皮膚外用剤
【課題】不全角化を起因とする皮膚の状態を予防または改善する皮膚外用剤の提供。
【解決手段】式(I)：
〔式中、Xaa1およびXaa5はセリル基、スレオニル基、チロシニル基、Xaa2はイソロイシル基、バリル基、ロイシル基、Xaa3およびXaa4はアスパラギニル基、グルタミニル基、アスパラチル基、グルタミル基、Cysはシステイニル基、Ｒ1は式(II)：
（式中、nは1〜10の整数を示す）または式(III)：
（式中、nは1〜10の整数を示す）〕の環状ペプチド化合物を含有する皮膚外用剤。
【解決手段】式(I)：
〔式中、Xaa1およびXaa5はセリル基、スレオニル基、チロシニル基、Xaa2はイソロイシル基、バリル基、ロイシル基、Xaa3およびXaa4はアスパラギニル基、グルタミニル基、アスパラチル基、グルタミル基、Cysはシステイニル基、Ｒ1は式(II)：
（式中、nは1〜10の整数を示す）または式(III)：
（式中、nは1〜10の整数を示す）〕の環状ペプチド化合物を含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用剤に関する。さらに詳しくは、不全角化を起因とする皮膚の状態の予防または改善に有用な皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの表皮は、下層から順に、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とからなる。ヒトの正常な皮膚は、通常、２８日間の周期でターンオーバーする。正常な皮膚のターンオーバーでは、ケラチノサイトが顆粒層から角質層へと押し上げられる。このとき、ケラチノサイトの分化により脱核が生じて有核細胞が消失し、成熟した角質層が形成される。
【０００３】
しかしながら、炎症や皮脂中に含まれる不飽和脂肪酸などによって表皮における細胞の増殖速度が著しく大きくなり、角化の速度が異常に促進された場合、最終分化段階のケラチノサイトにおいて、脱核が起こらないことがある（以下、「不全角化」という）。
【０００４】
不全角化を伴う皮膚は、前記角質層のバリア機能が著しく低下していることから、物理的刺激や化学的刺激を十分に防ぐことができない状態になっている。そのため、不全角化を伴う皮膚では、ニキビ、肌荒れなどの皮膚トラブルが生じやすい。
【０００５】
前記バリア機能を補うために、不全角化を伴う皮膚に対して、保湿剤などを含む皮膚外用剤が適用されている。しかしながら、一般に、前記保湿剤による表皮における保湿効果は、一時的に発揮されるにすぎないことから、当該保湿剤などを含む皮膚外用剤には、本質的な皮膚の状態の改善を期待することができないという欠点がある。そこで、不全角化を抑制し、当該不全角化を起因とする皮膚の状態を予防または改善することができる有用な皮膚外用剤が求められている。
【０００６】
一方、エピモルフィンは、上皮組織の形態形成の促進に関与している因子の１つであると考えられている。そこで、上皮組織の形態形成を制御するために、エピモルフィンによる上皮組織の形態形成促進作用を阻害するペプチドが開発されている（例えば、特許文献１および２を参照）。
【０００７】
しかしながら、現時点では、本発明者らは、エピモルフィンと炎症や皮脂中に含まれる不飽和脂肪酸などによる不全角化との関係を具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−７６９８号公報
【特許文献２】特許第３９２２３４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、不全角化を起因とする皮膚の状態を予防または改善することができる皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、
（１） 式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
【００１２】
〔式中、Ｘａａ1およびＸａａ5はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基、Ｘａａ2は置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基、Ｘａａ3およびＸａａ4はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｒ1は式（ＩＩ）：
【００１３】
【化２】
【００１４】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基または式（ＩＩＩ）：
【００１５】
【化３】
【００１６】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基を示す〕
で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を含有してなる皮膚外用剤、ならびに
（２） 式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である前記（１）に記載の皮膚外用剤
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の皮膚外用剤によれば、不全角化を起因とする皮膚の状態を予防または改善することができるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】参考例１において、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量とオレイン酸との関係を調べた結果を示す図面代用写真である。
【図２】参考例２において、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量とオレイン酸との関係を調べた結果を示す図面代用写真である。
【図３】実施例１において、ペプチドのマススペクトルを示すチャートである。
【図４】実施例１において、酸化後のペプチドのマススペクトルを示すチャートである。
【図５】（Ａ）は、試験例２において、実験番号：１１の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は実験番号：１０の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図６】試験例２において、試料の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図７】（Ａ）は、試験例３において、実験番号：１５の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は、実験番号：１４の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図８】試験例３において、試料の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図９】試験例４において、試料の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】試験例５において、試料の種類または細胞の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１１】（Ａ）は試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３２の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３３の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｃ）は試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３４の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｄ）は試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３５の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の皮膚外用剤は、前記したように、式（Ｉ）：
【００２０】
【化４】
【００２１】
〔式中、Ｘａａ1およびＸａａ5はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基、Ｘａａ2は置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基、Ｘａａ3およびＸａａ4はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｒ1は式（ＩＩ）：
【００２２】
【化５】
【００２３】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基または式（ＩＩＩ）：
【００２４】
【化６】
【００２５】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基を示す〕
で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を含有している。なお、前記式（Ｉ）は、配列番号：１に対応している。
【００２６】
前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、分子内に、配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド鎖が当該ペプチド鎖中のシステイニル基とこのペプチド鎖に付加されたシステイニル基と式（ＩＩ）で表される基または式（ＩＩＩ）で表される基とによって環化された構造を有している。前記構造のうち、前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列を一部に有する配列番号：３に示されるアミノ酸配列からなる直鎖状ペプチドは、エピモルフィンや、オレイン酸などの不飽和脂肪酸によって引き起こされるヒトの皮膚モデルにおける不全角化を抑制しないことが本発明者らによって見出されている。これに対して、前記環化された構造を有している前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、エピモルフィンの生理活性を抑制し、エピモルフィンや、オレイン酸などの不飽和脂肪酸によって引き起こされるヒトの皮膚モデルにおける不全角化を抑制することが本発明者らによって見出されている。したがって、本発明の皮膚外用剤は、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を含有していることから、不全角化を抑制することができるので、不全角化を起因とする皮膚の状態を予防または改善することができるという優れた効果を奏する。
【００２７】
なお、本明細書において、不全角化に起因するヒトの皮膚の状態とは、例えば、肌荒れ、ニキビ、吹き出物、タコ、イボ、乾癬、フケ症などをいう。
【００２８】
また、本明細書において、不全角化を抑制する作用を「抑制作用」という。かかる抑制作用は、例えば、
（ａ）エピモルフィンを発現するケラチノサイトを支持体上で三次元に培養して得られる分化細胞構築物の表面に本発明の皮膚外用剤を塗布すること、
（ｂ）ケラチノサイトを支持体上で三次元に培養して得られる分化細胞構築物の表面にオレイン酸を塗布した後、さらに本発明の皮膚外用剤を塗布すること、
（ｃ）エピモルフィンを発現するケラチノサイトの細胞凝集物をコラーゲンゲル中に包埋させ、当該細胞凝集物を、本発明の皮膚外用剤を含む培地中で培養すること、
（ｄ）ケラチノサイトの細胞凝集物をコラーゲンゲル中に包埋し、当該細胞凝集物を、オレイン酸と本発明の皮膚外用剤とを含む培地中で培養すること、
（ｅ）本発明の皮膚外用剤を含む培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオン導入剤を含む培地中で培養すること、または
（ｆ）本発明の皮膚外用剤とオレイン酸とを含む培地中でケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオン導入剤を含む培地中で培養すること
により、不全角化が改善されることに基づいて評価することができる。
【００２９】
Ｘａａ1は、置換基を有してもよいセリル基または置換基を有してもよいスレオニル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、例えば、単糖または多糖から誘導されたチオグリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＯ-グリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＮ-グリコシル基、リン酸基などが挙げられる。前記Ｘａａ1のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはセリル基である。
【００３０】
Ｘａａ2は、置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、例えば、炭素数１〜３のアルキル基などが挙げられる。前記Ｘａａ2のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはイソロイシル基である。
【００３１】
Ｘａａ3は、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。Ｘａａ3が置換基を有してもよいアスパラギニル基である場合、前記置換基としては、単糖または多糖から誘導されたチオグリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＯ-グリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＮ-グリコシル基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいグルタミニル基である場合、前記置換基としては、アミノ基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいアスパラチル基である場合、前記置換基としては、スクシンイミド基、リン酸基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいグルタミル基である場合、前記置換基としては、カルボキシル基などが挙げられる。前記Ｘａａ3のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはグルタミル基である。
【００３２】
Ｘａａ4は、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、前記Ｘａａ3における置換基と同様のものが挙げられる。前記Ｘａａ4のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはグルタミニル基である。
【００３３】
Ｘａａ5は、置換基を有してもよいセリル基または置換基を有してもよいスレオニル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、前記Ｘａａ1における置換基と同様のものが挙げられる。前記Ｘａａ5のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはセリル基である。
【００３４】
式（Ｉ）において、ｎは、１〜１０の整数である。前記ｎは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、１０以下、好ましくは８以下であり、より好ましくは５以下、さらに好ましくは３以下、特に好ましくは１である。
【００３５】
なお、Ｘａａ1〜Ｘａａ5、Ｒ1およびＣｙｓは、それぞれ、Ｌ−体の官能基であってもよく、Ｄ−体の官能基であってもよい。ヒトへの適応性の観点から、Ｘａａ1〜Ｘａａ5、Ｒ1およびＣｙｓは、好ましくはＬ−体の官能基である。
【００３６】
薬理的に許容される塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、無機酸塩、有機酸塩などが挙げられる。前記無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられる。また、有機酸塩としては、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、無機塩基塩、有機塩基塩などが挙げられる。無機塩基塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基塩としては、例えば、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩などが挙げられる。
【００３７】
式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である化合物が好ましい。
【００３８】
本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、例えば、
（１）式（Ｉ）におけるＣｙｓ、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5およびＣｙｓそれぞれに対応するアミノ酸と、式（ＩＶ）：
【００３９】
【化７】
【００４０】
〔式中、ｎは式（Ｉ）におけるｎと同じである〕
で表される化合物とを用い、式（Ｖ）：
【００４１】
【化８】
【００４２】
〔式中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、ＣｙｓおよびＲ1は式（Ｉ）におけるＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、ＣｙｓおよびＲ1と同じである〕
で表される化合物（配列番号：４）を製造するステップ、および
（２）前記ステップ（１）で得られた式（Ｖ）で表される化合物を環化させるステップ
を含む方法により製造することができる。
【００４３】
ステップ（１）においては、ペプチドの化学合成法などにより、式（Ｖ）で表される化合物を製造することができる。前記化学合成法としては、例えば、固相合成法、段階的伸長法、液相合成法などが挙げられる。前記化学合成法のなかでは、目的とする環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造が容易であり、しかも、その収率および純度が高いことから、固相合成法が好ましい。前記固相合成法としては、例えば、Ｆｍｏｃ合成法、Ｂｏｃ合成法などが挙げられる。かかる固相合成法は、市販のペプチド合成機を用いて行なうことができる。
【００４４】
ステップ（１）において、固相合成法を行なう場合、固相として、例えば、ペプチド合成用樹脂などが用いられる。前記ペプチド合成用樹脂としては、例えば、ＰＡＭ樹脂、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。
【００４５】
固相合成法において、前記アミノ酸は、前記保護基によって分子内のアミノ基を予め保護して用いられる。前記保護基としては、例えば、９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基などが挙げられる。なお、前記アミノ酸は、必要に応じて、側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いることができる。なお、本明細書において、アミノ基や側鎖の官能基が保護されているアミノ酸を「保護アミノ酸」という。
【００４６】
式（ＩＶ）において、ｎが１である場合、式（ＩＶ）で表される化合物として、グリシンを用いることができる。式（ＩＶ）において、ｎが２である場合、式（ＩＶ）で表される化合物として、β−アラニンを用いることができる。また、式（ＩＶ）において、ｎが３である場合、式（ＩＶ）で表される化合物として、４−アミノ酪酸を用いることができる。式（ＩＶ）において、ｎが４〜１０の整数である場合、式（ＩＶ）で表される化合物は、ストレッカー反応を利用した化学合成によって得ることができる。固相合成法において、かかる式（ＩＶ）で表される化合物は、前記アミノ酸の場合と同様に、アミノ基および必要に応じて側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いる。なお、本明細書において、アミノ基、側鎖の官能基などが保護されている式（ＩＶ）で表される化合物を「保護化合物」という。
【００４７】
ステップ（１）において、固相合成法を行なう場合、式（Ｉ）におけるＣｙｓ、Ｘａａ5、Ｘａａ4、Ｘａａ3、Ｘａａ2、Ｘａａ1、Ｒ1およびＣｙｓに対応する保護アミノ酸または保護化合物を、この順で、ペプチド合成用樹脂上で逐次的に縮合させ、つぎに、前記ペプチド合成用樹脂から式（Ｖ）で表される化合物に対応する生成物を切り出すと同時に保護基を除去する。
【００４８】
前記縮合には、一般的なペプチド合成に用いられる活性化試薬などが用いられる。前記縮合の際の反応温度は、ペプチドの合成において一般的な温度であればよい。通常、前記反応温度は、約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。
【００４９】
保護基の除去は、例えば、触媒の存在下での水素気流中での接触還元、酸処理、アルカリ処理などによって行なうことができる。
【００５０】
ステップ（１）においては、必要に応じて、得られた生成物の精製を行なってもよい。前記精製は、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００５１】
ステップ（２）において、式（Ｖ）で表される化合物の環化は、かかる化合物の両末端のシステイニル基同士を共有結合させることによって行なうことができる、前記システイニル基同士の共有結合は、例えば、式（Ｖ）で表される化合物を、酢酸水溶液などの酸性水溶液中でヨウ素によって酸化させることによって形成させることができる。
【００５２】
得られた生成物が式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩であることは、例えば、プロテインシークエンサー、質量分析装置などによって確認することができる。
【００５３】
なお、式（Ｉ）で表される化合物が遊離体として得られた場合、式（Ｉ）で表される化合物の薬理的に許容できる塩は、ステップ（２）で得られた生成物を、必要に応じて、常法に従って薬理的に許容できる塩に変換することにより得ることができる。
【００５４】
