ポリヌクレオチドの配列の決定
標的ポリヌクレオチドの配列は，以下のようにして決定することができる：
（ｉ）標的ポリヌクレオチドを，ポリメラーゼ反応が進行するのに適した条件下で，ポリメラーゼ酵素およびヌクレオチドＡ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣのいずれか１つと接触させ；（ｉｉ）ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合し，続いて標的ポリヌクレオチドから解離するのに要した時間を測定し，このことによりポリメラーゼがヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド上に取り込ませたか否かを判定し；（ｉｉｉ）追加のヌクレオチドを用いて任意に工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返し，このことにより標的ポリヌクレオチドの配列を同定する。
（ｉ）標的ポリヌクレオチドを，ポリメラーゼ反応が進行するのに適した条件下で，ポリメラーゼ酵素およびヌクレオチドＡ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣのいずれか１つと接触させ；（ｉｉ）ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合し，続いて標的ポリヌクレオチドから解離するのに要した時間を測定し，このことによりポリメラーゼがヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド上に取り込ませたか否かを判定し；（ｉｉｉ）追加のヌクレオチドを用いて任意に工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返し，このことにより標的ポリヌクレオチドの配列を同定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は，ポリヌクレオチドの配列を決定する方法，またはポリヌクレオチド配列間の変動を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ポリヌクレオチドの配列を決定する能力は，今やヒトゲノムの３０億塩基の全配列を決定したヒトゲノムプロジェクトにより示されているように，科学において非常に重要である。しかし，この配列情報は平均的なヒトを表しており，遺伝子レベルで個体間の相違を理解することが強く求められている。
【０００３】
一般に，大規模ＤＮＡ配列決定に用いられている主な方法は，鎖終止法である。この方法は，最初にＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎにより開発され（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７７；７４：５４６３−５４６７），４種類のヌクレオシド三リン酸のジデオキシ誘導体を使用して，これをポリメラーゼ連鎖反応において発生しつつあるポリヌクレオチド鎖に取り込ませる。ジデオキシ誘導体が取り込まれると，これはポリメラーゼ反応を停止させる。次に生成物をゲル電気泳動により分離し，分析して，特定のジデオキシ誘導体が鎖中に取り込まれた位置を明らかにする。
【０００４】
この方法は広く使用されており，信頼性のある結果を与えるが，遅く，労働集約型であり，高価であることが認識されている。さらにこれは，しばしば１つの塩基の変化からなる２つの配列の間の相違（一塩基多型，すなわちＳＮＰとして知られる）を検出するためには有効な方法ではない。
【０００５】
核酸アレイは最近，ポリヌクレオチド配列およびＳＮＰを決定する好ましい方法になってきており，通常はハイブリダイゼーション事象の状況で使用される（Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２：２７−３２）。アレイに基づく多数のシークエンシング方法は，加えられた（ハイブリダイズした）塩基の種類を取得するために，標識されたヌクレオチドを使用する。これらのアレイは，適切に標識された塩基の段階的同定に基づいており，米国特許５６３４４１３において"単一塩基"シークエンシング法と称されている。そのような"単一塩基"方法は，２種類の標識，すなわち，放射性標識および蛍光標識を使用する。ヌクレオチドの放射性標識は高い感度および低いバックグラウンドという利点を有する。しかし，放射性標識は，分解能が低いという欠点がある。
【０００６】
現在，蛍光標識されたヌクレオチドが多くの手法で広く用いられている。そのようなヌクレオチドは，ポリメラーゼ連鎖反応により，発生しつつあるポリヌクレオチド鎖に段階的様式で取り込まれることができる。異なるヌクレオチド（Ａ，Ｔ，ＧおよびＣ）のそれぞれの３’位にユニークな蛍光団を取り込ませ，感度の高い蛍光検出器，例えば，電荷結合検出器（ＣＣＤ）を用いてこれを検出することができる。蛍光団はしばしば"ブロッキング基"としても働く。すなわち，取り込まれたヌクレオチドがさらなるヌクレオチドの付加の基質として作用できないようにして，制御されない重合を防止することができる。しばしば，"除去可能なブロッキング基"が用いられ，これは，ヌクレオチドとブロッキング基との間の共有結合を切断する特定の処理により除去することができ，シークエンシング反応を継続することができる。
【０００７】
除去可能なブロッキング基は，多数の可能な除去処理戦略，例えば，光化学的，化学的または酵素的処理により除去することができる。しかし，これらの方法は制御してｓ適用することが困難であることが示されている。局所的環境，例えばアレイ中の環境の相違により，意図される標識のみではなく，全てのヌクレオチド，またはいくつかのヌクレオチドが除去される場合がある。ヌクレオチドの制御されない除去が起こると，シークエンシングデータが損失し，配列データは間違いだらけとなり，使用できなくなるため，このようなことが生ずると，シークエンシング方法の忠実度について深刻な結末となる。
【０００８】
両方の標識方法におけるさらなる不都合は，反復配列が不明瞭な結果につながることである。この問題は，Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７），ｅｄ．Ｔ．Ｊ．Ｂｅｕｇｅｌｓｄｉｊｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０：２０５−２２５において認識されている。
【０００９】
したがって，放射性標識されたヌクレオチドの高い感度および低いバックグラウンドと，蛍光標識された標識の高い分解能とを組み合わせた，ポリヌクレオチドの配列を同定するための，特にポリヌクレオチド配列中の変異を検出するための（例えばＳＮＰｓを検出するための），改良された方法が求められている。さらに，この方法は，ハイスループットの自動化プロセスにより実施することができ，現存する方法に伴うコストを低下させることができるべきである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は，ポリメラーゼ反応の間にポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合する時間を測定することにより，ポリヌクレオチド配列の同定を行うことができることの実現に基づく。一般に，ポリメラーゼは，取り込みに利用可能なヌクレオチドがない場合，標的ポリヌクレオチドに結合するのにより少ない時間を費やす。したがって，利用可能な唯一のヌクレオチドが非相補的である場合，ポリメラーゼはポリヌクレオチドにより短い時間結合し，これを判定することにより，標的ポリヌクレオチドの相補的配列の種類を明らかにすることができる。
【００１１】
本発明の第１の観点にしたがえば，ポリヌクレオチドの配列を同定する方法は，以下の工程を含む：（ｉ）標的ポリヌクレオチドを，ポリメラーゼ反応が進行するのに適した条件下で，ポリメラーゼ酵素およびヌクレオチドＡ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣの１つと接触させ；（ｉｉ）ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合して，続いてこれから解離するのに要する時間を測定し，このことによりポリメラーゼがヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド上に取り込ませたか否かを判定し；そして（ｉｉｉ）追加のヌクレオチドを用いて任意に工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返し，このことにより標的ポリヌクレオチドの配列を同定する。
【００１２】
本発明の第２の観点にしたがえば，標的ポリヌクレオチド中の変異を同定する方法は以下の工程を含む：（ｉ）標的ポリヌクレオチドを，ポリメラーゼ反応が進行するのに適した条件下で，ポリメラーゼ酵素およびヌクレオチドＡ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣの１つと接触させ；そして（ｉｉ）ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合し，続いてこれから解離するのに要する時間を測定し，このことにより，ポリメラーゼがヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド上に取り込ませたか否かを同定し，そして，標的の天然の配列を参照して，変異が存在するか否かを判定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の説明
