生物学的細胞における多価不飽和脂肪酸の含有量を変更するための組成物および方法
本発明は、組成物（例えば、恒常的に活性な、または組織に特異的なプロモーターもしくは他の制御配列に任意選択で操作可能に結合している、ｆａｔ−１をコードする核酸、およびその核酸または生物学的に活性なその変種を含む薬学的に許容できる製剤）、ならびに動物細胞（すなわち、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の細胞以外の細胞、例えば、筋肉細胞、ニューロン（末梢神経系でも中枢神経系でも）、脂肪細胞、内皮細胞、および癌細胞など、鳥類または魚類の細胞）におけるＰＵＦＡの含有量を効果的に変更するために用いることができる方法を特徴とする。組成物および方法は、少なくとも１つの最適化されたコドンを含むように変更されたｆａｔ−１遺伝子を含む。改変された細胞は、インビボでもイクスビボ（例えば、組織培養物中で）でも、それらを含むトランスジェニック動物（特に、魚類および鳥類）、ならびにそれらの動物から得られた食品（例えば、肉、または動物の他の可食部（例えば、肝臓、腎臓、またはスイートブレッド））も、本発明の範囲内である。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年２月４日出願の米国仮特許出願第６０／５４２０９８号、および２００４年３月２２日出願の米国仮特許出願第６０／５５５４２２号の利権を主張するものである。この両出願の内容は、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（政府支援）
本明細書に提示した研究のいくつかは、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの許可により支援されたものである（ＣＡ７９５５３）。したがって、米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、動物細胞における多価不飽和脂肪酸の含有量を変更するための組成物および方法に関する。
【０００４】
（従来技術）
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、１８個以上の炭素原子、および２個以上の二重結合を有する脂肪酸である。これは、脂肪酸のメチル末端に最も近い二重結合の位置（ｎ）に応じて、ｎ−６またはｎ−３の２グループに分類することができる（ＧｉｌｌおよびＶａｌｉｖｅｔｙ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻、４０１〜４０９頁、１９９７年；Ｂｒｏｕｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．、１９巻、１９７〜２１６頁、１９９９年；Ｎａｐｉｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．、２巻、１２３〜１２７頁、１９９９年）。ｎ−６およびｎ−３ＰＵＦＡは、それぞれリノール酸（ＬＡ、１８：２ｎ６）またはリノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ３）のいずれかで始まり、交替に連なる不飽和化および伸長により合成される（ＧｉｌｌおよびＶａｌｉｖｅｔｙ、前掲；Ｂｒｏｕｎら、前掲；Ｎａｐｉｅｒら、前掲）。動物におけるｎ−６経路の主要な終点の１つは、アラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ６）であり、ｎ−３経路の主要な終点はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ３）である。
【０００５】
ＰＵＦＡの合成に関与する重要なクラスの酵素は、脂肪酸不飽和化酵素のクラスである。これらの酵素は、酵素の特異性により決定される位置で、炭化水素鎖に二重結合を導入する。しかし、ほとんどの場合、動物は、ＬＡ（１８：２ｎ６）およびＡＬＡ（１８：３ｎ３）をより長い鎖のＰＵＦＡに転換する酵素活性を含む（この場合、転換の比率が限定的である）が、前駆物質（親）のＰＵＦＡである、ＬＡ、およびＡＬＡを合成するのに必要な１２−および１５不飽和化活性を欠く（Ｋｎｕｔｚｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３巻、２９３６０〜２９３６６頁、１９９８年）。さらに、ｎ−３およびｎ−６ＰＵＦＡは、哺乳動物の細胞では相互転換可能ではない（Ｇｏｏｄｎｉｇｈｔら、Ｂｌｏｏｄ、５８巻、８８０〜８８５頁、１９８１年）。したがって、ＬＡもＡＬＡも、これらの伸長、不飽和化の産物も、ヒトの食事に不可欠な脂肪酸であると考えられている。哺乳動物の細胞膜のＰＵＦＡ組成物は、食餌による摂取に大いに依存している（Ｃｌａｎｄｉｎｉｎら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６３巻、５４６〜５５６頁、１９８５年；ＭｃＬｅｎｎａｎら、Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．、１１６巻、７０９〜７１７頁、１９８８年）。
【０００６】
それとは対照的にある種の植物および微生物には、色素体でも小胞体でもグリセロ脂質の基質に対して作用する、膜結合した１２−および１５−（ｎ−３）不飽和化酵素があるので、ＡＬＡ（１８：３ｎ−３）などのｎ−３脂肪酸を合成することができる（ＢｒｏｗｓｅおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２巻、４６７〜５０６頁、１９９１年）。遺伝子技術により、シロイヌナズナおよび他の高等植物種から１２−および１５−不飽和化酵素をコードする遺伝子の同定がもたらされている（Ｏｋｕｌｅｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、６巻、１４７〜１５８頁、１９９４年；Ａｒｏｎｄｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８巻、１３５３〜１３５５頁、１９９２年）。最近、シノラブディス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）から、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素をコードするｆａｔ−１遺伝子がクローンされた（Ｓｐｙｃｈａｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１１４２〜１１４７頁、１９９７年；米国特許第６１９４１６７号も参照されたい）。
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、一部には、シー・エレガンス（C.elegans）のｎ−３不飽和化酵素遺伝子であるｆａｔ−１を他のタイプの動物細胞（例えば、哺乳動物、鳥類、および魚類）中に首尾よく導入することができ、そこでその遺伝子は迅速にかつ効果的に細胞のｎ−３ＰＵＦＡ含有量を増加させ、劇的にｎ−６：ｎ−３ＰＵＦＡの比のバランスをとるという知見に基づくものである。本発明者らは、改変されたシー・エレガンスのｆａｔ−１核酸配列も見出した。本発明者らは、アミノ酸配列をコードする天然に存在するコドンの１つまたは複数が変更されているが依然として同じアミノ酸配列をコードする場合に、これらの配列を「最適化された」と呼ぶ。例えば、アミノ酸残基のバリンをコードする「ＧＴＴ」と表される１つまたは複数のコドンは、やはりバリンをコードするＣＴＧで置き換えることができ、アミノ酸残基のアルギニンをコードする「ＣＧＴ」と表される１つまたは複数のコドンは、やはりアルギニンをコードするＣＧＣで置き換えることができる、などである。コドンは、組換えＤＮＡが挿入される生物体に好ましいコドンを含むように変更される。したがって、最初の、または天然に存在する状態からコドンの使用頻度を最適化することにより改変された核酸を含めた、オメガ−６脂肪酸を対応するオメガ−３脂肪酸に不飽和化する酵素的に活性なタンパク質をコードする配列を含む核酸、ならびにトランスジェニック動物（例えば、哺乳動物、鳥類、または魚類）を生成し、様々な疾患または状態を処置しまたは予防する手助けをするためのこれらの配列を用いる方法は、本発明の範囲内である。最適化された配列は、以下に記載するあらゆるベクターおよび細胞に組み込むことができ、野生型の配列（例えば、ｆａｔ−１遺伝子）を用いることができるあらゆる方法で用いることができる。ある場合には（例えば、トランスジェニック動物の産生では）、コドンが最適化された配列を使用することが好ましいことがある。最適化は、核酸配列を改変することができる唯一の方法ではない。本発明には、生物学的に活性なフラグメント、またはオメガ−３（すなわちｎ−３）不飽和化酵素もしくは最適化されたオメガ−３（すなわちｎ−３）不飽和化酵素の他の変異体をコードする配列の使用が含まれる。酵素的に活性なタンパク質、またはオメガ−３不飽和化酵素活性を有する酵素は、細胞で発現される場合に、細胞内でｎ−６ＰＵＦＡをｎ−３ＰＵＦＡに転換するタンパク質である。これらのタンパク質または酵素は、その長さおよび含有量が、天然に存在するタンパク質（例えば、ｆａｔ−１がコードするタンパク質）に一致してもよく、あるいは本明細書に記載する１つまたは複数の方法に有用な酵素活性を十分に保持するそのフラグメントまたは他の変異体であってもよい。
【０００８】
より詳しく述べると、ラットの心筋細胞におけるｆａｔ−１遺伝子の非相同発現により、これらの細胞が様々なｎ−６ＰＵＦＡを対応するｎ−３ＰＵＦＡに転換することができるようになり、ｎ−６：ｎ−３比を約１５：１（望ましくない比）から約１：１（望ましい比）に変えたことを、本発明者らの研究は実証した。所与の細胞内の配列がその細胞で通常発現される配列ではないことを示すのに、本発明者らは「非相同発現」の語を使用する。異なる種の配列であるので配列が「非相同」であってよい。さらに、本発明者らは、ｎ−６ＰＵＦＡ由来のエイコサノイド（すなわち、アラキドン酸）が、トランスジェニック細胞で著しく減少することを見出した。さらに下記するように、アラキドン酸のレベルを評価して、所与の核酸がオメガ−３不飽和化酵素活性を有する酵素をコードするか否かを決定することができ、同様に、ｎ−６ＰＵＦＡのレベル、ｎ−３ＰＵＦＡのレベル、および／またはｎ−６：ｎ−３ＰＵＦＡの比を評価することができる。したがって、本発明は、恒常的に活性なまたは組織に特異的なプロモーターに任意選択で、かつ操作可能に結合する組成物（例えば、オメガ−３不飽和化酵素活性（例えば、ｆａｔ−１）を有するポリペプチドをコードする核酸）、および動物細胞でＰＵＦＡの含有量を効果的に変更するのに用いることができる方法を特徴とする。細胞は、哺乳類、鳥類、または魚類の細胞であってよく、ｎ−６ＰＵＦＡを含むあらゆるタイプの細胞であってよい。例えば、細胞は、筋細胞、（末梢神経系または中枢神経系の）ニューロン、脂肪細胞、内皮細胞、肝細胞、または結腸、乳房、肝臓、前立腺、卵巣、および子宮頸部の癌細胞を含む癌細胞であってよい。以下に記載する実験は、主にシー・エレガンスのｆａｔ−１配列で行ったが、本発明はそれだけに限定されず、本発明の組成物および方法は、オメガ−３不飽和化酵素活性を有するポリペプチド（すなわち、天然に存在するものであってもなくても、シー・エレガンスのものであってもなくても、オメガ−６脂肪酸を対応するオメガ−３脂肪酸に不飽和化するあらゆるポリペプチド）をコードするあらゆる核酸を含む（または使用する）ものを含む。したがって、具体的な実施形態では、本発明は、動物でｎ−３脂肪酸不飽和化酵素（すなわち、オメガ−３不飽和化酵素活性）を産生することにより、動物でｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸を産生する方法を特徴とする。ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素の産生は、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素または生物学的に活性なその変種をコードする核酸を、動物に以下のように投与することに続いて開始することができる。このような核酸の詳しい例を本明細書に提供し、同様の機能的な配列は、特に本明細書に提供される手引きにより当業者であれば容易に同定することができる。動物は、本明細書で述べるあらゆる種であってよく（例えば、哺乳動物、鳥類、または魚類のクラスの範囲内の種）、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を産生する平均的の、または「正常の」能力を有しても、有さなくてもよい。例えば、本発明の方法は、不飽和化酵素を投与するより前に、ｎ−３脂肪酸を産生する望ましくなく限られた能力を有する動物（例えば、ヒト）で行ってもよい。
【０００９】
核酸（例えば、ｆａｔ−１配列、または生物学的に活性なその変種）を、制御配列に操作可能に結合させることができる。制御配列は、プロモーターだけではなく、エンハンサー、またはポリアデニル化シグナルなど、改変された細胞で核酸の発現を促進する他の発現制御配列も含む。このような改変された細胞を、インビボに置き、またはイクスビボ（例えば、組織培養中）に維持することができる。その天然の環境から取り除かれた細胞は、「単離されて」おり、本明細書に記載された核酸配列を有する場合は本発明の範囲内である（非相同の細胞内にある核酸は、同様に「単離された」と記載してもよい）。本明細書に記載された核酸または改変された細胞を有するヒト以外のトランスジェニック動物も、本発明の範囲内であり、これらの動物から得られる食品（例えば、肉、または動物の他の食用部分（例えば、肝臓、腎臓、皮膚、脂肪、もしくはスイートブレッド））、あるいは動物の部分を用いて産生される食品（例えば、ブロス、肉汁、スプレッド、またはトランスジェニックの部分（例えば、牛肉もしくは鶏肉の部分）で作られるあらゆる加工食品）も、本発明の範囲内である。食品はヒトが摂取するために、またはペットもしくは家畜用の餌として調製されてもよい。
【００１０】
トランスジェニック動物についてはさらに以下で論じるが、動物（またはそのあらゆる所与の組織）は、オメガ−３不飽和化酵素を天然に発現するものであってもなくてもよいことに本発明者らはここで注目し、本発明は、通常はその能力を欠く動物に、遺伝子導入によりｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を提供することにより、その動物でｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸を生成する方法を含む。記載した方法および組成物は、動物（例えば、哺乳動物、鳥類、または魚類）でｎ−３脂肪酸不飽和化酵素活性を増強しまたは補足するためにも用いることができる。一実施形態では、本発明は、シー・エレガンスのｆａｔ−１タンパク質（例えば、図１８に示した変種）をコードする変種を含む、ｎ−３不飽和化酵素（例えば、シー・エレガンスのｎ−３不飽和化酵素）または生物学的に活性なその変種（例えば、フラグメントもしくは他の変異体）をコードする、最適化されていてもされていなくてもよい核酸配列を含む哺乳類、トリ（鳥類）のまたはサカナ（魚類）の細胞を特徴とする。述べたように、ｎ−３不飽和化酵素の生物学的に活性な変種は、治療上または臨床上有効であるのに十分な野生型のｎ−３不飽和化酵素の生物学的活性を保持する変種（すなわち、患者を処置し、トランスジェニック動物を生成し、または診断検査もしくは他の臨床検査を行うのに有用な変種）である。例えば、ｎ−３不飽和化酵素の変種は、野生型ｎ−３不飽和化酵素の生物学的活性の少なくとも５〜２５％を保持する酵素の変異体またはフラグメントであってよい。例えば、ｎ−３不飽和化酵素のフラグメントが、同じ条件下で対応する野生型の酵素の少なくとも５〜２５％効率的に（例えば、野生型のｎ−３不飽和化酵素の５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、８０、９０、９５、または９９％効率的に）ｎ−６脂肪酸をｎ−３脂肪酸に転換する場合、フラグメントは生物学的に活性な全長の酵素の変種である。ｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸への転換を用いて、コドンの最適化により変更された配列を評価するのを助けることもできる（例えば、この転換を用いて、これらの配列が生物学的活性を保持しているのか生物学的活性を増強したかを決定することができる）。
【００１１】
変種は、また１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含んでもよい（例えば、野生型酵素の配列における１％、５％、１０％、２０％、２５％、またはそれを超えるアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置き換わり、または欠失してもよい）。換言すれば、本発明の範囲内の核酸の変種は、野生型のｎ−３不飽和化酵素遺伝子（例えば、シー・エレガンスのｆａｔ−１）に少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％一致する配列を有してもよく、または配列を含んでもよい。同様に、本発明の範囲内である核酸の変種は、野生型のｎ−３不飽和化酵素（例えば、シー・エレガンスのｆａｔ−１）に少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％一致する配列を有するタンパク質をコードしてもよい。変種が置換を含む場合、置換は当技術分野でよく知られている保存的アミノ酸置換を構成してもよい。野生型からここに記載する程度に変化する核酸の配列は、生物学的に活性であり続け、かつ／または生物学的に活性なタンパク質をコードする限り本発明の方法に有用である。
【００１２】
（任意選択で、恒常的に活性なもしくは組織に特異的なプロモーター、および／または他の調節要素に操作可能に結合した）ｆａｔ−１配列を発現する細胞は、ｆａｔ−１遺伝子およびその産物の機能上の性質を特徴づける都合のよいシステムを提供するので貴重である。組織培養細胞も特に便利であるが、本発明はそれだけに限定されない。ｆａｔ−１で変更した細胞により、現在必要とされている細胞または動物を飼育する長々しい手順なしに、ｎ−３脂肪酸が媒介するあらゆる細胞メカニズムが研究できるようにもなっている。細胞は、例えば、既存の方法を評価するため、またｎ−３不飽和化酵素をコードする配列をインビボで細胞内に効果的に導入するための新しい方法をデザインするために用いることができるモデルシステムとしても役立つことができる。
【００１３】
本明細書に記載したあらゆる文脈（例えば、本発明の組成物（例えば、核酸構築物）が患者を処置するために、トランスジェニック動物を産生するために、または細胞培養アッセイで使用する際に用いられるか否か）において、オメガ−３不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｆａｔ−１）を別の（すなわち「第２の」）遺伝子と（同一のベクターにより、または同一もしくは異なるタイプの別個のベクターを用いて）共発現させることができる。第２の遺伝子（ｆａｔ−１遺伝子が第１の遺伝子として）は、例えば、別の治療用の遺伝子（例えば、小分子もしくは化学療法剤に対する受容体）、またはマーカー遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または増強されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ）などの蛍光タンパク質をコードする配列）であってよい。最適化されたｆａｔ−１核酸を含む変種のｆａｔ−１核酸は、その野生型の対応物に勝るある種の有利点を示すタンパク質をコードすることがある。例えば、変種の配列は、（培養のまたはインビボの細胞で）不飽和化酵素を発現するのにより効果的であることがある。
【００１４】
本発明のあらゆる核酸分子は「単離された」ものであってよい（すなわち、それらが天然に存在する環境と異なる環境で）（コドンが最適化された配列に関する修飾語である「単離された」の使用についての下記の本発明者らのコメントを参照されたい）。例えば、核酸はプラスミドまたは他のベクター中に組み入れられ、または、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節要素を含む１つまたは複数の非相同配列に結合してもよい。核酸分子は、また、非相同の細胞（すなわち、それらが通常発現されない細胞）内に含まれる場合に単離される。例えば、哺乳動物の細胞（例えば、ヒト、ウシ、またはブタの細胞）、鳥類の細胞（例えば、ニワトリ、アヒル、またはガチョウの細胞）、または魚類の細胞（例えば、サケ、マス、またはマグロの細胞）で、シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子（またはその変種）を含む核酸は、単離された核酸である。ここに記載するｆａｔ−１を含む細胞は、本発明の範囲内である。
【００１５】
本発明の核酸は、患者に投与するために配合することもできる。例えば、患者に経口でまたは非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、経粘膜、経皮、または皮下の注射）投与するために滅菌水または滅菌した生理的バッファー（例えば、リン酸緩衝食塩水）にそれらを懸濁してもよい。製剤は、また、組織または臓器の表面に適用するために調製してもよい（例えば、溶液剤、ゲル剤、またはパスタ剤として）。患者が腫瘍を有する場合には、組成物を腫瘍内に注入し、または腫瘍を取り除いた部位の周囲の組織に投与してもよい。
【００１６】
本発明は、シー・エレガンスのｎ−３不飽和化酵素遺伝子または生物学的に活性なその変種を発現するトランスジェニック動物（家畜として飼われ、または食料源として用いられるあらゆる動物（例えば、魚類もしくは他の水生動物（例えば、イカ、タコ、甲殻類の動物（例えば、ロブスター、カニ、マキガイ、およびエビ）、または他の食用の水生動物（例えば、ウナギ）を含む）も特徴とする。シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が動物細胞に送達されると効果的に発現できるという発見を考慮して、当技術分野でよく知られた方法により、この遺伝子、その変種、および他のｆａｔ−１遺伝子を用いてトランスジェニックマウス、またはより大型のトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、またはあらゆる他の家畜、もしくは飼育された動物）、あらゆる食鳥（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、または猟鳥）、ならびに貝類および甲殻類を含む魚類を産生することができる。より詳しく述べると、本発明は、導入遺伝子がオメガ−３不飽和化酵素または生物学的に活性なその変種（例えば、少なくとも１つの最適化されたコドンを含むことができるシー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子）である、タラ（またはタラ目タラ科の任意の魚類（例えばハドック））、オヒョウ（オヒョウ属のカレイ類の２種のいずれかに対する一般名）、ニシン（アンチョビも含む、ニシン目のいくつかの魚類の一般名）、サバ（サバ科の輸入食用魚の様々な種類の一般名、サケ（または、マスを含めたサケ科の任意の魚類）、スズキ（またはスズキ科の任意の魚類）、シャッド（またはニシン科の任意の魚類）、ガンギエイ（またはガンギエイ科の任意の魚類）、スメルト（またはキュウリウオ科の任意の魚類）、シタビラメ（またはササウシノシタ科の任意の魚類）、およびマグロ（またはサバ科の任意の魚類）を含むトランスジェニック魚類を産生するための組成物および方法を含む。
【００１７】
用いた構築物が恒常的に活性なプロモーターを含むか組織に特異的なプロモーターを含むかに応じて、オメガ−３不飽和化酵素遺伝子（例えば、ｆａｔ−１遺伝子）は全体に発現されても、組織に特異的な方法で発現されてもよい。遺伝子を恒常的に活性なプロモーターの制御下に置くと多くの組織のタイプで発現されることがあり、または遺伝子を組織に特異的なプロモーター（例えば、骨格筋、心筋、または平滑筋、乳房組織、結腸、前立腺、ニューロン、網膜細胞、膵臓細胞（例えば、島細胞）、他の内分泌細胞、内皮細胞、皮膚細胞、脂肪細胞などの中の細胞のタイプなどの、特定の細胞のタイプで選択的に活性のあるプロモーター）の制御下に置くと特定の組織または細胞のタイプで発現されることがある。
【００１８】
トランスジェニック動物の細胞は、変更されたＰＵＦＡ含有量を含み、さらに下記に記載するように、摂取するのにより望ましい。したがって、ｆａｔ−１遺伝子がコードする不飽和化酵素を発現するトランスジェニックの家畜または食用に屠殺されるあらゆる動物（例えば、魚類および猟獣）は、より優れた（すなわち、より健康的な）食料源である。これらの動物から得た食品、またはこれらの動物を用いて製造した食品（例えば、加工食品およびペットフード）は、健常対象、または本明細書に記載する１つまたは複数の状態に罹患している対象に提供することができる。
【００１９】
述べたように、本発明は、ｎ−３ＰＵＦＡの不足またはｎ−３：ｎ−６ＰＵＦＡの比の不均衡に関連する状態を有し、または発症する可能性のある患者（ヒトおよび他の哺乳動物を含む）を、ｎ−３不飽和化酵素または生物学的に活性なその変種（例えば、フラグメント、変異体、またはコドンが最適化された配列）をコードする核酸を投与することにより処置する方法を特徴とする。あるいは、核酸または生物学的に活性な変種がコードするタンパク質を投与することができる。処置方法を、不整脈または心臓血管疾患（例えば、高レベルの血漿トリグリセリドまたは高血圧によって証明されるもの）、癌（例えば、乳癌または結腸癌）、炎症性疾患または自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、慢性閉塞性肺疾患、狼瘡、糖尿病、シェーグレン症候群移植術、強直性脊椎炎、結節性多発性動脈炎、ライター症候群、もしくは強皮症）、あるいは網膜または脳の形成異常（もしくは未熟児に起こる切迫形成異常）を有する患者に適用することができる。好適な患者には、糖尿病、肥満、皮膚障害、腎臓疾患、潰瘍性大腸炎、またはクローン病を有する者、または有すると診断される者も含まれる。他の適切な患者には、移植された臓器を拒絶する危険性のある患者が含まれる。ｆａｔ−１の発現は、ニューロンなどの細胞における細胞死（そのような死が起こる場合はアポトーシスによると本発明者らは考える）を阻害することができ、したがって、本発明の方法は、神経変性疾患を処置しまたは予防する（例えば、その可能性、またはその期間もしくは重症度を阻害する）ために用いることができる。したがって、本発明は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄延髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ；ケネディー病としても知られる）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、またはマシャドジョセフ病（ＭＪＤ／ＳＣＡ３）などの神経変性疾患を発症し、または発症する可能性のある患者を処置する方法を特徴とする（Ｒｅｄｄｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃ．、２２巻、２４８〜２５５頁、１９９９年）。
【００２０】
ｆａｔ−１の発現により癌細胞の細胞死が増加することもあり、したがって、本発明が特徴とする方法を用いて、乳房、結腸、前立腺、肝臓、子宮頸、肺、脳、皮膚、胃、頭頸部、膵臓、血液（例えば、白血病およびリンパ腫）、ならびに卵巣の癌を含む癌を処置し、または予防する（例えば、可能性を阻害し、または重症度もしくは拡散を阻害する）ことができる。特に、これらの方法は、最適化されたシー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子、および任意選択で第２のタンパク質（例えば、化学療法のタンパク質）をコードする配列を含む核酸構築物で行うことができる。構築物は、調節配列（例えば、恒常的に活性な、または細胞型に特異的なプロモーター）も含むことができる。癌の処置または予防を意図する核酸を、患者に投与するために配合してもよい。例えば、核酸を、滅菌した生理的に許容される希釈剤と組み合わせてもよい。腫瘍がすでに発症している場合には、核酸を注入可能な溶液に配合してもよい。
【００２１】
バランスのとれた、またはより望ましくバランスのとれたｎ−６：ｎ−３比は、通常の増殖および発達に重要であり、上記で述べたように、本発明の方法は、ＰＵＦＡに関連する識別できる疾患または状態のない患者に適用すると有利であり得る。
【００２２】
本明細書に用いられる略語には以下のものが含まれる：ＡＡはアラキドン酸（２０：４ｎ−６）。ＤＨＡはドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ−３）、ＥＰＡはエイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３）、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質、Ａｄ．ＧＦＰはＧＦＰ遺伝子を有するアデノウィルス、ＡＤ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１はｆａｔ−１遺伝子およびＧＦＰ遺伝子の両方を有するアデノウィルス、およびＰＵＦＡは多価不飽和脂肪酸である。
【００２３】
本明細書に記載したものと同様の、または同等の方法および材料を、本発明を実践し、または試験するのに用いることができるが、有用な方法および材料は以下に記載する。本出願から発行することができるあらゆる米国特許の目的では、本明細書に引用されるすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全文が参照として組み入れられる。
【００２４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載、図、および実施例から明らかになるであろう。
【００２５】
（図面の簡単な記載）
図１は、遺伝子導入効率を示す４枚の顕微鏡写真を集めた図である。ラット心筋細胞に、Ａｄ．ＧＦＰ（左パネル、対照）またはＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１（右パネル）を感染させた。感染４８時間後、心筋細胞を高輝度（上パネル）および５１０ｎｍの青色光（下パネル）で可視化した。ＧＦＰの共発現により、導入遺伝子が細胞で高い効率で発現されていることが肉眼的に説明される。
図２は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した心筋細胞（対照）、およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した心筋細胞におけるｆａｔ−１転写物レベルのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）プロテクションアッセイのオートラジオグラムを表す図である。心筋細胞から単離された全ＲＮＡ（１０μｇ）をアンチセンスのＲＮＡプローブとハイブリダイズし、ＲＮａｓｅで消化し、変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により単離した。ｆａｔ−１ｍＲＮＡをオートラジオグラフィーにより可視化した。β−アクチン遺伝子を標的にするプローブを対照として用いた。
図３は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照の心筋細胞、およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した心筋細胞から抽出した全細胞脂質の脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンを表す図である。
図４は、対照の心筋細胞およびｆａｔ−１遺伝子を発現する心筋細胞におけるプロスタグランジンＥ２レベル（酵素免疫法で測定した）を示す棒グラフである。値は３回の実験の平均±ＳＤであり、対照の％で表される。＊ｐ＜０．０１。
図５は、対照の心筋細胞およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックの心筋細胞からの全細胞脂質の多価不飽和脂肪酸組成を示す表である。
図６は、実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
図７は、実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
図８は、実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
図９は、対照のニューロンおよびＡｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染したニューロンから抽出した全細胞脂質の脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンである。
図１０は、ラットの皮質ニューロン（対照）およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡ（ｆａｔ−１）を発現するトランスジェニック細胞からの全細胞脂質のＰＵＦＡ組成を比較する表である。
図１１は、対照のニューロンおよびｆａｔ−１遺伝子を発現するニューロンにおけるプロスタグランジンＥ２レベルの酵素免疫法の結果を示す棒グラフである。Ａｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染したニューロンは、対照に比べてＰＧＥ２のレベルが低い。値は、３回の実験の平均±ＳＤであり、対照のパーセント値で示してある。＊ｐ＜０．０１。
図１２は、対照およびｆａｔ−１を発現する培養物における細胞生存度のＭＴＴアッセイの結果を表す棒グラフである。増殖因子中止２４時間後、ｆａｔ−１遺伝子を発現するニューロンの細胞生存度は、対照細胞よりも５０％高い（ｐ＜０．０１）。
図１３は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した筋細胞およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した筋細胞の、細胞外カルシウム７．５ｍＭに対する特異的な反応を示す１対の軌跡である。
図１４は、経時的（ウィルス注入後０〜４週間）の腫瘍体積、すなわち遺伝子導入の腫瘍の増殖に対する効果を示す折れ線グラフである。ヌードマウスの背部に、乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を皮下移植した。３週間後、マウスを腫瘍内注射により、Ａｄ．ＧＦＰ−ｆａｔ−１またはＡｄ．ＧＦＰ（対照、５０μｌ、１０１２ＶＰ／ｍ）で処置した。
図１５は、対照のＭＣＦ−７細胞、およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックのＭＣＦ−７細胞からの全細胞脂質のＰＵＦＡ組成を示す表である。
図１６は、対照のＭＣＦ−７細胞およびｆａｔ−１遺伝子を発現するＭＣＦ−７細胞におけるプロスタグランジンＥ２レベルの酵素免疫測定法の結果を表す棒グラフである。値は、３回の実験の平均±ＳＥであり、対照のパーセント値で示してある（＊Ｐ＜０．０５）。
図１７Ａおよび１７Ｂは、シー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびＦａｔ−１ポリペプチドの推定アミノ酸配列を表す。
図１８は、最適化したｆａｔ−１核酸配列を表す。
図１９は、野生型マウスの骨格筋（ＷＴ、上パネル）およびｆａｔ−１トランスジェニックマウス（ＴＧ、下パネル）の骨格筋から抽出した全脂質の特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンである。野生型マウスもトランスジェニックマウスも、８週齢のメスマウスであり、同じ食餌を与えた。トランスジェニックの筋肉（下パネル）では、野生型の筋肉（上パネル）と比べて、ｎ−６の多価不飽和酸（１８：２ｎ−６、２０：４ｎ−６、２２：４ｎ−６、および２２：５ｎ−６）のレベルは低いが、ｎ−３脂肪酸（＊で示した）は豊富である。野生型の動物では、組織に見られる多価不飽和脂肪酸は、主に（９８％）ｎ−６リノール酸（ＬＡ、１８：ｎ−６）およびアラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ−６）、ならびにパターン（または検出不可能な）量のｎ−３脂肪酸である。それとは対照的に、トランスジェニックマウスの組織には、リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ｎ−３）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）を含む、大量のｎ−３多価不飽和脂肪酸が存在する。したがって、トランスジェニックの組織におけるｎ−６脂肪酸であるＬＡおよびＡＡのレベルは大幅に減少し、ｎ−６からｎ−３脂肪酸への転換を示している。トランスジェニック動物の組織におけるｎ−６のｎ−３脂肪酸に対する得られた比は１に近かった。ｎ−６対ｎ−３比のバランスがとれ、ＡＡ／（ＥＰＡ＋ＤＰＡ＋ＤＨＡ）のバランスがよりとれたこのｎ−３に富む脂肪のプロファイルは、表１に列挙したすべての試験を行った臓器／組織で観察することができた。
図２０は、実施例８に記載したように変更した、野生型、およびｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニックのゼブラフィッシュの筋肉組織から抽出した全脂質の、特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンを示す図である。
図２１は、実施例８に記載したように変更した、野生型、およびｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニック豚の尾部組織から抽出した全脂質の、特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す１対の部分的ガスクロマトグラフパターンである。
【００２６】
（詳細な記載）
下記に記載する研究は、とりわけ、ｎ−３不飽和化酵素をコードする核酸分子は様々な動物細胞のタイプで効率的に発現することができ、結果として、これらの細胞は相当な量のｎ−３ＰＵＦＡを内因性のｎ−６ＰＵＦＡから生成し、ｎ−６のｎ−３ＰＵＦＡに対する比はよりバランスがとれている（１：１）ことを説明するものである。研究は、インビボまたはインビトロで遺伝子導入を媒介することができる組換えアデノウィルスの発現ベクターを用いて行った。オメガ−３不飽和化酵素（例えば、ｆａｔ−１）または生物学的に活性なその変種（例えば、コドンが最適化された配列）を発現するアデノウィルスのベクター、ならびに他のタイプのウィルスおよび非ウィルスの発現ベクターは、本発明の範囲内である。
【００２７】
より詳しく述べると、本発明は、ｎ−６を対応するｎ−３脂肪酸に不飽和化する酵素をコードする配列を含む核酸分子を特徴とする。本発明者らの研究は、シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子がコードする不飽和化酵素に重点を置いているが、他の不飽和化酵素をコードする配列も本発明の核酸構築物に含むことができ、本発明の方法に用いることができる。例えば、コードされる不飽和化酵素は植物、シー・エレガンス以外の線虫、シアノバクテリア、またはＥＰＡに富む真菌類（例えば、ミズカビ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ））のものであってもよい。不飽和化酵素配列を供給することができる他の菌類には、サッカロミセス クリヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、およびミズカビ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）が含まれる。したがって、本発明は調節要素（例えば、恒常的に活性な、または組織に特異的なプロモーター）に操作可能に結合しているｎ−３不飽和化酵素をコードする配列を含む核酸分子を特徴とする。特異的なプロモーターは当技術分野では知られており、さらに以下に記載する。
【００２８】
ｎ−３不飽和化酵素をコードする配列は、少なくとも１つの最適化されたコドンを含むことができる。最適化されたコドンの数は、変化してもよい。その数は、発現のいくつかの局面（例えば、転写するコピー数）を改善し、その他の方法では配列の有用性を高めるのに十分であることが好ましい。ある場合には、ほんの少数（例えば、１〜５個）のコドンを変更することで配列を改善することができる。他の場合には、より多数（例えば、少なくとも５から１５０個まで）のコドンを最適化することができる。詳しい実施形態では、不飽和化酵素をコードする配列の最初の供給源に関係なく、核酸分子は５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、１４５〜１５０、１０〜１２５、２５〜１００、３０〜９０、４０〜８０、５０〜７０、または約６０個の最適化されたコドンを含むことができる。一実施形態では、核酸分子は、図１８に示した核酸の配列を含むことができる。
【００２９】
さらに、最適化されたコドンの位置は変化することができる。シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子に関しては、最適化されたコドンは６、９、１８、２０、２２、２４、２８〜３０、３３〜３６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６１、６４、６７、６９〜７１、７３、７７、７９、８１、８６、８９、９２、９４〜９５、１００、１０１、１０５、１０６、１１２、１１５、１１８、１２４、１２７、１２８、１３１、１４６、１５１、１５４、１６１、１６３、１６４、１６９、１７８、１８７、１８８、１９５、１９７、２００、２０２、２０６、２１０、２１４、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、２２８、２３２、２３４、２４１、２４５、２５５、２７１、２８０〜２８２、２８４、２８５、３０１、３０３、３１０、３１２、３２７、３６２、または３７０の位置の１つまたは複数に見出すことができる。シー・エレガンスのｆａｔ−１の遺伝子以外の不飽和化酵素をコードする遺伝子を用いる場合は、これらと同じ位置の１つまたは複数（すべてを含む）でコドンを最適化することができる。相同遺伝子（例えば、植物または菌類のｎ−３不飽和化酵素遺伝子）では、最適化される位置は、上記に列挙した位置に対応する位置であることができる。
【００３０】
上記に述べたように、本発明の核酸分子のいくつかは「単離されている」と言ってもよい。しかし、核酸配列が天然に存在する配列ではない場合には、この修飾語は必要ではないと考えられる。最適化されている配列（特にいくつかのコドンが最適化されているもの）が天然に存在する可能性があまりない場合には、これらの配列を「単離されている」と述べる必要はないと考える。したがって、天然に存在する配列である核酸分子は「単離されて」（その天然の環境においてそれが関連する成分のいくつか、ほとんど、またはすべてから分けられて）いなければならないが、天然に存在しない核酸分子（例えば、非天然の最適化された配列を有する核酸）は単離されていると表す必要はない。
【００３１】
調節要素および不飽和化酵素をコードする配列の他に、核酸分子は、それ（例えば、治療用のポリペプチド）が投与される対象に利益を与え、またはアッセイ（例えば、第２の配列がマーカータンパク質をコードすることができる）で分子の有用性を改善するポリペプチドをコードする配列を含むことができる。本明細書では、蛍光の例（例えば、ＧＦＰおよびＥＧＦＰ）を提供し、非蛍光マーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ）の例も提供する。他のマーカーまたは「レポーター」タンパク質は、当技術分野で知られており、日常的に使用されており、本明細書に記載する核酸構築物に組み入れることもできる。
【００３２】
核酸分子は、ベクター（例えば、発現ベクター）であってよく、またはベクターの一部であってもよい。本発明者らは、本発明者らがアデノウィルスのベクターを使用したことを上記で述べた（実施例も参照されたい）。本発明で発現構築物として用いることができる他のウィルスベクターには、ワクシニアウィルス（例えば、ポックスウィルス、もしくは変更ワクシニアウィルス アンカラ株（ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ））、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、またはヘルペスウィルスなどのウィルスに由来するベクターが含まれる。これらのウィルスには、ヒトの細胞を含む動物細胞に関して使用するためのいくつかの魅力的な特徴がある。例えば、単純ヘルペスウィルス（例えば、ＨＳＶ−１）を、ニューロンに不飽和化酵素（例えば、ｆａｔ−１またはその相同体（もしくはコドンが最適化されている変種を含む、生物学的に活性の変種）を送達するために選択することができる。このようなベクターは、例えば、神経変性疾患を処置し、または予防するのに有用である。
【００３３】
レトロウィルス、リポソーム、およびプラスミドベクターも、当技術分野でよく知られており、ｎ−３不飽和化酵素をコードする配列を細胞に送達するのにも用いてもよい（例えば、不飽和化酵素をコードする（例えば、ｆａｔ−１）配列をｌａｃＺ遺伝子に融合したい場合に、発現ベクターのｐＵＲ２７８を用いることができ、ｌａｃＺは検出可能なマーカーであるβ−ガラクトシダーゼをコードしている（例えば、Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２巻、１７９１頁、１９８３年を参照されたい））。
【００３４】
