がっているバッファトラフ２３３にバッファを導入する。バッファトラフ２３３がバッファでいっぱいになると、バッファが濾過表面２３６にあふれ出る。バッファトラフ２３３は、濾過表面２３６とおおよそ同じレベルに位置する頂部を有する。代替として、バッファ入口２３２が、実質的に濾過表面２３６の全側面にバッファを広げるバッファ拡散器を具えていてもよい。バッファ入口２３２は、バッファを濾過表面２３６を超えて移動させて、バッファ入口２３２から捕捉チャネル２３８へバッファが流れるときに濾過表面２３６を一掃する。
【００１９】
濾過表面２３６は、第一分離層２３０の一部として形成してもよく、又別個に製造したあとに第一分離層２３０に結合するようにしてもよい。濾過表面２３６は、射出形成、マイクロリソグラフィー、光画像形成などのマイクロマシニング技術、ウェット及びドライエッチング、放射線「解凍」などの放射線ベースの処理、及びレーザー切断により製造することができる。「ウェットエッチング」とは、一般に液体成分に接触させてエッチングすることをいう。「ドライエッチング」とは、一般にガス又はプラズマに接触させてエッチングすることをいう。レーザー切断では、レーザー光の各パルスが、高分子材料のごく一部を取り除く。シンクトロンは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）のようなアクリル樹脂材料でできた高分子骨格を非結合又は「解凍」させるために用いることができる指向性の高いＸ線照射を行う。この概念を用いて、所望のパターンを規定する吸収及び送出セクションを有するＸ線マスクにより定義される高分子膜の露出部分を、電離放射線によって「解凍」し、続いて溶媒浴よって発現させることができる。
【００２０】
ＣＴＣｓの計算に関して、体積あたりのＣＴＣｓの数が非常に少ないため、感度はサンプルの体積に対応する。テストカード２００は、最大１０ｍｌ又はそれより多い体積の血液サンプルを濾過することができる。このサンプルサイズは、通常、マイクロ流体装置にみられるサンプルサイズより１０倍大きくてもよい。この結果、この大きいサンプルサイズが１０倍より大きい感度をもたらす。
【００２１】
図４Ａ−４Ｂは、捕捉チャネル２３８の一実施例の斜視図と断面図を示している。捕捉チャネル２３８は、サンプル中の特異的にターゲットされた成分に選択的に結合する結合剤で処理された壁を具える。一実施例では、捕捉チャネル２３８は、白血球細胞に結合するＣＤ４５抗体で処理された壁を具える。他の実施例では、捕捉チャネル２３８は、不要成分に選択的に結合できる抗体、アプタマー、ペプチド、及び／又は小型分子で処理された壁を具える。捕捉チャネル２３８は、白血球細胞又はその他の血液成分２３９が壁に結合するときに、詰まらないように充分な幅を有する。捕捉チャネル２３８は、約２０μｍから１０００μｍまでの幅を有し、約４００μｍが好ましい。捕捉チャネル２３８はまた、白血球細胞又はその他の血液成分の捕捉を強化するのに充分な長さを有する。捕捉チャネル２３８の、総経路長は、約０．１ｃｍから１０ｃｍであり、約５ｃｍが好ましい。捕捉チャネル２３８は、白血球細胞又はその他の血液成分の捕捉を強化する蛇行経路を描いている。一実施例では、捕捉チャネル２３８は、白血球細胞又はその他の血液成分を壁に接触させる、約９０度のターンをいくつか有する螺旋状の経路を描いている。これらのターンはまた、粒子が直進経路の流れから壁に衝突し他の粒子と衝突するときに乱流を作り、壁への接触する頻度上げる。捕捉チャネル２３８は、正方形、矩形、三角形、又はその他の適当な断面形状をとることができる。
【００２２】
粒子検出層２２０は、捕捉チャネル２３８と流体連通する粒子検出器３００を具える。粒子検出器３００は、特定の物資の量を定量化又はサンプル中の細胞の数をカウントすることができる。粒子検出器３００は、寒天ベースの塩橋インピーダンスセンサ、ＤＡＤＭＡＣ塩橋インピーダンスセンサ、又はその他の適切なセンサでもよい。
【００２３】
図５Ａ−５Ｂは、粒子検出器３００の一実施例の拡大図を示している。粒子検出器３００は、塩橋インピーダンスセンサ、具体的には寒天ベースの塩橋インピーダンスセンサである。粒子検出器３００は、捕捉チャネル２３８からサンプルを受けとり、それを主フローチャネル３０２に向けるセンサ入口３０１を具えている。主フローチャネル３０２は、約０．０５ｍｍから０．５ｍｍの幅を有し、約０．１ｍｍが好ましい。粒子検出器３００はまた、バッファ槽３０３と、主フローチャネル３０２の両側にバッファを導入するバッファ導入チャネル３０４と３０５を具えている。バッファ導入チャネル３０４と３０５は、流体力学的に、主フローチャネル３０２の中央にサンプルを集中させる。これは、サンプル中の細胞又は粒子を実質的に一列に並べるものである。代替として、単一のバッファ導入チャネルを用いて、主フローチャネル３０２の片側に、流体力学的にサンプルを集中させることができる。
【００２４】
粒子検出器３００はまた、寒天を含有し、連結チャネル３１３と３１４を介して主フローチャネル３０２に連結されている塩橋チャンバ３１１と３１２を具えている。連結チャネル３１３と３１４は、約０．００１ｍｍから０．０５ｍｍの幅と約０．０１ｍｍから０．２ｍｍの長さを有し、約０．０１ｍｍの幅と０．１ｍｍの長さが好ましい。電解質入口３１５と３１６は、電解質を含有し、塩橋チャンバ３１１と３１２と流体連通いている。電解質入口３１５と３１６は、電極３２５と３２６に接続されている。電極３２５と３２６は、最上層２１０を通って、ＰＯＣ分析器１００に電気的に接続されていてもよい。電極３２５と３２６は、Ａｇ／ＡｇＣｌその他の適切な材料で作ることができる。主フローチャネル３０２と流体連通する回収チャンバ３１９が、最後にサンプルを回収する。
【００２５】
粒子検出器３００は、塩橋チャンバ３１１と３１２の製造を促進する寒天入口３１７と３１８を具えている。塩橋チャンバ３１１と３１２は、寒天入口３１７と３１８を約２−１０％の寒天と１ＭのＫＣｌ（重量×体積）の混合物で充填することによって製造される。寒天が完全に溶解するまで、この寒天混合物は加熱される。寒天混合物は、準備が整うと透明になり、準備が整ったらすぐに寒天入口３１７と３１８に導入される。寒天混合物は、毛細管力又は陽圧により寒天入口３１７と３１８に導入される。最初に寒天入口３１７と３１８及び塩橋チャンバ３１１と３１２を寒天混合物で充填する。連結チャネル３１３と３１４は狭く、大きな流れ抵抗が寒天混合物が主フローチャネル３０２に流れ込むのを阻む。使用される量が少ないので、連結チャネル３１３と３１４のサイズによって、チャネル内に寒天又は別のポリマーをより一貫して充填できる。これにより、より大きな連結チャネルであればそうなるように、より多くのポリマーが充填されると特異的に重合化された塩橋を持ちにくくなる。これは、再現性がより高い検査結果をもたらす。一旦塩橋チャンバ３１１と３１２が寒天混合物で充填されると、流れを止めることができる。粒子検出器３００は、寒天混合物が冷えて、固化するまで室温で保管してもよい。粒子検出器３００は、１ＭのＫＣｌ溶液を電解質入口３１５と３１６に導入した後の時点で使用することができる。寒天ベースの塩橋センサの製造は、フォトリソグラフィを必要としない。寒天ベースの塩橋センサは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のような軟質材料を含む広い範囲の材料と互換性がある。寒天ベースの塩橋センサの製造は、光開始剤としてのＵＶや架橋剤を必要としない。
【００２６】
図５Ｃは、粒子検出器３００の別の実施例の拡大図を示している。検出器３００は、塩橋インピーダンスセンサ、特にジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＡＤＭＡＣ）塩橋センサである。粒子検出器３００は、捕捉チャネル２３８からサンプルを受けとり、主フローチャネル３０２にそれを向けるセンサ入口３０１を具える。主フローチャネル３０２は、幅が約０．０５ｍｍから０．５ｍｍであり、約０．１ｍｍが好ましい。粒子検出器３００はまた、バッファ槽３０３と主フローチャネル３０２の両側にバッファを導入するバッファ導入チャネル３０４と３０５を具える。バッファ導入チャネル３０４と３０５は、流体力学的に、主フローチャネル３０２の中央にサンプルを集中させる。これは、サンプル中の細胞を実質的に一列に並べるものである。代替として、単一のバッファ導入チャネルを用いて、主フローチャネル３０２の片側に、流体力学的にサンプルを集中させることができる。
【００２７】
粒子検出器３００はまた、ＤＡＤＭＡＣを含んでおり、主フローチャネル３０２と流体連通する、塩橋チャンバ３２１と３２２を具える。電解質入口３１５と３１６は、電解質を含み、塩橋チャンバ３１１と３１２と流体連通している。電解質入口３１５と３１６は、電極３２５と３２６に連結している。電極３２５と３２６は、最上層２１０を通って、ＰＯＣ分析器１００に電気的に接続されている。電極３２５と３２６は、Ａｇ／ＡｇＣｌ又はその他の適切な材料で作られている。主フローチャネル３０２と流体連通している回収チャンバ３１９は、最後にサンプルを回収する。
【００２８】
粒子検出器３００は、一般的なソフトリソグラフィー工程で製造することができる。ＳＵ−８又はシリコンベースの鋳型を、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いたフォトリソグラフィーにより製造する。粒子検出器３００は、光開始剤及びモノマーのプレポリマーの混合物で塩橋チャンバ３２１と３２２を充填し、ＵＶでそれを露出することにより製造される。プレポリマー混合物は、６５％のジアリルジメチルアンモニウムクロリド水溶液、２％の２−ｄｙｄｒｏｘｙ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（光開始剤）、及び２％のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（架橋剤）で構成されている。重合後、残りのプレポリマー混合物を、バッファ溶液（１Ｍ ＫＣｌ）で洗い流す。電気的測定用に、ＫＣｌ溶液を塩橋チャンバ３２１と３２２に連結されている電解質入口３１５と３１６に充填し、ＫＣｌ溶液の中の電極３２５と３２６の間に直流バイアスを印加することにより、陰イオン、この場合はＣｌイオンを塩橋チャンバ３２１と３２２を通過させる。これが塩橋チャンバ３２１と３２２の間の電流を駆動し、塩橋チャンバ３２１と３２２の間にあって電極３２５と３２６にかかるインピーダンスを変化させる主フローチャネル３０２を細胞が通過するときに、塩橋チャンバ３２１と３２２の間のインピーダンスがモニタされる。励起シグナルは、約０．０１Ｖから１０Ｖの交流又は直流の電圧をもっており、交流が使用されるときは５０Ｈｚから１０ｋＨｚの周波数を有する。
【００２９】
図６Ａ−６Ｂは、テストカード２００の別の実施例の組み立て図と分解図を示す。テストカード２００は、最上層２１０、結合層２２５、及び廃棄物層２６０を具える。結合層２２５は、粒子検出層２２０と第一分離層２３０に見られる要素を結合層２２５に結合させている。結合層２２５は、第一分離チャンバ２３５、捕捉チャンバ２３８、及び粒子検出器３００を具える。サンプル入口２３１によって、サンプルが第一分離チャンバ２３５に導入される。バッファ入口２３２によって、第一分離チャンバ２３５だけでなく、主フローチャネル３０２にもサンプルを導入することができる。
【実施例１】
【００３０】
［循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）］
テストカード２００は、全血中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）を検出に用いることができる。血漿、血小板、赤血球、白血球、及びＣＴＣｓを含む全血のサンプルは、抗凝血剤を用いて採取され、サンプル入口２３１に投入する。次いで、テストカード２００を、ＰＯＣ分析器１００に挿入する。サンプルが、第一分離チャンバ２３５に達して、サンプル入口２３１を経由して濾過表面２３６に実質上垂直に導入される。血漿、血小板、赤血球、及び小型の白血球は、孔２３７を通って廃棄物チャンバ２６０に入る。孔２３７は、直径約１４−１８μｍ、好ましくは約１６μｍである。大型の白血球とＣＴＣｓは、大き過ぎて孔２３７を通過できず、第一分離チャンバ２３５内にとどまる。ＰＯＣ分析器１００は、１−３分間サンプル入口２３１に約０−５０ｐｓｉの圧力を加えて、濾過工程を容易にすることができる。
【００３１】
バッファは、濾過表面２３６に実質的に平行な方向に、第一分離チャンバ２３５に導入される。サンプル入口２３１を閉じて、バッファの逆流を防止することができる。バッファはバッファ入口２３２から濾過表面２３６に実質的に平行に入り、濾過表面２３６を横切って捕捉チャネル２３８に向う「一掃する」動きを作り出す。第一分離チャンバ２３５入口地点でのバッファ入口２３２の高さを低くする一方で、バッファはバッファ入口２３２から流入し捕捉チャネル２３８に向かって移動するので、バッファ入口の長さを拡げてバッファを分散させて濾過表面２３６を完全に一掃できるようにする。正常な細胞の機能と容量を維持するために、キログラムあたり約２７５−２９９ミリ−オスモルのオスモル濃度を有するリン酸緩衝食塩水又はその他のｐＨ緩衝バッファを用いることができる。これは、濾過表面２３６上の白血球とＣＴＣｓ、特に孔２３７中に部分的に「詰まった」又は配置された白血球とＣＴＣｓを、捕捉チャネル２３８に「一掃する」又は取り除く効果がある。さらに、ＰＯＣ分析器１００は、一掃する工程を容易にするためにバッファ入口２３２に圧力を加えることができる。
【００３２】
バッファは、濾過されずに残留した白血球とＣＴＣｓを捕捉チャネル２３８を通って運ぶ。捕捉チャネル２３８の蛇行経路は、白血球が捕捉チャネル２３８の壁に接触し、白血球と特異的に結合するＣＤ４５抗体又はその他の捕捉剤で処理されている壁に結合する可能性を高める。ＣＴＣｓは、壁に結合せず、捕捉チャネル２３８を通過する。
【００３３】
バッファは、ＣＴＣｓを粒子検出器３００に運ぶ。ＣＴＣｓは、センサ入口３０１を通って主フローチャネル３０２に入る。バッファ槽３０３から追加のバッファが、バッファ導入チャネル３０４と３０５を通って主フローチャネル３０２に導入されており、ＣＴＣｓを流体力学的に主フローチャネル３０２の中央に集中させる。流体力学的に集中したＣＴＣｓは、連結チャネル３１３と３１４の間を通過し、カウントされる。電極３２５と３２６に約５ｍＶから５００ｍＶの電圧が印加され、インピーダンスをＰＯＣ分析器１００により測定する。
【００３４】
ＣＴＣｓは、回収チャンバ３１９内にたまり、必要に応じてさらなる分析のためにテストカード２００から取り出される。
【実施例２】
【００３５】
［移植組織適合検査］
移植に先立ち、ドナーとレシピエントの候補者の組織の適合性を検査する組織検査に、テストカード２００を用いることができる。胚、移植胚は、病気の兄弟のための臍帯血の幹細胞のドナーに確実になり得るタイプの組織である。
【００３６】
この適用は、直径約５μｍの孔２３７を有する濾過表面２３６を使用する。サンプルからの少量の白血球は、第一分離チャンバ２３５に残り、既知の抗−ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）抗体で特別に処理された壁を有する捕捉チャネル２３８に移動する。抗体が主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）上のエピトープを認識すると、白血球が捕捉チャネル２３８の壁に結合するので、粒子検出器３００によってカウントされない。これにより、捕捉チャネル２３８に存在する既知の抗体の特異性に基づく、間接的な細胞のＭＨＣの同定が可能となる。
【実施例３】
【００３７】
［疾病関連性のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合検査］
ヒトのある病状に関連して有用であるＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃの検出に、テストカード２００を用いることができる。
【００３８】
この適用は、直径約５μｍの孔２３７を有する濾過表面２３６を使用する。サンプル中の白血球は、第一分離チャンバ２３５内に残り、特定の抗−ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）抗体で処理された壁を有する捕捉チャネル２３８に移動する。抗体が白血球上のＨＬＡ抗原を認識すると、白血球は捕捉チャネル２３８の壁に結合し、粒子検出器３００によって測定されない。これにより、捕捉チャネル２３８に存在する既知の抗体の特異性に基づく、間接的な細胞のＨＬＡの同定が可能となる。
【実施例４】
【００３９】
［後天性造血幹細胞疾患］
血液細胞がある細胞表面マーカーが欠如しており、溶血と呼ばれる工程により体の一部又は全部の赤血球（ＲＢＣｓ）が破壊される後天性造血幹細胞疾患である、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）の同定に、テストカード２００を用いることができる。、表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ６４、及びＣＤ１５が結合していない血液細胞を検出するためにテストカード２００を用いることができる。
【００４０】
この適用は、直径約５μｍの孔２３７を有する濾過表面２３６を使用する。捕捉チャネル２３８は、ＣＤ４５、ＣＤ１４、及び／又はＣＤ３３抗体で処理された壁を有する。ＰＮＨに感染した白血球は壁に結合せず、捕捉チャネル２３８を通過して粒子検出器３００でカウントされる。
【００４１】
図７Ａ−７Ｂは、テストカード２００の別の実施例の組み立て図と分解図を示す。テストカード２００は、最上層２１０、第一分離層２３０、第二分離層２４０、ナノワイヤセンサ層２５０、及び廃棄物回収層２６０を具える。
【００４２】
図８Ａ−８Ｂは、第二分離層２４０の拡大図を示す。第二分離層２４０は、孔２３７を通って第一分離チャンバ２３５と流体連通する第二分離チャンバ２４５を具える。第二分離チャンバ２４５は、血漿、赤血球、血小板、及びその他の孔２３７のサイズより小さい血液成分を回収する。第二分離チャンバ２４５は、内壁２４１と外壁２４２を有する。 内壁２４１は、幅約４００μｍのオープンスペースを有し、第二分離チャンバ２４５から第二分離チャンバ２４５の内壁２４１と外壁２４２の間のチャネル２４８へ粒子を移動させる。チャネル２４８の壁は、第二分離チャンバ２４５内に回収した粒子に特異的に結合する捕捉剤で処理してもよい。サンプルは、ナノワイヤセンサ３５０に到達する前に、第二分離層２４０の上部と底部に沿って走るチャネル２４９を通過する。
【００４３】
ナノワイヤセンサ層２５０は、ナノワイヤセンサ３５０を具える。ナノワイヤセンサ３５０は、血漿又はその他のサンプル中の特定の物質の量の定量化できる。
【００４４】
図９Ａは、ナノワイヤセンサ３５０の一実施例の拡大図を示す。ナノワイヤセンサ３５０は、シリコンナノワイヤの電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）である。ナノワイヤセンサ３５０は、ベース３５２を具える。ナノワイヤセンサ３５０は、ソース電極３５３とドレイン電極３５４を具え、両者はベース３５２上に配置されている。ソース電極３５３とドレイン電極３５４は、絶縁層で覆われている。ナノワイヤセンサ３５０は、ソース電極３５３とドレイン電極３５４に接続されたナノワイヤ３５５を具える。ナノワイヤ３５５は、半導体であり、ケイ素、ゲルマニウム、インジウムヒ素、酸化亜鉛、シリコンゲルマニウム、又はその他の適切な材料でつくることができる。ナノワイヤ３５５は、約１ｎｍから５００ｎｍの厚さを有し、約２０ｎｍが好ましい。ナノワイヤ３５５は、約１０１６／ｃｍ３から１０２０／ｃｍ３にドープされており、１０１８／ｃｍ３が好ましい。ナノワイヤセンサ３５０はまた、ベース３５２上に配置されている制御電極３５６を具える。
【００４５】
