核酸増幅基板
【課題】基板上でＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、核酸の増幅を行う核酸増幅基板に関するものであり、核酸増幅反応工程において反応液が洩れることのない基板を開発する。
【解決手段】核酸増幅基板１０は、ガラス板からなる第一層１１とシリコンゴムからなる第二層１２が積層されたものである。第二層１２には、第一層１１との接触面側に微細な溝加工が施され、第一層１１と第二層１２の間で空隙６が形成されている。核酸増幅基板１０では、空隙のパターン（溝パターン）によって４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８が形成されている。核酸増幅・分離流路１８は、反応液溜部２０と電気泳動部２１を有し、これらの周辺に反応液往復流路２２、反応液吸引路２３、核酸供給路２５が設けられたものである。反応液溜部２０は、正面視が略正方形の空隙内にジグザクで迷路状の流路を設けたものである。
【解決手段】核酸増幅基板１０は、ガラス板からなる第一層１１とシリコンゴムからなる第二層１２が積層されたものである。第二層１２には、第一層１１との接触面側に微細な溝加工が施され、第一層１１と第二層１２の間で空隙６が形成されている。核酸増幅基板１０では、空隙のパターン（溝パターン）によって４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８が形成されている。核酸増幅・分離流路１８は、反応液溜部２０と電気泳動部２１を有し、これらの周辺に反応液往復流路２２、反応液吸引路２３、核酸供給路２５が設けられたものである。反応液溜部２０は、正面視が略正方形の空隙内にジグザクで迷路状の流路を設けたものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一枚の基板内でＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、核酸の増幅を行う核酸増幅基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学分野において、ＤＮＡを活用した診断が注目を集めている。また農業分野における遺伝子組み換え作物の判定や品種の判定にもＤＮＡ鑑定が活用されている。
上記した様な診断や品種の判定は、血液や作物の試料に目的とするＤＮＡが存在するか否かによって行われるが、試料中の目的ＤＮＡは微量である場合が多い。そこでＤＮＡ診断やＤＮＡ鑑定に先立って、試料中に含まれる目的ＤＮＡを増幅することが必要である。ここで試料中の目的ＤＮＡを特異的に増幅する方策として、各種の核酸増幅反応が提案されている。特にＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法による核酸増幅反応は、バイオテクノロジー分野における基本技術となっている。
ＰＣＲ法は、鋳型ＤＮＡ、プライマー、基質、耐熱性ポリメラーゼ酵素等を混合した反応液を温度調節し、所定の３種類の温度に順次変化させ、これを繰り返すことによって目的とするＤＮＡを増幅する方法である。
【０００３】
すなわち反応液を、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させるディナチュレーション反応を行う温度に温調し、続いて一本鎖ＤＮＡにプライマーを会合させるアニーリング反応を行う温度に温調し、さらに続いて耐熱性ポリメラーゼ酵素による二本鎖伸長反応を行う温度に温調する。この様に、反応液を三段階の温度に順次温調することにより、ＤＮＡの増幅を行うことができる。
【０００４】
具体的には、反応液を各設定温度に温調する工程を３０回程度繰返すことで、多量のＤＮＡ複製生産物を得る。なお、ディナチュレーション温度、アニーリング温度、二本鎖伸長の各反応温度はそれぞれ、９５℃、５０〜５５℃、７２℃程度である。
【０００５】
旧来、ＰＣＲ法はマイクロチューブを使用して行われ、当該マイクロチューブ内に試料やＰＣＲプライマーを含む反応液を入れ、さらにこのマイクロチューブを所定の温度雰囲気とすることによって行われてきた。
しかしながらマイクロチューブを使用する方法は、相応量の試料が必要であるが、微量の試料しか入手できない場合もあり、ＤＮＡ鑑定等ができない場合もあった。
またマイクロチューブを使用する方法は、ＤＮＡの増幅に時間がかかるという問題もあった。
さらに増幅されたＤＮＡを分析するには、マイクロチューブから反応液を抜き出して別途分離装置にかける必要があり、さらに手間がかかるという不満もあった。
【０００６】
これに対してＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅を基板上で行い、さらに同一の基板上でＤＮＡの分離を行う方策が提案されている。
下記の特許文献は、いずれもＤＮＡの増幅と分離を一枚の基板上で行う技術を開示するものである。
【特許文献１】特開２００３−８３９６５号公報
【特許文献２】特開２００２−３０６１５４号公報
【特許文献３】特開２００３−２７０２０４号公報
【０００７】
特許文献１に開示された基板は、ガラス板等の表面に窪みや溝を形成し、上面開放のＰＣＲ槽を設けたものである。特許文献１に開示された基板は、その一部にＰＣＲ槽を備えるが、当該ＰＣＲ槽は上面が開放されている。
特許文献１に開示された技術では、前記したＰＣＲ槽に反応液等を充填する。そして上部に設置された熱源によってＰＣＲ槽中の反応液等を非接触状態で加熱してディナチュレーション反応を行わしめる。
続いて下部に設置された冷却装置でＰＣＲ槽中の反応液等を冷却してアニーリングを行う。
さらに続いて上部に設置された熱源によってＰＣＲ槽中の反応液等を非接触状態で加熱して二本鎖伸長反応を行わしめる。
そしてこれらを繰り返して試料中の目的とするＤＮＡを増幅する。
【０００８】
特許文献２に開示された基板についても、上面開放のＰＣＲ槽が設けられ、ＰＣＲ槽に反応液等が充填されてＰＣＲが行われる。
特許文献２に開示された技術では、基板は底面側からのみ温調される。
【０００９】
特許文献３に開示された基板についても、上面開放のＰＣＲ槽が設けられ、ＰＣＲ槽に反応液等が充填されてＰＣＲが行われる。
特許文献３に開示された技術では、基板は上下面から加熱し、その際に温調装置側に設けられたシール部によってＰＣＲ槽の上面を塞ぐ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＤＮＡによる診断や鑑定は、今後ますます需要が増大するであろうと予想される。そのためＤＮＡの増幅をより簡便な方法で行うことができる技術の開発が急務である。また微量の試料をもって所望の診断等が行われることが望ましい。
さらにＤＮＡによる診断は、感染症の診断に利用される場合が多いので、ＤＮＡの増幅は迅速に行われなければならない。
そこで本発明者らは、ＰＣＲを行う際の温度調節をより迅速に行うために、基板の両面側から加熱・冷却する方策を検討した。より具体的には、上下が一対のヒートブロックを使用し、当該ヒートブロックで、基板を挟んで基板の温度調節を行う方策を検討した。
またさらに温度調節の迅速化を図るため、前記したヒートブロックを３組用意し、これらをそれぞれディナチュレーション温度、アニーリング温度、二本鎖伸長の各反応温度に予め温度調節しておき、基板を挟むヒートブロックを順次取り替えて三段階の温度に順次温調する方策を検討した。
【００１１】
ここで従来技術の基板は、いずれもＰＣＲ槽の上面が開放されていたため、基板の上部にヒートブロックを接触させることができない。また前記した特許文献３に開示された装置を使用すれば基板の上部にヒートブロックを接触させることもできるが、特許文献３に開示された装置では、温調装置側にシール部材があるので、シール部材が反応液で汚染される。そのため異なる基板を温調する際にシール部材をいちいち洗浄しなければならず、実用に耐えない。
さらに本発明者らのアイデアに基づいて基板を挟むヒートブロックを順次取り替えて三段階の温度に順次温調する方策を採用すると、基板が振動や衝撃を受けることは避けられない。これに対して従来技術の基板では、ＰＣＲ槽の上面が開放されているため、ＰＣＲ槽から反応液等がこぼれ、周囲を汚染したり、他の反応液と混ざってしまう危険があった。
そこで本発明は、従来技術の上記した問題点に注目し、ＰＣＲ等の核酸増幅反応工程において反応液が洩れ難い基板の開発を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、基板の一部に反応液溜部が形成され、当該反応液溜部内に核酸増幅反応に必要な成分を含む反応液が充填され、前記反応液溜部の温度を調節して反応液溜部内において核酸増幅反応を行い、核酸を増幅する核酸増幅基板において、前記反応液溜部は、基板の内部に設けられた空隙によって構成されており、反応液溜部内で増幅された核酸を電気泳動によって分離する電気泳動部を備えたことを特徴とする核酸増幅基板である。
【００１３】
本発明の核酸増幅基板では、反応液溜部は、基板の内部に設けられた空隙によって構成されており、半密閉状態である。そのため基板の表面に物が触れても、反応液によって汚染されることはない。また基板が振動を受けても反応液が反応液溜部からこぼれることはない。
また本発明の核酸増幅基板では、同一基板内に反応液溜部内で増幅された核酸を電気泳動によって分離する電気泳動部を備える。そのため本発明の核酸増幅基板によると、核酸の増幅と分離を同一基板内で行うことができる。
本発明の核酸増幅基板を用いて行われる核酸増幅反応の例としては、ＰＣＲ法、ＬＴＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Standard Displacement Amplification）法等が挙げられるが、ＰＣＲ法が代表的である。また、核酸増幅反応に必要な成分としては、例えばＰＣＲ法の場合は、鋳型ＤＮＡ、プライマー、デオキシヌクレオチド３リン酸類、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
【００１４】
請求項２に記載の発明は、反応液を導入する反応液導入部と、基板の内部に設けられた空隙によって形成され前記反応液導入部と反応液溜部を繋ぐ反応液流路を備え、反応液は反応液導入部に導入され、さらに反応液流路を経て反応液溜部に充填されることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅基板である。
【００１５】
本発明の核酸増幅基板は、反応液を導入する反応液導入部を備え、反応液は反応液導入部から基板内に導入される。本発明の核酸増幅基板では、反応液導入部と反応液溜部の間に反応液流路が設けられているので、反応液溜部と反応液導入部の間に相当の距離があり、反応液溜部の反応液が洩れにくい。
【００１６】
また請求項３に記載の発明は、基板は、２以上の層が積層されて成り、積層された２層の内の一方の積層面に溝が設けられ、当該溝によって基板の内部に前記空隙が形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸増幅基板である。
【００１７】
本発明の核酸増幅基板は、簡単な方法で基板の内部に空隙を形成することができ、製造が容易である。
【００１８】
また本発明者らは、各種形状の基板を試作したが、開発当初の試作品は、図１３に示すような一室的な空洞によって構成された反応液溜部１をもった核酸増幅基板２であった。
図１３に示す核酸増幅基板２は、振動を受けても反応液がこぼれることが無く、当初の目的を達成することができたが、開発当初には予期しなかった不具合があった。
すなわち図１３に示す核酸増幅基板２を用いて、前記したアイデア通り、核酸増幅基板２を挟むヒートブロックを順次取り替えて三段階の温度に順次温調し、これを３０回程度繰り返したところ、反応液溜部１から反応液が消失してしまった。
【００１９】
この原因を検討したところ、大きく二つの理由に基づくものであることが判明した。
