マクロライド系抗生物質による神経変性の予防
本開示は、神経変性を予防するため、また神経変性に伴って生じる疾患と症状を治療または予防するために、マクロライド系抗生物質を使用することを記載する。特定の作用機序に限定されないが、一つの実施形態では、マクロライド系抗生物質は、リソソームおよび／またはミトコンドリアの機能障害に起因する神経変性を抑制する。本開示は、任意のマクロライド系抗生物質およびその医薬的に許容できる誘導体の使用を意図するものである。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシンを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性と、神経変性によって特徴付けられる疾患と症状の治療および／または予防のための方法に関する。該方法は、神経変性によって特徴付けられる疾患または症状に苦しむ対象を治療するために、および／またはそうした疾患または症状が、罹患する危険が高い対象に起こるのを予防するために使用されてもよい。本発明はまた、該方法において有用な医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、一般的に使われる用語であり、その意味は広く理解されていると考えられる。しかし、神経変性の厳密な定義を明確に表すのは難しい。神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、多数の大辞典でも 定義は不完全であることが多い。語源的には、この用語は神経細胞（すなわちニューロン）を示す接頭辞「ｎｅｕｒｏ−」と、組織または臓器の場合には構造または機能を失う過程を表す「ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」からなり、この過程は治療に応じて可逆的である。
【０００３】
実際には、神経変性疾患や症状は、特異的な機能解剖系の特異的な一部のニューロンに発症する、多様な臨床的、病理学的発現を伴う幅広いグループの神経疾患を意味する。これらの疾患は若年期に認められるか（若年性疾患）、あるいは晩年期に認められることがあり（加齢関連性疾患）、発症の理由は不明であり、病状の進行は確実である。神経変性疾患または症状を、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病を発症する、最も一貫した危険因子は加齢である。
【０００４】
過去１００年間で、産業国における６５歳以上の人口の増加率は、人口全体の増加率をはるかに上回った。故に、次世代では老年者の人口が二倍になり、これに伴いある種の神経変性疾患または症状に苦しむ人々の人口も比例して増加することが予想される。これらの、身体障害を引き起こす病気に関わる患者、介護者、社会に対する、心理的、身体的、経済的な負担が増加していることから、この予想は、医療社会で高まりつつある懸念の焦点にある。いくつかの承認薬が、現在までにいくつかの神経変性疾患や症状の病状を部分的に改善してきたとはいえ、それらを慢性的に使用すると、患者を衰弱させる副作用を起こすことが多く、変性過程の進行を阻止するものがないという事実は、問題をさらに深刻化させている。これに合わせて、神経変性の原因や機構に関する我々の知識の限界が、効果的な予防療法または保護療法の開発を妨げてきた。従って、神経変性の疾患や症状の治療のための新たな化合物のための技術や、そのような化合物を用いた治療方法が必要となる。更に、神経変性疾患の治療および／または予防に適した化合物の同定方法も必要となってくる。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、神経変性によって特徴付けられる疾患と症状の治療および／または予防における、マクロライド系抗生物質の使用を開示する。本発明はまた、そのようなマクロライド系抗生物質を用いる治療および／または予防の方法を開示する。更に、本発明は、そのような方法において有用な医薬組成物を開示する。本発明はまた、神経変性疾患や症状を治療および／または予防するのに有効である可能性がある他の化合物を同定するための方法を提供する。
【０００６】
本発明は、神経変性を抑制するための、マクロライド系抗生物質の使用に関する。多くの病態が神経変性によって特徴付けられ、若年性の、また加齢関連性疾患および症状の両方を含む。観察される神経変性の分子基盤は、特定の病態によって異なる。
【０００７】
最近の証拠は、神経変性病態において、リソソーム経路とオートファジー（例えば、自家融解ストレスがあるが限定されない）を関連させる。リソソーム経路は、細胞の健全性を保つために必要な基本的な細胞の構成要素を供給するために、細胞成分をリサイクルするように働く、細胞器官の動的システムを含む。リソソーム経路の一要素はオートファジーである。オートファジーは、栄養不足、または細胞ストレスの他の症状によって引き起こされる、厳重に統制された過程である。オートファゴソームと呼ばれる、細胞質領域が二重膜の空胞で囲まれた場合に、オートファジーが始まる。オートファゴソームは単一膜ファゴリソームに成長し、最終的に酸性になり、エンドソームまたはリソソームと融合した後タンパク質分解酵素を獲得して分解過程を完了する。細胞の大きさ、リモデリング、形態の変化を支援するために、正常の細胞の発達の過程において、オートファジーを含むリソソーム経路は活性である。さらに、そのような系は、損傷された細胞成分を除去するために、監視システムとして働くことがある。しかし、正常なリソソーム経路またはオートファジーにおける混乱が、細胞死または細胞の異常機能をもたらす、活性のデスシグナルを生み出すことができる。
【０００８】
正常なオートファジーの乱れは、自家融解ストレスにつながることがあり、これは形態学上は自食胞の蓄積によって、また生化学的には自食胞の外膜に特異的に関連するタンパク質である、ＬＣ３−ＩＩのレベルの上昇によって定義される。さらに、リソソームの分解経路の機能障害（ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして、ＣＧＮのクロロキン処理によって、本発明で例示する）は、自食胞を増加させる、ある種の自家融解ストレスを誘発する。自家融解ストレスは、その後アポトーシス経路を介して細胞死につながる可能性がある（例えば限定されないがカスパーゼ−３活性などの、プロテアーゼ活性の増加によって測定されるように）だけでなく、自家融解ストレスの結果として、アポトーシスと同時に、あるいは無関係に起こることが示されている、その他の種類の機構を介して細胞死につながることがある。
【０００９】
最近の報告のいくつかで、多くの神経系の疾患と症状におけるリソソーム系と自家融解ストレスの機能障害が説明されている。リソソーム系の能力の低下は、限定されないが、タンパク質や複合糖質成分など、細胞物質の異常な沈着につながる。時間がたつと、細胞物質の異常沈着は、そのような疾患と症状に特有の発生学的異常、最終的には神経変性をもたらす。さらに、上述のように、リソソーム系の能力の低下と自家融解ストレスの増加は細胞死をもたらすことがある。
【００１０】
これらの発生学的異常が、多くの若年性の発症や加齢関連疾患の病態や症状に認められる、限定されないが、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症などの神経変性や他の症状の根底にあると考えられる。
【００１１】
限定されないがバフィロマイシンＡ１などの、ある種のマクロライド系抗生物質は、１ｎＭより高い濃度において、液胞のＡＴＰａｓｅを阻害することが報告されている。液胞のＡＴＰａｓｅの阻害によって、酸性の小胞や細胞小器官は中性になる。酸性の小胞と細胞小器官の中性化は、オートファゴソームとリソソームの融合を妨げ、リソソーム系の正常な機能を混乱させる。リソソーム系のこの乱れにより、限定されないが、オートファゴソームなどのそのような系に関わる中間体の蓄積がもたらされ、自家融解ストレスと、その後の神経変性につながることがある。
【００１２】
本発明はモデル系を用いて液胞のＡＴＰａｓｅと酸性の小胞の中性化への影響とは無関係な、マクロライド系抗生物質の新規な神経保護効果を説明する。リソソームの分解経路の機能障害は、本発明ではＣＧＮのクロロキン処理によって例示される。ＣＧＮのクロロキン処理は、リソソーム経路の機能障害を誘発し、自食胞の増加につながるある種の自家融解ストレスを誘発し、これは細胞の生存率の低下、カスパーゼ−３活性の上昇（アポトーシス活性のマーカー）、ＬＣ３−ＩＩプロセシング（自家融解ストレスのマーカー）の増加をもたらす。本発明は、神経変性を予防するため、そして神経変性を伴う疾患や症状を治療または予防するための、マクロライド系抗生物質の使用を説明する。特定の作用機序に限定されないが、一つの実施形態では、マクロライド系抗生物質はリソソーム障害および／または自家融解ストレスによって起こる神経変性を抑制する。本発明はマクロライド系抗生物質とその誘導体の使用を意図するものである。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、それらの誘導体を含む。さらなる特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１、またはその誘導体である。
【００１３】
定義
本書で使用する単語「予防」、「予防する」、「予防している」、「抑制」、「抑制する」、「抑制している」は、疾患または症状の、徴候、様相、特徴が発症する前に、そのような徴候、様相、または特徴を予防する、または軽減するために開始される一連の動作（例えば化合物または医薬組成物を投与する工程）を意味する。そのような予防する、抑制することが必ずしも完全である必要はない。
【００１４】
本書で用いる「治療」、「治療する」、「治療している」は、疾患または症状の、徴候、様相、特徴の発症後に、そのような徴候、様相、または特徴を取り除く、または軽減するために開始される一連の動作を意味する（例えば化合物または医薬組成物を投与する工程）。そのような治療することが必ずしも完全である必要はない。
【００１５】
本書で使用する用語「治療を必要とする」は、患者が治療を必要とする、あるいは治療が有益であるだろうという、介護者の判断を意味する。この判断は、介護者の専門領域の範疇にあり、本発明の方法または化合物によって治療可能な疾患または症状の結果として、患者が病気であり、または病気になるであろうという知識を含む多様な要素に基づいて判断される。
【００１６】
本書で使用する用語「予防を必要とする」は、患者が予防を必要とする、あるいは予防が有益であるだろうという、介護者の判断を意味する。この判断は、介護者の専門領域の範疇にあり、本発明の方法または化合物によって予防可能な疾患または症状の結果として、患者が病気になるであろう、または病気になる可能性があるという知識を含む多様な要素に基づいて判断される。
【００１７】
本書で使用する「個人」、「対象」または「患者」は、哺乳類を含む動物、例えばマウス、ラット、その他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類、及びヒトである。この単語は、オスまたはメスまたは両方を特定するか、あるいはオスであるかメスであるかを除外することもある。
【００１８】
本書で使用する用語「治療上有効な量」は、疾患または徴候、様相、または特徴に対して、検出可能な効能を発揮できる、単独での、あるいは医薬組成物の一部としての化合物の量を意味する。そのような効果が必ずしも完全である必要はない。
【００１９】
本書で使用する用語「マクロライド系抗生物質」は、限定されないがデオキシ糖などの一つ以上の置換基が結合するラクトン環（マクロライド環と称される）を含む化合物を意味する。マクロライド系抗生物質には、ｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質が含まれる。ｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質の例には、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシンが含まれるが、これに限定されない。
【００２０】
本書で使用する用語「神経変性」は、神経構造または機能が障害される症状であり、その障害は、本願に記載されるように、マクロライド系抗生物質によって少なくとも部分的に回復するまたは予防される可能性がある。
【００２１】
用語「医薬的に許容できる誘導体」は、受容者に投与した際に、開示されるマクロライド系抗生物質、または代謝産物またはその残分を（直接または間接的に）提供できる本発明のマクロライド系抗生物質の医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物またはその他の誘導体を意味する。特に好ましい誘導体は、そのようなマクロライド系抗生物質が患者に投与された際に、開示されるマクロライド系抗生物質の生体への利用率を高め（例えば、経口投与された化合物がより容易に血液に吸収されるようにすることにより）、マクロライド系抗生物質の、任意の生物学的組織への輸送を高め、注射による投与が可能になるように溶解度を高め、代謝を変化させ、または排出速度を変化させるものである。一つの実施形態では、誘導体はプロドラッグである。マクロライド系抗生物質のプロドラッグ形式の例は、米国特許第６，８０９，０８０号において記載されている形式である。
【００２２】
用語「医薬的に許容できる塩」には、特に断りが無い限り、本発明のマクロライド系抗生物質に存在する酸性基または塩基性基の塩が含まれる。
【００２３】
治療と予防の方法
本発明は、神経変性を抑制および／または予防するための、マクロライド系抗生物質の使用を説明する。本発明は、そのような治療および／または予防を必要とする対象に神経変性によって特徴付けられる疾患または症状を治療および／または予防するための方法を提供する。本発明はまた、そのような治療および／または予防を必要とする対象にそれらの病因において神経変性過程に依存する疾患または症状を治療および／または予防するための方法を提供する。
【００２４】
一つの実施形態では、本発明は、そのような治療を必要とする対象に神経変性によって特徴付けられる疾患または症状、またはそれらの病因において神経変性過程に依存する疾患または症状の治療を提供する。そのような疾患または症状には、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症が含まれるがこれに限定されない。特定の実施形態では、疾患または症状は、リソソーム障害および／または自家融解ストレスによって特徴付けられる。
【００２５】
治療方法には、そのような治療を必要とする対象を識別すること、前記対象において、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の投与を含む、治療法を開始することを含む。マクロライド系抗生物質は、ｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質であってもよい。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシンまたはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質は、治療上有効な量で投与される。そのようなマクロライド系抗生物質の投与は、疾患または症状を治療することになる。神経変性の治療には、少なくとも部分的にの神経細胞死の抑制、異常な神経病態（例えば神経の変性があるが限定はされない）の抑制、リソソーム障害によって生じるデスシグナルおよび／または自家融解ストレスによって生じるデスシグナルの抑制が含まれてもよい。上述のとおり、開示される治療法において、治療がかならずしも完全である必要はない。一つの実施形態では、治療なしで観察される神経変性と比べて、神経変性は少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上抑制される。
【００２６】
別な実施形態では、本発明は、そのような治療を必要とする対象に神経変性および／または神経変性によって特徴付けられる、またはそれらの病因において神経変性過程に依存する疾患または症状の予防法を提供する。そのような疾患または症状には、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症が含まれるがこれに限定されない。特定の実施形態では、疾患または症状はリソソーム障害および／または自家融解ストレスによって特徴付けられる。
【００２７】
予防方法は、そのような予防を必要とする対象を識別し、前記対象において、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の投与を含む、予防療法を開始することを含む。マクロライド系抗生物質は、ｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質であってもよい。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１またはコンカナマイシンである。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質は、治療上有効な量で投与される。結果として、そのようなマクロライド系抗生物質の投与は疾患または症状を予防する。神経変性の治療には、少なくとも部分的にの神経細胞死の抑制、異常な神経病態（例えば神経の変性があるが限定されない）の抑制、リソソーム障害によって生じるデスシグナルおよび／または自家融解ストレスによって生じるデスシグナルの抑制が含まれてもよい。上述のとおり、開示される予防方法において、予防がかならずしも完全である必要はない。一つの実施形態では、予防なしで観察される神経変性と比べて、神経変性は少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上抑制される。
【００２８】
本書に記載のごとく、マクロライド系抗生物質は神経変性を緩和することが示される。一つの実施形態では、神経変性は、少なくとも部分的にリソソーム障害または自家融解ストレスによって誘起される。例えば、本発明は、特定の濃度のｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質、バフィロマイシンＡ１が、ＣＧＮ内のクロロキンによって生じる神経変性を抑制することを示す（細胞死、カスパーゼ−３活性、ＬＣ３プロセシングによって検査した）。上述のとおり、クロロキンはリソソーム経路の機能障害やある種の自家融解ストレスを誘起し、これは自食胞の増加につながり、リソソーム障害と自家融解ストレスのモデル系として使用できる。代替的な作用機序に限定されることなく、マクロライド系抗生物質は、リソソーム障害および／または自家融解ストレスによって生み出されるデスシグナルをブロックするかもしれず、結果として正常な細胞機能を回復させる。
【００２９】
さらに、クロロキンやフルオロキノロン類（例えば、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、スパルフロキサシンがあるが限定されない）は、小胞の酸性化を妨げ、ミトコンドリア膜の潜在能力を崩壊させ、これがアポトーシスおよび／または細胞死をもたらすことが示されている。例えばクロロキンなどの薬が、疾患と症状、例えばマラリア、関節リウマチ、自己免疫疾患を治療するために使用される が、神経障害や視神経の機能障害などを含むがこれに限定されない、副作用の原因により、これがそれらの有効性を制限することが報告されている。フルオロキノロン類は、骨、関節感染、皮膚感染、尿路感染、前立腺の炎症、重篤な耳感染、気管支炎、肺炎、結核、ある種の性行為感染症（ＳＴＤ）、エイズ患者に発症するある種の感染症を治療するために使用される。そのような薬がリソソームとオートファジー系に影響を与えるのを防ぐことで（例えば、神経細胞死の抑制、異常な神経病態の抑制、リソソーム障害によって生じるデスシグナルおよび／または自家融解ストレスによって生じるデスシグナルの抑制によって）、有益な効果を損なうことなく、そのような薬の副作用は軽減されるかもしれない。
【００３０】
従って、本発明はまた、リソソームのまたはオートファジー経路に少なくとも部分的に影響を与える薬の有害な影響を、治療上有効な量の少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体を、そのような薬と併用して投与することで緩和する、または予防するための治療方法を提供する。本発明のマクロライド系抗生物質は、有益な効果をもたらすが、リソソームまたはオートファジー経路に有害な影響も与えるどのような薬と一緒に使用してもよい。治療は、少なくとも部分的に、神経細胞死の抑制、異常な神経病態の抑制（例えば、神経の変性があるが限定されない）、リソソーム障害によって生じるデスシグナルおよび／または自家融解ストレスによって生じるデスシグナルの抑制を含んでもよい。
【００３１】
本書で説明する治療するおよび／または予防する方法はまた、上述のマクロライド系抗生物質と併用して一つ以上の追加の治療薬をさらに投与することを含んでもよい。
【００３２】
同定する方法
さらに、神経変性によって特徴付けられる、またはそれらの病因において神経変性過程に依存する疾患または症状を治療および／または予防する化合物を同定するために、本発明を使用してもよい。故に、同定された化合物は、上述の治療および／または予防方法において有用なことがある。そのような化合物は、小分子の医薬品、ペプチド、生物学的製剤、様々な非コードＲＮＡ、アンチセンス分子、抗体であってもよい。
【００３３】
そのような化合物を同定するための方法またはアッセイは、リソソームのまたはオートファジー系が少なくとも部分的に機能が障害されている、または障害されるように誘導することができ、細胞株またはモデル系を提供し、前記細胞またはモデルを候補化合物とインキュベートすること、前記化合物の存在下と、前記化合物が存在しない状態で、前記モデル系の特性を決定すること、前記化合物の存在によって前記特性が高められるか、あるいは低減させられるかどうかを決定することを含む。そのような特性は、当業者に現在知られている分析技術を用いて測定可能なものならどのような特性であってもよい。特性の例には、プロテアーゼ活性（例えばカスパーゼ活性、特にカスパーゼ−３活性があるが限定されない）、アポトーシスの生物学的マーカー（例えばカスパーゼ−３があるが限定されない）の活性、またはオートファジー（例えばＬＣ３プロセシングがあるが限定されない）、細胞の生存率、小胞の酸性化、または本書で説明される、または当業者に既知のその他のマーカーまたは検査が含まれるがこれに限定されない。化合物は、本書で説明するように、前記特性を高めるまたは低減させることがある。
【００３４】
医薬組成物
本書で説明する方法で使用するための、上述のマクロライド系抗生物質は、単独で、または当業者に既知の方法で製剤される医薬組成物として投与されてもよい。化合物と医薬品組成を調製するための方法の特定の例は本書で説明され、また限定的な例として見なされるべきではない。さらに、化合物または医薬組成物は、当業者に既知のとおり対象に投与されてもよく、診療の提供者によって決定されてもよい。特定の投与形式が本書で提供されるが、限定的な例とみなされるべきではない。さらに、化合物または医薬組成物を、本書で説明する方法で他の薬剤と一緒に投与してもよい。そのような他の薬剤は、例えば変性の制限または開示される化合物の不活性化によって、または開示される化合物の吸収または活性を高めることによって、開示される化合物の活性を高める薬剤であってもよい。
【００３５】
説明される化合物と医薬組成物は、開示される化合物を有効成分として含む、医薬製剤、例えばエアロゾル、固形、半固形、または液体の形態で用いることができる。さらに、医薬組成物を適切な医薬的に許容できる担体との混合物で用いてもよい。そのような医薬的に許容できる担体には、薬物の応用に適する、有機または無機担体、賦形剤または希釈剤が含まれるがこれに限定されない。有効成分を、錠剤、丸薬、カプセル、吸入剤、坐薬、溶液、エマルジョン、懸濁液、エアロゾル、使用に適したその他の形態にするために、例えば通常の毒性のない医薬的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤と混合してもよい。医薬組成物で使用するための医薬的に許容できる担体は製剤分野でよく知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔｏｒ、２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）で説明されている。そのような原料は、使用される用量や濃度では受容対象に対して毒性を持たず、これには水、タルク、アカシアガム、ゼラチン、三ケイ酸マグネシウム、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素、緩衝液、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、その他の有機酸塩の緩衝液、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、低分子量（約１０残基未満）ペプチド、例えばポリアルギニン、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリジノン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン、単糖類、二糖類、セルロースまたはその誘導体、乳糖、マンニトール、グルコース、マンノース、デキストリン、ジャガイモでんぷんまたはコーンスターチまたはでんぷん糊を含むその他の炭水化物、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール、対イオン例えばナトリウム、および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、プルロニック、またはポリエチレングリコールが含まれるがこれに限定されない。さらに、医薬組成物は助剤を含んでもよく、これには例えば味質改善剤、安定剤、増粘剤、着色料、香料が含まれるが限定されない。
【００３６】
望ましい程度の純度を持つ本発明の化合物を、生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、助剤などと医薬分野で知られるように混合することにより、医薬組成物を保存用または投与用に調製してもよい。そのような医薬組成物は、叙放性製剤または持続放出性製剤として提供されてもよい。
【００３７】
医薬組成物は固形の剤型、例えばカプセル、錠剤、パウダー、または液体の剤型、例えばエリキシル剤、シロップ、懸濁液で経口投与されてもよい。また、医薬組成物は滅菌済みの液体の剤型で非経口で投与されてもよい。さらに、医薬組成物は固形、液体、またはエアロゾルの形態で経粘膜的に、またはパッチ作用または軟膏で経皮的に、非経口で投与されてもよい。様々な種類の経粘膜投与には、気道粘膜投与、鼻粘膜投与、口腔粘膜（例えば舌下や頬粘膜）投与、直腸経粘膜的投与が含まれる。
【００３８】