ナノワイヤセンサ３５０も、制御電極３５６を具える。制御電極３５６は、ナノワイヤ３５５から約０．０１ｍｍから１ｍｍのところに位置しており、約０．１ｍｍが好ましい。一実施例では、制御電極３５６は金で作られているが、銀、銅、亜鉛、カドミウム、鉄、ニッケル、コバルト、又はその他の適切な材料で作ってもよい。一実施例では、制御電極３５６は、例えばアミン、カルボン酸、アルデヒド、又はチオール結合を介して制御電極３５６に結合するターゲット分子に特異的なペプチド核酸（ＰＮＡ）で機能化されている。ターゲット分子は、例えば事前に選択されたヌクレオチド配列を含んだ核酸分子でもよい。ＰＮＡは、例えばアミノ酸リンカー、又はモノマーあるいは例えば８−アミノ−３，６，−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ酸などのマルチマー、又制御電極３５６に結合するとＰＮＡに適応性を提供するその他の適切なスペーサの、スペーサ単位を具える。シグナルの変化は、ゲートとのＦＥＴの応答を測定することにより検出することができる。制御電極３５６に印加される電圧、コレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）は、ＦＥＴのゲート入力を提供する。ターゲット分子が、制御電極３５６に結合すると、制御電極３５６とナノワイヤ３５５の間の電気容量が変化し、同じコレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）に対するゲート応答が異なることになる。制御電極３５６は、例えば５μｍ×５μｍから５００μｍ×５００μｍと大きくてよく、制御電極３５６に結合するターゲット分子の数を増やして、これによって検出感度を上げるには約５０μｍ×５０μｍ（長さ×幅）の大きさが好ましい。制御電極３５６は、例えば約１０ｎｍから２００ｎｍの適切な厚さを有する。制御電極３５６の大きなサイズとナノワイヤ３５５ではなく、制御電極３５６の機能化がナノワイヤセンサ３５０の感度と特異性の増大に寄与する。
【００４６】
ナノワイヤ３５５と制御電極３５６は、互いに流体連通している。一実施例において、ナノワイヤ３５５と制御電極３５６はマイクロ流体チャネル３５７内に配置されている。代替として、ナノワイヤ３５５と制御電極３５６を、サンプルが固定又は撹拌されるサンプルチャンバに配置してもよい。制御電極３５６は、実質的にマイクロ流体チャネル３５７と同じか、又はその他の適切なサイズ又は幅である。
【００４７】
制御電極３５６は、多くの癌抗原のうちのいずれかで機能化できる。タンパク質５３（ｐ５３）核酸（腫瘍抑制）又はヒト表皮成長因子受容体２又はＨＥＲ２／ｎｅｕ核酸、又はその他に相補的なペプチド核酸（ＰＮＡ）で、制御電極３５６は機能化される。ＣＡ２７．２９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１５−３、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、又はその他の癌抗原に対する抗体で、制御電極３５６は機能化してもよい。
【００４８】
制御電極３５６を機能化して、多くのタンパク質バイオマーカーのうちのいずれかを検出することができる。Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）に対する抗体、心臓病や脳卒中の危険因子、鬱血性心不全（ＣＨＦ）を診断するためのＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の抗体、急性心筋梗塞や骨格筋損傷の検査をするクレアチニンキナーゼの抗体、栄養状態又は肝機能を検査するトランスフェリンに対する抗体、心臓病と脳卒中の危険がある患者を選別するホモシステインの抗体、糖尿病検査用グルコースのような小型血液分子に対する抗体、又は急性感染症の存在を検査するＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡＧ）の抗体で、制御電極３５６を機能化することができる。
【００４９】
制御電極３５６を多くの抗体のうちのいずれかで機能化して、ある種のタイプの癌、疾患、感染症、又は免疫状態を検出する免疫グロブリンと抗体を検出することができる。特異的免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）の抗体で、制御電極３５６は機能化して骨肉腫、ワルデンシュトレームのマクログロブリン血症を診断し、単クローン性免疫グロブリン血症とアミロイド症を評価することができる。制御電極３５６は、臨床的回復の及びその後のＢ型肝炎ウイルスに対する免疫の指標として使用される抗Ｂ型肝炎ウイルスの抗体、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）に関係する抗体を検出する抗２本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）の抗体、又はアトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び免疫欠損を診断するアレルゲン特異的な免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の抗体で機能化することができる。
【００５０】
制御電極３５６は、様々な感染症の検出に用いられる多くの相補的ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）のうちいずれかで機能化できる。制御電極３５６は、ＨＳＶ核酸、Ｃ型肝炎核酸、ＨＩＶ−１核酸、ニューモシスティス・カリニ肺炎（ＰＣＰ）核酸、バクテリア核酸、ラジオネラ・ニューモフィラ核酸、又は連鎖球菌Ｂ核酸に相補的なＰＮＡで機能化することができる。
【００５１】
上記の例は、サンプルとして全血を用いているが、尿素などの他のサンプルもテストカード２００に使用できる。例えば、制御電極３５６をアルブミンの抗体で機能化して糖尿病の初期兆候である尿素中のアルブミンを検出できる。
【００５２】
テストカード２００は、その他のナノスケールの器具と比較して検出感度と特異性を強化するように設計されている。テストカード２００は、サンプル中の成分をサイズによって、又電荷によって分離するマイクロ流体デバイスと、分子の生化学的及び物理的特性に基づいてターゲット生体分子を検出するナノワイヤセンサ３５０を具える。サンプル中の１又はそれ以上の生体分子の有無を検出する方法や、被験者のサンプル中の生体分子の存在に基づいて被験者の病状を診断する方法も記載されている。ここに記載されている方法は、核酸のピコモル及びフェムトモル量を検出するため、及びサンプル中の生体分子を検出するために、感度を改良するよう設計されている。
【００５３】
テストカード２００は、マイクロ流体デバイスとナノワイヤセンサ３５０を具える。マイクロ流体デバイスは、少なくともサイズ、構造及び電荷のうちの１又はそれ以上に基づきサンプル中の分子を分離するサイズ排除メカニズムを具える。ナノワイヤセンサ３５０は、ベース３５２と、所定の電流−電圧特性を有し生物学的センサとしての使用に適するゲートナノワイヤ電界効果トランジスタ（ＮＷ−ＦＥＴ）を具える。ナノワイヤセンサ３５０はまた、入口を有するマイクロ流体チャネル３５７を具える。ナノワイヤセンサ３５０は、ソース電極３５３、ドレイン電極３５４、ソース電極３５３とドレイン電極３５４間に接続、配置されたナノワイヤ３５５、及び所定の電流−電圧特性を有するＦＥＴを形成するターゲット分子に特異的な結合部位で機能化された制御電極３５６を具える。ＮＷ−ＦＥＴは、ベース３５２上に配置され、ベース３５２とマイクロ流体チャネル３５７間にある。制御電極３５６上のターゲット分子と結合部位間に生じる結合事象は、ＮＷ−ＦＥＴの電流−電圧特性に検出可能な変化を生じさせる。好ましい実施例では、ナノワイヤ３５５は、シリコンベースのナノワイヤであるが、ゲルマニウム、インジウムヒ素、酸化亜鉛、及びシリコンゲルマニウム、又はその他の半導体材料でもよい。制御電極３５６は、金、銀、銅、亜鉛、カドミウム、鉄、ニッケル、コバルト、又はその他の適切な元素又は化合物といった金属制御電極であってもよい。好ましい制御電極３５６は金である。この結合部位は例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、アプタマー、ペプチド、又はその他の物質など、アミン、カルボン酸、アルデヒド、又はチオール結合などを介して制御電極３５６に付着させたターゲット分子に特異的な結合部位である（図９Ｃ参照）。ターゲット分子は、例えば予め選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子であってもよい。ＰＮＡは、例えばアミノ酸リンカー、又はモノマーあるいは例えば８−アミノ−３，６，−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ酸などのマルチマー、又は制御電極３５６に結合するとＰＮＡに適応性を提供するその他の適切なスペーサの、スペーサ単位を具える。シグナルの変化は、ゲートとのＮＷ−ＦＥＴの応答を測定することにより検出することができる。制御電極３５６に印加される電圧、コレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）は、ＮＷ−ＦＥＴのゲート入力を提供する。ターゲット分子が、制御電極３５６に結合すると、制御電極３５６とナノワイヤ３５５の間の電気容量が変化し、同じコレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）に対するゲート応答が異なることになる。制御電極３５６は、例えば５μｍ×５μｍから５００μｍ×５００μｍと大きくてよく、制御電極３５６に結合するターゲット分子の数を増やして、これによって検出感度を上げるには約５０μｍ×５０μｍ（長さ×幅）の大きさが好ましい。制御電極３５６は、例えば約１０μｍから２００μｍの適切な厚さを有する。制御電極３５６の大きなサイズとナノワイヤ３５５ではなく制御電極３５６の機能化が、ナノワイヤセンサ３５０の感度と特異性の増大に寄与する。
【００５４】
本発明の別の実施例は、サンプルをナノワイヤセンサ３５０に塗布し、ナノワイヤセンサ３５０のシグナル変化を検出することにより、サンプル、特に生体サンプル中のターゲット核酸分子の有無を検出する方法であり、ここでシグナル変化はサンプル中のターゲット分子がナノワイヤセンサ３５０内の制御電極３５６上の結合部位に結合することにより誘発される。サンプルは、血液又は血漿サンプルのような生体サンプルでもよい。ターゲット分子は、例えば腫瘍の存在の特徴を示す腫瘍由来のＤＮＡ配列など予め選択された配列を含むＤＮＡ分子が好ましい。腫瘍由来のＤＮＡは、腫瘍の存在の診断および予後指標、腫瘍の進行及び予測の指標、又は治療に対する反応として機能するマーカー又は潜在的なマーカーとなりうる。このＤＮＡは、例えば変異Ｋ−ｒａｓであり、腫瘍は、膵臓癌特に膵臓腺癌である。
【００５５】
この方法はまた、生体サンプル中のターゲットＤＮＡの濃度と癌の状態の相関関係を確立するのに有用である。この方法はまた、ターゲットＤＮＡの由来である腫瘍の早期検出用又は腫瘍の進行分析用のスクリーニング方法として用いることができる。例えばこの方法を用いて、被験者からのサンプル中の追加の変異Ｋ−ｒａｓの存在について膵臓病変を有する被験者からのサンプルを分析することによって、又は臨床的に有意なＫ−ｒａｓＤＮＡレベルを超える変異Ｋ−ｒａｓＤＮＡの上昇レベルの存在について被験者からのサンプルを分析することによって、非癌性膵臓病変から癌性膵臓病変への変化を検出することができる。被験者のサンプル中の追加の変異Ｋ−ｒａｓＤＮＡの存在又は変異Ｋ−ｒａｓＤＮＡの上昇は、膵臓病変が癌性である又はこれから癌性になることの指標となる。さらにこの方法は、治療に対する反応の予測又は特定の療法で最も適切に治療されるであろう患者を選択するのに有用である。例えば、２００８年に米国臨床腫瘍学会及び欧州臨床腫瘍学会で発表されたように、転移性結腸大腸癌におけるＫ−ｒａｓ突然変異の存在は、一般にセツキシマブ（エルビタックス、イムクローン社）及びパニツムマブ（ベクチビクス、アムジェン社）などの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）キナーゼに対する抗体への低い反応が関係している。
【００５６】
本発明のさらなる実施例は、組織サンプルから分離されたゲノムＤＮＡ中で予め選択されたＤＮＡ配列を検出する方法である。ゲノムＤＮＡサンプルは、ナノワイヤセンサ３５０内の制御電極３５６に接触し、ここで制御電極３５６は予め選択されたＤＮＡに特異的な結合部位で機能化されており、電導度又は電流に変化が検出される。予め選択されたＤＮＡ配列は、例えばＢ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、又はサイトメガロウイルスなどのウイルスに特異的なＤＮＡ配列である。
【００５７】
電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）は、ゲート電極、ソース電極、及びドレイン電極を具える三電極装置である。ＦＥＴは、「Ａｒｔ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ」第二版、ポールホロウィッツ、ウィンフィールドヒル著、ケンブリッジ大学出版局、１９８９年、１１３−１７４頁により詳細に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。電荷担体の使用可能性は、ゲート電極としても知られる第三の「制御電極」に印加される電圧によって制御される。チャネル中の伝導は、チャネルを横切って電界を作り出すゲート電極に印加される電圧により制御される。
【００５８】
検知デバイスは、（ａ）ソース電極３５３とドレイン電極３５４間に接続され、配置されるナノワイヤ３５５と、（ｂ）ゲート電極又は制御電極３５６と、（ｃ）選択的に流体入口と出口を有するマイクロ流体チャネル３５７と、を具える。ソース電極３５３、ドレイン電極３５４、ナノワイヤ３５５、及び制御電極３５６がナノワイヤセンサ３５０を形成している。ナノワイヤ３５５と制御電極３５６は物理的に離れており、制御電極３５６はマイクロ流体チャネル３５７の流れの中にある。ナノワイヤセンサ３５０とマイクロ流体チャネル３５７は、支持ベース３５２上に配置されている。ナノワイヤセンサ３５０は、支持ベース３５２とマイクロ流体チャネル３５７間に位置する。制御電極３５６は、予め選択されたターゲット分子の結合部位で機能化される。制御電極３５６上の結合部位に結合しているターゲット分子は、ナノワイヤ３５５の担体配分を変える電界を生じさせるゲートで電圧を与える。ナノワイヤ３５５内の担体配分の変化は、ナノワイヤ３５５を通過する電流の流れに影響を与え、ナノワイヤ３５５は例えば電圧計付電流−電圧スキャンのような検出器により検出される。
【００５９】
測定は液相内で行われるため、ナノワイヤ３５５に接続されたソース電極３５３とドレイン電極３５４は、ソース電極３５３とドレイン電極３５４を絶縁材でコーティングすることにより、マイクロ流体チャネル３５７内のサンプルへの露出から保護される。例えば、窒化ケイ素、酸化ケイ素及びその他の適当な材料など色々な絶縁材を用いることができる。窒化ケイ素又は酸化ケイ素をプラズマ化学気相成長法（ＰＥＣＶＤ）によりソース電極３５３とドレイン電極３５４上に蒸着して、絶縁を提供できる。ＰＥＣＶＤを用いて窒化ケイ素又は酸化ケイ素を薄層蒸着させる条件は、さらに最適化することができる。
【００６０】
ナノワイヤセンサ３５０はまた、制御電極３５６の電気容量又はその特性の変化を測定する器具を具えることもできる。ナノワイヤセンサ３５０は簡単電子機器、好ましくはナノワイヤ３５５と、例えば電源、増幅器、及び電圧計などの電子部品に接続されたフォトリソグラフィーによって規定したミクロンサイズのソース電極３５３で操作される。マイクロ流体チャネル３５７中のサンプルを含む電解質を流れる寄生電流を最小にするために、ソース電極３５３とドレイン電極３５４は窒化ケイ素又は二酸化ケイ素のような絶縁材で分離されている。制御電極３５６はマイクロ流体チャネル３５７の流れの中にある。マイクロ流体チャネル３５７のサイズが小さいので、少量のサンプル（一般には１マイクロリットル未満）しか必要としない。サンプル溶液は、重力あるいはマイクロ流体チャネル３５７を通るポンピングにより一定流速でマイクロ流体チャネル３５７を流れる。サンプルは、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、又はその他の適切な器具により送圧される。サンプルはまた、圧縮空気又は窒素レギュレータを用いてマイクロ流体チャネル３５７を強制的に流れるようにしてもよい。サンプルは、およそ１から１００μｌ／分の割合で送圧される。
【００６１】
ここで使用される用語「ナノワイヤ」は、その全体が本明細書に組み込まれている米国特許第７，３８５，２６７号に記載されており、この特許は、ナノワイヤを、長さに沿った任意の点における細長いナノスケール半導体と定義しており、少なくとも一の断面の寸法を有し、いくつかの実施例においては、直交する二つの断面の寸法が５００ｎｍより小さく、好ましくは２００ｎｍより小さく、より好ましくは１５０ｎｍより小さく、さらにより好ましくは１００ｎｍより小さく、さらにより好ましくは７０ｎｍより小さく、さらにより好ましくは５０ｎｍより小さく、さらにより好ましくは２０ｎｍより小さく、さらにより好ましくは１０ｎｍより小さく、５ｎｍより小さくてもよい。別の実施例において、断面寸法は２ｎｍ又は１ｎｍより小さくてもよい。いくつかの実施例において、ナノワイヤの少なくとも一の断面の寸法は０．５ｎｍから２００ｎｍの範囲である。ナノワイヤがコア及び外側領域を有する場合には、上記寸法はコア領域に関する寸法である。細長い半導体の断面は任意の形状を有しており、円形、正方形、矩形、楕円、及び管状を含むがこれらに限定されるものではない。規則的な又は不規則的な形状も含まれる。本発明のナノワイヤを作ることのできる材料の非限定的なリストを以下に表記する。ナノチューブは、本発明で用いるクラスのナノワイヤであり、一実施例では、本発明の器具はナノチューブに見合ったスケールのワイヤを具える。ここで使用する「ナノチューブ」は、空洞のコアを有するナノワイヤであり、当業者に知られているナノチューブを含む。「非ナノチューブナノワイヤ」は、ナノチューブではないナノワイヤである。本発明のいくつかの実施例では、非改質表面（ナノワイヤが置かれている環境でナノチューブに本来備わっていない補助反応の実体は含まない）を有する非ナノチューブナノワイヤが、ナノワイヤ又はナノチューブを使用できるここに記載された本発明の構成において使用されている。「ワイヤ」とは、少なくとも半導体又は金属が有する導電性を持つ材料をいう。「導電性」ワイヤ又はナノワイヤに関連して用いられる「導電性の」、「導体」、又は「導電体」の用語は、それ自身を電荷が通過するワイヤの能力を意味する。導電性材料は、約１０−３より低い抵抗を有し、約１０−４より低い抵抗がより好ましく、約１０−６又は１０−７Ωｍより低い抵抗が最も好ましい。
【００６２】
ナノワイヤ３５５は、特に規定がない限り、カーボンナノチューブ、ナノロッド、ナノワイヤ、有機と無機の導電性又は半導体ポリマー、その他を含む。分子ワイヤではないが、様々なナノスケール寸法を有するその他の導電性又は半導体要素も、例えば主属及び金属原子ベースのワイヤ状シリコン、遷移金属含有ワイヤ、ガリウムヒ素、窒化ガリウム、リン化インジウム、ゲルマニウム、セレン化カドニウム構造、又はその他の適切な組成物などの、無機構造の場合に使用することができる。これらの多種多様なナノワイヤやその他のナノワイヤは、過度な実験をすることなしにナノワイヤを含むここに記載した技術に類似する方法で、電子デバイスに有用なパターンで表面上に成長させる及び／又は塗布することができる。ナノワイヤ３５５の長さは、少なくとも１μｍ、好ましくは少なくとも３μｍ、より好ましくは少なくとも５μｍ、さらに好ましくは１０又は２０μｍ、厚さ（高さと幅）は、約１００ｎｍより小さいことが好ましく、より好ましくは約７５ｎｍより小さく、より好ましいのは約５０ｎｍより小さく、さらに好ましいのは約２５ｎｍより小さい。ナノワイヤ３５５のアスペクト比（厚さに対する長さ）は、少なくとも約２：１であるべきで、好ましくは約１０：１より大きく、より好ましくは約１０００：１より大きい。
【００６３】
ナノワイヤ３５５は、シリコンナノワイヤ（ＳｉＮＷ）であるのが好ましく、シリコン非ナノチューブ（中実）ナノワイヤであるのが好ましい。しかし、任意の適切な材料を使うことができる。
【００６４】