一つは、反応液の昇温・冷却を繰り返す中で、反応液が膨張・収縮し、これに伴って反応液が移動して反応液溜部の外部に逃げてしまうことが原因であった。
もう一つの原因は、図１５の二点鎖線の様に上下のヒートブロック片３，４で挟まれた際に反応液溜部１の上部の壁面が撓み、内部が加圧されて反応液が反応液溜部１の外部に押し出されてしまうことが原因であった。
そこで本発明者らは、この対策として、請求項４乃至７に記載の発明を発案した。
【００２０】
すなわち請求項４に記載の発明は、反応液溜部内又は反応液溜部の出入口近傍に反応液の移動を抑制する移動抑制手段が設けられたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸増幅基板である。
【００２１】
本発明の核酸増幅基板では、反応液の移動を抑制する移動抑制手段が設けられている。そのため反応液が反応液溜部の外部に逃げることが阻止される。
移動抑制手段としては、例えば流路抵抗を増大させる構成が考えられる。
【００２２】
また請求項５に記載の発明は、反応液溜部内又は反応液溜部の出入口近傍に複数の曲路を含む流路が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅基板である。
【００２３】
本発明の核酸増幅基板では、反応液溜部内又は反応液溜部の出入口近傍に複数の曲路を含む流路が形成されているので、反応液溜部内又はその近傍における流路抵抗が高い。そのため、反応液が反応液溜部の外部に逃げることが阻止される。
なお、曲路を含む流路は、「移動抑制手段」としても機能する。
また特に反応液溜部内に流路が形成されている場合は、流路を形成する壁面によって反応液溜部の表裏面の撓みが軽減される。そのため後者の原因による反応液の流出も阻止される。
【００２４】
また請求項６に記載の発明は、反応液溜部内には複数の曲路を含む直列の流路が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅基板である。
【００２５】
本発明の核酸増幅基板についても反応液溜部内に複数の曲路を含む流路が形成されているので、流路抵抗が高く、且つ反応液溜部の表裏面の撓みが軽減され、反応液の流出が阻止される。
また特に本発明の核酸増幅基板では、反応液溜部内の流路が直列であるから、反応液溜部内に反応液を密に充填することができる。
【００２６】
また請求項７に記載の発明は、反応液溜部内に耐圧縮部が設けられ、反応液溜部を表裏の方向に圧縮した時、当該圧縮力を前記耐圧縮部に負担させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の核酸増幅基板である。
【００２７】
本発明の核酸増幅基板では、反応液溜部内に耐圧縮部が設けられており、圧縮力の一部又は全部を圧縮部が負担する。そのため反応液溜部の表裏面の撓みが軽減され、反応液の流出が阻止される。
なお前記した反応液溜部内に設けられた流路も耐圧縮部として機能する。
【００２８】
また反応液溜部と電気泳動部は分離されており、両者の距離は、基板の最も厚い部位の厚さの３倍以上であることが望ましい（請求項８）。
【００２９】
すなわち、電気泳動部には、ＰＣＲ等の核酸増幅反応で増幅されたＤＮＡ等の核酸を分離するための担体が充填される。この担体は、多くの場合ゲルである。ここで本発明の核酸増幅基板は、同一基板内で核酸増幅反応を行うものであり、ＰＣＲ等の核酸増幅反応が行われる反応液溜部は昇温される。そのため電気泳動部が反応液溜部に近い位置にあると、反応液溜部を昇温する際に電気泳動部が加熱され、内部のゲル中の水分が蒸散してしまう。その結果、ゲルの組成が変化し、電気泳動時の分離能に悪影響が及ぶ。
これに対して請求項８に記載の発明では、反応液溜部と電気泳動部は分離されており、両者の距離は、基板の最も厚い部位の厚さの３倍以上であるから、反応液溜部を加熱しても電気泳動部はその熱影響を受けず、電気泳動時の分離能に悪影響が及ぶことはない。
【００３０】
また請求項９に記載の発明は、反応液溜部の厚さは、電気泳動部の厚さに比べて薄いことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の核酸増幅基板である。
【００３１】
本発明の核酸増幅基板では、反応液溜部の厚さは、電気泳動部の厚さに比べて薄い。そのため反応液溜部の温度を外部からコントロールし易い。また逆に電気泳動部の厚さが厚いので、電気泳動部は外部からの熱影響を受けにくい。
【００３２】
また反応液導入部から反応液溜部に至る領域は、親水性であることが望ましい（請求項１０）。
【００３３】
すなわち、請求項１０に記載の発明では、当該部位が親水性であるので、試料が表面に馴染みやすく、基板への試料の導入が容易である。さらに、反応液溜部において基板から試料への熱伝導がよいので、より確実にＰＣＲ等によって核酸を増幅することができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の核酸増幅基板は、核酸増幅反応工程において反応液が洩れることが少なく、周囲の汚染や異種試料の混入がないという効果がある。さらに、一枚の基板によって核酸増幅と分離を行うことが可能であり、作業効率が高いという効果がある。
また特に請求項４乃至７に記載の核酸増幅基板は、基板をヒートブロック等で挟んだ時に反応液溜部から反応液が流出することを阻止する効果があり、微量の試料でもＤＮＡ診断等が可能である。
【００３５】
また特に請求項９に記載の核酸増幅基板では、反応液溜部内の温度変化を迅速に行うことが可能であり、且つ電気泳動部への熱影響が少ないという優れた効果がある。
【００３６】
また特に請求項１０に記載の核酸増幅基板では、試料の導入が容易であり、さらに、試料のロスが少ないのでより微量の試料から核酸を増幅できるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下さらに本発明の実施形態について説明する。
図１は、本発明の実施形態の核酸増幅基板の正面図である。図２は、図１の核酸増幅基板の斜視図である。図３は、図１の核酸増幅基板の二系統の核酸増幅・分離流路の正面図である。図４は、図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の第一層と第二層の分解斜視図である。図５は、図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の拡大断面図である。図６は、図１の核酸増幅基板の反応液導入口周辺の拡大斜視図である。
【００３８】
図において、１０は、本発明の実施形態の核酸増幅基板を示す。核酸増幅基板１０は略長方形の板状であり、その大きさは、３０×４０ｍｍ〜７０×１００ｍｍ程度である。
【００３９】
核酸増幅基板１０は、ガラス板からなる第一層１１とシリコンゴムからなる第二層１２が積層されたものである。第一層１１は、主として全体の剛性を確保するために設けられた層であり、ガラスの他、石英、アクリル樹脂等の材質のものが使用可能である。
第二層１２は、第一層１１との界面に空隙を形成させるために設けられた層であり、微細な溝や凹部が形成可能な素材が選択される。シリコンゴムの例としては、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を挙げることができる。また、シリコンゴムの他、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等のプラスチック、ガラス、石英等、様々の材質が使用可能である。
試料を光学的に検出する場合には、第一層１１及び第二層１２は、透明あるいは光透過性であることが望ましい。
【００４０】
本実施形態では、第一層１１たるガラス板は、図４、図５に示すように表裏面とも平滑である。これに対して第二層１２たるシリコンゴムには、図４、図５の様に第一層１１との接触面側に微細な溝５が設けられ、第一層１１と第二層１２の間に空隙６が形成される。
また第二層１２には図１、図２の様に複数の貫通孔が設けられており、当該貫通孔によって空隙と外部とが連通する。
【００４１】
上記した空隙内及び開口は、いずれも親水処理がなされており、その表面は、親水性である。
【００４２】
第一層１１の厚さは、０．２〜５．０ｍｍ程度である。第一層１１の厚さが、０．２ｍｍ未満の場合は、全体の剛性が低く、ヒートブロックで挟んで加熱するのには適しない。逆に第一層１１の厚さが５．０ｍｍを越えると、ヒートブロックから内部に熱が伝わり難い。第一層の厚さとして最も好適な範囲は、０，２〜０．６ｍｍ程度である。
【００４３】
第二層１２の厚さは一様ではなく、後記する反応液溜部２０が設けられたエリアＤは、図２の様に他のエリアに比べて厚さが薄い。具体的には反応液溜部２０の厚さが０．２〜１．０ｍｍあり、他の部位の厚さは０．６〜３ｍｍである。
第二層の反応液溜部２０に相当する部位は、その厚さが０．２ｍｍ未満の場合は、全体の剛性が低く、撓みが大きくてヒートブロックで挟んで加熱するのには適しない。当該部位の厚さが１．０ｍｍを越えると、ヒートブロックから内部に熱が伝わり難い。この点から最も推奨される範囲は、０．３ｍｍ〜０．６ｍｍ程度である。
後記する電気泳動部２１は、外部から熱影響を受けないことが望ましく、第二層の厚さは、反応液溜部２０よりも厚く設計されている。また電気泳動部２１に電極を取り付ける関係上もある程度の厚さをもつことが望ましい。
【００４４】
本実施形態の核酸増幅基板１０では、空隙６のパターン（溝パターン）によって図１の様に４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８が形成されている。
【００４５】
上記した４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８は、いずれも略同一形状であるので、図１の最下部に図示された核酸増幅・分離流路１８をこれらの代表例として説明する。
【００４６】
核酸増幅・分離流路１８は、図１，３に示す様な反応液溜部２０と電気泳動部２１を有し、これらの周辺に反応液往復流路２２、反応液吸引路２３、核酸供給路２５が設けられたものである。
さらに核酸増幅・分離流路１８には、反応液導入開口（反応液導入部）３０、吸引用開口３１、核酸供給路末端側開口３３、泳動部始端側開口３５、泳動部終端側開口３６が設けられている。各開口３０，３１，３３，３５，３６は、いずれも第二層１２に設けられた貫通孔によって構成されており、第一層１１と第二層１２の間で形成される空隙６と外部とを連通するものである。
【００４７】
以下、順次説明する。
反応液溜部２０は、内部に反応液を貯留することを目的として形成された空隙部分である。本実施形態では、反応液溜部２０は、Ｓ字カーブ状に曲がった流路４０を密状態に繋げて作られている。見方を変えると、反応液溜部２０は、正面視が略正方形の空隙内に隔壁７（図５）が設けられ、ジグザクで迷路状の流路を設けたものであるとも言える。反応液溜部２０内の流路は直列である。すなわち反応液溜部２０内においては、略同一長さの８本の直線路４１が平行に配され、隣接する直線路４１の端部同士が曲路４３で接続され、全体として直列状となっている。
曲路４３は、図３（ｂ）の様な円状の流路である。曲路は、図３（ｃ）の様な角型の流路であってもよいが、角型の流路は角の部位に気泡が残留し易いので、図３（ｂ）の様な円状の流路を採用することが推奨される。
【００４８】
反応液溜部２０は、前記した様に内部に反応液を貯留する為に形成された部分であるため、内部の流路は、他の部位の流路に比べて幅、深さ、共に大きい。
すなわち反応液溜部２０内の流路は、前記した様に第二層１２の界面に形成された溝によって構成されているが、当該溝の幅は、１００μｍ〜５００μｍ、より好ましくは２５０〜４５０μｍである。
また反応液溜部２０の溝の深さは、１００〜３００μｍである。なお他の部位における溝の深さは、１０〜５０μｍ程度である。
