免疫モジュレーションのための方法および薬剤ならびに推定免疫モジュレーターの同定方法が提供される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体における免疫応答の調節方法に関し、より詳しくは、標準および代替のＮＦ−κＢ活性化経路の両方に関与するＮＩＫおよびＮＩＫ結合性タンパク質を標的化する方法および薬剤、ＮＩＫ活性のモジュレーションのための分子／薬剤の同定方法、およびその方法によって得られ得る分子／薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子であるＮＦ−κＢ／Ｒｅｌファミリーは、炎症性応答および免疫細胞応答、細胞周期調節、分化ならびにアポトーシスからの保護において活性がある［Baeuerle and Baltimore, Cell 87:13-20, (1996）; Ghosh et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 225-260, (1998）］。哺乳動物において、この転写因子のファミリーは、５つのメンバーｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ＮＦ−κＢ１（これは、前駆体ｐ１０５として、およびプロセッシングされた形態ｐ５０としての両方で存在する）およびＮＦ−κＢ２（これは、前駆体ｐ１００として、およびそのプロセッシングされた形態ｐ５２としての両方で存在する）から構成される。ＮＦ−κＢタンパク質ホモ二量体およびヘテロ二量体は、細胞質内において、抑制因子であるＩκＢファミリーとの複合体で存在する。ＮＦ−κＢ１およびＮＦ−κＢ２の前駆体形態（それぞれ、ｐ１０５およびｐ１００）は、Ｃ末端ＩκＢ相同抑制領域（homologous inhibitory region）を含む。これらのＮＦ−κＢタンパク質を含む二量体は、ＩκＢ相同領域の機能のおかげで細胞質内に保持されている。さらに、ＮＦ−κＢ１／ｐ１０５およびＮＦ−κＢ２／ｐ１００はまた、他のＮＦ−κＢタンパク質の二量体とも会合し得、これらを細胞質内に保持させる。ＮＦ−κＢ活性化は、主に、ＩκＢタンパク質またはＮＦ−κＢ１／ｐ１０５およびＮＦ−κＢ２／ｐ１００のＩκＢ相同領域の誘導分解、および続くＮＦ−κＢ二量体の核への移行により起こる。ＩκＢタンパク質の誘導分解は、ＮＦ−κＢ活性を調節する最も重要な機序をもたらす（Baeuerle and Baltimore, 1996）（Ghosh et al., 1998）（Ghosh and Karin, 2002）。
【０００３】
これらのプロセスの知見のほとんどは、遍在するＮＦ−κＢ二量体ｐ６５: ｐ５０の活性化の機序に関する。この「標準」経路を開始する必須事象は、ＩκＢリン酸化タンパク質キナーゼＩＫＫ２の活性化である。ＩＫＫ２は、巨大分子複合体である「ＩＫＫシグナルソーム」うちに、構造的に相同なキナーゼＩＫＫ１およびアダプタータンパク質ＮＥＭＯと会合した状態で存在する。ＩκＢのＩＫＫ２媒介性リン酸化は、そのプロテオソーム分解をもたらし、したがって、その会合したＮＦ−κＢ二量体の活性化をもたらす（Karin and Ben-Neriah, 2000）。
【０００４】
他の研究により、ＮＦ−κＢ２／ｐ１００を含むＮＦ−κＢ二量体が活性化される「代替」経路の知識がある程度得られている。この活性化は、ＩＫＫ２またはＮＥＭＯとは独立して起こるが、ＩＫＫ１には依存性である。この経路の活性化時のｐ１００のリン酸化は、ｐ１００内のＩκＢ相同領域のみが分解される限定的タンパク質分解性プロセッシングを導く。このプロセスにより、生じたｐ５２断片が、いくつかの他のＮＦ−κＢタンパク質（主に、ＲｅｌＢ）と会合して核に移行するのが可能になる（Xiao et al., 2001）（Senftleben et al., 2001）（Solan et al., 2002）（Coope et al., 2002）（Claudio et al., 2002）（Kayagaki et al., 2002）（Dejardin et al., 2002）（Yilmaz et al., 2003）（Hatada et al., 2003）。
【０００５】
腫瘍壊死因子／神経成長因子（ＴＮＦ／ＮＧＦ）レセプターファミリーのタンパク質は、免疫系のホメオスタシスの維持に不可欠に関与する細胞表面レセプターの一群である。これらのタンパク質は、その対応するリガンドと相互作用し、免疫細胞の細胞死を誘導するか、または細胞生存を促進する。タンパク質のこの群の生物学的機能は、免疫応答の調節および自己免疫性疾患の病因と密接に関連している［Zhou et al., Immunol. Res. 26:323-336, (2002）］。ＴＮＦレセプターは、多くの免疫防御活性およびＮＦ−κＢ活性化を介するある特定の発生（developmental）プロセスを制御する（Wallach et al., 1999）（Locksley et al., 2001）。これらのレセプターのほとんどは、標準ＮＦ−κＢ経路を活性化することができる。加えて、その発現が間質細胞に限定されるリンホトキシン−βレセプター（ＬＴβＲ）およびリンパ球に存在するいくつかのレセプター（ＣＤ４０、ＢｌｙＳ／ＢＡＦＦおよび本発明の研究で示されるようにＣＤ２７）もまた、代替経路を活性化する（Dejardin et al., 2002）（Coope et al., 2002）（Claudio et al., 2002）（Kayagaki et al., 2002）（Hatada et al., 2003）。
【０００６】
ＴＮＦレセプターファミリーのいくつかのレセプターによるＮＦ−κＢ活性化のシグナル伝達は、ＴＲＡＦファミリーのアダプタータンパク質へのそれらの結合によって開始される。ＴＮＦで処理した細胞では、ＴＲＡＦは、アダプタータンパク質ＲＩＰと協働的に、ｐ５５ ＴＮＦレセプターへのシグナルソーム成分の補充を助長することが示された（Zhang et al., 2000）（Devin et al., 2000）（Devin et al., 2001）。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーによるＮＦ−κＢ活性化に関与するさらなるタンパク質は、「ＮＦ−κＢ誘導性キナーゼ」（ＮＩＫ）であると同定された（Malinin et al., 1997）。
【０００７】
最初は、ＮＩＫは、多くの異なる生理学的機能を有する多数の誘導因子に応答して標準ＮＦ−κＢ経路の活性化を媒介することが示唆された（Malinin et al., 1997）。しかしながら、後の非機能性ＮＩＫ変異体を発現するａｌｙ系統マウスおよびＮＩＫノックアウトマウスの研究は、ＮＩＫが、これらの誘導因子のほとんどの活性において機能的役割を有するという考えに異論を唱えるものであった。ＮＩＫは、どちらかというと、リンパ球の発生および機能に特異的に影響を及ぼす限定された組のリガンドによってＮＦ−κＢの活性化に選択的に関与することが示された（Shinkura et al., 1999）（Yin et al., 2001）。またさらに、これらの変異体マウス由来の細胞の特徴づけに基づき、ＮＩＫは、標準ＮＦ−κＢ経路にはまったく関与しないが、代替経路を排他的に活性化する機能を果たすことが示唆された（Pomerantz and Baltimore, 2002）。ＮＩＫ−変異体マウスのリンパ球は、高度に異常な分化パターンを示し（Miyawaki et al., 1994）（Shinkura et al., 1999）（Matsumoto et al., 1999）（Yamada et al., 2000）（Karrer et al., 2000）（Fagarasan et al., 2000）、したがって、本発明は、リンパ球におけるＮＩＫシグナル伝達の役割を再評価することを目的とした。
【０００８】
本発明において、リンパ球におけるＮＩＫの機能は、ここでは、リンパ芽球株の培養細胞において、そのインビトロ枯渇またはインビトロ抑制の影響を評価することによって再評価した。ＮＩＫが、リンパ球におけるＴＮＦによる標準経路の活性化に必要とされないことを示すことをアッセイでは確認した。しかしながら、以下に詳述するように、ＮＩＫは、これらの細胞において、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）およびＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ誘導による標準経路の活性化に加えて代替経路の活性化にも重要な役割を果たすことがわかった。さらにまた、主にＴリンパ球および記憶Ｂリンパ球において発現され、以前にＮＩＫ非依存的に（Akiba et al., 1998）、ＮＦ−κＢを活性化することが示唆された（Yamamoto et al., 1998）ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーレセプターであるＣＤ２７（Camerini et al., 1991）は、代替経路を開始することが示された。また本発明者らは、ＮＩＫが、ＳＩＶＡ（ＣＤ２７と会合しているタンパク質（Prasad et al., 1997））に結合し、このレセプターに応答して標準経路および代替ＮＦ−κＢ活性化経路の両方を媒介することを見出した。ＮＩＫは、ｐ５５ ＴＮＦレセプターによるシグナルソームの活性化に必要とされなかったが、CD27によるシグナルソームの活性化は、ＮＩＫに依存した。またさらに、ｐ５５ ＴＮＦレセプターによる誘発とは異なり、ＣＤ２７による誘発は、ＮＩＫ依存的に、ＩＫＫ１のこのレセプターへの選択的補充（ＣＤ２７による両ＮＦ−κＢ経路のＮＩＫ依存的活性化における開始事象であり得るプロセス）を誘導した。
【０００９】
ＮＩＫ依存性ＮＦ−κＢ経路のメンバーの生物学的機能は、免疫応答の調節および自己免疫性疾患の病因と密接に関連している。
【００１０】
本発明により、従来技術とは対照的に、ＮＩＫは、標準ＮＦ−κＢ活性化経路に関与することが示される。加えて、ＮＩＫは、ＢｌｙＳおよびＣＤ４０Ｌによって誘導される代替ＮＦ−κＢ経路に関与することが示され、ＣＤ７０が、この代替経路の新規な誘導因子であると同定された。
【００１１】
このように、本発明の知見により、ＮＦ−κＢ活性化におけるＮＩＫの役割が確立され、したがって、種々の免疫疾患の治療において、種々のＮＩＫ標的薬剤を用いることの動機付けが提供される。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、免疫障害の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ複合体形成を増加または減少させることができる薬剤の使用に関する。より詳しくは、前記免疫障害は、ＢｌｙＳ／ＢＡＦＦ、ＣＤ２７、ＳＩＶＡおよびＮＩＫからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の機能異常またはレベル異常を特徴とする。本発明による免疫障害の例は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤｓ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、全身性エリテマトーデス、炎症性大腸疾患、全身性炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である。
【００１３】
一側面において、本発明は、免疫障害の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ依存性ＣＤ２７調節を増大または低下させることができる薬剤の使用を提供する。特に、本発明は、たとえば、リン酸化ＮＩＫ活性化ループに対して指向される抗体などのＮＩＫに結合することができる抗体、またはたとえば、配列番号：１５記載のものなどの低分子干渉性ＲＮＡ分子またはリボザイムなどのＮＩＫ依存性ＣＤ２７調節を低下させるための薬剤の使用を提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、標準経路を介して異常なＮＦ−κＢ活性化によって引き起こされるか、または悪化する免疫障害の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫの活性を増大または低下させることができる薬剤の使用を提供する。特に、本発明は、たとえば、リン酸化ＮＩＫ活性化ループに対して指向される抗体などのＮＩＫに結合することができる抗体、または、たとえば、配列番号：１５記載のものなどの低分子干渉性ＲＮＡ分子、またはリボザイムなどのＮＩＫ依存性ＣＤ２７調節を低下させるための薬剤の使用を提供する。より詳しくは、前記の異常なＮＦ−κＢ活性化は、ＣＤ４０Ｌ、Ｂｌｙｓ、ＣＤ７０の誘導および／またはそのレセプターの活性化によって引き起こされ得る。
【００１５】
加えて、本発明は、免疫障害を有する個体に、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ複合体形成を増加または減少させることができる薬剤の治療有効量を投与し、それにより、該個体において免疫障害を治療することを含む、免疫障害の治療方法を提供する。特に、前記免疫障害は、ＢｌｙＳ／ＢＡＦＦ、ＣＤ２７、ＳＩＶＡおよびＮＩＫからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の機能異常またはレベル異常を特徴とする。より詳しくは、本発明による方法は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤｓ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、全身性エリテマトーデス、炎症性大腸疾患、全身性炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療するために使用され得る。本発明の一実施態様では、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ相互作用をモジュレートする薬剤の投与は、前記個体のリンパ球などの細胞内で前記薬剤を発現させることによって行なわれ得る。
【００１６】
また、本発明は、免疫障害を有する個体に、ＮＩＫ依存性ＣＤ２７調節を増大または低下させることができる薬剤の治療有効量を投与し、それにより、該個体において免疫障害を治療することを含む免疫障害の治療方法に関する。特に、この投与は、前記個体のリンパ球などの細胞内で前記薬剤を発現させることによって行なわれ得る。
【００１７】
さらなる実施形態において、本発明は、標準経路による異常なＮＦ−κＢ活性化で引き起こされるか、または悪化する免疫障害の治療方法に関し、該障害に罹患した個体に、ＮＩＫの活性を低下または増大させることができる薬剤の治療有効量を投与することを含む、免疫障害の治療方法に関する。特に、異常なＮＦ−κＢ活性化は、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０もしくはＢｌｙｓの誘導および／またはそのレセプターの活性化によって引き起こされ得る。本発明の特定の一実施態様では、該方法は、ＮＩＫの活性を低下させることができる薬剤、たとえば、リン酸化ＮＩＫ活性化ループに対して指向される抗体、配列番号：１５記載のものなどの低分子干渉性ＲＮＡ分子、またはリボザイムの使用を含む。
【００１８】
本発明はまた、供される細胞内でＮＩＫ発現を特異的に下方調節することができる核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド、たとえば、配列番号：１５記載のものなど低分子干渉性ＲＮＡ分子、かかるポリヌクレオチドを含有する構築物および該核酸構築物を含む細胞を提供する。
【００１９】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：２の座標６２４〜９４７、配列番号：３の１２３〜１７５および／または配列番号：４の５８〜１１０記載のアミノ酸配列領域に特異的に結合することができる抗体または抗体断片を提供する。
【００２０】
加えて、本発明は、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ複合体形成を増加または減少させることができる分子であって、推定免疫モジュレーターである該分子を同定することを含む推定免疫モジュレーターの同定方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、ＮＩＫ依存性ＣＤ２７調節を増大または低下させることができる分子であって、推定免疫モジュレーターである該分子を同定することを含む推定免疫モジュレーターの同定方法を提供する。
【００２２】
さらにまた、本発明は、細胞を該細胞においてＮＩＫ依存的標準および代替経路を誘導することができるＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのリガンドと接触させること、前記接触前、接触後、または接触中に細胞を個々の被験分子とともにインキュベートすること、細胞内の標準経路の活性化を検出すること、および前記リガンドによって誘導される標準経路の誘導をモジュレートすることができる単一の分子／分子群を選択することを含む、ＮＩＫの活性をモジュレートすることができる分子のスクリーニング（または同定および／または選択）方法を提供する。
【００２３】
一側面において、本発明は、リンパ芽球細胞を該細胞内でＮＩＫおよび標準経路を活性化することができるＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのリガンドと接触させること、前記接触前、接触後、またはそのあいだに細胞を個々の被験分子とともにインキュベートすること、標準経路の活性化を検出すること、およびＮＩＫ非依存的に前記リガンドによって誘導されるが、標準経路を誘導することができる他のどのリガンドによっても誘導されない標準経路の誘導をモジュレートすることができる単一の分子／分子群を選択することを含む、ＮＩＫ活性をモジュレートすることができる分子のスクリーニング（同定および／または選択）方法を提供する。
【００２４】
本発明の一実施態様では、該スクリーニング方法に使用されるリガンドは、ＣＤ７０、ＣＤ４０ＬまたはＢｌｙｓ／ＢＡＦＦから選択される。
【００２５】
本発明の別の実施態様では、該スクリーニング方法に使用される細胞は、リンパ芽球型、たとえば、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｒａｊｉ細胞またはＢＪＡＢ細胞などである。
【００２６】
本発明のさらなる実施態様では、標準経路の活性化は、ＩκＢ分解、ＩκＢαリン酸化およびｐ６５転位などの標準経路活性化を示すパラメータをモニターすることによるスクリーニング方法で検出される。
【００２７】
特に規定のない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施および試験において使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載するものである。矛盾する場合は、定義を含む本特許出願が支配する。加えて、材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。
【００２８】
本発明を、添付の図面を参照しながら、単に例示のために本明細書において記載する。図面に対する詳細な以下の具体的な言及に関して、示した特定の内容は、例示のため、および本発明の好ましい実施態様の実例の検討を目的とするにすぎず、本発明の原理および概念的側面の最も有用かつ容易に理解される記載と考えられるものを提供する理由で示したことを強調する。これに関連し、本発明の構造的詳細を本発明の基本的な理解に必要とされる以上に詳細に示す試みはしておらず、本記載内容は、図面と合わせると本発明のいくつかの形態がどのようにして実際に具現化され得るかが当業者に自明となろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、標準経路による異常なＮＦ−κＢ活性化によって引き起こされるか、または悪化する免疫障害における、ＮＩＫの活性を増大または低下させることができる薬剤の使用に関する。別の側面において、本発明は、免疫障害の治療におけるＮＩＫ−ＳＩＶＡ複合体形成を増加または減少させることができる薬剤の使用に関する。
【００３０】
本発明はまた、ＮＩＫの活性をモジュレート（増大または低下）することができる分子のスクリーニング（同定および／または選択）方法、およびその方法によって得られ得る分子に関する。
【００３１】
本発明の原理および操作は、図面およびそれに伴う説明を参照すると、より良好に理解されよう。
【００３２】
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、以下の説明に記載された詳細事項または実施例に例示された詳細事項に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施態様が可能であり、または種々の様式で実施もしくは実行することが可能である。また、本明細書で使用する語法および専門用語は、説明を目的としたものにすぎず、限定するものとみなされるべきでないことを理解されたい。
【００３３】
転写因子であるＮＦ−κＢファミリーは、炎症性細胞応答および免疫細胞応答、細胞周期調節、分化ならびにアポトーシスからの保護を含む多数の生物学的機能と関連している［Baeuerle and Baltimore, Cell 87:13-20, (1996）; Ghosh et al., Annu. Rev. Immunol. 16:225-260, (1998）］。これらの活性の多くは、リンパ球の生存および活性化の調節におけるＮＦ−κＢ機能の研究からわかった。
【００３４】
ＮＦ−κＢの制御された活性化が正常な先天的および適応的免疫応答に必須であること、ならびにリンパ球におけるＮＦ−κＢシグナル伝達の異常な調節が慢性炎症や自己免疫からリンパ腫に及ぶ疾患の発症をもたらすことは、充分確立されている［Ruland and Mak, Semin. Immunol. 3:177-83 (2003）］。したがって、リガンド−レセプター相互作用をブロックすることによるＮＦ−κＢシグナルの停止は、ＴおよびＢリンパ球の活性化および成長、炎症、線維芽細胞増殖ならびに細胞死と関連するシグナル伝達活性の有効な抑制を可能にする。したがって、ＮＦ−κＢ活性の調節は、上述の細胞シグナル伝達活性と関連する種々の障害の治療に有益であることが示され得る。
【００３５】
ＮＦ−κＢ活性化は、先の背景の項目で詳細に記載した標準および代替と称する２つの並行するシグナル伝達経路の少なくとも一方の活性化に起因する。
【００３６】
ＮＦ−κＢ活性化における重要な要素の１つは、ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）である。このタンパク質は、最初は、多数の誘導因子に応答して標準ＮＦ−κＢ経路の活性化に関与するとされていたが［N. L. Malinin, M. P. Boldin, A. V. Kovalenko, D. Wallach, Nature 385,540-4 (1997）; H. Akiba et al., J Biol Chem 273, 13353-8. (1998）］、これらの参照した従来技術文献の研究は、過剰発現したＮＩＫ変異体のシグナル伝達をブロックする能力に基づくものであり、これは、該アプローチが、ＮＩＫは標準経路のＴＮＦ活性化において機能するという証拠を提供した事実から明白であるように今では信頼できないとされている実験アプローチであり、それ以来、否定されている知見である［L. Yin et al., Science 291,2162-5. (2001）］。
【００３７】
したがって、より最近の研究は、初期の知見に異論を唱えるものであり、ＮＩＫは標準経路の活性化に関与せず、ＮＩＫがＣＤ２７シグナル伝達に関与することを示した研究は誤りであったという確かな証拠を提供する［S. Ghosh, M. Karin, Cell 109 Suppl, S81-96 (Apr, 2002）; E. Dejardin et al., Immunity 17,525-35 (Oct, 2002) and J. L. Pomerantz, D. Baltimore, Mol Cell 10,693-5 (Oct, 2002）。
【００３８】
したがって、ＮＩＫ阻害は、全身性炎症性反応症候群の治療における可能な治療的アプローチであることが示されているが、標準経路によるＮＦ−κＢ活性化によって引き起こされるかまたは悪化する疾患において、ＮＩＫ抑制剤を有効な薬物として利用することは非常に考えにくい。というのは、現在、当技術分野の業界では、標準経路の活性化におけるＮＩＫの役割は明らかに疑わしいと考えられているからである。
【００３９】
本発明により、従来技術とは対照的に、ＮＩＫは標準ＮＦ−κＢ活性化経路に関与することが確立された。加えて、ＮＩＫは、ＣＤ７０／ＣＤ２７シグナル伝達による代替ＮＦ−κＢ経路の活性化にも関与することがわかった。
【００４０】
本発明の知見により、ＮＦ−κＢ活性化におけるＮＩＫの役割が確立され、したがって、種々のＮＩＫ標的薬剤を、ＮＦ−κＢ活性化によって引き起こされるかまたは悪化する種々の免疫疾患の治療において用いることの動機付けが提供される。
【００４１】