ナノワイヤ３５５を製造する技術には、多くの方法が利用可能であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第７，３０１，１９９号及び米国特許第７，４１０，９０４号などを参照されたい。気相−液相−固相（ＶＬＳ）方によるバルク材料としてナノワイヤを成長させる「ボトムアップ」法のような方法が利用可能である。この方法は、高品質なナノワイヤを製造するが、長さと直径が均質なナノワイヤを製造することが困難である。また、所望のスポット上にナノワイヤを配置し、電極を具える、ナノワイヤセンサ３５０の他の部品と整列させることが困難であり、それがデバイス間の均一性の低下を引き起こす（ガオら著、「分析化学」、２００７年発行、７９号、３２９１−７頁）。使用できるその他の方法は、電子ビームリソグラフィー及びウエット／ドライエッチングに基づく「トップダウン」法である。ナノワイヤのサイズと配置がより制御しやすく、従って製造に関して高スループット及び自動化が可能であるため、後者の方法がより好ましい。
【００６５】
様々な実施例において、以下の例及び組み合わせを含む様々な方法を用いて制御電極３５６を製造している：インプリンティング、リソグラフィー、化学蒸着（ＣＶＤ）、エッチング、レーザー切断、アーク放電、及び／又は電気化学的方法。制御電極３５６は、５μｍ×５μｍから５００μｍ×５００μｍの範囲の大きさを有しており、約５０μｍ×５０μｍ（長さ×幅）、又はその他の適切な大きさが好ましい。制御電極３５６は、例えば約１０μｍから約２００μｍの適切な厚さを有する。
【００６６】
制御電極３５６を「機能性物質」でコーティングする工程を、ここでは「機能化」と呼び、コーティングされた制御電極を「機能化された」という。機能性物質は、例えばチオール基、例えばデオキシリボ核酸即ち「ＤＮＡ」、ペプチド核酸即ち「ＰＮＡ」、リボ核酸即ち「ＲＮＡ」などの核酸、アプタマー、ホルモン、炭水化物、タンパク質、抗体、抗原、分子受容体、及び／又は細胞表面結合部位といった対象となる化学的又は生化学的スピーシーズと結合していくつかの生化学的例を提供する。本発明では、結合部位を形成するために制御電極３５６に結合された機能性物質は、サンプル中のターゲット分子に特異的又は相補的である。例えば第一の電着した金でできた機能性物質は、チオール末端ＰＮＡ機能性物質であるか又はこれに結合しており、次に分析中のサンプル内の相補的ＤＮＡターゲット分子に結合する。制御電極３５６は、約０．１μｍから約１００μｍのＰＮＡ、好ましくは約１μｍから約１０μｍのＰＮＡに結合させることができる。
【００６７】
ＳｉＮＷと非金属制御電極３５６は、ｐ型又はｎ型のドーパントでドープすることができる。制御電極３５６の表面は、捕捉剤、例えばＫ−ｒａｓ突然変異ｓｓＤＮＡなど予め選択されたＤＮＡ配列に相補的な配列を含むＰＮＡで改質することができる。
【００６８】
ナノワイヤ３５５又は制御電極３５６は又はその両方をドープすることができる。スピン−オンドーパントに基づくドーピングとイオン注入の二の方法でナノワイヤ３５５及び／又は制御電極３５６をドープしてさらなる最適化を行うことができる。スピン−オンドーパント法は、基板をｐ型またはｎ型スピン−オンドーパント溶液でスピンコートし、高温で拡散工程を行う。最終ドーピングレベルは、熱工程の温度と時間によって決まる。イオン注入の場合は、ホウ素、リン、ヒ素のような高エネルギーイオンを、加速器内の様々なガス源からつくって、基板に向ける。イオンは、基板の表面近傍の領域に注入される。どちらの方法でも良い結果が与えることが報告されている（ガオら著、「分析化学」２００７年、７９号：３２９１−７頁及び「ナノ文学」、２００６年、６（６）：１０９６−１１００頁）。最適ドーピングレベルは、四点深針測定に基づいて選択することができる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、ロバートＦ．ピエレら著、「半導体デバイスの基礎」、Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ社、３章、８５−８９頁及びセクション３．１．４と佐藤ら著、「表面分析ジャーナル」、２００４年、１１（２）５８−６１を参照されたい）。約１０１８ホール又はドナーａｔｏｍｓ／ｃｍ３のドーピングレベルを、最適化の開始点として用いることができる。ドーピングレベルは、必要に応じて増やす又は減らすことができる。
【００６９】
合成ペプチド核酸オリゴマー（ＰＮＡｓ）は、色々なソースから商業的に入手することができる。本発明においては、ＰＮＡｓを制御電極３５６に結合させて結合部位を形成することができる。ＰＮＡｓは、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはｓｓＤＮＡといったサンプルのターゲット分子中の予め選択されたヌクレオチド配列に特異的／相補的である。本発明で用いられるＰＮＡｓは、サンプル中に存在するターゲットＤＮＡに特異的に結合するのに適した長さと配列、例えば約５から約７５、好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド、を有し、ターゲットＤＮＡ中の予め選択された配列に８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の相補性を有するのが好ましい。予め選択された配列と１００％の相補性を有するＰＮＡｓの配列が好ましい。ＰＮＡは配列番号：２、３、４、５、又は６の相補体又はいずれか一つ有する配列を具えることができる。ターゲットＤＮＡの予め選択された配列と制御電極３５６に付着したＰＮＡとの間の１塩基のミスマッチを検出するのに適した条件下で、ターゲットＤＮＡを制御電極３５６に付着させたＰＮＡとハイブリダイズするのが好ましい。この条件は、例えば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、のような低塩ハイブリダイゼーション条件又は同等の条件であることが好ましい。
【００７０】
複数のナノワイヤセンサ３５０を用いることができ、各センサはサンプル中の色々なターゲット分子を検出するよう設計されている。検知デバイスはまた、複数のＮＷ−ＦＥＴを具えており、各ＮＷ−ＦＥＴは色々なターゲット分子を検出するよう設計されている。例えば、本明細書に記載されているように検知デバイスは複数のＮＷ−ＦＥＴを具えており、各ＮＷ−ＦＥＴは配列番号：２−６のうちの一の配列を含むターゲット分子用の結合部位で機能化された制御電極３５６を含んでいる。
【００７１】
用語「サンプル」は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる米国特許第７，３８５，２６７号に記載されており、任意の細胞、細胞培養培地、組織、又は生体起源の流体（「生体サンプル」）、又はその他の媒体、例えば血漿、血清、又は水のように本発明に従って診断されうる生物学的又は非生物学的な媒体をいう。サンプルは、これに限定するものではないが、有機体由来の生体サンプル（例えば、ヒト、非ヒトほ乳類、無脊椎動物、植物、菌類、藻類、バクテリア、ウイルスなど）、ヒトが消費するために作られた食品由来のサンプル、家畜の餌などの動物が消費するために作られた食料由来のサンプル、ミルク、臓器提供サンプル、輸血用の血液サンプル、水道水サンプル、又は同様のものを含む。サンプルの一例は、特別な核酸配列の有無を判断するためにヒト又は動物から採取したサンプルである。
【００７２】
サンプルは、血液、血漿、又は血清サンプルが好ましく、膵臓腫瘍のような腫瘍を有する又は疑いのある被験者由来の血液、血漿、又は血清サンプルがより好ましい。サンプルは、均質化され、溶液中に入れた組織サンプルであってもよい。
【００７３】
ナノワイヤセンサ３５０は、以下のように製造することができる。
【００７４】
電極上のＰＮＡの固定化：固定化は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）により特徴付けられる。ＸＰＳは、化学物質だけでなく薄層の構造特性を評価するｅｘ−ｓｉｔｕ法である。ＨＳ−ｓｓＰＮＡ固定化の後、表面上で定量分析を行うこともできる。表面の被覆率の変化をモニタして、ＨＳ−ｓｓＰＮＡ単分子層と遮断剤（メルカプトエタノール）を含む混合自己組織化ＰＮＡ単分子層を監視することで見出される。フーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）分光法は、分子のフィンガープリント配向について追加の情報を提供する。これらの二つの方法に基づいて、表面の状態をＰＮＡ配向性だけでなく被覆率の観点から決定することができる。
【００７５】
絶縁層の形成：測定は溶液相で行われるので、金属電極は液体にさらされることから保護される。窒化シリコンと酸化シリコンは、この目的のための最も一般的な材料である。薄層蒸着は、例えばＰＥＣＶＤを用いたものが最適である。２層リフト−オフ法は、パターン化した絶縁層を形成するのに用いられる。下層は、スピンコートされ、フォトレジストが続いて行われる。同じ露出条件と現像条件では、下層は、フォトレジストよりも容易で速く発現する。浮遊フォトレジストパターンは、金属蒸着ステップの間はマスクとして機能し、金属蒸着の後は基板上に新しく形成された金属パターンの周りにスペースを提供する。薄層を異方的に形成し、続いてリフト−オフされるＰＥＣＶＤ工程の後、金属電極パターンは窒化シリコン又は酸化シリコンで覆われる。
【００７６】
ドーピング工程：少なくとも二の異なるドーピング法：スピンオンドーパント法とイオン注入法が適している。ドーピングの後、四点深針測定によりおよそのドーピングレベルを計算する。層のシート抵抗ｐｓを測定する。四本の深針は直線状に配置される。外側の二つの深針へ定電流を印加しながら内側の二つの深針で定電流を維持する電圧を測定する。電流値と電圧値の関係から、シート抵抗を計算する。ドーピングレベルは、抵抗率対ドーパント濃度曲線から計算する。ドーピングレベルの初期目標は、１０１８／ｃｍ３となる。目的のドーピングレベルは、バックゲート測定からＮＷ−ＦＥＴのゲート性能に基づいて調整する。
【００７７】
ナノワイヤＦＥＴデバイス：電子ビームリソグラフィーと様々なエッチング法を用いて、ナノワイヤをつくることができる。ナノワイヤを製造した後、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影してナノワイヤを特徴付ける。次いで金属電極を例えば、電子ビームリソグラフィー、フォトリソグラフィー、及びリフトオフ法によって規定する。ここでもパターンサイズと質を例えばＳＥＭを用いてモニタする。電気的性能は、電流−電圧測定及びバックゲート測定によりテストする。ドーピングレベルは、ゲート性能に基づいて変化する。
【００７８】
絶縁層：金属電極の全体被覆率を、例えばＳＥＭ画像により確認することができる。同様に電気的絶縁も例えば液体中の電流−電圧測定によりチェックすることができる。
【実施例５】
【００７９】
［ターゲット分子］
膵臓癌に関連する４つの重要なＫ−ｒａｓ点突然変異（以下＃１−４という）がある。追加の点突然変異（以下＃５という）は、膵臓癌中に生じる頻度が極端に低い。ターゲットオリゴヌクレオチドは、Ｋ−ｒａｓの核酸配列を少なくとも約２０−５０ヌクレオチド含み、４つの突然変異（＃１−４）の少なくとも１つを含んでいる。Ｋ−ｒａｓの核酸配列を少なくとも約２０−５０ヌクレオチド含み、＃５突然変異を含むターゲットヌクレオチドは、膵臓癌検出の特異性を高めるネガティブコントロールとして機能する。
【００８０】
以下に記載され、約２０−５０ヌクレオチドを含む各突然変異＃１−５に対する相補的ＰＮＡｓも合成される。すべての合成オリゴヌクレオチドは、市販されている。
【００８１】
【００８２】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）固定化戦略
ＰＮＡがＤＮＡを一塩基の感度で検出できること（ワングら著、「米国化学会誌」１９９６年、１１８（３３）、７６６７−７６７０頁）、及び金表面上の一本鎖ＰＮＡの秩序自己組織化単分子層（ＳＡＭｓ）が、相補的ｓｓＤＮＡの特異的認識を表していること（ブリオネスら著、「米国物理学会速報誌」２００４年、９３（２０）：２０８１０３）が示されている。ＰＮＡは、ＤＮＡに対して高い結合親和性を有するので、ここでは結合部位として使用されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるブリオネスら著、米国物理学会速報誌、９３、２０８１０３（２００４）に基本的に記載されているように、単分子層を形成するチオールベースの固定化を使用して、ＰＮＡは制御電極３５６の表面に固定化されている。単分子層を形成するための条件は、ＰＮＡ濃度、スペーサの長さ、及びＰＮＡ固定化の後に制御電極の表面を遮断するために用いられるチオール溶液に基づいて最適化される。
【００８３】
ＰＮＡ濃度は、例えば約０．１μｍから約１０μｍに適度にパックされた単分子層を形成するように最適化される。ＰＮＡ濃度が高すぎると金表面が完全に覆われるので、立体効果により結合効率が低下する。
【００８４】
スペーサ効果：ナノ表面上の結合の特徴は、バルク溶液内の特徴とは、非常に異なっている。結合に対するウォール効果を減少させ、ＰＮＡｓにさらなる適応性を与える８−アミノ−３，６，−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ酸のスペーサは、ＰＮＡに含まれており、８−アミノ−３，６，−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ酸の二量体及び三量体などマルチマーは、結合分析用のスペーサの長さを最適化するために使用される。
【００８５】
チオール溶液阻害効果：その後のＤＮＡハイブリダイゼーションを成功させるべくチオールＰＮＡを固定化した後、制御電極の金表面を遮断するために、メルカプトエタノール溶液を遮断剤として使用する。図９Ｃは、混合したＰＮＡのＳＡＭとメルカプトエタノールを示す略図である。
【００８６】
マイクロ流体デバイスの設計とプロセス
開始サンプルとサンプル処理
サンプルを、マイクロ流体デバイスに加えて、約１μｍのサイズの孔２３７により血漿を血液細胞と血小板から分離して、第二分離チャンバ２４５に入れる。
【００８７】
サンプルは、チャネル２４８の壁にシリコン又はガラスが結合しているチャネル２４８に流入するか、送圧される。充分に飽和したカオトロピック試薬（例えばヨウ化ナトリウムと塩化グアニジウム試薬）をサンプルと混合させて、ＤＮＡをガラス表面に結合させるために充分な時間と温度である、約５分間、２５℃でサンプルをチャネル２４８に接触させる。結合条件と時間は、さらに最適化することができる。カオトロピック塩の存在下でのガラスまたはシリカ表面へのＤＮＡの吸着は、フォーゲルとガレスピー（フォーゲルら著、「米国科学アカデミー紀要」１９７９年、７６（２）６１５−６１９頁）による、ガラス粉を用いてアガロ−スからＤＮＡフラグメントを精製する彼らの研究に最初に記載されている。
【００８８】
結合したＤＮＡを有するマイクロ流体チャネルを、５０％のエタノールと５０％のバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の混合液で洗浄してヨウ化ナトリウムを取り除く。次いで脱イオン水又は低塩溶出バッファでシリコン又はガラスからＤＮＡを溶出する。ターゲットＤＮＡを検知デバイスに運ぶ溶出バッファの塩とｐＨは、制御電極に結合されてるＰＮＡにターゲットＤＮＡがハイブリダイゼーションするのに適切な、例えば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に調整される。溶出されたＤＮＡを運ぶ塩とｐＨを調整したハイブリダイゼーション溶液は、マイクロ流体チャネル３５７を通ってナノワイヤセンサ３５０に流れ、又は送圧され、そこで予め選択されたターゲット分子に特異的なペプチド核酸分子で機能化された制御電極３５６に接触して、ターゲットＤＮＡがＰＮＡにハイブリダイズする。
【００８９】
シリコンナノワイヤベースのセンサ設計／開発
本発明の検知デバイスのターゲット分子を結合するナノワイヤ３５５と制御電極３５６は、物理的に分離されている。ナノワイヤセンサ３５０の実施例の概略図を図９Ａに示す。図示したように、ナノワイヤセンサ３５０は、二つの構成要素：ソース電極３５３とドレイン電極３５４の間に配置されたナノワイヤ３５５と、制御電極３５６によって作動する。ターゲット分子は、適切なハイブリダイズ条件下で制御電極３５６の表面に結合されてるＰＮＡｓにハイブリダイズする。ＳｉＮＷ−ＦＥＴは、制御電極３５６と、変化したゲート応答によるナノワイヤ３５５表面の電気容量の変化を検出する。コレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）が制御電極３５６に印加されて、ナノワイヤ３５５上にイオン二重層がイオンの移動によって形成される。この現象はゲート電圧として機能し、ナノワイヤ３５５内の電荷密度の変化を誘発する。ＤＮＡターゲット分子が制御電極３５６の結合部位に結合すると、制御電極３５６とナノワイヤ３５５間の容量が変化し、コレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）に対するナノワイヤ３５５からのゲート応答も変化する。例えば電圧計で電流を監視して、ナノワイヤ３５５を通過する導電性を測定することにより、この変化が検出される。
【００９０】
図９Ｂは、ナノワイヤセンサ３５０の応答である伝導度対制御電極電圧の概略図を示す。閾値、Ｖｔｈは、伝導度の線形領域がゼロになるまで線形外挿に基づいて設定されている。制御電極３５６の表面にターゲット分子（ｓｓＤＮＡｓ）が結合すると、制御電極３５６とナノワイヤ３５５表面間の容量が変化する。この容量変化は、ナノワイヤセンサ３５０の出力信号であるナノワイヤ３５５の閾値電圧をシフトする。
【００９１】
分別検出方法
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の点突然変異を検出するため、血液サンプルを分析して単一塩基突然変異を含むＤＮＡを求める。
【００９２】
多くの生体成分から成るヒトの血液サンプルを採取して、抗凝固剤（例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸、ヘパリン）に結合させる。ＥＤＴＡで抗凝固された血液が好ましい。抗凝固血液サンプルを採取して、マイクロ流体デバイスのサイズ排除メカニズムを通過させ、ＤＮＡをマイクロ流体チャネルに結合させて、次いで上記のとおり結合されたＤＮＡを溶出することによって、ＤＮＡをサンプル中の非ＤＮＡ分子から分離する。溶出されたＤＮＡを含むサンプルは、二つのナノワイヤセンサ３５０：ターゲット核酸分子に特異的に結合したＰＮＡを伴う第一ナノワイヤセンサ３５０（サンプルナノワイヤセンサ３５０）と、ターゲット核酸分子に結合したＰＮＡを具えていない第二ナノワイヤセンサ３５０（サンプルナノワイヤセンサ３５０）に、サンプル中のターゲット分子がＰＮＡとハイブリダイズする条件下で、適用される。両方の検知デバイスに同様に影響を与える血液サンプル中のターゲットＤＮＡ以外のシグナルは、ナノスケールで二つのナノワイヤセンサ３５０からの反応差を用いて取り除かれる（サンプルナノワイヤセンサ３５０の信号から制御ナノワイヤセンサ３５０のシグナルを引く）。
【００９３】
一のナノワイヤセンサ内での分別検出と二つのＮＷ−ＦＥＴ
少なくとも二セットのＳｉＮＷ−ＦＥＴと制御電極３５６：第一ＳｉＮＷ−ＦＥＴと捕捉ＰＮＡｓで機能化した第一制御電極３５６から成る一セットと第二ＳｉＮＷ ＦＥＴと捕捉ＰＮＡｓを有さない第二制御電極３５６を含む使い捨ての単回使用テストカードカートリッジ器具を用意する。追加のセットは、追加のＳｉＮＷ−ＦＥＴと様々な捕捉ＰＮＡｓで機能化した制御電極３５６である。ＳｉＮＷ−ＦＥＴは、両方のセットで同じものである（電流−電圧特性とゲート応答に関して同様の性能を有している）。この器具は、同じ入口を共有する少なくとも二つのマイクロ流体チャネルを具える。各チャネルは一のＳｉＮＷ−ＦＥＴを具える。溶出されたＤＮＡサンプルはマイクロ流体チャネルに流れ込み、各チャネル内に配置されたＳｉＮＷ−ＦＥＴからのシグナルを、検出手段で検出して比較する。
【００９４】
本発明のその他の態様は、当業者には明らかであり、ここに繰り返し記載する必要はない。使用されている用語や表現は、説明の用語として使用され用語を限定するものではなく、それらの用語と表現の使用において、ここに記載された特徴の同等物又はこれらの一部を排除することを意図するものではなく、発明の範囲内において様々な修正は可能であると認識される。