反応液溜部２０の溝の断面積（流路の断面積）は、０．０１〜０．１５平方ミリであり、他の部位の溝に比べて３倍から５０倍大きい。
反応液溜部２０の全体の容積は、３〜１０ミリリットル程度である。
【００４９】
反応液溜部２０の一端側は、反応液往復流路２２を介して反応液導入開口（反応液導入部）３０と連通している。反応液導入開口３０は、核酸増幅基板１０の中央部近傍に設けられた開口である。反応液導入開口３０と反応液溜部２０を結ぶ反応液往復流路２２は、直線を基調とするものであり、「Ｕ」路や「Ｓ」路は無い。
【００５０】
また反応液溜部２０の他端側は、反応液吸引路２３を介して吸引用開口３１と連通している。吸引用開口３１についても核酸増幅基板１０に設けられた開口である。反応液吸引路２３は、曲路を基調としたものであり、Ｓ字カーブ状に曲がった流路である。反応液吸引路２３の曲路は、流路抵抗の増大を目的としたものであり、図３（ｃ）の様な角型である。
反応液吸引路２３の曲部は、「移動抑制手段」として機能する。
【００５１】
電気泳動部２１は、泳動部始端側開口３５から泳動部終端側開口３６に至る流路であり、中途部分で核酸供給路２５と交差する。泳動部始端側開口３５から交差部５０に至る間は、泳動準備路５１であり、単に通電路として機能する。
泳動準備路５１は、複数の曲路を有して相当量の距離が確保されている。
【００５２】
交差部５０から泳動部終端側開口３６に至る間は泳動路５２であり、後記する様にゲルが充填され、増幅されたＤＮＡ等の核酸が実際に泳動され分離される部分である。
泳動路５２は、一部が「く」の字状に折れているが、基本的には直線を基調としている。
【００５３】
核酸供給路２５は、反応液導入開口３０と核酸供給路末端側開口３３を接続するものであり、その中間部分で前記した様に電気泳動部２１と交差する。
反応液導入開口３０は、前記した様に核酸増幅基板１０の中央部近傍に設けられているので、交差部５０に至る間は、反応液溜部２０側に戻る方向に延びる流路となる。また反応液導入開口３０から交差部５０に至る間の流路には、「コ」の字状に曲げられた部位が設けられている。当該「コ」の字状に曲がった部位は、流路が平行に並ぶものであるが、平行に並ぶ流路同士の間には相当の距離があり、当該部位における圧力損失は少ない。すなわち前記した「コ」の字状部は、流路抵抗を増大するために設けられたものではなく、反応液導入開口３０から交差部５０に至る間の距離を所定長以上確保するために設けられたものである。
本実施形態では、交差部５０から核酸供給路末端側開口３３に至る流路のレイアウトは、反応液導入開口３０から交差部５０に至る流路のレイアウトと対称形である。
【００５４】
本実施形態では、前記した通り４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８を有し、各流路のレイアウトは多少相違するが、いずれの核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８も、電気泳動部２１の流路の長さは同一である。すなわち各核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８の、泳動部始端側開口３５から泳動部終端側開口３６に至る流路の距離はいずれも同一である。また泳動部始端側開口３５から交差部５０までの距離、及び交差部５０から泳動部終端側開口３６までの距離についても、各核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８の間で相違はない。
【００５５】
核酸供給路２５についても同様であり、反応液導入開口３０と核酸供給路末端側開口３３の長さはいずれの核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８でも同一である。また反応液導入開口３０から交差部５０に至る間の長さ、及び交差部５０から核酸供給路末端側開口３３に至る長さも各核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８の間で相違はない。
【００５６】
本実施形態では、図１の様に、核酸増幅反応を行う反応液溜部２０のエリアＡと電気泳動を行わしめるエリアＢが分離されており、両者の間に相当の距離がある。この距離Ｃは、反応液溜部２０の熱が電気泳動部２１に伝わらない距離であり、核酸増幅基板１０の板厚（最も厚い部分の厚み）の３倍以上、又はガラス板からなる第一層１１の板厚の５倍以上である。
【００５７】
上記した電気泳動部２１及び核酸供給路２５には、核酸の電気泳動に一般的に使用される水性ポリマーからなるゲルが充填される。当該ゲルの例としては、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメトキシセルロース等が挙げられる。
ゲルの濃度は、分離する核酸の大きさによって適宜選択される。核酸がＤＮＡの場合を例にとると、数１０〜数１００塩基対程度の大きさのＤＮＡであれば、５％程度のポリジメチルアクリルアミドを使用することができる。１０００塩基対を越える様なＤＮＡの場合は、０．５〜２．５％程度のアガロースゲルを使用することができる。
なお、ゲルには、あらかじめエチジウムブロマイドの様な蛍光を発するインターカレーターを含ませておくことが一般的である。そのようにすれば、電気泳動に供されたＤＮＡ等の核酸が泳動と同時にエチジウムブロマイド等で染色され、ただちに蛍光検出器で染色された核酸を検出することができる。
【００５８】
電気泳動部２１及び核酸供給路２５に対するゲルの充填は、核酸増幅基板１０を使用する直前に行うことが望ましい。
ゲルの充填は、泳動部終端側開口３６から圧入することにより行われる。
【００５９】
次に本実施形態の核酸増幅基板１０の機能について説明する。
本実施形態の核酸増幅基板１０は、図７に示す様な装置に装着して所定の検査を行うものである。
ここで図７は、図１の核酸増幅基板を装着して核酸増幅及び分離を行う温調装置及び電気泳動装置の斜視図である。図８は、反応液導入口から反応液溜部に反応液を送る際における反応液の挙動を示す説明図である。図９は、反応液溜部から反応液導入口側に反応液を戻す際における反応液の挙動を示す説明図である。図１０は、核酸を分離する際における反応液の挙動を示す説明図である。
図７に示す装置は、大きく分けて核酸増幅反応を行う温調装置８０と電気泳動・検出装置８１が組み合わされたものである。
【００６０】
温調装置８０は、３組のヒートブロック５５，５６，５７と、基板送り機構５８と、反応液注入・吸引機構６０を備えたものである。
３組のヒートブロック５５，５６，５７は、それぞれ上片５５ａ，５６ａ，５７ａと下片５５ｂ，５６ｂ，５７ｂを有し、上片と下片の両方が昇降してその間に核酸増幅基板１０を挟むことができる。ヒートブロック５５，５６，５７が挟む位置は、核酸増幅基板１０の反応液溜部２０の領域だけであり、電気泳動部２１は挟まない。
【００６１】
３組のヒートブロック５５，５６，５７は、予め所定の温度に温度調節されるものである。核酸増幅反応としてＰＣＲを行う場合を例にとると、向かって右端のヒートブロック５５はディナチュレーション温度（９５℃）近傍に、左端のヒートブロック５７はアニーリング温度（５５℃）近傍に、中央のヒートブロック５６は二本鎖伸長の各反応温度（７２℃）近傍にそれぞれ温度調節される。
３組のヒートブロック５５，５６，５７の内、ＰＣＲを行う場合にディナチュレーション温度近傍に温度調節されるヒートブロック５５と、二本鎖伸長の各反応温度近傍に温度調節されるヒートブロック５６は、電気ヒータを内蔵するものである。一方、アニーリング温度近傍に温度調節されるヒートブロック５７は、電気ヒータの他に空冷用ファンによる冷却機能を備えている。
【００６２】
各ヒートブロックの核酸増幅基板１０に対する接触面には、熱伝導性に優れたシートが接着されている。当該シートには例えばシリコンを素材とするものが採用される。
【００６３】
基板送り機構５８は、核酸増幅基板１０を保持して水平移動させ、核酸増幅基板１０を各ヒートブロックに順次挟ませるものである。基板送り機構５８は、核酸増幅基板１０の装着台６１を備える。また装着台６１には、基板押さえ６２が設けられている。基板押さえ６２は、板バネによって核酸増幅基板１０を押圧するものであり、核酸増幅基板１０の振動を防止する機能を持つ。
【００６４】
反応液注入・吸引機構６０は、小型の加圧装置と真空装置を備えたものである。
【００６５】
電気泳動・検出装置８１の内部は図示しないが、電気泳動装置と蛍光検出装置を内蔵するものである。電気泳動装置は、増幅核酸移動用の電極と、増幅核酸泳動用の電極を備える。
【００６６】
前述した核酸増幅基板１０は、基板送り機構５８に装着され、まず最初に反応液注入・吸引機構６０の位置に移送される。
反応液注入・吸引機構６０では、図８（ａ）に示すように、反応液導入開口３０に反応液が注入される。
この反応液は、核酸増幅反応に必要な成分を全て含むものである。核酸増幅反応がＰＣＲである場合は、鋳型ＤＮＡ、プライマー、デオキシヌクレオチド３リン酸類、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等が混合されたものが反応液となる。この場合、プライマーにあらかじめ蛍光標識がなされる場合もある。プライマーにあらかじめ蛍光標識がなされる場合は、増幅されたＤＮＡはすでに蛍光標識されているので、電気泳動部２１のゲルにインターカレーターを添加する必要はない。
【００６７】
本実施形態では、反応液導入開口３０に注入された反応液は、毛細管現象によって反応液往復流路２２に引き込まれ、反応液溜部２０に充填される。この際、反応液往復流路２２及び反応液溜部２０が親水性であるから、試料が表面に馴染みやすく、反応液導入開口３０への試料の導入が容易である。さらに、反応液溜部２０において基板から試料への熱伝導がよい。
また必要に応じて吸引用開口３１に真空源が接続される。その結果、反応液導入開口３０に注入された反応液は、真空源の負圧によって吸引され、反応液往復流路２２を流れて図８（ｂ）の様に反応液溜部２０に入る。
【００６８】
そして次に核酸増幅基板１０内でＰＣＲ等の核酸増幅反応が行われる。
具体的には、基板送り機構５８を動作し、最も右のヒートブロック５５に核酸増幅基板１０を移送し、上下のヒートブロックの上片５５ａ及び下片５５ｂで核酸増幅基板１０の反応液溜部２０を挟む。
以下、ＰＣＲを行う場合を例に説明する。まず、当該ヒートブロック５５は、予めディナチュレーション温度の近傍に温度調節されている。また核酸増幅基板１０は薄く、特にヒートブロック５５で挟まれる反応液溜部２０は厚さが薄い。そのため反応液溜部２０の反応液は、数秒の内にディナチュレーション温度に達し、ディナチュレーション反応が速やかに進む。
【００６９】
また本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０は、核酸増幅基板１０内の空隙６内に形成されており、上面側と下面側は完全に密閉されている。そのためヒートブロック５５で核酸増幅基板１０を挟んでも、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはなく、ヒートブロック５５が汚染されることはない。
【００７０】
数秒間、ヒートブロック５５で反応液溜部２０を挟み続け、ディナチュレーション温度に維持した後、核酸増幅基板１０を移動して左端に設けられたヒートブロック５７の位置に核酸増幅基板１０を運ぶ、この時、核酸増幅基板１０は相当の振動や衝撃を受けるが、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはない。
【００７１】
そして左端に設けられたヒートブロック５７によって核酸増幅基板１０を挟む。この場合も、反応液溜部２０だけがヒートブロック５７で挟まれ、反応液溜部２０内の反応液は、ただちにアニーリング温度に達する。