以下の実施例の項目に説明するように、本発明者らは、ＮＩＫが、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦおよびＣＤ２７による標準経路の活性化に加えて、代替経路の活性化にも非常に重要な役割を果たすことを確立した。さらにまた、ＮＩＫは、ＣＤ２７と会合しているタンパク質のＳＩＶＡ（Prasad et al., 1997）に結合し、それにより、このレセプターに応答して標準および代替の両方のＮＦ−κＢ活性化経路を媒介することがわかった。ＮＩＫは、ｐ５５ ＴＮＦレセプターによるシグナルソームの活性化に必要とされなかったが、ＣＤ２７によるシグナルソームの活性化は、ＮＩＫに依存した。さらに、ｐ５５ ＴＮＦレセプターによる誘発とは異なり、ＣＤ２７による誘発は、ＮＩＫ依存的に、ＩＫＫ１のこのレセプターへの選択的補充（ＣＤ２７による両ＮＦ−κＢ経路のＮＩＫ依存活性化の開始事象であり得るプロセス）を誘導した。
【００４２】
本発明の研究が可能にした代替経路および標準ＮＦ−κＢ活性化経路の解明により（図６参照）、これらの経路のトランスデューサーおよびエフェクターの無秩序な活性の有害な影響を特異的に阻止することを目的とする改善された治療法の設計が可能になる。
【００４３】
したがって、本発明は、個体における免疫障害の治療方法を提供する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、語句「免疫障害」は、ＮＩＫ依存性ＮＦ−κＢシグナル伝達（すなわち、標準経路および代替経路、たとえば、図６に示したものなど）に関与する少なくとも１種のタンパク質（以下にさらに記載する）の異常な活性が存在する過剰抗原特異的または抗原非特異的（すなわち、先天的）免疫応答の不十分さと関連する障害をいう。かかる障害の例としては、限定されないが、多発性骨髄腫（ＭＭ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤｓ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、全身性エリテマトーデス、炎症性大腸疾患、全身性炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アジソン病、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、好酸球増多症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、慢性関節リウマチ、強皮症、全身性アナフィラキシー、全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、ヴェルナー症候群、および癌の合併症、血液透析、ならびに体外循環；ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生生物性、原生動物性および寄生虫性感染；ならびに外傷が挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「治療する」は、前記免疫障害の有害効果を予防、治癒、逆転、減衰、緩和、最小化、抑制または停止することをいう。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトをいう。
【００４７】
本発明によれば、個体には、ＮＩＫ依存ＮＦ−κＢシグナル伝達に関与する標的遺伝子または標的遺伝子産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の活性をモジュレートすることができる薬剤の治療有効量が提供され、それにより、該個体において免疫障害が治療され得る。
【００４８】
本明細書で使用する場合、語句「活性をモジュレートする」は、標的遺伝子または標的遺伝子の産物の固有の触媒活性（たとえば、ＮＩＫのキナーゼ活性）、相互作用活性（たとえば、実施例の項目の実施例１に説明したようなＮＩＫ−ＳＩＶＡ相互作用）または発現（たとえば、実施例の項目の実施例２に説明したようなＮＩＫ発現）を増大または低下することをいう。
【００４９】
いくつかの遺伝子およびその産物が、本発明にしたがって標的として使用され得る（図６を参照）。かかる標的遺伝子の例を、以下に、これが関与する免疫障害の例とともに列挙する。
【００５０】
ＢＬｙＳ−ＢＬｙＳは、ＢＡＦＦ−レセプタータンパク質に結合し、成熟Ｂ細胞の生存およびＢ細胞応答を助長する。このタンパク質は、末梢血白血球内で豊富に発現され、単球およびマクロファージにおいて特異的に発現される。また、これは、脾臓、リンパ節、骨髄、Ｔ細胞および樹状細胞においても見られる。多発性骨髄腫（ＭＭ）におけるＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）の関与は、いくつかの側面において実証された。ＭＭ細胞は、ＢＬｙＳレセプターを発現することが示され、同様に、ＢＬｙＳが、ＭＭ細胞の増殖能および生存をモジュレートすることが示された。ＢＬｙｓタンパク質はまた、ＭＭ患者の骨髄においても見られた［Novak et al., Blood. 先行公開（Epub ahead of print) (2003）］。ＢＬｙＳレベルはグロブリンとともに、ＨＩＶ疾患が進行するにつれて増大することがわかった［Rodriguez et al., AIDS. 17:1983-1985 (2003）］。別の自己免疫性疾患であるシェーグレン症候群（ＳＳ）におけるＢＬｙＳ分子の関与は、Ｂリンパ球のポリクローナル活性化を媒介するその能力、およびその自己抗体の産生におけるその役割によって明らかにされた。また、ヒトＳＳ患者において、そのＢＬｙＳレベルは、自己抗体のレベルと相関することが示された。したがって、ＢＬｙＳは、該疾患の顕著な特徴である特異的自己反応性Ｂ細胞の活性化および自己抗体産生レベルのモジュレーションに、ある役割を果たし得る［Mariette et al., Ann. Rheum. Dis. 62:168-171, (2003）］。ＢＬｙＳがある役割を果たすことが示された別の疾患は全身性エリテマトーデスである。マウスにおけるＢＬｙＳの過剰発現は、全身性エリテマトーデス様（ＳＬＥ様）疾患をもたらす。ＢＬｙＳの過剰発現はまた、ヒトＳＬＥにおいてもよく見られる。ＢＬｙＳアンタゴニストでのＳＬＥ易発性マウスの治療は、疾患進行を改善し、生存を向上させる［Stohl, Arthritis Res. Ther. 5: 136-138, (2003）］。ＢｙＬＳの効果は、末梢および骨髄におけるＣＤ５（＋）Ｂ細胞の蓄積を特徴とする疾患であるＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）において明らかにされた。調べた全てのＢ−ＣＬＬ患者の細胞は、ＢＬｙＳに対する３種類の既知レセプターの１種以上を発現した。患者のサブセット由来のＢ−ＣＬＬ細胞はＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬのｍＲＮＡを異常に発現するが、これらの分子は正常Ｂ細胞では検出可能でなかった。加えて、ＢＬｙＳは、Ｂ−ＣＬＬ細胞をアポトーシスから保護し、細胞生存を向上させることがわかった［Novak et al., Blood. 100:2973-2979, (2002）］。２種類のタンパク質ＡＰＲＩＬおよびＢＬｙＳのヘテロ三量体は、全身性免疫リウマチ疾患の患者由来の血清試料において見られ、これは、リウマチ疾患におけるこれらの分子の役割をも示唆する［Roschke et al., J. Immunol. 169:4314-4321, (2002）］。したがって、本発明は、前記免疫障害を克服するための、ＮＩＫ依存ＮＦ−κＢ経路によるＢＬｙｓシグナル伝達の下方調節を想定する。
【００５１】
ＣＤ４０Ｌ−このリガンドは、ＣＤ４０レセプターへの結合により、ＮＩＫ依存性ＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化し得る（実施例の項目の実施例６を参照）。ＣＤ４０Ｌは、ＨＩＶ感染に関与することが示された。ＨＩＶ感染において見られる相対的ＣＤ４０Ｌ欠損の逆転は、ＡＩＤＳにおいて免疫回復を助長し得ることが示唆された［Kornbluth, J. Leukoc. Biol. 68:373-382, (2000）］。したがって、本発明は、上記の免疫障害を克服するための、ＮＩＫ依存性ＮＦ−κＢ経路によるＣＤ４０Ｌシグナル伝達の上方調節を想定する。
【００５２】
ＣＤ２７−Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞によるＣＤ２７の発現は、この疾患の臨床試験結果に影響することが示された［Bannerji and Byrd, Curr. Opin. Oncol. 12:22-29, (2000）］。ＣＤ２７はまた、多発性骨髄腫患者において不均一な発現を有することが示された。低ＣＤ２７発現は、疾患リスクの高い患者と相関することがわかった［Guikema et al., Br. J. Haematol. 121:36-43, (2003）］。ＣＤ２７はまた、全身性エリテマトーデス患者において、リンパ球計測数および疾患過程と関連して見い出された［Swaak et al., Clin. Rheumatol. 14:293-300, (1995）］。したがって、本発明は、治療対象の免疫障害に応じた、ＮＩＫ依存ＮＦ−κＢ経路によるＣＤ２７シグナル伝達の上方調節または下方調節の選択を想定する。
【００５３】
ＮＩＫ−「ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ」は、ＳＩＶＡ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＩＫＫＡおよびＮＦ−カッパＢ^-２／Ｐ１００に結合する。このタンパク質は、精巣、小腸、脾臓、胸腺、末梢血白血球、前立腺、卵巣および結腸において弱く発現される。
【００５４】
ＳＩＶＡ−ＣＤ２７およびＳＩＶＡにおける上方調節は、腎機能障害（たとえば、虚血性および損傷性腎組織）において示された。両タンパク質の発現は、アポトーシスまたは壊死による死を受けることが知られた細胞集団において見られた［Schumer et al., Am. J. Pathol. 140:831-838, (1992）; Shimzu and Yamanaka, Virchows Archiv. B Cell Pathol. 64:171-180; (1993）, Basile et al., Am J. Physiol. 272:F640-F647, (1997）］。ＣＤ２７媒介性腎アポトーシスの変更を指令するストラテジーは、急性虚血性腎損傷の過程にプラスの効果を与えることが示唆された［Padanilam et al., Kidney Int. 54:1967-1975, (1998）］。したがって、本発明は、上記の腎障害を克服するための、ＮＩＫ依存ＮＦ−κＢ経路によるＳＩＶＡシグナル伝達の下方調節を想定する。コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）のキャプシドタンパク質ＶＰ２とのＳＩＶＡ相互作用は、ＣＶＢ３誘発性疾患を持続させることが示された［Henke (2003) Clin. Exp. Med. 2（4）:192-6］。したがって、本発明は、ウイルス性障害を克服するための、ＮＩＫ依存性ＮＦ−κＢ経路によるＳＩＶＡシグナル伝達の下方調節を想定する。ＳＩＶＡ−ＣＤ２７相互作用の欠如は骨髄腫発生に関与し、これは、骨髄腫発生を克服するための、ＮＩＫ依存性ＮＦ−κＢ経路によるＳＩＶＡ−ＣＤ２７シグナル伝達の上方調節を示唆する［Katayama (2003) Br J Haematol. 120（2）:223-34］。
【００５５】
上述のように、免疫障害の治療は、本発明によれば、たとえば、上記のものなどの少なくとも１種類の標的遺伝子または遺伝子産物の活性を増大（すなわち、上方調節）または低下（すなわち、下方調節）することができる薬剤を個体に与えることにより行なわれ得る。
【００５６】
本発明の標的遺伝子の発現を上方調節することができる薬剤は、本発明の標的遺伝子の少なくとも機能的部分が発現されるように設計および構築された外因性ポリヌクレオチド配列であってもよい。したがって、外因性ポリヌクレオチド配列は、免疫障害をモジュレートすることができるＣＤ２７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２４２）、ＣＤ４０Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００７４）、ＢＬｙｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６５７３）、ＳＩＶＡ（ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２ それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６４２７およびＮＭ＿０２１７０９）またはＮＩＫ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３９５４）分子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの配列であり得る。
【００５７】
したがって、たとえば、外因性ＮＩＫを哺乳動物細胞において発現させるため、ＮＩＫをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：１）を、好ましくは、哺乳動物細胞発現に適した核酸構築物内にライゲートする。かかる核酸構築物としては、該細胞内でのポリヌクレオチド配列の転写を構成的または誘導的に指令するためのプロモーター配列が含まれる。好適なプロモーターは、たとえば、Ｂリンパ球においてＮＩＫ発現を指令することができるレンチウイルス系ベクター（たとえば、ｐＳＵＰＥＲ）由来のプロモーターであり得る（実施例２参照）。本発明の核酸構築物は、さらなるポリヌクレオチド配列、たとえば、選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする配列、細菌の複製起点をコードする配列、単一のｍＲＮＡ（ＩＲＥＳ）からいくつかのタンパク質を翻訳させる配列（たとえば、ＮＩＫとＳＩＶＡの同時発現を指令し、各々のより高い発現レベルを得、したがって、より高いＮＦ−κＢ活性化レベルを得るため）（実施例の項目の実施例１を参照）、プロモーター／キメラポリペプチドコード領域のゲノム集積のための配列および／または哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１（これらはインビトロジェンから入手可能）、ｐＣＩ（これはプロメガから入手可能）、およびｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはストラタジーンから入手可能）、ｐＴＲＥＳ（これらはクロンテックから入手可能））ならびに一般的に含まれるその誘導体などの配列などをさらに含み得る。
【００５８】
核酸構築物は個体に、任意の適当な投与様式、たとえば、以下に記載のもの（すなわち、インビボ遺伝子治療）を用いて投与され得ることを認識されたい。あるいはまた、核酸構築物を適当な細胞内に、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同組換えなど）および必要に応じて発現系により導入し、次いで、改変細胞を拡大培養し、個体にもどす（すなわち、エキソビボ遺伝子治療）。
【００５９】
現在のところ好ましいインビボ核酸導入手法としては、アデノウイルス、レンチウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルス系または非ウイルス系構築物によるトランスフェクションおよび脂質系システムが含まれる。遺伝子の脂質媒介導入に有用な脂質は、たとえば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである［Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1) :54-65 (1996）］。遺伝子治療における使用に最も好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。レトロウイルス系構築物などのウイルス系構築物は、少なくとも１種類の転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座規定エレメント、またはたとえば、選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出またはメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。かかるベクター構築物はまた、該ウイルス系構築物に既に存在する場合を除いて、パッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲｓ）またはその部分、および使用するウイルスに適切な正および負鎖プライマー結合性部位を含む。加えて、かかる構築物は、典型的には、これが内在する宿主細胞由来のペプチドの分泌のためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物シグナル配列または本発明のポリペプチドバリアントのシグナル配列である。任意に、構築物はまた、ポリアデニル化を指令するシグナルならびに１つ以上の制限部位および翻訳末端配列を含む。一例として、かかる構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲまたはその部分を含む。非ウイルス系の他のベクター、たとえば、カチオン系脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなどを使用してもよい。
【００６０】
また、本発明の標的遺伝子を上方調節することができる薬剤は、本発明の標的遺伝子をコードする内在性ＤＮＡまたはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を増加させることができる任意の化合物であり得る。たとえば、ＰＨＡを用いてＣＤ２７およびＣＤ７０を増加させることができる。加えて、ＣＤ２７レベルを増大させるために抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ３抗体が使用され得る（de Jonget al.)が、ＣＤ７０レベルを増大させるためにはＣＤ４０Ｌの発現が用いられ得る（Hintzenet al.)。
【００６１】
あるいはまた、加えて、上方調節は、個体に少なくとも１種類の標的、たとえば、上記のものなどを投与することによって行なわれ得る。かかるタンパク質は、たとえば、標準的な固相手法を用いることなどによって生化学的に合成され得る。このような方法としては、排他的固相合成、部分固相合成法、断片縮合、古典的な溶液合成が挙げられる。これらの方法は、好ましくは、ペプチドが比較的短い（すなわち、１０ｋＤａ）場合および／または組換え手法により作製できない（すなわち、核酸配列にコードされていない）ため、異なる化学反応を伴う場合に使用される。
【００６２】
固相ペプチド合成手法は、当該技術分野でよく知られており、John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Syntheses（第２版, Pierce Chemical Company, 1984）にさらに記載されている。
【００６３】
合成ペプチドは分取用高速液体クロマトグラフィー［Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.］によって精製することができ、その組成はアミノ酸配列決定により確認することができる。
【００６４】
大量の本発明のペプチドが所望される場合、本発明のタンパク質を、たとえば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組換えＣＤ７０の大規模産生について記載されたもの（以下の実施例の項目の実施例２参照）、ならびにBitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544、Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89、Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514、Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311、Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 and Brogli et al., (1984) Science 224:838-843、Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 and Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463に記載されたものなどの組換え手法を用いて作製してもよい。
【００６５】
本発明のタンパク質標的はまた、市販品として入手され得ることを理解されたい。たとえば、組換えＢＡＦＦ（カタログ番号ＰＦ０８８）および組換えＣＤ４０Ｌ（カタログ番号ＰＦ０９１）は、メルク バイオサイエンスから入手可能である。
【００６６】
上記のように、本発明による免疫障害の処置はまた、たとえば、上記のものなどのその産物の標的遺伝子を下方調節することによって行なわれ得る。
【００６７】
本発明の標的遺伝子産物を下方調節することができる薬剤の一例は、標的遺伝子産物に特異的に結合し、エフェクター分子へのその結合を阻害することができる抗体または抗体断片である。たとえば、ＮＩＫのアミノ酸座標６２４〜９４７（配列番号：２）、ＳＩＶＡ１のアミノ酸座標１２３〜１７５（配列番号：３）またはＳＩＶＡ２のアミノ酸座標５８〜１１０（配列番号：４）に指向される抗体は、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ複合体形成を抑制し、それにより、ＮＦ−κＢシグナル伝達を低減する。あるいはまた、本発明の抗体は、標的遺伝子産物のそのエフェクター分子への結合は依然として維持し得るが、その触媒活性を阻害し得るものであってもよい。リン酸化ＮＩＫ活性化ループに指向されるかかる抗体を、以下の実施例の項目の実施例４に記載する。
【００６８】
好ましくは、該抗体は、標的遺伝子産物の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する。本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基をいう。
【００６９】
エピトープ決定基は、通常、化学的に活性な表面分子（たとえば、アミノ酸または炭化水素側鎖など）の集団からなり、通常、特異的な三次元の構造的特徴および特異的な帯電特性を有する。
【００７０】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、マクロファージに結合することができるインタクトな分子およびその機能性断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなど）を含む。これらの機能性抗体断片は、以下のように定義する。（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性断片を含む断片であり、完全な抗体を酵素パパインによる消化によってインタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部分を作製され得る。（２）Ｆａｂ’は、完全な抗体のペプシンによる処理後、還元によってインタクトな軽鎖および重鎖の一部分を生成させることにより得られ得る抗体分子の断片である。１つの抗体分子につき、２つのＦａｂ’断片が得られる。（３）（Ｆａｂ’）２は、完全な抗体を酵素ペプシンで処理する（その後の還元は行なわない）ことにより得られ得る抗体の断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって互いに支持する２つのＦａｂ’断片の二量体である。（４）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学的に作製した断片と定義される。（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、適当なポリペプチドリンカーで連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を、遺伝子工学的に融合した単鎖分子として含有する遺伝子工学的に作製した分子である。
【００７１】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにその断片の作製方法は、当該技術分野において周知である(たとえば、引用により本明細書に組み込まれる Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照)。
【００７２】