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００８年１２月５日出願、発明の名称「半導体集積−ナノセンサ分析システム」、シリアル番号６１／１２０，２５３の米国暫定特許出願の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿、及びその他の体液などの生体サンプル中の抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、アプタマー、及び特定の細胞型又は物質の細胞受容体の検出は、病気の診断、治療効果の評価、及びその他の多くの目的で用いられる。現在の診断分析は、患者が医師を訪ねるか、研究所に赴く必要があるが、ポイント・オブ・ケア分析は診療室にいるかかりつけ医によって、又は自宅にいる患者によって、さらには遠隔地又は寝たきりの患者用の病院にいる医療提供者によっても実施することができる。
【０００３】
マイクロ流体技術は、従来の実験技術のいくつかの欠点に取り組むために適用されてきた。例えば、マイクロ流体技術は非常に少量の試薬を必要とする。しかしながら、マイクロ流体技術は、非常に少量の生体サンプルを処理することができるが、このことが検出するべき特定の細胞又は物質の量が非常に少ないときに感度を制限することになる。
【０００４】
安価で労働集約的でない生体サンプル中の特定の物質を検出するシステム及び方法が求められている。
【０００５】
ポイント・オブ・ケアで迅速に結果を出すことができる生体サンプル中の特定物質を検出するシステム及び方法が求められている。
【０００６】
非常に感度のよい生体サンプル中の特定物質を検出するシステム及び方法が求められている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、テストカードと共に使用するのに適したポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）分析器の一実施例を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、テストカードと共に使用するのに適したポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）分析器の一実施例を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、テストカードの一実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、テストカードの一実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図３Ａ】図３Ａは、第一分離チャンバの拡大図を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、孔の拡大図を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、捕捉チャネル２３８の一実施例の斜視図と断面図を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、捕捉チャネル２３８の一実施例の斜視図と断面図を示している。
【図５Ａ】図５Ａは、粒子検出器の一実施例の拡大図を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、粒子検出器の一実施例の拡大図を示している。
【図５Ｃ】図５Ｃは、粒子検出器の別の実施例の拡大図を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、テストカードの別の実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、テストカードの別の実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図７Ａ】図７Ａは、テストカードの別の実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、テストカードの別の実施例の組み立て図と分解図を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、それぞれ第二分離層の平面と底面の拡大図を示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、それぞれ第二分離層の平面と底面の拡大図を示している。
【図９Ａ】図９Ａは、ナノワイヤセンサの一実施例の拡大図を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ナノワイヤセンサの応答の概略図を示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とメルカプトエタノールの混合自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）の概略図を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
図１Ａ−１Ｂは、テストカード２００と共に使用するのに適したポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）分析器１００の一実施例を示している。ＰＯＣ分析器１００は、カード差し込み口１１２、ディスプレイ１１４、及び制御手段１１６を具えている。カード差し込み口１１２は、テストカード２００を受けるように構成されている。ディスプレイ１１４は、ＰＯＣ分析器１００の状態と検査結果を示すものである。制御手段１１６は、ＰＯＣ分析器１００の電源を入れたり切ったり、検査を開始したり終了したり、及びディスプレイ１１４を変更したりする。
【０００９】
ＰＯＣ分析器１００は、テストカード２００を加圧するための、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、又はその他の適切なポンプなどの加圧器具を具えている。ＰＯＣ分析器１００はまた、テストカード２００上の対応する電気接点と結合するように構成された電気接点を具えている。
【００１０】
テストカード２００は、サンプルを受けとり、次いでＰＯＣ分析器１００を用いてサンプル中の特定の物質を定量化又はカウントするように設計されている。サンプルは、全血、血漿、血清、細針吸引物、骨髄サンプル、髄液、嚢胞液、関節液若しくは髄液、子宮内膜吸引サンプル、胃サンプル、眼液、卵巣液、組織培養媒体、尿素、又はその他の生体サンプル又は非生体サンプルでもよい。
【００１１】
一の実施例では、テストカード２００は、全血サンプルを受けて、サンプル中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）のおおよその数をカウントするように構成されている。同じ実施例又はその他の実施例では、テストカード２００を用いて、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ６４、又はＣＤ１５細胞表面マーカーのいずれかを欠くサンプル中の白血球のおおよその数のカウントすることができる。同じ実施例又はさらに別の実施例では、テストカード２００を用いて癌細胞の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）増幅、癌幹細胞のＣＤ１３３、又は抗原特異性のＴ細胞受容体といった特異的表面マーカーを有する細胞のおおよその数をカウントすることができる。
【００１２】
テストカード２００は、プラスチック、ガラス、又はその他の適切な材料で作られている。テストカード２００は、一又はそれ以上の層から構成されてもよい。エポキシ樹脂、熱接合、又はその他の適切な方法及び／又は材料を用いて、該層を互いに結合してもよい。テストカード２００は、約７０ｍｍ×５５ｍｍ×５ｍｍの寸法を有してもよい。テストカード２００は、バッファ電源が付いており、アクセスが容易になるように配置された電気接点を有していてもよい。
【００１３】
図２Ａ−２Ｂは、テストカード２００の一実施例の組み立て図と分解図を示している。テストカード２００は、全血サンプルを受けて、ＣＴＣｓのおおよその数を提供するのに適している。テストカード２００は、最上層２１０、粒子検出層２２０、第一分離層２３０、及び廃棄物回収層２６０を具える層の束で構成されている。これらの層の機能性は、製造及び経費検討に応じて、組み合わせても、より少ない層又はより多い層に分けてもよい。
【００１４】
第一分離層２３０は、サンプル入口２３１を具える。サンプル入口２３１は、約０．０１ｍｌから１０ｍｌの大量のサンプルを受けることができる。サンプル入口２３１は、目詰まりの可能性を最小限にする大きさである。サンプル入口２３１は、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、好ましくは５ｍｍの直径を有していてもよい。サンプル入口２３１は、最上層２１０と粒子検出層２２０を通って第一分離層２３０に到達している。
【００１５】
第一分離層２３０はまた、サンプル入口２３１と流体連通する第一分離チャンバ２３５を具えている。第一分離層２３０はまた、第一分離チャンバ２３５と流体連通する捕捉チャネル２３８を具える。
【００１６】
図３Ａは、第一分離チャンバ２３５の拡大図を示している。第一分離チャンバ２３５は、濾過表面２３６を具えている。濾過表面２３６は、適切なサイズの複数の孔２３７を具えている。全血中のＣＴＣｓを検出するために、孔２３７は、小型の白血球、赤血球、血小板、血漿、及びその他の血液成分は通過させるが、ＣＴＣｓと大型白血球は通過させないサイズ、又は約１μｍから３０μｍ、好ましくは約１６μｍの直径を有する。癌細胞の抗原、核酸、抗体、免疫グロブリン、その他のバイオマーカー、及び微生物の検出といった他の適用に、孔２３７は、約１μｍの直径を有していてもよい。濾過表面２３６は、多孔率が５０％を超えてもよい。多孔率とは、濾過表面２３６の孔２３７で構成される部分又はパーセンテージのことを言う。図３Ｂは、孔２３７の拡大図を示している。孔２３７は、六角形、矩形、その他の適切な形状で配置することができる。孔２３７は、円形、六角形、又はその他の適切な形状でもよい。孔２３７は、均一のサイズ又はさまざまなサイズであってもよい。濾過表面２３６は、約縦６ｍｍ×幅６ｍｍで、約１００，０００の孔を具えている。
【００１７】
サンプル入口２３１は、濾過表面２３６上方に位置している。サンプル入口２３１は、上記濾過表面２３６から第一分離チャンバ２３５に全血サンプルを誘導し、濾過表面２３６に対して実質的に垂直方向にサンプルが流れるようにしている。これが流速を増加させ、試験時間を減少させる効果をもたらしている。
【００１８】
第一分離層２３０はまた、第一分離チャンバ２３５と流体連通するバッファ入口２３２を具える。バッファ入口２３２は、最上層２１０と粒子検出層２２０を貫通して第一分離層２３０に達している。バッファ入口２３２は、ＰＯＣ分析器１００中の加圧器に流体連通することができる。バッファ入口２３２は、濾過表面２３６に実質的に平行方向において第一分離チャンバ２３５にバッファを誘導して、濾過表面２３６を横切って、捕捉チャネル２３８に向かって「一掃する」動作を生じさせる。バッファ入口２３２は、まず、実質的に濾過表面２３６の全側部に広がっているバッファトラフ２３３にバッファを導入する。バッファトラフ２３３がバッファでいっぱいになると、バッファが濾過表面２３６にあふれ出る。バッファトラフ２３３は、濾過表面２３６とおおよそ同じレベルに位置する頂部を有する。代替として、バッファ入口２３２が、実質的に濾過表面２３６の全側面にバッファを広げるバッファ拡散器を具えていてもよい。バッファ入口２３２は、バッファを濾過表面２３６を超えて移動させて、バッファ入口２３２から捕捉チャネル２３８へバッファが流れるときに濾過表面２３６を一掃する。
【００１９】
濾過表面２３６は、第一分離層２３０の一部として形成してもよく、又別個に製造したあとに第一分離層２３０に結合するようにしてもよい。濾過表面２３６は、射出形成、マイクロリソグラフィー、光画像形成などのマイクロマシニング技術、ウェット及びドライエッチング、放射線「解凍」などの放射線ベースの処理、及びレーザー切断により製造することができる。「ウェットエッチング」とは、一般に液体成分に接触させてエッチングすることをいう。「ドライエッチング」とは、一般にガス又はプラズマに接触させてエッチングすることをいう。レーザー切断では、レーザー光の各パルスが、高分子材料のごく一部を取り除く。シンクトロンは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）のようなアクリル樹脂材料でできた高分子骨格を非結合又は「解凍」させるために用いることができる指向性の高いＸ線照射を行う。この概念を用いて、所望のパターンを規定する吸収及び送出セクションを有するＸ線マスクにより定義される高分子膜の露出部分を、電離放射線によって「解凍」し、続いて溶媒浴よって発現させることができる。
【００２０】
ＣＴＣｓの計算に関して、体積あたりのＣＴＣｓの数が非常に少ないため、感度はサンプルの体積に対応する。テストカード２００は、最大１０ｍｌ又はそれより多い体積の血液サンプルを濾過することができる。このサンプルサイズは、通常、マイクロ流体装置にみられるサンプルサイズより１０倍大きくてもよい。この結果、この大きいサンプルサイズが１０倍より大きい感度をもたらす。
【００２１】
図４Ａ−４Ｂは、捕捉チャネル２３８の一実施例の斜視図と断面図を示している。捕捉チャネル２３８は、サンプル中の特異的にターゲットされた成分に選択的に結合する結合剤で処理された壁を具える。一実施例では、捕捉チャネル２３８は、白血球細胞に結合するＣＤ４５抗体で処理された壁を具える。他の実施例では、捕捉チャネル２３８は、不要成分に選択的に結合できる抗体、アプタマー、ペプチド、及び／又は小型分子で処理された壁を具える。捕捉チャネル２３８は、白血球細胞又はその他の血液成分２３９が壁に結合するときに、詰まらないように充分な幅を有する。捕捉チャネル２３８は、約２０μｍから１０００μｍまでの幅を有し、約４００μｍが好ましい。捕捉チャネル２３８はまた、白血球細胞又はその他の血液成分の捕捉を強化するのに充分な長さを有する。捕捉チャネル２３８の、総経路長は、約０．１ｃｍから１０ｃｍであり、約５ｃｍが好ましい。捕捉チャネル２３８は、白血球細胞又はその他の血液成分の捕捉を強化する蛇行経路を描いている。一実施例では、捕捉チャネル２３８は、白血球細胞又はその他の血液成分を壁に接触させる、約９０度のターンをいくつか有する螺旋状の経路を描いている。これらのターンはまた、粒子が直進経路の流れから壁に衝突し他の粒子と衝突するときに乱流を作り、壁への接触する頻度上げる。捕捉チャネル２３８は、正方形、矩形、三角形、又はその他の適当な断面形状をとることができる。
【００２２】
粒子検出層２２０は、捕捉チャネル２３８と流体連通する粒子検出器３００を具える。粒子検出器３００は、特定の物資の量を定量化又はサンプル中の細胞の数をカウントすることができる。粒子検出器３００は、寒天ベースの塩橋インピーダンスセンサ、ＤＡＤＭＡＣ塩橋インピーダンスセンサ、又はその他の適切なセンサでもよい。
【００２３】
図５Ａ−５Ｂは、粒子検出器３００の一実施例の拡大図を示している。粒子検出器３００は、塩橋インピーダンスセンサ、具体的には寒天ベースの塩橋インピーダンスセンサである。粒子検出器３００は、捕捉チャネル２３８からサンプルを受けとり、それを主フローチャネル３０２に向けるセンサ入口３０１を具えている。主フローチャネル３０２は、約０．０５ｍｍから０．５ｍｍの幅を有し、約０．１ｍｍが好ましい。粒子検出器３００はまた、バッファ槽３０３と、主フローチャネル３０２の両側にバッファを導入するバッファ導入チャネル３０４と３０５を具えている。バッファ導入チャネル３０４と３０５は、流体力学的に、主フローチャネル３０２の中央にサンプルを集中させる。これは、サンプル中の細胞又は粒子を実質的に一列に並べるものである。代替として、単一のバッファ導入チャネルを用いて、主フローチャネル３０２の片側に、流体力学的にサンプルを集中させることができる。
【００２４】
粒子検出器３００はまた、寒天を含有し、連結チャネル３１３と３１４を介して主フローチャネル３０２に連結されている塩橋チャンバ３１１と３１２を具えている。連結チャネル３１３と３１４は、約０．００１ｍｍから０．０５ｍｍの幅と約０．０１ｍｍから０．２ｍｍの長さを有し、約０．０１ｍｍの幅と０．１ｍｍの長さが好ましい。電解質入口３１５と３１６は、電解質を含有し、塩橋チャンバ３１１と３１２と流体連通いている。電解質入口３１５と３１６は、電極３２５と３２６に接続されている。電極３２５と３２６は、最上層２１０を通って、ＰＯＣ分析器１００に電気的に接続されていてもよい。電極３２５と３２６は、Ａｇ／ＡｇＣｌその他の適切な材料で作ることができる。主フローチャネル３０２と流体連通する回収チャンバ３１９が、最後にサンプルを回収する。
【００２５】
粒子検出器３００は、塩橋チャンバ３１１と３１２の製造を促進する寒天入口３１７と３１８を具えている。塩橋チャンバ３１１と３１２は、寒天入口３１７と３１８を約２−１０％の寒天と１ＭのＫＣｌ（重量×体積）の混合物で充填することによって製造される。寒天が完全に溶解するまで、この寒天混合物は加熱される。寒天混合物は、準備が整うと透明になり、準備が整ったらすぐに寒天入口３１７と３１８に導入される。寒天混合物は、毛細管力又は陽圧により寒天入口３１７と３１８に導入される。最初に寒天入口３１７と３１８及び塩橋チャンバ３１１と３１２を寒天混合物で充填する。連結チャネル３１３と３１４は狭く、大きな流れ抵抗が寒天混合物が主フローチャネル３０２に流れ込むのを阻む。使用される量が少ないので、連結チャネル３１３と３１４のサイズによって、チャネル内に寒天又は別のポリマーをより一貫して充填できる。これにより、より大きな連結チャネルであればそうなるように、より多くのポリマーが充填されると特異的に重合化された塩橋を持ちにくくなる。これは、再現性がより高い検査結果をもたらす。一旦塩橋チャンバ３１１と３１２が寒天混合物で充填されると、流れを止めることができる。粒子検出器３００は、寒天混合物が冷えて、固化するまで室温で保管してもよい。粒子検出器３００は、１ＭのＫＣｌ溶液を電解質入口３１５と３１６に導入した後の時点で使用することができる。寒天ベースの塩橋センサの製造は、フォトリソグラフィを必要としない。寒天ベースの塩橋センサは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のような軟質材料を含む広い範囲の材料と互換性がある。寒天ベースの塩橋センサの製造は、光開始剤としてのＵＶや架橋剤を必要としない。
【００２６】
図５Ｃは、粒子検出器３００の別の実施例の拡大図を示している。検出器３００は、塩橋インピーダンスセンサ、特にジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＡＤＭＡＣ）塩橋センサである。粒子検出器３００は、捕捉チャネル２３８からサンプルを受けとり、主フローチャネル３０２にそれを向けるセンサ入口３０１を具える。主フローチャネル３０２は、幅が約０．０５ｍｍから０．５ｍｍであり、約０．１ｍｍが好ましい。粒子検出器３００はまた、バッファ槽３０３と主フローチャネル３０２の両側にバッファを導入するバッファ導入チャネル３０４と３０５を具える。バッファ導入チャネル３０４と３０５は、流体力学的に、主フローチャネル３０２の中央にサンプルを集中させる。これは、サンプル中の細胞を実質的に一列に並べるものである。代替として、単一のバッファ導入チャネルを用いて、主フローチャネル３０２の片側に、流体力学的にサンプルを集中させることができる。
【００２７】
粒子検出器３００はまた、ＤＡＤＭＡＣを含んでおり、主フローチャネル３０２と流体連通する、塩橋チャンバ３２１と３２２を具える。電解質入口３１５と３１６は、電解質を含み、塩橋チャンバ３１１と３１２と流体連通している。電解質入口３１５と３１６は、電極３２５と３２６に連結している。電極３２５と３２６は、最上層２１０を通って、ＰＯＣ分析器１００に電気的に接続されている。電極３２５と３２６は、Ａｇ／ＡｇＣｌ又はその他の適切な材料で作られている。主フローチャネル３０２と流体連通している回収チャンバ３１９は、最後にサンプルを回収する。
【００２８】
