前生物学的調製物
本発明は、アラビノキシランを含む栄養的添加剤に関する。これは、ヒトの腸内微生物叢の調節を手助けする。さらに、添加剤を含むいくつかの食品および飲料、さらには、上記添加剤を調製するための方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、前生物的な栄養的添加剤として使用するためのアラビノキシラン調製物に関し、そして、上記添加剤を用いてヒトの食事を補うことによってヒトの消化管の健康状態を改善する方法に関する。好ましい実施形態においては、アラビノキシラン調製物は、植物性の材料のような自然界に存在している供給源に由来し、より好ましくは、穀物に由来する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、所定のデンプン以外の多糖類（ＮＳＰ）を含む食品の消化管（より具体的には、腸の微生物叢）の健康状態に対するポジティブな作用に関係する。ＮＳＰには、様々な物理化学的特性を有している様々な化合物が含まれる。ペントサンとも呼ばれもアラビノキシランは穀物のＮＳＰの重要なグループであり、これはＯ−２および／またはＯ−３
α−Ｌ−アラビノ−フラノシル単位がそれに連結させられているβ−１，４−結合Ｄ−キシロピラノシル単位の主鎖から構成されている。典型的なアラビノキシランの中には、未置換の、１置換された、および２置換されたキシロース残基が存在している（図１を参照のこと）。アラビノキシランは、水で抽出できるか、または水では抽出できないかのいずれかである。後者は、アルカリ条件下、または酵素を使用することによって部分的に溶解させることができ、そして大量の水に結合する。水で抽出することができるアラビノキシランは、並外れた粘性を生じる能力を有している。一般的には、それらの分子量は、供給源と抽出方法によっては非常に大きい（８００，０００ダルトンまで）。これらは微量成分に過ぎないという事実にもかかわらず。これらは、コムギデンプン、パスタ、およびビールの製造、製パン、ならびに他の食品への適用のようなバイオテクノロジープロセスにおける穀物の機能性について重要である。
【０００３】
アラビノキシランまたはキシラン（β−１，４−結合Ｄ−キシロピラノシル単位の未置換のポリマー）に由来するオリゴ糖のいくつかのタイプは、前生物学的特性を発揮することが示されている。前生物学的物質は化合物、通常は非グルコシドオリゴ糖であり、これは、上部消化管の酵素によっては分解され得ないが、大腸の中のいくつかのタイプの腸内細菌によって選択的に発酵される（Ｇｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ，１９９５；Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ，１９８８；Ｖａｎ Ｌｏｏ，２００４）。食事の中に前生物学的物質が存在することにより、腸の細菌集団の組成にシフトが生じ、これは通常、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種の相対的な増加を特徴とする。腸の微生物叢のシフトは、全体的な健康状態の改善、腸の感染症の減少、腸の短鎖脂肪酸のレベルの増大、ミネラルのより良好な吸収、および結腸ガンの開始の抑制に関係している（Ｖａｎ Ｌｏｏ，２００４）。
【０００４】
２〜３の重合度（ＤＰ）を有しているオリゴ糖（キシロビオースおよびキロトリオース）が優位であるキシロ−オリゴ糖（ＸＯＳ、β−１，４−結合Ｄ−キシロピラノシル単位から構成されるオリゴ糖）の調製物は、ラットの糞および盲腸（ＥＰ０２６５９７０Ｂ１；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９７；Ｈｓｕら、２００４）、ならびにヒトの結腸（Ｏｋａｚａｋｉら、１９９０）の中のビフィズス菌のレベルの有意な増加を生じさせることが示されている。このようなキシロビオースを多く含むＸＯＳ調製物はまた、ラットにおいては化学物質によって誘導される結腸での発ガンの初期症状を抑制し（Ｈｓｅら、２００４）、そしてカルシウムの吸収を高める（Ｔｏｙｏｄａら、１９９３）。主に３〜５のＤＰを有しているアラビノキシロ−オリゴ糖（ＡＸＯＳ）から構成される調製物（アラビノシ
ルキシロビオース、アラビノシルキシロトリオース、アラビノシルキシロテトラロース、およびジアラビノシルキシロテトラオース）もまた、ラットおよびマウスの腸の中のビフィズス菌のレベルを増加させることが示されている（Ｙａｍａｄａら、１９９３）。
【０００５】
それらの商業的な可能性を厳しく制限する、現在市販されているＸＯＳ調製物についての１つの主要な欠点は、それらの価格水準が他のオリゴ糖と比較して非常に高いことであり、このことは、現在の製造プロセスは費用効率が悪いことを示している。２〜３のＤＰを有しているＸＯＳが優位である前生物学的調製物の製造については１つの方法が記載されており、これには、植物をベースにして作られた製品（広葉樹材、トウモロコシの穂軸、綿実殻、小麦ふすま、または醸造に使用された穀物）からの、ＮａＣｌＯ溶液と高濃縮ＫＯＨ溶液を使用するキシランの化学的抽出、その後の、エンドキシラナーゼ酵素による抽出されたキシランの酵素による加水分解が含まれる（ＥＰ０２６５９７０Ｂ１）。同様の方法が前生物学的ＡＸＯＳ調製物（３〜５のＤＰを有しているＡＸＯＳの調製物）を作製するために使用されており、これには、濃縮されたアルカリ溶液を使用するアラビノキシランの化学的抽出、その後の、塩類の除去、エンドキシラナーゼでの酵素による加水分解、および炭素カラム上でのクロマトグラフィーが含まれる（Ｙａｍａｄａら、１９９３）。これらの方法の主な欠点は、キシランまたはアラビノキシランの化学的抽出が環境にやさしくなく、そして酵素による加水分解を行うことができるまでに大規模な透析または限外濾過によるコストのかかる化学物質の除去が必要であることである。ＸＯＳまたはＡＸＯＳを生産するための別の方法には、広葉樹材または醸造に使用された穀物の熱水による自動加水分解（ａｕｔｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）が含まれる。この方法では、植物性の材料の懸濁液が特殊な反応容器の中で１５０〜１９０℃で２０〜６０分間加熱される（ＥＰ０２６５９７０Ｂ１；Ｋａｂｅｌら、２００２；Ｃａｒｖａｌｈｅｉｒｏら、２００４）。この方法の欠点は、高い反応温度のせいで、食品の目的には望ましくない副生成物（例えば、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、およびレブリン酸）が生じることである（Ｃａｒｖａｌｈｅｉｒｏら、２００４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在までに記載されたＸＯＳおよびＡＸＯＳの前生物学的調製物は、２（ＥＰ０２６５９７０Ｂ１）または４（Ｙａｍａｄａら、１９９３）のいずれかの平均重合度を有している。食品分野での特定の用途については、これらの調製物にはいくつかの欠点がある。第１に、この調製物にはキシロースが多く含まれており、これはスクロースの約６０％の甘味を有している（Ｓｕｎｔｏｒｙ、キシロオリゴ糖、パンフレットおよび製品説明書、２００１）。甘味は、一部の用途について所望され得るが、他の用途については、より自然な風味がより望ましい。平均重合度が低いキシロオリゴ糖もまた、スクロースの約４０％の甘味を有している（Ｓｕｎｔｏｒｙ、キシロオリゴ糖、パンフレットおよび製品説明書、２００１）。第２に、平均重合度が低い調製物は、低カロリー食品の成分においては望ましくないエネルギレベルを有している。キシロオリゴ糖のエネルギ値の計算については、キシロースの代謝エネルギ値は、キシロビオースおよびキシロトリオースについては１グラムあたり４カロリー、１ｇあたり２カロリーと考えられ、＞４のＤＰを有しているキシロ−アラビノ−オリゴ糖については１ｇあたり０カロリーとみなされる（Ｓｕｎｔｏｒｙ、キシロオリゴ糖、パンフレットおよび製品説明書、２００１）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、アラビノキシランを含む栄養的添加剤に関する。これは、ヒトの腸内微生物叢の調節を手助けする。さらに、添加剤を含むいくつかの食品および飲料、さらには、上記添加剤を調製するための方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
詳細な説明
発明の記述
特定のアラビノキシラン調製物を含む補給用の飼料または食品の前生物学的効果は以前に記載されている。より具体的には、先行技術によって、４未満の平均重合度（ＤＰ）を有している一方のキシロ−アラビノ−オリゴ糖に対する、および長鎖の自然界に存在しているアラビノキシランを含む他方のアラビノキシラン調製物に対するビフィズス菌特異的効果の例が提供されている。
【０００９】
市販されているキシロ−アラビノ−オリゴ糖調製物は、激しい、制御されていない脱重合化条件下で生産され、これによって、比較的高レベルのキシロースおよび短いキシロ−オリゴ糖の存在を生じる。これらには甘味がある。これらの調製物の甘味により、特定の食品へのそれらの使用が制限される。さらに、４未満のＤＰを有しているキシロ−アラビノ−オリゴ糖分子は、低カロリー食品には望ましくない代謝エネルギ含有量を有している。
【００１０】
自然界に存在しているアラビノキシランの物理化学的特性（例えば、高い粘性および高い保水力）により、これらは広い範囲の食品での使用には適していない。自然界に存在しているアラビノキシランの部分的な脱重合化によってそれらの物理化学的特性が改善されており、そして、約５８の平均ＤＰを有しているアラビノキシラン分子を含む調製物が記載されている。しかし、これらの部分的に脱重合化されたアラビノキシランのヒトでの前生物学的効果は、比較的高用量（１日あたり＞６ｇ；Ｇｒａｓｔｅｎら、２００３）でしか明らかにされていない。
【００１１】
本発明は、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランを含むアラビノキシラン調製物が、ヒトおよびヒト用のモデルとしての役割を果たす。試験動物に投与された場合には、強力な前生物学的物質であるとの知見に基づく。さらに、このような調製物は、自然界に存在しているアラビノキシランまたは短鎖のキシロ−アラビノ−オリゴ糖のいずれかを含む調製物の物理化学的または感覚刺激性の不都合のいずれをも有さない。ヒト、ラット、およびニワトリのいずれにおいても、本発明のアラビノキシラン調製物が５８以上の平均ＤＰを有している部分的に脱重合化されたアラビノキシランを含む調製物よりも強いビフィズス菌特異的効果を有していることもまた明らかにされた。加えて、本発明のアラビノキシラン調製物は、結腸の遠位部分においてそれらの前生物学的効果を主に発揮し、一方、短鎖キシロオリゴ糖は結腸の近位部分においてより活性であることが観察された。これらによって遠位結腸の微生物叢の組成と結腸の疾患（特に、結腸ガン）の発症との間の関係が明らかであるので、この発見は特に重要である。次に、前生物学的効果自体もまた、本発明のアラビノキシラン調製物の使用に関する他の有用な効果であることが、尿による窒素の排出の減少、および同時に起こる便によるＮの排出の増加、さらには、クレゾールおよびフェノールの尿による排出の減少などとして見られた。
【００１２】
したがって、第１の目的においては、本発明によって、食品添加物として、または栄養補給用製品の主成分として使用されるアラビノキシラン調製物が提供される。アラビノキシラン調製物は、上記調製物に含まれるアラビノキシラン分子が５から５０の間で変化する平均ＤＰを有することを特徴とする。好ましい実施形態においては、アラビノキシラン調製物には、前記アラビノキシラン分子が少なくとも１５％含まれる。より好ましい実施形態においては、これらの調製物には、３０％を超える（例えば、６０％を超える）上記アラビノキシランが含まれる。さらに好ましい実施形態においては、本発明の調製物に含まれるアラビノキシランは、７から４０の間の平均ＤＰを、さらに好ましくは、７から２０の間のＤＰを有する。好ましくは、本発明の調製物に含まれるアラビノキシランの９０％が、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を使用して決定すると、２から
６５０の間、より好ましくは、２から１３０の間のＤＰを有する。
【００１３】
好ましい実施形態においては、本発明のアラビノキシラン調製物は、自然界に存在している供給源、例えば、植物性の材料から、より好ましくは、穀物から得ることができる。これらは、上記の自然界に存在しているアラビノキシランの選択された画分であることができ、また、上記自然界に存在しているアラビノキシランの脱重合または断片化によって得ることができ、また、これらは、化学的、酵素的、および／または物理的プロセスによって生産された構造類似物であることもできる。好ましい実施形態においては、アラビノキシラン調製物は、ＷＰＣ（Ｐｆｅｉｆｅｒ ＆ Ｌａｎｇｅｎ）のような、グルテン−デンプン分離プロセスの副流に由来する。別の好ましい実施形態においては、アラビノキシラン調製物は、穀物のふすまに由来する。
【００１４】
本発明のアラビノキシラン調製物の前生物学的効果は、食品によって投与された場合には、１回分について０．２５ｇの用量で観察された。したがって、第２の目的においては、本発明によって、本発明のアラビノキシラン調製物を含む食品または飲料が提供される。好ましい実施形態においては、この食品または飲料には、１回分について、０．１から５ｇの間の本発明のアラビノキシラン調製物が含まれる。より好ましい実施形態においては、食品または飲料には、１回分について、０．２５から５ｇの間の本発明のアラビノキシラン調製物が含まれる。より好ましい実施形態においては、食品または飲料には、１回分について、１から３ｇの間の本発明のアラビノキシラン調製物が含まれる。別の好ましい実施形態においては、食品または飲料には、１回分について、０．１から５ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる。より好ましい実施形態においては、食品または飲料には、１回分について、０．２５から５ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる。さらに好ましい実施形態においては、食品または飲料には、１回分について、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる。上記に示されるように、本発明のアラビノキシラン調製物は、低カロリー食品への有用な添加物として特に適している。
【００１５】
特定の実施形態においては、食品は乳製品、例えば、ヨーグルトまたはフレッシュチーズである。好ましくは、上記乳製品には、１２５ｇの１回分について１００ｇあたりで、０．２５から５ｇの間、より好ましくは１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる。状況に応じて、上記乳製品には、生存しているビフィズス菌属または乳酸菌属の細菌が含まれる。これらはアラビノキシランを発酵させることができる。別の特定の実施形態においては、本発明の飲料は、いわゆるアルコールを含まない機能性清涼飲料である。好ましくは、このような機能性清涼飲料には、１００ｍｌあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる。あるいは、上記機能性清涼飲料には、所望される量のこのようなアラビノキシランが２５０ｍｌ中に含まれる。特定の実施形態においては、上記機能性清涼飲料には、生存しているビフィズス菌属または乳酸菌属の細菌が含まれる。これらはアラビノキシランを発酵させることができる。
【００１６】
一般的には、有効成分として穀物または穀物に由来する物質を含む食品にはアラビノキシランが含まれる。しかし、これらの食品に含まれるアラビノキシランは、６０００を超えるＤＰを有している長鎖の自然界に存在しているアラビノキシランであるか、または少なくとも２００から３００のＤＰを有している部分的に脱重合化させられたアラビノキシランであるかのいずれかである。したがって、本発明のアラビノキシランが上記食品に多く含まれることによってまた、それらの栄養価も改善される。好ましくは、このような富化は、穀物を含む食品の調製の間に、材料の１つとして所定の量の本発明のアラビノキシラン調製物を添加することによって得られる。このような富化によって、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランの集団に加えて、２００以上のＤＰを有しているアラビ
ノキシランを含む穀物を含む食品が得られることは明らかである。上記集団は、５から５０の間の平均ＤＰを特徴とする。当業者は、２００を下回るＤＰを有しているアラビノキシランの上記集団での穀物を含む食品の富化は、これらの食品の調製の間に、適切な条件下でキシラン分解酵素を使用することによって、少なくとも一部得ることができることを理解するであろう。特定の実施形態においては、上記食品は、パンのようなベーカリ製品である。好ましくは、上記パンには、１００ｇあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが多く含まれている。別の実施形態においては、食品はケーキのようなペストリ製品である。好ましくは、上記ペストリ製品には、１００ｇあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが多く含まれている。さらに別の実施形態においては、食品はパスタ製品である。好ましくは、上記パスタ製品には、８０ｇあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが多く含まれている。さらに別の実施形態においては、食品は、朝食用シリアルである、好ましくは、上記朝食用シリアルには、３０ｇあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが多く含まれている。さらに別の実施形態においては、食品はビスケットであり、例えば、朝食用の乾いたビスケットである。好ましくは、上記ビスケットには、１２５ｇあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは、から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが多く含まれている。
【００１７】
本発明のアラビノキシラン調製物を補給することを手助けすることができる他の食品は、例えば、ひき肉製品、チョコレート、クッキー、バー（ｂａｒｓ）、およびデザート用のプリンのようなデザートであるが、これらに限定はされない。
【００１８】
本発明の第３の目的によっては、本発明のアラビノキシラン調製物を含む食品補給製品（ｆｏｏｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔ）が提供される。好ましい実施形態においては、食品補給製品は、カプセル、錠剤、粉末などである。より好ましい実施形態においては、食品補給製品は、それによって０．１および５ｇの、より好ましくは、０．２５から５ｇの間、例えば、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランの連日投与が可能であるように処方される。
【００１９】
第５の目的においては、本発明によって、本発明のアラビノキシラン調製物を調製するための方法が提供される。第１の実施形態においては、この方法には以下の工程が含まれる：
ｉ．ふすま、小麦粉、または小麦スキージ（ｗｈｅａｔ ｓｑｕｅｅｇｅｅ）のようなアラビノキシランを多く含む材料から水で抽出できないアラビノキシラン画分を、上記アラビノキシランを多く含む材料の除デンプン（ｄｅｓｔａｒｃｈｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および除タンパク（好ましくは、それぞれ、デンプン分解酵素およびタンパク質分解酵素を使用して）によって単離する工程
ｉｉ．１つ以上のキシラン分解酵素を使用して水で抽出できないアラビノキシラン画分を脱重合化させる工程。
【００２０】
第２の実施形態においては、この方法には以下の工程が含まれる：
ｉ．部分的に脱重合化された水で抽出することができるアラビノキシランを含む調製物、例えば、デンプン−グルテン分離プロセスの副流によって得られる調製物を得る工程
ｉｉ．必要に応じて、上記アラビノキシランを含む調製物からデンプンおよびタンパク質を（好ましくは、それぞれ、デンプン分解酵素およびタンパク質分解酵素を使用して）除去する工程。
【００２１】
ｉｉｉ．１つ以上のキシラン分解酵素を使用して上記調製物中に含まれるアラビノキシランを脱重合化させる工程。
【００２２】
特定の実施形態においては、調製物は、調製物から４以下のＤＰを有している単糖およびオリゴ糖の量を減少させるために、キシラン分解酵素での処理の後に限外濾過に供される。
【００２３】
最後の目的においては、本発明によって、穀物を含む食品中の２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランの集団の濃度および平均ＤＰを分析するための方法が提供される。上記方法には以下の工程が含まれる：
ｉ．穀物を含む食品の試料を、好ましくは、上記試料を乾燥または凍結乾燥させた後に粉砕する工程；
ｉｉ．粉砕した試料を蒸留水中で抽出する工程；
ｉｉｉ．全てのデンプンをグルコースに変換するために、適切な条件下でデンプン分解酵素で（例えば、アミラーゼでの処理、その後のアミログルコシダーゼでの処理を使用して）抽出物を処理する工程；
ｉｖ．（ｉｉｉ）で得られた試料から、例えば、酵母を使用してグルコースを代謝させることによって、グルコースを除去する工程；
ｖ．（ｉｖ）で得られた試料に含まれるアラビノキシランの分子量プロフィールを、好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して決定する工程；
ｖｉ．例えば、ＨＰＬＣ曲線下の表面積の分析によって、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシラン画分の相対的な量および平均ＤＰを計算する工程。
【００２４】
本発明は、以下に記載される例示的な実施形態によってさらに説明される。
例示的な実施形態
［実施例］
実施例１：＞４の平均ＤＰを有しているＸＯＳ／ＡＸＯＳの調製
材料および方法
Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ。キシロビオース、キシロトリオース、およびキシロテトラオースから主に構成される市販されているキシロオリゴ糖調製物Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐは、Ｓｕｎｔｏｒｙ Ｌｔｄ．（東京、日本）から入手した。
【００２５】
小麦ふすまからの水で抽出できないアラビノキシランの調製。ふすまの水で抽出できないアラビノキシラン（ＷＵ−ＡＸ）の調製のために、市販されている小麦ふすま（Ｍｅｎｅｂａ Ｍｅｅｌ ＢＶ，ロッテルダム、オランダ）を出発材料として使用した。アラビノキシラン以外の材料は、Ｍａｅｓら（２００４）に記載されている方法にしたがって、酵素処理によってふすまから部分的に除去した。小麦ふすまの水への懸濁液（１：７ｗ／ｖ）を、熱安定性α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ １２０ＬＳ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；１μｌ／ｇの小麦ふすま）で９０℃で９０分間処理して、デンプンを加水分解させた。５０℃に冷却した後、懸濁液のｐＨを濃ＨＣｌを使用して６．０に調整し、懸濁液をプロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ ０．８Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；１５０μｌ／ｇの小麦ふすま）と共に５０℃で２４時間インキュベートして、残っているタンパク質を加水分解した。その後、懸濁液を沸騰させて濾過し、濾液を廃棄した。残渣（「ふすまＷＵ−ＡＸ」と呼ぶ）を水で洗浄し、風乾させた。
【００２６】
小麦粉または小麦スキージデンプンからの水では抽出できないアラビノキシランの調製。小麦粉は、標準的な方法（ＭｃＲｉｔｃｈｉｅ，１９８５）を使用して４つの異なる画分に分画することができる：Ａ−デンプン（主要なデンプン）、Ｂ−デンプン（スキージデンプンまたはくず）、グルテン、および水溶性画分。ＷＵ−ＡＸはスキージデンプン画
分の中に濃縮される。アラビノキシラン以外の物質は、酵素処理によってスキージ画分から部分的に除去した。スキージデンプンの水への懸濁液（１：６ｗ／ｖ）を、最初に、熱安定性α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ １２０ＬＳ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；３０μｌ／ｇスキージデンプン）で９０℃で６０分間、そしてアミログルコシダーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ブレー、アイルランド，２０μｌ／ｇスキージデンプン）で６０℃で１６時間処理して、デンプンを加水分解させた。３０分間沸騰させて遠心分離した後、残渣をプロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ ０．８Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク，２０μｌ／ｇスキージデンプン）と共に５０℃で２０時間インキュベートして、残っているタンパク質を加水分解した。その後、懸濁液を再び沸騰させて（３０分間）、濾過し、そして濾液を廃棄した。残渣（「小麦粉ＷＵ−ＡＸ」と呼ぶ）を水、エタノール（９５％ｖ／ｖ）で洗浄し、風乾させた。小麦デンプンからＷＵ−ＡＸを抽出するのではなく、ＷＵ−ＡＸはまた、小麦スキージデンプンから直接単離することもできる。この場合、産業的なデンプン−グルテン分離プロセスの市販されている副流であるＭｅｒｉｔｅｎａ ２３３（Ｔａｔｅ ＆ Ｌｙｌｅ，アールスト、ベルギー）を、出発材料として使用した。水中のＭｅｒｉｔｅｎａ ２３３の懸濁液（１：５ｗ／ｖ）を、続いて、熱安定性α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ １２０ＬＳ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；３０μｌ／ｇのＭｅｒｉｔｅｎａ ２３３）で９０度で６０分間、そしてアミログルコシダーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ブレー、アイルランド；２０μｌ／ｇ Ｍｅｒｉｔｅｎａ ２３３）で６０度で１６時間処理して、デンプンを加水分解させた。３０分間の沸騰と遠心分離の後、残渣をプロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ ０．８Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；２０μｌ／ｇのＭｅｒｉｔｅｎａ ２３３）とともに５０℃で２０時間インキュベートして、残っているタンパク質を加水分解させた。その後、懸濁液を再び沸騰させ（３０分間）、濾過し、そして濾液を廃棄した。残渣を「スキージＷＵ−ＡＸ」と呼び、これを水、エタノール（９５％ｖ／ｖ）で洗浄し、風乾させた。
【００２７】
小麦ペントサン濃縮物（Ｗｈｅａｔ Ｐｅｎｔｏｓａｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ：ＷＰＣ）。小麦ペントサン濃縮物（ＷＰＣ、Ｐｆｅｉｆｅｒ ＆ Ｌａｎｇｅｎ，ドルマーゲン、ドイツ）は小麦粉に由来し、その化学的組成は、Ｃｏｕｒｔｉｎ ａｎｄ Ｄｅｌｃｏｕｒ（１９９８）によって詳細に記載されている。ＷＰＣは水で抽出することができるアラビノキシラン（ｃａ．４３％）とタンパク質物質（ｃａ．３０％）とを多く含む。残りの部分は主に、アラビノガラクタンペプチド（ｃａ．１４％）と、それより少ない程度の重合体グルコース（６％）から構成される。
【００２８】
１２２のａｖＤＰと、０．６６のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−１２２−０．６６）の調製。ＡＸＯＳ−１２２−０．６６の調製のための出発材料は市販の小麦ペントサン濃縮物（ＷＰＣ，Ｐｆｅｉｆｅｒ ＆ Ｌａｎｇｅｎ，ドルマーゲン、ドイツ）であった。ＷＰＣを脱イオン水に溶解させ（１：１０ｗ／ｖ）、そしてシリカを水性懸濁液（２０％ｗ／ｖ）として、シリカ／タンパク質の比が７：１になるまで添加した。シリカへのタンパク質の最大吸着を得るために、混合物のｐＨを０．１ＭのＨＣｌを使用して４．８に調整した。３０分の攪拌の後、懸濁液をブフナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）濾過した。シリカ／タンパク質を含む残渣を廃棄し、一方、濾液はエタノール沈殿させた。エタノール（９５％ｖ／ｖ）を連続攪拌下で添加して、６５％（ｖ／ｖ）の最終濃度とし、さらに３０分間の攪拌の後、落ち着かせ（２４時間、４℃）、そして濾過した。得られた残渣は、溶媒を乾燥させ（エタノール、アセトン、およびジエチルエーテル）、そして風乾させた。得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００２９】
１６のａｖＤＰと、０．７８のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−１６−０．７８）の調製。ＡＸＯＳ−１６−０．７８を、市販の小麦ペントサン濃縮物（ＷＰＣ，Ｐｆｅｉｆｅｒ ＆ Ｌａｎｇｅｎ，ドルマーゲン、ドイツ）から出発して調製した。ＡＸ
ＯＳ−１２２−０．６６の調製について記載したように、タンパク質を除去するためにＷＰＣをシリカで処理した。回収した濾液を、小麦ペントサン濃縮物１ｇあたり２９単位のアスペルギルス・アクリエート（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）由来のエンドキシラナーゼであるＸＡＡ（Ｓｈｅａｒｚｙｍｅ ５００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク）とともに３０℃で２４時間、さらにインキュベートした。沸騰（３０分間）による酵素の不活化の後、得られた溶液を冷却し、エタノール沈殿を行った。エタノール（９５％ｖ／ｖ）を連続攪拌下で、最終濃度が８０％（ｖ／ｖ）になるように添加して、さらに３０分間の攪拌の後、落ち着かせ（２４時間、４℃）、そして濾過し、得られた残渣を脱イオン水に溶解させ、再びエタノール沈殿させた。エタノール（９５％ｖ／ｖ）を、連続攪拌下で、最終濃度が６５％（ｖ／ｖ）になるように添加して、さらに３０分間の攪拌の後、落ち着かせ（２４時間、４℃）、そして濾過した。沈殿した物質を除去した。残った上清を、エタノールを除去するために回転式エバポレーションし、脱イオン水に溶解させ、そして凍結乾燥させた。得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００３０】
７のａｖＤＰと、０．３４のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−７−０．３４）の調製。ＡＸＯＳ−７−０．３４の調製のための出発材料は、上記に記載したように単離したふすまＷＵ−ＡＸであった。続いて、ふすまＷＵ−ＡＸを、１ｇの乾燥した状態の単離したふすまＷＵ−ＡＸあたり８０単位のエンドキシラナーゼＸＢＳ（Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ Ｈ６４０，ダニスコ、デンマーク）とともに、３０℃で２４時間インキュベートした。濾過、および沸騰（３０分間）による酵素の不活化の後、濾液を凍結乾燥させ、そして得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００３１】