固体組成、例えば限定されないが錠剤またはカプセルなどを調製するために、均一性の高い組成を作る目的で、適切な医薬的に許容できる担体、例えば伝統的な錠剤化材料（乳糖、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモでんぷん、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、ゴム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ソルビトール、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、第二リン酸カルシウム、その他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存料、着香料、薬理学的に適合する担体）、希釈剤（水、生理食塩水または緩衝液が含まれるが限定されない）と医薬組成物を混合してもよい。均一性の高い組成は、等しく効果的な単位の投薬形態、例えば錠剤、丸薬、カプセルに容易に細分できるように、成分（本書で説明される化合物と医薬的に許容できる担体）が組成中で均一に分散していることを意味する。説明される固体の組成物は、持続性作用の利点をもたらす投薬形態を提供するために、コーティングされるか、または別の方法で混合されてもよい。例えば、錠剤または丸薬は内部投薬成分と外部投薬成分を含むことができ、後者は前者のまわりを包む形態である。二つの成分を、胃の中で分解抵抗性に働き、内部成分が原型のまま胃を通過できるように、あるいは放出を遅らせるようにする腸溶性レイヤーで分けることができる。そのような腸溶性レイヤーまたはコーティングに様々な原料を使用でき、そのような原料は、多くのポリマー酸や、ポリマー酸と、セラック、セチルアルコール、酢酸セルロースとしてのそのような原料の混合物を含む。活性のある化合物は、伝統的な坐薬の基剤、例えばカカオバターまたはその他のグリセリドなどを含む、坐薬またはかん腸などの直腸用の組成物として調製されてもよい。固体の組成物はまた、界面活性剤、潤滑剤、不活性充填剤、例えば乳糖、スクロース、リン酸カルシウム、コーンスターチなどを含むカプセル、例えば硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセルを含んでもよい。
【００３９】
経鼻投与、肺内投与、または吸入のその他の方式による投与については、医薬組成物を溶液または懸濁液の形態でポンプ式スプレー容器から、適切な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、窒素、プロパン、炭酸ガス、またはその他の適切なガス）を用いて、または加圧容器または噴霧器からエアロゾルスプレー方式として、または乾燥粉末として投与してもよい。エアロゾルまたは乾燥粉末形式の場合、定量を投与するために、バルブを使うことで投与される化合物の量（投与量）を決定してもよい。
【００４０】
液体の形態を経口で、非経口で、または経粘膜的に投与されてもよい。液体での投与に適切な形態には、水溶液、適切に香り付けされたシロップ、水性または油性懸濁液、および食用油、例えば綿実油、ごま油、ココナッツ油、またはピーナッツ油とともにエリキシル剤や類似の医薬的賦形剤を用いて、香り付けしたエマルジョンが含まれる。水性懸濁液のための、適切な分散剤または懸濁化剤には、合成天然ゴム、例えばトラガカント、アカシア、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはゼラチンが含まれる。そのような液体製剤を、医薬的に許容できる添加剤、例えば懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは食用硬化脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性賦形剤（例えば、アーモンド脂、油性エステルまたはエチルアルコール）、保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）、人工および天然色素および／または甘味料を用いて、伝統的な手段を用いて調製してもよい。液体製剤は、希釈剤、例えば水とアルコール、例えばエタノール、ベンジル・アルコール、プロピレン・グリコール、グリセリン、医薬的に許容できる界面活性剤、懸濁化剤、または乳化剤を添加した、または添加しないポリエチレンアルコールを含んでもよい。頬粘膜または舌下投与については、組成物は伝統的な方式で調製される錠剤またはトローチ剤の形態であってもよい。薬用キャンディーの形態は、香料、通常はスクロースやアカシアまたはトラガカントに有効成分を含むことができ、トローチ剤は、例えばゼラチンやグリセリン不活性基剤に有効成分を含み、あるいは、有効成分に加えて、担体を含むスクロースやアカシア、エマルジョン、ゲルが当分野で知られている。
【００４１】
開示される化合物（単体または医薬組成物のどちらか）を非経口的投与用に調製してもよい。非経口投与には、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、くも膜下腔投与、関節内投与、心臓内投与、球後投与、インプラント、例えば持続放出性インプラントを用いた投与が含まれるがこれに限定されない。
【００４２】
医薬組成物を、単位用量または多重用量の密封容器、例えばアンプルやバイアル内に入れてもよく、滅菌済み液状賦形剤、例えば注射用蒸留水を使用直前に加えるだけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席の注射溶液や懸濁液を、滅菌パウダー、顆粒、錠剤から調製することができる。注射可能な組成物用の、効果的な医薬的に許容できる担体の要件は、当業者に良く知られている。Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，Ｅｄｓ．，２３８−２５０（１９８２）とＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，６２２−６３０（１９８６）を参照されたい。
【００４３】
医薬組成物は治療上有効な量で投与される。当然のことながら、治療上有効な量は既知の要素、例えば特定の化合物の薬力学的特性と、その投与方式と経路や、対象の年齢、健康状態、体重や、疾患の状態または症状の重篤度とステージや、併用治療の種類や、治療の頻度や、所望の効果に応じて変化する。投与される化合物の総量もまた、投与の経路、時期、頻度だけでなく、化合物の投与に付随する可能性がある副作用の有無、性質、程度や、所望の生理学的効果によって決定される。様々な症状または疾患、特に慢性症状または疾患は、多数の投与を伴う長期の治療を必要とする可能性があることを当業者は理解するであろう。
【００４４】
結果
以下の結果において、使用された方法は、本発明の方法の項と、本書に引用される文献で規定された方法であった。
【００４５】
クロロキンは神経細胞死を誘発する
神経細胞と神経変性へのクロロキンの影響を検討するため、小脳の顆粒神経細胞（ＣＧＮ）を４日間培養し、５〜４０μＭクロロキンで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで２４時間処理し、それらの生存率とカスパーゼ−３様活性度（アポトーシス細胞死に関連する酵素活性）を１６〜２４時間後に測定した（図１Ａと１Ｂ）。クロロキンは、濃度依存性に生存率を低下させ（図１Ａ）、カスパーゼ−３様活性を増加させ（図１Ｂ）、クロロキン濃度≧１０μＭで著明な効果が認められた。クロロキンは、２０μＭで生存率を２４％まで、４０μＭで８％まで低下させた一方で（図１Ａ）、２０−４０μＭでは、６〜７倍のカスパーゼ−３様活性の増加が最大であった（図１Ｂ）。本書で説明する以下の全ての実験については、２０μＭの濃度のクロロキンを用いた。タンパク質合成の阻害物質である、シクロヘキシミドを用いた処理（０．１〜１ｍｇ／ｍｌ）はクロロキンが誘発する細胞死の規模を変化させず（データ示さず）、これはクロロキンの有害な効果は新規のタンパク質合成に依存しないことを示唆している。
【００４６】
クロロキンによる、細胞死とカスパーゼ−３様活性の時間的誘導を検討するために、ＣＧＮにおいて経時変化の研究を行った（図１Ｃと１Ｄ）。これらの実験では、ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、濃度２０μＭのクロロキン処理後、最大４８時間まで測定を行った。クロロキン濃度２０μＭで、生存率は８時間後にわずかに低下し（９３％）、続く４０時間の間に著しく低下し続けた（図１Ｃ）。クロロキン濃度２０μＭで、カスパーゼ３−様活性は、クロロキンを用いた処理後８時間で著しく上昇し、１６時間 （６倍の誘導）で最大となり、２４〜４８時間の間、高い数値を維持した（図１Ｄ）。ＣＧＮ内の、切断されたまたは「活性の」カスパーゼ−３（ＣＬカスパーゼ−３）の経時パターンをウエスタンブロットによる分析で確認した（図２Ａと２Ｂ）、２０μＭのクロロキンを用いた処理の後、８時間まで低濃度で明らかであり、１６時間後に最も強固であった。図２Ａ〜２Ｅでは、ＣＱはクロロキン処理を表し、ＣＴＬは対照を、ＮＴは処理なしを表す。
【００４７】
オートファゴソームに対するクロロキンの影響を検討するため、ＬＣ３のプロセシングをウエスタンブロットで評価した（図２Ａと２Ｃ〜Ｅ）。ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、２０μＭのクロロキン処理後最大４８時間まで測定を行った。ＬＣ３は、細胞質型（ＬＣ３−Ｉ）からのプロセシングの際に、共有結合脂質化を介して、ＬＣ３−ＩＩとしてオートファゴソームの内境界膜と外境界膜に挿入される微小管関連タンパクである９、１０。１８ｋＤａのＬＣ３−Ｉのレベルは、同じ時間で測定した対照サンプルのレベルと比べて、クロロキンを用いた処理後２４〜４８時間で低下したようであった（図２Ａと２Ｃ）。オートファゴソームの膜に特異的なＬＣ３の１６ｋＤａ型１０であるＬＣ３−ＩＩは、クロロキンに曝露した後４時間以内に上昇し、４８時間、高いレベルを維持した（図２Ａと２Ｄ）、これは対照サンプルにはほぼ認められなかった効果であった。ＬＣ３−ＩＩのこの上昇もまた、細胞質のＬＣ３−Ｉの割合に対する、オートファゴソーム結合ＬＣ３−ＩＩの割合の上昇を反映していた（図２Ｅ）。オートファゴソーム結合ＬＣ３−ＩＩの上昇は、ＣＧＮ中のオートファゴソームの数を増加させることによってクロロキンがリソソーム経路を妨げ、正常なオートファジーを崩壊させることを示唆する（すなわち、自家融解ストレスを誘発する）。
【００４８】
バフィロマイシンＡ１はクロロキン誘導性アポトーシスを減退させる
バフィロマイシンＡ１への曝露から２４時間後に、ＣＧＮに対するバフィロマイシンＡ１の影響を評価した（図３Ａと３Ｂ）。これらの実験では、ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、バフィロマイシンＡ１の添加後２４時間後に測定を行った。それ単独では、バフィロマイシンＡ１は濃度≦１ｎＭでは生存率を低下させず、またはカスパーゼ−３様活性を誘導しなかったが、濃度≧１０ｎＭでは生存率を著しく低下させカスパーゼ−３様活性を上昇させた（図３Ａと３Ｂ）。カスパーゼ−３の活性に対するバフィロマイシンＡ１の影響を確認するために、そしてＬＣ３のプロセシングに対するその影響を検討するために、ウエスタンブロットによる分析を行った（図４）。切断カスパーゼ−３（ＣＬカスパーゼ−３）の上昇は、１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１を用いた処理においてのみ明らかだった（図３Ｂ、４Ａと４Ｂ）。バフィロマイシンＡ１を用いた処理ではどの濃度でもＬＣ３−Ｉのレベルは変化しなかったが、１０ｎＭ バフィロマイシンＡ１はＬＣ３−ＩＩのレベルを劇的に上昇させ（図４Ａと４Ｃ）、これはまた、ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの割合の増加を反映していた（図４Ｄ）。
【００４９】
バフィロマイシンＡ１の影響も、中毒量のクロロキン（２０μＭ）の存在下で評価した（図５）。これらの実験では、ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、表示の濃度のバフィロマイシンＡ１とクロロキンの添加の２４時間後に測定を行った。バフィロマイシンＡ１は、検査した全ての濃度でクロロキン誘導性の生存率の減少を著しく減退させ、減退度は１ｎＭで最大であった（バフィロマイシンＡ１の使用で８８％に対して、無しの場合は２４％：図５Ａ）。１０〜１００ｎＭのバフィロマイシンＡ１は生存率のみを低下させたが（図３Ａ）、これらの濃度はなお、クロロキンによって誘導される大幅な生存率の減少を減退させた（図５Ａ）。クロロキン誘導性のカスパーゼ−３様活性の上昇は、０．３〜１ｎＭのバフィロマイシンＡ１を同時に添加したときにのみ低下し、１ｎＭで最大であった（３倍の減少：図５Ｂ）。バフィロマイシンＢ１とクロロキンもまた、上記の条件下の全ての１ｎＭで、クロロキン誘導性（２０μＭ）の生存率の減少を減退させた（データ示さず）。
【００５０】
バフィロマイシンＡ１が古典的なアポトーシス誘導刺激の毒性に影響するかどうかを検討するために、ＣＧＮ培養系でカスパーゼ−３様活性を著しく上昇させる濃度である（データ示さず）、０．１μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）でＣＧＮを２４時間処理した（図５Ｃ）。スタウロスポリンを用いた２４時間の処理により、生存率は平均４４％まで低下し、この効果は１ｎＭバフィロマイシンＡ１との同時投与で変化しなかった。しかし、１０ｎＭバフィロマイシンＡ１を用いた処理により、スタウロスポリン処理ＣＧＮの生存率が２０％までさらに低下した。
【００５１】
バフィロマイシンＡ１のカスパーゼ−３の活性に対する影響を確認するため、そしてクロロキン（２０μＭ）の存在下で、ＬＣ３のプロセシングに対するその影響を検討するために、ウエスタンブロットによる分析を行った（図６Ａ〜Ｄ）。これらの実験では、ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、表示の濃度のバフィロマイシンＡ１とクロロキンの添加の２４時間後に測定を行った。切断カスパーゼ−３（ＣＬカスパーゼ−３）のクロロキン誘導性の上昇は、≦１ｎＭバフィロマイシンＡ１と同時に処理することにより減退された（図６Ａと６Ｂ）。バフィロマイシンＡ１は、ＬＣ３−ＩＩのクロロキン誘導性のレベルを減退させなかったが、ＬＣ３−Ｉのレベルを増加させたように思われ（図６Ｃ）、これは検査したバフィロマイシンＡ１の全ての濃度での、ＬＣ３−Ｉに対するＬＣ３−ＩＩの割合の減少を反映している（図６Ａと６Ｄ）。
【００５２】
クロロキン（２０μＭ）および／またはバフィロマイシンＡ１を用いる処理の２４時間後に、生存率マーカー、カルセインＡＭの存在下で、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（ＬＴＲ）を用いてインキュベートすることにより液胞の酸性化を測定した（図７）。これらの実験では、ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、表示の濃度のバフィロマイシンＡ１とクロロキンの添加の２４時間後に測定を行った。それ単独では、１ｎＭ バフィロマイシンＡ１はＬＴＲの染色パターンを変化させず、対照細胞と比べて生存率を低下させることもなかった（図７Ａと７Ｂ）。対照的に、１０ｎＭバフィロマイシンＡ１を用いた処理は、ＬＴＲによる液胞の酸性化の検出を妨げただけでなく、生存ＣＧＮの数も減少させ（図７Ｃ）、これはクロロキンの存在下での、または存在しない場合と同様の効果であった（図７Ｃと７Ｆ）。クロロキンを用いた処理は生存ＣＧＮの数を減少させた（図７Ｄ）。しかし、このクロロキンの２４時間処理に耐えた、減少した一群のＣＧＮでは、対照細胞に認められたものよりも強度が強いＬＴＲ染色を示した（図７Ｄ）。１ｎＭバフィロマイシンＡ１とクロロキンを同時に添加すると、生存ニューロンの数が増加し、これはまたクロロキンまたはバフィロマイシンＡ１単独を用いた処理と比べ、ＬＴＲ染色の強度の増強も同時に示した（図７Ｅ）。
【００５３】
Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのこの過程における役割を評価するために、Ｂａｘ欠損ＣＧＮ（ＫＯと表記）から培養物を調製した（図８Ａ〜Ｅ）。これらの実験では、ＣＧＮ（野生型、ＷＴと表記、およびＢａｘ欠損、ＫＯと表記）をｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、表示の濃度のバフィロマイシンＡ１とクロロキンの添加の２４時間後に測定を行った。ＢａｘはプロアポトーシスのＢｃｌ−２ファミリーのメンバーであり、クロロキン誘導性の細胞死に影響を与え、リソソーム障害と自家融解ストレスに起因する細胞死に関与すると主張されてきた。Ｂａｘの標的欠損は、野生型（ＷＴ）と比較して２４時間目に測定された、クロロキン誘導性（２０μＭ）の、生存率における減少（図８Ａ）と、カスパーゼ−３様活性の増加（図８Ｂ）を減退させたが、１ｎＭバフィロマイシンＡ１によってもたらされた防御を上回ることはなかった（図８Ａと８Ｂ）。反対に、Ｂａｘの欠損は、１０ｎＭバフィロマイシンＡ１を用いた２４時間の処理によって誘導された、生存率の低下とカスパーゼ−３様活性の増加を妨げた（図８Ｃと８Ｄ）。Ｂａｘ標的欠損のカスパーゼ−３活性への影響をウエスタンブロットで確認した（図８Ｅ）。さらに、ウエスタンブロットによる分析は、Ｂａｘの欠損がＬＣ３−ＩＩのクロロキン誘導性の症状を妨げなかったことを示した（図８Ｅ）。
【００５４】
カルパインの作用によって、Ｂａｘを、２１ｋＤａの前駆体（ｐ２１）から１８ｋＤａのフラグメントへ（ｐ１８）切断することができる４１。Ｂａｘのｐ１８は、ミトコンドリアレベルでその細胞死作用を高めることが示されている。図８Ｆは、ＣＧＮにおいて、クロロキン（２０μＭで２４時間）とバフィロマイシンＡ１（１０ｎＭで２４時間）がｐ１８ Ｂａｘの量を増加させたことを示す。ｐ１８ Ｂａｘレベルのこの増加は、１ｎＭバフィロマイシンＡ１によって劇的に弱まった。これは、マクロライド系抗生物質が、アポトーシスとは別のメカニズムでｐ１８ Ｂａｘを活性化するデスシグナル（例えばカルパイン活性の誘導があるが、これに限定されない）の減弱を介して、それらが持つ神経保護効果を少なくとも部分的に誘導する可能性があることを示唆する。Ｂｉｄ（別のＢｃｌ−２ファミリーメンバー）の切断はクロロキンによって増加せず、これはＢｉｄの活性化は、ＣＧＮにおけるクロロキン誘導性の効果に関与しないことを示唆する（データ示さず）。
【００５５】
クロロキンがカスパーゼ−３の活性の劇的な上昇を誘導したため、このエフェクターであるカスパーゼの、クロロキン（２０μＭで２４時間）が誘発する細胞死の経路における相対的な位置を検討するために、ＣＧＮの培養物をカスパーゼ−３欠損マウスから調製した。カスパーゼ−３様活性における著しい減弱が認められたが、カスパーゼ−３の不在は、生存率（図９Ａ）におけるクロロキン誘導性の減少を妨げなかった（図９Ｂ）。他のカスパーゼ、例えばカスパーゼ−９がクロロキン誘導性の細胞死に重要であるかどうかを検討するため、野生型ＣＧＮを、広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤である、ＢＯＣ−アスパルチル（Ｏｍｅ）−フルオロメチルケトン（ＢＡＦ）で処理した。この阻害剤を用いた処理では、クロロキン誘導性の細胞死（２０μＭで２４時間）は弱まらなかった（図９Ｃ）が、カスパーゼ−３様活性のクロロキン誘導性上昇を著しく減退させた（図９Ｄ）。
【００５６】
上記の結果は、例えばバフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシンが含まれるが限定されない、マクロライド系抗生物質の投与が、神経細胞におけるクロロキン誘導性細胞死を、劇的かつ著しく減退させたことを示す。この効果は逆Ｕ字型の濃度依存性によって特徴付けられた。バフィロマイシンＡ１については、この効果は１ｎＭの濃度で最大であった。さらに、１ｎＭバフィロマイシンＢ１とコンカナマイシンも、神経細胞におけるクロロキン誘導性の細胞死を抑制した。この濃度のバフィロマイシンＡ１は液胞の酸性化を変化させず、またはオートファゴソームの形成を誘導しなかった。さらに、これらの濃度のマクロライド系抗生物質は、無細胞系における液胞のＡＴＰａｓｅの抑制に、最小限の影響を与えることがこれまでに示されている２１，２２。しかし、１０〜１００ｎＭのバフィロマイシンＡ１は、ＣＧＮ生存率と細胞死経路の誘導を低下させるその能力にもかかわらず、低い濃度ほど強固ではないにしても、クロロキン誘導性の細胞死を抑制した。これは、≧１０ｎＭでの、内因性のアポトーシス経路のバフィロマイシンＡ１依存性の誘導によるものと思われる。≧１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１の有無にかかわらず、クロロキン誘導性カスパーゼ−３様活性が最大であったことから、高濃度のバフィロマイシンＡ１が、クロロキン誘導性細胞死の明確な、カスパーゼ依存性の経路を妨げる可能性もある。従来は、様々な細胞培養モデルにおけるバフィロマイシンＡ１の効果は、一般的に≧１０ｎＭの濃度を用いて報告されてきた。１９，２０，２７、２８
【００５７】
１ｎＭのバフィロマイシンＡ１は、クロロキンによる傷害に耐えたＣＧＮの数を増やしただけでなく、濃染した、ＬＴＲ陽性の酸性の小胞の数も増やした。オートファゴソームの数の増加と同時に起こり、続いて起こるミトコンドリア膜の潜在能力の崩壊と、結果として起こるアポトーシスを示す細胞でのみ消失する２０、ＬＴＲ染色の一時的で強固な増加は、クロロキンを用いた処理でこれまでに説明されている１９，２０。本研究では、ＬＴＲの濃染を示すＣＧＮは、２４時間のクロロキンの傷害に耐え、ミトコンドリアの機能が損なわれていない細胞の集団に相当するかもしれない。
【００５８】
ＬＴＲ陽性の小胞は、成熟する間に酸性度が増加する、後期のオートファゴソームの集団に相当するかもしれない３２、３３。リソソームの機能を崩壊させることで、クロロキンは後期のオートファゴソームとの融合を妨げているのかもしれず、これは最終的に後期のオートファゴソームの蓄積をもたらす。一方で、１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１を用いた処理は、クロロキンの有無にかかわらずＬＴＲ染色を完全に妨げた。液胞のＡＴＰａｓｅを完全に阻害する濃度のバフィロマイシンＡ１は、融合を妨ることで初期のオートファゴソームの成熟を妨げるかもしれず、故にｐＨが高いためにＬＴＲで検出できなくなるオートファゴソームの蓄積をもたらす。生化学的には、ＬＣ３−ＩＩは初期と後期の両方のオートファゴソームで証明されており３４、これはクロロキンと１０ｎＭのＢａｆＡ１の両方が、ＬＣ３−ＩＩレベルを上昇させながらも、ＬＴＲの染色パターンの差をもたらす理由を示すものである。
【００５９】
バフィロマイシンＡ１に観察された濃度依存性の二相性は、Ｂａｘが無い場合のその効果によって注目される。クロロキン誘導性の細胞死が部分的にＢａｘ依存性であることを結果は明確に示すが、１ｎＭのバフィロマイシンＡ１によってもたらされたクロロキンに対する防御の程度は、Ｂａｘの欠損によってもたらされるそれよりはるかに大きかった。バフィロマイシンＡ１が、カスパーゼ−３の活性を著しく減退させｐ１８ Ｂａｘの形成を抑制することを考慮すると、バフィロマイシンＡ１の効果はＢａｘの上流に位置する可能性があり、また内因性のアポトーシス経路および／または古典的なアポトーシスに関連するだけでなく、細胞死をもたらす他の経路の活性化を妨げる可能性がある（図１０）。Ｂａｘの欠損がクロロキン誘導性のカスパーゼ−３の活性化を実質的に妨げたことから、このバフィロマイシンＡ１の補助的な防御効果を、例えば重複する調節機能をＢａｘと共有する、Ｂａｋなどの分子の機能阻害に起因すると考えることはできない４，３６。対照的に、Ｂａｘの欠損は１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１によって起こるカスパーゼ−３様活性の誘導と生存率の低下を著しく弱め、これはクロロキンの効果と同じように、高濃度のバフィロマイシンＡ１によるオートファジーの抑制がＢａｘ依存性のアポトーシスを誘導することを示唆する。
【００６０】
クロロキンはカスパーゼ−３の強固な活性化を誘導したが、カスパーゼ−３の標的欠損とカスパーゼの広範な薬理学的阻害ではクロロキン誘導性の細胞死を防げなかった。これまでに、培養した終脳のニューロンで同様の結果が得られており１８、これはクロロキン誘導性神経細胞死の拘束点がカスパーゼ活性化の上流に位置することを示唆する。これらの所見は、一般的なカスパーゼ阻害剤を用いた処理で減退した、ＨｅＬａ細胞のクロロキン誘導性の細胞死とは対照的である１９。
【００６１】
本発明は、バフィロマイシンＡ１の機能における、新規の濃度依存性の二相性を明らかにする。マクロライド系抗生物質の濃度が≦１ｎＭでは、マクロライド系抗生物質は細胞の生存率のクロロキン誘導性の低下を防ぐ。他の代替的な機構的説明に限定されないが、マクロライド系抗生物質（バフィロマイシンＡ１で説明するように）はリソソーム障害および／または自家融解ストレスに起因するデスシグナルを抑制する可能性がある。そのような抑制が、Ｂａｘとカスパーゼ−３活性化の上流に位置することをデータは示唆する。そのようなデスシグナルを阻害することで、正常な神経機能が回復され、細胞死が防がれるまたは少なくなる。これらの結果は、低濃度のマクロライド系抗生物質の神経保護薬としての役割を示唆する。従って、自家融解ストレスおよび／またはリソソーム障害によって誘導される神経変性を軽減することにより、マクロライド系抗生物質は神経細胞の生存率を維持し、神経細胞の機能を保護する。
【００６２】
前述の説明は、本発明の化合物と方法を図示し説明する。さらに、本発明は化合物と方法の一部の実施形態を説明するにすぎないが、上述のとおり、本発明の他の様々な組み合わせ、変更、環境で使用することができ、上記の教えおよび／または関連技術の技術または知識にふさわしい、本書で表される発明概念の範囲内で変更または修正することができることを理解するべきである。上記、本書で開示される実施形態は、本発明を実施する上で知られており、最良の形態を説明すること、また当業者がそのような実施形態、またはその他の実施形態において、本発明の特定の応用または使用に必要とされる様々な修正とともに、本発明を利用できるようにすることを意図している。従って、説明は、本発明を本書で開示される形態に限定することを意図するものではない。本書に引用する全ての文献は、完全に本発明で説明するものとして、参照することにより組み込まれる。
【００６３】
方法
試薬
特に記載のない限り、試薬はＳｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００６４】
動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを全ての実験で使用した。Ｂａｘとカスパーゼ−３が欠損したマウスの作成はこれまでに説明されている３７〜３９。これまでに説明されているように、遺伝的な状態は、（マウスの）尾から抽出したＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析によって決定された３８，３９。ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓのガイドラインに従ってマウスを飼育した。全ての動物プロトコールは、アラバマ大学バーミンガム校のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。
【００６５】
細胞培養
小脳顆粒神経細胞（ＣＧＮ）を、これまでに説明されたように生後７日のマウスから単離した４０。ＣＧＮをポリ−Ｌ−リジンコートのプレートに、１２５０細胞／ｍｍ２の密度で接種した。生存率とカスパーゼ活性のアッセイに、４８ウェルのプレートを使用し、ウエスタンブロットによる分析には１００ｍｍのディッシュを使用し、液胞の酸性化の分析には４ウェルのＰａｒａｄｏｘ ｃｈａｍｂｅｒスライド（Ａｇｅｎｅ）を使用した。