粒子検出器３００は、一般的なソフトリソグラフィー工程で製造することができる。ＳＵ−８又はシリコンベースの鋳型を、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いたフォトリソグラフィーにより製造する。粒子検出器３００は、光開始剤及びモノマーのプレポリマーの混合物で塩橋チャンバ３２１と３２２を充填し、ＵＶでそれを露出することにより製造される。プレポリマー混合物は、６５％のジアリルジメチルアンモニウムクロリド水溶液、２％の２−ｄｙｄｒｏｘｙ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（光開始剤）、及び２％のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（架橋剤）で構成されている。重合後、残りのプレポリマー混合物を、バッファ溶液（１Ｍ ＫＣｌ）で洗い流す。電気的測定用に、ＫＣｌ溶液を塩橋チャンバ３２１と３２２に連結されている電解質入口３１５と３１６に充填し、ＫＣｌ溶液の中の電極３２５と３２６の間に直流バイアスを印加することにより、陰イオン、この場合はＣｌイオンを塩橋チャンバ３２１と３２２を通過させる。これが塩橋チャンバ３２１と３２２の間の電流を駆動し、塩橋チャンバ３２１と３２２の間にあって電極３２５と３２６にかかるインピーダンスを変化させる主フローチャネル３０２を細胞が通過するときに、塩橋チャンバ３２１と３２２の間のインピーダンスがモニタされる。励起シグナルは、約０．０１Ｖから１０Ｖの交流又は直流の電圧をもっており、交流が使用されるときは５０Ｈｚから１０ｋＨｚの周波数を有する。
【００２９】
図６Ａ−６Ｂは、テストカード２００の別の実施例の組み立て図と分解図を示す。テストカード２００は、最上層２１０、結合層２２５、及び廃棄物層２６０を具える。結合層２２５は、粒子検出層２２０と第一分離層２３０に見られる要素を結合層２２５に結合させている。結合層２２５は、第一分離チャンバ２３５、捕捉チャンバ２３８、及び粒子検出器３００を具える。サンプル入口２３１によって、サンプルが第一分離チャンバ２３５に導入される。バッファ入口２３２によって、第一分離チャンバ２３５だけでなく、主フローチャネル３０２にもサンプルを導入することができる。
【実施例１】
【００３０】
［循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）］
テストカード２００は、全血中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）を検出に用いることができる。血漿、血小板、赤血球、白血球、及びＣＴＣｓを含む全血のサンプルは、抗凝血剤を用いて採取され、サンプル入口２３１に投入する。次いで、テストカード２００を、ＰＯＣ分析器１００に挿入する。サンプルが、第一分離チャンバ２３５に達して、サンプル入口２３１を経由して濾過表面２３６に実質上垂直に導入される。血漿、血小板、赤血球、及び小型の白血球は、孔２３７を通って廃棄物チャンバ２６０に入る。孔２３７は、直径約１４−１８μｍ、好ましくは約１６μｍである。大型の白血球とＣＴＣｓは、大き過ぎて孔２３７を通過できず、第一分離チャンバ２３５内にとどまる。ＰＯＣ分析器１００は、１−３分間サンプル入口２３１に約０−５０ｐｓｉの圧力を加えて、濾過工程を容易にすることができる。
【００３１】
バッファは、濾過表面２３６に実質的に平行な方向に、第一分離チャンバ２３５に導入される。サンプル入口２３１を閉じて、バッファの逆流を防止することができる。バッファはバッファ入口２３２から濾過表面２３６に実質的に平行に入り、濾過表面２３６を横切って捕捉チャネル２３８に向う「一掃する」動きを作り出す。第一分離チャンバ２３５入口地点でのバッファ入口２３２の高さを低くする一方で、バッファはバッファ入口２３２から流入し捕捉チャネル２３８に向かって移動するので、バッファ入口の長さを拡げてバッファを分散させて濾過表面２３６を完全に一掃できるようにする。正常な細胞の機能と容量を維持するために、キログラムあたり約２７５−２９９ミリ−オスモルのオスモル濃度を有するリン酸緩衝食塩水又はその他のｐＨ緩衝バッファを用いることができる。これは、濾過表面２３６上の白血球とＣＴＣｓ、特に孔２３７中に部分的に「詰まった」又は配置された白血球とＣＴＣｓを、捕捉チャネル２３８に「一掃する」又は取り除く効果がある。さらに、ＰＯＣ分析器１００は、一掃する工程を容易にするためにバッファ入口２３２に圧力を加えることができる。
【００３２】
バッファは、濾過されずに残留した白血球とＣＴＣｓを捕捉チャネル２３８を通って運ぶ。捕捉チャネル２３８の蛇行経路は、白血球が捕捉チャネル２３８の壁に接触し、白血球と特異的に結合するＣＤ４５抗体又はその他の捕捉剤で処理されている壁に結合する可能性を高める。ＣＴＣｓは、壁に結合せず、捕捉チャネル２３８を通過する。
【００３３】
バッファは、ＣＴＣｓを粒子検出器３００に運ぶ。ＣＴＣｓは、センサ入口３０１を通って主フローチャネル３０２に入る。バッファ槽３０３から追加のバッファが、バッファ導入チャネル３０４と３０５を通って主フローチャネル３０２に導入されており、ＣＴＣｓを流体力学的に主フローチャネル３０２の中央に集中させる。流体力学的に集中したＣＴＣｓは、連結チャネル３１３と３１４の間を通過し、カウントされる。電極３２５と３２６に約５ｍＶから５００ｍＶの電圧が印加され、インピーダンスをＰＯＣ分析器１００により測定する。
【００３４】
ＣＴＣｓは、回収チャンバ３１９内にたまり、必要に応じてさらなる分析のためにテストカード２００から取り出される。
【実施例２】
【００３５】
［移植組織適合検査］
移植に先立ち、ドナーとレシピエントの候補者の組織の適合性を検査する組織検査に、テストカード２００を用いることができる。胚、移植胚は、病気の兄弟のための臍帯血の幹細胞のドナーに確実になり得るタイプの組織である。
【００３６】
この適用は、直径約５μｍの孔２３７を有する濾過表面２３６を使用する。サンプルからの少量の白血球は、第一分離チャンバ２３５に残り、既知の抗−ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）抗体で特別に処理された壁を有する捕捉チャネル２３８に移動する。抗体が主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）上のエピトープを認識すると、白血球が捕捉チャネル２３８の壁に結合するので、粒子検出器３００によってカウントされない。これにより、捕捉チャネル２３８に存在する既知の抗体の特異性に基づく、間接的な細胞のＭＨＣの同定が可能となる。
【実施例３】
【００３７】
［疾病関連性のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合検査］
ヒトのある病状に関連して有用であるＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃの検出に、テストカード２００を用いることができる。
【００３８】
この適用は、直径約５μｍの孔２３７を有する濾過表面２３６を使用する。サンプル中の白血球は、第一分離チャンバ２３５内に残り、特定の抗−ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）抗体で処理された壁を有する捕捉チャネル２３８に移動する。抗体が白血球上のＨＬＡ抗原を認識すると、白血球は捕捉チャネル２３８の壁に結合し、粒子検出器３００によって測定されない。これにより、捕捉チャネル２３８に存在する既知の抗体の特異性に基づく、間接的な細胞のＨＬＡの同定が可能となる。
【実施例４】
【００３９】
［後天性造血幹細胞疾患］
血液細胞がある細胞表面マーカーが欠如しており、溶血と呼ばれる工程により体の一部又は全部の赤血球（ＲＢＣｓ）が破壊される後天性造血幹細胞疾患である、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）の同定に、テストカード２００を用いることができる。、表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ６４、及びＣＤ１５が結合していない血液細胞を検出するためにテストカード２００を用いることができる。
【００４０】
この適用は、直径約５μｍの孔２３７を有する濾過表面２３６を使用する。捕捉チャネル２３８は、ＣＤ４５、ＣＤ１４、及び／又はＣＤ３３抗体で処理された壁を有する。ＰＮＨに感染した白血球は壁に結合せず、捕捉チャネル２３８を通過して粒子検出器３００でカウントされる。
【００４１】
図７Ａ−７Ｂは、テストカード２００の別の実施例の組み立て図と分解図を示す。テストカード２００は、最上層２１０、第一分離層２３０、第二分離層２４０、ナノワイヤセンサ層２５０、及び廃棄物回収層２６０を具える。
【００４２】
図８Ａ−８Ｂは、第二分離層２４０の拡大図を示す。第二分離層２４０は、孔２３７を通って第一分離チャンバ２３５と流体連通する第二分離チャンバ２４５を具える。第二分離チャンバ２４５は、血漿、赤血球、血小板、及びその他の孔２３７のサイズより小さい血液成分を回収する。第二分離チャンバ２４５は、内壁２４１と外壁２４２を有する。 内壁２４１は、幅約４００μｍのオープンスペースを有し、第二分離チャンバ２４５から第二分離チャンバ２４５の内壁２４１と外壁２４２の間のチャネル２４８へ粒子を移動させる。チャネル２４８の壁は、第二分離チャンバ２４５内に回収した粒子に特異的に結合する捕捉剤で処理してもよい。サンプルは、ナノワイヤセンサ３５０に到達する前に、第二分離層２４０の上部と底部に沿って走るチャネル２４９を通過する。
【００４３】
ナノワイヤセンサ層２５０は、ナノワイヤセンサ３５０を具える。ナノワイヤセンサ３５０は、血漿又はその他のサンプル中の特定の物質の量の定量化できる。
【００４４】
図９Ａは、ナノワイヤセンサ３５０の一実施例の拡大図を示す。ナノワイヤセンサ３５０は、シリコンナノワイヤの電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）である。ナノワイヤセンサ３５０は、ベース３５２を具える。ナノワイヤセンサ３５０は、ソース電極３５３とドレイン電極３５４を具え、両者はベース３５２上に配置されている。ソース電極３５３とドレイン電極３５４は、絶縁層で覆われている。ナノワイヤセンサ３５０は、ソース電極３５３とドレイン電極３５４に接続されたナノワイヤ３５５を具える。ナノワイヤ３５５は、半導体であり、ケイ素、ゲルマニウム、インジウムヒ素、酸化亜鉛、シリコンゲルマニウム、又はその他の適切な材料でつくることができる。ナノワイヤ３５５は、約１ｎｍから５００ｎｍの厚さを有し、約２０ｎｍが好ましい。ナノワイヤ３５５は、約１０１６／ｃｍ３から１０２０／ｃｍ３にドープされており、１０１８／ｃｍ３が好ましい。ナノワイヤセンサ３５０はまた、ベース３５２上に配置されている制御電極３５６を具える。
【００４５】
ナノワイヤセンサ３５０も、制御電極３５６を具える。制御電極３５６は、ナノワイヤ３５５から約０．０１ｍｍから１ｍｍのところに位置しており、約０．１ｍｍが好ましい。一実施例では、制御電極３５６は金で作られているが、銀、銅、亜鉛、カドミウム、鉄、ニッケル、コバルト、又はその他の適切な材料で作ってもよい。一実施例では、制御電極３５６は、例えばアミン、カルボン酸、アルデヒド、又はチオール結合を介して制御電極３５６に結合するターゲット分子に特異的なペプチド核酸（ＰＮＡ）で機能化されている。ターゲット分子は、例えば事前に選択されたヌクレオチド配列を含んだ核酸分子でもよい。ＰＮＡは、例えばアミノ酸リンカー、又はモノマーあるいは例えば８−アミノ−３，６，−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ酸などのマルチマー、又制御電極３５６に結合するとＰＮＡに適応性を提供するその他の適切なスペーサの、スペーサ単位を具える。シグナルの変化は、ゲートとのＦＥＴの応答を測定することにより検出することができる。制御電極３５６に印加される電圧、コレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）は、ＦＥＴのゲート入力を提供する。ターゲット分子が、制御電極３５６に結合すると、制御電極３５６とナノワイヤ３５５の間の電気容量が変化し、同じコレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）に対するゲート応答が異なることになる。制御電極３５６は、例えば５μｍ×５μｍから５００μｍ×５００μｍと大きくてよく、制御電極３５６に結合するターゲット分子の数を増やして、これによって検出感度を上げるには約５０μｍ×５０μｍ（長さ×幅）の大きさが好ましい。制御電極３５６は、例えば約１０ｎｍから２００ｎｍの適切な厚さを有する。制御電極３５６の大きなサイズとナノワイヤ３５５ではなく、制御電極３５６の機能化がナノワイヤセンサ３５０の感度と特異性の増大に寄与する。
【００４６】
ナノワイヤ３５５と制御電極３５６は、互いに流体連通している。一実施例において、ナノワイヤ３５５と制御電極３５６はマイクロ流体チャネル３５７内に配置されている。代替として、ナノワイヤ３５５と制御電極３５６を、サンプルが固定又は撹拌されるサンプルチャンバに配置してもよい。制御電極３５６は、実質的にマイクロ流体チャネル３５７と同じか、又はその他の適切なサイズ又は幅である。
【００４７】
制御電極３５６は、多くの癌抗原のうちのいずれかで機能化できる。タンパク質５３（ｐ５３）核酸（腫瘍抑制）又はヒト表皮成長因子受容体２又はＨＥＲ２／ｎｅｕ核酸、又はその他に相補的なペプチド核酸（ＰＮＡ）で、制御電極３５６は機能化される。ＣＡ２７．２９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１５−３、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、又はその他の癌抗原に対する抗体で、制御電極３５６は機能化してもよい。
【００４８】
制御電極３５６を機能化して、多くのタンパク質バイオマーカーのうちのいずれかを検出することができる。Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）に対する抗体、心臓病や脳卒中の危険因子、鬱血性心不全（ＣＨＦ）を診断するためのＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の抗体、急性心筋梗塞や骨格筋損傷の検査をするクレアチニンキナーゼの抗体、栄養状態又は肝機能を検査するトランスフェリンに対する抗体、心臓病と脳卒中の危険がある患者を選別するホモシステインの抗体、糖尿病検査用グルコースのような小型血液分子に対する抗体、又は急性感染症の存在を検査するＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡＧ）の抗体で、制御電極３５６を機能化することができる。
【００４９】
制御電極３５６を多くの抗体のうちのいずれかで機能化して、ある種のタイプの癌、疾患、感染症、又は免疫状態を検出する免疫グロブリンと抗体を検出することができる。特異的免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）の抗体で、制御電極３５６は機能化して骨肉腫、ワルデンシュトレームのマクログロブリン血症を診断し、単クローン性免疫グロブリン血症とアミロイド症を評価することができる。制御電極３５６は、臨床的回復の及びその後のＢ型肝炎ウイルスに対する免疫の指標として使用される抗Ｂ型肝炎ウイルスの抗体、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）に関係する抗体を検出する抗２本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）の抗体、又はアトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び免疫欠損を診断するアレルゲン特異的な免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の抗体で機能化することができる。
【００５０】
制御電極３５６は、様々な感染症の検出に用いられる多くの相補的ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）のうちいずれかで機能化できる。制御電極３５６は、ＨＳＶ核酸、Ｃ型肝炎核酸、ＨＩＶ−１核酸、ニューモシスティス・カリニ肺炎（ＰＣＰ）核酸、バクテリア核酸、ラジオネラ・ニューモフィラ核酸、又は連鎖球菌Ｂ核酸に相補的なＰＮＡで機能化することができる。
【００５１】
上記の例は、サンプルとして全血を用いているが、尿素などの他のサンプルもテストカード２００に使用できる。例えば、制御電極３５６をアルブミンの抗体で機能化して糖尿病の初期兆候である尿素中のアルブミンを検出できる。
【００５２】
テストカード２００は、その他のナノスケールの器具と比較して検出感度と特異性を強化するように設計されている。テストカード２００は、サンプル中の成分をサイズによって、又電荷によって分離するマイクロ流体デバイスと、分子の生化学的及び物理的特性に基づいてターゲット生体分子を検出するナノワイヤセンサ３５０を具える。サンプル中の１又はそれ以上の生体分子の有無を検出する方法や、被験者のサンプル中の生体分子の存在に基づいて被験者の病状を診断する方法も記載されている。ここに記載されている方法は、核酸のピコモル及びフェムトモル量を検出するため、及びサンプル中の生体分子を検出するために、感度を改良するよう設計されている。
【００５３】
テストカード２００は、マイクロ流体デバイスとナノワイヤセンサ３５０を具える。マイクロ流体デバイスは、少なくともサイズ、構造及び電荷のうちの１又はそれ以上に基づきサンプル中の分子を分離するサイズ排除メカニズムを具える。ナノワイヤセンサ３５０は、ベース３５２と、所定の電流−電圧特性を有し生物学的センサとしての使用に適するゲートナノワイヤ電界効果トランジスタ（ＮＷ−ＦＥＴ）を具える。ナノワイヤセンサ３５０はまた、入口を有するマイクロ流体チャネル３５７を具える。ナノワイヤセンサ３５０は、ソース電極３５３、ドレイン電極３５４、ソース電極３５３とドレイン電極３５４間に接続、配置されたナノワイヤ３５５、及び所定の電流−電圧特性を有するＦＥＴを形成するターゲット分子に特異的な結合部位で機能化された制御電極３５６を具える。ＮＷ−ＦＥＴは、ベース３５２上に配置され、ベース３５２とマイクロ流体チャネル３５７間にある。制御電極３５６上のターゲット分子と結合部位間に生じる結合事象は、ＮＷ−ＦＥＴの電流−電圧特性に検出可能な変化を生じさせる。好ましい実施例では、ナノワイヤ３５５は、シリコンベースのナノワイヤであるが、ゲルマニウム、インジウムヒ素、酸化亜鉛、及びシリコンゲルマニウム、又はその他の半導体材料でもよい。制御電極３５６は、金、銀、銅、亜鉛、カドミウム、鉄、ニッケル、コバルト、又はその他の適切な元素又は化合物といった金属制御電極であってもよい。好ましい制御電極３５６は金である。この結合部位は例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、アプタマー、ペプチド、又はその他の物質など、アミン、カルボン酸、アルデヒド、又はチオール結合などを介して制御電極３５６に付着させたターゲット分子に特異的な結合部位である（図９Ｃ参照）。ターゲット分子は、例えば予め選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子であってもよい。ＰＮＡは、例えばアミノ酸リンカー、又はモノマーあるいは例えば８−アミノ−３，６，−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ酸などのマルチマー、又は制御電極３５６に結合するとＰＮＡに適応性を提供するその他の適切なスペーサの、スペーサ単位を具える。シグナルの変化は、ゲートとのＮＷ−ＦＥＴの応答を測定することにより検出することができる。制御電極３５６に印加される電圧、コレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）は、ＮＷ−ＦＥＴのゲート入力を提供する。ターゲット分子が、制御電極３５６に結合すると、制御電極３５６とナノワイヤ３５５の間の電気容量が変化し、同じコレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）に対するゲート応答が異なることになる。制御電極３５６は、例えば５μｍ×５μｍから５００μｍ×５００μｍと大きくてよく、制御電極３５６に結合するターゲット分子の数を増やして、これによって検出感度を上げるには約５０μｍ×５０μｍ（長さ×幅）の大きさが好ましい。制御電極３５６は、例えば約１０μｍから２００μｍの適切な厚さを有する。制御電極３５６の大きなサイズとナノワイヤ３５５ではなく制御電極３５６の機能化が、ナノワイヤセンサ３５０の感度と特異性の増大に寄与する。