本明細書において用いる場合，"ポリヌクレオチド"または"標的ポリヌクレオチド"との用語は，広義に解釈すべきであり，ＤＮＡおよびＲＮＡを含み，修飾されたＤＮＡおよびＲＮＡ，ならびに他のハイブリダイズ可能な核酸様分子，例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。標的ポリヌクレオチドは二本鎖でも一本鎖でもよい。好ましくは，標的ポリヌクレオチドは，少なくとも部分的には一本鎖であり，より好ましくは，ポリメラーゼ酵素が標的ポリヌクレオチドに結合しうるように，プライマー配列がこれに結合している。このことは当業者には理解されるであろう。
【００１４】
酵素は，相補鎖を伸長させるプロセスにおいて標的ポリヌクレオチドと相互作用するポリメラーゼ酵素であり，既知のタイプのいずれであってもよい。例えば，ポリメラーゼは任意のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子である場合，ポリメラーゼは，ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ，すなわちリバーストランスクリプターゼ，またはＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ，すなわちＲＮＡレプリカーゼであってもよい。プライマーゼ酵素もこの定義中に含まれる。
【００１５】
標的ポリヌクレオチドは，好ましくは支持材料上の特定の部位に位置する。好ましくは，ポリヌクレオチドは，固体支持体上に固定化することにより局在化させる。ポリヌクレオチドを固定化するために用いるのに適した支持体は当業者には明らかであり，例えば，シリコン，ガラスまたはセラミック材料はすべて使用することができる。固定化は，共有結合の手段で行ってもよく，非共有結合の手段で行ってもよい。例えば，共有結合リンカー分子を用いることができる。好ましい態様においては，プライマーは支持材料上に固定化されており，標的ポリヌクレオチドはこれにハイブリダイズする。あるいは，標的ポリヌクレオチドとプライマーとのハイブリダイゼーションは溶液中で生じてもよく，プライマーまたは標的ポリヌクレオチドのいずれかを，次にまたは同時に，支持材料に結合させる。
【００１６】
１またはそれ以上の標的ポリヌクレオチドを固体支持材料に固定化することができる。好ましい態様においては，複数の標的ポリヌクレオチドを支持体に結合させる。これらの標的ポリヌクレオチドの"アレイ"は，既知の密度のいずれのものであってもよく，例えば，多数分子の高密度アレイ，ならびに個々のポリヌクレオチドの位置を分解することができる"単一分子"アレイであってもよい。すなわち，単一のポリヌクレオチド上で生ずるポリメラーゼ反応をモニターすることができる。
【００１７】
シークエンシング方法の第１の工程として，標的ポリヌクレオチドをハイブリダイズ／重合バッファ中で適当なプライマーと接触させる。典型的には，バッファは，標的ポリヌクレオチド上に存在するすべての二次構造を破壊（または溶解）するのに十分な温度である。冷却すると，プライマーは標的上のその相補体にアニーリングする。次にこれをポリメラーゼと接触させて，標的ポリヌクレオチド／ポリメラーゼ複合体を形成させる。
【００１８】
本発明の１つの態様においては，ヌクレオチドの添加は，ポリメラーゼ／標的複合体に異なるヌクレオチドが順番に加えられるように制御する。例えば，ｄＧＴＰを加え，ポリメラーゼ／ポリヌクレオチド複合体の上を流れるようにする；次に，ポリメラーゼがポリヌクレオチドと複合体化する時間を測定する。未結合ｄＧＴＰを反応部位から流し出し，さらに別のヌクレオチドを導入する。このようにして，複合体が形成される時間をその時間の間に存在する特定のヌクレオチドと関連づけることができ，したがって，ポリヌクレオチド配列を決定することができる。
【００１９】
ポリメラーゼを標的ポリヌクレオチドおよびヌクレオチドを含む反応混合物に加えることにより反応を開始させてもよい。ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドと会合し解離するのに要する時間をモニターした後，未結合ヌクレオチドを除去し，次のヌクレオチドを導入して，さらなるシークエンシング工程を行うことができる。
【００２０】
ヌクレオチドが標的に取り込まれるためには，取り込みが可能でない場合に要する時間より長い時間ポリメラーゼが標的と会合することが必要である。したがって，ポリメラーゼと標的との間の会合を測定すると，同じタイプの一連のヌクレオチドを有する標的上の領域で取り込み事象が生じたか否かが明らかとなり，会合の時間は比例して増加するであろう。したがって，この方法を用いて，同じタイプの連続するヌクレオチドを同定することができる。
【００２１】
ポリメラーゼ酵素と標的ポリヌクレオチドとの間の相互作用の検出は，適用した放射線の変化を測定することにより行うことができる。ポリメラーゼと標的ポリヌクレオチドとの間の相互作用に生ずる放射性の変化の測定は，慣用の装置を用いて行うことができる。
【００２２】
１つの態様においては，ポリメラーゼと標的ポリヌクレオチドとの相互作用は，非線形画像システムを用いて測定する。
【００２３】
非線形画像システムは当該技術分野において知られている。一般に，ある材料の非線形分極は以下のように表される：
Ｐ＝Ｘ(2)Ｅ1＋Ｘ(2)Ｅ2＋Ｘ(3)Ｅ3＋ ・・・
式中，Ｐは誘導された分極であり，Ｘ(n)はｎ次の非線形感受率であり，Ｅは電場ベクターである。第１項は光の正常な吸収および反射を記述し，第２項は第二高調波発生（ＳＨＧ），和周波数および差周波数の発生を記述し，第３項は光散乱，誘導ラマンプロセス，第三高調波発生（ＴＧＨ），および二光子および三光子吸収の両方を記述する。
【００２４】
本発明の好ましい画像システムは，第二高調波発生または第三高調波発生から生じたシグナルの検出に基づく。
【００２５】
第二または第三高調波発生を用いる単分子分解（以下，ＳＨＧと称する）は，当該技術分野において知られている（Ｐｅｌｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９；９５：６７００−６７０４およびＰｅｌｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ，１９９６；４：２１５−２２４）。適当なシステムはＷＯ−Ａ−０２／０９５０７０に記載されている。
【００２６】
１つの態様においては，検出は，溶液相（すなわち，ポリメラーゼおよび標的ポリヌクレオチドは固定化されていない）で，ラマン散乱および／またはＬＳＰＲ手法を用いて行う。
【００２７】
光が分子に向けられたとき，大部分の入射光子は，波長が変化せずに弾力的に散乱される。これはレイリー散乱と称される。しかし，入射光子の一部のエネルギー（１０7個の光子につき約１個）は，分子の結合の別の振動モード中にカップリングする。そのようなカップリングにより，入射光の一部は，入射光の範囲とは異なる範囲の周波数を有する分子により非弾力的に散乱される。これはラマン効果と称されている。そのような非弾力的に散乱される光の周波数を強度に対してプロットすることにより，調べている分子の独特のラマンスペクトルが得られる。未知のサンプルのラマンスペクトルを分析することにより，サンプルの分子組成に関する情報が得られる。
【００２８】
ラマン効果は，ラマン活性分子を組織化された金属表面と近接（＜約５０Å）させることにより顕著に増強することができ，この場は表面から離れるにしたがって指数的に減衰する。分子を金属表面に近接させることは，典型的には，適切に粗くした金，銀，銅または他の自由電子金属の上にラマン活性分子を吸着させることにより行う。ラマン活性の表面増強は，誘電体基板上の金属コロイド粒子，金属フィルムで，および金属粒子アレイで観察される。この表面増強ラマン散乱が生ずるメカニズムはよくわかっていないが，（ｉ）光の局所的強度を強化する金属中の表面プラスモン共鳴，および；（ｉｉ）金属表面とラマン活性分子との間の電荷移動錯体の形成および続く移動の組み合わせによるものと考えられている。
【００２９】
ラマン効果を利用して，ポリメラーゼと標的ポリヌクレオチドとの間の会合の時間を測定することができる。ラマンシグナルを改良するためには，標的が金属表面上に固定化されていることが好ましい。
【００３０】
本発明の好ましい態様においては，ポリメラーゼに結合した金属コロイドナノ粒子，例えば，金または銀ナノ粒子を用いて表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を使用する。ラマン活性分子に会合するかまたは結合しているラマン増強金属ナノ粒子は，光学的タグとしての有用性を有する。この一般的な概念は，米国特許６，５１４，７６７（その内容を本明細書の一部としてここに引用する）に概説されている。１つの態様においては，標的ポリヌクレオチドおよびポリメラーゼは，ラマン活性分子のユニークなラマンスペクトルを検索することにより検出することができる。単一のラマンスペクトル（１００−３５００ｃｍ-1）は多くの異なるラマン活性分子を検出することができるため，本発明のマルチプレックスアッセイのフォーマットの状況で，ポリメラーゼに結合しているか会合しているＳＥＲＳ活性ナノ粒子を用いることができる。
【００３１】
別の態様においては，放射の変化は表面電磁波技術を利用してモニターする。
【００３２】