本発明による抗体断片は、抗体のタンパク質分解性加水分解により、または大腸菌もしくは哺乳動物細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）において該断片をコードするＤＮＡを発現させることにより調製することができる。抗体断片は、慣用法による完全な抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。たとえば、抗体断片は、ペプシンを用いた抗体の酵素による切断によって作製でき、Ｆ（ａｂ’）２で示される５Ｓ断片を提供する。この断片を、チオール還元剤および、任意には、ジスルフィド結合の切断によって生じるスルフヒドリル基の保護基を使用することにより、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を生成させることができる。あるいはまた、ペプシンを用いた酵素による切断により、２つの一価のＦａｂ’断片とＦｃ断片とが直接生成される。これらの方法は、たとえば、Goldenbergの米国特許第4,036,945号および同第4,331,647号、ならびにそれらに記載された参考文献（これらの特許は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、Porter, R. R. [Biochem. J. 73:119-126 (1959)]も参照のこと。たとえば、一価の軽／重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断などの抗体を切断する他の方法、または他の酵素的、化学的または遺伝子工学的な手法もまた、断片がインタクトな抗体に認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
【００７３】
Ｆｖ断片は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖の結合を含む。この結合は、Inbar et al., [Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (1972)］に記載のように、非共有結合性であり得る。あるいはまた、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結されたものであっても、グルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋されたものであってもよい。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含有する。このような単鎖抗原結合性タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含有する構造遺伝子を構築することにより調製される。該構造遺伝子を発現ベクター内に挿入し、続いて、これを、大腸菌などの宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドによって単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖの作製方法は、たとえば、[Whitlow and Filpula, Methods 2:97-105 (1991)；Bird et al., Science 242:423-426 (1988)；Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993)；および米国特許第4,946,778号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００７４】
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域(ＣＤＲ)をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド(「最小限の認識単位」)は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。かかる遺伝子は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を用い、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製される。たとえば、Larrick and Fry [Methods, 2:106-10 (1991)]を参照のこと。
【００７５】
非ヒト（たとえば、マウス）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖もしくは断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２または抗体の他の抗原結合性の部分配列）のキメラ分子であり、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む。ヒト化抗体としては、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域(ＣＤＲ)由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基と置き換えられたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基と置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても外来性ＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見られない残基を含有し得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含有し、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが関連するヒトコンセンサス配列のものに対応する。また、最適には、ヒト化抗体は、免疫グロブリン由来の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンもの）の少なくとも一部分を含む[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]。
【００７６】
非ヒト抗体のヒト化の方法は、当該技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば外来性残基とよばれ、典型的には、外来性可変ドメインから採用される。本質的に、ヒト化は、Winter および共働者[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]の方法にしたがって、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって行なわれ得る。したがって、かかるヒト化抗体はキメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に短いものが、非ヒト種由来の対応する配列で置き換えられている。実際面では、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかのＣＤＲ残基やいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体内の類似部位由来の残基で置き換えられたヒト抗体であり得る。
【００７７】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーなどの当該技術分野において公知の種々の手法を用いて作製することができる[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]。Cole et al., and Boernerらの手法もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991)]。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物（たとえば、マウス）に導入することにより作製することができる。抗原によってチャレンジされると、ヒト抗体産生が観察され、これは、ヒトにおいて見られるものと、すべての点（遺伝子再編成、鎖合成および抗体レパートリーなど）において非常に類似する。このアプローチは、たとえば、米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、および以下の科学雑誌：Marks et al., Bio/Technology 10,:779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature 368 812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13,65-93 (1995)に記載されている。
【００７８】
本発明の標的遺伝子を下方調節することができる別の薬剤は低分子干渉性ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ）分子である。
【００７９】
ＲＮＡ干渉は、２段階のプロセスであり、第１段階は、開始段階とよばれるもので、投入ｄｓＲＮＡが２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に消化され（おそらく、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮアーゼＩＩＩファミリーのメンバーであるＤｉｃｅｒの作用による）、これは、ｄｓＲＮＡ（直接、または導入遺伝子またはウイルスにより導入）をＡＴＰ依存的にプロセッシング（切断）する。逐次的な切断事象がＲＮＡを、各々、２ヌクレオチドの３’突出端を有する１９〜２１ｂｐ二重らせん（ｓｉＲＮＡ）に分解する[Hutvagner and Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232 (2002); and Bernstein Nature 409:363-366 (2001)]。
【００８０】
エフェクター段階では、ｓｉＲＮＡ二重らせんは、ヌクレアーゼ複合体に結合し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)を形成する。ｓｉＲＮＡ二重らせんのＡＴＰ依存的巻き戻しは、ＲＩＳＣの活性化に必要とされる。次いで、活性なＲＩＳＣは、相同な転写物を、塩基対相互作用により標的化し、ｍＲＮＡを、ｓｉＲＮＡの３’末端から１２ヌクレオチド断片に切断する[Hutvagner and Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232 (2002)；Hammond et al., (2001) Nat. Rev. Gen. 2:110-119 (2001)；ならびに Sharp Genes. Dev. 15:485-90 (2001)]。切断機構は、なお解明の余地があるが、研究により、各ＲＩＳＣは、単一のｓｉＲＮＡおよびＲＮアーゼを含むことが示された［Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232, (2002)]。
【００８１】
ＲＮＡｉの顕著な効力のため、ＲＮＡｉ経路における増幅工程が示唆されている。増幅は、より多くのｓｉＲＮＡを精製し得る投入ｄｓＲＮＡのコピーにより、または形成されるｓｉＲＮＡの複製により起こり得る。あるいはまた加えて、増幅は、ＲＩＳＣの多数回の代謝回転事象により行なわれ得る[Hammond et al., Nat. Rev. Gen. 2:110-119 (2001), Sharp Genes. Dev. 15:485-90 (2001)；Hutvagner and Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232 (2002)]。ＲＮＡｉに関するさらなる情報については、以下の概説Tuschl ChemBiochem. 2:239-245 (2001)；Cullen Nat. Immunol. 3:597-599 (2002); and Brantl Biochem. Biophys. Act. 1575:15-25 (2002)を参照のこと。
【００８２】
本発明での使用に好適なＲＮＡｉ分子の合成は、以下のようにして行なわれ得る。第１に、ｍＲＮＡ配列は、ＡＡジヌクレオチド配列をＡＵＧ開始コドンの下流でスキャンする。各ＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの発生を潜在的ｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位は、オープンリーディングフレームから選択され、これは、非翻訳領域（ＵＴＲ）は調節タンパク質接合性部位を多く含むためである。ＵＴＲ結合性タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合と相互作用し得る[Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]。しかしながら、５’ＵＴＲに指向されたｓｉＲＮＡが細胞性ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの約９０％減少を媒介し、タンパク質レベルを完全になくしたＧＡＰＤＨについて示されたように(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)、非翻訳領域に指向されるｓｉＲＮＡもまた有効であり得ることは認識されよう。
【００８３】
第２に、潜在的標的部位を、任意の配列アラインメントソフトウェア（たとえば、ＮＣＢＩサーバー(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェアなど）を用いて、適切なゲノムデータベース（たとえば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコード配列との有意な相同性を示す推定標的部位を選出する。
【００８４】
適格な標的配列をｓｉＲＮＡ合成用の鋳型として選択する。好ましい配列は低Ｇ／Ｃ含量を含むものである。それは、これらが、ジーンサイレンシングの媒介において、５５％より高いＧ／Ｃ含量を有するものと比べ、より有効であることが証明されているためである。いくつかの標的部位は、好ましくは、評価用標的遺伝子の長さにより選択される。
【００８５】
ＮＩＫのｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしてその合成を停止することができるＳｉＲＮＡ分子を、以下の実施例の項目の実施例２に記載する（配列番号：１５）。
【００８６】
選択したｓｉＲＮＡのより良好な評価のため、好ましくは、陰性対照が、合わせて使用される。陰性対照ｓｉＲＮＡは、好ましくは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムに対する有意な相同性を欠く。したがって、ｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列が好ましく使用されるが、任意の他の遺伝子に対して有意な相同性はまったく示さないものとする。
【００８７】
本発明の標的遺伝子を下方調節することができる別の薬剤は、本発明の標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することができるDNAzyme分子である。DNAzymeは、一本鎖と二本鎖のどちらの標的配列も切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドである (Breaker, R. R. and Joyce, G. Chemistry and Biology 1995；2:655；Santoro, S. W. & Joyce, G. F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997；943:4262)。DNAzymeの一般的なモデル(「10-23」モデル)が提案されている。「10-23」DNAzymeは、各々７〜９個のデオキシリボヌクレオチドからなる２つの基質認識ドメインと隣接する１５デオキシリボヌクレオチドの触媒性ドメインを有する。この型のDNAzymeは、その基質ＲＮＡをプリン−ピリミジン混合配列で効果的に切断することができる(Santoro, S. W. & Joyce, G. F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199；DNAzymeの概説については、Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)を参照のこと]。
【００８８】
一本鎖および二本鎖の標的切断部位を認識する、合成によって作製したDNAzymeの構築および増幅の例は、Joyceらに対する米国特許第6,326,174号に開示されている。ヒトウロキナーゼレセプターに対して指向された同様の設計のDNAzymeは、最近、ウロキナーゼレセプター発現を阻害し、結腸癌細胞転移をインビボで成功裡に抑制することが観察された(Itoh et al., 20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.org)。別の適用において、ｂｃｒ−ａｂ１癌遺伝子に相補的なDNAzymeは、癌遺伝子発現を白血病細胞において成功裡に抑制し、ＣＭＬおよびＡＬＬの場合において自己骨髄移植組織の再発率を低下させた。
【００８９】
本発明の標的遺伝子の下方調節はまた、標的遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを用いることにより行なわれ得る。
【００９０】
標的遺伝子を効率的に下方調節するために使用され得るアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプローチに重要な２つの側面を考慮して行なわれなければならない。第１の側面は、オリゴヌクレオチドを適切な細胞の細胞質内に送達することであり、第２の側面は、細胞内の指定のｍＲＮＡに、その翻訳を阻害する様式で特異的に結合するオリゴヌクレオチドを設計することである。
【００９１】
従来技術は、オリゴヌクレオチドを多種多様な細胞型に効率的に送達するために使用され得る多数の送達ストラテジーを教示している[たとえば、Luft, J Mol Med 76:75-6,1998；Kronenwett et al., Blood 91:852-62,1998；Rajur et al., Bioconjug Chem 8:935-40, 1997；Lavigne et al., Biochem Biophys Res Commun 237:566-71,1997; and Aoki et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 231:540-5, 1997を参照のこと]。
【００９２】
加えて、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造的改変のエネルギー特性の説明となる熱力学サイクルに基づいて、その標的ｍＲＮＡに対して最も高いと予測される結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムもまた使用可能である[たとえば、Walton et al., Biotechnol Bioeng 65:1-9,1999を参照のこと]。
【００９３】
かかるアルゴリズムは、アンチセンスアプローチを細胞において実施するために成功裡に使用されている。たとえば、Waltonらによって開発されたアルゴリズムは、科学者らが、ウサギβ-グロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦα)転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを成功裡に設計するのを可能にした。同じ研究グループは、つい最近、細胞培養物内において、３種のモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢならびにラットｇｐｌ３０）に対する、合理的に選択したオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性（速度論的(kinetic)ＰＣＲ技術により評価）は、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートのオリゴヌクレオチド化学成分を有する２つの細胞型における３種の異なる標的に対する試験を含むほとんどすべての場合において有効であることが証明されたことを報告した。
【００９４】
加えて、インビトロ系を用いた特異的オリゴヌクレオチドの設計および効率の予測のためのいくつかのアプローチが公表された(Matveeva et al., Nature Biotechnology 16,1374-1375 (1998)]。
【００９５】
いくつかの臨床試験により、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性および活性が実証された。たとえば、癌の治療に好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドが成功裡に使用されており (Holmund et al., Curr Opin Mol Ther 1:372-85,1999)、一方で、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３およびＢｃｌ−２による血液悪性腫瘍の治療は、臨床試験に入り、患者に耐容性であることが示された[Gerwitz Curr Opin Mol Ther 1:297-306 (1999)]。
【００９６】
つい最近、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介型抑制は、マウスモデルにおいてヒト癌細胞の胸膜播種を阻害することが報告された[Uno et al., Cancer Res 61:7855-60 (2001)]。
【００９７】
したがって、現在一致している認識は、上記のようなアンチセンス技術分野における最近の発展が非常に正確なアンチセンス設計アルゴリズムおよび多種多様なオリゴヌクレオチド送達系の作製をもたらし、当業者が過度試行錯誤実験に頼ることなく、既知配列の発現の下方調節に適したアンチセンスアプローチを設計および実施することが可能になったということである。
【００９８】
本発明の標的遺伝子を下方調節することができる別の薬剤は、標的遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。リボザイムは、ますます、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的抑制に使用されるようになっている[Welch et al., Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]。任意の特定の標的ＲＮＡを切断するためのリボザイムの設計が可能なことにより、これらは基礎研究と治療適用の両方において、有益なツールとなっている。治療分野では、リボザイムは、感染性疾患におけるウイルス性ＲＮＡ、癌における優性癌遺伝子および遺伝性障害における特定の体細胞変異を標的化するために利用されている[Welch et al., Clin Diagn Virol. 10:163-71 (1998)]。最も注目すべきことは、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子療法プロトコルが、すでにフェーズ１臨床試験に入っていることである。つい最近では、リボザイムはトランスジェニック動物試験、遺伝子標的確認および経路解明に使用されている。いくつかのリボザイムが臨床試験の種々の段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験で試験された最初の化学合成リボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管新生経路の重要な成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮成長因子レセプター）の形成を特異的に抑制する。Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.ならびに他の企業により、動物モデルにおいて抗血管新生治療の重要性が実証された。ＨＥＰＴＡＺＹＭＥは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するよう設計されたリボザイムであり、細胞培養アッセイにおいて、Ｃ型肝炎ウイルス性ＲＮＡを減少させるのに有効であることがわかった(Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated-WEBホームページ)。
【００９９】
細胞内で標的遺伝子の発現を調節するさらなる方法は、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）によるものである。最近の研究により、二本鎖らせんＤＮＡ内のポリプリン／ポリピリミジン領域を配列特異的に認識し、これに結合し得るＴＦＯが設計され得ることが示された。このような認識規則は、Maher III, L. J. et al., Science, 1989;245:725-730；Moser H. E. et al., Science, 1987;238:645-630；Beal, P. A. et al., Science, 1992;251:1360-1363；Cooney, M. et al., Science, 1988;241:456-459; and Hogan, M. E. et al., ＥＰ公開公報第375408号に概略が示されている。たとえば、インターカレーターの導入および主鎖置換などのオリゴヌクレオチドの修飾、ならびに結合条件（ｐＨおよびカチオン濃度）の至適化は、ＴＦＯ活性に対する固有の障害（たとえば、電荷斥力および不安定性など）の克服に役立っており、最近、合成オリゴヌクレオチドが特定配列に標的化し得ることが示された（最近の概説として、Seidman and Glazer, J Clin Invest 2003;112:487-94を参照のこと）。