１５のａｖＤＰと、０．２７のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−１５−０．２７）の調製。市販の小麦ふすま（Ｄｏｓｓｃｈｅ Ｍｉｌｌｓ ＆ Ｂａｋｅｒｙ，デーンズ、ベルギー）をＡＸＯＳ−１５−０．２７の調製のための出発材料として使用した。小麦ふすまの水への懸濁液（１：７ｗ／ｖ）を、最初に、熱安定性α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ １２０ＬＳ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバーグ、デンマーク；１μｌ／ｇの小麦ふすま）で９０℃で９０分間処理して、デンプンを加水分解させた。５０℃に冷却した後、懸濁液のｐＨを濃ＨＣｌを使用して６．０に調整し、懸濁液をプロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ ０．８Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；４０μｌ／ｇの小麦ふすま）と共に５０℃で４時間インキュベートして、残っているタンパク質を加水分解した。その後、懸濁液を２０分間沸騰させて濾過し、濾液を廃棄した。残渣を水で洗浄し、脱イオン水に再懸濁させた（１：１４ｗ／ｖ）。懸濁液を、デンプンを除去し（ｄｅｓｔａｒｃｈｅｄ）そしてタンパク質を除去した（ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｓｅｄ）小麦ふすま１ｇあたり１．４単位のエンドキシラナーゼＸＢＳ（Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ
Ｈ６４０，ダニスコ、デンマーク）とともに、５０℃で１０時間、連続攪拌下でインキュベートし、デンプンを除去しそしてタンパク質を除去した小麦ふすま１ｇあたり１．１単位の、２回目の用量のエンドキシラナーゼＸＢＳの添加後、５０℃でさらに１０時間インキュベートした。沸騰（３０分間）による酵素の不活化の後、溶液を、薄膜降下式エバポレーターの中で２０％の乾燥物質となるまで濃縮させ、最後に噴霧乾燥機の中で乾燥させた。
【００３２】
８のａｖＤＰと、０．２７のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−８−０．２７）の調製。ＡＸＯＳ−８−０．２７は、ＡＸＯＳ−１５−０．２７の溶液（１：１０ｗ／ｖ）を、１ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７あたり１２５単位のアスペルギルス・アクリエート由来のエンドキシラナーゼであるＸＡＡ（Ｓｈｅａｒｚｙｍｅ ５００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク）とともに３０℃で１時間インキュベートすることによって調製した。沸騰（３０分間）による酵素の不活化の後、溶液を凍結乾燥させ、得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００３３】
３９のａｖＤＰと、０．２２のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−３９−０．２２）の調製。ＡＸＯＳ−３９−０．２２を、上記のＭｅｒｉｔｅｎａ ２３３ Ｂ−ｓｔａｒｃｈから単離した小麦スキージＷＵ−ＡＸから調製した。０．６３の平均Ａ／Ｘ比を有しているスキージＷＵ−ＡＸを２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）に３ｇ／ｌで懸濁させ、そして１ｇのスキージＷＵ−ＡＸあたり３．３単位のエンドキシラナーゼＸＢＳ（Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ Ｈ６４０，ダニスコ、デンマーク）とともに３０℃で２時間、連続攪拌下でインキュベートした。遠心分離（１０，０００ｇ、１５分間、１８℃）後、上清を３０分間沸騰させて酵素を不活化させ、一方、残渣は、先に記載した酢酸ナトリウム緩衝液（最初の容量の１／４）で洗浄した。洗浄水を不活化させ（３０分、１００℃）、そして上清と混合した。濾過後、得られた溶液を凍結乾燥させると、２６２のａｖＤＰＧＣと０．５０のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳが得られた。酵素を溶解させた物質をさらに脱イオン水に溶解させ（１：２０ｗ／ｖ）、ＨＣｌ（１Ｍ）の添加によって溶液のｐＨを２．８にした。この溶液を、ＡＸＯＳのβ−１，４−結合キシロースサブユニットよりも酸加水分解されやすいと思われるα−１，２−およびα−１，３−結合アラビノース置換基の大きな画分を除去するために、９０℃で２４時間インキュベートした。室温に冷却した後、溶液を１ＭのＮａＯＨの添加によって中和し、そして遠心分離した（１０，０００ｇ、２０分間、１８℃）。エタノール（９５％ｖ／ｖ）を、得られた上清に対して連続攪拌下で添加して、最終エタノール濃度を８０％（ｖ／ｖ）とした。混合物をさらに３０分間攪拌し、一晩４℃に保った。沈殿したＡＸＯＳ化合物を遠心分離（１０，０００ｇ、２０分間、４℃）によって回収し、脱イオン水中に溶解させ、凍結乾燥させ、そして得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００３４】
１３のａｖＤＰと、０．２１のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−１３−０．２１）の調製。ＡＸＯＳ−１３−０．２１は、ＡＸＯＳ−３９−０．２２の溶液（３ｇ／ｌ）を、１ｇのＡＸＯＳ−３９−０．２２あたり２７．７単位のアスペルギルス・アクリエート由来のエンドキシラナーゼであるＸＡＡ（Ｓｈｅａｒｚｙｍｅ ５００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバーグ、デンマーク）とともに３０℃で２時間インキュベートすることによって調製した。沸騰（３０分間）による酵素の不活化の後、溶液を凍結乾燥させ、そして得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００３５】
単離した調製物の特性決定
種々の技術を使用してオリゴ糖調製物を特性決定した。
【００３６】
全糖含有量および還元末端糖含有量を、Ｃｏｕｒｔｉｎら（２０００）に記載されているように、気体−液体クロマトグラフィー分析によって決定した。試料のアラビノキシラン（ＡＸ）含有量を、０．８８ｘ（％アラビノース＋％キシロース）として表した。気体−液体クロマトグラフィーによって決定したＡＸＯＳの平均重合度（ａｖＤＰＧＣ）を、還元末端キシロース含有量で割り算した全キシロース含有量と全アラビノース含有量の和として計算した。試料のタンパク質含有量（Ｎ×５．７）を、デュマ法（Ｄｕｍａｓ ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ＡＯＡＣ公式方法（ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ
Ｍｅｔｈｏｄ（１９９５））の採用によって決定した。
【００３７】
調製物中の構成オリゴ糖のプロファイリングを、ＥＤ−４０電気化学的検出器、ＧＰ−５０勾配ポンプ、およびＡＳ−３５００自動サンプリング装置を備えたＤｉｏｎｅｘ ＤＸ−５００クロマトグラフィーシステム（サニーベール、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、パルスアンペロメトリック検出を用いる高速陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｐｕｌｓｅｄ Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ））によって行った。試料（１０ｍｇ）を精製した脱イオン水（２ｍｌ、比
抵抗率１８ｍΩ−ｃｍ）に溶解させ、濾過し、そしてＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ−１００陰イオン交換カラム（４×２５０ｍｍ）に取り付けたＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ−１００ガードカラム（４×２５ｍｍ）に注入（２５μｌ）した。溶出（１．０ｍｌ／分）を、３０分間の１００ｍＭのＮａＯＨ中の０から２５０ｍＭの酢酸ナトリウムの直線勾配によって、その後に、１５分間の１００ｍＭのＮａＯＨ中の２５０から４００ｍＭの酢酸ナトリウムの直線勾配で行った。勾配の後、カラムを、１００ｍＭのＮａＯＨで５分間溶出させた。溶出液を、電位および時間についての以下の設定を含むパルスアンペロメトリック検出形式で、ＥＤ−４０検出器を使用してモニターした：Ｅ１＋０．０５Ｖ（ｔ１＝４００ｍｓ）；Ｅ２＋０．７５Ｖ（ｔ２＝２００ｍｓ）；Ｅ３−０．１５Ｖ（ｔ３＝４００ｍｓ）。アラビノース（Ａ）、キシロース（Ｘ１）、キシロビオース（Ｘ２）、および３から６のＤＰを有しているＸＯＳ（Ｘ３からＸ６）を参照として使用した。
【００３８】
高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を、自動注入器を備えたＨＰＬＣシステム（Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，３２５ポンプシステム，Ｋｏｎｔｒｏｎ，ミラノ、イタリア）で行った。全ての調製物を０．３％の塩化ナトリウム（１．５ｍｌ）に溶解させ、濾過し、そしてＳｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０６ ＨＱ ＨＰＳＥＣカラム（３００×８ｍｍ、分離範囲：１×１０２〜２０×１０６Ｄａ）に取り付けたＳｈｏｄｅｘ ＳＢ−８００Ｐガードカラム（Ｓｈｏｗａ，Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，東京、日本、５０×６ｍｍ）に注入（２０μｌ）した。溶出は０．３％の塩化ナトリウム（０．５ｍｌ／分；３０℃）で行い、屈折率検出装置（ＶＤＳ Ｏｐｔｉｌａｂ，ベルリン、ドイツ）を用いてモニターした。分子量マーカーは、７８．８×１０４、４０．４×１０４、２１．２×１０４、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、０．５９×１０４Ｄａの分子量を有しているＳｈｏｄｅｘ標準Ｐ−８２プルラン（２．０ｍｇ／ｍｌ）と、１８０Ｄａの分子量を有しているグルコースであった。高速サイズ排除クロマトグラフィー（ａｖＤＰＨＰＳＥＣ）によって決定したオリゴ糖の平均重合度（ａｖＤＰ）をＭＭＨＰＳＥＣ／１３２として計算した。
【００３９】
キシラン分解酵素の活性の決定。キシラン分解酵素の活性を、アッセイについての製造業者の説明書にしたがって不溶性物質としてキシラザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ブレー、アイルランド）を使用して比色によって測定した。１単位は、アッセイ条件下で５９０ｎｍで１．０の消光の変化を生じるために必要な酵素の量と定義した。
【００４０】
結果および考察
様々なタイプのＡＸＯＳを、材料および方法に記載したように、小麦ふすま、小麦粉、または小麦スキージデンプンのいずれかから調製した。様々な調製物の特性を、アラビノキシラン含有量、平均置換度（キシロースに対するアラビノースの比）、および平均重合度に関して表１に示す。ここでは、これらを、既知の前生物学的特性を有している市販されているＸＯＳ調製物であるＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９７；Ｈｓｕら、２００４）の特性と比較した。表１と本明細書中に後で使用した命名法にしたがって、ＡＸＯＳ調製物をＡＸＯＳ−ｘ−ｙと呼ぶ。ここでは、ｘは気体−液体クロマトグラフィーによって決定した平均重合度であり、ｙはキシロースに対するアラビノースの比である。様々な調製物は、７から１２２までの範囲の平均重合度（Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐについての２と比較）、および０．２１から０．７８までの範囲の置換度（Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐについての０．０９と比較）を有していた。小麦ふすまに由来する調製物（ＡＸＯＳ−７−０．３４、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、ＡＸＯＳ−８−０．２７）は、小麦粉に由来する調製物（ＡＸＯＳ−１２２−０．６６、ＡＸＯＳ−１６−０．７８）よりも低い置換度を有していた。本発明者らはまた、ＡＸＯＳ化合物の置換度を酸での処理によって低下させることができることも示した。実際、ＡＸＯＳ−３９−０．２２は、酸での処理を含む種々の工程によってスキージＷＵ−ＡＸから調製し（材料および方法を参照のこと）、そしてこれによって、平均置換度は、スキージＷＵ−ＡＸの０
．６３からＡＸＯＳ−３９−０．２２の０．２２にまで低下する。
【００４１】
図２は、ＨＰＳＥＣによって決定した種々のＡＸＯＳ調製物の分子量分布を示す。全てのＡＸＯＳ調製物は多分散性であり、そして気体−液体クロマトグラフィーによって決定すると、ａｖＤＰに近い状態のピークを有している分子的実体から構成されていた。ＨＰＳＥＣ溶出プロフィールから決定した、そのオリゴ糖の９０％がその中に入る重合度の範囲を、様々なＡＸＯＳ調製物について表１に提供する。
【００４２】
実施例２：ＸＯＳ／ＡＸＯＳ調製物の物理化学的特性および感覚的特性
材料および方法
オリゴ糖調製物。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、ＡＸＯＳ−３９−０．２２、およびＡＸＯＳ−１３−０．２１は、実施例１の材料および方法に記載したように入手した。フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）調製物は市販されている製品Ｒａｆｔｉｌｏｓｅ（Ｏｒａｆｔｉ，チーネン、ベルギー）であった。感覚的分析に使用したＡＸＯＳ−１５−０．２７を最初に水に溶解（１：２５ｗ／ｖ）させ、活性炭素で処理して、生産プロセスに起因する起こりうるオフフレーバを除去した。ＡＸＯＳ−１５−０．２７と活性炭素（０．７５ｇ／ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７）の懸濁液を１８℃で１時間攪拌し、デカンテーションの後、活性炭素を遠心分離（１００００ｇ、３０分間、１８℃）によって除去した。
【００４３】
安定性の測定。安定性の測定は、オリゴ糖調製物の水で抽出することができる部分について行った。これは、脱イオン水中への調製物の懸濁（１：１０ｗ／ｖ）、その後の震盪（２時間、１８℃）、遠心分離（１０，０００ｇ、２０分間、１８℃）、および濾過によって得た。濾過物の凍結乾燥の後、水で抽出することができる試料を、２、３、７、および１１のｐＨ値を有している共通の緩衝液に溶解させると、０．１５％（ｗ／ｖ）のオリゴ糖濃度を有する溶液が得られた。共通の緩衝液は、水（１．０Ｌ）中の６．０ｇのクエン酸、３．９ｇのリン酸二水素カリウム、１．８ｇのホウ酸、および５．８ｇのジエチルバルビツール酸のストック溶液から調製した（Ｂｒｉｔｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｆｏｒｄ，１９３７）。このストック溶液のアリコート（２０ｍｌ）を、２．０ＭのＨＣｌまたは２．０ＭのＮａＯＨのいずれかで調整して、所望されるｐＨとした。オリゴ糖溶液のそれぞれを、様々な時間の間（０、５、１０、１５、２０、３０、および６０分間）、沸騰水の中に維持した。その後、溶液を冷却し、全単糖含有量および還元末端糖含有量を、実施例１の材料および方法に記載したように、気体−液体クロマトグラフィーによって測定した。ＦＯＳの分解の割合を式（１）を用いて計算し、一方、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５ＰおよびＡＸＯＳ−１５−０．２７の分解の割合を式（２）を用いて計算した。ＦＯＳの加水分解の割合、ならびに、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５ＰおよびＡＸＯＳ−１５−０．２７の加水分解の割合を、それぞれ、式（３）および（４）を用いて計算した。
【００４４】
（１）％分解＝（時間０およびｐＨ７での全グルコース＋マンノース濃度）−（全グルコース＋マンノース濃度）／（時間０およびｐＨ７での全グルコース＋マンノース濃度）
（２）％分解＝（時間０およびｐＨ７での全キシロース＋アラビノース濃度）−（全キシロース＋アラビノース濃度）／（時間０およびｐＨ７での全キシロース＋アラビノース濃度）
（３）％分解＝（還元グルコース＋マンノース濃度）−（時間０およびｐＨ７での還元グルコース＋マンノース濃度）／（溶液中に存在し得る還元グルコース＋マンノースの最大量）
（４）％分解＝（還元キシロース＋アラビノース濃度）−（時間０およびｐＨ７での還元キシロース＋アラビノース濃度）／（溶液中に存在し得る還元キシロース＋アラビノースの最大量）
ＡＸＯＳ−１５−０．２７中の加水分解されたキシロースおよびアラビノース結合の割
合は、それぞれ、式（５）および（６）によって計算した。
【００４５】
（５）％キシロースの加水分解＝（還元キシロース濃度）−（時間０およびｐＨ７での還元キシロース濃度）／（溶液中に存在し得る還元キシロースの最大量）
（６）％アラビノースの加水分解＝（還元アラビノース濃度）−（時間０およびｐＨ７での還元アラビノース濃度）／（溶液中に存在し得る還元アラビノースの最大量）
感覚的分析。感覚的分析は、１度に最大１０人のボランティアを含むセッションにおいて隔離室で行った。被験体には、セッションの前に少なくとも１時間の間、飲食をやめるように求めた。被験体を最初に手順に慣れさせ、その後、精製した脱イオン水（比抵抗率１８ｍΩ−ｃｍ）の中に調製した様々な濃度のＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、スクロース（対照の甘味の刺激）、塩化ナトリウム（対照の塩味の刺激）、およびアスコルビン酸（対照の酸味の刺激）を有しているコード化した試料を味わうように求めた。最も高濃度の各化合物を含む溶液を８と番号付けし、そして最も低濃度を１と番号付けした（表２）。被験体には、濃度を増大させるために、１つの化合物の濃度範囲の全てを連続して味わうように求めたが、個々の個体に様々な化合物を提示する順番はランダムにした。一連の濃度の化合物を味わう前に、口を、最初は精製した脱イオン水（比抵抗率１８ｍΩ−ｃｍ）で２回、その後、５ｍｌのそれぞれの試験溶液を、使い捨ての注射器で被験体の口に入れ、およそ５秒間、口の中でグルグル回させ、その後、嚥下させた。参加者に、化合物を甘い、塩辛い、または酸っぱいと認識できた最低濃度（個々の認識閾）を示すように求めた。被験体の半数が特定の化合物の正確な味を認識した濃度として決定した平均の味覚認識閾を、全部で２０人から得た個々の認識閾についてのデータを用いて計算した。
【００４６】
粘性の測定。粘性の測定は、オリゴ糖調製物の水で抽出できる部分について行った。これは、水中への調製物の懸濁（１：１０ｗ／ｖ）、その後の震盪（２時間、１８℃）、遠心分離（１０，０００ｇ、２０分間、１８℃）、および濾過によって得た。濾過物の凍結乾燥の後、５．０％（ｗ／ｖ）の溶液の粘性を、Ｖｉｎｋｘら（１９９１）にしたがって、３０℃で、Ｏｓｔｗａｌｄ型粘度計（毛細管粘度計（Ｃａｐｐｉｌｌａｒｙ Ｖｉｓｃｏｓｉｍｅｔｅｒ），Ｓｃｈｏｔｔ Ｇｅｒａｅｔｅ，５０９０４型）を用いて測定した。溶液の粘性の測定は３連で行い、それぞれのオリゴ糖溶液についてのフロー時間を同じ実験条件下での脱イオン水のフロー時間で割り算することによって、脱イオン水の粘度に対して相対的に（ηｒｅｌ）表した。比粘度（ηｓｐ＝ηｒｅｌ−１）の計算の後、見かけの固有粘度（［ηａｐｐ］、ｄｌ／ｇ）を、式（７）に示したＭｏｒｒｉｓ方程式（Ｍｏｒｒｉｓ，１９８４）を使用して決定した。ここでは、オリゴ糖だけが溶液の粘性特性に寄与すると仮定して、ｃ（ｍｇ／ｍｌとして表す）はオリゴ糖濃度を示す。個々の分析の後、粘度計を脱イオン水で２回、９５％のエタノールで２回、アセトンで１回、そしてジエチルエーテルで１回すすぎ、その後、圧縮空気で乾燥させた。
【００４７】
【数１】
【００４８】
結果および考察
ＡＸＯＳ−１５−０．２７のｐＨ安定性を、確立されている前生物学的化合物であるフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ，市販されている製品Ｒａｆｔｉｌｏｓｅ）とキシロオリゴ糖（ＸＯＳ，市販されている製品Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ）のｐＨ安定性とを比較した。様々なオリゴ糖を、様々な時間の間、１００℃で様々なｐＨ値（ｐＨ２、３、７、および
１１）で維持した。分解の割合を、構成要素である単糖の含有量の減少を測定することによって決定し、そして加水分解の割合を、構成要素である還元単糖の量の増加を測定することによって決定した。図３に示すように、低いｐＨまたは中性のｐＨ（ｐＨ２、３、または７）では実質的な分解を受けたオリゴ糖はなかった。一方、試験した３つのオリゴ糖のすべてについて、アルカリｐＨ（ｐＨ１１）では分解が観察された。この効果は、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐについては最も顕著であり、６０分後にはその７３％が分解された。アルカリに対して最も安定であったのはＡＸＯＳ−１５−０．２７であった（図３）。アルカリｐＨで観察された分解は、アルカリによる剥離（ａｌｋａｌｉ ｐｅｅｌｉｎｇ）として知られており、これは、高温（６０〜１００℃）で起こり、そしてオリゴ糖の還元末端から進行する（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ ａｎｄ ＢｅＭｉｌｌｅｒ，１９５８；Ｓａｎｔｏｒｉら、２００３）。
【００４９】
試験した３つのオリゴ糖のうち、ＦＯＳは、明らかに、低いｐＨで最も加水分解を受けやすかった（図４）。ｐＨ２および３では、ＦＯＳの５８％および５３％が、６０分後に加水分解された。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５ＰおよびＡＸＯＳ−１５−０．２７は、ｐＨ２で同等レベルの加水分解を示した。しかし、ＡＸＯＳ−１５−０．２７は、ｐＨ３ではＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐよりも安定であり、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐについての６％に対して、ＡＸＯＳ−１５−０．２７についてはわずかに２％しか加水分解されなかった（図４）。低いｐＨでのＡＸＯＳ−１５−０．２７の加水分解についてのさらなる研究によって、アラビノース結合がキシロース結合よりも酸による加水分解に対してより敏感であることが明らかになった。実際、ＡＸＯＳ−１５−０．２７の、ｐＨ２、１００℃での６０分間のインキュベーションによっては、全てのアラビノース結合の５４％の加水分解が生じたのに対して、これらの条件ではキシロース結合はわずか４％しか加水分解されなかった（図５）。
【００５０】
Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐのような低いＤＰを有しているキシロオリゴ糖は、スクロースの約４０％の甘さの甘味を示すことが報告されている（Ｓｕｎｔｏｒｙ，キシロオリゴ糖、パンフレットおよび製品説明書、２００１）。重合度の高いアラビノキシロオリゴ糖の味の特性については、これまでのところ知られていない。２０人からなる味覚のパネルを用いて、本発明者らは、ＡＸＯＳ−１５−０．２７およびＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐの味認識閾を決定した。試験試料にはまた、甘味、塩味、および酸味の代表として、それぞれ、スクロース、塩化ナトリウム、およびアスコルビン酸も含めた。被験体には、試験化合物のそれぞれの濃度の系列について、化合物を甘い、塩辛い、または酸っぱいと認識した濃度を示すように求めた。試験した最大濃度（７１．５ｇ／ｌ）のＡＸＯＳ−１５−０．２７については、味覚のパネルのわずか１５％しか甘いと示さず、塩味または酸味を示した被験体はなかった。スクロースおよびＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐの甘味についての平均の味覚認識閾は、それぞれ、７ｇ／Ｌおよび２４ｇ／Ｌであったが、ＡＸＯＳ−１５−０．２７についての平均の味覚認識閾は、７１．５ｇ／Ｌよりも高かった。したがって、ＡＸＯＳ−１５−０．２７はスクロースよりも１０倍以上甘味が少なく、そしてスクロースよりもおよそ３倍甘味が少ないＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐよりも３倍以上甘味が少ない。
【００５１】
ＡＸＯＳ−１５−２７、ＡＸＯＳ−３９−０．２２、およびＡＸＯＳ−１３−０．２１について粘度を決定し、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ、市販されている製品Ｒａｆｔｉｌｏｓｅ）およびキシロオリゴ糖（ＸＯＳ、市販されている製品Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ）の粘性と比較した。表３に示したように、様々なＡＸＯＳ調製物は、ＦＯＳおよびＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐと比較して３倍から１０倍高い、高い見かけの固有粘性を有している。
【００５２】
実施例３
限外濾過によるＡＸＯＳ調製物の分画
材料および方法
ＡＸＯＳの調製。スキージＷＵ−ＡＸは、実施例１の材料および方法に記載したように調製した。スキージＷＵ−ＡＸを酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．７）に３ｇ／ｌで懸濁させ、１ｇのスキージＷＵ−ＡＸあたり１８．４Ｕの、アスペルギルス・アクリエート由来のエンドキシラナーゼであるＸＡＡ（Ｓｈｅａｒｚｙｍｅ ５００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク）とともに、３０℃で４時間インキュベートした。沸騰（３０分間）による酵素の不活化、およびその後の懸濁液の濾過の後、ＡＸＯＳは濾液の中に回収された。
【００５３】
限外濾過によるＡＸＯＳの分離。ＡＸＯＳを端末「ＨＰ４７５０攪拌セル」限外濾過装置（ｄｅａｄ−ｅｎｄ ‘ＨＰ４７５０ ｓｔｉｒｒｅｄ ｃｅｌｌ’ ｕｌｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）（Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ケント、米国）において分画した。使用した限外濾過膜は、５ｋＤａ（Ｐ００５Ｆ、Ｃｅｌｇａｒｄ，ウィースバーデン、ドイツ）、１０ｋＤａ（ＰＥＳ−１０，Ｓｙｎｄｅｒ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ヴァルカビル、ＣＡ、米国）、または３０ｋＤａ（ＰＥＳ−０３０Ｈ，Ｃｅｌｇａｒｄ）のいずれかの分子量カットオフ（ＭＭＣＯ）を有していた。膜表面での濃度分極は、セル内の中央に配置された、７００ｒｐｍの攪拌速度を有しているテフロン（登録商標）コーティングされた磁気攪拌棒の機構によって最小にした。圧力源は圧縮窒素ガスシリンダであった。圧力は圧力調節装置によって制御し、全ての濾過実験は、室温で４ｂａｒの定圧で行った。端末限外濾過セルに分画される３００ｍｌの溶液を充填し、およそ２００ｍｌの浸透液の全容量が回収された時点で、濾過を停止した。
【００５４】
単離された調製物の特性決定。実施例１の材料および方法を参照のこと。高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）は、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０２．５ ＨＱ ＨＰＳＥＣカラム（Ｓｈｏｗａ，Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，東京、日本、３００×８ｍｍ、分離範囲：１×１０２〜１×１０４Ｄａ）を使用したことを除いて、実施例１の材料および方法に記載したように行った。分子量マーカーは、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、および０．５９×１０３Ｄａの分子量を有しているＳｈｏｄｅｘ標準Ｐ−８２プルラン（２．０ｍｇ／ｍｌ）、８１０（ＤＰ６）、６７８（ＤＰ５）、５４６（ＤＰ４）、４１４（ＤＰ３）、および２８２Ｄａ（ＤＰ２）の分子量を有しているキシロオリゴ糖標準物、ならびに１８０Ｄａの分子量を有しているグルコースであった。
【００５５】
結果および考察
ＡＸＯＳ調製物中での甘味と代謝性の低分子量オリゴ糖の存在は、食品用の成分としての特定の用途には望ましくない場合があるが、他の用途については、主に低分子量のオリゴ糖から構成される甘味のあるＡＸＯＳ調製物を使用することが所望される。この理由から、２〜３のＤＰを有しているＡＸＯＳ／ＸＯＳが、より高いＤＰを有しているＡＸＯＳから分離されるようにＡＸＯＳ調製物を分画することができる方法を開発することが有効である。アラビノキシランの分画は、これまでは必ず、種々の濃度のアルコール溶液での沈殿によって行われてきた（Ｃｏｕｒｔｉｎ ａｎｄ Ｄｅｌｃｏｕｒ，１９９８）。しかし、産業的な規模でアルコール沈殿を行うことは技術的に、そして経済的にも厄介である。したがって、限外濾過によって酵素によって生産されたＡＸＯＳをさらに分画することの実現可能性が研究された。
【００５６】
一例として、スキージＷＵ−ＡＸをＸＡＡ（１８．４Ｕ／ｇ）とともに３０℃で４時間インキュベートすることによって調製したＡＸＯＳを、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、または３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＭＣＯ）を有している膜を使用して限外濾過した。
【００５７】
５ｋＤａの膜を使用した場合には、浸透画分（ＰＥＲ５ｋＤａ）のＨＰＳＥＣプロフィール（図７ａ）は、主に、大きさでキシロビオース（ＤＰ２）およびキシロトリオース（ＤＰ３）に相当するオリゴ糖を示した。ＡＸＯＳストック溶液中の可溶性アラビノキシランを８６％含む保持画分（ＲＥＴ５ｋＤａ）（表４）は、ＤＰ２およびＤＰ３を有しているオリゴ糖の量がおよそ半分に減少したことを除いて、基本的には、限外濾過の前のＡＸＯＳ調製物と同じ分子量プロフィールを示す（図７ａ）。ＲＥＴ５ｋＤａ画分中の低いＤＰを有しているオリゴ糖の不完全な除去は、おそらく、高分子量の成分の存在によって引き起こされる浸透による移動の減少の結果としてのそれらの保持によって生じている。
【００５８】
１０ｋＤａの膜を使用した限外濾過によっては、アラビノキシラン含有量の３４％が、浸透画分中に回収され、一方、６５％が浸透画分の中に保持された（表４）。浸透画分（ＰＥＲ１０ｋＤａ）には、主に、ＤＰ２からＤＰ６を有しているオリゴ糖が含まれていた。保持画分（ＲＥＴ１０ｋＤａ）は、２〜４のＤＰを有している小さい大きさのオリゴ糖を低いレベルで有しており、主に、７００から＞１１０，０００Ｄａまで（ＤＰ５からＤＰ＞８５０まで）の範囲の分子量を有しているオリゴ糖から構成されていた（図７ｂ）。ＰＥＲ１０ｋＤａ画分と比較すると、３０ｋＤａの膜を用いて得られた浸透液（ＰＥＲ３０ｋＤａ）は、１０００から１０，０００Ｄａの範囲のオリゴ糖を高い含有量で有していた。対応して、３０ｋＤａ膜の保持画分（ＲＥＴ３０ｋＤａ）は、ＲＥＴ１０ｋＤａと比較すると１０００から１０，０００Ｄａの範囲のオリゴ糖の含有量は少なかったが、驚くべきことに、ＤＰ２およびＤＰ３オリゴ糖の含有量は、ＲＥＴ１０ｋＤａの中よりもＲＥＴ３０ｋＤａの中において高かった。
【００５９】
表４から、限外濾過が得られたＡＸＯＳ画分のＡ／Ｘ比に影響を与えることが明らかである。浸透画分（ＰＥＲ５ｋＤａ、ＰＥＲ１０ｋＤａ、およびＰＥＲ３０ｋＤａ）は、比較的低いＡ／Ｘ比を有しているオリゴ糖を多く含み、一方、保持画分（ＲＥＴ５ｋＤａ、ＲＥＴ１０ｋＤａ、およびＲＥＴ３０ｋＤａ）には、より高いＡ／Ｘ比を有している成分が含まれていた。
【００６０】
限外濾過によるＡＸＯＳのさらなる分画の可能性を評価するために、ＲＥＴ１０ｋＤａ画分を、３０ｋＤａのＭＭＣＯを有している膜を使用した２回目の限外濾過プロセスに供した。３０ｋＤａのＭＭＣＯを有している膜を介したＲＥＴ１０ｋＤａ画分の限外濾過後に得られた浸透画分（ＰＥＲ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ）および保持画分（ＲＥＴ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ）のＨＰＳＥＣプロフィールを、ＰＥＲ１０ｋＤａ画分と一緒に図８に示す。
【００６１】
ＲＥＴ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ画分には、主に、高分子量の成分（＞２０，０００Ｄａ）が含まれており、これは、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０２．５ ＨＱカラムの空隙容量に見られた。ＰＥＲ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ画分は、ＡＸＯＳストック溶液中のアラビノキシランのおよそ２５％を示し（表５）、主に、これは７００から１０，０００Ｄａまで（ＤＰ５から７５）の範囲の分子量を有している中程度の大きさのオリゴ糖から構成されていた（図８）。
