本発明はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の１つ又は複数に対する二本鎖分子、又はかかる二本鎖分子を含有する組成物、ベクター、若しくは細胞を投与することにより肺癌を治療又は予防する方法に関する。本発明はまたＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの中から選択される１つ又は複数の過剰発現された遺伝子を用いて肺癌、特にＮＳＣＬＣ又はＳＣＬＣを診断する方法を特徴とする。また、肺癌におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの１つ又は複数の過剰発現、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの１つ又は複数の細胞増殖機能、又はＣＤＫＮ３とＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、及び／又はＥＦ−１δとの間の相互作用に対する化合物の効果を指標として用いて、肺癌を治療及び予防するための化合物を同定する方法が開示される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に導入した場合にＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲのｉｎ ｖｉｖｏ発現、及び細胞増殖を阻害する単離二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含む、二本鎖分子。
【請求項２】
前記センス鎖が配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項１に記載の二本鎖分子。
【請求項３】
前記二本鎖分子が、約１９ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の二本鎖分子。
【請求項４】
介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項１に記載の二本鎖分子。
【請求項５】
一般式：
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有する二本鎖分子であって、式中、［Ａ］は配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、請求項４に記載の二本鎖分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖分子を発現するベクター。
【請求項７】
ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する癌を治療する方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離二本鎖分子、又は請求項６に記載のベクターの少なくとも１つを投与する工程を含む方法。
【請求項８】
治療される前記癌が肺癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する癌を治療するための組成物であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離二本鎖分子又は請求項６に記載のベクターの少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項１０】
治療される前記癌が肺癌である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
肺癌を診断する方法であって、
（ａ）被験体から得た生体試料において、
（ｉ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、及びＣＤＫＮ３の群から選択されるｍＲＮＡを検出すること、
（ｉｉ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、及びＣＤＫＮ３の群から選択されるタンパク質を検出すること、及び
（ｉｉｉ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、及びＣＤＫＮ３の群から選択されるタンパク質の生物活性を検出すること
から成る群から選択される方法のいずれか１つによって、遺伝子の発現レベルを求める工程、並びに
（ｂ）前記遺伝子の正常対照レベルと比較した場合の、工程（ａ）において求められる前記発現レベルの上昇を、肺癌の存在と関連付ける工程
を含む、方法。
【請求項１２】
工程（ａ）において求められる前記発現レベルが、前記正常対照レベルより少なくとも１０％高い、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）において求められる前記発現レベルをＥＢＩ３、ＤＬＸ５、及びＣＤＫＮ３の群から選択されるタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより求める、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体から得た生体試料が生検材料、痰、血液、胸水、又は尿を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
肺癌患者の予後を判定又は決定する方法であって、
（ａ）患者から得た生体試料において遺伝子の発現レベルを検出する工程、
（ｂ）検出される前記発現レベルを対照レベルと比較する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）の比較に基づいて前記患者の予後を決定する工程
を含み、前記遺伝子がＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δから成る群から選択される、方法。
【請求項１６】
前記対照レベルが予後良好な対照レベルであり、該対照レベルと比較した場合の前記発現レベルの上昇が、予後不良であると決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記上昇が前記対照レベルより少なくとも１０％高い、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記発現レベルが、
（ａ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δのｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質を検出すること、及び
（ｃ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質の生物活性を検出すること
から成る群から選択される方法のいずれか１つによって求められる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者から得た生体試料が生検材料、痰、又は血液、胸水、又は尿を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
肺癌を診断するか、又は肺癌患者の予後を判定若しくは決定するためのキットであって、
（ａ）遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬、
（ｂ）前記遺伝子によりコードされるタンパク質を検出するための試薬、及び
（ｃ）前記タンパク質の生物活性を検出するための試薬
から成る群から選択される試薬を含み、前記遺伝子がＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δから成る群から選択される、キット。
【請求項２１】
前記試薬が前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記試薬が前記遺伝子によりコードされる前記タンパク質に対する抗体である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
被験体において肺癌を診断する方法であって、
（ａ）診断される被験体に由来する血液試料を準備する工程、
（ｂ）前記血液試料におけるＥＢＩ３タンパク質のレベルを求める工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）において求められる前記ＥＢＩ３レベルを正常対照のＥＢＩ３レベルと比較する工程
を含み、前記血液試料におけるＥＢＩ３レベルが前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、方法。