またこの場合についても、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはなく、ヒートブロック５７が汚染されることはない。
【００７２】
そしてアニーリングが終了すると、再度核酸増幅基板１０を移動し、中央のヒートブロック５６で、核酸増幅基板１０を挟み、二本鎖伸長反応が行われる。またこの場合についても、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはなく、ヒートブロック５６が汚染されることはない。
【００７３】
二本鎖伸長反応が終了すると、基板送り機構５８によって核酸増幅基板１０を移動させ、最初のヒートブロック５５で核酸増幅基板１０を挟み、再度ディナチュレーション反応を行わしめる。
以後、先と同様の一連の工程を３０回程度繰り返し、ＰＣＲ法によって目的のＤＮＡを増幅させる。
【００７４】
この様に、本実施形態では、反応液溜部２０内の反応液は昇温と冷却が繰り返され、内部の反応液は、膨張と収縮が繰り返される。また本実施形態では、ヒートブロック５５，５６，５７によって反応液溜部２０を挟むので、反応液溜部２０の表裏面側の壁は、繰り返し圧縮される。
【００７５】
しかしながら本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０から反応液が流出することはない。
すなわち本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０の内部に隔壁７（図５）が設けられてジグザグ状の流路が形成されており、全体の流路抵抗が高く、内部における反応液の移動が抑制されている。さらに本実施形態では、反応液溜部２０の近傍に反応液吸引路２３が設けられているが、反応液吸引路２３は、曲路を基調とした流路があり、当該流路も「移動抑制手段」として機能する。
そのため本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０の内外における反応液の移動が少なく、反応液の多くは反応液溜部２０に残る。
【００７６】
さらに本実施形態では、前記した様に、反応液溜部２０の内部に流路が形成されており、図５の様に流路の隔壁７の先端が第一層１１の表面と接している。そのため反応液溜部２０が圧縮力を受けたとき、当該圧縮力は、流路の隔壁７で負担され、反応液溜部２０の表面側の撓みが少ない。
すなわち本実施形態では、流路の隔壁７が耐圧縮部として機能し、反応液溜部２０の表面側を撓ませない。
そのため本実施形態では、反応液溜部２０に負荷される圧力が小さく、反応液溜部２０から反応液を排出させようとする力自体が小さい。
したがって本実施形態の核酸増幅基板１０は、反応液溜部２０内の反応液が昇温と冷却を繰り返し、且つ反応液溜部２０が繰り返し圧縮されるにも係わらず、反応液の多くが反応液溜部２０に残留する。逆に言えば、本実施形態の核酸増幅基板１０は、少ない試料でＰＣＲ法等による核酸増幅反応を行うことができる。
【００７７】
核酸増幅反応によって核酸増幅が終了すると、基板送り機構５８によって核酸増幅基板１０を再度反応液注入・吸引機構６０の位置に移送する。
そして図９（ａ）の様に吸引用開口３１に加圧源Ｐを接続し、吸引用開口３１側を高圧雰囲気にして反応液溜部２０内の反応液を押し出す。反応液は、図９（ａ）の様に反応液往復流路２２を戻って反応液導入開口３０に戻る（図９（ｂ））。
【００７８】
この状態で、基板移載機構５９によって核酸増幅基板１０を電気泳動・検出装置８１に移載する。
電気泳動・検出装置８１内においては、最初に図１０（ａ）に示すように反応液導入開口３０と、核酸供給路末端側開口３３に電極が接続され、核酸供給路末端側開口３３を正、反応液導入開口３０側を負として直流電流が通電される。
【００７９】
その結果、反応液導入開口３０内の核酸が核酸供給路末端側開口３３側に移動する。
そして続いて図１０（ｂ）の様に泳動部始端側開口３５と泳動部終端側開口３６に電極が接続され、泳動部終端側開口３６を正、泳動部始端側開口３５を負として直流電流が通電される。
その結果、交差部５０に到達していた核酸が泳動部終端側開口３６側に引き寄せられ、核酸は泳動路５２において分子量の大きさに従って分離される。そして、図示しない蛍光検出装置によって蛍光分析が行われる。
【００８０】
以上説明した核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０の内部にジグザグ状の流路が形成したものを例に挙げた。本実施形態の様に内部に流路を形成する構造を採用すると、前記した様に反応液溜部２０の流路抵抗が高まり、且つ反応液溜部２０の表面側の撓みが小さなものとなり、反応液溜部２０の反応液が消失しにくく、推奨される構造である。
【００８１】
本実施形態では、ジグザグ状の流路は流路幅が一定であったが、図１１に示す反応液溜部７０の様に部分的に流路幅を狭めて反応液の移動を阻止してもよい。
なお図１１は、本発明の他の実施形態における核酸増幅基板の反応液溜部の正面図である。
【００８２】
また図１２に示す反応液溜部７１の様に、内部に柱状部７２を設け、当該柱状部７２によって圧縮力を負担させて反応液溜部２０の表面側の撓みを抑制する構成も考えられる。なお図１２は、本発明のさらに他の実施形態における核酸増幅基板の正面図である。
また本発明は、図１３、図１４に示すような単一室であり且つ内部が空洞状態の反応液溜部を否定するものではない。
【００８３】
本実施形態の核酸増幅基板１０では、４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８を設けたが、核酸増幅・分離流路の数は任意であり、１系統でも５系統以上でもよい。
【実施例１】
【００８４】
次に、本発明の効果を確認するために行った実施例について説明する。
本発明者らは、図１に示す核酸増幅基板１０を試作し、ＰＣＲによる実験を行った。実験に使用した鋳型ＤＮＡは、ブタゲノムから得た２００塩基対のＤＮＡ断片であり、従来技術のＰＣＲ装置で増幅したＰＣＲ産物である。実験には、このＰＣＲ産物を希釈して使用した。
プライマーは、上記した鋳型ＤＮＡを得る際に使用したものと同一のフォワード、リバースのプライマーを使用した。
酵素、基質、バッファー等の他の試薬類は、タカラバイオ株式会社製の「TaKaRa Taq」を含むキットを用いた。
【００８５】
ＰＣＲに使用した反応液は、約８〜１０ミリリットルであり、反応液導入開口３０に供給し、吸引用開口３１から吸引して反応液溜部２０に導いた。
なお実験で試作した核酸増幅基板１０は、反応液溜部２０の容積が約５ミリリットルであり、残量は、吸引用開口３１に残った。
そして図７に示す装置を使用してＰＣＲ及び電気泳動を行わしめた。
温調装置８０のヒートブロック５５は、反応液溜部２０をディナチュレーション温度とするために、９８．５℃に温調した。
またヒートブロック５７は、反応液溜部２０をアニーリング温度とするために、５３．０℃に温調した。
さらにヒートブロック５６は、反応液溜部２０を二本鎖伸長の反応温度とするために７４．５℃に温調した。
【００８６】
そしてヒートブロック５５で核酸増幅基板１０を５秒間挟んでディナチュレーション反応を行わしめ、続いてヒートブロック５７で５秒間挟んでアニーリングを行い、さらに続いてヒートブロック５６で５秒間挟んで二本鎖伸長の反応を行わしめた。これを３０回繰り返した。
以上のＰＣＲ法に要した時間は、約１０分であった。
そして核酸増幅基板１０を電気泳動・検出装置８１に移し、ＤＮＡの泳動実験を行ったところ、明らかに鋳型ＤＮＡが増幅されたものと見られるピークが出現した。
そのため、本実施例の核酸増幅基板１０を用いてＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡが増幅可能であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の実施形態の核酸増幅基板の正面図である。
【図２】図１の核酸増幅基板の斜視図である。
【図３】図１の核酸増幅基板の二系統の核酸増幅・分離流路の正面図である。
【図４】図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の第一層と第二層の分解斜視図である。
【図５】図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の拡大断面図である。
【図６】図１の核酸増幅基板の反応液導入口周辺の拡大斜視図である。
【図７】図１の核酸増幅基板を装着して核酸増幅及び分離を行う温調装置及び電気泳動装置の斜視図である。
【図８】反応液導入口から反応液溜部に反応液を送る際における反応液の挙動を示す説明図である。
【図９】反応液溜部から反応液導入口側に反応液を戻す際における反応液の挙動を示す説明図である。
【図１０】核酸を分離する際における反応液の挙動を示す説明図である。
【図１１】本発明の他の実施形態における核酸増幅基板の反応液溜部の正面図である。
【図１２】本発明のさらに他の実施形態における核酸増幅基板の正面図である。
【図１３】本発明のさらに他の実施形態における核酸増幅基板の正面図である。
【図１４】図１３のＡ−Ａ拡大断面斜視図である。
【図１５】図１３に示す核酸増幅基板の表裏面をヒートブロックで挟んだ際の挙動を示す説明図である。
【符号の説明】
【００８８】
１，２０，７０，７１ 反応液溜部
２，１０ 核酸増幅基板
５ 溝
６ 空隙
７ 隔壁（耐圧縮部）
１１ 第一層（層）
１２ 第二層（層）
２１ 電気泳動部
２２ 反応液往復流路（反応液流路）
２３ 反応液吸引路（移動抑制手段）
３０ 反応液導入開口（反応液導入部）
４１ 直線路（流路）
４３ 曲路
７２ 柱状部（耐圧縮部）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一枚の基板内でＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、核酸の増幅を行う核酸増幅基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学分野において、ＤＮＡを活用した診断が注目を集めている。また農業分野における遺伝子組み換え作物の判定や品種の判定にもＤＮＡ鑑定が活用されている。
上記した様な診断や品種の判定は、血液や作物の試料に目的とするＤＮＡが存在するか否かによって行われるが、試料中の目的ＤＮＡは微量である場合が多い。そこでＤＮＡ診断やＤＮＡ鑑定に先立って、試料中に含まれる目的ＤＮＡを増幅することが必要である。ここで試料中の目的ＤＮＡを特異的に増幅する方策として、各種の核酸増幅反応が提案されている。特にＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法による核酸増幅反応は、バイオテクノロジー分野における基本技術となっている。
ＰＣＲ法は、鋳型ＤＮＡ、プライマー、基質、耐熱性ポリメラーゼ酵素等を混合した反応液を温度調節し、所定の３種類の温度に順次変化させ、これを繰り返すことによって目的とするＤＮＡを増幅する方法である。
【０００３】
すなわち反応液を、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させるディナチュレーション反応を行う温度に温調し、続いて一本鎖ＤＮＡにプライマーを会合させるアニーリング反応を行う温度に温調し、さらに続いて耐熱性ポリメラーゼ酵素による二本鎖伸長反応を行う温度に温調する。この様に、反応液を三段階の温度に順次温調することにより、ＤＮＡの増幅を行うことができる。
【０００４】
具体的には、反応液を各設定温度に温調する工程を３０回程度繰返すことで、多量のＤＮＡ複製生産物を得る。なお、ディナチュレーション温度、アニーリング温度、二本鎖伸長の各反応温度はそれぞれ、９５℃、５０〜５５℃、７２℃程度である。
【０００５】
旧来、ＰＣＲ法はマイクロチューブを使用して行われ、当該マイクロチューブ内に試料やＰＣＲプライマーを含む反応液を入れ、さらにこのマイクロチューブを所定の温度雰囲気とすることによって行われてきた。