【０１００】
一般に、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、配列対応：
オリゴ ３’--Ａ Ｇ Ｇ Ｔ
二重鎖 ５’--Ａ Ｇ Ｃ Ｔ
二重鎖 ３’--Ｔ Ｃ Ｇ Ａ
を有する。
【０１０１】
しかしながら、Ａ−ＡＴおよびＧ−ＧＣトリプレットは、最大三重らせん安定性を有することが示された（Reither and Jeltsch, BMC Biochem, 2002, Septl2, Epub）。同じ著者により、Ａ−ＡＴおよびＧ−ＧＣ規則にしたがって設計されたＴＦＯは、非特異的三重鎖を形成しないことが示され、これは、この三重鎖形成が確かに配列特異的であることを示す。
【０１０２】
したがって、標的遺伝子調節領域内の任意の所与の配列に対し、三重鎖形成性配列を創出するのがよい。三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１５、より好ましくは２５、さらにより好ましくは３０またはそれ以上のヌクレオチド長（５０または１００ｂｐまで）である。
【０１０３】
ＴＦＯでの細胞のトランスフェクション（たとえば、カチオン系リポソームにより）、および標的ＤＮＡとの三重らせん構造の形成により、立体構造的および機能的変化が誘導され、転写開始および伸長が阻止され、所望の配列変化を内在性ＤＮＡ内に導入することが可能になり、遺伝子発現の特異的下方調節がもたらされる。ＴＦＯで処理した細胞内でのかかる遺伝子発現の抑制の例としては、哺乳動物細胞内でのエピソームｓｕｐＦＧ１遺伝子および内在性ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウト（Vasquez et al., Nucl Acids Res. 1999;27:1176-81, and Puri, et al., Biol Chem, 2001;276:28991-98）、ならびにＥｔｓ２転写因子（前立腺癌病因に重要）（Carbone et al., Nucl Acid Res. 2003;31:833-43）およびプロ炎症性ＩＣＡＭ−１遺伝子（Besch et al., J Biol Chem, 2002;277:32473-79）の発現の配列特異的および標的特異的下方調節が挙げられる。加えて、Vuyisich and Bealは、最近、配列特異的ＴＦＯが、ｄｓＲＮＡに結合し、ｄｓＲＮＡ依存性酵素（たとえば、ＲＮＡ依存性キナーゼなど）の活性を阻害し得ることを示した（Vuyisich and Beal, Nuc. Acids Res 2000;28:2369-74）。
【０１０４】
加えて、前記原理にしたがって設計されたＴＦＯは、ＤＮＡ修復を行なうことができる特異的変異誘発を誘導し得、したがって、内在性遺伝子の発現の下方調節と上方調節の両方をもたらす(Seidman and Glazer, J Clin Invest 2003;112:487-94）。有効なＴＦＯの設計、合成および投与の詳細な記載は、Froehlerらに対する米国特許出願第2003 017068号および2003 0096980号、ならびにEmanueleらに対する同第2002 0128218号および同第2002 0123476号、ならびにLawnに対する米国特許第5,721,138号に見られ得る。
【０１０５】
たとえば前述のものなどのポリヌクレオチドおよびポリペプチドもまた、標的遺伝子産物の活性を下方調節するために使用され得ることは認識されよう。
【０１０６】
したがって、たとえば、マウス自然突然変異であるリンパ組織形成不全症（ａｌｙ）を含むＮＩＫポリペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオチドを用いてＮＩＫ依存性ＮＦ−κＢシグナル伝達を下方調節することができる。この変異は、常染色体劣性であり、該変異を有するマウスにおいて、免疫欠損に伴うリンパ節およびパイアー斑の全身性欠乏、脾臓構造および胸腺構造の破壊をもたらすことが示された［Shinkura (1999) Nature Genet. 22: 74-77］。
【０１０７】
ポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチドの下方調節は、優性ネガティブ機能（野生型標的遺伝子産物の活性に対して本質的に優性な効果）を特徴とし得ることは認識されよう。たとえば、キナーゼ欠損ＮＩＫのタンパク質産物は、エフェクタータンパク質（たとえば、ＳＩＶＡ）に結合し得、したがって、不活性な複合体が形成され、ＮＩＫ依存性ＮＦ−κＢシグナル伝達が阻害される。ＮＩＫの優性ネガティブ変異体は、当該技術分野でよく知られており、たとえば、Hay (2003) Biochem. Biophys. Acta. 1642(1-2):33-44; and Chandrasekar (2003) Biochem. J. 373:547-58を参照されたい。ＮＦ−κＢ活性化をブロックするＩＫＫａの優性ネガティブ分子は、Shikama (2003) Eur. J. Immunol. 33:1998-2006に記載されている。ＴＲＡＦ−２の優性ネガティブ分子は、Costabnzo (2003) J. Cell Physiol. 195:402-10に記載されている。
【０１０８】
あるいはまた、本発明の標的遺伝子を下方調節することができる薬剤は、本発明の標的遺伝子産物をコードする内在性ＤＮＡまたはｍＲＮＡの転写および／または翻訳のプロセスまたはレベルを低下させることができる任意の化合物であり得る。たとえば、De Jonge 1991に記載のように、ＣＤ２７ ｍＲＮＡレベルに対してＰＭＡ治療を使用し得る（後述）。
【０１０９】
本発明において使用され得るさらなる薬剤（すなわち、推定免疫モジュレーター）は、ＮＩＫ依存ＮＦ−κＢシグナル伝達を増加または減少させることができるその能力を調べることによって同定され得ることは認識されよう。したがって、たとえば、薬剤は、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ複合体形成またはＮＩＫ依存性ＣＤ２７調節を増加または減少させるその能力について、当該技術分野でよく知られた、以下の実施例の項目の実施例１〜３に記載の細胞学的、遺伝学的および／または生化学的方法を用いて試験し得る。
【０１１０】
ＮＩＫの活性をモジュレートするために使用され得る分子／薬剤は、細胞を、該細胞内でＮＩＫ依存性標準および代替経路を誘導することができるＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのリガンドと接触させること、前記接触前、接触後、または接触中に細胞を個々の被験分子とともにインキュベートすること、細胞内の標準経路の活性化を検出すること、および前記リガンドによって誘導される標準経路の誘導をモジュレートすることができる単一の分子／分子群を選択することによってスクリーニング（同定および／または選択）され得る。
【０１１１】
好ましい実施形態では、ＣＤ７０、ＣＤ４０ＬまたはＢｌｙｓ／ＢＡＦＦリガンドが分子のスクリーニングに使用される。あるいはまた、以下にＣＤ７０について例示するように、ＮＩＫ依存性標準および代替経路を誘導することができる新たなリガンドを同定してもよい。
【０１１２】
分子のスクリーニングのための標準経路活性化の検出は、ＩκＢ分解、ＩκＢαリン酸化およびｐ６５移行標準経路を示すパラメータをモニターすることにより行なわれ得る。
【０１１３】
本発明の好ましい実施形態では、リンパ芽球細胞型、たとえば、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＢＪＡＢ細胞が、本発明の分子のスクリーニングに使用される。
【０１１４】
加えて、ＮＩＫの活性をモジュレートするために使用され得る分子／薬剤は、リンパ芽球細胞を、該細胞内でＮＩＫおよび標準経路を活性化することができるＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのリガンドと接触させること、前記接触前、接触後、またはそのあいだに細胞を個々の被験分子とともにインキュベートすること、標準経路の活性化を検出すること、およびＮＩＫ非依存的に前記リガンドによって誘導されるが、標準経路を誘導することができる他のどのリガンドによっても誘導されない標準経路の誘導をモジュレートすることができる単一の分子／分子群（たとえば、ＴＮＦなど）を選択することによってスクリーニングされ得る。
【０１１５】
本発明の薬剤は被験体に、それ自体を投与してもよく、または薬学的に許容され得る担体と混合された医薬組成物の一部として配合してもよい。
【０１１６】
本明細書において使用する場合、「医薬組成物」は、本明細書に記載の１種類以上の活性成分または薬剤と他の化学成分（たとえば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物をいう。医薬組成物の目的は、化合物の生物体への投与を容易にすることである。
【０１１７】
本明細書において、用語「活性成分」は、生物学的効果を担う調製物をいう。
【０１１８】
以下、本明細書において、語句「生理学的に許容され得る担体」および「薬学的に許容され得る担体」は、互換的に使用され得、生物体に対して有意な刺激を引き起こさず、かつ投与された化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤をいう。アジュバントは、これらの語句に含まれる。薬学的に許容され得る担体に包含される成分の一例は、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、有機系および水性媒体の両方において広範囲の溶解度を有する生体適合性ポリマー（Mutter et al. (1979))であり得る。
【０１１９】
本明細書において、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質をいう。賦形剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類および数種のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１２０】
薬物の製剤化および投与のための手法は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版（引用により本明細書に組み込まれる）に見られ得る。
【０１２１】
投与の好適な経路としては、たとえば、経口、経直腸、経粘膜、特に経皮、腸または非経口送達（筋肉内、皮下および髄内注射など）ならびに鞘内、直接脳質内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼球内注射が挙げられ得る。あるいはまた、調製物を、全身的ではなく局所に、たとえば、調製物を直接患者の身体の特定領域内に注射することにより投与してもよい。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において周知の方法によって、たとえば、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、微粒化、乳化、カプセル封入、内包または凍結乾燥方法によって製造され得る。
【０１２３】
本発明に従う使用のための医薬組成物は、慣用的な様式で、活性成分の薬学的に使用可能な調製物への加工処理を容易にする１種類以上の生理学的に許容され得る担体（賦形剤および補助剤を含む）を用いて製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１２４】
注射用としては、医薬組成物の活性成分は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液（たとえば、ハンクス溶液、リンゲル液または生理食塩緩衝液）中に製剤化され得る。経粘膜投与用としては、障壁を透過するのに適当な浸透剤を製剤中に使用する。かかる浸透剤は、一般的に、当該技術分野において公知である。
【０１２５】
経口投与用としては、医薬組成物は、活性化合物を当該技術分野において周知の薬学的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。かかる担体は、医薬組成物を、患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ、スラリー剤、懸濁剤などに製剤化するのを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、固体賦形剤を用い、任意に、得られた混合物を磨砕し、所望により適当な補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工処理して錠剤または糖衣錠コアを得ることにより作製され得る。好適な賦形剤は、特に、充填剤（たとえば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖類など) ;セルロース調製物（たとえば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、イモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど）;および／または生理学的に許容され得るポリマー（たとえば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など）である。所望により、たとえば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（たとえば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を添加してもよい。
【０１２６】
糖衣錠コアには適当なコーティングが施される。この目的のため、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールジェル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る濃縮糖溶液が使用され得る。異なる組み合わせの活性化合物投薬量を識別または特徴付けるため、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【０１２７】
経口で使用することができる医薬組成物としては、ゼラチン製の押し込み型カプセルならびにゼラチンおよび可塑剤（たとえば、グリセロールまたはソルビトールなど）で作製された軟質密封カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、活性成分を、充填剤（たとえば、ラクトース）、結合剤(たとえば、デンプンなど)、滑剤（たとえば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および任意に安定化剤などと混合した状態でを含み得る。軟質カプセルでは、活性成分を、適当な液体（たとえば、脂肪油、液状パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールなど）中に溶解または懸濁させ得る。また、安定化剤を添加してもよい。経口投与のためのすべての製剤は、選択した投与経路に適した用量であるべきである。
【０１２８】
口内投与用としては、組成物は、慣用的な様式で製剤化される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０１２９】
鼻腔吸入による投与用としては、本発明による使用のための活性成分は、加圧パックからのエアロゾル噴霧提示または好適なプロペラント（たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用を伴うネブライザーの形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、定量を到達するためのバルブを設けることにより決定され得る。ディスペンサーにおける使用のために、化合物の粉末ミックスおよび適当な粉末基剤（たとえば、ラクトースまたはデンプンなど）を含む、たとえばゼラチン製のカプセルおよびカートリッジが製剤化され得る。
【０１３０】
本明細書に記載の医薬組成物は、たとえば、ボーラス注射または連続輸液により、非経口投与用に製剤化され得る。注射用の製剤は、単位投薬形態で、たとえば、任意に保存料を添加したアンプルまたは反復投与容器にて提示され得る。該組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤またはエマルジョンであり得、製剤用剤（たとえば、懸濁剤、安定剤および／または分散剤など）を含み得る。
【０１３１】
非経口投与用の医薬組成物としては、水溶性形態の活性調製物の水溶液が挙げられる。加えて、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水性注射懸濁剤として調製され得る。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル（たとえば、オレイン酸エチル、トリグリセリドもしくはリポソームなど）が挙げられる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁剤の粘度を増加させる物質、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含み得る。任意に、懸濁剤はまた、好適な可塑剤、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために活性成分の溶解度を増加させる薬剤を含み得る。
【０１３２】
あるいはまた、活性成分は、使用前に好適なビヒクル（たとえば、発熱物質無含有の滅菌水系溶液）で構築するための粉末形態であり得る。
【０１３３】
本発明の医薬組成物はまた、たとえば、慣用的な座剤用基剤（たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドなど）を用い、経直腸組成物（たとえば、座剤または停留浣腸など）に製剤化され得る。
【０１３４】
本発明の状況における使用に適した医薬組成物としては、活性成分が意図した目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が挙げられる。より詳細には、治療有効量は、疾患の症状を予防、緩和もしくは改善することができるか、または治療対象の個体の生存を延長することができる活性成分の量を意味する。
【０１３５】
治療有効量の決定は、充分、当業者の能力の範囲内である。
【０１３６】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療有効量または治療投薬量は、まず、インビトロアッセイから概算され得る。たとえば、ある投薬量が動物モデルにおいて策定され得、かかる情報を用い、ヒトにおいて有用な投薬量をより正確に決定することができる。
【０１３７】
本明細書に記載の活性成分の毒性または治療的効能は、インビトロでの標準的な製薬手順により、細胞培養物または実験動物において決定され得る。これらのインビトロ細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を策定するために使用することができる。該用量は、使用した投薬形態および用いた投与経路に応じて異なり得る。正確な製剤、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（たとえば、“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 第１章 p.1のFingl et al., 1975を参照のこと）。
【０１３８】
治療対象の状態の重篤度および応答性に応じて、投薬は、１回、または数日間から数週間持続する治療過程をともなって、または治癒するまで、もしくは疾患状態の減退が達成されるまでの複数回の投与であり得る。
【０１３９】
投与される組成物の量は、もちろん、治療対象の個体、苦痛の重篤度、投与様式、処方する医師の判断などによる。
【０１４０】
適合性のある医薬用担体内に製剤化された本発明の調製物を含有する組成物はまた、適切な容器内で調製および配置され、適応症状の治療のためにラベル表示される。
【０１４１】
本発明の組成物は、所望により、活性成分を含有する単位投薬形態を１つ以上含み得る、たとえば、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスにて提示され得る。パックはたとえば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックのホイルを含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための使用説明書が添付されてもよい。パックまたはディスペンサーにはまた、政府機関による医薬品の製造、使用または販売規制により指示された形態の容器に関連する通知が添付されてもよく、該通知は、組成物の形態またはヒト用もしくは獣医用投与の該機関による承認を反映する。かかる通知は、たとえば、処方薬について米国食品医薬品局により承認されたラベル表示、または承認製品挿入物であり得る。
【０１４２】
明確にするため別々の実施態様において記載した本発明のある特定の諸特徴は、単一の実施態様において組合せで提供され得ることは認識されよう。また、逆に、簡潔にするため単一の実施態様において記載した本発明の種々の特徴は、単独または任意の適当な下位の組み合わせで使用され得る。
【０１４３】
本発明のさらなる目的、利点および新規特徴は、限定を意図しないが、以下の実施例の試験を行なうと、当業者に自明となろう。加えて、上記に示し、かつ以下の特許請求の範囲に請求した本発明の種々の実施形態および側面の各々について、以下の実施例において実験的裏づけが見出されよう。
【実施例】
【０１４４】
次に、上記の記載とともに非限定的に本発明を説明する以下の実施例について言及する。
【０１４５】
一般的に、本明細書において使用される命名法および本発明において用いられる実験手順は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。かかる技術は、文献に充分に説明されている。例えば、“Molecular Cloning：A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989) ;“Current Protocols in Molecular Biology”第I〜III巻 Ausubel, R. M.編 (1994) ; Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) ; Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988) ;Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York； Birren et al.(編）“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series”, 1〜4巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998）;米国特許第4,666,828号；同第4,683,202号；同第4,801,531号；同第5,192,659号および同第5,272,057号に記載の方法論；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”, I〜III巻 Cellis, J. E.編 (1994) ;“Current Protocols in Immunology” I〜III巻 Coligan J. E.編 (1994) ; Stites et al.(編）, “Basic and Clinical Immunology”（第8版）, Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ; Mishell and Shiigi (編）, “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980）を参照のこと；利用可能な免疫アッセイは特許および科学文献にさらに記載されている。例えば、米国特許第3,791,932号；同第3,839,153号；同第3,850,752号；同第3,850,578号；同第3,853,987号；同第3,867,517号；同第3,879,262号；同第3,901,654号；同第3,935,074号；同第3,984,533号；同第3,996,345号；同第4,034,074号；同第4,098,876号；同第4,879,219号；同第5,011,771号および同第5,281,521号；“Oligonucleotide Synthesis”Gait, M. J.編（1984) ;“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J.編 (1985) ;“Transcription and Translation” Hames, B. D.および Higgins S. J.編 (1984) ;“Animal Cell Culture” Freshney, R. I.編 (1986) ;“Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986) ;“A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984） および“Methods in Enzymology” 1-317巻, Academic Press；“PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990) ; Marshak et al.,“Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual”CSHL Press (1996）を参照のこと；これらのすべては、引用により、本明細書に完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本明細書中に提供されている。本発明における手順は、当該技術分野において周知であると考え、読み手の便益のために提供する。本明細書に含まれるすべての情報は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