また、ステップ（２）で得られた生成物がその分子内に前記保護基を有する場合、常法に従って前記保護基を脱離させることができる。ステップ（２）では、必要に応じて、得られた生成物の単離または精製を行なってもよい。前記生成物の単離または精製は、ステップ（１）における精製の手法、常法などに従って、実施することができる。
【００５５】
本発明の皮膚外用剤中における前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の含有量は、前記皮膚外用剤の用途などによって異なるので、一概には決定することができないため、前記皮膚外用剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。通常、本発明の皮膚外用剤中における前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の含有量は、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０００００００１質量％以上、より好ましくは０．００００００１質量％以上、取り扱い時における容易性を確保するとともに、ヒトへの負荷を抑制する観点から、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以下である。なお、液剤である皮膚外用剤の場合、本発明の皮膚外用剤中における前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の含有量は、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以上、取り扱い時における容易性を確保する観点から、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下である。
【００５６】
本発明の皮膚外用剤には、本発明の目的が妨げられない範囲で、皮膚化粧料、医薬部外品または医薬品に配合されるその他の成分が配合されていてもよい。前記成分としては、例えば、油性成分、保湿剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤、粘度調整剤、キレート化剤、アルコール、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン、アミノ酸、水などが挙げられる。本発明の皮膚外用剤中における前記成分の含有量は、当該成分の種類などによって異なるので、一概には決定することができないので、前記成分の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００５７】
本発明の皮膚外用剤としては、特に限定されないが、例えば、皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品などが挙げられる。
【００５８】
前記皮膚化粧料としては、特に限定されないが、例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ファンデーションなどが挙げられる。洗顔料としては、特に限定されないが、例えば、石けん、クレンジングフォーム、クレンジングジェル、洗顔パウダー、シェービングフォーム、クレンジングミルク、クレンジングオイル、クレンジングマスクなどが挙げられる。化粧水としては、特に限定されないが、例えば、柔軟化粧水、収れん化粧水などが挙げられる。乳液としては、例えば、エモリエントローション、マッサージローション、クレンジングローション、メーキャップローション、ハンドローション、ボディーローションなどが挙げられる。クリームとしては、特に限定されないが、メーキャップクリーム、ベースクリーム、プレメーキャップクリーム、エモリエントクリーム、クレンジングクリーム、ファンデーションクリーム、マッサージクリーム、デオドラントクリームなどが挙げられる。ファンデーションとしては、パウダーファンデーション、ケーキタイプファンデーション、両用ファンデーションなどが挙げられる。
【００５９】
医薬部外品としては、例えば、軟膏、クリーム、ローションなどが挙げられる。また、医薬品としては、例えば、軟膏、クリームなどが挙げられる。
【００６０】
本発明の皮膚外用剤によれば、当該皮膚外用剤を、正常な皮膚と接触させることにより、エピモルフィンの生理活性を抑制し、当該エピモルフィンや不飽和脂肪酸により引き起こされる不全角化の発生を抑制することができる。したがって、本発明の皮膚外用剤によれば、不全角化を起因とする皮膚の状態を予防することができる。また、本発明の皮膚外用剤によれば、当該皮膚外用剤を、不全角化を伴う皮膚と接触させることにより、エピモルフィンの生理活性を抑制し、当該エピモルフィンや不飽和脂肪酸により引き起こされる不全角化の状態を改善することができる。したがって、本発明の皮膚外用剤によれば、不全角化を起因とする皮膚の状態を改善することができる。
【００６１】
本発明の皮膚外用剤を皮膚と接触させる際の前記皮膚外用剤の使用量は、皮膚の種類や範囲などによって異なるので、一概には決定することができないため、皮膚の種類や範囲などに応じて適宜設定することが好ましい。通常、前記皮膚外用剤の使用量は、皮膚の面積１０ｃｍ2あたりの前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の量が、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは１ｎｇ以上、より好ましくは１０ｎｇ以上となり、取り扱い時における容易性を確保する観点から、好ましくは１０００μｇ以下、より好ましくは１００μｇ以下、さらに好ましくは１０μｇ以下となる程度に調整されることが望ましい。
【００６２】
本発明の皮膚外用剤と皮膚との接触は、当該皮膚外用剤の剤形などに応じた方法によって行なうことができる。
【００６３】
以上のように、本発明の皮膚外用剤によれば、不全角化を抑制することができることから、前記不全角化に起因するヒトの状態の異常を改善することができる。したがって、本発明の皮膚外用剤は、不全角化に起因するヒトの皮膚の状態を予防または改善する用途などに有用である。
【実施例】
【００６４】
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｓｅｒはセリル基、Ｇｌｎはグルタミニル基、Ｇｌｕはグルタミル基、Ｉｌｅはイソロイシル基、Ｇｌｙはグリシル基を示す。
【００６５】
（製造例１）
ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（シグマ−アルドリッチ社製）に、熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を濃度が１０質量％となるように添加し、熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地（以下、「ＤＨ１０培地」という）を得た。
【００６６】
正常ヒト表皮ケラチノサイト細胞株であるＨａＣａＴ細胞を、前記ＤＨ１０培地中、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。
【００６７】
マウスエピモルフィンをコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：Ｅ０６６２９、配列番号：５）におけるエピモルフィンのＮ末端側に対応する部位に、Ｔ７−タグをコードするＤＮＡ（配列番号：６）を付加し、Ｔ７−タグエピモルフィンをコードするｃＤＮＡを調製した。つぎに、前記Ｔ７−タグエピモルフィンをコードするｃＤＮＡを、レトロウイルス発現ベクターｐＱＣＸＩＮ（クローンテック社製）のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入し、Ｔ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを調製した。
【００６８】
得られたＴ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを、遺伝子導入用試薬（インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミンおよびインビトロジェン社製、商品名：プラス試薬）を用いてパッケージング細胞〔クローンテック社製、ＰＴ６７細胞（マウス線維芽細胞由来細胞）〕に導入した。つぎに、得られた細胞のうち、５００μｇ/ｍＬのジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）に対して耐性能を示す細胞から培養上清を回収した。回収された培養上清中から、レトロウイルスを得た。得られたレトロウイルスを前記ＨａＣａＴ細胞に感染させ、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）の存在下に、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、Ｔ７−タグエピモルフィンを産生するケラチノサイト（ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞）を単離した。
【００６９】
（製造例２）
ＰＴ６７細胞を、ＤＨ１０培地中、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。
【００７０】
前記製造例１のＴ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを、遺伝子導入用試薬（インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミンおよびインビトロジェン社製、商品名：プラス試薬）を用いて、ＰＴ６７細胞に導入した。つぎに、得られた細胞を、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製）の存在下に、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、Ｔ７−タグエピモルフィンを産生する線維芽細胞（ＰＴ６７−ＴＥ細胞）を単離した。
【００７１】
（製造例３）
ＩＬ−２シグナルペプチドをコードする核酸（配列番号：７）を、エピモルフィンをコードするｃＤＮＡ（配列番号：５）におけるエピモルフィンのＮ末端に対応する部位に付加し、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードする核酸を得た。得られた核酸をレトロウイルス発現ベクター（クローンテック社製、商品名：ｐＱＣＸＩＮ）のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入して、細胞表面エピモルフィン用発現プラスミドを調製した。
【００７２】
得られた細胞表面エピモルフィン用発現プラスミドを、商品名：リポフェクタミン（インビトロジェン社製）およびプラス試薬（インビトロジェン社製）を用いてＰＴ６７に導入した。前記製造例１と同様にして得られたレトロウイルスをＨａＣａＴ細胞に感染させた。つぎに、得られた細胞を、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）の存在下に、５体積％二酸化炭素下、３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、細胞外エピモルフィンを産生する細胞（ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞）を単離した。
【００７３】
（参考例１）
ＨａＣａＴ細胞をＤＨ１０培地（実験番号：１）、０．０１体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：２）または０．０２５体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：３）中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【００７４】
培養後の細胞を単離し、得られた細胞を可溶化試薬〔組成：２体積％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０体積％グリセロール、５体積％２−メルカプトエタノール、０．００８体積％ブロモフェノールブルー、０．６５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ約６．８）〕に溶解させることによって細胞抽出液を得た。
【００７５】
得られた細胞抽出液と抗エピモルフィン抗体〔Ｒ＆Ｄシステムズ社製〕とを用いてウエスタンブロッティングを行ない、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量とオレイン酸との関係を調べた。なお、抗エピモルフィン抗体の代わりに抗β−アクチン抗体を用いたことを除き、前記と同様にして、ＨａＣａＴ細胞におけるβ―アクチンの発現量とオレイン酸との関係を調べた。
【００７６】
参考例１において、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量とオレイン酸との関係を調べた結果を図１に示す。図１中、レーン１は実験番号：１の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンド、レーン２は実験番号：２の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンド、レーン３は、実験番号：３の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンドを示す。
【００７７】
図１に示された結果から、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量は、実験番号：１〜３のいずれの培地を用いた場合であっても同程度であることがわかる。なお、ＨａＣａＴ細胞におけるβ―アクチンの発現量も、実験番号：１〜３のいずれの培地を用いた場合であっても同程度であることがわかる。したがって、これらの結果から、オレイン酸は、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量にはほとんど影響を与えないことがわかる。
【００７８】
（参考例２）
製造例１で得られたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞または製造例２で得られたＰＴ６７−ＴＥ細胞をＤＨ１０培地（実験番号：４）、０．０１体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：５）または０．０２５体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：６）中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。また、製造例１で得られたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞または製造例２で得られたＰＴ６７−ＴＥ細胞に対して、照射量が１０ｍＪ／ｃｍ2となるように紫外線Ｂ（ＵＶＢ）を照射し、その後、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した（実験番号７）。
【００７９】
得られた培養物を遠心分離〔１０００×ｇ、３０分間）に供し、培養上清を得た。
【００８０】
得られた培養上清から、抗Ｔ７タグ抗体〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕と、プロテインＧセファロースビーズ〔ＧＥヘルスケア製〕とを用いて、分泌エピモルフィンを回収した。回収された分泌エピモルフィンとＨＲＰ標識抗Ｔ７タグ抗体〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕とを用いてウエスタンブロッティングを行ない、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量とオレイン酸との関係を調べた。
【００８１】
参考例２において、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量とオレイン酸との関係を調べた結果を図２に示す。図２中、レーン１は実験番号：４の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン２は実験番号：５の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン３は、実験番号：６の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン４は、実験番号：７の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンドを示す。
【００８２】
図２に示された結果から、ケラチノサイトであるＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量は、オレイン酸の濃度が最も高い実験番号：６の培地を用いた場合、最も多く、ＵＶＢが照射されたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量と同程度であることがわかる。一方、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量は、オレイン酸を含まない実験番号：４の培地を用いた場合、最も低くなることがわかる。これに対して、線維芽細胞であるＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清においては、オレイン酸の濃度とは関係なく、分泌エピモルフィンが検出されないことがわかる。これらの結果から、オレイン酸は、ケラチノサイトからのエピモルフィンの分泌を引き起こすことがわかる。したがって、オレイン酸により引き起こされる皮膚の不全角化とエピモルフィンにより引き起こされる皮膚の状態の異常とが関連していることが示唆される。
【００８３】
（実施例１）
式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基を示し、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、ｎ＝１である化合物を以下のようにして、合成した。
【００８４】
（１）ペプチドの合成
出発原料として、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂〔２-クロロトリチルクロライド樹脂１ｇあたりＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の量が０．７０ｍｍｏｌ〕０．２５ｍｍｏｌ相当量を、自動ペプチド合成装置〔アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社製、商品名：４３０Ａ〕に入れた。
【００８５】
まず、自動ペプチド合成装置のプログラムの制御下に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体であるＦｍｏｃ−Ｓｅｒ(ＯＢｕ)２ｍｍｏｌをカップリング剤〔組成：０．４５Ｍ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（以下、「ＨＢＴｕ」という）と０．４５Ｍ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、「ＨＯＢｔ」という）とを含むジメチルホルムアミド〕で活性化させ、前記反応槽に入れた。これにより、前記反応槽内において、樹脂上のアミノ酸残基とＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体とのカップリング反応を行ない、Ｆｍｏｃ基保護ペプチド鎖を生成した。
【００８６】
つぎに、樹脂上のＦｍｏｃ基保護ペプチド鎖中におけるＦｍｏｃ基を２０体積％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン溶液で除去し（脱保護）、洗浄した。その後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をこの順で用いて前記と同様の操作を行なうことにより、配列番号：４に示されるアミノ酸配列にしたがって、対応するＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体を樹脂上のＦｍｏｃ基保護ペプチド鎖に逐次導入し、配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有するＦｍｏｃ基保護ペプチドを含む樹脂を得た。なお、カップリング反応の成否は、カイザーテストを行なうことにより適宜確認した。
【００８７】
得られたＦｍｏｃ基保護ペプチドを含む樹脂を、トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」という）とトリイソプロピルシラン（以下、「ＴＩＳ」という）と水とエタンジチオール（以下、「ＤＴ」という）の混合液〔ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＤＴ（体積比）が９２．５／２．５／２．５／２．５〕中、室温で２時間インキュベーションして脱保護および樹脂からのペプチド鎖の切り出しを行なった。インキュベーション後の混合液から２-クロロトリチルクロライド樹脂をろ別し、ろ液を得た。得られたろ液を減圧下に濃縮して当該ろ液からＴＦＡを留去した。得られた残渣に、冷却ジエチルエーテルを添加して、ペプチドの粗生成物の沈殿物約７００ｍｇを回収した。
【００８８】
得られた粗生成物約７００ｍｇを、逆相カラム〔ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）社製、オクタデシルシリカカラム、カラムの内径：３０ｍｍ、カラムの長さ２５０ｍｍ〕を備えた高速液体クロマトグラフィー分取装置〔（株）島津製作所製、商品名：モデルＬＣ８Ａ〕に供した。そして、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１体積％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液とを用い、溶離液中のアセトニトリルの濃度勾配が１〜６０体積％となるように溶離液中のアセトニトリルの濃度を調整しながら、流速：１．０ｍＬ／分で２５分間クロマトグラフィーを行なった。目的のペプチドを含む画分を回収し、前記画分からアセトニトリルを留去した。つぎに、残渣を凍結乾燥させ、目的のペプチドのトリフルオロ酢酸塩１１０ｍｇを得た。その後、目的のペプチドのトリフルオロ酢酸塩を脱塩し、目的のペプチド（直鎖状ペプチド）を得た。なお、カイザーテストの結果から、前記ペプチドは、配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが確認された。