【００６６】
ＣＧＮ を４日目にｉｎ ｖｉｔｒｏで処理した。ＢａｆＡ１（最終濃度０．１〜１００ｎＭ）、ＢＯＣ−アスパルチル（Ｏｍｅ）−フルオロメチルケトン（最終濃度１５０μＭ：ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、オハイオ州オーロラ）、またはシクロヘキシミド（最終濃度０．０１〜１μｇ／ｍｌ）の存在下、または存在しない状態で、馴化培地を、クロロキン（最終濃度５−４０μＭ）を含む、または含まない新鮮培地と取替えた。ＣＧＮの別の培養物も、ＢａｆＡ１（最終濃度１〜１０ｎＭ）の存在下、または存在しない状態で、スタウロスポリン（０．１μＭ）で２４時間処理した。
【００６７】
生存率とカスパーゼ３様活性の測定
細胞の生存率（ＣａｌｃｅｉｎＡＭ蛍光性物質変換アッセイ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーンによる）とカスパーゼ〜３様活性（蛍光性物質ＤＥＶＤ切断アッセイによる）を、これまでに説明されているように行い４０、処理なしの対照と比較して表した。
【００６８】
ＬＴＲを用いたＣＧＮの標識
４ウェルのｐｅｒｍａｎｏｘ ｃｈａｍｂｅｒ スライド中で発育したＣＧＮから馴化培地を除去した。ＬＴＲ（０．０５μＭ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）とカルセインＡＭ（２．５μｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）をＬｏｃｋｅ緩衝液中で調製し、各ウェルに３７℃、３０分間加えた。このインキュベーション後、細胞をＬｏｃｋｅ緩衝液で洗浄し、封入した。落射蛍光機能を備えたＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡で画像を得た。
【００６９】
ウエスタンブロット
Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて３７℃で５分間インキュベーションすることにより、細胞をそれらの基質から剥離した。馴化培地をと細胞を遠心分離した（７００×ｇ、５分間、４℃）。上清を吸引し、１ｍｌの氷冷ＰＢＳで再懸濁した後、再び遠心分離した（７００ｘｇ、５分間、４℃）。得られたペレットを、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＳＤＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％プロテアーゼ阻害剤混合液、１％ホスファターゼ阻害剤混合液（Ｓｉｇｍａ）を含む、ｌｙｓｉｓバッファー中に再懸濁した。ＤＮＡをせん断するために、細胞溶解物を超音波分解した後、遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）、得られた上清を（細胞溶解物全体を取る）新しい試験管に移した。引き続き、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク濃度を決定した。等量のタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、ＰＶＤＦに転写された。転写された後、ブロットをおよそ３７ｋＤａで半分に切断した。タンパク質負荷を正常化する目的で、最初に、切断されたまたは活性なフラグメントに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて、低分子量のブロットを、活性なカスパーゼ−３を検出するために使用した、β−ＩＩＩチュブリンの検出のために、高分子量のブロットを使用した（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。ブロットを室温で１時間ブロッキングし、ＲＴ（５％ミルク）、続いて一次抗体で一晩インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＴＢＳでブロットを洗浄した後、二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｂｉｏｒａｄ）で室温１時間インキュベートし、続いて洗浄した。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナルを検出した。切断カスパーゼ−３を検出した後、Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてボトムブロットを切り出し、上述の同じウエスタンブロットプロトコールを用いてウサギ抗−ＬＣ３（Ｕｃｈｉｙａｍａラボより提供）でプローブした。ブロットをＢｉｏｒａｄ Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウェアを用いて密度測定でスキャンした。
【００７０】
統計
一元配置分散分析ＡＮＯＶＡ（３つ以上の集団の場合）または両側、対応のないｔ検定（二つの集団の場合）のいずれかを用いて処理による有意な効果を分析した。処理による遺伝子型特異的な効果を、有意性について二元配置分散分析ＡＮＯＶＡで分析した。ボンフェローニ検定を用いて事後解析を行った。ｐ＜０．０５を有意であると考えた。
【００７１】
参考文献
１．Ｓｃｈｗｅｉｃｈｅｌ ＪＵ，Ｍｅｒｋｅｒ ＨＪ（１９７３）Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｐｒｅｎａｔａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ．７：２５３−２６６
２．Ｃｌａｒｋｅ ＰＧ（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ：ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ａｎａｔ Ｅｍｂｒｙｏｌ（Ｂｅｒｌ）．１８１：１９５−２１３
３．Ｂｒｅｄｅｓｅｎ ＤＥ（２０００）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１７：８０１−８１０
４．Ｐｕｔｃｈａ ＧＶ，Ｈａｒｒｉｓ ＣＡ，Ｍｏｕｌｄｅｒ ＫＬ，Ｅａｓｔｏｎ ＲＭ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ ＥＭ，Ｊｒ．（２００２）Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｎｄ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５７：４４１−４５３
５．Ｓｈａｃｋａ ＪＪ，Ｒｏｔｈ ＫＡ（２００５）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｃｌ−２ ｆａｍｉｌｙ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｌ Ｄｉｓｏｒｄ．４：２５−３９
６．Ｋｌｉｏｎｓｋｙ ＤＪ，Ｅｍｒ ＳＤ（２０００）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９０：１７１７−１７２１
７．Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ Ｅ−Ｌ（２００５）Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ Ｖａｃｕｏｌｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．１：１−１０
８．Ｌｕｍ ＪＪ，ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ ＲＪ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ（２００５）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｍｅｔａｚｏａｎｓ：ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｎｄ ｏｆ ｐｌｅｎｔｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：４３９−４４８
９．Ｉｃｈｉｍｕｒａ Ｙ，Ｋｉｒｉｓａｋｏ Ｔ，Ｔａｋａｏ Ｔ，Ｓａｔｏｍｉ Ｙ，Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ Ｙ，Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｎ，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｎ，
Ｔａｎｉｄａ Ｉ，Ｋｏｍｉｎａｍｉ Ｅ，Ｏｈｓｕｍｉ Ｍ，Ｎｏｄａ Ｔ ａｎｄ Ｏｈｓｕｍｉ Ｙ（２０００）Ａ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｙｓｔｅｍ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．４０８：４８８−４９２
１０．Ｋａｂｅｙａ Ｙ，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｎ，Ｕｅｎｏ Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ａ，Ｋｉｒｉｓａｋｏ Ｔ，Ｎｏｄａ Ｔ，Ｋｏｍｉｎａｍｉ Ｅ，Ｏｈｓｕｍｉ Ｙ ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｔ（２０００）ＬＣ３，ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｙｅａｓｔ Ａｐｇ８ｐ，ｉｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｆｔｅｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９：５７２０−５７２８
１１．Ｌｕｍ ＪＪ，Ｂａｕｅｒ ＤＥ，Ｋｏｎｇ Ｍ，Ｈａｒｒｉｓ ＭＨ，Ｌｉ Ｃ，Ｌｉｎｄｓｔｅｎ Ｔ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ（２００５）Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ．１２０：２３７−２４８
１２．Ｂａｉｒｄ ＪＫ（２００５）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｄｒｕｇｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３５２：１５６５−１５７７
１３．Ｌａｉ ＪＨ，Ｈｏ ＬＪ，Ｌｕ ＫＣ，Ｃｈａｎｇ ＤＭ，Ｓｈａｉｏ ＭＦ ａｎｄ Ｈａｎ ＳＨ（２００１）Ｗｅｓｔｅｒｎ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｎｔｉｒｈｅｕｍａｔｉｃ ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｕｓｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｓｐａｓｅ ｃａｓｃａｄｅｓ ａｎｄ ｉｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ Ｆａｓ／Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６９１４−６９２４
１４．Ｉｓｓａ ＳＮ，Ｒｕｄｅｒｍａｎ ＥＭ（２００４）Ｄａｍａｇｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｈａｒｄ−ｈｉｔｔｉｎｇ，ｅａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｔｏ ｃｕｒｂｉｎｇ ｊｏｉｎｔ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｐｏｓｔｇｒａｄ Ｍｅｄ．１１６：１４−１４
１５．Ｗｏｚｎｉａｃｋａ Ａ，ＭｃＣａｕｌｉｆｆｅ ＤＰ（２００５）Ｏｐｔｉｍａｌ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ ｉｎ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．６：１−１１
１６．ｄｅ Ｄｕｖｅ Ｃ５ ｄｅ Ｂａｒｓｙ Ｔ，Ｐｏｏｌｅ Ｂ，Ｔｒｏｕｅｔ Ａ，Ｔｕｌｋｅｎｓ Ｐ ａｎｄ Ｖａｎ Ｈｏｏｆ Ｆ（１９７４）Ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ．Ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２３：２４９５−２５３１
１７．Ｓｅｇｌｅｎ ＰＯ，Ｇｏｒｄｏｎ ＰＢ（１９８０）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ ｍｏｎｏａｍｉｎｅｓ，ｄｉａｍｉｎｅｓ，ａｍｉｎｏ ａｌｃｏｈｏｌｓ，ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｍｉｎｏ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８：４６８−４７５
１８．Ｚａｉｄｉ ＡＵ，ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ ＪＳ，Ｋｌｏｃｋｅ ＢＪ，Ｌａｔｈａｍ ＣＢ，Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ ＳＪ，Ｆｌａｖｅｌｌ ＲＡ，Ｓｃｈｍｉｄｔ ＲＥ ａｎｄ Ｒｏｔｈ ＫＡ（２００１）Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｐ５３ ａｎｄ Ｂｃｌ−２ ｆａｍｉｌｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｕｔ ｃａｓｐａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．６０：９３７−９４５
１９．Ｂｏｙａ Ｐ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｏｌｏ ＲＡ，Ｐｏｎｃｅｔ Ｄ，Ａｎｄｒｅａｕ Ｋ，Ｖｉｅｉｒａ ＨＬ，Ｒｏｕｍｉｅｒ Ｔ，Ｐｅｒｆｅｔｔｉｎｉ ＪＬ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ（２００３）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｔｅｐ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２２：３９２７−３９３６
２０．Ｂｏｙａ Ｐ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｏｌｏ ＲＡ，Ｃａｓａｒｅｓ Ｎ，Ｐｅｒｆｅｔｔｉｎｉ ＪＬ，Ｄｅｓｓｅｎ Ｐ，Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅ Ｎ，Ｍｅｔｉｖｉｅｒ Ｄ，Ｍｅｌｅｙ Ｄ，Ｓｏｕｑｕｅｒｅ Ｓ，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｔ，Ｐｉｅｒｒｏｎ Ｇ，Ｃｏｄｏｇｎｏ Ｐ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ（２００５）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：１０２５−１０４０
２１．Ｂｏｗｍａｎ ＥＪ，Ｓｉｅｂｅｒｓ Ａ ａｎｄ Ａｌｔｅｎｄｏｒｆ Ｋ（１９８８）Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎｓ：ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ＡＴＰａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８５：７９７２−７９７６
２２．Ｄｒｏｓｅ Ｓ，Ｂｉｎｄｓｅｉｌ ＫＵ，Ｂｏｗｍａｎ ＥＪ，Ｓｉｅｂｅｒｓ Ａ，Ｚｅｅｃｋ Ａ ａｎｄ Ａｌｔｅｎｄｏｒｆ Ｋ（１９９３）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎｓ ａｎｄ ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎｓ ｏｎ Ｐ− ａｎｄ Ｖ−ｔｙｐｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：３９０２−３９０６
２３．Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ａ，Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｙ，Ｆｕｔａｉ Ｍ ａｎｄ Ｔａｓｈｉｒｏ Ｙ（１９９１）Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａｌ，ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ−ｔｙｐｅ Ｈ（＋）−ＡＴＰａｓｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６６：１７７０７−１７７１２
２４．Ｙａｍａｍｏｔｏ Ａ，Ｔａｇａｗａ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｔ，Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｙ，Ｍａｓａｋｉ Ｒ ａｎｄ Ｔａｓｈｉｒｏ Ｙ（１９９８）Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａｌ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｖａｃｕｏｌｅｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ．２３：３３−４２
２５．Ｎｉｓｈｉｈａｒａ Ｔ，Ａｋｉｆｕｓａ Ｓ，Ｋｏｓｅｋｉ Ｔ，Ｋａｔｏ Ｓ，Ｍｕｒｏ Ｍ ａｎｄ Ｈａｎａｄａ Ｎ（１９９５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ ｔｙｐｅ Ｈ（＋）− ＡＴＰａｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２１２：２５５−２６２
２６．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｋ，Ｗａｒｉｔａｎｉ Ｔ，Ｎｏｔｏ Ｍ，Ｔａｋｉｚａｗａ Ｋ，Ｍｉｎｅｍｏｔｏ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ａ ａｎｄ Ｏｈｋｕｍａ Ｓ（１９９６）Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａｌ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３９８：６１−６６
２７．Ｋａｎｚａｗａ Ｔ，Ｋｏｎｄｏ Ｙ，Ｉｔｏ Ｈ，Ｋｏｎｄｏ Ｓ ａｎｄ Ｇｅｒｍａｎｏ Ｉ（２００３）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｒｓｅｎｉｃ ｔｒｉｏｘｉｄｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：２１０３−２１０８
２８．Ｋａｎｚａｗａ Ｔ，Ｇｅｒｍａｎｏ ＩＭ，Ｋｏｍａｔａ Ｔ，Ｉｔｏ Ｈ，Ｋｏｎｄｏ Ｙ ａｎｄ Ｋｏｎｄｏ Ｓ（２００４）Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１１：４４８−４５７
２９．Ｌｅｅ ＣＹ，Ｂａｅｈｒｅｃｋｅ ＥＨ（２００１）Ｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２８：１４４３−１４５５
３０．Ｍａｒｔｉｎ ＤＮ，Ｂａｅｈｒｅｃｋｅ ＥＨ（２００４）Ｃａｓｐａｓｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１３１：２７５−２８４
３１．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｏｌｏ ＲＡ，Ｂｏｙａ Ｐ，Ｐａｕｌｅａｕ ＡＬ，Ｊａｌｉｌ Ａ，Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅ Ｎ，Ｓｏｕｑｕｅｒｅ Ｓ，Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ ＥＬ，Ｐｉｅｒｒｏｎ Ｇ，Ｓａｆｔｉｇ Ｐ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ（２００５）Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ／ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｐａｒａｄｏｘ：ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｅｆｏｒｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｄｅａｔｈ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．
３２．Ｄｕｎｎ ＷＡ，Ｊｒ．（１９９０）Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ：ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｖａｃｕｏｌｅ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１０：１９３５−１９４５
３３．Ｐｕｎｎｏｎｅｎ ＥＬ，Ａｕｔｉｏ Ｓ，Ｍａｒｊｏｍａｋｉ ＶＳ ａｎｄ Ｒｅｕｎａｎｅｎ Ｈ（１９９２）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ａｎｄ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４０：１５７９−１５８７
３４．Ｊａｇｅｒ Ｓ，Ｂｕｃｃｉ Ｃ，Ｔａｎｉｄａ Ｉ，Ｕｅｎｏ Ｔ，Ｋｏｍｉｎａｍｉ Ｅ，Ｓａｆｔｉｇ Ｐ ａｎｄ Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ ＥＬ（２００４）Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｒａｂ７ ｉｎ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｔｅ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｖａｃｕｏｌｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１７：４８３７−４８４８
３５．Ｔａｎｉｄａ Ｉ，Ｍｉｎｅｍａｔｓｕ−Ｉｋｅｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｕｅｎｏ Ｔ ａｎｄ Ｋｏｍｉｎａｍｉ Ｅ（２００５）Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｔｕｒｎｏｖｅｒ，ｂｕｔ Ｎｏｔ ａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｅｖｅｌ，ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＬＣ３ ｉｓ ａ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．１：８４−９１
３６．Ｗｅｉ ＭＣ，Ｚｏｎｇ ＷＸ，Ｃｈｅｎｇ ＥＨ，Ｌｉｎｄｓｔｅｎ Ｔ，Ｐａｎｏｕｔｓａｋｏｐｏｕｌｏｕ Ｖ，Ｒｏｓｓ ＡＪ，Ｒｏｔｈ ＫＡ，ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ＧＲ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ ａｎｄ Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ ＳＪ（２００１）Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＢＡＸ ａｎｄ ＢＡＫ：ａ ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ ｇａｔｅｗａｙ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅａｔｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９２：７２７−７３０
３７．Ｋｎｕｄｓｏｎ ＣＭ，Ｔｕｎｇ ＫＳ，Ｔｏｕｒｔｅｌｌｏｔｔｅ ＷＧ，Ｂｒｏｗｎ ＧＡ ａｎｄ Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ ＳＪ（１９９５）Ｂａｘ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ａｎｄ ｍａｌｅ ｇｅｎｕ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７０：９６−９９
３８．Ｋｕｉｄａ Ｋ，Ｚｈｅｎｇ ＴＳ，Ｎａ Ｓ，Ｋｕａｎ Ｃ，Ｙａｎｇ Ｄ，Ｋａｒａｓｕｙａｍａ Ｈ，Ｒａｋｉｃ Ｐ ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ ＲＡ（１９９６）Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ＣＰＰ３２−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ．３８４：３６８−３７２
３９．Ｓｈｉｎｄｌｅｒ ＫＳ，Ｌａｔｈａｍ ＣＢ ａｎｄ Ｒｏｔｈ ＫＡ（１９９７）Ｂａｘ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｂｃｌ−ｘ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：３１１２−３１１９
４０．Ｎｏｗｏｓｌａｗｓｋｉ Ｌ，Ｋｌｏｃｋｅ ＢＪ ａｎｄ Ｒｏｔｈ ＫＡ（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．６４：４９０−４９７