【００６２】
これらの結果は、限外濾過（好ましくは、１０ｋＤａのＭＭＣＯを有している膜を使用する）を、限外濾過の浸透液を利用することによって２〜６のＤＰを有しているオリゴ糖の高い含有量、または限外濾過の保持物を利用することによって、＞４のＤＰを有しているオリゴ糖の高い含有量と２〜４のＤＰを有しているオリゴ糖の低い含有量のいずれかを有しているＡＸＯＳ調製物を作製するための方法として使用することができることを示している。連続する限外濾過（好ましくは、１０ｋＤａの膜の保持物を使用し、そして、３０ｋＤａ膜を通過させる）を使用すると、５〜７５までのＤＰの範囲のＡＸＯＳを多く含むＡＸＯＳ画分を得ることができる。
【００６３】
実施例４：ニワトリの腸に対するＡＸＯＳ調製物の効果
材料および方法
オリゴ糖調製物。実施例１の材料および方法を参照のこと。
【００６４】
プレートを計数することによる微生物学的分析。ニワトリの盲腸の内容物の重さを測定し、滅菌のペプトン生理食塩溶液（ＰＰＳＳ；０．１％のバクトペプトン、０．８５％のＮａＣｌ）に１：１０に稀釈し、ストマッカでホモジナイズし、さらに、１０倍稀釈手順にしたがってＰＰＳＳ中にさらに稀釈した。その後、適切な稀釈液を、腸内細菌科の計数のためには、バイオレットレッド胆汁ブドウ糖寒天培地（Ｖｉｏｌｅｔ Ｒｅｄ Ｂｉｌｅ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ａｇａｒ（ＶＲＢＧ；Ｏｘｆｏｒｄ ＣＭ０４８５Ｂ，ベージングストーク、英国））上に、そしてビフィズス菌については、氷酢酸（１ｍｌ／ｌ）とムピロシン（１００ｍｇ／ｌ）の添加によって改変したウィルキンス−チャルグレンアナエロブ寒天（Ｗｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ ａｎａｅｒｏｂｅ ａｇａｒ）（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ６１９）上に、混釈平板技術を使用してプレートした。後者の改変によっては、ウィルキンス−チャルグレン寒天のビフィズス菌についての選択性が増強され、そして改変されたウィルキンス−チャルグレン寒天は、ニワトリの盲腸の中のビフィズス菌の数の１工程での決定に特に適していることが示された（Ｒａｄａら、１９９９；Ｒａｄａ ａｎｄ Ｐｅｔｒ，２０００）。コロニーは、腸内細菌科については３７℃での１日の好気的なインキュベーションの後で、そしてビフィズス菌については３７℃で４日間の嫌気的なインキュベーション（Ｏｘｏｉｄ ａｎａｅｒｏｇｅｎ ｓｙｓｔｅｍ ＡＮ００２５Ａを備えた嫌気性のジャーの中）の後で、計数した。数は、盲腸の内容物１ｇあたりとして表した。いくつかの予防策を、試料の調製の間の酸素に対するビフィズス菌の暴露を最小にするために行った：（ｉ）盲腸の内容物を試料の調製を始める直前に盲腸から取り出した；（ｉｉ）稀釈剤と寒天は、溶存酸素を除去するために使用の直前にオートクレーブしたかまたは沸騰させた；（ｉｉｉ）ビフィズス菌の計数のためのプレートは試料の調製開始から２時間以内に嫌気条件下に置いた。
【００６５】
定量的ＰＣＲによる微生物学的分析。ＤＮＡの抽出を、ＰＰＳＳ中に１：５稀釈した盲腸の試料について、Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｅｌｅら（２００４）に記載されているように行った。増幅は、蓋（ｏｐｔｉｃａｌｃａｐ）が備わっているＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェル反応プレート（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の中で、供給業者（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｉｅｕｗｅｒｋｅｒｋ
ａ／ｄ Ｉｊｓｓｅｌ，オランダ）によって記載されているように、サイバーグリーンＰＣＲコア試薬（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）とともに供給された緩衝液を使用することによって、２５μｌの反応物の混合物中で行った。正方向プライマーと逆方向プライマー（それぞれ、ＢＩＦ１６４ｆおよびＢＩＦ１６３ｒ（Ｓａｔｏｋａｒｉら、２００１））は、ビフィズス菌属の細菌に由来する１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子のコピーの検出のためには、１μＭの濃度で使用した。ＰＣＲ温度プログラムは以下とした：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後、９４℃で１分間、６２℃で１分間、および６０度で１分間を４０サイクル。鋳型ＤＮＡを３連の反応混合物の中で増幅させ、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＳＤＳ７０００機器（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でモニターした。検量線を、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、ＬＭＧ１１０４２株）の培養物から抽出したＤＮＡの４種類の稀釈物に対する４連の反応での実時間ＰＣＲ増幅に基づいて構築した。実験試料による実時間ＰＣＲデータを検量線に対してプロットし、そして個々の実験試料のＤＮＡ濃度によって割り算した最も高いＤＮＡ濃度を有している実験試料中のＤＮＡ濃度からなる因数を使用して、ＤＮＡ抽出の効率について補正した。
【００６６】
統計分析。動物の体重、飼料の摂取量、または腸内微生物の組成に対する様々な飼料の
効果を、Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔソフトウェア、バージョン１．７１を使用して、９５％の信頼性のレベルで１因数分散分析によって分析した。因数である飼料について統計学的に有意な効果が観察された場合には、それぞれの飼料の間での差を、最小有意差（ＬＳＤ）試験またはテューキー検定のいずれかによって、９５％の信頼性のレベルで分析した。
【００６７】
結果および考察
様々な（アラビノ）キシラン由来の調製物の添加の効果を、ニワトリの腸下部の微生物の組成について試験した。
【００６８】
最初の実験には、６４匹の１日齢の雄のニワトリ（Ｒｏｓｓ ｒｏｏｓｔｅｒｓ）を商業的な孵化場（Ａｖｉｂｅｌ，ティールト、ベルギー）から購入し、４つの囲い（１つの囲いについて１６匹のニワトリ）となるように分配した。個々の囲いには、飲み物用のたらいと１ｍの飼料用の容器を置いた。安定な温度は、鳥類の生存については３５℃であり、その後、２日おきに１℃ずつ下げた。動物を、２３時間の明所と１時間の暗所の光の周期で維持した。飼料（１つの囲いについて１つの飼料）と飲み水は、無制限に与えた。実験期間は１４日間とした。
【００６９】
以下の実験用の飼料を試験した：
・対照の飼料
・対照の飼料＋０．２５％のＡＸＯＳ−７−０．３４調製物（０．１７％の純粋なＡＸ）
・対照の飼料＋０．２５％のＡＸＯＳ−１２２−０．６６調製物（０．１８％の純粋なＡＸ）
・対照の飼料＋０．２５％のＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ（０．２２％の純粋なＡＸ）
括弧の中に示した濃度は、それらのＡＸ含有量によって計算したそれらの純度について補正した。対照の飼料は、添加剤としてキシラナーゼとグルカナーゼ酵素の混合物（Ｒｏｘａｚｙｍｅ）が含まれている市販のスタータ用の飼料（ｓｔａｒｔｅｒ ｆｅｅｄ）（Ｋｒｉｘ ０，Ｈｅｎｄｒｉｘ ＵＴＤ，ボックスミア、オランダ）から構成されていた。
【００７０】
７日齢で、全ての動物の体重を測定し、１つのグループについて８匹の動物をランダムに選択し、首を切り落として屠殺した。その後、盲腸を回収するために動物を解剖した。盲腸を空にし、内容物を、１回の処理について２つのグループに分けてプールした（それぞれ４つの盲腸）。盲腸を１回の処置について３つのグループに分けてプールした（それぞれ、３匹、３匹、および２匹の動物）ことを除いて、このプロトコールを、残りの動物が１４日齢に達するまで繰り返した。
【００７１】
ＡＸＯＳ−７−０．３４グループの動物については、対照グループと比較して、平均体重に有意な差は観察されなかった。ＡＸＯＳ−１２２−０．６６グループおよびＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐグループの動物は、７日後には対照グループよりも有意に少ない体重を有していたが、動物は１４日後には追いつき、そして対照との差は有意ではなくなった。ＡＸＯＳ−１２２−０．６６グループの場合には、７日後には比較的少ない体重となり、これは、孵化した時点でこのグループのニワトリの体重が有意に少なかったことが原因である。
【００７２】
ニワトリの盲腸の微生物叢の分析は、腸内細菌科の高いレベル（約１０８〜１０９／ｇの盲腸内容物）を、飼料を与え始めてから７日後および１４日後の両方で示し、いずれの処置についても有意な差は観察されなかった。ビフィズス菌のレベルは、ビフィズス菌のレベルがはるかに高かった（約１０８／ｇ盲腸内容物）Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐグループの動物を除いて、７日後には全ての処置グループにおいて低かった（約１０２〜１０
３／ｇ盲腸内容物）（図９）。１４日後は、盲腸のビフィズス菌の数は対照については少ないままであった。反対に、ビフィズス菌の数の明らかな増加（約１０５倍）が、ＡＸＯＳ−７−０．３４グループの盲腸内容物において観察された。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐグループにおいては、ビフィズス菌のレベルは、７日後のレベルと比較するといくらか下がったが、なおも、１４日後には、これは対照グループよりもまだ有意に高かった。ＡＸＯＳ−１２２−０．６６グループにおいては、盲腸内容物中のビフィズス菌の数の穏やかな増加が１４日後に生じていたが、この増加は対照グループと比較すると有意ではなかった。
【００７３】
ニワトリについての第２の実験には、５４匹の１日齢の雄のニワトリ（Ｒｏｓｓ Ｒｏｏｓｔｅｒｓ）を、商業的な孵化場（Ａｖｉｂｅｌ，ティールト、ベルギー）から購入し、６個の囲い（１つの囲いについて９匹のニワトリ）となるように分配した。囲いの条件は第１の実験について記載したとおりとした（上記を参照のこと）。実験期間は１４日間とした。
【００７４】
以下の実験用の飼料を試験した：
・対照の飼料
・対照の飼料＋０．１４１％のＡＸＯＳ−１５−０．２７調製物（０．１％の純粋なＡＸ）
・対照の飼料＋０．３５２％のＡＸＯＳ−１５−０．２７調製物（０．２５％の純粋なＡＸ）
・対照の飼料＋０．２６３％のＦＯＳ調製物（０．２５％の純粋なＦＯＳ）
・対照の飼料＋１．０５３％のＦＯＳ調製物（１％の純粋なＦＯＳ）
・対照の飼料＋０．０１％のキシラナーゼ調製物
括弧の中に示した濃度は、それらのＡＸまたはＦＯＳ含有量によって計算したそれらの純度について補正した。ＦＯＳ調製物は、市販されている製品であるＲａｆｔｉｌｏｓｅ（Ｏｒａｆｔｉ，チーネン、ベルギー）であった。キシラナーゼ調製物は、市販されている製品であるＢｅｌｆｅｅｄ（Ｂｅｌｄｅｍ，Ｇｒｏｏｔ−Ｂｉｊｇａａｒｄｅｎ，ベルギー）であった。対照の飼料の組成は表６に示す。１４日齢で、すべての動物の体重を測定し、首を切り落として屠殺した。その後、盲腸を回収するために動物を解剖した。盲腸の内容物を、同じ処置グループに属している３匹の動物ごとにプールした。プールした盲腸の試料の中のビフィズス菌の数を定量的ＰＣＲによって測定した。
【００７５】
それぞれの飼料を与え始めてから２週間後には、様々な処置の間で、体重に有意な差は観察できなかった。２週間後のニワトリの盲腸の中のビフィズス菌の数に関しては、０．２５％のＡＸＯＳ−１５−０．２７を含む飼料を与えたニワトリだけが、対照の処置とは有意に異なっていた（図１０）。０．２５％のＡＸＯＳ−１５−０．２７を含む飼料を与えたニワトリの中のビフィズス菌の数は、対照の飼料を与えたニワトリにおけるビフィズス菌の数よりも２２倍多かった。比較の目的のために含めた十分に研究されている前生物学的化合物であるフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）は、ＡＸＯＳ−１５−０．２７が有効であった用量よりも４倍多い用量でもなお、ニワトリの盲腸の中のビフィズス菌の数の増大を生じることはなかった。このことは、ＡＸＯＳ−１５−０．２７が驚くほど強力なビフィズス菌増殖促進性の化合物であることを示している。
【００７６】
ビフィズス菌は、動物およびヒトの健康状態にポジティブに関係しており、これは多くの前生物学的化合物の要素である。動物およびヒトのポジティブな健康状態を促進または維持する（これには、結腸直腸ガンに対する抑制効果が含まれる）ために、微生物の調製物を直接摂取させることに加えて、消化管の中のこれらの細菌集団を選択的に富化させることに対して関心が高まっている（Ｖａｎ Ｌｏｏら、２００４）。ニワトリを用いた給飼料試験の結果は、すべてのアラビノキシランを含む飼料によってニワトリの盲腸の中の
ビフィズス菌の存在が刺激されたことを示している。重合度の高いＡＸＯＳ調製物であるＡＸＯＳ−１２２−０．６６は、ニワトリの盲腸の中のビフィズス菌集団の穏やかな有意ではない増加しか生じなかった。一方、低い重合度から中程度の重合度を有している調製物である、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ、ＡＸＯＳ−７−０．３４、およびＡＸＯＳ−１５−０．２７は、ビフィズス菌の猛烈な有意な増加を誘発し、これによっては、動物の体重の減少は引き起こされなかった。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐに対する反応は７日後にすでに観察することができたが、ＡＸＯＳ−７−０．３４およびＡＸＯＳ−１５−０．２７は、１４日後にビフィズス菌増殖促進性の反応を生じただけであった。このことは、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐが、より高い平均重合度とより高い平均置換度を有しているＡＸＯＳ−７−０．３４およびＡＸＯＳ−１５−０．２７調製物よりも早くビフィズス菌によって発酵されることを示している。選択された有利な細菌による遅い発酵は、ヒトおよび長い腸を有している動物での適用のための前生物学的化合物について所望される特性である。腸内細菌による遅い発酵によって、結腸の近位部分を通過した後には完全に消費されておらず、したがって、結腸の遠位部分にある適切な細菌による発酵のための基質として使用され得る前生物学的化合物の画分が増加させられる。まとめると、ヒトにおいては、結腸の遠位部分および直腸部分のガンの罹患率は、直腸の近位部分のガンの罹患率よりも高く（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｔｅ．ｎｊ．ｕｓ／ｈｅａｌｔｈ／ｃａｎｃｅｒ／ｃｒ／ｓｕｂｓｉｔｅ．ｈｔｍ）、したがって、前生物学的化合物が遠位結腸および直腸の有用な微生物を刺激できることが重要である。
【００７７】
実施例５
ラットの腸に対するＡＸＯＳ調製物の効果
材料および方法
ＸＯＳ／ＡＸＯＳ調製物。実施例１の材料および方法を参照のこと。
【００７８】
定量的ＰＣＲによる微生物の分析。実施例４の材料および方法を参照のこと。
短鎖脂肪酸の分析。腸の試料を、５倍量の水／リン酸／ギ酸（９８／１．８／０．２、ｖ／ｖ／ｖ）で抽出し、遠心分離（２２，０００ｇ、１０分）によって明澄化した。短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を、気体−液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＧＣ １４Ａ）によって、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ Ｗ（メッシュサイズ６０／３０；Ｓｕｐｅｌｃｏ，ベルフォンテ、ＵＳＡ）を充填したカラム上で分析し、炎イオン化によって検出した。ＳＣＦＡの濃度を、濃度が既知の種々の酸を含む標準物に基づいて計算した。カプロン酸を内部標準として使用した。
【００７９】
統計分析。様々な試料の体重、飼料の摂取量、ＳＣＦＡ、または動物の腸の微生物の組成に対する効果を、Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔソフトウェア、バージョン１．７１を使用して、９５％の信頼性のレベルで１因数分散分析によって分析した。統計学的に有意な効果が因数である飼料について観察された場合には、それぞれの飼料の間での差を、最小有意差（ＬＳＤ）試験によって、９５％の信頼性のレベルで分析した。
【００８０】
結果および考察
ラットについての最初の実験には、４０匹の６週齢の雄のラット（Ｗｉｓｔａｒ）を、Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ，フランス）から購入し、１４−１０時間の明所−暗所のサイクルで、環境を制御した室内（２２℃）で、ステンレス鋼製のワイヤー底のケージに入れた（１つのケージについて２匹のラット）。ラットは、７日間、水と、「基本的な人工の飼料（ｂａｓｉｃ ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ｄｉｅｔ）」であるペレット（１０ｍｍ）に自由に近づけるようにした。「基本的な人工の飼料」の組成は表７に示す。「基本的な人工の飼料」を与え始めてから７日後、ラットを、５種類の処置グループの１つにランダムに分け（８匹のラット／グループ）、そしてこれらのグループにそれぞれ、１３日間、以下の飼料の１つのペレット（１０ｍｍ）に自
由に近づけるようにして与えた：
・基本的な人工の飼料
・基本的な人工の飼料＋０．７０％のＡＸＯＳ−１２２−０．６６調製物（０．５％の純粋なＡＸ）
・基本的な人工の飼料＋０．６９％のＡＸＯＳ−１６−０．７８調製物（０．５％の純粋なＡＸ）
・基本的な人工の飼料＋０．７３％のＡＸＯＳ−１５−０．２７調製物（０．５％の純粋なＡＸ）
・基本的な人工の飼料＋０．７２％のＡＸＯＳ−８−０．２７調製物（０．５％の純粋なＡＸ）
括弧の中に示した濃度は、それらのＡＸ含有量によって計算したそれらの純度について補正した。ＡＸＯＳを含む飼料について、基本的な人工の飼料の中のデンプンを、適切な量のＡＸＯＳで置き換えた。
【００８１】
動物の体重を測定し、そして飼料の摂取量を、１週間に３回測定した。処置の１３日後に、全ての動物の体重を測定し、ネムブタール（Ｎｅｍｂｕｔａｌ）の過剰摂取を用いて麻酔した。その後、動物を、糞を回収するために解剖した。糞を、遠位結腸から肛門までのペレットとして回収した。糞を同じ処置グループに属している２匹の動物ごとにプールし、そしてＳＣＦＡ含有量について分析した。
【００８２】
処置期間の飼料の摂取量は、１８．９から２７．７ｇ／日の範囲であり、平均は２２．７ｇ／日であった。処置の開始時点でのラットの最初の体重は平均すると２６２．０ｇであり、処置の１３日後の最後の体重は平均すると３７５．３ｇであった。体重または飼料の摂取量に関して、様々な処置の間で有意な差を観察することはできなかった。
【００８３】
腸の高いＳＣＦＡレベルは、前生物学液化合物の摂取によって誘導された腸の微生物叢のシフトの顕著な特徴であるので（Ｖａｎ Ｌｏｏ，２００４）、本発明者らは、様々な処置グループについて糞のＳＣＦＡ含有量を測定した。図１１に示すように、ＡＸＯＳ−８−０．２７、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、およびＡＸＯＳ−１６−０．７８を与えたラットの糞の中のプロピオン酸塩のレベルは、対照グループまたはＡＸＯＳ−１２２−０．６６グループのレベルよりも有意に高かった。ＡＸＯＳ−８−０．２７、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、およびＡＸＯＳ−１６−０．７８グループの糞の中の酢酸塩および酪酸塩のレベルの増大にも１つの傾向があった。
【００８４】
酢酸塩、プロピオン酸塩、および酪酸塩のようなＳＣＦＡは、腸の嫌気性環境において細菌による呼吸の電子の受けてエレクトロンシンク（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｉｎｋ）として生じる。前生物学的化合物は、下部消化管のＳＦＣＡレベルを増大させることが知られている。高いＳＣＦＡレベルは、これらが腸の内容物のｐＨを下げ、それによって潜在的に病原性である腐敗菌の増殖を制限するという理由から望ましい。腸のｐＨの低下にはまた、鉱物であるカルシウムおよびマグネシウムの溶解度および生体利用性の増大も伴う（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，２００２）。短鎖脂肪酸、特に、酪酸塩は、さらに結腸上皮細胞を刺激して、それによって上皮の吸収能力を高める（Ｔｏｐｐｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｆｔｏｎ，２００１）。
【００８５】
ほぼ同じ平均重合度を有しているがＡ／Ｘ比が異なる２つの調製物であるＡＸＯＳ−１５−０．２７またはＡＸＯＳ−１６−０．７８で処置したラットの間には有意な差が観察されなかったという事実は、置換度は結腸内での細菌による発酵を刺激するＡＸＯＳの能力には大きな影響は与えないことを示している。一方、ほぼ同じ置換度を有しているが重合度が異なる２つの調製物であるＡＸＯＳ−１６−０．７８およびＡＸＯＳ−１２２−０．６６の効果を比較した場合には、ＡＸＯＳ−１２２−０．６６のような重合度の高いＡ
ＸＯＳ調製物が、平均重合度の低い調製物よりも弱い前生物学的化合物であることが明らかである。したがって、１２０未満の平均重合度を有しているＡＸＯＳ調製物が好ましい前生物学的化合物である。遅い発酵が好ましい場合には、遠位結腸および直腸でのＡＸＯＳの利用性を増大させるために、４を上回る平均重合度を有しているＡＸＯＳ調製物が好ましい。
【００８６】
ラットについての第２の実験には、２４匹の６週齢の雄のラット（Ｗｉｓｔａｒ）を、Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ，フランス）から購入し、１４−１０時間の明所−暗所のサイクルで、環境を制御した室内（２２℃）で、ステンレス鋼製のワイヤー底のケージに入れた（１つのケージについて２匹のラット）。ラットは、６日間、水と、「基本的な人工の飼料」であるペレット（１０ｍｍ）に自由に近づけるようにした。「基本的な人工の飼料」の組成は表７に示す。「基本的な人工の飼料」を与え始めてから６日後、ラットを、３つの処置グループの１つにランダムに分け（８匹のラット／グループ）、そしてこれらのグループには、それぞれ、以下の飼料の１つのペレット（１０ｍｍ）に自由に近づけるようにして与えた：
・基本的な人工の飼料
・基本的な人工の飼料＋５．８７％のＡＸＯＳ−１５−０．２７調製物（４％の純粋なＡＸ）
・基本的な人工の飼料＋５．２６％のＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ（４％の純粋なＡＸ）
括弧の中に示した濃度は、それらのＡＸ含有量によって計算したそれらの純度について補正した。ＡＸＯＳ−１５−０．２７またはＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐを含む飼料について、基本的な人工の飼料の中のデンプンを、適切な量のＡＸＯＳで置き換えた。
【００８７】
動物の体重を測定し、そして飼料の摂取量を１週間に３回測定した。処置の１４日後に全ての動物の体重を測定し、ネムブタールの過剰摂取を用いて麻酔し、そして近位結腸、盲腸、および遠位結腸を回収するために解剖した。盲腸の内容物を、同じ処置グループに属している２匹の動物ごとにプールし、そして定量的ＰＣＲによってビフィズス菌の量について分析した。近位結腸と遠位結腸の内容物を同じ処置グループに属している２匹の動物ごとにプールし、そしてＳＣＦＡ含有量について分析した。
【００８８】
近位結腸においては、ＳＣＦＡレベルは、遠位結腸よりもはるかに低かった。酢酸塩だけが、近位結腸試料の中で検出限界を上回っていた。したがって、近位結腸の中の酢酸塩と、遠位結腸の中の酢酸塩、プロピオン酸塩、および酪酸塩についてのデータしか得ることができなかった。いずれの処置も、９５％の信頼性のレベルでは、ＳＣＦＡレベルに対して有意な効果は生じなかった。しかし、データからは明確な傾向を観察することができた。図１２に示すように、ＡＸＯＳ−１５−０．２７グループとＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐグループは、対照グループと比較して、高いレベルの酢酸塩および酪酸塩を有していたが、プロピオン酸塩についてはそうではなかった。最も顕著な効果は、遠位結腸の酪酸塩について観察された。対照グループと比較したその増大は、ＡＸＯＳ−１５−０．２７グループにおいては５８％であり、そしてＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐグループにおいては３４％であった。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐと比較したＡＸＯＳ−１５−０．２７のより強い効果が、遠位結腸の全てのＳＣＦＡについて観察された。興味深いことに、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐは、近位結腸において最も強い酢酸塩の増加を生じたが、一方、ＡＸＯＳ−１５−０．２７は、遠位結腸において最も強い酢酸塩の追加を生じた。
【００８９】
ビフィズス菌の量は、対照の飼料を与えたラットと比較して、ＡＸＯＳ−１５−０．２７またはＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐのいずれかを与えたラットの盲腸においては有意に増加した。盲腸のビフィズス菌について最大の増加は、ＡＸＯＳ−１５−０．２７グループにおいて観察された（１．０８対数単位、または対照グループに対して１２倍高い、図
１３）。
【００９０】
これらの結果は、ＡＸＯＳ−１５−０．２７がＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐよりも強い前生物学的化合物であることを示している。データはまた、ＡＸＯＳ−１５−０．２７が、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐよりもゆっくりと発酵されることも示している。なぜなら、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐは、近位結腸においてより強いＳＣＦＡ効果を生じたが、一方、ＡＸＯＳ−１５−０．２７は遠位結腸においてより強い効果を生じたからである。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐに対するＡＸＯＳ−１５−０．２７の遅い発酵は、実施例５に示したニワトリの実験でも観察された。ＡＸＯＳ−１５−０．２７の遅い発酵の特性は、これによってより多くの前生物学的化合物が遠位結腸に到達し、ここで、その推定される有用な発ガン抑制効果を発揮できるので、望ましい。
【００９１】
実施例６：ヒトの腸に対するＡＸＯＳ調製物の効果
材料および方法
ＡＸＯＳ−１５−０．２７およびＷＰＣ調製物。実施例１の材料および方法を参照のこと。
【００９２】
定量的ＰＣＲによる微生物学的分析。実施例４の材料および方法を参照のこと。
被験体。実験に参加したボランティアは全て、消化器疾患または代謝性疾患あるいはこれまでの外科手術の病歴はなかった。被験体には、実験の開始前の少なくとも３ヶ月間は、腸通過時間または腸内微生物叢に影響を及ぼす抗生物質または任意の他の医薬品での処置を行わなかった。いずれの女性も実験の間には妊娠していなかった。ボランティアには標準的な食事は強制しなかった。しかし、彼らに実験期間の最後まで基本的な食事のパターンを維持するように、そして多量の発酵性糖質を含む発酵乳製品および食品成分の過剰な摂取を避けるように求めた。Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｕｖｅｎによって実験は承認され、全ての被験体にインフォームドコンセントを行った。
【００９３】
標識した基質。ラクトース−［１５Ｎ，１５Ｎ］−ウレイドを、Ｈｏｆｍａｎｎ（１９３１）によって改変されたＳｃｈｏｏｒｌの方法にしたがって、Ｅｕｒｉｓｏ−ｔｏｐ（Ｓａｉｎｔ−Ａｕｂｉｎ，Ｆａｎｃｅ）から入手した［１５Ｎ，１５Ｎ］尿素を用いて合成した。３Ｈで標識したポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）（３Ｈ−ＰＥＧ）を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ボストン、ＭＡ、米国）から入手した。
【００９４】
尿および便のＮｔｏｔおよび１５Ｎの決定。尿および便の全Ｎ含有量および１５Ｎ濃縮を熱導体検出器（ＴＣＤ；ＰＤＺ）と安定同位体比質量分析装置（ＩＲＭＳ；ＰＤＺ）の両方を取り付けた元素分析計（ＡＮＣＡ−ＳＬ；ＰＤＺ，チェシャー、英国）を使用することによって測定した。既知の容量（１５μｌ）または既知の質量の便（約５〜７ｍｇの凍結乾燥排泄物）を、１，０００℃で酸素の存在下で酸化させた。その後、酸化物を、６００℃で、銅を含む第２の加熱炉に通し、ここでは、過剰の酸素が吸収され、酸化窒素が元素窒素に還元される。全窒素含有量を、ＴＣＤ検出器で測定した。ここでは、１５Ｎ濃縮を、元素分析計の燃焼ユニットを取り付けたＩＲＭＳ検出器によって決定した。Ｎ２のＮ１５対Ｎ１４同位元素比を、較正した実験室標準物（すなわち、標準的な硫酸アンモニウム溶液）と比較して測定した。回収した１５Ｎの投与した用量に対する割合を、以下のように計算した（Ｅｖｅｎｅｐｏｅｌら、１９９９）：
【００９５】
【数２】
【００９６】
式中、
【００９７】
【数３】
【００９８】
そして、ＡＰｔ：特定の尿試料についての測定した１５Ｎ濃縮、原子の割合（ＡＰ）として表す
ＡＰｂａｓ：基底の尿試料についての１５Ｎ濃縮（ＡＰで表す）
Ｎｔｏｔ：特定の尿試料中の全窒素含有量
尿試料については、投与した１５Ｎの用量に対する割合を、試験用の食事後０〜４８時間の期間について累積した。一方、便の試料については、投与した１５Ｎの用量に対する割合を、試験用の食事後０〜７２時間の期間について累積した。個体間の糞便の通過時間（ｏｒｏ−ｆａｅｃａｌ ｔｒａｎｓｉｔ ｔｉｍｅ）の差の補正を、便の試料について行った。これは、７２時間にわたって回収した投与した３Ｈ−ＰＥＧの用量の累積割合で、７２時間にわたって回収した投与した１５Ｎの用量の累積割合を割り算することによって行った。排泄物中の３Ｈ−ＰＥＧ含有量を、３Ｈ−Ｈ２Ｏへと酸化（Ｐａｃｋａｒｄ試料酸化装置、モデル３０７）させた後に、液体シンチレーションカウンティング（Ｔｒｉｃａｒｂ液体シンチレーションスペクトルクトロメーター、モデル３３７５；Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，米国）によって測定した。
【００９９】
尿のフェノール系化合物の決定。全ｐ−クレゾールおよびフェノール含有量を、気体−液体クロマトグラフィー−質量スペクトル分析（ＧＣ−ＭＳ）技術によって測定した。９５０ｍｌの尿のｐＨを、濃Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨ１に調整した。この溶液を、９０度で３０分間加熱して除タンパクし、結合していたフェノールを加水分解した。室温に冷却したあと、５０ｍｌの２，６−ジメチルフェノール（２０ｍｇ／１００ｍｌ）を、内部標準物として添加した。フェノールを１ｍｌの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、０．５ｍｌのこの溶液をＧＣ−ＭＳ（Ｔｒａｃｅ ＧＣ−ＭＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ，サンノゼ、ＣＡ、米国）で分析した。分析用カラムは、３０ｍ×０．３２ｍｍの内径、１μｍのＡＴ５−ＭＳ（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，ディアフィールド、ＩＬ、米国）であった。ヘリウムガス（ＧＣ等級）を、１．３ｍｌ／分の一定の流速で担体として使用した。炉の温度は、７５℃（５分間等温）からプログラムし、１０℃／分で１６０℃まで、そして２０℃／分で２８０℃まで上昇させた。質量スペクトルの検出は、２スキャン／ｓで、ｍ／ｚ ５９からｍ／ｚ ５９０までの電子衝撃完全スキャン形式で行った。ｐ−クレゾールおよびフェノールについての結果を、０〜２４時間の回収において回収した全含有量（ｍｇ）として表した。