実施例１
ＮＩＫ−ＳＩＶＡ結合
ＮＩＫのＳＩＶＡへの結合およびその同時発現の効果を、結合、同時発現および免疫沈降アッセイを用いて試験した。
【０１４７】
抗体：
抗ＨＩＳ抗体は、シグマから購入した。抗ｍｙｃモノクローナル抗体（クローン−９Ｅ１０）は、ｍｙｃ−ペプチドアフィニティカラムにてマウス腹水から精製した。
【０１４８】
細胞：
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル最少必須培地中で培養した。
【０１４９】
発現ベクター：
Ｎ末端をｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号：５）に融合させたＮＩＫ発現用ベクター（配列番号：１）を、Michael Kracht博士（ドイツ）から頂いた。ヒトＳＩＶＡ１（配列番号：６）およびＳＩＶＡ２（配列番号：７）のｃＤＮＡを、ＥＳＴからＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ3.1-ＨＩＳベクター（インビトロジェン）うちにクローン化した。ｐＥＧＦＰプラスミドはクロンテックから購入した。マウスａｌｙ変異（Ｇ８６０Ｒ）（Shinkura et al., 1999; ＮＭ＿０１６８９６）に相当する変異を有するヒトＮＩＫを、部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン）により、（センス）５'ＣＣＡＡＧＣＴＡＴＴＴＣＡＡＴＣＧＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＣ（配列番号：８）および（アンチセンス）５'ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＴＴＣＡＣＡＣＧＡＴＴＧＡＡＡＴＡＧＣＴＴＧＧ（配列番号：９）を用いて作製した。
【０１５０】
酵母ツーハイブリッドスクリーニング：
ｐｃＮＩＫベクター由来のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化ＮＩＫ挿入断片を、Gal4 DNA結合性ドメインベクターｐＧＢＫＴ７（クロンテック）のＢａｍＨＩ/ＳａｌＩ認識部位内にサブクローン化した。形質転換済みヒト骨髄ライブラリー（HL4053AH,クロンテック）を、製造業者の使用説明書（酵母プロトコルハンドブック, クロンテック− www.clontech.com）に従い、ベイトとしてｐＧＢＫＴ−ＮＩＫを用いたツーハイブリッドスクリーニングに供した。陽性クローンを、四連選択およびβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイにより同定した。ＳＩＶＡクローンのＮＩＫおよびＮＩＫ６２４〜９４７への結合を再確認し、ＮＩＫのＴＲＡＦ２への結合は、酵母ＳＦＹ526レポーター系統（クロンテック）ならびにｐＧＢＫＴ7およびｐＧＡＤＴ７ベクターを用いたβ-ガラクトシダーゼ発現アッセイにより評価した。
【０１５１】
トランスフェクション、免疫ブロテッィングおよび免疫沈降：
トランスフェクトされたタンパク質の免疫共沈降のため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９０ｍｍ径プレート上に播種し（１．５×１０⁶細胞／プレート）、１日後に、リン酸カルシウム沈降法（Sambrook et al., 1989）を用い、全量１０μｇのＤＮＡを用いて、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地１０ｍｌ中でトランスフェクトした。コトランスフェクションでは、被験タンパク質をコードするプラスミドの１：１混合物を使用した。トランスフェクション の２４時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回リンスし、１ｍｌの溶解バッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）、２５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＰＭＳＦ）（これは、１×完全プロテアーゼ抑制因子カクテル（ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ）を含む）中で溶解した。予備精製したライセートを２時間４℃でプロテインＧ-セファロースビーズ（アマシャム バイオサイエンス）にあらかじめ吸着させた抗ｍｙｃまたは抗ＨＩＳ抗体２μｇとともにインキュベートした。次いで、ビーズを溶解バッファーでリンスし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、表示した抗体でプローブ標識した。抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体により、高感度化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロテッィング検出システム（アマシャム）を製造業者の使用説明書にしたがって用いて可視化した。
【０１５２】
レポーター遺伝子試験：
ＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化を、レポーター遺伝子アッセイにより測定した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１．５×１０⁵／ウェル）を、６ウェルプレート上に播種し、１日後に、リン酸カルシウム沈降法（Sambrook et al., 1989）によりトランスフェクトした。コトランスフェクションでは、被験タンパク質をコードするプラスミドの１：１混合物を使用した。全ＤＮＡ濃度を２μg／ウェルに維持するため、ｐｃＤＮＡ3（インビトロジェン）「空」ベクターを添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を回収し、溶解し、レポーター遺伝子活性をルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を用いて測定した。
【０１５３】
ＮＩＫはＳＩＶＡ（ＣＤ２７と会合しているアダプタータンパク質）に結合する：
ＮＩＫをベイトとして用いたヒト骨髄ツーハイブリッドライブラリーのスクリーニングにより、ＮＩＫは、ＳＩＶＡと称するタンパク質（これは、主にＴおよびＢリンパ球で発現されるＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターであるＣＤ２７と会合していることが以前に示された（Prasad et al., 1997））のＣ末端部分に特異的に結合することがわかった。ＴＲＡＦのＮＩＫへの結合のように（Malinin et al., 1997）、本発明の研究では、ＳＩＶＡのＣ末端部分はＮＩＫのＣ末端部分に結合すること、およびこの結合はタンパク質全体でなくそれぞれの部分を結合アッセイに用いた場合、より強くなることが示された（図１ａ）。これは、おそらく、ＮＩＫのＮ末端部分が自身のＣ末端に結合し、したがって、この部分が他のタンパク質と結合することを阻止する傾向性によるものである（Xiao and Sun, 2000）。
【０１５４】
ＮＩＫとＳＩＶＡ１またはＳＩＶＡ２（２つの既知ＳＩＶＡスプライスバリアント）（Yoon et al., 1999）との、一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞内での同時発現により、ＮＩＫは哺乳動物細胞においてＳＩＶＡに結合し得ることが明らかになった。図１ｂ〜ｃに示すように、ＮＩＫは、トランスフェクト細胞のライセート由来の両スプライスバリアントとともに二方向に免疫共沈降させた。トランスフェクト細胞内のＳＩＶＡ１またはＳＩＶＡ２の量は、ＮＩＫと同時発現させた場合に増大し、これは会合したＮＩＫ分子によるＳＩＶＡの安定化を明白に反映する。ＮＩＫの発現はまた、２つのＳＩＶＡスプライスバリアントのいずれの同時発現によっても増強された（図１ｂ、１ｃ）。このような増強は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはＩＫＫ１を用いたＮＩＫの同時発現では観察されなかった（図１ｄ）。ＳＩＶＡ２の発現は、ａｌｙマウスに見られるもの（Ｇ８６０Ｒ）に相当する不活性なミスセンス変異を含む同時発現ＮＩＫの量を増大させなかったものの、このＮＩＫ変異体は、ＳＩＶＡ１と免疫共沈降し、ある程度ＳＩＶＡ２とも免疫共沈降した（図１ｂ〜ｃ）。
【０１５５】
ＳＩＶＡはまた、ＮＩＫ機能に影響を与え得るようであった。単独で発現させると、ＳＩＶＡ１またはＳＩＶＡ２は、ほんのわずかのＮＦ−κＢ活性化を引き起こした。しかしながら、両方のスプライスバリアントでは、同時発現ＮＩＫ ａｌｙ変異体によるＮＦ−κＢの活性化に影響を与えずに、同時発現ＮＩＫによるＮＦ−κＢの活性化が有意に増強された（図１ｅ）。
【０１５６】
実施例２
ＣＤ２７はリンパ球においてＩκＢとＮＦ−κＢ２／ｐ１００の両方のプロセシングを誘導し、一方で、Ｒａｍｏｓリンパ芽球細胞内でのＮＩＫ合成の停止は、ＣＤ２７誘導ＮＦ−κＢ活性化を阻止する
ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）が、リンパ球においてＩκＢとＮＦ−κＢ２／ｐ１００の両方のプロセッシングを誘導する能力を、ｐ１００、ｐ５２、ＲｅｌＢ、ＩκＢαおよびｐ６５に指向される抗体を用いたウエスタンブロット解析により測定した。誘導されるプロセッシングに対してこれらの細胞内のＮＩＫの存在が与える効果を、ＮＩＫ抑制細胞における同分子のウエスタンブロット解析により評価した。
【０１５７】
試薬：
ＣＤ７０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１３６３６）を、関連発現構築物でのヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞の大規模トランスフェクションにより産生させた（下記参照）。ＭＧ132は、カルビオケムから購入した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅは、アマシャム バイオサイエンスから購入した。Ｇ４１８は、ライフ テクノロジーから購入した。フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）はシグマから購入した。すべての試験において、トランスフェクト細胞の条件培地を１：４の希釈率で用いた。
【０１５８】
抗体：
抗ｐ５２抗体は、アップステート バイオテクノロジーから購入し、ｐ６５、ＲｅｌＢ、ＣＤ２７およびラミン Ａ/Ｃに対する抗体は、サンタ クルス バイオテクノロジーから、抗ＩκＢαはトランスダクション ラボラトリーから購入し、抗ｍｙｃモノクローナル抗体は、実施例１に記載のようにして精製した。抗ＮＩＫモノクローナル抗体ＮＩＫ−８１は、Ｎ末端に結合するためのシステインを含むＮＩＫキナーゼドメイン（ＲＬＧＲＧＳＦＧＥＶＨＲＭＥＤＫ、配列番号：10）内の配列に相当するＫＬＨ結合ペプチドでマウスを免疫化することによって生成させた。抗ＮＩＫモノクローナル抗体を、アフィゲル（バイオラッド）にて、ＢＳＡ結合ペプチドを結合させたアフィニティカラムで精製した。
【０１５９】
細胞：
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、軟膜試料から、４５０×ｇでのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離により単離した。細胞を、前処理なしでＣＤ７０での刺激に供するか、または、１μｇ／ｍｌのＰＨＡにより４８時間活性化した後、ＰＨＡなしで１２時間放置した。ＰＢＭＣ、ならびにバーキットリンパ腫起源のヒトＢリンパ芽球株の細胞、Ｒａｍｏｓ細胞（Benjamin et al., 1982）、Ｒａｊｉ細胞（Pulvertaft, 1964）を、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ培地中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、実施例の項目の実施例１に記載のようにして培養した。
【０１６０】
発現ベクター:
ｍＣＤ７０の細胞外ドメインのｃＤＮＡを、ＥＳＴからＰＣＲ増幅し、修飾ロイシンジッパーおよびＦＬＡＧタグ（Fanslow et al., 1994）と融合させた状態でｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）うちにクローン化した。完全長ＮＩＫに相当するｃＤＮＡを、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合性ドメインベクターｐＧＢＫＴ７（クロンテック）うちにクローン化した。配列をＮＩＫ ｓｉＲＮＡに非相補的となるよう改変したＮＩＫを、（センス）５'ＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＡＣＣＴＡＣＡＴＴＣＣＣＧＣＡＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＧ（配列番号：１１）および（アンチセンス）５'ＣＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＴＧＴＡＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＣ（配列番号：１２）をプライマーとして用いて作製した。
【０１６１】
ｓｉＲＮＡおよびレンチウイルス形質導入：
ヘアピンｓｉＲＮＡを、ｐＳＵＰＥＲベクターを用い、既述（Brummelkamp et al., 2002）のようにして発現させた。簡単には、二本鎖オリゴヌクレオチドを、ヒトＮＩＫオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１５１３〜１５３１）内の９塩基対スペーサー領域（ｔｔｃａａｇａｇａ 配列番号：１５）により連結された領域に相当するフォワード配列およびリバース配列：センス鎖５' ｇａｔｃｃｃｃＴＡＣＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣＧＡＡＧＧＡｔｔｃａａｇａｇａＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＧＴＧＧＡＧＧＴＡｔｔｔｔｔｇｇａａａ（配列番号：１３) ;アンチセンス鎖５'ａｇｃｔｔｔｔｃｃａａａａａＴＡＣＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣＧＡＡＧＧＡｔｃｔｃｔｔｇａａＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＧＴＧＧＡＧＧＴＡｇｇｇ（配列番号：１４）を含むように設計した。２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ｐＳＵＰＥＲのＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Brummelkamp et al., 2002）部位内にクローン化し、Ｈ１ ＲＮＡプロモーター（Brummelkamp et al., 2002）の制御下で発現させた。コトランスフェクトＮＩＫに対して５倍過剰までのこのｐＳＵＰＥＲ−ＮＩＫで、上記のようにして一過性トランスフェクションを行なった。
【０１６２】
Ｒａｍｏｓ細胞内で構成的にｐＳＵＰＥＲ−ＮＩＫを発現させるため、レンチウイルス系ベクター（Lois et al., 2002）を使用した。Ｈ１プロモーター（Brummelkamp et al., 2002）およびＮＩＫ ＲＮＡｉを含むカセットを、ｐＳＵＰＥＲベクターから、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ともにニュー イングランド バイオラブ製）を用いて切り出し、接着末端を、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ニュー イングランド バイオラブ）を用いて平滑末端とし、この平滑末端断片を、ＧＦＰ発現ＦＵＧＷレンチウイルス系ベクター（Lois et al., 2002）の平滑末端化ＰａｃＩ部位内に挿入した。形質導入細胞を、ＧＦＰ発現についてＦＡＣＳにより分取した（FACS Vantage,ベクトン‐ディッキンソン）。分取した細胞は、ＧＦＰの発現およびＮＩＫの欠損を数ヶ月間示した。
【０１６３】
トランスフェクション、免疫ブロテッィングおよび免疫沈降：
トランスフェクション、免疫ブロテッィングおよび免疫沈降は、実施例の項目の実施例１に記載のようにして行なった。
【０１６４】
内在性ＮＩＫを検出するため、Ｒａｍｏｓ細胞（２〜４×１０⁸；１×１０⁸細胞／ｍｌ）を溶解し、プロテインＧ−セファロースビーズに結合させたアフィニティ精製マウス抗ＮＩＫ抗血清とともに免疫沈降させた。沈降したタンパク質を、ウエスタンブロッティングにより、ＮＩＫ−８１抗体およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ピアース）を用いて検出した。
【０１６５】
ＮＫ―κＢタンパク質の免疫沈降では、１０〜２０×１０⁶細胞由来の核抽出物を希釈し、以下の組成：０．５％ＮＰ−４０、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．９、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＥＧＴＡ、１ ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ ｍＭ ＰＭＳＦおよび１×完全プロテアーゼ抑制因子カクテルを得た。プロテインＡ−セファロースビーズ（アマシャム バイオサイエンス）にあらかじめ吸着させた抗ＲｅｌＢ抗体を、予備精製した核ライセートとともに２時間４℃でインキュベートした。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）を用いて解析し、ゲルを、上記のようにしてウエスタンブロテッィングに供した。
【０１６６】
リンパ系細胞株およびＰＢＭＣのリガンド活性化は、典型的には１×１０⁶細胞を図に示した時間（０、０．３および４時間または０、１および４時間；図２ａ〜ｂ）関連リガンドで刺激することにより行ない、核抽出物および細胞質抽出物は記載（Schreiber et al., 1989）のようにして調製し、ウエスタンブロテッィングにより解析した。
【０１６７】
Ｒａｊｉ細胞のリガンド活性化は、細胞を、図に示した時間（０、0.3および４時間または０、１および４時間；図２ａ〜ｂ）、ＣＤ７０で刺激することにより行なった。正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞のリガンド活性化は、細胞を図に示した時間（０、０．３、１、４および２０時間；図２ｄ〜ｅまたは０、０．１５、０．３、４および１６時間；図２ｈ）、ＣＤ７０で刺激することにより行なった。
【０１６８】
ＮＩＫのＮＩＫ^(MINUS)細胞への再導入を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖを製造業者の使用説明書にしたがって（アマクサ バイオシステムズ）用い、発現ベクターによるＮＩＫ^(MINUS)細胞のヌクレオトランスフェクションにより行なった。簡単には、２×１０⁶ ＮＩＫ^(MINUS)細胞を４μｇの変異ｍｙｃタグ化ＮＩＫプラスミドおよび１μｇのｐｃＤＮＡ３により、溶液Ｖ中で、プログラムＳ１８を用いてＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置にてヌクレオフェクトした。トランスフェクトされたタンパク質を安定的に発現する細胞をＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）にて選択した。
【０１６９】
プロテインキナーゼＣアッセイ：
対照およびＮＩＫ欠損Ｒａｍｏｓ細胞のＰＫＣ活性を、ＣＤ７０刺激の（０、１５および３０分間）後に、Ｓｉｇｎａｔｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ アッセイシステム（プロメガ）を用いて測定した。ＰＫＣの酵素活性は、リン脂質の非存在下でのアッセイ時に得られた値をその存在下で得られた値から差し引くことにより測定した。
【０１７０】
ＣＤ２７は、リンパ球においてＩκＢとＮＦ−κＢ２／ｐ１００の両方のプロセシングを誘導する：
ＮＩＫがＳＩＶＡに結合する能力は、ＮＩＫがＣＤ２７の細胞機能に、ある役割を果たし得ることを示唆した。したがって、代替ＮＦ−κＢ活性化経路（これには、ＮＩＫ機能が関与している）に対するＣＤ２７の効果を調べた。
【０１７１】
ヒト末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）をＣＤ２７リガンドであるＣＤ７０で処理すると、ＩκＢαの急速な低下が誘導され（図２ａ、２ｂ、上パネル）、これは、該レセプターが標準ＮＦ−κＢ経路の活性化を誘発し得ることを示す。この低下は、基底ＩκＢαレベルが高い活性化されたＰＢＭＣにおいてより容易に検出されたが（図２ｂ、上パネル）、注意深く調べると、ずっと低いレベルのＩκＢαを含む非刺激ＰＢＭＣにおいても認められた（図２ａ、上パネル）。休止ＰＢＭＣでは、ＣＤ７０もまた、ＲｅｌＢに加えてＮＦ−κＢ／ｐ５２（ｐ５２）の核への移行を誘導した。これは、ＣＤ２７が、これらの細胞においても代替ＮＦ−κＢ経路を刺激することを示す（図２ａ、下パネル）。ＰＨＡ活性化（これは、ＰＢＭＣにおいてＣＤ２７とＣＤ７０の両方の発現増大をもたらす（de Jong et al., 1991 and Hintzen et al., 1994））の後、ｐ５２とＲｅｌＢの両方の基底核レベルは非常に高く、適用したＣＤ７０のｐ５２生成に対する効果の評価が妨げられた（図２ｂ、下パネル）。
【０１７２】
また、本発明の研究では、ＣＤ７０が、ＲａｍｏｓおよびＲａｊｉリンパ芽球株において、ＩκＢα分解およびＲｅｌＢとＮＦ−κＢ２／ｐ５２の核移行を誘導することが示された（図２ｃおよび図２ｄ、２ｅの左パネル）。ＣＤ７０でのＲａｊｉ細胞の処理により、ＣＤ７０適用の２０分以内にＩκＢα分解が誘導されたが、後に、ＩκＢαレベルは増大した。ＩκＢα分解は、ｐ６５、ＲｅｌＢおよびＮＦ−κＢ２／ｐ５２の核移行と関連した（図２ｃ）。
【０１７３】
同様のＩκＢα分解パターンが、ＣＤ７０適用後にＲａｍｏｓ細胞において観察された（図２ｅ、左パネル）。ＩκＢα分解は、核ｐ６５レベルの長期増大と関連した（図２ｅ、左パネル）。他方において、ＲｅｌＢの核移行は、どちらかというとゆっくりと起こり、ＣＤ７０適用の約４時間後に最大移行に達した（図２ｄ、左パネル）。ｐ５２の核移行は、最初の２０分以内に開始し、２０時間維持された。Ｒａｍｏｓ細胞の核内へのｐ１００の蓄積は、ＲｅｌＢと会合したこのタンパク質の核への誘導された移行を反映することが示唆されるプロセス（Yilmaz et al., 2003）である、最初の１時間以内に現れた（図２ｄ、左パネル）。
【０１７４】
Ｒａｍｏｓリンパ芽球細胞におけるＮＩＫ合成の停止は、標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方のＣＤ２７誘導型活性化を阻止する：
ＣＤ２７による種々のＮＦ−κＢ形態の活性化におけるＮＩＫの役割を調べるため、Ｒａｍｏｓ細胞におけるＮＩＫ合成を、ＮＩＫ合成を阻止することができるヘアピン低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現するレンチウイルス系ベクターをこれらの細胞に感染させることによって停止させた。ウエスタン解析により、一過性発現様式および安定的発現様式の両方を確認し、ｓｉＲＮＡベクターは、有効にＮＩＫの合成を停止させた（図２ｆ、上および中央パネル）。既報のＮＦ−κＢ代替経路におけるＮＩＫの関与から予測されるように、ＣＤ７０でのＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の処理では、ｐ５２またはＲｅｌＢのその核への移行は誘導されなかった。これらの細胞においてＣＤ７０により誘導されたｐ１００の移行もまた、有意に遅滞された（図２ｄ、右パネル）。また、ＮＩＫ欠損により、ＣＤ７０は、ＩκＢα分解も核ｐ６５移行（ともに標準経路の表示）も誘導することができなかった（図２ｅ、右パネル）。