述べたように、不飽和化酵素をコードする配列（例えば、ｆａｔ−１配列）または生物学的に活性なその変種（コドンが最適化される配列を含む）は、発現された場合に、融合タンパク質の量または質（例えば、可溶性、または循環半減期）を改善する別の治療用の遺伝子または配列をコードする配列などの、他のタイプの非相同配列に融合することもできる。例えば、ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合した本発明のタンパク質を発現させることができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへ吸着させ、次いで遊離のグルタチオンの存在下で溶離することにより溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ、６７巻、３１〜４０頁、１９８８年）は、クローンされた標的の遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出できるように、トロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ切断部位を含むようにデザインされている。他の融合パートナーには、アルブミン、および免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ）の領域（例えば、ヒンジ領域のある、またはないＦｃ領域）が含まれる。他の有用なベクターには、ｐＭＡＬ（マサチューセッツ州、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびｐＲＩＴ５（ニュージャージー州、Ｐｉｃａｔａｗａｙ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれ、それぞれマルトースＥ結合性タンパク質、およびタンパク質Ａを、ｎ−３不飽和化酵素に融合させる。
【００３５】
導入遺伝子の発現は、あらゆる所与の発現ベクターをその導入遺伝子とともに再投与することが必要ないようにエピソーム系から十分に延長することができる。あるいは、ベクターは、好ましくは部位特異的位置において、宿主ゲノムへの組込みを促進するようにデザインすることができ、細胞の生存期間中に導入遺伝子が確実に失われないようにするのを助ける。送達の手段が何であっても、転写の制御は、宿主細胞が行い、組織特異性を促進し導入遺伝子の発現を調節する。したがって、本発明の核酸分子は、不飽和化酵素をコードする配列の宿主ゲノムへの組込みを促進する配列を含むことができる。
【００３６】
発現ベクターは、例えば、形質転換される宿主細胞のタイプ、および望まれるタンパク質発現のレベルに応じて選択し、またはデザインする。例えば、宿主細胞が哺乳動物の細胞の場合、発現ベクターは、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルス、およびシミアンウィルス４０由来のプロモーターなどのウィルスの調節要素を含むことができる。これらの調節要素を、非哺乳動物の（例えば、鳥類または魚類の）細胞でも用いることができる。挿入された核酸（すなわち発現されるべき配列、ここではｆａｔ−１がコードするもののようなｎ−３不飽和化酵素）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で優先的に利用される残基をコードするように変更することもできる（Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２０巻、２１１１〜２１１８頁、１９９２年）。同様に、必要に応じ、または所望により、大腸菌以外の生物でコドンを優先的に変更することができる。これらのような変更（例えば、様々な調節要素の組入れおよびコドンの最適化）は、標準の組換え技術により実現することができる。より一般的には、本発明の発現ベクターを、原核生物の、または真核生物の細胞でタンパク質を発現するようにデザインすることができる。例えば、本発明のポリペプチドを、細菌の細胞（例えば、大腸菌）、真菌、酵母菌、または昆虫の細胞で（例えば、バキュロウィルスの発現ベクターを用いて）発現させることができる。例えば、オートグラファカリフォルニカ核多角体ウィルス（ＡｃＮＰＶ）などのバキュロウィルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞で増殖し、ｎ−３不飽和化酵素を発現するベクターとして用いることができる。本発明はそれだけに限定されないが、発現の主要な目的がオメガ−３不飽和化酵素の生成および精製である場合は、大腸菌、酵母菌、および昆虫細胞が宿主細胞として働くと、本発明者らは予想している。本明細書で述べたように、本発明は、広範囲の様々なタイプのトランスジェニック動物内におけるものを含む、より高等な目（もく）の細胞におけるオメガ−３不飽和化酵素の発現も含む。
【００３７】
上記したように、宿主細胞が多細胞動物から得られ、または多細胞生物の細胞である場合は、不飽和化酵素を発現するために用いられる発現ベクターおよび核酸（例えば、ｆａｔ−１核酸配列）は、組織に特異的なプロモーターも含むことができる。このようなプロモーターは当技術分野では知られており、それだけには限定されないが、肝臓に特異的なプロモーター（例えば、アルブミン；Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１巻、５１２４〜５１３２頁、１９９７年）、筋肉に特異的なプロモーター（例えば、ミオシン軽鎖１（Ｓｈｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、８巻、４０３〜４１０頁、１９９７年）またはα−アクチン）、膵臓に特異的なプロモーター（例えば、インスリンまたはグルカゴンのプロモーター）、神経に特異的なプロモーター（例えば、チロシンヒドロキシラーゼのプロモーター、またはニューロンに特異的なエノラーゼプロモーター）、内皮細胞に特異的なプロモーター（例えば、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｔ；Ｏｚａｋｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻、１４８３〜１４９０頁、１９９６年）、および平滑筋細胞に特異的なプロモーター（例えば、２２ａ）が含まれる。腫瘍に特異的なプロモーターは癌治療を開発するのにも使用されており、Ｂ１６メラノーマに対するチロシンキナーゼ特異的プロモーター（Ｄｉａｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻、７８９〜７９５頁、１９９８年）、ある種の乳癌に対するＤＦ３／ＭＵＣ１（Ｗｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５３巻、６４１〜６５１頁、１９９３年；乳癌には、ヒトアロマターゼチトクロームｐ４５０（ｐ４５０ａｒｏｍ）の脂肪に特異的なプロモーター領域も用いることができる（米国特許第５４４６１４３号；Ｍａｈｅｎｄｒｏｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻、１９４６３〜１９４７０頁、１９９３年；およびＳｉｍｐｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３９巻、３１７〜３２４頁、１９９３年を参照されたい）が含まれる。α−フェトプロテインのプロモーターは、肝細胞癌で直接発現させるために用いることができる（Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５巻、５２８３〜５２８７頁、１９９５年）。組織に特異的な発現が必要とされず、または望まれない場合、ｎ−３不飽和化酵素をコードする配列は、恒常的に活性なプロモーター（例えば、β−アクチンのプロモーター）の制御下におく（すなわち操作可能に結合する）ことができる。他の恒常的に活性なプロモーターは、当技術分野で知られており使用されている。
【００３８】
本発明のベクターおよび他の核酸分子（例えば、ｆａｔ−１ｃＤＮＡ自身）は、導入遺伝子の一時的発現を制限する配列も含むことができる。例えば、導入遺伝子は、例えば、プロモーターにｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）のエンハンサーを含むことにより、また、形質移入されまたは感染した細胞をｃＡＭＰ変調性の薬物で処置することにより、薬物誘導性のプロモーターにより制御され得る（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻、１８８３〜１８９３、１９９６年）。あるいは、リプレッサー因子は、薬物の存在下で転写を防止することができる（Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻、３３３９〜３３４３頁、１９９７年）。発現の空間的制御は、また、電離放射線（放射線治療）をｅｒｇ１遺伝子のプロモーターと組み合わせて用いて実現することができている。このような制御配列を含む構築物は、本発明の範囲内である。
【００３９】
発現ベクターを含めた、本明細書に記載する核酸分子を含む宿主細胞も、本発明の範囲内である。細胞は原核生物でも真核生物でもよい。適切な原核生物細胞は細菌の細胞を含み、適切な真核生物細胞は哺乳動物、鳥類、および魚類の細胞を含む。細胞系は、確立され公共の保管場所に保管されているものを含み、宿主細胞として用いることもできる。これらのあらゆる細胞を、特に核酸配列を最適化する過程で使用することができる。細胞は、健常であるとも疾患を有するとも考えることができる（例えば、細胞が炎症により影響を受けることもあり、あるいは望ましくない（例えば、望ましくなく早い）速度で形質転換され、かつ／または増殖するものであってもよい。
【００４０】
本明細書に記載する核酸、およびそれらがコードするタンパク質を、医薬組成物に含むことができる。例えば、組成物は、本明細書に記載する発現ベクター、および生理的に許容される希釈剤（例えば、通常の食塩水、またはリン酸緩衝食塩水などの生理的に許容されるバッファー）を含むことができる。確かに治療上または予防上の方策にヒト対象が意図されるが、本発明はそれだけに限定されない。医薬組成物を、家畜、ペット、動物園もしくはサーカスの動物、または野生で負傷しもしくは病んで見出された動物のために、配合し、投与してもよい。対象に関係なく、根底をなす疾患または状態を処置が完全に根治しなくても、処置は成功であるとみなすことができる。疾患の徴候あるいは症状の１つまたは複数を改善し、または疾患（例えば、神経変性疾患または癌）の進行を遅延することも有益であり、本明細書に記載した組成物を用いて実現することができる。核酸分子は、濃縮された形態で、または対象に投与するのに適する量（例えば、治療上有効な量）で存在できる。対象に投与する際に、対象で細胞のｎ−３ＰＵＦＡ含有量が増加し、かつ／またはｎ−６：ｎ−３ＰＵＦＡの比がより好ましくバランスがとれる程度まで、核酸がｎ−３不飽和化酵素を発現する場合に、投与した量が治療上有効であるとみなされる。
【００４１】
本発明は、本明細書に記載する核酸分子を含むヒト以外のトランスジェニック動物（例えば、哺乳動物、鳥類、または魚類）も含む。動物は、食用（例えば、ヒトまたは他の動物（例えば、家畜もしくはペット）による摂取）に飼われ、飼育され、捕獲され、または狩猟されるものであってよい。述べたように、哺乳動物はウシ、ブタ、またはヒツジであってよく、鳥類はニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、または猟鳥であってよく、魚類はサケ、マス、またはマグロであってよい。
【００４２】
これらのヒト以外のトランスジェニック動物、またはその組織もしくは加工された部分を含む食品または栄養補助食品も、本発明の範囲内である。製品は、（動物全体、または動物の部分すべて（例えば、関節、指関節、もしくは臓器）の場合のように）非加工でもよく、屠殺した動物またはその部分（例えば、骨、脂肪、皮膚、もしくはそれらから得た油）から加工してもよい。栄養補助食品（例えば、魚油カプセル）を製造する方法は、当技術分野では知られており、本発明の遺伝子を変更したあらゆる動物の使用に応用することができる。本発明は、本明細書に記載した動物（例えば、トランスジェニックの哺乳動物、鳥類、または魚類）から食品または栄養補助食品を製造する方法も含む。これらの方法は、現在知られているあらゆるプロセスを含むあらゆる方法で行うことができ、その供給源は、単に、本明細書に記載したように生成されたヒト以外のトランスジェニック動物（もしくはその部分）であり、またはそれを含む。
【００４３】
本発明の他の方法は、上記した食品または栄養補助食品を対象に投与することにより、対象の食餌におけるｎ−３脂肪酸の含有量を改善することを含む。対象は、明らかに健康であってもよく、あるいは癌（例えば、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、子宮頸癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、頭頸部癌、膵臓癌、血液癌、または卵巣癌）を有すると診断されていてもよい。本明細書に記載した組成物を、例えば、本明細書に記載した核酸分子の治療上有効な量を対象に投与することにより、対象におけるニューロンの細胞死を阻害する方法に用いることもできる。したがって、対象は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病）を有すると診断された者であってよい。他の処置可能な、または予防可能な状態には、不整脈、心臓血管疾患、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、網膜または脳の形成異常または切迫形成異常、糖尿病、肥満、皮膚障害、腎臓疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、または慢性閉塞性肺疾患が含まれる。対象が、生物学的な臓器、組織、または細胞を含む移植体を受け、または受ける予定であるものであってもよい。対象または移植体のいずれかに、本明細書に記載した核酸分子を投与することにより、この方法を行うことができる。
【００４４】
述べたように、本明細書に記載した核酸分子（コドン使用頻度が宿主に最適化されたものを含めて）を用いて、ヒト以外のトランスジェニック動物を産生することができる。本発明はそれだけに限定されないが、核酸は、飼育され、または他には食料源とみなされる動物を遺伝的に変更するために最も頻繁に用いられるであろうと、本発明者らは予想している。動物は、当技術分野で知られている技術を用いて産生することができる。より詳しくは、哺乳動物および魚類は、以下の実施例に記載した方法を用いて産生することができる。
【００４５】
詳しい実施形態では、本発明は、ｎ−６脂肪酸を対応するｎ−３脂肪酸に不飽和化する酵素をコードする核酸配列を含むトランスジェニック魚類またはトランスジェニック鳥類を特徴とする。トランスジェニック魚類は、タラ目タラ科のタラまたは任意の魚類、オヒョウ、ニシン目のニシンまたは任意の魚類、サバ科のサバまたは任意の魚類、マスを含めたサケ科のサケまたは任意の魚類、スズキ科のスズキまたは任意の魚類、ニシン科のシャッドまたは任意の魚類、ガンギエイ科のガンギエイまたは任意の魚類、キュウリウオ科のスメルトまたは任意の魚類、ササウシノシタ科のシタビラメまたは任意の魚類、およびサバ科のマグロまたは任意の魚類であることができる。他の魚類は、上記したものであり、当業者に知られている。
【００４６】
トランスジェニック魚類またはトランスジェニック鳥類を生成する際に、シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子を含む核酸配列を含む、本明細書に記載したあらゆる核酸配列を用いることができる。あらゆる核酸配列は、少なくとも１つの最適化されたコドンを含むことができる。例えば、配列は少なくとも５個から１５０個までの最適化されたコドンを含むことができる。詳しい実施形態では、不飽和化酵素をコードする配列の最初の供給源に関係なく、トランスジェニック鳥類またはトランスジェニック魚類を産生するために用いられる核酸分子は、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、１４５〜１５０、１０〜１２５、２５〜１００、３０〜９０、４０〜８０、５０〜７０、または約６０個の最適化されたコドンを含むことができる。一実施形態では、魚類または鳥類の中の導入遺伝子は、図１８に示した核酸の配列を含む核酸分子を含むことができる。
【００４７】
他に示されるように、最適化されたコドンの位置は、ヒト以外のトランスジェニック動物（例えば、本明細書に記載した哺乳動物、鳥類、および魚類）を生成するのに用いられる構築物で変化することがある。シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子に関しては、最適化されたコドンは、６、９、１８、２０、２２、２４、２８〜３０、３３〜３６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６１、６４、６７、６９〜７１、７３、７７、７９、８１、８６、８９、９２、９４〜９５、１００、１０１、１０５、１０６、１１２、１１５、１１８、１２４、１２７、１２８、１３１、１４６、１５１、１５４、１６１、１６３、１６４、１６９、１７８、１８７、１８８、１９５、１９７、２００、２０２、２０６、２１０、２１４、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、２２８、２３２、２３４、２４１、２４５、２５５、２７１、２８０〜２８２、２８４、２８５、３０１、３０３、３１０、３１２、３２７、３６２、または３７０の位置の１つまたは複数に見出すことができる。シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子以外の不飽和化酵素をコードする遺伝子を用いる場合、コドンはこれらの同じ位置の１つまたは複数（すべてを含む）で最適化され得る。相同遺伝子を用いる場合には（例えば、植物または菌類のｎ−３不飽和化酵素遺伝子）、最適化する位置は上記に列挙した位置に対応するものであってよい。
【００４８】
以下の実施例では、ＲＮＡ分析および酵素アッセイを行って遺伝子発現を評価し、ガスクロマトグラフィー質量分析法を用いて脂肪酸プロファイルを決定した（これらは、ｆａｔ−１配列のあらゆる変種の生物学的活性を評価するために当業者が用いることができる標準的な技術であり、またはｆａｔ−１を発現させるために患者から得たサンプルを評価するあらゆる方法を含んでいる）。
【００４９】
以下に記載した試験のいくつかは、皮質ニューロンを用いて行った。ｆａｔ−１の発現は、細胞のｎ−３：ｎ−６脂肪酸比、およびこれらのニューロンにおけるエイコサノイドプロファイルを変更しただけではなく、細胞をアポトーシスから保護し、その結果細胞の生存度を上昇させもした。より詳しく述べると、ｆａｔ−１の発現は、外因性のｎ−３ＰＵＦＡの補足なしに、脂肪酸比を変更し、増殖因子の投与中止が誘発するアポトーシスからラットの皮質ニューロンを保護した。したがって、本明細書に記載した核酸分子（および他の組成物）、をあらゆる神経変性疾患を有する未熟児に、および年長の患者に投与することができる（あるいは、その部分をその後患者が摂取する分子または他の組成物を動物に送達することができる）神経保護薬として用いることができる。ニューロンのアポトーシスに対する遺伝子導入の保護効果は、ｎ−３脂肪酸の補足の保護効果を模倣するものである。
【００５０】
ｎ−３ＰＵＦＡが欠乏すると、特に未熟児で網膜および脳の異常な発達がもたらされ（Ｕａｕｙら、Ｌｉｐｉｄｓ、３６巻、８８５〜８９５頁、２００１年）、ｎ−３ＰＵＦＡの欠乏した動物は記憶、空間および脈絡に依存する学習の欠損を示し、ならびに視覚の鋭敏さを欠く（Ｃａｒｒｉｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、２６６巻、６９〜７２頁、１９９９年；Ｙｅｈｕｄａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、５６巻、５６５〜７０頁、１９９９年）ので、ニューロンで得られた前向きな結果は特に励みとなる。ヒトにおける様々な神経学的な疾患の状態が、ｎ−３欠乏状態に関連するという指摘もある（Ｖａｎｃａｓｓｅｌら、Ｐｒｏｓｔ．Ｌｅｕｋ．Ｅｓｓ．Ｆａｔｔ．Ａｃｉｄｓ、６５巻、１〜７頁、２００１年；ＨｏｆｆｍａｎおよびＢｉｒｃｈ、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ、８３巻、５２〜６９頁、１９９８年）。
【００５１】
ＰＵＦＡの生物学的機能は、本明細書に記載する核酸分子（および他の組成物）での処置に敏感に反応する状態のタイプに効果があるので、これらの機能をさらにここに記載する。ＰＵＦＡは、膜のリン脂質の重要な構造上の構成成分であり、プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンを含むシグナリング分子（エイコサノイド）のファミリーの前駆物質である（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５５巻、６９〜１０２頁、１９８６年；ＳｍｉｔｈおよびＢｏｒｇｅａｔ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」、Ｄ．Ｅ．ＶａｎｃｅおよびＪ．Ｅ．Ｖａｎｃｅ編集、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、カリフォルニア州、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、００３２５〜３６０頁、１９８６年）。ＰＵＦＡ由来のエイコサノイドは、炎症、サイトカインの放出、免疫反応、血小板凝集、脈管反応性、血栓症、およびアレルギー現象を変調する上で重要な役割を果たす（Ｄｙｅｒｂｅｒｇら、Ｌａｎｃｅｔ、２巻、１１７〜１１９頁、１９７８年；ＣｙｅｒｂｅｒｇおよびＢａｎｇ、Ｌａｎｃｅｔ、２巻、４３３〜４３５頁、１９７９年；Ｊａｍｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７巻、３４３Ｓ〜３４３８Ｓ頁、２０００年；Ｃａｌｄｅｒ、Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．、４１巻、２０３〜２３４頁、１９９７年）。これらのシグナリング化合物の主要な脂肪酸前駆物質は、シリーズ２化合物の主要な合成を担うｎ−６基質を提供するアラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ６）、およびさらなる二重結合を有する多くのシリーズ３のエイコサノイドのパラレル合成を担うｎ−３基質であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ３）である。リン脂質におけるｎ−６：ｎ−３比は、ＡＡおよびＥＰＡに由来する２および３シリーズのエイコサノイド間のバランスを調節する。ＡＡ（シリーズ２）およびＥＰＡ（シリーズ３）由来のエイコサノイドは、機能的に異なり、いくつかの重要な対立する生理学的機能を有する（Ｄｙｅｒｂｅｒｇら、Ｌａｎｃｅｔ、２巻、１１７〜１１９頁、１９７８年；ＣｙｅｒｂｅｒｇおよびＢａｎｇ、Ｌａｎｃｅｔ、２巻、４３３〜４３５頁、１９７９年；Ｊａｍｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７巻、３４３Ｓ〜３４３８Ｓ頁、２０００年；Ｃａｌｄｅｒ、Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．、４１巻、２０３〜２３４頁、１９９７年）。シリーズ３のエイコサノイドは弱い作動物質であり、または、ある場合には、シリーズ２エイコサノイドの拮抗物質である。例えば、２シリーズのエイコサノイドは炎症および血小板凝集を促進し、免疫反応を活性化するが、シリーズ３のエイコサノイドはこれらの作用を回復させる傾向がある。さらに、遊離脂肪酸の形態のＰＵＦＡは、遺伝子の発現および細胞間の細胞間情報交換に関与する（Ｐｒｉｃｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ、１１巻、３〜７頁、２０００年；Ｓｅｌｌｍａｙｅｒら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、追補Ｓ３７〜Ｓ４０頁、１９９６年；ｖｏｎＳｃｈａｃｋｙ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２８巻、５〜６頁、１９９６年）。このように、ＰＵＦＡは、多くの様々な生物学的効果を表すことができる。
【００５２】
本明細書に記載した組成物および方法を、様々な特定の状態を処置し、また最初の健康状態（例えば、不良、平均、または良好）に関係なく一般的な健康を増進するために用いることができる。ｎ−３ＰＵＦＡの投与による処置に敏感に反応するあらゆる状態は、ｎ−３不飽和化酵素をコードする遺伝子（例えば、シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子）の投与を含めた、本発明の方法による処置に敏感に反応する。処置に敏感に反応する状態のいくつかを、本明細書に記載してある。
【００５３】
ｎ−３ＰＵＦＡは、薬物および栄養補助化合物として、かなりの注目を集めている（Ｃｏｎｎｏｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７０巻、５６０Ｓ〜５６９Ｓ頁、１９９９年；Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７０巻、５６２Ｓ〜５６９Ｓ頁、１９９９年；Ｓａｌｅｍら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、Ｓ１〜Ｓ３２６頁、１９９６年）。過去２５年の間に、４５００を超える研究で、ｎ−３脂肪酸がヒトの代謝および健康（例えば、心臓血管上の健康）に及ぼす効果が探索されている。疫学から細胞培養まで、および動物試験から無作為の対照試験まで、オメガ−３脂肪酸の心臓保護効果が認められている（ＬｅａｆおよびＫａｎｇ、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ．、８３巻、２４〜３７頁、１９９８年；Ｄｅ Ｃａｔｅｒｉｎａら編集、「ｎ−３ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９９年、１６６頁；Ｏ’ＫｅｅｆｅおよびＨａｒｒｉｓ、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．、７５巻、６０７〜６１４頁、２０００年）。優れた有益な効果には、突然死の減少（Ａｌｂｅｒｔら、ＪＡＭＡ、２７９巻、２３〜２８頁、１９９８年；Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋら、ＪＡＭＡ、２７４巻、１３６３〜１３６７頁、１９９５年）、不整脈の危険性の減少（ＫａｎｇおよびＬｅａｆ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９４巻、１７７４〜１７８０頁、１９９６年）、血漿トリグリセリドレベルの低下（Ｈａｒｒｉｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、６５巻、１６４５Ｓ〜１６５４Ｓ、１９９７年）、ならびに血液凝固傾向の低下（Ａｇｒｅｎら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄ．Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ、５７巻、４１９〜４２１頁、１９９７年；Ｍｏｒｉら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍ．Ｂａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、１７巻、２７９〜２８６頁、１９９７年）が含まれる。疫学上の研究からの証拠が示すのは、別のｎ−３脂肪酸であるα−リノレン酸が心筋梗塞の危険性を低下させ（Ｇｕａｌｌａｒら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、１９巻、１１１１〜１１１８頁、１９９９年）、および女性における死にいたる虚血性心疾患の危険性を低下させることである（Ｈｕら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、６９巻、８９０〜８９７頁、１９９９年）。いくつかの無作為対照試験により、最近、冠状動脈疾患を有する患者における冠状動脈の罹患率および死亡率両方に対する、α−リノレン酸（ｄｅ Ｌｏｒｇｅｒｉｌら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９９巻、７７９〜７８５頁、１９９９年）および海洋のオメガ−３脂肪酸（Ｓｉｎｇｈら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇｓ Ｔｈｅｒ．、１１巻、４８５〜４９１頁、１９９７年；Ｖｏｎ Ｓｃｈａｃｋｙら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１３０巻、５５４〜５６２頁、１９９９年；ＧＩＳＳＩ−Ｐｒｅｖｅｎｚｉｏｎｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ、Ｌａｎｃｅｔ、３５４巻、４４７〜４５５頁、１９９９年）両方の有益な効果が説明されている。ｎ−３脂肪酸であるＥＰＡは、インビトロおよび実験的な癌の動物モデルで抗癌活性を発揮している（Ｂｏｕｇｎｏｕｘ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｅ、２巻、１２１〜１２６頁、１９９９年；Ｃａｖｅ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、４６巻、２３９〜２４６頁、１９９７年）。ヒトでの研究では、ＥＰＡに富む食事を摂取している集団は、著しく低い癌の発病率を示すことが示されている（ＲｏｓｅおよびＣｏｎｎｏｌｌｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、８３巻、２１７〜２４４頁、１９９９年）。ｎ−３ＰＵＦＡの補足により、関節炎などの炎症性疾患および自己免疫疾患に対する治療効果が示され（Ｋｒｅｍｅｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７１巻、３４９Ｓ〜３５１Ｓ頁、２０００年；Ａｒｉｚａ−Ａｒｉｚａら、Ｓｅｍｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、２７巻、３６６〜３７０頁、１９９８年；Ｊａｍｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７１巻、３４３Ｓ〜３４８Ｓ頁）、ヒト以外の霊長類での研究（Ｎｅｕｒｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻、４０２１〜４０２５頁、１９８６年）およびヒト新生児での研究（Ｕａｕｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｏｃ．、５９巻、３〜１５頁、２０００年；Ｕａｕｙら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、Ｓ１６７〜１７６頁、１９９６年）は、ｎ−３脂肪酸であるＤＨＡが、特に未熟児の網膜および脳の正常の機能の発達に不可欠であることを指摘している。さらに、ｎ−３ＰＵＦＡは、高血圧（Ａｐｐｅｌら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１５３巻、１４２９〜１４３８頁、１９９３年）、糖尿病（Ｒａｈｅｊａら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６８３巻、２５８〜２７１頁、１９９３年）、肥満（Ｃｌａｒｋｅ、Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．、８３巻、Ｓ５９〜６６頁、２０００年）、皮膚障害（Ｚｉｂｏｈ、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ．、６６巻、４２５〜４３５頁、１９９１年）、腎臓疾患（Ｄｅ Ｃａｔｅｒｉｎａら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、４４巻、８４３〜８５０頁、１９９３年）、潰瘍性大腸炎（Ｓｔｅｎｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１１６巻、６０９〜６１４頁、１９９２年）、クローン病（Ｂｅｌｌｕｚｚｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３４巻、１５５７〜１５６０頁、１９９６年）、慢性閉塞性肺疾患（Ｓｈａｈａｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３１巻、２２８〜２３３頁、１９９４年）、および移植臓器の拒絶反応（Ｏｔｔｏら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５０巻、１９３〜１９８頁、１９９０年）など、多くの他の臨床上の問題に有益な効果があることが示されている。一般に、身体の脂質のバランスのとれたｎ−６：ｎ−３の比は、正常の増殖および発達に不可欠であり、多くの臨床上の問題の予防および処置で重要な役割を果たしている。上記した疾患、障害、および状態は、本明細書に記載した核酸分子（および他の組成物）での処置に敏感に反応する。例えば、これらの疾患、障害、および状態は、ｎ−３不飽和化酵素をコードする発現ベクター（例えば、ｆａｔ−１遺伝子配列を含む発現ベクター）（例えば、上記したもの）を対象に投与することにより、処置し、または予防することができる。この疾患、障害、または状態は、処置し、または予防することができる。
【００５４】
最近の研究によれば（Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｕｓ、Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７９巻、９６１〜９７０頁、２０００年）、今日の食事におけるｎ−６のｎ−３に対する必須脂肪酸の比は、約１０〜２０：１である。これは、現在の西欧の食事は、ヒトが進化しヒトの遺伝子パターンが確立された食事（ｎ−６／ｎ−３＝１：１）に比べてｎ−３脂肪酸が欠乏していることを示している（ＬｅａｆおよびＷｅｂｅｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．、４５巻、１０４８〜１０５３頁、１９８７年）。ｎ−６およびｎ−３脂肪酸は、代謝上および機能上異なり、対立する重要な生理学的機能を有するので、これらのバランスは恒常性、および正常の発達に重要である。しかし、哺乳動物の細胞は酵素のｎ−３不飽和化酵素を欠くので、ヒトの体ではｎ−３およびｎ−６ＰＵＦＡは相互転換可能ではない。したがって、生物学的な膜におけるｎ−６とｎ−３ＰＵＦＡの間のバランスは、食事による供給をもとに調節される。ヒト対象または動物でｎ−３脂肪酸の組織濃度を上昇させることは、ｎ−３ＰＵＦＡを富ませた食品またはｎ−３ＰＵＦＡサプリメントの摂取を増加することによる。ｎ−３ＰＵＦＡの潜在的な治療上の作用を仮定して、国際科学ワーキンググループは、ｎ−６脂肪酸の摂取が減少しｎ−３脂肪酸の摂取が増加した食事を推薦している（Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｕ、Ｆｏｏｄ Ａｕｓｔｒａｌｉａ、５１巻、３３２〜３３３頁、１９９９年）。米国心臓協会（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）も、最近このような食事の勧告を作成した（ＡＨＡ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：２０００年改訂、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０２巻、２２８４〜２２９９頁、２０００年）。
【００５５】
ｎ−３ＰＵＦＡで食事を補足することは安全な介入であるが、数々の制限がある。例えば、インビボでｎ−３ＰＵＦＡの組織濃度の大幅な上昇を実現するには、少なくとも２〜３カ月の期間、高用量のｎ−３ＰＵＦＡを長期間摂取することを必要とする。食事から細胞への脂肪酸のバイオアベイラビリティには、脂肪の消化、吸収、輸送、および代謝を含む一連の生理学的過程が関与する。したがって、食事介入の有効性は、個体の生理学的状態および健康状態に依存する。危険な状態にある患者、または消化器障害を有する患者は、脂肪の多い食事またはｎ−３ＰＵＦＡサプリメントを消化し、または吸収することができない可能性がある。さらに、カプセル化した魚油サプリメントは、カロリー含有量が高いので、ヒトの生涯を通した日常の使用に適する可能性がない。さらに、沿岸水および湖水由来のある種類の魚を摂取すると、有毒となる量の水銀または有機毒素が含まれることがあり、有効な食事介入には、ある者にとっては耐えることができないことがある、食習慣の厳しい変更が必要となる。前述のことを考慮すると、魚または魚油サプリメントの長期摂取にたよらずに細胞のｎ−３ＰＵＦＡ含有量を迅速かつ効果的に上昇させ、ｎ−６：ｎ−３比のバランスを取る手段が大いに必要とされている。この必要性は、（その細胞が非トランスジェニック動物よりも実質的に多くのｎ−３ＰＵＦＡを含むトランスジェニックの家畜により）代替の食料源を作り出し、またはｎ−３不飽和化酵素をコードする遺伝子を患者（例えば、ヒト患者）に投与することをもたらす本発明の方法により満たされる。本方法の特定の利点は、ｎ−３ＰＵＦＡの組織濃度を上昇させるだけではなく、同時に過剰の外因性ｎ−６ＰＵＦＡのレベルも低下させることでもある。
【００５６】
実施例
実施例１：組換えアデノウィルスの構築
Ｈｅらが記載した方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、２５０９〜２５１４頁、１９９８年）と同様の以下の手順で、ｆａｔ−１遺伝子を有する組換えアデノウィルスを構築した。ｐＣＥ８中のｎ−３脂肪酸不飽和化酵素ｃＤＮＡ（ｆａｔ−１遺伝子）は、Ｊ．Ｂｒｏｗｓｅ博士（ワシントン州立大学）の好意により提供された（しかし、当業者に入手可能の情報および技術を用いて合成し、またはクローニングすることができる。Ｓｐｙｃｈａｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１１４２〜１１４７頁、１９９７年；米国特許第６１９４１６７号；図１７Ａおよび１７Ｂを参照されたい）。ｐＣＥ８のｃＤＮＡ挿入断片を、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで二重切断してプラスミドから切り出し、シャトルベクター（shuttler vector）に挿入し、次いでＨｅら（前掲）の方法にしたがってアデノウィルスのバックボーンとの組換えを行った。２つの第１世代のタイプ５の組換えアデノウィルス、すなわちサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、レポーター遺伝子として）を有するＡｄ．ＧＦＰおよびそれぞれ別々のＣＭＶプロモーターの制御下のｆａｔ−１遺伝子およびＧＦＰ遺伝子の両方を有するＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１が生じた。組換えウィルスを、先に記載したように（Ｈａｊｊａｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９５巻、４２３〜４２９頁、１９９７年）、２９３細胞で増殖させることにより高力価保存株として調製した。構築物を、酵素消化およびＤＮＡ配列分析により確認した。Ｈａｊｊａｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９５巻、４２３０４２９頁、１９９７年、およびＨａｊｊａｒら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、８１巻、１４５〜１５３頁、１９９７年も参照されたい。
【００５７】
野生型アデノウィルスの汚染を評価することができ、ＰＣＲで検出可能なＥ１配列が存在せず、かつ非許容のＡ５４９細胞系に対する細胞変性効果が存在しないことにより汚染が除外されることを示すことができる。必要または所望であれば、他のプロモーターを有する代替のアデノウィルスベクターまたはアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターを構築することができる。
【００５８】
実施例２：心筋細胞のアデノウィルスとの培養および感染
国際心筋細胞単離システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ニュージャージー州、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）を用いて、心筋細胞を１日齢のラットから単離した。単離した細胞を、６ウェルプレートに配置し、５％ウシ胎児血清および１０％ウマ血清を含むＦ−１０培地で、３７℃で組織培養インキュベーター中５％ＣＯ２、相対湿度９８％で培養した。２〜３日培養後、細胞を実験に使用した。２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地に様々な濃度（５×１０９〜１０１０ｐｆｕ）のウィルス粒子を加えてウィルス感染を行った。２４時間インキュベーション後、感染培地を、１０μＭの１８：２ｎ−６および２０：４ｎ−６を補足した通常の（１５％血清）培地で置き換えた。感染約４８時間後に細胞を使用することができる（例えば、次いで遺伝子の発現、脂肪酸の組成、生存度、または成長（例えば、増殖または分裂速度）を分析することができる）。
【００５９】
実施例３：蛍光顕微鏡およびＲＮＡ分析によるｆａｔ−１発現の検出
遺伝子発現は、分子生物学の分野で知られている多くの方法により評価することができる。ここでは、上記したように感染させた心筋細胞におけるｆａｔ−１の発現を、感染細胞の肉眼検査およびリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）プロテクションアッセイにより評価した。
【００６０】
より詳しく述べると、ＧＦＰの共発現により、本発明者らは感染し導入遺伝子を発現する細胞を同定できるようになった。感染約４８時間後に、ほとんどすべての細胞（＞９０％）が明るい蛍光を示し、遺伝子導入の効率が高く、導入遺伝子の発現レベルが高いことを示していた（図１を参照されたい）。ｆａｔ−１転写物の発現は、また、ＲＰＡＩＩＩ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮａｓｅプロテクションアッセイにより測定した。手短に述べると、ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い製造元のプロトコールに従い、全ＲＮＡを培養細胞から抽出した。ｆａｔ−１遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＥ８を線状化し、転写テンプレートとして使用した。アンチセンスのＲＮＡプローブを３３Ｐ−ＵＴＰを用いてインビトロで転写し、筋細胞から抽出した全ＲＮＡとハイブリダイズし、ＲＮａｓｅで消化し、ハイブリダイズされなかったＲＮＡおよびプローブを除去した。保護されたＲＮＡ：ＲＮＡを条件付きバッファーによる電気泳動により単離し、オートラジオグラフィーにかけた。対照として、β−アクチン遺伝子を標的とするプローブを用いた。ｆａｔ−１のｍＲＮＡは、ＡＤ．ＧＦＰ（やはり対照として使用した）に感染した細胞では検出されなかったが、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞では豊富であった（図２）。この結果は、アデノウィルスを介した遺伝子導入は、通常その遺伝子を欠くラット心筋細胞にｆａｔ−１遺伝子の非常に高い発現を付与することを示している。
【００６１】
実施例４：脂質分析；ｎ−３不飽和化酵素の脂肪酸組成に及ぼす効果
脂質分析により、心筋細胞（またはあらゆる他の細胞型）におけるｆａｔ−１遺伝子の発現によりｎ−６脂肪酸がｎ−３脂肪酸に転換されるか否か、またそれにより、細胞の脂肪酸組成が変化するか否かを決定することができる。上記したアデノウィルスでの感染の後、細胞をｎ−６脂肪酸（１０μＭ１８：２ｎ−６および１０μＭ２０：４ｎ−６）を補足した培地中で２〜３日間インキュベートした。インキュベート後、全細胞脂質の脂肪酸組成を先に記載されている（Ｋａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１１２８巻、２６７〜２７４頁、１９９２年；Ｗｅｙｌａｎｄｔら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、９７７〜９８２頁、１９９６年）ように分析した。
【００６２】
０．００５％ブチル化ヒドロキシトルエン（抗酸化剤として）を含むクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）で脂質を抽出した。１４％ＢＦ３／メタノール試薬を用いて脂肪酸メチルエステルを調製した。脂肪酸メチルエステルは、ＳｕｐｅｌｃｏｗａｘＳＰ−１０キャピラリーカラムを装着したＨＰ５８９０シリーズＩＩガスクロマトグラフにＨＰ−５９７１質量分析計を接続したものを用いて、ＧＣ／ＭＳにより定量する。注入部および検出部は、それぞれ２６０℃および２８０℃に維持する。オーブンのプログラムは、最初１５０℃で２分間維持し、次いで１０℃／分で２００℃まで上げ４分間保持し、５℃／分で２４０℃まで再度上げ３分間保持し、最後に１０℃／分で２７０℃まで上げ５分間維持する。キャリアガス流量は終始、一定の０．８ｍＬ／分で維持する。５０〜５５０原子質量単位の質量範囲を含めて全イオン検出を行う。様々な分析した脂肪酸の面積を、内部標準の一定濃度の面積と比較することにより、脂肪酸の質量を決定する。
【００６３】
Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照細胞とＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞との間で、脂肪酸のプロファイルは著しく異なっていた（図３）。さらに、Ａｄ．ＧＦＰに感染した細胞では、非感染細胞と比較して、それらの脂肪酸プロファイルに変化は表れなかった。ｆａｔ−１遺伝子（ｎ−３不飽和化酵素）を発現した細胞では、ほとんどすべての種類のｎ−６脂肪酸が対応するｎ−３脂肪酸に、すなわち１８：２ｎ−６から１８：３ｎ−３に、２０：２ｎ−６から２０：３ｎ−３に、２０：３ｎ−６から２０：４ｎ−３に、２０：４ｎ−６から２０：５ｎ−３に、および２２：４ｎ−６から２２：５ｎ−３に概ね転換された。結果として、ｆａｔ−１を発現する細胞の脂肪酸組成は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照細胞の脂肪酸組成に対して大幅に変化した（図５）。重要なことは、ｎ−６：ｎ−３の比が、対照細胞における１５：１から、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を発現する細胞における１：１．２に減少したことである。
【００６４】
実施例５：ｆａｔ−１発現に続くエイコサノイドの測定
２０：４ｎ−６（ＡＡ）および２０：５ｎ−３（ＥＰＡ）は、それぞれ２−シリーズおよび３−シリーズのエイコサノイドの前駆物質であるため、ＡＡおよびＥＰＡの含有量の違いが細胞におけるエイコサノイドの産生の違いをもたらすことがある。したがって、本発明者らは、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７で刺激した後、感染細胞におけるエイコサノイドの産生を、プロスタグランジンＥ３との交差反応性１６％でプロスタグランジンＥ２を特異的に検出するＥＩＡキットを用いることにより測定した。より詳しく述べると、プロスタグランジンＥ２を、酵素免疫測定法キット（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ社）を用いて製造元のプロトコールに従い測定した（ＰＧＥ３との交差反応性は１６％である）。培養細胞を洗浄し、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（５μＭ）を含む無血清培地中でインキュベートした。１０分間インキュベート後、順化培地を回収し、エイコサノイドの測定を行った。対照細胞が産生したプロスタグランジンＥ２の量は、ｆａｔ−１がコードするｎ−３不飽和化酵素を発現する細胞が産生したプロスタグランジンよりも有意に多かった（図４）。
【００６５】
実施例６：培養動物細胞の分析
この実施例および後の２つの実施例では、本発明者らは３つの異なる実験用のモデル：培養細胞（他のタイプの培養細胞はさらに下記で試験する）、成熟ラット、およびトランスジェニックマウスについて述べる。上記したように、培養細胞のモデルを用いて、ｎ−３不飽和化酵素がインビトロの哺乳動物細胞で発現された場合の酵素特性および生化学的効果を特徴づけることができ、成熟ラットモデルを用いて伝達されたｆａｔ−１遺伝子がインビボでｎ−３ＰＵＦＡの組織濃度を増加させることができる効力を評価することができ、トランスジェニックマウスモデルを用いてインビボで様々な組織または臓器の脂質組成に及ぼす導入遺伝子の長期効果および全身効果を評価することができる。最初の２つのモデルでは、ｆａｔ−１遺伝子の哺乳動物細胞／組織中への導入を、（組換えアデノウィルスが媒介する）アデノウィルスの遺伝子導入により行う。最後のモデルでは、遺伝子導入を、マウス受精卵中に導入遺伝子をマイクロインジェクションすることにより行う。遺伝子導入の後、導入された遺伝子の発現プロファイルを、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質分析により特徴づけることができ（例えば、上記実施例３を参照されたい）、主に細胞または組織の脂肪酸組成である生化学的効果はＧＣ−ＭＳ技術により決定する（例えば、上記実施例４を参照されたい）。エイコサノイドは酵素免疫測定法により測定する（例えば、実施例５を参照されたい）。ｆａｔ−１を発現する細胞から得たデータを、同じ（または、同様の）ウィルスに感染しているがｆａｔ−１を導入していない対照細胞または組織から得たデータと比べることにより変化を確認する。これらの試験の終点は、細胞の脂肪酸組成およびエイコサノイドプロファイルにおける生化学的変化である。
【００６６】
実質的にあらゆる動物細胞（ヒト細胞系を含む）の培養物に、組換えアデノウィルス（Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１、またはＡｄ．ＧＦＰ）を感染させることができ、その後、導入された遺伝子の発現は、ＲＮＡまたはタンパク質の分析により評価することができる。実験手順および関連する方法を、上記の実施例に記載し、図６に略述する。心筋、ニューロン、肝細胞、内皮細胞、およびマクロファージを含む様々な細胞型が、ｎ−３脂肪酸の試験に用いられている。
【００６７】
心筋細胞を上記したように（実施例２を参照されたい）単離し、培養することができ、小脳顆粒ニューロンおよび肝細胞などの他の細胞型を、Ｓｃｈｏｕｓｂｏｅらが記載した以下の方法で１〜５日齢のラットから調製することができる（「Ａ Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｓｈａｈａｒら編集、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、２０３〜２０６頁、１９８９年）。乳癌細胞系および白血病細胞系を含むヒト細胞系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＭＥＮ培地またはＲＰＭＩ１６４０で、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で培養することができる。
【００６８】
ウィルス感染は、ＦＢＳを含まない培地または２％ＦＢＳを含む培地にウィルス粒子を様々な濃度で（例えば、２×１０９〜２×１０１０ｐｆｕ）加えることにより行うことができる（実施例２も参照されたい）。２４時間インキュベーション後、感染培地を通常の（１０％ＦＢＳ）培地に置き換える。感染４８時間後に、細胞を遺伝子発現または脂肪酸組成の分析に用いることができる。導入遺伝子の発現は、蛍光タグが導入遺伝子中に含まれる場合は蛍光顕微鏡により（実施例１、および図１を参照されたい。同様に、タグは蛍光抗体により検出される抗原タンパク質であることができる）、または標準のＲＮＡアッセイ（例えば、ノーザンブロット、またはＲＮａｓｅプロテクションアッセイ）により評価することができる。ｆａｔ−１遺伝子は、通常は対照細胞中に存在しないので、対照細胞とｆａｔ−１を発現する細胞との間のｆａｔ−１ｍＲＮＡの差を明らかにするのは難しくない。
【００６９】
ｎ−３不飽和化酵素は、ｎ−３二重結合のｎ−６脂肪酸への導入を触媒し、それらの前駆物質のｎ−６脂肪酸より１つ多い二重結合を有するｎ−３脂肪酸の形成をもたらす（例えば、１８：２ｎ−６→１８：３ｎ−３、２０：４ｎ−６→２０：５ｎ−３）。基質を産物に転換する速度（所与の時間中に形成される産物の量）は、不飽和化酵素の発現／活性に直接比例すると考えられている。したがって、動物から得たサンプル（例えば、組織サンプル）から、または培養細胞で以下の方法を用い転換（産物の量）を測定することにより、この酵素の機能活性を決定することができる。
【００７０】
基質として放射能標識したｎ−６脂肪酸を用いた脂肪酸不飽和化アッセイ
アッセイは、Ｋａｎｇらが記載した以下のプロトコールを行うことができる（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１１２８巻、２６７〜２７４頁、１９９２年）。手短に述べると、ＢＳＡに結合している様々に標識したｎ−６脂肪酸（例えば、［１４Ｃ］１８：２ｎ−６、［１４Ｃ］２０：４ｎ−６）を、無血清培地に加え、細胞とともに４〜６時間インキュベートする。その後、細胞および培地を回収する。脂質を抽出しメチル化する（下記を参照されたい）。ＡｇＮＯ３を含浸させたシリカゲルＴＬＣプレート上で、不飽和の程度（すなわち、二重結合の数）にしたがって、標識した脂肪酸メチルエステルを単離する。標準と比較して、様々な二重結合を有する脂肪酸を含むバンドを同定することができる。標識した脂肪酸の量をシンチレーション計数により測定し、対照細胞とｆａｔ−１遺伝子発現細胞との間でデータを比較する。
【００７１】
ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸の分析
脂肪酸の転換は、ガスクロマトグラフィー質量分析を用いて脂肪酸組成を分析することにより、より正確に測定することができる（下記を参照されたい）。この方法を用いれば、放射標識した脂肪酸は必要とされない。ｎ−３不飽和化酵素遺伝子を発現する培養細胞の脂肪酸含有量を、様々な基質の存在下で分析することができる。対照細胞とｆａｔ−１遺伝子を発現する細胞との間の脂肪酸のプロファイルを比較することにより、各脂肪酸の転換を測定することができる。
【００７２】
細胞のすべての脂質またはリン脂質の脂肪酸組成を、先に記載したように分析することができる（Ｋａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１１２８巻、２６７〜２７４頁、１９９２年；Ｗｅｙｌａｎｄｔら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、９７７〜９８２頁、１９９６年）。手順は以下の通りである。
【００７３】
脂質の抽出（実施例４も参照されたい）
０．００５％ブチル化ヒドロキシトルエン（抗酸化剤として）を含むクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）５ｍｌを、洗浄した細胞ペレットに加え、１分間激しくボルテックスにかけ、次いで４℃で一夜放置する。０．８８％ＮａＣｌ １ｍｌを加え、再び混和する。脂質を含むクロロホルム相を回収する。残渣をもう１度、２ｍｌのクロロホルムで抽出する。クロロホルムをプールし、窒素下で乾燥させ、密封した試験管中−７０℃で貯蔵する。
【００７４】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による脂質の単離
ＴＬＣプレートを、１００℃で６０分間活性化する。ＴＬＣ展開槽を、使用の少なくとも１時間前に溶媒で平衡にする。石油エーテル／ジエチルエーテル／酢酸（体積で８０：２０：１）からなる溶媒系を用いて、３０〜３５分間シリカゲルＧプレート上にサンプルを流して、すべてのリン脂質およびトリアシルグリセロールを単離する。個々のリン脂質をＴＬＣにより、以下の溶媒系を用いてシリカゲルＨプレート上で単離する。クロロホルム／メタノール／２−プロパノール／０．２５％ＫＣｌ／トリエチルアミン（体積で、３０：９：２５：６：１８）。脂質を含むバンドを、０．０１％８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸で可視化し、各脂質分画のゲルを掻き取ったものをメチル化用に回収する。
【００７５】
脂肪酸のメチル化
１４％ＢＦ３／メタノール試薬を用いて、脂肪酸メチルエステルを調製する。ヘキサン１または２ｍｌおよびＢＦ３／メタノール試薬１ｍｌを、テフロン加工のキャップ付ガラス試験管中の脂質サンプルに加える。窒素を流した後、サンプルを１００℃で１時間加熱し、室温に冷却し、メチルエステルをヘキサン相中に抽出し、続けてＨ２Ｏ １ｍｌを加える。サンプルを２０〜３０分間静置し、上部のヘキサン層を除去し、ＧＣ分析用に窒素下で濃縮する。
【００７６】
ガスクロマトグラフィー質量分析
メチル化したサンプルを、１００〜２００μｌのヘキサンまたはイソオクタン中で再構成し、その１〜２μｌをガスクロマトグラフィーにより分析する。Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０Ａガスクロマトグラフ（ペンシルバニア州、Ａｖｏｎｄａｇｅ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）で、Ｏｍｅｇａｗａｓカラム（３０ｍ；ペンシルバニア州、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いる。キャリアガスは水素（２．３９ｍｌ／分）で、分割比１：３１で注入する。温度は最初１６５℃で５分間、次いで２．５℃／分で１９５℃に上げ、そこから５℃／分で２２０℃まで上げる。温度を１０．５分間保持し、次いで２７．５℃／分で１６５℃まで下げる。ピークは、脂肪酸標準物質（ミネソタ州、Ｅｌｙｓｉａｎ、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ−Ｐｒｅｐ）と比較して同定し、解析したすべてのピークに対する面積のパーセント値を、Ｐａｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＭ１インテグレータを用いて分析する（コネチカット州、Ｎｏｒｗｏｏｄ、Ｐａｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）。これらの分析条件で、鎖長における炭素Ｃ１４からＣ２５までのすべての飽和、モノ、ジ、および多価不飽和脂肪酸を単離する。サンプルを加えるときに、外部標準をもとにサンプルサイズを計算する。さらに、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ質量選択検出器（モデル５９７２）を用い、イオン化電圧７０ｅＶ、スキャンレンジ２０〜５００Ｄａで操作して、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を実施する。得られたあらゆる新しいピークのマススペクトルを、データベースＮＢＳ７５Ｋ．Ｌ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）における標準（ミネソタ州、Ｅｌｙｓｉａｎ、Ｎｕ Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ）のマススペクトルと比較する。
【００７７】
実施例７：インビボにおけるｎ−３不飽和化酵素遺伝子導入の評価
ここに記載する実施例により、ｆａｔ−１遺伝子を動物の組織または臓器（例えば、心臓）に導入できるようになり、そこで酵素の産物は、ｎ−３ＰＵＦＡの含有量を増加させｎ−６ＰＵＦＡの含有量を減少させることにより、脂肪酸のプロファイルを速やかに最適化することができる。心臓を遺伝子導入のための実験の標的として選択するのは、心臓はｎ−３脂肪酸に関して十分に研究されており、生命維持に必要な臓器であるからである。
【００７８】
２カ月間通常の食餌またはｎ−６ＰＵＦＡの高い食餌を与えた成熟ラットを無作為化して、ｆａｔ−１遺伝子を有するアデノウィルス（Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１）またはレポーター遺伝子のＧＦＰを有するアデノウィルス（Ａｄ．ＧＦＰ、対照として）のいずれかを与えた。アデノウィルスは、カテーテルベースの技術を用いて生存動物の心臓に送達され、これは心臓全体で非常に均一な発現パターンを生成することができる（Ｈａｊｊａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、５２５１０５２５６、１９９８年）。感染（遺伝子導入）２日後、４日後、１０日後、３０日後、および６０日後に、動物を屠殺し、その心臓を回収し、導入遺伝子の発現の測定および脂肪酸組成の分析のために使用する。別のグループのラットは、遺伝子導入を行わずにｎ−３脂肪酸に富む（ｎ−６／ｎ−３比の低い）食餌を２カ月間与え、参照として用いる。これらの実験（動物に異なる食餌を与え、様々な時間点でサンプルを回収する）は、ｆａｔ−１遺伝子の導入が食餌の介入（すなわち、ｎ−３ＦＡの補足）により引き起こされるものと同様、またはそれに勝る望ましい生化学的効果（ｎ−６／ｎ−３比、エイコサノイドプロファイル）を生じることができるか否か、脂肪酸組成の著しい変化をどれほど速やかに実現することができるか、また変化がどのくらい長く続くことができるかを決定するためにデザインされている。レポーター（ＧＦＰ）遺伝子を注入したラットを対照として用いる（本発明者らの予備試験ではＧＦＰの遺伝子導入は脂肪酸の組成に効果がないことを示していた）。実験のフローチャートを図７に示す。
【００７９】
動物および食餌
体重をマッチさせたスプレーグ−ドーリー成熟ラットを、無作為に３グループに割り当てる。各グループに、３つの異なる食餌の１つを与える。通常（ベース）食、高ｎ−６食、または高ｎ−３食。これらの食餌は以下のように調製する。
【００８０】
ベース食：市販の無脂肪ラット食（ニューヨーク州、Ｓｙｒａｃｕｓｅ、Ａｇｗａｙ Ｉｎｃ．Ｃ．Ｇ．）に２％（ｗ／ｗ）トウモロコシ油を加える。高ｎ−６食：ベース食にさらなる１３％（ｗ／ｗ）トウモロコシ油またはベニバナ油（ｎ−６脂肪酸に富む）を添加して補足し、最終の食餌を全脂肪分１５％とする。高ｎ−３食：ベース食に１３％（ｗ／ｗ）魚油（３０％ＥＰＡ、２０％ＤＨＡ、６５％全ｎ−３ＰＵＦＡ）（オスロ、Ｐｒｏｎｏｖａ Ｂｉｏｃａｒｅ Ａ／Ｓ）を補足し、最終の食餌を全脂肪分１５％とする。このグループはこの試験の対照グループの役割を果たす。
【００８１】
食餌は、毎週小さなバッチで調製し、−２０℃で保存し、必要量を毎日解凍する。長鎖多価不飽和脂肪酸の酸化を防ぐために、ビタミンＥ（脂肪１００ｇあたり１００ｍｇ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（最終濃度０．０５％）を加える（ＢＨＴは、調製および貯蔵の間中不飽和脂肪酸の自動酸化を防ぐ作用をする）。動物が確実に十分な栄養を得るために、全グループのラットの体重を毎週測定する。食餌開始８週間後、動物に遺伝子導入を受けさせる。
【００８２】
アデノウィルス送達プロトコール
アデノウィルスの心臓への送達は、Ｈａｊｊａｒらが記載した（前掲）技術と同様のカテーテルベースの技術を用いて行う。手短に述べると、ラットに腹腔内のペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、人工呼吸器上に置く。左側から第３肋間腔を通して胸に入る。心膜を開き、左室心尖部に７〜０縫合を配置する。大動脈と肺動脈を確認する。アデノウィルス２００μＬ（９〜１０×１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）を含む２２ゲージのカテーテルを左室（ＬＶ）心尖部から大動脈起始部に進める。大動脈および肺動脈をカテーテルの部位の遠位でクランプ固定し、溶液を注入する。心臓が閉鎖系に（同体積に）対して拍動する間１０秒間、クランプを維持する。１０秒後、大動脈および肺動脈上のクランプを開放し、胸を閉じ、動物から抜管し、ケージに戻す。
【００８３】
遺伝子導入の２、４、１０、３０、および６０日後に、動物を屠殺し、ウィルスに感染したこれらの心臓を取り出し、食塩水で灌流または洗浄して血液をすべて除き、組織の部分を脂質分析およびエイコサノイド測定用に−８０℃で速やかに凍結する。残りの組織をｍＲＮＡレベルおよび／またはｎ−３不飽和化酵素のタンパク質レベルの測定のために用いる。
【００８４】
脳および肝臓などの他の臓器も、血流に入ったアデノウィルスにより高レベルで感染している可能性がある。したがって、他の臓器も、心臓に加えて、導入遺伝子発現および脂質プロファイルの分析用に回収する。
【００８５】
培養細胞の意味合いで上記したように、導入遺伝子発現の評価を含む他の方法（ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、またはインサイチュハイブリダイゼーションによる）、脂肪酸組成の分析、エイコサノイドの測定、および統計学的分析を行う。
【００８６】
実施例８：トランスジェニック動物
ここに記載する試験は、ｆａｔ−１遺伝子を全体的に発現するトランスジェニックマウスを産生するために、また、これらの動物の組織および臓器の脂質プロファイルを特徴づけるためにデザインされている。トランスジェニックマウスは、インビボで、ある遺伝子の生理学的意義を評価するための価値あるモデルとなっている。トランスジェニックマウスが入手可能であることから、本発明者らは、ある動物の寿命の様々な段階において、様々な細胞型における導入遺伝子の効果が研究できる。このｎ−３トランスジェニックマウスのモデルは、成長および細胞生物学における、ｎ−３ＰＵＦＡおよびそれに由来する化合物の役割を解明する新しい機会を提供する。
【００８７】
ｆａｔ−１遺伝子を全体的に発現することができるトランスジェニック動物を産生するために、ｆａｔ−１遺伝子およびニワトリβ−アクチンプロモーターを、広範囲の細胞型で高度に活性であり、したがって導入遺伝子が高レベルで広範に発現できるようにするＣＭＶエンハンサー（ＣＡＧプロモーター）とともに含む発現ベクターを使用することができる（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１０８巻、１９３〜１９９頁、１９９１年；Ｏｋａｂｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４０７巻、３１３〜３１９頁、１９９７年）（トランスジェニック魚類を、以下に詳しく記載する）。トランスジェニックマウスを産生するために、発現構築物をＣ５７ＢＬ／６ＸＣ３Ｈマウスの１細胞胚の前核中にマイクロインジェクションする。マウスを飼育し、トランスジェニックマウス系統を確立する。離乳仔マウスに、通常食または高ｎ−６ＰＵＦＡ食のいずれかを与える。導入遺伝子の発現レベルを評価し、脂肪酸の組成を決定するために、様々な齢の（新生仔、１カ月までの離乳、６カ月までの成体、および１２カ月までの老齢、１時点あたり３〜５匹のマウスを用いる）これらの動物から、様々な組織を回収する。血漿および様々な組織におけるエイコサノイドのレベルも測定する。同じ食餌（通常食または高ｎ−６食のいずれか）を与えた野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）のグループを、対照として用いる。結果を、同じ食餌を与えた野生型の動物から得た結果と比較する。手順を図８に図示する。
【００８８】
導入遺伝子は、Ｏｋａｂｅら（前掲）が記載した方法と同様の方法により調製する。手短に述べると、ｆａｔ−１遺伝子をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより５−ａｇａａｔｔｃｇｇｃａｃｇａｇｃｃａａ ｇｔｔｔｇａｇｇｔ−３’（配列番号１）および５’−ｇｃｃｔｇａｇｇｃｔｔｔａｔｇｃａｔｔｃａａｃｇｃａｃｔ−３’（配列番号２）のプライマーで、テンプレートとしてｐＣＥ−ｆａｔ１（ワシントン州立大学、Ｊ．Ｂｒｏｗｓｅ博士より提供）を用いて増幅する。ｆａｔ−１のどちら側にもさらなるアミノ酸配列は付加されない。ＰＣＲ産物をＤＮＡシークエンシングにより確認する。ＰＣＲプライマーに含まれるＥｃｏＲ１およびＢｇｌ−ＩＩの部位を用いて、増幅したｆａｔ−１ｃＤＮＡを、ニワトリのβ−アクチンのプロモーターおよびサイトメガロウィルスのエンハンサー、β−アクチンのイントロンおよびウシグロビンのポリアデニレーションシグナル（大阪大学医学部、Ｍｉｙａｚａｋｉ博士より提供）を含む、ｐＣＡＧＧＳ発現ベクターに導入する。プロモーターおよびコード配列を有する全挿入断片を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌ１で切り出しゲルで精製する。
【００８９】
精製したＢａｍＨＩおよびＳａｌＩフラグメントを、Ｃ５７ＢＬ／６ＸＣ３Ｈ受精卵中に注入することにより、トランスジェニックマウス系を産生する。ＤＮＡを注入した卵を、偽妊娠したマウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１）に移植してトランスジェニックマウスを産生する。ファウンダートランスジェニックマウスは、尾部ＤＮＡのＰＣＲ分析およびサザンブロッティング分析により同定し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させる。子孫（ヘテロ接合体またはホモ接合体のいずれか）を、導入遺伝子または表現型の発現レベルに応じて用いる。
【００９０】
離乳期のトランスジェニックマウスに、通常食または高ｎ−６ＰＵＦＡ食のいずれかを与える（上記を参照されたい）。動物を様々な齢（新生仔、１カ月までの離乳仔、６カ月までの成体、および１２カ月までの老齢、１時点あたり３〜５匹のマウスを用いる）で屠殺し、様々な組織を回収して導入遺伝子の発現レベルを評価し、脂肪酸組成を決定する。結果を、同じ食餌を与えた野生型の動物からの結果と比べる。
【００９１】
導入遺伝子の発現の評価（ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、またはインサイチュハイブリダイゼーション）、脂肪酸の組成の分析、エイコサノイドの測定、および統計学的分析を含めた他の方法を、上記したように行う。
【００９２】
上記に提供した教示に概ね従い、本発明者らは、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素をコードするシー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを産生した。これらのマウスは、ｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸を産生することができ、筋肉およびミルクを含むほとんどすべての臓器および組織で、ｎ−３脂肪酸が豊富になりｎ−６脂肪酸のレベルが減少することになり、食餌のｎ−３脂肪酸を提供する必要がない。この業績は、このような動物（すなわち、ｆａｔ−１核酸配列の産物を効果的に発現し、または過剰発現するあらゆる動物）は独特の研究手段であり、ヒトおよび他の動物の栄養上の必要満たすために用いることができるｎ−３脂肪酸の新しく理想的な供給源であるという本発明者らの理論を支持している。
【００９３】
マウスでシー・エレガンスのｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を非相同に発現させるために、このタンパク質をコードするｆａｔ−１遺伝子を、原型から哺乳動物の細胞にコドンの使用頻度を最適化することにより改変し、広範囲の細胞型で高度に活性でありその結果マウスにおける導入遺伝子の高レベルで広範な発現を可能にする、ニワトリのβ−アクチンのプロモーターおよびサイトメガロウィルスのエンハンサーと結合させる（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１０８巻、１９３〜１９９頁、１９９１年；Ｏｋａｂｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４０７巻、３１３〜３１９頁、１９９７年）。
【００９４】
トランスジェニックファウンダーマウスおよびその子孫からのＦ１仔におけるｆａｔ−１の発現を、尾部ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲにより、および尾部脂質の分析により試験した。トランスジェニックマウスは、正常かつ非常に健康に見受けられた。トランスジェニックマウスも、野生型マウスも、オメガ−６脂肪酸（主にリノール酸）に富みオメガ−３脂肪酸が非常に少ない（供給された全脂質の約０．１％）食餌で維持した。このｎ−３の欠乏した食餌を与えることで、本発明者らは表現型を容易に区別することができた。この食餌レジメンでは、野生型のマウスは生来ｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸を産生することができないのでこの動物の組織にはｎ−３脂肪酸がほとんどまたはまったくないが、導入遺伝子がインビボで機能しうる場合にはｆａｔ−１導入遺伝子マウスはその組織中にかなりの量の（ｎ−６脂肪酸に由来する）ｎ−３脂肪酸を有するはずである。
【００９５】
トランスジェニックマウス系の表現型は主に脂質プロファイルに反映されるので、本発明者らは、様々な年齢のトランスジェニックマウスの様々な臓器の脂肪酸組成を、ガスクロマトグラフィー質量分析計により分析した。
【００９６】
興味深いことに、トランスジェニック動物の筋肉がこれらの比で最も顕著な変化を有し、この組織の酵素活性が最も高いことを示している。現在まで、トランスジェニックマウス系の４世代（ホモ接合体またはヘテロ接合体のいずれか）を試験したが、これらの組織の脂肪酸プロファイルはｎ−３脂肪酸が常に高レベルであることを示し、導入遺伝子がインビボで機能的に活性であり遺伝可能であることを指摘した。本発明者らのデータは、ｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニックマウスはｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸を産生することができ、結果として食餌によるｎ−３の供給を必要としないでそれらの臓器／組織におけるｎ−３脂肪酸を豊富にするが、これは野生型の哺乳動物では不可能であることを明確に示している。
【００９７】
本発明者らの発見は、ｎ−３不飽和化酵素遺伝子を有する、大型のトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、シカ、ニワトリ、および他の家禽（例えば、ガチョウ、アヒル、キジ、および猟鳥））、および／またはトランスジェニック魚類、または飼育されもしくは川、湖水、小川、もしくは海に住む他の食用動物を産生することにより、ｎ−３ＰＵＦＡに富む食料品（例えば、肉、ミルク、および卵）を生成するための新規の方策を提供する。
【００９８】
動物を産生するのに用いる方法を、下記により詳しく記載する。
【００９９】
発現ベクター
ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素をコードするｃＤＮＡを、シー・エレガンスからクローニングしたｆａｔ−１の配列に基づいて（Ｓｐｙｃｈａｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１１４２〜１１４７頁、１９９７年）、参照としてマウスのコドン頻度を用いてコドン使用頻度を変更して合成した。合成したｆａｔ−１ｃＤＮＡを、ＤＮＡシークエンシングにより確認し、次いでニワトリβ−アクチンのプロモーターおよびサイトメガロウィルスのエンハンサー、β−アクチンイントロンおよびウシグロビンのポリアデニレーションシグナルを含むｐＣＡＧＧＳ発現ベクター中にクローニングした。プロモーターおよびコード配列を含む全挿入部分を、ＳｓｐＩおよびＳｆｉＩで切り出し、ゲルで精製した。
【０１００】
トランスジェニックマウスの作製
精製したＳｓｐＩおよびＳｆｉフラグメントをＣ５７ＢＬ／６ＸＣ３Ｈ受精卵中に注入することにより、トランスジェニックマウス系を作製した。ＤＮＡを注入した卵を、偽妊娠したマウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１）に移植してトランスジェニックマウスを産生した。ファウンダートランスジェニックマウスを、尾部ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲおよび尾部組織の脂質分析により同定し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配した。本発明者らは、７匹のトランスジェニックファウンダーを得た。それらのうち３匹を選択して、トランスジェニック系の雄親とした。それぞれ、現在まで３世代である。
【０１０１】
動物の食餌
トランスジェニックマウスも野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスも、ベニバナ油５％（ｗ／ｗ）を含むＡＩＮ−７６ベースのげっ歯類食で維持した。ベニバナ油の脂肪酸組成は以下の通りである。１０％飽和脂肪酸、１４％モノ不飽和脂肪酸、７６％ｎ−６多価不飽和リノール酸、および〜０．１％ｎ−３多価不飽和α−リノレン酸。
【０１０２】
脂質分析
全組織脂肪の脂肪酸組成を、先に記載したように分析した（Ｋａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１１２８巻、２６７〜２７４頁、１９９２年）。脂質を、０．００５％ブチル化ヒドロキシトルエン（抗酸化剤として）を含むクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）で抽出した。脂肪酸メチルエステルを、１４％ＢＦ３／メタノール試薬を用いて調製した。脂肪酸メチルエステルを、水素炎イオン化検出器を装備した全自動のＨＰ５８９０システムを用いてガスクロマトグラフィーにより分析した。クロマトグラフィーは、Ｏｍｅｇａｗａｘ２５０キャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．）を利用した。オーブンプログラムは、最初１８０℃で５分間維持し、次いで２℃／分で２００℃まで上げ、４８分間保持する。ピークを脂肪酸標準物質（ミネソタ州、Ｅｌｙｓｉａｎ、Ｎｕ−ｃｈｅｋ−Ｐｒｅｐ）と比較して同定し、すべての解析したピークの面積のパーセント値をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｍ１インテグレータを用いて分析した。脂肪酸の質量を、分析した様々な脂肪酸の面積を、外部標準を添加したときの定濃度の面積と比較して決定した。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
実施例９：ニューロンの細胞死の阻害
組換えアデノウィルス（Ａｄ）の構築
ｆａｔ−１遺伝子を有する組換えＡｄを、先に記載したように構築した（Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、４０５０〜４０５４頁、２００１年、上記も参照されたい）。使用したｎ−３脂肪酸不飽和化酵素のｃＤＮＡ（ｆａｔ−１遺伝子）は、上記したものであり、プラスミドｐＣＥ８中に供給された。ｆａｔ−１ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩの消化でプラスミドから切り出し、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクター中に挿入した。構築物を引き続き、アデノウィルスのバックボーンベクター（ｐＡｄＥａｓｙ１）で相同に組み換えて、それぞれ別々のＣＭＶプロモーターの制御下で２つのクローン、すなわちレポーターまたはマーカーとしてＧＦＰを発現するＡｄ−ＧＦＰ、およびｆａｔ−１もＧＦＰ遺伝子も有するＡｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１を生成した。組換えアデノウィルスベクターのＤＮＡを、ＰａｃＩで消化した。線状化したベクターのＤＮＡをＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ）と混合し、２９３細胞に感染させるのに使用した。組換えウィルスを、２９３細胞で増殖させることにより高力保存価株として調製した。構築物の完全さを酵素消化（すなわち、制限酵素地図作成）およびＤＮＡシークエンシングにより確認した。精製したウィルスを点検し、その配列を再びＰＣＲ分析により確認した。
【０１０５】
組織培養およびＡｄでの感染
ラットの皮質ニューロンを、標準の技法を用いて調製した。手短に述べると、出生前胎仔１７日目（Ｅ１７）ラットの皮質ニューロンを解離し、ポリリジンでコートしたウェルに、２×１０６細胞／ウェルで接種した。細胞を、２５ｍＭグルタミン酸（ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、０．５ｍＭグルタミン、１％抗生物質−抗真菌性物質溶液、および２％Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地（ＮＢＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖させた。培養物を、５％ＣＯ２および相対湿度９８％の空気中、３７℃に保った。培地を４日ごとに交換した。８〜１０日後の培養物に、細胞は、Ａｄ−ＧＦＰプラスミド（対照）またはＡｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１のプラスミドのいずれかに形質移入した。培地にウィルス粒子を加えて、ウィルス感染を行った。４８時間インキュベート後、細胞を、遺伝子発現、脂肪酸組成、エイコサノイド産生、およびアポトーシス誘発の分析に使用した。
【０１０６】
ＲＮＡ分析
ＲＮａｓｅプロテクションアッセイでＲＰＡＩＩＩ（登録商標）キット（テキサス州、Ａｕｓｔｉｎ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ｍＲＮＡ転写物をプローブしてｆａｔ−１発現のレベルを測定した。手短に述べると、全ＲＮＡ単離試薬（ＴＲＩｚｏｌ、ＧＩＢｃｏ ＢＲＬ）を用いて製造元のプロトコールに従い、培養細胞から全ＲＮＡを抽出した。ｆａｔ−１遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＥ８を線状化し、転写テンプレートとして使用した。アンチセンスＲＮＡプローブを、インビトロで［３３Ｐ］−ＵＴＰ、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）Ｔ７キット、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写し、ニューロンから抽出した全ＲＮＡ（１５μｇ）でハイブリダイズし、リボヌクレアーゼで消化してハイブリダイズしなかったＲＮＡおよびプローブを除去した。保護されているＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、変性５％シークエンスゲルに溶解し、オートラジオグラフィーにかけた。β−アクチン遺伝子を標的とするプローブを内部標準として使用した。ｆａｔ−１ｍＲＮＡはＡｄ−ＧＦＰに感染した細胞（対照）では検出されなかったが、Ａｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染した細胞中では非常に豊富であった。
【０１０７】
細胞は、蛍光顕微鏡でも試験した。ｆａｔ−１遺伝子を発現する感染した細胞は、ＧＦＰを共発現するので容易に同定可能であった。感染４８時間後、ニューロンの３０〜４０％が感染し、ＧＦＰを発現した。この結果は、Ａｄが媒介する遺伝子導入は、通常ｆａｔ−１遺伝子を欠くラットの皮質ニューロンにｆａｔ−１遺伝子の高度な発現を付与することを説明している。
【０１０８】
脂質分析
全細胞脂質の脂肪酸組成を、Ｋａｎｇらの記載した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、４０５０〜４０５４頁、２００１年）ように分析した。脂質を、０．００５％ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、抗酸化剤として）を含むクロロホルム：メタノール（２：１、体積：体積）で抽出した。脂肪酸メチルエステルを、１４％（重量／体積）ＢＦ３／メタノール試薬を用いて調製した。脂肪酸メチルエステルを、Ｓｕｐｅｌｃｏｗａｘ（登録商標）ＳＰ−１０キャピラリーカラム（ペンシルベニア州、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を装着したＨＰ−５８９０シリーズＩＩガスクロマトグラフをＨＰ−５９７１質量分析計に接続したものを用いてＧＣ／ＭＳで定量した。注入部および検出部は、それぞれ２６０℃および２８０℃に維持する。オーブンプログラムは、最初１５０℃で２分間維持し、次いで１０℃／分で２００℃まで上げ、４分間保持し、再び５℃／分で２４０℃まで上げ、３分間保持し、１０℃／分で最終的に２７０℃まで上げ、５分間維持する。キャリアガス流量は、終始０．８ｍｌ／分の一定に維持する。５０〜５５０原子質量単位からの質量範囲を含めて全イオン検出を行う。脂肪酸の質量は、分析した様々な脂肪酸の面積を内部標準の一定濃度の面積と比べることにより決定する。
【０１０９】
ｆａｔ−１の発現は、ｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸への転換をもたらし、したがって、ｎ−６：ｎ−３脂肪酸の比の著しい変化をもたらした。対照細胞から得られた脂肪酸プロファイルは、Ａｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染した細胞のものとは著しく異なっている（図９。図１０も参照されたい）。Ａｄ−ＧＦＰに感染した細胞は、非感染の細胞と比較した場合に脂肪酸組成に変化を示さなかった。ｎ−３不飽和化酵素を発現する細胞では、ほとんどすべてのタイプのｎ−６脂肪酸が対応するｎ−３脂肪酸に、すなわち、１８：２ｎ−６から１８：３ｎ−３に、２０：４ｎ−６から２０：５ｎ−３に、２２：４ｎ−６から２２：５ｎ−３に、および２２：５ｎ−６から２２：６ｎ−３に転換された。ｆａｔ−１遺伝子を発現する細胞の脂肪酸組成の変化は、ｎ−６：ｎ−３比を対照細胞における６．４：１からｎ−３不飽和化酵素を発現する細胞における１．７：１に減少させる結果になった。シー・エレガンスのｎ−３脂肪酸不飽和化酵素の発現は、形質移入した細胞でＤＨＡレベルの大幅な上昇をもたらした。ＥＰＡおよびＡＬＡのレベルの上昇が観察され、それに伴いＡＡおよびＬＡが低下し、これはＰＧＥ２の産生の減少はｎ−６：ｎ−３脂肪酸比の変化、およびＤＨＡが媒介するＡＡの加水分解の阻害の両方に起因することを示唆している。
【０１１０】
エイコサノイドの測定
２−シリーズのエイコサノイドは、年齢に随伴する神経変性疾患、および虚血などの急性興奮毒性発作におけるニューロンのアポトーシスに関連することがある（Ｓａｎｚｇｉｒｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、４１巻、２２１〜２２９頁、１９９９年；ＤｒａｃｈｍａｎおよびＲｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４８巻、７９２〜７９５頁、２０００年；Ｂｅｚｚｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１巻、２８１〜２８５頁、１９９８年）。アラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ−６）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）は、それぞれ２−シリーズおよび３−シリーズのエイコサノイドの前駆物質である。遺伝子導入が媒介するＡＡおよびＥＰＡの含有量の変更が細胞におけるエイコサノイドの産生における相違をもたらすことがあるか否かを決定するために、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７で刺激した後の感染細胞で、ＡＡ由来の主要なエイコサノイドの１つであるプロスタグランジンＥ２の産生を測定した。より詳しく述べると、プロスタグランジンＥ２を酵素免疫測定法キット（ミシガン州、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて製造元のプロトコールに従い測定した。（プロスタグランジンＥ３との交差反応性は１６％である）培養細胞をＬＨバッファー（１％ＢＳＡを含む）で洗浄し、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（５μＭ）を含む同バッファーでインキュベートした。１０分間インキュベート後、順化バッファーを回収し、エイコサノイド測定にかけた。ｆａｔ−１発現細胞が産生するプロスタグランジンＥ２の量は、対照細胞が産生した量よりも２０％低かった（図１１）。
【０１１１】
アポトーシスの誘導と、細胞増殖および細胞生存度の決定
増殖因子を取り除くことによりアポトーシスを誘導した。ニューロンに形質移入した４８時間後、培地を、２５ｍＭグルタミン酸（ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、および０．５ｍＭグルタミンを補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地に変更した。増殖因子を取り除いた２４時間後に、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ（オレゴン州、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、細胞毒性を測定した。手短に述べると、細胞を、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、引き続き氷中で２０〜３０分間、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液（１ｍｌ／ｍｌ）およびＰＩ溶液（１ｍｌ／ｍｌ）を含む氷冷したＰＢＳ中でインキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、写真を撮った。
【０１１２】
細胞増殖および細胞生存度
細胞増殖および細胞生存度を、ＭＴＴ細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて決定した。ＭＴＴ標識試薬（１００μｌ）を各ウェルに加えた。４時間インキュベート後、各ウェル中に可溶化溶液１．０ｍｌを加えた。次いで、細胞を３７℃で一夜インキュベートし、６００ｎｍにおける分光光度計の溶液の吸光度を測定した。
【０１１３】