表面電磁波技術（および，特に，表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）センサー）を用いるバイオセンサーは，表面電磁波（ＳＥＷ）が，ＳＥＷが伝播する表面に隣接した薄層の屈折率に感受性であることに基づいている。バイオセンサーにおいては，ポリメラーゼおよびヌクレオチドは，固定化された標的ポリヌクレオチドを含む表面を横切って流れるようにする。結合が生ずると，表面上の質量の蓄積または再分配が局所的な屈折率を変化させ，これをセンサーによりリアルタイムでモニターすることができる。
【００３３】
ＳＰＲ技術を用いるいくつかの方法が提案されており，バイオセンサーにおいて実現されている。最も一般的な方法は，クレッチマン・レザー（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ−Ｒａｅｔｈｅｒ）の設定に基づくものであり，センサーから反射される光の強度をモニターする。この手法は，最も感度の高い手法であると考えられており，Ｊ．Ｈｏｍｏｌａら（Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ５４，ｐ．３−１５（１９９９））に記載されており，５ｘ１０7屈折率単位の検出限界を有する。ＳＰＲ相変化を測定すると，センサーの感度をさらに１または２桁高めることができる。これは，Ｎｅｌｓｏｎら（Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ３５−３６，ｐ．１８７（１９９６））およびＫａｂａｓｈｋｉｎら（Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １５０，ｐ．５（１９９８））に記載されている。従来の干渉法デバイス，例えばマッハツェンダ素子は，センサー表面で相シフトにより屈折率の変動を測定するように構成されている。これは，国際公開ＷＯ−Ａ−０１２０２９５に開示されている。この形状は，４つの独立した成分を必要とし，これらの成分の波長下の相対的置換に感受性である。したがって，機械的および環境的動揺が非常に小さい。より機械的に強固なモノリシック構造の干渉法の設計はＷＯ−Ａ−０３０１４７１５に概説されている。
【００３４】
好ましい態様においては，表面電磁波（ＳＥＷ）センサーシステムを用いる。これは，バッファのバルク屈折率の変化を補償することができるか，またはバルク屈折率の干渉パターンへの寄与をセンサー表面に吸収された被検物質の寄与から分離させることができる。したがって，バイオセンサーは，以下のものを含む：
入射波を生成するコヒーレント照射源；
固定化されたポリヌクレオチドを支持する担体表面であって，基板上に設けられ，表面電磁波（ＳＥＷ）を支持することができる担体表面；
入射波をＳＥＷおよび第１の散乱波に分割する手段（ここで，ＳＥＷは担体表面に沿って伝播し固定化されたポリヌクレオチドと相互作用する）；
ＳＥＷから第２の散乱波を生成する手段；および
第１の散乱波と第２の散乱波との間の干渉をモニターするための検出器。
【００３５】
この態様においては，単色レーザーにより生成されたコヒーレント光のビームを，レンズを用いて，表面電磁波（ＳＥＷ）を支持することができる金属フィルムの端に焦点を結ぶようにする。光ビームは金属フィルムが装着されているガラスプリズムを通過する。照明源として近赤外線レーザーを用いる。近赤外線光源を用いることは，金および銀中で表面プラスモンの長い伝播長が得られ，一方，画像化および照射には慣用の光学をなお使用することができるという利点を有する。しかし，他の単色光源も適しており，これらを用いることもできる。
【００３６】
このシステムは，ＷＯ−Ａ−０４／０２０９８５に記載されており，その内容を本明細書の一部としてここに引用する。
【００３７】
好ましい態様においては，ポリメラーゼは標識されている。
【００３８】
本明細書において用いる場合，"標識"との用語は広く解釈することができる。適当な標識は当業者には明らかであろう。好ましい態様においては，標識は蛍光団である。特定の態様においては，ポリメラーゼは，ＧＦＰ（グリーン蛍光蛋白質）との組換え融合蛋白質として調製する。これは，野生型ＧＦＰであってもよく，またはスペクトルがシフトしたその変異体であってもよい（Ｔｓｉｅｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８；６７：５０９，ＵＳ５，７７７，０７９および米国特許５，６２５，０４８）。ＧＦＰは，酵素のＮ末端に位置してもよく，Ｃ末端に位置してもよい（ポリメラーゼを"スライディングクランプ"と組み合わせて用いる場合にはＣ末端が望ましいかもしれない）。あるいは，ＧＦＰ分子は酵素活性が保持される限り酵素中のいずれの位置に存在してもよい。別の標識を用いてもよい。分子を標識する多くの方法が報告されており，例えば，マイクロスフェア（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）７２，１５：３６７８−３６８１），金ナノ粒子（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２，１５：３７９５−３７９６），銀コロイド粒子（ＰＮＡＳ，（２０００）９７，３：９９６−１００１）およびカンタムドットなどが挙げられる。ポリメラーゼと標的ポリヌクレオチドおよびヌクレオチドとの相互作用を明白に分解しうるいかなる標識技術も，本発明の状況の中で利用することができる。好ましくは，酵素の標的ポリヌクレオチド：ヌクレオチド複合体への結合および／または解離の時間分解を可能とする標識を用いる。
【００３９】
好ましくは，固定化された標的ポリヌクレオチドのアレイを作成し，ポリメラーゼ酵素を酵素活性に適した条件下で４つのヌクレオチドの少なくとも１つとともにアレイ上に流す。より好ましくは，これはフローセル中で行う。次に，単一の固定化標的ポリヌクレオチドまたは複数の同一の標的ポリヌクレオチドを含むアレイ中の各"アレイ位置"を，酵素の標的ポリヌクレオチド／ヌクレオチド複合体への結合の分解を可能とする時間分割で，好ましくは，１から少なくとも数ヘルツで画像化する。
【００４０】
別の好ましい態様においては，ポリメラーゼ酵素を蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）対で標識する。この系は，ＷＯ−Ａ−０１／２５４８０に記載されている。当業者には理解されるように，ＦＲＥＴ対は蛍光団および蛍光団と相互作用し，エネルギードナーまたはアクセプターとして作用しうる第２の分子を必要とする。この対の間の相互作用は蛍光団の放出スペクトルを変化させ，これを検出する。第２の分子は別の蛍光団であってもよく，または他の任意の適当な分子，例えば金属粒子であってもよい。好ましくは，１つの蛍光団の放出波長が他方の励起波長と対応するように，標識および蛍光団の両方を選択する古典的なＦＲＥＴ対を用いる。酵素上の固定化位置は，酵素がポリヌクレオチドに結合して三者複合体を形成したときに，蛍光団が互いに移動するように選択される。ＦＲＥＴ対の間のこの相対的な移動により，ＦＲＥＴ対を設計する方法に依存して，対からの放出のスペクトルがシフトする。次に，多いかまたは少ないエネルギーがドナーからアクセプターにカップリングし，，ドナー蛍光の励起または減衰が生ずる。これを高い時間分解能でモニターして，所望の情報を得る。好ましくは，蛍光の程度を画像化するのに用いられるデバイスは，電荷結合素子（ＣＣＤ）であり，これは速い読み出し時間および高い空間的分解に適した光学特性を有する。
【００４１】
ポリメラーゼと標的との間の相互作用をモニターするのに必要な分解システムは，調べているサンプルを"スキャンする"必要を考慮して改変することができる。そのようなスキャンは，特に，高分解能システム，例えば，単一分子システムであろう。単一分子実験に必要とされる高いレベルの空間的分解においては，有効な観測領域は対応して減少する。"動力学的"分析は通常，単一の規程された領域における連続的な"リアルタイム"モニタリングを必要とするため，スキャニングには，非連続的モニタリングの問題が生ずる。。そのような非連続的モニタリングは，相互作用事象を見逃すかもしれないため，動力学的分析と適合しない。したがって，本発明の好ましい観点においては，５’末端で標識されたヌクレオチドを用い，標識は除去可能なブロッキング基として作用する。すなわち，高度な空間的分解を用いる状況においては（例えば，観測領域が典型的にはわずか１００μｍ×１００μｍであり，チップは一般にこれより少なくとも１００倍大きい単一分子アレイ），観測領域を新たな位置に"移動"させ，この領域をブロッキング基を除去するのに適した放射（例えば，ＵＶ）で照射する。この戦略により，会合／動力学的事象が"観測された"領域内でのみ生ずることが確実となる。次に，"観測された"領域をチップの周りに回転させて動かし，観測している領域のみをヌクレオチドのブロックをはずすのに十分な放射に曝露することにより，選択的相互作用がこの領域内でのみ生ずるようにする。
【００４２】
さらに別の好ましい態様においては，画像化領域は個々のフローセルに限定される。すなわち，観測領域が１００μｍ×１００μｍに制限されている場合，フローセルはこれらの相対的寸法に制限される。すなわち，この態様においては，ヌクレオチドを実際に画像化されているフローセルにのみ注入する。したがって，ポリヌクレオチドのアレイがその上に形成されている支持材料は，個々にアドレス可能なフローセルの"アレイ"から構成されるようにすることができる。画像化領域がチップの周りで移動するため，ヌクレオチドは画像化領域においてのみフローセル中に注入する。
【００４３】