しかしながらマイクロチューブを使用する方法は、相応量の試料が必要であるが、微量の試料しか入手できない場合もあり、ＤＮＡ鑑定等ができない場合もあった。
またマイクロチューブを使用する方法は、ＤＮＡの増幅に時間がかかるという問題もあった。
さらに増幅されたＤＮＡを分析するには、マイクロチューブから反応液を抜き出して別途分離装置にかける必要があり、さらに手間がかかるという不満もあった。
【０００６】
これに対してＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅を基板上で行い、さらに同一の基板上でＤＮＡの分離を行う方策が提案されている。
下記の特許文献は、いずれもＤＮＡの増幅と分離を一枚の基板上で行う技術を開示するものである。
【特許文献１】特開２００３−８３９６５号公報
【特許文献２】特開２００２−３０６１５４号公報
【特許文献３】特開２００３−２７０２０４号公報
【０００７】
特許文献１に開示された基板は、ガラス板等の表面に窪みや溝を形成し、上面開放のＰＣＲ槽を設けたものである。特許文献１に開示された基板は、その一部にＰＣＲ槽を備えるが、当該ＰＣＲ槽は上面が開放されている。
特許文献１に開示された技術では、前記したＰＣＲ槽に反応液等を充填する。そして上部に設置された熱源によってＰＣＲ槽中の反応液等を非接触状態で加熱してディナチュレーション反応を行わしめる。
続いて下部に設置された冷却装置でＰＣＲ槽中の反応液等を冷却してアニーリングを行う。
さらに続いて上部に設置された熱源によってＰＣＲ槽中の反応液等を非接触状態で加熱して二本鎖伸長反応を行わしめる。
そしてこれらを繰り返して試料中の目的とするＤＮＡを増幅する。
【０００８】
特許文献２に開示された基板についても、上面開放のＰＣＲ槽が設けられ、ＰＣＲ槽に反応液等が充填されてＰＣＲが行われる。
特許文献２に開示された技術では、基板は底面側からのみ温調される。
【０００９】
特許文献３に開示された基板についても、上面開放のＰＣＲ槽が設けられ、ＰＣＲ槽に反応液等が充填されてＰＣＲが行われる。
特許文献３に開示された技術では、基板は上下面から加熱し、その際に温調装置側に設けられたシール部によってＰＣＲ槽の上面を塞ぐ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＤＮＡによる診断や鑑定は、今後ますます需要が増大するであろうと予想される。そのためＤＮＡの増幅をより簡便な方法で行うことができる技術の開発が急務である。また微量の試料をもって所望の診断等が行われることが望ましい。
さらにＤＮＡによる診断は、感染症の診断に利用される場合が多いので、ＤＮＡの増幅は迅速に行われなければならない。
そこで本発明者らは、ＰＣＲを行う際の温度調節をより迅速に行うために、基板の両面側から加熱・冷却する方策を検討した。より具体的には、上下が一対のヒートブロックを使用し、当該ヒートブロックで、基板を挟んで基板の温度調節を行う方策を検討した。
またさらに温度調節の迅速化を図るため、前記したヒートブロックを３組用意し、これらをそれぞれディナチュレーション温度、アニーリング温度、二本鎖伸長の各反応温度に予め温度調節しておき、基板を挟むヒートブロックを順次取り替えて三段階の温度に順次温調する方策を検討した。
【００１１】
ここで従来技術の基板は、いずれもＰＣＲ槽の上面が開放されていたため、基板の上部にヒートブロックを接触させることができない。また前記した特許文献３に開示された装置を使用すれば基板の上部にヒートブロックを接触させることもできるが、特許文献３に開示された装置では、温調装置側にシール部材があるので、シール部材が反応液で汚染される。そのため異なる基板を温調する際にシール部材をいちいち洗浄しなければならず、実用に耐えない。
さらに本発明者らのアイデアに基づいて基板を挟むヒートブロックを順次取り替えて三段階の温度に順次温調する方策を採用すると、基板が振動や衝撃を受けることは避けられない。これに対して従来技術の基板では、ＰＣＲ槽の上面が開放されているため、ＰＣＲ槽から反応液等がこぼれ、周囲を汚染したり、他の反応液と混ざってしまう危険があった。
そこで本発明は、従来技術の上記した問題点に注目し、ＰＣＲ等の核酸増幅反応工程において反応液が洩れ難い基板の開発を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、基板の一部に反応液溜部が形成され、当該反応液溜部内に核酸増幅反応に必要な成分を含む反応液が充填され、前記反応液溜部の温度を調節して反応液溜部内において核酸増幅反応を行い、核酸を増幅する核酸増幅基板において、前記反応液溜部は、基板の内部に設けられた空隙によって構成されており、反応液溜部内で増幅された核酸を電気泳動によって分離する電気泳動部を備えたことを特徴とする核酸増幅基板である。
【００１３】
本発明の核酸増幅基板では、反応液溜部は、基板の内部に設けられた空隙によって構成されており、半密閉状態である。そのため基板の表面に物が触れても、反応液によって汚染されることはない。また基板が振動を受けても反応液が反応液溜部からこぼれることはない。
また本発明の核酸増幅基板では、同一基板内に反応液溜部内で増幅された核酸を電気泳動によって分離する電気泳動部を備える。そのため本発明の核酸増幅基板によると、核酸の増幅と分離を同一基板内で行うことができる。
本発明の核酸増幅基板を用いて行われる核酸増幅反応の例としては、ＰＣＲ法、ＬＴＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Standard Displacement Amplification）法等が挙げられるが、ＰＣＲ法が代表的である。また、核酸増幅反応に必要な成分としては、例えばＰＣＲ法の場合は、鋳型ＤＮＡ、プライマー、デオキシヌクレオチド３リン酸類、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
【００１４】
請求項２に記載の発明は、反応液を導入する反応液導入部と、基板の内部に設けられた空隙によって形成され前記反応液導入部と反応液溜部を繋ぐ反応液流路を備え、反応液は反応液導入部に導入され、さらに反応液流路を経て反応液溜部に充填されることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅基板である。
【００１５】
本発明の核酸増幅基板は、反応液を導入する反応液導入部を備え、反応液は反応液導入部から基板内に導入される。本発明の核酸増幅基板では、反応液導入部と反応液溜部の間に反応液流路が設けられているので、反応液溜部と反応液導入部の間に相当の距離があり、反応液溜部の反応液が洩れにくい。
【００１６】
また請求項３に記載の発明は、基板は、２以上の層が積層されて成り、積層された２層の内の一方の積層面に溝が設けられ、当該溝によって基板の内部に前記空隙が形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸増幅基板である。
【００１７】
本発明の核酸増幅基板は、簡単な方法で基板の内部に空隙を形成することができ、製造が容易である。
【００１８】
また本発明者らは、各種形状の基板を試作したが、開発当初の試作品は、図１３に示すような一室的な空洞によって構成された反応液溜部１をもった核酸増幅基板２であった。
図１３に示す核酸増幅基板２は、振動を受けても反応液がこぼれることが無く、当初の目的を達成することができたが、開発当初には予期しなかった不具合があった。
すなわち図１３に示す核酸増幅基板２を用いて、前記したアイデア通り、核酸増幅基板２を挟むヒートブロックを順次取り替えて三段階の温度に順次温調し、これを３０回程度繰り返したところ、反応液溜部１から反応液が消失してしまった。
【００１９】
この原因を検討したところ、大きく二つの理由に基づくものであることが判明した。
一つは、反応液の昇温・冷却を繰り返す中で、反応液が膨張・収縮し、これに伴って反応液が移動して反応液溜部の外部に逃げてしまうことが原因であった。
もう一つの原因は、図１５の二点鎖線の様に上下のヒートブロック片３，４で挟まれた際に反応液溜部１の上部の壁面が撓み、内部が加圧されて反応液が反応液溜部１の外部に押し出されてしまうことが原因であった。
そこで本発明者らは、この対策として、請求項４乃至７に記載の発明を発案した。
【００２０】
すなわち請求項４に記載の発明は、反応液溜部内又は反応液溜部の出入口近傍に反応液の移動を抑制する移動抑制手段が設けられたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸増幅基板である。
【００２１】
本発明の核酸増幅基板では、反応液の移動を抑制する移動抑制手段が設けられている。そのため反応液が反応液溜部の外部に逃げることが阻止される。
移動抑制手段としては、例えば流路抵抗を増大させる構成が考えられる。
【００２２】
また請求項５に記載の発明は、反応液溜部内又は反応液溜部の出入口近傍に複数の曲路を含む流路が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅基板である。
【００２３】
本発明の核酸増幅基板では、反応液溜部内又は反応液溜部の出入口近傍に複数の曲路を含む流路が形成されているので、反応液溜部内又はその近傍における流路抵抗が高い。そのため、反応液が反応液溜部の外部に逃げることが阻止される。
なお、曲路を含む流路は、「移動抑制手段」としても機能する。
また特に反応液溜部内に流路が形成されている場合は、流路を形成する壁面によって反応液溜部の表裏面の撓みが軽減される。そのため後者の原因による反応液の流出も阻止される。
【００２４】
また請求項６に記載の発明は、反応液溜部内には複数の曲路を含む直列の流路が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅基板である。
【００２５】
本発明の核酸増幅基板についても反応液溜部内に複数の曲路を含む流路が形成されているので、流路抵抗が高く、且つ反応液溜部の表裏面の撓みが軽減され、反応液の流出が阻止される。
また特に本発明の核酸増幅基板では、反応液溜部内の流路が直列であるから、反応液溜部内に反応液を密に充填することができる。
【００２６】
また請求項７に記載の発明は、反応液溜部内に耐圧縮部が設けられ、反応液溜部を表裏の方向に圧縮した時、当該圧縮力を前記耐圧縮部に負担させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の核酸増幅基板である。
【００２７】
本発明の核酸増幅基板では、反応液溜部内に耐圧縮部が設けられており、圧縮力の一部又は全部を圧縮部が負担する。そのため反応液溜部の表裏面の撓みが軽減され、反応液の流出が阻止される。
なお前記した反応液溜部内に設けられた流路も耐圧縮部として機能する。
【００２８】
また反応液溜部と電気泳動部は分離されており、両者の距離は、基板の最も厚い部位の厚さの３倍以上であることが望ましい（請求項８）。
【００２９】
すなわち、電気泳動部には、ＰＣＲ等の核酸増幅反応で増幅されたＤＮＡ等の核酸を分離するための担体が充填される。この担体は、多くの場合ゲルである。ここで本発明の核酸増幅基板は、同一基板内で核酸増幅反応を行うものであり、ＰＣＲ等の核酸増幅反応が行われる反応液溜部は昇温される。そのため電気泳動部が反応液溜部に近い位置にあると、反応液溜部を昇温する際に電気泳動部が加熱され、内部のゲル中の水分が蒸散してしまう。その結果、ゲルの組成が変化し、電気泳動時の分離能に悪影響が及ぶ。
これに対して請求項８に記載の発明では、反応液溜部と電気泳動部は分離されており、両者の距離は、基板の最も厚い部位の厚さの３倍以上であるから、反応液溜部を加熱しても電気泳動部はその熱影響を受けず、電気泳動時の分離能に悪影響が及ぶことはない。
【００３０】