ｆａｔ−１遺伝子の発現は、ラットの皮質ニューロンにおけるアポトーシスに対する強力な保護をもたらした。アポトーシス誘導の２４時間後の皮質培養物のＨｏｅｓｔ３３６２５およびＰＩ染色では、Ａｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染した培養物はＡｄ−ＧＦＰに感染した培養物よりもアポトーシスを少なく受けることが示された。ＭＴＴ分析により、Ａｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１細胞の生存度は、Ａｄ−ＧＦＰに感染した細胞の生存度よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いことが指摘された（図１２）。これらの結果は、ｆａｔ−１の発現が、ニューロンのアポトーシスを阻害し、細胞の生存度を促進することができることを示している。シー・エレガンスのｎ−３脂肪酸不飽和化酵素がニューロン細胞のアポトーシスを阻害する能力により、神経保護におけるｎ−６：ｎ−３脂肪酸比の重要性が強調される。したがって、ｆａｔ−１配列、または生物学的に活性なその変種をニューロンに送達する技術は、細胞のｎ−６：ｎ−３脂肪酸比を速やかにかつ劇的にバランスをとり、外因性のｎ−３ＰＵＦＡを補足する必要なしにエイコサノイドのプロファイルを変更（し、それによりニューロン細胞に抗アポトーシス効果を発揮）する手段を提供する。食餌の介入に比べると、この取組みは、同時に組織のｎ−３ＰＵＦＡ濃度を上昇させ内因性ｎ−６ＰＵＦＡのレベルを低下させるので、ｎ−６：ｎ−３比のバランスをとる上でより効果的である。この方法は新規であり、ニューロン細胞における脂肪酸組成を変更する効果的な取組みであり、独立型の遺伝子治療として、または補助療法もしくは化学的予防手順として（例えば、卒中患者に）応用することができる。
【０１１４】
データ分析、統計学的分析
細胞生存度のデータ（ＭＴＴ）、ならびに脂肪酸組成およびエイコサノイドレベルを、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて比較した。分析には１グループあたり６ウェルが含まれ（脂質分析を除く。１グループあたり４ウェル）、各実験は３回繰り返した。有意レベルは、ｐ＜０．０５に設定した。
【０１１５】
実施例１０：ヒト内皮細胞におけるｆａｔ−１発現および炎症の阻害
ｎ−６からｎ−３ＰＵＦＡの転換は、初期のヒト血管内皮細胞に遺伝的に与えられ得るか否かを決定するために、またサイトカイン刺激後の内皮の活性化に対する潜在的な保護作用を研究するために、ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰ発現カセットと一続きになってｆａｔ−１導入遺伝子を含む（Ａｄ．ｆａｔ−１）第１世代（タイプ５）の組換えアデノウィルスベクター（Ａｄ）を構築した。ＧＦＰ／β−ｇａｌアデノウィルスが、対照ベクターとして働いた（Ａｄ．ＧＦＰ／β−ｇａｌ）。単分子層の初期のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ａｄ．ｆａｔ−１または対照のＡｄで３６時間感染させ、１０ｍＭアラキドン酸に２４時間曝露し、ガスクロマトグラフィーによる脂質分析、免疫測定法による表面接着分子分析、および単球細胞系であるＴＨＰ−１との内皮の相互作用を研究するためのビデオ顕微鏡に、層流条件下で行った。
【０１１６】
ｆａｔ−１の発現により、ヒト内皮細胞の脂質組成は劇的に変化し、ｎ−６のｎ−３ＰＵＦＡに対する全体的な比は８．５から１．４に変化した。さらに、サイトカインに曝露した後（ＴＮＦ−α、５μ／ｍｌを４時間適用）、ｆａｔ−１発現は接着分子および炎症のマーカーの表面発現を有意に（Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、およびＶＣＡＭ−１をそれぞれ４２％、４３％、および５７％（ｐ＜０．００１））減少させた。
【０１１７】
本発明者らは次に、接着分子プロファイルの変化は、アテローム硬化性病変部位に見られる最も優勢な白血球のタイプである単球と内皮の相互作用を変化させるのに十分であるか否かを問う。層流下、規定の約２ダイン／ｃｍ２のせん断応力下で、ｆａｔ−１に感染したＨＵＶＥＣは、対照ベクターに感染したＨＵＶＥＣに比べて、約５０％弱い接着を支え、ＴＨＰ−１細胞との回転相互作用にはほとんど効果がなかった。したがって、シー・エレガンスの不飽和化酵素であるｆａｔ−１の非相同の発現は、ヒト内皮細胞がｎ−６をｎ−３ＰＵＦＡに転換する能力を付与する。この効果は、擬似的な生理学的流動条件下で、内皮の炎症反応のサイトカインの誘導および単球細胞系であるＴＨＰ−１の堅い接着を著しく抑制した。したがって、ｆａｔ−１の発現は、アテローム性動脈硬化などの炎症性血管疾患を処置するための、可能性のある治療上の取組みを表わす。
【０１１８】
実施例１１：抗不整脈薬としてのｎ−３不飽和化酵素
ｆａｔ−１発現が抗不整脈効果をもたらし得るか否かを決定するために、ｎ−３不飽和化酵素を発現する筋細胞の、催不整脈性物質により引き起こされる不整脈に対する感受性を試験した。カバーガラス上で増殖させた自発拍動可能な新生仔ラット心筋細胞を、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１またはＡｄ．ＧＦＰに感染させた。感染２日後、細胞を灌流系に移し、カルシウムを高濃度（５〜１０ｍＭ）含む無血清培地で還流した。この培地は、催不整脈性である。灌流プロセスの間中、筋細胞の収縮を位相差顕微鏡およびビデオモニターエッジ検出器を用いてモニターした。高［Ｃａ２＋］（７．５ｍＭ）誘発後、Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照細胞は、速やかに拍動速度の増加を示した後痙攣性の収縮または細動を示したが、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞は規則正しい拍動を続けることができた。したがって、ｎ−３不飽和化酵素を発現する筋細胞は、催不整脈性の刺激に対し、あるとしてもほとんど感受性を示さない（図１３）。
【０１１９】
実施例１２：ｆａｔ−１発現および腫瘍の増殖の阻害
インビボの腫瘍増殖に対する遺伝子導入の効果を試験するために、ヒト乳癌異種移植片を有する２匹のヌードマウス（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）でパイロット実験を行った。１匹のマウスに、１日おきに２回ずつ、５０ｍｌのＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１（１０１２粒子／ｍｌ）を腫瘍内注射した。他方には、対照ベクター（Ａｄ．ＧＦＰ）を注射した。腫瘍の増殖速度を、４週間モニターした。Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１で処置した腫瘍の増殖速度は、対照の腫瘍の増殖速度より遅い様子であった（図１４）。
【０１２０】
実施例１３：脂肪酸組成および培養物中のヒト乳癌細胞の増殖に対するｆａｔ−１発現の効果
組換えアデノウィルス（Ａｄ）の構築
ｆａｔ−１ｃＤＮＡを有する組換えＡｄを、先に記載したように構築した（Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、４０５０〜４０５４頁、２００１年）。手短に述べると、ｐＣＥ８中のｆａｔ−１ｃＤＮＡ（上記）を、プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで二重切断して切り出し、シャトルベクター中に挿入し、次いでＨｅらの方法にしたがってアデノウィルスのバックボーンとの相同的組換えを行った（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、２５０９〜２５１４頁、１９９８年）。２つの、第１世代のタイプ５組換えアデノウィルス、すなわちＣＭＶプロモーターの制御下でレポーター遺伝子としてＧＦＰを有するＡｄ．ＧＦＰ、ならびにｆａｔ−１遺伝子およびＧＦＰ遺伝子の両方をそれぞれ別々のＣＭＶプロモーターの制御下で有するＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１を産生した。組換えウィルスは、先に記載したように、２９３細胞における増殖により高力保存価株として調製した（Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、４０５０〜４０５４頁、２００１年）。構築物の完全さを、酵素消化により、およびＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【０１２１】
細胞培養およびＡｄ．での感染
ＭＣＦ−７細胞は、日常的に、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質溶液（ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ）を補足したＤＭＥＭおよびＨａｍのＦ１２培地の１：１（ｖ／ｖ）の混合物中で、ＣＯ２５％および相対湿度９８％の組織培養インキュベーターで３７℃で維持した。無血清培地にウィルス粒子を加えることにより（３〜５×１０８粒子／ｍｌ）細胞が約７０％のコンフルエンスまで増殖したら、実験用に細胞にＡｄを感染させた。最初に、高い遺伝子発現と細胞毒性を最小にするためのウィルスの低い力価の最適のバランスを達成するために、Ａｄ．ＧＦＰを用いて、最適のウィルス濃度を決定した。２４時間インキュベート後、感染培地を、１０μＭの１８：２ｎ６および２０：４ｎ６を補足した通常の培地で置き換えた。感染４８時間後、遺伝子発現、脂肪酸組成、エイコサノイド産生、ならびに細胞の増殖およびアポトーシスの分析に細胞を使用した。
【０１２２】
ＲＮＡ分析
ｆａｔ−１転写物は、ＲＰＡＩＩＩ（登録商標）キット（テキサス州、Ａｕｓｔｉｎ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いてリボヌクレアーゼプロテクションアッセイにより試験した。手短に述べると、全ＲＮＡを、ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、製造元のプロトコールに従い、培養細胞から抽出した。ｆａｔ−１を含むプラスミドであるｐＣＥ８を線状化し、転写テンプレートとして用いた。アンチセンスＲＮＡプローブを、３３Ｐ−ＵＴＰおよびＴ７ポリメラーゼ（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）システムＴ７キット、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてインビトロで転写し、癌細胞から抽出した全ＲＮＡとハイブリダイズし、ＲＮａｓｅで消化してハイブリダイズしなかったＲＮＡおよびプローブを除去した。保護されたＲＮＡ：ＲＮＡを変性シーケンスゲル中で単離し、オートラジオグラフィーにかけた。ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にするプローブを内部標準として用いた。
【０１２３】
感染し、導入遺伝子を発現する細胞は、ＧＦＰ（鮮やかな蛍光を示す）を共発現するので、蛍光顕微鏡により容易に同定することができる。感染３日後、約６０〜７０％の細胞が感染し、導入遺伝子を発現することが観察された。リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いたｍＲＮＡの分析により、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞中にｆａｔ−１ｍＲＮＡが非常に豊富であることが示されたが、Ａｄ．ＧＦＰに感染した細胞（対照）では検出されなかった。この結果より、Ａｄが媒介する遺伝子導入は、通常ｆａｔ−１遺伝子を欠くＭＣＦ−７細胞におけるｆａｔ−１遺伝子の高度な発現を付与することができることが指摘されている。
【０１２４】
脂質分析
ヒトＭＣＦ−７細胞の脂肪酸組成を変更する際の遺伝子導入の有効性を試験するために、Ａｄに感染させｎ−６脂肪酸で２〜３日間インキュベートした後、全細胞脂質を抽出しガスクロマトグラフにより分析した。全細胞脂質の脂肪酸組成を、記載された（Ｋａｎｇら、前掲）ように分析した。脂質を、０．００５％ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、抗酸化剤として）を含むクロロホルム／メタノール（２：１、体積／体積）で抽出した。脂肪酸メチルエステルを、１４％（重量／体積）ＢＦ３／メタノール試薬を用いて調製した。脂肪酸メチルエステルを、ＳｕｐｅｌｃｏｗａｘＳＰ−１０キャピラリーカラム（ペンシルベニア州、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を装着したＨＰ−５８９０シリーズＩＩガスクロマトグラフをＨＰ−５９７１質量分析計に接続したものを用いてＧＣ／ＭＳで定量した。注入部および検出部は、それぞれ２６０℃および２８０℃に維持する。オーブンプログラムは、最初１５０℃で２分間維持し、次いで１０℃／分で２００℃まで上げ、４分間保持し、再び５℃／分で２４０℃まで上げ、３分間保持し、１０℃／分で最終的に２７０℃まで上げ、５分間維持する。キャリアガス流量は、終始０．８ｍｌ／分の一定に維持する。５０〜５５０原子質量単位からの質量範囲を含めて全イオンのモニタリングを行う。脂肪酸の質量は、分析した様々な脂肪酸の面積を内部標準の定濃度の面積と比較することにより決定する。
【０１２５】
ＭＣＦ−７細胞におけるｆａｔ−１ｃＤＮＡの発現は、ｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸への転換をもたらし、ｎ−６／ｎ−３脂肪酸の比に著しい変化をもたらした。脂肪酸プロファイルは、Ａｄ．ＧＦＰのみに感染した対照細胞とＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞との間では著しく異なる（図１５）。Ａｄ．ＧＦＰに感染した細胞は、非感染の細胞と比較した場合にそれらの脂肪酸プロファイルで変化がなかった。ｆａｔ−１ｃＤＮＡ（ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素）を発現する細胞では、様々なｎ−６脂肪酸が対応するｎ−３脂肪酸に、例えば、１８：２ｎ６から１８：３ｎ３に、２０：４ｎ６から２０：５ｎ３に、および２２：４ｎ６から２２：５ｎ３に概ね転換された。結果として、ｆａｔ−１遺伝子を発現する細胞の脂肪酸組成は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照細胞の脂肪酸組成と比べると大幅に変化し（図１５）、ｎ−６／ｎ−３比を対照細胞における１２から、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を発現する対照細胞における０．８に大きく低下した。
【０１２６】
エイコサノイドの測定
２０：４ｎ６（アラキドン酸）に由来する主要なエイコサノイドの１つであるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は癌の発症に関連があることが、以前に示されている（ＲｏｓｅおよびＣｏｎｎｏｌｌｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｔｈｅｒ．、８３巻、２１７〜２４４頁、１９９９年；ｃａｖｅ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、４６巻、２３９〜２４６頁、１９９７年）。遺伝子導入が誘導する、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸の含有量の変更が細胞におけるエイコサノイドの産生を変えることができるか否かを決定するために、本発明者らはカルシウムイオノフォアＡ２３１８７で刺激した後の感染細胞におけるＰＥＧ２の産生を、ＡＡに由来するプロスタグランジンＥ２を、ＥＰＡからのプロスタグランジンＥ３と１６％の交差反応性で特異的に検出する酵素免疫測定法キットを用いて測定した。より詳しくは、プロスタグランジンＥ２を酵素免疫アッセイキット（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ社）を用いて、製造元のプロトコールにしたがって測定した。（ＰＧＥ３との交差反応性は１６％である。）培養細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（５μＭ）を含む無血清培地でインキュベートした。１０分間インキュベート後、順化培地を回収し、エイコサノイド測定にかけた。ｆａｔ−１細胞が産生するプロスタグランジンＥ２の量は、対照細胞が産生した量よりも有意に低かった（図１６）。
【０１２７】
細胞の増殖およびアポトーシスの分析
ｆａｔ−１遺伝子の発現のＭＣＦ−７細胞の増殖に対する効果を決定するために、遺伝子導入後の細胞増殖およびアポトーシスを評価した。日常的に、細胞の形態を顕微鏡により観察し（死細胞は解離し、丸型で小型に見える）、生存細胞を血球計数器を用いて計数することにより、各ウェルにおける細胞の総数を決定した。さらに、細胞の増殖を、ＭＴＴ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＫｉｔＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔａｉｏｎ）を用いて評価した。アポトーシス細胞は、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ ＃５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で、製造元のプロトコールに従い染色して決定した。
【０１２８】
形態学的変化（丸形の小型または断片化）および核染色（鮮青色）により示されるように、ｆａｔ−１遺伝子を発現する細胞の多数が、アポトーシスを起こしていた。アポトーシス細胞計数を統計学的に分析すると、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞の３０〜５０％がアポトーシスであったが、対照細胞（Ａｄ．ＧＦＰに感染した）では１０％にすぎない死細胞しか見受けられなかった。ＭＴＴ分析では、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞の増殖活性は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した細胞の増殖活性よりも大幅に低いことが指摘された。したがって、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞における生存細胞の総数は、対照細胞における生存細胞よりも約３０％少なかった。これらの結果は、ｆａｔ−１発現物が、抗癌剤として作用することができるという提案と一致する。
【０１２９】
データ分析、統計学的分析
データは、平均±ＳＥで示した。ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて、２つの値の間の差異を評価した。有意レベルは、結果のｐ＜０．０５に設定した。
【０１３０】
実施例１４：トランスジェニック魚類の製造
ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子（野生型遺伝子、最適化した配列、または他の生物学的に活性なフラグメントもしくはその変種のいずれか）を、変更したｎ−６脂肪酸含有物を有するトランスジェニック魚類を産生するために用いることができる。不飽和化酵素遺伝子およびプロモーターを含む構築物を、Ｊｅｓｕｔｈａｓａｎら（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２４２巻、８８〜９５．３頁、２００２年）により記載されたゼブラフィッシュで用いられる方法など（精子核移植により）、従来の遺伝子導入方法により魚に導入することができる。Ｊｅｓｕｔｈａｓａｎ法は、以下のように行った。
【０１３１】
精子核調製
氷水に浸漬して屠殺した成年オスゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）から精巣を切開した。精巣は、うきぶくろの片側に位置し、細いピンセットで取り出す。脱膜化した精子核を、ＫｒｏｌｌおよびＡｍａｙａが実質的に記載したように（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２巻、３１７３〜３１８３頁、１９９６年）、いくつか修正して（例えば、プロテアーゼ阻害物質の省略）調製する。脱膜化に、リゾレシチン（Ｓｉｇｍａ Ｌ４１２９）またはジギチオン（ｄｉｇｉｔｉｏｎ）（Ｓｉｇｍａ Ｄ５６２８）のいずれかを用いた。洗浄後の濃度を確認するために、核をＨｏｅｃｈｓｔまたはＳｙｔｏ１１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でラベルし、ヘマサイトメーター（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で計数した。１ｎｌあたり核約１００個の濃度のアリコートの１０μｌを、液体窒素中に速やかに凍結し、−８０℃で貯蔵した。核を凍結−溶解により脱膜化する代替の手順も用いることができた。核を、５％ＢＳＡを加えた核単離培地９ｍｌで２回洗浄し、１回は１ｍｌで洗浄し、最終的に２５０μｌに再懸濁し、その後等分し、凍結保護せずに速やかに凍結する。
【０１３２】
導入遺伝子混合物
プラスミドＤＮＡを適切な制限酵素で線状化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、滅菌水中に希釈して７０ｎｇ／μｌの濃度にした。精子のアリコートを氷上で溶解し、次いで切断した白チップ付きピペットで吸い上げ排出することにより混合した。精子懸濁液の５μｌを１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管に移し、１μｌの線状化したＤＮＡを加えた。多量のＤＮＡでの実験では、ストックの濃度を増加させることができるが、添加する体積は１μｌに保たれる。この組合せをピペッティングにより混合し、室温で１、５、または２０分間保ち、次いで精子希釈用バッファー（ＳＤＢ）で希釈した。ショ糖２５０ｍＭ、ＫＣｌ ７５ｍＭ、スペルミジン三塩酸塩０．５ｍＭ、精子の四塩酸塩０．２ｍＭ、ｐＨ７．４またはＭＯＨバッファー溶液（ＫＰＯ４ １０ｍＭ、ｐＨ７．２、グルコン酸カリウム１２５ｍＭ、ＮａＣｌ ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ０．５ｍＭ、ショ糖２５０ｍＭ、スペルミジン三塩酸塩０．２５ｍＭ、スペルミン四塩酸塩０．１２５ｍＭ）で最終体積を５００μｌにする。希釈した混合物は、使用まで氷中に保つ。
【０１３３】
精子核の注入
メスゼブラフィッシュをトリカイン（Ｓｉｇｍａ Ａ５０４０）で麻酔し、ペトリ皿上の清浄な１枚のパラフィルム上に置き、優しく圧搾して成熟卵を放出させる。卵をマウンド状に保ち、皿は脱水を防ぐために直ちに蓋をした。パスツールピペットを用いて卵（１回に約５０個）を注入チャンバーに移すが、注入チャンバーは、１．２％アガロースのＨａｎｋｓ溶液に形成されるｖ型の槽からなり、活性化を遅らせるために０．５％ＢＳＡを含むＨａｎｋｓの食塩水で満たされている。槽は卵がちょうど浸漬するように満たされ、つまり卵の上端とメニスカスの下端との間の距離は１ｍｍ未満である。これにより卵は食塩水の帳面張力により戻されるので、卵から注入針を効果的に引き抜くのが確実になる。
【０１３４】
注入針は、薄い壁のキャピラリーをピペットプラー上で引いて製造し、先端をピンセットで割って外径を１０〜１５μｍにする（精子核の直径は約５μｍである）。針をホルダーに装着し、メカニカルマニピュレーターに接続し、先端からマイクロインジェクターを用いて充填する。精子核は暗視野照明法で目に見えるので、充填は解剖顕微鏡でモニターした。バックフィリングとして、２０μｌのピペットを用いて黄色チップに接続したタイゴン製の管材料内に混合物を引いた。次いで、管材料をキャピラリーに接続し、精子懸濁液をキャピラリー中に押し出し、２００μｌピペットを用いてチップ中に押し込んだ。
【０１３５】
注入は、３〜５ｐｓｉの圧力および１００分の時間を用いてインジェクターで行った。精子核を、卵の動物極領域中に注入した。卵は、明視野照明法のもとで目に見える卵門から約５０〜１００μｍ貫通させ、次いで注入前にチップが卵門付近にあるように回転させた。１バッチの卵が注入された後、それをパスツールピペットでＥ３（ＮａＣｌ ５ｍＭ、ＫＣｌ ０．１７ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．３３ｍＭ、ＭｇＳＯ４ ０．３３ｍＭ）を２０ｍｌ含む９ｃｍペトリ皿に移し、次いで２８℃のインキュベーター中に置いた。いくつかの受精卵は成体に成長し、野生型の魚と交配させると、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を発現する子孫を生じた。
【０１３６】
遺伝子型の決定および表現型の決定は、それぞれＲＴ−ＰＣＲおよびガスクロマトグラフィー（脂質分析）で、トランスジェニックマウスの分析で記載したように行った。
【０１３７】
野生型およびｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニックのゼブラフィッシュの筋肉組織から抽出し、実施例８に記載したように変更した全脂質の特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す部分的なガスクロマトグラフのパターンを図２０に示す。トランスジェニック魚類の組織におけるオメガ−３脂肪酸のレベルは、野生型の魚に比べると大幅に高く、オメガ−６脂肪酸のレベルは明らかに低かった。トランスジェニック魚類を製造するために用いたＤＮＡ構築物は、実施例８に記載したものと同じであった。
【０１３８】
外来の遺伝子をゼブラフィッシュの生殖細胞系に導入するための、他の方法を用いることができる。これには、プラスミドＤＮＡの初期胚の中への注入、トランスポゾンが媒介する遺伝子挿入、またはレトロウィルスが媒介する遺伝子導入が含まれる（Ｕｄｖａｄｉａ ＡＪおよびＬｉｎｎｅｙＥ．、Ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｈｉｓｔｏｒｉｃ，ｃｕｒｒｅｎｔ，ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年、２５６巻、１〜１７頁；Ｄｅｔｒｉｃｈ Ｈ．Ｉ．、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．、Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．（編集）、Ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、５９および６０巻）。
【０１３９】
ここに記載した方法は、サケ（例えば、タイセイヨウサケ（Ａｔｌａｎｔｉｃ ｓａｌｍｏｎ）、Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）を含む他の硬骨魚類に応用できる。
【０１４０】
当業者が調べることのできるさらなる情報は：ＳｉｍｏｐｏｕｌｏｓおよびＣｌｅｌａｎｄ、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ（Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ）、９２巻、２００３年；Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓら（編集）、Ｗｏｒｌｄ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ（Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ）、８３巻、１９９８年；Ｃｏｎｎｏｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７１巻、１７１Ｓ〜１７５Ｓ頁、２０００年；Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７０巻、５６０Ｓ〜５６９Ｓ頁、１９９９年；Ｓａｌｅｍら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、Ｓ１〜Ｓ３２６、１９９６年；ＬｅａｆおよびＷｅｂｅｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、４５巻、１０４８〜１０５３頁、１９８７年）。
【０１４１】
実施例１５：トランスジェニック豚の製造
本発明者らは、トランスジェニックマウスの製造で上記したのと同様の方法を用いて、トランスジェニック豚を製造した。トランスジェニック豚は、実施例８に記載したように変更されたｆａｔ−１遺伝子を発現した。野生型およびトランスジェニック豚の尾部組織から抽出した全脂質の特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す部分的なガスクロマトグラフの痕跡を、図２１に示す。トランスジェニック豚の組織におけるオメガ−３脂肪酸のレベルは、野生型の豚と比べると大幅に高く、オメガ−６脂肪酸のレベルは明らかに低かった。トランスジェニック豚を製造するために用いたＤＮＡ構築物は、実施例８に記載したものと同じであった。
【０１４２】
本発明の多くの実施形態を記載した。それでも、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、様々な変更形態が可能であることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】遺伝子導入効率を示す４枚の顕微鏡写真を集めた図である。
【図２】Ａｄ．ＧＦＰに感染した心筋細胞（対照）、およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した心筋細胞におけるｆａｔ−１転写物レベルのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）プロテクションアッセイのオートラジオグラムを表す図である。
【図３】Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照の心筋細胞、およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した心筋細胞から抽出した全細胞脂質の脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンを表す図である。
【図４】対照の心筋細胞およびｆａｔ−１遺伝子を発現する心筋細胞におけるプロスタグランジンＥ２レベル（酵素免疫法で測定した）を示す棒グラフである。
【図５】対照の心筋細胞およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックの心筋細胞からの全細胞脂質の多価不飽和脂肪酸組成を示す表である。
【図６】実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
【図７】実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
【図８】実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
【図９】対照のニューロンおよびＡｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染したニューロンから抽出した全細胞脂質の脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンである。
【図１０】ラットの皮質ニューロン（対照）およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡ（ｆａｔ−１）を発現するトランスジェニック細胞からの全細胞脂質のＰＵＦＡ組成を比較する表である。
【図１１】対照のニューロンおよびｆａｔ−１遺伝子を発現するニューロンにおけるプロスタグランジンＥ２レベルの酵素免疫法の結果を示す棒グラフである。
【図１２】対照およびｆａｔ−１を発現する培養物における細胞生存度のＭＴＴアッセイの結果を表す棒グラフである。
【図１３】Ａｄ．ＧＦＰに感染した筋細胞およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した筋細胞の、細胞外カルシウム７．５ｍＭに対する特異的な反応を示す１対の軌跡である。
【図１４】経時的（ウィルス注入後０〜４週間）の腫瘍体積、すなわち遺伝子導入の腫瘍の増殖に対する効果を示す折れ線グラフである。
【図１５】対照のＭＣＦ−７細胞、およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックのＭＣＦ−７細胞からの全細胞脂質のＰＵＦＡ組成を示す表である。
【図１６】対照のＭＣＦ−７細胞およびｆａｔ−１遺伝子を発現するＭＣＦ−７細胞におけるプロスタグランジンＥ２レベルの酵素免疫測定法の結果を表す棒グラフである。
【図１７Ａ】シー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびＦａｔ−１ポリペプチドの推定アミノ酸配列を表す。
【図１７Ｂ】シー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびＦａｔ−１ポリペプチドの推定アミノ酸配列を表す。
【図１８】最適化したｆａｔ−１核酸配列を表す。
【図１９】野生型マウスの骨格筋（ＷＴ、上パネル）およびｆａｔ−１トランスジェニックマウス（ＴＧ、下パネル）の骨格筋から抽出した全脂質の特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンである。
【図２０】実施例８に記載したように変更した、野生型、およびｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニックのゼブラフィッシュの筋肉組織から抽出した全脂質の、特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンを示す図である。
【図２１】実施例８に記載したように変更した、野生型、およびｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニック豚の尾部組織から抽出した全脂質の、特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す１対の部分的ガスクロマトグラフパターンである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年２月４日出願の米国仮特許出願第６０／５４２０９８号、および２００４年３月２２日出願の米国仮特許出願第６０／５５５４２２号の利権を主張するものである。この両出願の内容は、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（政府支援）
本明細書に提示した研究のいくつかは、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの許可により支援されたものである（ＣＡ７９５５３）。したがって、米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、動物細胞における多価不飽和脂肪酸の含有量を変更するための組成物および方法に関する。
【０００４】
（従来技術）
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、１８個以上の炭素原子、および２個以上の二重結合を有する脂肪酸である。これは、脂肪酸のメチル末端に最も近い二重結合の位置（ｎ）に応じて、ｎ−６またはｎ−３の２グループに分類することができる（ＧｉｌｌおよびＶａｌｉｖｅｔｙ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻、４０１〜４０９頁、１９９７年；Ｂｒｏｕｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．、１９巻、１９７〜２１６頁、１９９９年；Ｎａｐｉｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．、２巻、１２３〜１２７頁、１９９９年）。ｎ−６およびｎ−３ＰＵＦＡは、それぞれリノール酸（ＬＡ、１８：２ｎ６）またはリノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ３）のいずれかで始まり、交替に連なる不飽和化および伸長により合成される（ＧｉｌｌおよびＶａｌｉｖｅｔｙ、前掲；Ｂｒｏｕｎら、前掲；Ｎａｐｉｅｒら、前掲）。動物におけるｎ−６経路の主要な終点の１つは、アラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ６）であり、ｎ−３経路の主要な終点はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ３）である。
【０００５】
ＰＵＦＡの合成に関与する重要なクラスの酵素は、脂肪酸不飽和化酵素のクラスである。これらの酵素は、酵素の特異性により決定される位置で、炭化水素鎖に二重結合を導入する。しかし、ほとんどの場合、動物は、ＬＡ（１８：２ｎ６）およびＡＬＡ（１８：３ｎ３）をより長い鎖のＰＵＦＡに転換する酵素活性を含む（この場合、転換の比率が限定的である）が、前駆物質（親）のＰＵＦＡである、ＬＡ、およびＡＬＡを合成するのに必要な１２−および１５不飽和化活性を欠く（Ｋｎｕｔｚｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３巻、２９３６０〜２９３６６頁、１９９８年）。さらに、ｎ−３およびｎ−６ＰＵＦＡは、哺乳動物の細胞では相互転換可能ではない（Ｇｏｏｄｎｉｇｈｔら、Ｂｌｏｏｄ、５８巻、８８０〜８８５頁、１９８１年）。したがって、ＬＡもＡＬＡも、これらの伸長、不飽和化の産物も、ヒトの食事に不可欠な脂肪酸であると考えられている。哺乳動物の細胞膜のＰＵＦＡ組成物は、食餌による摂取に大いに依存している（Ｃｌａｎｄｉｎｉｎら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６３巻、５４６〜５５６頁、１９８５年；ＭｃＬｅｎｎａｎら、Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．、１１６巻、７０９〜７１７頁、１９８８年）。
【０００６】
それとは対照的にある種の植物および微生物には、色素体でも小胞体でもグリセロ脂質の基質に対して作用する、膜結合した１２−および１５−（ｎ−３）不飽和化酵素があるので、ＡＬＡ（１８：３ｎ−３）などのｎ−３脂肪酸を合成することができる（ＢｒｏｗｓｅおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２巻、４６７〜５０６頁、１９９１年）。遺伝子技術により、シロイヌナズナおよび他の高等植物種から１２−および１５−不飽和化酵素をコードする遺伝子の同定がもたらされている（Ｏｋｕｌｅｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、６巻、１４７〜１５８頁、１９９４年；Ａｒｏｎｄｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８巻、１３５３〜１３５５頁、１９９２年）。最近、シノラブディス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）から、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素をコードするｆａｔ−１遺伝子がクローンされた（Ｓｐｙｃｈａｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１１４２〜１１４７頁、１９９７年；米国特許第６１９４１６７号も参照されたい）。
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、一部には、シー・エレガンス（C.elegans）のｎ−３不飽和化酵素遺伝子であるｆａｔ−１を他のタイプの動物細胞（例えば、哺乳動物、鳥類、および魚類）中に首尾よく導入することができ、そこでその遺伝子は迅速にかつ効果的に細胞のｎ−３ＰＵＦＡ含有量を増加させ、劇的にｎ−６：ｎ−３ＰＵＦＡの比のバランスをとるという知見に基づくものである。本発明者らは、改変されたシー・エレガンスのｆａｔ−１核酸配列も見出した。本発明者らは、アミノ酸配列をコードする天然に存在するコドンの１つまたは複数が変更されているが依然として同じアミノ酸配列をコードする場合に、これらの配列を「最適化された」と呼ぶ。例えば、アミノ酸残基のバリンをコードする「ＧＴＴ」と表される１つまたは複数のコドンは、やはりバリンをコードするＣＴＧで置き換えることができ、アミノ酸残基のアルギニンをコードする「ＣＧＴ」と表される１つまたは複数のコドンは、やはりアルギニンをコードするＣＧＣで置き換えることができる、などである。コドンは、組換えＤＮＡが挿入される生物体に好ましいコドンを含むように変更される。したがって、最初の、または天然に存在する状態からコドンの使用頻度を最適化することにより改変された核酸を含めた、オメガ−６脂肪酸を対応するオメガ−３脂肪酸に不飽和化する酵素的に活性なタンパク質をコードする配列を含む核酸、ならびにトランスジェニック動物（例えば、哺乳動物、鳥類、または魚類）を生成し、様々な疾患または状態を処置しまたは予防する手助けをするためのこれらの配列を用いる方法は、本発明の範囲内である。最適化された配列は、以下に記載するあらゆるベクターおよび細胞に組み込むことができ、野生型の配列（例えば、ｆａｔ−１遺伝子）を用いることができるあらゆる方法で用いることができる。ある場合には（例えば、トランスジェニック動物の産生では）、コドンが最適化された配列を使用することが好ましいことがある。最適化は、核酸配列を改変することができる唯一の方法ではない。本発明には、生物学的に活性なフラグメント、またはオメガ−３（すなわちｎ−３）不飽和化酵素もしくは最適化されたオメガ−３（すなわちｎ−３）不飽和化酵素の他の変異体をコードする配列の使用が含まれる。酵素的に活性なタンパク質、またはオメガ−３不飽和化酵素活性を有する酵素は、細胞で発現される場合に、細胞内でｎ−６ＰＵＦＡをｎ−３ＰＵＦＡに転換するタンパク質である。これらのタンパク質または酵素は、その長さおよび含有量が、天然に存在するタンパク質（例えば、ｆａｔ−１がコードするタンパク質）に一致してもよく、あるいは本明細書に記載する１つまたは複数の方法に有用な酵素活性を十分に保持するそのフラグメントまたは他の変異体であってもよい。
【０００８】
より詳しく述べると、ラットの心筋細胞におけるｆａｔ−１遺伝子の非相同発現により、これらの細胞が様々なｎ−６ＰＵＦＡを対応するｎ−３ＰＵＦＡに転換することができるようになり、ｎ−６：ｎ−３比を約１５：１（望ましくない比）から約１：１（望ましい比）に変えたことを、本発明者らの研究は実証した。所与の細胞内の配列がその細胞で通常発現される配列ではないことを示すのに、本発明者らは「非相同発現」の語を使用する。異なる種の配列であるので配列が「非相同」であってよい。さらに、本発明者らは、ｎ−６ＰＵＦＡ由来のエイコサノイド（すなわち、アラキドン酸）が、トランスジェニック細胞で著しく減少することを見出した。さらに下記するように、アラキドン酸のレベルを評価して、所与の核酸がオメガ−３不飽和化酵素活性を有する酵素をコードするか否かを決定することができ、同様に、ｎ−６ＰＵＦＡのレベル、ｎ−３ＰＵＦＡのレベル、および／またはｎ−６：ｎ−３ＰＵＦＡの比を評価することができる。したがって、本発明は、恒常的に活性なまたは組織に特異的なプロモーターに任意選択で、かつ操作可能に結合する組成物（例えば、オメガ−３不飽和化酵素活性（例えば、ｆａｔ−１）を有するポリペプチドをコードする核酸）、および動物細胞でＰＵＦＡの含有量を効果的に変更するのに用いることができる方法を特徴とする。細胞は、哺乳類、鳥類、または魚類の細胞であってよく、ｎ−６ＰＵＦＡを含むあらゆるタイプの細胞であってよい。例えば、細胞は、筋細胞、（末梢神経系または中枢神経系の）ニューロン、脂肪細胞、内皮細胞、肝細胞、または結腸、乳房、肝臓、前立腺、卵巣、および子宮頸部の癌細胞を含む癌細胞であってよい。以下に記載する実験は、主にシー・エレガンスのｆａｔ−１配列で行ったが、本発明はそれだけに限定されず、本発明の組成物および方法は、オメガ−３不飽和化酵素活性を有するポリペプチド（すなわち、天然に存在するものであってもなくても、シー・エレガンスのものであってもなくても、オメガ−６脂肪酸を対応するオメガ−３脂肪酸に不飽和化するあらゆるポリペプチド）をコードするあらゆる核酸を含む（または使用する）ものを含む。したがって、具体的な実施形態では、本発明は、動物でｎ−３脂肪酸不飽和化酵素（すなわち、オメガ−３不飽和化酵素活性）を産生することにより、動物でｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸を産生する方法を特徴とする。ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素の産生は、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素または生物学的に活性なその変種をコードする核酸を、動物に以下のように投与することに続いて開始することができる。このような核酸の詳しい例を本明細書に提供し、同様の機能的な配列は、特に本明細書に提供される手引きにより当業者であれば容易に同定することができる。動物は、本明細書で述べるあらゆる種であってよく（例えば、哺乳動物、鳥類、または魚類のクラスの範囲内の種）、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を産生する平均的の、または「正常の」能力を有しても、有さなくてもよい。例えば、本発明の方法は、不飽和化酵素を投与するより前に、ｎ−３脂肪酸を産生する望ましくなく限られた能力を有する動物（例えば、ヒト）で行ってもよい。
【０００９】
核酸（例えば、ｆａｔ−１配列、または生物学的に活性なその変種）を、制御配列に操作可能に結合させることができる。制御配列は、プロモーターだけではなく、エンハンサー、またはポリアデニル化シグナルなど、改変された細胞で核酸の発現を促進する他の発現制御配列も含む。このような改変された細胞を、インビボに置き、またはイクスビボ（例えば、組織培養中）に維持することができる。その天然の環境から取り除かれた細胞は、「単離されて」おり、本明細書に記載された核酸配列を有する場合は本発明の範囲内である（非相同の細胞内にある核酸は、同様に「単離された」と記載してもよい）。本明細書に記載された核酸または改変された細胞を有するヒト以外のトランスジェニック動物も、本発明の範囲内であり、これらの動物から得られる食品（例えば、肉、または動物の他の食用部分（例えば、肝臓、腎臓、皮膚、脂肪、もしくはスイートブレッド））、あるいは動物の部分を用いて産生される食品（例えば、ブロス、肉汁、スプレッド、またはトランスジェニックの部分（例えば、牛肉もしくは鶏肉の部分）で作られるあらゆる加工食品）も、本発明の範囲内である。食品はヒトが摂取するために、またはペットもしくは家畜用の餌として調製されてもよい。