【０１００】
統計分析。統計分析はＳＰＳＳソフトウェア、バージョン１２．０を用いて行った。データの統計学的評価は、９５％の信頼性のレベルでウイルコクソンの符号付き検定を適用して行った。
【０１０１】
結果および考察
ヒトについての最初の実験は、１０人の健常なボランティア（５人の男性と５人の女性、年齢は２３〜３７歳の範囲）について行った。１０人のボランティアは、２つのグループのいずれかに５人ずつランダムに割り振った。第１のグループには、１日当たり水に懸濁した７ｇ（４．８８ｇ）のＡＸＯＳ−１５−０．２７を２週間投与し、一方、第２のグループには、１日あたり水に懸濁した１１．６ｇ（４．８２ｇ）のＷＰＣを投与した。括弧内の重量の値は、調製物のＡＸ含有量と水分含有量に基づいて補正したＡＸＯＳの重量である。
【０１０２】
ボランティアのそれぞれについて、便の試料を実験の開始よりも前と、１５日目の間に回収した。それぞれ、その日の最初の排泄物を回収し、重さを測定し、そして定量的ＰＣＲによって微生物を分析するまで−２０℃で保存した。図１４に示すように、４．８８ｇ／日のＡＸＯＳ−１５−０．２７を１４日間投与した被験体は、基底レベル（ｐ＝０．０４３）と比較して１．５５対数単位（＝３５倍）高い便のビフィズス菌のレベルを有していた。対照的に、ビフィズス菌のレベルは、４．８２ｇ／日のＷＰＣを投与した被験体においては、２週間後にはわずかに低下していたが、基底レベルと比較した差は有意ではなかった（ｐ＝０．７１５）。
【０１０３】
これらのデータは、ＡＸＯＳ−１５−０．２７（ａｖＤＰ＝１５、表１）のような中程度の平均重合度を有しているＡＸＯＳ化合物は、ＷＰＣ（ａｖＤＰ＝５８、表１）のような高い平均重合度を有している化合物よりも強い前生物学的効果を発揮することを示している。同じ結論は、ニワトリにおけるビフィズス菌増殖促進作用（実施例４を参照のこと）、およびラットのＳＣＦＡの増加（実施例５を参照のこと）についての試験からもすでに導くことができた。
【０１０４】
第２の実験においては、ＡＸＯＳ−１５−０．２７の種々の１回だけの用量の効果を、ヒトの結腸の中でのＮＨ３、ｐ−クレゾール、およびフェノールの代謝について評価した。ＮＨ３、フェノール、およびｐ−クレゾールは毒性がある潜在的に発ガン性の代謝物であり、これは、タンパク質の発酵の際に結腸の細菌によって生産される。ＮＨ３の代謝は、ラクトース−［１５Ｎ，１５Ｎ］−ウレイドを生体マーカーとして使用して評価した。経口投与すると、ラクトース−ウレイドは、修飾されないまま結腸に到達する。なぜなら、ラクトース−ウレイドの糖質部分と尿素の間の分子結合は、ヒトの消化管の中での酵素による分解に耐性であるからである。ラクトース−［１５Ｎ，１５Ｎ］−ウレイドが結腸に達すると、これは、選択された細菌によって［１５Ｎ，１５Ｎ］で標識された尿素に分解される。標識された尿素は、早い加水分解を受け、これには１５ＮＨ３の生産が伴う（Ｗｕｔｚｋｅら、１９９７）。標識されたＮＨ３は結腸の中に存在しているアンモニアと混合され、結果として、１５Ｎで標識された測定値に関して観察される変化は、結腸の全ＮＨ３の運命を反映する。
【０１０５】
結腸のＮＨ３代謝物をモニターすることに加えて、フェノールおよびｐ−クレゾールの存在を、結腸の中でのタンパク質の細菌による発酵の特徴として、尿中で測定した。文献によるデータ（Ｅｖｅｎｅｐｏｅｌら、１９９９）に基づくと、生理学的環境下では、摂取されたタンパク質の約３％から６％が未消化のままであると推測される。消化されていないタンパク質が結腸に達すると、これらは、結腸の微生物叢によって発酵させられる。アミノ酸であるチロシンの細菌による発酵によっては、フェノールおよびｐ−クレゾールの生産が生じる。これらの化合物は、大部分が結腸から吸収され、粘膜および肝臓の中で（グルクロニド−および硫酸エステル−結合体によって）無毒化され、最後に尿中に排出される。フェノールおよびｐ−クレゾールは、完全に細菌による代謝に由来し、ヒトによる代謝によっては生じないので、フェノールおよびｐ−クレゾールの尿による排出は、結腸の中での細菌によるこれらの化合物の生産を反映する（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｃｆ
ａｒｌａｎｅ，１９９６）。結果として、結腸でのタンパク質の発酵に対する前生物学的化合物の全ての影響が、フェノールおよびｐ−クレゾールの尿中濃度に反映されるはずである。
【０１０６】
ヒトについての第２の実験は、９人の健常なボランティア（３人の男性と６人の女性、１６〜２６歳の範囲）について行った。それぞれのボランティアには、それぞれの試験用食事の中に、１週間の間隔で、様々な用量のＡＸＯＳ−１５−０．２７を含む５種類の試験用食事を与えた。１日あたりの様々なＡＸＯＳ−１５−０．２７の用量は、０，０．３５ｇ（０．２４ｇ）、１．０５ｇ（０．７３ｇ）、３．１７ｇ（２．２１ｇ）、および７ｇ（４．８８ｇ）のいずれかとした。括弧内の重量の値は、調製物のＡＸ含有量と水分含有量に基づいて補正したＡＸＯＳの重量である。種々の試験用食事をボランティアに与える順序はランダムとした。試験用食事は、７５ｇの、安定な同位元素で標識された基質であるラクトース−［１５Ｎ，１５Ｎ］−ウレイド、１８５ｋＢｑのトリチウムで標識したポリエチレングリコール（３Ｈ−ＰＥＧ）、および適切な用量のＡＸＯＳ−１５−０．２７を含むパンケーキ（１５．８ｇのタンパク質、１１．６ｇの脂肪、および２１．１ｇの炭水化物；２５５ｋｃａｌ）であった。３Ｈ−ＰＥＧを、糞便の通過時間についての生体マーカーとして使用した（Ｇｅｂｏｅｓら、２００５）。
【０１０７】
尿を、１グラムのネオマイシンを細菌の増殖を防ぐために添加したレシピエントから回収した。基底の尿試料を、試験用の食事を摂取させる前に回収した。各試験用の食事の摂取後、４８時間での尿の回収を、３つの異なる画分として行った：０〜６時間、６〜２４時間、および２４〜４８時間。尿量の測定の後、試料を採取し、そして分析するまで−２０℃で保存した。排泄物を、試験用の食事を与えた後７２時間にわたって回収した。排泄物を、排泄後直ちに凍結し、重さを測定し、その後、−２０℃で保存した。同日に回収された全ての排泄物を混合し、さらに分析する前にホモジナイズした。既知の重量の試料を取り出し、凍結乾燥させた。乾燥物質を、再び重さを測定し、窒素および放射活性の分析のためにアリコートに分けた。
【０１０８】
図１５Ａに示すように、１５Ｎで標識した窒素の一貫して遅い尿による排出速度が、ＡＸＯＳ−１５−０．２７を含まない対照の食事と比較して、ＡＸＯＳ−１５−０．２７を含む試験用食事を摂取した後に記録された。投与した１５Ｎ用量の４４．５％が、対照の食事を摂取させた後の尿の試料の中に戻ってきた。この画分は、それぞれ、０．２４、０．７３、２．２１、および４．８８ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７の摂取後、４０．４％（対照と比較して−９％）、４３．７％（対照と比較して−２％）、３３．１％（対照と比較して−２６％）、および３３．６％（対照と比較して−２５％）に減少した。尿による１５Ｎの排出の減少は、２．２１ｇおよび４．８８ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７について、ｐ＜０．０５で有意であった。
【０１０９】
逆に、試験用の食事に対するＡＸＯＳ−１５−０．２７の補給によっては、便による１５Ｎの排出に一貫して増大が生じた（図１５Ｂ）。対照の試験用食事のグループにおいては、投与した１５Ｎの用量の１５．１％が便の中に戻ってきた。この画分は、それぞれ、０．２４、０．７３、２．２１、および４．８８ｇの摂取後、１６．４％（対照と比較して＋８％）、１８．８％（対照と比較して＋２４％）、２５．３％（対照と比較して＋６７％）、および２６．１％（対照と比較して＋７２％）に増大した。便による１５Ｎの排出の増加は、２．２１ｇおよび４．８８ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７について、ｐ＜０．０５で有意であった。ＡＸＯＳ−１５−０．２７は、消化管を通過する時間に対しては、３Ｈ−ＰＥＧ生体マーカーによって測定した場合には、試験した用量のいずれでも影響を与えなかった（図１５Ｃ）。
【０１１０】
ｐ−クレゾールおよびフェノールの一貫した尿による低い排出速度が、ＡＸＯＳ−１５
−０．２７を含まない対照の食事と比較した、ＡＸＯＳ−１５−０．２７を含む試験用食事の摂取後に記録された（図１６）。尿によって排出されたｐ−クレゾールの画分は、それぞれ、０．２４、０．７３、２．２１、および４．８８ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７の摂取後、対照と比較して、−９％、−２１％，−３５％、および−４１％に減少した（図１６Ａ）。尿によって排出されたフェノールの画分は、それぞれ、０．２４、０．７３、２．２１、および４．８８ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７の摂取後、対照と比較して、−４５％、−３９％，−３３％、および−４５％に減少した（図１６Ｂ）。尿によるフェノールの排出の減少は、０．２４ｇから４．８８ｇまでの範囲の試験したＡＸＯＳ−１５−０．２７の全てについて、ｐ＜０．０５で有意であった。したがって、ＡＸＯＳ−１５−０．２７は、１回の食事について０．２４ｇを下回る、驚くほど低い用量で活性である、ヒトにおける前生物学的化合物であることが明らかになった。
【０１１１】
尿による窒素の排出の減少と、便によるＮの排出の一貫した増加は、既知の前生物学的化合物（例えば、インシュリンおよびラクツロース）を投与したヒトにおいて以前に観察されている（Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒら、２００４；Ｇｅｂｏｅｓら、２００５）。便によるアンモニアの排出の刺激は、アンモニアが結腸上皮細胞の寿命を短くすること、その代謝回転を増大させること、そして化学物質による発ガン性に対してそれらをより敏感にすることが示されているので、望ましい（Ｖｉｓｅｋ １９７８）。結腸の内腔の中にあるアンモニアは、消化されていないタンパク質の細菌による発酵に主に由来する（Ｓｍｉｔｈ
＆ Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，１９９６；Ｆｏｏｋｓら、１９９９）。中程度の重合度を有しているＡＸＯＳのような、ゆっくりと発酵される前生物学的炭水化物は、糖分解性の細菌と、結腸に存在している細菌の解糖系を刺激する。したがって、このような化合物は、結腸の中でのタンパク質分解的発酵を抑制し、そして主な炭素源およびエネルギ源を炭水化物に頼る細菌による窒素源としてのアンモニアの再利用を刺激する。同時に、タンパク質の発酵代謝物であるクレゾールおよびフェノールの尿による排出の減少は、これらのフェノール系化合物が腸ガンに関係しているので望ましい（Ｂｏｎｅら、１９７６）。フェノール系化合物の尿による排出の減少は、前生物学的化合物であるラクツロースについて以前に観察されている（Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒら、２００４）。クレゾールおよびフェノールの排出の減少は、前生物学的化合物によって刺激されると、結腸の中の糖分解性細菌活性の増大を通じて、アミノ酸であるチロシン、またはタンパク質の腐敗による代謝産物の利用の増大によって引き起こされると考えられる。
【０１１２】
参考文献
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
【表３】
【０１１６】
【表４】
【０１１７】
【表５】
【０１１８】
【表６】
【０１１９】
【表７】
【０１２０】
【表８】
【０１２１】
【表９】
【０１２２】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】アラビノキシランの構成要素。Ａ：未置換のβ−Ｄ−キシロピラノシル残基。Ｂ：Ｏ−２でα−Ｌ−アラビノフラノシル部分によって置換されたβ−Ｄ−キシロピラノシル残基。Ｃ：Ｏ−３でα−Ｌ−アラビノフラノシル部分によって置換されたβ−Ｄ−キシロピラノシル残基。Ｄ：Ｏ−２およびＯ−３でα−Ｌ−アラビノフラノシル部分によって置換されたβ−Ｄ−キシロピラノシル残基。構造Ｃは、α−Ｌ−アラビノフラノシル残基のＯ−５に対するフェルラ酸の結合を示す。
【図２】種々のＡＸＯＳ調製物のＨＰＳＥＣ分子量プロフィール。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０６ＨＱ（３００×８ｍｍ、Ｓｈｏｗａ，Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，東京、日本）であった。７８．８×１０４、４０．４×１０４、２１．２×１０４、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、０．５９×１０４Ｄａの分子量を有しているプルラン標準物と、グルコース（１８０Ｄａ）の溶出容量が、左から右に向かって記号「ｘ」で示される。
【図３】ｐＨ２、３、７、および１１で１００℃での様々なインキュベーション時間についての、ＡＸＯＳ−１５−０．２７（Ａ）、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ（Ｂ）、およびフルクトオリゴ糖（Ｃ）の構成成分である単糖の分解の割合。
【図４】ｐＨ２、３、および７で１００℃での様々なインキュベーション時間についての、ＡＸＯＳ−１５−０．２７（Ａ）、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ（Ｂ）、およびフルクトオリゴ糖（Ｃ）の加水分解の割合。
【図５】ｐＨ２、３、および７で１００℃での様々なインキュベーション時間についての、ＡＸＯＳ−１５−０．２７の中のキシロース結合（Ａ）およびアラビノース結合（Ｂ）の加水分解の割合。
【図６】ＡＸＯＳ−１５−０．２７、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ、およびスクロースの甘味。曲線は、化合物の濃度（ｇ／ｌ）に対してプロットした被験体（ｎ＝２０）が認識する甘味の累積率を示す。
【図７】スキージＷＵ−ＡＸのエンドキシラナーゼ処理によって生じたＡＸＯＳの限外濾過後に得られたオリゴ糖画分のＨＰＳＥＣ分子量プロフィール。使用した膜は５ｋＤａ（パネルＡ）、１０ｋＤａ（パネルＢ）、および３０ｋＤａ（パネルＣ）のＭＭＣＯを有していた。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０２．５ ＨＱ（３００×８ｍｍ、Ｓｈｏｗａ，Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，東京、日本）であった。分子量マーカーは、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、０．５９×１０４Ｄａの分子量を有しているＳｈｏｄｅｘ標準プルランＰ−８２、８１０（ＤＰ６）、６７８（ＤＰ５）、５４６（ＤＰ４）、４１４（ＤＰ３）、および２８２Ｄａ（ＤＰ２）の分子量を有しているキシロオリゴ糖標準物、ならびに１８０Ｄａの分子量を有しているグルコースであり、これらのそれぞれの溶出容量が、左から右に向かって記号「ｘ」で示される。
【図８】スキージＷＵ−ＡＸのエンドキシラナーゼ処理によって生じたＡＸＯＳの１０ｋＤａおよび３０ｋＤａのＭＭＣＯを有している膜の連続的な通過による限外濾過後に得られたオリゴ糖画分のＨＰＳＥＣ分子量プロフィール。分析した画分は、１０ｋＤａの膜の保持物の３０ｋＤａのＭＭＣＯを通過させた後の保持物（ＲＥＴ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ）、１０ｋＤＡの膜の保持物の３０ｋＤａのＭＭＣＯを通過させた後の浸透液（ＰＥＲ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ）、または１０ｋＤａの膜を通過させた後の浸透液（ＰＥＲ１０ｋＤａ）のいずれかである。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０２．５ ＨＱ（３００×８ｍｍ、Ｓｈｏｗａ，Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，東京、日本）であった。分子量マーカーは、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、および０．５９×１０４Ｄａの分子量を有しているＳｈｏｄｅｘ標準Ｐ−８２プルラン、８１０（ＤＰ６）、６７８（ＤＰ５）、５４６（ＤＰ４）、４１４（ＤＰ３）、および２８２Ｄａ（ＤＰ２）の分子量を有しているキシロオリゴ糖標準物、ならびに１８０Ｄａの分子量を有しているグルコースであり、これらのそれぞれの溶出容量が、左から右に向かって記号「ｘ」で示される。
【図９】ニワトリの盲腸の中の微生物叢に対する、ＡＸＯＳ−７−０．３４、ＡＸＯＳ−１２２−０．６６、またはＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐのニワトリ用の飼料への添加の効果。盲腸の微生物叢の組成を、腸内細菌およびビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）についてプレートを数えることによって、実験の開始後１週間および２週間でそれぞれ決定した。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。任意の時点について、様々な文字を用いてマークした値は、テューキー検定にしたがうと互いにｐ＜０．０５で有意に異なる。
【図１０】１４日後のニワトリの盲腸の中のビフィズス菌の数に対する、０．１％または０．２５％のＡＸＯＳ−１５−０．２７、０．２５％または１％のフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）のニワトリ用の飼料への添加、またはエンドキシラナーゼの効果。ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌が定量的ＰＣＲによって測定された。様々な文字でマークされた値は、最小有意差検定にしたがうと互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５；ｎ＝３）。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。
【図１１】飼料を与え始めてから１３日後のラットの糞の中での、酢酸塩（上段のパネル）、プロピオン酸塩（中段のパネル）、および酪酸塩（下段のパネル）のレベルに対する、ラットの飼料に対する０．２５％のＡＸＯＳ−８−０．２７、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、ＡＸＯＳ−１６−０．７８、またはＡＸＯＳ−１２２−０．６６の添加の効果。様々な文字でマークされた値は、最小有意差検定にしたがうと互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５；ｎ＝４）。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。
【図１２】飼料を与え始めてから１４日後のラットの近接結腸中の酢酸塩（Ａ）、遠位結腸中の酢酸塩（Ｂ）、遠位結腸中のプロピオン酸塩（Ｃ）、および遠位結腸中の酪酸塩（Ｄ）のレベルに対する、ラットの飼料への４％のＡＸＯＳ−１５−０．２７またはＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐの添加の効果。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。
【図１３】飼料を与え始めてから１４日後の盲腸のビフィズス菌のレベルに対する、ラットの飼料への４％のＡＸＯＳ−１５−０．２７またはＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐの添加の効果。ビフィズス菌属に属する細菌が定量的ＰＣＲによって測定された。様々な文字で示された値は、最小有意差検定にしたがうと互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５；ｎ＝４）。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。
【図１４】健常なヒトボランティアの糞の中のビフィズス菌の数に対する、１４日間の間の４．８８ｇ／日のＡＸＯＳ−１５−０．２７または４．８１ｇ／日のＷＰＣの摂取の効果。ビフィズス菌属に属する細菌が定量的ＰＣＲによって測定された。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。星で示された棒は、ウイルコクソンの符号付き検定にしたがうと基底レベルとは有意な差を示す（ｐ＜０．０５；ｎ＝５）。
【図１５】窒素の尿による排出（Ａ）および便による排出（Ｂ）に対する、ならびに、盲腸通過時間（ｏｒｏ−ｃａｅｃａｌ ｔｒａｎｓｉｔ ｔｉｍｅ）（Ｃ）に対する１回だけの用量のＡＸＯＳ−１５−０．２７（０．２４、０．７３、２．２１、または４．８８ｇ）の摂取の効果。窒素の排出が、それぞれ、試験用の食事の摂取後０〜４８時間、および０〜７２時間の間に採取された尿または便の試料のいずれかの中に戻ってきた投与された１５Ｎ標識窒素の割合として表される。盲腸通過時間は、０〜７２時間の間に回収された糞試料中に存在する投与された３Ｈで標識されたＰＥＧの割合として表される。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。１つの星で示された棒、または２つの星で示された棒は、ウイルコクソンの符号付き検定にしたがうと、対照処置とは有意な差（それぞれ、ｐ＜０．０５（ｎ＝９）およびｐ＜０．０１（ｎ＝９））を示す。
【図１６】尿によるｐ−クレゾールの排出（Ａ）およびフェノールの排出（Ｂ）に対する１回だけの用量のＡＸＯＳ−１５−０．２７（０．２４、０．７３、２．２１、または４．８８ｇ）の摂取の効果。ｐ−クレゾールおよびフェノールの排出が、試験用の食事の摂取後０〜２４時間の間に採取された尿試料の中に戻ってきたｐ−クレゾールおよびフェノール含有量（ｍｇ）として表される。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。１つの星で示された棒、または２つの星で示された棒は、ウイルコクソンの符号付き検定にしたがうと対照処置とは有意な差（それぞれ、ｐ＜０．０５（ｎ＝９）およびｐ＜０．０１（ｎ＝９））を示す。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、前生物的な栄養的添加剤として使用するためのアラビノキシラン調製物に関し、そして、上記添加剤を用いてヒトの食事を補うことによってヒトの消化管の健康状態を改善する方法に関する。好ましい実施形態においては、アラビノキシラン調製物は、植物性の材料のような自然界に存在している供給源に由来し、より好ましくは、穀物に由来する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、所定のデンプン以外の多糖類（ＮＳＰ）を含む食品の消化管（より具体的には、腸の微生物叢）の健康状態に対するポジティブな作用に関係する。ＮＳＰには、様々な物理化学的特性を有している様々な化合物が含まれる。ペントサンとも呼ばれもアラビノキシランは穀物のＮＳＰの重要なグループであり、これはＯ−２および／またはＯ−３
α−Ｌ−アラビノ−フラノシル単位がそれに連結させられているβ−１，４−結合Ｄ−キシロピラノシル単位の主鎖から構成されている。典型的なアラビノキシランの中には、未置換の、１置換された、および２置換されたキシロース残基が存在している（図１を参照のこと）。アラビノキシランは、水で抽出できるか、または水では抽出できないかのいずれかである。後者は、アルカリ条件下、または酵素を使用することによって部分的に溶解させることができ、そして大量の水に結合する。水で抽出することができるアラビノキシランは、並外れた粘性を生じる能力を有している。一般的には、それらの分子量は、供給源と抽出方法によっては非常に大きい（８００，０００ダルトンまで）。これらは微量成分に過ぎないという事実にもかかわらず。これらは、コムギデンプン、パスタ、およびビールの製造、製パン、ならびに他の食品への適用のようなバイオテクノロジープロセスにおける穀物の機能性について重要である。
【０００３】
アラビノキシランまたはキシラン（β−１，４−結合Ｄ−キシロピラノシル単位の未置換のポリマー）に由来するオリゴ糖のいくつかのタイプは、前生物学的特性を発揮することが示されている。前生物学的物質は化合物、通常は非グルコシドオリゴ糖であり、これは、上部消化管の酵素によっては分解され得ないが、大腸の中のいくつかのタイプの腸内細菌によって選択的に発酵される（Ｇｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ，１９９５；Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ，１９８８；Ｖａｎ Ｌｏｏ，２００４）。食事の中に前生物学的物質が存在することにより、腸の細菌集団の組成にシフトが生じ、これは通常、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種の相対的な増加を特徴とする。腸の微生物叢のシフトは、全体的な健康状態の改善、腸の感染症の減少、腸の短鎖脂肪酸のレベルの増大、ミネラルのより良好な吸収、および結腸ガンの開始の抑制に関係している（Ｖａｎ Ｌｏｏ，２００４）。
【０００４】
２〜３の重合度（ＤＰ）を有しているオリゴ糖（キシロビオースおよびキロトリオース）が優位であるキシロ−オリゴ糖（ＸＯＳ、β−１，４−結合Ｄ−キシロピラノシル単位から構成されるオリゴ糖）の調製物は、ラットの糞および盲腸（ＥＰ０２６５９７０Ｂ１；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９７；Ｈｓｕら、２００４）、ならびにヒトの結腸（Ｏｋａｚａｋｉら、１９９０）の中のビフィズス菌のレベルの有意な増加を生じさせることが示されている。このようなキシロビオースを多く含むＸＯＳ調製物はまた、ラットにおいては化学物質によって誘導される結腸での発ガンの初期症状を抑制し（Ｈｓｅら、２００４）、そしてカルシウムの吸収を高める（Ｔｏｙｏｄａら、１９９３）。主に３〜５のＤＰを有しているアラビノキシロ−オリゴ糖（ＡＸＯＳ）から構成される調製物（アラビノシ
ルキシロビオース、アラビノシルキシロトリオース、アラビノシルキシロテトラロース、およびジアラビノシルキシロテトラオース）もまた、ラットおよびマウスの腸の中のビフィズス菌のレベルを増加させることが示されている（Ｙａｍａｄａら、１９９３）。
【０００５】
それらの商業的な可能性を厳しく制限する、現在市販されているＸＯＳ調製物についての１つの主要な欠点は、それらの価格水準が他のオリゴ糖と比較して非常に高いことであり、このことは、現在の製造プロセスは費用効率が悪いことを示している。２〜３のＤＰを有しているＸＯＳが優位である前生物学的調製物の製造については１つの方法が記載されており、これには、植物をベースにして作られた製品（広葉樹材、トウモロコシの穂軸、綿実殻、小麦ふすま、または醸造に使用された穀物）からの、ＮａＣｌＯ溶液と高濃縮ＫＯＨ溶液を使用するキシランの化学的抽出、その後の、エンドキシラナーゼ酵素による抽出されたキシランの酵素による加水分解が含まれる（ＥＰ０２６５９７０Ｂ１）。同様の方法が前生物学的ＡＸＯＳ調製物（３〜５のＤＰを有しているＡＸＯＳの調製物）を作製するために使用されており、これには、濃縮されたアルカリ溶液を使用するアラビノキシランの化学的抽出、その後の、塩類の除去、エンドキシラナーゼでの酵素による加水分解、および炭素カラム上でのクロマトグラフィーが含まれる（Ｙａｍａｄａら、１９９３）。これらの方法の主な欠点は、キシランまたはアラビノキシランの化学的抽出が環境にやさしくなく、そして酵素による加水分解を行うことができるまでに大規模な透析または限外濾過によるコストのかかる化学物質の除去が必要であることである。ＸＯＳまたはＡＸＯＳを生産するための別の方法には、広葉樹材または醸造に使用された穀物の熱水による自動加水分解（ａｕｔｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）が含まれる。この方法では、植物性の材料の懸濁液が特殊な反応容器の中で１５０〜１９０℃で２０〜６０分間加熱される（ＥＰ０２６５９７０Ｂ１；Ｋａｂｅｌら、２００２；Ｃａｒｖａｌｈｅｉｒｏら、２００４）。この方法の欠点は、高い反応温度のせいで、食品の目的には望ましくない副生成物（例えば、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、およびレブリン酸）が生じることである（Ｃａｒｖａｌｈｅｉｒｏら、２００４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在までに記載されたＸＯＳおよびＡＸＯＳの前生物学的調製物は、２（ＥＰ０２６５９７０Ｂ１）または４（Ｙａｍａｄａら、１９９３）のいずれかの平均重合度を有している。食品分野での特定の用途については、これらの調製物にはいくつかの欠点がある。第１に、この調製物にはキシロースが多く含まれており、これはスクロースの約６０％の甘味を有している（Ｓｕｎｔｏｒｙ、キシロオリゴ糖、パンフレットおよび製品説明書、２００１）。甘味は、一部の用途について所望され得るが、他の用途については、より自然な風味がより望ましい。平均重合度が低いキシロオリゴ糖もまた、スクロースの約４０％の甘味を有している（Ｓｕｎｔｏｒｙ、キシロオリゴ糖、パンフレットおよび製品説明書、２００１）。第２に、平均重合度が低い調製物は、低カロリー食品の成分においては望ましくないエネルギレベルを有している。キシロオリゴ糖のエネルギ値の計算については、キシロースの代謝エネルギ値は、キシロビオースおよびキシロトリオースについては１グラムあたり４カロリー、１ｇあたり２カロリーと考えられ、＞４のＤＰを有しているキシロ−アラビノ−オリゴ糖については１ｇあたり０カロリーとみなされる（Ｓｕｎｔｏｒｙ、キシロオリゴ糖、パンフレットおよび製品説明書、２００１）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、アラビノキシランを含む栄養的添加剤に関する。これは、ヒトの腸内微生物叢の調節を手助けする。さらに、添加剤を含むいくつかの食品および飲料、さらには、上記添加剤を調製するための方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
詳細な説明
発明の記述
特定のアラビノキシラン調製物を含む補給用の飼料または食品の前生物学的効果は以前に記載されている。より具体的には、先行技術によって、４未満の平均重合度（ＤＰ）を有している一方のキシロ−アラビノ−オリゴ糖に対する、および長鎖の自然界に存在しているアラビノキシランを含む他方のアラビノキシラン調製物に対するビフィズス菌特異的効果の例が提供されている。
【０００９】
市販されているキシロ−アラビノ−オリゴ糖調製物は、激しい、制御されていない脱重合化条件下で生産され、これによって、比較的高レベルのキシロースおよび短いキシロ−オリゴ糖の存在を生じる。これらには甘味がある。これらの調製物の甘味により、特定の食品へのそれらの使用が制限される。さらに、４未満のＤＰを有しているキシロ−アラビノ−オリゴ糖分子は、低カロリー食品には望ましくない代謝エネルギ含有量を有している。
【００１０】
自然界に存在しているアラビノキシランの物理化学的特性（例えば、高い粘性および高い保水力）により、これらは広い範囲の食品での使用には適していない。自然界に存在しているアラビノキシランの部分的な脱重合化によってそれらの物理化学的特性が改善されており、そして、約５８の平均ＤＰを有しているアラビノキシラン分子を含む調製物が記載されている。しかし、これらの部分的に脱重合化されたアラビノキシランのヒトでの前生物学的効果は、比較的高用量（１日あたり＞６ｇ；Ｇｒａｓｔｅｎら、２００３）でしか明らかにされていない。
【００１１】