さらに別の態様においては，ポリメラーゼの結合は，インターカレート分子とポリメラーゼ上の染料／クエンチャーとの間の共鳴エネルギー伝達により検出される。インターカレート染料（例えば，ＣＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）は，二本鎖プライマー−テンプレート複合体に結合したときにのみ蛍光を生ずる。次にこのシグナルを用いて，標的ポリヌクレオチドの位置を識別することができる。ポリメラーゼは，インターカレート染料を吸収しこれからエネルギーを再放出することができる"アクセプター"分子である染料で修飾する。あるいは，"標識"はクエンチャーであってもよい。すなわち，結合／相互作用事象は，エネルギー伝達によるシグナルの変化を観察することによりモニターすることができる。
【００４４】
本発明の方法は，標的ポリヌクレオチド配列全体を同定するために用いてもよく，ポリヌクレオチドの一部の配列を同定するために用いてもよい。この方法は，標的中の変異の存在を判定するのに，例えば，対照または参照配列と比較して置換，欠失または付加が生じたか否かを判定するのに適している。
【００４５】
好ましい態様においては，この方法を用いて，遺伝子サンプルにおける一塩基多型を同定することができる。本明細書において用いる場合，"多型"との用語は，異なるゲノムまたは個体の間で２またはそれ以上の代替的ゲノム配列またはアレルが生ずることを表す。一塩基多型（ＳＮＰ）は，単一の塩基対の変化である。典型的には，ＳＮＰとは，多型部位において１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドで置き換えられていることである。単一のヌクレオチドの欠失，または単一のヌクレオチドの挿入によっても，一塩基多型が生ずる。
【００４６】
本発明の方法は，変異の推定部位におけるヌクレオチドの種類を判定するために用いられ，次にこの情報を参照配列と比較して，変異が存在するか否かを明らかにする。
【００４７】
以下の実施例により本発明を具体的に説明する。
【実施例】
【００４８】
この実験においては，当該技術分野においてよく知られる組換え手法により，グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）とポリメラーゼとの融合蛋白質を作製した。
【００４９】
石英チップ（直径１４ｍｍ，厚さ０．３ｍｍ）に固定化ストレプトアビジンで修飾した平面的なデキストランの層（Ｘａｎｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をスピンコーティングした。実験のプラットフォームとしては，全反射（ＴＩＲ）照明付き直立型顕微鏡（１３５ＴＶ，Ｚｅｉｓｓ）を用いた。ピーク４８８ｎｍ，出力１００ｍＷのレーザービーム（ＭｅｌｌｅｓＧｒｉｏｔ）は，四分の一波長板により円偏光されて，特注のプリズム中でＴＩＲが進行する。プリズムは，屈折率の合ったゲルを用いてチップに光学的に結合させた。次に，Ｏ−リングのシールおよび透明な光学軸を有するフローセルをプリズムおよび水晶チップの上に組立てた。対物レンズは，フローセルの透明な上表面を通して蛍光シグナルを集めた。画像は帯域通過フィルタを通って進み，裏側にスズを有する電荷結合素子（Ａｎｄｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に入るようにした。
【００５０】
２つのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成した。配列番号１で定義されるオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドとして用い，配列番号２で定義されるオリゴヌクレオチドをビオチン化してプライマーとして用いた。ビオチン化プライマー（配列番号２）は，１００ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＴｒｉｓバッファ中の１０ｐＭの配列番号２をフローセルに注入することにより，ストレプトアビジンをコーティングしたチップに沈着させ，１０分間インキュベートした。
配列番号１
ＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧ
配列番号２
ビオチン−ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴＣＧＴＣ
【００５１】
フローバッファを５００μｌ／分の速度でフローセル中にフラッシュして加えた。次に，相補的配列である配列番号１をフローセル中に１μＭの濃度で５μｌ／分の流速で注入した。この注入の間，フローセル中の白金加熱電極でセルを７０℃で数分間加熱し，２５℃まで冷却させた。次に，注入をさらに１０分間続けた。注入が完了した後，フローバッファを流速５００μｌ／分で連続的にシステムを通るようフラッシュした。１０分後，０．４ｍＭ ｄＡＴＰ（８μｌ）を流速５００μｌ／分でバッファ中に注入することによりシークエンス反応を開始させた。注入を開始した１秒後に，最大フレーム速度（３０フレーム／秒）で一連のＣＣＤ画像を記録し，最も高いシグナル強度を有するフレームを保存した。次に，相補的ヌクレオチドｄＣＴＰを０．４ｍＭで注入し，さらに注入の１秒後にＣＣＤ画像を保存した。
【００５２】
"時間分解"法で画像化したとき，相補的ヌクレオチド（図１ａ）は，非相補的ヌクレオチド（図１ｂ）と比較して強いシグナルを与えた。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、相補的ヌクレオチドおよび非相補的ヌクレオチドから得られたシグナルを示す。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は，ポリヌクレオチドの配列を決定する方法，またはポリヌクレオチド配列間の変動を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ポリヌクレオチドの配列を決定する能力は，今やヒトゲノムの３０億塩基の全配列を決定したヒトゲノムプロジェクトにより示されているように，科学において非常に重要である。しかし，この配列情報は平均的なヒトを表しており，遺伝子レベルで個体間の相違を理解することが強く求められている。
【０００３】
一般に，大規模ＤＮＡ配列決定に用いられている主な方法は，鎖終止法である。この方法は，最初にＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎにより開発され（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７７；７４：５４６３−５４６７），４種類のヌクレオシド三リン酸のジデオキシ誘導体を使用して，これをポリメラーゼ連鎖反応において発生しつつあるポリヌクレオチド鎖に取り込ませる。ジデオキシ誘導体が取り込まれると，これはポリメラーゼ反応を停止させる。次に生成物をゲル電気泳動により分離し，分析して，特定のジデオキシ誘導体が鎖中に取り込まれた位置を明らかにする。
【０００４】
この方法は広く使用されており，信頼性のある結果を与えるが，遅く，労働集約型であり，高価であることが認識されている。さらにこれは，しばしば１つの塩基の変化からなる２つの配列の間の相違（一塩基多型，すなわちＳＮＰとして知られる）を検出するためには有効な方法ではない。
【０００５】
核酸アレイは最近，ポリヌクレオチド配列およびＳＮＰを決定する好ましい方法になってきており，通常はハイブリダイゼーション事象の状況で使用される（Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２：２７−３２）。アレイに基づく多数のシークエンシング方法は，加えられた（ハイブリダイズした）塩基の種類を取得するために，標識されたヌクレオチドを使用する。これらのアレイは，適切に標識された塩基の段階的同定に基づいており，米国特許５６３４４１３において"単一塩基"シークエンシング法と称されている。そのような"単一塩基"方法は，２種類の標識，すなわち，放射性標識および蛍光標識を使用する。ヌクレオチドの放射性標識は高い感度および低いバックグラウンドという利点を有する。しかし，放射性標識は，分解能が低いという欠点がある。
【０００６】
現在，蛍光標識されたヌクレオチドが多くの手法で広く用いられている。そのようなヌクレオチドは，ポリメラーゼ連鎖反応により，発生しつつあるポリヌクレオチド鎖に段階的様式で取り込まれることができる。異なるヌクレオチド（Ａ，Ｔ，ＧおよびＣ）のそれぞれの３’位にユニークな蛍光団を取り込ませ，感度の高い蛍光検出器，例えば，電荷結合検出器（ＣＣＤ）を用いてこれを検出することができる。蛍光団はしばしば"ブロッキング基"としても働く。すなわち，取り込まれたヌクレオチドがさらなるヌクレオチドの付加の基質として作用できないようにして，制御されない重合を防止することができる。しばしば，"除去可能なブロッキング基"が用いられ，これは，ヌクレオチドとブロッキング基との間の共有結合を切断する特定の処理により除去することができ，シークエンシング反応を継続することができる。
【０００７】
除去可能なブロッキング基は，多数の可能な除去処理戦略，例えば，光化学的，化学的または酵素的処理により除去することができる。しかし，これらの方法は制御してｓ適用することが困難であることが示されている。局所的環境，例えばアレイ中の環境の相違により，意図される標識のみではなく，全てのヌクレオチド，またはいくつかのヌクレオチドが除去される場合がある。ヌクレオチドの制御されない除去が起こると，シークエンシングデータが損失し，配列データは間違いだらけとなり，使用できなくなるため，このようなことが生ずると，シークエンシング方法の忠実度について深刻な結末となる。