【００８９】
（２）ペプチドの環化
前記（１）で得られたペプチド１１０ｍｇ（０．１３５ｍｍｏｌ）を５０体積％酢酸水溶液１３０ｍＬに添加した。つぎに、得られた混合物に、０．５Ｍヨウ素水溶液２１０μＬ（０．８当量）を添加し、撹拌しながら室温で３時間混合した。これにより、ペプチド中の２つのシステイニル基のチオール基を酸化して、ジスルフィド結合を形成させた。その後、得られた混合物にアスコルビン酸７０ｍｇを添加した。
【００９０】
つぎに、得られた混合物を、逆相カラム〔ズルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）社製、オクタデシルシリカカラム、カラムの内径：３０ｍｍ、カラムの長さ２５０ｍｍ〕を備えた逆相高速クロマトグラフィー分取装置〔（株）島津製作所製、商品名：モデルＬＣ８Ａ〕に供した。そして、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１体積％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液とを用い、溶離液中のアセトニトリルの濃度勾配が１〜６０体積％となるように溶離液中のアセトニトリルの濃度を調整しながら、流速：１．０ｍＬ／分で２５分間クロマトグラフィーを行なった。これにより、生成物２０ｍｇを得た。
【００９１】
（３）環状ペプチド化合物の確認
前記（１）で得られたペプチドおよび前記（２）で得られた生成物（酸化後のペプチド）それぞれを質量分析装置〔（株）島津製作所製、商品名：ＬＣ−ＭＳ−２０１０〕に供し、前記（１）で得られたペプチドおよび前記（２）で得られた酸化後のペプチドそれぞれのマススペクトルを調べた。実施例１において、ペプチドのマススペクトルを図３に、実施例１において、酸化後のペプチドのマススペクトルを図４に示す。
【００９２】
図３に示された結果から、前記（１）で得られたペプチドのマススペクトルでは、配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドの理論値付近の８２６．２ｍ／ｚにピークが見られることがわかる。この結果から、前記（１）で得られたペプチドが配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが裏付けられた。
【００９３】
また、図３および４に示された結果から、前記（１）で得られたペプチドのマススペクトルでは、８２６．２ｍ／ｚにピークが見られるのに対して（図１参照）、前記（２）で得られた酸化後のペプチドのマススペクトルでは、水素原子２個分少ない８２４．２ｍ／ｚにピークが見られることがわかる。これらの結果から、前記（２）で得られた酸化後のペプチドは、２つのシステイニル基間でジスルフィド結合が形成されることによって、前記（１）で得られたペプチドが環化されていることが裏付けられた。したがって、前記（２）で得られたペプチドは、環状ペプチド化合物であることがわかる。なお、前記環状ペプチド化合物の純度を高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」という）で調べたところ、９８．２％であることが確認された。
【００９４】
（４）皮膚外用剤の調製
前記（２）で得られた環状ペプチド化合物をその濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように精製水に添加し、皮膚外用剤を得た。
【００９５】
（実施例２）
実施例１において、ｎ＝１である化合物の代わりにｎ＝５である化合物を用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、皮膚外用剤を得た。
【００９６】
（実施例３）
実施例１において、ｎ＝１である化合物の代わりにｎ＝８である化合物を用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、皮膚外用剤を得た。
【００９７】
（比較例１）
（１）直鎖状ペプチドの調製
実施例（１）において、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂の代わりにＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ）−Ａｌｋｏ−樹脂〔樹脂１ｇあたりＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ）の量が０．７０ｍｍｏｌ〕０．２５ｍｍｏｌ相当量を用いたことと、実施例、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体として、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をこの順に用いる代わりに、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＩｌｅおよびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）をこの順に用いたこととを除き、実施例１（１）と同様に操作を行ない、配列番号：３に示されるアミノ酸配列からなる直鎖状ペプチドを得た。
【００９８】
（２）皮膚外用剤の調製
前記（１）で得られた直鎖状ペプチドをその濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように精製水に添加し、皮膚外用剤を得た。
【００９９】
（試験例１）
実施例１で得られた皮膚外用剤１００μＬを実施例１（２）で得られた環状ペプチド化合物の濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た。得られた試料中において、製造例３で得られたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃でインキュベーションし、経時的に細胞を採取した。採取された細胞に、細胞計数用キット〔（株）同仁化学研究所製、商品名：Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ〕に添付の試薬Ａ〔（株）同仁化学研究所製、商品名：ＷＳＴ−１〕と溶液Ｂとの混合溶液〔試薬Ａと溶液Ｂとの体積比（試薬Ａ／溶液Ｂ）＝１０／１〕１１０μＬを添加し、３時間インキュベーションした。得られた混合物について、分光光度計〔ワッラック（ＷＡＬＬＡＣ）社製、商品名：ＡＲＶＯｔｍＳＸ １４２０ ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ ＣＯＵＮＴＥＲ〕を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた。
【０１００】
実施例１で得られた皮膚外用剤の代わりに実施例２で得られた皮膚外用剤、実施例３で得られた皮膚外用剤または比較例１で得られた皮膚外用剤を用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた。実施例１で得られた皮膚外用剤を含む試料、実施例２で得られた皮膚外用剤を含む試料、実施例３で得られた皮膚外用剤を含む試料および比較例１で得られた皮膚外用剤を含む試料それぞれによるＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた結果を表１に示す。なお、表１における評価基準は以下のとおりである。
【０１０１】
＋＋：対照を用いたときと比べ、有意にＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育の回復が検出される（危険率０．０１以下）。
＋ ：対照を用いたときと比べ、有意にＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育の回復が検出される（危険率０．０５以下）。
− ：ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育の回復が検出されない。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】
表１に示された結果から、実施例１〜３で得られた皮膚外用剤を含む試料中でインキュベーションしたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、生育状態が良好であることがわかる。なかでも、実施例１で得られた皮膚外用剤を含む試料中でインキュベーションしたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、生育状態が最も良好であることがわかる。これに対し、比較例１で得られた皮膚外用剤を含む試料中でインキュベーションしたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、生育状態が不良であることがわかる。
【０１０４】
ＨａＣａＴ細胞において、エピモルフィンを発現させたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、ＨａＣａＴ細胞と比べて生育状態が不良になる。しかしながら、実施例１〜３で得られた皮膚外用剤を含む試料は、エピモルフィンの生理活性を抑制して細胞の生育状態を改善していることが示唆される。
【０１０５】
（試験例２）
（１）試料の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：８の試料として用いた。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液を、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：９）。さらに、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と比較例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：１０）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：１１）。
【０１０６】
（２）細胞クラスターの形成および内腔形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞を、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。
【０１０７】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞を、１０００Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ（シグマ−アルドリッチ社製）含有ＤＨ１０培地３５０μＬに懸濁した。得られた懸濁物を、２４−ウェルディッシュ（コーニング社製、超低接着表面）中、１００ｍｉｎ-1で回転させながら、５体積％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で２４時間旋回培養して、平滑で丸い細胞凝集物を形成させた。
【０１０８】
形成された細胞凝集物を、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液〔（株）高研製〕で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋した。
【０１０９】
つぎに、包埋後の細胞凝集物を、実験番号８：の試料、実験番号：９の試料、実験番号：１０の試料または実験番号：１１の試料中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で４日間インキュベーションして、細胞クラスターを形成させた。得られた細胞クラスターの形態を位相差顕微鏡下で観察した。
【０１１０】
細胞クラスター内において、最外層の細胞は、コラーゲンと接しているために未分化状態を保持している。しかしながら、前記最外層に存在する未分化状態の細胞の内側に位置する細胞は、通常、速やかに分化を開始し、アノイキスに至る。そのため、前記細胞クラスターでは、正常状態では培養開始から３〜４日間経過時において、容易に判別できる内腔が形成される。そこで、ランダムに選択された１００個の細胞クラスターを観察し、全１００個の細胞クラスターにおける明らかな内腔形成が見られた細胞クラスターの割合を調べることにより、内腔形成率を算出した。
【０１１１】
試験例２において、実験番号：１１の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図５（Ａ）に、実験番号：１０の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図５（Ｂ）に示す。図中、スケールバーは１００μｍの長さを示す。
【０１１２】
また、試験例２において、試料の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を図６に示す。図中、レーン１は実験番号：８の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン２は実験番号：９の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン３は実験番号：１０の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン４は実験番号：１１の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率を示す。
【０１１３】
図５（Ａ）、図５（Ｂ）および図６に示された結果から、実験番号：１１の試料を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が高いのに対して、実験番号：１０の試料を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が低いことがわかる。これらの結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１１の試料は、オレイン酸により引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制しているが、比較例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１０の試料は、オレイン酸により引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制していないことがわかる。前記細胞クラスターにおける内腔形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、オレイン酸により引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常は、オレイン酸により引き起こされる不全角化を再現していると考えられる。したがって、実施例１で得られた皮膚外用剤は、不全角化を抑制することができることが示唆される。
【０１１４】
（試験例３）
（１）試料の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：１２の試料として用いた。精製水１μＬをＤＨ１０培地１ｍＬに添加し、培地を得た（実験番号：１３）。さらに、比較例１で得られた皮膚外用剤を直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：１４）。また、実施例１で得られた皮膚外用剤を環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：１５）。
【０１１５】
（２）細胞クラスターの形成および内腔形成率の算出
試験例２（１）において、ＨａＣａＴ細胞の代わりに製造例３で得られたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を用いたことを除き、試験例２と同様に操作を行ない、平滑で丸い細胞凝集物を形成させた。
【０１１６】
形成された細胞凝集物を、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液〔（株）高研製〕で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋した。
【０１１７】
つぎに、包埋後の細胞凝集物を、実験番号１２：の試料、実験番号：１３の試料、実験番号：１４の試料または実験番号：１５の試料中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で４日間インキュベーションして、細胞クラスターを形成させた。また、試験例２と同様に操作を行ない、内腔形成率を算出した。
【０１１８】
試験例３において、実験番号：１５の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図７（Ａ）に、実験番号：１４の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図７（Ｂ）に示す。図中、スケールバーは１００μｍの長さを示す。
【０１１９】
また、試験例３において、試料の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を図８に示す。図中、レーン１は実験番号：１２の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン２は実験番号：１３の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン３は実験番号：１４の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン４は実験番号：１５の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊は、Ｐ＜０．０５である。
【０１２０】
図７（Ａ）、図７（Ｂ）および図８に示された結果から、実験番号：１５の試料を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が高いのに対して、実験番号：１４の試料を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が低いことがわかる。これらの結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１５の試料は、エピモルフィンにより引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制しているが、比較例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１４の試料は、エピモルフィンにより引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制していないことがわかる。前記細胞クラスターにおける内腔形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、エピモルフィンを発現する細胞からなる細胞クラスターにおける内腔形成の異常は、エピモルフィンにより引き起こされる不全角化を再現していると考えられる。したがって、実施例１で得られた皮膚外用剤は、不全角化を抑制することができることが示唆される。
【０１２１】
（試験例４）
（１）試料の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：１６の試料として用いた。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液をオレイン酸の濃度が０．０２体積％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：１７）。さらに、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と比較例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：１８）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：１９）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と比較例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２０）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２１）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と比較例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２２）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２３）。
【０１２２】
（２）コーニファイドエンベロープ形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞を、実験番号：１６〜２３のいずれかの培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【０１２３】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、ついで、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液〔シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製〕５００μＬ中において、３７℃で３分間インキュベーションした。
【０１２４】
その後、得られたＨａＣａＴ細胞を１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように無血清ＤＨ培地（ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２、シグマ−アルドリッチ社製）に懸濁した。得られた懸濁液に、カルシウム流入を引き起こすカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（シグマ−アルドリッチ社製）を濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物中に含まれるＨａＣａＴ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５時間培養した。