本発明は、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランを含むアラビノキシラン調製物が、ヒトおよびヒト用のモデルとしての役割を果たす。試験動物に投与された場合には、強力な前生物学的物質であるとの知見に基づく。さらに、このような調製物は、自然界に存在しているアラビノキシランまたは短鎖のキシロ−アラビノ−オリゴ糖のいずれかを含む調製物の物理化学的または感覚刺激性の不都合のいずれをも有さない。ヒト、ラット、およびニワトリのいずれにおいても、本発明のアラビノキシラン調製物が５８以上の平均ＤＰを有している部分的に脱重合化されたアラビノキシランを含む調製物よりも強いビフィズス菌特異的効果を有していることもまた明らかにされた。加えて、本発明のアラビノキシラン調製物は、結腸の遠位部分においてそれらの前生物学的効果を主に発揮し、一方、短鎖キシロオリゴ糖は結腸の近位部分においてより活性であることが観察された。これらによって遠位結腸の微生物叢の組成と結腸の疾患（特に、結腸ガン）の発症との間の関係が明らかであるので、この発見は特に重要である。次に、前生物学的効果自体もまた、本発明のアラビノキシラン調製物の使用に関する他の有用な効果であることが、尿による窒素の排出の減少、および同時に起こる便によるＮの排出の増加、さらには、クレゾールおよびフェノールの尿による排出の減少などとして見られた。
【００１２】
したがって、第１の目的においては、本発明によって、食品添加物として、または栄養補給用製品の主成分として使用されるアラビノキシラン調製物が提供される。アラビノキシラン調製物は、上記調製物に含まれるアラビノキシラン分子が５から５０の間で変化する平均ＤＰを有することを特徴とする。好ましい実施形態においては、アラビノキシラン調製物には、前記アラビノキシラン分子が少なくとも１５％含まれる。より好ましい実施形態においては、これらの調製物には、３０％を超える（例えば、６０％を超える）上記アラビノキシランが含まれる。さらに好ましい実施形態においては、本発明の調製物に含まれるアラビノキシランは、７から４０の間の平均ＤＰを、さらに好ましくは、７から２０の間のＤＰを有する。好ましくは、本発明の調製物に含まれるアラビノキシランの９０％が、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を使用して決定すると、２から
６５０の間、より好ましくは、２から１３０の間のＤＰを有する。
【００１３】
好ましい実施形態においては、本発明のアラビノキシラン調製物は、自然界に存在している供給源、例えば、植物性の材料から、より好ましくは、穀物から得ることができる。これらは、上記の自然界に存在しているアラビノキシランの選択された画分であることができ、また、上記自然界に存在しているアラビノキシランの脱重合または断片化によって得ることができ、また、これらは、化学的、酵素的、および／または物理的プロセスによって生産された構造類似物であることもできる。好ましい実施形態においては、アラビノキシラン調製物は、ＷＰＣ（Ｐｆｅｉｆｅｒ ＆ Ｌａｎｇｅｎ）のような、グルテン−デンプン分離プロセスの副流に由来する。別の好ましい実施形態においては、アラビノキシラン調製物は、穀物のふすまに由来する。
【００１４】
本発明のアラビノキシラン調製物の前生物学的効果は、食品によって投与された場合には、１回分について０．２５ｇの用量で観察された。したがって、第２の目的においては、本発明によって、本発明のアラビノキシラン調製物を含む食品または飲料が提供される。好ましい実施形態においては、この食品または飲料には、１回分について、０．１から５ｇの間の本発明のアラビノキシラン調製物が含まれる。より好ましい実施形態においては、食品または飲料には、１回分について、０．２５から５ｇの間の本発明のアラビノキシラン調製物が含まれる。より好ましい実施形態においては、食品または飲料には、１回分について、１から３ｇの間の本発明のアラビノキシラン調製物が含まれる。別の好ましい実施形態においては、食品または飲料には、１回分について、０．１から５ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる。より好ましい実施形態においては、食品または飲料には、１回分について、０．２５から５ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる。さらに好ましい実施形態においては、食品または飲料には、１回分について、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる。上記に示されるように、本発明のアラビノキシラン調製物は、低カロリー食品への有用な添加物として特に適している。
【００１５】
特定の実施形態においては、食品は乳製品、例えば、ヨーグルトまたはフレッシュチーズである。好ましくは、上記乳製品には、１２５ｇの１回分について１００ｇあたりで、０．２５から５ｇの間、より好ましくは１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる。状況に応じて、上記乳製品には、生存しているビフィズス菌属または乳酸菌属の細菌が含まれる。これらはアラビノキシランを発酵させることができる。別の特定の実施形態においては、本発明の飲料は、いわゆるアルコールを含まない機能性清涼飲料である。好ましくは、このような機能性清涼飲料には、１００ｍｌあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる。あるいは、上記機能性清涼飲料には、所望される量のこのようなアラビノキシランが２５０ｍｌ中に含まれる。特定の実施形態においては、上記機能性清涼飲料には、生存しているビフィズス菌属または乳酸菌属の細菌が含まれる。これらはアラビノキシランを発酵させることができる。
【００１６】
一般的には、有効成分として穀物または穀物に由来する物質を含む食品にはアラビノキシランが含まれる。しかし、これらの食品に含まれるアラビノキシランは、６０００を超えるＤＰを有している長鎖の自然界に存在しているアラビノキシランであるか、または少なくとも２００から３００のＤＰを有している部分的に脱重合化させられたアラビノキシランであるかのいずれかである。したがって、本発明のアラビノキシランが上記食品に多く含まれることによってまた、それらの栄養価も改善される。好ましくは、このような富化は、穀物を含む食品の調製の間に、材料の１つとして所定の量の本発明のアラビノキシラン調製物を添加することによって得られる。このような富化によって、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランの集団に加えて、２００以上のＤＰを有しているアラビ
ノキシランを含む穀物を含む食品が得られることは明らかである。上記集団は、５から５０の間の平均ＤＰを特徴とする。当業者は、２００を下回るＤＰを有しているアラビノキシランの上記集団での穀物を含む食品の富化は、これらの食品の調製の間に、適切な条件下でキシラン分解酵素を使用することによって、少なくとも一部得ることができることを理解するであろう。特定の実施形態においては、上記食品は、パンのようなベーカリ製品である。好ましくは、上記パンには、１００ｇあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが多く含まれている。別の実施形態においては、食品はケーキのようなペストリ製品である。好ましくは、上記ペストリ製品には、１００ｇあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが多く含まれている。さらに別の実施形態においては、食品はパスタ製品である。好ましくは、上記パスタ製品には、８０ｇあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが多く含まれている。さらに別の実施形態においては、食品は、朝食用シリアルである、好ましくは、上記朝食用シリアルには、３０ｇあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが多く含まれている。さらに別の実施形態においては、食品はビスケットであり、例えば、朝食用の乾いたビスケットである。好ましくは、上記ビスケットには、１２５ｇあたり０．２５から５ｇの間、より好ましくは、から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが多く含まれている。
【００１７】
本発明のアラビノキシラン調製物を補給することを手助けすることができる他の食品は、例えば、ひき肉製品、チョコレート、クッキー、バー（ｂａｒｓ）、およびデザート用のプリンのようなデザートであるが、これらに限定はされない。
【００１８】
本発明の第３の目的によっては、本発明のアラビノキシラン調製物を含む食品補給製品（ｆｏｏｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔ）が提供される。好ましい実施形態においては、食品補給製品は、カプセル、錠剤、粉末などである。より好ましい実施形態においては、食品補給製品は、それによって０．１および５ｇの、より好ましくは、０．２５から５ｇの間、例えば、１から３ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランの連日投与が可能であるように処方される。
【００１９】
第５の目的においては、本発明によって、本発明のアラビノキシラン調製物を調製するための方法が提供される。第１の実施形態においては、この方法には以下の工程が含まれる：
ｉ．ふすま、小麦粉、または小麦スキージ（ｗｈｅａｔ ｓｑｕｅｅｇｅｅ）のようなアラビノキシランを多く含む材料から水で抽出できないアラビノキシラン画分を、上記アラビノキシランを多く含む材料の除デンプン（ｄｅｓｔａｒｃｈｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および除タンパク（好ましくは、それぞれ、デンプン分解酵素およびタンパク質分解酵素を使用して）によって単離する工程
ｉｉ．１つ以上のキシラン分解酵素を使用して水で抽出できないアラビノキシラン画分を脱重合化させる工程。
【００２０】
第２の実施形態においては、この方法には以下の工程が含まれる：
ｉ．部分的に脱重合化された水で抽出することができるアラビノキシランを含む調製物、例えば、デンプン−グルテン分離プロセスの副流によって得られる調製物を得る工程
ｉｉ．必要に応じて、上記アラビノキシランを含む調製物からデンプンおよびタンパク質を（好ましくは、それぞれ、デンプン分解酵素およびタンパク質分解酵素を使用して）除去する工程。
【００２１】
ｉｉｉ．１つ以上のキシラン分解酵素を使用して上記調製物中に含まれるアラビノキシランを脱重合化させる工程。
【００２２】
特定の実施形態においては、調製物は、調製物から４以下のＤＰを有している単糖およびオリゴ糖の量を減少させるために、キシラン分解酵素での処理の後に限外濾過に供される。
【００２３】
最後の目的においては、本発明によって、穀物を含む食品中の２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランの集団の濃度および平均ＤＰを分析するための方法が提供される。上記方法には以下の工程が含まれる：
ｉ．穀物を含む食品の試料を、好ましくは、上記試料を乾燥または凍結乾燥させた後に粉砕する工程；
ｉｉ．粉砕した試料を蒸留水中で抽出する工程；
ｉｉｉ．全てのデンプンをグルコースに変換するために、適切な条件下でデンプン分解酵素で（例えば、アミラーゼでの処理、その後のアミログルコシダーゼでの処理を使用して）抽出物を処理する工程；
ｉｖ．（ｉｉｉ）で得られた試料から、例えば、酵母を使用してグルコースを代謝させることによって、グルコースを除去する工程；
ｖ．（ｉｖ）で得られた試料に含まれるアラビノキシランの分子量プロフィールを、好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して決定する工程；
ｖｉ．例えば、ＨＰＬＣ曲線下の表面積の分析によって、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシラン画分の相対的な量および平均ＤＰを計算する工程。
【００２４】
本発明は、以下に記載される例示的な実施形態によってさらに説明される。
例示的な実施形態
［実施例］
実施例１：＞４の平均ＤＰを有しているＸＯＳ／ＡＸＯＳの調製
材料および方法
Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ。キシロビオース、キシロトリオース、およびキシロテトラオースから主に構成される市販されているキシロオリゴ糖調製物Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐは、Ｓｕｎｔｏｒｙ Ｌｔｄ．（東京、日本）から入手した。
【００２５】
小麦ふすまからの水で抽出できないアラビノキシランの調製。ふすまの水で抽出できないアラビノキシラン（ＷＵ−ＡＸ）の調製のために、市販されている小麦ふすま（Ｍｅｎｅｂａ Ｍｅｅｌ ＢＶ，ロッテルダム、オランダ）を出発材料として使用した。アラビノキシラン以外の材料は、Ｍａｅｓら（２００４）に記載されている方法にしたがって、酵素処理によってふすまから部分的に除去した。小麦ふすまの水への懸濁液（１：７ｗ／ｖ）を、熱安定性α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ １２０ＬＳ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；１μｌ／ｇの小麦ふすま）で９０℃で９０分間処理して、デンプンを加水分解させた。５０℃に冷却した後、懸濁液のｐＨを濃ＨＣｌを使用して６．０に調整し、懸濁液をプロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ ０．８Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；１５０μｌ／ｇの小麦ふすま）と共に５０℃で２４時間インキュベートして、残っているタンパク質を加水分解した。その後、懸濁液を沸騰させて濾過し、濾液を廃棄した。残渣（「ふすまＷＵ−ＡＸ」と呼ぶ）を水で洗浄し、風乾させた。
【００２６】
小麦粉または小麦スキージデンプンからの水では抽出できないアラビノキシランの調製。小麦粉は、標準的な方法（ＭｃＲｉｔｃｈｉｅ，１９８５）を使用して４つの異なる画分に分画することができる：Ａ−デンプン（主要なデンプン）、Ｂ−デンプン（スキージデンプンまたはくず）、グルテン、および水溶性画分。ＷＵ−ＡＸはスキージデンプン画
分の中に濃縮される。アラビノキシラン以外の物質は、酵素処理によってスキージ画分から部分的に除去した。スキージデンプンの水への懸濁液（１：６ｗ／ｖ）を、最初に、熱安定性α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ １２０ＬＳ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；３０μｌ／ｇスキージデンプン）で９０℃で６０分間、そしてアミログルコシダーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ブレー、アイルランド，２０μｌ／ｇスキージデンプン）で６０℃で１６時間処理して、デンプンを加水分解させた。３０分間沸騰させて遠心分離した後、残渣をプロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ ０．８Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク，２０μｌ／ｇスキージデンプン）と共に５０℃で２０時間インキュベートして、残っているタンパク質を加水分解した。その後、懸濁液を再び沸騰させて（３０分間）、濾過し、そして濾液を廃棄した。残渣（「小麦粉ＷＵ−ＡＸ」と呼ぶ）を水、エタノール（９５％ｖ／ｖ）で洗浄し、風乾させた。小麦デンプンからＷＵ−ＡＸを抽出するのではなく、ＷＵ−ＡＸはまた、小麦スキージデンプンから直接単離することもできる。この場合、産業的なデンプン−グルテン分離プロセスの市販されている副流であるＭｅｒｉｔｅｎａ ２３３（Ｔａｔｅ ＆ Ｌｙｌｅ，アールスト、ベルギー）を、出発材料として使用した。水中のＭｅｒｉｔｅｎａ ２３３の懸濁液（１：５ｗ／ｖ）を、続いて、熱安定性α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ １２０ＬＳ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；３０μｌ／ｇのＭｅｒｉｔｅｎａ ２３３）で９０度で６０分間、そしてアミログルコシダーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ブレー、アイルランド；２０μｌ／ｇ Ｍｅｒｉｔｅｎａ ２３３）で６０度で１６時間処理して、デンプンを加水分解させた。３０分間の沸騰と遠心分離の後、残渣をプロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ ０．８Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；２０μｌ／ｇのＭｅｒｉｔｅｎａ ２３３）とともに５０℃で２０時間インキュベートして、残っているタンパク質を加水分解させた。その後、懸濁液を再び沸騰させ（３０分間）、濾過し、そして濾液を廃棄した。残渣を「スキージＷＵ−ＡＸ」と呼び、これを水、エタノール（９５％ｖ／ｖ）で洗浄し、風乾させた。
【００２７】
小麦ペントサン濃縮物（Ｗｈｅａｔ Ｐｅｎｔｏｓａｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ：ＷＰＣ）。小麦ペントサン濃縮物（ＷＰＣ、Ｐｆｅｉｆｅｒ ＆ Ｌａｎｇｅｎ，ドルマーゲン、ドイツ）は小麦粉に由来し、その化学的組成は、Ｃｏｕｒｔｉｎ ａｎｄ Ｄｅｌｃｏｕｒ（１９９８）によって詳細に記載されている。ＷＰＣは水で抽出することができるアラビノキシラン（ｃａ．４３％）とタンパク質物質（ｃａ．３０％）とを多く含む。残りの部分は主に、アラビノガラクタンペプチド（ｃａ．１４％）と、それより少ない程度の重合体グルコース（６％）から構成される。
【００２８】
１２２のａｖＤＰと、０．６６のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−１２２−０．６６）の調製。ＡＸＯＳ−１２２−０．６６の調製のための出発材料は市販の小麦ペントサン濃縮物（ＷＰＣ，Ｐｆｅｉｆｅｒ ＆ Ｌａｎｇｅｎ，ドルマーゲン、ドイツ）であった。ＷＰＣを脱イオン水に溶解させ（１：１０ｗ／ｖ）、そしてシリカを水性懸濁液（２０％ｗ／ｖ）として、シリカ／タンパク質の比が７：１になるまで添加した。シリカへのタンパク質の最大吸着を得るために、混合物のｐＨを０．１ＭのＨＣｌを使用して４．８に調整した。３０分の攪拌の後、懸濁液をブフナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）濾過した。シリカ／タンパク質を含む残渣を廃棄し、一方、濾液はエタノール沈殿させた。エタノール（９５％ｖ／ｖ）を連続攪拌下で添加して、６５％（ｖ／ｖ）の最終濃度とし、さらに３０分間の攪拌の後、落ち着かせ（２４時間、４℃）、そして濾過した。得られた残渣は、溶媒を乾燥させ（エタノール、アセトン、およびジエチルエーテル）、そして風乾させた。得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００２９】
１６のａｖＤＰと、０．７８のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−１６−０．７８）の調製。ＡＸＯＳ−１６−０．７８を、市販の小麦ペントサン濃縮物（ＷＰＣ，Ｐｆｅｉｆｅｒ ＆ Ｌａｎｇｅｎ，ドルマーゲン、ドイツ）から出発して調製した。ＡＸ
ＯＳ−１２２−０．６６の調製について記載したように、タンパク質を除去するためにＷＰＣをシリカで処理した。回収した濾液を、小麦ペントサン濃縮物１ｇあたり２９単位のアスペルギルス・アクリエート（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）由来のエンドキシラナーゼであるＸＡＡ（Ｓｈｅａｒｚｙｍｅ ５００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク）とともに３０℃で２４時間、さらにインキュベートした。沸騰（３０分間）による酵素の不活化の後、得られた溶液を冷却し、エタノール沈殿を行った。エタノール（９５％ｖ／ｖ）を連続攪拌下で、最終濃度が８０％（ｖ／ｖ）になるように添加して、さらに３０分間の攪拌の後、落ち着かせ（２４時間、４℃）、そして濾過し、得られた残渣を脱イオン水に溶解させ、再びエタノール沈殿させた。エタノール（９５％ｖ／ｖ）を、連続攪拌下で、最終濃度が６５％（ｖ／ｖ）になるように添加して、さらに３０分間の攪拌の後、落ち着かせ（２４時間、４℃）、そして濾過した。沈殿した物質を除去した。残った上清を、エタノールを除去するために回転式エバポレーションし、脱イオン水に溶解させ、そして凍結乾燥させた。得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００３０】
７のａｖＤＰと、０．３４のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−７−０．３４）の調製。ＡＸＯＳ−７−０．３４の調製のための出発材料は、上記に記載したように単離したふすまＷＵ−ＡＸであった。続いて、ふすまＷＵ−ＡＸを、１ｇの乾燥した状態の単離したふすまＷＵ−ＡＸあたり８０単位のエンドキシラナーゼＸＢＳ（Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ Ｈ６４０，ダニスコ、デンマーク）とともに、３０℃で２４時間インキュベートした。濾過、および沸騰（３０分間）による酵素の不活化の後、濾液を凍結乾燥させ、そして得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００３１】
１５のａｖＤＰと、０．２７のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−１５−０．２７）の調製。市販の小麦ふすま（Ｄｏｓｓｃｈｅ Ｍｉｌｌｓ ＆ Ｂａｋｅｒｙ，デーンズ、ベルギー）をＡＸＯＳ−１５−０．２７の調製のための出発材料として使用した。小麦ふすまの水への懸濁液（１：７ｗ／ｖ）を、最初に、熱安定性α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ １２０ＬＳ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバーグ、デンマーク；１μｌ／ｇの小麦ふすま）で９０℃で９０分間処理して、デンプンを加水分解させた。５０℃に冷却した後、懸濁液のｐＨを濃ＨＣｌを使用して６．０に調整し、懸濁液をプロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ ０．８Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク；４０μｌ／ｇの小麦ふすま）と共に５０℃で４時間インキュベートして、残っているタンパク質を加水分解した。その後、懸濁液を２０分間沸騰させて濾過し、濾液を廃棄した。残渣を水で洗浄し、脱イオン水に再懸濁させた（１：１４ｗ／ｖ）。懸濁液を、デンプンを除去し（ｄｅｓｔａｒｃｈｅｄ）そしてタンパク質を除去した（ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｓｅｄ）小麦ふすま１ｇあたり１．４単位のエンドキシラナーゼＸＢＳ（Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ
Ｈ６４０，ダニスコ、デンマーク）とともに、５０℃で１０時間、連続攪拌下でインキュベートし、デンプンを除去しそしてタンパク質を除去した小麦ふすま１ｇあたり１．１単位の、２回目の用量のエンドキシラナーゼＸＢＳの添加後、５０℃でさらに１０時間インキュベートした。沸騰（３０分間）による酵素の不活化の後、溶液を、薄膜降下式エバポレーターの中で２０％の乾燥物質となるまで濃縮させ、最後に噴霧乾燥機の中で乾燥させた。
【００３２】
８のａｖＤＰと、０．２７のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−８−０．２７）の調製。ＡＸＯＳ−８−０．２７は、ＡＸＯＳ−１５−０．２７の溶液（１：１０ｗ／ｖ）を、１ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７あたり１２５単位のアスペルギルス・アクリエート由来のエンドキシラナーゼであるＸＡＡ（Ｓｈｅａｒｚｙｍｅ ５００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク）とともに３０℃で１時間インキュベートすることによって調製した。沸騰（３０分間）による酵素の不活化の後、溶液を凍結乾燥させ、得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００３３】
３９のａｖＤＰと、０．２２のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−３９−０．２２）の調製。ＡＸＯＳ−３９−０．２２を、上記のＭｅｒｉｔｅｎａ ２３３ Ｂ−ｓｔａｒｃｈから単離した小麦スキージＷＵ−ＡＸから調製した。０．６３の平均Ａ／Ｘ比を有しているスキージＷＵ−ＡＸを２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）に３ｇ／ｌで懸濁させ、そして１ｇのスキージＷＵ−ＡＸあたり３．３単位のエンドキシラナーゼＸＢＳ（Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ Ｈ６４０，ダニスコ、デンマーク）とともに３０℃で２時間、連続攪拌下でインキュベートした。遠心分離（１０，０００ｇ、１５分間、１８℃）後、上清を３０分間沸騰させて酵素を不活化させ、一方、残渣は、先に記載した酢酸ナトリウム緩衝液（最初の容量の１／４）で洗浄した。洗浄水を不活化させ（３０分、１００℃）、そして上清と混合した。濾過後、得られた溶液を凍結乾燥させると、２６２のａｖＤＰＧＣと０．５０のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳが得られた。酵素を溶解させた物質をさらに脱イオン水に溶解させ（１：２０ｗ／ｖ）、ＨＣｌ（１Ｍ）の添加によって溶液のｐＨを２．８にした。この溶液を、ＡＸＯＳのβ−１，４−結合キシロースサブユニットよりも酸加水分解されやすいと思われるα−１，２−およびα−１，３−結合アラビノース置換基の大きな画分を除去するために、９０℃で２４時間インキュベートした。室温に冷却した後、溶液を１ＭのＮａＯＨの添加によって中和し、そして遠心分離した（１０，０００ｇ、２０分間、１８℃）。エタノール（９５％ｖ／ｖ）を、得られた上清に対して連続攪拌下で添加して、最終エタノール濃度を８０％（ｖ／ｖ）とした。混合物をさらに３０分間攪拌し、一晩４℃に保った。沈殿したＡＸＯＳ化合物を遠心分離（１０，０００ｇ、２０分間、４℃）によって回収し、脱イオン水中に溶解させ、凍結乾燥させ、そして得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００３４】
１３のａｖＤＰと、０．２１のＡ／Ｘ比を有しているＡＸＯＳ（ＡＸＯＳ−１３−０．２１）の調製。ＡＸＯＳ−１３−０．２１は、ＡＸＯＳ−３９−０．２２の溶液（３ｇ／ｌ）を、１ｇのＡＸＯＳ−３９−０．２２あたり２７．７単位のアスペルギルス・アクリエート由来のエンドキシラナーゼであるＸＡＡ（Ｓｈｅａｒｚｙｍｅ ５００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバーグ、デンマーク）とともに３０℃で２時間インキュベートすることによって調製した。沸騰（３０分間）による酵素の不活化の後、溶液を凍結乾燥させ、そして得られた物質をホモジナイズし、２５０μｍの篩にかけた。
【００３５】
単離した調製物の特性決定
種々の技術を使用してオリゴ糖調製物を特性決定した。
【００３６】
全糖含有量および還元末端糖含有量を、Ｃｏｕｒｔｉｎら（２０００）に記載されているように、気体−液体クロマトグラフィー分析によって決定した。試料のアラビノキシラン（ＡＸ）含有量を、０．８８ｘ（％アラビノース＋％キシロース）として表した。気体−液体クロマトグラフィーによって決定したＡＸＯＳの平均重合度（ａｖＤＰＧＣ）を、還元末端キシロース含有量で割り算した全キシロース含有量と全アラビノース含有量の和として計算した。試料のタンパク質含有量（Ｎ×５．７）を、デュマ法（Ｄｕｍａｓ ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ＡＯＡＣ公式方法（ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ
Ｍｅｔｈｏｄ（１９９５））の採用によって決定した。
【００３７】
調製物中の構成オリゴ糖のプロファイリングを、ＥＤ−４０電気化学的検出器、ＧＰ−５０勾配ポンプ、およびＡＳ−３５００自動サンプリング装置を備えたＤｉｏｎｅｘ ＤＸ−５００クロマトグラフィーシステム（サニーベール、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、パルスアンペロメトリック検出を用いる高速陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｐｕｌｓｅｄ Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ））によって行った。試料（１０ｍｇ）を精製した脱イオン水（２ｍｌ、比
抵抗率１８ｍΩ−ｃｍ）に溶解させ、濾過し、そしてＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ−１００陰イオン交換カラム（４×２５０ｍｍ）に取り付けたＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ−１００ガードカラム（４×２５ｍｍ）に注入（２５μｌ）した。溶出（１．０ｍｌ／分）を、３０分間の１００ｍＭのＮａＯＨ中の０から２５０ｍＭの酢酸ナトリウムの直線勾配によって、その後に、１５分間の１００ｍＭのＮａＯＨ中の２５０から４００ｍＭの酢酸ナトリウムの直線勾配で行った。勾配の後、カラムを、１００ｍＭのＮａＯＨで５分間溶出させた。溶出液を、電位および時間についての以下の設定を含むパルスアンペロメトリック検出形式で、ＥＤ−４０検出器を使用してモニターした：Ｅ１＋０．０５Ｖ（ｔ１＝４００ｍｓ）；Ｅ２＋０．７５Ｖ（ｔ２＝２００ｍｓ）；Ｅ３−０．１５Ｖ（ｔ３＝４００ｍｓ）。アラビノース（Ａ）、キシロース（Ｘ１）、キシロビオース（Ｘ２）、および３から６のＤＰを有しているＸＯＳ（Ｘ３からＸ６）を参照として使用した。
【００３８】
高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を、自動注入器を備えたＨＰＬＣシステム（Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，３２５ポンプシステム，Ｋｏｎｔｒｏｎ，ミラノ、イタリア）で行った。全ての調製物を０．３％の塩化ナトリウム（１．５ｍｌ）に溶解させ、濾過し、そしてＳｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０６ ＨＱ ＨＰＳＥＣカラム（３００×８ｍｍ、分離範囲：１×１０２〜２０×１０６Ｄａ）に取り付けたＳｈｏｄｅｘ ＳＢ−８００Ｐガードカラム（Ｓｈｏｗａ，Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，東京、日本、５０×６ｍｍ）に注入（２０μｌ）した。溶出は０．３％の塩化ナトリウム（０．５ｍｌ／分；３０℃）で行い、屈折率検出装置（ＶＤＳ Ｏｐｔｉｌａｂ，ベルリン、ドイツ）を用いてモニターした。分子量マーカーは、７８．８×１０４、４０．４×１０４、２１．２×１０４、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、０．５９×１０４Ｄａの分子量を有しているＳｈｏｄｅｘ標準Ｐ−８２プルラン（２．０ｍｇ／ｍｌ）と、１８０Ｄａの分子量を有しているグルコースであった。高速サイズ排除クロマトグラフィー（ａｖＤＰＨＰＳＥＣ）によって決定したオリゴ糖の平均重合度（ａｖＤＰ）をＭＭＨＰＳＥＣ／１３２として計算した。
【００３９】
キシラン分解酵素の活性の決定。キシラン分解酵素の活性を、アッセイについての製造業者の説明書にしたがって不溶性物質としてキシラザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ブレー、アイルランド）を使用して比色によって測定した。１単位は、アッセイ条件下で５９０ｎｍで１．０の消光の変化を生じるために必要な酵素の量と定義した。
【００４０】
結果および考察