【００１０】
トランスジェニック動物についてはさらに以下で論じるが、動物（またはそのあらゆる所与の組織）は、オメガ−３不飽和化酵素を天然に発現するものであってもなくてもよいことに本発明者らはここで注目し、本発明は、通常はその能力を欠く動物に、遺伝子導入によりｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を提供することにより、その動物でｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸を生成する方法を含む。記載した方法および組成物は、動物（例えば、哺乳動物、鳥類、または魚類）でｎ−３脂肪酸不飽和化酵素活性を増強しまたは補足するためにも用いることができる。一実施形態では、本発明は、シー・エレガンスのｆａｔ−１タンパク質（例えば、図１８に示した変種）をコードする変種を含む、ｎ−３不飽和化酵素（例えば、シー・エレガンスのｎ−３不飽和化酵素）または生物学的に活性なその変種（例えば、フラグメントもしくは他の変異体）をコードする、最適化されていてもされていなくてもよい核酸配列を含む哺乳類、トリ（鳥類）のまたはサカナ（魚類）の細胞を特徴とする。述べたように、ｎ−３不飽和化酵素の生物学的に活性な変種は、治療上または臨床上有効であるのに十分な野生型のｎ−３不飽和化酵素の生物学的活性を保持する変種（すなわち、患者を処置し、トランスジェニック動物を生成し、または診断検査もしくは他の臨床検査を行うのに有用な変種）である。例えば、ｎ−３不飽和化酵素の変種は、野生型ｎ−３不飽和化酵素の生物学的活性の少なくとも５〜２５％を保持する酵素の変異体またはフラグメントであってよい。例えば、ｎ−３不飽和化酵素のフラグメントが、同じ条件下で対応する野生型の酵素の少なくとも５〜２５％効率的に（例えば、野生型のｎ−３不飽和化酵素の５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、８０、９０、９５、または９９％効率的に）ｎ−６脂肪酸をｎ−３脂肪酸に転換する場合、フラグメントは生物学的に活性な全長の酵素の変種である。ｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸への転換を用いて、コドンの最適化により変更された配列を評価するのを助けることもできる（例えば、この転換を用いて、これらの配列が生物学的活性を保持しているのか生物学的活性を増強したかを決定することができる）。
【００１１】
変種は、また１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含んでもよい（例えば、野生型酵素の配列における１％、５％、１０％、２０％、２５％、またはそれを超えるアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置き換わり、または欠失してもよい）。換言すれば、本発明の範囲内の核酸の変種は、野生型のｎ−３不飽和化酵素遺伝子（例えば、シー・エレガンスのｆａｔ−１）に少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％一致する配列を有してもよく、または配列を含んでもよい。同様に、本発明の範囲内である核酸の変種は、野生型のｎ−３不飽和化酵素（例えば、シー・エレガンスのｆａｔ−１）に少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％一致する配列を有するタンパク質をコードしてもよい。変種が置換を含む場合、置換は当技術分野でよく知られている保存的アミノ酸置換を構成してもよい。野生型からここに記載する程度に変化する核酸の配列は、生物学的に活性であり続け、かつ／または生物学的に活性なタンパク質をコードする限り本発明の方法に有用である。
【００１２】
（任意選択で、恒常的に活性なもしくは組織に特異的なプロモーター、および／または他の調節要素に操作可能に結合した）ｆａｔ−１配列を発現する細胞は、ｆａｔ−１遺伝子およびその産物の機能上の性質を特徴づける都合のよいシステムを提供するので貴重である。組織培養細胞も特に便利であるが、本発明はそれだけに限定されない。ｆａｔ−１で変更した細胞により、現在必要とされている細胞または動物を飼育する長々しい手順なしに、ｎ−３脂肪酸が媒介するあらゆる細胞メカニズムが研究できるようにもなっている。細胞は、例えば、既存の方法を評価するため、またｎ−３不飽和化酵素をコードする配列をインビボで細胞内に効果的に導入するための新しい方法をデザインするために用いることができるモデルシステムとしても役立つことができる。
【００１３】
本明細書に記載したあらゆる文脈（例えば、本発明の組成物（例えば、核酸構築物）が患者を処置するために、トランスジェニック動物を産生するために、または細胞培養アッセイで使用する際に用いられるか否か）において、オメガ−３不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｆａｔ−１）を別の（すなわち「第２の」）遺伝子と（同一のベクターにより、または同一もしくは異なるタイプの別個のベクターを用いて）共発現させることができる。第２の遺伝子（ｆａｔ−１遺伝子が第１の遺伝子として）は、例えば、別の治療用の遺伝子（例えば、小分子もしくは化学療法剤に対する受容体）、またはマーカー遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または増強されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ）などの蛍光タンパク質をコードする配列）であってよい。最適化されたｆａｔ−１核酸を含む変種のｆａｔ−１核酸は、その野生型の対応物に勝るある種の有利点を示すタンパク質をコードすることがある。例えば、変種の配列は、（培養のまたはインビボの細胞で）不飽和化酵素を発現するのにより効果的であることがある。
【００１４】
本発明のあらゆる核酸分子は「単離された」ものであってよい（すなわち、それらが天然に存在する環境と異なる環境で）（コドンが最適化された配列に関する修飾語である「単離された」の使用についての下記の本発明者らのコメントを参照されたい）。例えば、核酸はプラスミドまたは他のベクター中に組み入れられ、または、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節要素を含む１つまたは複数の非相同配列に結合してもよい。核酸分子は、また、非相同の細胞（すなわち、それらが通常発現されない細胞）内に含まれる場合に単離される。例えば、哺乳動物の細胞（例えば、ヒト、ウシ、またはブタの細胞）、鳥類の細胞（例えば、ニワトリ、アヒル、またはガチョウの細胞）、または魚類の細胞（例えば、サケ、マス、またはマグロの細胞）で、シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子（またはその変種）を含む核酸は、単離された核酸である。ここに記載するｆａｔ−１を含む細胞は、本発明の範囲内である。
【００１５】
本発明の核酸は、患者に投与するために配合することもできる。例えば、患者に経口でまたは非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、経粘膜、経皮、または皮下の注射）投与するために滅菌水または滅菌した生理的バッファー（例えば、リン酸緩衝食塩水）にそれらを懸濁してもよい。製剤は、また、組織または臓器の表面に適用するために調製してもよい（例えば、溶液剤、ゲル剤、またはパスタ剤として）。患者が腫瘍を有する場合には、組成物を腫瘍内に注入し、または腫瘍を取り除いた部位の周囲の組織に投与してもよい。
【００１６】
本発明は、シー・エレガンスのｎ−３不飽和化酵素遺伝子または生物学的に活性なその変種を発現するトランスジェニック動物（家畜として飼われ、または食料源として用いられるあらゆる動物（例えば、魚類もしくは他の水生動物（例えば、イカ、タコ、甲殻類の動物（例えば、ロブスター、カニ、マキガイ、およびエビ）、または他の食用の水生動物（例えば、ウナギ）を含む）も特徴とする。シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が動物細胞に送達されると効果的に発現できるという発見を考慮して、当技術分野でよく知られた方法により、この遺伝子、その変種、および他のｆａｔ−１遺伝子を用いてトランスジェニックマウス、またはより大型のトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、またはあらゆる他の家畜、もしくは飼育された動物）、あらゆる食鳥（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、または猟鳥）、ならびに貝類および甲殻類を含む魚類を産生することができる。より詳しく述べると、本発明は、導入遺伝子がオメガ−３不飽和化酵素または生物学的に活性なその変種（例えば、少なくとも１つの最適化されたコドンを含むことができるシー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子）である、タラ（またはタラ目タラ科の任意の魚類（例えばハドック））、オヒョウ（オヒョウ属のカレイ類の２種のいずれかに対する一般名）、ニシン（アンチョビも含む、ニシン目のいくつかの魚類の一般名）、サバ（サバ科の輸入食用魚の様々な種類の一般名、サケ（または、マスを含めたサケ科の任意の魚類）、スズキ（またはスズキ科の任意の魚類）、シャッド（またはニシン科の任意の魚類）、ガンギエイ（またはガンギエイ科の任意の魚類）、スメルト（またはキュウリウオ科の任意の魚類）、シタビラメ（またはササウシノシタ科の任意の魚類）、およびマグロ（またはサバ科の任意の魚類）を含むトランスジェニック魚類を産生するための組成物および方法を含む。
【００１７】
用いた構築物が恒常的に活性なプロモーターを含むか組織に特異的なプロモーターを含むかに応じて、オメガ−３不飽和化酵素遺伝子（例えば、ｆａｔ−１遺伝子）は全体に発現されても、組織に特異的な方法で発現されてもよい。遺伝子を恒常的に活性なプロモーターの制御下に置くと多くの組織のタイプで発現されることがあり、または遺伝子を組織に特異的なプロモーター（例えば、骨格筋、心筋、または平滑筋、乳房組織、結腸、前立腺、ニューロン、網膜細胞、膵臓細胞（例えば、島細胞）、他の内分泌細胞、内皮細胞、皮膚細胞、脂肪細胞などの中の細胞のタイプなどの、特定の細胞のタイプで選択的に活性のあるプロモーター）の制御下に置くと特定の組織または細胞のタイプで発現されることがある。
【００１８】
トランスジェニック動物の細胞は、変更されたＰＵＦＡ含有量を含み、さらに下記に記載するように、摂取するのにより望ましい。したがって、ｆａｔ−１遺伝子がコードする不飽和化酵素を発現するトランスジェニックの家畜または食用に屠殺されるあらゆる動物（例えば、魚類および猟獣）は、より優れた（すなわち、より健康的な）食料源である。これらの動物から得た食品、またはこれらの動物を用いて製造した食品（例えば、加工食品およびペットフード）は、健常対象、または本明細書に記載する１つまたは複数の状態に罹患している対象に提供することができる。
【００１９】
述べたように、本発明は、ｎ−３ＰＵＦＡの不足またはｎ−３：ｎ−６ＰＵＦＡの比の不均衡に関連する状態を有し、または発症する可能性のある患者（ヒトおよび他の哺乳動物を含む）を、ｎ−３不飽和化酵素または生物学的に活性なその変種（例えば、フラグメント、変異体、またはコドンが最適化された配列）をコードする核酸を投与することにより処置する方法を特徴とする。あるいは、核酸または生物学的に活性な変種がコードするタンパク質を投与することができる。処置方法を、不整脈または心臓血管疾患（例えば、高レベルの血漿トリグリセリドまたは高血圧によって証明されるもの）、癌（例えば、乳癌または結腸癌）、炎症性疾患または自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、慢性閉塞性肺疾患、狼瘡、糖尿病、シェーグレン症候群移植術、強直性脊椎炎、結節性多発性動脈炎、ライター症候群、もしくは強皮症）、あるいは網膜または脳の形成異常（もしくは未熟児に起こる切迫形成異常）を有する患者に適用することができる。好適な患者には、糖尿病、肥満、皮膚障害、腎臓疾患、潰瘍性大腸炎、またはクローン病を有する者、または有すると診断される者も含まれる。他の適切な患者には、移植された臓器を拒絶する危険性のある患者が含まれる。ｆａｔ−１の発現は、ニューロンなどの細胞における細胞死（そのような死が起こる場合はアポトーシスによると本発明者らは考える）を阻害することができ、したがって、本発明の方法は、神経変性疾患を処置しまたは予防する（例えば、その可能性、またはその期間もしくは重症度を阻害する）ために用いることができる。したがって、本発明は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄延髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ；ケネディー病としても知られる）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、またはマシャドジョセフ病（ＭＪＤ／ＳＣＡ３）などの神経変性疾患を発症し、または発症する可能性のある患者を処置する方法を特徴とする（Ｒｅｄｄｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃ．、２２巻、２４８〜２５５頁、１９９９年）。
【００２０】
ｆａｔ−１の発現により癌細胞の細胞死が増加することもあり、したがって、本発明が特徴とする方法を用いて、乳房、結腸、前立腺、肝臓、子宮頸、肺、脳、皮膚、胃、頭頸部、膵臓、血液（例えば、白血病およびリンパ腫）、ならびに卵巣の癌を含む癌を処置し、または予防する（例えば、可能性を阻害し、または重症度もしくは拡散を阻害する）ことができる。特に、これらの方法は、最適化されたシー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子、および任意選択で第２のタンパク質（例えば、化学療法のタンパク質）をコードする配列を含む核酸構築物で行うことができる。構築物は、調節配列（例えば、恒常的に活性な、または細胞型に特異的なプロモーター）も含むことができる。癌の処置または予防を意図する核酸を、患者に投与するために配合してもよい。例えば、核酸を、滅菌した生理的に許容される希釈剤と組み合わせてもよい。腫瘍がすでに発症している場合には、核酸を注入可能な溶液に配合してもよい。
【００２１】
バランスのとれた、またはより望ましくバランスのとれたｎ−６：ｎ−３比は、通常の増殖および発達に重要であり、上記で述べたように、本発明の方法は、ＰＵＦＡに関連する識別できる疾患または状態のない患者に適用すると有利であり得る。
【００２２】
本明細書に用いられる略語には以下のものが含まれる：ＡＡはアラキドン酸（２０：４ｎ−６）。ＤＨＡはドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ−３）、ＥＰＡはエイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３）、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質、Ａｄ．ＧＦＰはＧＦＰ遺伝子を有するアデノウィルス、ＡＤ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１はｆａｔ−１遺伝子およびＧＦＰ遺伝子の両方を有するアデノウィルス、およびＰＵＦＡは多価不飽和脂肪酸である。
【００２３】
本明細書に記載したものと同様の、または同等の方法および材料を、本発明を実践し、または試験するのに用いることができるが、有用な方法および材料は以下に記載する。本出願から発行することができるあらゆる米国特許の目的では、本明細書に引用されるすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全文が参照として組み入れられる。
【００２４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載、図、および実施例から明らかになるであろう。
【００２５】
（図面の簡単な記載）
図１は、遺伝子導入効率を示す４枚の顕微鏡写真を集めた図である。ラット心筋細胞に、Ａｄ．ＧＦＰ（左パネル、対照）またはＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１（右パネル）を感染させた。感染４８時間後、心筋細胞を高輝度（上パネル）および５１０ｎｍの青色光（下パネル）で可視化した。ＧＦＰの共発現により、導入遺伝子が細胞で高い効率で発現されていることが肉眼的に説明される。
図２は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した心筋細胞（対照）、およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した心筋細胞におけるｆａｔ−１転写物レベルのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）プロテクションアッセイのオートラジオグラムを表す図である。心筋細胞から単離された全ＲＮＡ（１０μｇ）をアンチセンスのＲＮＡプローブとハイブリダイズし、ＲＮａｓｅで消化し、変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により単離した。ｆａｔ−１ｍＲＮＡをオートラジオグラフィーにより可視化した。β−アクチン遺伝子を標的にするプローブを対照として用いた。
図３は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照の心筋細胞、およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した心筋細胞から抽出した全細胞脂質の脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンを表す図である。
図４は、対照の心筋細胞およびｆａｔ−１遺伝子を発現する心筋細胞におけるプロスタグランジンＥ２レベル（酵素免疫法で測定した）を示す棒グラフである。値は３回の実験の平均±ＳＤであり、対照の％で表される。＊ｐ＜０．０１。
図５は、対照の心筋細胞およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックの心筋細胞からの全細胞脂質の多価不飽和脂肪酸組成を示す表である。
図６は、実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
図７は、実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
図８は、実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
図９は、対照のニューロンおよびＡｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染したニューロンから抽出した全細胞脂質の脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンである。
図１０は、ラットの皮質ニューロン（対照）およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡ（ｆａｔ−１）を発現するトランスジェニック細胞からの全細胞脂質のＰＵＦＡ組成を比較する表である。
図１１は、対照のニューロンおよびｆａｔ−１遺伝子を発現するニューロンにおけるプロスタグランジンＥ２レベルの酵素免疫法の結果を示す棒グラフである。Ａｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染したニューロンは、対照に比べてＰＧＥ２のレベルが低い。値は、３回の実験の平均±ＳＤであり、対照のパーセント値で示してある。＊ｐ＜０．０１。
図１２は、対照およびｆａｔ−１を発現する培養物における細胞生存度のＭＴＴアッセイの結果を表す棒グラフである。増殖因子中止２４時間後、ｆａｔ−１遺伝子を発現するニューロンの細胞生存度は、対照細胞よりも５０％高い（ｐ＜０．０１）。
図１３は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した筋細胞およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した筋細胞の、細胞外カルシウム７．５ｍＭに対する特異的な反応を示す１対の軌跡である。
図１４は、経時的（ウィルス注入後０〜４週間）の腫瘍体積、すなわち遺伝子導入の腫瘍の増殖に対する効果を示す折れ線グラフである。ヌードマウスの背部に、乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を皮下移植した。３週間後、マウスを腫瘍内注射により、Ａｄ．ＧＦＰ−ｆａｔ−１またはＡｄ．ＧＦＰ（対照、５０μｌ、１０１２ＶＰ／ｍ）で処置した。
図１５は、対照のＭＣＦ−７細胞、およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックのＭＣＦ−７細胞からの全細胞脂質のＰＵＦＡ組成を示す表である。
図１６は、対照のＭＣＦ−７細胞およびｆａｔ−１遺伝子を発現するＭＣＦ−７細胞におけるプロスタグランジンＥ２レベルの酵素免疫測定法の結果を表す棒グラフである。値は、３回の実験の平均±ＳＥであり、対照のパーセント値で示してある（＊Ｐ＜０．０５）。
図１７Ａおよび１７Ｂは、シー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびＦａｔ−１ポリペプチドの推定アミノ酸配列を表す。
図１８は、最適化したｆａｔ−１核酸配列を表す。
図１９は、野生型マウスの骨格筋（ＷＴ、上パネル）およびｆａｔ−１トランスジェニックマウス（ＴＧ、下パネル）の骨格筋から抽出した全脂質の特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンである。野生型マウスもトランスジェニックマウスも、８週齢のメスマウスであり、同じ食餌を与えた。トランスジェニックの筋肉（下パネル）では、野生型の筋肉（上パネル）と比べて、ｎ−６の多価不飽和酸（１８：２ｎ−６、２０：４ｎ−６、２２：４ｎ−６、および２２：５ｎ−６）のレベルは低いが、ｎ−３脂肪酸（＊で示した）は豊富である。野生型の動物では、組織に見られる多価不飽和脂肪酸は、主に（９８％）ｎ−６リノール酸（ＬＡ、１８：ｎ−６）およびアラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ−６）、ならびにパターン（または検出不可能な）量のｎ−３脂肪酸である。それとは対照的に、トランスジェニックマウスの組織には、リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ｎ−３）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）を含む、大量のｎ−３多価不飽和脂肪酸が存在する。したがって、トランスジェニックの組織におけるｎ−６脂肪酸であるＬＡおよびＡＡのレベルは大幅に減少し、ｎ−６からｎ−３脂肪酸への転換を示している。トランスジェニック動物の組織におけるｎ−６のｎ−３脂肪酸に対する得られた比は１に近かった。ｎ−６対ｎ−３比のバランスがとれ、ＡＡ／（ＥＰＡ＋ＤＰＡ＋ＤＨＡ）のバランスがよりとれたこのｎ−３に富む脂肪のプロファイルは、表１に列挙したすべての試験を行った臓器／組織で観察することができた。
図２０は、実施例８に記載したように変更した、野生型、およびｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニックのゼブラフィッシュの筋肉組織から抽出した全脂質の、特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンを示す図である。
図２１は、実施例８に記載したように変更した、野生型、およびｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニック豚の尾部組織から抽出した全脂質の、特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す１対の部分的ガスクロマトグラフパターンである。
【００２６】
（詳細な記載）
下記に記載する研究は、とりわけ、ｎ−３不飽和化酵素をコードする核酸分子は様々な動物細胞のタイプで効率的に発現することができ、結果として、これらの細胞は相当な量のｎ−３ＰＵＦＡを内因性のｎ−６ＰＵＦＡから生成し、ｎ−６のｎ−３ＰＵＦＡに対する比はよりバランスがとれている（１：１）ことを説明するものである。研究は、インビボまたはインビトロで遺伝子導入を媒介することができる組換えアデノウィルスの発現ベクターを用いて行った。オメガ−３不飽和化酵素（例えば、ｆａｔ−１）または生物学的に活性なその変種（例えば、コドンが最適化された配列）を発現するアデノウィルスのベクター、ならびに他のタイプのウィルスおよび非ウィルスの発現ベクターは、本発明の範囲内である。
【００２７】
より詳しく述べると、本発明は、ｎ−６を対応するｎ−３脂肪酸に不飽和化する酵素をコードする配列を含む核酸分子を特徴とする。本発明者らの研究は、シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子がコードする不飽和化酵素に重点を置いているが、他の不飽和化酵素をコードする配列も本発明の核酸構築物に含むことができ、本発明の方法に用いることができる。例えば、コードされる不飽和化酵素は植物、シー・エレガンス以外の線虫、シアノバクテリア、またはＥＰＡに富む真菌類（例えば、ミズカビ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ））のものであってもよい。不飽和化酵素配列を供給することができる他の菌類には、サッカロミセス クリヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、およびミズカビ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）が含まれる。したがって、本発明は調節要素（例えば、恒常的に活性な、または組織に特異的なプロモーター）に操作可能に結合しているｎ−３不飽和化酵素をコードする配列を含む核酸分子を特徴とする。特異的なプロモーターは当技術分野では知られており、さらに以下に記載する。
【００２８】
ｎ−３不飽和化酵素をコードする配列は、少なくとも１つの最適化されたコドンを含むことができる。最適化されたコドンの数は、変化してもよい。その数は、発現のいくつかの局面（例えば、転写するコピー数）を改善し、その他の方法では配列の有用性を高めるのに十分であることが好ましい。ある場合には、ほんの少数（例えば、１〜５個）のコドンを変更することで配列を改善することができる。他の場合には、より多数（例えば、少なくとも５から１５０個まで）のコドンを最適化することができる。詳しい実施形態では、不飽和化酵素をコードする配列の最初の供給源に関係なく、核酸分子は５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、１４５〜１５０、１０〜１２５、２５〜１００、３０〜９０、４０〜８０、５０〜７０、または約６０個の最適化されたコドンを含むことができる。一実施形態では、核酸分子は、図１８に示した核酸の配列を含むことができる。
【００２９】
さらに、最適化されたコドンの位置は変化することができる。シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子に関しては、最適化されたコドンは６、９、１８、２０、２２、２４、２８〜３０、３３〜３６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６１、６４、６７、６９〜７１、７３、７７、７９、８１、８６、８９、９２、９４〜９５、１００、１０１、１０５、１０６、１１２、１１５、１１８、１２４、１２７、１２８、１３１、１４６、１５１、１５４、１６１、１６３、１６４、１６９、１７８、１８７、１８８、１９５、１９７、２００、２０２、２０６、２１０、２１４、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、２２８、２３２、２３４、２４１、２４５、２５５、２７１、２８０〜２８２、２８４、２８５、３０１、３０３、３１０、３１２、３２７、３６２、または３７０の位置の１つまたは複数に見出すことができる。シー・エレガンスのｆａｔ−１の遺伝子以外の不飽和化酵素をコードする遺伝子を用いる場合は、これらと同じ位置の１つまたは複数（すべてを含む）でコドンを最適化することができる。相同遺伝子（例えば、植物または菌類のｎ−３不飽和化酵素遺伝子）では、最適化される位置は、上記に列挙した位置に対応する位置であることができる。
【００３０】
上記に述べたように、本発明の核酸分子のいくつかは「単離されている」と言ってもよい。しかし、核酸配列が天然に存在する配列ではない場合には、この修飾語は必要ではないと考えられる。最適化されている配列（特にいくつかのコドンが最適化されているもの）が天然に存在する可能性があまりない場合には、これらの配列を「単離されている」と述べる必要はないと考える。したがって、天然に存在する配列である核酸分子は「単離されて」（その天然の環境においてそれが関連する成分のいくつか、ほとんど、またはすべてから分けられて）いなければならないが、天然に存在しない核酸分子（例えば、非天然の最適化された配列を有する核酸）は単離されていると表す必要はない。
【００３１】
調節要素および不飽和化酵素をコードする配列の他に、核酸分子は、それ（例えば、治療用のポリペプチド）が投与される対象に利益を与え、またはアッセイ（例えば、第２の配列がマーカータンパク質をコードすることができる）で分子の有用性を改善するポリペプチドをコードする配列を含むことができる。本明細書では、蛍光の例（例えば、ＧＦＰおよびＥＧＦＰ）を提供し、非蛍光マーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ）の例も提供する。他のマーカーまたは「レポーター」タンパク質は、当技術分野で知られており、日常的に使用されており、本明細書に記載する核酸構築物に組み入れることもできる。
【００３２】
核酸分子は、ベクター（例えば、発現ベクター）であってよく、またはベクターの一部であってもよい。本発明者らは、本発明者らがアデノウィルスのベクターを使用したことを上記で述べた（実施例も参照されたい）。本発明で発現構築物として用いることができる他のウィルスベクターには、ワクシニアウィルス（例えば、ポックスウィルス、もしくは変更ワクシニアウィルス アンカラ株（ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ））、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、またはヘルペスウィルスなどのウィルスに由来するベクターが含まれる。これらのウィルスには、ヒトの細胞を含む動物細胞に関して使用するためのいくつかの魅力的な特徴がある。例えば、単純ヘルペスウィルス（例えば、ＨＳＶ−１）を、ニューロンに不飽和化酵素（例えば、ｆａｔ−１またはその相同体（もしくはコドンが最適化されている変種を含む、生物学的に活性の変種）を送達するために選択することができる。このようなベクターは、例えば、神経変性疾患を処置し、または予防するのに有用である。
【００３３】
レトロウィルス、リポソーム、およびプラスミドベクターも、当技術分野でよく知られており、ｎ−３不飽和化酵素をコードする配列を細胞に送達するのにも用いてもよい（例えば、不飽和化酵素をコードする（例えば、ｆａｔ−１）配列をｌａｃＺ遺伝子に融合したい場合に、発現ベクターのｐＵＲ２７８を用いることができ、ｌａｃＺは検出可能なマーカーであるβ−ガラクトシダーゼをコードしている（例えば、Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２巻、１７９１頁、１９８３年を参照されたい））。
【００３４】
述べたように、不飽和化酵素をコードする配列（例えば、ｆａｔ−１配列）または生物学的に活性なその変種（コドンが最適化される配列を含む）は、発現された場合に、融合タンパク質の量または質（例えば、可溶性、または循環半減期）を改善する別の治療用の遺伝子または配列をコードする配列などの、他のタイプの非相同配列に融合することもできる。例えば、ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合した本発明のタンパク質を発現させることができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへ吸着させ、次いで遊離のグルタチオンの存在下で溶離することにより溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ、６７巻、３１〜４０頁、１９８８年）は、クローンされた標的の遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出できるように、トロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ切断部位を含むようにデザインされている。他の融合パートナーには、アルブミン、および免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ）の領域（例えば、ヒンジ領域のある、またはないＦｃ領域）が含まれる。他の有用なベクターには、ｐＭＡＬ（マサチューセッツ州、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびｐＲＩＴ５（ニュージャージー州、Ｐｉｃａｔａｗａｙ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれ、それぞれマルトースＥ結合性タンパク質、およびタンパク質Ａを、ｎ−３不飽和化酵素に融合させる。
【００３５】
導入遺伝子の発現は、あらゆる所与の発現ベクターをその導入遺伝子とともに再投与することが必要ないようにエピソーム系から十分に延長することができる。あるいは、ベクターは、好ましくは部位特異的位置において、宿主ゲノムへの組込みを促進するようにデザインすることができ、細胞の生存期間中に導入遺伝子が確実に失われないようにするのを助ける。送達の手段が何であっても、転写の制御は、宿主細胞が行い、組織特異性を促進し導入遺伝子の発現を調節する。したがって、本発明の核酸分子は、不飽和化酵素をコードする配列の宿主ゲノムへの組込みを促進する配列を含むことができる。
【００３６】
発現ベクターは、例えば、形質転換される宿主細胞のタイプ、および望まれるタンパク質発現のレベルに応じて選択し、またはデザインする。例えば、宿主細胞が哺乳動物の細胞の場合、発現ベクターは、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルス、およびシミアンウィルス４０由来のプロモーターなどのウィルスの調節要素を含むことができる。これらの調節要素を、非哺乳動物の（例えば、鳥類または魚類の）細胞でも用いることができる。挿入された核酸（すなわち発現されるべき配列、ここではｆａｔ−１がコードするもののようなｎ−３不飽和化酵素）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で優先的に利用される残基をコードするように変更することもできる（Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２０巻、２１１１〜２１１８頁、１９９２年）。同様に、必要に応じ、または所望により、大腸菌以外の生物でコドンを優先的に変更することができる。これらのような変更（例えば、様々な調節要素の組入れおよびコドンの最適化）は、標準の組換え技術により実現することができる。より一般的には、本発明の発現ベクターを、原核生物の、または真核生物の細胞でタンパク質を発現するようにデザインすることができる。例えば、本発明のポリペプチドを、細菌の細胞（例えば、大腸菌）、真菌、酵母菌、または昆虫の細胞で（例えば、バキュロウィルスの発現ベクターを用いて）発現させることができる。例えば、オートグラファカリフォルニカ核多角体ウィルス（ＡｃＮＰＶ）などのバキュロウィルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞で増殖し、ｎ−３不飽和化酵素を発現するベクターとして用いることができる。本発明はそれだけに限定されないが、発現の主要な目的がオメガ−３不飽和化酵素の生成および精製である場合は、大腸菌、酵母菌、および昆虫細胞が宿主細胞として働くと、本発明者らは予想している。本明細書で述べたように、本発明は、広範囲の様々なタイプのトランスジェニック動物内におけるものを含む、より高等な目（もく）の細胞におけるオメガ−３不飽和化酵素の発現も含む。
【００３７】
上記したように、宿主細胞が多細胞動物から得られ、または多細胞生物の細胞である場合は、不飽和化酵素を発現するために用いられる発現ベクターおよび核酸（例えば、ｆａｔ−１核酸配列）は、組織に特異的なプロモーターも含むことができる。このようなプロモーターは当技術分野では知られており、それだけには限定されないが、肝臓に特異的なプロモーター（例えば、アルブミン；Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１巻、５１２４〜５１３２頁、１９９７年）、筋肉に特異的なプロモーター（例えば、ミオシン軽鎖１（Ｓｈｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、８巻、４０３〜４１０頁、１９９７年）またはα−アクチン）、膵臓に特異的なプロモーター（例えば、インスリンまたはグルカゴンのプロモーター）、神経に特異的なプロモーター（例えば、チロシンヒドロキシラーゼのプロモーター、またはニューロンに特異的なエノラーゼプロモーター）、内皮細胞に特異的なプロモーター（例えば、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｔ；Ｏｚａｋｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻、１４８３〜１４９０頁、１９９６年）、および平滑筋細胞に特異的なプロモーター（例えば、２２ａ）が含まれる。腫瘍に特異的なプロモーターは癌治療を開発するのにも使用されており、Ｂ１６メラノーマに対するチロシンキナーゼ特異的プロモーター（Ｄｉａｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻、７８９〜７９５頁、１９９８年）、ある種の乳癌に対するＤＦ３／ＭＵＣ１（Ｗｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５３巻、６４１〜６５１頁、１９９３年；乳癌には、ヒトアロマターゼチトクロームｐ４５０（ｐ４５０ａｒｏｍ）の脂肪に特異的なプロモーター領域も用いることができる（米国特許第５４４６１４３号；Ｍａｈｅｎｄｒｏｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻、１９４６３〜１９４７０頁、１９９３年；およびＳｉｍｐｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３９巻、３１７〜３２４頁、１９９３年を参照されたい）が含まれる。α−フェトプロテインのプロモーターは、肝細胞癌で直接発現させるために用いることができる（Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５巻、５２８３〜５２８７頁、１９９５年）。組織に特異的な発現が必要とされず、または望まれない場合、ｎ−３不飽和化酵素をコードする配列は、恒常的に活性なプロモーター（例えば、β−アクチンのプロモーター）の制御下におく（すなわち操作可能に結合する）ことができる。他の恒常的に活性なプロモーターは、当技術分野で知られており使用されている。
【００３８】
本発明のベクターおよび他の核酸分子（例えば、ｆａｔ−１ｃＤＮＡ自身）は、導入遺伝子の一時的発現を制限する配列も含むことができる。例えば、導入遺伝子は、例えば、プロモーターにｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）のエンハンサーを含むことにより、また、形質移入されまたは感染した細胞をｃＡＭＰ変調性の薬物で処置することにより、薬物誘導性のプロモーターにより制御され得る（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻、１８８３〜１８９３、１９９６年）。あるいは、リプレッサー因子は、薬物の存在下で転写を防止することができる（Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻、３３３９〜３３４３頁、１９９７年）。発現の空間的制御は、また、電離放射線（放射線治療）をｅｒｇ１遺伝子のプロモーターと組み合わせて用いて実現することができている。このような制御配列を含む構築物は、本発明の範囲内である。
【００３９】
発現ベクターを含めた、本明細書に記載する核酸分子を含む宿主細胞も、本発明の範囲内である。細胞は原核生物でも真核生物でもよい。適切な原核生物細胞は細菌の細胞を含み、適切な真核生物細胞は哺乳動物、鳥類、および魚類の細胞を含む。細胞系は、確立され公共の保管場所に保管されているものを含み、宿主細胞として用いることもできる。これらのあらゆる細胞を、特に核酸配列を最適化する過程で使用することができる。細胞は、健常であるとも疾患を有するとも考えることができる（例えば、細胞が炎症により影響を受けることもあり、あるいは望ましくない（例えば、望ましくなく早い）速度で形質転換され、かつ／または増殖するものであってもよい。
【００４０】
本明細書に記載する核酸、およびそれらがコードするタンパク質を、医薬組成物に含むことができる。例えば、組成物は、本明細書に記載する発現ベクター、および生理的に許容される希釈剤（例えば、通常の食塩水、またはリン酸緩衝食塩水などの生理的に許容されるバッファー）を含むことができる。確かに治療上または予防上の方策にヒト対象が意図されるが、本発明はそれだけに限定されない。医薬組成物を、家畜、ペット、動物園もしくはサーカスの動物、または野生で負傷しもしくは病んで見出された動物のために、配合し、投与してもよい。対象に関係なく、根底をなす疾患または状態を処置が完全に根治しなくても、処置は成功であるとみなすことができる。疾患の徴候あるいは症状の１つまたは複数を改善し、または疾患（例えば、神経変性疾患または癌）の進行を遅延することも有益であり、本明細書に記載した組成物を用いて実現することができる。核酸分子は、濃縮された形態で、または対象に投与するのに適する量（例えば、治療上有効な量）で存在できる。対象に投与する際に、対象で細胞のｎ−３ＰＵＦＡ含有量が増加し、かつ／またはｎ−６：ｎ−３ＰＵＦＡの比がより好ましくバランスがとれる程度まで、核酸がｎ−３不飽和化酵素を発現する場合に、投与した量が治療上有効であるとみなされる。
【００４１】
本発明は、本明細書に記載する核酸分子を含むヒト以外のトランスジェニック動物（例えば、哺乳動物、鳥類、または魚類）も含む。動物は、食用（例えば、ヒトまたは他の動物（例えば、家畜もしくはペット）による摂取）に飼われ、飼育され、捕獲され、または狩猟されるものであってよい。述べたように、哺乳動物はウシ、ブタ、またはヒツジであってよく、鳥類はニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、または猟鳥であってよく、魚類はサケ、マス、またはマグロであってよい。
【００４２】
これらのヒト以外のトランスジェニック動物、またはその組織もしくは加工された部分を含む食品または栄養補助食品も、本発明の範囲内である。製品は、（動物全体、または動物の部分すべて（例えば、関節、指関節、もしくは臓器）の場合のように）非加工でもよく、屠殺した動物またはその部分（例えば、骨、脂肪、皮膚、もしくはそれらから得た油）から加工してもよい。栄養補助食品（例えば、魚油カプセル）を製造する方法は、当技術分野では知られており、本発明の遺伝子を変更したあらゆる動物の使用に応用することができる。本発明は、本明細書に記載した動物（例えば、トランスジェニックの哺乳動物、鳥類、または魚類）から食品または栄養補助食品を製造する方法も含む。これらの方法は、現在知られているあらゆるプロセスを含むあらゆる方法で行うことができ、その供給源は、単に、本明細書に記載したように生成されたヒト以外のトランスジェニック動物（もしくはその部分）であり、またはそれを含む。
【００４３】
本発明の他の方法は、上記した食品または栄養補助食品を対象に投与することにより、対象の食餌におけるｎ−３脂肪酸の含有量を改善することを含む。対象は、明らかに健康であってもよく、あるいは癌（例えば、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、子宮頸癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、頭頸部癌、膵臓癌、血液癌、または卵巣癌）を有すると診断されていてもよい。本明細書に記載した組成物を、例えば、本明細書に記載した核酸分子の治療上有効な量を対象に投与することにより、対象におけるニューロンの細胞死を阻害する方法に用いることもできる。したがって、対象は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病）を有すると診断された者であってよい。他の処置可能な、または予防可能な状態には、不整脈、心臓血管疾患、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、網膜または脳の形成異常または切迫形成異常、糖尿病、肥満、皮膚障害、腎臓疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、または慢性閉塞性肺疾患が含まれる。対象が、生物学的な臓器、組織、または細胞を含む移植体を受け、または受ける予定であるものであってもよい。対象または移植体のいずれかに、本明細書に記載した核酸分子を投与することにより、この方法を行うことができる。