【０１２５】
得られた細胞をリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄した。洗浄後の細胞を可溶化液〔組成：２質量％ＳＤＳ、２０ｍＭジチオスレイトール、残部精製水〕中で１０分間インキュベーションした。その後、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７によるカルシウム流入後の不溶性コーニファイドエンベロープに起因する残存不溶化細胞の数を光学顕微鏡下で計数し、全細胞の数と残存不溶化細胞の数とを用い、コーニファイドエンベロープ形成率を算出した。
【０１２６】
試験例４において、試料の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を図９に示す。図中、１は実験番号：１６の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、２は実験番号：１７の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、３は実験番号：１８の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、４は実験番号：１９の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、５は実験番号：２０の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、６は実験番号：２１の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、７は実験番号：２２の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、８は実験番号：２３の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１である。
【０１２７】
図９に示された結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１９の試料（図中、４）、実験番号：２１の試料（図中、６）および実験番号：２３の試料（図中、８）それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率は、比較例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１８の試料（図中、３）、実験番号：２０の試料（図中、５）および実験番号：２２の試料（図中、７）それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率と比べて高くなっていることがわかる。コーニファイドエンベロープの形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、オレイン酸存在下におけるコーニファイドエンベロープの形成率は、皮膚の不全角化の場合のコーニファイドエンベロープの形成率と相関していると考えられる。したがって、これらの結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤は、不全角化を抑制することができることが示唆される。
【０１２８】
（試験例５）
（１）試料の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：２４または２５の試料として用いた。比較例１で得られた皮膚外用剤を、直鎖状ペプチドの濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２６）。また、実施例１で得られた皮膚外用剤を、環状ペプチド化合物の濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２７）。比較例１で得られた皮膚外用剤を、直鎖状ペプチドの濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２８）。実施例１で得られた皮膚外用剤を、環状ペプチド化合物の濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２９）。また、比較例１で得られた皮膚外用剤を、直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：３０）。実施例１で得られた皮膚外用剤を、環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：３１）。
【０１２９】
（２）コーニファイドエンベロープ形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞を用いた場合、ＨａＣａＴ細胞を実験番号：２４の培地中で５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【０１３０】
一方、ＨａＣａＴ-ＥＰＭ細胞を用いた場合、ＨａＣａＴ-ＥＰＭ細胞を実験番号：２５〜３１のいずれかの培地中で５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【０１３１】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞またはＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、ついで、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液５００μＬ中において、３７℃で３分間インキュベーションした。
【０１３２】
その後、得られたＨａＣａＴ細胞またはＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように無血清ＤＨ培地に懸濁した。得られた懸濁液に、カルシウム流入を引き起こすカルシウムイオノフォアＡ２３１８７を濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物中に含まれるＨａＣａＴ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５時間培養した。
【０１３３】
試験例４と同様の操作を行なって、コーニファイドエンベロープ形成率を算出した。
【０１３４】
試験例５において、試料の種類または細胞の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を図１０に示す。図中、１は実験番号：２４の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、２は実験番号：２５の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、３は実験番号：２６の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、４は実験番号：２７の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、５は実験番号：２８の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、６は実験番号：２９の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、７は実験番号：３０の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、８は実験番号：３１の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１である。
【０１３５】
図１０に示された結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：２７の試料（図中、４）、実験番号：２９の試料（図中、６）および実験番号：３１の試料（図中、８）それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率は、比較例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：２６の試料（図中、３）、実験番号：２８の試料、図中、５）および実験番号：３０の試料（図中、７）それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率と比べて高くなっていることがわかる。コーニファイドエンベロープの形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、エピモルフィンを発現させたときにおけるコーニファイドエンベロープの形成率は、皮膚の不全角化の場合のコーニファイドエンベロープの形成率と相関していると考えられる。したがって、これらの結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤は、不全角化を抑制することができることが示唆される。
【０１３６】
（試験例６）
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：３２の試料として用いた。精製水１μＬをＤＨ１０培地１ｍＬに添加し、試料を得た（実験番号：３３）。また、実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物をその濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：３４）。さらに、比較例１（１）で得られた直鎖状ペプチドをその濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：３５）。
【０１３７】
ヒト胎児肺線維芽細胞のＭＲＣ−５細胞を、１０質量％熱不活性化ＦＣＳを含有するα−ＭＥＭ（ギブコ・ラボラトリー社製）１０ｍＬ中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で７２時間培養した。
【０１３８】
２４ウェル培養プレートのウェル内に支持体〔ＢＤバイオサイエンス社製、商品名：セルカルチャーインサート〕を設置した。前記支持体中において、前記ＭＲＣ−５細胞とコラーゲンゲル混合溶液（コラーゲンＩ型、新田ゼラチン株式会社製）とを混合した。得られた混合物をゲル化させて、細胞包埋ゲル（１．７×１０5／ｍＬ）を得た。得られた細胞包埋ゲルの上表面に、１ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン水溶液（ＢＤバイオサイエンス社製）０．０５ｍｌを添加し、前記細胞包埋ゲルを室温で１時間放置した。つぎに、前記細胞包埋ゲル中のＭＲＣ−５細胞を、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で一晩インキュベーションした。
【０１３９】
その後、０．４μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（シグマ−アルドリッチ社製）と１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ギブコ・ラボラトリー社製）とインスリン（５μｇ／ｍｌ）と５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（シグマ−アルドリッチ社製）とを含有するＤＨ１０培地０．２ｍＬに懸濁したＨａＣａＴ細胞（７．０×１０４細胞）を前記細胞包埋ゲル上に播種した。
【０１４０】
つぎに、前記ＨａＣａＴ細胞が播種された細胞包埋ゲルを、２４ウェル培養プレートのウェル中のＤＨ１０培地に浸漬させた。その後、細胞包埋ゲル中に含まれる細胞を、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５日間インキュベーションし、細胞構築物を得た。つぎに、得られた細胞構築物中のＨａＣａＴ細胞の表面を、空気とＤＨ１０培地との接触面まで持ち上げて配置し、前記細胞構築物を、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で１５日間培養し、ＨａＣａＴ細胞を含む分化細胞構築物を得た。
【０１４１】
その後、分化細胞構築物の表面に、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液５μＬと、実験番号：３２〜３５のいずれかの試料５μＬとを塗布し、分化細胞構築物を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃でさらに１日間培養した。
【０１４２】
得られた細胞構造体から凍結切片を作製した。かかる凍結切片をヘマトキシリン−エオシン染色により、細胞核を青紫色に染色するとともに、細胞質細胞質物質の大部分を赤色に染色した。染色後の凍結切片を用い、細胞構造体の組織形態を位相差顕微鏡下で観察した。
【０１４３】
試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３２の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ａ）に、試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３３の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ｂ）に、試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３４の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ｃ）に、試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３５の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ｄ）に示す。図中、スケールバーは、５０μｍの長さを示す。
【０１４４】
図１１（Ａ）および（Ｃ）に示された結果から、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および環状ペプチド化合物を含む実験番号：３４の試料を塗布したときの細胞構造体では、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３２の試料を塗布したときの細胞構造体と同様に、細胞核が見られないことがわかる。したがって、環状ペプチド化合物は、オレイン酸によって引き起こされる不全角化を抑制することができることがわかる。
【０１４５】
一方、図１１（Ｂ）および（Ｄ）に示された結果から、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３３の試料を塗布したときの細胞構造体ならびに０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および直鎖状ペプチドを含む実験番号：３５の試料を塗布したときの細胞構造体においては、細胞核が見られることがわかる。したがって、直鎖状ペプチドは、オレイン酸によって引き起こされる不全角化を抑制することができないことがわかる。
【０１４６】
（試験例７）
試験例６において、実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物の代わりに、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物のうち、実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物以外の化合物を用いたことを除き、試験例６と同様の操作を行ない、細胞構造体の組織形態を位相差顕微鏡下で観察する。
【０１４７】
その結果、実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物を用いたときと同様の結果が得られる。
【０１４８】
以上の結果から、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を含有する皮膚外用剤によれば、エピモルフィンまたはオレイン酸によってヒトの皮膚に引き起こされる不全角化を抑制することができることがわかる。したがって、前記皮膚外用剤は、不全角化に起因するヒトの皮膚の状態の異常を改善する用途などに有用であることが示唆される。
【０１４９】
（処方例）
以下、本発明に係る皮膚外用剤の処方例を示す。
（処方例１ エモリエントローション）
実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物 ０．０００１質量％
エタノール ５．０質量％
ポリイキシエチレン（５０）硬化ヒマシ油 １．０質量％
グリセリン １５．０質量％
１，３−ブチレングリコール １．５質量％
クエン酸 ０．０５質量％
クエン酸ナトリウム ０．１質量％
メチルパラベン ０．３質量％
香料 適量
紫外線吸収剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０質量％
【０１５０】
（処方例２ エモリエント乳液）
実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物 ０．０００３質量％
流動パラフィン １５．０質量％
ミツロウ ２．０質量％
ラノリン １．５質量％
セスキオレイン酸ソルビタン ２．５質量％
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル １．０質量％
１，２−オクタンジオール ０．０５質量％
グリセリン １０．０質量％
１，３−ブチレングリコール ３．０質量％
キサンタンガム ０．５質量％
香料 適量
紫外線吸収剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０質量％
【０１５１】
（処方例３ エモリエントクリーム）
実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物 ０．０００５質量％
ステアリルアルコール ５．０質量％
ステアリン酸 ２．０質量％
ワセリン ５．０質量％
スクワラン ５．０質量％
トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリル １．０質量％
ホホバ油 １．０質量％
オリーブ油 １．０質量％
１，３−ブチレングリコール ３．０質量％
グリセリン １０．０質量％
プロピレングリコールモノステアリン酸エステル ２．５質量％
ポリオキシエチレンセチルエーテル ３．０質量％
トリエタノールアミン １．０質量％
メチルパラベン ０．１５質量％
プロピルパラベン ０．１質量％
香料 適量
酸化防止剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０質量％
【配列表フリーテキスト】
【０１５２】
配列番号：１は、環状ペプチド化合物の配列である。１番目のシステイニル基と８番目のシステイニル基との間には、ジスルフィド結合が形成されている。２番目のＸａａは、−ＣＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（式中、ｎは１〜１０の整数である）である。３番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。４番目のＸａａは、置換基を有してもよいＩｌｅ、置換基を有してもよいＶａｌまたは置換基を有してもよいＬｅｕである。５番目のＸａａは置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。６番目のＸａａは、置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。７番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。
【０１５３】
配列番号：２は、直鎖状ペプチドまたは環状ペプチド化合物の部分配列である。
配列番号：３は、直鎖状ペプチドの配列である。
【０１５４】
配列番号：４は、環状ペプチド化合物の部分配列である。２番目のＸａａは、−ＣＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（式中、ｎは１〜１０の整数である）である。３番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。４番目のＸａａは、置換基を有してもよいＩｌｅ、置換基を有してもよいＶａｌまたは置換基を有してもよいＬｅｕである。５番目のＸａａは置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。６番目のＸａａは、置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。７番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。
【０１５５】
配列番号：６は、Ｔ７タグ配列である。
配列番号：７は、ＩＬ−２シグナルペプチドの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用剤に関する。さらに詳しくは、不全角化を起因とする皮膚の状態の予防または改善に有用な皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの表皮は、下層から順に、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とからなる。ヒトの正常な皮膚は、通常、２８日間の周期でターンオーバーする。正常な皮膚のターンオーバーでは、ケラチノサイトが顆粒層から角質層へと押し上げられる。このとき、ケラチノサイトの分化により脱核が生じて有核細胞が消失し、成熟した角質層が形成される。
【０００３】
しかしながら、炎症や皮脂中に含まれる不飽和脂肪酸などによって表皮における細胞の増殖速度が著しく大きくなり、角化の速度が異常に促進された場合、最終分化段階のケラチノサイトにおいて、脱核が起こらないことがある（以下、「不全角化」という）。
【０００４】