【０００８】
両方の標識方法におけるさらなる不都合は，反復配列が不明瞭な結果につながることである。この問題は，Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７），ｅｄ．Ｔ．Ｊ．Ｂｅｕｇｅｌｓｄｉｊｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０：２０５−２２５において認識されている。
【０００９】
したがって，放射性標識されたヌクレオチドの高い感度および低いバックグラウンドと，蛍光標識された標識の高い分解能とを組み合わせた，ポリヌクレオチドの配列を同定するための，特にポリヌクレオチド配列中の変異を検出するための（例えばＳＮＰｓを検出するための），改良された方法が求められている。さらに，この方法は，ハイスループットの自動化プロセスにより実施することができ，現存する方法に伴うコストを低下させることができるべきである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は，ポリメラーゼ反応の間にポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合する時間を測定することにより，ポリヌクレオチド配列の同定を行うことができることの実現に基づく。一般に，ポリメラーゼは，取り込みに利用可能なヌクレオチドがない場合，標的ポリヌクレオチドに結合するのにより少ない時間を費やす。したがって，利用可能な唯一のヌクレオチドが非相補的である場合，ポリメラーゼはポリヌクレオチドにより短い時間結合し，これを判定することにより，標的ポリヌクレオチドの相補的配列の種類を明らかにすることができる。
【００１１】
本発明の第１の観点にしたがえば，ポリヌクレオチドの配列を同定する方法は，以下の工程を含む：（ｉ）標的ポリヌクレオチドを，ポリメラーゼ反応が進行するのに適した条件下で，ポリメラーゼ酵素およびヌクレオチドＡ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣの１つと接触させ；（ｉｉ）ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合して，続いてこれから解離するのに要する時間を測定し，このことによりポリメラーゼがヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド上に取り込ませたか否かを判定し；そして（ｉｉｉ）追加のヌクレオチドを用いて任意に工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返し，このことにより標的ポリヌクレオチドの配列を同定する。
【００１２】
本発明の第２の観点にしたがえば，標的ポリヌクレオチド中の変異を同定する方法は以下の工程を含む：（ｉ）標的ポリヌクレオチドを，ポリメラーゼ反応が進行するのに適した条件下で，ポリメラーゼ酵素およびヌクレオチドＡ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣの１つと接触させ；そして（ｉｉ）ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合し，続いてこれから解離するのに要する時間を測定し，このことにより，ポリメラーゼがヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド上に取り込ませたか否かを同定し，そして，標的の天然の配列を参照して，変異が存在するか否かを判定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の説明
本明細書において用いる場合，"ポリヌクレオチド"または"標的ポリヌクレオチド"との用語は，広義に解釈すべきであり，ＤＮＡおよびＲＮＡを含み，修飾されたＤＮＡおよびＲＮＡ，ならびに他のハイブリダイズ可能な核酸様分子，例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。標的ポリヌクレオチドは二本鎖でも一本鎖でもよい。好ましくは，標的ポリヌクレオチドは，少なくとも部分的には一本鎖であり，より好ましくは，ポリメラーゼ酵素が標的ポリヌクレオチドに結合しうるように，プライマー配列がこれに結合している。このことは当業者には理解されるであろう。
【００１４】
酵素は，相補鎖を伸長させるプロセスにおいて標的ポリヌクレオチドと相互作用するポリメラーゼ酵素であり，既知のタイプのいずれであってもよい。例えば，ポリメラーゼは任意のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子である場合，ポリメラーゼは，ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ，すなわちリバーストランスクリプターゼ，またはＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ，すなわちＲＮＡレプリカーゼであってもよい。プライマーゼ酵素もこの定義中に含まれる。
【００１５】
標的ポリヌクレオチドは，好ましくは支持材料上の特定の部位に位置する。好ましくは，ポリヌクレオチドは，固体支持体上に固定化することにより局在化させる。ポリヌクレオチドを固定化するために用いるのに適した支持体は当業者には明らかであり，例えば，シリコン，ガラスまたはセラミック材料はすべて使用することができる。固定化は，共有結合の手段で行ってもよく，非共有結合の手段で行ってもよい。例えば，共有結合リンカー分子を用いることができる。好ましい態様においては，プライマーは支持材料上に固定化されており，標的ポリヌクレオチドはこれにハイブリダイズする。あるいは，標的ポリヌクレオチドとプライマーとのハイブリダイゼーションは溶液中で生じてもよく，プライマーまたは標的ポリヌクレオチドのいずれかを，次にまたは同時に，支持材料に結合させる。
【００１６】
１またはそれ以上の標的ポリヌクレオチドを固体支持材料に固定化することができる。好ましい態様においては，複数の標的ポリヌクレオチドを支持体に結合させる。これらの標的ポリヌクレオチドの"アレイ"は，既知の密度のいずれのものであってもよく，例えば，多数分子の高密度アレイ，ならびに個々のポリヌクレオチドの位置を分解することができる"単一分子"アレイであってもよい。すなわち，単一のポリヌクレオチド上で生ずるポリメラーゼ反応をモニターすることができる。
【００１７】
シークエンシング方法の第１の工程として，標的ポリヌクレオチドをハイブリダイズ／重合バッファ中で適当なプライマーと接触させる。典型的には，バッファは，標的ポリヌクレオチド上に存在するすべての二次構造を破壊（または溶解）するのに十分な温度である。冷却すると，プライマーは標的上のその相補体にアニーリングする。次にこれをポリメラーゼと接触させて，標的ポリヌクレオチド／ポリメラーゼ複合体を形成させる。
【００１８】
本発明の１つの態様においては，ヌクレオチドの添加は，ポリメラーゼ／標的複合体に異なるヌクレオチドが順番に加えられるように制御する。例えば，ｄＧＴＰを加え，ポリメラーゼ／ポリヌクレオチド複合体の上を流れるようにする；次に，ポリメラーゼがポリヌクレオチドと複合体化する時間を測定する。未結合ｄＧＴＰを反応部位から流し出し，さらに別のヌクレオチドを導入する。このようにして，複合体が形成される時間をその時間の間に存在する特定のヌクレオチドと関連づけることができ，したがって，ポリヌクレオチド配列を決定することができる。
【００１９】
ポリメラーゼを標的ポリヌクレオチドおよびヌクレオチドを含む反応混合物に加えることにより反応を開始させてもよい。ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドと会合し解離するのに要する時間をモニターした後，未結合ヌクレオチドを除去し，次のヌクレオチドを導入して，さらなるシークエンシング工程を行うことができる。
【００２０】
ヌクレオチドが標的に取り込まれるためには，取り込みが可能でない場合に要する時間より長い時間ポリメラーゼが標的と会合することが必要である。したがって，ポリメラーゼと標的との間の会合を測定すると，同じタイプの一連のヌクレオチドを有する標的上の領域で取り込み事象が生じたか否かが明らかとなり，会合の時間は比例して増加するであろう。したがって，この方法を用いて，同じタイプの連続するヌクレオチドを同定することができる。
【００２１】
ポリメラーゼ酵素と標的ポリヌクレオチドとの間の相互作用の検出は，適用した放射線の変化を測定することにより行うことができる。ポリメラーゼと標的ポリヌクレオチドとの間の相互作用に生ずる放射性の変化の測定は，慣用の装置を用いて行うことができる。
【００２２】
１つの態様においては，ポリメラーゼと標的ポリヌクレオチドとの相互作用は，非線形画像システムを用いて測定する。
【００２３】
非線形画像システムは当該技術分野において知られている。一般に，ある材料の非線形分極は以下のように表される：
Ｐ＝Ｘ(2)Ｅ1＋Ｘ(2)Ｅ2＋Ｘ(3)Ｅ3＋ ・・・
式中，Ｐは誘導された分極であり，Ｘ(n)はｎ次の非線形感受率であり，Ｅは電場ベクターである。第１項は光の正常な吸収および反射を記述し，第２項は第二高調波発生（ＳＨＧ），和周波数および差周波数の発生を記述し，第３項は光散乱，誘導ラマンプロセス，第三高調波発生（ＴＧＨ），および二光子および三光子吸収の両方を記述する。