【請求項２４】
前記血液試料が全血、血清、及び血漿から成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＥＢＩ３タンパク質をイムノアッセイにより検出する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ｄ）前記血液試料におけるＣＥＡのレベルを求める工程、及び
（ｅ）工程（ｄ）において求められる前記ＣＥＡレベルを正常対照のＣＥＡレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるＥＢＩ３レベル及びＣＥＡレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記肺癌がＮＳＣＬＣである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ｄ）前記血液試料におけるＣＹＦＲＡのレベルを求める工程、
（ｅ）工程（ｅ）において求められる前記ＣＹＦＲＡレベルを正常対照のＣＹＦＲＡレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるＥＢＩ３レベル及びＣＹＦＲＡレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記肺癌がＳＣＣである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ｄ）前記血液試料におけるｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを求める工程、
（ｅ）工程（ｅ）において求められる前記ｐｒｏ−ＧＲＰレベルを正常対照のｐｒｏ−ＧＲＰレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるＥＢＩ３レベル及びｐｒｏ−ＧＲＰレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記肺癌がＳＣＬＣである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＥＢＩ３を発現する癌を検出するためのキットであって、
（ｉ）血液試料におけるＥＢＩ３のレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｉ）ＥＢＩ３に対する陽性対照試料
を含む、キット。
【請求項３４】
（ｉｉｉ）血液試料におけるＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｖ）ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰに対する陽性対照試料をさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記陽性対照試料がＥＢＩ３、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰに対して陽性である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
被験体における肺癌を診断する方法であって、
（ａ）診断を受ける被験体から血液試料を採取する工程、
（ｂ）前記血液試料におけるＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡのレベルを求める工程、
（ｃ）工程（ｂ）において求められる前記ＮＰＴＸ１レベル及び前記ＣＹＦＲＡレベルを、正常対照のＮＰＴＸ１レベル及びＣＹＦＲＡレベルと比較する工程、及び
（ｄ）前記血液試料において、前記正常対照と比較して高いＮＰＴＸ１レベル及び高いＣＹＦＲＡレベルのいずれか又は両方が、前記被験体が肺癌を患っていることを示唆すると判断する工程
を含む、方法。
【請求項３７】
前記肺癌が扁平上皮癌（ＳＣＣ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記血液試料が全血、血清、及び血漿から成る群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡタンパク質を発現する癌を検出するためのキットであって、
（ｉ）血液試料におけるＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡタンパク質のレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｉ）ＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡタンパク質に対する陽性対照試料
を含む、キット。
【請求項４０】
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物をＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
（ｂ）前記ポリペプチドと前記試験化合物との結合活性を検出する工程、及び
（ｃ）前記ポリペプチドに結合する化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項４１】
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物をＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の前記ポリペプチドの生物活性を検出する工程、及び
（ｃ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３の前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドの生物活性を、前記試験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して抑制する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
前記生物活性が細胞増殖、細胞浸潤、細胞外分泌、ホスファターゼ活性、及びＡｋｔリン酸化の促進の群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ホスファターゼ活性がＥＦ−１δを用いて検出されたものである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物をＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３を発現する細胞と接触させる工程、及び
（ｂ）前記試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項４５】
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物をＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３の転写調節領域、及び該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる工程、
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
（ｃ）対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現又は活性レベルを低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＣＤＫＮ３ポリペプチド又はその機能的等価物を、ＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−１αポリペプチド、ＥＦ−１βポリペプチド、ＥＦ−１γポリペプチド、ＥＦ−１δポリペプチド、及びそれらの機能的等価物から成る群から選択される相互作用パートナーと接触させる工程、
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程、及び
（ｃ）これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項４７】
前記ＥＦ−１δポリペプチドの機能的等価物が、配列番号４８から成るポリペプチドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＣＤＫＮ３ポリペプチドの機能的等価物がＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−１αポリペプチド、ＥＦ−１βポリペプチド、ＥＦ−１γポリペプチド、又はＥＦ−１δ結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物をＣＤＫＮ３を過剰発現する細胞と接触させる工程、