不全角化を伴う皮膚は、前記角質層のバリア機能が著しく低下していることから、物理的刺激や化学的刺激を十分に防ぐことができない状態になっている。そのため、不全角化を伴う皮膚では、ニキビ、肌荒れなどの皮膚トラブルが生じやすい。
【０００５】
前記バリア機能を補うために、不全角化を伴う皮膚に対して、保湿剤などを含む皮膚外用剤が適用されている。しかしながら、一般に、前記保湿剤による表皮における保湿効果は、一時的に発揮されるにすぎないことから、当該保湿剤などを含む皮膚外用剤には、本質的な皮膚の状態の改善を期待することができないという欠点がある。そこで、不全角化を抑制し、当該不全角化を起因とする皮膚の状態を予防または改善することができる有用な皮膚外用剤が求められている。
【０００６】
一方、エピモルフィンは、上皮組織の形態形成の促進に関与している因子の１つであると考えられている。そこで、上皮組織の形態形成を制御するために、エピモルフィンによる上皮組織の形態形成促進作用を阻害するペプチドが開発されている（例えば、特許文献１および２を参照）。
【０００７】
しかしながら、現時点では、本発明者らは、エピモルフィンと炎症や皮脂中に含まれる不飽和脂肪酸などによる不全角化との関係を具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−７６９８号公報
【特許文献２】特許第３９２２３４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、不全角化を起因とする皮膚の状態を予防または改善することができる皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、
（１） 式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
【００１２】
〔式中、Ｘａａ1およびＸａａ5はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基、Ｘａａ2は置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基、Ｘａａ3およびＸａａ4はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｒ1は式（ＩＩ）：
【００１３】
【化２】
【００１４】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基または式（ＩＩＩ）：
【００１５】
【化３】
【００１６】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基を示す〕
で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を含有してなる皮膚外用剤、ならびに
（２） 式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である前記（１）に記載の皮膚外用剤
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の皮膚外用剤によれば、不全角化を起因とする皮膚の状態を予防または改善することができるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】参考例１において、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量とオレイン酸との関係を調べた結果を示す図面代用写真である。
【図２】参考例２において、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量とオレイン酸との関係を調べた結果を示す図面代用写真である。
【図３】実施例１において、ペプチドのマススペクトルを示すチャートである。
【図４】実施例１において、酸化後のペプチドのマススペクトルを示すチャートである。
【図５】（Ａ）は、試験例２において、実験番号：１１の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は実験番号：１０の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図６】試験例２において、試料の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図７】（Ａ）は、試験例３において、実験番号：１５の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は、実験番号：１４の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図８】試験例３において、試料の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図９】試験例４において、試料の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】試験例５において、試料の種類または細胞の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１１】（Ａ）は試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３２の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３３の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｃ）は試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３４の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｄ）は試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３５の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の皮膚外用剤は、前記したように、式（Ｉ）：
【００２０】
【化４】
【００２１】
〔式中、Ｘａａ1およびＸａａ5はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基、Ｘａａ2は置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基、Ｘａａ3およびＸａａ4はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｒ1は式（ＩＩ）：
【００２２】
【化５】
【００２３】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基または式（ＩＩＩ）：
【００２４】
【化６】
【００２５】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基を示す〕
で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を含有している。なお、前記式（Ｉ）は、配列番号：１に対応している。
【００２６】
前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、分子内に、配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド鎖が当該ペプチド鎖中のシステイニル基とこのペプチド鎖に付加されたシステイニル基と式（ＩＩ）で表される基または式（ＩＩＩ）で表される基とによって環化された構造を有している。前記構造のうち、前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列を一部に有する配列番号：３に示されるアミノ酸配列からなる直鎖状ペプチドは、エピモルフィンや、オレイン酸などの不飽和脂肪酸によって引き起こされるヒトの皮膚モデルにおける不全角化を抑制しないことが本発明者らによって見出されている。これに対して、前記環化された構造を有している前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、エピモルフィンの生理活性を抑制し、エピモルフィンや、オレイン酸などの不飽和脂肪酸によって引き起こされるヒトの皮膚モデルにおける不全角化を抑制することが本発明者らによって見出されている。したがって、本発明の皮膚外用剤は、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を含有していることから、不全角化を抑制することができるので、不全角化を起因とする皮膚の状態を予防または改善することができるという優れた効果を奏する。
【００２７】
なお、本明細書において、不全角化に起因するヒトの皮膚の状態とは、例えば、肌荒れ、ニキビ、吹き出物、タコ、イボ、乾癬、フケ症などをいう。
【００２８】
また、本明細書において、不全角化を抑制する作用を「抑制作用」という。かかる抑制作用は、例えば、
（ａ）エピモルフィンを発現するケラチノサイトを支持体上で三次元に培養して得られる分化細胞構築物の表面に本発明の皮膚外用剤を塗布すること、
（ｂ）ケラチノサイトを支持体上で三次元に培養して得られる分化細胞構築物の表面にオレイン酸を塗布した後、さらに本発明の皮膚外用剤を塗布すること、
（ｃ）エピモルフィンを発現するケラチノサイトの細胞凝集物をコラーゲンゲル中に包埋させ、当該細胞凝集物を、本発明の皮膚外用剤を含む培地中で培養すること、
（ｄ）ケラチノサイトの細胞凝集物をコラーゲンゲル中に包埋し、当該細胞凝集物を、オレイン酸と本発明の皮膚外用剤とを含む培地中で培養すること、
（ｅ）本発明の皮膚外用剤を含む培地中でエピモルフィンを発現するケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオン導入剤を含む培地中で培養すること、または
（ｆ）本発明の皮膚外用剤とオレイン酸とを含む培地中でケラチノサイトを培養した後、得られたケラチノサイトを、カルシウムイオン導入剤を含む培地中で培養すること
により、不全角化が改善されることに基づいて評価することができる。
【００２９】
Ｘａａ1は、置換基を有してもよいセリル基または置換基を有してもよいスレオニル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、例えば、単糖または多糖から誘導されたチオグリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＯ-グリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＮ-グリコシル基、リン酸基などが挙げられる。前記Ｘａａ1のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはセリル基である。
【００３０】
Ｘａａ2は、置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、例えば、炭素数１〜３のアルキル基などが挙げられる。前記Ｘａａ2のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはイソロイシル基である。
【００３１】
Ｘａａ3は、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。Ｘａａ3が置換基を有してもよいアスパラギニル基である場合、前記置換基としては、単糖または多糖から誘導されたチオグリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＯ-グリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＮ-グリコシル基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいグルタミニル基である場合、前記置換基としては、アミノ基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいアスパラチル基である場合、前記置換基としては、スクシンイミド基、リン酸基などが挙げられる。Ｘａａ3が置換基を有してもよいグルタミル基である場合、前記置換基としては、カルボキシル基などが挙げられる。前記Ｘａａ3のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはグルタミル基である。
【００３２】
Ｘａａ4は、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、前記Ｘａａ3における置換基と同様のものが挙げられる。前記Ｘａａ4のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはグルタミニル基である。
【００３３】
Ｘａａ5は、置換基を有してもよいセリル基または置換基を有してもよいスレオニル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、前記Ｘａａ1における置換基と同様のものが挙げられる。前記Ｘａａ5のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくはセリル基である。
【００３４】
式（Ｉ）において、ｎは、１〜１０の整数である。前記ｎは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、１０以下、好ましくは８以下であり、より好ましくは５以下、さらに好ましくは３以下、特に好ましくは１である。
【００３５】
なお、Ｘａａ1〜Ｘａａ5、Ｒ1およびＣｙｓは、それぞれ、Ｌ−体の官能基であってもよく、Ｄ−体の官能基であってもよい。ヒトへの適応性の観点から、Ｘａａ1〜Ｘａａ5、Ｒ1およびＣｙｓは、好ましくはＬ−体の官能基である。
【００３６】
薬理的に許容される塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、無機酸塩、有機酸塩などが挙げられる。前記無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられる。また、有機酸塩としては、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、無機塩基塩、有機塩基塩などが挙げられる。無機塩基塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基塩としては、例えば、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩などが挙げられる。
【００３７】
式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である化合物が好ましい。
【００３８】
本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、例えば、
（１）式（Ｉ）におけるＣｙｓ、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5およびＣｙｓそれぞれに対応するアミノ酸と、式（ＩＶ）：
【００３９】
【化７】
【００４０】
〔式中、ｎは式（Ｉ）におけるｎと同じである〕
で表される化合物とを用い、式（Ｖ）：
【００４１】
【化８】
【００４２】
〔式中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、ＣｙｓおよびＲ1は式（Ｉ）におけるＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、ＣｙｓおよびＲ1と同じである〕
で表される化合物（配列番号：４）を製造するステップ、および
（２）前記ステップ（１）で得られた式（Ｖ）で表される化合物を環化させるステップ
を含む方法により製造することができる。
【００４３】
ステップ（１）においては、ペプチドの化学合成法などにより、式（Ｖ）で表される化合物を製造することができる。前記化学合成法としては、例えば、固相合成法、段階的伸長法、液相合成法などが挙げられる。前記化学合成法のなかでは、目的とする環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造が容易であり、しかも、その収率および純度が高いことから、固相合成法が好ましい。前記固相合成法としては、例えば、Ｆｍｏｃ合成法、Ｂｏｃ合成法などが挙げられる。かかる固相合成法は、市販のペプチド合成機を用いて行なうことができる。
【００４４】
ステップ（１）において、固相合成法を行なう場合、固相として、例えば、ペプチド合成用樹脂などが用いられる。前記ペプチド合成用樹脂としては、例えば、ＰＡＭ樹脂、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。
【００４５】
固相合成法において、前記アミノ酸は、前記保護基によって分子内のアミノ基を予め保護して用いられる。前記保護基としては、例えば、９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基などが挙げられる。なお、前記アミノ酸は、必要に応じて、側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いることができる。なお、本明細書において、アミノ基や側鎖の官能基が保護されているアミノ酸を「保護アミノ酸」という。
【００４６】
式（ＩＶ）において、ｎが１である場合、式（ＩＶ）で表される化合物として、グリシンを用いることができる。式（ＩＶ）において、ｎが２である場合、式（ＩＶ）で表される化合物として、β−アラニンを用いることができる。また、式（ＩＶ）において、ｎが３である場合、式（ＩＶ）で表される化合物として、４−アミノ酪酸を用いることができる。式（ＩＶ）において、ｎが４〜１０の整数である場合、式（ＩＶ）で表される化合物は、ストレッカー反応を利用した化学合成によって得ることができる。固相合成法において、かかる式（ＩＶ）で表される化合物は、前記アミノ酸の場合と同様に、アミノ基および必要に応じて側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いる。なお、本明細書において、アミノ基、側鎖の官能基などが保護されている式（ＩＶ）で表される化合物を「保護化合物」という。
【００４７】
ステップ（１）において、固相合成法を行なう場合、式（Ｉ）におけるＣｙｓ、Ｘａａ5、Ｘａａ4、Ｘａａ3、Ｘａａ2、Ｘａａ1、Ｒ1およびＣｙｓに対応する保護アミノ酸または保護化合物を、この順で、ペプチド合成用樹脂上で逐次的に縮合させ、つぎに、前記ペプチド合成用樹脂から式（Ｖ）で表される化合物に対応する生成物を切り出すと同時に保護基を除去する。
【００４８】
前記縮合には、一般的なペプチド合成に用いられる活性化試薬などが用いられる。前記縮合の際の反応温度は、ペプチドの合成において一般的な温度であればよい。通常、前記反応温度は、約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。
【００４９】
保護基の除去は、例えば、触媒の存在下での水素気流中での接触還元、酸処理、アルカリ処理などによって行なうことができる。
【００５０】
ステップ（１）においては、必要に応じて、得られた生成物の精製を行なってもよい。前記精製は、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００５１】
ステップ（２）において、式（Ｖ）で表される化合物の環化は、かかる化合物の両末端のシステイニル基同士を共有結合させることによって行なうことができる、前記システイニル基同士の共有結合は、例えば、式（Ｖ）で表される化合物を、酢酸水溶液などの酸性水溶液中でヨウ素によって酸化させることによって形成させることができる。
【００５２】
得られた生成物が式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩であることは、例えば、プロテインシークエンサー、質量分析装置などによって確認することができる。
【００５３】
なお、式（Ｉ）で表される化合物が遊離体として得られた場合、式（Ｉ）で表される化合物の薬理的に許容できる塩は、ステップ（２）で得られた生成物を、必要に応じて、常法に従って薬理的に許容できる塩に変換することにより得ることができる。
【００５４】
また、ステップ（２）で得られた生成物がその分子内に前記保護基を有する場合、常法に従って前記保護基を脱離させることができる。ステップ（２）では、必要に応じて、得られた生成物の単離または精製を行なってもよい。前記生成物の単離または精製は、ステップ（１）における精製の手法、常法などに従って、実施することができる。
【００５５】
本発明の皮膚外用剤中における前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の含有量は、前記皮膚外用剤の用途などによって異なるので、一概には決定することができないため、前記皮膚外用剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。通常、本発明の皮膚外用剤中における前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の含有量は、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０００００００１質量％以上、より好ましくは０．００００００１質量％以上、取り扱い時における容易性を確保するとともに、ヒトへの負荷を抑制する観点から、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以下である。なお、液剤である皮膚外用剤の場合、本発明の皮膚外用剤中における前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の含有量は、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以上、取り扱い時における容易性を確保する観点から、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下である。
【００５６】
本発明の皮膚外用剤には、本発明の目的が妨げられない範囲で、皮膚化粧料、医薬部外品または医薬品に配合されるその他の成分が配合されていてもよい。前記成分としては、例えば、油性成分、保湿剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤、粘度調整剤、キレート化剤、アルコール、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン、アミノ酸、水などが挙げられる。本発明の皮膚外用剤中における前記成分の含有量は、当該成分の種類などによって異なるので、一概には決定することができないので、前記成分の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００５７】