【００２４】
本発明の好ましい画像システムは，第二高調波発生または第三高調波発生から生じたシグナルの検出に基づく。
【００２５】
第二または第三高調波発生を用いる単分子分解（以下，ＳＨＧと称する）は，当該技術分野において知られている（Ｐｅｌｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９；９５：６７００−６７０４およびＰｅｌｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ，１９９６；４：２１５−２２４）。適当なシステムはＷＯ−Ａ−０２／０９５０７０に記載されている。
【００２６】
１つの態様においては，検出は，溶液相（すなわち，ポリメラーゼおよび標的ポリヌクレオチドは固定化されていない）で，ラマン散乱および／またはＬＳＰＲ手法を用いて行う。
【００２７】
光が分子に向けられたとき，大部分の入射光子は，波長が変化せずに弾力的に散乱される。これはレイリー散乱と称される。しかし，入射光子の一部のエネルギー（１０7個の光子につき約１個）は，分子の結合の別の振動モード中にカップリングする。そのようなカップリングにより，入射光の一部は，入射光の範囲とは異なる範囲の周波数を有する分子により非弾力的に散乱される。これはラマン効果と称されている。そのような非弾力的に散乱される光の周波数を強度に対してプロットすることにより，調べている分子の独特のラマンスペクトルが得られる。未知のサンプルのラマンスペクトルを分析することにより，サンプルの分子組成に関する情報が得られる。
【００２８】
ラマン効果は，ラマン活性分子を組織化された金属表面と近接（＜約５０Å）させることにより顕著に増強することができ，この場は表面から離れるにしたがって指数的に減衰する。分子を金属表面に近接させることは，典型的には，適切に粗くした金，銀，銅または他の自由電子金属の上にラマン活性分子を吸着させることにより行う。ラマン活性の表面増強は，誘電体基板上の金属コロイド粒子，金属フィルムで，および金属粒子アレイで観察される。この表面増強ラマン散乱が生ずるメカニズムはよくわかっていないが，（ｉ）光の局所的強度を強化する金属中の表面プラスモン共鳴，および；（ｉｉ）金属表面とラマン活性分子との間の電荷移動錯体の形成および続く移動の組み合わせによるものと考えられている。
【００２９】
ラマン効果を利用して，ポリメラーゼと標的ポリヌクレオチドとの間の会合の時間を測定することができる。ラマンシグナルを改良するためには，標的が金属表面上に固定化されていることが好ましい。
【００３０】
本発明の好ましい態様においては，ポリメラーゼに結合した金属コロイドナノ粒子，例えば，金または銀ナノ粒子を用いて表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を使用する。ラマン活性分子に会合するかまたは結合しているラマン増強金属ナノ粒子は，光学的タグとしての有用性を有する。この一般的な概念は，米国特許６，５１４，７６７（その内容を本明細書の一部としてここに引用する）に概説されている。１つの態様においては，標的ポリヌクレオチドおよびポリメラーゼは，ラマン活性分子のユニークなラマンスペクトルを検索することにより検出することができる。単一のラマンスペクトル（１００−３５００ｃｍ-1）は多くの異なるラマン活性分子を検出することができるため，本発明のマルチプレックスアッセイのフォーマットの状況で，ポリメラーゼに結合しているか会合しているＳＥＲＳ活性ナノ粒子を用いることができる。
【００３１】
別の態様においては，放射の変化は表面電磁波技術を利用してモニターする。
【００３２】
表面電磁波技術（および，特に，表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）センサー）を用いるバイオセンサーは，表面電磁波（ＳＥＷ）が，ＳＥＷが伝播する表面に隣接した薄層の屈折率に感受性であることに基づいている。バイオセンサーにおいては，ポリメラーゼおよびヌクレオチドは，固定化された標的ポリヌクレオチドを含む表面を横切って流れるようにする。結合が生ずると，表面上の質量の蓄積または再分配が局所的な屈折率を変化させ，これをセンサーによりリアルタイムでモニターすることができる。
【００３３】
ＳＰＲ技術を用いるいくつかの方法が提案されており，バイオセンサーにおいて実現されている。最も一般的な方法は，クレッチマン・レザー（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ−Ｒａｅｔｈｅｒ）の設定に基づくものであり，センサーから反射される光の強度をモニターする。この手法は，最も感度の高い手法であると考えられており，Ｊ．Ｈｏｍｏｌａら（Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ５４，ｐ．３−１５（１９９９））に記載されており，５ｘ１０7屈折率単位の検出限界を有する。ＳＰＲ相変化を測定すると，センサーの感度をさらに１または２桁高めることができる。これは，Ｎｅｌｓｏｎら（Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ３５−３６，ｐ．１８７（１９９６））およびＫａｂａｓｈｋｉｎら（Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １５０，ｐ．５（１９９８））に記載されている。従来の干渉法デバイス，例えばマッハツェンダ素子は，センサー表面で相シフトにより屈折率の変動を測定するように構成されている。これは，国際公開ＷＯ−Ａ−０１２０２９５に開示されている。この形状は，４つの独立した成分を必要とし，これらの成分の波長下の相対的置換に感受性である。したがって，機械的および環境的動揺が非常に小さい。より機械的に強固なモノリシック構造の干渉法の設計はＷＯ−Ａ−０３０１４７１５に概説されている。
【００３４】
好ましい態様においては，表面電磁波（ＳＥＷ）センサーシステムを用いる。これは，バッファのバルク屈折率の変化を補償することができるか，またはバルク屈折率の干渉パターンへの寄与をセンサー表面に吸収された被検物質の寄与から分離させることができる。したがって，バイオセンサーは，以下のものを含む：
入射波を生成するコヒーレント照射源；
固定化されたポリヌクレオチドを支持する担体表面であって，基板上に設けられ，表面電磁波（ＳＥＷ）を支持することができる担体表面；
入射波をＳＥＷおよび第１の散乱波に分割する手段（ここで，ＳＥＷは担体表面に沿って伝播し固定化されたポリヌクレオチドと相互作用する）；
ＳＥＷから第２の散乱波を生成する手段；および
第１の散乱波と第２の散乱波との間の干渉をモニターするための検出器。
【００３５】
この態様においては，単色レーザーにより生成されたコヒーレント光のビームを，レンズを用いて，表面電磁波（ＳＥＷ）を支持することができる金属フィルムの端に焦点を結ぶようにする。光ビームは金属フィルムが装着されているガラスプリズムを通過する。照明源として近赤外線レーザーを用いる。近赤外線光源を用いることは，金および銀中で表面プラスモンの長い伝播長が得られ，一方，画像化および照射には慣用の光学をなお使用することができるという利点を有する。しかし，他の単色光源も適しており，これらを用いることもできる。
【００３６】
このシステムは，ＷＯ−Ａ−０４／０２０９８５に記載されており，その内容を本明細書の一部としてここに引用する。
【００３７】
好ましい態様においては，ポリメラーゼは標識されている。
【００３８】
本明細書において用いる場合，"標識"との用語は広く解釈することができる。適当な標識は当業者には明らかであろう。好ましい態様においては，標識は蛍光団である。特定の態様においては，ポリメラーゼは，ＧＦＰ（グリーン蛍光蛋白質）との組換え融合蛋白質として調製する。これは，野生型ＧＦＰであってもよく，またはスペクトルがシフトしたその変異体であってもよい（Ｔｓｉｅｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８；６７：５０９，ＵＳ５，７７７，０７９および米国特許５，６２５，０４８）。ＧＦＰは，酵素のＮ末端に位置してもよく，Ｃ末端に位置してもよい（ポリメラーゼを"スライディングクランプ"と組み合わせて用いる場合にはＣ末端が望ましいかもしれない）。あるいは，ＧＦＰ分子は酵素活性が保持される限り酵素中のいずれの位置に存在してもよい。別の標識を用いてもよい。分子を標識する多くの方法が報告されており，例えば，マイクロスフェア（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）７２，１５：３６７８−３６８１），金ナノ粒子（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２，１５：３７９５−３７９６），銀コロイド粒子（ＰＮＡＳ，（２０００）９７，３：９９６−１００１）およびカンタムドットなどが挙げられる。ポリメラーゼと標的ポリヌクレオチドおよびヌクレオチドとの相互作用を明白に分解しうるいかなる標識技術も，本発明の状況の中で利用することができる。好ましくは，酵素の標的ポリヌクレオチド：ヌクレオチド複合体への結合および／または解離の時間分解を可能とする標識を用いる。
【００３９】
好ましくは，固定化された標的ポリヌクレオチドのアレイを作成し，ポリメラーゼ酵素を酵素活性に適した条件下で４つのヌクレオチドの少なくとも１つとともにアレイ上に流す。より好ましくは，これはフローセル中で行う。次に，単一の固定化標的ポリヌクレオチドまたは複数の同一の標的ポリヌクレオチドを含むアレイ中の各"アレイ位置"を，酵素の標的ポリヌクレオチド／ヌクレオチド複合体への結合の分解を可能とする時間分割で，好ましくは，１から少なくとも数ヘルツで画像化する。