【００５４】
本発明の別の実施例は、サンプルをナノワイヤセンサ３５０に塗布し、ナノワイヤセンサ３５０のシグナル変化を検出することにより、サンプル、特に生体サンプル中のターゲット核酸分子の有無を検出する方法であり、ここでシグナル変化はサンプル中のターゲット分子がナノワイヤセンサ３５０内の制御電極３５６上の結合部位に結合することにより誘発される。サンプルは、血液又は血漿サンプルのような生体サンプルでもよい。ターゲット分子は、例えば腫瘍の存在の特徴を示す腫瘍由来のＤＮＡ配列など予め選択された配列を含むＤＮＡ分子が好ましい。腫瘍由来のＤＮＡは、腫瘍の存在の診断および予後指標、腫瘍の進行及び予測の指標、又は治療に対する反応として機能するマーカー又は潜在的なマーカーとなりうる。このＤＮＡは、例えば変異Ｋ−ｒａｓであり、腫瘍は、膵臓癌特に膵臓腺癌である。
【００５５】
この方法はまた、生体サンプル中のターゲットＤＮＡの濃度と癌の状態の相関関係を確立するのに有用である。この方法はまた、ターゲットＤＮＡの由来である腫瘍の早期検出用又は腫瘍の進行分析用のスクリーニング方法として用いることができる。例えばこの方法を用いて、被験者からのサンプル中の追加の変異Ｋ−ｒａｓの存在について膵臓病変を有する被験者からのサンプルを分析することによって、又は臨床的に有意なＫ−ｒａｓＤＮＡレベルを超える変異Ｋ−ｒａｓＤＮＡの上昇レベルの存在について被験者からのサンプルを分析することによって、非癌性膵臓病変から癌性膵臓病変への変化を検出することができる。被験者のサンプル中の追加の変異Ｋ−ｒａｓＤＮＡの存在又は変異Ｋ−ｒａｓＤＮＡの上昇は、膵臓病変が癌性である又はこれから癌性になることの指標となる。さらにこの方法は、治療に対する反応の予測又は特定の療法で最も適切に治療されるであろう患者を選択するのに有用である。例えば、２００８年に米国臨床腫瘍学会及び欧州臨床腫瘍学会で発表されたように、転移性結腸大腸癌におけるＫ−ｒａｓ突然変異の存在は、一般にセツキシマブ（エルビタックス、イムクローン社）及びパニツムマブ（ベクチビクス、アムジェン社）などの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）キナーゼに対する抗体への低い反応が関係している。
【００５６】
本発明のさらなる実施例は、組織サンプルから分離されたゲノムＤＮＡ中で予め選択されたＤＮＡ配列を検出する方法である。ゲノムＤＮＡサンプルは、ナノワイヤセンサ３５０内の制御電極３５６に接触し、ここで制御電極３５６は予め選択されたＤＮＡに特異的な結合部位で機能化されており、電導度又は電流に変化が検出される。予め選択されたＤＮＡ配列は、例えばＢ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、又はサイトメガロウイルスなどのウイルスに特異的なＤＮＡ配列である。
【００５７】
電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）は、ゲート電極、ソース電極、及びドレイン電極を具える三電極装置である。ＦＥＴは、「Ａｒｔ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ」第二版、ポールホロウィッツ、ウィンフィールドヒル著、ケンブリッジ大学出版局、１９８９年、１１３−１７４頁により詳細に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。電荷担体の使用可能性は、ゲート電極としても知られる第三の「制御電極」に印加される電圧によって制御される。チャネル中の伝導は、チャネルを横切って電界を作り出すゲート電極に印加される電圧により制御される。
【００５８】
検知デバイスは、（ａ）ソース電極３５３とドレイン電極３５４間に接続され、配置されるナノワイヤ３５５と、（ｂ）ゲート電極又は制御電極３５６と、（ｃ）選択的に流体入口と出口を有するマイクロ流体チャネル３５７と、を具える。ソース電極３５３、ドレイン電極３５４、ナノワイヤ３５５、及び制御電極３５６がナノワイヤセンサ３５０を形成している。ナノワイヤ３５５と制御電極３５６は物理的に離れており、制御電極３５６はマイクロ流体チャネル３５７の流れの中にある。ナノワイヤセンサ３５０とマイクロ流体チャネル３５７は、支持ベース３５２上に配置されている。ナノワイヤセンサ３５０は、支持ベース３５２とマイクロ流体チャネル３５７間に位置する。制御電極３５６は、予め選択されたターゲット分子の結合部位で機能化される。制御電極３５６上の結合部位に結合しているターゲット分子は、ナノワイヤ３５５の担体配分を変える電界を生じさせるゲートで電圧を与える。ナノワイヤ３５５内の担体配分の変化は、ナノワイヤ３５５を通過する電流の流れに影響を与え、ナノワイヤ３５５は例えば電圧計付電流−電圧スキャンのような検出器により検出される。
【００５９】
測定は液相内で行われるため、ナノワイヤ３５５に接続されたソース電極３５３とドレイン電極３５４は、ソース電極３５３とドレイン電極３５４を絶縁材でコーティングすることにより、マイクロ流体チャネル３５７内のサンプルへの露出から保護される。例えば、窒化ケイ素、酸化ケイ素及びその他の適当な材料など色々な絶縁材を用いることができる。窒化ケイ素又は酸化ケイ素をプラズマ化学気相成長法（ＰＥＣＶＤ）によりソース電極３５３とドレイン電極３５４上に蒸着して、絶縁を提供できる。ＰＥＣＶＤを用いて窒化ケイ素又は酸化ケイ素を薄層蒸着させる条件は、さらに最適化することができる。
【００６０】
ナノワイヤセンサ３５０はまた、制御電極３５６の電気容量又はその特性の変化を測定する器具を具えることもできる。ナノワイヤセンサ３５０は簡単電子機器、好ましくはナノワイヤ３５５と、例えば電源、増幅器、及び電圧計などの電子部品に接続されたフォトリソグラフィーによって規定したミクロンサイズのソース電極３５３で操作される。マイクロ流体チャネル３５７中のサンプルを含む電解質を流れる寄生電流を最小にするために、ソース電極３５３とドレイン電極３５４は窒化ケイ素又は二酸化ケイ素のような絶縁材で分離されている。制御電極３５６はマイクロ流体チャネル３５７の流れの中にある。マイクロ流体チャネル３５７のサイズが小さいので、少量のサンプル（一般には１マイクロリットル未満）しか必要としない。サンプル溶液は、重力あるいはマイクロ流体チャネル３５７を通るポンピングにより一定流速でマイクロ流体チャネル３５７を流れる。サンプルは、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、又はその他の適切な器具により送圧される。サンプルはまた、圧縮空気又は窒素レギュレータを用いてマイクロ流体チャネル３５７を強制的に流れるようにしてもよい。サンプルは、およそ１から１００μｌ／分の割合で送圧される。
【００６１】
ここで使用される用語「ナノワイヤ」は、その全体が本明細書に組み込まれている米国特許第７，３８５，２６７号に記載されており、この特許は、ナノワイヤを、長さに沿った任意の点における細長いナノスケール半導体と定義しており、少なくとも一の断面の寸法を有し、いくつかの実施例においては、直交する二つの断面の寸法が５００ｎｍより小さく、好ましくは２００ｎｍより小さく、より好ましくは１５０ｎｍより小さく、さらにより好ましくは１００ｎｍより小さく、さらにより好ましくは７０ｎｍより小さく、さらにより好ましくは５０ｎｍより小さく、さらにより好ましくは２０ｎｍより小さく、さらにより好ましくは１０ｎｍより小さく、５ｎｍより小さくてもよい。別の実施例において、断面寸法は２ｎｍ又は１ｎｍより小さくてもよい。いくつかの実施例において、ナノワイヤの少なくとも一の断面の寸法は０．５ｎｍから２００ｎｍの範囲である。ナノワイヤがコア及び外側領域を有する場合には、上記寸法はコア領域に関する寸法である。細長い半導体の断面は任意の形状を有しており、円形、正方形、矩形、楕円、及び管状を含むがこれらに限定されるものではない。規則的な又は不規則的な形状も含まれる。本発明のナノワイヤを作ることのできる材料の非限定的なリストを以下に表記する。ナノチューブは、本発明で用いるクラスのナノワイヤであり、一実施例では、本発明の器具はナノチューブに見合ったスケールのワイヤを具える。ここで使用する「ナノチューブ」は、空洞のコアを有するナノワイヤであり、当業者に知られているナノチューブを含む。「非ナノチューブナノワイヤ」は、ナノチューブではないナノワイヤである。本発明のいくつかの実施例では、非改質表面（ナノワイヤが置かれている環境でナノチューブに本来備わっていない補助反応の実体は含まない）を有する非ナノチューブナノワイヤが、ナノワイヤ又はナノチューブを使用できるここに記載された本発明の構成において使用されている。「ワイヤ」とは、少なくとも半導体又は金属が有する導電性を持つ材料をいう。「導電性」ワイヤ又はナノワイヤに関連して用いられる「導電性の」、「導体」、又は「導電体」の用語は、それ自身を電荷が通過するワイヤの能力を意味する。導電性材料は、約１０−３より低い抵抗を有し、約１０−４より低い抵抗がより好ましく、約１０−６又は１０−７Ωｍより低い抵抗が最も好ましい。
【００６２】
ナノワイヤ３５５は、特に規定がない限り、カーボンナノチューブ、ナノロッド、ナノワイヤ、有機と無機の導電性又は半導体ポリマー、その他を含む。分子ワイヤではないが、様々なナノスケール寸法を有するその他の導電性又は半導体要素も、例えば主属及び金属原子ベースのワイヤ状シリコン、遷移金属含有ワイヤ、ガリウムヒ素、窒化ガリウム、リン化インジウム、ゲルマニウム、セレン化カドニウム構造、又はその他の適切な組成物などの、無機構造の場合に使用することができる。これらの多種多様なナノワイヤやその他のナノワイヤは、過度な実験をすることなしにナノワイヤを含むここに記載した技術に類似する方法で、電子デバイスに有用なパターンで表面上に成長させる及び／又は塗布することができる。ナノワイヤ３５５の長さは、少なくとも１μｍ、好ましくは少なくとも３μｍ、より好ましくは少なくとも５μｍ、さらに好ましくは１０又は２０μｍ、厚さ（高さと幅）は、約１００ｎｍより小さいことが好ましく、より好ましくは約７５ｎｍより小さく、より好ましいのは約５０ｎｍより小さく、さらに好ましいのは約２５ｎｍより小さい。ナノワイヤ３５５のアスペクト比（厚さに対する長さ）は、少なくとも約２：１であるべきで、好ましくは約１０：１より大きく、より好ましくは約１０００：１より大きい。
【００６３】
ナノワイヤ３５５は、シリコンナノワイヤ（ＳｉＮＷ）であるのが好ましく、シリコン非ナノチューブ（中実）ナノワイヤであるのが好ましい。しかし、任意の適切な材料を使うことができる。
【００６４】
ナノワイヤ３５５を製造する技術には、多くの方法が利用可能であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第７，３０１，１９９号及び米国特許第７，４１０，９０４号などを参照されたい。気相−液相−固相（ＶＬＳ）方によるバルク材料としてナノワイヤを成長させる「ボトムアップ」法のような方法が利用可能である。この方法は、高品質なナノワイヤを製造するが、長さと直径が均質なナノワイヤを製造することが困難である。また、所望のスポット上にナノワイヤを配置し、電極を具える、ナノワイヤセンサ３５０の他の部品と整列させることが困難であり、それがデバイス間の均一性の低下を引き起こす（ガオら著、「分析化学」、２００７年発行、７９号、３２９１−７頁）。使用できるその他の方法は、電子ビームリソグラフィー及びウエット／ドライエッチングに基づく「トップダウン」法である。ナノワイヤのサイズと配置がより制御しやすく、従って製造に関して高スループット及び自動化が可能であるため、後者の方法がより好ましい。
【００６５】
様々な実施例において、以下の例及び組み合わせを含む様々な方法を用いて制御電極３５６を製造している：インプリンティング、リソグラフィー、化学蒸着（ＣＶＤ）、エッチング、レーザー切断、アーク放電、及び／又は電気化学的方法。制御電極３５６は、５μｍ×５μｍから５００μｍ×５００μｍの範囲の大きさを有しており、約５０μｍ×５０μｍ（長さ×幅）、又はその他の適切な大きさが好ましい。制御電極３５６は、例えば約１０μｍから約２００μｍの適切な厚さを有する。
【００６６】
制御電極３５６を「機能性物質」でコーティングする工程を、ここでは「機能化」と呼び、コーティングされた制御電極を「機能化された」という。機能性物質は、例えばチオール基、例えばデオキシリボ核酸即ち「ＤＮＡ」、ペプチド核酸即ち「ＰＮＡ」、リボ核酸即ち「ＲＮＡ」などの核酸、アプタマー、ホルモン、炭水化物、タンパク質、抗体、抗原、分子受容体、及び／又は細胞表面結合部位といった対象となる化学的又は生化学的スピーシーズと結合していくつかの生化学的例を提供する。本発明では、結合部位を形成するために制御電極３５６に結合された機能性物質は、サンプル中のターゲット分子に特異的又は相補的である。例えば第一の電着した金でできた機能性物質は、チオール末端ＰＮＡ機能性物質であるか又はこれに結合しており、次に分析中のサンプル内の相補的ＤＮＡターゲット分子に結合する。制御電極３５６は、約０．１μｍから約１００μｍのＰＮＡ、好ましくは約１μｍから約１０μｍのＰＮＡに結合させることができる。
【００６７】
ＳｉＮＷと非金属制御電極３５６は、ｐ型又はｎ型のドーパントでドープすることができる。制御電極３５６の表面は、捕捉剤、例えばＫ−ｒａｓ突然変異ｓｓＤＮＡなど予め選択されたＤＮＡ配列に相補的な配列を含むＰＮＡで改質することができる。
【００６８】
ナノワイヤ３５５又は制御電極３５６は又はその両方をドープすることができる。スピン−オンドーパントに基づくドーピングとイオン注入の二の方法でナノワイヤ３５５及び／又は制御電極３５６をドープしてさらなる最適化を行うことができる。スピン−オンドーパント法は、基板をｐ型またはｎ型スピン−オンドーパント溶液でスピンコートし、高温で拡散工程を行う。最終ドーピングレベルは、熱工程の温度と時間によって決まる。イオン注入の場合は、ホウ素、リン、ヒ素のような高エネルギーイオンを、加速器内の様々なガス源からつくって、基板に向ける。イオンは、基板の表面近傍の領域に注入される。どちらの方法でも良い結果が与えることが報告されている（ガオら著、「分析化学」２００７年、７９号：３２９１−７頁及び「ナノ文学」、２００６年、６（６）：１０９６−１１００頁）。最適ドーピングレベルは、四点深針測定に基づいて選択することができる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、ロバートＦ．ピエレら著、「半導体デバイスの基礎」、Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ社、３章、８５−８９頁及びセクション３．１．４と佐藤ら著、「表面分析ジャーナル」、２００４年、１１（２）５８−６１を参照されたい）。約１０１８ホール又はドナーａｔｏｍｓ／ｃｍ３のドーピングレベルを、最適化の開始点として用いることができる。ドーピングレベルは、必要に応じて増やす又は減らすことができる。
【００６９】
合成ペプチド核酸オリゴマー（ＰＮＡｓ）は、色々なソースから商業的に入手することができる。本発明においては、ＰＮＡｓを制御電極３５６に結合させて結合部位を形成することができる。ＰＮＡｓは、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはｓｓＤＮＡといったサンプルのターゲット分子中の予め選択されたヌクレオチド配列に特異的／相補的である。本発明で用いられるＰＮＡｓは、サンプル中に存在するターゲットＤＮＡに特異的に結合するのに適した長さと配列、例えば約５から約７５、好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド、を有し、ターゲットＤＮＡ中の予め選択された配列に８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の相補性を有するのが好ましい。予め選択された配列と１００％の相補性を有するＰＮＡｓの配列が好ましい。ＰＮＡは配列番号：２、３、４、５、又は６の相補体又はいずれか一つ有する配列を具えることができる。ターゲットＤＮＡの予め選択された配列と制御電極３５６に付着したＰＮＡとの間の１塩基のミスマッチを検出するのに適した条件下で、ターゲットＤＮＡを制御電極３５６に付着させたＰＮＡとハイブリダイズするのが好ましい。この条件は、例えば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、のような低塩ハイブリダイゼーション条件又は同等の条件であることが好ましい。
【００７０】
複数のナノワイヤセンサ３５０を用いることができ、各センサはサンプル中の色々なターゲット分子を検出するよう設計されている。検知デバイスはまた、複数のＮＷ−ＦＥＴを具えており、各ＮＷ−ＦＥＴは色々なターゲット分子を検出するよう設計されている。例えば、本明細書に記載されているように検知デバイスは複数のＮＷ−ＦＥＴを具えており、各ＮＷ−ＦＥＴは配列番号：２−６のうちの一の配列を含むターゲット分子用の結合部位で機能化された制御電極３５６を含んでいる。
【００７１】
用語「サンプル」は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる米国特許第７，３８５，２６７号に記載されており、任意の細胞、細胞培養培地、組織、又は生体起源の流体（「生体サンプル」）、又はその他の媒体、例えば血漿、血清、又は水のように本発明に従って診断されうる生物学的又は非生物学的な媒体をいう。サンプルは、これに限定するものではないが、有機体由来の生体サンプル（例えば、ヒト、非ヒトほ乳類、無脊椎動物、植物、菌類、藻類、バクテリア、ウイルスなど）、ヒトが消費するために作られた食品由来のサンプル、家畜の餌などの動物が消費するために作られた食料由来のサンプル、ミルク、臓器提供サンプル、輸血用の血液サンプル、水道水サンプル、又は同様のものを含む。サンプルの一例は、特別な核酸配列の有無を判断するためにヒト又は動物から採取したサンプルである。
【００７２】
サンプルは、血液、血漿、又は血清サンプルが好ましく、膵臓腫瘍のような腫瘍を有する又は疑いのある被験者由来の血液、血漿、又は血清サンプルがより好ましい。サンプルは、均質化され、溶液中に入れた組織サンプルであってもよい。
【００７３】
ナノワイヤセンサ３５０は、以下のように製造することができる。
【００７４】
電極上のＰＮＡの固定化：固定化は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）により特徴付けられる。ＸＰＳは、化学物質だけでなく薄層の構造特性を評価するｅｘ−ｓｉｔｕ法である。ＨＳ−ｓｓＰＮＡ固定化の後、表面上で定量分析を行うこともできる。表面の被覆率の変化をモニタして、ＨＳ−ｓｓＰＮＡ単分子層と遮断剤（メルカプトエタノール）を含む混合自己組織化ＰＮＡ単分子層を監視することで見出される。フーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）分光法は、分子のフィンガープリント配向について追加の情報を提供する。これらの二つの方法に基づいて、表面の状態をＰＮＡ配向性だけでなく被覆率の観点から決定することができる。
【００７５】
絶縁層の形成：測定は溶液相で行われるので、金属電極は液体にさらされることから保護される。窒化シリコンと酸化シリコンは、この目的のための最も一般的な材料である。薄層蒸着は、例えばＰＥＣＶＤを用いたものが最適である。２層リフト−オフ法は、パターン化した絶縁層を形成するのに用いられる。下層は、スピンコートされ、フォトレジストが続いて行われる。同じ露出条件と現像条件では、下層は、フォトレジストよりも容易で速く発現する。浮遊フォトレジストパターンは、金属蒸着ステップの間はマスクとして機能し、金属蒸着の後は基板上に新しく形成された金属パターンの周りにスペースを提供する。薄層を異方的に形成し、続いてリフト−オフされるＰＥＣＶＤ工程の後、金属電極パターンは窒化シリコン又は酸化シリコンで覆われる。
【００７６】
ドーピング工程：少なくとも二の異なるドーピング法：スピンオンドーパント法とイオン注入法が適している。ドーピングの後、四点深針測定によりおよそのドーピングレベルを計算する。層のシート抵抗ｐｓを測定する。四本の深針は直線状に配置される。外側の二つの深針へ定電流を印加しながら内側の二つの深針で定電流を維持する電圧を測定する。電流値と電圧値の関係から、シート抵抗を計算する。ドーピングレベルは、抵抗率対ドーパント濃度曲線から計算する。ドーピングレベルの初期目標は、１０１８／ｃｍ３となる。目的のドーピングレベルは、バックゲート測定からＮＷ−ＦＥＴのゲート性能に基づいて調整する。