【００４４】
述べたように、本明細書に記載した核酸分子（コドン使用頻度が宿主に最適化されたものを含めて）を用いて、ヒト以外のトランスジェニック動物を産生することができる。本発明はそれだけに限定されないが、核酸は、飼育され、または他には食料源とみなされる動物を遺伝的に変更するために最も頻繁に用いられるであろうと、本発明者らは予想している。動物は、当技術分野で知られている技術を用いて産生することができる。より詳しくは、哺乳動物および魚類は、以下の実施例に記載した方法を用いて産生することができる。
【００４５】
詳しい実施形態では、本発明は、ｎ−６脂肪酸を対応するｎ−３脂肪酸に不飽和化する酵素をコードする核酸配列を含むトランスジェニック魚類またはトランスジェニック鳥類を特徴とする。トランスジェニック魚類は、タラ目タラ科のタラまたは任意の魚類、オヒョウ、ニシン目のニシンまたは任意の魚類、サバ科のサバまたは任意の魚類、マスを含めたサケ科のサケまたは任意の魚類、スズキ科のスズキまたは任意の魚類、ニシン科のシャッドまたは任意の魚類、ガンギエイ科のガンギエイまたは任意の魚類、キュウリウオ科のスメルトまたは任意の魚類、ササウシノシタ科のシタビラメまたは任意の魚類、およびサバ科のマグロまたは任意の魚類であることができる。他の魚類は、上記したものであり、当業者に知られている。
【００４６】
トランスジェニック魚類またはトランスジェニック鳥類を生成する際に、シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子を含む核酸配列を含む、本明細書に記載したあらゆる核酸配列を用いることができる。あらゆる核酸配列は、少なくとも１つの最適化されたコドンを含むことができる。例えば、配列は少なくとも５個から１５０個までの最適化されたコドンを含むことができる。詳しい実施形態では、不飽和化酵素をコードする配列の最初の供給源に関係なく、トランスジェニック鳥類またはトランスジェニック魚類を産生するために用いられる核酸分子は、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、１４５〜１５０、１０〜１２５、２５〜１００、３０〜９０、４０〜８０、５０〜７０、または約６０個の最適化されたコドンを含むことができる。一実施形態では、魚類または鳥類の中の導入遺伝子は、図１８に示した核酸の配列を含む核酸分子を含むことができる。
【００４７】
他に示されるように、最適化されたコドンの位置は、ヒト以外のトランスジェニック動物（例えば、本明細書に記載した哺乳動物、鳥類、および魚類）を生成するのに用いられる構築物で変化することがある。シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子に関しては、最適化されたコドンは、６、９、１８、２０、２２、２４、２８〜３０、３３〜３６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６１、６４、６７、６９〜７１、７３、７７、７９、８１、８６、８９、９２、９４〜９５、１００、１０１、１０５、１０６、１１２、１１５、１１８、１２４、１２７、１２８、１３１、１４６、１５１、１５４、１６１、１６３、１６４、１６９、１７８、１８７、１８８、１９５、１９７、２００、２０２、２０６、２１０、２１４、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、２２８、２３２、２３４、２４１、２４５、２５５、２７１、２８０〜２８２、２８４、２８５、３０１、３０３、３１０、３１２、３２７、３６２、または３７０の位置の１つまたは複数に見出すことができる。シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子以外の不飽和化酵素をコードする遺伝子を用いる場合、コドンはこれらの同じ位置の１つまたは複数（すべてを含む）で最適化され得る。相同遺伝子を用いる場合には（例えば、植物または菌類のｎ−３不飽和化酵素遺伝子）、最適化する位置は上記に列挙した位置に対応するものであってよい。
【００４８】
以下の実施例では、ＲＮＡ分析および酵素アッセイを行って遺伝子発現を評価し、ガスクロマトグラフィー質量分析法を用いて脂肪酸プロファイルを決定した（これらは、ｆａｔ−１配列のあらゆる変種の生物学的活性を評価するために当業者が用いることができる標準的な技術であり、またはｆａｔ−１を発現させるために患者から得たサンプルを評価するあらゆる方法を含んでいる）。
【００４９】
以下に記載した試験のいくつかは、皮質ニューロンを用いて行った。ｆａｔ−１の発現は、細胞のｎ−３：ｎ−６脂肪酸比、およびこれらのニューロンにおけるエイコサノイドプロファイルを変更しただけではなく、細胞をアポトーシスから保護し、その結果細胞の生存度を上昇させもした。より詳しく述べると、ｆａｔ−１の発現は、外因性のｎ−３ＰＵＦＡの補足なしに、脂肪酸比を変更し、増殖因子の投与中止が誘発するアポトーシスからラットの皮質ニューロンを保護した。したがって、本明細書に記載した核酸分子（および他の組成物）、をあらゆる神経変性疾患を有する未熟児に、および年長の患者に投与することができる（あるいは、その部分をその後患者が摂取する分子または他の組成物を動物に送達することができる）神経保護薬として用いることができる。ニューロンのアポトーシスに対する遺伝子導入の保護効果は、ｎ−３脂肪酸の補足の保護効果を模倣するものである。
【００５０】
ｎ−３ＰＵＦＡが欠乏すると、特に未熟児で網膜および脳の異常な発達がもたらされ（Ｕａｕｙら、Ｌｉｐｉｄｓ、３６巻、８８５〜８９５頁、２００１年）、ｎ−３ＰＵＦＡの欠乏した動物は記憶、空間および脈絡に依存する学習の欠損を示し、ならびに視覚の鋭敏さを欠く（Ｃａｒｒｉｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、２６６巻、６９〜７２頁、１９９９年；Ｙｅｈｕｄａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、５６巻、５６５〜７０頁、１９９９年）ので、ニューロンで得られた前向きな結果は特に励みとなる。ヒトにおける様々な神経学的な疾患の状態が、ｎ−３欠乏状態に関連するという指摘もある（Ｖａｎｃａｓｓｅｌら、Ｐｒｏｓｔ．Ｌｅｕｋ．Ｅｓｓ．Ｆａｔｔ．Ａｃｉｄｓ、６５巻、１〜７頁、２００１年；ＨｏｆｆｍａｎおよびＢｉｒｃｈ、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ、８３巻、５２〜６９頁、１９９８年）。
【００５１】
ＰＵＦＡの生物学的機能は、本明細書に記載する核酸分子（および他の組成物）での処置に敏感に反応する状態のタイプに効果があるので、これらの機能をさらにここに記載する。ＰＵＦＡは、膜のリン脂質の重要な構造上の構成成分であり、プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンを含むシグナリング分子（エイコサノイド）のファミリーの前駆物質である（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５５巻、６９〜１０２頁、１９８６年；ＳｍｉｔｈおよびＢｏｒｇｅａｔ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」、Ｄ．Ｅ．ＶａｎｃｅおよびＪ．Ｅ．Ｖａｎｃｅ編集、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、カリフォルニア州、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、００３２５〜３６０頁、１９８６年）。ＰＵＦＡ由来のエイコサノイドは、炎症、サイトカインの放出、免疫反応、血小板凝集、脈管反応性、血栓症、およびアレルギー現象を変調する上で重要な役割を果たす（Ｄｙｅｒｂｅｒｇら、Ｌａｎｃｅｔ、２巻、１１７〜１１９頁、１９７８年；ＣｙｅｒｂｅｒｇおよびＢａｎｇ、Ｌａｎｃｅｔ、２巻、４３３〜４３５頁、１９７９年；Ｊａｍｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７巻、３４３Ｓ〜３４３８Ｓ頁、２０００年；Ｃａｌｄｅｒ、Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．、４１巻、２０３〜２３４頁、１９９７年）。これらのシグナリング化合物の主要な脂肪酸前駆物質は、シリーズ２化合物の主要な合成を担うｎ−６基質を提供するアラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ６）、およびさらなる二重結合を有する多くのシリーズ３のエイコサノイドのパラレル合成を担うｎ−３基質であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ３）である。リン脂質におけるｎ−６：ｎ−３比は、ＡＡおよびＥＰＡに由来する２および３シリーズのエイコサノイド間のバランスを調節する。ＡＡ（シリーズ２）およびＥＰＡ（シリーズ３）由来のエイコサノイドは、機能的に異なり、いくつかの重要な対立する生理学的機能を有する（Ｄｙｅｒｂｅｒｇら、Ｌａｎｃｅｔ、２巻、１１７〜１１９頁、１９７８年；ＣｙｅｒｂｅｒｇおよびＢａｎｇ、Ｌａｎｃｅｔ、２巻、４３３〜４３５頁、１９７９年；Ｊａｍｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７巻、３４３Ｓ〜３４３８Ｓ頁、２０００年；Ｃａｌｄｅｒ、Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．、４１巻、２０３〜２３４頁、１９９７年）。シリーズ３のエイコサノイドは弱い作動物質であり、または、ある場合には、シリーズ２エイコサノイドの拮抗物質である。例えば、２シリーズのエイコサノイドは炎症および血小板凝集を促進し、免疫反応を活性化するが、シリーズ３のエイコサノイドはこれらの作用を回復させる傾向がある。さらに、遊離脂肪酸の形態のＰＵＦＡは、遺伝子の発現および細胞間の細胞間情報交換に関与する（Ｐｒｉｃｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ、１１巻、３〜７頁、２０００年；Ｓｅｌｌｍａｙｅｒら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、追補Ｓ３７〜Ｓ４０頁、１９９６年；ｖｏｎＳｃｈａｃｋｙ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２８巻、５〜６頁、１９９６年）。このように、ＰＵＦＡは、多くの様々な生物学的効果を表すことができる。
【００５２】
本明細書に記載した組成物および方法を、様々な特定の状態を処置し、また最初の健康状態（例えば、不良、平均、または良好）に関係なく一般的な健康を増進するために用いることができる。ｎ−３ＰＵＦＡの投与による処置に敏感に反応するあらゆる状態は、ｎ−３不飽和化酵素をコードする遺伝子（例えば、シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子）の投与を含めた、本発明の方法による処置に敏感に反応する。処置に敏感に反応する状態のいくつかを、本明細書に記載してある。
【００５３】
ｎ−３ＰＵＦＡは、薬物および栄養補助化合物として、かなりの注目を集めている（Ｃｏｎｎｏｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７０巻、５６０Ｓ〜５６９Ｓ頁、１９９９年；Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７０巻、５６２Ｓ〜５６９Ｓ頁、１９９９年；Ｓａｌｅｍら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、Ｓ１〜Ｓ３２６頁、１９９６年）。過去２５年の間に、４５００を超える研究で、ｎ−３脂肪酸がヒトの代謝および健康（例えば、心臓血管上の健康）に及ぼす効果が探索されている。疫学から細胞培養まで、および動物試験から無作為の対照試験まで、オメガ−３脂肪酸の心臓保護効果が認められている（ＬｅａｆおよびＫａｎｇ、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ．、８３巻、２４〜３７頁、１９９８年；Ｄｅ Ｃａｔｅｒｉｎａら編集、「ｎ−３ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９９年、１６６頁；Ｏ’ＫｅｅｆｅおよびＨａｒｒｉｓ、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．、７５巻、６０７〜６１４頁、２０００年）。優れた有益な効果には、突然死の減少（Ａｌｂｅｒｔら、ＪＡＭＡ、２７９巻、２３〜２８頁、１９９８年；Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋら、ＪＡＭＡ、２７４巻、１３６３〜１３６７頁、１９９５年）、不整脈の危険性の減少（ＫａｎｇおよびＬｅａｆ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９４巻、１７７４〜１７８０頁、１９９６年）、血漿トリグリセリドレベルの低下（Ｈａｒｒｉｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、６５巻、１６４５Ｓ〜１６５４Ｓ、１９９７年）、ならびに血液凝固傾向の低下（Ａｇｒｅｎら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄ．Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ、５７巻、４１９〜４２１頁、１９９７年；Ｍｏｒｉら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍ．Ｂａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、１７巻、２７９〜２８６頁、１９９７年）が含まれる。疫学上の研究からの証拠が示すのは、別のｎ−３脂肪酸であるα−リノレン酸が心筋梗塞の危険性を低下させ（Ｇｕａｌｌａｒら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、１９巻、１１１１〜１１１８頁、１９９９年）、および女性における死にいたる虚血性心疾患の危険性を低下させることである（Ｈｕら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、６９巻、８９０〜８９７頁、１９９９年）。いくつかの無作為対照試験により、最近、冠状動脈疾患を有する患者における冠状動脈の罹患率および死亡率両方に対する、α−リノレン酸（ｄｅ Ｌｏｒｇｅｒｉｌら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９９巻、７７９〜７８５頁、１９９９年）および海洋のオメガ−３脂肪酸（Ｓｉｎｇｈら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇｓ Ｔｈｅｒ．、１１巻、４８５〜４９１頁、１９９７年；Ｖｏｎ Ｓｃｈａｃｋｙら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１３０巻、５５４〜５６２頁、１９９９年；ＧＩＳＳＩ−Ｐｒｅｖｅｎｚｉｏｎｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ、Ｌａｎｃｅｔ、３５４巻、４４７〜４５５頁、１９９９年）両方の有益な効果が説明されている。ｎ−３脂肪酸であるＥＰＡは、インビトロおよび実験的な癌の動物モデルで抗癌活性を発揮している（Ｂｏｕｇｎｏｕｘ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｅ、２巻、１２１〜１２６頁、１９９９年；Ｃａｖｅ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、４６巻、２３９〜２４６頁、１９９７年）。ヒトでの研究では、ＥＰＡに富む食事を摂取している集団は、著しく低い癌の発病率を示すことが示されている（ＲｏｓｅおよびＣｏｎｎｏｌｌｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、８３巻、２１７〜２４４頁、１９９９年）。ｎ−３ＰＵＦＡの補足により、関節炎などの炎症性疾患および自己免疫疾患に対する治療効果が示され（Ｋｒｅｍｅｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７１巻、３４９Ｓ〜３５１Ｓ頁、２０００年；Ａｒｉｚａ−Ａｒｉｚａら、Ｓｅｍｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、２７巻、３６６〜３７０頁、１９９８年；Ｊａｍｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７１巻、３４３Ｓ〜３４８Ｓ頁）、ヒト以外の霊長類での研究（Ｎｅｕｒｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻、４０２１〜４０２５頁、１９８６年）およびヒト新生児での研究（Ｕａｕｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｏｃ．、５９巻、３〜１５頁、２０００年；Ｕａｕｙら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、Ｓ１６７〜１７６頁、１９９６年）は、ｎ−３脂肪酸であるＤＨＡが、特に未熟児の網膜および脳の正常の機能の発達に不可欠であることを指摘している。さらに、ｎ−３ＰＵＦＡは、高血圧（Ａｐｐｅｌら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１５３巻、１４２９〜１４３８頁、１９９３年）、糖尿病（Ｒａｈｅｊａら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６８３巻、２５８〜２７１頁、１９９３年）、肥満（Ｃｌａｒｋｅ、Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．、８３巻、Ｓ５９〜６６頁、２０００年）、皮膚障害（Ｚｉｂｏｈ、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ．、６６巻、４２５〜４３５頁、１９９１年）、腎臓疾患（Ｄｅ Ｃａｔｅｒｉｎａら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、４４巻、８４３〜８５０頁、１９９３年）、潰瘍性大腸炎（Ｓｔｅｎｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１１６巻、６０９〜６１４頁、１９９２年）、クローン病（Ｂｅｌｌｕｚｚｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３４巻、１５５７〜１５６０頁、１９９６年）、慢性閉塞性肺疾患（Ｓｈａｈａｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３１巻、２２８〜２３３頁、１９９４年）、および移植臓器の拒絶反応（Ｏｔｔｏら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５０巻、１９３〜１９８頁、１９９０年）など、多くの他の臨床上の問題に有益な効果があることが示されている。一般に、身体の脂質のバランスのとれたｎ−６：ｎ−３の比は、正常の増殖および発達に不可欠であり、多くの臨床上の問題の予防および処置で重要な役割を果たしている。上記した疾患、障害、および状態は、本明細書に記載した核酸分子（および他の組成物）での処置に敏感に反応する。例えば、これらの疾患、障害、および状態は、ｎ−３不飽和化酵素をコードする発現ベクター（例えば、ｆａｔ−１遺伝子配列を含む発現ベクター）（例えば、上記したもの）を対象に投与することにより、処置し、または予防することができる。この疾患、障害、または状態は、処置し、または予防することができる。
【００５４】
最近の研究によれば（Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｕｓ、Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７９巻、９６１〜９７０頁、２０００年）、今日の食事におけるｎ−６のｎ−３に対する必須脂肪酸の比は、約１０〜２０：１である。これは、現在の西欧の食事は、ヒトが進化しヒトの遺伝子パターンが確立された食事（ｎ−６／ｎ−３＝１：１）に比べてｎ−３脂肪酸が欠乏していることを示している（ＬｅａｆおよびＷｅｂｅｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．、４５巻、１０４８〜１０５３頁、１９８７年）。ｎ−６およびｎ−３脂肪酸は、代謝上および機能上異なり、対立する重要な生理学的機能を有するので、これらのバランスは恒常性、および正常の発達に重要である。しかし、哺乳動物の細胞は酵素のｎ−３不飽和化酵素を欠くので、ヒトの体ではｎ−３およびｎ−６ＰＵＦＡは相互転換可能ではない。したがって、生物学的な膜におけるｎ−６とｎ−３ＰＵＦＡの間のバランスは、食事による供給をもとに調節される。ヒト対象または動物でｎ−３脂肪酸の組織濃度を上昇させることは、ｎ−３ＰＵＦＡを富ませた食品またはｎ−３ＰＵＦＡサプリメントの摂取を増加することによる。ｎ−３ＰＵＦＡの潜在的な治療上の作用を仮定して、国際科学ワーキンググループは、ｎ−６脂肪酸の摂取が減少しｎ−３脂肪酸の摂取が増加した食事を推薦している（Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｕ、Ｆｏｏｄ Ａｕｓｔｒａｌｉａ、５１巻、３３２〜３３３頁、１９９９年）。米国心臓協会（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）も、最近このような食事の勧告を作成した（ＡＨＡ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：２０００年改訂、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０２巻、２２８４〜２２９９頁、２０００年）。
【００５５】
ｎ−３ＰＵＦＡで食事を補足することは安全な介入であるが、数々の制限がある。例えば、インビボでｎ−３ＰＵＦＡの組織濃度の大幅な上昇を実現するには、少なくとも２〜３カ月の期間、高用量のｎ−３ＰＵＦＡを長期間摂取することを必要とする。食事から細胞への脂肪酸のバイオアベイラビリティには、脂肪の消化、吸収、輸送、および代謝を含む一連の生理学的過程が関与する。したがって、食事介入の有効性は、個体の生理学的状態および健康状態に依存する。危険な状態にある患者、または消化器障害を有する患者は、脂肪の多い食事またはｎ−３ＰＵＦＡサプリメントを消化し、または吸収することができない可能性がある。さらに、カプセル化した魚油サプリメントは、カロリー含有量が高いので、ヒトの生涯を通した日常の使用に適する可能性がない。さらに、沿岸水および湖水由来のある種類の魚を摂取すると、有毒となる量の水銀または有機毒素が含まれることがあり、有効な食事介入には、ある者にとっては耐えることができないことがある、食習慣の厳しい変更が必要となる。前述のことを考慮すると、魚または魚油サプリメントの長期摂取にたよらずに細胞のｎ−３ＰＵＦＡ含有量を迅速かつ効果的に上昇させ、ｎ−６：ｎ−３比のバランスを取る手段が大いに必要とされている。この必要性は、（その細胞が非トランスジェニック動物よりも実質的に多くのｎ−３ＰＵＦＡを含むトランスジェニックの家畜により）代替の食料源を作り出し、またはｎ−３不飽和化酵素をコードする遺伝子を患者（例えば、ヒト患者）に投与することをもたらす本発明の方法により満たされる。本方法の特定の利点は、ｎ−３ＰＵＦＡの組織濃度を上昇させるだけではなく、同時に過剰の外因性ｎ−６ＰＵＦＡのレベルも低下させることでもある。
【００５６】
実施例
実施例１：組換えアデノウィルスの構築
Ｈｅらが記載した方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、２５０９〜２５１４頁、１９９８年）と同様の以下の手順で、ｆａｔ−１遺伝子を有する組換えアデノウィルスを構築した。ｐＣＥ８中のｎ−３脂肪酸不飽和化酵素ｃＤＮＡ（ｆａｔ−１遺伝子）は、Ｊ．Ｂｒｏｗｓｅ博士（ワシントン州立大学）の好意により提供された（しかし、当業者に入手可能の情報および技術を用いて合成し、またはクローニングすることができる。Ｓｐｙｃｈａｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１１４２〜１１４７頁、１９９７年；米国特許第６１９４１６７号；図１７Ａおよび１７Ｂを参照されたい）。ｐＣＥ８のｃＤＮＡ挿入断片を、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで二重切断してプラスミドから切り出し、シャトルベクター（shuttler vector）に挿入し、次いでＨｅら（前掲）の方法にしたがってアデノウィルスのバックボーンとの組換えを行った。２つの第１世代のタイプ５の組換えアデノウィルス、すなわちサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、レポーター遺伝子として）を有するＡｄ．ＧＦＰおよびそれぞれ別々のＣＭＶプロモーターの制御下のｆａｔ−１遺伝子およびＧＦＰ遺伝子の両方を有するＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１が生じた。組換えウィルスを、先に記載したように（Ｈａｊｊａｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９５巻、４２３〜４２９頁、１９９７年）、２９３細胞で増殖させることにより高力価保存株として調製した。構築物を、酵素消化およびＤＮＡ配列分析により確認した。Ｈａｊｊａｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９５巻、４２３０４２９頁、１９９７年、およびＨａｊｊａｒら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、８１巻、１４５〜１５３頁、１９９７年も参照されたい。
【００５７】
野生型アデノウィルスの汚染を評価することができ、ＰＣＲで検出可能なＥ１配列が存在せず、かつ非許容のＡ５４９細胞系に対する細胞変性効果が存在しないことにより汚染が除外されることを示すことができる。必要または所望であれば、他のプロモーターを有する代替のアデノウィルスベクターまたはアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターを構築することができる。
【００５８】
実施例２：心筋細胞のアデノウィルスとの培養および感染
国際心筋細胞単離システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ニュージャージー州、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）を用いて、心筋細胞を１日齢のラットから単離した。単離した細胞を、６ウェルプレートに配置し、５％ウシ胎児血清および１０％ウマ血清を含むＦ−１０培地で、３７℃で組織培養インキュベーター中５％ＣＯ２、相対湿度９８％で培養した。２〜３日培養後、細胞を実験に使用した。２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地に様々な濃度（５×１０９〜１０１０ｐｆｕ）のウィルス粒子を加えてウィルス感染を行った。２４時間インキュベーション後、感染培地を、１０μＭの１８：２ｎ−６および２０：４ｎ−６を補足した通常の（１５％血清）培地で置き換えた。感染約４８時間後に細胞を使用することができる（例えば、次いで遺伝子の発現、脂肪酸の組成、生存度、または成長（例えば、増殖または分裂速度）を分析することができる）。
【００５９】
実施例３：蛍光顕微鏡およびＲＮＡ分析によるｆａｔ−１発現の検出
遺伝子発現は、分子生物学の分野で知られている多くの方法により評価することができる。ここでは、上記したように感染させた心筋細胞におけるｆａｔ−１の発現を、感染細胞の肉眼検査およびリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）プロテクションアッセイにより評価した。
【００６０】
より詳しく述べると、ＧＦＰの共発現により、本発明者らは感染し導入遺伝子を発現する細胞を同定できるようになった。感染約４８時間後に、ほとんどすべての細胞（＞９０％）が明るい蛍光を示し、遺伝子導入の効率が高く、導入遺伝子の発現レベルが高いことを示していた（図１を参照されたい）。ｆａｔ−１転写物の発現は、また、ＲＰＡＩＩＩ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮａｓｅプロテクションアッセイにより測定した。手短に述べると、ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い製造元のプロトコールに従い、全ＲＮＡを培養細胞から抽出した。ｆａｔ−１遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＥ８を線状化し、転写テンプレートとして使用した。アンチセンスのＲＮＡプローブを３３Ｐ−ＵＴＰを用いてインビトロで転写し、筋細胞から抽出した全ＲＮＡとハイブリダイズし、ＲＮａｓｅで消化し、ハイブリダイズされなかったＲＮＡおよびプローブを除去した。保護されたＲＮＡ：ＲＮＡを条件付きバッファーによる電気泳動により単離し、オートラジオグラフィーにかけた。対照として、β−アクチン遺伝子を標的とするプローブを用いた。ｆａｔ−１のｍＲＮＡは、ＡＤ．ＧＦＰ（やはり対照として使用した）に感染した細胞では検出されなかったが、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞では豊富であった（図２）。この結果は、アデノウィルスを介した遺伝子導入は、通常その遺伝子を欠くラット心筋細胞にｆａｔ−１遺伝子の非常に高い発現を付与することを示している。
【００６１】
実施例４：脂質分析；ｎ−３不飽和化酵素の脂肪酸組成に及ぼす効果
脂質分析により、心筋細胞（またはあらゆる他の細胞型）におけるｆａｔ−１遺伝子の発現によりｎ−６脂肪酸がｎ−３脂肪酸に転換されるか否か、またそれにより、細胞の脂肪酸組成が変化するか否かを決定することができる。上記したアデノウィルスでの感染の後、細胞をｎ−６脂肪酸（１０μＭ１８：２ｎ−６および１０μＭ２０：４ｎ−６）を補足した培地中で２〜３日間インキュベートした。インキュベート後、全細胞脂質の脂肪酸組成を先に記載されている（Ｋａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１１２８巻、２６７〜２７４頁、１９９２年；Ｗｅｙｌａｎｄｔら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、９７７〜９８２頁、１９９６年）ように分析した。
【００６２】
０．００５％ブチル化ヒドロキシトルエン（抗酸化剤として）を含むクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）で脂質を抽出した。１４％ＢＦ３／メタノール試薬を用いて脂肪酸メチルエステルを調製した。脂肪酸メチルエステルは、ＳｕｐｅｌｃｏｗａｘＳＰ−１０キャピラリーカラムを装着したＨＰ５８９０シリーズＩＩガスクロマトグラフにＨＰ−５９７１質量分析計を接続したものを用いて、ＧＣ／ＭＳにより定量する。注入部および検出部は、それぞれ２６０℃および２８０℃に維持する。オーブンのプログラムは、最初１５０℃で２分間維持し、次いで１０℃／分で２００℃まで上げ４分間保持し、５℃／分で２４０℃まで再度上げ３分間保持し、最後に１０℃／分で２７０℃まで上げ５分間維持する。キャリアガス流量は終始、一定の０．８ｍＬ／分で維持する。５０〜５５０原子質量単位の質量範囲を含めて全イオン検出を行う。様々な分析した脂肪酸の面積を、内部標準の一定濃度の面積と比較することにより、脂肪酸の質量を決定する。
【００６３】
Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照細胞とＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞との間で、脂肪酸のプロファイルは著しく異なっていた（図３）。さらに、Ａｄ．ＧＦＰに感染した細胞では、非感染細胞と比較して、それらの脂肪酸プロファイルに変化は表れなかった。ｆａｔ−１遺伝子（ｎ−３不飽和化酵素）を発現した細胞では、ほとんどすべての種類のｎ−６脂肪酸が対応するｎ−３脂肪酸に、すなわち１８：２ｎ−６から１８：３ｎ−３に、２０：２ｎ−６から２０：３ｎ−３に、２０：３ｎ−６から２０：４ｎ−３に、２０：４ｎ−６から２０：５ｎ−３に、および２２：４ｎ−６から２２：５ｎ−３に概ね転換された。結果として、ｆａｔ−１を発現する細胞の脂肪酸組成は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照細胞の脂肪酸組成に対して大幅に変化した（図５）。重要なことは、ｎ−６：ｎ−３の比が、対照細胞における１５：１から、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を発現する細胞における１：１．２に減少したことである。
【００６４】
実施例５：ｆａｔ−１発現に続くエイコサノイドの測定
２０：４ｎ−６（ＡＡ）および２０：５ｎ−３（ＥＰＡ）は、それぞれ２−シリーズおよび３−シリーズのエイコサノイドの前駆物質であるため、ＡＡおよびＥＰＡの含有量の違いが細胞におけるエイコサノイドの産生の違いをもたらすことがある。したがって、本発明者らは、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７で刺激した後、感染細胞におけるエイコサノイドの産生を、プロスタグランジンＥ３との交差反応性１６％でプロスタグランジンＥ２を特異的に検出するＥＩＡキットを用いることにより測定した。より詳しく述べると、プロスタグランジンＥ２を、酵素免疫測定法キット（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ社）を用いて製造元のプロトコールに従い測定した（ＰＧＥ３との交差反応性は１６％である）。培養細胞を洗浄し、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（５μＭ）を含む無血清培地中でインキュベートした。１０分間インキュベート後、順化培地を回収し、エイコサノイドの測定を行った。対照細胞が産生したプロスタグランジンＥ２の量は、ｆａｔ−１がコードするｎ−３不飽和化酵素を発現する細胞が産生したプロスタグランジンよりも有意に多かった（図４）。
【００６５】
実施例６：培養動物細胞の分析
この実施例および後の２つの実施例では、本発明者らは３つの異なる実験用のモデル：培養細胞（他のタイプの培養細胞はさらに下記で試験する）、成熟ラット、およびトランスジェニックマウスについて述べる。上記したように、培養細胞のモデルを用いて、ｎ−３不飽和化酵素がインビトロの哺乳動物細胞で発現された場合の酵素特性および生化学的効果を特徴づけることができ、成熟ラットモデルを用いて伝達されたｆａｔ−１遺伝子がインビボでｎ−３ＰＵＦＡの組織濃度を増加させることができる効力を評価することができ、トランスジェニックマウスモデルを用いてインビボで様々な組織または臓器の脂質組成に及ぼす導入遺伝子の長期効果および全身効果を評価することができる。最初の２つのモデルでは、ｆａｔ−１遺伝子の哺乳動物細胞／組織中への導入を、（組換えアデノウィルスが媒介する）アデノウィルスの遺伝子導入により行う。最後のモデルでは、遺伝子導入を、マウス受精卵中に導入遺伝子をマイクロインジェクションすることにより行う。遺伝子導入の後、導入された遺伝子の発現プロファイルを、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質分析により特徴づけることができ（例えば、上記実施例３を参照されたい）、主に細胞または組織の脂肪酸組成である生化学的効果はＧＣ−ＭＳ技術により決定する（例えば、上記実施例４を参照されたい）。エイコサノイドは酵素免疫測定法により測定する（例えば、実施例５を参照されたい）。ｆａｔ−１を発現する細胞から得たデータを、同じ（または、同様の）ウィルスに感染しているがｆａｔ−１を導入していない対照細胞または組織から得たデータと比べることにより変化を確認する。これらの試験の終点は、細胞の脂肪酸組成およびエイコサノイドプロファイルにおける生化学的変化である。
【００６６】
実質的にあらゆる動物細胞（ヒト細胞系を含む）の培養物に、組換えアデノウィルス（Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１、またはＡｄ．ＧＦＰ）を感染させることができ、その後、導入された遺伝子の発現は、ＲＮＡまたはタンパク質の分析により評価することができる。実験手順および関連する方法を、上記の実施例に記載し、図６に略述する。心筋、ニューロン、肝細胞、内皮細胞、およびマクロファージを含む様々な細胞型が、ｎ−３脂肪酸の試験に用いられている。
【００６７】
心筋細胞を上記したように（実施例２を参照されたい）単離し、培養することができ、小脳顆粒ニューロンおよび肝細胞などの他の細胞型を、Ｓｃｈｏｕｓｂｏｅらが記載した以下の方法で１〜５日齢のラットから調製することができる（「Ａ Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｓｈａｈａｒら編集、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、２０３〜２０６頁、１９８９年）。乳癌細胞系および白血病細胞系を含むヒト細胞系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＭＥＮ培地またはＲＰＭＩ１６４０で、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で培養することができる。
【００６８】
ウィルス感染は、ＦＢＳを含まない培地または２％ＦＢＳを含む培地にウィルス粒子を様々な濃度で（例えば、２×１０９〜２×１０１０ｐｆｕ）加えることにより行うことができる（実施例２も参照されたい）。２４時間インキュベーション後、感染培地を通常の（１０％ＦＢＳ）培地に置き換える。感染４８時間後に、細胞を遺伝子発現または脂肪酸組成の分析に用いることができる。導入遺伝子の発現は、蛍光タグが導入遺伝子中に含まれる場合は蛍光顕微鏡により（実施例１、および図１を参照されたい。同様に、タグは蛍光抗体により検出される抗原タンパク質であることができる）、または標準のＲＮＡアッセイ（例えば、ノーザンブロット、またはＲＮａｓｅプロテクションアッセイ）により評価することができる。ｆａｔ−１遺伝子は、通常は対照細胞中に存在しないので、対照細胞とｆａｔ−１を発現する細胞との間のｆａｔ−１ｍＲＮＡの差を明らかにするのは難しくない。
【００６９】
ｎ−３不飽和化酵素は、ｎ−３二重結合のｎ−６脂肪酸への導入を触媒し、それらの前駆物質のｎ−６脂肪酸より１つ多い二重結合を有するｎ−３脂肪酸の形成をもたらす（例えば、１８：２ｎ−６→１８：３ｎ−３、２０：４ｎ−６→２０：５ｎ−３）。基質を産物に転換する速度（所与の時間中に形成される産物の量）は、不飽和化酵素の発現／活性に直接比例すると考えられている。したがって、動物から得たサンプル（例えば、組織サンプル）から、または培養細胞で以下の方法を用い転換（産物の量）を測定することにより、この酵素の機能活性を決定することができる。
【００７０】
基質として放射能標識したｎ−６脂肪酸を用いた脂肪酸不飽和化アッセイ
アッセイは、Ｋａｎｇらが記載した以下のプロトコールを行うことができる（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１１２８巻、２６７〜２７４頁、１９９２年）。手短に述べると、ＢＳＡに結合している様々に標識したｎ−６脂肪酸（例えば、［１４Ｃ］１８：２ｎ−６、［１４Ｃ］２０：４ｎ−６）を、無血清培地に加え、細胞とともに４〜６時間インキュベートする。その後、細胞および培地を回収する。脂質を抽出しメチル化する（下記を参照されたい）。ＡｇＮＯ３を含浸させたシリカゲルＴＬＣプレート上で、不飽和の程度（すなわち、二重結合の数）にしたがって、標識した脂肪酸メチルエステルを単離する。標準と比較して、様々な二重結合を有する脂肪酸を含むバンドを同定することができる。標識した脂肪酸の量をシンチレーション計数により測定し、対照細胞とｆａｔ−１遺伝子発現細胞との間でデータを比較する。
【００７１】
ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸の分析
脂肪酸の転換は、ガスクロマトグラフィー質量分析を用いて脂肪酸組成を分析することにより、より正確に測定することができる（下記を参照されたい）。この方法を用いれば、放射標識した脂肪酸は必要とされない。ｎ−３不飽和化酵素遺伝子を発現する培養細胞の脂肪酸含有量を、様々な基質の存在下で分析することができる。対照細胞とｆａｔ−１遺伝子を発現する細胞との間の脂肪酸のプロファイルを比較することにより、各脂肪酸の転換を測定することができる。
【００７２】
細胞のすべての脂質またはリン脂質の脂肪酸組成を、先に記載したように分析することができる（Ｋａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１１２８巻、２６７〜２７４頁、１９９２年；Ｗｅｙｌａｎｄｔら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、９７７〜９８２頁、１９９６年）。手順は以下の通りである。
【００７３】
脂質の抽出（実施例４も参照されたい）
０．００５％ブチル化ヒドロキシトルエン（抗酸化剤として）を含むクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）５ｍｌを、洗浄した細胞ペレットに加え、１分間激しくボルテックスにかけ、次いで４℃で一夜放置する。０．８８％ＮａＣｌ １ｍｌを加え、再び混和する。脂質を含むクロロホルム相を回収する。残渣をもう１度、２ｍｌのクロロホルムで抽出する。クロロホルムをプールし、窒素下で乾燥させ、密封した試験管中−７０℃で貯蔵する。
【００７４】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による脂質の単離
ＴＬＣプレートを、１００℃で６０分間活性化する。ＴＬＣ展開槽を、使用の少なくとも１時間前に溶媒で平衡にする。石油エーテル／ジエチルエーテル／酢酸（体積で８０：２０：１）からなる溶媒系を用いて、３０〜３５分間シリカゲルＧプレート上にサンプルを流して、すべてのリン脂質およびトリアシルグリセロールを単離する。個々のリン脂質をＴＬＣにより、以下の溶媒系を用いてシリカゲルＨプレート上で単離する。クロロホルム／メタノール／２−プロパノール／０．２５％ＫＣｌ／トリエチルアミン（体積で、３０：９：２５：６：１８）。脂質を含むバンドを、０．０１％８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸で可視化し、各脂質分画のゲルを掻き取ったものをメチル化用に回収する。
【００７５】
脂肪酸のメチル化
１４％ＢＦ３／メタノール試薬を用いて、脂肪酸メチルエステルを調製する。ヘキサン１または２ｍｌおよびＢＦ３／メタノール試薬１ｍｌを、テフロン加工のキャップ付ガラス試験管中の脂質サンプルに加える。窒素を流した後、サンプルを１００℃で１時間加熱し、室温に冷却し、メチルエステルをヘキサン相中に抽出し、続けてＨ２Ｏ １ｍｌを加える。サンプルを２０〜３０分間静置し、上部のヘキサン層を除去し、ＧＣ分析用に窒素下で濃縮する。
【００７６】
ガスクロマトグラフィー質量分析
メチル化したサンプルを、１００〜２００μｌのヘキサンまたはイソオクタン中で再構成し、その１〜２μｌをガスクロマトグラフィーにより分析する。Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０Ａガスクロマトグラフ（ペンシルバニア州、Ａｖｏｎｄａｇｅ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）で、Ｏｍｅｇａｗａｓカラム（３０ｍ；ペンシルバニア州、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いる。キャリアガスは水素（２．３９ｍｌ／分）で、分割比１：３１で注入する。温度は最初１６５℃で５分間、次いで２．５℃／分で１９５℃に上げ、そこから５℃／分で２２０℃まで上げる。温度を１０．５分間保持し、次いで２７．５℃／分で１６５℃まで下げる。ピークは、脂肪酸標準物質（ミネソタ州、Ｅｌｙｓｉａｎ、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ−Ｐｒｅｐ）と比較して同定し、解析したすべてのピークに対する面積のパーセント値を、Ｐａｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＭ１インテグレータを用いて分析する（コネチカット州、Ｎｏｒｗｏｏｄ、Ｐａｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）。これらの分析条件で、鎖長における炭素Ｃ１４からＣ２５までのすべての飽和、モノ、ジ、および多価不飽和脂肪酸を単離する。サンプルを加えるときに、外部標準をもとにサンプルサイズを計算する。さらに、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ質量選択検出器（モデル５９７２）を用い、イオン化電圧７０ｅＶ、スキャンレンジ２０〜５００Ｄａで操作して、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を実施する。得られたあらゆる新しいピークのマススペクトルを、データベースＮＢＳ７５Ｋ．Ｌ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）における標準（ミネソタ州、Ｅｌｙｓｉａｎ、Ｎｕ Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ）のマススペクトルと比較する。