様々なタイプのＡＸＯＳを、材料および方法に記載したように、小麦ふすま、小麦粉、または小麦スキージデンプンのいずれかから調製した。様々な調製物の特性を、アラビノキシラン含有量、平均置換度（キシロースに対するアラビノースの比）、および平均重合度に関して表１に示す。ここでは、これらを、既知の前生物学的特性を有している市販されているＸＯＳ調製物であるＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９７；Ｈｓｕら、２００４）の特性と比較した。表１と本明細書中に後で使用した命名法にしたがって、ＡＸＯＳ調製物をＡＸＯＳ−ｘ−ｙと呼ぶ。ここでは、ｘは気体−液体クロマトグラフィーによって決定した平均重合度であり、ｙはキシロースに対するアラビノースの比である。様々な調製物は、７から１２２までの範囲の平均重合度（Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐについての２と比較）、および０．２１から０．７８までの範囲の置換度（Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐについての０．０９と比較）を有していた。小麦ふすまに由来する調製物（ＡＸＯＳ−７−０．３４、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、ＡＸＯＳ−８−０．２７）は、小麦粉に由来する調製物（ＡＸＯＳ−１２２−０．６６、ＡＸＯＳ−１６−０．７８）よりも低い置換度を有していた。本発明者らはまた、ＡＸＯＳ化合物の置換度を酸での処理によって低下させることができることも示した。実際、ＡＸＯＳ−３９−０．２２は、酸での処理を含む種々の工程によってスキージＷＵ−ＡＸから調製し（材料および方法を参照のこと）、そしてこれによって、平均置換度は、スキージＷＵ−ＡＸの０
．６３からＡＸＯＳ−３９−０．２２の０．２２にまで低下する。
【００４１】
図２は、ＨＰＳＥＣによって決定した種々のＡＸＯＳ調製物の分子量分布を示す。全てのＡＸＯＳ調製物は多分散性であり、そして気体−液体クロマトグラフィーによって決定すると、ａｖＤＰに近い状態のピークを有している分子的実体から構成されていた。ＨＰＳＥＣ溶出プロフィールから決定した、そのオリゴ糖の９０％がその中に入る重合度の範囲を、様々なＡＸＯＳ調製物について表１に提供する。
【００４２】
実施例２：ＸＯＳ／ＡＸＯＳ調製物の物理化学的特性および感覚的特性
材料および方法
オリゴ糖調製物。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、ＡＸＯＳ−３９−０．２２、およびＡＸＯＳ−１３−０．２１は、実施例１の材料および方法に記載したように入手した。フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）調製物は市販されている製品Ｒａｆｔｉｌｏｓｅ（Ｏｒａｆｔｉ，チーネン、ベルギー）であった。感覚的分析に使用したＡＸＯＳ−１５−０．２７を最初に水に溶解（１：２５ｗ／ｖ）させ、活性炭素で処理して、生産プロセスに起因する起こりうるオフフレーバを除去した。ＡＸＯＳ−１５−０．２７と活性炭素（０．７５ｇ／ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７）の懸濁液を１８℃で１時間攪拌し、デカンテーションの後、活性炭素を遠心分離（１００００ｇ、３０分間、１８℃）によって除去した。
【００４３】
安定性の測定。安定性の測定は、オリゴ糖調製物の水で抽出することができる部分について行った。これは、脱イオン水中への調製物の懸濁（１：１０ｗ／ｖ）、その後の震盪（２時間、１８℃）、遠心分離（１０，０００ｇ、２０分間、１８℃）、および濾過によって得た。濾過物の凍結乾燥の後、水で抽出することができる試料を、２、３、７、および１１のｐＨ値を有している共通の緩衝液に溶解させると、０．１５％（ｗ／ｖ）のオリゴ糖濃度を有する溶液が得られた。共通の緩衝液は、水（１．０Ｌ）中の６．０ｇのクエン酸、３．９ｇのリン酸二水素カリウム、１．８ｇのホウ酸、および５．８ｇのジエチルバルビツール酸のストック溶液から調製した（Ｂｒｉｔｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｆｏｒｄ，１９３７）。このストック溶液のアリコート（２０ｍｌ）を、２．０ＭのＨＣｌまたは２．０ＭのＮａＯＨのいずれかで調整して、所望されるｐＨとした。オリゴ糖溶液のそれぞれを、様々な時間の間（０、５、１０、１５、２０、３０、および６０分間）、沸騰水の中に維持した。その後、溶液を冷却し、全単糖含有量および還元末端糖含有量を、実施例１の材料および方法に記載したように、気体−液体クロマトグラフィーによって測定した。ＦＯＳの分解の割合を式（１）を用いて計算し、一方、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５ＰおよびＡＸＯＳ−１５−０．２７の分解の割合を式（２）を用いて計算した。ＦＯＳの加水分解の割合、ならびに、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５ＰおよびＡＸＯＳ−１５−０．２７の加水分解の割合を、それぞれ、式（３）および（４）を用いて計算した。
【００４４】
（１）％分解＝（時間０およびｐＨ７での全グルコース＋マンノース濃度）−（全グルコース＋マンノース濃度）／（時間０およびｐＨ７での全グルコース＋マンノース濃度）
（２）％分解＝（時間０およびｐＨ７での全キシロース＋アラビノース濃度）−（全キシロース＋アラビノース濃度）／（時間０およびｐＨ７での全キシロース＋アラビノース濃度）
（３）％分解＝（還元グルコース＋マンノース濃度）−（時間０およびｐＨ７での還元グルコース＋マンノース濃度）／（溶液中に存在し得る還元グルコース＋マンノースの最大量）
（４）％分解＝（還元キシロース＋アラビノース濃度）−（時間０およびｐＨ７での還元キシロース＋アラビノース濃度）／（溶液中に存在し得る還元キシロース＋アラビノースの最大量）
ＡＸＯＳ−１５−０．２７中の加水分解されたキシロースおよびアラビノース結合の割
合は、それぞれ、式（５）および（６）によって計算した。
【００４５】
（５）％キシロースの加水分解＝（還元キシロース濃度）−（時間０およびｐＨ７での還元キシロース濃度）／（溶液中に存在し得る還元キシロースの最大量）
（６）％アラビノースの加水分解＝（還元アラビノース濃度）−（時間０およびｐＨ７での還元アラビノース濃度）／（溶液中に存在し得る還元アラビノースの最大量）
感覚的分析。感覚的分析は、１度に最大１０人のボランティアを含むセッションにおいて隔離室で行った。被験体には、セッションの前に少なくとも１時間の間、飲食をやめるように求めた。被験体を最初に手順に慣れさせ、その後、精製した脱イオン水（比抵抗率１８ｍΩ−ｃｍ）の中に調製した様々な濃度のＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、スクロース（対照の甘味の刺激）、塩化ナトリウム（対照の塩味の刺激）、およびアスコルビン酸（対照の酸味の刺激）を有しているコード化した試料を味わうように求めた。最も高濃度の各化合物を含む溶液を８と番号付けし、そして最も低濃度を１と番号付けした（表２）。被験体には、濃度を増大させるために、１つの化合物の濃度範囲の全てを連続して味わうように求めたが、個々の個体に様々な化合物を提示する順番はランダムにした。一連の濃度の化合物を味わう前に、口を、最初は精製した脱イオン水（比抵抗率１８ｍΩ−ｃｍ）で２回、その後、５ｍｌのそれぞれの試験溶液を、使い捨ての注射器で被験体の口に入れ、およそ５秒間、口の中でグルグル回させ、その後、嚥下させた。参加者に、化合物を甘い、塩辛い、または酸っぱいと認識できた最低濃度（個々の認識閾）を示すように求めた。被験体の半数が特定の化合物の正確な味を認識した濃度として決定した平均の味覚認識閾を、全部で２０人から得た個々の認識閾についてのデータを用いて計算した。
【００４６】
粘性の測定。粘性の測定は、オリゴ糖調製物の水で抽出できる部分について行った。これは、水中への調製物の懸濁（１：１０ｗ／ｖ）、その後の震盪（２時間、１８℃）、遠心分離（１０，０００ｇ、２０分間、１８℃）、および濾過によって得た。濾過物の凍結乾燥の後、５．０％（ｗ／ｖ）の溶液の粘性を、Ｖｉｎｋｘら（１９９１）にしたがって、３０℃で、Ｏｓｔｗａｌｄ型粘度計（毛細管粘度計（Ｃａｐｐｉｌｌａｒｙ Ｖｉｓｃｏｓｉｍｅｔｅｒ），Ｓｃｈｏｔｔ Ｇｅｒａｅｔｅ，５０９０４型）を用いて測定した。溶液の粘性の測定は３連で行い、それぞれのオリゴ糖溶液についてのフロー時間を同じ実験条件下での脱イオン水のフロー時間で割り算することによって、脱イオン水の粘度に対して相対的に（ηｒｅｌ）表した。比粘度（ηｓｐ＝ηｒｅｌ−１）の計算の後、見かけの固有粘度（［ηａｐｐ］、ｄｌ／ｇ）を、式（７）に示したＭｏｒｒｉｓ方程式（Ｍｏｒｒｉｓ，１９８４）を使用して決定した。ここでは、オリゴ糖だけが溶液の粘性特性に寄与すると仮定して、ｃ（ｍｇ／ｍｌとして表す）はオリゴ糖濃度を示す。個々の分析の後、粘度計を脱イオン水で２回、９５％のエタノールで２回、アセトンで１回、そしてジエチルエーテルで１回すすぎ、その後、圧縮空気で乾燥させた。
【００４７】
【数１】
【００４８】
結果および考察
ＡＸＯＳ−１５−０．２７のｐＨ安定性を、確立されている前生物学的化合物であるフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ，市販されている製品Ｒａｆｔｉｌｏｓｅ）とキシロオリゴ糖（ＸＯＳ，市販されている製品Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ）のｐＨ安定性とを比較した。様々なオリゴ糖を、様々な時間の間、１００℃で様々なｐＨ値（ｐＨ２、３、７、および
１１）で維持した。分解の割合を、構成要素である単糖の含有量の減少を測定することによって決定し、そして加水分解の割合を、構成要素である還元単糖の量の増加を測定することによって決定した。図３に示すように、低いｐＨまたは中性のｐＨ（ｐＨ２、３、または７）では実質的な分解を受けたオリゴ糖はなかった。一方、試験した３つのオリゴ糖のすべてについて、アルカリｐＨ（ｐＨ１１）では分解が観察された。この効果は、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐについては最も顕著であり、６０分後にはその７３％が分解された。アルカリに対して最も安定であったのはＡＸＯＳ−１５−０．２７であった（図３）。アルカリｐＨで観察された分解は、アルカリによる剥離（ａｌｋａｌｉ ｐｅｅｌｉｎｇ）として知られており、これは、高温（６０〜１００℃）で起こり、そしてオリゴ糖の還元末端から進行する（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ ａｎｄ ＢｅＭｉｌｌｅｒ，１９５８；Ｓａｎｔｏｒｉら、２００３）。
【００４９】
試験した３つのオリゴ糖のうち、ＦＯＳは、明らかに、低いｐＨで最も加水分解を受けやすかった（図４）。ｐＨ２および３では、ＦＯＳの５８％および５３％が、６０分後に加水分解された。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５ＰおよびＡＸＯＳ−１５−０．２７は、ｐＨ２で同等レベルの加水分解を示した。しかし、ＡＸＯＳ−１５−０．２７は、ｐＨ３ではＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐよりも安定であり、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐについての６％に対して、ＡＸＯＳ−１５−０．２７についてはわずかに２％しか加水分解されなかった（図４）。低いｐＨでのＡＸＯＳ−１５−０．２７の加水分解についてのさらなる研究によって、アラビノース結合がキシロース結合よりも酸による加水分解に対してより敏感であることが明らかになった。実際、ＡＸＯＳ−１５−０．２７の、ｐＨ２、１００℃での６０分間のインキュベーションによっては、全てのアラビノース結合の５４％の加水分解が生じたのに対して、これらの条件ではキシロース結合はわずか４％しか加水分解されなかった（図５）。
【００５０】
Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐのような低いＤＰを有しているキシロオリゴ糖は、スクロースの約４０％の甘さの甘味を示すことが報告されている（Ｓｕｎｔｏｒｙ，キシロオリゴ糖、パンフレットおよび製品説明書、２００１）。重合度の高いアラビノキシロオリゴ糖の味の特性については、これまでのところ知られていない。２０人からなる味覚のパネルを用いて、本発明者らは、ＡＸＯＳ−１５−０．２７およびＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐの味認識閾を決定した。試験試料にはまた、甘味、塩味、および酸味の代表として、それぞれ、スクロース、塩化ナトリウム、およびアスコルビン酸も含めた。被験体には、試験化合物のそれぞれの濃度の系列について、化合物を甘い、塩辛い、または酸っぱいと認識した濃度を示すように求めた。試験した最大濃度（７１．５ｇ／ｌ）のＡＸＯＳ−１５−０．２７については、味覚のパネルのわずか１５％しか甘いと示さず、塩味または酸味を示した被験体はなかった。スクロースおよびＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐの甘味についての平均の味覚認識閾は、それぞれ、７ｇ／Ｌおよび２４ｇ／Ｌであったが、ＡＸＯＳ−１５−０．２７についての平均の味覚認識閾は、７１．５ｇ／Ｌよりも高かった。したがって、ＡＸＯＳ−１５−０．２７はスクロースよりも１０倍以上甘味が少なく、そしてスクロースよりもおよそ３倍甘味が少ないＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐよりも３倍以上甘味が少ない。
【００５１】
ＡＸＯＳ−１５−２７、ＡＸＯＳ−３９−０．２２、およびＡＸＯＳ−１３−０．２１について粘度を決定し、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ、市販されている製品Ｒａｆｔｉｌｏｓｅ）およびキシロオリゴ糖（ＸＯＳ、市販されている製品Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ）の粘性と比較した。表３に示したように、様々なＡＸＯＳ調製物は、ＦＯＳおよびＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐと比較して３倍から１０倍高い、高い見かけの固有粘性を有している。
【００５２】
実施例３
限外濾過によるＡＸＯＳ調製物の分画
材料および方法
ＡＸＯＳの調製。スキージＷＵ−ＡＸは、実施例１の材料および方法に記載したように調製した。スキージＷＵ−ＡＸを酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．７）に３ｇ／ｌで懸濁させ、１ｇのスキージＷＵ−ＡＸあたり１８．４Ｕの、アスペルギルス・アクリエート由来のエンドキシラナーゼであるＸＡＡ（Ｓｈｅａｒｚｙｍｅ ５００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，バグスバード、デンマーク）とともに、３０℃で４時間インキュベートした。沸騰（３０分間）による酵素の不活化、およびその後の懸濁液の濾過の後、ＡＸＯＳは濾液の中に回収された。
【００５３】
限外濾過によるＡＸＯＳの分離。ＡＸＯＳを端末「ＨＰ４７５０攪拌セル」限外濾過装置（ｄｅａｄ−ｅｎｄ ‘ＨＰ４７５０ ｓｔｉｒｒｅｄ ｃｅｌｌ’ ｕｌｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）（Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ケント、米国）において分画した。使用した限外濾過膜は、５ｋＤａ（Ｐ００５Ｆ、Ｃｅｌｇａｒｄ，ウィースバーデン、ドイツ）、１０ｋＤａ（ＰＥＳ−１０，Ｓｙｎｄｅｒ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ヴァルカビル、ＣＡ、米国）、または３０ｋＤａ（ＰＥＳ−０３０Ｈ，Ｃｅｌｇａｒｄ）のいずれかの分子量カットオフ（ＭＭＣＯ）を有していた。膜表面での濃度分極は、セル内の中央に配置された、７００ｒｐｍの攪拌速度を有しているテフロン（登録商標）コーティングされた磁気攪拌棒の機構によって最小にした。圧力源は圧縮窒素ガスシリンダであった。圧力は圧力調節装置によって制御し、全ての濾過実験は、室温で４ｂａｒの定圧で行った。端末限外濾過セルに分画される３００ｍｌの溶液を充填し、およそ２００ｍｌの浸透液の全容量が回収された時点で、濾過を停止した。
【００５４】
単離された調製物の特性決定。実施例１の材料および方法を参照のこと。高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）は、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０２．５ ＨＱ ＨＰＳＥＣカラム（Ｓｈｏｗａ，Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，東京、日本、３００×８ｍｍ、分離範囲：１×１０２〜１×１０４Ｄａ）を使用したことを除いて、実施例１の材料および方法に記載したように行った。分子量マーカーは、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、および０．５９×１０３Ｄａの分子量を有しているＳｈｏｄｅｘ標準Ｐ−８２プルラン（２．０ｍｇ／ｍｌ）、８１０（ＤＰ６）、６７８（ＤＰ５）、５４６（ＤＰ４）、４１４（ＤＰ３）、および２８２Ｄａ（ＤＰ２）の分子量を有しているキシロオリゴ糖標準物、ならびに１８０Ｄａの分子量を有しているグルコースであった。
【００５５】
結果および考察
ＡＸＯＳ調製物中での甘味と代謝性の低分子量オリゴ糖の存在は、食品用の成分としての特定の用途には望ましくない場合があるが、他の用途については、主に低分子量のオリゴ糖から構成される甘味のあるＡＸＯＳ調製物を使用することが所望される。この理由から、２〜３のＤＰを有しているＡＸＯＳ／ＸＯＳが、より高いＤＰを有しているＡＸＯＳから分離されるようにＡＸＯＳ調製物を分画することができる方法を開発することが有効である。アラビノキシランの分画は、これまでは必ず、種々の濃度のアルコール溶液での沈殿によって行われてきた（Ｃｏｕｒｔｉｎ ａｎｄ Ｄｅｌｃｏｕｒ，１９９８）。しかし、産業的な規模でアルコール沈殿を行うことは技術的に、そして経済的にも厄介である。したがって、限外濾過によって酵素によって生産されたＡＸＯＳをさらに分画することの実現可能性が研究された。
【００５６】
一例として、スキージＷＵ−ＡＸをＸＡＡ（１８．４Ｕ／ｇ）とともに３０℃で４時間インキュベートすることによって調製したＡＸＯＳを、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、または３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＭＣＯ）を有している膜を使用して限外濾過した。
【００５７】
５ｋＤａの膜を使用した場合には、浸透画分（ＰＥＲ５ｋＤａ）のＨＰＳＥＣプロフィール（図７ａ）は、主に、大きさでキシロビオース（ＤＰ２）およびキシロトリオース（ＤＰ３）に相当するオリゴ糖を示した。ＡＸＯＳストック溶液中の可溶性アラビノキシランを８６％含む保持画分（ＲＥＴ５ｋＤａ）（表４）は、ＤＰ２およびＤＰ３を有しているオリゴ糖の量がおよそ半分に減少したことを除いて、基本的には、限外濾過の前のＡＸＯＳ調製物と同じ分子量プロフィールを示す（図７ａ）。ＲＥＴ５ｋＤａ画分中の低いＤＰを有しているオリゴ糖の不完全な除去は、おそらく、高分子量の成分の存在によって引き起こされる浸透による移動の減少の結果としてのそれらの保持によって生じている。
【００５８】
１０ｋＤａの膜を使用した限外濾過によっては、アラビノキシラン含有量の３４％が、浸透画分中に回収され、一方、６５％が浸透画分の中に保持された（表４）。浸透画分（ＰＥＲ１０ｋＤａ）には、主に、ＤＰ２からＤＰ６を有しているオリゴ糖が含まれていた。保持画分（ＲＥＴ１０ｋＤａ）は、２〜４のＤＰを有している小さい大きさのオリゴ糖を低いレベルで有しており、主に、７００から＞１１０，０００Ｄａまで（ＤＰ５からＤＰ＞８５０まで）の範囲の分子量を有しているオリゴ糖から構成されていた（図７ｂ）。ＰＥＲ１０ｋＤａ画分と比較すると、３０ｋＤａの膜を用いて得られた浸透液（ＰＥＲ３０ｋＤａ）は、１０００から１０，０００Ｄａの範囲のオリゴ糖を高い含有量で有していた。対応して、３０ｋＤａ膜の保持画分（ＲＥＴ３０ｋＤａ）は、ＲＥＴ１０ｋＤａと比較すると１０００から１０，０００Ｄａの範囲のオリゴ糖の含有量は少なかったが、驚くべきことに、ＤＰ２およびＤＰ３オリゴ糖の含有量は、ＲＥＴ１０ｋＤａの中よりもＲＥＴ３０ｋＤａの中において高かった。
【００５９】
表４から、限外濾過が得られたＡＸＯＳ画分のＡ／Ｘ比に影響を与えることが明らかである。浸透画分（ＰＥＲ５ｋＤａ、ＰＥＲ１０ｋＤａ、およびＰＥＲ３０ｋＤａ）は、比較的低いＡ／Ｘ比を有しているオリゴ糖を多く含み、一方、保持画分（ＲＥＴ５ｋＤａ、ＲＥＴ１０ｋＤａ、およびＲＥＴ３０ｋＤａ）には、より高いＡ／Ｘ比を有している成分が含まれていた。
【００６０】
限外濾過によるＡＸＯＳのさらなる分画の可能性を評価するために、ＲＥＴ１０ｋＤａ画分を、３０ｋＤａのＭＭＣＯを有している膜を使用した２回目の限外濾過プロセスに供した。３０ｋＤａのＭＭＣＯを有している膜を介したＲＥＴ１０ｋＤａ画分の限外濾過後に得られた浸透画分（ＰＥＲ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ）および保持画分（ＲＥＴ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ）のＨＰＳＥＣプロフィールを、ＰＥＲ１０ｋＤａ画分と一緒に図８に示す。
【００６１】
ＲＥＴ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ画分には、主に、高分子量の成分（＞２０，０００Ｄａ）が含まれており、これは、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０２．５ ＨＱカラムの空隙容量に見られた。ＰＥＲ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ画分は、ＡＸＯＳストック溶液中のアラビノキシランのおよそ２５％を示し（表５）、主に、これは７００から１０，０００Ｄａまで（ＤＰ５から７５）の範囲の分子量を有している中程度の大きさのオリゴ糖から構成されていた（図８）。
【００６２】
これらの結果は、限外濾過（好ましくは、１０ｋＤａのＭＭＣＯを有している膜を使用する）を、限外濾過の浸透液を利用することによって２〜６のＤＰを有しているオリゴ糖の高い含有量、または限外濾過の保持物を利用することによって、＞４のＤＰを有しているオリゴ糖の高い含有量と２〜４のＤＰを有しているオリゴ糖の低い含有量のいずれかを有しているＡＸＯＳ調製物を作製するための方法として使用することができることを示している。連続する限外濾過（好ましくは、１０ｋＤａの膜の保持物を使用し、そして、３０ｋＤａ膜を通過させる）を使用すると、５〜７５までのＤＰの範囲のＡＸＯＳを多く含むＡＸＯＳ画分を得ることができる。
【００６３】
実施例４：ニワトリの腸に対するＡＸＯＳ調製物の効果
材料および方法
オリゴ糖調製物。実施例１の材料および方法を参照のこと。
【００６４】
プレートを計数することによる微生物学的分析。ニワトリの盲腸の内容物の重さを測定し、滅菌のペプトン生理食塩溶液（ＰＰＳＳ；０．１％のバクトペプトン、０．８５％のＮａＣｌ）に１：１０に稀釈し、ストマッカでホモジナイズし、さらに、１０倍稀釈手順にしたがってＰＰＳＳ中にさらに稀釈した。その後、適切な稀釈液を、腸内細菌科の計数のためには、バイオレットレッド胆汁ブドウ糖寒天培地（Ｖｉｏｌｅｔ Ｒｅｄ Ｂｉｌｅ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ａｇａｒ（ＶＲＢＧ；Ｏｘｆｏｒｄ ＣＭ０４８５Ｂ，ベージングストーク、英国））上に、そしてビフィズス菌については、氷酢酸（１ｍｌ／ｌ）とムピロシン（１００ｍｇ／ｌ）の添加によって改変したウィルキンス−チャルグレンアナエロブ寒天（Ｗｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ ａｎａｅｒｏｂｅ ａｇａｒ）（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ６１９）上に、混釈平板技術を使用してプレートした。後者の改変によっては、ウィルキンス−チャルグレン寒天のビフィズス菌についての選択性が増強され、そして改変されたウィルキンス−チャルグレン寒天は、ニワトリの盲腸の中のビフィズス菌の数の１工程での決定に特に適していることが示された（Ｒａｄａら、１９９９；Ｒａｄａ ａｎｄ Ｐｅｔｒ，２０００）。コロニーは、腸内細菌科については３７℃での１日の好気的なインキュベーションの後で、そしてビフィズス菌については３７℃で４日間の嫌気的なインキュベーション（Ｏｘｏｉｄ ａｎａｅｒｏｇｅｎ ｓｙｓｔｅｍ ＡＮ００２５Ａを備えた嫌気性のジャーの中）の後で、計数した。数は、盲腸の内容物１ｇあたりとして表した。いくつかの予防策を、試料の調製の間の酸素に対するビフィズス菌の暴露を最小にするために行った：（ｉ）盲腸の内容物を試料の調製を始める直前に盲腸から取り出した；（ｉｉ）稀釈剤と寒天は、溶存酸素を除去するために使用の直前にオートクレーブしたかまたは沸騰させた；（ｉｉｉ）ビフィズス菌の計数のためのプレートは試料の調製開始から２時間以内に嫌気条件下に置いた。
【００６５】
定量的ＰＣＲによる微生物学的分析。ＤＮＡの抽出を、ＰＰＳＳ中に１：５稀釈した盲腸の試料について、Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｅｌｅら（２００４）に記載されているように行った。増幅は、蓋（ｏｐｔｉｃａｌｃａｐ）が備わっているＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェル反応プレート（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の中で、供給業者（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｉｅｕｗｅｒｋｅｒｋ
ａ／ｄ Ｉｊｓｓｅｌ，オランダ）によって記載されているように、サイバーグリーンＰＣＲコア試薬（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）とともに供給された緩衝液を使用することによって、２５μｌの反応物の混合物中で行った。正方向プライマーと逆方向プライマー（それぞれ、ＢＩＦ１６４ｆおよびＢＩＦ１６３ｒ（Ｓａｔｏｋａｒｉら、２００１））は、ビフィズス菌属の細菌に由来する１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子のコピーの検出のためには、１μＭの濃度で使用した。ＰＣＲ温度プログラムは以下とした：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後、９４℃で１分間、６２℃で１分間、および６０度で１分間を４０サイクル。鋳型ＤＮＡを３連の反応混合物の中で増幅させ、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＳＤＳ７０００機器（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でモニターした。検量線を、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、ＬＭＧ１１０４２株）の培養物から抽出したＤＮＡの４種類の稀釈物に対する４連の反応での実時間ＰＣＲ増幅に基づいて構築した。実験試料による実時間ＰＣＲデータを検量線に対してプロットし、そして個々の実験試料のＤＮＡ濃度によって割り算した最も高いＤＮＡ濃度を有している実験試料中のＤＮＡ濃度からなる因数を使用して、ＤＮＡ抽出の効率について補正した。
【００６６】
統計分析。動物の体重、飼料の摂取量、または腸内微生物の組成に対する様々な飼料の
効果を、Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔソフトウェア、バージョン１．７１を使用して、９５％の信頼性のレベルで１因数分散分析によって分析した。因数である飼料について統計学的に有意な効果が観察された場合には、それぞれの飼料の間での差を、最小有意差（ＬＳＤ）試験またはテューキー検定のいずれかによって、９５％の信頼性のレベルで分析した。
【００６７】
結果および考察
様々な（アラビノ）キシラン由来の調製物の添加の効果を、ニワトリの腸下部の微生物の組成について試験した。
【００６８】
最初の実験には、６４匹の１日齢の雄のニワトリ（Ｒｏｓｓ ｒｏｏｓｔｅｒｓ）を商業的な孵化場（Ａｖｉｂｅｌ，ティールト、ベルギー）から購入し、４つの囲い（１つの囲いについて１６匹のニワトリ）となるように分配した。個々の囲いには、飲み物用のたらいと１ｍの飼料用の容器を置いた。安定な温度は、鳥類の生存については３５℃であり、その後、２日おきに１℃ずつ下げた。動物を、２３時間の明所と１時間の暗所の光の周期で維持した。飼料（１つの囲いについて１つの飼料）と飲み水は、無制限に与えた。実験期間は１４日間とした。
【００６９】
以下の実験用の飼料を試験した：
・対照の飼料
・対照の飼料＋０．２５％のＡＸＯＳ−７−０．３４調製物（０．１７％の純粋なＡＸ）
・対照の飼料＋０．２５％のＡＸＯＳ−１２２−０．６６調製物（０．１８％の純粋なＡＸ）
・対照の飼料＋０．２５％のＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ（０．２２％の純粋なＡＸ）
括弧の中に示した濃度は、それらのＡＸ含有量によって計算したそれらの純度について補正した。対照の飼料は、添加剤としてキシラナーゼとグルカナーゼ酵素の混合物（Ｒｏｘａｚｙｍｅ）が含まれている市販のスタータ用の飼料（ｓｔａｒｔｅｒ ｆｅｅｄ）（Ｋｒｉｘ ０，Ｈｅｎｄｒｉｘ ＵＴＤ，ボックスミア、オランダ）から構成されていた。
【００７０】
７日齢で、全ての動物の体重を測定し、１つのグループについて８匹の動物をランダムに選択し、首を切り落として屠殺した。その後、盲腸を回収するために動物を解剖した。盲腸を空にし、内容物を、１回の処理について２つのグループに分けてプールした（それぞれ４つの盲腸）。盲腸を１回の処置について３つのグループに分けてプールした（それぞれ、３匹、３匹、および２匹の動物）ことを除いて、このプロトコールを、残りの動物が１４日齢に達するまで繰り返した。
【００７１】
ＡＸＯＳ−７−０．３４グループの動物については、対照グループと比較して、平均体重に有意な差は観察されなかった。ＡＸＯＳ−１２２−０．６６グループおよびＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐグループの動物は、７日後には対照グループよりも有意に少ない体重を有していたが、動物は１４日後には追いつき、そして対照との差は有意ではなくなった。ＡＸＯＳ−１２２−０．６６グループの場合には、７日後には比較的少ない体重となり、これは、孵化した時点でこのグループのニワトリの体重が有意に少なかったことが原因である。
【００７２】
ニワトリの盲腸の微生物叢の分析は、腸内細菌科の高いレベル（約１０８〜１０９／ｇの盲腸内容物）を、飼料を与え始めてから７日後および１４日後の両方で示し、いずれの処置についても有意な差は観察されなかった。ビフィズス菌のレベルは、ビフィズス菌のレベルがはるかに高かった（約１０８／ｇ盲腸内容物）Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐグループの動物を除いて、７日後には全ての処置グループにおいて低かった（約１０２〜１０
３／ｇ盲腸内容物）（図９）。１４日後は、盲腸のビフィズス菌の数は対照については少ないままであった。反対に、ビフィズス菌の数の明らかな増加（約１０５倍）が、ＡＸＯＳ−７−０．３４グループの盲腸内容物において観察された。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐグループにおいては、ビフィズス菌のレベルは、７日後のレベルと比較するといくらか下がったが、なおも、１４日後には、これは対照グループよりもまだ有意に高かった。ＡＸＯＳ−１２２−０．６６グループにおいては、盲腸内容物中のビフィズス菌の数の穏やかな増加が１４日後に生じていたが、この増加は対照グループと比較すると有意ではなかった。