４１．Ｗｏｏｄ，ＤＥ ａｎｄ Ｎｅｗｃｏｍｂ，ＥＷ（２０００）Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｂａｘ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｔｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５６：３７５−３８２
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、クロロキンが細胞の生存率を低下させ、小脳の顆粒神経細胞（ＣＧＮ）のカスパーゼ−３様活性を増加させることを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、％対照（ＣＴＬ）と分別カスパーゼ−３様活性度（アポトーシスのマーカー）（図１Ｂ）で表す生存率（図１Ａ）を、方法の項で説明するようにクロロキン（５〜４０μＭ）で処理後２４時間後に測定した。生存率（図１Ｃ）とカスパーゼ−３様活性（図１Ｄ）も、方法の項で説明するように、２０μＭ クロロキンで処理後最大４８時間後まで測定した。少なくとも三回反復した、独立した三回の実験は、検査した各時間ポイントと濃度を表す。処理と時間の有意な効果を、一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。図１Ａと１Ｂに関しては、ｐ＜０．０５（＊はＣＴＬと比較して、†は５μＭのクロロキンと比較して、‡は１０μＭのクロロキンと比較して、♯は２０μＭのクロロキンと比較して）である。図１Ｃと１Ｄに関しては、 ｐ＜０．０５（＊０時間と比較して、†８時間と比較して、‡１６時間と比較して、♯は２４時間と比較して）である。
【図２】図２Ａ−２Ｅは、クロロキンがＣＧＮにアポトーシスの生物学的マーカー（カスパーゼ−３）と自家融解ストレス（ＬＣ３−ＩＩ）を引き起こすことを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。代表的なウエスタンブロット（図２Ａ）は、０時間の処理なしの（ＮＴ）サンプル、また４〜４８時間の、対照（ＣＴＬ）またはクロロキン（２０μＭ、ＣＱ）処理溶解産物での、切断カスパーゼ−３の定量とＬＣ３の切り出しを示す。β−ＩＩＩ−チュブリンのレベル、ならびにＬＣ３−ＩＩ／Ｉ（図２Ｅ）の比と比較して表した、切断カスパーゼ−３（アポトーシスのマーカー）（図２Ｂ）と、ＬＣ３−Ｉ（図２Ｃ）とＬＣ３−ＩＩ（自家融解ストレスのマーカー）（図２Ｄ）のレベルを評価するために、少なくとも３つの独立した実験を使用した。
【図３】図３Ａと３Ｂは、バフィロマイシンＡ１が、濃度依存性にＣＧＮの生存率を低下させ、カスパーゼ−３様活性を上昇させることを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。生存率（図３Ａ）とカスパーゼ−３様活性度（アポトーシスのマーカー）（図３Ｂ）を、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（０〜１００ｎＭ）の投与後、２４時間後に測定した。少なくとも三回反復した、独立した三回の実験は、検査した各時間ポイントと濃度を表す。処理の有意な効果は、一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊は０、０．１と０．３ｎＭのバフィロマイシンＡ１に比較して†は１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１に比較して）である。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、ＣＧＮにおいて、バフィロマイシンＡ１が用量依存性にアポトーシスのマーカーと自家融解ストレスを調節することを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。代表的なウエスタンブロット（図４Ａ）は、対照細胞（ＣＴＬ）での、溶解物における切断カスパーゼ−３の定量とＬＣ３のプロセシング、また様々な濃度のバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡｌ）の２４時間の投与を示す。β−ＩＩＩ−チュブリンのレベル、ならびにＬＣ３−ＩＩ／Ｉ（図４Ｄ）の比と比較して表した、切断カスパーゼ−３（アポトーシスのマーカー）（図４Ｂ）と、ＬＣ３−ＩとＬＣ３−ＩＩ（自家融解ストレスのマーカー）（図４Ｃ）のレベルを評価するために、少なくとも３つの独立した実験を使用した。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、クロロキン誘導性だが、スタウロスポリン誘導性でない、ＣＧＮの生存率の減少とカスパーゼ−３様活性の上昇を、バフィロマイシンＡ１が濃度依存性に弱めることを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。２０μＭ クロロキン（ＣＱ）とバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（０〜１００ｎＭ）を同時に投与した後、生存率（図５Ａ）とカスパーゼ−３様活性度（図５Ｂ）を２４時間後に測定した。バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（０〜１００ｎＭ）とスタウロスポリン（０．１μＭ）（ＳＴＳ）を同時に投与した後、２４時間後に生存率（図５Ｃ）を測定した。バフィロマイシンＡ１は、クロロキン誘導性の生存率とカスパーゼ−３活性（アポトーシスのマーカー）の減少を弱めたが、スタウロスポリン処理後、２４時間後の生存率の減少を防げなかった。独立した三回の実験は、検査した各濃度を表す。図５Ａと５Ｂに関しては、バフィロマイシンＡ１の有意な効果（ＣＱの存在下、あるいは存在しない場合で）は、一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊はＣＴＬと比べて、† はＣＱと比べて、‡は０．１ｎＭバフィロマイシンＡ１と比べて、♯は０．３ｎＭバフィロマイシンＡ１と比べて、§は１ｎＭ バフィロマイシンＡ１と比べて）。図５Ｃに関しては、スタウロスポリン（バフィロマイシンＡ１の存在下、または存在しない場合）の有意な効果を二元配置分散分析で評価し、バフィロマイシンＡ１の濃度依存性の差を、一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊はスタウロスポリン存在下のバフィロマイシンＡ１の各濃度と比べて、†は０および１ｎＭのバフィロマイシンＡ１と比べて）、
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、ＣＧＮのクロロキン誘導性のカスパーゼ−３の切断とＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの比を、バフィロマイシンＡ１が用量依存性に弱めることを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。２０μＭクロロキン（ＣＱ）の存在下、または存在しない状態で、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（０．３〜１０ｎＭ）で２４時間処理したサンプルでの、切断カスパーゼ−３と、ＬＣ３の切り出しを示す。β−ＩＩＩ−チュブリンのレベル、ならびにＬＣ３−Ｉに対するＬＣ３−ＩＩの比（図６Ｄ）と比較して表した、切断カスパーゼ−３（アポトーシスのマーカー）（図６Ｂ）と、ＬＣ３−ＩとＬＣ３−ＩＩ（自家融解ストレスのマーカー）（図６Ｃ）のレベルを評価するために、少なくとも３つの独立した実験を使用した。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、ＣＧＮの酸性の小胞の標識に対するクロロキンとバフィロマイシンＡ１の効果を示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。ＣＧＮを、（図７Ａ）対照（ＣＴＬ）、（図７Ｂ）１ｎＭのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）、（図７Ｃ）１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）、（図７Ｄ）２０μＭのクロロキン（ＣＱ）、（図７Ｅ）２０μＭのクロロキン（ＣＱ）＋１ｎＭのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）、（図７Ｆ） ２０μＭのクロロキン（ＣＱ）＋１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）で２４時間処理した後Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで酸性の小胞について、カルセインＡＭで生存率について標識した。各実験を３回反復し、結果は同様であった。スケールバー＝１００ミクロンである。
【図８】図８Ａ〜８Ｆは、ＣＧＮにおけるバフィロマイシンＡ１の細胞保護効果がＢａｘ依存性であることを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。対照（ＣＴＬ）とクロロキン（ＣＱ：２０μＭ）処理の野生型（ＷＴ）とＢａｘ欠損（ＫＯ）ＣＧＮを、１ｎＭ（図８Ａと８Ｂ）または１０ｎＭ （図８Ｃと８Ｄ）バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）の存在下で、生存率（図８Ａと８Ｃ）とカスパーゼ−３様活性度（アポトーシスのマーカー）（図８Ｂと８Ｄ）について評価した。少なくとも３回反復した、少なくとも三回の独立した実験が、検査した各濃度と遺伝子型を表す。代表的なウエスタンブロット（図８Ｅ）は、対照薬またはクロロキン（ＣＱ、２０μＭ）処理後、２４時間後のＷＴとＫＯの溶解物での、切断カスパーゼ−３とＬＣ３の切り出しを示す。ＮＴは処理なし、０時間である。代表的なウエスタンブロット（図８Ｆ）は、１ｎＭ（ＢａｆＡ１−低濃度）バフィロマイシンＡ１が、ＷＴのＣＧＮ細胞における、表示された化合物での処理後２４時間後の、クロロキン（ＣＱ、２０μＭ） 誘導性のｐ１８Ｂａｘのレベルの上昇を抑制することを示す。図８Ａと８Ｂに関しては、処理に対する遺伝子型の有意な効果を二元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価し、有意な処理の効果を一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊はそれぞれのＷＴの処理ペアと比較して、†は遺伝子型を適合させたＣＴＬと比較して、‡は遺伝子型を適合させた、１ｎＭ バフィロマイシンＡ１を用いた処理と比較して、＃遺伝子型を適合させたＣＱを用いた処理と比較して）。図８Ｃと８Ｄに関しては、処理に対する遺伝子型の有意な効果を二元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価し、有意な処理の効果を両側、対応のないｔ検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊はそれぞれのＷＴ処理ペアと比べて、†は遺伝子型を適合させたＣＴＬと比べて）。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＧＮにおいて、カスパーゼ−３の欠損と、カスパーゼの薬理学的阻害のどちらも、クロロキン誘導性の細胞死を防げないことを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。細胞生存率（図９Ａと９Ｃ）とカスパーゼ−３様活性度（アポトーシスのマーカー）（図９Ｂと９Ｄ）を、野生型（ＷＴ）およびカスパーゼ−３−欠損（ＫＯ）ＣＧＮ（図９Ａと９Ｂ）において、または広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤ＢＯＣ−アスパルチル（Ｏｍｅ）−フルオロメチルケトン（ＢＡＦ、１５０μＭ：図９Ｃと９Ｄ）で同時に処理したＣＧＮにおいて、クロロキン（ＣＱ）または対照（ＣＴＬ）で処理した後、２４時間後に測定した。少なくとも三回反復した、少なくとも三回の独立した実験は、検査した各濃度と遺伝子型を表す。図９Ａと９Ｂに関しては、両側、対応のないｔ検定で遺伝子型の有意な効果を評価した。ｐ＜０．０５（＊はＣＴＬと比べて）である。図９Ｃと９Ｄに関しては、処理の有意な効果を一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊はＣＴＬと比べて、†はＣＱと比べて）である。
【図１０】図１０は、神経細胞死に対する、バフィロマイシンＡ１の濃度依存性効果を示す、可能性のある提案モデルを示す。バフィロマイシンＡ１が、低濃度ではリソソーム障害または自家融解ストレスに起因する細胞デスシグナルを抑制することが仮定される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性と、神経変性によって特徴付けられる疾患と症状の治療および／または予防のための方法に関する。該方法は、神経変性によって特徴付けられる疾患または症状に苦しむ対象を治療するために、および／またはそうした疾患または症状が、罹患する危険が高い対象に起こるのを予防するために使用されてもよい。本発明はまた、該方法において有用な医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、一般的に使われる用語であり、その意味は広く理解されていると考えられる。しかし、神経変性の厳密な定義を明確に表すのは難しい。神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、多数の大辞典でも 定義は不完全であることが多い。語源的には、この用語は神経細胞（すなわちニューロン）を示す接頭辞「ｎｅｕｒｏ−」と、組織または臓器の場合には構造または機能を失う過程を表す「ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」からなり、この過程は治療に応じて可逆的である。
【０００３】
実際には、神経変性疾患や症状は、特異的な機能解剖系の特異的な一部のニューロンに発症する、多様な臨床的、病理学的発現を伴う幅広いグループの神経疾患を意味する。これらの疾患は若年期に認められるか（若年性疾患）、あるいは晩年期に認められることがあり（加齢関連性疾患）、発症の理由は不明であり、病状の進行は確実である。神経変性疾患または症状を、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病を発症する、最も一貫した危険因子は加齢である。
【０００４】
過去１００年間で、産業国における６５歳以上の人口の増加率は、人口全体の増加率をはるかに上回った。故に、次世代では老年者の人口が二倍になり、これに伴いある種の神経変性疾患または症状に苦しむ人々の人口も比例して増加することが予想される。これらの、身体障害を引き起こす病気に関わる患者、介護者、社会に対する、心理的、身体的、経済的な負担が増加していることから、この予想は、医療社会で高まりつつある懸念の焦点にある。いくつかの承認薬が、現在までにいくつかの神経変性疾患や症状の病状を部分的に改善してきたとはいえ、それらを慢性的に使用すると、患者を衰弱させる副作用を起こすことが多く、変性過程の進行を阻止するものがないという事実は、問題をさらに深刻化させている。これに合わせて、神経変性の原因や機構に関する我々の知識の限界が、効果的な予防療法または保護療法の開発を妨げてきた。従って、神経変性の疾患や症状の治療のための新たな化合物のための技術や、そのような化合物を用いた治療方法が必要となる。更に、神経変性疾患の治療および／または予防に適した化合物の同定方法も必要となってくる。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、神経変性によって特徴付けられる疾患と症状の治療および／または予防における、マクロライド系抗生物質の使用を開示する。本発明はまた、そのようなマクロライド系抗生物質を用いる治療および／または予防の方法を開示する。更に、本発明は、そのような方法において有用な医薬組成物を開示する。本発明はまた、神経変性疾患や症状を治療および／または予防するのに有効である可能性がある他の化合物を同定するための方法を提供する。
【０００６】
本発明は、神経変性を抑制するための、マクロライド系抗生物質の使用に関する。多くの病態が神経変性によって特徴付けられ、若年性の、また加齢関連性疾患および症状の両方を含む。観察される神経変性の分子基盤は、特定の病態によって異なる。
【０００７】
最近の証拠は、神経変性病態において、リソソーム経路とオートファジー（例えば、自家融解ストレスがあるが限定されない）を関連させる。リソソーム経路は、細胞の健全性を保つために必要な基本的な細胞の構成要素を供給するために、細胞成分をリサイクルするように働く、細胞器官の動的システムを含む。リソソーム経路の一要素はオートファジーである。オートファジーは、栄養不足、または細胞ストレスの他の症状によって引き起こされる、厳重に統制された過程である。オートファゴソームと呼ばれる、細胞質領域が二重膜の空胞で囲まれた場合に、オートファジーが始まる。オートファゴソームは単一膜ファゴリソームに成長し、最終的に酸性になり、エンドソームまたはリソソームと融合した後タンパク質分解酵素を獲得して分解過程を完了する。細胞の大きさ、リモデリング、形態の変化を支援するために、正常の細胞の発達の過程において、オートファジーを含むリソソーム経路は活性である。さらに、そのような系は、損傷された細胞成分を除去するために、監視システムとして働くことがある。しかし、正常なリソソーム経路またはオートファジーにおける混乱が、細胞死または細胞の異常機能をもたらす、活性のデスシグナルを生み出すことができる。
【０００８】
正常なオートファジーの乱れは、自家融解ストレスにつながることがあり、これは形態学上は自食胞の蓄積によって、また生化学的には自食胞の外膜に特異的に関連するタンパク質である、ＬＣ３−ＩＩのレベルの上昇によって定義される。さらに、リソソームの分解経路の機能障害（ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして、ＣＧＮのクロロキン処理によって、本発明で例示する）は、自食胞を増加させる、ある種の自家融解ストレスを誘発する。自家融解ストレスは、その後アポトーシス経路を介して細胞死につながる可能性がある（例えば限定されないがカスパーゼ−３活性などの、プロテアーゼ活性の増加によって測定されるように）だけでなく、自家融解ストレスの結果として、アポトーシスと同時に、あるいは無関係に起こることが示されている、その他の種類の機構を介して細胞死につながることがある。
【０００９】
最近の報告のいくつかで、多くの神経系の疾患と症状におけるリソソーム系と自家融解ストレスの機能障害が説明されている。リソソーム系の能力の低下は、限定されないが、タンパク質や複合糖質成分など、細胞物質の異常な沈着につながる。時間がたつと、細胞物質の異常沈着は、そのような疾患と症状に特有の発生学的異常、最終的には神経変性をもたらす。さらに、上述のように、リソソーム系の能力の低下と自家融解ストレスの増加は細胞死をもたらすことがある。
【００１０】
これらの発生学的異常が、多くの若年性の発症や加齢関連疾患の病態や症状に認められる、限定されないが、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症などの神経変性や他の症状の根底にあると考えられる。
【００１１】
限定されないがバフィロマイシンＡ１などの、ある種のマクロライド系抗生物質は、１ｎＭより高い濃度において、液胞のＡＴＰａｓｅを阻害することが報告されている。液胞のＡＴＰａｓｅの阻害によって、酸性の小胞や細胞小器官は中性になる。酸性の小胞と細胞小器官の中性化は、オートファゴソームとリソソームの融合を妨げ、リソソーム系の正常な機能を混乱させる。リソソーム系のこの乱れにより、限定されないが、オートファゴソームなどのそのような系に関わる中間体の蓄積がもたらされ、自家融解ストレスと、その後の神経変性につながることがある。
【００１２】
本発明はモデル系を用いて液胞のＡＴＰａｓｅと酸性の小胞の中性化への影響とは無関係な、マクロライド系抗生物質の新規な神経保護効果を説明する。リソソームの分解経路の機能障害は、本発明ではＣＧＮのクロロキン処理によって例示される。ＣＧＮのクロロキン処理は、リソソーム経路の機能障害を誘発し、自食胞の増加につながるある種の自家融解ストレスを誘発し、これは細胞の生存率の低下、カスパーゼ−３活性の上昇（アポトーシス活性のマーカー）、ＬＣ３−ＩＩプロセシング（自家融解ストレスのマーカー）の増加をもたらす。本発明は、神経変性を予防するため、そして神経変性を伴う疾患や症状を治療または予防するための、マクロライド系抗生物質の使用を説明する。特定の作用機序に限定されないが、一つの実施形態では、マクロライド系抗生物質はリソソーム障害および／または自家融解ストレスによって起こる神経変性を抑制する。本発明はマクロライド系抗生物質とその誘導体の使用を意図するものである。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、それらの誘導体を含む。さらなる特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１、またはその誘導体である。
【００１３】
定義
本書で使用する単語「予防」、「予防する」、「予防している」、「抑制」、「抑制する」、「抑制している」は、疾患または症状の、徴候、様相、特徴が発症する前に、そのような徴候、様相、または特徴を予防する、または軽減するために開始される一連の動作（例えば化合物または医薬組成物を投与する工程）を意味する。そのような予防する、抑制することが必ずしも完全である必要はない。
【００１４】
本書で用いる「治療」、「治療する」、「治療している」は、疾患または症状の、徴候、様相、特徴の発症後に、そのような徴候、様相、または特徴を取り除く、または軽減するために開始される一連の動作を意味する（例えば化合物または医薬組成物を投与する工程）。そのような治療することが必ずしも完全である必要はない。
【００１５】
本書で使用する用語「治療を必要とする」は、患者が治療を必要とする、あるいは治療が有益であるだろうという、介護者の判断を意味する。この判断は、介護者の専門領域の範疇にあり、本発明の方法または化合物によって治療可能な疾患または症状の結果として、患者が病気であり、または病気になるであろうという知識を含む多様な要素に基づいて判断される。
【００１６】
本書で使用する用語「予防を必要とする」は、患者が予防を必要とする、あるいは予防が有益であるだろうという、介護者の判断を意味する。この判断は、介護者の専門領域の範疇にあり、本発明の方法または化合物によって予防可能な疾患または症状の結果として、患者が病気になるであろう、または病気になる可能性があるという知識を含む多様な要素に基づいて判断される。
【００１７】
本書で使用する「個人」、「対象」または「患者」は、哺乳類を含む動物、例えばマウス、ラット、その他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類、及びヒトである。この単語は、オスまたはメスまたは両方を特定するか、あるいはオスであるかメスであるかを除外することもある。
【００１８】
本書で使用する用語「治療上有効な量」は、疾患または徴候、様相、または特徴に対して、検出可能な効能を発揮できる、単独での、あるいは医薬組成物の一部としての化合物の量を意味する。そのような効果が必ずしも完全である必要はない。
【００１９】
本書で使用する用語「マクロライド系抗生物質」は、限定されないがデオキシ糖などの一つ以上の置換基が結合するラクトン環（マクロライド環と称される）を含む化合物を意味する。マクロライド系抗生物質には、ｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質が含まれる。ｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質の例には、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシンが含まれるが、これに限定されない。
【００２０】
本書で使用する用語「神経変性」は、神経構造または機能が障害される症状であり、その障害は、本願に記載されるように、マクロライド系抗生物質によって少なくとも部分的に回復するまたは予防される可能性がある。
【００２１】
用語「医薬的に許容できる誘導体」は、受容者に投与した際に、開示されるマクロライド系抗生物質、または代謝産物またはその残分を（直接または間接的に）提供できる本発明のマクロライド系抗生物質の医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物またはその他の誘導体を意味する。特に好ましい誘導体は、そのようなマクロライド系抗生物質が患者に投与された際に、開示されるマクロライド系抗生物質の生体への利用率を高め（例えば、経口投与された化合物がより容易に血液に吸収されるようにすることにより）、マクロライド系抗生物質の、任意の生物学的組織への輸送を高め、注射による投与が可能になるように溶解度を高め、代謝を変化させ、または排出速度を変化させるものである。一つの実施形態では、誘導体はプロドラッグである。マクロライド系抗生物質のプロドラッグ形式の例は、米国特許第６，８０９，０８０号において記載されている形式である。
【００２２】
用語「医薬的に許容できる塩」には、特に断りが無い限り、本発明のマクロライド系抗生物質に存在する酸性基または塩基性基の塩が含まれる。
【００２３】
治療と予防の方法
本発明は、神経変性を抑制および／または予防するための、マクロライド系抗生物質の使用を説明する。本発明は、そのような治療および／または予防を必要とする対象に神経変性によって特徴付けられる疾患または症状を治療および／または予防するための方法を提供する。本発明はまた、そのような治療および／または予防を必要とする対象にそれらの病因において神経変性過程に依存する疾患または症状を治療および／または予防するための方法を提供する。
【００２４】
一つの実施形態では、本発明は、そのような治療を必要とする対象に神経変性によって特徴付けられる疾患または症状、またはそれらの病因において神経変性過程に依存する疾患または症状の治療を提供する。そのような疾患または症状には、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症が含まれるがこれに限定されない。特定の実施形態では、疾患または症状は、リソソーム障害および／または自家融解ストレスによって特徴付けられる。
【００２５】
治療方法には、そのような治療を必要とする対象を識別すること、前記対象において、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の投与を含む、治療法を開始することを含む。マクロライド系抗生物質は、ｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質であってもよい。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシンまたはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質は、治療上有効な量で投与される。そのようなマクロライド系抗生物質の投与は、疾患または症状を治療することになる。神経変性の治療には、少なくとも部分的にの神経細胞死の抑制、異常な神経病態（例えば神経の変性があるが限定はされない）の抑制、リソソーム障害によって生じるデスシグナルおよび／または自家融解ストレスによって生じるデスシグナルの抑制が含まれてもよい。上述のとおり、開示される治療法において、治療がかならずしも完全である必要はない。一つの実施形態では、治療なしで観察される神経変性と比べて、神経変性は少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上抑制される。