また請求項９に記載の発明は、反応液溜部の厚さは、電気泳動部の厚さに比べて薄いことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の核酸増幅基板である。
【００３１】
本発明の核酸増幅基板では、反応液溜部の厚さは、電気泳動部の厚さに比べて薄い。そのため反応液溜部の温度を外部からコントロールし易い。また逆に電気泳動部の厚さが厚いので、電気泳動部は外部からの熱影響を受けにくい。
【００３２】
また反応液導入部から反応液溜部に至る領域は、親水性であることが望ましい（請求項１０）。
【００３３】
すなわち、請求項１０に記載の発明では、当該部位が親水性であるので、試料が表面に馴染みやすく、基板への試料の導入が容易である。さらに、反応液溜部において基板から試料への熱伝導がよいので、より確実にＰＣＲ等によって核酸を増幅することができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の核酸増幅基板は、核酸増幅反応工程において反応液が洩れることが少なく、周囲の汚染や異種試料の混入がないという効果がある。さらに、一枚の基板によって核酸増幅と分離を行うことが可能であり、作業効率が高いという効果がある。
また特に請求項４乃至７に記載の核酸増幅基板は、基板をヒートブロック等で挟んだ時に反応液溜部から反応液が流出することを阻止する効果があり、微量の試料でもＤＮＡ診断等が可能である。
【００３５】
また特に請求項９に記載の核酸増幅基板では、反応液溜部内の温度変化を迅速に行うことが可能であり、且つ電気泳動部への熱影響が少ないという優れた効果がある。
【００３６】
また特に請求項１０に記載の核酸増幅基板では、試料の導入が容易であり、さらに、試料のロスが少ないのでより微量の試料から核酸を増幅できるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下さらに本発明の実施形態について説明する。
図１は、本発明の実施形態の核酸増幅基板の正面図である。図２は、図１の核酸増幅基板の斜視図である。図３は、図１の核酸増幅基板の二系統の核酸増幅・分離流路の正面図である。図４は、図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の第一層と第二層の分解斜視図である。図５は、図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の拡大断面図である。図６は、図１の核酸増幅基板の反応液導入口周辺の拡大斜視図である。
【００３８】
図において、１０は、本発明の実施形態の核酸増幅基板を示す。核酸増幅基板１０は略長方形の板状であり、その大きさは、３０×４０ｍｍ〜７０×１００ｍｍ程度である。
【００３９】
核酸増幅基板１０は、ガラス板からなる第一層１１とシリコンゴムからなる第二層１２が積層されたものである。第一層１１は、主として全体の剛性を確保するために設けられた層であり、ガラスの他、石英、アクリル樹脂等の材質のものが使用可能である。
第二層１２は、第一層１１との界面に空隙を形成させるために設けられた層であり、微細な溝や凹部が形成可能な素材が選択される。シリコンゴムの例としては、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を挙げることができる。また、シリコンゴムの他、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等のプラスチック、ガラス、石英等、様々の材質が使用可能である。
試料を光学的に検出する場合には、第一層１１及び第二層１２は、透明あるいは光透過性であることが望ましい。
【００４０】
本実施形態では、第一層１１たるガラス板は、図４、図５に示すように表裏面とも平滑である。これに対して第二層１２たるシリコンゴムには、図４、図５の様に第一層１１との接触面側に微細な溝５が設けられ、第一層１１と第二層１２の間に空隙６が形成される。
また第二層１２には図１、図２の様に複数の貫通孔が設けられており、当該貫通孔によって空隙と外部とが連通する。
【００４１】
上記した空隙内及び開口は、いずれも親水処理がなされており、その表面は、親水性である。
【００４２】
第一層１１の厚さは、０．２〜５．０ｍｍ程度である。第一層１１の厚さが、０．２ｍｍ未満の場合は、全体の剛性が低く、ヒートブロックで挟んで加熱するのには適しない。逆に第一層１１の厚さが５．０ｍｍを越えると、ヒートブロックから内部に熱が伝わり難い。第一層の厚さとして最も好適な範囲は、０，２〜０．６ｍｍ程度である。
【００４３】
第二層１２の厚さは一様ではなく、後記する反応液溜部２０が設けられたエリアＤは、図２の様に他のエリアに比べて厚さが薄い。具体的には反応液溜部２０の厚さが０．２〜１．０ｍｍあり、他の部位の厚さは０．６〜３ｍｍである。
第二層の反応液溜部２０に相当する部位は、その厚さが０．２ｍｍ未満の場合は、全体の剛性が低く、撓みが大きくてヒートブロックで挟んで加熱するのには適しない。当該部位の厚さが１．０ｍｍを越えると、ヒートブロックから内部に熱が伝わり難い。この点から最も推奨される範囲は、０．３ｍｍ〜０．６ｍｍ程度である。
後記する電気泳動部２１は、外部から熱影響を受けないことが望ましく、第二層の厚さは、反応液溜部２０よりも厚く設計されている。また電気泳動部２１に電極を取り付ける関係上もある程度の厚さをもつことが望ましい。
【００４４】
本実施形態の核酸増幅基板１０では、空隙６のパターン（溝パターン）によって図１の様に４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８が形成されている。
【００４５】
上記した４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８は、いずれも略同一形状であるので、図１の最下部に図示された核酸増幅・分離流路１８をこれらの代表例として説明する。
【００４６】
核酸増幅・分離流路１８は、図１，３に示す様な反応液溜部２０と電気泳動部２１を有し、これらの周辺に反応液往復流路２２、反応液吸引路２３、核酸供給路２５が設けられたものである。
さらに核酸増幅・分離流路１８には、反応液導入開口（反応液導入部）３０、吸引用開口３１、核酸供給路末端側開口３３、泳動部始端側開口３５、泳動部終端側開口３６が設けられている。各開口３０，３１，３３，３５，３６は、いずれも第二層１２に設けられた貫通孔によって構成されており、第一層１１と第二層１２の間で形成される空隙６と外部とを連通するものである。
【００４７】
以下、順次説明する。
反応液溜部２０は、内部に反応液を貯留することを目的として形成された空隙部分である。本実施形態では、反応液溜部２０は、Ｓ字カーブ状に曲がった流路４０を密状態に繋げて作られている。見方を変えると、反応液溜部２０は、正面視が略正方形の空隙内に隔壁７（図５）が設けられ、ジグザクで迷路状の流路を設けたものであるとも言える。反応液溜部２０内の流路は直列である。すなわち反応液溜部２０内においては、略同一長さの８本の直線路４１が平行に配され、隣接する直線路４１の端部同士が曲路４３で接続され、全体として直列状となっている。
曲路４３は、図３（ｂ）の様な円状の流路である。曲路は、図３（ｃ）の様な角型の流路であってもよいが、角型の流路は角の部位に気泡が残留し易いので、図３（ｂ）の様な円状の流路を採用することが推奨される。
【００４８】
反応液溜部２０は、前記した様に内部に反応液を貯留する為に形成された部分であるため、内部の流路は、他の部位の流路に比べて幅、深さ、共に大きい。
すなわち反応液溜部２０内の流路は、前記した様に第二層１２の界面に形成された溝によって構成されているが、当該溝の幅は、１００μｍ〜５００μｍ、より好ましくは２５０〜４５０μｍである。
また反応液溜部２０の溝の深さは、１００〜３００μｍである。なお他の部位における溝の深さは、１０〜５０μｍ程度である。
反応液溜部２０の溝の断面積（流路の断面積）は、０．０１〜０．１５平方ミリであり、他の部位の溝に比べて３倍から５０倍大きい。
反応液溜部２０の全体の容積は、３〜１０ミリリットル程度である。
【００４９】
反応液溜部２０の一端側は、反応液往復流路２２を介して反応液導入開口（反応液導入部）３０と連通している。反応液導入開口３０は、核酸増幅基板１０の中央部近傍に設けられた開口である。反応液導入開口３０と反応液溜部２０を結ぶ反応液往復流路２２は、直線を基調とするものであり、「Ｕ」路や「Ｓ」路は無い。
【００５０】
また反応液溜部２０の他端側は、反応液吸引路２３を介して吸引用開口３１と連通している。吸引用開口３１についても核酸増幅基板１０に設けられた開口である。反応液吸引路２３は、曲路を基調としたものであり、Ｓ字カーブ状に曲がった流路である。反応液吸引路２３の曲路は、流路抵抗の増大を目的としたものであり、図３（ｃ）の様な角型である。
反応液吸引路２３の曲部は、「移動抑制手段」として機能する。
【００５１】
電気泳動部２１は、泳動部始端側開口３５から泳動部終端側開口３６に至る流路であり、中途部分で核酸供給路２５と交差する。泳動部始端側開口３５から交差部５０に至る間は、泳動準備路５１であり、単に通電路として機能する。
泳動準備路５１は、複数の曲路を有して相当量の距離が確保されている。
【００５２】
交差部５０から泳動部終端側開口３６に至る間は泳動路５２であり、後記する様にゲルが充填され、増幅されたＤＮＡ等の核酸が実際に泳動され分離される部分である。
泳動路５２は、一部が「く」の字状に折れているが、基本的には直線を基調としている。
【００５３】
核酸供給路２５は、反応液導入開口３０と核酸供給路末端側開口３３を接続するものであり、その中間部分で前記した様に電気泳動部２１と交差する。
反応液導入開口３０は、前記した様に核酸増幅基板１０の中央部近傍に設けられているので、交差部５０に至る間は、反応液溜部２０側に戻る方向に延びる流路となる。また反応液導入開口３０から交差部５０に至る間の流路には、「コ」の字状に曲げられた部位が設けられている。当該「コ」の字状に曲がった部位は、流路が平行に並ぶものであるが、平行に並ぶ流路同士の間には相当の距離があり、当該部位における圧力損失は少ない。すなわち前記した「コ」の字状部は、流路抵抗を増大するために設けられたものではなく、反応液導入開口３０から交差部５０に至る間の距離を所定長以上確保するために設けられたものである。
本実施形態では、交差部５０から核酸供給路末端側開口３３に至る流路のレイアウトは、反応液導入開口３０から交差部５０に至る流路のレイアウトと対称形である。
【００５４】
本実施形態では、前記した通り４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８を有し、各流路のレイアウトは多少相違するが、いずれの核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８も、電気泳動部２１の流路の長さは同一である。すなわち各核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８の、泳動部始端側開口３５から泳動部終端側開口３６に至る流路の距離はいずれも同一である。また泳動部始端側開口３５から交差部５０までの距離、及び交差部５０から泳動部終端側開口３６までの距離についても、各核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８の間で相違はない。
【００５５】
核酸供給路２５についても同様であり、反応液導入開口３０と核酸供給路末端側開口３３の長さはいずれの核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８でも同一である。また反応液導入開口３０から交差部５０に至る間の長さ、及び交差部５０から核酸供給路末端側開口３３に至る長さも各核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８の間で相違はない。
【００５６】