【００７７】
ナノワイヤＦＥＴデバイス：電子ビームリソグラフィーと様々なエッチング法を用いて、ナノワイヤをつくることができる。ナノワイヤを製造した後、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影してナノワイヤを特徴付ける。次いで金属電極を例えば、電子ビームリソグラフィー、フォトリソグラフィー、及びリフトオフ法によって規定する。ここでもパターンサイズと質を例えばＳＥＭを用いてモニタする。電気的性能は、電流−電圧測定及びバックゲート測定によりテストする。ドーピングレベルは、ゲート性能に基づいて変化する。
【００７８】
絶縁層：金属電極の全体被覆率を、例えばＳＥＭ画像により確認することができる。同様に電気的絶縁も例えば液体中の電流−電圧測定によりチェックすることができる。
【実施例５】
【００７９】
［ターゲット分子］
膵臓癌に関連する４つの重要なＫ−ｒａｓ点突然変異（以下＃１−４という）がある。追加の点突然変異（以下＃５という）は、膵臓癌中に生じる頻度が極端に低い。ターゲットオリゴヌクレオチドは、Ｋ−ｒａｓの核酸配列を少なくとも約２０−５０ヌクレオチド含み、４つの突然変異（＃１−４）の少なくとも１つを含んでいる。Ｋ−ｒａｓの核酸配列を少なくとも約２０−５０ヌクレオチド含み、＃５突然変異を含むターゲットヌクレオチドは、膵臓癌検出の特異性を高めるネガティブコントロールとして機能する。
【００８０】
以下に記載され、約２０−５０ヌクレオチドを含む各突然変異＃１−５に対する相補的ＰＮＡｓも合成される。すべての合成オリゴヌクレオチドは、市販されている。
【００８１】
【００８２】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）固定化戦略
ＰＮＡがＤＮＡを一塩基の感度で検出できること（ワングら著、「米国化学会誌」１９９６年、１１８（３３）、７６６７−７６７０頁）、及び金表面上の一本鎖ＰＮＡの秩序自己組織化単分子層（ＳＡＭｓ）が、相補的ｓｓＤＮＡの特異的認識を表していること（ブリオネスら著、「米国物理学会速報誌」２００４年、９３（２０）：２０８１０３）が示されている。ＰＮＡは、ＤＮＡに対して高い結合親和性を有するので、ここでは結合部位として使用されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるブリオネスら著、米国物理学会速報誌、９３、２０８１０３（２００４）に基本的に記載されているように、単分子層を形成するチオールベースの固定化を使用して、ＰＮＡは制御電極３５６の表面に固定化されている。単分子層を形成するための条件は、ＰＮＡ濃度、スペーサの長さ、及びＰＮＡ固定化の後に制御電極の表面を遮断するために用いられるチオール溶液に基づいて最適化される。
【００８３】
ＰＮＡ濃度は、例えば約０．１μｍから約１０μｍに適度にパックされた単分子層を形成するように最適化される。ＰＮＡ濃度が高すぎると金表面が完全に覆われるので、立体効果により結合効率が低下する。
【００８４】
スペーサ効果：ナノ表面上の結合の特徴は、バルク溶液内の特徴とは、非常に異なっている。結合に対するウォール効果を減少させ、ＰＮＡｓにさらなる適応性を与える８−アミノ−３，６，−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ酸のスペーサは、ＰＮＡに含まれており、８−アミノ−３，６，−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ酸の二量体及び三量体などマルチマーは、結合分析用のスペーサの長さを最適化するために使用される。
【００８５】
チオール溶液阻害効果：その後のＤＮＡハイブリダイゼーションを成功させるべくチオールＰＮＡを固定化した後、制御電極の金表面を遮断するために、メルカプトエタノール溶液を遮断剤として使用する。図９Ｃは、混合したＰＮＡのＳＡＭとメルカプトエタノールを示す略図である。
【００８６】
マイクロ流体デバイスの設計とプロセス
開始サンプルとサンプル処理
サンプルを、マイクロ流体デバイスに加えて、約１μｍのサイズの孔２３７により血漿を血液細胞と血小板から分離して、第二分離チャンバ２４５に入れる。
【００８７】
サンプルは、チャネル２４８の壁にシリコン又はガラスが結合しているチャネル２４８に流入するか、送圧される。充分に飽和したカオトロピック試薬（例えばヨウ化ナトリウムと塩化グアニジウム試薬）をサンプルと混合させて、ＤＮＡをガラス表面に結合させるために充分な時間と温度である、約５分間、２５℃でサンプルをチャネル２４８に接触させる。結合条件と時間は、さらに最適化することができる。カオトロピック塩の存在下でのガラスまたはシリカ表面へのＤＮＡの吸着は、フォーゲルとガレスピー（フォーゲルら著、「米国科学アカデミー紀要」１９７９年、７６（２）６１５−６１９頁）による、ガラス粉を用いてアガロ−スからＤＮＡフラグメントを精製する彼らの研究に最初に記載されている。
【００８８】
結合したＤＮＡを有するマイクロ流体チャネルを、５０％のエタノールと５０％のバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の混合液で洗浄してヨウ化ナトリウムを取り除く。次いで脱イオン水又は低塩溶出バッファでシリコン又はガラスからＤＮＡを溶出する。ターゲットＤＮＡを検知デバイスに運ぶ溶出バッファの塩とｐＨは、制御電極に結合されてるＰＮＡにターゲットＤＮＡがハイブリダイゼーションするのに適切な、例えば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に調整される。溶出されたＤＮＡを運ぶ塩とｐＨを調整したハイブリダイゼーション溶液は、マイクロ流体チャネル３５７を通ってナノワイヤセンサ３５０に流れ、又は送圧され、そこで予め選択されたターゲット分子に特異的なペプチド核酸分子で機能化された制御電極３５６に接触して、ターゲットＤＮＡがＰＮＡにハイブリダイズする。
【００８９】
シリコンナノワイヤベースのセンサ設計／開発
本発明の検知デバイスのターゲット分子を結合するナノワイヤ３５５と制御電極３５６は、物理的に分離されている。ナノワイヤセンサ３５０の実施例の概略図を図９Ａに示す。図示したように、ナノワイヤセンサ３５０は、二つの構成要素：ソース電極３５３とドレイン電極３５４の間に配置されたナノワイヤ３５５と、制御電極３５６によって作動する。ターゲット分子は、適切なハイブリダイズ条件下で制御電極３５６の表面に結合されてるＰＮＡｓにハイブリダイズする。ＳｉＮＷ−ＦＥＴは、制御電極３５６と、変化したゲート応答によるナノワイヤ３５５表面の電気容量の変化を検出する。コレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）が制御電極３５６に印加されて、ナノワイヤ３５５上にイオン二重層がイオンの移動によって形成される。この現象はゲート電圧として機能し、ナノワイヤ３５５内の電荷密度の変化を誘発する。ＤＮＡターゲット分子が制御電極３５６の結合部位に結合すると、制御電極３５６とナノワイヤ３５５間の容量が変化し、コレクタエミッタ間電圧（ＶＣＥ）に対するナノワイヤ３５５からのゲート応答も変化する。例えば電圧計で電流を監視して、ナノワイヤ３５５を通過する導電性を測定することにより、この変化が検出される。
【００９０】
図９Ｂは、ナノワイヤセンサ３５０の応答である伝導度対制御電極電圧の概略図を示す。閾値、Ｖｔｈは、伝導度の線形領域がゼロになるまで線形外挿に基づいて設定されている。制御電極３５６の表面にターゲット分子（ｓｓＤＮＡｓ）が結合すると、制御電極３５６とナノワイヤ３５５表面間の容量が変化する。この容量変化は、ナノワイヤセンサ３５０の出力信号であるナノワイヤ３５５の閾値電圧をシフトする。
【００９１】
分別検出方法
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の点突然変異を検出するため、血液サンプルを分析して単一塩基突然変異を含むＤＮＡを求める。
【００９２】
多くの生体成分から成るヒトの血液サンプルを採取して、抗凝固剤（例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸、ヘパリン）に結合させる。ＥＤＴＡで抗凝固された血液が好ましい。抗凝固血液サンプルを採取して、マイクロ流体デバイスのサイズ排除メカニズムを通過させ、ＤＮＡをマイクロ流体チャネルに結合させて、次いで上記のとおり結合されたＤＮＡを溶出することによって、ＤＮＡをサンプル中の非ＤＮＡ分子から分離する。溶出されたＤＮＡを含むサンプルは、二つのナノワイヤセンサ３５０：ターゲット核酸分子に特異的に結合したＰＮＡを伴う第一ナノワイヤセンサ３５０（サンプルナノワイヤセンサ３５０）と、ターゲット核酸分子に結合したＰＮＡを具えていない第二ナノワイヤセンサ３５０（サンプルナノワイヤセンサ３５０）に、サンプル中のターゲット分子がＰＮＡとハイブリダイズする条件下で、適用される。両方の検知デバイスに同様に影響を与える血液サンプル中のターゲットＤＮＡ以外のシグナルは、ナノスケールで二つのナノワイヤセンサ３５０からの反応差を用いて取り除かれる（サンプルナノワイヤセンサ３５０の信号から制御ナノワイヤセンサ３５０のシグナルを引く）。
【００９３】
一のナノワイヤセンサ内での分別検出と二つのＮＷ−ＦＥＴ
少なくとも二セットのＳｉＮＷ−ＦＥＴと制御電極３５６：第一ＳｉＮＷ−ＦＥＴと捕捉ＰＮＡｓで機能化した第一制御電極３５６から成る一セットと第二ＳｉＮＷ ＦＥＴと捕捉ＰＮＡｓを有さない第二制御電極３５６を含む使い捨ての単回使用テストカードカートリッジ器具を用意する。追加のセットは、追加のＳｉＮＷ−ＦＥＴと様々な捕捉ＰＮＡｓで機能化した制御電極３５６である。ＳｉＮＷ−ＦＥＴは、両方のセットで同じものである（電流−電圧特性とゲート応答に関して同様の性能を有している）。この器具は、同じ入口を共有する少なくとも二つのマイクロ流体チャネルを具える。各チャネルは一のＳｉＮＷ−ＦＥＴを具える。溶出されたＤＮＡサンプルはマイクロ流体チャネルに流れ込み、各チャネル内に配置されたＳｉＮＷ−ＦＥＴからのシグナルを、検出手段で検出して比較する。
【００９４】
本発明のその他の態様は、当業者には明らかであり、ここに繰り返し記載する必要はない。使用されている用語や表現は、説明の用語として使用され用語を限定するものではなく、それらの用語と表現の使用において、ここに記載された特徴の同等物又はこれらの一部を排除することを意図するものではなく、発明の範囲内において様々な修正は可能であると認識される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の成分を分離する器具であって、
複数の孔を規定している濾過表面を有する第一分離チャンバと；
前記第一分離チャンバと流体連通するサンプル入口であって、前記濾過表面に対し実質的に垂直な方向に前記サンプルを前記第一分離チャンバに導入するよう構成されたサンプル入口と；
前記第一分離チャンバと流体連通する捕捉チャネルであって、特にターゲットとされている前記孔より大きい成分の少なくとも一つを選択的に結合させるために捕捉剤で処理された壁を有する捕捉チャネルと；
前記第一分離チャンバと流体連通するバッファ入口であって、前記濾過表面に実質的に平行な方向に前記第一分離チャンバにバッファを導入して前記孔より大きい成分を前記捕捉チャネルに押し出すように構成した前記バッファ入口と；を具え、
前記濾過表面が、前記孔より小さい成分を通過させ、前記孔より大きい成分を前記第一分離チャンバに保持しており；
前記孔より大きい成分が前記捕捉チャネルを通過するときに、前記捕捉チャネルの壁が前記孔より大きい成分の少なくとも一つに選択的に結合することを特徴とする器具。
【請求項２】
前記濾過表面が、約０．０１ｍｌから１０ｍｌのサンプルを受けることができることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項３】
前記濾過表面が、約１ｍｍ×１ｍｍから１００ｍｍ×１００ｍｍのサイズを有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項４】
前記濾過表面が、少なくとも５０％の多孔率を有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項５】
前記サンプルが、全血であることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項６】
前記孔が、約１μｍの直径を有することを特徴とする請求項５に記載の器具。
【請求項７】
前記孔より小さい成分が、血漿を含むことを特徴とする請求項６に記載の器具。
【請求項８】
前記孔が、約５μｍの直径を有することを特徴とする請求項５に記載の器具。
【請求項９】
前記孔より大きい成分が、白血球を含むことを特徴とする請求項８に記載の器具。
【請求項１０】
前記孔が、約１６μｍの直径を有することを特徴とする請求項５に記載の器具。
【請求項１１】
前記孔より大きい成分が、大型白血球及び循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）を含むことを特徴とする請求項１０に記載の器具。
【請求項１２】
前記サンプ入口が、約０．５ｍｍから１０ｍｍの直径を有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１３】
前記捕捉チャネルが、蛇行経路を有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１４】
前記捕捉チャネルが、約２０μｍから１０００μｍの幅を有することを特徴とする請求項１の器具。
【請求項１５】
前記捕捉チャネルが、約０．１ｃｍから１０ｃｍの長さを有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１６】
前記捕捉チャネルが、角度を有する複数のターンを構成することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１７】
前記捕捉剤が、抗体、ペプチド、小分子、又はアプタマーであることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１８】
前記バッファ入口が、バッファトラフを具え、該バッファトラフが、実質的に前記濾過表面の全側部に渡って延びており、前記バッファ入口が、バッファを前記バッファトラフに導入するように構成され、前記バッファトラフが、バッファを前記濾過表面にあふれさせるように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１９】
前記バッファトラフが、実質的に前記濾過表面と同じレベルに配置した頂部を有することを特徴とする請求項１８に記載の器具。
【請求項２０】
前記バッファ入口が、バッファ拡散器を具え、該バッファ拡散器が、実質的に前記濾過表面の全面にわたってバッファを拡げるように構成されていることを特徴とする請求項１に記載に器具。
【請求項２１】
サンプル中の成分を分離する方法であって、
複数の孔を規定している濾過表面を有する第一分離チャンバを提供するステップと；
前記濾過表面に対して実質的に垂直方向に前記第一分離チャンバにサンプルを導入するステップであって、前記濾過表面が、前記孔より小さい成分を通過させ、前記孔より大きい成分を前記第一分離チャンバに保持するステップと；
前記第一分離チャンバと流体連通する捕捉チャネルを提供するステップであって、前記捕捉チャネルが、前記孔より大きい成分の少なくとも一つを選択的に結合させるために捕捉剤で処理された壁を有するステップと；
前記孔より大きい成分を前記捕捉チャネルに押し出すためにバッファを前記濾過表面に対して実質的に平行方向に導入するステップであって、前記孔より大きい成分が前記捕捉チャネルを通過するとき、前記捕捉チャネルの壁が前記孔より大きい成分の少なくとも一つと選択的に結合するステップと；を具えることを特徴とする方法。
【請求項２２】
サンプル中の成分を分離する器具であって、
複数の孔を規定している濾過表面を有する第一分離チャンバと；
前記第一分離チャンバと流体連通するサンプル入口であって、前記濾過表面に対して実質的に垂直方向に前記第一分離チャンバにサンプルを導入するよう構成されたサンプル入口と；
前記第一分離チャンバと流体連通するバッファ入口であって、前記孔より大きい成分を前記濾過表面から押し出すために実質的に前記濾過表面に平行方向に前記第一分離チャンバにバッファを導入するように構成されたバッファ入口と；を具え、
前記濾過表面が、前記孔より小さい成分を通過させ、前記孔より大きい成分を第一分離チャンバに保持していることを特徴とする器具。
【請求項２３】
請求項２２に記載の器具がさらに、
前記第一分離チャンバと流体連通する捕捉チャネルであって、前記濾過表面から前記孔より大きい成分を受けるように構成され、前記孔より大きい成分の少なくとも一つを選択的に結合するよう捕捉剤で処理された壁を有する捕捉チャネルであって、当該捕捉チャネルの壁が、前記孔より大きい成分が前記捕捉チャネルを通過するときに、前記孔より大きい成分の少なくとも一つを選択的に結合させる、捕捉チャネルを具えることを特徴とする器具。
【請求項２４】
サンプル中の特定の物質の量を定量化する器具であって、
ベースと；
前記ベースに接続されたソース電極と；
前記ベースに接続されたドレイン電極であって、前記ソース電極より低い電位を有するドレイン電極と；
前記ソース電極及び前記ドレイン電極に接続された半導体ナノワイヤと；及び
前記ベースに接続された制御電極と；を具え、
前記制御電極の表面の少なくとも一部が前記物質に選択的に結合する捕捉剤で処理されており、
前記ナノワイヤを流れる電流の量が、前記制御電極に印加された電圧に対応し、前記制御電極に結合された前記物質の量に影響されることを特徴とする器具。
【請求項２５】
前記ナノワイヤが、約１ｎｍから０．９９μｍの幅を有することを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項２６】
前記ナノワイヤが、約１０１６から１０２０のホール又はドナーａｔｏｍｓ／ｃｍ３のレベルまでドープされることを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項２７】
前記制御電極が、約５μｍ×５μｍから約５００μｍ×５００μｍの長さと幅を有することを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項２８】
前記制御電極が、約１０ｎｍから２００ｎｍの厚さを有することを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項２９】
前記捕捉剤が、生体分子に結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、アプタマー、又は小ペプチドであることを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項３０】
前記制御電極上の前記捕捉剤が、約０．１ｎｍから１００ｎｍの厚さを有する層を形成していることを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項３１】
サンプル中の特定の物質の量を定量化する器具であって、
サンプルを含有するよう構成されたテストチャンバと；
ソース電極と；
ドレイン電極であって、前記ソース電極より低い電位を有する前記ドレイン電極と；
前記テストチャンバ内に少なくとも部分的に配置された半導体ナノワイヤであって、前記ソース電極及び前記ドレイン電極に接続された半導体ナノワイヤと；
前記ナノワイヤを流れる電流の量を測定する検出器と；及び
前記テストチャンバ内に少なくとも部分的に配置された制御電極と；を具え、
前記制御電極の表面の少なくとも一部が、前記物質に選択的に結合する捕捉剤で処理されており、
前記ナノワイヤを通過する電流の量は、前記制御電極に印加された電圧に対応し、前記制御電極に結合する前記物質の量に影響されることを特徴とする器具。
【請求項３２】
前記ナノワイヤが、約１ｎｍから０．９９μｍの幅を有することを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３３】
前記ナノワイヤが、約１０１６から１０２０のホール又はドナーａｔｏｍｓ／ｃｍ３のレベルまでドープされることを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３４】