【００７７】
実施例７：インビボにおけるｎ−３不飽和化酵素遺伝子導入の評価
ここに記載する実施例により、ｆａｔ−１遺伝子を動物の組織または臓器（例えば、心臓）に導入できるようになり、そこで酵素の産物は、ｎ−３ＰＵＦＡの含有量を増加させｎ−６ＰＵＦＡの含有量を減少させることにより、脂肪酸のプロファイルを速やかに最適化することができる。心臓を遺伝子導入のための実験の標的として選択するのは、心臓はｎ−３脂肪酸に関して十分に研究されており、生命維持に必要な臓器であるからである。
【００７８】
２カ月間通常の食餌またはｎ−６ＰＵＦＡの高い食餌を与えた成熟ラットを無作為化して、ｆａｔ−１遺伝子を有するアデノウィルス（Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１）またはレポーター遺伝子のＧＦＰを有するアデノウィルス（Ａｄ．ＧＦＰ、対照として）のいずれかを与えた。アデノウィルスは、カテーテルベースの技術を用いて生存動物の心臓に送達され、これは心臓全体で非常に均一な発現パターンを生成することができる（Ｈａｊｊａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、５２５１０５２５６、１９９８年）。感染（遺伝子導入）２日後、４日後、１０日後、３０日後、および６０日後に、動物を屠殺し、その心臓を回収し、導入遺伝子の発現の測定および脂肪酸組成の分析のために使用する。別のグループのラットは、遺伝子導入を行わずにｎ−３脂肪酸に富む（ｎ−６／ｎ−３比の低い）食餌を２カ月間与え、参照として用いる。これらの実験（動物に異なる食餌を与え、様々な時間点でサンプルを回収する）は、ｆａｔ−１遺伝子の導入が食餌の介入（すなわち、ｎ−３ＦＡの補足）により引き起こされるものと同様、またはそれに勝る望ましい生化学的効果（ｎ−６／ｎ−３比、エイコサノイドプロファイル）を生じることができるか否か、脂肪酸組成の著しい変化をどれほど速やかに実現することができるか、また変化がどのくらい長く続くことができるかを決定するためにデザインされている。レポーター（ＧＦＰ）遺伝子を注入したラットを対照として用いる（本発明者らの予備試験ではＧＦＰの遺伝子導入は脂肪酸の組成に効果がないことを示していた）。実験のフローチャートを図７に示す。
【００７９】
動物および食餌
体重をマッチさせたスプレーグ−ドーリー成熟ラットを、無作為に３グループに割り当てる。各グループに、３つの異なる食餌の１つを与える。通常（ベース）食、高ｎ−６食、または高ｎ−３食。これらの食餌は以下のように調製する。
【００８０】
ベース食：市販の無脂肪ラット食（ニューヨーク州、Ｓｙｒａｃｕｓｅ、Ａｇｗａｙ Ｉｎｃ．Ｃ．Ｇ．）に２％（ｗ／ｗ）トウモロコシ油を加える。高ｎ−６食：ベース食にさらなる１３％（ｗ／ｗ）トウモロコシ油またはベニバナ油（ｎ−６脂肪酸に富む）を添加して補足し、最終の食餌を全脂肪分１５％とする。高ｎ−３食：ベース食に１３％（ｗ／ｗ）魚油（３０％ＥＰＡ、２０％ＤＨＡ、６５％全ｎ−３ＰＵＦＡ）（オスロ、Ｐｒｏｎｏｖａ Ｂｉｏｃａｒｅ Ａ／Ｓ）を補足し、最終の食餌を全脂肪分１５％とする。このグループはこの試験の対照グループの役割を果たす。
【００８１】
食餌は、毎週小さなバッチで調製し、−２０℃で保存し、必要量を毎日解凍する。長鎖多価不飽和脂肪酸の酸化を防ぐために、ビタミンＥ（脂肪１００ｇあたり１００ｍｇ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（最終濃度０．０５％）を加える（ＢＨＴは、調製および貯蔵の間中不飽和脂肪酸の自動酸化を防ぐ作用をする）。動物が確実に十分な栄養を得るために、全グループのラットの体重を毎週測定する。食餌開始８週間後、動物に遺伝子導入を受けさせる。
【００８２】
アデノウィルス送達プロトコール
アデノウィルスの心臓への送達は、Ｈａｊｊａｒらが記載した（前掲）技術と同様のカテーテルベースの技術を用いて行う。手短に述べると、ラットに腹腔内のペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、人工呼吸器上に置く。左側から第３肋間腔を通して胸に入る。心膜を開き、左室心尖部に７〜０縫合を配置する。大動脈と肺動脈を確認する。アデノウィルス２００μＬ（９〜１０×１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）を含む２２ゲージのカテーテルを左室（ＬＶ）心尖部から大動脈起始部に進める。大動脈および肺動脈をカテーテルの部位の遠位でクランプ固定し、溶液を注入する。心臓が閉鎖系に（同体積に）対して拍動する間１０秒間、クランプを維持する。１０秒後、大動脈および肺動脈上のクランプを開放し、胸を閉じ、動物から抜管し、ケージに戻す。
【００８３】
遺伝子導入の２、４、１０、３０、および６０日後に、動物を屠殺し、ウィルスに感染したこれらの心臓を取り出し、食塩水で灌流または洗浄して血液をすべて除き、組織の部分を脂質分析およびエイコサノイド測定用に−８０℃で速やかに凍結する。残りの組織をｍＲＮＡレベルおよび／またはｎ−３不飽和化酵素のタンパク質レベルの測定のために用いる。
【００８４】
脳および肝臓などの他の臓器も、血流に入ったアデノウィルスにより高レベルで感染している可能性がある。したがって、他の臓器も、心臓に加えて、導入遺伝子発現および脂質プロファイルの分析用に回収する。
【００８５】
培養細胞の意味合いで上記したように、導入遺伝子発現の評価を含む他の方法（ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、またはインサイチュハイブリダイゼーションによる）、脂肪酸組成の分析、エイコサノイドの測定、および統計学的分析を行う。
【００８６】
実施例８：トランスジェニック動物
ここに記載する試験は、ｆａｔ−１遺伝子を全体的に発現するトランスジェニックマウスを産生するために、また、これらの動物の組織および臓器の脂質プロファイルを特徴づけるためにデザインされている。トランスジェニックマウスは、インビボで、ある遺伝子の生理学的意義を評価するための価値あるモデルとなっている。トランスジェニックマウスが入手可能であることから、本発明者らは、ある動物の寿命の様々な段階において、様々な細胞型における導入遺伝子の効果が研究できる。このｎ−３トランスジェニックマウスのモデルは、成長および細胞生物学における、ｎ−３ＰＵＦＡおよびそれに由来する化合物の役割を解明する新しい機会を提供する。
【００８７】
ｆａｔ−１遺伝子を全体的に発現することができるトランスジェニック動物を産生するために、ｆａｔ−１遺伝子およびニワトリβ−アクチンプロモーターを、広範囲の細胞型で高度に活性であり、したがって導入遺伝子が高レベルで広範に発現できるようにするＣＭＶエンハンサー（ＣＡＧプロモーター）とともに含む発現ベクターを使用することができる（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１０８巻、１９３〜１９９頁、１９９１年；Ｏｋａｂｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４０７巻、３１３〜３１９頁、１９９７年）（トランスジェニック魚類を、以下に詳しく記載する）。トランスジェニックマウスを産生するために、発現構築物をＣ５７ＢＬ／６ＸＣ３Ｈマウスの１細胞胚の前核中にマイクロインジェクションする。マウスを飼育し、トランスジェニックマウス系統を確立する。離乳仔マウスに、通常食または高ｎ−６ＰＵＦＡ食のいずれかを与える。導入遺伝子の発現レベルを評価し、脂肪酸の組成を決定するために、様々な齢の（新生仔、１カ月までの離乳、６カ月までの成体、および１２カ月までの老齢、１時点あたり３〜５匹のマウスを用いる）これらの動物から、様々な組織を回収する。血漿および様々な組織におけるエイコサノイドのレベルも測定する。同じ食餌（通常食または高ｎ−６食のいずれか）を与えた野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）のグループを、対照として用いる。結果を、同じ食餌を与えた野生型の動物から得た結果と比較する。手順を図８に図示する。
【００８８】
導入遺伝子は、Ｏｋａｂｅら（前掲）が記載した方法と同様の方法により調製する。手短に述べると、ｆａｔ−１遺伝子をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより５−ａｇａａｔｔｃｇｇｃａｃｇａｇｃｃａａ ｇｔｔｔｇａｇｇｔ−３’（配列番号１）および５’−ｇｃｃｔｇａｇｇｃｔｔｔａｔｇｃａｔｔｃａａｃｇｃａｃｔ−３’（配列番号２）のプライマーで、テンプレートとしてｐＣＥ−ｆａｔ１（ワシントン州立大学、Ｊ．Ｂｒｏｗｓｅ博士より提供）を用いて増幅する。ｆａｔ−１のどちら側にもさらなるアミノ酸配列は付加されない。ＰＣＲ産物をＤＮＡシークエンシングにより確認する。ＰＣＲプライマーに含まれるＥｃｏＲ１およびＢｇｌ−ＩＩの部位を用いて、増幅したｆａｔ−１ｃＤＮＡを、ニワトリのβ−アクチンのプロモーターおよびサイトメガロウィルスのエンハンサー、β−アクチンのイントロンおよびウシグロビンのポリアデニレーションシグナル（大阪大学医学部、Ｍｉｙａｚａｋｉ博士より提供）を含む、ｐＣＡＧＧＳ発現ベクターに導入する。プロモーターおよびコード配列を有する全挿入断片を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌ１で切り出しゲルで精製する。
【００８９】
精製したＢａｍＨＩおよびＳａｌＩフラグメントを、Ｃ５７ＢＬ／６ＸＣ３Ｈ受精卵中に注入することにより、トランスジェニックマウス系を産生する。ＤＮＡを注入した卵を、偽妊娠したマウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１）に移植してトランスジェニックマウスを産生する。ファウンダートランスジェニックマウスは、尾部ＤＮＡのＰＣＲ分析およびサザンブロッティング分析により同定し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させる。子孫（ヘテロ接合体またはホモ接合体のいずれか）を、導入遺伝子または表現型の発現レベルに応じて用いる。
【００９０】
離乳期のトランスジェニックマウスに、通常食または高ｎ−６ＰＵＦＡ食のいずれかを与える（上記を参照されたい）。動物を様々な齢（新生仔、１カ月までの離乳仔、６カ月までの成体、および１２カ月までの老齢、１時点あたり３〜５匹のマウスを用いる）で屠殺し、様々な組織を回収して導入遺伝子の発現レベルを評価し、脂肪酸組成を決定する。結果を、同じ食餌を与えた野生型の動物からの結果と比べる。
【００９１】
導入遺伝子の発現の評価（ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、またはインサイチュハイブリダイゼーション）、脂肪酸の組成の分析、エイコサノイドの測定、および統計学的分析を含めた他の方法を、上記したように行う。
【００９２】
上記に提供した教示に概ね従い、本発明者らは、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素をコードするシー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを産生した。これらのマウスは、ｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸を産生することができ、筋肉およびミルクを含むほとんどすべての臓器および組織で、ｎ−３脂肪酸が豊富になりｎ−６脂肪酸のレベルが減少することになり、食餌のｎ−３脂肪酸を提供する必要がない。この業績は、このような動物（すなわち、ｆａｔ−１核酸配列の産物を効果的に発現し、または過剰発現するあらゆる動物）は独特の研究手段であり、ヒトおよび他の動物の栄養上の必要満たすために用いることができるｎ−３脂肪酸の新しく理想的な供給源であるという本発明者らの理論を支持している。
【００９３】
マウスでシー・エレガンスのｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を非相同に発現させるために、このタンパク質をコードするｆａｔ−１遺伝子を、原型から哺乳動物の細胞にコドンの使用頻度を最適化することにより改変し、広範囲の細胞型で高度に活性でありその結果マウスにおける導入遺伝子の高レベルで広範な発現を可能にする、ニワトリのβ−アクチンのプロモーターおよびサイトメガロウィルスのエンハンサーと結合させる（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１０８巻、１９３〜１９９頁、１９９１年；Ｏｋａｂｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４０７巻、３１３〜３１９頁、１９９７年）。
【００９４】
トランスジェニックファウンダーマウスおよびその子孫からのＦ１仔におけるｆａｔ−１の発現を、尾部ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲにより、および尾部脂質の分析により試験した。トランスジェニックマウスは、正常かつ非常に健康に見受けられた。トランスジェニックマウスも、野生型マウスも、オメガ−６脂肪酸（主にリノール酸）に富みオメガ−３脂肪酸が非常に少ない（供給された全脂質の約０．１％）食餌で維持した。このｎ−３の欠乏した食餌を与えることで、本発明者らは表現型を容易に区別することができた。この食餌レジメンでは、野生型のマウスは生来ｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸を産生することができないのでこの動物の組織にはｎ−３脂肪酸がほとんどまたはまったくないが、導入遺伝子がインビボで機能しうる場合にはｆａｔ−１導入遺伝子マウスはその組織中にかなりの量の（ｎ−６脂肪酸に由来する）ｎ−３脂肪酸を有するはずである。
【００９５】
トランスジェニックマウス系の表現型は主に脂質プロファイルに反映されるので、本発明者らは、様々な年齢のトランスジェニックマウスの様々な臓器の脂肪酸組成を、ガスクロマトグラフィー質量分析計により分析した。
【００９６】
興味深いことに、トランスジェニック動物の筋肉がこれらの比で最も顕著な変化を有し、この組織の酵素活性が最も高いことを示している。現在まで、トランスジェニックマウス系の４世代（ホモ接合体またはヘテロ接合体のいずれか）を試験したが、これらの組織の脂肪酸プロファイルはｎ−３脂肪酸が常に高レベルであることを示し、導入遺伝子がインビボで機能的に活性であり遺伝可能であることを指摘した。本発明者らのデータは、ｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニックマウスはｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸を産生することができ、結果として食餌によるｎ−３の供給を必要としないでそれらの臓器／組織におけるｎ−３脂肪酸を豊富にするが、これは野生型の哺乳動物では不可能であることを明確に示している。
【００９７】
本発明者らの発見は、ｎ−３不飽和化酵素遺伝子を有する、大型のトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、シカ、ニワトリ、および他の家禽（例えば、ガチョウ、アヒル、キジ、および猟鳥））、および／またはトランスジェニック魚類、または飼育されもしくは川、湖水、小川、もしくは海に住む他の食用動物を産生することにより、ｎ−３ＰＵＦＡに富む食料品（例えば、肉、ミルク、および卵）を生成するための新規の方策を提供する。
【００９８】
動物を産生するのに用いる方法を、下記により詳しく記載する。
【００９９】
発現ベクター
ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素をコードするｃＤＮＡを、シー・エレガンスからクローニングしたｆａｔ−１の配列に基づいて（Ｓｐｙｃｈａｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１１４２〜１１４７頁、１９９７年）、参照としてマウスのコドン頻度を用いてコドン使用頻度を変更して合成した。合成したｆａｔ−１ｃＤＮＡを、ＤＮＡシークエンシングにより確認し、次いでニワトリβ−アクチンのプロモーターおよびサイトメガロウィルスのエンハンサー、β−アクチンイントロンおよびウシグロビンのポリアデニレーションシグナルを含むｐＣＡＧＧＳ発現ベクター中にクローニングした。プロモーターおよびコード配列を含む全挿入部分を、ＳｓｐＩおよびＳｆｉＩで切り出し、ゲルで精製した。
【０１００】
トランスジェニックマウスの作製
精製したＳｓｐＩおよびＳｆｉフラグメントをＣ５７ＢＬ／６ＸＣ３Ｈ受精卵中に注入することにより、トランスジェニックマウス系を作製した。ＤＮＡを注入した卵を、偽妊娠したマウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１）に移植してトランスジェニックマウスを産生した。ファウンダートランスジェニックマウスを、尾部ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲおよび尾部組織の脂質分析により同定し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配した。本発明者らは、７匹のトランスジェニックファウンダーを得た。それらのうち３匹を選択して、トランスジェニック系の雄親とした。それぞれ、現在まで３世代である。
【０１０１】
動物の食餌
トランスジェニックマウスも野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスも、ベニバナ油５％（ｗ／ｗ）を含むＡＩＮ−７６ベースのげっ歯類食で維持した。ベニバナ油の脂肪酸組成は以下の通りである。１０％飽和脂肪酸、１４％モノ不飽和脂肪酸、７６％ｎ−６多価不飽和リノール酸、および〜０．１％ｎ−３多価不飽和α−リノレン酸。
【０１０２】
脂質分析
全組織脂肪の脂肪酸組成を、先に記載したように分析した（Ｋａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１１２８巻、２６７〜２７４頁、１９９２年）。脂質を、０．００５％ブチル化ヒドロキシトルエン（抗酸化剤として）を含むクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）で抽出した。脂肪酸メチルエステルを、１４％ＢＦ３／メタノール試薬を用いて調製した。脂肪酸メチルエステルを、水素炎イオン化検出器を装備した全自動のＨＰ５８９０システムを用いてガスクロマトグラフィーにより分析した。クロマトグラフィーは、Ｏｍｅｇａｗａｘ２５０キャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．）を利用した。オーブンプログラムは、最初１８０℃で５分間維持し、次いで２℃／分で２００℃まで上げ、４８分間保持する。ピークを脂肪酸標準物質（ミネソタ州、Ｅｌｙｓｉａｎ、Ｎｕ−ｃｈｅｋ−Ｐｒｅｐ）と比較して同定し、すべての解析したピークの面積のパーセント値をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｍ１インテグレータを用いて分析した。脂肪酸の質量を、分析した様々な脂肪酸の面積を、外部標準を添加したときの定濃度の面積と比較して決定した。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
実施例９：ニューロンの細胞死の阻害
組換えアデノウィルス（Ａｄ）の構築
ｆａｔ−１遺伝子を有する組換えＡｄを、先に記載したように構築した（Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、４０５０〜４０５４頁、２００１年、上記も参照されたい）。使用したｎ−３脂肪酸不飽和化酵素のｃＤＮＡ（ｆａｔ−１遺伝子）は、上記したものであり、プラスミドｐＣＥ８中に供給された。ｆａｔ−１ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩの消化でプラスミドから切り出し、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクター中に挿入した。構築物を引き続き、アデノウィルスのバックボーンベクター（ｐＡｄＥａｓｙ１）で相同に組み換えて、それぞれ別々のＣＭＶプロモーターの制御下で２つのクローン、すなわちレポーターまたはマーカーとしてＧＦＰを発現するＡｄ−ＧＦＰ、およびｆａｔ−１もＧＦＰ遺伝子も有するＡｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１を生成した。組換えアデノウィルスベクターのＤＮＡを、ＰａｃＩで消化した。線状化したベクターのＤＮＡをＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ）と混合し、２９３細胞に感染させるのに使用した。組換えウィルスを、２９３細胞で増殖させることにより高力保存価株として調製した。構築物の完全さを酵素消化（すなわち、制限酵素地図作成）およびＤＮＡシークエンシングにより確認した。精製したウィルスを点検し、その配列を再びＰＣＲ分析により確認した。
【０１０５】
組織培養およびＡｄでの感染
ラットの皮質ニューロンを、標準の技法を用いて調製した。手短に述べると、出生前胎仔１７日目（Ｅ１７）ラットの皮質ニューロンを解離し、ポリリジンでコートしたウェルに、２×１０６細胞／ウェルで接種した。細胞を、２５ｍＭグルタミン酸（ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、０．５ｍＭグルタミン、１％抗生物質−抗真菌性物質溶液、および２％Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地（ＮＢＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖させた。培養物を、５％ＣＯ２および相対湿度９８％の空気中、３７℃に保った。培地を４日ごとに交換した。８〜１０日後の培養物に、細胞は、Ａｄ−ＧＦＰプラスミド（対照）またはＡｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１のプラスミドのいずれかに形質移入した。培地にウィルス粒子を加えて、ウィルス感染を行った。４８時間インキュベート後、細胞を、遺伝子発現、脂肪酸組成、エイコサノイド産生、およびアポトーシス誘発の分析に使用した。
【０１０６】
ＲＮＡ分析
ＲＮａｓｅプロテクションアッセイでＲＰＡＩＩＩ（登録商標）キット（テキサス州、Ａｕｓｔｉｎ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ｍＲＮＡ転写物をプローブしてｆａｔ−１発現のレベルを測定した。手短に述べると、全ＲＮＡ単離試薬（ＴＲＩｚｏｌ、ＧＩＢｃｏ ＢＲＬ）を用いて製造元のプロトコールに従い、培養細胞から全ＲＮＡを抽出した。ｆａｔ−１遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＥ８を線状化し、転写テンプレートとして使用した。アンチセンスＲＮＡプローブを、インビトロで［３３Ｐ］−ＵＴＰ、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）Ｔ７キット、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写し、ニューロンから抽出した全ＲＮＡ（１５μｇ）でハイブリダイズし、リボヌクレアーゼで消化してハイブリダイズしなかったＲＮＡおよびプローブを除去した。保護されているＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、変性５％シークエンスゲルに溶解し、オートラジオグラフィーにかけた。β−アクチン遺伝子を標的とするプローブを内部標準として使用した。ｆａｔ−１ｍＲＮＡはＡｄ−ＧＦＰに感染した細胞（対照）では検出されなかったが、Ａｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染した細胞中では非常に豊富であった。
【０１０７】
細胞は、蛍光顕微鏡でも試験した。ｆａｔ−１遺伝子を発現する感染した細胞は、ＧＦＰを共発現するので容易に同定可能であった。感染４８時間後、ニューロンの３０〜４０％が感染し、ＧＦＰを発現した。この結果は、Ａｄが媒介する遺伝子導入は、通常ｆａｔ−１遺伝子を欠くラットの皮質ニューロンにｆａｔ−１遺伝子の高度な発現を付与することを説明している。
【０１０８】
脂質分析
全細胞脂質の脂肪酸組成を、Ｋａｎｇらの記載した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、４０５０〜４０５４頁、２００１年）ように分析した。脂質を、０．００５％ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、抗酸化剤として）を含むクロロホルム：メタノール（２：１、体積：体積）で抽出した。脂肪酸メチルエステルを、１４％（重量／体積）ＢＦ３／メタノール試薬を用いて調製した。脂肪酸メチルエステルを、Ｓｕｐｅｌｃｏｗａｘ（登録商標）ＳＰ−１０キャピラリーカラム（ペンシルベニア州、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を装着したＨＰ−５８９０シリーズＩＩガスクロマトグラフをＨＰ−５９７１質量分析計に接続したものを用いてＧＣ／ＭＳで定量した。注入部および検出部は、それぞれ２６０℃および２８０℃に維持する。オーブンプログラムは、最初１５０℃で２分間維持し、次いで１０℃／分で２００℃まで上げ、４分間保持し、再び５℃／分で２４０℃まで上げ、３分間保持し、１０℃／分で最終的に２７０℃まで上げ、５分間維持する。キャリアガス流量は、終始０．８ｍｌ／分の一定に維持する。５０〜５５０原子質量単位からの質量範囲を含めて全イオン検出を行う。脂肪酸の質量は、分析した様々な脂肪酸の面積を内部標準の一定濃度の面積と比べることにより決定する。
【０１０９】
ｆａｔ−１の発現は、ｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸への転換をもたらし、したがって、ｎ−６：ｎ−３脂肪酸の比の著しい変化をもたらした。対照細胞から得られた脂肪酸プロファイルは、Ａｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染した細胞のものとは著しく異なっている（図９。図１０も参照されたい）。Ａｄ−ＧＦＰに感染した細胞は、非感染の細胞と比較した場合に脂肪酸組成に変化を示さなかった。ｎ−３不飽和化酵素を発現する細胞では、ほとんどすべてのタイプのｎ−６脂肪酸が対応するｎ−３脂肪酸に、すなわち、１８：２ｎ−６から１８：３ｎ−３に、２０：４ｎ−６から２０：５ｎ−３に、２２：４ｎ−６から２２：５ｎ−３に、および２２：５ｎ−６から２２：６ｎ−３に転換された。ｆａｔ−１遺伝子を発現する細胞の脂肪酸組成の変化は、ｎ−６：ｎ−３比を対照細胞における６．４：１からｎ−３不飽和化酵素を発現する細胞における１．７：１に減少させる結果になった。シー・エレガンスのｎ−３脂肪酸不飽和化酵素の発現は、形質移入した細胞でＤＨＡレベルの大幅な上昇をもたらした。ＥＰＡおよびＡＬＡのレベルの上昇が観察され、それに伴いＡＡおよびＬＡが低下し、これはＰＧＥ２の産生の減少はｎ−６：ｎ−３脂肪酸比の変化、およびＤＨＡが媒介するＡＡの加水分解の阻害の両方に起因することを示唆している。
【０１１０】
エイコサノイドの測定
２−シリーズのエイコサノイドは、年齢に随伴する神経変性疾患、および虚血などの急性興奮毒性発作におけるニューロンのアポトーシスに関連することがある（Ｓａｎｚｇｉｒｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、４１巻、２２１〜２２９頁、１９９９年；ＤｒａｃｈｍａｎおよびＲｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４８巻、７９２〜７９５頁、２０００年；Ｂｅｚｚｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１巻、２８１〜２８５頁、１９９８年）。アラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ−６）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）は、それぞれ２−シリーズおよび３−シリーズのエイコサノイドの前駆物質である。遺伝子導入が媒介するＡＡおよびＥＰＡの含有量の変更が細胞におけるエイコサノイドの産生における相違をもたらすことがあるか否かを決定するために、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７で刺激した後の感染細胞で、ＡＡ由来の主要なエイコサノイドの１つであるプロスタグランジンＥ２の産生を測定した。より詳しく述べると、プロスタグランジンＥ２を酵素免疫測定法キット（ミシガン州、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて製造元のプロトコールに従い測定した。（プロスタグランジンＥ３との交差反応性は１６％である）培養細胞をＬＨバッファー（１％ＢＳＡを含む）で洗浄し、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（５μＭ）を含む同バッファーでインキュベートした。１０分間インキュベート後、順化バッファーを回収し、エイコサノイド測定にかけた。ｆａｔ−１発現細胞が産生するプロスタグランジンＥ２の量は、対照細胞が産生した量よりも２０％低かった（図１１）。
【０１１１】
アポトーシスの誘導と、細胞増殖および細胞生存度の決定
増殖因子を取り除くことによりアポトーシスを誘導した。ニューロンに形質移入した４８時間後、培地を、２５ｍＭグルタミン酸（ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、および０．５ｍＭグルタミンを補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地に変更した。増殖因子を取り除いた２４時間後に、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ（オレゴン州、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、細胞毒性を測定した。手短に述べると、細胞を、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、引き続き氷中で２０〜３０分間、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液（１ｍｌ／ｍｌ）およびＰＩ溶液（１ｍｌ／ｍｌ）を含む氷冷したＰＢＳ中でインキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、写真を撮った。
【０１１２】
細胞増殖および細胞生存度
細胞増殖および細胞生存度を、ＭＴＴ細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて決定した。ＭＴＴ標識試薬（１００μｌ）を各ウェルに加えた。４時間インキュベート後、各ウェル中に可溶化溶液１．０ｍｌを加えた。次いで、細胞を３７℃で一夜インキュベートし、６００ｎｍにおける分光光度計の溶液の吸光度を測定した。
【０１１３】
ｆａｔ−１遺伝子の発現は、ラットの皮質ニューロンにおけるアポトーシスに対する強力な保護をもたらした。アポトーシス誘導の２４時間後の皮質培養物のＨｏｅｓｔ３３６２５およびＰＩ染色では、Ａｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染した培養物はＡｄ−ＧＦＰに感染した培養物よりもアポトーシスを少なく受けることが示された。ＭＴＴ分析により、Ａｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１細胞の生存度は、Ａｄ−ＧＦＰに感染した細胞の生存度よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いことが指摘された（図１２）。これらの結果は、ｆａｔ−１の発現が、ニューロンのアポトーシスを阻害し、細胞の生存度を促進することができることを示している。シー・エレガンスのｎ−３脂肪酸不飽和化酵素がニューロン細胞のアポトーシスを阻害する能力により、神経保護におけるｎ−６：ｎ−３脂肪酸比の重要性が強調される。したがって、ｆａｔ−１配列、または生物学的に活性なその変種をニューロンに送達する技術は、細胞のｎ−６：ｎ−３脂肪酸比を速やかにかつ劇的にバランスをとり、外因性のｎ−３ＰＵＦＡを補足する必要なしにエイコサノイドのプロファイルを変更（し、それによりニューロン細胞に抗アポトーシス効果を発揮）する手段を提供する。食餌の介入に比べると、この取組みは、同時に組織のｎ−３ＰＵＦＡ濃度を上昇させ内因性ｎ−６ＰＵＦＡのレベルを低下させるので、ｎ−６：ｎ−３比のバランスをとる上でより効果的である。この方法は新規であり、ニューロン細胞における脂肪酸組成を変更する効果的な取組みであり、独立型の遺伝子治療として、または補助療法もしくは化学的予防手順として（例えば、卒中患者に）応用することができる。
【０１１４】
データ分析、統計学的分析
細胞生存度のデータ（ＭＴＴ）、ならびに脂肪酸組成およびエイコサノイドレベルを、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて比較した。分析には１グループあたり６ウェルが含まれ（脂質分析を除く。１グループあたり４ウェル）、各実験は３回繰り返した。有意レベルは、ｐ＜０．０５に設定した。
【０１１５】
実施例１０：ヒト内皮細胞におけるｆａｔ−１発現および炎症の阻害
ｎ−６からｎ−３ＰＵＦＡの転換は、初期のヒト血管内皮細胞に遺伝的に与えられ得るか否かを決定するために、またサイトカイン刺激後の内皮の活性化に対する潜在的な保護作用を研究するために、ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰ発現カセットと一続きになってｆａｔ−１導入遺伝子を含む（Ａｄ．ｆａｔ−１）第１世代（タイプ５）の組換えアデノウィルスベクター（Ａｄ）を構築した。ＧＦＰ／β−ｇａｌアデノウィルスが、対照ベクターとして働いた（Ａｄ．ＧＦＰ／β−ｇａｌ）。単分子層の初期のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ａｄ．ｆａｔ−１または対照のＡｄで３６時間感染させ、１０ｍＭアラキドン酸に２４時間曝露し、ガスクロマトグラフィーによる脂質分析、免疫測定法による表面接着分子分析、および単球細胞系であるＴＨＰ−１との内皮の相互作用を研究するためのビデオ顕微鏡に、層流条件下で行った。
【０１１６】
ｆａｔ−１の発現により、ヒト内皮細胞の脂質組成は劇的に変化し、ｎ−６のｎ−３ＰＵＦＡに対する全体的な比は８．５から１．４に変化した。さらに、サイトカインに曝露した後（ＴＮＦ−α、５μ／ｍｌを４時間適用）、ｆａｔ−１発現は接着分子および炎症のマーカーの表面発現を有意に（Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、およびＶＣＡＭ−１をそれぞれ４２％、４３％、および５７％（ｐ＜０．００１））減少させた。
【０１１７】
本発明者らは次に、接着分子プロファイルの変化は、アテローム硬化性病変部位に見られる最も優勢な白血球のタイプである単球と内皮の相互作用を変化させるのに十分であるか否かを問う。層流下、規定の約２ダイン／ｃｍ２のせん断応力下で、ｆａｔ−１に感染したＨＵＶＥＣは、対照ベクターに感染したＨＵＶＥＣに比べて、約５０％弱い接着を支え、ＴＨＰ−１細胞との回転相互作用にはほとんど効果がなかった。したがって、シー・エレガンスの不飽和化酵素であるｆａｔ−１の非相同の発現は、ヒト内皮細胞がｎ−６をｎ−３ＰＵＦＡに転換する能力を付与する。この効果は、擬似的な生理学的流動条件下で、内皮の炎症反応のサイトカインの誘導および単球細胞系であるＴＨＰ−１の堅い接着を著しく抑制した。したがって、ｆａｔ−１の発現は、アテローム性動脈硬化などの炎症性血管疾患を処置するための、可能性のある治療上の取組みを表わす。
【０１１８】
実施例１１：抗不整脈薬としてのｎ−３不飽和化酵素
ｆａｔ−１発現が抗不整脈効果をもたらし得るか否かを決定するために、ｎ−３不飽和化酵素を発現する筋細胞の、催不整脈性物質により引き起こされる不整脈に対する感受性を試験した。カバーガラス上で増殖させた自発拍動可能な新生仔ラット心筋細胞を、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１またはＡｄ．ＧＦＰに感染させた。感染２日後、細胞を灌流系に移し、カルシウムを高濃度（５〜１０ｍＭ）含む無血清培地で還流した。この培地は、催不整脈性である。灌流プロセスの間中、筋細胞の収縮を位相差顕微鏡およびビデオモニターエッジ検出器を用いてモニターした。高［Ｃａ２＋］（７．５ｍＭ）誘発後、Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照細胞は、速やかに拍動速度の増加を示した後痙攣性の収縮または細動を示したが、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞は規則正しい拍動を続けることができた。したがって、ｎ−３不飽和化酵素を発現する筋細胞は、催不整脈性の刺激に対し、あるとしてもほとんど感受性を示さない（図１３）。
【０１１９】
実施例１２：ｆａｔ−１発現および腫瘍の増殖の阻害
インビボの腫瘍増殖に対する遺伝子導入の効果を試験するために、ヒト乳癌異種移植片を有する２匹のヌードマウス（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）でパイロット実験を行った。１匹のマウスに、１日おきに２回ずつ、５０ｍｌのＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１（１０１２粒子／ｍｌ）を腫瘍内注射した。他方には、対照ベクター（Ａｄ．ＧＦＰ）を注射した。腫瘍の増殖速度を、４週間モニターした。Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１で処置した腫瘍の増殖速度は、対照の腫瘍の増殖速度より遅い様子であった（図１４）。
【０１２０】
実施例１３：脂肪酸組成および培養物中のヒト乳癌細胞の増殖に対するｆａｔ−１発現の効果
組換えアデノウィルス（Ａｄ）の構築
ｆａｔ−１ｃＤＮＡを有する組換えＡｄを、先に記載したように構築した（Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、４０５０〜４０５４頁、２００１年）。手短に述べると、ｐＣＥ８中のｆａｔ−１ｃＤＮＡ（上記）を、プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで二重切断して切り出し、シャトルベクター中に挿入し、次いでＨｅらの方法にしたがってアデノウィルスのバックボーンとの相同的組換えを行った（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、２５０９〜２５１４頁、１９９８年）。２つの、第１世代のタイプ５組換えアデノウィルス、すなわちＣＭＶプロモーターの制御下でレポーター遺伝子としてＧＦＰを有するＡｄ．ＧＦＰ、ならびにｆａｔ−１遺伝子およびＧＦＰ遺伝子の両方をそれぞれ別々のＣＭＶプロモーターの制御下で有するＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１を産生した。組換えウィルスは、先に記載したように、２９３細胞における増殖により高力保存価株として調製した（Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、４０５０〜４０５４頁、２００１年）。構築物の完全さを、酵素消化により、およびＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【０１２１】
細胞培養およびＡｄ．での感染
ＭＣＦ−７細胞は、日常的に、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質溶液（ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ）を補足したＤＭＥＭおよびＨａｍのＦ１２培地の１：１（ｖ／ｖ）の混合物中で、ＣＯ２５％および相対湿度９８％の組織培養インキュベーターで３７℃で維持した。無血清培地にウィルス粒子を加えることにより（３〜５×１０８粒子／ｍｌ）細胞が約７０％のコンフルエンスまで増殖したら、実験用に細胞にＡｄを感染させた。最初に、高い遺伝子発現と細胞毒性を最小にするためのウィルスの低い力価の最適のバランスを達成するために、Ａｄ．ＧＦＰを用いて、最適のウィルス濃度を決定した。２４時間インキュベート後、感染培地を、１０μＭの１８：２ｎ６および２０：４ｎ６を補足した通常の培地で置き換えた。感染４８時間後、遺伝子発現、脂肪酸組成、エイコサノイド産生、ならびに細胞の増殖およびアポトーシスの分析に細胞を使用した。
【０１２２】
ＲＮＡ分析
ｆａｔ−１転写物は、ＲＰＡＩＩＩ（登録商標）キット（テキサス州、Ａｕｓｔｉｎ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いてリボヌクレアーゼプロテクションアッセイにより試験した。手短に述べると、全ＲＮＡを、ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、製造元のプロトコールに従い、培養細胞から抽出した。ｆａｔ−１を含むプラスミドであるｐＣＥ８を線状化し、転写テンプレートとして用いた。アンチセンスＲＮＡプローブを、３３Ｐ−ＵＴＰおよびＴ７ポリメラーゼ（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）システムＴ７キット、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてインビトロで転写し、癌細胞から抽出した全ＲＮＡとハイブリダイズし、ＲＮａｓｅで消化してハイブリダイズしなかったＲＮＡおよびプローブを除去した。保護されたＲＮＡ：ＲＮＡを変性シーケンスゲル中で単離し、オートラジオグラフィーにかけた。ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にするプローブを内部標準として用いた。
【０１２３】
感染し、導入遺伝子を発現する細胞は、ＧＦＰ（鮮やかな蛍光を示す）を共発現するので、蛍光顕微鏡により容易に同定することができる。感染３日後、約６０〜７０％の細胞が感染し、導入遺伝子を発現することが観察された。リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いたｍＲＮＡの分析により、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞中にｆａｔ−１ｍＲＮＡが非常に豊富であることが示されたが、Ａｄ．ＧＦＰに感染した細胞（対照）では検出されなかった。この結果より、Ａｄが媒介する遺伝子導入は、通常ｆａｔ−１遺伝子を欠くＭＣＦ−７細胞におけるｆａｔ−１遺伝子の高度な発現を付与することができることが指摘されている。
【０１２４】
脂質分析
ヒトＭＣＦ−７細胞の脂肪酸組成を変更する際の遺伝子導入の有効性を試験するために、Ａｄに感染させｎ−６脂肪酸で２〜３日間インキュベートした後、全細胞脂質を抽出しガスクロマトグラフにより分析した。全細胞脂質の脂肪酸組成を、記載された（Ｋａｎｇら、前掲）ように分析した。脂質を、０．００５％ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、抗酸化剤として）を含むクロロホルム／メタノール（２：１、体積／体積）で抽出した。脂肪酸メチルエステルを、１４％（重量／体積）ＢＦ３／メタノール試薬を用いて調製した。脂肪酸メチルエステルを、ＳｕｐｅｌｃｏｗａｘＳＰ−１０キャピラリーカラム（ペンシルベニア州、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を装着したＨＰ−５８９０シリーズＩＩガスクロマトグラフをＨＰ−５９７１質量分析計に接続したものを用いてＧＣ／ＭＳで定量した。注入部および検出部は、それぞれ２６０℃および２８０℃に維持する。オーブンプログラムは、最初１５０℃で２分間維持し、次いで１０℃／分で２００℃まで上げ、４分間保持し、再び５℃／分で２４０℃まで上げ、３分間保持し、１０℃／分で最終的に２７０℃まで上げ、５分間維持する。キャリアガス流量は、終始０．８ｍｌ／分の一定に維持する。５０〜５５０原子質量単位からの質量範囲を含めて全イオンのモニタリングを行う。脂肪酸の質量は、分析した様々な脂肪酸の面積を内部標準の定濃度の面積と比較することにより決定する。
【０１２５】
ＭＣＦ−７細胞におけるｆａｔ−１ｃＤＮＡの発現は、ｎ−６脂肪酸からｎ−３脂肪酸への転換をもたらし、ｎ−６／ｎ−３脂肪酸の比に著しい変化をもたらした。脂肪酸プロファイルは、Ａｄ．ＧＦＰのみに感染した対照細胞とＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞との間では著しく異なる（図１５）。Ａｄ．ＧＦＰに感染した細胞は、非感染の細胞と比較した場合にそれらの脂肪酸プロファイルで変化がなかった。ｆａｔ−１ｃＤＮＡ（ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素）を発現する細胞では、様々なｎ−６脂肪酸が対応するｎ−３脂肪酸に、例えば、１８：２ｎ６から１８：３ｎ３に、２０：４ｎ６から２０：５ｎ３に、および２２：４ｎ６から２２：５ｎ３に概ね転換された。結果として、ｆａｔ−１遺伝子を発現する細胞の脂肪酸組成は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照細胞の脂肪酸組成と比べると大幅に変化し（図１５）、ｎ−６／ｎ−３比を対照細胞における１２から、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を発現する対照細胞における０．８に大きく低下した。