本実施形態では、図１の様に、核酸増幅反応を行う反応液溜部２０のエリアＡと電気泳動を行わしめるエリアＢが分離されており、両者の間に相当の距離がある。この距離Ｃは、反応液溜部２０の熱が電気泳動部２１に伝わらない距離であり、核酸増幅基板１０の板厚（最も厚い部分の厚み）の３倍以上、又はガラス板からなる第一層１１の板厚の５倍以上である。
【００５７】
上記した電気泳動部２１及び核酸供給路２５には、核酸の電気泳動に一般的に使用される水性ポリマーからなるゲルが充填される。当該ゲルの例としては、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメトキシセルロース等が挙げられる。
ゲルの濃度は、分離する核酸の大きさによって適宜選択される。核酸がＤＮＡの場合を例にとると、数１０〜数１００塩基対程度の大きさのＤＮＡであれば、５％程度のポリジメチルアクリルアミドを使用することができる。１０００塩基対を越える様なＤＮＡの場合は、０．５〜２．５％程度のアガロースゲルを使用することができる。
なお、ゲルには、あらかじめエチジウムブロマイドの様な蛍光を発するインターカレーターを含ませておくことが一般的である。そのようにすれば、電気泳動に供されたＤＮＡ等の核酸が泳動と同時にエチジウムブロマイド等で染色され、ただちに蛍光検出器で染色された核酸を検出することができる。
【００５８】
電気泳動部２１及び核酸供給路２５に対するゲルの充填は、核酸増幅基板１０を使用する直前に行うことが望ましい。
ゲルの充填は、泳動部終端側開口３６から圧入することにより行われる。
【００５９】
次に本実施形態の核酸増幅基板１０の機能について説明する。
本実施形態の核酸増幅基板１０は、図７に示す様な装置に装着して所定の検査を行うものである。
ここで図７は、図１の核酸増幅基板を装着して核酸増幅及び分離を行う温調装置及び電気泳動装置の斜視図である。図８は、反応液導入口から反応液溜部に反応液を送る際における反応液の挙動を示す説明図である。図９は、反応液溜部から反応液導入口側に反応液を戻す際における反応液の挙動を示す説明図である。図１０は、核酸を分離する際における反応液の挙動を示す説明図である。
図７に示す装置は、大きく分けて核酸増幅反応を行う温調装置８０と電気泳動・検出装置８１が組み合わされたものである。
【００６０】
温調装置８０は、３組のヒートブロック５５，５６，５７と、基板送り機構５８と、反応液注入・吸引機構６０を備えたものである。
３組のヒートブロック５５，５６，５７は、それぞれ上片５５ａ，５６ａ，５７ａと下片５５ｂ，５６ｂ，５７ｂを有し、上片と下片の両方が昇降してその間に核酸増幅基板１０を挟むことができる。ヒートブロック５５，５６，５７が挟む位置は、核酸増幅基板１０の反応液溜部２０の領域だけであり、電気泳動部２１は挟まない。
【００６１】
３組のヒートブロック５５，５６，５７は、予め所定の温度に温度調節されるものである。核酸増幅反応としてＰＣＲを行う場合を例にとると、向かって右端のヒートブロック５５はディナチュレーション温度（９５℃）近傍に、左端のヒートブロック５７はアニーリング温度（５５℃）近傍に、中央のヒートブロック５６は二本鎖伸長の各反応温度（７２℃）近傍にそれぞれ温度調節される。
３組のヒートブロック５５，５６，５７の内、ＰＣＲを行う場合にディナチュレーション温度近傍に温度調節されるヒートブロック５５と、二本鎖伸長の各反応温度近傍に温度調節されるヒートブロック５６は、電気ヒータを内蔵するものである。一方、アニーリング温度近傍に温度調節されるヒートブロック５７は、電気ヒータの他に空冷用ファンによる冷却機能を備えている。
【００６２】
各ヒートブロックの核酸増幅基板１０に対する接触面には、熱伝導性に優れたシートが接着されている。当該シートには例えばシリコンを素材とするものが採用される。
【００６３】
基板送り機構５８は、核酸増幅基板１０を保持して水平移動させ、核酸増幅基板１０を各ヒートブロックに順次挟ませるものである。基板送り機構５８は、核酸増幅基板１０の装着台６１を備える。また装着台６１には、基板押さえ６２が設けられている。基板押さえ６２は、板バネによって核酸増幅基板１０を押圧するものであり、核酸増幅基板１０の振動を防止する機能を持つ。
【００６４】
反応液注入・吸引機構６０は、小型の加圧装置と真空装置を備えたものである。
【００６５】
電気泳動・検出装置８１の内部は図示しないが、電気泳動装置と蛍光検出装置を内蔵するものである。電気泳動装置は、増幅核酸移動用の電極と、増幅核酸泳動用の電極を備える。
【００６６】
前述した核酸増幅基板１０は、基板送り機構５８に装着され、まず最初に反応液注入・吸引機構６０の位置に移送される。
反応液注入・吸引機構６０では、図８（ａ）に示すように、反応液導入開口３０に反応液が注入される。
この反応液は、核酸増幅反応に必要な成分を全て含むものである。核酸増幅反応がＰＣＲである場合は、鋳型ＤＮＡ、プライマー、デオキシヌクレオチド３リン酸類、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等が混合されたものが反応液となる。この場合、プライマーにあらかじめ蛍光標識がなされる場合もある。プライマーにあらかじめ蛍光標識がなされる場合は、増幅されたＤＮＡはすでに蛍光標識されているので、電気泳動部２１のゲルにインターカレーターを添加する必要はない。
【００６７】
本実施形態では、反応液導入開口３０に注入された反応液は、毛細管現象によって反応液往復流路２２に引き込まれ、反応液溜部２０に充填される。この際、反応液往復流路２２及び反応液溜部２０が親水性であるから、試料が表面に馴染みやすく、反応液導入開口３０への試料の導入が容易である。さらに、反応液溜部２０において基板から試料への熱伝導がよい。
また必要に応じて吸引用開口３１に真空源が接続される。その結果、反応液導入開口３０に注入された反応液は、真空源の負圧によって吸引され、反応液往復流路２２を流れて図８（ｂ）の様に反応液溜部２０に入る。
【００６８】
そして次に核酸増幅基板１０内でＰＣＲ等の核酸増幅反応が行われる。
具体的には、基板送り機構５８を動作し、最も右のヒートブロック５５に核酸増幅基板１０を移送し、上下のヒートブロックの上片５５ａ及び下片５５ｂで核酸増幅基板１０の反応液溜部２０を挟む。
以下、ＰＣＲを行う場合を例に説明する。まず、当該ヒートブロック５５は、予めディナチュレーション温度の近傍に温度調節されている。また核酸増幅基板１０は薄く、特にヒートブロック５５で挟まれる反応液溜部２０は厚さが薄い。そのため反応液溜部２０の反応液は、数秒の内にディナチュレーション温度に達し、ディナチュレーション反応が速やかに進む。
【００６９】
また本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０は、核酸増幅基板１０内の空隙６内に形成されており、上面側と下面側は完全に密閉されている。そのためヒートブロック５５で核酸増幅基板１０を挟んでも、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはなく、ヒートブロック５５が汚染されることはない。
【００７０】
数秒間、ヒートブロック５５で反応液溜部２０を挟み続け、ディナチュレーション温度に維持した後、核酸増幅基板１０を移動して左端に設けられたヒートブロック５７の位置に核酸増幅基板１０を運ぶ、この時、核酸増幅基板１０は相当の振動や衝撃を受けるが、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはない。
【００７１】
そして左端に設けられたヒートブロック５７によって核酸増幅基板１０を挟む。この場合も、反応液溜部２０だけがヒートブロック５７で挟まれ、反応液溜部２０内の反応液は、ただちにアニーリング温度に達する。
またこの場合についても、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはなく、ヒートブロック５７が汚染されることはない。
【００７２】
そしてアニーリングが終了すると、再度核酸増幅基板１０を移動し、中央のヒートブロック５６で、核酸増幅基板１０を挟み、二本鎖伸長反応が行われる。またこの場合についても、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはなく、ヒートブロック５６が汚染されることはない。
【００７３】
二本鎖伸長反応が終了すると、基板送り機構５８によって核酸増幅基板１０を移動させ、最初のヒートブロック５５で核酸増幅基板１０を挟み、再度ディナチュレーション反応を行わしめる。
以後、先と同様の一連の工程を３０回程度繰り返し、ＰＣＲ法によって目的のＤＮＡを増幅させる。
【００７４】
この様に、本実施形態では、反応液溜部２０内の反応液は昇温と冷却が繰り返され、内部の反応液は、膨張と収縮が繰り返される。また本実施形態では、ヒートブロック５５，５６，５７によって反応液溜部２０を挟むので、反応液溜部２０の表裏面側の壁は、繰り返し圧縮される。
【００７５】
しかしながら本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０から反応液が流出することはない。
すなわち本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０の内部に隔壁７（図５）が設けられてジグザグ状の流路が形成されており、全体の流路抵抗が高く、内部における反応液の移動が抑制されている。さらに本実施形態では、反応液溜部２０の近傍に反応液吸引路２３が設けられているが、反応液吸引路２３は、曲路を基調とした流路があり、当該流路も「移動抑制手段」として機能する。
そのため本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０の内外における反応液の移動が少なく、反応液の多くは反応液溜部２０に残る。
【００７６】
さらに本実施形態では、前記した様に、反応液溜部２０の内部に流路が形成されており、図５の様に流路の隔壁７の先端が第一層１１の表面と接している。そのため反応液溜部２０が圧縮力を受けたとき、当該圧縮力は、流路の隔壁７で負担され、反応液溜部２０の表面側の撓みが少ない。
すなわち本実施形態では、流路の隔壁７が耐圧縮部として機能し、反応液溜部２０の表面側を撓ませない。
そのため本実施形態では、反応液溜部２０に負荷される圧力が小さく、反応液溜部２０から反応液を排出させようとする力自体が小さい。
したがって本実施形態の核酸増幅基板１０は、反応液溜部２０内の反応液が昇温と冷却を繰り返し、且つ反応液溜部２０が繰り返し圧縮されるにも係わらず、反応液の多くが反応液溜部２０に残留する。逆に言えば、本実施形態の核酸増幅基板１０は、少ない試料でＰＣＲ法等による核酸増幅反応を行うことができる。
【００７７】
核酸増幅反応によって核酸増幅が終了すると、基板送り機構５８によって核酸増幅基板１０を再度反応液注入・吸引機構６０の位置に移送する。
そして図９（ａ）の様に吸引用開口３１に加圧源Ｐを接続し、吸引用開口３１側を高圧雰囲気にして反応液溜部２０内の反応液を押し出す。反応液は、図９（ａ）の様に反応液往復流路２２を戻って反応液導入開口３０に戻る（図９（ｂ））。
【００７８】
この状態で、基板移載機構５９によって核酸増幅基板１０を電気泳動・検出装置８１に移載する。
電気泳動・検出装置８１内においては、最初に図１０（ａ）に示すように反応液導入開口３０と、核酸供給路末端側開口３３に電極が接続され、核酸供給路末端側開口３３を正、反応液導入開口３０側を負として直流電流が通電される。
【００７９】
その結果、反応液導入開口３０内の核酸が核酸供給路末端側開口３３側に移動する。
そして続いて図１０（ｂ）の様に泳動部始端側開口３５と泳動部終端側開口３６に電極が接続され、泳動部終端側開口３６を正、泳動部始端側開口３５を負として直流電流が通電される。
その結果、交差部５０に到達していた核酸が泳動部終端側開口３６側に引き寄せられ、核酸は泳動路５２において分子量の大きさに従って分離される。そして、図示しない蛍光検出装置によって蛍光分析が行われる。