前記制御電極が、約５μｍ×５μｍから約５００μｍ×５００μｍの長さと幅を有することを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３５】
前記制御電極が、約１０ｎｍから２００ｎｍの厚さを有することを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３６】
前記捕捉剤が、生体分子に結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、アプタマー、又は小ペプチドであることを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３７】
前記制御電極上の前記捕捉剤が、約０．１ｎｍから１００ｎｍの厚さを有する層を形成することを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３８】
サンプル中の粒子を検出する器具であって、
主フローチャネルと；
前記主フローチャネルに流体連通するバッファ導入チャネルであって、前記主フローチャネル内のサンプル中の粒子を流体力学的に集中させるようにバッファを主フローチャネルに導入することができるバッファ導入チャネルと；
主フローチャネルの第一と第二の対向する側にそれぞれ流体連通する第一と第二塩橋チャンバであって、少なくとも部分的に寒天が充填されている第一と第二塩橋チャンバと；
前記第一と第二塩橋チャンバにそれぞれ流体連通する第一と第二電解質チャンバであって、少なくとも部分的に電解質が充填されている第一と第二電解質チャンバと；
前記第一と第二電解質チャンバ内にそれぞれ配置された第一と第二電極であって、励起シグナルを前記第一と第二電解質チャンバ及び記第一と第二塩橋チャンバにそれぞれ適用することができる第一と第二電極と；
前記第一と第二塩橋チャンバ間のインピーダンスを測定するために前記第一と第二電極に接続されたインピーダンス分析器と；を具え、
前記主フローチャネルと前記第一と第二塩橋チャンバを通過する粒子が、前記励起シグナルが適用される間に前記第一と第二塩橋チャンバ間のインピーダンスに検出可能な変化を生じさせることを特徴する器具。
【請求項３９】
前記第一と第二塩橋チャンバが、前記第一と第二の連結チャネルを通って前記主フローチャネルの第一と第二の対向する側に各々流体連通していることを特徴とする請求項３８に記載の器具。
【請求項４０】
前記第一と第二の連結チャネルが、約０．００１ｍｍから０．０５ｍｍの幅を有することを特徴とする請求項３８に記載の器具。
【請求項４１】
前記第一と第二の連結チャネルが、約０．０１ｍｍから０．２ｍｍの長さを有することを特徴請求項３８に記載の器具。
【請求項４２】
請求項３８に記載の器具がさらに、
前記第一と第二塩橋チャンバにそれぞれ連結された第一と第二寒天入口であって、前記第一と第二塩橋チャンバを容易に寒天で充填するように構成された第一と第二寒天入口を具えることを特徴とする器具。
【請求項４３】
前記主フローチャネルが、約０．０５ｍｍから０．５ｍｍの幅を有することを特徴とする請求項３８に記載の器具。
【請求項４４】
前記寒天が、約２−１０％の寒天と１Ｍ ＫＣｌ重量／容量の混合物であることを特徴とする請求項３８に記載の器具。
【請求項４５】
前記励起シグナルが、約０．０１Ｖから１０Ｖの電圧と約５０Ｈｚから１０ｋＨｚの周波数を有することを特徴とする請求項３８に記載の器具。
【請求項４６】
サンプル中の粒子の数を計算する方法であって、
前記粒子を主フローチャネルに流体力学的に集中させるステップと；
前記主フローチャネルの第一と第二の対向する側にそれぞれ流体連通する第一と第二塩橋チャンバに励起シグナルを適用するステップであって、前記第一と第二塩橋チャンバが寒天で充填されているステップと；
前記第一と第二塩橋チャンバ間に前記粒子を通過させるステップと；
前記粒子が前記第一と第二塩橋チャンバ間を通過するとき、前記第一と第二塩橋チャンバ間のインピーダンスの変化を検出することにより前記粒子の数を計算するステップと；を具えることを特徴とする方法。
【請求項４７】
前記粒子が、前記主フローチャネルの中央に集まることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記粒子が、前記主フローチャネルの片側に集まることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項１】
サンプル中の成分を分離する器具であって、
複数の孔を規定している濾過表面を有する第一分離チャンバと；
前記第一分離チャンバと流体連通するサンプル入口であって、前記濾過表面に対し実質的に垂直な方向に前記サンプルを前記第一分離チャンバに導入するよう構成されたサンプル入口と；
前記第一分離チャンバと流体連通する捕捉チャネルであって、特にターゲットとされている前記孔より大きい成分の少なくとも一つを選択的に結合させるために捕捉剤で処理された壁を有する捕捉チャネルと；
前記第一分離チャンバと流体連通するバッファ入口であって、前記濾過表面に実質的に平行な方向に前記第一分離チャンバにバッファを導入して前記孔より大きい成分を前記捕捉チャネルに押し出すように構成した前記バッファ入口と；を具え、
前記濾過表面が、前記孔より小さい成分を通過させ、前記孔より大きい成分を前記第一分離チャンバに保持しており；
前記孔より大きい成分が前記捕捉チャネルを通過するときに、前記捕捉チャネルの壁が前記孔より大きい成分の少なくとも一つに選択的に結合することを特徴とする器具。
【請求項２】
前記濾過表面が、約０．０１ｍｌから１０ｍｌのサンプルを受けることができることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項３】
前記濾過表面が、約１ｍｍ×１ｍｍから１００ｍｍ×１００ｍｍのサイズを有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項４】
前記濾過表面が、少なくとも５０％の多孔率を有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項５】
前記サンプルが、全血であることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項６】
前記孔が、約１μｍの直径を有することを特徴とする請求項５に記載の器具。
【請求項７】
前記孔より小さい成分が、血漿を含むことを特徴とする請求項６に記載の器具。
【請求項８】
前記孔が、約５μｍの直径を有することを特徴とする請求項５に記載の器具。
【請求項９】
前記孔より大きい成分が、白血球を含むことを特徴とする請求項８に記載の器具。
【請求項１０】
前記孔が、約１６μｍの直径を有することを特徴とする請求項５に記載の器具。
【請求項１１】
前記孔より大きい成分が、大型白血球及び循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）を含むことを特徴とする請求項１０に記載の器具。
【請求項１２】
前記サンプ入口が、約０．５ｍｍから１０ｍｍの直径を有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１３】
前記捕捉チャネルが、蛇行経路を有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１４】
前記捕捉チャネルが、約２０μｍから１０００μｍの幅を有することを特徴とする請求項１の器具。
【請求項１５】
前記捕捉チャネルが、約０．１ｃｍから１０ｃｍの長さを有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１６】
前記捕捉チャネルが、角度を有する複数のターンを構成することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１７】
前記捕捉剤が、抗体、ペプチド、小分子、又はアプタマーであることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１８】
前記バッファ入口が、バッファトラフを具え、該バッファトラフが、実質的に前記濾過表面の全側部に渡って延びており、前記バッファ入口が、バッファを前記バッファトラフに導入するように構成され、前記バッファトラフが、バッファを前記濾過表面にあふれさせるように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１９】
前記バッファトラフが、実質的に前記濾過表面と同じレベルに配置した頂部を有することを特徴とする請求項１８に記載の器具。
【請求項２０】
前記バッファ入口が、バッファ拡散器を具え、該バッファ拡散器が、実質的に前記濾過表面の全面にわたってバッファを拡げるように構成されていることを特徴とする請求項１に記載に器具。
【請求項２１】
サンプル中の成分を分離する方法であって、
複数の孔を規定している濾過表面を有する第一分離チャンバを提供するステップと；
前記濾過表面に対して実質的に垂直方向に前記第一分離チャンバにサンプルを導入するステップであって、前記濾過表面が、前記孔より小さい成分を通過させ、前記孔より大きい成分を前記第一分離チャンバに保持するステップと；
前記第一分離チャンバと流体連通する捕捉チャネルを提供するステップであって、前記捕捉チャネルが、前記孔より大きい成分の少なくとも一つを選択的に結合させるために捕捉剤で処理された壁を有するステップと；
前記孔より大きい成分を前記捕捉チャネルに押し出すためにバッファを前記濾過表面に対して実質的に平行方向に導入するステップであって、前記孔より大きい成分が前記捕捉チャネルを通過するとき、前記捕捉チャネルの壁が前記孔より大きい成分の少なくとも一つと選択的に結合するステップと；を具えることを特徴とする方法。
【請求項２２】
サンプル中の成分を分離する器具であって、
複数の孔を規定している濾過表面を有する第一分離チャンバと；
前記第一分離チャンバと流体連通するサンプル入口であって、前記濾過表面に対して実質的に垂直方向に前記第一分離チャンバにサンプルを導入するよう構成されたサンプル入口と；
前記第一分離チャンバと流体連通するバッファ入口であって、前記孔より大きい成分を前記濾過表面から押し出すために実質的に前記濾過表面に平行方向に前記第一分離チャンバにバッファを導入するように構成されたバッファ入口と；を具え、
前記濾過表面が、前記孔より小さい成分を通過させ、前記孔より大きい成分を第一分離チャンバに保持していることを特徴とする器具。
【請求項２３】
請求項２２に記載の器具がさらに、
前記第一分離チャンバと流体連通する捕捉チャネルであって、前記濾過表面から前記孔より大きい成分を受けるように構成され、前記孔より大きい成分の少なくとも一つを選択的に結合するよう捕捉剤で処理された壁を有する捕捉チャネルであって、当該捕捉チャネルの壁が、前記孔より大きい成分が前記捕捉チャネルを通過するときに、前記孔より大きい成分の少なくとも一つを選択的に結合させる、捕捉チャネルを具えることを特徴とする器具。
【請求項２４】
サンプル中の特定の物質の量を定量化する器具であって、
ベースと；
前記ベースに接続されたソース電極と；
前記ベースに接続されたドレイン電極であって、前記ソース電極より低い電位を有するドレイン電極と；
前記ソース電極及び前記ドレイン電極に接続された半導体ナノワイヤと；及び
前記ベースに接続された制御電極と；を具え、
前記制御電極の表面の少なくとも一部が前記物質に選択的に結合する捕捉剤で処理されており、
前記ナノワイヤを流れる電流の量が、前記制御電極に印加された電圧に対応し、前記制御電極に結合された前記物質の量に影響されることを特徴とする器具。
【請求項２５】
前記ナノワイヤが、約１ｎｍから０．９９μｍの幅を有することを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項２６】
前記ナノワイヤが、約１０１６から１０２０のホール又はドナーａｔｏｍｓ／ｃｍ３のレベルまでドープされることを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項２７】
前記制御電極が、約５μｍ×５μｍから約５００μｍ×５００μｍの長さと幅を有することを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項２８】
前記制御電極が、約１０ｎｍから２００ｎｍの厚さを有することを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項２９】
前記捕捉剤が、生体分子に結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、アプタマー、又は小ペプチドであることを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項３０】
前記制御電極上の前記捕捉剤が、約０．１ｎｍから１００ｎｍの厚さを有する層を形成していることを特徴とする請求項２４に記載の器具。
【請求項３１】
サンプル中の特定の物質の量を定量化する器具であって、
サンプルを含有するよう構成されたテストチャンバと；
ソース電極と；
ドレイン電極であって、前記ソース電極より低い電位を有する前記ドレイン電極と；
前記テストチャンバ内に少なくとも部分的に配置された半導体ナノワイヤであって、前記ソース電極及び前記ドレイン電極に接続された半導体ナノワイヤと；
前記ナノワイヤを流れる電流の量を測定する検出器と；及び
前記テストチャンバ内に少なくとも部分的に配置された制御電極と；を具え、
前記制御電極の表面の少なくとも一部が、前記物質に選択的に結合する捕捉剤で処理されており、
前記ナノワイヤを通過する電流の量は、前記制御電極に印加された電圧に対応し、前記制御電極に結合する前記物質の量に影響されることを特徴とする器具。
【請求項３２】
前記ナノワイヤが、約１ｎｍから０．９９μｍの幅を有することを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３３】
前記ナノワイヤが、約１０１６から１０２０のホール又はドナーａｔｏｍｓ／ｃｍ３のレベルまでドープされることを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３４】
前記制御電極が、約５μｍ×５μｍから約５００μｍ×５００μｍの長さと幅を有することを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３５】
前記制御電極が、約１０ｎｍから２００ｎｍの厚さを有することを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３６】
前記捕捉剤が、生体分子に結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、アプタマー、又は小ペプチドであることを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３７】
前記制御電極上の前記捕捉剤が、約０．１ｎｍから１００ｎｍの厚さを有する層を形成することを特徴とする請求項３１に記載の器具。
【請求項３８】
サンプル中の粒子を検出する器具であって、
主フローチャネルと；
前記主フローチャネルに流体連通するバッファ導入チャネルであって、前記主フローチャネル内のサンプル中の粒子を流体力学的に集中させるようにバッファを主フローチャネルに導入することができるバッファ導入チャネルと；
主フローチャネルの第一と第二の対向する側にそれぞれ流体連通する第一と第二塩橋チャンバであって、少なくとも部分的に寒天が充填されている第一と第二塩橋チャンバと；
前記第一と第二塩橋チャンバにそれぞれ流体連通する第一と第二電解質チャンバであって、少なくとも部分的に電解質が充填されている第一と第二電解質チャンバと；
前記第一と第二電解質チャンバ内にそれぞれ配置された第一と第二電極であって、励起シグナルを前記第一と第二電解質チャンバ及び記第一と第二塩橋チャンバにそれぞれ適用することができる第一と第二電極と；
前記第一と第二塩橋チャンバ間のインピーダンスを測定するために前記第一と第二電極に接続されたインピーダンス分析器と；を具え、
前記主フローチャネルと前記第一と第二塩橋チャンバを通過する粒子が、前記励起シグナルが適用される間に前記第一と第二塩橋チャンバ間のインピーダンスに検出可能な変化を生じさせることを特徴する器具。
【請求項３９】
前記第一と第二塩橋チャンバが、前記第一と第二の連結チャネルを通って前記主フローチャネルの第一と第二の対向する側に各々流体連通していることを特徴とする請求項３８に記載の器具。
【請求項４０】
前記第一と第二の連結チャネルが、約０．００１ｍｍから０．０５ｍｍの幅を有することを特徴とする請求項３８に記載の器具。
【請求項４１】
前記第一と第二の連結チャネルが、約０．０１ｍｍから０．２ｍｍの長さを有することを特徴請求項３８に記載の器具。
【請求項４２】
請求項３８に記載の器具がさらに、
前記第一と第二塩橋チャンバにそれぞれ連結された第一と第二寒天入口であって、前記第一と第二塩橋チャンバを容易に寒天で充填するように構成された第一と第二寒天入口を具えることを特徴とする器具。
【請求項４３】
前記主フローチャネルが、約０．０５ｍｍから０．５ｍｍの幅を有することを特徴とする請求項３８に記載の器具。
【請求項４４】
前記寒天が、約２−１０％の寒天と１Ｍ ＫＣｌ重量／容量の混合物であることを特徴とする請求項３８に記載の器具。
【請求項４５】
前記励起シグナルが、約０．０１Ｖから１０Ｖの電圧と約５０Ｈｚから１０ｋＨｚの周波数を有することを特徴とする請求項３８に記載の器具。
【請求項４６】
サンプル中の粒子の数を計算する方法であって、
前記粒子を主フローチャネルに流体力学的に集中させるステップと；
前記主フローチャネルの第一と第二の対向する側にそれぞれ流体連通する第一と第二塩橋チャンバに励起シグナルを適用するステップであって、前記第一と第二塩橋チャンバが寒天で充填されているステップと；
前記第一と第二塩橋チャンバ間に前記粒子を通過させるステップと；
前記粒子が前記第一と第二塩橋チャンバ間を通過するとき、前記第一と第二塩橋チャンバ間のインピーダンスの変化を検出することにより前記粒子の数を計算するステップと；を具えることを特徴とする方法。
【請求項４７】
前記粒子が、前記主フローチャネルの中央に集まることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記粒子が、前記主フローチャネルの片側に集まることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【公表番号】特表２０１２−５１１１５６（Ｐ２０１２−５１１１５６Ａ）
【公表日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３９７７９（Ｐ２０１１−５３９７７９）
【出願日】平成２１年１２月７日（２００９．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７０２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６５９６７
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１１１３０６６７）ナノアイヴイディー，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＯＩＶＤ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月７日（２００９．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７０２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６５９６７
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１１１３０６６７）ナノアイヴイディー，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＯＩＶＤ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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