【００２６】
別な実施形態では、本発明は、そのような治療を必要とする対象に神経変性および／または神経変性によって特徴付けられる、またはそれらの病因において神経変性過程に依存する疾患または症状の予防法を提供する。そのような疾患または症状には、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症が含まれるがこれに限定されない。特定の実施形態では、疾患または症状はリソソーム障害および／または自家融解ストレスによって特徴付けられる。
【００２７】
予防方法は、そのような予防を必要とする対象を識別し、前記対象において、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の投与を含む、予防療法を開始することを含む。マクロライド系抗生物質は、ｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質であってもよい。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１またはコンカナマイシンである。特定の実施形態では、マクロライド系抗生物質は、治療上有効な量で投与される。結果として、そのようなマクロライド系抗生物質の投与は疾患または症状を予防する。神経変性の治療には、少なくとも部分的にの神経細胞死の抑制、異常な神経病態（例えば神経の変性があるが限定されない）の抑制、リソソーム障害によって生じるデスシグナルおよび／または自家融解ストレスによって生じるデスシグナルの抑制が含まれてもよい。上述のとおり、開示される予防方法において、予防がかならずしも完全である必要はない。一つの実施形態では、予防なしで観察される神経変性と比べて、神経変性は少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上抑制される。
【００２８】
本書に記載のごとく、マクロライド系抗生物質は神経変性を緩和することが示される。一つの実施形態では、神経変性は、少なくとも部分的にリソソーム障害または自家融解ストレスによって誘起される。例えば、本発明は、特定の濃度のｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質、バフィロマイシンＡ１が、ＣＧＮ内のクロロキンによって生じる神経変性を抑制することを示す（細胞死、カスパーゼ−３活性、ＬＣ３プロセシングによって検査した）。上述のとおり、クロロキンはリソソーム経路の機能障害やある種の自家融解ストレスを誘起し、これは自食胞の増加につながり、リソソーム障害と自家融解ストレスのモデル系として使用できる。代替的な作用機序に限定されることなく、マクロライド系抗生物質は、リソソーム障害および／または自家融解ストレスによって生み出されるデスシグナルをブロックするかもしれず、結果として正常な細胞機能を回復させる。
【００２９】
さらに、クロロキンやフルオロキノロン類（例えば、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、スパルフロキサシンがあるが限定されない）は、小胞の酸性化を妨げ、ミトコンドリア膜の潜在能力を崩壊させ、これがアポトーシスおよび／または細胞死をもたらすことが示されている。例えばクロロキンなどの薬が、疾患と症状、例えばマラリア、関節リウマチ、自己免疫疾患を治療するために使用される が、神経障害や視神経の機能障害などを含むがこれに限定されない、副作用の原因により、これがそれらの有効性を制限することが報告されている。フルオロキノロン類は、骨、関節感染、皮膚感染、尿路感染、前立腺の炎症、重篤な耳感染、気管支炎、肺炎、結核、ある種の性行為感染症（ＳＴＤ）、エイズ患者に発症するある種の感染症を治療するために使用される。そのような薬がリソソームとオートファジー系に影響を与えるのを防ぐことで（例えば、神経細胞死の抑制、異常な神経病態の抑制、リソソーム障害によって生じるデスシグナルおよび／または自家融解ストレスによって生じるデスシグナルの抑制によって）、有益な効果を損なうことなく、そのような薬の副作用は軽減されるかもしれない。
【００３０】
従って、本発明はまた、リソソームのまたはオートファジー経路に少なくとも部分的に影響を与える薬の有害な影響を、治療上有効な量の少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体を、そのような薬と併用して投与することで緩和する、または予防するための治療方法を提供する。本発明のマクロライド系抗生物質は、有益な効果をもたらすが、リソソームまたはオートファジー経路に有害な影響も与えるどのような薬と一緒に使用してもよい。治療は、少なくとも部分的に、神経細胞死の抑制、異常な神経病態の抑制（例えば、神経の変性があるが限定されない）、リソソーム障害によって生じるデスシグナルおよび／または自家融解ストレスによって生じるデスシグナルの抑制を含んでもよい。
【００３１】
本書で説明する治療するおよび／または予防する方法はまた、上述のマクロライド系抗生物質と併用して一つ以上の追加の治療薬をさらに投与することを含んでもよい。
【００３２】
同定する方法
さらに、神経変性によって特徴付けられる、またはそれらの病因において神経変性過程に依存する疾患または症状を治療および／または予防する化合物を同定するために、本発明を使用してもよい。故に、同定された化合物は、上述の治療および／または予防方法において有用なことがある。そのような化合物は、小分子の医薬品、ペプチド、生物学的製剤、様々な非コードＲＮＡ、アンチセンス分子、抗体であってもよい。
【００３３】
そのような化合物を同定するための方法またはアッセイは、リソソームのまたはオートファジー系が少なくとも部分的に機能が障害されている、または障害されるように誘導することができ、細胞株またはモデル系を提供し、前記細胞またはモデルを候補化合物とインキュベートすること、前記化合物の存在下と、前記化合物が存在しない状態で、前記モデル系の特性を決定すること、前記化合物の存在によって前記特性が高められるか、あるいは低減させられるかどうかを決定することを含む。そのような特性は、当業者に現在知られている分析技術を用いて測定可能なものならどのような特性であってもよい。特性の例には、プロテアーゼ活性（例えばカスパーゼ活性、特にカスパーゼ−３活性があるが限定されない）、アポトーシスの生物学的マーカー（例えばカスパーゼ−３があるが限定されない）の活性、またはオートファジー（例えばＬＣ３プロセシングがあるが限定されない）、細胞の生存率、小胞の酸性化、または本書で説明される、または当業者に既知のその他のマーカーまたは検査が含まれるがこれに限定されない。化合物は、本書で説明するように、前記特性を高めるまたは低減させることがある。
【００３４】
医薬組成物
本書で説明する方法で使用するための、上述のマクロライド系抗生物質は、単独で、または当業者に既知の方法で製剤される医薬組成物として投与されてもよい。化合物と医薬品組成を調製するための方法の特定の例は本書で説明され、また限定的な例として見なされるべきではない。さらに、化合物または医薬組成物は、当業者に既知のとおり対象に投与されてもよく、診療の提供者によって決定されてもよい。特定の投与形式が本書で提供されるが、限定的な例とみなされるべきではない。さらに、化合物または医薬組成物を、本書で説明する方法で他の薬剤と一緒に投与してもよい。そのような他の薬剤は、例えば変性の制限または開示される化合物の不活性化によって、または開示される化合物の吸収または活性を高めることによって、開示される化合物の活性を高める薬剤であってもよい。
【００３５】
説明される化合物と医薬組成物は、開示される化合物を有効成分として含む、医薬製剤、例えばエアロゾル、固形、半固形、または液体の形態で用いることができる。さらに、医薬組成物を適切な医薬的に許容できる担体との混合物で用いてもよい。そのような医薬的に許容できる担体には、薬物の応用に適する、有機または無機担体、賦形剤または希釈剤が含まれるがこれに限定されない。有効成分を、錠剤、丸薬、カプセル、吸入剤、坐薬、溶液、エマルジョン、懸濁液、エアロゾル、使用に適したその他の形態にするために、例えば通常の毒性のない医薬的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤と混合してもよい。医薬組成物で使用するための医薬的に許容できる担体は製剤分野でよく知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔｏｒ、２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）で説明されている。そのような原料は、使用される用量や濃度では受容対象に対して毒性を持たず、これには水、タルク、アカシアガム、ゼラチン、三ケイ酸マグネシウム、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素、緩衝液、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、その他の有機酸塩の緩衝液、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、低分子量（約１０残基未満）ペプチド、例えばポリアルギニン、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリジノン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン、単糖類、二糖類、セルロースまたはその誘導体、乳糖、マンニトール、グルコース、マンノース、デキストリン、ジャガイモでんぷんまたはコーンスターチまたはでんぷん糊を含むその他の炭水化物、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール、対イオン例えばナトリウム、および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、プルロニック、またはポリエチレングリコールが含まれるがこれに限定されない。さらに、医薬組成物は助剤を含んでもよく、これには例えば味質改善剤、安定剤、増粘剤、着色料、香料が含まれるが限定されない。
【００３６】
望ましい程度の純度を持つ本発明の化合物を、生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、助剤などと医薬分野で知られるように混合することにより、医薬組成物を保存用または投与用に調製してもよい。そのような医薬組成物は、叙放性製剤または持続放出性製剤として提供されてもよい。
【００３７】
医薬組成物は固形の剤型、例えばカプセル、錠剤、パウダー、または液体の剤型、例えばエリキシル剤、シロップ、懸濁液で経口投与されてもよい。また、医薬組成物は滅菌済みの液体の剤型で非経口で投与されてもよい。さらに、医薬組成物は固形、液体、またはエアロゾルの形態で経粘膜的に、またはパッチ作用または軟膏で経皮的に、非経口で投与されてもよい。様々な種類の経粘膜投与には、気道粘膜投与、鼻粘膜投与、口腔粘膜（例えば舌下や頬粘膜）投与、直腸経粘膜的投与が含まれる。
【００３８】
固体組成、例えば限定されないが錠剤またはカプセルなどを調製するために、均一性の高い組成を作る目的で、適切な医薬的に許容できる担体、例えば伝統的な錠剤化材料（乳糖、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモでんぷん、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、ゴム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ソルビトール、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、第二リン酸カルシウム、その他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存料、着香料、薬理学的に適合する担体）、希釈剤（水、生理食塩水または緩衝液が含まれるが限定されない）と医薬組成物を混合してもよい。均一性の高い組成は、等しく効果的な単位の投薬形態、例えば錠剤、丸薬、カプセルに容易に細分できるように、成分（本書で説明される化合物と医薬的に許容できる担体）が組成中で均一に分散していることを意味する。説明される固体の組成物は、持続性作用の利点をもたらす投薬形態を提供するために、コーティングされるか、または別の方法で混合されてもよい。例えば、錠剤または丸薬は内部投薬成分と外部投薬成分を含むことができ、後者は前者のまわりを包む形態である。二つの成分を、胃の中で分解抵抗性に働き、内部成分が原型のまま胃を通過できるように、あるいは放出を遅らせるようにする腸溶性レイヤーで分けることができる。そのような腸溶性レイヤーまたはコーティングに様々な原料を使用でき、そのような原料は、多くのポリマー酸や、ポリマー酸と、セラック、セチルアルコール、酢酸セルロースとしてのそのような原料の混合物を含む。活性のある化合物は、伝統的な坐薬の基剤、例えばカカオバターまたはその他のグリセリドなどを含む、坐薬またはかん腸などの直腸用の組成物として調製されてもよい。固体の組成物はまた、界面活性剤、潤滑剤、不活性充填剤、例えば乳糖、スクロース、リン酸カルシウム、コーンスターチなどを含むカプセル、例えば硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセルを含んでもよい。
【００３９】
経鼻投与、肺内投与、または吸入のその他の方式による投与については、医薬組成物を溶液または懸濁液の形態でポンプ式スプレー容器から、適切な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、窒素、プロパン、炭酸ガス、またはその他の適切なガス）を用いて、または加圧容器または噴霧器からエアロゾルスプレー方式として、または乾燥粉末として投与してもよい。エアロゾルまたは乾燥粉末形式の場合、定量を投与するために、バルブを使うことで投与される化合物の量（投与量）を決定してもよい。
【００４０】
液体の形態を経口で、非経口で、または経粘膜的に投与されてもよい。液体での投与に適切な形態には、水溶液、適切に香り付けされたシロップ、水性または油性懸濁液、および食用油、例えば綿実油、ごま油、ココナッツ油、またはピーナッツ油とともにエリキシル剤や類似の医薬的賦形剤を用いて、香り付けしたエマルジョンが含まれる。水性懸濁液のための、適切な分散剤または懸濁化剤には、合成天然ゴム、例えばトラガカント、アカシア、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはゼラチンが含まれる。そのような液体製剤を、医薬的に許容できる添加剤、例えば懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは食用硬化脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性賦形剤（例えば、アーモンド脂、油性エステルまたはエチルアルコール）、保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）、人工および天然色素および／または甘味料を用いて、伝統的な手段を用いて調製してもよい。液体製剤は、希釈剤、例えば水とアルコール、例えばエタノール、ベンジル・アルコール、プロピレン・グリコール、グリセリン、医薬的に許容できる界面活性剤、懸濁化剤、または乳化剤を添加した、または添加しないポリエチレンアルコールを含んでもよい。頬粘膜または舌下投与については、組成物は伝統的な方式で調製される錠剤またはトローチ剤の形態であってもよい。薬用キャンディーの形態は、香料、通常はスクロースやアカシアまたはトラガカントに有効成分を含むことができ、トローチ剤は、例えばゼラチンやグリセリン不活性基剤に有効成分を含み、あるいは、有効成分に加えて、担体を含むスクロースやアカシア、エマルジョン、ゲルが当分野で知られている。
【００４１】
開示される化合物（単体または医薬組成物のどちらか）を非経口的投与用に調製してもよい。非経口投与には、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、くも膜下腔投与、関節内投与、心臓内投与、球後投与、インプラント、例えば持続放出性インプラントを用いた投与が含まれるがこれに限定されない。
【００４２】
医薬組成物を、単位用量または多重用量の密封容器、例えばアンプルやバイアル内に入れてもよく、滅菌済み液状賦形剤、例えば注射用蒸留水を使用直前に加えるだけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席の注射溶液や懸濁液を、滅菌パウダー、顆粒、錠剤から調製することができる。注射可能な組成物用の、効果的な医薬的に許容できる担体の要件は、当業者に良く知られている。Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，Ｅｄｓ．，２３８−２５０（１９８２）とＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，６２２−６３０（１９８６）を参照されたい。
【００４３】
医薬組成物は治療上有効な量で投与される。当然のことながら、治療上有効な量は既知の要素、例えば特定の化合物の薬力学的特性と、その投与方式と経路や、対象の年齢、健康状態、体重や、疾患の状態または症状の重篤度とステージや、併用治療の種類や、治療の頻度や、所望の効果に応じて変化する。投与される化合物の総量もまた、投与の経路、時期、頻度だけでなく、化合物の投与に付随する可能性がある副作用の有無、性質、程度や、所望の生理学的効果によって決定される。様々な症状または疾患、特に慢性症状または疾患は、多数の投与を伴う長期の治療を必要とする可能性があることを当業者は理解するであろう。
【００４４】
結果
以下の結果において、使用された方法は、本発明の方法の項と、本書に引用される文献で規定された方法であった。
【００４５】
クロロキンは神経細胞死を誘発する
神経細胞と神経変性へのクロロキンの影響を検討するため、小脳の顆粒神経細胞（ＣＧＮ）を４日間培養し、５〜４０μＭクロロキンで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで２４時間処理し、それらの生存率とカスパーゼ−３様活性度（アポトーシス細胞死に関連する酵素活性）を１６〜２４時間後に測定した（図１Ａと１Ｂ）。クロロキンは、濃度依存性に生存率を低下させ（図１Ａ）、カスパーゼ−３様活性を増加させ（図１Ｂ）、クロロキン濃度≧１０μＭで著明な効果が認められた。クロロキンは、２０μＭで生存率を２４％まで、４０μＭで８％まで低下させた一方で（図１Ａ）、２０−４０μＭでは、６〜７倍のカスパーゼ−３様活性の増加が最大であった（図１Ｂ）。本書で説明する以下の全ての実験については、２０μＭの濃度のクロロキンを用いた。タンパク質合成の阻害物質である、シクロヘキシミドを用いた処理（０．１〜１ｍｇ／ｍｌ）はクロロキンが誘発する細胞死の規模を変化させず（データ示さず）、これはクロロキンの有害な効果は新規のタンパク質合成に依存しないことを示唆している。
【００４６】
クロロキンによる、細胞死とカスパーゼ−３様活性の時間的誘導を検討するために、ＣＧＮにおいて経時変化の研究を行った（図１Ｃと１Ｄ）。これらの実験では、ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、濃度２０μＭのクロロキン処理後、最大４８時間まで測定を行った。クロロキン濃度２０μＭで、生存率は８時間後にわずかに低下し（９３％）、続く４０時間の間に著しく低下し続けた（図１Ｃ）。クロロキン濃度２０μＭで、カスパーゼ３−様活性は、クロロキンを用いた処理後８時間で著しく上昇し、１６時間 （６倍の誘導）で最大となり、２４〜４８時間の間、高い数値を維持した（図１Ｄ）。ＣＧＮ内の、切断されたまたは「活性の」カスパーゼ−３（ＣＬカスパーゼ−３）の経時パターンをウエスタンブロットによる分析で確認した（図２Ａと２Ｂ）、２０μＭのクロロキンを用いた処理の後、８時間まで低濃度で明らかであり、１６時間後に最も強固であった。図２Ａ〜２Ｅでは、ＣＱはクロロキン処理を表し、ＣＴＬは対照を、ＮＴは処理なしを表す。
【００４７】
オートファゴソームに対するクロロキンの影響を検討するため、ＬＣ３のプロセシングをウエスタンブロットで評価した（図２Ａと２Ｃ〜Ｅ）。ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、２０μＭのクロロキン処理後最大４８時間まで測定を行った。ＬＣ３は、細胞質型（ＬＣ３−Ｉ）からのプロセシングの際に、共有結合脂質化を介して、ＬＣ３−ＩＩとしてオートファゴソームの内境界膜と外境界膜に挿入される微小管関連タンパクである９、１０。１８ｋＤａのＬＣ３−Ｉのレベルは、同じ時間で測定した対照サンプルのレベルと比べて、クロロキンを用いた処理後２４〜４８時間で低下したようであった（図２Ａと２Ｃ）。オートファゴソームの膜に特異的なＬＣ３の１６ｋＤａ型１０であるＬＣ３−ＩＩは、クロロキンに曝露した後４時間以内に上昇し、４８時間、高いレベルを維持した（図２Ａと２Ｄ）、これは対照サンプルにはほぼ認められなかった効果であった。ＬＣ３−ＩＩのこの上昇もまた、細胞質のＬＣ３−Ｉの割合に対する、オートファゴソーム結合ＬＣ３−ＩＩの割合の上昇を反映していた（図２Ｅ）。オートファゴソーム結合ＬＣ３−ＩＩの上昇は、ＣＧＮ中のオートファゴソームの数を増加させることによってクロロキンがリソソーム経路を妨げ、正常なオートファジーを崩壊させることを示唆する（すなわち、自家融解ストレスを誘発する）。
【００４８】
バフィロマイシンＡ１はクロロキン誘導性アポトーシスを減退させる
バフィロマイシンＡ１への曝露から２４時間後に、ＣＧＮに対するバフィロマイシンＡ１の影響を評価した（図３Ａと３Ｂ）。これらの実験では、ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、バフィロマイシンＡ１の添加後２４時間後に測定を行った。それ単独では、バフィロマイシンＡ１は濃度≦１ｎＭでは生存率を低下させず、またはカスパーゼ−３様活性を誘導しなかったが、濃度≧１０ｎＭでは生存率を著しく低下させカスパーゼ−３様活性を上昇させた（図３Ａと３Ｂ）。カスパーゼ−３の活性に対するバフィロマイシンＡ１の影響を確認するために、そしてＬＣ３のプロセシングに対するその影響を検討するために、ウエスタンブロットによる分析を行った（図４）。切断カスパーゼ−３（ＣＬカスパーゼ−３）の上昇は、１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１を用いた処理においてのみ明らかだった（図３Ｂ、４Ａと４Ｂ）。バフィロマイシンＡ１を用いた処理ではどの濃度でもＬＣ３−Ｉのレベルは変化しなかったが、１０ｎＭ バフィロマイシンＡ１はＬＣ３−ＩＩのレベルを劇的に上昇させ（図４Ａと４Ｃ）、これはまた、ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの割合の増加を反映していた（図４Ｄ）。
【００４９】
バフィロマイシンＡ１の影響も、中毒量のクロロキン（２０μＭ）の存在下で評価した（図５）。これらの実験では、ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、表示の濃度のバフィロマイシンＡ１とクロロキンの添加の２４時間後に測定を行った。バフィロマイシンＡ１は、検査した全ての濃度でクロロキン誘導性の生存率の減少を著しく減退させ、減退度は１ｎＭで最大であった（バフィロマイシンＡ１の使用で８８％に対して、無しの場合は２４％：図５Ａ）。１０〜１００ｎＭのバフィロマイシンＡ１は生存率のみを低下させたが（図３Ａ）、これらの濃度はなお、クロロキンによって誘導される大幅な生存率の減少を減退させた（図５Ａ）。クロロキン誘導性のカスパーゼ−３様活性の上昇は、０．３〜１ｎＭのバフィロマイシンＡ１を同時に添加したときにのみ低下し、１ｎＭで最大であった（３倍の減少：図５Ｂ）。バフィロマイシンＢ１とクロロキンもまた、上記の条件下の全ての１ｎＭで、クロロキン誘導性（２０μＭ）の生存率の減少を減退させた（データ示さず）。
【００５０】
バフィロマイシンＡ１が古典的なアポトーシス誘導刺激の毒性に影響するかどうかを検討するために、ＣＧＮ培養系でカスパーゼ−３様活性を著しく上昇させる濃度である（データ示さず）、０．１μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）でＣＧＮを２４時間処理した（図５Ｃ）。スタウロスポリンを用いた２４時間の処理により、生存率は平均４４％まで低下し、この効果は１ｎＭバフィロマイシンＡ１との同時投与で変化しなかった。しかし、１０ｎＭバフィロマイシンＡ１を用いた処理により、スタウロスポリン処理ＣＧＮの生存率が２０％までさらに低下した。
【００５１】
バフィロマイシンＡ１のカスパーゼ−３の活性に対する影響を確認するため、そしてクロロキン（２０μＭ）の存在下で、ＬＣ３のプロセシングに対するその影響を検討するために、ウエスタンブロットによる分析を行った（図６Ａ〜Ｄ）。これらの実験では、ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、表示の濃度のバフィロマイシンＡ１とクロロキンの添加の２４時間後に測定を行った。切断カスパーゼ−３（ＣＬカスパーゼ−３）のクロロキン誘導性の上昇は、≦１ｎＭバフィロマイシンＡ１と同時に処理することにより減退された（図６Ａと６Ｂ）。バフィロマイシンＡ１は、ＬＣ３−ＩＩのクロロキン誘導性のレベルを減退させなかったが、ＬＣ３−Ｉのレベルを増加させたように思われ（図６Ｃ）、これは検査したバフィロマイシンＡ１の全ての濃度での、ＬＣ３−Ｉに対するＬＣ３−ＩＩの割合の減少を反映している（図６Ａと６Ｄ）。
【００５２】
クロロキン（２０μＭ）および／またはバフィロマイシンＡ１を用いる処理の２４時間後に、生存率マーカー、カルセインＡＭの存在下で、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（ＬＴＲ）を用いてインキュベートすることにより液胞の酸性化を測定した（図７）。これらの実験では、ＣＧＮをｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、表示の濃度のバフィロマイシンＡ１とクロロキンの添加の２４時間後に測定を行った。それ単独では、１ｎＭ バフィロマイシンＡ１はＬＴＲの染色パターンを変化させず、対照細胞と比べて生存率を低下させることもなかった（図７Ａと７Ｂ）。対照的に、１０ｎＭバフィロマイシンＡ１を用いた処理は、ＬＴＲによる液胞の酸性化の検出を妨げただけでなく、生存ＣＧＮの数も減少させ（図７Ｃ）、これはクロロキンの存在下での、または存在しない場合と同様の効果であった（図７Ｃと７Ｆ）。クロロキンを用いた処理は生存ＣＧＮの数を減少させた（図７Ｄ）。しかし、このクロロキンの２４時間処理に耐えた、減少した一群のＣＧＮでは、対照細胞に認められたものよりも強度が強いＬＴＲ染色を示した（図７Ｄ）。１ｎＭバフィロマイシンＡ１とクロロキンを同時に添加すると、生存ニューロンの数が増加し、これはまたクロロキンまたはバフィロマイシンＡ１単独を用いた処理と比べ、ＬＴＲ染色の強度の増強も同時に示した（図７Ｅ）。