【００４０】
別の好ましい態様においては，ポリメラーゼ酵素を蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）対で標識する。この系は，ＷＯ−Ａ−０１／２５４８０に記載されている。当業者には理解されるように，ＦＲＥＴ対は蛍光団および蛍光団と相互作用し，エネルギードナーまたはアクセプターとして作用しうる第２の分子を必要とする。この対の間の相互作用は蛍光団の放出スペクトルを変化させ，これを検出する。第２の分子は別の蛍光団であってもよく，または他の任意の適当な分子，例えば金属粒子であってもよい。好ましくは，１つの蛍光団の放出波長が他方の励起波長と対応するように，標識および蛍光団の両方を選択する古典的なＦＲＥＴ対を用いる。酵素上の固定化位置は，酵素がポリヌクレオチドに結合して三者複合体を形成したときに，蛍光団が互いに移動するように選択される。ＦＲＥＴ対の間のこの相対的な移動により，ＦＲＥＴ対を設計する方法に依存して，対からの放出のスペクトルがシフトする。次に，多いかまたは少ないエネルギーがドナーからアクセプターにカップリングし，，ドナー蛍光の励起または減衰が生ずる。これを高い時間分解能でモニターして，所望の情報を得る。好ましくは，蛍光の程度を画像化するのに用いられるデバイスは，電荷結合素子（ＣＣＤ）であり，これは速い読み出し時間および高い空間的分解に適した光学特性を有する。
【００４１】
ポリメラーゼと標的との間の相互作用をモニターするのに必要な分解システムは，調べているサンプルを"スキャンする"必要を考慮して改変することができる。そのようなスキャンは，特に，高分解能システム，例えば，単一分子システムであろう。単一分子実験に必要とされる高いレベルの空間的分解においては，有効な観測領域は対応して減少する。"動力学的"分析は通常，単一の規程された領域における連続的な"リアルタイム"モニタリングを必要とするため，スキャニングには，非連続的モニタリングの問題が生ずる。。そのような非連続的モニタリングは，相互作用事象を見逃すかもしれないため，動力学的分析と適合しない。したがって，本発明の好ましい観点においては，５’末端で標識されたヌクレオチドを用い，標識は除去可能なブロッキング基として作用する。すなわち，高度な空間的分解を用いる状況においては（例えば，観測領域が典型的にはわずか１００μｍ×１００μｍであり，チップは一般にこれより少なくとも１００倍大きい単一分子アレイ），観測領域を新たな位置に"移動"させ，この領域をブロッキング基を除去するのに適した放射（例えば，ＵＶ）で照射する。この戦略により，会合／動力学的事象が"観測された"領域内でのみ生ずることが確実となる。次に，"観測された"領域をチップの周りに回転させて動かし，観測している領域のみをヌクレオチドのブロックをはずすのに十分な放射に曝露することにより，選択的相互作用がこの領域内でのみ生ずるようにする。
【００４２】
さらに別の好ましい態様においては，画像化領域は個々のフローセルに限定される。すなわち，観測領域が１００μｍ×１００μｍに制限されている場合，フローセルはこれらの相対的寸法に制限される。すなわち，この態様においては，ヌクレオチドを実際に画像化されているフローセルにのみ注入する。したがって，ポリヌクレオチドのアレイがその上に形成されている支持材料は，個々にアドレス可能なフローセルの"アレイ"から構成されるようにすることができる。画像化領域がチップの周りで移動するため，ヌクレオチドは画像化領域においてのみフローセル中に注入する。
【００４３】
さらに別の態様においては，ポリメラーゼの結合は，インターカレート分子とポリメラーゼ上の染料／クエンチャーとの間の共鳴エネルギー伝達により検出される。インターカレート染料（例えば，ＣＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）は，二本鎖プライマー−テンプレート複合体に結合したときにのみ蛍光を生ずる。次にこのシグナルを用いて，標的ポリヌクレオチドの位置を識別することができる。ポリメラーゼは，インターカレート染料を吸収しこれからエネルギーを再放出することができる"アクセプター"分子である染料で修飾する。あるいは，"標識"はクエンチャーであってもよい。すなわち，結合／相互作用事象は，エネルギー伝達によるシグナルの変化を観察することによりモニターすることができる。
【００４４】
本発明の方法は，標的ポリヌクレオチド配列全体を同定するために用いてもよく，ポリヌクレオチドの一部の配列を同定するために用いてもよい。この方法は，標的中の変異の存在を判定するのに，例えば，対照または参照配列と比較して置換，欠失または付加が生じたか否かを判定するのに適している。
【００４５】
好ましい態様においては，この方法を用いて，遺伝子サンプルにおける一塩基多型を同定することができる。本明細書において用いる場合，"多型"との用語は，異なるゲノムまたは個体の間で２またはそれ以上の代替的ゲノム配列またはアレルが生ずることを表す。一塩基多型（ＳＮＰ）は，単一の塩基対の変化である。典型的には，ＳＮＰとは，多型部位において１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドで置き換えられていることである。単一のヌクレオチドの欠失，または単一のヌクレオチドの挿入によっても，一塩基多型が生ずる。
【００４６】
本発明の方法は，変異の推定部位におけるヌクレオチドの種類を判定するために用いられ，次にこの情報を参照配列と比較して，変異が存在するか否かを明らかにする。
【００４７】
以下の実施例により本発明を具体的に説明する。
【実施例】
【００４８】
この実験においては，当該技術分野においてよく知られる組換え手法により，グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）とポリメラーゼとの融合蛋白質を作製した。
【００４９】
石英チップ（直径１４ｍｍ，厚さ０．３ｍｍ）に固定化ストレプトアビジンで修飾した平面的なデキストランの層（Ｘａｎｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をスピンコーティングした。実験のプラットフォームとしては，全反射（ＴＩＲ）照明付き直立型顕微鏡（１３５ＴＶ，Ｚｅｉｓｓ）を用いた。ピーク４８８ｎｍ，出力１００ｍＷのレーザービーム（ＭｅｌｌｅｓＧｒｉｏｔ）は，四分の一波長板により円偏光されて，特注のプリズム中でＴＩＲが進行する。プリズムは，屈折率の合ったゲルを用いてチップに光学的に結合させた。次に，Ｏ−リングのシールおよび透明な光学軸を有するフローセルをプリズムおよび水晶チップの上に組立てた。対物レンズは，フローセルの透明な上表面を通して蛍光シグナルを集めた。画像は帯域通過フィルタを通って進み，裏側にスズを有する電荷結合素子（Ａｎｄｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に入るようにした。
【００５０】
２つのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成した。配列番号１で定義されるオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドとして用い，配列番号２で定義されるオリゴヌクレオチドをビオチン化してプライマーとして用いた。ビオチン化プライマー（配列番号２）は，１００ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＴｒｉｓバッファ中の１０ｐＭの配列番号２をフローセルに注入することにより，ストレプトアビジンをコーティングしたチップに沈着させ，１０分間インキュベートした。
配列番号１
ＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧ
配列番号２
ビオチン−ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴＣＧＴＣ
【００５１】
フローバッファを５００μｌ／分の速度でフローセル中にフラッシュして加えた。次に，相補的配列である配列番号１をフローセル中に１μＭの濃度で５μｌ／分の流速で注入した。この注入の間，フローセル中の白金加熱電極でセルを７０℃で数分間加熱し，２５℃まで冷却させた。次に，注入をさらに１０分間続けた。注入が完了した後，フローバッファを流速５００μｌ／分で連続的にシステムを通るようフラッシュした。１０分後，０．４ｍＭ ｄＡＴＰ（８μｌ）を流速５００μｌ／分でバッファ中に注入することによりシークエンス反応を開始させた。注入を開始した１秒後に，最大フレーム速度（３０フレーム／秒）で一連のＣＣＤ画像を記録し，最も高いシグナル強度を有するフレームを保存した。次に，相補的ヌクレオチドｄＣＴＰを０．４ｍＭで注入し，さらに注入の１秒後にＣＣＤ画像を保存した。
【００５２】
"時間分解"法で画像化したとき，相補的ヌクレオチド（図１ａ）は，非相補的ヌクレオチド（図１ｂ）と比較して強いシグナルを与えた。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、相補的ヌクレオチドおよび非相補的ヌクレオチドから得られたシグナルを示す。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドの配列を同定する方法であって，