【００８０】
以上説明した核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０の内部にジグザグ状の流路が形成したものを例に挙げた。本実施形態の様に内部に流路を形成する構造を採用すると、前記した様に反応液溜部２０の流路抵抗が高まり、且つ反応液溜部２０の表面側の撓みが小さなものとなり、反応液溜部２０の反応液が消失しにくく、推奨される構造である。
【００８１】
本実施形態では、ジグザグ状の流路は流路幅が一定であったが、図１１に示す反応液溜部７０の様に部分的に流路幅を狭めて反応液の移動を阻止してもよい。
なお図１１は、本発明の他の実施形態における核酸増幅基板の反応液溜部の正面図である。
【００８２】
また図１２に示す反応液溜部７１の様に、内部に柱状部７２を設け、当該柱状部７２によって圧縮力を負担させて反応液溜部２０の表面側の撓みを抑制する構成も考えられる。なお図１２は、本発明のさらに他の実施形態における核酸増幅基板の正面図である。
また本発明は、図１３、図１４に示すような単一室であり且つ内部が空洞状態の反応液溜部を否定するものではない。
【００８３】
本実施形態の核酸増幅基板１０では、４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８を設けたが、核酸増幅・分離流路の数は任意であり、１系統でも５系統以上でもよい。
【実施例１】
【００８４】
次に、本発明の効果を確認するために行った実施例について説明する。
本発明者らは、図１に示す核酸増幅基板１０を試作し、ＰＣＲによる実験を行った。実験に使用した鋳型ＤＮＡは、ブタゲノムから得た２００塩基対のＤＮＡ断片であり、従来技術のＰＣＲ装置で増幅したＰＣＲ産物である。実験には、このＰＣＲ産物を希釈して使用した。
プライマーは、上記した鋳型ＤＮＡを得る際に使用したものと同一のフォワード、リバースのプライマーを使用した。
酵素、基質、バッファー等の他の試薬類は、タカラバイオ株式会社製の「TaKaRa Taq」を含むキットを用いた。
【００８５】
ＰＣＲに使用した反応液は、約８〜１０ミリリットルであり、反応液導入開口３０に供給し、吸引用開口３１から吸引して反応液溜部２０に導いた。
なお実験で試作した核酸増幅基板１０は、反応液溜部２０の容積が約５ミリリットルであり、残量は、吸引用開口３１に残った。
そして図７に示す装置を使用してＰＣＲ及び電気泳動を行わしめた。
温調装置８０のヒートブロック５５は、反応液溜部２０をディナチュレーション温度とするために、９８．５℃に温調した。
またヒートブロック５７は、反応液溜部２０をアニーリング温度とするために、５３．０℃に温調した。
さらにヒートブロック５６は、反応液溜部２０を二本鎖伸長の反応温度とするために７４．５℃に温調した。
【００８６】
そしてヒートブロック５５で核酸増幅基板１０を５秒間挟んでディナチュレーション反応を行わしめ、続いてヒートブロック５７で５秒間挟んでアニーリングを行い、さらに続いてヒートブロック５６で５秒間挟んで二本鎖伸長の反応を行わしめた。これを３０回繰り返した。
以上のＰＣＲ法に要した時間は、約１０分であった。
そして核酸増幅基板１０を電気泳動・検出装置８１に移し、ＤＮＡの泳動実験を行ったところ、明らかに鋳型ＤＮＡが増幅されたものと見られるピークが出現した。
そのため、本実施例の核酸増幅基板１０を用いてＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡが増幅可能であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の実施形態の核酸増幅基板の正面図である。
【図２】図１の核酸増幅基板の斜視図である。
【図３】図１の核酸増幅基板の二系統の核酸増幅・分離流路の正面図である。
【図４】図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の第一層と第二層の分解斜視図である。
【図５】図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の拡大断面図である。
【図６】図１の核酸増幅基板の反応液導入口周辺の拡大斜視図である。
【図７】図１の核酸増幅基板を装着して核酸増幅及び分離を行う温調装置及び電気泳動装置の斜視図である。
【図８】反応液導入口から反応液溜部に反応液を送る際における反応液の挙動を示す説明図である。
【図９】反応液溜部から反応液導入口側に反応液を戻す際における反応液の挙動を示す説明図である。
【図１０】核酸を分離する際における反応液の挙動を示す説明図である。
【図１１】本発明の他の実施形態における核酸増幅基板の反応液溜部の正面図である。
【図１２】本発明のさらに他の実施形態における核酸増幅基板の正面図である。
【図１３】本発明のさらに他の実施形態における核酸増幅基板の正面図である。
【図１４】図１３のＡ−Ａ拡大断面斜視図である。
【図１５】図１３に示す核酸増幅基板の表裏面をヒートブロックで挟んだ際の挙動を示す説明図である。
【符号の説明】
【００８８】
１，２０，７０，７１ 反応液溜部
２，１０ 核酸増幅基板
５ 溝
６ 空隙
７ 隔壁（耐圧縮部）
１１ 第一層（層）
１２ 第二層（層）
２１ 電気泳動部
２２ 反応液往復流路（反応液流路）
２３ 反応液吸引路（移動抑制手段）
３０ 反応液導入開口（反応液導入部）
４１ 直線路（流路）
４３ 曲路
７２ 柱状部（耐圧縮部）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の一部に反応液溜部が形成され、当該反応液溜部内に核酸増幅反応に必要な成分を含む反応液が充填され、前記反応液溜部の温度を調節して反応液溜部内において核酸増幅反応を行い、核酸を増幅する核酸増幅基板において、前記反応液溜部は、基板の内部に設けられた空隙によって構成されており、反応液溜部内で増幅された核酸を電気泳動によって分離する電気泳動部を備えたことを特徴とする核酸増幅基板。
【請求項２】
反応液を導入する反応液導入部と、基板の内部に設けられた空隙によって形成され前記反応液導入部と反応液溜部を繋ぐ反応液流路を備え、反応液は反応液導入部に導入され、さらに反応液流路を経て反応液溜部に充填されることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅基板。
【請求項３】
基板は、２以上の層が積層されて成り、積層された２層の内の一方の積層面に溝が設けられ、当該溝によって基板の内部に前記空隙が形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸増幅基板。
【請求項４】
反応液溜部内又は反応液溜部の出入口近傍に反応液の移動を抑制する移動抑制手段が設けられたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項５】
反応液溜部内又は反応液溜部の出入口近傍に複数の曲路を含む流路が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項６】
反応液溜部内には複数の曲路を含む直列の流路が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項７】
反応液溜部内に耐圧縮部が設けられ、反応液溜部を表裏の方向に圧縮した時、当該圧縮力を前記耐圧縮部に負担させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項８】
反応液溜部と電気泳動部は分離されており、両者の距離は、基板の最も厚い部位の厚さの３倍以上であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項９】
反応液溜部の厚さは、電気泳動部の厚さに比べて薄いことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項１０】
反応液導入部から反応液溜部に至る領域は、親水性であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項１】
基板の一部に反応液溜部が形成され、当該反応液溜部内に核酸増幅反応に必要な成分を含む反応液が充填され、前記反応液溜部の温度を調節して反応液溜部内において核酸増幅反応を行い、核酸を増幅する核酸増幅基板において、前記反応液溜部は、基板の内部に設けられた空隙によって構成されており、反応液溜部内で増幅された核酸を電気泳動によって分離する電気泳動部を備えたことを特徴とする核酸増幅基板。
【請求項２】
反応液を導入する反応液導入部と、基板の内部に設けられた空隙によって形成され前記反応液導入部と反応液溜部を繋ぐ反応液流路を備え、反応液は反応液導入部に導入され、さらに反応液流路を経て反応液溜部に充填されることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅基板。
【請求項３】
基板は、２以上の層が積層されて成り、積層された２層の内の一方の積層面に溝が設けられ、当該溝によって基板の内部に前記空隙が形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸増幅基板。
【請求項４】
反応液溜部内又は反応液溜部の出入口近傍に反応液の移動を抑制する移動抑制手段が設けられたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項５】
反応液溜部内又は反応液溜部の出入口近傍に複数の曲路を含む流路が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項６】
反応液溜部内には複数の曲路を含む直列の流路が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項７】
反応液溜部内に耐圧縮部が設けられ、反応液溜部を表裏の方向に圧縮した時、当該圧縮力を前記耐圧縮部に負担させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項８】
反応液溜部と電気泳動部は分離されており、両者の距離は、基板の最も厚い部位の厚さの３倍以上であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項９】
反応液溜部の厚さは、電気泳動部の厚さに比べて薄いことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【請求項１０】
反応液導入部から反応液溜部に至る領域は、親水性であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の核酸増幅基板。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００７−２４４３８９（Ｐ２００７−２４４３８９Ａ）
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０７５１３（Ｐ２００７−１０７５１３）
【出願日】平成１９年４月１６日（２００７．４．１６）
【分割の表示】特願２００４−３０５７８３（Ｐ２００４−３０５７８３）の分割
【原出願日】平成１６年１０月２０日（２００４．１０．２０）
【出願人】（０００１８３３６９）住友精密工業株式会社 (336)
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１６日（２００７．４．１６）
【分割の表示】特願２００４−３０５７８３（Ｐ２００４−３０５７８３）の分割
【原出願日】平成１６年１０月２０日（２００４．１０．２０）
【出願人】（０００１８３３６９）住友精密工業株式会社 (336)
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]