本発明の皮膚外用剤としては、特に限定されないが、例えば、皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品などが挙げられる。
【００５８】
前記皮膚化粧料としては、特に限定されないが、例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ファンデーションなどが挙げられる。洗顔料としては、特に限定されないが、例えば、石けん、クレンジングフォーム、クレンジングジェル、洗顔パウダー、シェービングフォーム、クレンジングミルク、クレンジングオイル、クレンジングマスクなどが挙げられる。化粧水としては、特に限定されないが、例えば、柔軟化粧水、収れん化粧水などが挙げられる。乳液としては、例えば、エモリエントローション、マッサージローション、クレンジングローション、メーキャップローション、ハンドローション、ボディーローションなどが挙げられる。クリームとしては、特に限定されないが、メーキャップクリーム、ベースクリーム、プレメーキャップクリーム、エモリエントクリーム、クレンジングクリーム、ファンデーションクリーム、マッサージクリーム、デオドラントクリームなどが挙げられる。ファンデーションとしては、パウダーファンデーション、ケーキタイプファンデーション、両用ファンデーションなどが挙げられる。
【００５９】
医薬部外品としては、例えば、軟膏、クリーム、ローションなどが挙げられる。また、医薬品としては、例えば、軟膏、クリームなどが挙げられる。
【００６０】
本発明の皮膚外用剤によれば、当該皮膚外用剤を、正常な皮膚と接触させることにより、エピモルフィンの生理活性を抑制し、当該エピモルフィンや不飽和脂肪酸により引き起こされる不全角化の発生を抑制することができる。したがって、本発明の皮膚外用剤によれば、不全角化を起因とする皮膚の状態を予防することができる。また、本発明の皮膚外用剤によれば、当該皮膚外用剤を、不全角化を伴う皮膚と接触させることにより、エピモルフィンの生理活性を抑制し、当該エピモルフィンや不飽和脂肪酸により引き起こされる不全角化の状態を改善することができる。したがって、本発明の皮膚外用剤によれば、不全角化を起因とする皮膚の状態を改善することができる。
【００６１】
本発明の皮膚外用剤を皮膚と接触させる際の前記皮膚外用剤の使用量は、皮膚の種類や範囲などによって異なるので、一概には決定することができないため、皮膚の種類や範囲などに応じて適宜設定することが好ましい。通常、前記皮膚外用剤の使用量は、皮膚の面積１０ｃｍ2あたりの前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の量が、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは１ｎｇ以上、より好ましくは１０ｎｇ以上となり、取り扱い時における容易性を確保する観点から、好ましくは１０００μｇ以下、より好ましくは１００μｇ以下、さらに好ましくは１０μｇ以下となる程度に調整されることが望ましい。
【００６２】
本発明の皮膚外用剤と皮膚との接触は、当該皮膚外用剤の剤形などに応じた方法によって行なうことができる。
【００６３】
以上のように、本発明の皮膚外用剤によれば、不全角化を抑制することができることから、前記不全角化に起因するヒトの状態の異常を改善することができる。したがって、本発明の皮膚外用剤は、不全角化に起因するヒトの皮膚の状態を予防または改善する用途などに有用である。
【実施例】
【００６４】
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｓｅｒはセリル基、Ｇｌｎはグルタミニル基、Ｇｌｕはグルタミル基、Ｉｌｅはイソロイシル基、Ｇｌｙはグリシル基を示す。
【００６５】
（製造例１）
ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（シグマ−アルドリッチ社製）に、熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を濃度が１０質量％となるように添加し、熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地（以下、「ＤＨ１０培地」という）を得た。
【００６６】
正常ヒト表皮ケラチノサイト細胞株であるＨａＣａＴ細胞を、前記ＤＨ１０培地中、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。
【００６７】
マウスエピモルフィンをコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：Ｅ０６６２９、配列番号：５）におけるエピモルフィンのＮ末端側に対応する部位に、Ｔ７−タグをコードするＤＮＡ（配列番号：６）を付加し、Ｔ７−タグエピモルフィンをコードするｃＤＮＡを調製した。つぎに、前記Ｔ７−タグエピモルフィンをコードするｃＤＮＡを、レトロウイルス発現ベクターｐＱＣＸＩＮ（クローンテック社製）のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入し、Ｔ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを調製した。
【００６８】
得られたＴ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを、遺伝子導入用試薬（インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミンおよびインビトロジェン社製、商品名：プラス試薬）を用いてパッケージング細胞〔クローンテック社製、ＰＴ６７細胞（マウス線維芽細胞由来細胞）〕に導入した。つぎに、得られた細胞のうち、５００μｇ/ｍＬのジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）に対して耐性能を示す細胞から培養上清を回収した。回収された培養上清中から、レトロウイルスを得た。得られたレトロウイルスを前記ＨａＣａＴ細胞に感染させ、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）の存在下に、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、Ｔ７−タグエピモルフィンを産生するケラチノサイト（ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞）を単離した。
【００６９】
（製造例２）
ＰＴ６７細胞を、ＤＨ１０培地中、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。
【００７０】
前記製造例１のＴ７−タグエピモルフィン用発現プラスミドを、遺伝子導入用試薬（インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミンおよびインビトロジェン社製、商品名：プラス試薬）を用いて、ＰＴ６７細胞に導入した。つぎに、得られた細胞を、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製）の存在下に、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、Ｔ７−タグエピモルフィンを産生する線維芽細胞（ＰＴ６７−ＴＥ細胞）を単離した。
【００７１】
（製造例３）
ＩＬ−２シグナルペプチドをコードする核酸（配列番号：７）を、エピモルフィンをコードするｃＤＮＡ（配列番号：５）におけるエピモルフィンのＮ末端に対応する部位に付加し、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードする核酸を得た。得られた核酸をレトロウイルス発現ベクター（クローンテック社製、商品名：ｐＱＣＸＩＮ）のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入して、細胞表面エピモルフィン用発現プラスミドを調製した。
【００７２】
得られた細胞表面エピモルフィン用発現プラスミドを、商品名：リポフェクタミン（インビトロジェン社製）およびプラス試薬（インビトロジェン社製）を用いてＰＴ６７に導入した。前記製造例１と同様にして得られたレトロウイルスをＨａＣａＴ細胞に感染させた。つぎに、得られた細胞を、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ・ラボラトリー社製、商品名：Ｇ４１８）の存在下に、５体積％二酸化炭素下、３７℃で８日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、細胞外エピモルフィンを産生する細胞（ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞）を単離した。
【００７３】
（参考例１）
ＨａＣａＴ細胞をＤＨ１０培地（実験番号：１）、０．０１体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：２）または０．０２５体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：３）中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【００７４】
培養後の細胞を単離し、得られた細胞を可溶化試薬〔組成：２体積％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０体積％グリセロール、５体積％２−メルカプトエタノール、０．００８体積％ブロモフェノールブルー、０．６５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ約６．８）〕に溶解させることによって細胞抽出液を得た。
【００７５】
得られた細胞抽出液と抗エピモルフィン抗体〔Ｒ＆Ｄシステムズ社製〕とを用いてウエスタンブロッティングを行ない、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量とオレイン酸との関係を調べた。なお、抗エピモルフィン抗体の代わりに抗β−アクチン抗体を用いたことを除き、前記と同様にして、ＨａＣａＴ細胞におけるβ―アクチンの発現量とオレイン酸との関係を調べた。
【００７６】
参考例１において、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量とオレイン酸との関係を調べた結果を図１に示す。図１中、レーン１は実験番号：１の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンド、レーン２は実験番号：２の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンド、レーン３は、実験番号：３の培地を用いたときの内因性エピモルフィンに対応するバンドを示す。
【００７７】
図１に示された結果から、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量は、実験番号：１〜３のいずれの培地を用いた場合であっても同程度であることがわかる。なお、ＨａＣａＴ細胞におけるβ―アクチンの発現量も、実験番号：１〜３のいずれの培地を用いた場合であっても同程度であることがわかる。したがって、これらの結果から、オレイン酸は、ＨａＣａＴ細胞における内因性エピモルフィンの発現量にはほとんど影響を与えないことがわかる。
【００７８】
（参考例２）
製造例１で得られたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞または製造例２で得られたＰＴ６７−ＴＥ細胞をＤＨ１０培地（実験番号：４）、０．０１体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：５）または０．０２５体積％オレイン酸含有ＤＨ１０培地（実験番号：６）中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。また、製造例１で得られたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞または製造例２で得られたＰＴ６７−ＴＥ細胞に対して、照射量が１０ｍＪ／ｃｍ2となるように紫外線Ｂ（ＵＶＢ）を照射し、その後、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した（実験番号７）。
【００７９】
得られた培養物を遠心分離〔１０００×ｇ、３０分間）に供し、培養上清を得た。
【００８０】
得られた培養上清から、抗Ｔ７タグ抗体〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕と、プロテインＧセファロースビーズ〔ＧＥヘルスケア製〕とを用いて、分泌エピモルフィンを回収した。回収された分泌エピモルフィンとＨＲＰ標識抗Ｔ７タグ抗体〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕とを用いてウエスタンブロッティングを行ない、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量とオレイン酸との関係を調べた。
【００８１】
参考例２において、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清およびＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清それぞれにおける分泌エピモルフィンの量とオレイン酸との関係を調べた結果を図２に示す。図２中、レーン１は実験番号：４の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン２は実験番号：５の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン３は、実験番号：６の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンド、レーン４は、実験番号：７の培地を用いたときの分泌エピモルフィンに対応するバンドを示す。
【００８２】
図２に示された結果から、ケラチノサイトであるＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量は、オレイン酸の濃度が最も高い実験番号：６の培地を用いた場合、最も多く、ＵＶＢが照射されたＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量と同程度であることがわかる。一方、ＨａＣａＴ−ＴＥ細胞の培養上清における分泌エピモルフィンの量は、オレイン酸を含まない実験番号：４の培地を用いた場合、最も低くなることがわかる。これに対して、線維芽細胞であるＰＴ６７−ＴＥ細胞の培養上清においては、オレイン酸の濃度とは関係なく、分泌エピモルフィンが検出されないことがわかる。これらの結果から、オレイン酸は、ケラチノサイトからのエピモルフィンの分泌を引き起こすことがわかる。したがって、オレイン酸により引き起こされる皮膚の不全角化とエピモルフィンにより引き起こされる皮膚の状態の異常とが関連していることが示唆される。
【００８３】
（実施例１）
式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基を示し、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、ｎ＝１である化合物を以下のようにして、合成した。
【００８４】
（１）ペプチドの合成
出発原料として、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂〔２-クロロトリチルクロライド樹脂１ｇあたりＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の量が０．７０ｍｍｏｌ〕０．２５ｍｍｏｌ相当量を、自動ペプチド合成装置〔アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社製、商品名：４３０Ａ〕に入れた。
【００８５】
まず、自動ペプチド合成装置のプログラムの制御下に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体であるＦｍｏｃ−Ｓｅｒ(ＯＢｕ)２ｍｍｏｌをカップリング剤〔組成：０．４５Ｍ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（以下、「ＨＢＴｕ」という）と０．４５Ｍ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、「ＨＯＢｔ」という）とを含むジメチルホルムアミド〕で活性化させ、前記反応槽に入れた。これにより、前記反応槽内において、樹脂上のアミノ酸残基とＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体とのカップリング反応を行ない、Ｆｍｏｃ基保護ペプチド鎖を生成した。
【００８６】
つぎに、樹脂上のＦｍｏｃ基保護ペプチド鎖中におけるＦｍｏｃ基を２０体積％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン溶液で除去し（脱保護）、洗浄した。その後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をこの順で用いて前記と同様の操作を行なうことにより、配列番号：４に示されるアミノ酸配列にしたがって、対応するＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体を樹脂上のＦｍｏｃ基保護ペプチド鎖に逐次導入し、配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有するＦｍｏｃ基保護ペプチドを含む樹脂を得た。なお、カップリング反応の成否は、カイザーテストを行なうことにより適宜確認した。
【００８７】
得られたＦｍｏｃ基保護ペプチドを含む樹脂を、トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」という）とトリイソプロピルシラン（以下、「ＴＩＳ」という）と水とエタンジチオール（以下、「ＤＴ」という）の混合液〔ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＤＴ（体積比）が９２．５／２．５／２．５／２．５〕中、室温で２時間インキュベーションして脱保護および樹脂からのペプチド鎖の切り出しを行なった。インキュベーション後の混合液から２-クロロトリチルクロライド樹脂をろ別し、ろ液を得た。得られたろ液を減圧下に濃縮して当該ろ液からＴＦＡを留去した。得られた残渣に、冷却ジエチルエーテルを添加して、ペプチドの粗生成物の沈殿物約７００ｍｇを回収した。
【００８８】
得られた粗生成物約７００ｍｇを、逆相カラム〔ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）社製、オクタデシルシリカカラム、カラムの内径：３０ｍｍ、カラムの長さ２５０ｍｍ〕を備えた高速液体クロマトグラフィー分取装置〔（株）島津製作所製、商品名：モデルＬＣ８Ａ〕に供した。そして、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１体積％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液とを用い、溶離液中のアセトニトリルの濃度勾配が１〜６０体積％となるように溶離液中のアセトニトリルの濃度を調整しながら、流速：１．０ｍＬ／分で２５分間クロマトグラフィーを行なった。目的のペプチドを含む画分を回収し、前記画分からアセトニトリルを留去した。つぎに、残渣を凍結乾燥させ、目的のペプチドのトリフルオロ酢酸塩１１０ｍｇを得た。その後、目的のペプチドのトリフルオロ酢酸塩を脱塩し、目的のペプチド（直鎖状ペプチド）を得た。なお、カイザーテストの結果から、前記ペプチドは、配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが確認された。
【００８９】
（２）ペプチドの環化
前記（１）で得られたペプチド１１０ｍｇ（０．１３５ｍｍｏｌ）を５０体積％酢酸水溶液１３０ｍＬに添加した。つぎに、得られた混合物に、０．５Ｍヨウ素水溶液２１０μＬ（０．８当量）を添加し、撹拌しながら室温で３時間混合した。これにより、ペプチド中の２つのシステイニル基のチオール基を酸化して、ジスルフィド結合を形成させた。その後、得られた混合物にアスコルビン酸７０ｍｇを添加した。
【００９０】
つぎに、得られた混合物を、逆相カラム〔ズルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）社製、オクタデシルシリカカラム、カラムの内径：３０ｍｍ、カラムの長さ２５０ｍｍ〕を備えた逆相高速クロマトグラフィー分取装置〔（株）島津製作所製、商品名：モデルＬＣ８Ａ〕に供した。そして、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１体積％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液とを用い、溶離液中のアセトニトリルの濃度勾配が１〜６０体積％となるように溶離液中のアセトニトリルの濃度を調整しながら、流速：１．０ｍＬ／分で２５分間クロマトグラフィーを行なった。これにより、生成物２０ｍｇを得た。
【００９１】
（３）環状ペプチド化合物の確認
前記（１）で得られたペプチドおよび前記（２）で得られた生成物（酸化後のペプチド）それぞれを質量分析装置〔（株）島津製作所製、商品名：ＬＣ−ＭＳ−２０１０〕に供し、前記（１）で得られたペプチドおよび前記（２）で得られた酸化後のペプチドそれぞれのマススペクトルを調べた。実施例１において、ペプチドのマススペクトルを図３に、実施例１において、酸化後のペプチドのマススペクトルを図４に示す。
【００９２】
図３に示された結果から、前記（１）で得られたペプチドのマススペクトルでは、配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドの理論値付近の８２６．２ｍ／ｚにピークが見られることがわかる。この結果から、前記（１）で得られたペプチドが配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが裏付けられた。