【０１７５】
対照試験により、ＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞がＣＤ２７を正常Ｒａｍｏｓ細胞のものに匹敵するレベルで発現し、したがって、ＣＤ２７誘発時に正常なプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化を示す（Erlichman and Howard, 1999）ことを確認した（図２ｇおよびその差込図）。これらの結果は、ＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞がＮＦ−κＢを活性化できないことは、異常なＣＤ２７機能によって引き起こされるのではないことを示した。この観察結果を確認するため、これらの細胞を、ｍｙｃタグ化ＮＩＫ ｃＤＮＡ（これには、ＮＩＫ ｓｉＲＮＡに非相補的となるように保存配列変化が導入されている）でトランスフェクトすることにより、ＮＩＫ発現をＮＩＫ^(MINUS)細胞に対して復活させた（図２ｆ、下パネル）。これらの細胞においてＩκＢαおよび核ｐ５２レベルは、通常よりもいくぶん高かったが（おそらく、超正常発現レベルの結果としての自発的ＮＩＫシグナル伝達により）、再構築されたＮＩＫ^(MINUS)細胞はＣＤ７０に応答する能力を回復し、核ｐ５２の増加およびＩκＢαの一過性の減少の両方を伴っており（図２ｈ）、代替および標準ＮＦ−κＢ経路の両方の活性化におけるＮＩＫの枢要な役割がさらに確認された。
【０１７６】
実施例３
標準および代替ＮＦ−κＢ経路に対するＮＩＫ抑制の効果
ＣＤ４０、ＢＬｙＳ、ＴＮＦ、タプシガルジンまたはＰＭＡが、標準および代替ＮＦ−κＢ経路を誘導する能力を、ｐ１００、ｐ５２、ＲｅｌＢ、ＩκＢαおよびｐ６５に指向される抗体を用いたウエスタンブロット解析により測定した。これらの細胞内にＮＩＫが存在する効果を、ＮＩＫ抑制細胞における同分子のウエスタンブロット解析により評価した。
【０１７７】
試薬：
ｈＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）およびｈＢＬｙＳ／ＢＡＦＦの産生は、関連発現構築物でのヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞の大規模トランスフェクションにより行った（下記参照）。すべての試験において、トランスフェクト細胞の条件培地は、実施例２に記載のとおりとした。G. Adolf博士（Boehringer Institute, Vienna,オーストリア）より頂いたＴＮＦを細胞に５０ ｎｇ／ｍｌの濃度で適用した。タプシガルジン、４β−ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）およびフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）は、シグマから購入した。
【０１７８】
抗体：
ｐ６５、ＲｅｌＢ、ｐ５２、ｐ１００、ＩκＢαに対する抗体の供給源は、実施例の項目の実施例２に記載している。抗ｃ−Ｒｅｌは、サンタ クルス バイオテクノロジーから購入した。抗βアクチンおよび抗ＦＬＡＧは、シグマから購入した。抗ホスホＩκＢαは、セル シグナリング テクノロジーから購入した。
【０１７９】
細胞：
Ｒａｍｏｓ（Benjamin et al., 1982）細胞は、実施例の項目の実施例２に記載のようにして培養した。
【０１８０】
発現ベクター：
ｈＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）（ＡＴＣＣクローン７９８１４）およびｈＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ（Ｒｅｓｇｅｎクローン６３１１１９）の細胞外ドメインのｃＤＮＡを、ＥＳＴからＰＣＲ増幅し、修飾ロイシンジッパーおよびＦＬＡＧタグ（Fanslow et al., 1994）と融合させた状態でｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）うちにクローン化した。ＮＩＫ抑制は、実施例の項目の実施例２に記載のようにして生成させた。
【０１８１】
トランスフェクション、免疫ブロテッィングおよび免疫沈降：
トランスフェクション、免疫ブロテッィングおよび免疫沈降は、実施例の項目の実施例１に記載のようにして行なった。リン酸化ＩκＢαを、プロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２（２５μＭ）で前処理（２時間）した後、検出した。
【０１８２】
正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞のリガンド活性化は、細胞を示した時間：０、０．２、０．５、１および１６時間（図３ａ）、０、０．２５、１および１６時間（図３ａ〜ｂ）ＣＤ４０Ｌで、０．３、４および２０時間の期間（図３ｃ〜ｄ）ＢＬｙＳで、０、０．３、４および２０時間の期間（図３ｅ）または０、０．３、４および２０時間の期間（図３ｆ）ＴＮＦで刺激することにより行なった。
【０１８３】
ＣＤ７０およびＴＮＦによる細胞刺激は、０、１５分間および４時間行なった（図３ｇ）。タプシガルジンおよびＰＭＡによる刺激は、０、３０分間および４時間行なった（図３ｈ）。
【０１８４】
リンパ球におけるＮＦ−κＢ活性化に対するＴＮＦファミリーの種々のリガンドの効果の試験により、２つのリガンドＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）（Berberich et al., 1994）（Coope et al., 2002）およびＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ（Claudio et al., 2002）（Kayagaki et al., 2002）（Hatada et al., 2003）による標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方の活性化が示された。他方において、ＴＮＦは、標準経路は有効に誘発することができるが、代替経路を誘発することはできないようである（Matsushima et al., 2001）（Yin et al., 2001）（Dejardin et al., 2002）（Yilmaz et al., 2003）。ＴＮＦは、ほんのわずかの核ｐ５２増加を誘導し、例えばＣＤ４０Ｌなどのリガンドにより誘導されるよりずっと少なく（Yilmaz et al., 2003）（Derudder et al., 2003）、これは、おそらく、ｐ１００の合成の刺激によるためである（de Wit et al., 1998）。ＴＮＦはまた、ＲｅｌＢの合成を誘導し（Bren et al., 2001）、明らかにＲｅｌＢはｐ１００：ＲｅｌＢ二量体の誘導された核移行により、一部が核内に蓄積される（Yilmaz et al., 2003）。
【０１８５】
本発明の研究におけるＲａｍｏｓ細胞のＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦおよびＴＮＦに対する応答は、既報と一致する。すべての３つのリガンドは標準経路の活性化を誘導し、これは、ｐ６５の急速な核移行に反映された（図３ｂ、３ｆ、左パネル）。この移行は、ＩκＢαの減少と関連し（図３ｂ、３ｆ、左パネル）、または、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ誘導の場合は、細胞レベルで可視的な変化を伴わないＩκＢαのリン酸化が検出された（図３ｄ、左パネル）。ＣＤ４０ＬおよびＢＬｙＳ／ＢＡＦＦはまた、ＲｅｌＢに加えて核ｐ５２の顕著な増加を誘導し、ともに、代替経路の活性化を反映する（図３ａ、３ｃ、左パネルs）。ＴＮＦは、ＲｅｌＢの核移行は誘導したが、核ｐ５２の増大eはほんのわずかであった（図３ｅ、左パネル）。Ｒａｍｏｓ細胞の核抽出物由来の種々のＮＦ−κＢタンパク質の免疫共沈降の評価により、ＣＤ７０は、主にＲｅｌＢ：ｐ５２の核蓄積を増加させるが、ＲｅｌＢ：ｐ５２の核蓄積もまた増加させ、一方、ＴＮＦは、ＲｅｌＢ：ｐ５２を増加させることなく、ＲｅｌＢ：ｐ１００の核レベルの増加を誘導することを確認した（図３ｇ）。
【０１８６】
ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＴＮＦ、タプシガルジンおよびＰＭＡによるＮＦ−κＢ経路の誘導を、ＮＩＫ発現が停止されたＲａｍｏｓ細胞において試験した。ＣＤ４０ＬおよびＢＬｙＳのＮＦ−κＢ活性化に対するすべての効果（ｐ１００、ｐ５２、ＲｅｌＢおよびｐ６５の核移行ならびに細胞質におけるＩκＢα分解）がＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞において停止した（図３ａ〜ｄ、右パネル）。対照的に、ＴＮＦによるＩκＢα分解の誘導、その結果生じるｐ６５の核移行、ならびにｐ１００およびＲｅｌＢの核移行の誘導は、ＮＩＫを発現する細胞と同様に有効にＮＩＫ^(MINUS)細胞において起こった（図３ｅ、３ｆ、右パネル）。また、ＮＩＫ枯渇は、タプシガルジン（筋小胞体ストレスの誘導によりＮＦ−κＢの活性化を誘発する筋小胞体Ｃａ²⁺アデノシン三リン酸の阻害剤（Pahl and Baeuerle, 1996））または４β−ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（ＰＫＣの刺激によりＮＦ−κＢを活性化する薬剤（Sen and Baltimore, 1986））に応答したＩκＢα分解に対して、影響はなかった（図３ｈ）。
【０１８７】
ＮＦ−κＢに対するＣＤ７０、ＣＤ４０およびＢＬｙＳ／ＢＡＦＦの効果に対する非応答性の低下に加え、ＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞はまた、その基底ＮＦ−κＢタンパク質レベルのある程度の構成的変化を示した。これらは、基底ｐ５２の顕著な減少、およびＲｅｌＢとｃ−Ｒｅｌの有意な減少、ならびにｐ１００およびＩκＢαのある程度の減少を示した（図３ｅ、３ｆおよび３ｉ）。上記のすべてのタンパク質の発現は、一部、ＮＦ−κＢ活性化に依存する（Hannink and Temin, 1990; Ten et al., 1992; Lombardi et al., 1995 ならびに Bren et al., 2001）。ｐ６５は、その発現がＮＦ−κＢに依存しておらず（Ueberla et al., 1993）、ＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞において通常の量で存在したが（図３ｉ）その基底核レベルは低下した（図２ｅ）。ＮＩＫ^(MINUS)細胞におけるＮＦ−κＢタンパク質レベルのこのような構成的変化は、ａｌｙマウスのリンパ球において観察されるものとよく似ている（Yamada et al., 2000）。これらは、おそらく、ＮＦ−κＢをサイレントな程度までＮＩＫ依存的に連続的に活性化するいくつかの自己分泌メディエーター（１種または複数）の効果の停止を反映する。
【０１８８】
実施例４
ＩκＢα分解に対するＮＩＫのリン酸化活性化-ループに対する抗体の効果
ＮＩＫのリン酸化活性化-ループ（αｐ−ＮＩＫ）に対する抗体を、Ｒａｍｏｓ細胞およびＢＪＡＢ細胞内に導入し、ＮＩＫ活性を即座に除去した。ＣＤ７０およびＣＤ４０ＬおよびＴＮＦによるＩκＢα分解の誘導に対するこれらの抗体の効果を測定した。
【０１８９】
試薬：
ＣＤ７０は、実施例の項目の実施例２に記載のようにして生成した。ＣＤ４０Ｌは、実施例の項目の実施例３に記載のようにして生成した。ＴＮＦは、実施例の項目の実施例３に記載のようにして得た。［γ³²Ｐ］ＡＴＰは、アマシャム バイオサイエンスから購入した。
【０１９０】
抗体：
ＩκＢα抗体は、実施例の項目の実施例２に記載している。抗ｍｙｃモノクローナル抗体は、実施例の項目の実施例１に記載のようにして精製した。リン酸化ＮＩＫ活性化ループ（α−ｐＮＩＫ）に対するモノクローナル抗体は、Ｔｈｒ５５９がリン酸化されたＮＩＫ活性化ループに相当するＫＬＨ結合ペプチドでマウスを免疫化することによって生成した。抗ＮＩＫモノクローナル抗体ＮＩＫ−８１は、実施例の項目の実施例２に記載のようにして生成した。両方の抗ＮＩＫモノクローナル抗体を、その対応するペプチドが結合されたアフィニティカラムにて精製した。
【０１９１】
細胞：
Ｒａｍｏｓ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、実施例の項目の実施例１に記載している。ＢＪＡＢ細胞（Clements et al., 1975）は、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ培地中で培養した。
【０１９２】
発現ベクター：
ＣＤ７０の細胞外ドメインのｃＤＮＡを、実施例の項目の実施例２に記載のようにしてクローン化した。ｈＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）およびｈＢＬｙＳ／ＢＡＦＦは、実施例の項目の実施例３に記載のようにしてクローン化した。
【０１９３】
トランスフェクション、免疫ブロテッィングおよび免疫沈降：
トランスフェクション、免疫ブロテッィングおよび免疫沈降は、実施例の項目の実施例１および実施例２に記載のようにして行なった。
【０１９４】
抗体トランスフェクション：
Pro−ject Protein Transfection Reagent Kit（ピアース）を製造業者の使用説明書にしたがって用い、血清無含有培地中で、抗体を細胞内にトランスフェクトした。抗体トランスフェクション後、リガンドを、通常（血清含有）培地（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０）中に３〜４時間適用した。
【０１９５】
ＦＩＴＣタグ化免疫グロブリンの取込みの評価:
ＦＩＴＣタグ化免疫グロブリン取込みの評価を、トランスフェクションの０、１、４および８時間後に、蛍光顕微鏡検査により行なった。
【０１９６】
ＮＩＫ^(MINUS)細胞と正常細胞間で観察されたリガンド効果の差が、長期ＮＩＫ欠損の結果として細胞に起こるかかる構成的変化に派生的であるという可能性を排除するため、ＮＩＫ活性化を即座に除去した。ＮＩＫ活性化は、その活性化ループのリン酸化を伴う（Lin et al., 1998）。リン酸化ＮＩＫ活性化ループ（α−ｐＮＩＫ）に相当するホスホペプチドに対して生成させ、Ｒａｍｏｓ細胞内に導入したモノクローナル抗体は、ＮＩＫのインビトロキナーゼ機能を、用量依存的に有効に阻止することが示された（図４ａ、上パネル）。図４ｂは、タンパク質トランスフェクションキットでのＲａｍｏｓ細胞の処理により、該細胞内への一過性だが有効な免疫グロブリンの導入が可能になったことを示す。α−ｐＮＩＫ抗体のＲａｍｏｓ細胞内への導入は、ＴＮＦによるＩκＢα分解の誘導に対して影響はなかった。しかしながら、この抗体は、ＣＤ７０またはＣＤ４０ＬによるＩκＢα分解の誘導を有効に阻止した（図４ｃ）。ＢＪＡＢ細胞では、ＣＤ４０ＬがＩκＢα分解を誘導し、この誘導は、α−ｐＮＩＫ抗体を導入すると、有意に減少した（図４ｄ）。これらの所見により、ＮＩＫはＴＮＦによる標準経路の活性化に関与しないが、リンパ球におけるその機能は他のリガンドによる標準経路の活性化には重要であることがさらに確認される。
【０１９７】
実施例５
標準経路の活性化に対するＣＤ７０の効果
ＴＮＦおよびＣＤ７０がＩＫＫシグナルソームを活性化する能力を比較した。標準経路の機序に対するその効果を、対照およびＮＩＫ欠損細胞において調べた。該細胞内にＮＩＫが存在する効果を、ＮＩＫ抑制細胞において同分子のウエスタンブロット解析により評価した。
【０１９８】
試薬：
ＣＤ７０は、実施例の項目の実施例２に記載してあり、ＴＮＦは、実施例の項目の実施例３に記載している。
【０１９９】
抗体：
抗ｍｙｃは、実施例の項目の実施例１に記載のようにして精製した。抗ＩκＢαおよび抗ＮＩＫ（ＮＩＫ−８１）は、実施例の項目の実施例２に記載している。抗ホスホＩκＢαは、実施例の項目の実施例３に記載している。リン酸化ＮＩＫ活性化ループ（α−ｐＮＩＫ）に対する抗体は、実施例の項目の実施例４に記載している。抗ＦＬＡＧ Ｍ２-ビーズは、シグマから、ＩＫＫα（Ｍ２８０ ＆ Ｈ７４４）は、サンタ クルス バイオテクノロジーから、抗ＩＫＫβおよび抗ＩＫＫγは、ＢＤ―ファーミンゲンから購入した。
【０２００】
細胞：
Ｒａｍｏｓ細胞およびＰＢＭＣ細胞は、実施例の項目の実施例２に記載している。
【０２０１】
発現ベクター:
ＧＳＴ−ＩκＢαは、シグナル ファーマシューティカルより頂いた。ＮＩＫ抑制ベクターは、実施例の項目の実施例２に記載している。
【０２０２】
トランスフェクション、免疫ブロテッィングおよび免疫沈降：
トランスフェクション、免疫ブロテッィングおよび免疫沈降は、実施例の項目の実施例２および実施例３に記載のようにして行った。休止ＰＢＭＣとＲａｍｏｓ細胞由来のＣＤ７０／ＣＤ２７リガンド-レセプター複合体の免疫沈降では、細胞ライセートを、前述のキナーゼ試験について記載したようにして調製し、４時間、４℃で、２５μｌの５０％Ｍ２−ＦＬＡＧアガロースビーズ／ｍｌ ライセートとともにインキュベートした。ＴＮＦ−レセプター複合体を、記載（Zhang et al., 2000）のようにして沈降させた。細胞ライセート由来のシグナルソームは、ＩＫＫ１に対する２種類の異なる抗体の１：１混合物を用いて免疫沈降させた（Ｍ−２８０およびＨ−７４４， サンタ クルス）。２５μｌの５０％プロテインＡ−セファロースビーズ／ｍｌ ライセートに吸着させた抗ＩＫＫα抗体１０μｇを用い、免疫沈降を２時間４℃で継続させた。
【０２０３】
正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞におけるインビトロＧＳＴ−ＩκＢαリン酸化を、示した時間の間（０、０．２５および４時間）（図５ａ）ＣＤ７０またはＴＮＦで細胞を刺激することにより行なった。
【０２０４】
キナーゼ試験：
レセプター複合体および細胞質内シグナルソームのインビトロＩＫＫキナーゼ活性を、細菌で発現させたＧＳＴ−ＩκＢα（１−５４）（Uhlik et al., 1998 and Dejardin et al., 2002））を基質として用い、既報（Uhlik et al., 1998 and Dejardin et al., 2002）のようにして評価した。つまり、２〜４×１０⁸Ｒａｍｏｓ細胞を、３０分間４℃で、溶解バッファー（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．６、２５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、２０ ｍＭ β−グリセロホスフェート、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート、０．１ ｍＭ バナジン酸ナトリウム、２ ｍＭ フッ化ナトリウム、１ ｍＭ ＤＴＴ、１ ｍＭ ＰＭＳＦおよび１×完全プロテアーゼ抑制因子カクテル）中で撹拌することにより溶解した。細胞残屑を１０，０００×ｇでの遠心分離により除去し、ライセートを、プロテインＡ／Ｇビーズ（これには、ウサギ／マウス免疫前血清が吸着されている）で予備精製し、次いで、２時間４℃で免疫沈降に供した。免疫沈降物を、溶解バッファーで４回、およびキナーゼバッファー（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．６、２０ ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ ｍＭβ−グリセロホスフェート、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、２ ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェートおよび２ ｍＭ ＤＴＴ）で２回洗浄した。キナーゼ反応は、２０μｌのビーズに結合した免疫沈降タンパク質を、１μｇのＧＳＴ−ＩκＢα（１−５４）および５μｃｉ［γ³²Ｐ］ＡＴＰを含有するキナーゼバッファー（４０μｌ）中、３０℃で３０分間インキュベートすることにより進行させた。ＮＩＫのキナーゼ活性を、同じ条件下でトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で過剰発現され、抗ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降させた、ｍｙｃタグ化ＮＩＫを用いて評価した。キナーゼ試験は、α−ｐＮＩＫまたは対照としてのＩｇＧの存在下で、免疫沈降物を抗体と１時間、４℃でプレインキュベートした後に行なった。キナーゼ反応の試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に移し、オートラジオグラフィーにより可視化し、示されたタンパク質をウエスタンブロット解析に供した。
【０２０５】
ＣＤ７０による標準経路の活性化は、ＩＫＫ１のＣＤ２７への選択的ＮＩＫ依存性補充と関連する：
標準経路における重要な事象は、ＩＫＫシグナルソームのＩκＢキナーゼ活性に対する刺激である。これらの２つのリガンドによる標準経路活性化の機序の違いを調べるため、ＴＮＦおよびＣＤ７０がＩＫＫシグナルソームを活性化する能力を比較した。
【０２０６】
ＴＮＦおよびＣＤ７０は、ともに、ＩＫＫシグナルソームのインビトロキナーゼ機能を増強することがわかり、これは、ＧＳＴ−ＩκＢαのリン酸化（図５ａ）ならびにＩＫＫの自己リン酸化およびＮＥＭＯのリン酸化（図５ｂ）において明示される。しかしながら、ＴＮＦによるシグナルソームの活性化は、ＮＩＫ欠損による影響を受けなかったが、シグナルソームに対するＣＤ７０の効果は、ＮＩＫ^(MINUS)細胞において抑制された（図５ａ、ｂ）。
【０２０７】
ＴＮＦによるシグナルソームの活性化後、シグナルソームの全ての３つの成分（ＩＫＫ１、ＩＫＫ２およびＮＥＭＯ）は、サイトゾル内で形成した複合体に見られるのと同じ比率で補充する。ＴＮＦ処理時のｐ５５ ＴＮＦレセプターへのシグナルソーム補充は、野生型細胞の場合と同様に有効にＮＩＫ^(MINUS)細胞において誘導される（図５ｃ、右パネル）。ＣＤ７０は、標準シグナルソームの３つの成分の１つの成分ＩＫＫ１だけのＣＤ２７への補充を誘導するようであり、ＣＤ７０処理時のＣＤ２７へのその補充は、ＮＩＫ^(MINUS)細胞において完全に排除され、これは、ＮＩＫ機能がこのプロセスに必要とされることを示す（図５ｃ、左パネル）。また、ＣＤ７０処理時のＣＤ２７へのＩＫＫ１の同様の選択的補充がＰＢＭＣにおいて観察された（図５ｄ）。ｐ５５ ＴＮＦレセプターおよびＣＤ２７の両方の場合において、レセプター結合ＩＫＫのキナーゼ活性は、細胞質内シグナルソームのものよりも弱かった（図５ｃの上および下パネル、ならびに図５ｄの右および左パネルのＧＳＴ−ＩκＢαのリン酸化）。これは、この補充が、完全なシグナルソームの活性化はもたらさず、単に、活性化プロセスの開始をもたらすことを示す。
【０２０８】
ＴＮＦによるシグナルソームの活性化における最も初期に知られた事象は、ｐ５５ ＴＮＦレセプターへのその補充（アダプタータンパク質ＲＩＰおよびＴＲＡＦ２の該レセプターへの補充により助長されるプロセス）である。ＣＤ７０は、ＣＤ２７へのＲＩＰの補充を誘導しない。しかしながら、図６ａに示すように、これは、ＴＲＡＦ２の補充は誘導する。興味深いことに、ＣＤ２７に補充されたＴＲＡＦ２分子は、おそらくユビキチン化に相当する大きな電気泳動パターン変形を示した。また、ＣＤ７０はシグナルソームの補充を誘導した。ＴＮＦレセプターへのシグナルソームの補充は、長期であったが、シグナルソームの３つの成分のＣＤ２７との結合は、ほんの数分間しか観察し得なかった。後の時点で、ＣＤ２７複合体におけるＩＫＫ２およびＮＥＭＯの量は、急激に減少した。しかしながら、驚いたことに、該レセプターと結合したＩＫＫ１の量は、長期間、高いまま維持された（図６ａ、左パネル）。ＣＤ２７と結合したＩＫＫ１のＣＤ７０処理後の同様の選択的維持はまた、ＰＢＭＣにおいても観察された（図６ｂ）。
【０２０９】
また、ＴＮＦおよびＣＤ７０はともに、標準ＮＦ−κＢ複合体の３成分ＩκＢα、ｐ６５およびｐ５０すべての補充を誘導した。ｐ１００プロセッシングはＣＤ７０によって誘導され、ＴＮＦによっては誘導されなかったが、ｐ１００のそのレセプターへの補充は、ＴＮＦによって誘導され、ＣＤ７０によっては誘導されなかった（図６ａ、右パネル）。この補充は、以前に、ｐ１００内のデスドメインが、ｐ５５ ＴＮＦレセプター結合アダプタータンパク質ＴＲＡＤＤ内のデスドメインに結合することにより起こることが示されており、ＮＦ−κＢを活性化するのではなく、このレセプターによるカスパーゼ−８活性化を介した細胞死誘導を増幅する機能を果たすようである（Wang et al., 2002）。
【０２１０】