【００７３】
ニワトリについての第２の実験には、５４匹の１日齢の雄のニワトリ（Ｒｏｓｓ Ｒｏｏｓｔｅｒｓ）を、商業的な孵化場（Ａｖｉｂｅｌ，ティールト、ベルギー）から購入し、６個の囲い（１つの囲いについて９匹のニワトリ）となるように分配した。囲いの条件は第１の実験について記載したとおりとした（上記を参照のこと）。実験期間は１４日間とした。
【００７４】
以下の実験用の飼料を試験した：
・対照の飼料
・対照の飼料＋０．１４１％のＡＸＯＳ−１５−０．２７調製物（０．１％の純粋なＡＸ）
・対照の飼料＋０．３５２％のＡＸＯＳ−１５−０．２７調製物（０．２５％の純粋なＡＸ）
・対照の飼料＋０．２６３％のＦＯＳ調製物（０．２５％の純粋なＦＯＳ）
・対照の飼料＋１．０５３％のＦＯＳ調製物（１％の純粋なＦＯＳ）
・対照の飼料＋０．０１％のキシラナーゼ調製物
括弧の中に示した濃度は、それらのＡＸまたはＦＯＳ含有量によって計算したそれらの純度について補正した。ＦＯＳ調製物は、市販されている製品であるＲａｆｔｉｌｏｓｅ（Ｏｒａｆｔｉ，チーネン、ベルギー）であった。キシラナーゼ調製物は、市販されている製品であるＢｅｌｆｅｅｄ（Ｂｅｌｄｅｍ，Ｇｒｏｏｔ−Ｂｉｊｇａａｒｄｅｎ，ベルギー）であった。対照の飼料の組成は表６に示す。１４日齢で、すべての動物の体重を測定し、首を切り落として屠殺した。その後、盲腸を回収するために動物を解剖した。盲腸の内容物を、同じ処置グループに属している３匹の動物ごとにプールした。プールした盲腸の試料の中のビフィズス菌の数を定量的ＰＣＲによって測定した。
【００７５】
それぞれの飼料を与え始めてから２週間後には、様々な処置の間で、体重に有意な差は観察できなかった。２週間後のニワトリの盲腸の中のビフィズス菌の数に関しては、０．２５％のＡＸＯＳ−１５−０．２７を含む飼料を与えたニワトリだけが、対照の処置とは有意に異なっていた（図１０）。０．２５％のＡＸＯＳ−１５−０．２７を含む飼料を与えたニワトリの中のビフィズス菌の数は、対照の飼料を与えたニワトリにおけるビフィズス菌の数よりも２２倍多かった。比較の目的のために含めた十分に研究されている前生物学的化合物であるフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）は、ＡＸＯＳ−１５−０．２７が有効であった用量よりも４倍多い用量でもなお、ニワトリの盲腸の中のビフィズス菌の数の増大を生じることはなかった。このことは、ＡＸＯＳ−１５−０．２７が驚くほど強力なビフィズス菌増殖促進性の化合物であることを示している。
【００７６】
ビフィズス菌は、動物およびヒトの健康状態にポジティブに関係しており、これは多くの前生物学的化合物の要素である。動物およびヒトのポジティブな健康状態を促進または維持する（これには、結腸直腸ガンに対する抑制効果が含まれる）ために、微生物の調製物を直接摂取させることに加えて、消化管の中のこれらの細菌集団を選択的に富化させることに対して関心が高まっている（Ｖａｎ Ｌｏｏら、２００４）。ニワトリを用いた給飼料試験の結果は、すべてのアラビノキシランを含む飼料によってニワトリの盲腸の中の
ビフィズス菌の存在が刺激されたことを示している。重合度の高いＡＸＯＳ調製物であるＡＸＯＳ−１２２−０．６６は、ニワトリの盲腸の中のビフィズス菌集団の穏やかな有意ではない増加しか生じなかった。一方、低い重合度から中程度の重合度を有している調製物である、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ、ＡＸＯＳ−７−０．３４、およびＡＸＯＳ−１５−０．２７は、ビフィズス菌の猛烈な有意な増加を誘発し、これによっては、動物の体重の減少は引き起こされなかった。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐに対する反応は７日後にすでに観察することができたが、ＡＸＯＳ−７−０．３４およびＡＸＯＳ−１５−０．２７は、１４日後にビフィズス菌増殖促進性の反応を生じただけであった。このことは、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐが、より高い平均重合度とより高い平均置換度を有しているＡＸＯＳ−７−０．３４およびＡＸＯＳ−１５−０．２７調製物よりも早くビフィズス菌によって発酵されることを示している。選択された有利な細菌による遅い発酵は、ヒトおよび長い腸を有している動物での適用のための前生物学的化合物について所望される特性である。腸内細菌による遅い発酵によって、結腸の近位部分を通過した後には完全に消費されておらず、したがって、結腸の遠位部分にある適切な細菌による発酵のための基質として使用され得る前生物学的化合物の画分が増加させられる。まとめると、ヒトにおいては、結腸の遠位部分および直腸部分のガンの罹患率は、直腸の近位部分のガンの罹患率よりも高く（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｔｅ．ｎｊ．ｕｓ／ｈｅａｌｔｈ／ｃａｎｃｅｒ／ｃｒ／ｓｕｂｓｉｔｅ．ｈｔｍ）、したがって、前生物学的化合物が遠位結腸および直腸の有用な微生物を刺激できることが重要である。
【００７７】
実施例５
ラットの腸に対するＡＸＯＳ調製物の効果
材料および方法
ＸＯＳ／ＡＸＯＳ調製物。実施例１の材料および方法を参照のこと。
【００７８】
定量的ＰＣＲによる微生物の分析。実施例４の材料および方法を参照のこと。
短鎖脂肪酸の分析。腸の試料を、５倍量の水／リン酸／ギ酸（９８／１．８／０．２、ｖ／ｖ／ｖ）で抽出し、遠心分離（２２，０００ｇ、１０分）によって明澄化した。短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を、気体−液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＧＣ １４Ａ）によって、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ Ｗ（メッシュサイズ６０／３０；Ｓｕｐｅｌｃｏ，ベルフォンテ、ＵＳＡ）を充填したカラム上で分析し、炎イオン化によって検出した。ＳＣＦＡの濃度を、濃度が既知の種々の酸を含む標準物に基づいて計算した。カプロン酸を内部標準として使用した。
【００７９】
統計分析。様々な試料の体重、飼料の摂取量、ＳＣＦＡ、または動物の腸の微生物の組成に対する効果を、Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔソフトウェア、バージョン１．７１を使用して、９５％の信頼性のレベルで１因数分散分析によって分析した。統計学的に有意な効果が因数である飼料について観察された場合には、それぞれの飼料の間での差を、最小有意差（ＬＳＤ）試験によって、９５％の信頼性のレベルで分析した。
【００８０】
結果および考察
ラットについての最初の実験には、４０匹の６週齢の雄のラット（Ｗｉｓｔａｒ）を、Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ，フランス）から購入し、１４−１０時間の明所−暗所のサイクルで、環境を制御した室内（２２℃）で、ステンレス鋼製のワイヤー底のケージに入れた（１つのケージについて２匹のラット）。ラットは、７日間、水と、「基本的な人工の飼料（ｂａｓｉｃ ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ｄｉｅｔ）」であるペレット（１０ｍｍ）に自由に近づけるようにした。「基本的な人工の飼料」の組成は表７に示す。「基本的な人工の飼料」を与え始めてから７日後、ラットを、５種類の処置グループの１つにランダムに分け（８匹のラット／グループ）、そしてこれらのグループにそれぞれ、１３日間、以下の飼料の１つのペレット（１０ｍｍ）に自
由に近づけるようにして与えた：
・基本的な人工の飼料
・基本的な人工の飼料＋０．７０％のＡＸＯＳ−１２２−０．６６調製物（０．５％の純粋なＡＸ）
・基本的な人工の飼料＋０．６９％のＡＸＯＳ−１６−０．７８調製物（０．５％の純粋なＡＸ）
・基本的な人工の飼料＋０．７３％のＡＸＯＳ−１５−０．２７調製物（０．５％の純粋なＡＸ）
・基本的な人工の飼料＋０．７２％のＡＸＯＳ−８−０．２７調製物（０．５％の純粋なＡＸ）
括弧の中に示した濃度は、それらのＡＸ含有量によって計算したそれらの純度について補正した。ＡＸＯＳを含む飼料について、基本的な人工の飼料の中のデンプンを、適切な量のＡＸＯＳで置き換えた。
【００８１】
動物の体重を測定し、そして飼料の摂取量を、１週間に３回測定した。処置の１３日後に、全ての動物の体重を測定し、ネムブタール（Ｎｅｍｂｕｔａｌ）の過剰摂取を用いて麻酔した。その後、動物を、糞を回収するために解剖した。糞を、遠位結腸から肛門までのペレットとして回収した。糞を同じ処置グループに属している２匹の動物ごとにプールし、そしてＳＣＦＡ含有量について分析した。
【００８２】
処置期間の飼料の摂取量は、１８．９から２７．７ｇ／日の範囲であり、平均は２２．７ｇ／日であった。処置の開始時点でのラットの最初の体重は平均すると２６２．０ｇであり、処置の１３日後の最後の体重は平均すると３７５．３ｇであった。体重または飼料の摂取量に関して、様々な処置の間で有意な差を観察することはできなかった。
【００８３】
腸の高いＳＣＦＡレベルは、前生物学液化合物の摂取によって誘導された腸の微生物叢のシフトの顕著な特徴であるので（Ｖａｎ Ｌｏｏ，２００４）、本発明者らは、様々な処置グループについて糞のＳＣＦＡ含有量を測定した。図１１に示すように、ＡＸＯＳ−８−０．２７、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、およびＡＸＯＳ−１６−０．７８を与えたラットの糞の中のプロピオン酸塩のレベルは、対照グループまたはＡＸＯＳ−１２２−０．６６グループのレベルよりも有意に高かった。ＡＸＯＳ−８−０．２７、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、およびＡＸＯＳ−１６−０．７８グループの糞の中の酢酸塩および酪酸塩のレベルの増大にも１つの傾向があった。
【００８４】
酢酸塩、プロピオン酸塩、および酪酸塩のようなＳＣＦＡは、腸の嫌気性環境において細菌による呼吸の電子の受けてエレクトロンシンク（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｉｎｋ）として生じる。前生物学的化合物は、下部消化管のＳＦＣＡレベルを増大させることが知られている。高いＳＣＦＡレベルは、これらが腸の内容物のｐＨを下げ、それによって潜在的に病原性である腐敗菌の増殖を制限するという理由から望ましい。腸のｐＨの低下にはまた、鉱物であるカルシウムおよびマグネシウムの溶解度および生体利用性の増大も伴う（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，２００２）。短鎖脂肪酸、特に、酪酸塩は、さらに結腸上皮細胞を刺激して、それによって上皮の吸収能力を高める（Ｔｏｐｐｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｆｔｏｎ，２００１）。
【００８５】
ほぼ同じ平均重合度を有しているがＡ／Ｘ比が異なる２つの調製物であるＡＸＯＳ−１５−０．２７またはＡＸＯＳ−１６−０．７８で処置したラットの間には有意な差が観察されなかったという事実は、置換度は結腸内での細菌による発酵を刺激するＡＸＯＳの能力には大きな影響は与えないことを示している。一方、ほぼ同じ置換度を有しているが重合度が異なる２つの調製物であるＡＸＯＳ−１６−０．７８およびＡＸＯＳ−１２２−０．６６の効果を比較した場合には、ＡＸＯＳ−１２２−０．６６のような重合度の高いＡ
ＸＯＳ調製物が、平均重合度の低い調製物よりも弱い前生物学的化合物であることが明らかである。したがって、１２０未満の平均重合度を有しているＡＸＯＳ調製物が好ましい前生物学的化合物である。遅い発酵が好ましい場合には、遠位結腸および直腸でのＡＸＯＳの利用性を増大させるために、４を上回る平均重合度を有しているＡＸＯＳ調製物が好ましい。
【００８６】
ラットについての第２の実験には、２４匹の６週齢の雄のラット（Ｗｉｓｔａｒ）を、Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ，フランス）から購入し、１４−１０時間の明所−暗所のサイクルで、環境を制御した室内（２２℃）で、ステンレス鋼製のワイヤー底のケージに入れた（１つのケージについて２匹のラット）。ラットは、６日間、水と、「基本的な人工の飼料」であるペレット（１０ｍｍ）に自由に近づけるようにした。「基本的な人工の飼料」の組成は表７に示す。「基本的な人工の飼料」を与え始めてから６日後、ラットを、３つの処置グループの１つにランダムに分け（８匹のラット／グループ）、そしてこれらのグループには、それぞれ、以下の飼料の１つのペレット（１０ｍｍ）に自由に近づけるようにして与えた：
・基本的な人工の飼料
・基本的な人工の飼料＋５．８７％のＡＸＯＳ−１５−０．２７調製物（４％の純粋なＡＸ）
・基本的な人工の飼料＋５．２６％のＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ（４％の純粋なＡＸ）
括弧の中に示した濃度は、それらのＡＸ含有量によって計算したそれらの純度について補正した。ＡＸＯＳ−１５−０．２７またはＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐを含む飼料について、基本的な人工の飼料の中のデンプンを、適切な量のＡＸＯＳで置き換えた。
【００８７】
動物の体重を測定し、そして飼料の摂取量を１週間に３回測定した。処置の１４日後に全ての動物の体重を測定し、ネムブタールの過剰摂取を用いて麻酔し、そして近位結腸、盲腸、および遠位結腸を回収するために解剖した。盲腸の内容物を、同じ処置グループに属している２匹の動物ごとにプールし、そして定量的ＰＣＲによってビフィズス菌の量について分析した。近位結腸と遠位結腸の内容物を同じ処置グループに属している２匹の動物ごとにプールし、そしてＳＣＦＡ含有量について分析した。
【００８８】
近位結腸においては、ＳＣＦＡレベルは、遠位結腸よりもはるかに低かった。酢酸塩だけが、近位結腸試料の中で検出限界を上回っていた。したがって、近位結腸の中の酢酸塩と、遠位結腸の中の酢酸塩、プロピオン酸塩、および酪酸塩についてのデータしか得ることができなかった。いずれの処置も、９５％の信頼性のレベルでは、ＳＣＦＡレベルに対して有意な効果は生じなかった。しかし、データからは明確な傾向を観察することができた。図１２に示すように、ＡＸＯＳ−１５−０．２７グループとＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐグループは、対照グループと比較して、高いレベルの酢酸塩および酪酸塩を有していたが、プロピオン酸塩についてはそうではなかった。最も顕著な効果は、遠位結腸の酪酸塩について観察された。対照グループと比較したその増大は、ＡＸＯＳ−１５−０．２７グループにおいては５８％であり、そしてＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐグループにおいては３４％であった。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐと比較したＡＸＯＳ−１５−０．２７のより強い効果が、遠位結腸の全てのＳＣＦＡについて観察された。興味深いことに、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐは、近位結腸において最も強い酢酸塩の増加を生じたが、一方、ＡＸＯＳ−１５−０．２７は、遠位結腸において最も強い酢酸塩の追加を生じた。
【００８９】
ビフィズス菌の量は、対照の飼料を与えたラットと比較して、ＡＸＯＳ−１５−０．２７またはＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐのいずれかを与えたラットの盲腸においては有意に増加した。盲腸のビフィズス菌について最大の増加は、ＡＸＯＳ−１５−０．２７グループにおいて観察された（１．０８対数単位、または対照グループに対して１２倍高い、図
１３）。
【００９０】
これらの結果は、ＡＸＯＳ−１５−０．２７がＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐよりも強い前生物学的化合物であることを示している。データはまた、ＡＸＯＳ−１５−０．２７が、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐよりもゆっくりと発酵されることも示している。なぜなら、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐは、近位結腸においてより強いＳＣＦＡ効果を生じたが、一方、ＡＸＯＳ−１５−０．２７は遠位結腸においてより強い効果を生じたからである。Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐに対するＡＸＯＳ−１５−０．２７の遅い発酵は、実施例５に示したニワトリの実験でも観察された。ＡＸＯＳ−１５−０．２７の遅い発酵の特性は、これによってより多くの前生物学的化合物が遠位結腸に到達し、ここで、その推定される有用な発ガン抑制効果を発揮できるので、望ましい。
【００９１】
実施例６：ヒトの腸に対するＡＸＯＳ調製物の効果
材料および方法
ＡＸＯＳ−１５−０．２７およびＷＰＣ調製物。実施例１の材料および方法を参照のこと。
【００９２】
定量的ＰＣＲによる微生物学的分析。実施例４の材料および方法を参照のこと。
被験体。実験に参加したボランティアは全て、消化器疾患または代謝性疾患あるいはこれまでの外科手術の病歴はなかった。被験体には、実験の開始前の少なくとも３ヶ月間は、腸通過時間または腸内微生物叢に影響を及ぼす抗生物質または任意の他の医薬品での処置を行わなかった。いずれの女性も実験の間には妊娠していなかった。ボランティアには標準的な食事は強制しなかった。しかし、彼らに実験期間の最後まで基本的な食事のパターンを維持するように、そして多量の発酵性糖質を含む発酵乳製品および食品成分の過剰な摂取を避けるように求めた。Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｕｖｅｎによって実験は承認され、全ての被験体にインフォームドコンセントを行った。
【００９３】
標識した基質。ラクトース−［１５Ｎ，１５Ｎ］−ウレイドを、Ｈｏｆｍａｎｎ（１９３１）によって改変されたＳｃｈｏｏｒｌの方法にしたがって、Ｅｕｒｉｓｏ−ｔｏｐ（Ｓａｉｎｔ−Ａｕｂｉｎ，Ｆａｎｃｅ）から入手した［１５Ｎ，１５Ｎ］尿素を用いて合成した。３Ｈで標識したポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）（３Ｈ−ＰＥＧ）を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ボストン、ＭＡ、米国）から入手した。
【００９４】
尿および便のＮｔｏｔおよび１５Ｎの決定。尿および便の全Ｎ含有量および１５Ｎ濃縮を熱導体検出器（ＴＣＤ；ＰＤＺ）と安定同位体比質量分析装置（ＩＲＭＳ；ＰＤＺ）の両方を取り付けた元素分析計（ＡＮＣＡ−ＳＬ；ＰＤＺ，チェシャー、英国）を使用することによって測定した。既知の容量（１５μｌ）または既知の質量の便（約５〜７ｍｇの凍結乾燥排泄物）を、１，０００℃で酸素の存在下で酸化させた。その後、酸化物を、６００℃で、銅を含む第２の加熱炉に通し、ここでは、過剰の酸素が吸収され、酸化窒素が元素窒素に還元される。全窒素含有量を、ＴＣＤ検出器で測定した。ここでは、１５Ｎ濃縮を、元素分析計の燃焼ユニットを取り付けたＩＲＭＳ検出器によって決定した。Ｎ２のＮ１５対Ｎ１４同位元素比を、較正した実験室標準物（すなわち、標準的な硫酸アンモニウム溶液）と比較して測定した。回収した１５Ｎの投与した用量に対する割合を、以下のように計算した（Ｅｖｅｎｅｐｏｅｌら、１９９９）：
【００９５】
【数２】
【００９６】
式中、
【００９７】
【数３】
【００９８】
そして、ＡＰｔ：特定の尿試料についての測定した１５Ｎ濃縮、原子の割合（ＡＰ）として表す
ＡＰｂａｓ：基底の尿試料についての１５Ｎ濃縮（ＡＰで表す）
Ｎｔｏｔ：特定の尿試料中の全窒素含有量
尿試料については、投与した１５Ｎの用量に対する割合を、試験用の食事後０〜４８時間の期間について累積した。一方、便の試料については、投与した１５Ｎの用量に対する割合を、試験用の食事後０〜７２時間の期間について累積した。個体間の糞便の通過時間（ｏｒｏ−ｆａｅｃａｌ ｔｒａｎｓｉｔ ｔｉｍｅ）の差の補正を、便の試料について行った。これは、７２時間にわたって回収した投与した３Ｈ−ＰＥＧの用量の累積割合で、７２時間にわたって回収した投与した１５Ｎの用量の累積割合を割り算することによって行った。排泄物中の３Ｈ−ＰＥＧ含有量を、３Ｈ−Ｈ２Ｏへと酸化（Ｐａｃｋａｒｄ試料酸化装置、モデル３０７）させた後に、液体シンチレーションカウンティング（Ｔｒｉｃａｒｂ液体シンチレーションスペクトルクトロメーター、モデル３３７５；Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，米国）によって測定した。
【００９９】
尿のフェノール系化合物の決定。全ｐ−クレゾールおよびフェノール含有量を、気体−液体クロマトグラフィー−質量スペクトル分析（ＧＣ−ＭＳ）技術によって測定した。９５０ｍｌの尿のｐＨを、濃Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨ１に調整した。この溶液を、９０度で３０分間加熱して除タンパクし、結合していたフェノールを加水分解した。室温に冷却したあと、５０ｍｌの２，６−ジメチルフェノール（２０ｍｇ／１００ｍｌ）を、内部標準物として添加した。フェノールを１ｍｌの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、０．５ｍｌのこの溶液をＧＣ−ＭＳ（Ｔｒａｃｅ ＧＣ−ＭＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ，サンノゼ、ＣＡ、米国）で分析した。分析用カラムは、３０ｍ×０．３２ｍｍの内径、１μｍのＡＴ５−ＭＳ（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，ディアフィールド、ＩＬ、米国）であった。ヘリウムガス（ＧＣ等級）を、１．３ｍｌ／分の一定の流速で担体として使用した。炉の温度は、７５℃（５分間等温）からプログラムし、１０℃／分で１６０℃まで、そして２０℃／分で２８０℃まで上昇させた。質量スペクトルの検出は、２スキャン／ｓで、ｍ／ｚ ５９からｍ／ｚ ５９０までの電子衝撃完全スキャン形式で行った。ｐ−クレゾールおよびフェノールについての結果を、０〜２４時間の回収において回収した全含有量（ｍｇ）として表した。
【０１００】
統計分析。統計分析はＳＰＳＳソフトウェア、バージョン１２．０を用いて行った。データの統計学的評価は、９５％の信頼性のレベルでウイルコクソンの符号付き検定を適用して行った。
【０１０１】
結果および考察
ヒトについての最初の実験は、１０人の健常なボランティア（５人の男性と５人の女性、年齢は２３〜３７歳の範囲）について行った。１０人のボランティアは、２つのグループのいずれかに５人ずつランダムに割り振った。第１のグループには、１日当たり水に懸濁した７ｇ（４．８８ｇ）のＡＸＯＳ−１５−０．２７を２週間投与し、一方、第２のグループには、１日あたり水に懸濁した１１．６ｇ（４．８２ｇ）のＷＰＣを投与した。括弧内の重量の値は、調製物のＡＸ含有量と水分含有量に基づいて補正したＡＸＯＳの重量である。
【０１０２】
ボランティアのそれぞれについて、便の試料を実験の開始よりも前と、１５日目の間に回収した。それぞれ、その日の最初の排泄物を回収し、重さを測定し、そして定量的ＰＣＲによって微生物を分析するまで−２０℃で保存した。図１４に示すように、４．８８ｇ／日のＡＸＯＳ−１５−０．２７を１４日間投与した被験体は、基底レベル（ｐ＝０．０４３）と比較して１．５５対数単位（＝３５倍）高い便のビフィズス菌のレベルを有していた。対照的に、ビフィズス菌のレベルは、４．８２ｇ／日のＷＰＣを投与した被験体においては、２週間後にはわずかに低下していたが、基底レベルと比較した差は有意ではなかった（ｐ＝０．７１５）。
【０１０３】
これらのデータは、ＡＸＯＳ−１５−０．２７（ａｖＤＰ＝１５、表１）のような中程度の平均重合度を有しているＡＸＯＳ化合物は、ＷＰＣ（ａｖＤＰ＝５８、表１）のような高い平均重合度を有している化合物よりも強い前生物学的効果を発揮することを示している。同じ結論は、ニワトリにおけるビフィズス菌増殖促進作用（実施例４を参照のこと）、およびラットのＳＣＦＡの増加（実施例５を参照のこと）についての試験からもすでに導くことができた。
【０１０４】
第２の実験においては、ＡＸＯＳ−１５−０．２７の種々の１回だけの用量の効果を、ヒトの結腸の中でのＮＨ３、ｐ−クレゾール、およびフェノールの代謝について評価した。ＮＨ３、フェノール、およびｐ−クレゾールは毒性がある潜在的に発ガン性の代謝物であり、これは、タンパク質の発酵の際に結腸の細菌によって生産される。ＮＨ３の代謝は、ラクトース−［１５Ｎ，１５Ｎ］−ウレイドを生体マーカーとして使用して評価した。経口投与すると、ラクトース−ウレイドは、修飾されないまま結腸に到達する。なぜなら、ラクトース−ウレイドの糖質部分と尿素の間の分子結合は、ヒトの消化管の中での酵素による分解に耐性であるからである。ラクトース−［１５Ｎ，１５Ｎ］−ウレイドが結腸に達すると、これは、選択された細菌によって［１５Ｎ，１５Ｎ］で標識された尿素に分解される。標識された尿素は、早い加水分解を受け、これには１５ＮＨ３の生産が伴う（Ｗｕｔｚｋｅら、１９９７）。標識されたＮＨ３は結腸の中に存在しているアンモニアと混合され、結果として、１５Ｎで標識された測定値に関して観察される変化は、結腸の全ＮＨ３の運命を反映する。
【０１０５】
結腸のＮＨ３代謝物をモニターすることに加えて、フェノールおよびｐ−クレゾールの存在を、結腸の中でのタンパク質の細菌による発酵の特徴として、尿中で測定した。文献によるデータ（Ｅｖｅｎｅｐｏｅｌら、１９９９）に基づくと、生理学的環境下では、摂取されたタンパク質の約３％から６％が未消化のままであると推測される。消化されていないタンパク質が結腸に達すると、これらは、結腸の微生物叢によって発酵させられる。アミノ酸であるチロシンの細菌による発酵によっては、フェノールおよびｐ−クレゾールの生産が生じる。これらの化合物は、大部分が結腸から吸収され、粘膜および肝臓の中で（グルクロニド−および硫酸エステル−結合体によって）無毒化され、最後に尿中に排出される。フェノールおよびｐ−クレゾールは、完全に細菌による代謝に由来し、ヒトによる代謝によっては生じないので、フェノールおよびｐ−クレゾールの尿による排出は、結腸の中での細菌によるこれらの化合物の生産を反映する（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｃｆ
ａｒｌａｎｅ，１９９６）。結果として、結腸でのタンパク質の発酵に対する前生物学的化合物の全ての影響が、フェノールおよびｐ−クレゾールの尿中濃度に反映されるはずである。
【０１０６】
ヒトについての第２の実験は、９人の健常なボランティア（３人の男性と６人の女性、１６〜２６歳の範囲）について行った。それぞれのボランティアには、それぞれの試験用食事の中に、１週間の間隔で、様々な用量のＡＸＯＳ−１５−０．２７を含む５種類の試験用食事を与えた。１日あたりの様々なＡＸＯＳ−１５−０．２７の用量は、０，０．３５ｇ（０．２４ｇ）、１．０５ｇ（０．７３ｇ）、３．１７ｇ（２．２１ｇ）、および７ｇ（４．８８ｇ）のいずれかとした。括弧内の重量の値は、調製物のＡＸ含有量と水分含有量に基づいて補正したＡＸＯＳの重量である。種々の試験用食事をボランティアに与える順序はランダムとした。試験用食事は、７５ｇの、安定な同位元素で標識された基質であるラクトース−［１５Ｎ，１５Ｎ］−ウレイド、１８５ｋＢｑのトリチウムで標識したポリエチレングリコール（３Ｈ−ＰＥＧ）、および適切な用量のＡＸＯＳ−１５−０．２７を含むパンケーキ（１５．８ｇのタンパク質、１１．６ｇの脂肪、および２１．１ｇの炭水化物；２５５ｋｃａｌ）であった。３Ｈ−ＰＥＧを、糞便の通過時間についての生体マーカーとして使用した（Ｇｅｂｏｅｓら、２００５）。
【０１０７】
尿を、１グラムのネオマイシンを細菌の増殖を防ぐために添加したレシピエントから回収した。基底の尿試料を、試験用の食事を摂取させる前に回収した。各試験用の食事の摂取後、４８時間での尿の回収を、３つの異なる画分として行った：０〜６時間、６〜２４時間、および２４〜４８時間。尿量の測定の後、試料を採取し、そして分析するまで−２０℃で保存した。排泄物を、試験用の食事を与えた後７２時間にわたって回収した。排泄物を、排泄後直ちに凍結し、重さを測定し、その後、−２０℃で保存した。同日に回収された全ての排泄物を混合し、さらに分析する前にホモジナイズした。既知の重量の試料を取り出し、凍結乾燥させた。乾燥物質を、再び重さを測定し、窒素および放射活性の分析のためにアリコートに分けた。
【０１０８】
図１５Ａに示すように、１５Ｎで標識した窒素の一貫して遅い尿による排出速度が、ＡＸＯＳ−１５−０．２７を含まない対照の食事と比較して、ＡＸＯＳ−１５−０．２７を含む試験用食事を摂取した後に記録された。投与した１５Ｎ用量の４４．５％が、対照の食事を摂取させた後の尿の試料の中に戻ってきた。この画分は、それぞれ、０．２４、０．７３、２．２１、および４．８８ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７の摂取後、４０．４％（対照と比較して−９％）、４３．７％（対照と比較して−２％）、３３．１％（対照と比較して−２６％）、および３３．６％（対照と比較して−２５％）に減少した。尿による１５Ｎの排出の減少は、２．２１ｇおよび４．８８ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７について、ｐ＜０．０５で有意であった。
【０１０９】
逆に、試験用の食事に対するＡＸＯＳ−１５−０．２７の補給によっては、便による１５Ｎの排出に一貫して増大が生じた（図１５Ｂ）。対照の試験用食事のグループにおいては、投与した１５Ｎの用量の１５．１％が便の中に戻ってきた。この画分は、それぞれ、０．２４、０．７３、２．２１、および４．８８ｇの摂取後、１６．４％（対照と比較して＋８％）、１８．８％（対照と比較して＋２４％）、２５．３％（対照と比較して＋６７％）、および２６．１％（対照と比較して＋７２％）に増大した。便による１５Ｎの排出の増加は、２．２１ｇおよび４．８８ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７について、ｐ＜０．０５で有意であった。ＡＸＯＳ−１５−０．２７は、消化管を通過する時間に対しては、３Ｈ−ＰＥＧ生体マーカーによって測定した場合には、試験した用量のいずれでも影響を与えなかった（図１５Ｃ）。
【０１１０】
ｐ−クレゾールおよびフェノールの一貫した尿による低い排出速度が、ＡＸＯＳ−１５
−０．２７を含まない対照の食事と比較した、ＡＸＯＳ−１５−０．２７を含む試験用食事の摂取後に記録された（図１６）。尿によって排出されたｐ−クレゾールの画分は、それぞれ、０．２４、０．７３、２．２１、および４．８８ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７の摂取後、対照と比較して、−９％、−２１％，−３５％、および−４１％に減少した（図１６Ａ）。尿によって排出されたフェノールの画分は、それぞれ、０．２４、０．７３、２．２１、および４．８８ｇのＡＸＯＳ−１５−０．２７の摂取後、対照と比較して、−４５％、−３９％，−３３％、および−４５％に減少した（図１６Ｂ）。尿によるフェノールの排出の減少は、０．２４ｇから４．８８ｇまでの範囲の試験したＡＸＯＳ−１５−０．２７の全てについて、ｐ＜０．０５で有意であった。したがって、ＡＸＯＳ−１５−０．２７は、１回の食事について０．２４ｇを下回る、驚くほど低い用量で活性である、ヒトにおける前生物学的化合物であることが明らかになった。
【０１１１】
尿による窒素の排出の減少と、便によるＮの排出の一貫した増加は、既知の前生物学的化合物（例えば、インシュリンおよびラクツロース）を投与したヒトにおいて以前に観察されている（Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒら、２００４；Ｇｅｂｏｅｓら、２００５）。便によるアンモニアの排出の刺激は、アンモニアが結腸上皮細胞の寿命を短くすること、その代謝回転を増大させること、そして化学物質による発ガン性に対してそれらをより敏感にすることが示されているので、望ましい（Ｖｉｓｅｋ １９７８）。結腸の内腔の中にあるアンモニアは、消化されていないタンパク質の細菌による発酵に主に由来する（Ｓｍｉｔｈ