【０１２６】
エイコサノイドの測定
２０：４ｎ６（アラキドン酸）に由来する主要なエイコサノイドの１つであるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は癌の発症に関連があることが、以前に示されている（ＲｏｓｅおよびＣｏｎｎｏｌｌｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｔｈｅｒ．、８３巻、２１７〜２４４頁、１９９９年；ｃａｖｅ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、４６巻、２３９〜２４６頁、１９９７年）。遺伝子導入が誘導する、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸の含有量の変更が細胞におけるエイコサノイドの産生を変えることができるか否かを決定するために、本発明者らはカルシウムイオノフォアＡ２３１８７で刺激した後の感染細胞におけるＰＥＧ２の産生を、ＡＡに由来するプロスタグランジンＥ２を、ＥＰＡからのプロスタグランジンＥ３と１６％の交差反応性で特異的に検出する酵素免疫測定法キットを用いて測定した。より詳しくは、プロスタグランジンＥ２を酵素免疫アッセイキット（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ社）を用いて、製造元のプロトコールにしたがって測定した。（ＰＧＥ３との交差反応性は１６％である。）培養細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（５μＭ）を含む無血清培地でインキュベートした。１０分間インキュベート後、順化培地を回収し、エイコサノイド測定にかけた。ｆａｔ−１細胞が産生するプロスタグランジンＥ２の量は、対照細胞が産生した量よりも有意に低かった（図１６）。
【０１２７】
細胞の増殖およびアポトーシスの分析
ｆａｔ−１遺伝子の発現のＭＣＦ−７細胞の増殖に対する効果を決定するために、遺伝子導入後の細胞増殖およびアポトーシスを評価した。日常的に、細胞の形態を顕微鏡により観察し（死細胞は解離し、丸型で小型に見える）、生存細胞を血球計数器を用いて計数することにより、各ウェルにおける細胞の総数を決定した。さらに、細胞の増殖を、ＭＴＴ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＫｉｔＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔａｉｏｎ）を用いて評価した。アポトーシス細胞は、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ ＃５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で、製造元のプロトコールに従い染色して決定した。
【０１２８】
形態学的変化（丸形の小型または断片化）および核染色（鮮青色）により示されるように、ｆａｔ−１遺伝子を発現する細胞の多数が、アポトーシスを起こしていた。アポトーシス細胞計数を統計学的に分析すると、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞の３０〜５０％がアポトーシスであったが、対照細胞（Ａｄ．ＧＦＰに感染した）では１０％にすぎない死細胞しか見受けられなかった。ＭＴＴ分析では、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞の増殖活性は、Ａｄ．ＧＦＰに感染した細胞の増殖活性よりも大幅に低いことが指摘された。したがって、Ａｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した細胞における生存細胞の総数は、対照細胞における生存細胞よりも約３０％少なかった。これらの結果は、ｆａｔ−１発現物が、抗癌剤として作用することができるという提案と一致する。
【０１２９】
データ分析、統計学的分析
データは、平均±ＳＥで示した。ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて、２つの値の間の差異を評価した。有意レベルは、結果のｐ＜０．０５に設定した。
【０１３０】
実施例１４：トランスジェニック魚類の製造
ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子（野生型遺伝子、最適化した配列、または他の生物学的に活性なフラグメントもしくはその変種のいずれか）を、変更したｎ−６脂肪酸含有物を有するトランスジェニック魚類を産生するために用いることができる。不飽和化酵素遺伝子およびプロモーターを含む構築物を、Ｊｅｓｕｔｈａｓａｎら（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２４２巻、８８〜９５．３頁、２００２年）により記載されたゼブラフィッシュで用いられる方法など（精子核移植により）、従来の遺伝子導入方法により魚に導入することができる。Ｊｅｓｕｔｈａｓａｎ法は、以下のように行った。
【０１３１】
精子核調製
氷水に浸漬して屠殺した成年オスゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）から精巣を切開した。精巣は、うきぶくろの片側に位置し、細いピンセットで取り出す。脱膜化した精子核を、ＫｒｏｌｌおよびＡｍａｙａが実質的に記載したように（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２巻、３１７３〜３１８３頁、１９９６年）、いくつか修正して（例えば、プロテアーゼ阻害物質の省略）調製する。脱膜化に、リゾレシチン（Ｓｉｇｍａ Ｌ４１２９）またはジギチオン（ｄｉｇｉｔｉｏｎ）（Ｓｉｇｍａ Ｄ５６２８）のいずれかを用いた。洗浄後の濃度を確認するために、核をＨｏｅｃｈｓｔまたはＳｙｔｏ１１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でラベルし、ヘマサイトメーター（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で計数した。１ｎｌあたり核約１００個の濃度のアリコートの１０μｌを、液体窒素中に速やかに凍結し、−８０℃で貯蔵した。核を凍結−溶解により脱膜化する代替の手順も用いることができた。核を、５％ＢＳＡを加えた核単離培地９ｍｌで２回洗浄し、１回は１ｍｌで洗浄し、最終的に２５０μｌに再懸濁し、その後等分し、凍結保護せずに速やかに凍結する。
【０１３２】
導入遺伝子混合物
プラスミドＤＮＡを適切な制限酵素で線状化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、滅菌水中に希釈して７０ｎｇ／μｌの濃度にした。精子のアリコートを氷上で溶解し、次いで切断した白チップ付きピペットで吸い上げ排出することにより混合した。精子懸濁液の５μｌを１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管に移し、１μｌの線状化したＤＮＡを加えた。多量のＤＮＡでの実験では、ストックの濃度を増加させることができるが、添加する体積は１μｌに保たれる。この組合せをピペッティングにより混合し、室温で１、５、または２０分間保ち、次いで精子希釈用バッファー（ＳＤＢ）で希釈した。ショ糖２５０ｍＭ、ＫＣｌ ７５ｍＭ、スペルミジン三塩酸塩０．５ｍＭ、精子の四塩酸塩０．２ｍＭ、ｐＨ７．４またはＭＯＨバッファー溶液（ＫＰＯ４ １０ｍＭ、ｐＨ７．２、グルコン酸カリウム１２５ｍＭ、ＮａＣｌ ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ０．５ｍＭ、ショ糖２５０ｍＭ、スペルミジン三塩酸塩０．２５ｍＭ、スペルミン四塩酸塩０．１２５ｍＭ）で最終体積を５００μｌにする。希釈した混合物は、使用まで氷中に保つ。
【０１３３】
精子核の注入
メスゼブラフィッシュをトリカイン（Ｓｉｇｍａ Ａ５０４０）で麻酔し、ペトリ皿上の清浄な１枚のパラフィルム上に置き、優しく圧搾して成熟卵を放出させる。卵をマウンド状に保ち、皿は脱水を防ぐために直ちに蓋をした。パスツールピペットを用いて卵（１回に約５０個）を注入チャンバーに移すが、注入チャンバーは、１．２％アガロースのＨａｎｋｓ溶液に形成されるｖ型の槽からなり、活性化を遅らせるために０．５％ＢＳＡを含むＨａｎｋｓの食塩水で満たされている。槽は卵がちょうど浸漬するように満たされ、つまり卵の上端とメニスカスの下端との間の距離は１ｍｍ未満である。これにより卵は食塩水の帳面張力により戻されるので、卵から注入針を効果的に引き抜くのが確実になる。
【０１３４】
注入針は、薄い壁のキャピラリーをピペットプラー上で引いて製造し、先端をピンセットで割って外径を１０〜１５μｍにする（精子核の直径は約５μｍである）。針をホルダーに装着し、メカニカルマニピュレーターに接続し、先端からマイクロインジェクターを用いて充填する。精子核は暗視野照明法で目に見えるので、充填は解剖顕微鏡でモニターした。バックフィリングとして、２０μｌのピペットを用いて黄色チップに接続したタイゴン製の管材料内に混合物を引いた。次いで、管材料をキャピラリーに接続し、精子懸濁液をキャピラリー中に押し出し、２００μｌピペットを用いてチップ中に押し込んだ。
【０１３５】
注入は、３〜５ｐｓｉの圧力および１００分の時間を用いてインジェクターで行った。精子核を、卵の動物極領域中に注入した。卵は、明視野照明法のもとで目に見える卵門から約５０〜１００μｍ貫通させ、次いで注入前にチップが卵門付近にあるように回転させた。１バッチの卵が注入された後、それをパスツールピペットでＥ３（ＮａＣｌ ５ｍＭ、ＫＣｌ ０．１７ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．３３ｍＭ、ＭｇＳＯ４ ０．３３ｍＭ）を２０ｍｌ含む９ｃｍペトリ皿に移し、次いで２８℃のインキュベーター中に置いた。いくつかの受精卵は成体に成長し、野生型の魚と交配させると、ｎ−３脂肪酸不飽和化酵素を発現する子孫を生じた。
【０１３６】
遺伝子型の決定および表現型の決定は、それぞれＲＴ−ＰＣＲおよびガスクロマトグラフィー（脂質分析）で、トランスジェニックマウスの分析で記載したように行った。
【０１３７】
野生型およびｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニックのゼブラフィッシュの筋肉組織から抽出し、実施例８に記載したように変更した全脂質の特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す部分的なガスクロマトグラフのパターンを図２０に示す。トランスジェニック魚類の組織におけるオメガ−３脂肪酸のレベルは、野生型の魚に比べると大幅に高く、オメガ−６脂肪酸のレベルは明らかに低かった。トランスジェニック魚類を製造するために用いたＤＮＡ構築物は、実施例８に記載したものと同じであった。
【０１３８】
外来の遺伝子をゼブラフィッシュの生殖細胞系に導入するための、他の方法を用いることができる。これには、プラスミドＤＮＡの初期胚の中への注入、トランスポゾンが媒介する遺伝子挿入、またはレトロウィルスが媒介する遺伝子導入が含まれる（Ｕｄｖａｄｉａ ＡＪおよびＬｉｎｎｅｙＥ．、Ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｈｉｓｔｏｒｉｃ，ｃｕｒｒｅｎｔ，ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年、２５６巻、１〜１７頁；Ｄｅｔｒｉｃｈ Ｈ．Ｉ．、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．、Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．（編集）、Ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、５９および６０巻）。
【０１３９】
ここに記載した方法は、サケ（例えば、タイセイヨウサケ（Ａｔｌａｎｔｉｃ ｓａｌｍｏｎ）、Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）を含む他の硬骨魚類に応用できる。
【０１４０】
当業者が調べることのできるさらなる情報は：ＳｉｍｏｐｏｕｌｏｓおよびＣｌｅｌａｎｄ、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ（Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ）、９２巻、２００３年；Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓら（編集）、Ｗｏｒｌｄ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ（Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ）、８３巻、１９９８年；Ｃｏｎｎｏｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７１巻、１７１Ｓ〜１７５Ｓ頁、２０００年；Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７０巻、５６０Ｓ〜５６９Ｓ頁、１９９９年；Ｓａｌｅｍら、Ｌｉｐｉｄｓ、３１巻、Ｓ１〜Ｓ３２６、１９９６年；ＬｅａｆおよびＷｅｂｅｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、４５巻、１０４８〜１０５３頁、１９８７年）。
【０１４１】
実施例１５：トランスジェニック豚の製造
本発明者らは、トランスジェニックマウスの製造で上記したのと同様の方法を用いて、トランスジェニック豚を製造した。トランスジェニック豚は、実施例８に記載したように変更されたｆａｔ−１遺伝子を発現した。野生型およびトランスジェニック豚の尾部組織から抽出した全脂質の特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す部分的なガスクロマトグラフの痕跡を、図２１に示す。トランスジェニック豚の組織におけるオメガ−３脂肪酸のレベルは、野生型の豚と比べると大幅に高く、オメガ−６脂肪酸のレベルは明らかに低かった。トランスジェニック豚を製造するために用いたＤＮＡ構築物は、実施例８に記載したものと同じであった。
【０１４２】
本発明の多くの実施形態を記載した。それでも、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、様々な変更形態が可能であることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】遺伝子導入効率を示す４枚の顕微鏡写真を集めた図である。
【図２】Ａｄ．ＧＦＰに感染した心筋細胞（対照）、およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した心筋細胞におけるｆａｔ−１転写物レベルのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）プロテクションアッセイのオートラジオグラムを表す図である。
【図３】Ａｄ．ＧＦＰに感染した対照の心筋細胞、およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した心筋細胞から抽出した全細胞脂質の脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンを表す図である。
【図４】対照の心筋細胞およびｆａｔ−１遺伝子を発現する心筋細胞におけるプロスタグランジンＥ２レベル（酵素免疫法で測定した）を示す棒グラフである。
【図５】対照の心筋細胞およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックの心筋細胞からの全細胞脂質の多価不飽和脂肪酸組成を示す表である。
【図６】実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
【図７】実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
【図８】実験のプロトコールのフローチャートを示す図である。
【図９】対照のニューロンおよびＡｄ−ＧＦＰ−ｆａｔ−１に感染したニューロンから抽出した全細胞脂質の脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンである。
【図１０】ラットの皮質ニューロン（対照）およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡ（ｆａｔ−１）を発現するトランスジェニック細胞からの全細胞脂質のＰＵＦＡ組成を比較する表である。
【図１１】対照のニューロンおよびｆａｔ−１遺伝子を発現するニューロンにおけるプロスタグランジンＥ２レベルの酵素免疫法の結果を示す棒グラフである。
【図１２】対照およびｆａｔ−１を発現する培養物における細胞生存度のＭＴＴアッセイの結果を表す棒グラフである。
【図１３】Ａｄ．ＧＦＰに感染した筋細胞およびＡｄ．ＧＦＰ．ｆａｔ−１に感染した筋細胞の、細胞外カルシウム７．５ｍＭに対する特異的な反応を示す１対の軌跡である。
【図１４】経時的（ウィルス注入後０〜４週間）の腫瘍体積、すなわち遺伝子導入の腫瘍の増殖に対する効果を示す折れ線グラフである。
【図１５】対照のＭＣＦ−７細胞、およびシー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックのＭＣＦ−７細胞からの全細胞脂質のＰＵＦＡ組成を示す表である。
【図１６】対照のＭＣＦ−７細胞およびｆａｔ−１遺伝子を発現するＭＣＦ−７細胞におけるプロスタグランジンＥ２レベルの酵素免疫測定法の結果を表す棒グラフである。
【図１７Ａ】シー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびＦａｔ−１ポリペプチドの推定アミノ酸配列を表す。
【図１７Ｂ】シー・エレガンスのｆａｔ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびＦａｔ−１ポリペプチドの推定アミノ酸配列を表す。
【図１８】最適化したｆａｔ−１核酸配列を表す。
【図１９】野生型マウスの骨格筋（ＷＴ、上パネル）およびｆａｔ−１トランスジェニックマウス（ＴＧ、下パネル）の骨格筋から抽出した全脂質の特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す、１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンである。
【図２０】実施例８に記載したように変更した、野生型、およびｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニックのゼブラフィッシュの筋肉組織から抽出した全脂質の、特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す１対の部分的なガスクロマトグラフのパターンを示す図である。
【図２１】実施例８に記載したように変更した、野生型、およびｆａｔ−１遺伝子を発現するトランスジェニック豚の尾部組織から抽出した全脂質の、特異的な多価不飽和脂肪酸プロファイルを示す１対の部分的ガスクロマトグラフパターンである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ−６脂肪酸を対応するｎ−３脂肪酸に不飽和化する酵素をコードする配列を含み、前記配列が少なくとも１つの最適化されたコドンを含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記配列がシノラブディス・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記配列が少なくとも５個から１５０個までの最適化されたコドンを含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記コドンの５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、または１４５〜１５０個が最適化されている、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
６、９、１８、２０、２２、２４、２８〜３０、３３〜３６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６１、６４、６７、６９〜７１、７３、７７、７９、８１、８６、８９、９２、９４〜９５、１００、１０１、１０５、１０６、１１２、１１５、１１８、１２４、１２７、１２８、１３１、１４６、１５１、１５４、１６１、１６３、１６４、１６９、１７８、１８７、１８８、１９５、１９７、２００、２０２、２０６、２１０、２１４、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、２２８、２３２、２３４、２４１、２４５、２５５、２７１、２８０〜２８２、２８４、２８５、３０１、３０３、３１０、３１２、３２７、３６２、または３７０の位置に最適化されたコドンを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
図１８に示した核酸の配列を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
治療用のポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
調節要素またはマーカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記調節要素が組織に特異的なプロモーターである、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項１に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１１】
前記ベクターがウィルスのベクターである、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記ウィルスのベクターがレトロウィルスまたはアデノウィルスのベクターである、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記ベクターがプラスミドである、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１０に記載の発現ベクターおよび生理的に許容できる希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記動物が哺乳動物、鳥類、または魚類である、請求項１７に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
前記哺乳動物がウシ、ブタ、またはヒツジであり、前記鳥類がニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、または猟鳥であり、前記魚類がサケ、マス、またはマグロである、請求項１８に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
請求項１７に記載のヒト以外のトランスジェニック動物、またはその組織もしくは加工された部分を含む、食品または栄養補助食品。
【請求項２１】
対象に請求項２０に記載の食品または栄養補助食品を投与することを含む、対象の食事におけるｎ−３脂肪酸の含有量を改善する方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の核酸分子の治療上有効な量を患者に投与することを含む、癌と診断された患者を処置する方法。
【請求項２３】
前記癌が、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、子宮頸癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、頭頸部癌、膵臓癌、血液癌、または卵巣癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸分子の治療上有効な量を対象に投与することを含む、対象における神経細胞死を阻害する方法。
【請求項２５】
前記対象が神経変性疾患を有すると診断された、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の核酸分子を対象に投与することを含む、ｎ−３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の不足またはｎ−３：ｎ−６ＰＵＦＡの比の不均衡に関連する状態を有する、または発症する可能性のある対象を処置する方法。
【請求項２８】
前記状態が、不整脈、心臓血管疾患、癌、炎症性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症などの炎症性血管疾患、または再狭窄などの血管の状態）、自己免疫疾患、網膜または脳の形成異常または切迫形成異常、糖尿病、肥満、皮膚障害、腎臓疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、または慢性閉塞性肺疾患である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の核酸分子を、対象または移植体のいずれかに投与することを含む、生物学的臓器、組織、または細胞を含む移植体を受け、または受ける予定である対象を処置する方法。
【請求項３０】
ｎ−６脂肪酸を対応するｎ−３脂肪酸に不飽和化する酵素をコードする核酸配列を含むトランスジェニック魚類。
【請求項３１】
前記魚類が、タラ目タラ科のタラまたは任意の魚類、オヒョウ、ニシン目のニシンまたは任意の魚類、サバ科のサバまたは任意の魚類、マスを含めたサケ科のサケまたは任意の魚類、スズキ科のスズキまたは任意の魚類、ニシン科のシャッドまたは任意の魚類、ガンギエイ科のガンギエイまたは任意の魚類、キュウリウオ科のスメルトまたは任意の魚類、ササウシノシタ科のシタビラメまたは任意の魚類、およびサバ科のマグロまたは任意の魚類である、請求項３０に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３２】
前記核酸配列がシー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子を含む、請求項３０に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３３】
前記シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が少なくとも１つの最適化されたコドンを含む、請求項３２に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３４】
前記配列が少なくとも５個から１５０個までの最適化されたコドンを含む、請求項３３に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３５】
前記コドンの５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、または１４５〜１５０個が最適化されている、請求項３３に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３６】
前記核酸が６、９、１８、２０、２２、２４、２８〜３０、３３〜３６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６１、６４、６７、６９〜７１、７３、７７、７９、８１、８６、８９、９２、９４〜９５、１００、１０１、１０５、１０６、１１２、１１５、１１８、１２４、１２７、１２８、１３１、１４６、１５１、１５４、１６１、１６３、１６４、１６９、１７８、１８７、１８８、１９５、１９７、２００、２０２、２０６、２１０、２１４、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、２２８、２３２、２３４、２４１、２４５、２５５、２７１、２８０〜２８２、２８４、２８５、３０１、３０３、３１０、３１２、３２７、３６２、または３７０の位置に最適化されたコドンを含む、請求項３３に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３７】
前記核酸が図１８に示した核酸の配列を含む、請求項３３に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３８】
ｎ−６脂肪酸を対応するｎ−３脂肪酸に不飽和化する酵素をコードする核酸配列を含み、鳥類が摂取用に飼育されている、トランスジェニック鳥類。
【請求項３９】
前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、または猟鳥である、請求項３８に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４０】
前記核酸配列がシー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子を含む、請求項３８に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４１】
前記シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が少なくとも１つの最適化されたコドンを含む、請求項４０に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４２】
前記シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が、が少なくとも５個から１５０個までの最適化されたコドンを含む、請求項４１に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４３】
前記コドンの５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、または１４５〜１５０個が最適化されている、請求項４２に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４４】
シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が、６、９、１８、２０、２２、２４、２８〜３０、３３〜３６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６１、６４、６７、６９〜７１、７３、７７、７９、８１、８６、８９、９２、９４〜９５、１００、１０１、１０５、１０６、１１２、１１５、１１８、１２４、１２７、１２８、１３１、１４６、１５１、１５４、１６１、１６３、１６４、１６９、１７８、１８７、１８８、１９５、１９７、２００、２０２、２０６、２１０、２１４、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、２２８、２３２、２３４、２４１、２４５、２５５、２７１、２８０〜２８２、２８４、２８５、３０１、３０３、３１０、３１２、３２７、３６２、または３７０の位置に最適化されたコドンを含む、請求項４１に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４５】
前記シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が図１８に示した配列を含む、請求項４１に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１】
ｎ−６脂肪酸を対応するｎ−３脂肪酸に不飽和化する酵素をコードする配列を含み、前記配列が少なくとも１つの最適化されたコドンを含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記配列がシノラブディス・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記配列が少なくとも５個から１５０個までの最適化されたコドンを含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記コドンの５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、または１４５〜１５０個が最適化されている、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
６、９、１８、２０、２２、２４、２８〜３０、３３〜３６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６１、６４、６７、６９〜７１、７３、７７、７９、８１、８６、８９、９２、９４〜９５、１００、１０１、１０５、１０６、１１２、１１５、１１８、１２４、１２７、１２８、１３１、１４６、１５１、１５４、１６１、１６３、１６４、１６９、１７８、１８７、１８８、１９５、１９７、２００、２０２、２０６、２１０、２１４、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、２２８、２３２、２３４、２４１、２４５、２５５、２７１、２８０〜２８２、２８４、２８５、３０１、３０３、３１０、３１２、３２７、３６２、または３７０の位置に最適化されたコドンを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
図１８に示した核酸の配列を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
治療用のポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
調節要素またはマーカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記調節要素が組織に特異的なプロモーターである、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項１に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１１】
前記ベクターがウィルスのベクターである、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記ウィルスのベクターがレトロウィルスまたはアデノウィルスのベクターである、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記ベクターがプラスミドである、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１０に記載の発現ベクターおよび生理的に許容できる希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記動物が哺乳動物、鳥類、または魚類である、請求項１７に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
前記哺乳動物がウシ、ブタ、またはヒツジであり、前記鳥類がニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、または猟鳥であり、前記魚類がサケ、マス、またはマグロである、請求項１８に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
請求項１７に記載のヒト以外のトランスジェニック動物、またはその組織もしくは加工された部分を含む、食品または栄養補助食品。
【請求項２１】
対象に請求項２０に記載の食品または栄養補助食品を投与することを含む、対象の食事におけるｎ−３脂肪酸の含有量を改善する方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の核酸分子の治療上有効な量を患者に投与することを含む、癌と診断された患者を処置する方法。
【請求項２３】
前記癌が、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、子宮頸癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、頭頸部癌、膵臓癌、血液癌、または卵巣癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸分子の治療上有効な量を対象に投与することを含む、対象における神経細胞死を阻害する方法。
【請求項２５】
前記対象が神経変性疾患を有すると診断された、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の核酸分子を対象に投与することを含む、ｎ−３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の不足またはｎ−３：ｎ−６ＰＵＦＡの比の不均衡に関連する状態を有する、または発症する可能性のある対象を処置する方法。
【請求項２８】
前記状態が、不整脈、心臓血管疾患、癌、炎症性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症などの炎症性血管疾患、または再狭窄などの血管の状態）、自己免疫疾患、網膜または脳の形成異常または切迫形成異常、糖尿病、肥満、皮膚障害、腎臓疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、または慢性閉塞性肺疾患である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の核酸分子を、対象または移植体のいずれかに投与することを含む、生物学的臓器、組織、または細胞を含む移植体を受け、または受ける予定である対象を処置する方法。
【請求項３０】
ｎ−６脂肪酸を対応するｎ−３脂肪酸に不飽和化する酵素をコードする核酸配列を含むトランスジェニック魚類。
【請求項３１】
前記魚類が、タラ目タラ科のタラまたは任意の魚類、オヒョウ、ニシン目のニシンまたは任意の魚類、サバ科のサバまたは任意の魚類、マスを含めたサケ科のサケまたは任意の魚類、スズキ科のスズキまたは任意の魚類、ニシン科のシャッドまたは任意の魚類、ガンギエイ科のガンギエイまたは任意の魚類、キュウリウオ科のスメルトまたは任意の魚類、ササウシノシタ科のシタビラメまたは任意の魚類、およびサバ科のマグロまたは任意の魚類である、請求項３０に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３２】
前記核酸配列がシー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子を含む、請求項３０に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３３】
前記シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が少なくとも１つの最適化されたコドンを含む、請求項３２に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３４】
前記配列が少なくとも５個から１５０個までの最適化されたコドンを含む、請求項３３に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３５】
前記コドンの５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、または１４５〜１５０個が最適化されている、請求項３３に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３６】
前記核酸が６、９、１８、２０、２２、２４、２８〜３０、３３〜３６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６１、６４、６７、６９〜７１、７３、７７、７９、８１、８６、８９、９２、９４〜９５、１００、１０１、１０５、１０６、１１２、１１５、１１８、１２４、１２７、１２８、１３１、１４６、１５１、１５４、１６１、１６３、１６４、１６９、１７８、１８７、１８８、１９５、１９７、２００、２０２、２０６、２１０、２１４、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、２２８、２３２、２３４、２４１、２４５、２５５、２７１、２８０〜２８２、２８４、２８５、３０１、３０３、３１０、３１２、３２７、３６２、または３７０の位置に最適化されたコドンを含む、請求項３３に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３７】
前記核酸が図１８に示した核酸の配列を含む、請求項３３に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３８】
ｎ−６脂肪酸を対応するｎ−３脂肪酸に不飽和化する酵素をコードする核酸配列を含み、鳥類が摂取用に飼育されている、トランスジェニック鳥類。
【請求項３９】
前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、または猟鳥である、請求項３８に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４０】
前記核酸配列がシー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子を含む、請求項３８に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４１】
前記シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が少なくとも１つの最適化されたコドンを含む、請求項４０に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４２】
前記シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が、が少なくとも５個から１５０個までの最適化されたコドンを含む、請求項４１に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４３】
前記コドンの５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、または１４５〜１５０個が最適化されている、請求項４２に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４４】
シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が、６、９、１８、２０、２２、２４、２８〜３０、３３〜３６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６１、６４、６７、６９〜７１、７３、７７、７９、８１、８６、８９、９２、９４〜９５、１００、１０１、１０５、１０６、１１２、１１５、１１８、１２４、１２７、１２８、１３１、１４６、１５１、１５４、１６１、１６３、１６４、１６９、１７８、１８７、１８８、１９５、１９７、２００、２０２、２０６、２１０、２１４、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、２２８、２３２、２３４、２４１、２４５、２５５、２７１、２８０〜２８２、２８４、２８５、３０１、３０３、３１０、３１２、３２７、３６２、または３７０の位置に最適化されたコドンを含む、請求項４１に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４５】
前記シー・エレガンスのｆａｔ−１遺伝子が図１８に示した配列を含む、請求項４１に記載のトランスジェニック鳥類。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２００７−５２７７１１（Ｐ２００７−５２７７１１Ａ）
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５２３４５（Ｐ２００６−５５２３４５）
【出願日】平成１７年２月４日（２００５．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３９１７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７０２２
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３９２０１５４６８）ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション (14)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＧＥＮＥＲＡＬ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月４日（２００５．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３９１７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７０２２
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３９２０１５４６８）ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション (14)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＧＥＮＥＲＡＬ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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