【００５３】
Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのこの過程における役割を評価するために、Ｂａｘ欠損ＣＧＮ（ＫＯと表記）から培養物を調製した（図８Ａ〜Ｅ）。これらの実験では、ＣＧＮ（野生型、ＷＴと表記、およびＢａｘ欠損、ＫＯと表記）をｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、表示の濃度のバフィロマイシンＡ１とクロロキンの添加の２４時間後に測定を行った。ＢａｘはプロアポトーシスのＢｃｌ−２ファミリーのメンバーであり、クロロキン誘導性の細胞死に影響を与え、リソソーム障害と自家融解ストレスに起因する細胞死に関与すると主張されてきた。Ｂａｘの標的欠損は、野生型（ＷＴ）と比較して２４時間目に測定された、クロロキン誘導性（２０μＭ）の、生存率における減少（図８Ａ）と、カスパーゼ−３様活性の増加（図８Ｂ）を減退させたが、１ｎＭバフィロマイシンＡ１によってもたらされた防御を上回ることはなかった（図８Ａと８Ｂ）。反対に、Ｂａｘの欠損は、１０ｎＭバフィロマイシンＡ１を用いた２４時間の処理によって誘導された、生存率の低下とカスパーゼ−３様活性の増加を妨げた（図８Ｃと８Ｄ）。Ｂａｘ標的欠損のカスパーゼ−３活性への影響をウエスタンブロットで確認した（図８Ｅ）。さらに、ウエスタンブロットによる分析は、Ｂａｘの欠損がＬＣ３−ＩＩのクロロキン誘導性の症状を妨げなかったことを示した（図８Ｅ）。
【００５４】
カルパインの作用によって、Ｂａｘを、２１ｋＤａの前駆体（ｐ２１）から１８ｋＤａのフラグメントへ（ｐ１８）切断することができる４１。Ｂａｘのｐ１８は、ミトコンドリアレベルでその細胞死作用を高めることが示されている。図８Ｆは、ＣＧＮにおいて、クロロキン（２０μＭで２４時間）とバフィロマイシンＡ１（１０ｎＭで２４時間）がｐ１８ Ｂａｘの量を増加させたことを示す。ｐ１８ Ｂａｘレベルのこの増加は、１ｎＭバフィロマイシンＡ１によって劇的に弱まった。これは、マクロライド系抗生物質が、アポトーシスとは別のメカニズムでｐ１８ Ｂａｘを活性化するデスシグナル（例えばカルパイン活性の誘導があるが、これに限定されない）の減弱を介して、それらが持つ神経保護効果を少なくとも部分的に誘導する可能性があることを示唆する。Ｂｉｄ（別のＢｃｌ−２ファミリーメンバー）の切断はクロロキンによって増加せず、これはＢｉｄの活性化は、ＣＧＮにおけるクロロキン誘導性の効果に関与しないことを示唆する（データ示さず）。
【００５５】
クロロキンがカスパーゼ−３の活性の劇的な上昇を誘導したため、このエフェクターであるカスパーゼの、クロロキン（２０μＭで２４時間）が誘発する細胞死の経路における相対的な位置を検討するために、ＣＧＮの培養物をカスパーゼ−３欠損マウスから調製した。カスパーゼ−３様活性における著しい減弱が認められたが、カスパーゼ−３の不在は、生存率（図９Ａ）におけるクロロキン誘導性の減少を妨げなかった（図９Ｂ）。他のカスパーゼ、例えばカスパーゼ−９がクロロキン誘導性の細胞死に重要であるかどうかを検討するため、野生型ＣＧＮを、広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤である、ＢＯＣ−アスパルチル（Ｏｍｅ）−フルオロメチルケトン（ＢＡＦ）で処理した。この阻害剤を用いた処理では、クロロキン誘導性の細胞死（２０μＭで２４時間）は弱まらなかった（図９Ｃ）が、カスパーゼ−３様活性のクロロキン誘導性上昇を著しく減退させた（図９Ｄ）。
【００５６】
上記の結果は、例えばバフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシンが含まれるが限定されない、マクロライド系抗生物質の投与が、神経細胞におけるクロロキン誘導性細胞死を、劇的かつ著しく減退させたことを示す。この効果は逆Ｕ字型の濃度依存性によって特徴付けられた。バフィロマイシンＡ１については、この効果は１ｎＭの濃度で最大であった。さらに、１ｎＭバフィロマイシンＢ１とコンカナマイシンも、神経細胞におけるクロロキン誘導性の細胞死を抑制した。この濃度のバフィロマイシンＡ１は液胞の酸性化を変化させず、またはオートファゴソームの形成を誘導しなかった。さらに、これらの濃度のマクロライド系抗生物質は、無細胞系における液胞のＡＴＰａｓｅの抑制に、最小限の影響を与えることがこれまでに示されている２１，２２。しかし、１０〜１００ｎＭのバフィロマイシンＡ１は、ＣＧＮ生存率と細胞死経路の誘導を低下させるその能力にもかかわらず、低い濃度ほど強固ではないにしても、クロロキン誘導性の細胞死を抑制した。これは、≧１０ｎＭでの、内因性のアポトーシス経路のバフィロマイシンＡ１依存性の誘導によるものと思われる。≧１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１の有無にかかわらず、クロロキン誘導性カスパーゼ−３様活性が最大であったことから、高濃度のバフィロマイシンＡ１が、クロロキン誘導性細胞死の明確な、カスパーゼ依存性の経路を妨げる可能性もある。従来は、様々な細胞培養モデルにおけるバフィロマイシンＡ１の効果は、一般的に≧１０ｎＭの濃度を用いて報告されてきた。１９，２０，２７、２８
【００５７】
１ｎＭのバフィロマイシンＡ１は、クロロキンによる傷害に耐えたＣＧＮの数を増やしただけでなく、濃染した、ＬＴＲ陽性の酸性の小胞の数も増やした。オートファゴソームの数の増加と同時に起こり、続いて起こるミトコンドリア膜の潜在能力の崩壊と、結果として起こるアポトーシスを示す細胞でのみ消失する２０、ＬＴＲ染色の一時的で強固な増加は、クロロキンを用いた処理でこれまでに説明されている１９，２０。本研究では、ＬＴＲの濃染を示すＣＧＮは、２４時間のクロロキンの傷害に耐え、ミトコンドリアの機能が損なわれていない細胞の集団に相当するかもしれない。
【００５８】
ＬＴＲ陽性の小胞は、成熟する間に酸性度が増加する、後期のオートファゴソームの集団に相当するかもしれない３２、３３。リソソームの機能を崩壊させることで、クロロキンは後期のオートファゴソームとの融合を妨げているのかもしれず、これは最終的に後期のオートファゴソームの蓄積をもたらす。一方で、１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１を用いた処理は、クロロキンの有無にかかわらずＬＴＲ染色を完全に妨げた。液胞のＡＴＰａｓｅを完全に阻害する濃度のバフィロマイシンＡ１は、融合を妨ることで初期のオートファゴソームの成熟を妨げるかもしれず、故にｐＨが高いためにＬＴＲで検出できなくなるオートファゴソームの蓄積をもたらす。生化学的には、ＬＣ３−ＩＩは初期と後期の両方のオートファゴソームで証明されており３４、これはクロロキンと１０ｎＭのＢａｆＡ１の両方が、ＬＣ３−ＩＩレベルを上昇させながらも、ＬＴＲの染色パターンの差をもたらす理由を示すものである。
【００５９】
バフィロマイシンＡ１に観察された濃度依存性の二相性は、Ｂａｘが無い場合のその効果によって注目される。クロロキン誘導性の細胞死が部分的にＢａｘ依存性であることを結果は明確に示すが、１ｎＭのバフィロマイシンＡ１によってもたらされたクロロキンに対する防御の程度は、Ｂａｘの欠損によってもたらされるそれよりはるかに大きかった。バフィロマイシンＡ１が、カスパーゼ−３の活性を著しく減退させｐ１８ Ｂａｘの形成を抑制することを考慮すると、バフィロマイシンＡ１の効果はＢａｘの上流に位置する可能性があり、また内因性のアポトーシス経路および／または古典的なアポトーシスに関連するだけでなく、細胞死をもたらす他の経路の活性化を妨げる可能性がある（図１０）。Ｂａｘの欠損がクロロキン誘導性のカスパーゼ−３の活性化を実質的に妨げたことから、このバフィロマイシンＡ１の補助的な防御効果を、例えば重複する調節機能をＢａｘと共有する、Ｂａｋなどの分子の機能阻害に起因すると考えることはできない４，３６。対照的に、Ｂａｘの欠損は１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１によって起こるカスパーゼ−３様活性の誘導と生存率の低下を著しく弱め、これはクロロキンの効果と同じように、高濃度のバフィロマイシンＡ１によるオートファジーの抑制がＢａｘ依存性のアポトーシスを誘導することを示唆する。
【００６０】
クロロキンはカスパーゼ−３の強固な活性化を誘導したが、カスパーゼ−３の標的欠損とカスパーゼの広範な薬理学的阻害ではクロロキン誘導性の細胞死を防げなかった。これまでに、培養した終脳のニューロンで同様の結果が得られており１８、これはクロロキン誘導性神経細胞死の拘束点がカスパーゼ活性化の上流に位置することを示唆する。これらの所見は、一般的なカスパーゼ阻害剤を用いた処理で減退した、ＨｅＬａ細胞のクロロキン誘導性の細胞死とは対照的である１９。
【００６１】
本発明は、バフィロマイシンＡ１の機能における、新規の濃度依存性の二相性を明らかにする。マクロライド系抗生物質の濃度が≦１ｎＭでは、マクロライド系抗生物質は細胞の生存率のクロロキン誘導性の低下を防ぐ。他の代替的な機構的説明に限定されないが、マクロライド系抗生物質（バフィロマイシンＡ１で説明するように）はリソソーム障害および／または自家融解ストレスに起因するデスシグナルを抑制する可能性がある。そのような抑制が、Ｂａｘとカスパーゼ−３活性化の上流に位置することをデータは示唆する。そのようなデスシグナルを阻害することで、正常な神経機能が回復され、細胞死が防がれるまたは少なくなる。これらの結果は、低濃度のマクロライド系抗生物質の神経保護薬としての役割を示唆する。従って、自家融解ストレスおよび／またはリソソーム障害によって誘導される神経変性を軽減することにより、マクロライド系抗生物質は神経細胞の生存率を維持し、神経細胞の機能を保護する。
【００６２】
前述の説明は、本発明の化合物と方法を図示し説明する。さらに、本発明は化合物と方法の一部の実施形態を説明するにすぎないが、上述のとおり、本発明の他の様々な組み合わせ、変更、環境で使用することができ、上記の教えおよび／または関連技術の技術または知識にふさわしい、本書で表される発明概念の範囲内で変更または修正することができることを理解するべきである。上記、本書で開示される実施形態は、本発明を実施する上で知られており、最良の形態を説明すること、また当業者がそのような実施形態、またはその他の実施形態において、本発明の特定の応用または使用に必要とされる様々な修正とともに、本発明を利用できるようにすることを意図している。従って、説明は、本発明を本書で開示される形態に限定することを意図するものではない。本書に引用する全ての文献は、完全に本発明で説明するものとして、参照することにより組み込まれる。
【００６３】
方法
試薬
特に記載のない限り、試薬はＳｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００６４】
動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを全ての実験で使用した。Ｂａｘとカスパーゼ−３が欠損したマウスの作成はこれまでに説明されている３７〜３９。これまでに説明されているように、遺伝的な状態は、（マウスの）尾から抽出したＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析によって決定された３８，３９。ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓのガイドラインに従ってマウスを飼育した。全ての動物プロトコールは、アラバマ大学バーミンガム校のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。
【００６５】
細胞培養
小脳顆粒神経細胞（ＣＧＮ）を、これまでに説明されたように生後７日のマウスから単離した４０。ＣＧＮをポリ−Ｌ−リジンコートのプレートに、１２５０細胞／ｍｍ２の密度で接種した。生存率とカスパーゼ活性のアッセイに、４８ウェルのプレートを使用し、ウエスタンブロットによる分析には１００ｍｍのディッシュを使用し、液胞の酸性化の分析には４ウェルのＰａｒａｄｏｘ ｃｈａｍｂｅｒスライド（Ａｇｅｎｅ）を使用した。
【００６６】
ＣＧＮ を４日目にｉｎ ｖｉｔｒｏで処理した。ＢａｆＡ１（最終濃度０．１〜１００ｎＭ）、ＢＯＣ−アスパルチル（Ｏｍｅ）−フルオロメチルケトン（最終濃度１５０μＭ：ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、オハイオ州オーロラ）、またはシクロヘキシミド（最終濃度０．０１〜１μｇ／ｍｌ）の存在下、または存在しない状態で、馴化培地を、クロロキン（最終濃度５−４０μＭ）を含む、または含まない新鮮培地と取替えた。ＣＧＮの別の培養物も、ＢａｆＡ１（最終濃度１〜１０ｎＭ）の存在下、または存在しない状態で、スタウロスポリン（０．１μＭ）で２４時間処理した。
【００６７】
生存率とカスパーゼ３様活性の測定
細胞の生存率（ＣａｌｃｅｉｎＡＭ蛍光性物質変換アッセイ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーンによる）とカスパーゼ〜３様活性（蛍光性物質ＤＥＶＤ切断アッセイによる）を、これまでに説明されているように行い４０、処理なしの対照と比較して表した。
【００６８】
ＬＴＲを用いたＣＧＮの標識
４ウェルのｐｅｒｍａｎｏｘ ｃｈａｍｂｅｒ スライド中で発育したＣＧＮから馴化培地を除去した。ＬＴＲ（０．０５μＭ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）とカルセインＡＭ（２．５μｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）をＬｏｃｋｅ緩衝液中で調製し、各ウェルに３７℃、３０分間加えた。このインキュベーション後、細胞をＬｏｃｋｅ緩衝液で洗浄し、封入した。落射蛍光機能を備えたＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡で画像を得た。
【００６９】
ウエスタンブロット
Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて３７℃で５分間インキュベーションすることにより、細胞をそれらの基質から剥離した。馴化培地をと細胞を遠心分離した（７００×ｇ、５分間、４℃）。上清を吸引し、１ｍｌの氷冷ＰＢＳで再懸濁した後、再び遠心分離した（７００ｘｇ、５分間、４℃）。得られたペレットを、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＳＤＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％プロテアーゼ阻害剤混合液、１％ホスファターゼ阻害剤混合液（Ｓｉｇｍａ）を含む、ｌｙｓｉｓバッファー中に再懸濁した。ＤＮＡをせん断するために、細胞溶解物を超音波分解した後、遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）、得られた上清を（細胞溶解物全体を取る）新しい試験管に移した。引き続き、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク濃度を決定した。等量のタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、ＰＶＤＦに転写された。転写された後、ブロットをおよそ３７ｋＤａで半分に切断した。タンパク質負荷を正常化する目的で、最初に、切断されたまたは活性なフラグメントに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて、低分子量のブロットを、活性なカスパーゼ−３を検出するために使用した、β−ＩＩＩチュブリンの検出のために、高分子量のブロットを使用した（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。ブロットを室温で１時間ブロッキングし、ＲＴ（５％ミルク）、続いて一次抗体で一晩インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＴＢＳでブロットを洗浄した後、二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｂｉｏｒａｄ）で室温１時間インキュベートし、続いて洗浄した。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナルを検出した。切断カスパーゼ−３を検出した後、Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてボトムブロットを切り出し、上述の同じウエスタンブロットプロトコールを用いてウサギ抗−ＬＣ３（Ｕｃｈｉｙａｍａラボより提供）でプローブした。ブロットをＢｉｏｒａｄ Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウェアを用いて密度測定でスキャンした。
【００７０】
統計
一元配置分散分析ＡＮＯＶＡ（３つ以上の集団の場合）または両側、対応のないｔ検定（二つの集団の場合）のいずれかを用いて処理による有意な効果を分析した。処理による遺伝子型特異的な効果を、有意性について二元配置分散分析ＡＮＯＶＡで分析した。ボンフェローニ検定を用いて事後解析を行った。ｐ＜０．０５を有意であると考えた。
【００７１】
参考文献
１．Ｓｃｈｗｅｉｃｈｅｌ ＪＵ，Ｍｅｒｋｅｒ ＨＪ（１９７３）Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｐｒｅｎａｔａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ．７：２５３−２６６
２．Ｃｌａｒｋｅ ＰＧ（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ：ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ａｎａｔ Ｅｍｂｒｙｏｌ（Ｂｅｒｌ）．１８１：１９５−２１３
３．Ｂｒｅｄｅｓｅｎ ＤＥ（２０００）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１７：８０１−８１０
４．Ｐｕｔｃｈａ ＧＶ，Ｈａｒｒｉｓ ＣＡ，Ｍｏｕｌｄｅｒ ＫＬ，Ｅａｓｔｏｎ ＲＭ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ ＥＭ，Ｊｒ．（２００２）Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｎｄ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５７：４４１−４５３
５．Ｓｈａｃｋａ ＪＪ，Ｒｏｔｈ ＫＡ（２００５）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｃｌ−２ ｆａｍｉｌｙ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｌ Ｄｉｓｏｒｄ．４：２５−３９
６．Ｋｌｉｏｎｓｋｙ ＤＪ，Ｅｍｒ ＳＤ（２０００）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９０：１７１７−１７２１
７．Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ Ｅ−Ｌ（２００５）Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ Ｖａｃｕｏｌｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．１：１−１０
８．Ｌｕｍ ＪＪ，ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ ＲＪ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ（２００５）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｍｅｔａｚｏａｎｓ：ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｎｄ ｏｆ ｐｌｅｎｔｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：４３９−４４８
９．Ｉｃｈｉｍｕｒａ Ｙ，Ｋｉｒｉｓａｋｏ Ｔ，Ｔａｋａｏ Ｔ，Ｓａｔｏｍｉ Ｙ，Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ Ｙ，Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｎ，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｎ，
Ｔａｎｉｄａ Ｉ，Ｋｏｍｉｎａｍｉ Ｅ，Ｏｈｓｕｍｉ Ｍ，Ｎｏｄａ Ｔ ａｎｄ Ｏｈｓｕｍｉ Ｙ（２０００）Ａ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｙｓｔｅｍ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．４０８：４８８−４９２
１０．Ｋａｂｅｙａ Ｙ，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｎ，Ｕｅｎｏ Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ａ，Ｋｉｒｉｓａｋｏ Ｔ，Ｎｏｄａ Ｔ，Ｋｏｍｉｎａｍｉ Ｅ，Ｏｈｓｕｍｉ Ｙ ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｔ（２０００）ＬＣ３，ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｙｅａｓｔ Ａｐｇ８ｐ，ｉｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｆｔｅｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９：５７２０−５７２８
１１．Ｌｕｍ ＪＪ，Ｂａｕｅｒ ＤＥ，Ｋｏｎｇ Ｍ，Ｈａｒｒｉｓ ＭＨ，Ｌｉ Ｃ，Ｌｉｎｄｓｔｅｎ Ｔ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ（２００５）Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ．１２０：２３７−２４８
１２．Ｂａｉｒｄ ＪＫ（２００５）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｄｒｕｇｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３５２：１５６５−１５７７
１３．Ｌａｉ ＪＨ，Ｈｏ ＬＪ，Ｌｕ ＫＣ，Ｃｈａｎｇ ＤＭ，Ｓｈａｉｏ ＭＦ ａｎｄ Ｈａｎ ＳＨ（２００１）Ｗｅｓｔｅｒｎ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｎｔｉｒｈｅｕｍａｔｉｃ ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｕｓｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｓｐａｓｅ ｃａｓｃａｄｅｓ ａｎｄ ｉｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ Ｆａｓ／Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６９１４−６９２４
１４．Ｉｓｓａ ＳＮ，Ｒｕｄｅｒｍａｎ ＥＭ（２００４）Ｄａｍａｇｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｈａｒｄ−ｈｉｔｔｉｎｇ，ｅａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｔｏ ｃｕｒｂｉｎｇ ｊｏｉｎｔ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｐｏｓｔｇｒａｄ Ｍｅｄ．１１６：１４−１４
１５．Ｗｏｚｎｉａｃｋａ Ａ，ＭｃＣａｕｌｉｆｆｅ ＤＰ（２００５）Ｏｐｔｉｍａｌ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ ｉｎ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．６：１−１１
１６．ｄｅ Ｄｕｖｅ Ｃ５ ｄｅ Ｂａｒｓｙ Ｔ，Ｐｏｏｌｅ Ｂ，Ｔｒｏｕｅｔ Ａ，Ｔｕｌｋｅｎｓ Ｐ ａｎｄ Ｖａｎ Ｈｏｏｆ Ｆ（１９７４）Ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ．Ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２３：２４９５−２５３１
１７．Ｓｅｇｌｅｎ ＰＯ，Ｇｏｒｄｏｎ ＰＢ（１９８０）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ ｍｏｎｏａｍｉｎｅｓ，ｄｉａｍｉｎｅｓ，ａｍｉｎｏ ａｌｃｏｈｏｌｓ，ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｍｉｎｏ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８：４６８−４７５
１８．Ｚａｉｄｉ ＡＵ，ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ ＪＳ，Ｋｌｏｃｋｅ ＢＪ，Ｌａｔｈａｍ ＣＢ，Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ ＳＪ，Ｆｌａｖｅｌｌ ＲＡ，Ｓｃｈｍｉｄｔ ＲＥ ａｎｄ Ｒｏｔｈ ＫＡ（２００１）Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｐ５３ ａｎｄ Ｂｃｌ−２ ｆａｍｉｌｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｕｔ ｃａｓｐａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．６０：９３７−９４５
１９．Ｂｏｙａ Ｐ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｏｌｏ ＲＡ，Ｐｏｎｃｅｔ Ｄ，Ａｎｄｒｅａｕ Ｋ，Ｖｉｅｉｒａ ＨＬ，Ｒｏｕｍｉｅｒ Ｔ，Ｐｅｒｆｅｔｔｉｎｉ ＪＬ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ（２００３）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｔｅｐ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２２：３９２７−３９３６