ＮＩＫ−細胞において、ｐ５５ ＴＮＦレセプターへの補充は、野生型細胞の場合と同様に有効に起こった（図６ｃ、右パネル）。対照的に、シグナルソームの成分のＣＤ２７への補充は、完全に排除された（図６ｃ、ｄ、左パネル）。「キナーゼ死」ＮＩＫでなく野生型ＮＩＫのＮＩＫ−細胞への導入により、ＣＤ７０に応答した補充が維持された（図６ｄ、中央および右パネル）。また、ＴＮＦでなくＣＤ７０は、ＮＩＫのそのレセプターへの補充を誘導した。この補充は、該野生型酵素を発現する細胞およびその「ｎｉｋ死」変異体を発現した細胞の両方で観察することができた。（図６ｄ）。したがって、シグナルソームの成分のＣＤ２７への補充はＮＩＫキナーゼ機能に依存するが、ＮＩＫ自体のレセプターへの補充は、その酵素活性とは独立して起こるようである。
【０２１１】
実施例６
ＴＮＦおよびＣＤ７０によるＮＦ−κＢ活性化を開始する機序の推測的モデル
ＴＮＦによるＮＦ−κＢのＮＩＫ非依存的活性化における開始事象と、ＣＤ７０によるＮＩＫ依存的活性化における開始事象とを比較すると、標準経路の活性化におけるＮＩＫの関与が、特定の誘導因子の効果に限定されることが本発明者らにより示される。
【０２１２】
ｐ５５ ＴＮＦレセプターによるＮＦ−κＢの活性化は、すべてのシグナルソームのこれへの補充と関連し、このプロセスでは、シグナルソームの成分がＴＲＡＦ２およびＲＩＰと相互作用する（Zhang et al., 2000）（Devin et al., 2000）（Devin et al., 2001）。ＣＤ７０による標準経路の活性化は、そのＴＮＦによる活性化と同様、シグナルソームの成分ＩＫＫ１、ＩＫＫ２およびＮＥＭＯのレセプター複合体への補充と関連する。しかしながら、ＴＮＦと異なり、ＣＤ７０はまた、ＮＩＫならびにシグナルソームの成分ＩＫＫ２およびＮＥＭＯのそのレセプターへの補充も誘導する。
【０２１３】
ＮＩＫとともにシグナルソームがＣＤ２７に補充されたすぐ後に、レセプター複合体内でＩＫＫ２およびＮＥＭＯの両方が急激に減少する。しかしながら、ＩＫＫ１およびＮＩＫはともに、長期間、該レセプターと結合したままである。後者の形態のＣＤ２７複合体が、おそらく、代替経路を開始させる役割を果たす（図７の仮想モデルを参照）。
【０２１４】
完全シグナルソームのＣＤ２７への補充と同様、レセプターとのＩＫＫ１の後続の優先的結合は、ＮＩＫを欠く細胞または非機能性ＮＩＫ変異体を発現する細胞においては観察され得ない。
【０２１５】
明らかに、ＣＤ７０による補充におけるこれらの２つの状況は機序的に関連しており、それにより、ＮＩＫ依存代替活性化経路の開始が標準経路の開始と対であることが裏付けられる。
【０２１６】
本発明により、ＮＩＫは、ＳＩＶＡ（ＣＤ２７と結合していると思われるタンパク質（Prasad et al., 1997））に結合することがわかった。従来技術の研究では、ＳＩＶＡがＣＤ２７による細胞死の誘導を媒介することが示されていた。しかしながら、細胞死誘導は、２つの既知のＳＩＶＡスプライスバリアントの一方だけ、すなわちＳＩＶＡ１（これはデスドメインモチーフを含む（Yoon et al., 1999））に限定されるようである。本発明者らは、ＳＩＶＡ２（これはデスドメインを欠く）およびＳＩＶＡ１の両方がＮＩＫに、２つのスプライスバリアントに共通するＣ末端領域を介して結合し、過剰発現されたＮＩＫによるＮＦ−κＢの活性化を潜在的に増強することを示す。ＳＩＶＡが非機能性ＮＩＫ ａｌｙ変異体によるＮＦ−κＢの活性化を増強しないという事実により、ＳＩＶＡがＮＩＫによるＮＦ−κＢ活性化にある程度の役割を果たすという可能性の証拠が得られる。この役割が、実際、ＣＤ２７によるＮＩＫ機能の誘発、またはＮＩＫ機能の他の別の側面と関連するか否かは、解明の余地がある。そのシグナル伝達においてＮＩＫを伴うことがこれまでに示された他のレセプターは、いずれもＳＩＶＡに結合することが知られていない。これらのレセプターは、ＮＩＫ活性化において、他の別のアダプタータンパク質を伴っている可能性がある。
【０２１７】
標準および代替ＮＦ−κＢ活性化経路により媒介される活性は、異なってはいるが、相互関係を有する。２つの経路により生成するＮＦ−κＢ二量体は、異なるＤＮＡ配列モチーフを認識し、したがって、異なるプロモーターに影響することにより、異なる遺伝子の発現を制御し得る（Perkins et al., 1992）（Lin et al., 1995）（Dejardin et al., 2002）（Hoffmann et al., 2003）。また、この２つの経路は、異なる速度論的特徴を有する。標準経路の活性化は急速であり、主にはＮＦ−κＢ阻害タンパク質（ＩκＢおよびＮＦ−κＢ／ｐ１００など）の合成を誘導するという理由により、一過性であることがわかった。対照的に、代替経路は、刺激後、ほんの数時間で有効な活性化に達し、長期間活性な状態が維持される。これらの違いにより、この２つの経路が、異なる機能を果たす異なる組の遺伝子を制御することが可能になる。したがって、その急速な誘導と一致して、標準経路によって活性化された二量体は、初期先天性免疫応答を媒介する一組の遺伝子を制御し、一方、代替経路によって生成される二量体は、長期間でよりゆっくりと誘導される適応性免疫応答に対して多様な様式で寄与する活性を制御する。これらの機能の違いは、２種類の活性を制御するリガンドに帰属する機能と相関する。前炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦおよびインターフェロンＩＬ−１など）は、潜在的に、標準経路を刺激し得るものの、代替経路を刺激する能力は（もしあったとしても）ほとんどないがＬＴα１β２、ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦおよびＣＤ７０などの適応性免疫を制御するリガンドは、標準経路の活性化に加えて代替経路も有効に誘発し得る。
【０２１８】
しかしながら、代替経路を活性化する同じリガンドが標準経路も活性化するという単なる事実が、これらの２つの経路により調節される遺伝子間の機能的相互作用を許容する。またさらに、２つのシグナル伝達経路が相互作用し、互いの活性化に影響を与える。標準経路の誘導は、ｐ１００およびＲｅｌＢ（de Wit et al., 1998）（Bren et al., 2001）（これらは、代替経路の影響を受ける前駆体二量体を一緒になって形成し、したがって、後者を増強する）の合成を誘発する。ｐ１００はまた逆に、ＲｅｌＢへの結合に加えて、標準経路により制御される二量体（ｐ５０：ｐ５０およびｃ−Ｒｅｌ：ｐ５０）と結合するので、したがって、これらの機能をブロックするため、代替経路によるそのプロセッシングは、標準経路の活性化を永続させるのに有用である。
【０２１９】
機能的に異なるが相互に作用する２組のＮＦ−κＢ二量体の活性化機序を、同じ誘導因子によって協調させるのを可能にするためには、これらは、ともに共通するが異なる調節エレメントに制御される必要がある。他の研究では、代替経路または標準経路に特有のいくつかの成分が開示されている。本発明者らにより、ＮＩＫが、これらの２つの異なるＮＦ−κＢ経路において共通する関与因子としての機能を果たし得ることが、初めて示される。
【０２２０】
本発明を、その具体的な実施態様とともに記載したが、多くの代替、改良および変形が当業者に自明であることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内に含まれるかかるすべての代替、改良および変形が、含まれるものとする。本明細書に記載されたすべての刊行物、特許および特許出願ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、個々の刊行物、特許もしくは特許出願またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号が、具体的に個々に示されて引用により本明細書に組み込まれているかのように、同程度に、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願におけるいずれの参考文献の引用または特定は、かかる参考文献が本発明に対する従来技術として利用され得ることの承認として解釈されるべきではない。
【０２２１】
引用した参考文献
（さらなる参考文献は、本文中で引用している）
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【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１ａ】ＮＩＫのＳＩＶＡへの結合を示す。ＳＩＶＡへのＮＩＫの酵母ツーハイブリッド結合アッセイを示す。ＮＩＫおよびそのＣ末端変異体（ＮＩＫ６２４〜９４７）のＳＩＶＡのＣ末端部分（ＳＩＶＡ１のアミノ酸１２３〜１７５もしくはＳＩＶＡ２のアミノ酸５８〜１１０）またはＴＲＡＦ２への結合を、形質転換ＳＦＹ５２６酵母を用いて評価した。１時間および３時間以内の強い呈色反応を、それぞれ「＋＋」および「＋」で示し、「−」は、２４時間以内に呈色がなかったことを示す。このアッセイは、Ｃ末端ＳＩＶＡ断片がＮＩＫのＣ末端部分に結合し、この結合は、完全長ＮＩＫタンパク質で観察されるものよりも強いことを示す。
【図１ｂ】ＮＩＫのＳＩＶＡへの結合を示す。上パネルは、ｍｙｃ−ＮＩＫ、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ１、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２またはｍｙｃ−ａｌｙ ＮＩＫを発現するプラスミドでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションパターンを示す表である。「＋」は、対応するプラスミドをトランスフェクションに使用したことを示し、そうでない場合を「−」で示す。中央パネルは、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２と融合させたＨＩＳに対する抗体を用いたＳＩＶＡとのＮＩＫ（またはａｌｙマウスにおいて見られるものに相当するミスセンス変異が導入されたＮＩＫ）の免疫共沈降を表す。免疫共沈降は２４時間後に評価した。下パネルは、ＮＩＫおよびａｌｙ ＮＩＫと融合させたｍｙｃタグに対する抗体を用いた、全細胞ライセートに関するウエスタンブロット解析である。
【図１ｃ】ＮＩＫのＳＩＶＡへの結合を示す。上パネルは、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ１、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２、ｍｙｃ−ＮＩＫまたはｍｙｃ−ａｌｙ ＮＩＫを発現するプラスミドでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションパターンを示す表である。「＋」は、対応するプラスミドをトランスフェクションに使用したことを示し、そうでない場合を「−」で示す。中央パネルは、ＮＩＫおよびａｌｙ ＮＩＫと融合させたｍｙｃに対する抗体を用いた、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＮＩＫとのＳＩＶＡの免疫共沈降であり、免疫共沈降は２４時間後に評価した。下パネルは、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２と融合させたＨＩＳタグに対する抗体を用いた、全細胞ライセートに関するウエスタンブロット解析である。図１ｂおよび１ｃは、ＮＩＫが、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２と二方向に免疫共沈降し、「ａｌｙ ＮＩＫ」は、ＳＩＶＡ１と免疫共沈降し、少しの程度でＳＩＶＡ２とも免疫共沈降することを示す。
【図１ｄ】ＮＩＫのＳＩＶＡへの結合を示す。上パネルは、ｍｙｃ−ＮＩＫ、ＨＩＳ−ｈＩＫＫ１、ｐＥＧＦＰ、ｐｃＨＩＳ−ＳＩＶＡ１またはｐｃＨＩＳ−ＳＩＶＡ２を発現するプラスミドでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションパターンを示す表である。「＋」は、対応するプラスミドをトランスフェクションに使用したことを示し、そうでない場合を「−」で示す。下パネルは、ＮＩＫと融合させたｍｙｃタグに対する抗体を用いた、全細胞ライセートに関するウエスタンブロット解析である。この図は、トランスフェクト細胞におけるＮＩＫの量が、ＳＩＶＡ１またはＳＩＶＡ２との同時発現によって増加することを示す。
【図１ｅ】ＮＩＫのＳＩＶＡへの結合を示す。同時発現されたＳＩＶＡによるＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化の増強を示す棒グラフである。ＮＩＫまたはａｌｙ ＮＩＫの過剰発現の、単独またはＳＩＶＡ１またはＳＩＶＡ２と一緒での、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＩＶ−ルシフェラーゼ発現に対する効果を、トランスフェクションの２４時間後に評価した。値は、２つの実験（各々は、三重で行なった）で得られた平均である。このグラフは、ＳＩＶＡがＮＩＫ機能に影響を及ぼし得ることを示す。
【図２ａ】ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）による、リンパ球における標準経路と代替経路の両方の誘導、およびＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＣＤ７０適用後の休止ＰＢＭＣの細胞質内のＩκＢαレベル、ならびにＣＤ７０処理後の休止ＰＢＭＣの核内のｐ５２およびＲｅｌＢレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、ＩκＢαの急速な減少ならびにＮＦ−κＢ／ｐ５２（ｐ５２）およびＲｅｌＢの核への移行を示す。
【図２ｂ】ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）による、リンパ球における標準経路と代替経路の両方の誘導、およびＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＣＤ７０処理時の、刺激されたＰＢＭＣの細胞質内のＩκＢαレベル、ならびに刺激されたＰＢＭＣの核内のｐ１００、ｐ５２およびＲｅｌＢレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、ＩκＢαの急速な減少を示す。
【図２ｃ】ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）による、リンパ球における標準経路と代替経路の両方の誘導、およびＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＣＤ７０処理時の、Ｒａｊｉ細胞の細胞質内のＩκＢαレベル、ならびにＲａｊｉ細胞の核内のｐ１００、ｐ５２、ＲｅｌＢおよびｐ６５レベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、ＩκＢα分解ならびにＲｅｌＢおよびＮＦ−κＢ２／ｐ５２の核移行を示す。
【図２ｄ】ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）による、リンパ球における標準経路と代替経路の両方の誘導、およびＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＣＤ７０処理時の、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の細胞質内のｐ１００およびｐ５２レベル、ならびにこれらの細胞の核内のｐ１００、ｐ５２およびＲｅｌＢレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、正常Ｒａｍｏｓ細胞におけるＲｅｌＢおよびＮＦ−κＢ２／ｐ５２の核移行の誘導、ならびにＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞におけるｐ１００の核移行の遅滞を示す。図２ｅは、ＣＤ７０処理時の、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の細胞質内のＩκＢαレベル、ならびにこれらの細胞の核内のｐ６５レベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、ＩκＢα分解ならびに正常Ｒａｍｏｓ細胞におけるｐ６５の核移行を示す。
【図２ｆ】ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）による、リンパ球における標準経路と代替経路の両方の誘導、およびＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＮＩＫ ｓｉＲＮＡの発現によるＮＩＫ合成の抑制を示す。上パネルは、ｍｙｃタグ化ＮＩＫを一過的に発現し、かつｐＳＵＰＥＲ−ＮＩＫにより１：１、１：２、１：３ および １：５の比率でコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＮＩＫレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析を示す。この図は、ＮＩＫが有効に抑制されることを示す。中央パネルは、対照としてレンチウイルス系ＧＦＰで形質導入したＲａｍｏｓ細胞と比べてレンチウイルス系ｐＳＵＰＥＲ−ＮＩＫを構成的に発現するＲａｍｏｓ細胞（ＮＩＫ^(MINUS)細胞）におけるＮＩＫレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析を示す。この図は、ＮＩＫが有効に抑制されることを示す。下パネルは、ｍｙｃタグ化ＮＩＫを構成的に発現することによりＮＩＫ発現がこれに対して回復されるＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞におけるＮＩＫレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析を示す。この図は、ＮＩＫ発現が回復されたことを示す。
【図２ｇ】ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）による、リンパ球における標準経路と代替経路の両方の誘導、およびＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。正常（黒バーおよびＮＩＫ^(MINUS)（白バー）Ｒａｍｏｓ細胞におけるＣＤ７０誘導性プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化を示す棒グラフである。ＰＫＣ活性化は、細胞ライセートにおいて、Ｓｉｇｎａｔｅｃｔ ＰＫＣアッセイシステムを用い、該細胞へのＣＤ７０適用後の種々の時点（０、１５および３０分間）において行なった。バーは、三重試験の平均を表す。正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞におけるＣＤ２７レベルを、差込図に示す。この図は、ＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞が正常Ｒａｍｏｓ細胞の場合に匹敵するレベルでＣＤ２７を発現し、ＣＤ２７誘発時に正常な程度のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化を示すことを示す。
【図２ｈ】ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）による、リンパ球における標準経路と代替経路の両方の誘導、およびＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＮＩＫ^(MINUS)再構築Ｒａｍｏｓ細胞の細胞質内のＩκＢαレベル、およびこの細胞の核内のｐ５２レベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、これらの細胞がＣＤ７０に応答する能力を回復し、核ｐ５２の増加およびＩκＢαの一過性の減少の両方を伴うことを示す。
【図３ａ】ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＴＮＦ、タプシガルジンまたはＰＭＡによる標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方の誘導、ならびにＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＣＤ４０Ｌ処理後の、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の核内のｐ１００、ｐ５２およびＲｅｌＢレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、正常Ｒａｍｏｓ細胞におけるｐ１００、ｐ５２およびＲｅｌＢの核移行の誘導を示す。
【図３ｂ】ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＴＮＦ、タプシガルジンまたはＰＭＡによる標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方の誘導、ならびにＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＣＤ４０Ｌ処理後の、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の細胞質内のＩκＢαレベル、ならびにこれらの細胞の核内のｐ６５レベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、正常Ｒａｍｏｓ細胞におけるＩκＢαの減少と関連するｐ６５の核移行の急速な誘導を示す。
【図３ｃ】ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＴＮＦ、タプシガルジンまたはＰＭＡによる標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方の誘導、ならびにＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＢＬｙＳ処理後の、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の核内のｐ１００、ｐ５２およびＲｅｌＢレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、正常Ｒａｍｏｓ細胞におけるｐ５２およびＲｅｌＢの核移行の誘導を示す。
【図３ｄ】ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＴＮＦ、タプシガルジンまたはＰＭＡによる標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方の誘導、ならびにＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＢＬｙＳ処理後の、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の細胞質内のリン酸化ＩκＢαレベル、ならびにこれらの細胞の核内のｐ６５レベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、正常Ｒａｍｏｓ細胞における細胞レベルで明白な変化を伴わないＩκＢαのリン酸化と関連するｐ６５の急速な核移行を示す。
【図３ｅ】ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＴＮＦ、タプシガルジンまたはＰＭＡによる標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方の誘導、ならびにＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＴＮＦ処理後の、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の核内のｐ１００、ＮＳ、ｐ５２およびＲｅｌＢレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、正常Ｒａｍｏｓ細胞におけるｐ１００およびＲｅｌＢの核移行の誘導だけでなく核ｐ５２のほんのわずかな増加、ならびにＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞におけるｐ１００およびＲｅｌＢの核移行を示す。
【図３ｆ】ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＴＮＦ、タプシガルジンまたはＰＭＡによる標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方の誘導、ならびにＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。ＴＮＦ処理後の、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の細胞質内のＩκＢαレベル、ならびにこれらの細胞の核内のｐ６５レベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓの両方におけるＩκＢα分解の誘導およびｐ６５の核移行を示す。