【００９３】
また、図３および４に示された結果から、前記（１）で得られたペプチドのマススペクトルでは、８２６．２ｍ／ｚにピークが見られるのに対して（図１参照）、前記（２）で得られた酸化後のペプチドのマススペクトルでは、水素原子２個分少ない８２４．２ｍ／ｚにピークが見られることがわかる。これらの結果から、前記（２）で得られた酸化後のペプチドは、２つのシステイニル基間でジスルフィド結合が形成されることによって、前記（１）で得られたペプチドが環化されていることが裏付けられた。したがって、前記（２）で得られたペプチドは、環状ペプチド化合物であることがわかる。なお、前記環状ペプチド化合物の純度を高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」という）で調べたところ、９８．２％であることが確認された。
【００９４】
（４）皮膚外用剤の調製
前記（２）で得られた環状ペプチド化合物をその濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように精製水に添加し、皮膚外用剤を得た。
【００９５】
（実施例２）
実施例１において、ｎ＝１である化合物の代わりにｎ＝５である化合物を用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、皮膚外用剤を得た。
【００９６】
（実施例３）
実施例１において、ｎ＝１である化合物の代わりにｎ＝８である化合物を用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、皮膚外用剤を得た。
【００９７】
（比較例１）
（１）直鎖状ペプチドの調製
実施例（１）において、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂の代わりにＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ）−Ａｌｋｏ−樹脂〔樹脂１ｇあたりＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ）の量が０．７０ｍｍｏｌ〕０．２５ｍｍｏｌ相当量を用いたことと、実施例、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体として、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をこの順に用いる代わりに、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＩｌｅおよびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｕ）をこの順に用いたこととを除き、実施例１（１）と同様に操作を行ない、配列番号：３に示されるアミノ酸配列からなる直鎖状ペプチドを得た。
【００９８】
（２）皮膚外用剤の調製
前記（１）で得られた直鎖状ペプチドをその濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように精製水に添加し、皮膚外用剤を得た。
【００９９】
（試験例１）
実施例１で得られた皮膚外用剤１００μＬを実施例１（２）で得られた環状ペプチド化合物の濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た。得られた試料中において、製造例３で得られたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃でインキュベーションし、経時的に細胞を採取した。採取された細胞に、細胞計数用キット〔（株）同仁化学研究所製、商品名：Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ〕に添付の試薬Ａ〔（株）同仁化学研究所製、商品名：ＷＳＴ−１〕と溶液Ｂとの混合溶液〔試薬Ａと溶液Ｂとの体積比（試薬Ａ／溶液Ｂ）＝１０／１〕１１０μＬを添加し、３時間インキュベーションした。得られた混合物について、分光光度計〔ワッラック（ＷＡＬＬＡＣ）社製、商品名：ＡＲＶＯｔｍＳＸ １４２０ ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ ＣＯＵＮＴＥＲ〕を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた。
【０１００】
実施例１で得られた皮膚外用剤の代わりに実施例２で得られた皮膚外用剤、実施例３で得られた皮膚外用剤または比較例１で得られた皮膚外用剤を用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた。実施例１で得られた皮膚外用剤を含む試料、実施例２で得られた皮膚外用剤を含む試料、実施例３で得られた皮膚外用剤を含む試料および比較例１で得られた皮膚外用剤を含む試料それぞれによるＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育への影響を調べた結果を表１に示す。なお、表１における評価基準は以下のとおりである。
【０１０１】
＋＋：対照を用いたときと比べ、有意にＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育の回復が検出される（危険率０．０１以下）。
＋ ：対照を用いたときと比べ、有意にＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育の回復が検出される（危険率０．０５以下）。
− ：ＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞の生育の回復が検出されない。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】
表１に示された結果から、実施例１〜３で得られた皮膚外用剤を含む試料中でインキュベーションしたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、生育状態が良好であることがわかる。なかでも、実施例１で得られた皮膚外用剤を含む試料中でインキュベーションしたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、生育状態が最も良好であることがわかる。これに対し、比較例１で得られた皮膚外用剤を含む試料中でインキュベーションしたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、生育状態が不良であることがわかる。
【０１０４】
ＨａＣａＴ細胞において、エピモルフィンを発現させたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞は、ＨａＣａＴ細胞と比べて生育状態が不良になる。しかしながら、実施例１〜３で得られた皮膚外用剤を含む試料は、エピモルフィンの生理活性を抑制して細胞の生育状態を改善していることが示唆される。
【０１０５】
（試験例２）
（１）試料の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：８の試料として用いた。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液を、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：９）。さらに、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と比較例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：１０）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０５体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：１１）。
【０１０６】
（２）細胞クラスターの形成および内腔形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞を、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で培養した。
【０１０７】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞を、１０００Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ（シグマ−アルドリッチ社製）含有ＤＨ１０培地３５０μＬに懸濁した。得られた懸濁物を、２４−ウェルディッシュ（コーニング社製、超低接着表面）中、１００ｍｉｎ-1で回転させながら、５体積％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で２４時間旋回培養して、平滑で丸い細胞凝集物を形成させた。
【０１０８】
形成された細胞凝集物を、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液〔（株）高研製〕で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋した。
【０１０９】
つぎに、包埋後の細胞凝集物を、実験番号８：の試料、実験番号：９の試料、実験番号：１０の試料または実験番号：１１の試料中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で４日間インキュベーションして、細胞クラスターを形成させた。得られた細胞クラスターの形態を位相差顕微鏡下で観察した。
【０１１０】
細胞クラスター内において、最外層の細胞は、コラーゲンと接しているために未分化状態を保持している。しかしながら、前記最外層に存在する未分化状態の細胞の内側に位置する細胞は、通常、速やかに分化を開始し、アノイキスに至る。そのため、前記細胞クラスターでは、正常状態では培養開始から３〜４日間経過時において、容易に判別できる内腔が形成される。そこで、ランダムに選択された１００個の細胞クラスターを観察し、全１００個の細胞クラスターにおける明らかな内腔形成が見られた細胞クラスターの割合を調べることにより、内腔形成率を算出した。
【０１１１】
試験例２において、実験番号：１１の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図５（Ａ）に、実験番号：１０の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図５（Ｂ）に示す。図中、スケールバーは１００μｍの長さを示す。
【０１１２】
また、試験例２において、試料の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を図６に示す。図中、レーン１は実験番号：８の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン２は実験番号：９の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン３は実験番号：１０の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン４は実験番号：１１の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率を示す。
【０１１３】
図５（Ａ）、図５（Ｂ）および図６に示された結果から、実験番号：１１の試料を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が高いのに対して、実験番号：１０の試料を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が低いことがわかる。これらの結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１１の試料は、オレイン酸により引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制しているが、比較例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１０の試料は、オレイン酸により引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制していないことがわかる。前記細胞クラスターにおける内腔形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、オレイン酸により引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常は、オレイン酸により引き起こされる不全角化を再現していると考えられる。したがって、実施例１で得られた皮膚外用剤は、不全角化を抑制することができることが示唆される。
【０１１４】
（試験例３）
（１）試料の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：１２の試料として用いた。精製水１μＬをＤＨ１０培地１ｍＬに添加し、培地を得た（実験番号：１３）。さらに、比較例１で得られた皮膚外用剤を直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：１４）。また、実施例１で得られた皮膚外用剤を環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：１５）。
【０１１５】
（２）細胞クラスターの形成および内腔形成率の算出
試験例２（１）において、ＨａＣａＴ細胞の代わりに製造例３で得られたＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を用いたことを除き、試験例２と同様に操作を行ない、平滑で丸い細胞凝集物を形成させた。
【０１１６】
形成された細胞凝集物を、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液〔（株）高研製〕で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋した。
【０１１７】
つぎに、包埋後の細胞凝集物を、実験番号１２：の試料、実験番号：１３の試料、実験番号：１４の試料または実験番号：１５の試料中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で４日間インキュベーションして、細胞クラスターを形成させた。また、試験例２と同様に操作を行ない、内腔形成率を算出した。
【０１１８】
試験例３において、実験番号：１５の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図７（Ａ）に、実験番号：１４の試料を用いたときの細胞クラスターの形態を観察した結果を図７（Ｂ）に示す。図中、スケールバーは１００μｍの長さを示す。
【０１１９】
また、試験例３において、試料の種類と内腔形成率との関係を調べた結果を図８に示す。図中、レーン１は実験番号：１２の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン２は実験番号：１３の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン３は実験番号：１４の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率、レーン４は実験番号：１５の試料を用いたときの細胞クラスターにおける内腔形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊は、Ｐ＜０．０５である。
【０１２０】
図７（Ａ）、図７（Ｂ）および図８に示された結果から、実験番号：１５の試料を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が高いのに対して、実験番号：１４の試料を用いたときの細胞クラスターは、内腔形成率が低いことがわかる。これらの結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１５の試料は、エピモルフィンにより引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制しているが、比較例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１４の試料は、エピモルフィンにより引き起こされる細胞クラスターにおける内腔形成の異常の発生を抑制していないことがわかる。前記細胞クラスターにおける内腔形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、エピモルフィンを発現する細胞からなる細胞クラスターにおける内腔形成の異常は、エピモルフィンにより引き起こされる不全角化を再現していると考えられる。したがって、実施例１で得られた皮膚外用剤は、不全角化を抑制することができることが示唆される。
【０１２１】
（試験例４）
（１）試料の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：１６の試料として用いた。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液をオレイン酸の濃度が０．０２体積％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：１７）。さらに、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と比較例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：１８）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：１９）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と比較例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２０）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２１）。また、１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と比較例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２２）。１体積％オレイン酸含有エタノール溶液と実施例１で得られた皮膚外用剤とを、オレイン酸の濃度が０．０２体積％となり、かつ環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２３）。
【０１２２】
（２）コーニファイドエンベロープ形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞を、実験番号：１６〜２３のいずれかの培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【０１２３】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、ついで、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液〔シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製〕５００μＬ中において、３７℃で３分間インキュベーションした。
【０１２４】
その後、得られたＨａＣａＴ細胞を１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように無血清ＤＨ培地（ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２、シグマ−アルドリッチ社製）に懸濁した。得られた懸濁液に、カルシウム流入を引き起こすカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（シグマ−アルドリッチ社製）を濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物中に含まれるＨａＣａＴ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５時間培養した。
【０１２５】
得られた細胞をリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄した。洗浄後の細胞を可溶化液〔組成：２質量％ＳＤＳ、２０ｍＭジチオスレイトール、残部精製水〕中で１０分間インキュベーションした。その後、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７によるカルシウム流入後の不溶性コーニファイドエンベロープに起因する残存不溶化細胞の数を光学顕微鏡下で計数し、全細胞の数と残存不溶化細胞の数とを用い、コーニファイドエンベロープ形成率を算出した。
【０１２６】
試験例４において、試料の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を図９に示す。図中、１は実験番号：１６の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、２は実験番号：１７の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、３は実験番号：１８の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、４は実験番号：１９の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、５は実験番号：２０の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、６は実験番号：２１の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、７は実験番号：２２の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、８は実験番号：２３の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１である。
【０１２７】