（ｂ）Ａｋｔ Ｓｅｒ４７３のリン酸化を測定する工程、及び
（ｃ）対照と比較して、前記リン酸化を低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項５０】
肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＮＰＴＸ１ポリペプチド又はその機能的等価物を、ＮＰＴＸＲポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる工程、
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程、及び
（ｃ）これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項５１】
前記ＮＰＴＸ１ポリペプチドの機能的等価物がＮＰＴＸＲ結合ドメインを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＮＰＴＸＲポリペプチドの機能的等価物がＮＰＴＸ１結合ドメインを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
配列番号８８又は配列番号８９を含むポリペプチドに結合する抗体。
【請求項５４】
ＮＰＴＸ１中和活性を有する、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
肺癌を治療又は予防するための組成物であって、薬学的に有効な量の抗ＮＰＴＸ１抗体又はその断片を含む、組成物。
【請求項５６】
前記ＮＰＴＸ１抗体が請求項５３及び５４に記載の抗体である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
被験体において肺癌を治療又は予防する方法であって、該被験体に抗ＮＰＴＸ１抗体又はその断片を投与することを含む、方法。
【請求項５８】
前記ＮＰＴＸ１抗体が請求項５３及び５４に記載の抗体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬ（配列番号６１）を含むポリペプチド又は該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列であって、配列番号８から成るペプチドの生物学的機能を欠く、ポリペプチド。
【請求項６０】
前記生物学的機能が細胞増殖活性である、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが８個〜３０個の残基から成る、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
前記ポリペプチドが細胞膜透過性物質で修飾される、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
一般式：
［Ｒ］−［Ｄ］
を有し、配列番号８から成るペプチドの生物学的機能を欠くポリペプチドであって、式中、［Ｒ］及び［Ｄ］はリンカーＧＧＧを介して直接的又は間接的に連結してもよく、［Ｒ］は細胞膜透過性物質を表し、［Ｄ］はＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬ（配列番号６１）を含む断片配列のアミノ酸配列、又は該断片配列を含む該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列を表す、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
前記細胞膜透過性物質が：
ポリアルギニン、
Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ／配列番号６３、
ペネトラチン／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ／配列番号６４、
ブホリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ／配列番号６５、
トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ／配列番号６６、
ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ／配列番号６７、
Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ／配列番号６８、
Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ／配列番号６９、
Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ／配列番号７０、
プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ／配列番号７１、
ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ／配列番号７２、
Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ／配列番号７３、
ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ／配列番号７４、
Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ／配列番号７５、及び
ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ／配列番号７６
から成る群から選択されるいずれか１つである、請求項６３に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
前記ポリアルギニンが１１個のＡｒｇ（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ／配列番号７７）である、請求項６４に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
活性成分として請求項５９〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、癌の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤。
【請求項６７】
前記癌が肺癌である、請求項６６に記載の薬剤。
【請求項６８】
請求項５９〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与する工程を含む、癌を治療又は予防する方法。
【請求項６９】
前記癌が肺癌である、請求項６８に記載の方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図２】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図４Ｅ】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図７Ｄ】

【図７Ｅ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図９Ｄ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１１】

【図１２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１３Ｃ】

【図１３Ｄ】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２３Ｃ】

【図２３Ｄ】

【図２３Ｅ】

【図２４】

【公表番号】特表２０１０−５３６３６６（Ｐ２０１０−５３６３６６Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２１５８１（Ｐ２０１０−５２１５８１）
【出願日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６５３５２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２８５８０
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】