【図３ｇ】ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＴＮＦ、タプシガルジンまたはＰＭＡによる標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方の誘導、ならびにＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。Ｒａｍｏｓ細胞の核抽出物由来の種々のＮＦ−κＢタンパク質のＲｅｌＢを用いた免疫沈降解析である（ＴＮＦまたはＣＤ７０の該細胞への適用後、１５分間および４時間）。ｐ１００、ＮＳおよびｐ５２のレベルは、ウエスタンブロット解析により検出した。この図は、ＣＤ７０は、ＲｅｌＢ：ｐ５２およびＲｅｌＢ：ｐ１００の核蓄積を増強するが、ＴＮＦは、ＲｅｌＢ：ｐ１００のみの核レベルの増加を誘導することを示す。
【図３ｈ】ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＴＮＦ、タプシガルジンまたはＰＭＡによる標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方の誘導、ならびにＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。タプシガルジンまたは４β−ホルボール−１２−ミリステート−13-アセテート（ＰＭＡ）に応答した正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の細胞質内のＩκＢαレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、ＮＩＫ枯渇が、ＩκＢα分解に対して影響を与えないことを示す。
【図３ｉ】ＣＤ４０Ｌ、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＴＮＦ、タプシガルジンまたはＰＭＡによる標準および代替ＮＦ−κＢ経路の両方の誘導、ならびにＮＩＫ欠損のこの誘導に対する影響を示す。正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞内のｐ１００、ｐ５２、ｐ６５、ＲｅｌＢ、ｃ−ＲｅｌおよびＩκＢαの基底レベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、正常Ｒａｍｏｓ細胞と比べ、ＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞における基底ｐ５２の顕著な減少、およびＲｅｌＢとｃ−Ｒｅｌの有意な減少、ならびにｐ１００とＩκＢαのある程度の減少を示す。
【図４ａ】ＴＮＦには誘導されないＣＤ４０ＬおよびＢＬｙＳによるＩκＢα分解が、リン酸化活性化ループに対するα-ｐＮＩＫ抗体によってブロックされることを示す。同じ試料において、ＮＩＫレベルのウエスタンブロット解析と比較したリン酸化タンパク質のオートラジオグラムである。０μｇ、０．５μｇ、１．０μｇおよび２μｇのα−ｐＮＩＫ抗体の存在下、または対照２μｇのＩｇＧとともに、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から免疫沈降させたｍｙｃ−ＮＩＫの自己リン酸化。この図は、α−ｐＮＩＫが、ＮＩＫのインビトロキナーゼ機能を有効にブロックすることを示す。
【図４ｂ】ＴＮＦには誘導されないＣＤ４０ＬおよびＢＬｙＳによるＩκＢα分解が、リン酸化活性化ループに対するα-ｐＮＩＫ抗体によってブロックされることを示す。タンパク質トランスフェクション試薬を用いた、抗体のＲａｍｏｓ細胞内への導入を示す。Ｒａｍｏｓ細胞によるＦＩＴＣタグ化免疫グロブリンの取込みの写真であり、蛍光顕微鏡により、トランスフェクション後の種々の時間（０、１、４および８時間）で評価した。この図は、タンパク質トランスフェクションキットでのＲａｍｏｓ細胞の処理により、該細胞内への免疫グロブリンの有効だが一過的な導入が可能になることを示す。
【図４ｃ】ＴＮＦには誘導されないＣＤ４０ＬおよびＢＬｙＳによるＩκＢα分解が、リン酸化活性化ループに対するα-ｐＮＩＫ抗体によってブロックされることを示す。α−ｐＮＩＫ抗体を有するＲａｍｏｓ細胞において、ＣＤ７０、ＣＤ４０ＬまたはＴＮＦにより誘導されるＩκＢαの分解を検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、α−ｐＮＩＫ抗体が、ＣＤ７０またはＣＤ４０ＬによるＩκＢα分解の誘導を有効にブロックすることを示す。
【図４ｄ】ＴＮＦには誘導されないＣＤ４０ＬおよびＢＬｙＳによるＩκＢα分解が、リン酸化活性化ループに対するα-ｐＮＩＫ抗体によってブロックされることを示す。α−ｐＮＩＫ抗体を有するＢＪＡＢ細胞におけるＣＤ４０ＬによるＩκＢαの分解を検出するために設計されたウエスタンブロット解析である。この図は、ＣＤ４０Ｌがこれらの細胞においてＩκＢα分解を誘導し、この誘導はα−ｐＮＩＫ抗体の存在下で有意に減少することを示す。
【図５ａ】正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞における、ＩＫＫの漸増およびＩＫＫシグナルソームの活性化に対するＣＤ７０またはＴＮＦの効果を示す。上パネルは、ＩＫＫ１に対する抗体を用いた免疫沈降により単離した、Ｒａｍｏｓ細胞におけるＩＫＫシグナルソームのインビトロＩκＢαリン酸化活性の速度論的解析であり、細胞ＩκＢαレベルを検出するために設計されたウエスタンブロット解析（下パネル）と比較し、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞へのＣＤ７０またはＴＮＦの適用後の示された時間（０、１５分間または４時間）で単離した。この図は、ＴＮＦおよびＣＤ７０がともに、正常Ｒａｍｏｓ細胞において、ＩＫＫシグナルソームのインビトロキナーゼ機能を増強することを示す。ＮＩＫ欠損Ｒａｍｏｓ細胞では、シグナルソームのＣＤ７０誘導性活性化がブロックされ、インビトロＩκＢリン酸化はなかったが、シグナルソームのＴＮＦ誘導性活性化は、全く影響を受けなかった。
【図５ｂ】正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞における、ＩＫＫの漸増およびＩＫＫシグナルソームの活性化に対するＣＤ７０またはＴＮＦの効果を示す。正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞へのＣＤ７０またはＴＮＦの適用の１５分後に単離したＩＫＫシグナルソームのインビトロキナーゼ試験における、ＩＫＫの自己リン酸化およびＮＥＭＯのリン酸化を示す。この図は、ＴＮＦおよびＣＤ７０がともに、正常Ｒａｍｏｓ細胞において、ＩＫＫの自己リン酸化およびＮＥＭＯのリン酸化を増強することを示す。ＣＤ７０のシグナルソームに対する効果は、ＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞において停止された。
【図５ｃ】正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞における、ＩＫＫの漸増およびＩＫＫシグナルソームの活性化に対するＣＤ７０またはＴＮＦの効果を示す。正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞における、ＣＤ７０またはＴＮＦ誘導によるＩＫＫ１、ＩＫＫ２およびＮＥＭＯの補充を示す。上パネルは、ＣＤ７０またはＴＮＦで15分間の刺激前および刺激後に正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞から単離したＣＤ２７と会合したレセプター複合体のＩＫＫシグナルソームの成分（左）およびｐ５５ ＴＮＦレセプター（右）のインビトロＩκＢαリン酸化活性および存在を示す。下パネルは、インビトロＩκＢαリン酸化活性、およびレセプター複合体の単離と同時にＲａｍｏｓ細胞から単離したＩＫＫシグナルソームを検出するために設計されたウエスタンブロット解析を示す。キナーゼ試験に導入したＩＫＫ１の量は、この図に示した量に対応した。この図は、正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞の両方において、ＴＮＦが、シグナルソームの全ての３つの成分（ＩＫＫ１、ＩＫＫ２およびＮＥＭＯ）の補充を、サイトゾルにおいてこれらが形成する複合体において見られるのとほぼ比率で誘導することを示す。ＣＤ７０は、正常Ｒａｍｏｓ細胞において、ＩＫＫ１のみの補充を誘導する。
【図５ｄ】正常およびＮＩＫ^(MINUS)Ｒａｍｏｓ細胞における、ＩＫＫの補充およびＩＫＫシグナルソームの活性化に対するＣＤ７０またはＴＮＦの効果を示す。インビトロＩκＢαリン酸化活性、ならびにＣＤ２７と会合したレセプター複合体およびＣＤ７０で１５分間の刺激前および刺激後に休止ＰＢＭＣから単離したシグナルソーム調製物内のＩＫＫシグナルソームの成分の存在を検出するために設計されたウエスタンブロット解析を示す。この図は、ＣＤ７０がＩＫＫ１の選択的補充を誘導することを示す。
【図６ａ】ＣＤ７０が、ＮＩＫキナーゼ機能に依存するようなＣＤ２７へのＩＫＫ１の選択的補充後にＩＫＫシグナルソームの補充を誘導すること、およびＮＩＫの補充を、そのキナーゼ機能とは独立して誘導することを示す。ＣＤ７０またはＴＮＦ適用後の種々の時点での、Ｒａｍｏｓ細胞における、ＴＲＡＦ２およびＲＩＰ、ＩＫＫシグナルソームの成分（ＩＫＫ１、ＩＫＫ２およびＮＥＭＯ）、標準ＮＦ−κＢ複合体の成分（ＩκＢα、ｐ６５およびｐ５０）、ならびにｐ１００のＣＤ２７およびｐ５５ ＴＮＦレセプター複合体への補充の速度論的解析を示し、細胞質内ＩＫＫシグナルソーム（ＮＥＭＯに対する抗体の使用により、刺激前に単離した；右）の組成、およびＩκＢαの細胞レベル（下）を比較している。
【図６ｂ】ＣＤ７０が、ＮＩＫキナーゼ機能に依存するようなＣＤ２７へのＩＫＫ１の選択的補充後にＩＫＫシグナルソームの補充を誘導すること、およびＮＩＫの補充を、そのキナーゼ機能とは独立して誘導することを示す。レセプター複合体および細胞質内シグナルソームにおける、ＩＫＫシグナルソームの成分のインビトロＩκＢリン酸化活性および存在を示す。ＣＤ２７複合体およびＣＤ２７で２０分間の刺激前および刺激後に休止ＰＢＭＣから単離したシグナルソーム調製物を示す。
【図６ｃ】ＣＤ７０が、ＮＩＫキナーゼ機能に依存するようなＣＤ２７へのＩＫＫ１の選択的補充後にＩＫＫシグナルソームの補充を誘導すること、およびＮＩＫの補充を、そのキナーゼ機能とは独立して誘導することを示す。レセプター複合体および細胞質内シグナルソームにおける、ＩＫＫシグナルソームの成分のインビトロＩκＢリン酸化活性および存在を示す。ＣＤ７０またはＴＮＦでの２０分間の刺激前および刺激後に対照およびＮＩＫ-Ｒａｍｏｓ細胞から単離したＣＤ２７（左）およびｐ５５ ＴＮＦレセプター（右）と会合したレセプター複合体を示す。
【図６ｄ】ＣＤ７０が、ＮＩＫキナーゼ機能に依存するようなＣＤ２７へのＩＫＫ１の選択的補充後にＩＫＫシグナルソームの補充を誘導すること、およびＮＩＫの補充を、そのキナーゼ機能とは独立して誘導することを示す。野生型または酵素的に不活性なＮＩＫ変異体（ＫＤ-ＮＩＫ）を補充したＮＩＫ細胞に対するＣＤ７０またはＴＮＦの適用後の種々の時間での、ＮＩＫおよびＩＫＫ１のＣＤ２７への補充、およびｐ５５ ＴＮＦレセプター複合体への補充の速度論の比較を示す。
【図７】図７は、ＴＮＦ（左パネル）およびＣＤ７０（右パネル）によるＮＦ−κＢ活性化を開始する機序の推測モデルを示す。この図は、ＴＮＦによるｐ５５ ＴＮＦレセプターの活性化（左）およびＣＤ７０によるＣＤ２７レセプターの活性化（右）からＮＦ−κＢ活性化へ導かれる分子事象の概略を表す。ＴＮＦは、シグナルソームの全ての３つの中心成分のそのレセプターへのＮＩＫ非依存的補充を、これらの成分とＴＲＡＦおよびＲＩＰとの相互作用に依存するように誘導する。この補充は、標準経路のみを開始する。ＣＤ７０は、ＴＲＡＦ２の補充および大量ユビキチン化を誘導するが、ＲＩＰでは誘導しない。これはまた、ＮＩＫの補充を誘導し、また、ＮＩＫのキナーゼ機能に依存するように、まず完全なシグナルソーム、ついでＩＫＫのみのＣＤ２７への補充を誘導する。完全なシグナルソームのこのレセプターへの補充、および結果として起こるＮＩＫによるＩＫＫ１の活性化は、このレセプターによる標準経路の開始機構であり、続いて起こるＩＫＫ１の補充は、このレセプターによる代替経路開始機序であろう。点線は、ＴＮＦおよびＣＤ７０による標準経路の活性化時のｐ１００およびＲｅｌＢの誘導、および結果として起こるｐ１００：ＲｅｌＢ複合体の核への移行を表す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫障害の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ複合体形成を増加または減少させることができる薬剤の使用。
【請求項２】
前記免疫障害が、ＢｌｙＳ／ＢＡＦＦ、ＣＤ２７、ＳＩＶＡおよびＮＩＫからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の機能異常またはレベル異常を特徴とする請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記免疫障害が、多発性骨髄腫（ＭＭ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤｓ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、全身性エリテマトーデス、炎症性大腸疾患、全身性炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）からなる群より選択される請求項１記載の使用。
【請求項４】
免疫障害の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ依存性ＣＤ２７調節を増大または減少させることができる薬剤の使用。
【請求項５】
ＮＩＫ依存性ＣＤ２７調節を減少させるための請求項４記載の使用。
【請求項６】
薬剤が、ＮＩＫに結合することができる抗体である請求項５記載の使用。
【請求項７】
薬剤が、リン酸化ＮＩＫ活性化ループに対して指向される抗体である請求項６記載の使用。
【請求項８】
薬剤が低分子干渉性ＲＮＡ分子である請求項５記載の使用。
【請求項９】
低分子干渉性ＲＮＡ分子が配列番号：１５のものである請求項８記載の使用。
【請求項１０】
薬剤がリボザイムである請求項４記載の使用。
【請求項１１】
標準経路による異常なＮＦ−κＢ活性化によって引き起こされるか、または悪化する免疫障害の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫの活性を増大または低下させることができる薬剤の使用。
【請求項１２】
ＮＩＫの活性を低下させるための請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
異常なＮＦ−κＢ活性化が、ＣＤ７０の誘導および／またはそのレセプターの活性化によって引き起こされる請求項１１記載の使用。
【請求項１４】
異常なＮＦ−κＢ活性化が、ＣＤ４０Ｌの誘導および／またはそのレセプターの活性化によって引き起こされる請求項１１記載の使用。
【請求項１５】
異常なＮＦ−κＢ活性化が、Ｂｌｙｓの誘導および／またはそのレセプターの活性化によって引き起こされる請求項１１記載の使用。
【請求項１６】
薬剤が、ＮＩＫに結合する抗体である請求項１１記載の使用。
【請求項１７】
薬剤が、リン酸化ＮＩＫ活性化ループに対する抗体である請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
薬剤が低分子干渉性ＲＮＡ分子である請求項１１記載の使用。
【請求項１９】
低分子干渉性ＲＮＡ分子が配列番号：１５のものである請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
薬剤がリボザイムである請求項１１記載の使用。
【請求項２１】
免疫障害を有する個体に、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ複合体形成を増加または減少させることができる薬剤の治療有効量を投与し、それにより、該個体において免疫障害を治療することを含む免疫障害の治療方法。
【請求項２２】
前記免疫障害が、ＢｌｙＳ／ＢＡＦＦ、ＣＤ２７、ＳＩＶＡおよびＮＩＫからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の機能異常またはレベル異常を特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫障害が、多発性骨髄腫（ＭＭ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤｓ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、全身性エリテマトーデス、炎症性大腸疾患、全身性炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）からなる群より選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記投与が、前記個体の細胞内で前記薬剤を発現させることによって行なわれる請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記個体の前記細胞がリンパ球細胞である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
免疫障害を有する個体に、ＮＩＫ依存性ＣＤ２７調節を増加または減少させることができる薬剤の治療有効量を投与し、それにより、該個体において免疫障害を治療することを含む免疫障害の治療方法。
【請求項２７】
前記投与が、前記個体の細胞内で前記薬剤を発現させることによって行なわれる請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記個体の前記細胞がリンパ球細胞である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
標準経路による異常なＮＦ−κＢ活性化によって引き起こされるか、または悪化する免疫障害の治療方法であって、該障害に罹患した個体に、ＮＩＫの活性を低下または増大させることができる薬剤の治療有効量を投与することを含む免疫障害の治療方法。
【請求項３０】
薬剤が、ＮＩＫの活性を低下させることができる請求項２９記載の治療方法。
【請求項３１】
異常なＮＦ−κＢ活性化が、ＣＤ４０Ｌの誘導および／またはそのレセプターの活性化によって引き起こされる請求項２９記載の治療方法。
【請求項３２】
異常なＮＦ−κＢ活性化が、ＣＤ７０の誘導および／またはそのレセプターの活性化によって引き起こされる請求項２９記載の治療方法。
【請求項３３】
異常なＮＦ−κＢ活性化が、Ｂｌｙｓの誘導および／またはそのレセプターの活性化によって引き起こされる請求項２９記載の治療方法。
【請求項３４】
薬剤が抗体である請求項３０記載の治療方法。
【請求項３５】
薬剤が、リン酸化ＮＩＫ活性化ループに対して指向される抗体である請求項３４記載の治療方法。
【請求項３６】
薬剤が低分子干渉性ＲＮＡ分子である請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
低分子干渉性ＲＮＡ分子が配列番号：１５のものである請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
薬剤がリボザイムである請求項３０記載の方法。
【請求項３９】
供される細胞内でＮＩＫ発現を特異的に下方調節することができる核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
低分子干渉性ＲＮＡ分子である請求項３９記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記低分子干渉性ＲＮＡ分子が配列番号：１５のものである請求項４０記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項３９記載の単離ポリヌクレオチドを含有する核酸構築物。
【請求項４３】
請求項４２記載の核酸構築物を含む細胞。
【請求項４４】
配列番号：２の座標６２４〜９４７記載のアミノ酸配列領域に特異的に結合することができる抗体または抗体断片。
【請求項４５】
配列番号：３の座標１２３〜１７５記載のアミノ酸配列領域に特異的に結合することができる抗体または抗体断片。
【請求項４６】
配列番号：４の座標５８〜１１０記載のアミノ酸配列領域に特異的に結合することができる抗体または抗体断片。
【請求項４７】
ＮＩＫ−ＳＩＶＡ複合体形成を増加または減少させることができる分子であって、推定免疫モジュレーターである該分子を同定することを含む推定免疫モジュレーターの同定方法。
【請求項４８】
ＮＩＫ依存性ＣＤ２７調節を増加または減少させることができる分子であって、推定免疫モジュレーターである該分子を同定することを含む推定免疫モジュレーターの同定方法。
【請求項４９】
細胞を、該細胞内でＮＩＫ依存性標準経路および代替経路を誘導することができるＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのリガンドと接触させること、前記接触前、接触後、または接触中に細胞を個々の被験分子とともにインキュベートすること、細胞内の標準経路の活性化を検出すること、および前記リガンドによって誘導される標準経路の誘導をモジュレートすることができる単一の分子／分子群を選択することを含む、ＮＩＫの活性をモジュレートすることができる分子のスクリーニング方法。
【請求項５０】
ＴＮＦ／ＮＧＦのリガンドが、ＣＤ７０、ＣＤ４０ＬおよびＢｌｙｓ／ＢＡＦＦから選択される請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
細胞がリンパ芽球型である請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
細胞が、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＢＪＡＢ細胞から選択される請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
標準経路の活性化が、ＩκＢ分解、ＩκＢαリン酸化およびｐ６５転位から選択される標準経路活性化を示すパラメータをモニターすることにより検出される請求項４９〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
リンパ芽球細胞を、該細胞内でＮＩＫおよび標準経路を活性化することができるＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのリガンドと接触させること、前記接触前、接触後、または接触中に細胞を個々の被験分子とともにインキュベートすること、標準経路の活性化を検出すること、およびＮＩＫ非依存的に前記リガンドによって誘導されるが、標準経路を誘導することができる他のどのリガンドによっても誘導されない標準経路の誘導をモジュレートすることができる単一の分子／分子群を選択することを含むＮＩＫ活性をモジュレートすることができる分子のスクリーニング方法。
【請求項５５】
ＴＮＦ／ＮＧＦのリガンドが、ＣＤ７０、ＣＤ４０ＬおよびＢｌｙｓ／ＢＡＦＦから選択される請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
ＮＩＫ非依存的形態で標準経路を誘導することができるリガンドがＴＮＦである請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
標準経路の活性化が、ＩκＢ分解、ＩκＢαリン酸化およびｐ６５転位から選択される標準経路活性化を示すパラメータをモニターして検出される請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
細胞が、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＢＪＡＢ細胞から選択される請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
請求項４９〜５９記載の方法のいずれかによって得られ得るＮＩＫの活性をモジュレートすることができる分子。

【図１ａ】

【図１ｂ】

【図１ｃ】

【図１】

【図２ａ】

【図２ｂ】

【図２ｃ】

【図２ｄ】

【図２ｅ】

【図２ｆ】

【図２ｇ】

【図２ｈ】

【図３ａ】

【図３ｂ】

【図３ｃ】

【図３ｄ】

【図３ｅ】

【図３ｆ】

【図３ｇ】

【図３ｈ】

【図３ｉ】

【図４ａ】

【図４ｂ】

【図４ｃ】

【図４ｄ】

【図５ａ】

【図５ｂ】

【図５ｃ】

【図５ｄ】

【図６ａ】

【図６ｂ】

【図６ｃ】

【図６ｄ】

【図７】

【公表番号】特表２００７−５１７５０１（Ｐ２００７−５１７５０１Ａ）
【公表日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４０７７７（Ｐ２００６−５４０７７７）
【出願日】平成１６年１１月３０日（２００４．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／００１０９５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５１４２３
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ　リサーチ　アンド　ディベロップメント　カンパニー　リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】