２０．Ｂｏｙａ Ｐ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｏｌｏ ＲＡ，Ｃａｓａｒｅｓ Ｎ，Ｐｅｒｆｅｔｔｉｎｉ ＪＬ，Ｄｅｓｓｅｎ Ｐ，Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅ Ｎ，Ｍｅｔｉｖｉｅｒ Ｄ，Ｍｅｌｅｙ Ｄ，Ｓｏｕｑｕｅｒｅ Ｓ，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｔ，Ｐｉｅｒｒｏｎ Ｇ，Ｃｏｄｏｇｎｏ Ｐ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ（２００５）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：１０２５−１０４０
２１．Ｂｏｗｍａｎ ＥＪ，Ｓｉｅｂｅｒｓ Ａ ａｎｄ Ａｌｔｅｎｄｏｒｆ Ｋ（１９８８）Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎｓ：ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ＡＴＰａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８５：７９７２−７９７６
２２．Ｄｒｏｓｅ Ｓ，Ｂｉｎｄｓｅｉｌ ＫＵ，Ｂｏｗｍａｎ ＥＪ，Ｓｉｅｂｅｒｓ Ａ，Ｚｅｅｃｋ Ａ ａｎｄ Ａｌｔｅｎｄｏｒｆ Ｋ（１９９３）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎｓ ａｎｄ ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎｓ ｏｎ Ｐ− ａｎｄ Ｖ−ｔｙｐｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：３９０２−３９０６
２３．Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ａ，Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｙ，Ｆｕｔａｉ Ｍ ａｎｄ Ｔａｓｈｉｒｏ Ｙ（１９９１）Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａｌ，ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ−ｔｙｐｅ Ｈ（＋）−ＡＴＰａｓｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６６：１７７０７−１７７１２
２４．Ｙａｍａｍｏｔｏ Ａ，Ｔａｇａｗａ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｔ，Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｙ，Ｍａｓａｋｉ Ｒ ａｎｄ Ｔａｓｈｉｒｏ Ｙ（１９９８）Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａｌ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｖａｃｕｏｌｅｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ．２３：３３−４２
２５．Ｎｉｓｈｉｈａｒａ Ｔ，Ａｋｉｆｕｓａ Ｓ，Ｋｏｓｅｋｉ Ｔ，Ｋａｔｏ Ｓ，Ｍｕｒｏ Ｍ ａｎｄ Ｈａｎａｄａ Ｎ（１９９５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ ｔｙｐｅ Ｈ（＋）− ＡＴＰａｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２１２：２５５−２６２
２６．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｋ，Ｗａｒｉｔａｎｉ Ｔ，Ｎｏｔｏ Ｍ，Ｔａｋｉｚａｗａ Ｋ，Ｍｉｎｅｍｏｔｏ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ａ ａｎｄ Ｏｈｋｕｍａ Ｓ（１９９６）Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａｌ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３９８：６１−６６
２７．Ｋａｎｚａｗａ Ｔ，Ｋｏｎｄｏ Ｙ，Ｉｔｏ Ｈ，Ｋｏｎｄｏ Ｓ ａｎｄ Ｇｅｒｍａｎｏ Ｉ（２００３）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｒｓｅｎｉｃ ｔｒｉｏｘｉｄｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：２１０３−２１０８
２８．Ｋａｎｚａｗａ Ｔ，Ｇｅｒｍａｎｏ ＩＭ，Ｋｏｍａｔａ Ｔ，Ｉｔｏ Ｈ，Ｋｏｎｄｏ Ｙ ａｎｄ Ｋｏｎｄｏ Ｓ（２００４）Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１１：４４８−４５７
２９．Ｌｅｅ ＣＹ，Ｂａｅｈｒｅｃｋｅ ＥＨ（２００１）Ｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２８：１４４３−１４５５
３０．Ｍａｒｔｉｎ ＤＮ，Ｂａｅｈｒｅｃｋｅ ＥＨ（２００４）Ｃａｓｐａｓｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１３１：２７５−２８４
３１．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｏｌｏ ＲＡ，Ｂｏｙａ Ｐ，Ｐａｕｌｅａｕ ＡＬ，Ｊａｌｉｌ Ａ，Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅ Ｎ，Ｓｏｕｑｕｅｒｅ Ｓ，Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ ＥＬ，Ｐｉｅｒｒｏｎ Ｇ，Ｓａｆｔｉｇ Ｐ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ（２００５）Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ／ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｐａｒａｄｏｘ：ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｅｆｏｒｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｄｅａｔｈ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．
３２．Ｄｕｎｎ ＷＡ，Ｊｒ．（１９９０）Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ：ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｖａｃｕｏｌｅ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１０：１９３５−１９４５
３３．Ｐｕｎｎｏｎｅｎ ＥＬ，Ａｕｔｉｏ Ｓ，Ｍａｒｊｏｍａｋｉ ＶＳ ａｎｄ Ｒｅｕｎａｎｅｎ Ｈ（１９９２）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ａｎｄ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４０：１５７９−１５８７
３４．Ｊａｇｅｒ Ｓ，Ｂｕｃｃｉ Ｃ，Ｔａｎｉｄａ Ｉ，Ｕｅｎｏ Ｔ，Ｋｏｍｉｎａｍｉ Ｅ，Ｓａｆｔｉｇ Ｐ ａｎｄ Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ ＥＬ（２００４）Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｒａｂ７ ｉｎ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｔｅ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｖａｃｕｏｌｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１７：４８３７−４８４８
３５．Ｔａｎｉｄａ Ｉ，Ｍｉｎｅｍａｔｓｕ−Ｉｋｅｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｕｅｎｏ Ｔ ａｎｄ Ｋｏｍｉｎａｍｉ Ｅ（２００５）Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｔｕｒｎｏｖｅｒ，ｂｕｔ Ｎｏｔ ａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｅｖｅｌ，ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＬＣ３ ｉｓ ａ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．１：８４−９１
３６．Ｗｅｉ ＭＣ，Ｚｏｎｇ ＷＸ，Ｃｈｅｎｇ ＥＨ，Ｌｉｎｄｓｔｅｎ Ｔ，Ｐａｎｏｕｔｓａｋｏｐｏｕｌｏｕ Ｖ，Ｒｏｓｓ ＡＪ，Ｒｏｔｈ ＫＡ，ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ＧＲ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ ａｎｄ Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ ＳＪ（２００１）Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＢＡＸ ａｎｄ ＢＡＫ：ａ ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ ｇａｔｅｗａｙ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅａｔｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９２：７２７−７３０
３７．Ｋｎｕｄｓｏｎ ＣＭ，Ｔｕｎｇ ＫＳ，Ｔｏｕｒｔｅｌｌｏｔｔｅ ＷＧ，Ｂｒｏｗｎ ＧＡ ａｎｄ Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ ＳＪ（１９９５）Ｂａｘ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ａｎｄ ｍａｌｅ ｇｅｎｕ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７０：９６−９９
３８．Ｋｕｉｄａ Ｋ，Ｚｈｅｎｇ ＴＳ，Ｎａ Ｓ，Ｋｕａｎ Ｃ，Ｙａｎｇ Ｄ，Ｋａｒａｓｕｙａｍａ Ｈ，Ｒａｋｉｃ Ｐ ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ ＲＡ（１９９６）Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ＣＰＰ３２−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ．３８４：３６８−３７２
３９．Ｓｈｉｎｄｌｅｒ ＫＳ，Ｌａｔｈａｍ ＣＢ ａｎｄ Ｒｏｔｈ ＫＡ（１９９７）Ｂａｘ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｂｃｌ−ｘ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：３１１２−３１１９
４０．Ｎｏｗｏｓｌａｗｓｋｉ Ｌ，Ｋｌｏｃｋｅ ＢＪ ａｎｄ Ｒｏｔｈ ＫＡ（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．６４：４９０−４９７
４１．Ｗｏｏｄ，ＤＥ ａｎｄ Ｎｅｗｃｏｍｂ，ＥＷ（２０００）Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｂａｘ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｔｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５６：３７５−３８２
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、クロロキンが細胞の生存率を低下させ、小脳の顆粒神経細胞（ＣＧＮ）のカスパーゼ−３様活性を増加させることを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養し、％対照（ＣＴＬ）と分別カスパーゼ−３様活性度（アポトーシスのマーカー）（図１Ｂ）で表す生存率（図１Ａ）を、方法の項で説明するようにクロロキン（５〜４０μＭ）で処理後２４時間後に測定した。生存率（図１Ｃ）とカスパーゼ−３様活性（図１Ｄ）も、方法の項で説明するように、２０μＭ クロロキンで処理後最大４８時間後まで測定した。少なくとも三回反復した、独立した三回の実験は、検査した各時間ポイントと濃度を表す。処理と時間の有意な効果を、一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。図１Ａと１Ｂに関しては、ｐ＜０．０５（＊はＣＴＬと比較して、†は５μＭのクロロキンと比較して、‡は１０μＭのクロロキンと比較して、♯は２０μＭのクロロキンと比較して）である。図１Ｃと１Ｄに関しては、 ｐ＜０．０５（＊０時間と比較して、†８時間と比較して、‡１６時間と比較して、♯は２４時間と比較して）である。
【図２】図２Ａ−２Ｅは、クロロキンがＣＧＮにアポトーシスの生物学的マーカー（カスパーゼ−３）と自家融解ストレス（ＬＣ３−ＩＩ）を引き起こすことを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。代表的なウエスタンブロット（図２Ａ）は、０時間の処理なしの（ＮＴ）サンプル、また４〜４８時間の、対照（ＣＴＬ）またはクロロキン（２０μＭ、ＣＱ）処理溶解産物での、切断カスパーゼ−３の定量とＬＣ３の切り出しを示す。β−ＩＩＩ−チュブリンのレベル、ならびにＬＣ３−ＩＩ／Ｉ（図２Ｅ）の比と比較して表した、切断カスパーゼ−３（アポトーシスのマーカー）（図２Ｂ）と、ＬＣ３−Ｉ（図２Ｃ）とＬＣ３−ＩＩ（自家融解ストレスのマーカー）（図２Ｄ）のレベルを評価するために、少なくとも３つの独立した実験を使用した。
【図３】図３Ａと３Ｂは、バフィロマイシンＡ１が、濃度依存性にＣＧＮの生存率を低下させ、カスパーゼ−３様活性を上昇させることを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。生存率（図３Ａ）とカスパーゼ−３様活性度（アポトーシスのマーカー）（図３Ｂ）を、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（０〜１００ｎＭ）の投与後、２４時間後に測定した。少なくとも三回反復した、独立した三回の実験は、検査した各時間ポイントと濃度を表す。処理の有意な効果は、一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊は０、０．１と０．３ｎＭのバフィロマイシンＡ１に比較して†は１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１に比較して）である。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、ＣＧＮにおいて、バフィロマイシンＡ１が用量依存性にアポトーシスのマーカーと自家融解ストレスを調節することを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。代表的なウエスタンブロット（図４Ａ）は、対照細胞（ＣＴＬ）での、溶解物における切断カスパーゼ−３の定量とＬＣ３のプロセシング、また様々な濃度のバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡｌ）の２４時間の投与を示す。β−ＩＩＩ−チュブリンのレベル、ならびにＬＣ３−ＩＩ／Ｉ（図４Ｄ）の比と比較して表した、切断カスパーゼ−３（アポトーシスのマーカー）（図４Ｂ）と、ＬＣ３−ＩとＬＣ３−ＩＩ（自家融解ストレスのマーカー）（図４Ｃ）のレベルを評価するために、少なくとも３つの独立した実験を使用した。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、クロロキン誘導性だが、スタウロスポリン誘導性でない、ＣＧＮの生存率の減少とカスパーゼ−３様活性の上昇を、バフィロマイシンＡ１が濃度依存性に弱めることを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。２０μＭ クロロキン（ＣＱ）とバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（０〜１００ｎＭ）を同時に投与した後、生存率（図５Ａ）とカスパーゼ−３様活性度（図５Ｂ）を２４時間後に測定した。バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（０〜１００ｎＭ）とスタウロスポリン（０．１μＭ）（ＳＴＳ）を同時に投与した後、２４時間後に生存率（図５Ｃ）を測定した。バフィロマイシンＡ１は、クロロキン誘導性の生存率とカスパーゼ−３活性（アポトーシスのマーカー）の減少を弱めたが、スタウロスポリン処理後、２４時間後の生存率の減少を防げなかった。独立した三回の実験は、検査した各濃度を表す。図５Ａと５Ｂに関しては、バフィロマイシンＡ１の有意な効果（ＣＱの存在下、あるいは存在しない場合で）は、一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊はＣＴＬと比べて、† はＣＱと比べて、‡は０．１ｎＭバフィロマイシンＡ１と比べて、♯は０．３ｎＭバフィロマイシンＡ１と比べて、§は１ｎＭ バフィロマイシンＡ１と比べて）。図５Ｃに関しては、スタウロスポリン（バフィロマイシンＡ１の存在下、または存在しない場合）の有意な効果を二元配置分散分析で評価し、バフィロマイシンＡ１の濃度依存性の差を、一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊はスタウロスポリン存在下のバフィロマイシンＡ１の各濃度と比べて、†は０および１ｎＭのバフィロマイシンＡ１と比べて）、
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、ＣＧＮのクロロキン誘導性のカスパーゼ−３の切断とＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの比を、バフィロマイシンＡ１が用量依存性に弱めることを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。２０μＭクロロキン（ＣＱ）の存在下、または存在しない状態で、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（０．３〜１０ｎＭ）で２４時間処理したサンプルでの、切断カスパーゼ−３と、ＬＣ３の切り出しを示す。β−ＩＩＩ−チュブリンのレベル、ならびにＬＣ３−Ｉに対するＬＣ３−ＩＩの比（図６Ｄ）と比較して表した、切断カスパーゼ−３（アポトーシスのマーカー）（図６Ｂ）と、ＬＣ３−ＩとＬＣ３−ＩＩ（自家融解ストレスのマーカー）（図６Ｃ）のレベルを評価するために、少なくとも３つの独立した実験を使用した。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、ＣＧＮの酸性の小胞の標識に対するクロロキンとバフィロマイシンＡ１の効果を示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。ＣＧＮを、（図７Ａ）対照（ＣＴＬ）、（図７Ｂ）１ｎＭのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）、（図７Ｃ）１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）、（図７Ｄ）２０μＭのクロロキン（ＣＱ）、（図７Ｅ）２０μＭのクロロキン（ＣＱ）＋１ｎＭのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）、（図７Ｆ） ２０μＭのクロロキン（ＣＱ）＋１０ｎＭのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）で２４時間処理した後Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで酸性の小胞について、カルセインＡＭで生存率について標識した。各実験を３回反復し、結果は同様であった。スケールバー＝１００ミクロンである。
【図８】図８Ａ〜８Ｆは、ＣＧＮにおけるバフィロマイシンＡ１の細胞保護効果がＢａｘ依存性であることを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。対照（ＣＴＬ）とクロロキン（ＣＱ：２０μＭ）処理の野生型（ＷＴ）とＢａｘ欠損（ＫＯ）ＣＧＮを、１ｎＭ（図８Ａと８Ｂ）または１０ｎＭ （図８Ｃと８Ｄ）バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）の存在下で、生存率（図８Ａと８Ｃ）とカスパーゼ−３様活性度（アポトーシスのマーカー）（図８Ｂと８Ｄ）について評価した。少なくとも３回反復した、少なくとも三回の独立した実験が、検査した各濃度と遺伝子型を表す。代表的なウエスタンブロット（図８Ｅ）は、対照薬またはクロロキン（ＣＱ、２０μＭ）処理後、２４時間後のＷＴとＫＯの溶解物での、切断カスパーゼ−３とＬＣ３の切り出しを示す。ＮＴは処理なし、０時間である。代表的なウエスタンブロット（図８Ｆ）は、１ｎＭ（ＢａｆＡ１−低濃度）バフィロマイシンＡ１が、ＷＴのＣＧＮ細胞における、表示された化合物での処理後２４時間後の、クロロキン（ＣＱ、２０μＭ） 誘導性のｐ１８Ｂａｘのレベルの上昇を抑制することを示す。図８Ａと８Ｂに関しては、処理に対する遺伝子型の有意な効果を二元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価し、有意な処理の効果を一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊はそれぞれのＷＴの処理ペアと比較して、†は遺伝子型を適合させたＣＴＬと比較して、‡は遺伝子型を適合させた、１ｎＭ バフィロマイシンＡ１を用いた処理と比較して、＃遺伝子型を適合させたＣＱを用いた処理と比較して）。図８Ｃと８Ｄに関しては、処理に対する遺伝子型の有意な効果を二元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価し、有意な処理の効果を両側、対応のないｔ検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊はそれぞれのＷＴ処理ペアと比べて、†は遺伝子型を適合させたＣＴＬと比べて）。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＧＮにおいて、カスパーゼ−３の欠損と、カスパーゼの薬理学的阻害のどちらも、クロロキン誘導性の細胞死を防げないことを示す。方法の項で説明するように、ＣＧＮを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した。細胞生存率（図９Ａと９Ｃ）とカスパーゼ−３様活性度（アポトーシスのマーカー）（図９Ｂと９Ｄ）を、野生型（ＷＴ）およびカスパーゼ−３−欠損（ＫＯ）ＣＧＮ（図９Ａと９Ｂ）において、または広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤ＢＯＣ−アスパルチル（Ｏｍｅ）−フルオロメチルケトン（ＢＡＦ、１５０μＭ：図９Ｃと９Ｄ）で同時に処理したＣＧＮにおいて、クロロキン（ＣＱ）または対照（ＣＴＬ）で処理した後、２４時間後に測定した。少なくとも三回反復した、少なくとも三回の独立した実験は、検査した各濃度と遺伝子型を表す。図９Ａと９Ｂに関しては、両側、対応のないｔ検定で遺伝子型の有意な効果を評価した。ｐ＜０．０５（＊はＣＴＬと比べて）である。図９Ｃと９Ｄに関しては、処理の有意な効果を一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定で評価した。ｐ＜０．０５（＊はＣＴＬと比べて、†はＣＱと比べて）である。
【図１０】図１０は、神経細胞死に対する、バフィロマイシンＡ１の濃度依存性効果を示す、可能性のある提案モデルを示す。バフィロマイシンＡ１が、低濃度ではリソソーム障害または自家融解ストレスに起因する細胞デスシグナルを抑制することが仮定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性によって特徴付けられる疾患または症状の治療または予防を該治療または予防を必要とする対象において行う方法であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質または、その医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記治療上有効な量は１ｎＭ以下である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記疾患または症状は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症で構成される群から選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項６】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項１の方法。
【請求項７】
前記神経変性が、治療しない場合に観察される神経変性と比較して、少なくとも５％以上抑制される、請求項１の方法。
【請求項８】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項１の方法。
【請求項９】
一つ以上の追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記対象はヒトである、請求項１の方法。
【請求項１２】
神経変性の予防を必要とする対象において、神経変性を少なくとも部分的に予防する方法であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質またはその医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を、前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記治療上有効な量は１ｎＭ以下である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記疾患または症状は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症からなる群から選択される、請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項１２の方法。
【請求項１６】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２の方法。