図９に示された結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１９の試料（図中、４）、実験番号：２１の試料（図中、６）および実験番号：２３の試料（図中、８）それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率は、比較例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：１８の試料（図中、３）、実験番号：２０の試料（図中、５）および実験番号：２２の試料（図中、７）それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率と比べて高くなっていることがわかる。コーニファイドエンベロープの形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、オレイン酸存在下におけるコーニファイドエンベロープの形成率は、皮膚の不全角化の場合のコーニファイドエンベロープの形成率と相関していると考えられる。したがって、これらの結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤は、不全角化を抑制することができることが示唆される。
【０１２８】
（試験例５）
（１）試料の調製
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：２４または２５の試料として用いた。比較例１で得られた皮膚外用剤を、直鎖状ペプチドの濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２６）。また、実施例１で得られた皮膚外用剤を、環状ペプチド化合物の濃度が０．０００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２７）。比較例１で得られた皮膚外用剤を、直鎖状ペプチドの濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２８）。実施例１で得られた皮膚外用剤を、環状ペプチド化合物の濃度が０．００００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：２９）。また、比較例１で得られた皮膚外用剤を、直鎖状ペプチドの濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：３０）。実施例１で得られた皮膚外用剤を、環状ペプチド化合物の濃度が０．０００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加して、試料を得た（実験番号：３１）。
【０１２９】
（２）コーニファイドエンベロープ形成率の算出
ＨａＣａＴ細胞を用いた場合、ＨａＣａＴ細胞を実験番号：２４の培地中で５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【０１３０】
一方、ＨａＣａＴ-ＥＰＭ細胞を用いた場合、ＨａＣａＴ-ＥＰＭ細胞を実験番号：２５〜３１のいずれかの培地中で５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で３日間培養した。
【０１３１】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞またはＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、ついで、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液５００μＬ中において、３７℃で３分間インキュベーションした。
【０１３２】
その後、得られたＨａＣａＴ細胞またはＨａＣａＴ−ＥＰＭ細胞を１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように無血清ＤＨ培地に懸濁した。得られた懸濁液に、カルシウム流入を引き起こすカルシウムイオノフォアＡ２３１８７を濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物中に含まれるＨａＣａＴ細胞を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５時間培養した。
【０１３３】
試験例４と同様の操作を行なって、コーニファイドエンベロープ形成率を算出した。
【０１３４】
試験例５において、試料の種類または細胞の種類とコーニファイドエンベロープ形成率との関係を調べた結果を図１０に示す。図中、１は実験番号：２４の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、２は実験番号：２５の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、３は実験番号：２６の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、４は実験番号：２７の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、５は実験番号：２８の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、６は実験番号：２９の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、７は実験番号：３０の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率、８は実験番号：３１の試料を用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率を示す。図中、データは、３回の計数に基づくものであり、平均±標準誤差で示す。また、図中、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１である。
【０１３５】
図１０に示された結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：２７の試料（図中、４）、実験番号：２９の試料（図中、６）および実験番号：３１の試料（図中、８）それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率は、比較例１で得られた皮膚外用剤を含む実験番号：２６の試料（図中、３）、実験番号：２８の試料、図中、５）および実験番号：３０の試料（図中、７）それぞれを用いたときのコーニファイドエンベロープ形成率と比べて高くなっていることがわかる。コーニファイドエンベロープの形成は、皮膚における分化や状態を反映していることから、エピモルフィンを発現させたときにおけるコーニファイドエンベロープの形成率は、皮膚の不全角化の場合のコーニファイドエンベロープの形成率と相関していると考えられる。したがって、これらの結果から、実施例１で得られた皮膚外用剤は、不全角化を抑制することができることが示唆される。
【０１３６】
（試験例６）
以下の実験において、ＤＨ１０培地を実験番号：３２の試料として用いた。精製水１μＬをＤＨ１０培地１ｍＬに添加し、試料を得た（実験番号：３３）。また、実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物をその濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：３４）。さらに、比較例１（１）で得られた直鎖状ペプチドをその濃度が０．００１質量％となるようにＤＨ１０培地に添加し、試料を得た（実験番号：３５）。
【０１３７】
ヒト胎児肺線維芽細胞のＭＲＣ−５細胞を、１０質量％熱不活性化ＦＣＳを含有するα−ＭＥＭ（ギブコ・ラボラトリー社製）１０ｍＬ中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で７２時間培養した。
【０１３８】
２４ウェル培養プレートのウェル内に支持体〔ＢＤバイオサイエンス社製、商品名：セルカルチャーインサート〕を設置した。前記支持体中において、前記ＭＲＣ−５細胞とコラーゲンゲル混合溶液（コラーゲンＩ型、新田ゼラチン株式会社製）とを混合した。得られた混合物をゲル化させて、細胞包埋ゲル（１．７×１０5／ｍＬ）を得た。得られた細胞包埋ゲルの上表面に、１ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン水溶液（ＢＤバイオサイエンス社製）０．０５ｍｌを添加し、前記細胞包埋ゲルを室温で１時間放置した。つぎに、前記細胞包埋ゲル中のＭＲＣ−５細胞を、ＤＨ１０培地中において、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で一晩インキュベーションした。
【０１３９】
その後、０．４μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（シグマ−アルドリッチ社製）と１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ギブコ・ラボラトリー社製）とインスリン（５μｇ／ｍｌ）と５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（シグマ−アルドリッチ社製）とを含有するＤＨ１０培地０．２ｍＬに懸濁したＨａＣａＴ細胞（７．０×１０４細胞）を前記細胞包埋ゲル上に播種した。
【０１４０】
つぎに、前記ＨａＣａＴ細胞が播種された細胞包埋ゲルを、２４ウェル培養プレートのウェル中のＤＨ１０培地に浸漬させた。その後、細胞包埋ゲル中に含まれる細胞を、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で５日間インキュベーションし、細胞構築物を得た。つぎに、得られた細胞構築物中のＨａＣａＴ細胞の表面を、空気とＤＨ１０培地との接触面まで持ち上げて配置し、前記細胞構築物を、５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃で１５日間培養し、ＨａＣａＴ細胞を含む分化細胞構築物を得た。
【０１４１】
その後、分化細胞構築物の表面に、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液５μＬと、実験番号：３２〜３５のいずれかの試料５μＬとを塗布し、分化細胞構築物を５体積％二酸化炭素雰囲気下に３７℃でさらに１日間培養した。
【０１４２】
得られた細胞構造体から凍結切片を作製した。かかる凍結切片をヘマトキシリン−エオシン染色により、細胞核を青紫色に染色するとともに、細胞質細胞質物質の大部分を赤色に染色した。染色後の凍結切片を用い、細胞構造体の組織形態を位相差顕微鏡下で観察した。
【０１４３】
試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３２の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ａ）に、試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３３の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ｂ）に、試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３４の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ｃ）に、試験例６において、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３５の試料を塗布したときの細胞構造体の組織形態を観察した結果を図１１（Ｄ）に示す。図中、スケールバーは、５０μｍの長さを示す。
【０１４４】
図１１（Ａ）および（Ｃ）に示された結果から、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および環状ペプチド化合物を含む実験番号：３４の試料を塗布したときの細胞構造体では、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液を塗布せずに実験番号：３２の試料を塗布したときの細胞構造体と同様に、細胞核が見られないことがわかる。したがって、環状ペプチド化合物は、オレイン酸によって引き起こされる不全角化を抑制することができることがわかる。
【０１４５】
一方、図１１（Ｂ）および（Ｄ）に示された結果から、０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および実験番号：３３の試料を塗布したときの細胞構造体ならびに０．５体積％オレイン酸含有エタノール溶液および直鎖状ペプチドを含む実験番号：３５の試料を塗布したときの細胞構造体においては、細胞核が見られることがわかる。したがって、直鎖状ペプチドは、オレイン酸によって引き起こされる不全角化を抑制することができないことがわかる。
【０１４６】
（試験例７）
試験例６において、実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物の代わりに、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物のうち、実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物以外の化合物を用いたことを除き、試験例６と同様の操作を行ない、細胞構造体の組織形態を位相差顕微鏡下で観察する。
【０１４７】
その結果、実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物を用いたときと同様の結果が得られる。
【０１４８】
以上の結果から、式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を含有する皮膚外用剤によれば、エピモルフィンまたはオレイン酸によってヒトの皮膚に引き起こされる不全角化を抑制することができることがわかる。したがって、前記皮膚外用剤は、不全角化に起因するヒトの皮膚の状態の異常を改善する用途などに有用であることが示唆される。
【０１４９】
（処方例）
以下、本発明に係る皮膚外用剤の処方例を示す。
（処方例１ エモリエントローション）
実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物 ０．０００１質量％
エタノール ５．０質量％
ポリイキシエチレン（５０）硬化ヒマシ油 １．０質量％
グリセリン １５．０質量％
１，３−ブチレングリコール １．５質量％
クエン酸 ０．０５質量％
クエン酸ナトリウム ０．１質量％
メチルパラベン ０．３質量％
香料 適量
紫外線吸収剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０質量％
【０１５０】
（処方例２ エモリエント乳液）
実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物 ０．０００３質量％
流動パラフィン １５．０質量％
ミツロウ ２．０質量％
ラノリン １．５質量％
セスキオレイン酸ソルビタン ２．５質量％
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル １．０質量％
１，２−オクタンジオール ０．０５質量％
グリセリン １０．０質量％
１，３−ブチレングリコール ３．０質量％
キサンタンガム ０．５質量％
香料 適量
紫外線吸収剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０質量％
【０１５１】
（処方例３ エモリエントクリーム）
実施例１（１）で得られた環状ペプチド化合物 ０．０００５質量％
ステアリルアルコール ５．０質量％
ステアリン酸 ２．０質量％
ワセリン ５．０質量％
スクワラン ５．０質量％
トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリル １．０質量％
ホホバ油 １．０質量％
オリーブ油 １．０質量％
１，３−ブチレングリコール ３．０質量％
グリセリン １０．０質量％
プロピレングリコールモノステアリン酸エステル ２．５質量％
ポリオキシエチレンセチルエーテル ３．０質量％
トリエタノールアミン １．０質量％
メチルパラベン ０．１５質量％
プロピルパラベン ０．１質量％
香料 適量
酸化防止剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０質量％
【配列表フリーテキスト】
【０１５２】
配列番号：１は、環状ペプチド化合物の配列である。１番目のシステイニル基と８番目のシステイニル基との間には、ジスルフィド結合が形成されている。２番目のＸａａは、−ＣＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（式中、ｎは１〜１０の整数である）である。３番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。４番目のＸａａは、置換基を有してもよいＩｌｅ、置換基を有してもよいＶａｌまたは置換基を有してもよいＬｅｕである。５番目のＸａａは置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。６番目のＸａａは、置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。７番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。
【０１５３】
配列番号：２は、直鎖状ペプチドまたは環状ペプチド化合物の部分配列である。
配列番号：３は、直鎖状ペプチドの配列である。
【０１５４】
配列番号：４は、環状ペプチド化合物の部分配列である。２番目のＸａａは、−ＣＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（式中、ｎは１〜１０の整数である）である。３番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。４番目のＸａａは、置換基を有してもよいＩｌｅ、置換基を有してもよいＶａｌまたは置換基を有してもよいＬｅｕである。５番目のＸａａは置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。６番目のＸａａは、置換基を有してもよいＡｓｎ、置換基を有してもよいＧｌｎ、置換基を有してもよいＡｓｐまたは置換基を有してもよいＧｌｕである。７番目のＸａａは、置換基を有してもよいＳｅｒ、置換基を有してもよいＴｈｒまたは置換基を有してもよいＴｙｒである。
【０１５５】
配列番号：６は、Ｔ７タグ配列である。
配列番号：７は、ＩＬ−２シグナルペプチドの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
〔式中、Ｘａａ1およびＸａａ5はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基、Ｘａａ2は置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基、Ｘａａ3およびＸａａ4はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｒ1は式（ＩＩ）：
【化２】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）で表される基または式（ＩＩＩ）：
【化３】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）で表される基を示す〕で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を含有してなる皮膚外用剤。
【請求項２】
式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である請求項１に記載の皮膚外用剤。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
〔式中、Ｘａａ1およびＸａａ5はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいセリル基、置換基を有してもよいスレオニル基または置換基を有してもよいチロシニル基、Ｘａａ2は置換基を有してもよいイソロイシル基、置換基を有してもよいバリル基または置換基を有してもよいロイシル基、Ｘａａ3およびＸａａ4はそれぞれ独立して、置換基を有してもよいアスパラギニル基、置換基を有してもよいグルタミニル基、置換基を有してもよいアスパラチル基または置換基を有してもよいグルタミル基、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｒ1は式（ＩＩ）：
【化２】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）で表される基または式（ＩＩＩ）：
【化３】
（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）で表される基を示す〕で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を含有してなる皮膚外用剤。
【請求項２】
式（Ｉ）において、Ｘａａ1がセリル基、Ｘａａ2がイソロイシル基、Ｘａａ3がグルタミル基、Ｘａａ4がグルタミニル基、Ｘａａ5がセリル基であり、Ｒ1が式（ＩＩＩ）で表される基であり、ｎが１である請求項１に記載の皮膚外用剤。
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図１１】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−１７２９０（Ｐ２０１２−１７２９０Ａ）
【公開日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５５５８８（Ｐ２０１０−１５５５８８）
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【出願人】（５０３０９２１８０）学校法人関西学院 (71)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【出願人】（５０３０９２１８０）学校法人関西学院 (71)
【Ｆターム（参考）】
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