（ｉ）標的ポリヌクレオチドを，ポリメラーゼ反応が進行するのに適した条件下でポリメラーゼ酵素およびヌクレオチドＡ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣの１つと接触させ；
（ｉｉ）ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合し，続いて標的ポリヌクレオチドから解離するのに要した時間を測定し，このことにより，ポリメラーゼがヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド上に取り込ませたか否かを判定し；
（ｉｉｉ）追加のヌクレオチドを用いて任意に工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返し，このことにより標的ポリヌクレオチドの配列を同定する，
の各工程を含む方法。
【請求項２】
標的ポリヌクレオチド中の変異を同定する方法であって，
（ｉ）標的ポリヌクレオチドを，ポリメラーゼ反応が進行するのに適した条件下でポリメラーゼ酵素およびヌクレオチドＡ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣの１つと接触させ；
（ｉｉ）ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合し，続いて標的ポリヌクレオチドから解離するのに要した時間を測定し，このことにより，ポリメラーゼがヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド上に取り込ませたか否かを同定し，そして，標的の天然配列を参照して，変異が存在するか否かを判定する，
の各工程を含む方法。
【請求項３】
異なるヌクレオチドのそれぞれを順に用いて，取り込みが検出されるまで工程（ｉ）−（ｉｉ）を実施する，請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的ポリヌクレオチドが支持材料上に固定化されている，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
複数の標的ポリヌクレオチドが支持材料上に固定化されている，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉ）が適用された放射線を測定することにより行われる，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉ）がラマン散乱を測定することにより行われる，請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）が表面電磁波を適用することにより行われる，請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
表面電磁波が表面プラズモン波である，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
検出が表面電磁波を測定することにより行われる，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ポリメラーゼがこれに結合した検出可能な標識を含む，請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
標識が蛍光団である，請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ポリメラーゼがさらにエネルギードナー標識またはエネルギーアクセプター標識を含み，および工程（ｉｉ）が蛍光団とエネルギードナーまたはアクセプターとの間のエネルギー伝達を測定することにより行われる，請求項１−６のいずれかに従属する請求項１１記載の方法。
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドの配列を同定する方法であって，
（ｉ）標的ポリヌクレオチドを，ポリメラーゼ反応が進行するのに適した条件下でポリメラーゼ酵素およびヌクレオチドＡ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣの１つと接触させ；
（ｉｉ）ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合し，続いて標的ポリヌクレオチドから解離するのに要した時間を測定し，このことにより，ポリメラーゼがヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド上に取り込ませたか否かを判定し；
（ｉｉｉ）追加のヌクレオチドを用いて任意に工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返し，このことにより標的ポリヌクレオチドの配列を同定する，
の各工程を含む方法。
【請求項２】
標的ポリヌクレオチド中の変異を同定する方法であって，
（ｉ）標的ポリヌクレオチドを，ポリメラーゼ反応が進行するのに適した条件下でポリメラーゼ酵素およびヌクレオチドＡ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣの１つと接触させ；
（ｉｉ）ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに結合し，続いて標的ポリヌクレオチドから解離するのに要した時間を測定し，このことにより，ポリメラーゼがヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド上に取り込ませたか否かを同定し，そして，標的の天然配列を参照して，変異が存在するか否かを判定する，
の各工程を含む方法。
【請求項３】
異なるヌクレオチドのそれぞれを順に用いて，取り込みが検出されるまで工程（ｉ）−（ｉｉ）を実施する，請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的ポリヌクレオチドが支持材料上に固定化されている，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
複数の標的ポリヌクレオチドが支持材料上に固定化されている，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉ）が適用された放射線を測定することにより行われる，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉ）がラマン散乱を測定することにより行われる，請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）が表面電磁波を適用することにより行われる，請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
表面電磁波が表面プラズモン波である，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
検出が表面電磁波を測定することにより行われる，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ポリメラーゼがこれに結合した検出可能な標識を含む，請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
標識が蛍光団である，請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ポリメラーゼがさらにエネルギードナー標識またはエネルギーアクセプター標識を含み，および工程（ｉｉ）が蛍光団とエネルギードナーまたはアクセプターとの間のエネルギー伝達を測定することにより行われる，請求項１−６のいずれかに従属する請求項１１記載の方法。
【公表番号】特表２００６−５２８４８５（Ｐ２００６−５２８４８５Ａ）
【公表日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２０９０６（Ｐ２００６−５２０９０６）
【出願日】平成１６年７月２６日（２００４．７．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３２３２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１０２１０
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【出願人】（３００００８６１２）メディカル・バイオシステムズ・リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＩＣＡＬ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２６日（２００４．７．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３２３２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１０２１０
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【出願人】（３００００８６１２）メディカル・バイオシステムズ・リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＩＣＡＬ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]