【請求項１７】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項１２の方法。
【請求項１８】
前記神経変性が、治療しない場合に観察される神経変性と比較して、少なくとも５％以上抑制される、請求項１２の方法。
【請求項１９】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項１２の方法。
【請求項２０】
一つ以上の追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１２の方法。
【請求項２１】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項１２の方法。
【請求項２２】
前記対象はヒトである、請求項１２の方法。
【請求項２３】
対象における症状を治療するが、前記対象におけるリソソーム経路に少なくとも部分的に有害な影響を及ぼす、薬の有害な影響を予防する方法であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を、前記薬と併用して前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記対象はヒトである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項２３の方法。
【請求項２６】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項２３の方法。
【請求項２７】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３の方法。
【請求項２８】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項２３の方法。
【請求項２９】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項２３の方法。
【請求項３０】
前記薬はクロロキンであり、及び前記症状はマラリア、関節リウマチ、または自己免疫疾患である、請求項２３の方法。
【請求項３１】
前記マクロライド系抗生物質は、ｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０の方法。
【請求項３３】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項３０の方法。
【請求項３４】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項３０の方法。
【請求項３５】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項３０の方法。
【請求項３６】
前記薬はフルオロキノロン類であり、前記症状は治療した骨、関節感染、皮膚感染、尿路感染、前立腺の炎症、耳感染、気管支炎、肺炎、結核、性行為感染症（ＳＴＤ）、後天性免疫不全症候群患者を侵す感染症である、請求項２３の方法。
【請求項３７】
前記フルオロキノロン類は、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、スパルフロキサシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６の方法。
【請求項４０】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項３６の方法。
【請求項４１】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項３６の方法。
【請求項４２】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項３６の方法。
【請求項４３】
対象における症状を治療するが、前記対象に自家融解ストレスを引き起こした薬の有害な影響を予防する方法であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を、前記薬と併用して前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
前記対象はヒトである、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項４３の方法。
【請求項４６】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項４３の方法。
【請求項４７】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項４３の方法。
【請求項４８】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項４３の方法。
【請求項４９】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項４３の方法。
【請求項５０】
前記薬はクロロキンであり、前記症状はマラリア、関節リウマチ、または自己免疫疾患である、請求項４３の方法。
【請求項５１】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項５０の方法。
【請求項５３】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項５０の方法。
【請求項５４】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項５０の方法。
【請求項５５】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項５０の方法。
【請求項５６】
前記薬はフルオロキノロン類であり、前記症状は治療した骨、関節感染、皮膚感染、尿路感染、前立腺の炎症、耳感染、気管支炎、肺炎、結核、性行為感染症（ＳＴＤ）、後天性免疫不全症候群患者を侵す感染症である、請求項４３の方法。
【請求項５７】
前記フルオロキノロン類は、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、スパルフロキサシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項５６の方法。
【請求項５８】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項５６の方法。
【請求項５９】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項５６の方法。
【請求項６０】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項５６の方法。
【請求項６１】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項５６の方法。
【請求項６２】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項５６の方法。
【請求項６３】
神経変性によって特徴付けられる疾患または症状の治療のための医薬組成物であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を含む、前記医薬組成物。
【請求項６４】
前記疾患または症状は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症からなる群から選択される、請求項６３の医薬組成物。
【請求項６５】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項６３の方法。
【請求項６６】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項６３の方法。
【請求項６７】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項６３の方法。
【請求項６８】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項６３の方法。
【請求項６９】
医薬的に許容できる担体をさらに含む、請求項６３の方法。
【請求項７０】
神経変性の予防のための医薬組成物であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を含む、前記医薬組成物。
【請求項７１】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項７０の方法。
【請求項７３】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項７０の方法。
【請求項７４】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項７０の方法。
【請求項７５】
医薬的に許容できる担体をさらに含む、請求項７０の方法。
【請求項７６】
神経変性を予防するために化合物を同定する方法であって、リソソーム系が少なくとも部分的に機能が損なわれているモデル系を提供すること、前記化合物を用いて前記モデル系をインキュベートすること、前記化合物の存在下および前記化合物の非存在下において神経変性を示す前記モデル系の特性を決定すること、及び前記特性が前記化合物の存在によって増加するかまたは減少するかを決定すること、を含む前記方法。
【請求項７７】
前記特性はカスパーゼ−３活性、アポトーシスの生化学的マーカーまたは自家融解ストレスの生化学的マーカーのうちの少なくとも一つであり、また前記特性は前記化合物の存在によって減少する、請求項７６の方法。
【請求項７８】
前記アポトーシスの生化学的マーカーはカスパーゼ−３活性である、請求項７７の方法。
【請求項７９】
前記自己貪食ストレスの生化学的マーカーはＬＣ３−ＩＩまたはＬＣ３−ＩＩのＬＣ３−Ｉに対する比である、請求項７７の方法。
【請求項８０】
前記特性は細胞の生存率または小胞の酸性化のうちの少なくとも一つであり、また前記特性は前記化合物の存在によって増加する、請求項７６の方法。
【請求項８１】
前記モデル系は株化細胞である、請求項７６の方法。
【請求項８２】
神経変性を治療または予防するために化合物を同定する方法であって、自己貪食ストレスの状態にあるモデル系を提供すること、前記化合物を用いて前記モデル系をインキュベートすること、前記化合物の存在下および前記化合物の非存在下において前記モデル系の特性を決定すること、前記化合物の存在下および非存在下において決定された前記特性を比較すること、を含む方法。
【請求項８３】
前記特性はカスパーゼ−３活性、アポトーシスの生化学的マーカーまたは自己貪食ストレスの生化学的マーカーのうちの少なくとも一つであり、また前記特性は前記化合物の存在によって減少する、請求項８２の方法。
【請求項８４】
前記アポトーシスの生化学的マーカーはカスパーゼ−３活性である、請求項８３の方法。
【請求項８５】
前記自己貪食ストレスの生化学的マーカーはＬＣ３−ＩＩまたはＬＣ３−ＩＩのＬＣ３−Ｉに対する比である、請求項８３の方法。
【請求項８６】
前記特性は細胞の生存率または小胞の酸性化のうちの少なくとも一つであり、また前記特性は前記化合物の存在によって増加する、請求項８２の方法。
【請求項８７】
前記モデル系は株化細胞である、請求項８２の方法。
【請求項１】
神経変性によって特徴付けられる疾患または症状の治療または予防を該治療または予防を必要とする対象において行う方法であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質または、その医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記治療上有効な量は１ｎＭ以下である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記疾患または症状は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症で構成される群から選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項６】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項１の方法。
【請求項７】
前記神経変性が、治療しない場合に観察される神経変性と比較して、少なくとも５％以上抑制される、請求項１の方法。
【請求項８】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項１の方法。
【請求項９】
一つ以上の追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記対象はヒトである、請求項１の方法。
【請求項１２】
神経変性の予防を必要とする対象において、神経変性を少なくとも部分的に予防する方法であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質またはその医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を、前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記治療上有効な量は１ｎＭ以下である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記疾患または症状は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症からなる群から選択される、請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項１２の方法。
【請求項１６】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２の方法。
【請求項１７】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項１２の方法。
【請求項１８】
前記神経変性が、治療しない場合に観察される神経変性と比較して、少なくとも５％以上抑制される、請求項１２の方法。
【請求項１９】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項１２の方法。
【請求項２０】
一つ以上の追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１２の方法。
【請求項２１】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項１２の方法。
【請求項２２】
前記対象はヒトである、請求項１２の方法。
【請求項２３】
対象における症状を治療するが、前記対象におけるリソソーム経路に少なくとも部分的に有害な影響を及ぼす、薬の有害な影響を予防する方法であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を、前記薬と併用して前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記対象はヒトである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項２３の方法。
【請求項２６】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項２３の方法。
【請求項２７】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３の方法。
【請求項２８】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項２３の方法。
【請求項２９】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項２３の方法。
【請求項３０】
前記薬はクロロキンであり、及び前記症状はマラリア、関節リウマチ、または自己免疫疾患である、請求項２３の方法。
【請求項３１】
前記マクロライド系抗生物質は、ｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０の方法。
【請求項３３】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項３０の方法。
【請求項３４】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項３０の方法。
【請求項３５】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項３０の方法。
【請求項３６】
前記薬はフルオロキノロン類であり、前記症状は治療した骨、関節感染、皮膚感染、尿路感染、前立腺の炎症、耳感染、気管支炎、肺炎、結核、性行為感染症（ＳＴＤ）、後天性免疫不全症候群患者を侵す感染症である、請求項２３の方法。
【請求項３７】
前記フルオロキノロン類は、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、スパルフロキサシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６の方法。
【請求項４０】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項３６の方法。
【請求項４１】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項３６の方法。
【請求項４２】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項３６の方法。
【請求項４３】
対象における症状を治療するが、前記対象に自家融解ストレスを引き起こした薬の有害な影響を予防する方法であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を、前記薬と併用して前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
前記対象はヒトである、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項４３の方法。
【請求項４６】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項４３の方法。
【請求項４７】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項４３の方法。
【請求項４８】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項４３の方法。
【請求項４９】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項４３の方法。
【請求項５０】
前記薬はクロロキンであり、前記症状はマラリア、関節リウマチ、または自己免疫疾患である、請求項４３の方法。
【請求項５１】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項５０の方法。
【請求項５３】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項５０の方法。
【請求項５４】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項５０の方法。
【請求項５５】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項５０の方法。
【請求項５６】
前記薬はフルオロキノロン類であり、前記症状は治療した骨、関節感染、皮膚感染、尿路感染、前立腺の炎症、耳感染、気管支炎、肺炎、結核、性行為感染症（ＳＴＤ）、後天性免疫不全症候群患者を侵す感染症である、請求項４３の方法。
【請求項５７】
前記フルオロキノロン類は、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、スパルフロキサシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項５６の方法。
【請求項５８】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項５６の方法。
【請求項５９】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項５６の方法。
【請求項６０】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項５６の方法。
【請求項６１】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項５６の方法。
【請求項６２】
前記治療は、神経細胞死、異常な神経病態、リソソーム障害によって生じるデスシグナルまたは自家融解ストレスによって生じるデスシグナルを、少なくとも部分的に抑制する、請求項５６の方法。
【請求項６３】
神経変性によって特徴付けられる疾患または症状の治療のための医薬組成物であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を含む、前記医薬組成物。
【請求項６４】
前記疾患または症状は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、テイ・サックス病、若年性神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ｂ型、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＦＴＤＰ−１７、レヴィー小体型認知症からなる群から選択される、請求項６３の医薬組成物。
【請求項６５】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項６３の方法。
【請求項６６】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項６３の方法。
【請求項６７】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項６３の方法。
【請求項６８】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項６３の方法。
【請求項６９】
医薬的に許容できる担体をさらに含む、請求項６３の方法。
【請求項７０】
神経変性の予防のための医薬組成物であって、少なくとも一つのマクロライド系抗生物質、またはその医薬的に許容できる誘導体の治療上有効な量を含む、前記医薬組成物。
【請求項７１】
前記マクロライド系抗生物質はｐｌｅｃｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ系抗生物質である、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記マクロライド系抗生物質は、バフィロマイシンＡ１、バフィロマイシンＢ１、コンカナマイシン、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される、請求項７０の方法。
【請求項７３】
前記マクロライド系抗生物質はバフィロマイシンＡ１である、請求項７０の方法。
【請求項７４】
前記医薬的に許容できる誘導体は、医薬的に許容できる塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物、またはプロドラッグである、請求項７０の方法。
【請求項７５】
医薬的に許容できる担体をさらに含む、請求項７０の方法。
【請求項７６】
神経変性を予防するために化合物を同定する方法であって、リソソーム系が少なくとも部分的に機能が損なわれているモデル系を提供すること、前記化合物を用いて前記モデル系をインキュベートすること、前記化合物の存在下および前記化合物の非存在下において神経変性を示す前記モデル系の特性を決定すること、及び前記特性が前記化合物の存在によって増加するかまたは減少するかを決定すること、を含む前記方法。
【請求項７７】
前記特性はカスパーゼ−３活性、アポトーシスの生化学的マーカーまたは自家融解ストレスの生化学的マーカーのうちの少なくとも一つであり、また前記特性は前記化合物の存在によって減少する、請求項７６の方法。
【請求項７８】
前記アポトーシスの生化学的マーカーはカスパーゼ−３活性である、請求項７７の方法。
【請求項７９】
前記自己貪食ストレスの生化学的マーカーはＬＣ３−ＩＩまたはＬＣ３−ＩＩのＬＣ３−Ｉに対する比である、請求項７７の方法。
【請求項８０】
前記特性は細胞の生存率または小胞の酸性化のうちの少なくとも一つであり、また前記特性は前記化合物の存在によって増加する、請求項７６の方法。
【請求項８１】
前記モデル系は株化細胞である、請求項７６の方法。
【請求項８２】
神経変性を治療または予防するために化合物を同定する方法であって、自己貪食ストレスの状態にあるモデル系を提供すること、前記化合物を用いて前記モデル系をインキュベートすること、前記化合物の存在下および前記化合物の非存在下において前記モデル系の特性を決定すること、前記化合物の存在下および非存在下において決定された前記特性を比較すること、を含む方法。
【請求項８３】
前記特性はカスパーゼ−３活性、アポトーシスの生化学的マーカーまたは自己貪食ストレスの生化学的マーカーのうちの少なくとも一つであり、また前記特性は前記化合物の存在によって減少する、請求項８２の方法。
【請求項８４】
前記アポトーシスの生化学的マーカーはカスパーゼ−３活性である、請求項８３の方法。
【請求項８５】
前記自己貪食ストレスの生化学的マーカーはＬＣ３−ＩＩまたはＬＣ３−ＩＩのＬＣ３−Ｉに対する比である、請求項８３の方法。
【請求項８６】
前記特性は細胞の生存率または小胞の酸性化のうちの少なくとも一つであり、また前記特性は前記化合物の存在によって増加する、請求項８２の方法。
【請求項８７】
前記モデル系は株化細胞である、請求項８２の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５０４７４３（Ｐ２００９−５０４７４３Ａ）
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２７０２９（Ｐ２００８−５２７０２９）
【出願日】平成１８年８月１４日（２００６．８．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３１６１９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２２０７６
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０５３２０７９１）ザ・ユー・エイ・ビー・リサーチ・フアンデーシヨン (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月１４日（２００６．８．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３１６１９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２２０７６
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０５３２０７９１）ザ・ユー・エイ・ビー・リサーチ・フアンデーシヨン (5)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]