＆ Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，１９９６；Ｆｏｏｋｓら、１９９９）。中程度の重合度を有しているＡＸＯＳのような、ゆっくりと発酵される前生物学的炭水化物は、糖分解性の細菌と、結腸に存在している細菌の解糖系を刺激する。したがって、このような化合物は、結腸の中でのタンパク質分解的発酵を抑制し、そして主な炭素源およびエネルギ源を炭水化物に頼る細菌による窒素源としてのアンモニアの再利用を刺激する。同時に、タンパク質の発酵代謝物であるクレゾールおよびフェノールの尿による排出の減少は、これらのフェノール系化合物が腸ガンに関係しているので望ましい（Ｂｏｎｅら、１９７６）。フェノール系化合物の尿による排出の減少は、前生物学的化合物であるラクツロースについて以前に観察されている（Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒら、２００４）。クレゾールおよびフェノールの排出の減少は、前生物学的化合物によって刺激されると、結腸の中の糖分解性細菌活性の増大を通じて、アミノ酸であるチロシン、またはタンパク質の腐敗による代謝産物の利用の増大によって引き起こされると考えられる。
【０１１２】
参考文献
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
【表３】
【０１１６】
【表４】
【０１１７】
【表５】
【０１１８】
【表６】
【０１１９】
【表７】
【０１２０】
【表８】
【０１２１】
【表９】
【０１２２】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】アラビノキシランの構成要素。Ａ：未置換のβ−Ｄ−キシロピラノシル残基。Ｂ：Ｏ−２でα−Ｌ−アラビノフラノシル部分によって置換されたβ−Ｄ−キシロピラノシル残基。Ｃ：Ｏ−３でα−Ｌ−アラビノフラノシル部分によって置換されたβ−Ｄ−キシロピラノシル残基。Ｄ：Ｏ−２およびＯ−３でα−Ｌ−アラビノフラノシル部分によって置換されたβ−Ｄ−キシロピラノシル残基。構造Ｃは、α−Ｌ−アラビノフラノシル残基のＯ−５に対するフェルラ酸の結合を示す。
【図２】種々のＡＸＯＳ調製物のＨＰＳＥＣ分子量プロフィール。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０６ＨＱ（３００×８ｍｍ、Ｓｈｏｗａ，Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，東京、日本）であった。７８．８×１０４、４０．４×１０４、２１．２×１０４、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、０．５９×１０４Ｄａの分子量を有しているプルラン標準物と、グルコース（１８０Ｄａ）の溶出容量が、左から右に向かって記号「ｘ」で示される。
【図３】ｐＨ２、３、７、および１１で１００℃での様々なインキュベーション時間についての、ＡＸＯＳ−１５−０．２７（Ａ）、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ（Ｂ）、およびフルクトオリゴ糖（Ｃ）の構成成分である単糖の分解の割合。
【図４】ｐＨ２、３、および７で１００℃での様々なインキュベーション時間についての、ＡＸＯＳ−１５−０．２７（Ａ）、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ（Ｂ）、およびフルクトオリゴ糖（Ｃ）の加水分解の割合。
【図５】ｐＨ２、３、および７で１００℃での様々なインキュベーション時間についての、ＡＸＯＳ−１５−０．２７の中のキシロース結合（Ａ）およびアラビノース結合（Ｂ）の加水分解の割合。
【図６】ＡＸＯＳ−１５−０．２７、Ｘｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐ、およびスクロースの甘味。曲線は、化合物の濃度（ｇ／ｌ）に対してプロットした被験体（ｎ＝２０）が認識する甘味の累積率を示す。
【図７】スキージＷＵ−ＡＸのエンドキシラナーゼ処理によって生じたＡＸＯＳの限外濾過後に得られたオリゴ糖画分のＨＰＳＥＣ分子量プロフィール。使用した膜は５ｋＤａ（パネルＡ）、１０ｋＤａ（パネルＢ）、および３０ｋＤａ（パネルＣ）のＭＭＣＯを有していた。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０２．５ ＨＱ（３００×８ｍｍ、Ｓｈｏｗａ，Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，東京、日本）であった。分子量マーカーは、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、０．５９×１０４Ｄａの分子量を有しているＳｈｏｄｅｘ標準プルランＰ−８２、８１０（ＤＰ６）、６７８（ＤＰ５）、５４６（ＤＰ４）、４１４（ＤＰ３）、および２８２Ｄａ（ＤＰ２）の分子量を有しているキシロオリゴ糖標準物、ならびに１８０Ｄａの分子量を有しているグルコースであり、これらのそれぞれの溶出容量が、左から右に向かって記号「ｘ」で示される。
【図８】スキージＷＵ−ＡＸのエンドキシラナーゼ処理によって生じたＡＸＯＳの１０ｋＤａおよび３０ｋＤａのＭＭＣＯを有している膜の連続的な通過による限外濾過後に得られたオリゴ糖画分のＨＰＳＥＣ分子量プロフィール。分析した画分は、１０ｋＤａの膜の保持物の３０ｋＤａのＭＭＣＯを通過させた後の保持物（ＲＥＴ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ）、１０ｋＤＡの膜の保持物の３０ｋＤａのＭＭＣＯを通過させた後の浸透液（ＰＥＲ１０ｋＤａ＋３０ｋＤａ）、または１０ｋＤａの膜を通過させた後の浸透液（ＰＥＲ１０ｋＤａ）のいずれかである。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＳＢ−８０２．５ ＨＱ（３００×８ｍｍ、Ｓｈｏｗａ，Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．，東京、日本）であった。分子量マーカーは、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、および０．５９×１０４Ｄａの分子量を有しているＳｈｏｄｅｘ標準Ｐ−８２プルラン、８１０（ＤＰ６）、６７８（ＤＰ５）、５４６（ＤＰ４）、４１４（ＤＰ３）、および２８２Ｄａ（ＤＰ２）の分子量を有しているキシロオリゴ糖標準物、ならびに１８０Ｄａの分子量を有しているグルコースであり、これらのそれぞれの溶出容量が、左から右に向かって記号「ｘ」で示される。
【図９】ニワトリの盲腸の中の微生物叢に対する、ＡＸＯＳ−７−０．３４、ＡＸＯＳ−１２２−０．６６、またはＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐのニワトリ用の飼料への添加の効果。盲腸の微生物叢の組成を、腸内細菌およびビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）についてプレートを数えることによって、実験の開始後１週間および２週間でそれぞれ決定した。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。任意の時点について、様々な文字を用いてマークした値は、テューキー検定にしたがうと互いにｐ＜０．０５で有意に異なる。
【図１０】１４日後のニワトリの盲腸の中のビフィズス菌の数に対する、０．１％または０．２５％のＡＸＯＳ−１５−０．２７、０．２５％または１％のフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）のニワトリ用の飼料への添加、またはエンドキシラナーゼの効果。ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌が定量的ＰＣＲによって測定された。様々な文字でマークされた値は、最小有意差検定にしたがうと互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５；ｎ＝３）。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。
【図１１】飼料を与え始めてから１３日後のラットの糞の中での、酢酸塩（上段のパネル）、プロピオン酸塩（中段のパネル）、および酪酸塩（下段のパネル）のレベルに対する、ラットの飼料に対する０．２５％のＡＸＯＳ−８−０．２７、ＡＸＯＳ−１５−０．２７、ＡＸＯＳ−１６−０．７８、またはＡＸＯＳ−１２２−０．６６の添加の効果。様々な文字でマークされた値は、最小有意差検定にしたがうと互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５；ｎ＝４）。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。
【図１２】飼料を与え始めてから１４日後のラットの近接結腸中の酢酸塩（Ａ）、遠位結腸中の酢酸塩（Ｂ）、遠位結腸中のプロピオン酸塩（Ｃ）、および遠位結腸中の酪酸塩（Ｄ）のレベルに対する、ラットの飼料への４％のＡＸＯＳ−１５−０．２７またはＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐの添加の効果。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。
【図１３】飼料を与え始めてから１４日後の盲腸のビフィズス菌のレベルに対する、ラットの飼料への４％のＡＸＯＳ−１５−０．２７またはＸｙｌｏｏｌｉｇｏ−９５Ｐの添加の効果。ビフィズス菌属に属する細菌が定量的ＰＣＲによって測定された。様々な文字で示された値は、最小有意差検定にしたがうと互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５；ｎ＝４）。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。
【図１４】健常なヒトボランティアの糞の中のビフィズス菌の数に対する、１４日間の間の４．８８ｇ／日のＡＸＯＳ−１５−０．２７または４．８１ｇ／日のＷＰＣの摂取の効果。ビフィズス菌属に属する細菌が定量的ＰＣＲによって測定された。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。星で示された棒は、ウイルコクソンの符号付き検定にしたがうと基底レベルとは有意な差を示す（ｐ＜０．０５；ｎ＝５）。
【図１５】窒素の尿による排出（Ａ）および便による排出（Ｂ）に対する、ならびに、盲腸通過時間（ｏｒｏ−ｃａｅｃａｌ ｔｒａｎｓｉｔ ｔｉｍｅ）（Ｃ）に対する１回だけの用量のＡＸＯＳ−１５−０．２７（０．２４、０．７３、２．２１、または４．８８ｇ）の摂取の効果。窒素の排出が、それぞれ、試験用の食事の摂取後０〜４８時間、および０〜７２時間の間に採取された尿または便の試料のいずれかの中に戻ってきた投与された１５Ｎ標識窒素の割合として表される。盲腸通過時間は、０〜７２時間の間に回収された糞試料中に存在する投与された３Ｈで標識されたＰＥＧの割合として表される。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。１つの星で示された棒、または２つの星で示された棒は、ウイルコクソンの符号付き検定にしたがうと、対照処置とは有意な差（それぞれ、ｐ＜０．０５（ｎ＝９）およびｐ＜０．０１（ｎ＝９））を示す。
【図１６】尿によるｐ−クレゾールの排出（Ａ）およびフェノールの排出（Ｂ）に対する１回だけの用量のＡＸＯＳ−１５−０．２７（０．２４、０．７３、２．２１、または４．８８ｇ）の摂取の効果。ｐ−クレゾールおよびフェノールの排出が、試験用の食事の摂取後０〜２４時間の間に採取された尿試料の中に戻ってきたｐ−クレゾールおよびフェノール含有量（ｍｇ）として表される。棒は測定値の平均を示し、そしてエラーバーは標準偏差を示す。１つの星で示された棒、または２つの星で示された棒は、ウイルコクソンの符号付き検定にしたがうと対照処置とは有意な差（それぞれ、ｐ＜０．０５（ｎ＝９）およびｐ＜０．０１（ｎ＝９））を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラビノキシランを含む腸内微生物叢を調節する栄養的添加剤であって、前記添加剤に含まれるアラビノキシランが５から５０の間の平均ＤＰを有することを特徴とする、栄養的添加剤。
【請求項２】
前記添加剤に含まれるアラビノキシランが７から４０の間の平均ＤＰを有している、請求項１に記載の栄養的添加剤。
【請求項３】
前記添加剤に含まれるアラビノキシランが７から２０の間の平均ＤＰを有している、請求項１または２のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項４】
１５％のアラビノキシランを含む、請求項１から３のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項５】
３０％のアラビノキシランを含む、請求項１から３のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項６】
６０％のアラビノキシランを含む、請求項１から３に記載の栄養的添加剤。
【請求項７】
アラビノキシランの９０％が２から６５０の間のＤＰを有している、請求項１から６のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項８】
アラビノキシランの９０％が２から１３０の間のＤＰを有している、請求項１から７のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項９】
前記添加剤が７０ｇ／ｌ水未満の濃度では甘味を有さない、請求項１から８のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項１０】
前記アラビノキシランが、アラビノキシランを含む植物性の材料に由来する、請求項１から９のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項１１】
前記アラビノキシランを含む材料が穀物に由来する材料である、請求項１０に記載の栄養的添加剤。
【請求項１２】
前記穀物材料が、小麦、大麦、ライムギ、オーツムギ、トウモロコシ、ソルガム、およびコメからなる群に由来する、請求項１１に記載の栄養的添加剤。
【請求項１３】
前記穀物材料が、ふすま、小麦粉、またはスキージである、請求項１１または１２に記載の栄養的添加剤。
【請求項１４】
前記アラビノキシランが、グルテン−デンプン分離プロセスの副流に由来する、請求項１１または１２に記載の栄養的添加剤。
【請求項１５】
前記アラビノキシランを含む材料が、キシラン分解性酵素で処理される、請求項１０から１４に記載の栄養的添加剤。
【請求項１６】
前記アラビノキシランを含む材料が、デンプン分解性酵素で処理される、請求項１０から１５に記載の栄養的添加剤。
【請求項１７】
前記アラビノキシランを含む材料が、タンパク質分解性酵素で処理される、請求項１０から１６に記載の栄養的添加剤。
【請求項１８】
０．２５から５ｇの間の請求項１から１７に記載の栄養的添加剤が含まれる、食品または飲料。
【請求項１９】
１から３ｇの間の請求項１から１７に記載の栄養的添加剤が含まれる、請求項２４に記載の食品または飲料。
【請求項２０】
１回分について０．２５から５ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２１】
１回分について１から３ｇの間の、５から５０の間のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、請求項２０に記載の穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２２】
１回分について０．２５から５ｇの間の、７から４０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、請求項２０に記載の穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２３】
１回分について１から３ｇの間の、７から４０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、請求項２０に記載の穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２４】
１回分について０．２５から５ｇの間の、７から２０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、請求項２０に記載の穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２５】
１回分について１から３ｇの間の、７から２０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、請求項２０に記載の穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２６】
前記食品が肉製品である、請求項１８から２５のいずれかに記載の食品。
【請求項２７】
前記食品が乳製品である、請求項１８から２５のいずれかに記載の食品。
【請求項２８】
前記飲料がアルコールを含まない飲料である、請求項１８から２５のいずれかに記載の飲料。
【請求項２９】
前記飲料が機能性清涼飲料である、請求項２８に記載の飲料。
【請求項３０】
前記食品に、ビフィズス菌属または乳酸菌属の生存している細菌が含まれる、請求項２７から２９に記載の飲料または食品。
【請求項３１】
１回分について０．２５から５ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は５から５０の間の平均ＤＰを有している、穀物をベースとする食品。
【請求項３２】
１回分について１から３ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は、５から５０の間の平均ＤＰを有している、請求項３１に記載の穀物をベースとする食品。
【請求項３３】
１回分について０．２５から５ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は、７から４０の間の平均ＤＰを有している、請求項３１に記載の穀物をベースとする食品。
【請求項３４】
１回分について１から３ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は、７から４０の間の平均ＤＰを有している、請求項３１に記載の穀物をベースとする食品。
【請求項３５】
１回分について０．２５から５ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は、７から２０の間の平均ＤＰを有している、請求項３１に記載の穀物をベースとする食品。
【請求項３６】
１回分について１から３ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は、７から２０の間の平均ＤＰを有している、請求項３１に記載の穀物をベースとする食品。
【請求項３７】
前記食品がベーカリ製品である、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項３８】
前記食品がペストリ製品である、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項３９】
前記食品が朝食用シリアルである、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項４０】
前記食品がビスケットである、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項４１】
前記食品がパスタ製品である、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項４２】
前記食品が産業的に製造されたデザート製品である、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項４３】
前記食品が乳製品である、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項４４】
前記食品または飲料が低カロリー製品である、請求項１８から４３のいずれかに記載の食品または飲料。
【請求項４５】
以下の工程：
ｉ．ふすま、小麦粉、または小麦スキージのようなアラビノキシランを多く含む材料から水で抽出できないアラビノキシラン画分を、好ましくは、それぞれ、デンプン分解酵素およびタンパク質分解酵素を使用して、上記アラビノキシランを多く含む材料の除デンプンおよび除タンパクによって単離する工程
ｉｉ．１つ以上のキシラン分解酵素を使用して水で抽出できないアラビノキシラン画分を脱重合化させる工程
を含む、請求項１から１７のいずれかに記載の栄養的添加剤の調製のための方法。
【請求項４６】
以下の工程：
ｉ．部分的に脱重合化された水で抽出することができるアラビノキシランを含む調製物、例えば、デンプン−グルテン分離プロセスの副流によって得られる調製物を得る工程
ｉｉ．必要に応じて、好ましくは、それぞれ、デンプン分解酵素およびタンパク質分解
酵素を使用して、上記アラビノキシランを含む調製物からデンプンおよびタンパク質を除去する工程；
ｉｉｉ．１つ以上のキシラン分解酵素を使用して前記調製物に含まれるアラビノキシランを脱重合化させる工程
を含む、請求項１から１７のいずれかに記載の栄養的添加剤の調製のための方法。
【請求項４７】
前記調製物が、前記栄養添加剤から４以下のＤＰを有しているオリゴ糖の量を減少させるために、キシラン分解酵素での処理の後に限界濾過に供される、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項１】
アラビノキシランを含む腸内微生物叢を調節する栄養的添加剤であって、前記添加剤に含まれるアラビノキシランが５から５０の間の平均ＤＰを有することを特徴とする、栄養的添加剤。
【請求項２】
前記添加剤に含まれるアラビノキシランが７から４０の間の平均ＤＰを有している、請求項１に記載の栄養的添加剤。
【請求項３】
前記添加剤に含まれるアラビノキシランが７から２０の間の平均ＤＰを有している、請求項１または２のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項４】
１５％のアラビノキシランを含む、請求項１から３のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項５】
３０％のアラビノキシランを含む、請求項１から３のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項６】
６０％のアラビノキシランを含む、請求項１から３に記載の栄養的添加剤。
【請求項７】
アラビノキシランの９０％が２から６５０の間のＤＰを有している、請求項１から６のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項８】
アラビノキシランの９０％が２から１３０の間のＤＰを有している、請求項１から７のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項９】
前記添加剤が７０ｇ／ｌ水未満の濃度では甘味を有さない、請求項１から８のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項１０】
前記アラビノキシランが、アラビノキシランを含む植物性の材料に由来する、請求項１から９のいずれかに記載の栄養的添加剤。
【請求項１１】
前記アラビノキシランを含む材料が穀物に由来する材料である、請求項１０に記載の栄養的添加剤。
【請求項１２】
前記穀物材料が、小麦、大麦、ライムギ、オーツムギ、トウモロコシ、ソルガム、およびコメからなる群に由来する、請求項１１に記載の栄養的添加剤。
【請求項１３】
前記穀物材料が、ふすま、小麦粉、またはスキージである、請求項１１または１２に記載の栄養的添加剤。
【請求項１４】
前記アラビノキシランが、グルテン−デンプン分離プロセスの副流に由来する、請求項１１または１２に記載の栄養的添加剤。
【請求項１５】
前記アラビノキシランを含む材料が、キシラン分解性酵素で処理される、請求項１０から１４に記載の栄養的添加剤。
【請求項１６】
前記アラビノキシランを含む材料が、デンプン分解性酵素で処理される、請求項１０から１５に記載の栄養的添加剤。
【請求項１７】
前記アラビノキシランを含む材料が、タンパク質分解性酵素で処理される、請求項１０から１６に記載の栄養的添加剤。
【請求項１８】
０．２５から５ｇの間の請求項１から１７に記載の栄養的添加剤が含まれる、食品または飲料。
【請求項１９】
１から３ｇの間の請求項１から１７に記載の栄養的添加剤が含まれる、請求項２４に記載の食品または飲料。
【請求項２０】
１回分について０．２５から５ｇの間の、５から５０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２１】
１回分について１から３ｇの間の、５から５０の間のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、請求項２０に記載の穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２２】
１回分について０．２５から５ｇの間の、７から４０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、請求項２０に記載の穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２３】
１回分について１から３ｇの間の、７から４０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、請求項２０に記載の穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２４】
１回分について０．２５から５ｇの間の、７から２０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、請求項２０に記載の穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２５】
１回分について１から３ｇの間の、７から２０の間の平均ＤＰを有しているアラビノキシランが含まれる、請求項２０に記載の穀物以外のものをベースとする食品または飲料。
【請求項２６】
前記食品が肉製品である、請求項１８から２５のいずれかに記載の食品。
【請求項２７】
前記食品が乳製品である、請求項１８から２５のいずれかに記載の食品。
【請求項２８】
前記飲料がアルコールを含まない飲料である、請求項１８から２５のいずれかに記載の飲料。
【請求項２９】
前記飲料が機能性清涼飲料である、請求項２８に記載の飲料。
【請求項３０】
前記食品に、ビフィズス菌属または乳酸菌属の生存している細菌が含まれる、請求項２７から２９に記載の飲料または食品。
【請求項３１】
１回分について０．２５から５ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は５から５０の間の平均ＤＰを有している、穀物をベースとする食品。
【請求項３２】
１回分について１から３ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は、５から５０の間の平均ＤＰを有している、請求項３１に記載の穀物をベースとする食品。
【請求項３３】
１回分について０．２５から５ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は、７から４０の間の平均ＤＰを有している、請求項３１に記載の穀物をベースとする食品。
【請求項３４】
１回分について１から３ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は、７から４０の間の平均ＤＰを有している、請求項３１に記載の穀物をベースとする食品。
【請求項３５】
１回分について０．２５から５ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は、７から２０の間の平均ＤＰを有している、請求項３１に記載の穀物をベースとする食品。
【請求項３６】
１回分について１から３ｇの間の、２００未満のＤＰを有しているアラビノキシランが含まれ、前記アラビノキシランの集団は、７から２０の間の平均ＤＰを有している、請求項３１に記載の穀物をベースとする食品。
【請求項３７】
前記食品がベーカリ製品である、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項３８】
前記食品がペストリ製品である、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項３９】
前記食品が朝食用シリアルである、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項４０】
前記食品がビスケットである、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項４１】
前記食品がパスタ製品である、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項４２】
前記食品が産業的に製造されたデザート製品である、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項４３】
前記食品が乳製品である、請求項１８から１９、または３１から３６のいずれかに記載の食品。
【請求項４４】
前記食品または飲料が低カロリー製品である、請求項１８から４３のいずれかに記載の食品または飲料。
【請求項４５】
以下の工程：
ｉ．ふすま、小麦粉、または小麦スキージのようなアラビノキシランを多く含む材料から水で抽出できないアラビノキシラン画分を、好ましくは、それぞれ、デンプン分解酵素およびタンパク質分解酵素を使用して、上記アラビノキシランを多く含む材料の除デンプンおよび除タンパクによって単離する工程
ｉｉ．１つ以上のキシラン分解酵素を使用して水で抽出できないアラビノキシラン画分を脱重合化させる工程
を含む、請求項１から１７のいずれかに記載の栄養的添加剤の調製のための方法。
【請求項４６】
以下の工程：
ｉ．部分的に脱重合化された水で抽出することができるアラビノキシランを含む調製物、例えば、デンプン−グルテン分離プロセスの副流によって得られる調製物を得る工程
ｉｉ．必要に応じて、好ましくは、それぞれ、デンプン分解酵素およびタンパク質分解
酵素を使用して、上記アラビノキシランを含む調製物からデンプンおよびタンパク質を除去する工程；
ｉｉｉ．１つ以上のキシラン分解酵素を使用して前記調製物に含まれるアラビノキシランを脱重合化させる工程
を含む、請求項１から１７のいずれかに記載の栄養的添加剤の調製のための方法。
【請求項４７】
前記調製物が、前記栄養添加剤から４以下のＤＰを有しているオリゴ糖の量を減少させるために、キシラン分解酵素での処理の後に限界濾過に供される、請求項４５または４６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００８−５０４０３８（Ｐ２００８−５０４０３８Ａ）
【公表日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１８４１４（Ｐ２００７−５１８４１４）
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＥ２００５／０００１０５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２４９５
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５９９０９８４９３）カー・イュー・ルーベン・リサーチ・アンド・ディベロップメント (83)
【氏名又は名称原語表記】Ｋ．Ｕ． Ｌｅｕｖｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＥ２００５／０００１０５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２４９５
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５９９０９８４９３）カー・イュー・ルーベン・リサーチ・アンド・ディベロップメント (83)
【氏名又は名称原語表記】Ｋ．Ｕ． Ｌｅｕｖｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
【Ｆターム（参考）】
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